DE69133490T2

DE69133490T2 - Antimikrobielle Peptide wirksam gegen Pflanzenpathogene, ihre Verwendung und auf sie bezogene Nachweismethoden

Info

Publication number: DE69133490T2
Application number: DE69133490T
Authority: DE
Inventors: Newell Fred Lawrenceville Bascomb; Claudio Princeton Mapelli; Michael Dennis Princeton Swerdloff; Jon Ira Robbinsville Williams; Nicholas Paul Pennington City Everett
Original assignee: Virtual Drug Development Inc Brentwood; Virtual Drug Development Inc
Current assignee: Virtual Drug Development Inc Brentwood; Virtual Drug Development Inc
Priority date: 1990-08-10
Filing date: 1991-08-09
Publication date: 2006-07-20
Anticipated expiration: 2011-08-10
Also published as: EP0472987B1; CA2048910C; US5424395A; DE69133490D1; EP0472987A1; CA2048910A1; JPH07242696A; ATE308562T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Peptide, welche zur Bekämpfung von Pflanzenpathogenen brauchbar sind, und Verfahren zu ihrer Verwendung gegen Pflanzenpathogene. Die vorliegende Erfindung betrifft Screening-Verfahren, welche in Verbindung damit brauchbar sind.
Chemische Verbindungen verschiedener Typen können das Wachstum von Mikroben und anderen Lebensformen inhibieren oder diese töten. Die Menschheit hat dieses Phänomen ausgenutzt, wie es beispielhaft durch solche alltäglichen Gebrauchsgüter wie apothekenfreie Desinfektionsmittel und pharmazeutische Verbindungen wie Antibiotika belegt wird. Die Erfindung, welche der Gegenstand dieser Arbeit ist, betrifft die Modifizierung und Ausarbeitung von einer kürzlich gefundenen Klasse von antimikrobiellen Verbindungen. Im Gegensatz zu den oben beispielhaft angeführten gängigen antimikrobiellen Verbindungen sind die diese Klasse bildenden Verbindungen Proteine, welche ebenfalls als Peptide bekannt sind. Proteine werden aus einzelnen Baublöcken, die als Aminosäuren bezeichnet werden, aufgebaut. Die Aminosäuren werden miteinander durch chemische Verknüpfungen, welche als Peptidbindungen bezeichnet werden, verknüpft. Ein Ende des Aminosäurestranges, welcher ein Protein aufbaut, wird als N-terminales Ende oder Amino-terminales Ende bezeichnet, und das andere Ende wird als C-terminales oder Carboxy-terminales Ende bezeichnet. Welche Aminosäure-Aufbaublöcke genau gewählt werden, um ein Peptid aufzubauen, und die Reihenfolge ihrer Auswahl wird durch das genetische Material, d. h. die DNA einer Zelle, bestimmt.
Ein bestimmtes Peptid kann auf zwei Wegen "aufgebaut" werden. Ein Weg ist die chemische Synthese des Peptids unter Anwendung einer ausschließlichen humanen, d. h. nicht-genetischen Intervention. Unter dieser Methodologie werden die jeweiligen Aminosäure-Aufbaublöcke gewählt und in der geeigneten Reihenfolge unter Anwendung chemischer Reaktionen verbunden. Diese chemische Synthese von Proteinen bedarf nicht direkt biologischer oder genetischer Unterstützung. Die zweite Methode wendet eine solche Unterstützung an, indem die Genetik eines Zellsystems so manipuliert wird, dass das System das gewünschte Protein herstellt. Diese letztere Methode wird allgemein als Gentechnologie bezeichnet.
Die antimikrobiellen Proteine, welche der Gegenstand dieser Erfindung sind, wie es vollständiger unten im Detail dargestellt wird, wurden so modifiziert, wie es durch diese Erfindung gelehrt wird, so dass sie besonders brauchbar für den landwirtschaftlichen Einsatz sind. Unter Anwendung der Erkenntnisse und Lehren dieser Erfindung wurde festgestellt, dass antimikrobielle Peptide verwendet werden können, um Pflanzenpathogene zu hemmen und/oder zu töten, welche sich als Plage oder schlimme zerstörende Mittel gegenüber Pflanzen mit entweder landwirtschaftlichem oder gartenbaulichem Wert herausgestellt haben. Unter den praktischen Anwendungen dieser Erfindung ist die Anwendung dieser antimikrobiellen Peptide bei Pflanzen unter Verwendung herkömmlicher Methoden, wie Sprays, oder nicht-herkömmlicher Methoden wie durch genetische Modifizierung oder gentechnologische Behandlung von Pflanzenzellen, wie Mais oder Kartoffeln, um diese Peptide zu exprimieren. Zum Beispiel könnte genetisches Material, welches eines der antimikrobiellen Peptide dieser Erfindung codiert, in Mais (Mais), welcher normalerweise keine Gene für diese Peptide besitzt, eingeführt werden, wodurch der genetisch transformierten Maispflanze ein hohes Ausmaß an Pflanzenpathogen-Resistenz verliehen wird. In diesem Zusammenhang ist es bedeutend, dass diese antimikrobiellen Peptide normalerweise nicht in Pflanzenzellen gefunden werden. Auf jeden Fall ist vorherzusehen, dass die Vorteile für die Gesellschaft aus dieser Erfindung ziemlich signifikant sein werden, da die hierin dargelegten antimikrobiellen Verbindungen in erheblichem Maße den Bedarf nach teuren, aus Erdöl hergeleiteten Pestizidverbindungen reduzieren oder in einigen Fällen eliminieren könnten.
Die antimikrobiellen Peptide, auf die wir uns beziehen, wurden zuerst im Jahre 1987 beschrieben, als zwei Gruppen von Forschern, wobei die eine von Dudley, H. Williams, geleitet wurde, und eine von Michael Zasloff geleitet wurde, erfolgreich eine Anzahl von Peptiden charakterisiert und beschrieben hatten, welche von Drüsen, die innerhalb der Haut des afrikanischen Krallenfrosches, Xenopus laevis, enthalten sind, sezerniert werden; siehe Giovannini et al., "Biosynthesis and Degradation of Peptides Derived from Xenopus Laevis Prohormones" Biochem. J., 243, (1987), 113-120; und Zasloff, "Magainins, A Class of Antimicrobial Peptides From Xenopus Skin: Isolation, Characterization of Two Active Forms and Partial cDNA Sequence of a Precursor", Proc Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 84, (1987), 5449-5453. Ihre Forschung wurde zumindest teilweise durch die Beobachtung angetrieben, dass diese Froschspezies eine bemerkenswerte Erholungskraft und die Fähigkeit besitzt, während der Wundheilung mit nur geringer oder keiner postoperativer Pflege von einer Infektion frei zu bleiben.
Unter diesen Peptiden wurden zwei Verbindungen mit 23 Resten, welche in der Allgemeinheit als Magainine bezeichnet werden, der Gegenstand zunehmender Aufmerksamkeit. Diese sind Magainin 1 mit der Aminosäuresequenz Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Gly-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-Gly-Glu-Ile-Met-Lys-Ser und Magainin 2, welches Austausche von Lys für Gly an der Position 10 und Asn für Lys an der Position 22 in der obigen Sequenz besitzt. Sowohl Magainin 1 als auch Magainin 2 wurden bezüglich ihrer potenziellen pharmazeutischen Verwendung aufgrund ihrer antimikrobiellen Breitspektrumaktivität gegen menschliche Pathogene untersucht. Dies gilt insbesondere für Magainin 2.
Darüber hinaus wurde eine Vielzahl von auf Magainin basierenden Derivaten mit unterschiedlichen Aktivitätsgraden hergestellt und untersucht; siehe Juretic et al., "Magainin 2 Amide und Analogues, Antimicrobial Activity, Membrane Depolarization and Susceptibility of Proteolysis", Febs Lett. 249, (1989), 219-223; Chen et al., "Synthetic Magainin Analogues With Improved Antimicrobial Activity", Febs Lett. 236, (1988), 462-466; Cuervo et al., "Synthesis and Antimicrobial Activity of Magainin Alanine Substitution Analogs", Proceedings of the Eleventh American Peptide Symposium; Peptides: Chemistry, Structure and Biology (J.E. Rivier et al.), (1990), S. 124-126, veröffentlicht von ESCOM-Leiden, Niederlande; Cuervo et al., "The Magainins: Sequence Factors Relevant to Increased Antimicrobial Activity and Decreased Hemolytic Activity", Peptide Research, 1, (1988), 81-86; Weltpatentanmeldung Nr. WO 88/06597; und japanische Patentanmeldung Nr. JP-1/299 299. Diese schließen die Reihe der vollständigen Analoge mit der Auslassung eines einzelnen Restes von Magainin 1 und 2, gewählte N-terminale Auslassungen von Magainin 2 sowie die Reihe der vollständigen Analoge mit einem Alanin(Ala)-Austausch von Magainin 2 und Magainin 2-Derivate, welche als ein Antibiotikum und/oder ein Anti-Krebs-Arzneistoff brauchbar sein könnten und welche an der 5. und 12. Position substituiert sind, ein.
Diese Magaininderivate werfen mehr Fragen über die Natur und Charakteristika von Magaininen und von Magainin abgeleiteten Peptiden auf, als sie beantworten. Zum Beispiel haben sowohl Zasloff et al. als auch Cuervo et al. berichtet, dass Auslassungsanaloge von Magaininen eine verringerte Aktivität gegen Tierpathogene besitzen; siehe Zasloff et al., "Antimicrobial Activity of Synthetic Magainin Peptides and Several Analogs", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, (1988), 910-913; und Cuervo et al., "The Magainins: Sequence Factors Relevant to Increased Antimicrobial Activity and Decreased Hemolytic Activity" oben. Beide Forschungsgruppen scheinen ebenfalls darin übereinzustimmen, dass die N-terminale Region (Aminosäuren 1-14) für die Aktivität des Peptids in Bezug auf Tierpathogene kritisch ist. Dagegen gibt es keine Übereinstimmung bezüglich des Ausmaßes, in welchem Auslassungen in dieser Region die antimikrobielle Aktivität des resultierenden Peptids beeinflussen. Die Gruppe von Zasloff hat belegt, dass Magainin-Auslassungsderivate, welche nur eine einzige ausgelassene Aminosäure an dem Amino-Terminus aufweisen, keine merkliche Abnahme in der Aktivität besitzen. Gemäß der Forschung von Zasloff ist die Abnahme in der Aktivität signifikant und/oder vollständig, nur wenn das resultierende Peptid 19 Reste oder kürzer ist (konsekutive Auslassungen vom N-Ende). Dies steht in starkem Widerspruch zu den Erkenntnissen der Gruppe von Cuervo. Cuervo et al. haben gefunden, dass Auslassungen eines einzelnen Restes in dem N-terminalen Bereich die Aktivität von Magainin 1 und Magainin 2 vollständig zunichte machen.
Diese zwei Forschungsgruppen haben ebenfalls zueinander im Widerspruch stehende Information in Bezug auf den relativen Einfluss von Einzel-Aminosäuredeletionen auf dem Carboxylende von C-Terminus-Magainin 2 vorgebracht. Zasloff und seine Kollegen haben gezeigt, dass die Entfernung des Ser-Restes an dem Carboxylende von Magainin 2 im Wesentlichen die Aktivität gegen humane bakterielle Pathogene eliminiert, während Cuervo et al. nur von einer beschränkten Reduktion in der Aktivität bei diesem Derivat mit einer Einzel-Auslassung von Magainin 2 gegenüber manchen der gleichen humanen Pathogene berichteten; siehe M. Zasloff WO 88/06597, und Cuervo et al., "The Magainins: Sequence Factors Relevant To Increased Antimicrobial Activity and Decreased Hemolytic Activity", oben. Überraschenderweise haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung herausgefunden, dass Einzel- oder Doppel-Auslassungen von Resten in der C-terminalen (nicht N-terminalen) Region von Magaininen und von Magainin-abgeleiteten Peptiden einen immensen Effekt auf die Aktivität aufweisen können, insbesondere in Bezug auf die Effizienz gegen Pflanzen-Pathogene (im Gegensatz zu Tierpathogenen).
Die Untersuchung von bestimmten Substitutionsderivaten von natürlichen Magaininen weitet diese Streitfragen über kritische Positionen nur noch aus. Insbesondere ist die N-terminale Region von Magaininen und/oder von Magainin-abgeleiteten Peptiden angenommenermaßen für die Aktivität kritisch; siehe Cuervo et al., oben. Darüber hinaus ergab eine Substitution von Ala in der Position 19 der Amidform von Magainin 2 (Magainin 2-NH₂) eine fünffache Zunahme in der Potenz, wenn mit nicht-substituiertem Magainin 2-NH₂ verglichen wurde. Diese Substitution war allen anderen Ala-Substitutionen in den Positionen 1-14 überlegen; siehe Cuervo et al., "Synthesis And Antimicrobial Activity of Magainin Alanine Substitution Analogs", oben; siehe auch Chen et al., "Synthetic Magainin Analogs With Improved Antimicrobial Activity", oben (darin wird von einer erhöhten antimikrobiellen Aktivität eines Magainins 2 berichtet, bei welchem Alanin an dessen 8., 13. und/oder 18. Position substituiert ist). Somit existiert keine klare Richtlinie in Bezug auf die spezifischen Modifikationen, welche solche Peptide beim Schützen von Pflanzen vor Pflanzenpathogenen brauchbar machen würden.
Viel der Magainin-Literatur hat sich auf den postulierten Mechanismus konzentriert, durch welchen Magaininpeptide mikrobielle Aktivität inhibieren und zum Beispiel in Protozoen eine Lyse verursachen. Diese Artikel haben ebenfalls die wechselseitige Beziehung der Alpha-Helix-Struktur, Größe und Ladung, welche diesen Peptiden zugeschrieben wird, und ihrer Nützlichkeit als antimikrobielle Mittel diskutiert; siehe im Allgemeinen, Matsuzaki et al., "Magainin 1-Induced Leakage of Entrapped Calcein Out of Negatively-Charged Lipid Vesicles", Biochimica Et Biophysica Acta, 981 (1989), 130-134; Rana et al., "Outer Membrane Structure in Smooth and Rough Strains of Salmonella Typhimurium and Their Susceptibility to the Antimicrobial Peptides, Magainins and Defensins", Prog. Clin. Biol. Res. 292, (1989), 77-85; Chen. et al., "Magainin Analogs: A Study of Activity as a Function of Alpha-Helix-Modification", Prog. of Eleventh American Peptide Symposium, oben, S. 124-126; Westerhoff et al., "Magainins and the Disruption of Membrane Linked Free-Energy Transduction", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, (1989), 6597-6601, U.S.-Patentanmeldung Serine-Nr. 07/021 493, eingereicht am 4. März 1987; siehe auch Cannon, "A Family of Wound Healers", Nature 328, (1987), 478; Williams et al., "Raman Spectroscopy of Synthetic Antimicrobial Frog Peptides Magainin 2a und PGLa", Biochemistry, 29, (1990), 4490-4496; Rana et al., "Interactions between Salmonella Typhimurium Lipopolysaccharide and the Antimicrobial Peptide, Magainin 2 Amide", FEBS LETT. 261, (1990), 464-467, Febr. 1990; Berkowitz et al., "Magainins: A New Family of Membrane-Active Host Defense Peptides", Biochemical Pharmacology, 39, Nr. 4, S. 625-629, 1990; Duclohier et al., "Antimicrobial Peptide Magainin 1 from Xenopus Skin Forms Anion-Permeable Channels in Planar Lipid Bilayers", Biophys. J. 56, (1989), 1017-1021. Siehe auch Urrutia, "Spontaneous Polymerisation of the Antibiotic Peptide Magainin 2", FEBS LETT. 247, (1989), 17-21.
Die veröffentlichten Arbeiten in Bezug auf Magainine und anderen Klassen von Antibiotika oder antimikrobiellen Peptiden (zum Beispiel Cecropine, Defensine, Sacotoxine, Melittine und dergleichen), von denen die Erfinder Kenntnis haben, haben sich im Allgemeinen zentral mit Pharmazeutika betreffenden Gesundheitstechnologien beim Menschen beschäftigt. Ausnahmen schließen jedoch zwei Anmeldungen ein, welche von Jaynes et al. eingereicht wurden (WO 89/04371 und WO 88/0976), welche sich allgemein auf Pflanzen beziehen, die genetisch für eine Krankheitsresistenz verbessert wurden. Jaynes et al. haben ohne unterstützende Daten spekuliert, dass genetisch transformierte Pflanzen produziert werden können, welche ein exprimierbares heterologes Gen für ein antimikrobielles Peptid enthalten. Auf diese Weise wird gehofft, dass die Pflanze eine verbesserte Resistenz gegenüber einer Krankheit besitzt. Gemäß Jaynes et al. werden jedoch Peptide, wie Melittine, Bombinine und Magainine, welche weniger als etwa 30 Reste besitzen, nicht für die Verwendung bei Anwendungen zum Schutz von Nutzpflanzen bevorzugt, da angenommenermaßen die Wirtspflanzenzellen in nachteiliger Weise ihre Einbringung und/oder Anwesenheit beeinflusst werden könnten.
Die bevorzugten Peptide nach Jaynes et al. besitzen etwa 30 bis etwa 40 Aminosäuren, da sie für Bakterien und Pilze stärker spezifisch sind. Jaynes et al. behaupten ebenfalls, dass Peptide mit mehr als etwa 40 Aminosäuren nicht ausreichend antimikrobiell sein könnten, wenn sie allein verwendet werden, um ein breites Spektrum an antimikrobiellem Schutz bereitzustellen. Die Herangehensweise von Jaynes et al. zum Schutz von Pflanzen vor Pflanzenpathogenen scheint darauf abzuzielen, spezifische, natürlich vorkommende Peptide mit einem Aktivitätsgrad und einer Empfindlichkeit, die in der Nähe von dem sind, was als vorteilhaft angesehen wird, zu finden und dann dieses Peptid zu modifizieren, um seine Charakteristika zu optimieren; siehe ebenfalls Jaynes et al., "Increasing Bacterial Disease Resistance In Plants Utilizing Antibacterial Genes from Insects", BioEssays 6, (1987), 236-270.
Andere haben Informationen in Bezug auf den Einbau von antimikrobiellen Peptiden in Pflanzen oder in der Tat die Verwendung von antimikrobiellen Peptiden zum Schutz von Pflanzen vor Pflanzenpathogenen veröffentlicht; siehe EP-A-299 828; T. Casteels et al., "Apidaecins: Antibacterial Peptides From Honeybees", The EMBO J., 8, (1989), 2387-2391; F. Ebrahim-Nesbat et al., "Cutivar-Related Differences in the Distribution of Cell-Wall-Bound Thionins in Compatible and Incompatible Interactions Between Barley and Powdery Mildew", Planta, 179, (1989), 203-210. Gleichwohl mangelt es der veröffentlichten Information an einer Diskussion in Bezug auf die verschiedentlichen Probleme und Lösungen, die mit dem Einbau und/oder der Verwendung von solchen Peptiden bei Pflanzen assoziiert sind. Es ist wünschenswert, dass die antimikrobiellen Peptide dieser Erfindung nicht nur brauchbar beim Schutz einer Pflanze vor Pflanzenpathogenen sind, sondern dass die Peptide nicht genau die Pflanzenzellen signifikant schädigen, welche sie schützen sollen.
Proteine, die in der Natur erzeugt werden, umfassen häufig eine Met-Aminosäure, die an das Amino- oder N-terminale Ende gebunden ist. Dies ist nicht der Fall bei natürlich auftretenden Magaininen oder anderen natürlich auftretenden antimikrobiellen Peptiden. Ein Teil der vorliegenden Erfindung richtet sich auf die Synthese von Peptiden mit einem N-terminalen Met-Rest. Nach der Synthese solcher Peptide stellt diese Erfindung ebenfalls dar, wie solche Peptide für den Schutz von Pflanzen vor Pflanzenpathogenen brauchbar sind.
Vor dieser Erfindung hat niemand die Modifizierung von auf Magainin basierenden Peptiden in Betracht gezogen, so dass sie sowohl aktiv gegen Pflanzenpathogene als auch besonders geeignet zur Verwendung mit Pflanzen und/oder zur Einbringung in Pflanzen sind. Insbesondere hat niemand die Wirkung von natürlich auftretender Pflanzenenzym-Aktivität auf antimikrobielle Peptide, d. h. die Wirkung von pflanzlicher proteolytischer Aktivität auf die antimikrobiellen Peptide wie jene, welche in dieser Erfindung dargestellt sind; den potenziellen schädlichen Effekt von antimikrobiellen Peptiden auf die Pflanzenzellen, welche die Peptide schützen sollen; oder wie solche schädlichen Wechselwirkungen verbessert werden können, in Betracht gezogen. In entsprechender Weise hat niemand den Einfluss von modifizierten Magaininen auf die Pflanzenzelltoxizität, welche ebenfalls als Phytotoxizität bekannt ist, direkt untersucht.
Die vorliegende Erfindung zielt nicht nur auf das Erfordernis nach antimikrobiellen Peptiden, die gegen mindestens ein Pflanzenpathogen wirksam sind, ab, sondern beschäftigt sich auch mit dem Anfordernis nach Peptiden, welche spezifisch entworfen wurden, um im Pflanzenreich funktionieren zu können. Als ein Ergebnis dieser Erfindung wurde bestimmt, dass Magainin 1-Derivate im Allgemeinen von geringerer Phytotoxizität sind. Folglich zeigt diese Erfindung, dass diese Derivate besonders brauchbar sind für landwirtschaftliche und agronomische Umgebungen, in welchen die Peptide auf den Pflanzen, zum Beispiel als Sprays, verwendet werden könnten oder in eine Pflanze, zum Beispiel durch gentechnologische Veränderung einer Pflanzenzelle, eingebracht werden könnten, so dass die Pflanzenzelle selbst das Peptid produziert. Ferner wurde in unerwarteter Weise herausgefunden, dass bestimmte Bindungen zwischen den Aminosäurekonstituenten von Magaininen empfindlich gegenüber einem proteolytischen Abbau sind. Es wurden ebenfalls antimikrobielle Peptide entwickelt, welche gegenüber einem solchen Abbau resistent sind, und es wurde gezeigt, dass diese Änderungen einer antimikrobiellen Aktivität nicht entgegenstehen und die Phytotoxizität nicht erhöhen.
Es ist somit ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Peptide vorzusehen, welche spezifisch dafür entworfen wurden, für die Hemmung von Pflanzenpathogenen und insbesondere zum Schutz von Pflanzen vor Pflanzenpathogenen brauchbar zu sein.
Es ist ebenfalls ein Ziel der vorliegenden Erfindung, antimikrobielle Peptide bereitzustellen, welche gegenüber einem Abbau durch Pflanzen resistent sind.
Die vorliegende Erfindung offenbart ebenfalls antimikrobielle Peptide, welche antimikrobielle Eigenschaften und annehmbare phytotoxische Eigenschaften besitzen.
Es ist ebenfalls ein Ziel der vorliegenden Erfindung, antimikrobielle Peptide mit N-terminaler Met- oder (f)Met-Aminosäure bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung offenbart ebenfalls ein Verfahren zur Hemmung von Pflanzenpathogen, insbesondere zum Vorteil für die landwirtschaftliche und gartenbauliche Kultivierung.
Die vorliegende Erfindung offenbart ebenfalls DNA, die zur Exprimierung der vorstehend erwähnten Peptide in der Lage ist, insbesondere, wenn die DNA in einer gentechnologisch veränderten Zelle, wie einer Pflanzenzelle, exprimiert wird.
Diese und andere Ziele werden leicht für den Fachmann in den relevanten Technologien bei einer Durchsicht hiervon ersichtlich.
Die vorliegende Erfindung repräsentiert den Höhepunkt der Erkennung und Aufdeckung bestimmter Tatsachen, welche für spezifische antimikrobielle Peptide und ihre Wechselwirkung mit pflanzlichen Pathogenen, Pflanzenzellen und/oder subzellulären Organellen von Pflanzen eigentümlich sind. Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben eine Klasse von antimikrobiellen Peptiden mit der Bezeichnung AMPPPs identifiziert und charakterisiert, welche gegen Pflanzenpathogene aktiv und beim Schutz von Pflanzen vor Erkrankung, Infektion, Befall und anderen Bedingungen, die für Pflanzen schädlich sind, brauchbar sind.
Die vorliegende Erfindung ist nicht bezüglich ihrer Anwendungen auf Peptide beschränkt, welche dazu dienen können, Pflanzenpathogene zu vernichten. Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben ebenfalls herausgefunden, wie diese AMPPPs durch die natürlichen Mechanismen der Organismen unwirksam gemacht werden können, welche sie zu schützen versuchen, und haben Wege entwickelt, um dieses Ereignis zu verhindern. Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben herausgefunden, dass AMPPPs, einschließlich Magainin 1 und Magainin 2, zwischen den Positionen 7 und 8 (Xaa⁷-Xaa⁸) und ebenfalls zwischen den Positionen 21 und 22 (Xaa²¹-Xaa²²) gespalten werden können, wenn sie einer Pflanzenprotease ausgesetzt werden. Es wurde ebenfalls herausgefunden, dass die Spaltung der Bindung zwischen den Positionen 7 und 8 einen höchst dramatischen Effekt auf die antimikrobielle Aktivität der resultierenden Peptidfragmente hat. Die Spaltung der Bindung zwischen den Aminosäuren 21 und 22 hat ebenfalls einen dramatischen Effekt auf die resultierenden Fragmente. Gleichwohl scheint, wenn die Spaltung der Bindung zwischen Xaa⁷ und Xaa⁸ minimiert wird, die Spaltung der Bindung zwischen Xaa²¹ und Xaa²² nur die antibakterielle Aktivität und nicht die antifungale Aktivität signifikant zu verändern. Es wurde ebenfalls herausgefunden, und zwar ziemlich unerwartet, dass die Substitution von spezifischen Aminosäuren an der Position 7 und/oder 8 in signifikanter Weise die proteolytische Empfindlichkeit senken kann. In der Tat haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung herausgefunden, dass die Substitution eines Lysins (Lys) oder Arginins (Arg) an der Position 7 fast die proteolytische Empfindlichkeit an dieser Stelle eliminiert. Dies ist insbesondere im Hinblick auf die Ladungsähnlichkeiten zwischen Arginin, Lysin und dem Histin(His)-Rest, welcher normalerweise diese Position besetzt, unerwartet. Die Substitution von Glutaminsäure (Glu) an der Position 8 eliminiert ebenfalls fast den proteolytischen Abbau eines auf diese Weise substituierten AMPPPs.
Es wurde zusätzlich und in unerwarteter Weise gefunden, dass mehrere der Substituenten, welche AMPPPs mit erhöhter Resistenz gegenüber Proteolyse erzeugen, ebenfalls zu AMPPPs mit annehmbarer oder sogar verbesserter antifungaler und/oder antibakterieller Aktivität führen. Zum Beispiel verringern Modifikationen, wie eine Substitution von Arg oder Lys an der Position 7, nicht nur die Empfindlichkeit der Peptidbindung zwischen den Positionen 7 und 8 gegenüber einer Pflanzen-Proteolyse, sondern erhöhen ebenfalls die resultierende Aktivität von AMPPPs in Bezug auf spezifische Pflanzenpathogene.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben ebenfalls festgestellt, dass die Addition eines Met-Restes am N-Terminus von AMPPPs im Allgemeinen deren Bioaktivität gegen spezifische Pflanzenpathogene nicht beträchtlich verringert. Zum Beispiel führt die Addition von Met am N-Terminus von Magainin 2 oder [Ala¹³, Ala¹⁸]Magainin 1 zu AMPPPs, welche immer noch signifikant aktiv gegen mehrere Pflanzenpathogene sind.
Es wurde ebenfalls herausgefunden, dass Magainin 1 und darauf basierende AMPPPs bevorzugt sind zur Verwendung mit Pflanzen, um speziell Pflanzenpathogene zu bekämpfen, welche landwirtschaftliche und gartenbauliche Pflanzen von kommerzieller Bedeutung negativ beeinflussen. Diese Peptide weisen ebenfalls eine gute Beständigkeit gegenüber Abbau durch Pflanzenproteasen auf und zeigen wünschenswerte phytotoxische Eigenschaften.
Nachdem die Erfinder die vorstehend erwähnten Parameter festgestellt hatten, waren sie in der Lage, antimikrobielle Peptide zu gestalten, welche spezifisch zur Verwendung in oder mit Pflanzen angepasst waren und welche die notwendigen Charakteristika der Beständigkeit gegenüber Abbau durch Pflanzen, z. B. Proteolyse, einer signifikanten antimikrobiellen Aktivität und ausreichend niedrigen Phytotoxizität aufzeigen. Die technologisch gestalteten AMPPPs dieser Erfindung sind brauchbar zum Schützen von Pflanzen vor pflanzlichen Pathogenen mittels der herkömmlichen Anwendungstechnologie. Diese AMPPPs werden bei weitem erfolgreicher sein, wenn Gene, welche diese Peptide exprimieren können, in das Genom einer Pflanze inseriert oder inkorporiert werden, so dass das Peptid in der Pflanze und in den nachfolgenden Generationen davon exprimiert wird.
In Übereinstimmung mit den obigen Zielen wird eine Stoffzusammensetzung bereitgestellt, welche ein Magainin 1-Substitutionsderivat ist, und welches die folgende Aminosäuresequenz besitzt:
Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Ala-Xaa-Xaa-Phe-Xaa-Lys-Ala-Phe-Val-Xaa-Xaa-Ile-Xaa-Lys-Xaa
worin Xaa⁶, Xaa⁷, Xaa⁸, Xaa¹¹, Xaa¹³, Xaa¹⁸, Xaa¹⁹, Xaa²¹ und Xaa²³ gleich oder unterschiedlich sein können und aus der Gruppe gewählt werden, die aus Ala, Arg, Orn, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, 3Hyp, 4Hyp, Ser, Thr, Trp, Tyr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin und Val besteht, und worin Xaa¹⁰ aus der Gruppe gewählt wird, die aus Ala, Arg, Orn, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin und Val besteht, mit der Maßgabe, dass das AMPPP nicht Magainin 1 ist. Diesbezüglich ist unter "nicht Magainin 1" zu verstehen, dass in den Zusammensetzungen in Übereinstimmung hiermit ein nicht substituiertes Magainin 1-Peptid nicht inbegriffen ist.
Verbindungen in Übereinstimmung mit diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung sind im Allgemeinen brauchbar gegen einen oder mehrere Typen an Pflanzenpathogen. Diese AMPPPs können zusätzlich eine erhöhte Resistenz gegenüber proteolytischem Abbau haben, wenn sie zumindest mit Magainin 1 verglichen werden, und sie sind dahingehend gestaltet, dass sie annehmbare phytotoxische Levels besitzen, und zwar vornehmlich in Verbindung mit landwirtschaftlichen Einsatzzwecken solcher Verbindungen.
In Übereinstimmung mit einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Stoffzusammensetzung bereitgestellt, welche ein Magainin 2-Substitutionsderivat ist, und welches die folgende Aminosäuresequenz besitzt:
Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Ala-Xaa-Xaa-Phe-Xaa-Lys-Ala-Phe-Val-Xaa-Xaa-Ile-Xaa-Asn-Xaa
worin Xaa⁶, Xaa⁷, Xaa⁸, Xaa¹¹, Xaa¹³, Xaa¹⁸, Xaa¹⁹, Xaa²¹ und Xaa²³ gleich oder unterschiedlich sein können und aus der Gruppe gewählt sein können, die aus Ala, Arg, Orn, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, 3Hyp, 4Hyp, Ser, Thr, Trp, Tyr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin und Val besteht, und worin Xaa¹⁰ aus der Gruppe gewählt wird, die aus Ala, Arg, Orn, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin und Val besteht, mit der Maßgabe, dass das AMPPP nicht Magainin 2, nur an Xaa¹¹ substituiertes Magainin 2, nur in mindestens zwei von Xaa⁸, Xaa¹³ und Xaa¹⁸ mit Ala substituiertes Magainin 2 ist, und mit der weiteren Maßgabe, dass das AMPPP nicht Magainin 2 ist, welches mit nur einem einzigen Ala substituiert ist.
Diese AMPPPs, welche Substitutionsderivate von Magainin 2 sind, weisen, wie ihre Magainin 1-Gegenstücke, den Vorteil auf, dass sie entweder spezifische oder breitgefächerte antimikrobielle/antibiotische Aktivität gegen Pflanzenpathogene besitzen. Viele besitzen ebenfalls eine gesteigerte Resistenz gegenüber proteolytischem Abbau und/oder besitzen keine erhöhte Phytotoxizität, wenn sie mit ihren Magainin 1- oder Magainin 2-Gegenstücken verglichen werden.
Besonders bevorzugte AMPPPs in Übereinstimmung mit der vorstehenden Diskussion sind die bereits vorausgehend beschriebenen Magainin 1- oder Magainin 2-Substitutionsderivate, wobei Xaa⁶ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Asn, Pro, 3Hyp, Ile und Leu besteht, Xaa⁷ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Phe, Ala, Met, Ser, Thr, Trp, Tyr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin, Gln, Pro, 3Hyp, 4Hyp, Lys, Asn, Glu, His, Asp, Orn und Arg besteht, Xaa⁸ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Ala, Met, Pro, 3Hyp, 4Hyp, Thr, Ser, Trp, Tyr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin, Gln, Lys, Asn, Glu, His, Asp, Orn und Arg besteht, Xaa¹⁰ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Gly, Leu, Ile, Val, Ala, Phe, Met, Thr, Ser, Trp, Tyr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin, Gln, Lys, Asn, Glu, His, Asp, Orn und Arg besteht, Xaa¹¹ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Met, Trp, Tyr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin, Gln, Lys, His, Pro, 3Hyp, 4Hyp, Ser, Orn und Arg besteht, Xaa¹³ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Leu, Ile, Trp, Phe, Val, Ala, Gly, Pro, 3Hyp und 4Hyp besteht, Xaa¹⁸ eine Aminosäure ist, welche aus der Gruppe gewählt wird, die aus Thr, Trp, Tyr, Asp, Glu, Lys, Arg, Gln, His, Met, Ala, Gly, Pro, 3Hyp und 4Hyp besteht, Xaa¹⁹ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Ala, Glu, Pro, 3Hyp und 4Hyp besteht, und Xaa¹¹ und Xaa²³ gleich oder unterschiedlich sein können und aus der Gruppe gewählt sind, welche aus Arg, Orn, Asp, His, Glu, Lys, Gln, Tyr, Thr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin, Trp, Met, Asn, Ser, Ala, Phe, Val, Ile, Leu, Pro, 3Hyp und 4Hyp besteht.
Stärker bevorzugte AMPPPs in Übereinstimmung mit den im Voraus beschriebenen Substitutionsderivaten schließen jene mit einer Aminosäuresequenz ein, worin Xaa⁶ Leu ist, Xaa⁷ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Phe, Ala, Met, Thr, Tyr, Gln, Lys, His und Arg besteht, Xaa⁸ eine Aminosäure ist, welche aus der Gruppe gewählt wird, die aus Ser, Ala, Met, Thr, Trp, Tyr, Gln, Lys, Asn, Glu, His, Asp und Arg besteht, Xaa¹⁰ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Gly, Leu, Val, Ala, Met, Thr, Ser, Trp, Tyr, Gln, Lys, Asn, Glu, His, Asp und Arg besteht, Xaa¹¹ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Met, Trp, Tyr, Gln, Lys, His, Ser und Arg besteht, Xaa¹³ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Ala, Gly, Leu, Ile, Trp, Phe und Val besteht, Xaa⁸ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Ala, Gly, Thr, Trp, Tyr, Asp, Glu, Lys, Arg, Gln, His und Met besteht, Xaa¹⁹ eine Aminosäure ist, welche aus der Gruppe gewählt wird, die aus Ala und Glu besteht, Xaa²¹ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Arg, Asp, His, Glu, Lys, Gln, Tyr, Thr, Trp, Met, Pro, 3Hyp, 4Hyp und Ala besteht, und Xaa²³ eine Aminosäure ist, welche aus der Gruppe gewählt wird, die aus Ser, Thr, Val, Ala, Leu, Ile, Trp, Phe, His, Gln, Pro, 3Hyp, 4Hyp und Tyr besteht.
Natürlich fallen die gerade eben beschriebenen bevorzugten und stärker bevorzugten AMPPPs unter die gleichen Maßgaben, wie es vorausgehend artikuliert wurde.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform in Übereinstimmung mit diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden AMPPPs bereitgestellt, welche Substitutionsderivate von Magainin 1 oder Magainin 2 sind, und welche so entworfen sind, dass sie besonders resistent gegenüber Pflanzen-Proteolyse sind. Diese Substitutionsderivate schließen allgemein mindestens eine Substitution an Xaa⁷, Xaa⁸ und/oder Xaa²¹ ein. Stärker bevorzugt ist Xaa⁷ eine Aminosäure, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Phe, Ala, His, Lys, Ser, Glu, Asp und Arg besteht, Xaa⁸ ist eine Aminosäure, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Thr, Ser, Ala, His, Asp und Glu besteht, und/oder Xaa²¹ ist eine Aminosäure, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Arg, Lys, His, Gln, Trp, Tyr, Thr, Val, Ala, Leu, Ile, Glu, Asp, Phe, Pro, 3Hyp, 4Hyp und Met besteht.
In Übereinstimmung mit einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Stoffzusammensetzung bereitgestellt, welche weder ein Substitutionsderivat von Magainin 1, noch ein Substitutionsderivat von Magainin 2 ist. Diese AMPPPs besitzen im Allgemeinen die Aminosäuresequenz:
Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Ala-Xaa-Xaa-Phe-Xaa-Lys-Ala-Phe-Val-Xaa-Xaa-Ile-Xaa-Xaa-Xaa
worin Xaa⁶, Xaa⁷, Xaa⁸, Xaa¹¹, Xaa¹³, Xaa¹⁸, Xaa¹⁹, Xaa²¹, Xaa²² und Xaa²³ gleich oder unterschiedlich sein können und aus der Gruppe gewählt werden, die aus Ala, Arg, Orn, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, 3Hyp, 4Hyp, Ser, Thr, Trp, Tyr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin und Val besteht, und worin Xaa¹⁰ aus der Gruppe gewählt wird, die aus Ala, Arg, Orn, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin und Val besteht, und worin, wenn Xaa²² Lys ist, Xaa¹⁰ nicht Gly sein kann, und wenn Xaa²² Asn ist, Xaa¹⁰ nicht Lys sein kann.
AMPPPs in Übereinstimmung mit diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung sind gleichartig hinsichtlich der Struktur zu Magainin 1, Magainin 2 und den bereits vorausgehend beschriebenen Substitutionsderivaten davon. Diese AMPPPs besitzen ebenfalls entweder eine spezifische oder breitgefächerte Aktivität gegen Pflanzenpathogene und können ebenfalls eine gesteigerte Resistenz gegenüber Pflanzen-Proteolyse haben und/oder können keine erhöhte Phytotoxizität besitzen.
In Übereinstimmung mit noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden AMPPPs bereitgestellt, welche eine Aminosäure einschließen, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Met und N-formyliertem Met "(f)Met", gebunden durch eine Peptidbindung an dem N-Terminus eines Peptids, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus einem AMPPP besteht, wobei eine oder mehrere Aminosäuren davon mit einer Aminosäure substituiert ist/sind, welche aus der Gruppe gewählt wird, die aus Ala, Arg, Orn, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin und Val besteht, und worin jede beliebige Aminosäure, außer der Aminosäure an der Position 10 des AMPPP, zusätzlich mit einer Aminosäure substituiert sein kann, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Pro, 3Hyp und 4Hyp besteht.
In Übereinstimmung mit einem stärker bevorzugten Aspekt der oben beschriebenen Erfindung besitzen AMPPPs Met oder (f)Met anhängig an dem Endterminus der Aminosäuresequenz:
Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Ala-Xaa-Xaa-Phe-Xaa-Lys-Ala-Phe-Val-Xaa-Xaa-Ile-Xaa-Xaa-Xaa
worin Xaa⁶, Xaa⁷, Xaa⁸, Xaa¹¹, Xaa¹³, Xaa⁸, Xaa¹⁹, Xaa²¹, Xaa²² und Xaa²³ gleich oder unterschiedlich sein können und aus der Gruppe gewählt werden, die aus Ala, Arg, Orn, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, 3Hyp, 4Hyp, Ser, Thr, Trp, Tyr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin und Val besteht, und worin Xaa¹⁰ aus der Gruppe gewählt wird, die aus Ala, Arg, Orn, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin und Val besteht.
Diese Met-AMPPPs und (f)Met-AMPPPs sind brauchbar bei der Hemmung von Pflanzenpathogenen insofern, als dass herausgefunden worden ist, dass diese Peptide eine spezifische und/oder Breitspektrumaktivität gegen Pflanzenpathogene beibehalten, und zwar trotz der Met- oder (f)Met-Verlängerung. Diese Peptide können zusätzlich eine verminderte proteolytische Empfindlichkeit gegenüber Pflanzenproteasen besitzen und/oder besitzen keine erhöhte Phytotoxizität. Diese Peptide können ebenfalls besonders brauchbar zur Einbringung in Pflanzen- oder bakterielle Zellen und für die genetische Expression in Zellen allgemein sein.
In Übereinstimmung mit einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Derivate mit einer Einzel-Rest-Auslassung eines AMPPP mit folgender Aminosäuresequenz bereitgestellt:
Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Ala-Xaa-Xaa-Phe-Xaa-Lys-Ala-Phe-Val-Xaa-Xaa-Ile-Xaa-Xaa-Xaa
worin Xaa⁶, Xaa⁷, Xaa⁸, Xaa¹¹, Xaa¹³, Xaa¹⁸, Xaa¹⁹, Xaa²¹, Xaa²² und Xaa²³ gleich oder unterschiedlich sein können und aus der Gruppe gewählt sind, die aus Ala, Arg, Orn, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, 3Hyp, 4Hyp, Ser, Thr, Trp, Tyr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin und Val besteht, und worin Xaa¹⁰ aus der Gruppe gewählt ist, die aus Ala, Arg, Orn, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin und Val besteht, und worin, wenn Xaa²² Lys ist, Xaa¹⁰ nicht Gly sein kann, und wenn Xaa²² Asn ist, Xaa¹⁰ nicht Lys sein kann.
Andere Peptide gemäß einem verwandten Aspekt der vorliegenden Erfindung schließen Derivate mit Doppel-Rest-Auslassungen eines AMPPP mit der folgenden Aminosäuresequenz ein:
Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Ala-Xaa-Xaa-Phe-Xaa-Lys-Ala-Phe-Val-Xaa-Xaa-Ile-Xaa-Xaa-Xaa
worin Xaa⁶, Xaa⁷, Xaa⁸, Xaa¹¹, Xaa¹³, Xaa¹⁸, Xaa¹⁹, Xaa²¹, Xaa²² und Xaa²³ gleich oder unterschiedlich sein können und aus der Gruppe gewählt werden, die aus Ala, Arg, Orn, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, 3Hyp, 4Hyp, Ser, Thr, Trp, Tyr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin und Val besteht, und worin Xaa¹⁰ aus der Gruppe gewählt wird, die aus Ala, Arg, Orn, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Ihr, Trp, Tyr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin und Val besteht, und worin, wenn Xaa²² Asn ist, Xaa¹⁰ nicht Lys sein darf.
Diese Derivate mit Einzel- oder Doppel-Rest-Auslassungen können ferner eine Aminosäure einschließen, welche aus der Gruppe gewählt wird, die aus Met und (f)Met besteht, gebunden durch eine Peptidbindung an den N-Terminus davon.
In Übereinstimmung mit einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Stoffzusammensetzung bereitgestellt, umfassend ein Peptid, das aus der Gruppe gewählt wird, die aus Einzel-Rest-Auslassungsderivaten eines Peptids mit einer Sequenz Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Ala-Gly-Xaa-Phe-Xaa-Lys-Ala-Phe-Val-Xaa-Xaa-Ile-Xaa-Lys-Xaa, dem Doppel-Rest-Auslassungsderivat eines Peptids mit der Sequenz Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Ala-Gly-Xaa-Phe-Xaa-Lys-Ala-Phe-Val-Xaa-Xaa-Ile-Xaa-Lys-Xaa, Einzel-Rest-Auslassungsderivaten eines Peptids mit der Sequenz Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Ala-Lys-Xaa-Phe-Xaa-Lys-Ala-Phe-Val-Xaa-Xaa-Ile-Xaa-Asn-Xaa und Doppel-Rest-Auslassungsderivaten eines Peptids mit der Sequenz Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Ala-Lys-Xaa-Phe-Xaa-Lys-Ala-Phe-Val-Xaa-Xaa-Ile-Xaa-Asn-Xaa besteht, wobei Xaa⁶, Xaa⁷, Xaa⁸, Xaa¹¹, Xaa¹³, Xaa¹⁸, Xaa²¹, Xaa²³ gleich oder unterschiedlich sein können und aus der Gruppe gewählt werden können, die aus Ala, Arg, Orn, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, 3Hyp, 4Hyp, Ser, Thr, Trp, Tyr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin und Val besteht, mit der Maßgabe, dass mindestens eine nicht-ausgelassene Position substituiert ist.
Diese AMPPPs mit einer einzelnen oder doppelten Auslassung an Resten können ebenfalls eine Aminosäure einschließen, welche aus der Gruppe gewählt ist, die aus Met und (f)Met, gebunden an dem N-Terminus davon durch eine Peptidbindung, besteht. Der Ausdruck "mindestens eine nicht-ausgelassene Position ist substituiert" soll AMPPPs in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung beschreiben, welche, wenn sie mit Magainin 1 und/oder Magainin 2 verglichen werden, mindestens eine Substitution in Ergänzung zu einer einzelnen oder doppelten Auslassung an Resten einschließen. Diese Peptide würden [Arg⁷, Des Lys²², Des Ser²³]Mag 1, [Des Gly¹, Glu⁸, Des Ser²³]Mag 1 und/oder [Ala¹³, Ala¹⁸, Des Met²¹]Mag 1 einschließen. In Bezug auf die AMPPPs in Übereinstimmung mit diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung muss mindestens eine Substitution bestehen bleiben, selbst nachdem Auslassungen vorgenommen wurden.
Die vorstehend beschriebenen AMPPPs, welche weder Magainin 1 noch Magainin 2 sind, schließen vorzugsweise eine Sequenz ein, wie sie hierin vorgesehen ist, worin Xaa²² eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Arg, Orn, Asp, His, Glu, Lys, Gln, Tyr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin, Trp, Met, Asn, Ala, Pro, 3Hyp, Ser, Thr und 4Hyp besteht, und worin Xaa⁶ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Asn, Pro, 3Hyp, 4Hyp, Ile und Leu besteht, Xaa⁷ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Phe, Ala, Met, Ser, Thr, Trp, Tyr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin, Gln, Pro, 3Hyp, 4Hyp, Lys, Asn, Glu, His, Asp, Orn und Arg besteht, Xaa⁸ eine Aminosäure ist, welche aus der Gruppe gewählt wird, die aus Ala, Met, Pro, 3Hyp, 4Hyp, Thr, Ser, Trp, Tyr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin, Gln, Lys, Asn, Glu, His, Asp, Orn und Arg besteht, Xaa¹⁰ eine Aminosäure ist, welche aus der Gruppe gewählt wird, die aus Gly, Leu, Ile, Val, Ala, Phe, Met, Thr, Ser, Trp, Tyr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin, Gln, Lys, Asn, Glu, His, Asp, Orn und Arg besteht, Xaa¹¹ eine Aminosäure ist, welche aus der Gruppe gewählt wird, die aus Met, Trp, Tyr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin, Gln, Lys, His, Pro, 3Hyp, 4Hyp, Ser, Orn und Arg besteht, Xaa¹³ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Leu, Ile, Trp, Phe, Val, Ala, Gly, Pro, 3Hyp und 4Hyp besteht, Xaa⁸ eine Aminosäure ist, welche aus der Gruppe gewählt, die aus Thr, Trp, Tyr, Asp, Glu, Lys, Arg, Gln, His, Met, Ala, Gly, Pro, 3Hyp und 4Hyp besteht, Xaa¹⁹ eine Aminosäure ist, welche aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Ala, Glu, Pro, 3Hyp und 4Hyp besteht, und Xaa²¹ und Xaa²³ gleich oder unterschiedlich sein können und aus der Gruppe gewählt werden, die aus Arg, Orn, Asp, His, Glu, Lys, Gln, Tyr, Thr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin, Trp, Met, Asn, Ser, Ala, Phe, Val, Ile, Leu, Pro, 3Hyp und 4Hyp besteht.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung haben AMPPPs eine Sequenz, in der Xaa²² eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Lys, Asn, Arg, Asp, His, Glu, Lys, Gln, Tyr, Thr, Trp, Met, Pro, 3Hyp, 4Hyp und Ala besteht, Xaa⁶ für Leu steht, Xaa⁷ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Phe, Ala, Met, Thr, Tyr, Gln, Lys, His und Arg besteht, Xaa⁸ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Ser, Ala, Met, Thr, Trp, Tyr, Gln, Lys, Asn, Glu, His, Asp und Arg besteht, Xaa¹⁰ eine Aminosäure ist, welche aus der Gruppe gewählt wird, die aus Gly, Leu, Val, Ala, Met, Thr, Ser, Trp, Tyr, Gln, Lys, Asn, Glu, His, Asp und Arg besteht, Xaa¹¹ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt, welche aus Met, Trp, Tyr, Gln, Lys, His, Ser und Arg besteht, Xaa¹³ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Ala, Gly, Leu, Ile, Trp, Phe und Val besteht, Xaa¹⁸ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Ala, Gly, Thr, Trp, Tyr, Asp, Glu, Lys, Arg, Gln, His und Met besteht, Xaa¹⁹ eine Aminosäure ist, welche aus der Gruppe gewählt wird, die aus Ala und Glu besteht, Xaa²¹ eine Aminosäure ist, welche aus der Gruppe gewählt wird, die aus Arg, Asp, His, Glu, Lys, Gln, Tyr, Thr, Trp, Met, Pro, 3Hyp, 4Hyp und Ala besteht, und Xaa²³ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Ser, Thr, Val, Ala, Leu, Ile, Trp, Phe, His, Gln, Pro, 3Hyp, 4Hyp und Tyr besteht.
In einem anderen bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung besitzen diese AMPPPs, einschließlich der Derivate mit Einzel- oder Doppel-Rest-Auslassungen, den Met- und (f)Met-AMPPPs und den Nicht-Magainin-1-,Nicht-Magainin 2-AMPPPs, oben beschrieben, vorzugsweise eine erhöhte Resistenz gegenüber einem Abbau durch eine oder mehrere Pflanzenproteasen. Diese stärker bevorzugten AMPPPs schließen im Allgemeinen mindestens eine Substitution an Xaa⁷, Xaa⁸, Xaa²¹ und/oder Xaa²² ein. Stärker bevorzugt ist Xaa⁷ eine Aminosäure, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Phe, Ala, His, Lys, Orn, Glu, Asp und Arg besteht, Xaa⁸ ist eine Aminosäure, welche aus der Gruppe gewählt wird, die aus Thr, Asp, Ser, Ala und Glu besteht, Xaa²¹ ist eine Aminosäure, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Arg, Lys, His, Gln, Trp, Tyr, Thr, Ala, Pro, 3Hyp, 4Hyp und Met besteht, und Xaa²² ist eine Aminosäure, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Arg, Lys, His, Gln, Trp, Tyr, Ser, 3,4-Dihydroxyphenylalanin, Thr, Pro, 3Hyp, 4Hyp, Val, Ala, Glu, Asp, Phe, Asn und Met besteht.
Es werden ebenfalls Peptide in Übereinstimmung mit einem Aspekt der vorliegenden Erfindung bereitgestellt, welche eine Aminosäure einschließen, die aus der Gruppe gewählt ist, welche aus Met und (f)Met besteht, gebunden durch eine Peptidbindung an den N-Terminus eines Peptids, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Einzel-Rest-Auslassungsderivaten eines Peptids mit einer Sequenz Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Ala-Gly-Xaa-Phe-Xaa-Lys-Ala-Phe-Val-Xaa-Xaa-Ile-Xaa-Lys-Xaa, Doppel-Rest-Auslassungsderivaten eines Peptids mit einer Sequenz Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Ala-Gly-Xaa-Phe-Xaa-Lys-Ala-Phe-Val-Xaa-Xaa-Ile-Xaa-Lys-Xaa, Einzel-Rest-Auslassungsderivaten eines Peptids mit einer Sequenz Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Ala-Lys-Xaa-Phe-Xaa-Lys-Ala-Phe-Val-Xaa-Xaa-Ile-Xaa-Asn-Xaa und Doppel-Rest-Auslassungsderivaten eines Peptids mit einer Sequenz Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Ala-Lys-Xaa-Phe-Xaa-Lys-Ala-Phe-Val-Xaa-Xaa-Ile-Xaa-Asn-Xaa, worin Xaa⁶, Xaa⁷, Xaa⁸, Xaa¹¹, Xaa¹³, Xaa¹⁸, Xaa¹⁹, Xaa²¹, Xaa²³ gleich oder unterschiedlich sein können und aus der Gruppe gewählt werden können, die aus Ala, Arg, Orn, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, 3Hyp, 4Hyp, Ser, Thr, Trp, Tyr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin und Val besteht.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine AMPPP-Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend ein Peptid mit etwa 18 bis etwa 23 Aminosäureresten, wobei das Peptid so substituiert ist, dass es gegenüber einem Abbau durch mindestens eine Pflanzenprotease resistent ist.
Genauer gesagt, wird eine Stoffzusammensetzung bereitgestellt, welche ein Peptid mit etwa 18 bis etwa 23 Aminosäureresten einschließt, wobei das Peptid ein Derivat eines Peptids mit folgender Aminosäuresequenz ist:
Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Ala-Xaa-Xaa-Phe-Xaa-Lys-Ala-Phe-Val-Xaa-Xaa-Ile-Xaa-Xaa-Xaa
worin Xaa⁶, Xaa⁷, Xaa⁸, Xaa¹¹, Xaa¹³, Xaa¹⁸, Xaa¹⁹, Xaa²¹, Xaa²² und Xaa²³ gleich oder unterschiedlich sein können und aus der Gruppe gewählt werden, die aus: Ala, Arg, Orn, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, 3Hyp, 4Hyp, Ser, Thr, Trp, Tyr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin und Val besteht, und worin Xaa¹⁰ aus der Gruppe gewählt wird, die aus Ala, Arg, Orn, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin und Val besteht, wobei das Peptid so substituiert ist, dass es gegenüber einem proteolytischen Abbau durch mindestens eine Pflanzenprotease resistent ist.
Ein weiterer bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Vorsehung eines Oligonukleotids, welches spezifisch angepasst ist, um ein beliebiges der vorangehend beschriebenen AMPPPs zu exprimieren.
Zum Beispiel können Magainin 1-Substitutionsderivate durch ein Oligonukleotid mit der folgenden Nukleotidsequenz exprimiert werden:
GGNATHGGNA ARTTYNNNN NNNNGCNNNN NNNTTYNNNA 40
ARGCNTTYGT NNNNNNNATH NNNAARNNN 69
worin C Cytosin ist, A Adenin ist, G Guanin ist, T Thymin ist, H eine Variable ist, welche Adenin, Cytosin oder Thymin jedoch nicht Guanin sein kann, R Adenin oder Guanin sein kann, Y Cytosin oder Thymin sein kann, und N Adenin, Cytosin, Guanin oder Thymin sein kann, und worin N16-N18, N19-N21, N22-N24, N31-N33, N37-N39, N52-N54, N55-N57, N61-N63 und N67-N69 kooperieren, um eine Aminosäure zu codieren, welche gleich oder unterschiedlich sein kann und aus der Gruppe gewählt wird, die aus Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr und Val besteht, und worin N28-N30 kooperieren, um eine Aminosäure zu codieren, die aus der Gruppe gewählt ist, welche aus Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr und Val besteht, mit der Maßgabe, dass das Oligonukleotid nicht Magainin 1 codieren darf.
Magainin 2-Substitutionsderivate können durch ein Oligonukleotid mit folgender Nukleotidsequenz exprimiert werden:
GGNATHGGNA ARTTYNNNNN NNNNGCNNNN NNNTTYNNNA 40
ARGCNTTYGT NNNNNNNATH NNNAAYNNN 69
worin N16-N18, N19-N21, N22-N24, N31-N33, N37-N39, N52-N54, N55-N57, N61-N63 und N67-N69 kooperieren, um eine Aminosäure zu codieren, welche gleich oder unterschiedlich sein kann und aus der Gruppe gewählt ist, die aus Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr und Val besteht, und worin N28-N30 kooperieren, um eine Aminosäure zu codieren, die aus der Gruppe gewählt ist, welche aus Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr und Val besteht, mit den Maßgaben, dass das Oligonukleotid nicht Magainin 2, Magainin 2, substituiert nur an der Position 21, Magainin 2, substituiert nur an mindestens zwei der Positionen 8, 13 oder 18 mit Ala, codiert, und mit der weiteren Maßgabe, dass das Peptid nicht Magainin 2, welches nur mit einem einzelnen Ala substituiert ist.
In entsprechender Weise können AMPPPs, welche nicht Magainin 1 oder Magainin 2 sind, wie vorausgehend beschrieben, durch ein Oligonukleotid mit der folgenden Nukleotidsequenz exprimiert werden:
GGNATHGGNA ARTTYNNNNN NNNNGCNNNN NNNTTYNNNA 40
ARGCNTTYGT NNNNNNNATH NNNNNNNNN 69
worin N16-N18, N19-N21, N22-N24, N31-N33, N37-N39, N52-N54, N55-N57, N61-N63, N64-N66, N67-N69 kooperieren, wodurch eine Aminosäure codiert wird, welche gleich oder unterschiedlich sein kann und aus der Gruppe gewählt wird, die aus Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr und Val besteht, und worin N28-N30 kooperieren unter Codierung einer Aminosäure, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe. Ser, Thr, Trp, Tyr und Val besteht, mit der Maßgabe, dass, wenn N64-N66 kooperieren unter Codierung der Aminosäure Lys, N28-N30 nicht unter Codierung der Aminosäure Gly kooperieren können, und wenn N64-N66 unter Codierung der Aminosäure Asn kooperieren, N28-N30 nicht unter Codierung der Aminosäure Lys kooperieren können.
Met- und (f)Met-AMPPPs in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung können exprimiert werden durch eine erste Vielzahl von Nukleotiden, welche unter Codierung einer Aminosäure kooperieren, welche aus der Gruppe gewählt ist, die aus Met und (f)Met besteht, wobei die erste Vielzahl von Nukleotiden durch eine Phosphodiesterbindung an eine zweite Vielzahl von Nukleotiden gebunden ist, welche unter Codierung eines AMPPP kooperieren, worin eine oder mehrere Aminosäure(n) davon mit einer Aminosäure substituiert sind, die aus der Gruppe gewählt ist, welche aus Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr und Val besteht, und worin eine beliebige andere Aminosäure als die Aminosäure an der Position 10 der Substitutionsderivate von Magainin 1 oder Magainin 2 zusätzlich durch Pro substituiert sein kann.
Eine Einzelrest-Auslassung aufweisende Derivate von AMPPPs in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung werden durch ein Trinukleotid-Auslassungsderivat eines Oligonukleotids mit der folgenden Nukleotidsequenz exprimiert:
GGNATHGGNA ARTTYNNNNN NNNNGCNNNN NNNTTYNNNA 40
ARGCNTTYGT NNNNNNNATH NNNNNNNNN 69
worin N16-N18, N19-N21, N22-N24, N31-N33, N37-N39, N52-N54, N55-N57, N61-N63, N64-N66, N67-N69 kooperieren unter Codierung einer Aminosäure, welche gleich oder unterschiedlich sind und aus der Gruppe gewählt werden können, die aus Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr und Val besteht, und worin N28-N30 unter Codierung einer Aminosäure kooperieren, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr und Val besteht, und mit der Maßgabe, dass wenn N64-N66 unter Codierung der Aminosäure Lys kooperieren, N28-N30 nicht unter Codierung der Aminosäure Gly kooperieren können, und wenn N64-N66 unter Codierung der Aminosäure Asn kooperieren, N28-N30 nicht unter Codierung der Aminosäure Lys kooperieren können.
Doppel-Rest-Auslassungsderivate von AMPPPs in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung werden durch ein Derivat mit sechs Nukleotidauslassungen eines Oligonukleotids mit der folgenden Sequenz exprimiert:
GGNATHGGNA ARTTYNNNNN NNNNGCNNNN NNNTTYNNNA 40
ARGCNTTYGT NNNNNNNATHNNNNNNNNN 69
worin N16-N18, N19-N21, N22-N24, N31-N33, N37-N39, N52-N54, N55-N57, N61-N63, N64-N66, N67-N69 kooperieren unter Codierung einer Aminosäure, welche gleich oder unterschiedlich sein können und aus der Gruppe gewählt sind, die aus Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr und Val besteht, und worin N28-N30 kooperieren unter Codierung einer Aminosäure, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr und Val besteht, und mit der Maßgabe, dass wenn N64-N66 kooperieren unter Codierung der Aminosäure Asn, N28-N30 nicht zur Codierung der Aminosäure Lys kooperieren können.
Die (f)Met- und Met-Derivate der vorstehend erwähnten Peptide können ebenfalls durch die Addition einer Vielzahl von Nukleotiden, welche unter Codierung dieser Aminosäuren kooperieren können, an die vorstehend erwähnten Oligonukleotide exprimiert werden. Diese können durch eine Phosphodiesterbindung verknüpft werden. In entsprechender Weise können in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung die Met- und (f)Met-Verlängerungen der Einzel- und Doppel-Rest-Auslassungsderivate von AMPPPs ebenfalls durch ein entsprechendes Trinukleotid-Auslassungsderivat oder ein Sechs-Nukleotid-Auslassungsderivat eines Oligonukleotids mit der folgenden Nukleotidsequenz exprimiert werden:
GGNATHGGNA ARTTYNNNNN NNNNGCNNNN NNNTTYNNNA 40
ARGCNTTYGT NNNNNNNATH NNNNNNNN 69
worin N16-N18, N19-N21, N22-N24, N31-N33, N37-N39, N52-N54, N55-N57, N61-N63 und N67-N69 unter Codierung einer Aminosäure kooperieren können, welche gleich oder unterschiedlich sein kann, und die Aminosäure wird aus der Gruppe gewählt, welche aus Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Glu, Gly, His, Ile, Lev, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr und Val besteht, und worin N28-N30 unter Codierung einer Aminosäure kooperieren, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Gly und Lys besteht, und N64-N66 unter Codierung einer Aminosäure kooperieren, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Lys und Asn besteht.
In Übereinstimmung mit einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Hemmung des Überlebens oder des Wachstums von Pflanzenpathogenen bereitgestellt, welches die Schritte der Bereitstellung mindestens eines AMPPP in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung oder Mischungen von einer Vielzahl von solchen AMPPPs in einer Menge, die zur Hemmung des Überlebens oder Wachstums von mindestens einem Pflanzenpathogen wirksam ist, und das Kontaktieren des Pathogens damit einschließt. Unter dem Ausdruck "Menge, die zur Hemmung mindestens eines Pflanzenpathogens wirksam ist" ist zu verstehen, dass, obwohl die wirksame Menge wahrscheinlich durch das Verfahren der Anwendung beeinflusst wird, es erwartet wird, dass die wirksame Menge normalerweise im Bereich von 1-100 Mikrogramm/ml liegt.
In Übereinstimmung mit einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird hierdurch ein biologisches Screening-Reagens bereitgestellt, welches für die Bestimmung der Resistenz einer Verbindung gegenüber einem proteolytischen Abbau brauchbar ist, umfassend mindestens eine im Wesentliche reine Pflanzenprotease in einer Menge, die wirksam ist, um einen mindestens 50%igen Abbau der Verbindung in etwa fünf Stunden zu verursachen, wobei der Rest Wasser ist. Diese proteolytischen Lösungen werden entworfen, um eine Protease enthaltende Umgebung innerhalb des extrazellulären Raums einer Pflanzenzelle genau nachzuahmen. Deshalb kann das Reagens verwendet werden, um eine genauere Abschätzung der relativen proteolytischen Empfindlichkeit eines spezifischen Peptids in vivo bereitzustellen. Das Reagens kann ebenfalls die proteolytische Aktivität von Pflanzenpathogenen simulieren und kann verwendet werden, um AMPPPs zu behandeln, um den Grad ihres Abbaus zu bestimmen.
Ein Verfahren zur Herstellung dieser Reagenzien aus Zellen, die innerhalb eines flüssigen Kulturmediums enthalten sind, in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, wird ebenfalls bereitgestellt und schließt die Schritte des Abtrennens von Zellen aus einem flüssigen Kulturmedium und das Sammeln des Mediums, welches mindestens eine extrazelluläre Pflanzenprotease enthält, ein. Dieses Verfahren besitzt mehrere Vorteile. Am wichtigsten ist jedoch die Tatsache, dass dieses Verfahren angewandt werden kann, um nicht nur die extrazelluläre Proteasen enthaltenden Lösungen aus Pflanzenzellen sondern ebenfalls die extrazelluläre Proteasen enthaltenden Lösungen aus Pflanzenpathogenen, wie Pilzen und Bakterien, zu erhalten.
Dieser Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt ebenfalls die Verwendung des oben beschriebenen Reagens ein, um die Resistenz einer Verbindung gegenüber einem Abbau durch mindestens eine Pflanzenprotease zu bestimmen. Dieses Verfahren schließt die Schritte der Bereitstellung einer Quelle einer Verbindung, die zu screenen ist, das Inkubieren der Verbindung mit dem biologischen Screening-Reagens der vorliegenden Erfindung, aufweisend etwa 0,05 Teile pro Million Wasser bis etwa ein Teil pro Tausend Wasser an mindestens einer Protease, während einer vorbestimmten Zeit, das Abbrechen der Reaktion durch Inaktivieren des Reagens und das Analysieren der resultierenden Verbindung ein.
"AMPPP" ist ein Akronym für antimikrobielles Peptid, welches gegen Pflanzenpathogene aktiv ist, welches, wie hierin definiert, ein Protein oder Peptid mit mindestens antifungaler und/oder antibakterieller Aktivität ist. Obgleich der Begriff breitere Anwendung für eine oder mehrere gesamte Familien von antimikrobiellen Peptiden besitzen kann, schließt der Begriff AMPPP, wie hierin verwendet, Magainin 1-, Magainin 2- und Magaininderivat-Zusammensetzungen, die vorzugsweise 18 bis 24 Aminosäuren aufweisen, ein. Im Allgemeinen besitzen AMPPPs in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung die folgende Sequenz:
(I)

Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Ala-Xaa-Xaa-Phe-Xaa-Lys-Ala-Phe-Val-Xaa-Xaa-Ile-Xaa-Xaa-Xaa

"Xaa", wie in der obigen Sequenz verwendet, gibt eine Variable an, so dass jede beliebige einer gewählten Gruppe an Aminosäuren hierin positioniert werden kann. Ferner wird "Xaaⁿ" verwendet, um nicht nur die Variable anzugeben, sondern auch, um die relative Position dieser Variablen oder die Aminosäuren, welche die Variable repräsentiert, anzugeben (d. h. "n" repräsentiert die Position oder die Aminosäure an der nten Position). Somit repräsentiert Xaa⁶ die Variable in der 6. Position des AMPPP mit der Sequenz (I). Die "n"te Position ist relativ zu dem N-terminalen Ende des Peptids, welches für gewöhnlich Glycin (Gly) ist. Wenn das vorstehend erwähnte Peptid der Sequenz (I) ferner ein Methionin (Met) oder N-formyliertes Met (f)Met, gebunden durch eine Peptidbindung an dem N-terminalen Glycin, einschließt, behält die Variable Xaa⁶ ihre Nomenklatur und ihre Position relativ zu dem N-terminalen Glycin bei. In ähnlicher Weise, wenn das N-terminale Glycin weggelassen wird, sodass die Variable Xaa⁶ der 5. Rest in dem resultierenden Peptid ist, wird sie nichtsdestotrotz immer noch als Xaa⁶ bezeichnet (IleGlyLysPheXaa..., Xaa ist immer noch Xaa⁶). Wenn man mit solchen Begriffen arbeitet, ist Magainin 1 ein spezifisches AMPPP, in dem Xaa⁶ Leucin (Leu) ist, Xaa⁷ Histidin (His) ist, Xaa⁸ Serin (Ser) ist, Xaa¹⁰ Glycin (Gly) ist, Xaa¹¹ Lysin (Lys) ist, Xaa¹³ und Xaa¹⁸ Glycin (Gly) sind, Xaa¹⁹ Glutaminsäure (Glu) ist, Xaa²¹ Methionin (Met) ist, Xaa²² Lysin (Lys) ist und Xaa²³ Serin (Ser) ist. Magainin 2 ist strukturell dem Magainin 1 ähnlich, außer dass Xaa¹⁰ Lysin (Lys) ist und Xaa²² Asparagin (Asn) ist.
In entsprechender Weise schließt die vorliegende Erfindung die Desoxyribonukleinsäuren und/oder Ribonukleinsäuren (DNA und/oder RNA) ein, welche Oligonukleotide sind, die zur Exprimierung der AMPPPs der vorliegenden Erfindung in der Lage sind und welche die folgende Nukleotidbasensequenz enthalten:
(II)

GGNATHGGNA ARTTYNNNNN NNNNGCNNNN NNNTTYNNNA 40
ARGCNTTYGT NNNNNNNATH NNNNNNNNN 69

Wenn RNA das fragliche Oligonukleotid ist, steht T für die Pyrimidinbase Uracil. Wie allgemein bekannt ist, werden Oligonukleotide wie DNA in Codons, oder Dreiergruppen, gelesen. Das heißt, es ist die Kombination der Information, die in drei benachbarten Nukleotiden enthalten ist, welche den Typ der Aminosäure bestimmt, welche in die spezifische und entsprechende Position des codierten Peptids eingebaut wird. Zum Beispiel codiert das Codon GGN, welches die ersten drei Nukleotide der Oligonukleotidsequenz II einschließt, die Aminosäure Gly, welche die N-terminale Aminosäure der Peptide in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ist. Deshalb versteht es sich, dass Gruppen von drei Nukleotiden kooperieren, um spezifische Aminosäuren zu codieren. Ferner wird der Ausdruck "Nn", worin "n" der Positionszahl des Nukleotids von 1 bis 69 in der Oligonukleotidsequenz (II) entspricht, verwendet, um variable Nukleotide zu identifizieren, welche mit anderen Nukleotiden in einem Codon kooperieren können, um eine Vielzahl von Aminosäuren zu codieren. Somit repräsentiert N16-N18 ein spezifisches Codon, welches die Aminosäure in der Position Xaa⁶ des resultierenden exprimierten Peptids codieren wird.
Der Ausdruck "Substitutionsderivate von Magainin 1 oder Magainin 2" oder "Deletionsderivate von Magainin 1 oder Magainin 2" sind im Allgemeinen mit dem Ausdruck "AMPPP", wie im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendet, synonym. Der Ausdruck "Substitutionsderivat" schließt nicht nur Peptide ein, wie sie vorstehend beschrieben worden sind worin mindestens eines von Xaa⁶, Xaa⁷, Xaa⁸, Xaa¹⁰, Xaa¹¹, Xaa¹³, Xaa¹⁸, Xaa¹⁹, Xaa²¹, Xaa²² und Xaa²³ substituiert ist, sondern er kann auch Peptide mit 21 bis 24 Aminosäuren Länge mit Substitutionen in einer beliebigen der anderen Positionen einschließen.
Der Ausdruck "Substitution" soll Zusammensetzungen definieren, in welchen mindestens einer der 18-24 Reste in entweder Magainin 1, Magainin 2 oder Nicht-Magainin 1, Nicht-Magainin 2, Magainin-artigen Peptiden, die in der vorliegenden Erfindung beinhaltet sind, oder den Einzel- oder Doppel-Rest-Auslassungsderivaten davon absichtlich von seiner ansonsten natürlichen Struktur und Anordnung, wie vorstehend beschrieben, abgeändert wird/werden. Veranschaulichende Beispiele für Substitutionsderivate würden [Arg⁷, Glu⁸]-Mag 1 (worin Mag 1 sich auf Magainin 1 bezieht), [Lys⁷, Glu⁸, Des Lys²², Des Ser²³]-Mag 1, Ala¹⁹]-Mag 1, Arg⁷, Des Met²¹]-Mag 1,[Phe⁷, Ala¹³, Ala¹⁸]-Mag 2, [Lys⁷]-Mag 2, [Arg⁷ [Ala¹⁹]-Mag 1 [Arg⁷, Des Met²¹]-Mag¹,[Phe⁷, Ala¹³, Ala¹⁸]-Mag 2, [Lys⁷]-Mag 2, [Arg⁷]-Mag 2, [Met¹ Glu⁸]-Mag 2 und dergleichen einschließen.
Der Ausdruck "Derivat", wie er hierin verwendet wird, schließt AMPPPs mit etwa 18 bis etwa 23 Aminosäureresten Länge ein. Diese Peptide sind bis auf die Abwesenheit von bis zu fünf Aminosäuren die gleichen sowohl hinsichtlich Sequenz als auch hinsichtlich der Reihenfolge wie die vollständigen AMPPPs mit 23 Resten in Übereinstimmung hiermit. Da die Auslassung oder Deletion von bis zu fünf Aminosäuren in einer beliebigen der 23 Positionen der Peptide mit der allgemeinen Sequenz II vorliegen kann, und zwar bis zu dem Ausmaß, wie solche Deletionen vorgenommen werden, ist es zweckdienlicher und gängiger, die AMPPP-Gegenstücke mit 23 Resten so zu beschreiben, dass vorausgehend die Angabe erfolgt, welche Auslassungen vorgenommen wurden. Veranschaulichende Beispiele solcher AMPPP-Derivate sind [Des Gly¹, Des Ile², Des Gly³, Des Lys⁴, Ala¹³, Ala¹⁸, Des Ser²³]Mag 1 und [Des Gly¹, Des Ile², Des Gly³, Des Lys⁴, Des Phe⁵, Ala¹⁹]Mag 2. "Derivat" bedeutet nicht notwendigerweise, dass das AMPPP zuerst konstruiert wird und dann spezifische Deletionen vorgenommen werden. Der Ausdruck schließt ebenfalls AMPPPs ein, welche mit weniger als 23 Resten konstruiert werden.
Bei den Ausdrücken "Derivat mit einer einzelnen Auslassung an Resten", "Einzelauslassungsderivat" und "Einzel-Rest-Deletionsderivat" wird beabsichtigt, dass AMPPPs mit 22 Resten Länge eingeschlossen sind. Diese sind Peptide, welche mit Ausnahme der Auslassung von einem der 23 Reste, wenn sie mit Magainin 1, Magainin 2 oder Nicht-Magainin 1, Nicht-Magainin 2, Magainin-artigen Peptiden, die in der vorliegenden Erfindung beinhaltet sind, oder Substitutionsderivaten davon verglichen werden, in ihrer Struktur und Sequenz zu ihrem natürlich vorkommenden Gegenstück identisch sind. Da die Auslassung oder Deletion in einer beliebigen der 23 Positionen des Stamm-AMPPP vorliegen kann, ist es zweckdienlicher und gängiger, das AMPPP-Gegenstück mit 23 Resten so zu beschreiben, dass vorangehend angegeben wird, welche Auslassung eines einzelnen Restes vorgenommen wurde. Zum Beispiel wird das Deletionsderivat von Magainin 2, bei welchem der Rest 5 ausgelassen ist, durch die Nomenklatur [Des Phe⁵]-Magainin 2 beschrieben, worin "Des" für eine Deletion steht. In entsprechender Weise wird das Deletionsderivat eines Magainins 2, welches mit Arg an der Position 7 substituiert ist, welches den Rest 5 auslässt, durch die Nomenklatur [Des Phe⁵, Arg⁷]-Magainin 2 beschrieben.
Trotz der Tatsache, dass zum Beispiel ein 23-Reste-AMPPP die Verwendung von Pro in der Position 11 (Xaa¹¹ = Pro) angeben kann, kann das Einzel-Rest-Auslassungsderivat davon den Rest an der Position 11 ausschließen. In einem solchen Fall würde die beschreibende Nomenklatur, welche zur Anwendung kommen würde, zum Beispiel [Des Xaa¹¹]-AMPPP sein, worin AMPPP das Peptid-Gegenstück zu diesem Einzel-Rest-Auslassungsderivat (wobei das Gegenstück selbst ein Substitutions- und/oder Einzel-Rest-Auslassungsderivat sein könnte) bezeichnen würde, von dem der Rest an der Position 11 deletiert worden ist.
In entsprechender Weise bezeichnet der Ausdruck "Trinukleotid-Auslassungsderivat eines Oligonukleotids" ein Oligonukleotid, das entworfen wurde, um ein AMPPP zu exprimieren, welches ein Einzel-Rest-Auslassungsderivat ist, wie im Voraus definiert. Da Oligonukleotide als Codons funktionell sind, ist es notwendig, dass das gesamte Codon aus drei Nukleotiden aus der Sequenz eliminiert wird, um die Expression einer bestimmten Aminosäure zu verhindern und sicherzustellen, dass der Leserahmen der verbleibenden Sequenzen der gleiche bleibt. Ein veranschaulichendes Beispiel eines Trinukleotid-Auslassungsderivats eines Oligonukleotids innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung ist das Oligonukleotid mit der folgenden Sequenz:
(III)

GGAATAGGAA AGTTTCTGCA CTCAGCAG ARGTTTGGAA 40
AGGCATTTGT GGGAGAGATA ATGAAG 66 welches das Peptid [Des Ser²³]-Mag 1 codiert.

Die Ausdrücke "Doppel-Auslassungsderivat" oder "Doppel-Rest-Auslassungsderivat" werden in der gleichen Weise verwendet, wie die Ausdrücke "Einzel-Auslassungsderivate" oder "Derivate mit Einzel-Rest-Auslassung" und sollen AMPPPs mit 21 Resten Länge einschließen. Auslassungen von Aminosäureresten in Doppel-Rest-Auslassungsderivaten können aufeinanderfolgend sein, so dass zum Beispiel die Reste 22 und 23 (Xaa²²-Xaa²³) ausgelassen werden, oder sie können gestaffelt sein, so dass zum Beispiel der Rest 9 (Ala) und der Rest 17 (Val) gleichzeitig ausgelassen werden.
Der Ausdruck "Sechs-Nukleotid-Auslassungsderivat eines Oligonukleotids" bezeichnet ein Oligonukleotid, das entworfen wurde, um ein AMPPP zu exprimieren, welches ein Doppel-Rest-Auslassungsderivat ist. Mit Bezug auf die Oligonukleotidsequenz (III) würde die weitere Auslassung der Nukleotide 64, 65 und 66 zu einem Oligonukleotid führen, welches das Peptid [Des Lys²², Des Ser²³]-Magainin 1 codiert.
AMPPPs in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung können in vorteilhafter Weise entweder durch eine traditionelle chemische Synthese oder durch ein oder mehrere Verfahren der Einführung von spezifischem DNA-Material, welches genetisch ein oder mehrere AMPPPs codiert, in eine Wirtszelle und Ermöglichen, dass die Zelle das gewünschte Peptid exprimiert, hergestellt werden.
Im Hinblick auf die traditionelle chemische Synthese können AMPPPs gemäß der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von irgendeiner der bekannten Peptidsynthesevorschriften, wie jenen, die beschrieben sind in "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology"; Band 2 – "Special Methods in Peptide Synthesis, Teil A", E. Gross und J. Meienhofer, Herausgeber, Academic Press, New York, 1980, und Band 9 – "Special Methods in Peptide Synthesis, Teil C", S. Udenfriend und J. Meienhofer, Herausgeber, Academic Press, San Diego, 1987, synthetisiert werden.
Bevorzugt zur Verwendung in dieser Erfindung für die chemische Synthese von Peptiden sind Festphasentechniken, weil sie die schnelle Synthese von hochreinen Peptiden erlauben. In derartigen Verfahren werden Peptide, vorzugsweise eine Aminosäure auf einmal, auf einem unlöslichen Polymerträger (genannt ein Harz) beginnend vom C-Terminus des Peptids synthetisiert. Eine Synthese wird begonnen, indem durch eine chemische Verknüpfungsgruppe, wie ein Amid oder ein Ester, die C-terminale Aminosäure des Peptids an das Harz geknüpft wird. Falls letztere als ein Ester an das Harz geknüpft ist, wird das resultierende Peptid eine C-terminale Carbonsäure sein; im Fall der Verknüpfung als ein Amid wird das resultierende Peptid ein C-terminales Amid sein. Bei den XTAA wie auch allen anderen in der Peptidsynthese verwendeten Aminosäuren müssen deren alpha-Aminogruppen- und Seitenkettenfunktionalitäten (sofern vorhanden) differentiell als Derivate, die während der Synthese selektiv entfernt (entschützt) werden können, geschützt vorliegen. Die Synthese (Kopplung) wird durchgeführt, indem eine aktivierte Form einer Aminosäure, wie ihr symmetrisches Anhydrid oder ein aktiver Ester, mit der nicht blockierten alpha-Aminogruppe der N-terminalen Aminosäure, die an das Harz geknüpft ist, umgesetzt wird. Die Abfolge des Entschützens derartiger alpha-Aminogruppen, gefolgt von der Kopplung wird wiederholt, bis die gesamte Peptidkette aufgebaut ist. Die Gesamtheit der in dem Peptid vorliegenden Funktionalitäten wird entschützt, und das Peptid wird von dem Harz abgespalten, üblicherweise in Anwesenheit von Abfangmittel genannten Substanzen, die Nebenreaktionen mit dem Peptid während des Verfahrens inhibieren. Das resultierende Peptid wird dann mittels einer Reihe von Techniken, wie Gelfiltration, Ionenaustausch- und Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) gereinigt. Während der Spaltungs- und Reinigungsprozesse kann das Peptid in irgendeine einer Anzahl von Säuresalzformen, gebunden an die am N-Terminus und in jedweden Lysinen, Argininen, Histidinen oder Ornithinen des Peptids vorliegenden Aminogruppen, umgewandelt werden, und folglich wird das resultierende reine Peptid üblicherweise in der Form eines derartigen Salzes erhalten.
Für die Verwendung in dieser Erfindung sind Festphasentechniken vom Merrifield-Typ bevorzugt, wie in G. Barany und R. B. Merrifield, "Solid-Phase Peptide Synthesis", The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Band 2, Kapitel 1, S. 3-284; und in J. M. Stewart und J. D. Young in "Solid-Phase Peptide Synthesis, 2. Ausgabe", Pierce Chemical Company, Rockford, I11., 1984, beschrieben. Im Allgemeinen kann eine beliebige Standardseitengruppenschutzstrategie vorteilhaft verwendet werden, obwohl Strategien mit t-Boc (tert-Butyloxycarbonyl; siehe zum Beispiel Barany und Merrifield, und Steward und Young, oben) und FMOC (9-Fluorenylmethoxycarbonyl; siehe zum Beispiel E. Atherton und R.C. Sheppard in "The Fluorenylmethoxycarbonyl Amino Protecting Group", oben, Band 9, Kapitel 1, S. 1-38) bevorzugt sind.
Die Synthesen von Peptidharzen, die als Vorstufen für eine C-terminale Carbonsäure enthaltende Peptide benötigt werden, werden typischerweise auf kommerziell erhältlichen vernetzten Polystyrol- oder Polyamidpolymerharzen begonnen, wie Chlormethyl, Hydroxymethyl, Aminomethyl, PAM (Phenylacetamidomethyl), HMP (p-Hydroxymethylphenoxyessigsäure), p-Benzyloxybenzylalkohol, Hycram (4-Bromcrotonyl-beta-alanylamidomethyl; Advanced Chemtech, Inc., Louisville, KY), oder Sasrin (2-Methoxy-4-alkoxybenzylalkohol; Bachem Bioscience, Inc., Philadelphia, PA). Die Kopplung von Aminosäuren kann entweder unter Verwendung von symmetrischen Anhydriden, hergestellt beispielsweise aus DCC (Dicyclohexylcarbodiimid), HOBT (1-Hydroxybenzotriazol), aktiven, zum Beispiel aus DCC/HOBT produzierten Estern, oder beipielsweise aus verschiedenen BOP-Reagentien (siehe zum Beispiel J. Coste et al., "BOP and Congeners: Present Status and New Developments", Proceedings of the Eleventh American Peptide Symposium; Peptides: Chemistry, Structure and Biology, J. E. Rivier und G. R. Marshall, Herausgeber, ESCOM, Leiden, Niederlande, 1990, S. 885-888) in Lösungsmitteln wie DCM (Dichlormethan), TFE (Trifluorethanol) enthaltendem DCM, DMF (N,N-Dimethylformamid), NMP (N-Methylpyrrolidon), oder DMSO (Dimethylsulfoxid) enthaltendem NMP erreicht werden.
Bevorzugt für die Verwendung in dieser Erfindung sind die Kopplung von symmetrischen Anhydriden von t-geschützten Aminosäuren, ausgenommen Arginin (Arg), Asparagin (Asn), Glutamin (Gln) und Histidin (His), welche vorzugsweise als aus DCC/HOBT hergestellte aktive HOBT-Ester gekoppelt werden, auf PAM-Harzen in DMF oder DMF/DCM-Lösungen und die Kopplung von via DCC/HOBT hergestellten aktiven HOBT-Estern von FMOC-geschützten Aminosäuren auf HMP-Polystyrolharzen in NMP-Lösungen.
Am meisten bevorzugt für die Verwendung in dieser Erfindung ist die Kopplung von via DCC/HOBT hergestellten aktiven HOBT-Estern von t-Boc-geschützten Aminosäuren auf PAM-Harzen zunächst in NMP, danach in einer 80/20-Lösung von NMP/DMSO und schließlich in einer 80/20-Lösung von NMP/DMSO, welche 1,9 mmol DIEA/0,5 mmol PAM-Harz enthält.
Die Synthese von Peptid-Harzen als Vorstufen von ein C-terminales Amid enthaltenden Peptiden kann unter Anwendung der zuvor beschriebenen Verfahrensweisen in zufriedenstellender Weise erreicht werden. Es kann jedoch ein Polymerträger, wie Benzhydrylamin(BHA)- oder 4-Methylbenzhydrylamin(MBHA)-Polystyrolharze, verwendet werden. Bevorzugt für die Verwendung gemäß dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung, d.h., der Herstellung von AMPPPs mit einer an den C-Terminus gebundenen Amidogruppe, sind 4-Methylbenzhydrylamin-Polystyrolharze.
Viele Arten von Seitenkettenschutzgruppen können entweder für die t-Boc- oder die FMOC-Festphasensynthese verwendet werden, wie beispielsweise beschrieben von Barany und Merrifield, oben, Gross und Meienhofer, "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology," Band 3 – "Protection of Functional Groups in Peptide Synthesis", Academic Press, New York, 1981, und Stewart und Young, oben, für t-Boc-Aminosäuren, und von Atherton und Sheppard, oben, für FMOC-Aminosäuren.
Bevorzugt für die Verwendung in dieser Erfindung für t-Boc-Aminosäuren sind MTS (Mesitylen-2-sulfonyl) für Arginin, OBzl (Benzylester) für Asparaginsäure, 4-MeBzl (4-Methylbenzylthioether) für Cystein, Bzl₂ (Dibenzyldiether) für 3,4-Dihydroxyphenylalanin, OBzl für Glutaminsäure, Bom (Benzyloxymethyl) oder Z (Benzyloxycarbonyl) für Histidin, Bzl für sowohl 3- wie auch 4-Hydroxyprolin, Cl-Z (2-Chlorbenzyloxycarbonyl) für sowohl Lysin wie auch Ornithin, Bzl für sowohl Serin wie auch Threonin, CHO (Formyl) für Tryptophan und Br-Z (2-Brombenzyloxycarbonyl) für Tyrosin. Methionin kann in Form seines Sulfoxids, Met(O), geschützt sein, wird aber vorzugsweise ungeschützt verwendet.
AMPPPS in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung können entweder unter Verwendung von automatisierten Geräten oder manuellen Techniken synthetisiert werden. Automatisierte Techniken werden allerdings bevorzugt. Alle der in dieser Erfindung beschriebenen Beispiele von AMPPPs wurden tatsächlich unter Verwendung eines automatisierten Peptid-Synthesizers, Modell 430A, von Applied Biosystems, Inc. (ABI) hergestellt, wobei die t-Boc-Vorschriften, die in dem Anwenderhandbuch für den Peptid-Synthesizer, Modell 430A, von Applied Biosystems, Version 1.30, Abschnitt 6, Applied Biosystems, Foster City, CA, Februar 1987 (durchgesehen November 1987 und Oktober 1987), beschrieben sind, zur Anwendung kamen.
Gemäß diesen Protokollen werden die Peptide auf den Harzen ausgehend vom C-Terminus der Peptide aufgebaut. PAM- oder HMP-Harze, die für die Synthese von C-terminalen Carbonsäuren erforderlich sind, können von ABI oder anderen Herstellern bereits gekoppelt an die alpha-Aminosäure und C-terminale Aminosäure mit geschützter Seitenkette käuflich erworben werden. Jedoch muss bei der Präparation C-terminaler Carboxyamide die C-terminale Aminosäure zunächst entweder an BHA- oder MBHA-Harz gekoppelt werden. In jedem Fall wird das Harz, welches die alpha-Aminosäure und die C-terminale Aminosäure mit geschützter Seitenkette enthält, in das Reaktionsgefäß eingebracht, und die Peptidkette wird vorzugsweise mit einer Aminosäure auf einmal (der Aufbau von Peptidfragmenten ist möglich, ist aber üblicherweise für die in dieser Erfindung beschriebenen AMPPPs weniger bevorzugt) durch eine sich wiederholende Abfolge von Entschützung der alpha-Aminogruppe der N-terminalen Aminosäure, die an das Harz geknüpft ist, und Kopplung der nächsten Aminosäure daran, die ebenfalls eine alpha-Aminosäure und Seitenketten-geschützt ist, aufgebaut.
Die Abfolge von Entschützung der alpha-Aminogruppe der N-terminalen Aminosäure, gefolgt von der Kopplung der nächsten geschützten Aminosäure wird fortgesetzt, bis die gewünschte Peptidkette aufgebaut ist. Das resultierende N-terminal- und Seitenketten-geschützte Peptid, geknüpft an ein Polymerträgerharz, wird dann dem geeigneten Entschützungs- und Abspaltungsverfahren unterzogen, um das ungeschützte Peptid zu ergeben, üblicherweise als N-terminale Säuresalze von Lysin, Histidin und Ornithin.
Die Synthesen wurden unter Verwendung von t-Boc-Schutzstrategien durchgeführt, wobei mit 0,5 mmol des Harzes mit der C-terminalen Aminosäure und 2,0 mmol der t-BOC-Aminosäure mit geschützter Seitenkette in den Kopplungsschritten begonnen wurde. Diese Mengen sind jedoch nicht kritisch und proportional größere und kleinere Mengen können verwendet werden, abhängig von dem verwendeten Typ des automatisierten Instruments oder der manuellen Apparatur. Zum Beispiel wurden von den Erfindern Synthesen unter Verwendung des ABI-Instruments durchgeführt, bei denen so wenig wie 0,1 mmol und so viel wie 0,6 mmol des Aminosäure-PAM-Harzes eingesetzt wurden. Obwohl ein molares Verhältnis der zu koppelnden Aminosäure zu der Aminosäure oder dem Peptid, die/das an das PAM-Harz geknüpft ist, von 4,0 bei Verwendung dieses Instruments bevorzugt ist, können größere oder kleinere Verhältnisse benutzt werden. So niedrige Verhältnisse wie 3,33 (0,6 mmol PAM-Harz/2,0 mmol Aminosäure) wurden ohne irgendeinen signifikanten Abfall in den Kopplungsleistungen verwendet. Niedrigere Verhältnisse können genutzt werden, um die Menge des pro Durchlauf hergestellten Peptids zu erhöhen, werden jedoch weniger bevorzugt, weil die Kopplungseffizienz und damit die Peptidreinheit niedriger sein können. Höhere Verhältnisse sind allgemein nicht bevorzugt, weil sie nicht länger effizient sind.
Bei Synthesen, die auf t-Boc-Schutzstrategien in DMF beruhen, wird die Entschützung der alpha-Aminogruppen bei Umgebungstemperatur unter Einsatz von TFA/DCM, gefolgt von Neutralisierung mit DIEA/DMF vorgenommen. Symmetrische Anhydride werden aus DCC in DCM gebildet, ausgenommen bei Leucin, Methioninsulfoxid, Tryptophan und Formyltryptophan, die in 10% DMF in DCM gebildet werden. Nach der Filtration des Nebenprodukts DCU (N,N-Dicyclohexylharnstoff) wird das DCM verdampft und durch DMF ersetzt, während die Temperatur auf 10-15°C gehalten wird. Für unter Anwendung dieser Vorschrift synthetisierte AMPPPs wurden Aminosäuren doppelt gekoppelt, nachdem die Länge der wachsenden Peptidkette neun Aminosäuren überschritt. In diesen Fällen wird die DCM-Lösung nach Filtration direkt im nächsten Schritt eingesetzt. Aktive HOBT-Ester werden für Asparagin, Glutamin und geschütztes Histidin aus der Reaktion von DCC mit HOBT, enthaltend 8-10% v/v DCM, und von Arginin(MTS) aus der Reaktion von DCC mit HOBT, enthaltend 25-30% v/v DCM, gebildet. Nach Filtration des Nebenprodukts DCM werden die Lösungen des aktiven HOBT-Esters direkt im nächsten Schritt ohne Entfernung des DCM verwendet. Diese vier Aminosäuren werden immer doppelt gekoppelt, wobei das gleiche Verfahren angewendet wird.
Sobald entweder das symmetrische Aminosäureanhydrid oder der aktive HOBT-Ester im geeigneten Lösungsmittel hergestellt ist, wird die Lösung in das Reaktionsgefäß überführt und mit dem am N-terminalen alpha-Amin entschützten Peptidharz geschüttelt. Die Kopplung findet während dieses Zeitabschnitts statt, der anfangs von 18-26 Minuten für symmetrische Anhydride bis zu 26-42 Minuten für aktive HOBT-Ester reicht. Die Kopplungsdauer wird graduell mit der Verlängerung der Peptidkette vergrößert. Beispielsweise wird nach 15 Aminosäuren ein zusätzlicher 10-Minuten-Zeitraum hinzugefügt. Die Kopplungen werden anfangs bei den Temperaturen durchgeführt, bei denen die symmetrischen Anhydride gebildet werden, aber während der Kopplungsdauer wird graduell Umgebungstemperatur erreicht. Bei der Vollendung der Kopplungsdauer wird das Harz mit DCM gewaschen, eine Probe für die Ninhydrin-Überwachung (siehe Sarin et al., "Quantitative Monitoring of Solid-Phase Peptide Synthesis by the Ninhydrin Reaction", Anal. Biochem. 117, (1981), 147-157) wird entnommen, und danach zur Vorbereitung für den nächsten Kopplungszyklus getrocknet.
Bei auf t-Boc-Schutzstrategien in NMP beruhenden Synthesen wird die Entschützung der alpha-Aminogruppen wie oben vorgenommen, mit der Ausnahme, dass die Neutralisation überschüssiger TFA durch Waschungen mit DIEA/DCM, DIEA/NMP und NMP allein bewerkstelligt wird. Alle Aminosäuren werden in aktive HOBT-Ester umgewandelt, indem jeweils 1,0 Äquivalent von DCC, HOBT und einer N-terminal und Seitenketten-geschützten Aminosäure in NMP während etwa 40-60 Minuten bei Umgebungstemperatur umgesetzt wird. Nach Filtration des Nebenprodukts DCU werden die Lösungen des aktiven HOBT-Esters direkt in der Kopplungsreaktion eingesetzt. Die Kopplung wird bei Umgebungstemperatur während 30 Minuten in DMP, weitere 16 Minuten lang nach Zugabe von ausreichend DMSO, um eine 20:80-Lösung von DMSO in NMP zu ergeben, und schließlich weitere sieben Minuten lang nach der Zugabe von 1,9 mmol DIEA durchgeführt. So wie die Länge der Peptidkette zunimmt, werden längere Kopplungszeiten verwendet. Nachdem beispielsweise die Peptidkette 15 Aminosäuren erreicht hat, wird die Kopplungszeit um 15 Minuten zugenommen haben. Doppelte Kopplungszyklen werden in gleicher Weise wie die einfachen Kopplungszyklen durchgeführt, wurden jedoch im Allgemeinen nur für Lys⁴ oder das Äquivalent bei Magainin-Peptiden verwendet. Bei der Vollendung der Kopplungszyklen werden nicht-umgesetzte, am Peptidharz verbleibende Aminogruppen mit einer Kappe versehen, indem sie mit einer Lösung von 10% Essigsäureanhydrid und 5% DIEA in DCM zwei Minuten lang behandelt werden, gefolgt von Schütteln mit 10% Essigsäureanhydrid in DCM während vier Minuten. Nach gründlichem Waschen mit DCM wird wie oben eine Probe des Harzes für die Ninhydrin-Überwachung der Kopplungseffizienz entnommen, und es wird dann zur Vorbereitung des nächsten Kopplungszyklus getrocknet. Die Kopplungseffizienzen unter Verwendung von entweder DMF oder NMP waren stets größer als 98% und in den meisten Fällen größer als 99%.
AMPPPs gemäß der vorliegenden Erfindung können ebenfalls erfolgreich unter Verwendung der FMOC-Chemie durchgeführt werden, die hierin beschrieben und auf einem ABI-Peptidsynthesizer, Modell 430A, verfügbar ist (K. M. Otteson, "Recent Developments with NMP Chemistry" in "Is Protein Chemistry an Art or a Science?", Applied Biosystems, FASEB Meeting, New Orleans, April, 1989). Ebenso hat S. Nozaki, "Solid Phase Synthesis of Magainin 1 Under Continous Flow Conditions", Chemistry Lett., (1989), 749-752, ein Verfahren zum Synthetisieren von Magainin 1 unter Verwendung von HMP-Harz und eines automatisierten, dem hierin beschriebenen sehr ähnlichen FMOC-Verfahrens im Detail beschrieben.
Obwohl alle der hierin beschriebenen Peptide individuell hergestellt werden können, ist es manchmal wünschenswert und zweckdienlich, mehrere Peptide gleichzeitig herzustellen. Verfahren für die Ausführung derartiger Synthesen sind in der Literatur gut bekannt und kommerzielle Instrumente für die Durchführung solcher Aufgaben sind ebenfalls verfügbar.
Zum Beispiel berichten Cuervo et al., "The Magainins: Sequence Factors Relevant to Increased Antimicrobial Activity and Decreased Hemolytic Activity", oben, und "Synthesis and Antimicrobial Activity of Magainin Alanine Substitution Analogues", oben, über die simultane Präparation von Alanin-Auslassungs- und Substitutionsanalogen von C-terminalen Amiden und Carbonsäuren von Magainin 1 und Magainin 2 unter Verwendung des SMPS(Simultane Multiple Peptidsynthese)-Verfahrens mit t-Boc-geschützten Aminosäuren sowohl auf PAM- als auch 4-Methylbenzhydrylaminharzen. Auch F. S. Tjoeng, et al., "Multiple Peptide Synthesis Using a Single Support (MPS3), Int. J. Peptide Protein Res. 35, (1990), 141-146, stellten gleichzeitig Magainin 2-Analoga, die mit einer Vielfalt von Aminosäuren an der Position 21 substituiert waren, unter Verwendung einer manuellen Synthese von t-Boc-geschützten Aminosäuren und PAM-Harzen her. In derselben Veröffentlichung zeigten diese Autoren jedoch auch, dass das Verfahren unter Einsatz eines ABI-Peptidsynthesizers, Modell 430A, für die simultane Synthese von 11-substituierten Analoga von Schweine-Angiotensinogen-Peptid automatisiert werden konnte.
Verfahren, ähnlich jenen, die in der zuvor erwähnten Veröffentlichung offenbart sind, sind spezifisch in der Praxis der vorliegenden Erfindung angewendet worden. In Übereinstimmung hiermit nutzte eine bevorzugte Technik t-Boc-Aminosäuren, PAM-Harze und DCC/HOBT-Kopplungen in NMP-NMP/DMSO für die simultane Synthese von drei Magainin-Substitutionsanaloga. Eine größere Anzahl von Substitutionsanaloga kann simultan gekoppelt werden, aber die Trennung der resultierenden Peptide wird schwieriger, und die Ausbeute an jedem resultierendem Peptid nimmt ab.
Bei der praktischen Ausführung der vorliegenden Erfindung ist es möglich gewesen, Abschnitte von einer Reihe von AMPPPs, die lange gemeinsame Segmente aufweisen, simultan zu synthetisieren. Zum Beispiel können AMPPPs, die sich lediglich am C-Terminus in Substitution oder Kettenlänge unterscheiden, simultan synthetisiert werden, indem PAM-Harze, die die unterschiedlichen C-terminalen Sequenzen enthalten, miteinander vermischt werden und dann die gemeinsamen Aminosäuresegmente in der üblichen Weise simultan sequentiell auf die Mischung von Harzen gekoppelt werden. Für diesen Zweck ist die Verwendung der aktiven HOBT-Ester, die unter Verwendung von DCC/HOBT in NMP-NMP/DMSO unter Einsatz von t-Boc-Aminosäuren auf PAM-Harzen hergestellt werden, das bevorzugte Verfahren.
In ähnlicher Weise können große Segmente von AMPPPs, die sich vorwiegend an dem N-Terminus unterscheiden, simultan synthetisiert werden, indem zunächst das Peptid-PAM-Harz hergestellt wird, das die gemeinsame C-terminale Kette enthält, bis die erste unterschiedliche Aminosäure am N-Terminus erreicht ist. Das Peptidharz wird dann in getrennte Gefäße aufgeteilt, und jede individuelle Peptidsynthese unabhängig fortgesetzt. Die zwei wachsenden Peptidharze können bis zur Vollendung gekoppelt werden oder in einer späteren Stufe der Peptidsynthese weiter aufgeteilt werden, wenn andere wünschenswerte Verzweigungsstellen erreicht werden. Für die Verwendung bei multiplen Peptidsynthesen innerhalb des Umfangs dieser Erfindung sind t-Boc-Protokolle auf PAM-Harzen unter Einsatz von DCC/HOBT-Kopplungen in NMP-NMP/DMSO bevorzugt. Um die Menge an produziertem Peptid-Harz zu steigern, können eher 0,6 mmol als standardmäßig 0,5 mmol Harz bei multiplen Peptidsynthesen ohne einen Verlust an Kopplungseffizienz eingesetzt werden.
Die Peptide, die als Vorstufen entweder für C-terminale Carbonsäuren oder Amidpeptide erhalten werden, können entschützt werden und von den Harzen abgespalten werden unter Verwendung irgendeiner der gut bekannten, in der Literatur beschriebenen Standardverfahrensweisen (siehe zum Beispiel, Barany und Merrified, oben; Stewart et al., oben; J. P. Tam und R. B. Merrifield in "Strong Acid Deprotection of Synthetic Peptides: Mechanisms and Methods", ("The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Band 9, Kapitel 5, S. 185-248); und Applied Biosystems, "Strategies in Peptide Synthesis-Introduction to Cleavage Techniques", Applied Biosystems, 1990. Für t-Boc-Peptid-Harze zum Beispiel schließen sie standardmäßiges wasserfreies HF (Fluorwasserstoff), HF von niedrig bis hoch, TFMSA (Trifluormethansulfonsäure) und TMSOTf (Trimethylsilyltrifluormethansulfonat). Allerdings werden Verfahren mit standardmäßigem HF und mit niedrigem-hohem HF für die Anwendung in dieser Erfindung für die Entschützung und Abspaltung von t-Boc-Peptidharzen bevorzugt. Es ist auch bevorzugt, dass die N-terminale t-Boc-Schutzgruppe entfernt wird, bevor das Peptid der HF-Entschützung und -Abspaltung unterzogen wird.
Die Abspaltung und Entschützung von t-Boc-Peptid-PAM-Harzen unter Einsatz der Bedingungen für „standardmäßiges" wasserfreies HF wird im Allgemeinen gemäß den in den oben zitierten Referenzen angegebenen Verfahrensweisen durchgeführt. Typischerweise wird etwa 1 g des Peptidharzes für etwa 50-90 Min. bei –5°C bis 0°C in einer Lösung von 10-12 ml von wasserfreiem HF, enthaltend 1,0 ml Anisol, 0,4 ml Dimethylsulfid (DMS), 0,2-0,4 ml 1,2-Ethandithiol und 3 mg 2-Mercaptopyridin als Abfangmittel, gerührt. Geringfügige Variationen in den Mengen der vorhandenen Abfangmittel beeinträchtigen die Ergebnisse nicht substanziell, und andere Abfangmittel, so wie diejenigen, die in den oben zitierten Literaturreferenzen beschrieben sind, können verwendet werden (beispielsweise sollten auch 3 mg Skatol für Tryptophan enthaltende Peptide zugesetzt werden). Es wird jedoch bevorzugt, dass die oben spezifizierten Reaktionszeiten und -temperaturen verwendet werden, weil kürzere Reaktionszeiten oder niedrigere Reaktionstemperaturen zu unvollständiger Entschützung oder Abspaltung führen können, während höhere Reaktionstemperaturen das Auftreten von Nebenreaktionen verursachen können. Längere Reaktionszeiten sind im Allgemeinen nicht vorteilhaft und können zu Nebenreaktionen führen, obwohl in bestimmten Fällen, zum Beispiel wenn ein mit einer Tosylgruppe geschütztes Arginin oder mehrere Arginine in der Peptidkette vorliegen, Reaktionszeiten von bis zu zwei Stunden erforderlich sein können, um eine vollständigere Entschützung herbeizuführen. Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Durchführung des HF-Verfahrens ist dasjenige von Immuno-Dynamics Inc., La Jolla, CA. In diesem Verfahren wird die HF/Abfangmittel/Peptidharz-Mischung zunächst während 30 Minuten bei –10°C und dann 30 Minuten bei 0°C (5 Minuten länger pro Arginin bei 0°C) gerührt.
Das Verfahren mit „niedrig-hoch" wasserfreiem HF kann für die Entschützung und Abspaltung von irgendeinem der in dieser Erfindung beschriebenen Peptidharze angewandt werden, um Nebenreaktionen, wie die Methioninalkylierung, zu minimieren, ist aber insbesondere für die Entschützung and Abspaltung der Peptidharzmischungen, die von der simultanen Synthese mehrerer Peptide hergestellt werden, bevorzugt. Das bevorzugte Verfahren, dem gefolgt wird, ist grundsätzlich dasjenige, das von J. P. Tam et al. in "SN₂ Deprotection of Synthetic Peptides with a Low Concentration of HF in Dimethyl Sulfide: Evidence and Application in Peptide Synthesis", J. Am. Chem. Soc. 105, (1983), 6442-6455, und Tam und Merrifield, siehe oben, beschrieben ist, und beinhaltet das Rühren von etwa 1 g des Peptidharzes während etwa zwei Stunden bei –5°C bis 0°C in einer Lösung von 10-20 ml (10-12 ml sind bevorzugt) von wasserfreiem HF/Dimethylsulfid/p-Kresol im Verhältnis 2,5:6,5:1 (falls das Peptidharz Trp(For) enthält, wird anstattdessen eine Lösung von wasserfreiem HF/Dimethylsulfid/p-Kresol/Thiokresol im Verhältnis 10:26:3:1 verwendet). Das HF und das DMS werden dann bei etwa –5°C bis 0°C unter Vakuum entfernt, und 10 ml frisches wasserfreies HF werden zugesetzt. Die "Hoch"- oder "Standard"-Abspaltung wird danach durchgeführt, indem die Mischung während zusätzlicher 45-90 Minuten bei –5°C bis 0°C gerührt wird. Ein stärker bevorzugtes Verfahren zur Durchführung dieser "Hoch"-HF-Entschützung ist dasjenige von Immuno-Dynamics Inc. Bei diesem Verfahren werden 1 ml Anisol, 0,4 ml DMS, 0,4 ml 1,2-Ethandithiol und 3 mg 2-Mercaptopyridin zusammen mit den 10 ml des frischen wasserfreien HF zugefügt, und die Mischung wird dann 30 Minuten lang bei –10°C und 30 Minuten bei 0°C (5 Minuten länger pro Arginin bei 0°C) gerührt.
Nach Vollendung von entweder dem "Standard"- oder dem "Niedrig-hoch"-HF-Entschützungs- und Abspaltungsverfahren werden HF und jedwedes verbleibendes DMS vollständig unter Vakuum bei –5°C bis 0°C verdampft. Die resultierende Peptidharz-Abfangmittel-Mischung wird dann mit etwa 10-15 ml Diethylether, Ethylacetat oder dergleichen (das Volumen ist unkritisch, Diethylether ist bevorzugt) gemischt, filtriert und der Rückstand nochmals 2-4 mal mit etwa 10-15 ml Diethylether, Ethylacetat oder dergleichen (das Volumen ist unkritisch, Diethylether ist bevorzugt) gewaschen, um organische Abfangmittel zu entfernen. An diesem Punkt ist es bevorzugt, den Rückstand für 30 Minuten mit 5 ml 2-Mercaptoethanol (BME) zu rühren, um Methioninsulfoxide zu Methioninen zu reduzieren. Das Peptid wird dann dreimal mit 25-30 ml an 10-30%-iger Essigsäure, die 2% BME enthält, extrahiert, die Extrakte werden vereinigt, mit Wasser verdünnt (falls erforderlich), um eine Endkonzentration der Essigsäure von 10% oder weniger zu ergeben, und danach bis zur Trockenheit lyophilisiert (gefriergetrocknet). Das Gewicht des erhaltenen rohen Peptids liegt üblicherweise im Bereich zwischen 50-90%.
Nach Vollendung des "Niedrig-hoch"-HF-Abspaltungs- und Entschützungsvorgehens besteht ein bevorzugtes Verfahren zur Extraktion des Peptids in demjenigen, das von Immuno-Dynamics Inc. verwendet wird. Bei dieser Verfahrensweise wird die Peptid/Harz-Mischung, nach Verdampfung des HF und DMS, mit Chloroform zum Quellen gebracht, mit 3 × 10 ml Ether gewaschen und 20-30 Minuten lang mit 5 ml BME gerührt. Anschließend wird die Mischung dreimal mit 25-30 ml von 1:1 10-30%-ige Essigsäure/BME extrahiert (manchmal ist eine zusätzliche Extraktion mit 20-30 ml an 50%-igem wässrigem Acetonitril, enthaltend 0,1% TFA, vorteilhaft). Die Extrakte werden dann vereinigt und dreimal mit 20 ml Ether zur Entfernung verbleibender Abfangmittel extrahiert, und das Peptid wird durch Lyophilisation der wässrigen Essigsäure/(Acetonitril)/BME-Schicht rückgewonnen.
Die aus den HF-Entschützungs-Abspaltungsverfahren erhaltenen rohen Peptide liegen als N-terminale Lysin-, Arginin-, Histidin- und Ornithin-Fluorwasserstoffsalze und wahrscheinlich auch kontaminiert mit anderen Fluoridsalzen und Abfangmitteln vor (falls andere Entschützungs-Schemata, wie Trifluormethansulfonsäure, verwendet werden, werden anstattdessen andere anorganische Salze, wie Trifluormethansulfonate, vorliegen). Solche Peptide oder anorganischen Salze sind nicht wünschenswert, weil sie alleine oder in Anwesenheit von Feuchtigkeit als starke Säuren wirken können, die entweder das Peptid zersetzen können oder toxisch für eine Pflanze sind. Es ist daher vorzuziehen, das Peptid von derartigen Salzen durch weitere Reinigung zu befreien, wodurch auch ein Peptid mit höherer Aktivität pro Gewichtseinheit bereitgestellt wird. Ein bevorzugtes Verfahren zur Reinigung des Peptids besteht darin, die Fluoridsalze durch Anionenaustauschchromatographie zu entfernen und es dann durch HPLC (Hochleistungsflüssigchromatographie) zu isolieren.
Bei typischer Durchführung in der Ausführung dieser Erfindung sehen Anionenaustauschchromatographie- oder FMOC-Vorschriften die AMPPPs als Acetatsalze vor, während HPLC die AMPPPs als Trifluoracetatsalze zur Verfügung stellt.
Mittels FMOC-Techniken präparierte Peptide können entschützt und von den Harzen abgespalten werden, indem 1-1,5 Stunden lang bei 20-25°C etwa 1 g des Peptid-Harzes mit einer TFA-Abfangmittel-Lösung gerührt wird, die entweder aus TFA/Anisol im Verhältnis 8:1, 95%-iger wässeriger TFA, 10 ml TFA, enthaltend 0,75 g kristallines Phenol, 0,25 ml EDT, 0,5 ml Thioanisol und 0,5 ml Wasser, oder 9,5 ml TFA, enthaltend 0,25 ml EDT und 0,25 ml Wasser (siehe Applied Biosystems, "Introduction to Cleavage Techniques, S. 6-19, oben, und Nozaki in "Solid Phase Synthesis of Magainin 1 Under Continous Flow Conditions", oben) zubereitet wird. Die Peptide werden dann als N-terminate Lysin-, Arginin-Histidin- und Ornithin-Trifluoracetatsalze isoliert, die möglicherweise auch mit anderen Trifluoracetatsalzen und Abfangmitteln kontaminiert sind. Obwohl diese Trifluoracetatsalze nicht so unerwünscht wie Fluorwasserstoff oder Trifluormethansulfonatsalze sind, ist es vorzuziehen, das Peptid von derartigen Salzen durch weitere Reinigung zu befreien, wobei die zuvor spezifizierten Methoden für die entsprechenden Fluorwasserstoffsalze, oben, angewandt werden, wodurch ebenfalls ein Peptid mit höherer Aktivität pro Gewichtseinheit bereitgestellt wird.
Ein typisches Verfahren zur Ausführung der Ionenaustauschchromatographie besteht darin, das rohe Peptid in einem minimalen Volumen von 5-30%-iger Essigsäure zu lösen (die höheren Essigsäurekonzentrationen werden für die hydrophoberen Peptide benötigt), jedwedes restliche unlösliche Material abzufiltrieren (wie eingeschlossenes Harz) und die Lösung durch ein Anionenaustauschharz, wie BioRad AGI-X-8 (Acetatform) (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) in 5-30%-iger Essigsäure, laufen zu lassen. Die resultierenden Peptidfraktionen, nachgewiesen durch einen Ninhydrintest (Sarin et al., oben) werden vereinigt und lyophilisiert, um die Peptide als N-terminale Lysin-, Arginin-, Histidin- und Ornithin-Acetatsalze, frei von anorganischen Verunreinigungen aber möglicherweise noch Abfangmittel enthaltend, vorzusehen. Die auf diese Weise erhaltenen Peptide sind 50-80% rein, gemäß HPLC-Analyse (siehe unten), und sind in dieser Form hochwirksam bei der Zerstörung von Pflanzenpathogenen. Ein Peptid mit einer etwas höheren Aktivität pro Gewichtseinheit kann erhalten werden, entweder vor oder nach dem Anionenaustausch-Verfahren, indem die Peptidsalze mit einer schwachen Base, wie 5-10%-igem Ammoniumbikarbonat oder 6M Guanidinhydrochlorid, behandelt werden, um jedwede N→O-Acylverschiebung umzukehren, die in Peptiden, die Serine und/oder Threonine enthalten, unter den sauren Abspaltungsbedingungen aufgetreten ist. Typischerweise wird dies bewerkstelligt, indem das Peptidsalz in 5-10%-igem Ammoniumbikarbonat aufgelöst wird, die Lösung über Nacht bei 15-25°C stehen gelassen wird, und dann das Peptid durch Lyophilisation rückgewonnen wird.
In manchen Fällen, insbesondere wenn Methionin in Form seiner Sulfoxide während des Peptidkettenaufbaus geschützt war, ist es von Vorteil, die Peptidmischung erneut mit einem Reduktionsmittel zu behandeln, um jedwede verbleibenden Methioninsulfoxide zurück zu Methionin zu reduzieren. Obwohl viele Reagentien für diesen Zweck in der Literatur beschrieben sind, wie DTT (Dithiothreitol) und DTE (Dithioerythritol), wird MMA (N-Methylmercaptoacetamid) bevorzugt. Die Reduktion wird typischerweise durchgeführt, indem eine Lösung von 1 bis 5 mg/l Peptid in einer etwa 10%(w/v)-igen Lösung von MMA in 10-30%-iger Essigsäure für 12-48 Stunden bei 20-40°C unter einer Stickstoffatmosphäre unter Befolgung des Verfahrens von A. Culwell in "Reduction of Methionin Sulfoxide in Peptides Using N-Methylmercaptoacetamide" (MMA), Applied Biosystems Peptide Synthesizer Bulletin Nr. 17, (1987), Foster City, CA, inkubiert wird. Die Reduktion kann mittels HPLC verfolgt und die Inkubation angehalten werden, wenn die Reduktion vollständig ist. Die Reduktion der Methioninsulfoxide zu Methionin ist nicht erforderlich, weil die Erfinder gezeigt haben, dass solche Methioninsulfoxid enthaltende Peptide Aktivität gegen Pflanzenpathogene besitzen, aber Peptide mit einer höheren Aktivität pro Gewichtseinheit können durch Ausführung des Reduktionsverfahrens erhalten werden. In den Fällen, in denen die Peptide mit MMA behandelt worden sind, werden überschüssiges MMA und assoziierte Nebenprodukte entfernt, indem eine Lösung der Peptidmischung in 5-30%iger Essigsäure durch eine Sephadex G25-Säule (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc., Piscataway, NJ) laufen gelassen und der Ausfluss bei 254 nm überwacht wird.
Die Peptid enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und durch Lyophilisierung getrocknet.
Peptide mit der höchsten Aktivität pro Gewichtseinheit werden durch weiteres Reinigen dieser mittels HPLC (Hochleistungs-Flüssigchromatographie) erhalten. Typischerweise werden die Peptide mittels Umkehrphasen-HPLC gereinigt, indem 15-30 mg des in 1-2 ml 0,1 % TFA (Trifluoressigsäure) gelösten Peptids auf eine 2,2 × 25 cm große 10 Mikron-30 Ångström-Vydak C-4-Säule injiziert wurden und mit verschiedenen Gradienten aus Acetonitril und Wasser, die 0,1 % TFA enthielten, eluiert wurde. Die auf diese Weise erhaltenen Peptide sind N-terminale, Lysin-, Arginin-, Histidin- und Ornithin-Trifluoressigsäuresalze, welche im Allgemeinen gemäß der HPLC-Integration bei 215 nm rein zu mehr als 95 % sind. Es wird eine analytische HPLC der Peptidfraktionen auf einer 0,46 × 25 cm großen 10 Mikron-300 Ångström-Vydak C-4-Säule unter Anwendung der folgenden Elutionsbedingungen durchgeführt: linearer Gradient von 0-60 % B in A über 30 min; Flussrate = 1,0 ml/min; Lösungsmittel A = 0,1 % wässriges TFA; Lösungsmittel B = 0,1 % TFA in Acetonitril; Überwachen mittels UV-Absorption bei 215 nm.
Die Strukturen der Peptide wurden in den meisten Fällen durch Aminosäure- oder Massenspektralanalyse bestätigt. Die Aminosäureanalyse von Peptiden wurde durchgeführt, gefolgt von einer Hydrolyse mit 6 N Chlorwasserstoffsäure bei 100°C während 24 Stunden mittels HPLC unter Verwendung eines Beckman System Gold-Aminosäure-Analysators (Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA) auf einer Ionenaustauschsäule (zum Beispiel einer Beckman Spherogel AA-Li⁺-Kationenaustauschsäule) unter Verwendung der Ninhydrindetektion. Eine Aminosäureanalyse wurde ebenfalls durch Immuno-Dynamics durchgeführt, welche die Aminosäuren als PTC (Phenylthiocarbamyl)-Derivate auf einem Waters Associates Pico-Tag-System (Millipone Corporation, Bedford, MA) detektierte.
Die Aminosäureanalyse der Peptide wurde ebenfalls unter Verwendung von Peptidharzen nach der Prozedur von F. Westall et al. in "Fifteen Minute Acid Hydrolysis of Peptides", Anal. Biochem., 61, (1974), 610-613, erhalten. In diesen Fällen wird das Peptidharz mittels 1:1 Chlorwasserstoffsäure/Propionsäure anstelle von Chlorwasserstoffsäure allein hydrolysiert. Die resultierende Mischung wird durch ein 0,45-Mikron-Nylonfilter unter Anwendung von 2 bis 4 Volumina Wasser zum Waschen filtriert, das Filtrat wird lyophilisiert und der Rückstand wird wie oben analysiert.
Eine FAB-MS (Fast-Atom-Bombardment-Massenspektroskopie) der Peptide wurde unter Verwendung eines Kratos MS5ORF-Massenspektrometers erhalten, das mit einer Ion Tech B11NF-Sattelfeld-Kanone, die bei 8 kV und einem Strom von 40 Mikroampere betrieben wurde, ausgestattet war, unter Verwendung von Xenon, um energetische Ionen zu erzeugen. Spektren wurden von einer Lösung erhalten, die durch Mischen von 1 Mikroliter einer 4-mM-Lösung des Peptids mit 1 Mikroliter 90%igem Glycerol in 40 mm Oxalsäure auf dem Kupfer-Target der Probensonde hergestellt wurde. Das Instrument wurde mit Cäsiumiodid kalibriert, es wurde bei einer Rate von 5 bis 10 Sekunden pro Scan von einem Massenbereich von etwa 500 Atommasseneinheiten oberhalb und unterhalb der erwarteten Masse gescannt, und die Daten wurden mit Mehrkanal-Analysator-Programmen, die auf einem DS90-Datensystem verfügbar waren, gesammelt, um (M+H)⁺-Fragmente bereitzustellen.
Genetische Synthese und Reinigung von AMPPP
Wie bereits früher angemerkt, können AMPPPs ebenfalls hergestellt werden, indem in eine Wirtszelle eine Desoxyribonukleotid- oder DNA-Gensequenz, wie jene der Formeln II und III, die ein oder mehrere AMPPPs codieren, mit geeigneten regulatorischen Signalen, wie einer Genpromotorsequenz und einem Genterminator oder einer Polyadenylierungssequenz, die einer solchen Gensequenz anhängig ist, eingeführt wird und eine Exprimierung der Gensequenzen, die AMPPPs codieren, in einer solchen Wirtszelle durch biologische Prozesse zur Proteinsynthese realisiert wird. Die Wirtszelle für diesen Prozess kann von entweder prokaryotischem (zum Beispiel eine Bakterienzelle) oder eukaryotischem (zum Beispiel eine Pflanzen- oder Tierzelle) Ursprung sein. Zum Zwecke der Produktion im großen Maßstab können mikrobielle Wirte, wie Bakterien oder Hefen, aufgrund des fortgeschrittenen Stands von Fermentationsverfahren für diese Organismen eingesetzt werden. Alternativ können andere Genexpressionssysteme zur Herstellung von AMPPPs verwendet werden, wie jene, welche Pilze (zum Beispiel Neurospora), kultivierte menschliche Zellen oder Insektenzellen involvieren.
Gene, welche AMPPPs codieren, können gänzlich durch chemische synthetische Mittel hergestellt werden, oder sie können teilweise aus einem Abschnitt oder der Gesamtheit einer Sequenz, die von natürlichen, Magaininen codierenden Sequenzen abgeleitet sind, bestehen. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden, die gänzlich aus Desoxyribonukleotiden bestehen, kann erreicht werden durch Anwendung von Lösungschemien oder kann vorzugsweise auf Feststoffträgern durchgeführt werden. Mehrere Synthesechemien für Oligonukleotide sind entworfen worden und schließen die Phosphotriester-, Phosphit-triester- und Phosphoramidit-Chemien ein; siehe M. H. Caruthers, "New methods for chemically synthesizing deoxyoligonucleotides" in Methods of DNA und RNA Sequencing (S. M. Weissman, Hrsg.; Praeger Publishers, New York), (1983), 1-22, und K. Itakura et al., "Synthesis and use of synthetic oligonucleotides:, Ann. Rev. Biochem. 53, (1984), 323-356. Phosphoramidit-Synthesechemien, wie jene, welche N,N-Dimethylaminophosphoramidite oder Beta-Cyanoethyl-diisopropylaminophosphoramidite oder Desoxyribonukleosidmorpholino-methoxyphosphine involvieren, sind bevorzugt, und zwar aufgrund ihres effizienten Koppelns von Nukleotiden an einer wachsenden Oligonukleotidkette und aufgrund der Stabilität der angewandten chemischen Reagenzien. Die am meisten bevorzugten Phosphoramidit-Chemien sind jene, welche Beta-Cyanoethyl-diisopropylaminophosphoramidite anwenden, und zwar aufgrund ihrer verlängerten Stabilität in Bezug auf vergleichbare Intermediaten und ihrer Vermeidung von toxischen Reagenzien wie Thiophenol; siehe S. L. Beaucage und M. H. Caruthers, "Deoxynucleoside phosphoramidites – a new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis", Tetrahedron Lett. 22, (1981), 1859-1862; L. J. McBride und M. H. Caruthers, "An investigation of several deoxynucleotide phosphoramidites useful for synthesizing deoxyoligonucleotides:", Tetrahedron Lett. 24, (1983), 245-248; T. Dorper und E. L. Winnacker, "Improvements in the phosphoramidite procedure for the synthesis of oligodeoxyribonucleotides", Nuc. Acids Res. 11, (1983) 2575-2584; und S. P. Adams et al., "Hindered dialkylamino nucleoside phosphite reagents in the synthesis of two DNA 51-mers", J. Amer. Chem. Soc., 105, (1983) 661-663. Phosphoramiditchemien auf festen Trägern bestehen, kurz gesagt, aus dem Anheften eines modifizierten Nukleotids an ein festes Material, wie Glas, Silicagel, Polyacrylamid, Cellulose, Polystyrol, Nitrocellulose und einigen anderen im Allgemeinen chemisch inerten Materialien, wobei die Nukleotid-Phosphatgruppe und jede exocyclischen Stickstoffatome in der Nukleotidbase mit chemischen Gruppen geschützt werden, um so unerwünschte Nebenreaktionen während der linearen Verlängerung der Oligonukleotidkette zu verhindern. Solche Anheftungen können mittels einer Vielzahl von Linker- oder Spacer-Gruppen erfolgen, jedoch sind bevorzugte Linker im Allgemeinen langkettige Alkylamino; siehe M. D. Matteucci und M. H. Caruthers, US-A-4 458 066. Das angeheftete Nukleotid wird an der 5'-Zuckerposition mit einer säurelabilen chemischen Dimethoxytritylgruppe geschützt, welche mit einer Säure wie Benzolsulfonsäure, Trichloressigsäure oder Dichloressigsäure zur Befreiung einer 5'-OH-Gruppe für das Koppeln entfernt wird, wodurch die Verknüpfung von zusätzlichen Nukleotiden beginnt. Bevorzugte Säuren für diesen Entblockungs- oder Aktivierungsschritt sind Dichloressigsäure und Trichloressigsäure. Ein Phosphoramiditmonomer-Nukleotid, das in entsprechender Weise zu dem an dem festen Träger angehefteten Nukleotid geschützt ist, wird dann in Gegenwart einer schwachen Säure hinzugesetzt, um den nukleophilen Angriff der 5'-OH-Gruppe auf das Phosphoramiditreagens zu fördern. Bevorzugte schwache Säuren für den Kopplungsschritt schließen Tetrazol, Aminhydrochloride und 3-Nitrotriazol ein, wobei die am meisten bevorzugte schwache Säure Tetrazol ist. Stellen auf dem festen Träger, wo eine Kopplung nicht erfolgte, werden dann durch Acetylierung von freien Hydroxylgruppen mit Essigsäureanhydrid blockiert oder mit einer Kappe versehen. Ein bevorzugter Co-Reaktant in dem Capping-Schritt ist 1-Methylimidazol.
Die natürliche Phosphatdiester-Internukleotid-Verknüpfung wird anschließend bei jedem Zyklus der Nukleotidaddition durch die Behandlung der wachsenden Nukleotidketten auf dem festen Träger mit einer milden Oxidationsmischung erzeugt. Dieser Oxidationsschritt wandelt Phosphor(III) zu dem stabileren Phosphor(V)-Oxidationszustand um und verhindert eine Nukleotidkettenspaltung bei jedweden nachfolgenden Entblockungs- oder Aktivierungsbehandlungsschritten durch Säurespezien, wie Dichloressigsäure oder Trichloressigsäure. Iod wird als die oxidierende Spezies mit Wasser als dem Sauerstoffdonor verwendet. Bevorzugte Co-Reagenzien schließen Tetrahydrofuran und Lutidin ein. Nach einem Waschen des festen Trägers mit wasserfreiem Acetonitril kann der Entblockungs/Kopplungs/Oxidations/Capping-Zyklus so viele Male wiederholt werden, wie es notwendig ist, um das Oligonukleotid oder die Oligonukleotide der Wahl herzustellen, wobei jedes Mal das geeignete geschützte Beta-Cyanoethylphosphoramidit-Nukleosid verwendet wird, um das Nukleotid der Wahl, das eine Purin- oder Pyrimidinbase trägt, einzufügen. Die Purinbasen sind vorzugsweise entweder Adenin oder Guanin auf dem eingefügten Nukleotid, und die Pyrimidinbasen sind vorzugsweise Cytosin oder Thymin. Die Einfachheit der chemischen Synthese von Oligonukleotiden hat zu der Entwicklung von praktischen Anleitungen für die Laborarbeit und den gängigen Einsatz von kommerziellen automatisierten DNA-Synthesizern geführt; siehe M. H. Caruthers, "Gene synthesis machines: DNA chemistry and its uses", Science, 230, (1985), 281-285; und J. W. Efcavitch, "Automated system for the optimized chemical synthesis of oligodeoxyribonucleotides" in Macromolecular Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications (Alan R. Liss, Inc., New York), (1988), 221-234. Kommerzielle Instrumente sind von mehreren Quellen verfügbar, wie DuPont Company (Wilmington, DE), Milligen/BioSearch, Inc. (San Rafael, CA) und Applied Biosystems (Foster City, CA). Bevorzugt sind die Biosearch 8700- oder die Applied Biosystems 391 PCR-Mate-DNA-Syntheseinstrumente. Der Betrieb dieser Instrumente und die Details der Beta-Cyanoethylphosphoramidit-Chemie-Zyklen, die mit diesen zur Anwendung kommen, wird einerseits in der Betriebsanleitung des Modells 8600/8700 von Biosearch Inc. oder in dem Benutzerhandbuch des DNA-Synthesizers PCR-Mate Modell 391 (Applied Biosystems Teilenummer 900936, Version 1.00, Revision A vom Mai 1989) beschrieben.
Der letzte Kopplungszyklus von Oligonukleotiden kann komplettiert werden, indem die 5'-terminale Dimethoxytritylgruppe daran- oder weggelassen wird. Die Dimethoxytritylgruppe wird vorzugsweise aus Bequemlichkeitsgründen bei der anschließenden Reinigung vom Volllängenoligonukleotid darangelassen. Das komplettierte und geschützte Oligonukleotid muss entschützt und von dem festen Träger vor der Reinigung abgespalten werden. Der feste Träger, welcher die komplettierten Oligonukleotide trägt, wird mit frischem konzentrierten Ammoniumhydroxid bei Raumtemperatur mindestens eine Stunde lang behandelt, um die Oligonukleotide von dem Trägerharz abzuspalten. Der feste Träger wird dann mit mehr konzentriertem Ammoniumhydroxid gewaschen, und das kombinierte konzentrierte Ammoniumhydroxid wird bei 55-60 °C in einem verschlossenen Gefäß inkubiert, um die schützenden chemischen Funktionalitäten von den geschützten Basen zu entfernen. Die Probe wird dann gekühlt und, als ein Minimum, bis zur Trockne unter Vakuum eingedampft. Die Probe kann ebenfalls erneut aus frischem konzentrierten Ammoniumhydroxid oder Ethanol mit einer Reinheit von mindestens 95 Vol.-% eingedampft werden. Die fertige Probe kann dann in einem lyophilisierten (getrockneten) Zustand gelagert werden oder kann in sterilem destilliertem Wasser vor der Lagerung bei –20 °C ohne Zeitlimit suspendiert werden; siehe die Gebrauchsanleitung vom PCR-Mate-Modell 391, oben, und M. H. Caruthers et al., Methods in Enzymology, 154, oben.
Jedes abgespaltene und entschützte Oligonukleotid, welches durch eine Methodologie hergestellt wird, die von den obigen bevorzugten Wahlmöglichkeiten abgeleitet ist, kann mittels einer oder mittels mehrerer von einigen im Fachbereich bekannten Verfahren gereinigt werden. Diese Reinigungstechniken schließen die Polyacrylamidgel-Elektrophorese, Agarosegel-Elektrophorese, Größenausschlusschromatographie, Affinitätschromatographie, Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie und die Chromatograpie unter hydrophober Wechselwirkung ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Das bevorzugte Verfahren wird aus der Gruppe von Reinigungstechniken gewählt, welche aus der Polyacrylamidgel-Elektrophorese, Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie und Chromatographie unter hydrophober Wechselwirkung besteht. Ein solches bevorzugtes Verfahren ist die elektrophoretische Polyacrylamidgel-Reinigung von Oligonukleotiden, welchen ein Dimethoxytritylrest auf dem 5'-Ende fehlt, auf einem vertikalen 12%igen Polyacrylamid-Slab-Gel, 20 × 40 × 09,08 cm, in 7 M Harnstoff, 90 mM Tris-HCl, pH 8,3, 90 mM Borat, 1-2 mM Dinatriumethylendiamintetraessigsäure (EDTA). Ein Teil von jedem zu reinigenden Oligonukleotid (0,3-3,0 a₂₆₀-Einheiten) wird bis zur Trockne unter Vakuum eingedampft, in entionisiertem Formamid : 1 mM Dinatrium-EDTA (>9 : <1), das mindestens 0,01 % Bromphenolblau und mindestens 0,01 % Xylolcyanol enthält, resuspendiert, 2-3 Minuten in einem Bad mit siedendem Wasser erhitzt, schnell in eine Eisaufschlämmung gestellt und dann in eine einzelnen Vertiefung aufgetragen (mit mindestens 6 mm Breite). Die Probe(n) wird bei 80-90 W in Richtung zur Anode elektrophoretisiert, bis das Bromphenolblau zumindestens zwei Drittel der Länge des Polyacrylamidgels gewandert ist. Die Volllängen-Oligonukleotide werden dann sichtbar gemacht, indem das Polyacrylamidgel auf ein Stück aus flexiblem, durchsichtigen Kunststoffeinwickelmaterial, wie Saran Wrap, gelegt wird, es auf eine Platte zur Dünnschichtchromatographie (z. B. Silicagel F-254; Fisher Scientific Company, Pittsburgh, PA) aufgebracht wird, enthaltend eine Fluoreszenz-Indikatorverbindung, und das Polyacrylamidgel unter einer Beleuchtung mit ultraviolettem Licht von kurzer Wellenlänge untersucht wird. Das Volllängen-Bandenmaterial wird dann im Polyacrylamid herausgeschnitten und kann aus dem Gel heraus durch verschiedene Verfahren wie Elektroelution oder einfache Diffusion in einem Puffer gereinigt werden. Das bevorzugte Verfahren der Extraktion ist die Diffusion in 0,5 ml 0,3 M Natriumacetat, pH 7,5, über Nacht unter Schütteln, gefolgt von einer Zentrifugation, um das Polyacrylamidgel zu entfernen, und anschließende Extraktionen der wässrige Phase mit Phenol : Chloroform (1 : 1, v : v) und Ethanolpräzipitation. Das präzipitierte Oligonukleotid kann dann in einem geeigneten Volumen (für gewöhnlich im Bereich von 10-1000 μl) in einem geeigneten Puffer wie 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM Dinatrium-EDTA, oder in sterilem destillierten Wasser resuspendiert und bei –20 °C gelagert werden; siehe Abschnitt 2.12, "Purification of oligonucleotides using denaturing polyacrylamide gel electrophoresis", in Current Protocols in Molecular Biology, F. M Ausubel et al., Hrsg. (John Wiley and Sons, New York), (1989).
Ein alternatives bevorzugteres Verfahren der Reinigung und eines, das gut zur Reinigung von Oligonukleotiden, die immer noch einen Dimethoxytritylrest auf dem 5'-Ende aufweisen, geeignet ist, ist die Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) auf einer Umkehrphasen-HPLC-Säule. Eine solche Umkehrphasen-HPLC-Säule kann mit einer Vielzahl von auf Silica oder Polymer basierenden Harzen gepackt werden, welche im Handel von einer Vielzahl von Vertreibern, wie Millipore/Waters (Milford, MA), The Nest Group (Southboro, MA), Rainin Instrument Company, Inc. (Woburn, MA), J. T. Baker Inc. (Phillipsburg, NJ), Alltech Associates Inc. (Deerfield, IL) oder Pierce Chemical Company (Rockford, IL), verfügbar sind. Oligonukleotide werden auf eine solche HPLC-Säule geladen, fraktioniert und daraus eluiert, zum Beispiel durch einen Acetonitrilgradienten in einem von mehreren geeigneten nicht-destruktiven Puffern. Bevorzugte Acetonitrilgradienten liegen im Bereich von 5 % bis 40 %, und stärker bevorzugt im Bereich von 5 % bis 30 % in 0,1 M Triethylammoniumacetat-Puffer, pH 7,0. Bevorzugte Umkehrphasen-HPLC-Säulen schließen jene mit daran gebundenen linearen Alkylkettenresten, wie C⁴-, C⁸- oder C¹⁸-Alkylketten, ein. Die geeigneten Fraktionen, welche gereinigtes Volllängen-Oligonukleotid enthalten, werden dann gepoolt, unter Vakuum eingedampft und in 3 % (v/v)-Essigsäure in Wasser bei Raumtemperatur 10-30 Minuten lang resuspendiert. Die detritylierten Oligonukleotide werden dann mittels Ethanol präzipitiert oder mittels anderer geeigneter Methoden, wie der Größenausschlusschromatographie, gereinigt. Alternativ können detritylierte Volllängen-Oligonukleotide auch mittels HPLC unter Anwendung von verschiedenen Typen an Säulen und Gradientenmaterialien gereinigt werden; zur Anleitung siehe G. Zon und J. A. Thompson, "A review of high-performance liquid chromatography in nucleic acids research", BioChromatography, 1, (1986), 22-32.
Ein weiteres alternatives bevorzugteres Verfahren ist die Reinigung des Oligonukleotids durch hydrophobe Wechselwirkungschromatographie. Diese Reinigungstechnik für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist eine Form der Umkehrphasenchromatographie unter atmosphärischem Druck über ein hydrophobes Harz. Eine rohe Oligonukleotidmischung in der Ammoniumhydroxid-Entschützungs- und Abspaltungslösung wird auf das hydrophobe Harz aufgetragen, welches in einem geeigneten Puffer, wie 1,0 M Triethylammoniumacetat, pH 7,0, äquilibriert worden ist. Gebundene Oligonukleotide werden dann detrityliert durch Aussetzen an 2%ige Trifluoressigsäure während 1-3 Minuten und anschließend in 15-40 % Acetonitril in Wasser rückgewonnen. Das rückgewonnene Oligonukleotid wird dann lyophilisiert und, wie oben beschrieben, in einem geeigneten Puffer oder sterilem destillierten Wasser resuspendiert.
Eine oder mehrere synthetische Oligonukleotide sind notwendig, um ein partielles oder vollständiges synthetisches Gen für die Zwecke der vorliegenden Erfindung herzustellen. Jedwede geeigneten Oligonukleotide und/oder Bereiche oder die Gesamtheit eines natürlichen Gens, wie eines natürlichen Magainingens, können zu einem Gen, das ein oder mehrere AMPPPs codiert, zusammengebaut werden, und zwar durch Denaturieren dieser DNAs durch einige Methoden wie Erhitzen, Vermischen mit einem chaotropen Mittel, wie Harnstoff oder Formamid, oder durch Aussetzen an eine alkalische Lösung. Phosphatreste können enzymatisch an beliebige DNAs oder Oligonukleotide, welche diese nicht aufweisen, angeheftet werden, und zwar unter Verwendung eines Enzyms, wie T4-Polynukleotidkinase; siehe Abschnitt 3.10 in Current Protocols in Molecular Biology, oben. Jedwede Oligonukleotide, welche bei der Herstellung eines Gens innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung und in Anwesenheit oder Abwesenheit irgendwelcher zusätzlichen natürlichen DNAs verwendet werden, werden dann mittels geeigneter Mittel renaturiert und aneinander angelagert (annealed), wie durch langsames Kühlen auf Raumtemperatur oder Dialyse, um jedwede chaotropen Mittel zu entfernen. Diese angelagerten DNAs können durch die Behandlung mit einem geeigneten Enzym, wie T4-DNA-Ligase, kovalent verknüpft werden; siehe Abschnitt 3.14 in Current Protocols in Molecular Biology, oben.
Sofern erforderlich und wo geeignet können die AMPPPs codierenden Genprodukte, welche auf diesem Wege hergestellt wurden, vorbereitet werden zur Anknüpfung an genetische regulatorische DNA-Sequenzen durch die Behandlung mit Restriktionsendonukleasen gemäß den Spezifikationen der Hersteller oder mittels im Fachbereich bekannten Verfahren; siehe zum Beispiel T. Maniatis et al., Molecular Cloning, oben, S. 104-106.
Genetische regulatorische Signale, welche an AMPPPs codierende Gene angeknüpft werden, um sie so zur Expression als Protein in einer definierten Wirtszelle in die Lage zu versetzen, schließen Genpromotor-Sequenzen ein, welche DNA-Sequenzen sind, die durch die biologische Maschinerie der Wirtszelle erkannt werden, und welche die Transkription der DNA-Sequenz zu Messenger-RNA (mRNA) durch eine RNA-Polymerase innerhalb der Wirtszelle induzieren. Diese mRNA muss dann in der Lage sein, auf Ribosomen innerhalb der Wirtszelle zu einem Proteinprodukt translatiert zu werden. Die Genpromotor-Sequenzen können teilweise oder in Gesamtheit von Promotorsequenzen abgeleitet werden, welche in Zellen, die sich von jenen der Wirtszelle unterscheiden, gefunden werden, solange sie die obigen Kriterien zur Transkription und Translation erfüllen. Zum Beispiel kann eine Genpromotor-Sequenz von dem gramnegativen Bakterium Escherichia coli zur Expression eines AMPPP-Gens im grampositiven Bakterium Bacillus subtillis zufriedenstellend sein.
Ein zweites genetisches regulatorisches Element, welches an einem AMPPP-Gen zur Expression von einem oder mehreren AMPPPs anhängig sein kann, ist eine Gen-Terminator- oder Polyadenylierungssequenz. Diese DNA-Sequenz enthält genetische Information, welche die weitere Transkription unterbricht und aufhält und im Falle von eukaryotischen Zellen Information bereitstellt, um die Anheftung von einem oder mehreren Adenosinnukleotiden an dem 3'-Ende der mRNA zu lenken. Eine Gen-Terminator-Sequenz kann teilweise oder in der Gesamtheit eine Terminatorsequenz repräsentieren, die aus dem Genom der Wirtszelle oder aus dem Genom einer andersartigen Zelle abstammt, von welcher bekannt ist, zur geeigneten Termination der Transkription innerhalb der Wirtszelle wirksam zu sein. Ein Beispiel einer solchen Sequenz wäre die rho-unabhängige Transkriptionsterminatorsequenz des his-Operons von Salmonella typhimurium (siehe zum Beispiel M. E. Winkler, Escherichia coli and Salmonella tynhimurium: Cellular and Molecular Biology [F. C. Neidhardt, Chefhrsg.; American Society for Microbiology, 1987], Kapitel 25) oder die Octopin-Synthase-Terminatorsequenz von einem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens (siehe zum Beispiel H. DeGreve et al., "Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase gene", J. Mol. Appl. Genet. 1, (1982), 499-511).
Ein AMPPP-Gen oder -Gene mit angehefteten genetischen regulatorischen Signalen wird bevorzugterweise in eine Wirtszelle von entweder prokaryotischem oder eukaryotischem Ursprung in der Absicht der Exprimierung des einen oder der mehreren AMPPPs, welche durch die relevanten Gene codiert sind, eingeführt. Die Mittel zur Einführung sind gut im Fachbereich beschrieben und hängen von dem Typ der Wirtszelle ab, in welchem die Genexpression angestrebt wird. Zum Beispiel kann eine Transformation von bakteriellen Zellen mit extern zugeführter DNA., wie Zellen von Escherichia coli, durch eine Calciumchlorid-Prozedur bewerkstelligt werden. Typischerweise wird/werden das AMPPP-Gen oder -Gene mit angehefteten genetischen regulatorischen Signalen vor der Transformationsprozedur kovalent in einen geeigneten Transformationsvektor eingebunden. Solche Vektoren wurden in Vectors: a Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, von R. L. Rodriguez und D. T. Denhardt (Butterworths, Boston; 1988) überblickmäßig dargestellt; siehe ebenfalls T. Maniatis et al., Molecular Cloning, oben, S. 247-255.
Sobald die AMPPPs mit irgendeinem solchen Genexpressionssystem in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert worden sind, können sie mittels herkömmlicher Methoden extrahiert und/oder gereinigt werden und gegen Pflanzenpathogene in entweder einer teilweise gereinigten oder im Wesentlichen gereinigten Form verwendet werden. Verfahren zum Extrahieren von AMPPPs aus Wirtszellen schließen Wärme und/oder enzymatische Lyse der Wirtszelle, das Solubilisieren in einem lipidartigen Lösungsmittel oder einer wässrigorganischen mizellaren Lösung und das mittels Druck erfolgende Aufbrechen der Zellmenbranen und/oder Zellwände durch Durchpressen der Wirtszellen durch eine French-Presse ein. Das bevorzugte Verfahren zur Zelllyse für den Fall von Bakterien als Wirtszellen hängt von dem Maßstab der angestrebten Produktion ab. Für eine Produktion im großen Maßstab werden Wärme oder das Aufbrechen mittels Druck der Bakterienzelle bevorzugt; siehe zum Beispiel H. Hellebust, "Different approaches to stabilize a recombinant fusion protein", BioTechnology, 7, (1898), 165-168. Die extrahierten AMPPPs können in ihrer unmittelbaren Form ohne weitere Reinigung verwendet werden, oder sie können teilweise oder vollständig durch Anwendung von einer oder mehreren Fraktionierungen des Zellinhalts durch ein Verfahren, wie Größenausschlusschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Elektrophorese, Affinitätschromatographie und dergleichen, gereinigt werden.
Ein andere Möglichkeit besteht darin, totipotente Pflanzenzellen als Wirtsrezipient zur Exprimierung dieser AMPPPs codierenden Gene und zur Exprimierung von AMPPPs als Proteinprodukt zu verwenden, wobei die Pflanzenzellen in der Lage sind, fruchtbare Nutzpflanzen zu generieren. In diesem letzteren Fall werden die Empfänger-Pflanzen als genetisch transformierte oder transgene Pflanzen bezeichnet. Es gibt mehrere bekannte Verfahren zur Einführung von Fremdgenen in Pflanzen. Das Verfahren der Wahl hängt vornehmlich von dem Typ der Nutzpflanze, welche zu transformieren ist, ab. Gleichwohl können viele dieser Methoden in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Ein Verfahren, welches besonders effizient zum Transfer von DNA in zweikeimblättrige Pflanzen ist, beinhaltet die Verwendung von Agrobacterium. In diesem Verfahren wird das Gen von Interesse (zum Beispiel ein AMPPP mit einer CAMV-35S-5'-Promotor-Region und einer 3'-OCS-Terminator-Region) zwischen die Grenzen bzw. "Borders" der T-DNA-Region inseriert, welche zu einem kleinen rekombinanten Plasmid mit einem selektierbaren Gen (zum Beispiel Gene, die Neomycinphosphotransferase II von Transposon Tn5, Phosphinothriein-Acetyltransferase und dergleichen codieren) gespleißt worden ist. Das rekombinante Plasmid wird dann in einen Agrobacterium-Wirt entweder durch direkte Transformation oder durch triparenterales Kreuzen eingeführt. Der Agrobacterium-Stamm, welcher das Gen von Interesse trägt, wird dann in der Transformation von Dicot-Pflanzengewebe durch Co-Kultivieren des Bakteriums mit der Pflanzenprobe (zum Beispiel Blattscheibe) für einen Zeitraum von 2-3 Tagen verwendet. Transformierte Zellen werden durch Selektion auf dem geeigneten Mittel gewonnen, und Pflanzen können dann regeneriert werden; siehe R. B. Horsch et al., "A Simple and General Method of Transferring Genes into Plants", Science, 227, 1985), 1229-1231.
Andere Verfahren, welche bei der Transformation von Pflanzenzellen, und insbesondere bei widerstandsfähigeren monocotyledonen Nutzpflanzen, verwendet wurden, schließen chemisch induzierten Transfer (z. B. mit Polyethylenglykol; (siehe Lorz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 5824-5828, 1985), Biolistik (W. J. Gordon-Kamm et al., "Transformation of Maize Cells and Regeneration of Fertile Transgenic Plants", The Plant Cell, 2, (1990), 603-618), Mikroinjektion (Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet., 75: 30-36, 1987) und andere (Potrykus, Bio/Technology, 9: 535-542, 1990) ein.
Externe Aufbringung von AMPPP
Wenn eine äußerliche Aufbringung von AMPPPs zur Anwendung kommen soll, um eine Pflanze gegen Pathogene zu schützen, würde erwartet werden, dass die AMPPPs zur Bildung einer flüssigen Lösung oder Suspension, die zwischen 1-100 Mikrogramm/ml der AMPPPs enthält, verdünnt werden könnten oder mit einem Verdünnungsfeststoff zur Aufbringung als ein Staub vermischt werden könnten. Die genaue Natur der Aufbringung hängt teilweise von den besonderen Pathogenen ab, auf die abgezielt wird. Ausführliche Verfahren zur Anpassung von allgemeinen Verfahren zur Anwendung bei spezifischen Nutzpflanzen und Pathogenen können in Methods For Evaluating Pesticides For Control Of Plant Pathogens, K. D. Hickey, Hrsg., The American Phytopathological Society, 1986, gefunden werden. Verfahren der Aufbringung, von denen erwartet wird, dass sie in Übereinstimmung mit diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung besonders brauchbar sind, schließen die periodisch durchgeführten wässrigen und nicht-wässrigen Besprühungen der gesamten Pflanze oder Teilen davon, Samenbeschichtungen und die Einbringung in Besprühungssystemen (zum Beispiel Nebelbänken von Treibhäusern) ein. Hilfszusatzstoffe, welche der Formulierung hinzugesetzt werden könnten, würden Mittel zur Unterstützung der Solubilisierung, Benetzungsmittel und Stabilisatoren oder Mittel, welche zur Bildung eines mikroeingekapselten Produktes führen, einschließen. Die Formulierung sollte vorzugsweise keine hohen Konzentrationen an anorganischen Salzen und insbesondere keine zweiwertigen Kationen wie Ca⁺⁺, Mg⁺, Fe⁺⁺ enthalten. Externe Anwendungen könnten auch rekombinante Mikroorganismen entweder in einer lebensfähigen Form oder nachdem sie zu einer nicht lebensfähigen Form mittels eines Verfahrens umgewandelt wurden, das die AMPPPs nicht inaktiviert, verwenden. Wenn lebensfähige rekombinante Organismen verwendet werden, um die AMPPPs zuzuführen, wäre es bevorzugt, wenn sie die Fähigkeit hätten, die Zielpflanze zu kolonisieren.
Antimikrobielle Aktivität von AMPPP
Jene AMPPP-Zusammensetzungen, welche für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bevorzugt werden, sind jene, welche mindestens einige einer Vielzahl von Kriterien erfüllen. Ein primäres Kriterium für AMPPPs in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ist die Aktivität gegen ein oder mehrere Pflanzenpathogene. Das heißt, diese Peptide sollten wirksam sein, um Pflanzenpathogene zu hemmen. Der Ausdruck "Pflanzenpathogen" umfasst jene Organismen, welche bei Pflanzen einen Schaden und/oder eine Erkrankung verursachen können, und er schließt Pilze, Prokaryoten (Bakterien und Mycoplasmen), Viren und Viroide, Nematoden, Protozoen und dergleichen ein.
Zum Beispiel gibt es mehr als 8000 Pilzarten, welche eine Pflanzenerkrankung verursachen können; siehe Plant Pathology, George N. Agrios, 3. Ausgabe, Academic Press, Inc., 1988; A Literature Guide for Identification Of Plant Pathogenic Bacteria, A. Y. Rossman et al., American Pathological Society, St. Paul, MN, 1988; The Laboratory Guide for Identification Of Plant Pathogenic Bacteria, N. W. Schad, Hrsg., American Phytopathological Society, St. Paul, MN, 1980. Unter Beachtung der übermäßigen Anzahl von solchen Pathogenen sind die nützlichsten AMPPPs innerhalb des Kontexts eines Aspekts der vorliegenden Erfindung jene, welche ein breites Spektrum an Aktivität besitzen, das Wachstum oder Überleben von zahlreichen Pflanzenpathogenen inhibieren oder hemmen, oder welche sehr wirksam gegen spezifische Gruppen von Pathogenen sind, insbesondere Gruppen, welche Erkrankungen in Nutzpflanzen verursachen. Zum Beispiel sind Erwinia-Arten verantwortlich für eine Vielzahl von weichen Verfaulungs- und Verwelkungserkrankungen, welche die Farmern hunderte von Millionen an Dollarn jährlich kosten. Ein oder mehrere AMPPPs, welche das Überleben oder das Wachstum von Erwinia-Arten bekämpfen könnten, wäre/wären somit wünschenswert. Wünschenswerter sind jedoch AMPPPs, welche auch ein gewisses Ausmaß an Aktivität gegenüber anderen Spezies von Pilzen und/oder gegen andere Klassen von Pathogenen, welche sich beim Angriff auf einen spezifischen Wirt zusammentun könnten, bereitstellen. Beispiele für einen solchen Zustand sind Stengelverfaulungen in Mais, welche durch unterschiedliche Kombinationen mehrerer Spezies von Pilzen und Bakterien (z. B. Fusarium spp, Gibberella spp, Diplodia spp, Macrophomina spp, Pythium spp, Cephalosporium spp, Erwinia spp, Pseudomonas spp) verursacht werden. Andere Beispiele schließen Zustände ein, bei denen geschädigte Gewebe durch saprophytische Organismen invasiv befallen werden, wie bei Erkrankungen von Pflanzenprodukten nach der Ernte.
Eine Vielzahl von symbiotischen oder gutartigen Mikroorganismen, welche hauptsächlich bakterielle Spezies sind, werden mit Pflanzen in assoziativer Verbindung gefunden. Brauchbare AMPPPs wären jene, welche keinen Effekt auf das Überleben dieser Mikroorganismen haben, wobei sie dagegen eine wirksame Bekämpfung von einem oder mehreren verschiedenen Pflanzenpathogen(en) aufweisen. Deshalb ist einigen Situationen ein gewisser Grad an Spezifität von Vorteil. Wenn zum Beispiel der Schutz eines Wurzelsystems wünschenswert ist, wäre es von Vorteil, Organismen wie Rhizobium spp., welche atmosphärischen Stickstoff fixieren, oder Wurzel-kolonisierende Organismen, wie Pseudomonas spp., welche dazu dienen, die Wurzeln vor gewissen Pathogenen zu schützen, intakt zu lassen. Da viele dieser vorteilhaften oder gutartigen Organismen Bakterien sind, gibt es eine spezifische Nützlichkeit für AMPPPs, welche verringerte Aktivität gegen Bakterien aufweisen. AMPPPs in Übereinstimmung mit diesem Aspekt schließen, ohne Beschränkung, [His¹⁰]-Mag 2, [His¹¹]Mag 2, [His¹⁰, His¹¹]Mag 2, [Thr⁸]Mag 2, [Glu⁸]Mag 2 und [Phe⁷]Mag 2 ein.
Proteolytische Resistenz von AMPPP
Eine andere Basis zur Auswahl von AMPPP-Zusammensetzungen in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ist die Resistenz gegenüber einem Verdau oder Abbau durch eine oder mehrere Pflanzenproteasen oder Pflanzenpathogen-Proteasen. Pflanzen enthalten Enzyme, welche verwendet werden, um Proteine innerhalb einer Zelle, innerhalb einer subzellulären Organelle, innerhalb eines Kompartiments oder innerhalb des extrazellulären Raums zwischen Zellen abzubauen. Diese Enzyme, welche ebenfalls als Proteasen bekannt sind, bauen Proteine und Peptide ab, indem sie die spezifischen Bindungen, welche die Aminosäuresequenzen verknüpfen, brechen, und sie erzeugen inaktive oder weniger aktive Fragmente. Im Kontext der vorliegenden Erfindung kann dieses natürliche Phänomen verheerend sein, da es die AMPPPs deaktivieren kann, welche eine Pflanze durch Hemmung von Pflanzenpathogenen schützen könnten. Dieses Problem liegt sowohl für topisch aufgetragene AMPPPs, welche Proteasen ausgesetzt sind, die innerhalb der extrazellulären Räume enthalten sind, als auch exprimierte AMPPPs, welche intrazellulären Proteasen ausgesetzt sind, vor.
Eine post-translationale Spaltung der Xaa¹⁰-Xaa¹¹-Position wird natürlicherweise durch Proteasen verursacht, die für Exsudate der Haut von Xeropus laevis nativ sind, was anzeigt, dass diese Stelle für einen Abbau durch Proteasen zugänglich ist; siehe M. G. Giovannini et al., oben.
Wenigstens einige Aminosäuresubstitutionen und/oder -deletionen an Stellen, die benachbart zu Peptidbindungen liegen, welche als empfindlich gegenüber einer oder mehreren Pflanzenproteasen charakterisiert werden können, sollten die Proteolyse verringern oder eliminieren. Dies kann zumindest teilweise bedingt sein durch die Inhibition der Wirkung der jeweiligen Pflanzenprotease oder -proteasen durch Herbeiführen einer schlechteren "Passung" zwischen dem Proteaseenzym und der AMPPP-Substratspaltungsstelle.
Es wurde in unerwarteter Weise gefunden, dass der proteolytische Abbau durch Pflanzen aufgrund der Behandlung von AMPPPs mit extrazellulärem Pflanzenfluid, das Pflanzenproteasen enthält, durch Spaltung der Bindungen zwischen His und Ser an den Positionen 7 bzw. 8 von Magainin 1 und Magainin 2 und von Met und Asn an den Positionen 21 bzw. 22 von Magainin 2 stattfindet. Unter Beachtung dieser Phänomene wurden spezifische Substitutionen an einer oder mehreren dieser Positionen gefunden, welche wirksam dabei sind, in starkem Maße den nachteiligen proteolytischen Abbau durch Pflanzenproteasen zu verringern. Die so modifizierten Peptide sind deshalb wahrscheinliche Kandidaten für die Expression in transgenen Pflanzen, ebenso wie sie für die herkömmliche Aufbringung zum Nutzpflanzenschutz brauchbar sind. Substitutionen an den vorstehenden Positionen können wirksam sein bei der Reduzierung, wenn nicht sogar Eliminierung, eines nachteiligen proteolytischen Abbaus durch Pflanzen- und/oder Pflanzenpathogenproteasen, welche Phe, Ala, Glu, Asp, Lys, Ser oder Arg an Xaa⁷, Thr, Asp, Ala, His und Glu bei Xaa⁸, Arg, Lys, His, Gln, Trp, Tyr, Thr, Val, Ala, Leu, Ile, Glu, Asp, Phe, Pro, 3Hyp oder 4Hyp bei Xaa²¹ oder Arg, His, Glu, Trp, Tyr, Thr, Val, Ala, Leu, Ile, Gly, Asp, Phe, Pro, 3Hyp, 4Hyp oder Met bei Xaa²² einschließen. Die am meisten bevorzugten Substitutionen in Übereinstimmung mit diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung sind Arg- oder Lys-Substitutionen bei Xaa⁷ und/oder Glu-Substitutionen bei Xaa⁸.
Die Tatsache, dass festgestellt wurde, dass Arg und Lys einen beträchtlichen Effekt auf die Proteolyse besitzen, ist unerwartet, und zwar aufgrund der Ähnlichkeit bezüglich der Änderung bei physiologischem pH zwischen diesen Verbindungen und dem His-Rest, welchen sie in Magainin 1 und Magainin 2 ersetzen. Eine beliebige oder alle der bevorzugten Aminosäuresubstitutionen an den Positionen 7, 8, 21 und/oder 22 in AMPPPs können mit anderen Substitutionen, Deletionen und/oder Verlängerungen in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung kombiniert werden, um ein Peptid bereitzustellen, welches nicht nur gegenüber einer Proteolyse resistent ist, sondern auch ein solches mit einer erhöhten Aktivität gegen ein oder mehrere Pflanzenpathogene, mit ausgewählter Aktivität gegen spezifische Pflanzenpathogene und/oder mit geringer Phytotoxizität, z.B. landwirtschaftlich annehmbarer Phytotoxizität, ist.
Bei der Entscheidung, welche Substitution oder Substitutionen an diesen Positionen vorzunehmen sind, um die Resistenz gegenüber proteolytischem Abbau eines AMPPP zu verbessern, sollte eine Vielzahl von Faktoren in Betracht gezogen werden. Ein zu berücksichtigender Faktor ist der Effekt eines proteolytischen Abbaus an den verschiedenen Stellen. Die Fragmente, welche aus dem Abbau der Bindung zwischen Xaa⁷ und Xaa⁸ resultieren, sind gegenüber den meisten Pflanzenpathogenen inaktiv. Dahingegen kann das 21mer, welches aus der Spaltung der Bindung zwischen Xaa²¹ und Xaa²² resultiert, eine signifikante Aktivität, insbesondere gegen pathogene Pflanzenpilze, beibehalten. Somit ist es für gewöhnlich wünschenswert, Substitutionen in AMPPPs vorzunehmen, welche die Xaa⁷-Xaa⁸-Bindung stabilisieren werden, jedoch ist es nicht notwendigerweise wünschenswert, Substitutionen vorzunehmen, welche die Xaa²¹-Xaa²²-Bindung bewahren.
Ferner kann die Größe des AMPPP signifikant bei der Entscheidung sein, ob eine Substitution an den verschiedenen Positionen, und insbesondere an den Positionen 21 und 22, vorgenommen werden sollte oder nicht. Zum Beispiel ist das [Des Asn²², Des Ser²³]-Magainin 2 ein Doppel-Rest-Auslassungsderivat gemäß der vorliegenden Erfindung, welches eine signifikante anti-fungale Aktivität besitzt. Gleichwohl ist dieses 21mer zu dem 21mer identisch, welches ansonsten aus dem proteolytischen Abbau resultiert, und somit besteht kein Bedarf der Konservierung der nicht-existierenden Xaa²¹-Xaa²²-Bindung. Es ist nichtsdestotrotz wünschenswert, eine verringerte Empfindlichkeit des verbleibenden 21mer vorzusehen, indem Substitutionen vorgenommen werden, welche den Abbau der Xaa⁷-Xaa⁸-Bindung reduzieren oder eliminieren.
Ein weiterer Faktor, welcher bei der Konstruktion von AMPPPs zu beachten ist, ist, wie angemerkt, die Phytotoxizität. Ein spezifisches AMPPP mit potenzieller Phytotoxizität kann nicht funktionell phytotoxisch sein, wenn seine Konzentration unter einem bestimmten Spiegel gehalten wird. Deshalb kann es wünschenswert sein, eine beliebige der vorstehend erwähnten Positionen zu modifizieren, um eine verringerte, jedoch nicht vollständige Resistenz gegenüber einem proteolytischen Abbau bereitzustellen, zumindest an den Positionen 7 und B. Es kann möglich sein, ein AMPPP zu entwerfen, welches mit einer Rate abgebaut wird, die die Akkumulation von phytotoxischen Konzentrationen vermeidet.
Ein Maß der relativen Resistenz eines AMPPP gegenüber einer oder mehreren Pflanzenproteasen in einem Pflanzengewebe und insbesondere extrazellulären Proteasen kann erhalten werden durch die Verwendung einer Lösung, die mit Proteinen angereichert ist, einschließlich von aus Pflanzengewebe abgeleiteten Pflanzenproteasen. Im Falle von extrazellulären Proteasen kann dies bewerkstelligt werden unter Anwendung von Standardverfahren zum Erhalt von interzellulärem Fluid, wie jenen, welche in F. Klemnot, "Method Of Obtaining Fluid From the Intercellular Spaces Of Foliage and the Fluid's Merit As Substitute For Phytobacterial Pathogens", Phytopathology, 55, (1965), 1033-1034, diskutiert sind, oder durch Absammeln einer gewissen Portion einer Überstandslösung, die von kultivierten Zellen einer bestimmten Nutzpflanze oder eines Pflanzengewebeinfiltrats entnommen wurde. Diese Prozeduren können ebenfalls angewandt werden, um Proteasen von Pflanzenpathogenen zu erhalten. Eine Dosis-Antwort-Beziehung kann für jeden proteolytischen Abbau des AMPPPs ermittelt werden, wenn gezeigt werden kann, dass die Inkubation eines AMPPP während steigender Zeitdauern oder mit steigenden Konzentrationen einer Lösung, die eine oder mehrere Pflanzenproteasen enthält, zu einem steigenden Ausmaß des proteolytischem Abbaus des AMPPPs führt. Dieses Verfahren ist gegenüber anderen Methodologien bei weitem überlegen, da es ein AMPPP proteolytischen Bedingungen und Verbindungen aussetzt, welche es in einer Nutzpflanze antreffen könnte, welche mit ihm behandelt wird oder in welcher es produziert wird.
Zusätzlich zu extrazellulären Proteasen können AMPPPs ebenfalls gegen Proteasen getestet werden, die in anderen Organellen oder Kompartimenten vorkommen. Dies würde bewerkstelligt werden, indem Pflanzenzellen oder -gewebe mechanisch oder enzymatisch aufgebrochen werden und dann die Organellen durch Geschwindigkeits- und Dichtegradientenzentrifugation fraktioniert werden. Die Organelle wird dann aufgebrochen, um die interne(n) Protease(n) freizusetzen. Diese allgemeine Prozedur könnte angewandt werden, um die Stabilität von AMPPPs in Gegenwart von Proteasen in Organellen wie Chloropasten, Mitochondrien, Peroxisomen, Vakuolen und dergleichen zu untersuchen.
Lösungen, die aus einer subzellulären Organelle, Pflanzengewebe, Pflanzenzellkulturen oder Pflanzenpathogenzellkulturen in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung präpariert werden, sind im Allgemeinen sehr verdünnt. Die Protease liegt für gewöhnlich in Lösung in einer Menge von etwa 1 ppm Wasser (ein Teil pro Million Teile an Wasser) bis etwa 1 ppt Wasser (ein Teil pro tausend Teile Wasser) vor. Gleichwohl wird, wenn die Lösung verwendet wird, um die Resistenz gegenüber proteolytischem Abbau zu testen, diese weiter bis zu 20fach mit Wasser verdünnt. Somit kann die Protease in einer Menge von so wenig wie etwa 0,05 ppm Wasser vorliegen. Die tatsächliche Menge an Protease, welche in Reagenzien in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung brauchbar ist, ist verständlicherweise schwierig zu artikulieren. Gleichwohl ist es bevorzugt, dass das verwendete Reagens eine Menge an Protease enthält, die ausreichend ist, um zumindest einen 50%igen Abbau einer getesteten Verbindung in einer vorbestimmten Zeit, für gewöhnlich weniger als etwa fünf Stunden, zu bewirken. Das Reagens und die zu testende Verbindung werden bei einer Temperatur von etwa 37°C inkubiert und dann wird der Abbau, bis zu dem Ausmaß, wie er auftritt, durch Inaktivieren der Proteasen innerhalb des Reagens gestoppt. Dies kann durch eine Vielzahl von Methoden geschehen, wie der Zugabe einer Säure, wie Zitronensäure oder Trifluoressigsäure, der Zugabe eines Tensids oder Erhitzen. Eine einfache Prüfung zum Verifizieren der Wirksamkeit des Reagens ist der, dass sein Effekt auf Magainin 1 oder Magainin 2, welche keine natürliche Resistenz gegenüber Proteolyse besitzen, getestet wird. Wenn das getestete Magainin 1 oder Magainin 2 in weniger als etwa fünf Stunden ausreichend abgebaut wird, dann können andere mit dem Reagens getestete AMPPPs qualitativ damit verglichen werden.
Andere herkömmliche Additive können in die Reagenzien in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung aus Gründen, welche leicht ersichtlich ist, eingebracht werden. Diese schließen Puffer, wie Tris(tris-[hydroxymethyl]aminomethan); Met(2-[N-morpholino]-ethansulfonsäure); und (N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure]), Konservierungsmittel, wie Natriumazid oder Thimerosal, ein. Mischungen von diesen Additiven können ebenfalls brauchbar sein. Wenn vorliegend, liegen diese Additive im Allgemeinen in einer Menge von etwa 0,01 % bis etwa 0,10 % vor.
Der proteolytische Abbau kann durch eine Anzahl von Techniken, wie Ionenaustauschchromatographie, analytische Elektrophorese-Techniken, isoelektrische Fokussierung, Hochleistungs-Flüssigschromatographie, Größenausschlusschromatographie, Affinitätschromatographie, Immunoassay und anderen im Fachbereich bekannten Verfahren, überwacht werden. Die Bestätigung des proteolytischen Abbaus kann erreicht werden durch Detektieren von Fragmenten eines AMPPP. Ein zusätzlicher Beweis des proteolytischen Abbaus kann erhalten werden, indem die Zusammensetzung solcher AMPPP-Fragmente charakterisiert wird. Eine solche Charakterisierung kann mittels einer Vielzahl von im Fachbereich bekannten Techniken erfolgen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Aminosäureanalyse und Molekulargewichtsbestimmungen solcher Fragmente. Bevorzugte Verfahren der Molekulargewichtsbestimmung schließen FAB-MS und HPLC-MS ein. Die Information dieser Art kann ebenfalls einen Hinweis in Bezug auf die Stelle oder Stellen des proteolytischen Angriffs auf einem AMPPP bereitstellen und Aminosäureaustausche- und/oder -substitutionen nahe legen, welche die Resistenz eines AMPPPs gegenüber einem proteolytischen Abbau erhöhen würden.
Es ist ebenfalls möglich, dass ein oder mehrere der AMPPPs, die von der vorliegenden Erfindung beinhaltet sind, sich als resistent gegenüber dem Abbau durch eine oder mehrere Pflanzenproteasen erweisen, jedoch gegenüber einem proteolytischen Abbau durch eine oder mehrere Proteasen, welche von einem Pflanzenpathogen sezerniert werden, empfindlich sind. In diesem Fall wäre der Nachweis von solchen Proteasen durch Inkubieren eines AMPPPs mit einem Kulturüberstand eines oder mehrerer Pflanzenpathogene, gegen welche AMPPP-Wirksamkeit angestrebt wird, und Bestimmen, ob das AMPPP exo- oder endoproteolytisch abgebaut wird, durch ein oder mehrere oben diskutierte Verfahren möglich. Jede so nachgewiesene, mikrobiell abgeleitete Proteaseaktivität dieser Art gegenüber einem AMPPP könnte als Basis zur Bestimmung der Stelle oder Stellen einer solchen Spaltung innerhalb eines AMPPP dienen und potenziell zu dem Design oder der Synthese von Aminosäuresubstitutionen und/oder -deletionen innerhalb des AMPPP führen, welche seine Anfälligkeit gegenüber einem Abbau durch Proteasen, die von einem Ziel-Pflanzenpathogen abstammen, verringern oder eliminieren.
Es ist möglich, dass bestimmte Aminosäuresubstitutionen und/oder -deletionen, obgleich sie zum Zwecke der Verringerung der Proteolyse bevorzugt sind, einen negativen Effekt auf die AMPPP-Potenz gegen ein oder mehrere landwirtschaftlich wichtige Pflanzenpathogene haben. Im Gegensatz dazu könnten sich solche Substitutionen und/oder Deletionen, welche zur Bewahrung oder Steigerung der AMPPP-Potenz bevorzugt sein könnten, als unwirksam bei der Bereitstellung von Resistenz gegenüber einer oder mehreren Pflanzenproteasen herausstellen. Deshalb könnte sich der größte Nutzen aus jenen Peptiden ergeben, welche eine größere Resistenz gegenüber Pflanzenproteolyse erzeugen, während sie ebenfalls einige bevorzugte Merkmale der Antibiose, wie einen hohen Grad der Aktivität gegen ein bevorzugtes Pflanzenpathogen als einem Zielorganismus, oder einige andere verbesserte Charakteristika, wie eine reduzierte Phytotoxizität, aufrechterhalten oder verbessern.
Man muss ebenfalls die Stelle oder Stellen innerhalb eines Pflanzengewebes in Betracht ziehen, wo eine signifikante Konzentration von einem oder mehreren AMPPPs angestrebt wird, da dies Resistenz gegenüber dem proteolytischen Abbau der relevanten AMPPPs vorsieht. Wenn zum Beispiel das AMPPP bei wirksamen Konzentrationen hauptsächlich in Pflanzenwurzeln erwünscht ist, um eine größere Resistenz gegenüber einer Erkrankung bereitzustellen, die durch Infektionen auf der Wurzel-Ebene, wie durch Pilze und/oder Nematoden, hervorgerufen wird, dann wäre eine Resistenz gegenüber Wurzel-spezifischen Proteaseaktivitäten von vornehmlichen Interesse. Die Bereitstellung von Resistenz gegenüber proteolytischem Abbau von AMPPPs muss ebenfalls die Stelle oder die Stellen innerhalb von Pflanzengewebe in Betracht ziehen, wo eine signifikante Konzentration von einem oder von mehreren AMPPPs angestrebt wird. Wenn zum Beispiel das AMPPP bei wirksamen Konzentrationen hauptsächlich in Pflanzenwurzeln erwünscht ist, um eine größere Resistenz gegenüber einer Erkrankung bereitzustellen, welche durch Infektionen auf der Wurzelebene hervorgerufen wird, wie durch Pilze und/oder Nematoden, dann wäre Resistenz gegenüber Wurzel-spezifischen Proteaseaktivitäten von vornehmlichen Interesse.
Phytotoxizität
Noch eine andere Grundlage zur Auswahl von bevorzugten Zusammensetzungen, die bei der Hemmung von Pflanzenpathogenen zu verwenden sind, ist die Phytotoxizität. AMPPPs sollten vorzugsweise ein relativ minimales toxisches Verhalten gegenüber den Pflanzenzellen oder Pflanzengewebe zeigen. Insbesondere sollten Modifikationen, die zur Erhöhung der antimikrobiellen Aktivität oder Stabilität gegenüber Proteaseabbau ausgelegt sind, nicht die Phytotoxizität erhöhen. Ein toxisches Verhalten kann durch Tod, verringertes Wachstum, verringerte Photofixation von atmosphärischem Kohlenstoff, verringerte Assimilation von Nährstoffen, wie Stickstoff oder Phosphor, oder verringerten Ernteertrag manifestiert werden. Deshalb ist es wichtig, Peptide bereitzustellen, welche funktionell mit ihrem Wirt kompatibel sind.
Ein relativer Index der Phytotoxizität ist deshalb bevorzugt beim Vergleich von einem AMPPP mit einem anderen oder den natürlichen Magaininen oder anderen antibiotischen Verbindungen von aktuellem oder voraussichtlichem kommerziellen Wert. Ein solcher Index könnte der mögliche Effekt eines AMPPP auf die Inhibierung der normalen Pflanzenzell-Organellenfunktion sein. Bevorzugte Indizes sind die Inhibition der Sauerstoffentwicklung oder Kohlenstoff-Fixation durch isolierte Pflanzenchloroplasten oder die Sauerstoffrespiration durch isolierte Pflanzenmitochondrien oder Zellen. Diese Effekte können mittels einer Vielzahl von Techniken und Instrumenten überwacht werden, welche im Fachbereich verfügbar sind, wie eine Warburg-Vorrichtung oder eine Sauerstoffelektrode; siehe "The Use Of the Oxygen Electrode and Fluorescence Probes In Simple Measurements Of Photosynthesis", D. Walker, 1987, Hansatech Ltd., Kings Lynn, Norfolk, England.
Aminosäure-Aufbau von AMPPP
Zusätzlich zu den eben diskutierten Pflanzen-interaktiven Kriterien besitzen AMPPPs in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung eine bevorzugte Größe. Die bevorzugte Größe eines AMPPPs, das bezüglich eines natürlichen Magainins modelliert wurde, beträgt etwa 18-24 Aminosäuren und stärker bevorzugt etwa 21-24 Aminosäuren. Die minimale Größe von 18 Aminosäuren für ein AMPPP wird gewählt, da dies in etwa der minimalen Größe für ein Transmembranpeptid entspricht. Eine bevorzugte minimale Größe von etwa 21 Aminosäuren wird für ein AMPPP gewählt, da diese Größe der ungefähren Größe von Derivaten von natürlichen Magaininen entspricht, welche eine im Wesentlichen vollständige oder fast vollständige Aktivität gegen mindestens einige humane pathogene Mikroorganismen und mindestens einige Pflanzenpathogene besitzen, wenn mittels der hierin diskutierten Methoden getestet wird. Die obere Grenze bezüglich der Länge liegt vorzugsweise bei etwa 24 Resten, da diese Größe eine Erweiterung der AMPPPs in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung repräsentiert, welche ein N-terminales Met oder (f)Met einschließen.
Bevorzugte Substitutionen von Magainin 1 in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung schließen die Zusammensetzungen mit der Sequenz von Formel (I) ein, worin Xaa²² Lys ist, worin Xaa⁶ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Asn, Pro, 3Hyp, Ile, 4Hyp und Leu besteht, Xaa⁷ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Phe, Ala, Met, Ser, Thr, Trp, Tyr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin, Gln, Pro, 3Hyp, 4Hyp, Lys, Asn, Glu, His, Asp, Orn und Arg besteht, Xaa⁸ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Ala, Met, Pro, 3Hyp, 4Hyp, Thr, Ser, Trp, Tyr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin, Gln, Lys, Asn, Glu, His, Asp, Orn und Arg besteht, Xaa¹⁰ eine Aminosäure ist, welche aus der Gruppe gewählt wird, die aus Gly, Leu, Ile, Val, Ala, Phe, Met, Thr, Ser, Trp, Tyr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin, Gln, Lys, Asn, Glu, His, Asp, Orn und Arg besteht, Xaa¹¹ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Met, Trp, Tyr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin, Gln, Lys, His, Pro, 3Hyp, 4Hyp, Ser, Orn und Arg besteht, Xaa¹³ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Leu, Ile, Trp, Phe, Val, Ala, Gly, Pro, 3Hyp und 4Hyp besteht, Xaa⁸ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Thr, Trp, Tyr, Asp, Glu, Lys, Arg, Gln, His, Met, Ala, Gly, Pro, 3Hyp und 4Hyp besteht, Xaa¹⁹ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Ala, Glu, Pro, 3Hyp und 4Hyp besteht, und Xaa²¹ und Xaa²³ gleich oder unterschiedlich sein können und aus der Gruppe gewählt werden, die aus Arg, Orn, Asp, His, Glu, Lys, Gln, Tyr, Thr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin, Trp, Met, Asn, Ser, Ala, Phe, Val, Ile, Leu, Pro, 3Hyp und 4Hyp besteht. Magainin 1, welches mit einer oder mehreren dieser Aminosäuren an den angegebenen Positionen substituiert ist, wird bevorzugt, und zwar aufgrund ihrer Nützlichkeit bei der Hemmung von Pflanzenpathogenen. Die Ausdrücke "hemmen" und "hemmend", wie hierin verwendet, stehen für Inhibition, Zerstörung und/oder Deaktivierung. Somit müssen die Peptide in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung nicht notwendigerweise das Ziel-Pflanzenpathogen töten, sondern müssen nur seine Ausbreitung bei ansonstiger Infektion einer Pflanze behindern.
In Übereinstimmung mit einem stärker bevorzugten Aspekt schließen Substitutionen in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung Zusammensetzungen mit der Sequenz der Formel (I) ein, worin Xaa²² Lys ist und worin Xaa⁶ Leu ist, Xaa⁷ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Phe, Ala, Met, Thr, Tyr, Gln, Lys, His und Arg besteht, Xaa⁸ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt ist, welche aus Ser, Ala, Met, Thr, Trp, Tyr, Gln, Lys, Asn, Glu, His, Asp und Arg besteht, Xaa¹⁰ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Gly, Leu, Val, Ala, Met, Thr, Ser, Trp, Tyr, Gln, Lys, Asn, Glu, His, Asp und Arg besteht, Xaa¹¹ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Met, Trp, Tyr, Gln, Lys, His, Ser und Arg besteht, Xaa¹³ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Ala, Gly, Leu, Ile, Trp, Phe und Val besteht, Xaa¹⁸ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Ala, Gly, Thr, Trp, Tyr, Asp, Glu, Lys, Arg, Gln, His und Met besteht, Xaa¹⁹ eine Aminosäure ist, welche aus der Gruppe gewählt wird, die aus Ala und Glu besteht, Xaa²¹ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Arg, Asp, His, Glu, Lys, Gln, Tyr, Thr, Trp, Met und Ala besteht, und Xaa²³ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Ser, Val, Ala, Leu, Ile, Trp, Phe, Thr, His, Gln und Tyr besteht.
Einige der bevorzugteren Substitutionen von Magainin 1 in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung schließen Ala¹³, Ala¹⁸; Lys⁷; Arg⁷; Ala⁷; Phe⁷; Thr⁸; Glu⁸; Lys¹⁰; Ala¹⁸; Ala¹⁹, Arg⁷ Thr⁸; Arg⁷, Glu⁸; Arg⁷, Ala⁸; Lys⁷; Thr⁸; Lys⁷, Ala⁸; Lys⁷, Glu⁸; Ala⁷, Thr⁸; Ala⁷, Glu⁸; Ala⁷; Ala⁸; Phe⁷, Thr⁸; Phe⁷, Ala⁸; Phe⁷, Glu⁸; Pro¹¹; His¹⁰; His¹¹; und H¹⁰, H¹¹ ein.
Natürlich vorkommendes Magainin 1 und Magainin 2 sind wirksam gegen Tierpathogene, und sie werden im afrikanischen Krallenfrosch gefunden und weisen keinen Methionylrest, ob nun Met oder (f)Met, am N-terminalen Ende auf. Dies ist nicht überraschend, da höhere Lebensformen, d. h. Eukaryoten, für gewöhnlich Peptide in methionierter Form exprimieren und anschließend das methionierte Peptid prozessieren, um die aktive Peptidform zu erhalten.
Aktive AMPPPs, welche in Übereinstimmung mit den Lehren dieser Erfindung konstruiert werden, können N-terminale Methionylreste, d.h. f(Met) oder Met, aufweisen und weisen dies in einigen Fällen erwünschterweise tatsächlich auf. Dies ist eine bedeutende Erkenntnis, da das Erfordernis nach einer zellulären Prozessierung von AMPPPs, die wie hierin dargelegt konstruiert wurden, bedeutend vermindert wenn nicht sogar eliminiert wird. Somit zeigen AMPPPs, die so technologisch entworfen sind, dass sie methioniert sind, ob nun durch Addition eines Methionylrestes oder durch Deletion und/oder Substitution von anderen Aminosäureresten, gekoppelt mit der Addition eines Methionylrestes, antimikrobielle Aktivität ohne eine weitere zelluläre Prozessierung. Die Ausnutzung dieser Erkenntnis wird nicht nur in starkem Maße die Entwicklung von Produkten für den landwirtschaftlichen Einsatz erleichtern, sondern wird auch die gentechnologische Produktion von AMPPPs erleichtern.
Die Verlängerung eines AMPPP durch die Addition von einer der Aminosäuren Methionin oder N-formyliertes Methionin "(f)Met" an den Aminoterminus eines AMPPPs zählt ebenfalls unter die bevorzugten Aspekte in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, da in der Natur hergestellte Proteine im Allgemeinen ein Methionin (Met) am Aminoterminus besitzen. Bakterielle Proteine initiieren jedoch im Allgemeinen die Proteinsynthese durch Einführen eines N-formylierten Met am N-Terminus, gefolgt von einer posttranslationalen Entfernung der Formylgruppe. Im Gegensatz zu natürlich auftretendem aktiven Magainin 1 und 2, sollten, wo AMPPPs durch Bakterien erzeugt werden, einige oder alle der erzeugten aktiven AMPPPs eine (f)Met-Aminosäure am N-Ende einschließen.
AMPPPs der vorliegenden Erfindung involvieren bestimmte spezifische Derivate mit einzelnen oder doppelten Auslassungen an Resten. Diese AMPPPs behalten ihre antimikrobielle Aktivität gegen Pflanzenpathogene bei, trotz der Tatsache, dass von ähnlichen Verbindungen früher berichtet worden ist, dass sie bei der Behandlung von humanen bakteriellen Pathogenen unwirksam sind. Zum Beispiel waren [Des Gly¹]Mag 1 und [Des Gly¹, Des Ile²]Mag 1 beide wirksam bei der Behandlung von spezifischen Pflanzenpathogenen wie Erwinia carotovora oder Trichoderma reesi, trotz des Berichtes, dass [Des Gly¹]Mag 1 nicht gegen die menschlichen Pathogene Escherichia coli, Staphylococcus epidermis oder Candida albicans aktiv ist; siehe J. H. Cuervo et al., Peptide Res., oben.
Einige der bevorzugten Deletionen und/oder Verlängerungen von Magainin 1 in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung sind Met-; Met [Ala¹³, Ala¹⁸]; [Des Gly¹, Des Ile²]; Met [Des Met²¹]; Met [Des Lys²², Des Ser²³]; [Des Lys²², Des Ser²³]. Es sei darin erinnert, dass "Des" eine Deletion angibt und die hochgestellte Zahl die Position relativ zu dem N-terminalen Gly oder N-Terminus, wie im Vorangehenden definiert, angibt, "Met" die Addition an den N-Terminus angibt, und die restlichen Drei-Buchstaben-Kombinationen die Aminosäure angeben, welche für die natürlich auftretende Aminosäure in der Position oder in den Positionen, welche durch die entsprechende hochgestellte Zahl angegeben wird, substituiert ist.
Kombinationen der vorstehend erwähnten AMPPP-Konstruktionen werden ebenfalls in Betracht gezogen, wie zum Beispiel [Arg⁷, Glu⁸, Ala¹³, Ala¹⁸, Des Lys²², Des Ser²³]Mag 1, Met[Phe⁷]Mag 1 oder [Lys⁷, Glu⁸, Ala¹⁹]Mag 1. Weiterhin können Substitutionen in anderen Positionen, wie zum Beispiel Xaa⁶, mit den vorstehend erwähnten Substitutionen, Deletionen und/oder Verlängerungen kombiniert werden. Dies geschieht mit der Maßgabe, dass das resultierende Peptid nicht Magainin 1 oder nur ein Einzel-Rest-Auslassungsanalog von Magainin 1 ist.
Ähnliche Substitutionen, Deletionen und/oder Verlängerungen von Magainin 2 werden ebenfalls in Betracht gezogen. Diese schließen die bevorzugten und stärker bevorzugten Substitutionen, welche oben beschrieben sind, sowie die bevorzugten Deletionen und Verlängerungen, welche in Bezug auf Magainin 1 beschrieben wurden, ein. Gleichwohl ist in diesen Fällen Xaa²² Asn. Dies geschieht mit der Maßgabe, dass das resultierende Peptid nicht Magainin 2, Magainin 2, welches in nur zwei oder mehreren von Xaa⁸, Xaa¹³ oder Xaa⁸ mit Ala substituiert ist, Magainin 2, welches mit nur einem Ala substituiert ist, ein Einzel-Rest-Auslassungs-Analog von Magainin 2 ohne andere Substitutionen und/oder Verlängerungen, [Des Gly¹, Des Ile²]Mag 2 oder Magainin 2, welches nur in Position 21 (Xaa²¹) substituiert ist, ist. Deshalb schließen einige der am meisten bevorzugten Substitutionen sowie einige der bevorzugten Deletionen und/oder Verlängerungen von Magainin 2 in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung Lys⁷; Arg⁷; Ala⁷; Phe⁷; Thr⁸; Glu⁸; Lys¹⁰; Arg⁷, Thr⁸; Arg⁷, Glu⁸; Arg⁸, Ala⁸; Lys⁷, Thr⁸; Lys⁷, Ala⁸; Lys⁷, Glu⁸; Ala⁷ Thr⁸; Ala⁷, Glu⁸; Ala⁷, Ala⁸; Phe⁷, Thr⁸; Phe⁷, Ala⁸; Phe⁷, Glu⁸; Pro¹¹; His¹⁰; His¹¹; His¹⁰, His¹¹; Met-; Met[Ala¹³, Ala¹⁸]; Met[Des Gly¹, Des Ile²]; Met[Des Met²¹]; Met[Des Asn²², Des Ser²³]; und/oder [Des Asn²², Des Ser²³] ein.
AMPPP-Konstruktionen, die verwandt mit den vorstehend diskutierten Substitutionen, Deletionen und/oder Verlängerungen sind, können in Magainin-abgeleiteten Peptiden, welche nicht Magainin 1 oder Magainin 2 sind, vorgenommen werden. Das heißt, genauer gesagt, sind diese Peptide nicht Magainin 1 oder Magainin 2 oder direkte Derivate davon. Solche AMPPPs werden ein Lys oder Asn in der Position 22 und/oder das korrespondierende Gly oder Lys an der Position 10 nicht einschließen. Diese schließen zum Beispiel in einer bevorzugten Ausführungsform Zusammensetzungen mit der Sequenz der Formel I ein, worin Xaa²² eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Arg, Orn, Asp, His, Glu, Lys, Gln, Tyr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin, Trp, Met, Asn, Ala, Pro, 3Hyp, Ser, Ihr und 4Hyp besteht, und worin Xaa⁶ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Asn, Pro, 3Hyp, 4Hyp, Ile und Leu besteht, Xaa⁷ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Phe, Ala, Met, Ser, Thr, Trp, Tyr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin, Gln, Pro, 3Hyp, 4Hyp, Lys, Asn, Glu, His, Asp, Orn und Arg besteht, Xaa⁸ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Ala, Met, Pro, 3Hyp, 4Hyp, Thr, Ser, Trp, Tyr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin, Gln, Lys, Asn, Glu, His, Asp, Orn und Arg besteht, Xaa¹⁰ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Gly, Leu, Ile, Val, Ala, Phe, Met, Thr, Ser, Trp, Tyr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin, Gln, Lys, Asn, Glu, His, Asp, Orn und Arg besteht, Xaa¹¹ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Met, Trp, Tyr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin, Gln, Lys, His, Pro, 3Hyp, 4Hyp, Ser, Orn und Arg besteht, Xaa¹³ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Leu, Ile, Trp, Phe, Val, Ala, Gly, Pro, 3Hyp und 4Hyp besteht, Xaa¹⁸ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Thr, Trp, Tyr, Asp, Glu, Lys, Arg, Gln, His, Met, Ala, Gly, Pro, 3Hyp und 4Hyp besteht, Xaa¹⁹ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt, welche aus Ala, Glu, Pro, 3Hyp und 4Hyp besteht, und Xaa²¹ und Xaa²³ gleich oder unterschiedlich sein können und aus der Gruppe gewählt werden, die aus Arg, Orn, Asp, His, Glu, Lys, Gln, Tyr, Thr, 3,4-Dihydroxyphenylalanin, Trp, Met, Asn, Ser, Ala, Phe, Val, Ile, Leu, Pro, 3Hyp und 4Hyp besteht.
In Übereinstimmung mit einem stärker bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung schließen Magainin-artige Peptide die Zusammensetzungen mit der Sequenz der Formel I ein, worin Xaa²² eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Lys, Asn, Arg, Asp, His, Glu, Lys, Gln, Tyr, Thr, Trp, Met und Ala besteht, Xaa⁶ ist Leu, Xaa⁷ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Phe, Ala, Met, Thr, Tyr, Gln, Lys, His und Arg besteht, Xaa⁸ eine Aminosäure ist, welche aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Ser, Ala, Met, Thr, Trp, Tyr, Gln, Lys, Asn, Glu, His, Asp und Arg besteht, Xaa¹⁰ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Gly, Leu, Val, Ala, Met, Thr, Ser, Trp, Tyr, Gln, Lys, Asn, Glu, His, Asp und Arg besteht, Xaa¹¹ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Met, Trp, Tyr, Gln, Lys, His, Ser und Arg besteht, Xaa¹³ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Ala, Gly, Leu, Ile, Trp, Phe und Val besteht, Xaa¹⁸ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Ala, Gly, Thr, Trp, Tyr, Asp, Glu, Lys, Arg, Gln, His und Met besteht, Xaa¹⁹ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Ala und Glu besteht, Xaa²¹ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Arg, Asp, His, Glu, Lys, Gln, Tyr, Thr, Trp, Met und Ala besteht, und Xaa²³ eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Ser, Val, Ala, Leu, Thr, Ile, Trp, Phe, His, Gln und Tyr besteht.
Diese Substitutionen können mit anderen Substitutionen, Deletionen und/oder Verlängerungen kombiniert werden, um ein Peptid bereitzustellen, welches nicht nur gegenüber Pflanzen-Proteolyse resistent ist, sondern auch ein solches mit erhöhter Aktivität gegen ein oder mehrere Pflanzenpathogene, ausgewählter Aktivität gegen spezifische Pflanzenpathogene und/oder niedrigerer Phytotoxizität ist.
Ebenfalls veranschaulichend für AMPPPs sind die Peptide mit den folgenden Sequenzen:
Die Salze der freien Säureformen dieser AMPPPs und der C-terminalen Aminformen davon sind ebenfalls der Gegenstand dieser vorliegenden Erfindung, ebenso wie andere und/oder zusätzliche Substitutionen oder Deletionen.
Es gibt verschiedene Nachsynthese-Modifkationen von AMPPPs, welche deren Effektivität gegen ein oder mehrere Pflanzenpathogene verbessern könnten. Eine derartige Nachsynthese-Modifikation ist die Amidierung der Carboxyl-Enden von natürlichen Magaininen und der AMPPPPs der vorliegenden Erfindung; siehe zum Beispiel Cuervo et al., "The Magainins: Sequence Factors Relevant To Increased Anitmicrobial Activity and Decreased Hemolytic Activity", Peptide Res., 1, 1988, 81-86. Die Amidierung von AMPPPs verbessert bekanntermaßen im Allgemeinen ihre antimikrobielle Aktivität. Andere Nachsynthese-Modifikationen von AMPPPs, welche sich in Bezug auf antimikrobielle Aktivität, Resistenz gegen proteolytischen Abbau und/oder Phytotoxizität als nützlich erweisen können, einschließlich derjenigen Modifikationen, welche resultieren können aus post-translationalen Modifikationen von AMPPPs, hergestellt durch biologische Expression von einer DNA-Sequenz, welche ein oder mehrere AMPPPs kodiert, schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Acetylierung, Glycosylierung, Farnesylierung, Amidierung, Tyrosin-Sulfonierung, Oxidationen durch chemische oder enzymatische Methoden, wie durch Oxidation von Methioninresten, Prolin- oder Tyrosin-Hydroxylierung, Pronin-Isomerisierung und/oder Phosphorylierung ein.
Diese Substitutionen können mit anderen Substitutionen, Deletionen und/oder Verlängerungen kombiniert werden, um ein Peptid, welches nicht nur resistent gegen Pflanzen-Proteolyse ist, sondern ebenfalls ein solches mit erhöhter Aktivität gegen ein oder mehrere Pflanzenpathogene, ausgewählter Aktivität gegen spezifische Pflanzenpathogene und/oder niedrigerer Phytotoxizität vorzusehen. Die Tatsache, dass Arg und Lys einen substanziellen Effekt auf Proteolyse aufweisen, ist unerwartet, wegen der Ähnlichkeit hinsichtlich Ladung und/oder Struktur zwischen diesen Verbindungen und der Aminosäure, welche sie in natürlich vorkommendem Magainin 1, Magainin 2 und anderen AMPPPs gemäß der vorliegenden Erfindung ersetzen, d. h. His.
Das Vorangehende wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele besser verstanden werden. Diese Beispiele dienen lediglich dem Zweck der Veranschaulichung. Sie sollen nicht als den Umfang und die Natur der vorliegenden Erfindung einschränkend angesehen werden.
BEISPIEL 1 – HERSTELLUNG VON [Met]Mag 2-OH (AMPPP #3)
t-Boc-[Met]Mag-2-OCH₂PAM-Harz wurde unter Verwendung eines ABI-Modell 430A-Peptidsynthesizers unter Anwendung von t-Boc-Schutz, DCC-geförderter symmetrischer Anhydridbildung in DMF/DCM und Glu(OBzl), His(Z), Lys(Cl-Z) und Ser(Bzl) als Seitenketten-Schutzgruppen hergestellt. Die Synthese wurde von 0,5 mmol (0,78 g) t-Boc-Ser(Bzl)-OCH₂PAM-Harz begonnen, welches repetitiven Entschützungs-, Neutralisierungs- und Kopplungsschritten unter Befolgung der standardmäßigen DMF/t-Boc-Chemie-Zyklen, die von dem Instrument angewandt werden, unterzogen wurde. Vor der Kopplung des N-terminalen Methionins wurde die Hälfte des Harzes entfernt, um Mag 2-OH herzustellen, so dass die letzte Kopplung lediglich an der Hälfte des Harzes durchgeführt wurde.
Das erhaltene t-Boc- und Seitenketten-geschützte Harz (Trockengewicht = 0,6 g) wurde 50 Minuten bei –5°C mit einer Lösung von 6 ml wasserfreiem HF, 0,6 ml Anisol, 0,23 ml DMS und 0,18 ml 1,2-Ethandithiol gerührt. Nach Verdampfung des HF und DMS wurde das Peptid/Harz/Abfangmittel-Gemisch mit 3 × 10 ml kaltem 99 : 1 Ether/BME gewaschen, um Abfangmittel und andere Nebenprodukte zu entfernen. Das Peptid wurde dann mit 2 × 6 ml 6 M Guanidinhydrochlorid/1 % BME extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt, und das gewünschte Peptid wurde direkt aus der Guanidinhydrochloridlösung mittels HPLC-Chromatographie auf einer 2,2 × 25 cm großen 10 Mikron-330 Ångström-Vydak C-18-Säule unter Anwendung der folgenden Elutionsbedingungen bei Umgebungstemperatur isoliert: Fließgeschwindigkeit von 4 ml/min.; linearer Gradient von 0 %-100 % B in A über 60 min.; Lösungsmittel A: 0,1 % wässriges TFA; Lösungsmittel B: 0,087 % TFA, 10 % Wasser, 20 % Isopropanol, 70 % Acetonitril; Überwachung: UV-Absorbtion bei 229 nm. Der Hauptpeak, welcher bei 47,6 Minuten eluierte, wurde aufgefangen, wodurch [Met]Mag 2-OH, vermutlich als sein Hexatrifluoracetat-Salz, vorgesehen wurde. Es wurde gezeigt, dass das Peptid bei HPLC-Analyse zu mehr als 95 % rein war. [Met]Mag 2-OH ist auch durch das in Beispiel 3 beschriebene Verfahren hergestellt worden.
BEISPIEL 2 – HERSTELLUNG VON [Pro¹¹]Mag2-OH (AMPPP #5)
t-Boc-[Pro¹¹]Mag 2-OCH₂PAM-Harz wurde gemäß des in Beispiel 1 angegebenen Verfahrens hergestellt, außer, dass die Aminosäuren 1-14 in DMF/DCM doppelgekoppelt wurden, und His(Bom) anstelle von His(Z) verwendet wurde. Entschützung und Spaltung erfolgten durch Rühren von 1,0 g des Peptid-Harzes mit einer Lösung von 12 ml wasserfreiem HF, 1,0 ml Anisol, 0,4 ml DMS und 0,2 ml 1,2-Ethandithiol während 30 Minuten bei –10 °C und dann während 30 Minuten bei 0 °C. Nach Verdampfen des HF und DMS wurde der Rückstand mit 5 ml BME gerührt und dann mit 3 × 10 ml 15 % Essigsäure/2 % BME extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt und der Reihe nach mit 2 × 20 ml Diethylether extrahiert. Die Essigsäureschicht wurde dann lyophilisiert, um 217 mg unreines Peptid vorzusehen, welches in etwa 4 ml 1 N Essigsäure, enthaltend 1 % BME, gelöst und durch eine 2,6 × 10 cm große Bio-Rad AG1-X-8-Ionenaustauschersäule (Acetatform) in 1 N Essigsäure hindurchgeleitet wurde. Die Peptidfraktionen, welche mittels Ninhydrin-Überwachung nachgewiesen wurden (Sarin et al, siehe oben), wurden vereinigt und lyophilisiert, wodurch man 0,26 g Peptid erhielt, welches vermutlich nun in Form seines Pentaacetat-Salzes vorlag. Eine Lösung des Peptids in 10% Essigsäure/1% BME wurde ferner gereinigt, indem sie durch eine 2,6 × 70 cm große Sephadex G-25-Säule bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min. eluiert wurde, und die Peptid-Fraktionen aufgefangen wurden, welche durch Überwachen des Ausflusses bei 254 nm detektiert wurden. Die Peptidfraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert, wodurch man 250 mg Peptid erhielt, von welchem durch (HPLC-Analyse gezeigt wurde, zu mehr als 95 % rein zu sein, und dessen Zusammensetzung durch Aminosäureanalyse bestätigt wurde.
BEISPIEL 3 – HERSTELLUNG VON [His¹⁰]Mag2-OH (AMPPP #12)
t-Boc-[His¹⁰]Mag 2-OCH₂PAM-Harz wurde unter Verwendung eines ABI-Modell 430A-Peptidsynthesizers unter Anwendung von t-Boc-Schutz, via DCC/HOBT hergestellten aktiven HOBT-Estern in NMP sowie Glu(OBzl), His(Bom), Lys(Cl-Z) und Ser(Bzl) als Seitenketten-Schutzgruppen hergestellt. Die Synthese wurde von 0,5 mmol (0,693 g) t-Boc-Ser(Bzl)-OCH₂PAM-Harz (Substitutionsspiegel = 0,73 mmol/g) aus begonnen, welches repetitiven Entschützungs-, Neutralisierungs- und Kopplungsschritten unter Befolgung der standardmäßigen NMP/t-Boc-Chemie-Zyklen, welche von dem Gerät verwendet werden, unterzogen wurde. Nach Trocknung zu einem konstanten Gewicht wurden 1,82 g (78 %) Peptid-Harz erhalten.
Entschützen und Spaltung von 0,95 g Peptidharz unter Anwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Verfahrens ergaben 432 mg (82 %) unreines Peptid. Dieses wurde in seine Acetat-Form umgewandelt, wobei das in Beispiel 8 beschriebene Verfahren angewandt wurde, wodurch 400 mg des vermeintlichen Hexaacetat-Salzes bereitgestellt wurden. Das Letztere wurde in 50 ml 10 % Ammoniumbicarbonat gelöst, und die Lösung wurde 20 Stunden lang unter einer Stickstoffatmosphäre bei Raumtemperatur gerührt. Eine Lyophilisierung dieser Lösung ergab 0,38 g Peptid mit einem verbesserten Produktprofil. Die letztendliche Reinigung wurde durch präparative Umkehrphasen-HPLC bewerkstelligt, wobei repetitive Injektionen von Peptid (15 – 30 mg) in eine 2,2 × 25 cm große 10 Mikron-300 Ångström-Vydak C-4-Säule und Elution mit dem folgenden linearen Gradienten angewandt wurden: 22 %-42 % B in A über 40 Minuten hinweg; Fließgeschwindigkeit: 6,0 ml/min.; Lösungsmittel A: 0,1% wässriges TFA; Lösungsmittel B: 0,08% TFA in Acetonitril; Überwachung: UV-Absorption bei 235 nm. Der Haupt-Peak, welcher bei 28,1 Minuten eluierte, vermutlich die Hexatrifluoracetat-Form des Peptids, wurde aufgefangen und war, wie mittels HPLC gezeigt wurde, zu mehr als 98 % rein.
BEISPIEL 4 – HERSTELLUNG VON [Des Gly¹, Met²]Mag 2-OH (AMPPP #9)
t-Boc-[Des Gly¹, Met²]Mag 2-OCH₂PAM-Harz wurde unter Anwendung des in Beispiel 3 angegebenen Vorgehens hergestellt, außer dass Lys³ doppelgekoppelt wurde. Die Zusammen setzung des Peptids auf dem Harz wurde durch Aminosäureanalyse bestätigt (Westall et al., siehe oben).
Das Peptid-Harz wurde entschützt und abgespalten, wobei das in Beispiel 2 beschriebene Verfahren angewandt wurde (1,65 g Peptidharz ergaben 824 mg (95 %) unreines Peptid. Das Peptid wurde durch das in Beispiel 3 beschriebene Verfahren gereinigt, außer dass es, nach der Anionenaustausch-Chromatographie, nicht mit Ammoniumbicarbonat behandelt wurde. Unter Verwendung der in Beispiel 3 beschriebenen HPLC-Bedingungen wurde der Haupt-Peak, welcher bei 23,82 Minuten eluierte, aufgefangen, wodurch das gewünschte Peptid, vermutlich als sein Hexatrifluoracetat-Salz, vorgesehen wurde, welches sich bei der HPLC-Analyse als zu mehr denn 97 % rein erwies.
BEISPIEL 5 – HERSTELLUNG VON Met [Ala¹³, Ala¹⁸]Mag 2-OH (AMPPP #11)
t-Boc-Met[Ala¹³, Ala¹⁸]Mag2-OCH₂PAM-Harz wurde hergestellt, entschützt und gespalten, wobei die im Beispiel 3 angegebenen Vorgehensweisen eingesetzt wurden, und das Peptid wurde in seiner Acetatform unter Anwendung des in Beispiel 4 beschriebenen Verfahrens isoliert. Eine HPLC-Reinigung wurde durchgeführt, wie beschrieben in Beispiel 3, außer, dass anstattdessen ein linearer Gradient von 28 %-48 % B in A verwendet wurde. Der Haupt-Peak, welcher bei 35,7 Minuten eluierte, vermutlich die Hexatrifluoracetat-Form des Peptids, wurde aufgefangen, und es wurde durch HPLC gezeigt, das er eine größere Reinheit als 97 % aufwies.
BEISPIEL 6 – HERSTELLUNG VON [His¹¹]Mag 2-OH {AMPPP # 13) und [His¹⁰, His¹¹]Mag 2-OH (AMPPP #14)
Unter Anwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Verfahrens wurde das gemeinsame Segment der zwei Peptide, His¹¹-Ser²³ von Magainin 2, auf einem PAM-Harz zusammengefügt. Das Harz wurde dann in Hälften aufgeteilt, und die Synthese wurde in zwei getrennten Gefäßen fortgesetzt, wobei der einzige Unterschied darin bestand, dass die nächste angekoppelte Aminosäure in einem Fall ein Histidin und im anderen Fall ein Lysin war. Jede Synthese wurde dann unabhängig unter Anwendung der in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren vervollständigt. Für den Fall von [His¹¹]Mag 2 wurden 889 mg Peptid-Harz in der üblichen Weise entschützt und gespalten, wodurch man 385 mg unreines Peptid bereitstellte, wohingegen für den Fall von [His¹⁰,His¹¹]Mag 2 804 mg Peptidharz 320 mg (71 %) unreines Peptid bereitstellten. Die Peptide wurden gereinigt und in ihre Acetatformen umgewandelt, wobei das Verfahren von Beispiel 4 angewandt wurde, und jedes wurde einer Endreinigung mittels HPLC unter Anwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Verfahrens unterzogen. Der Haupt-Peak, welcher für [His¹¹]Mag 2-OH bei 27,9 Minuten und für [His¹⁰, His¹¹]Mag 2-OH bei 25,1 Minuten eluierte, vermutlich die Hexatrifluoracetat-Formen der Peptide, wurde isoliert und wies gezeigtermaßen bei HPLC in jedem Fall eine größere Reinheit als 95 % auf.
BEISPIEL 7 – HERSTELLUNG VON [Arg⁷]Mag 2-OH (AMPPP # 19), [Lys⁷]Mag 2-OH (AMPPP #18 und [Phe⁷]Mag 2-OH (AMPPP #20)
Unter Anwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Verfahrens wurde das gemeinsame Segment der drei Peptide, Ala⁹-Ser²³ von Mag 2, auf einem PAM-Harz zusammengefügt. Ausgehend von 0,600 mmol t-Boc-Ser(Bzl)-OHC₂PAM-Harz wurden 1,76 g des Seitenketten-geschützten t-Boc-Ala⁹-Ser²³-Segements von Magainin 2 auf PAM-Harz erhalten. Die Hälfte davon, 0,88 g (0,244 mmol) wurde zur Verwendung in Beispiel 2 beiseite gestellt, wohingegen die andere Hälfte mit t-Boc-Ser(Bzl) gekoppelt wurde, um t-Boc-Ser⁸-Ser²³-Mag2-OCH₂PAM-Harz herzustellen. Dann wurde unter Anwendung eines Verfahrens, ähnlich zu demjenigen, welches von Tjoeng et al., siehe oben, beschrieben wurde, eine äquimolare Mischung (0,667 mmol jeweils) von t-Boc-Arg(MTS), t-Boc-Lys(Cl-Z) und t-Boc-Phe an das Harz gekoppelt, wobei der t-Boc-Lys(Cl-Z)/NMP-Einzelkoppel-Zyklus des Peptidsynthesizers verwendet wurde (Ninhydrin-Überwachung (Sarin et al., siehe oben) zeigte eine Kopplungseffizienz von 99,1 % für diesen Schritt an). Die Peptidharz-Mischung wurde dann durch Acetylierung und Anhängung des restlichen gemeinsamen Segments "gecappt" bzw. mit einer Kappe versehen, wobei die standardmäßigen HOBT/NMP-Kopplungszyklen des Peptidsynthesizers verwendet wurden (die Ninhydrin-Überwachung (Saren et al., siehe oben) zeigte, dass die Kopplungseffizienzen im Bereich von 98,5 bis 99,6 % lagen).
Die N-terminale t-Boc-Gruppe wurde durch den Peptidsynthesizer unter Verwendung von TFA entfernt, und die Peptidmischung wurde dann entschützt und von dem Harz unter Anwendung des folgenden Niedrig/Hoch-HF-Vorgehens abgespalten: 1,03 g der Peptid-PAM-Harz-Mischung wurden zwei Stunden lang bei 0°C mit einer Lösung von 2,5 ml wasserfreiem HF, 6,5 ml DMS und 1,0 ml p-Cresol gerührt. Nach Verdampfung des HF und DMS wurde die Peptid-Harz-Mischung mit einer frischen Lösung von 12 ml wasserfreiem HF, 1,0 ml Anisol, 0,4 ml DMS, 0,2 ml 1,2-Ethandithiol und 3,0 mg 2-Mercaptopyridin gerührt. Nach Verdampfung des HF und anderer flüchtiger Bestandteile wurde das Harz mit Chloroform gequellt, und die Mischung wurde mit 3 × 10 ml Ether gewaschen, 30 Minuten lang mit 5 ml BME gerührt und mit 3 × 6 ml von 1:1 15% Essigsäure/BME, sowie einmal mit 30 ml 50% wässrigem Acetonitril, enthaltend 0,001% TFA, extrahiert. Die wässrigen Extrakte wurden vereinigt, mit 3 × 15 ml Ether extrahiert und lyophilisiert, um 398 mg (etwa 70 %) einer Peptidmischung bereitzustellen, welche unter Anwendung des in Beispiel 4 beschriebenen Verfahrens in die Acetat-Formen umgewandelt wurde.
Die Peptide wurden getrennt und isoliert und Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen HPLC-Verfahrens, außer dass der verwendete Gradient 22%-28% B in A während 60 Minuten, gefolgt von 28%-39% B in A während 10 Minuten war. Die Peptide, vermutlich als ihre Trifluoracetate (Hexa, für Arg⁷ und Lys⁷; Penta für Phe⁷) wurden mittels HPLC und FAB-MS analysiert, und von ihnen wurde festgestellt, die folgenden Charakteristika aufzuweisen (präparative HPLC-RT bzw. -Retentionszeit in Minuten, % Reinheit bei HPLC, erwartete (M+H)⁺ in amu und tatsächliche (M+H)⁺ in amu): [Arg⁷]Mag 2 (49,8, >96, 2458,4, 2458,7); [Lys⁷]Mag2 (48,2, >96, 2458,4, 2458,7) und [Phe⁷]Mag2 (64,0, >98, 2477,3, 2477,9).
BEISPIEL 8 – HERSTELLUNG VON [Ala⁸]Mag-2-OH (AMPPP # 16), [Glu⁸]Mag 2-OH (AMPPP # 17) und [Thr⁸]Mag 2-OH (AMPPP # 15)
Das PAM-Harz, welches das Segment Ala⁹-Ser²³ von Magainin 2 in Beispiel 7 enthält (0,88 g, 0,244 mmol), wurde mit einer äquimolaren Mischung (jeweils 0,667 mmol) von t-Boc-Ala, t-Boc-Glu(OBzl) und t-Boc-Thr(Bzl) gekoppelt. Die Peptid-Harz-Mischung wurde durch Acetylierung mit einer Kappe versehen, und das restliche gemeinsame Segment wurde unter Anwendung der in Beispiel 7 beschriebenen Verfahren angehängt. Eine Ninhydrin-Überwachung (Sarin et al., siehe oben) zeigte, dass die Kopplungseffizienzen in allen Fällen größer als 98,5 % waren. Die Peptid-Harz-Mischung (0,940 mg) wurde entschützt und gespalten, wobei das in Beispiel 13 beschriebene Verfahren eingesetzt wurde, um 352 mg (68 %) der Peptidmischung zu erhalten, welche unter Anwendung des in Beispiel 4 beschriebenen Verfahrens in die Acetatformen umgewandelt wurde.
Die Peptide wurden unter Anwendung des in Beispiel 3 beschriebenen HPLC-Vorgehens getrennt und isoliert, außer dass der verwendete Gradient in 23%-30% B in A während 70 Minuten, gefolgt von 5 Minuten bei 30% B, bestand. Die Peptide, vermutlich als ihre Hexatrifluoracetate, wurden mittels HPLC und FAB-MS analysiert, und von ihnen wurde festgestellt, die folgenden Charakteristika aufzuweisen (präparative HPLC-RT in Minuten, %Reinheit bei HPLC, erwartete (M+H)⁺ in amu und beobachtete (M+H)⁺ amu): [Ala⁸]Mag2-OH (67,4, >95, 2451,3, 2451,4); [Glu⁸]Mag2-OH (70,5, >90, 2509,3, 2509,6) und [Thr⁸]Mag 2-OH (56,2, >95, 2481,4, 2481,7).
BEISPIEL 9 – HERSTELLUNG VON [Des Asn²², Des Ser²³]Mag 2-OH (AMPPP #22)
Unter Anwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Verfahrens wurde das gemeinsame Segment der zwei Peptide, Gly¹-Ile²⁰ von Magainin2, an eine Mischung von 0,20 mmol t-Boc-Met-OCH₂PAM und 0,30 mmol t-Boc-Met-Asn-OCH₂PAM (hergestellt unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 3, beginnend von t-Boc-Asn-OCH₂PAM) angehängt. In dieser Synthese wurde jedoch das Segment von Gly¹ bis Lys¹¹ unter Verwendung von Doppel-Kopplungen für jede Aminosäure zusammengefügt. Die Peptid-Harz-Mischung (1,15 g) wurde unter Anwendung des in Beispiel 7 beschriebenen Verfahrens entschützt und gespalten, wodurch man 419 mg (65 %) einer Peptidmischung erhielt, welche unter Anwendung des in Beispiel 4 beschriebenen Verfahrens in die Acetatformen umgewandelt wurde.
Die Peptide wurden getrennt und isoliert, wobei das in Beispiel 3 beschriebene HPLC-Vorgehen verwendet wurde, mit der Ausnahme, dass der verwendete Gradient in 20 %-23 % B in A über 60 Minuten hinweg, gefolgt von 23 %-25 % B in A über 20 Minuten hinweg, bestand. Die Peptide wurden, vermutlich als ihre Hexatrifluoracetate, durch HPLC und FAB-MS analysiert, und von ihnen wurde gefunden, die nachstehenden Charakteristika aufzuweisen (präparative HPLC-RT in Minuten, % Reinheit bei HPLC, erwartete (M+H)⁺ in amu und beobachtete (M+H)⁺ amu): [Des Asn²², Des Ser²³)]Mag 2 (65,6, >94, 2266,3, 2266,9; [Des Ser²³]Mag 2 (AMPPP #21, hergestellt zu Referenz-Zwecken) (62,2, >92, 2380,3, 2381,8).
BEISPIEL 10 – HERSTELLUNG VON [Des Gly¹, Des Ile²]Mag 1-OH (AMPPP #23) und [Met]Mag 1-OH (AMPPP #25)
Unter Anwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Verfahrens, mit der Ausnahme, dass Gly³ und Lys⁴ doppelgekoppelt wurden, wurde t-Boc-[Des Gly¹, Des Ile²]Mag 1-OCH₂PAM-Harz synthetisiert, wobei von 0,602 mmol t-Boc-Ser(Bzl)-OCH₂PAM-Harz ausgegangen wurde. Etwa ein Drittel dieses Peptidharzes (830 mg, Trockengewicht) wurde entfernt und beiseite gestellt. Unter Verwendung einer Einzel-Kopplung wurde ein Isoleucin an das verbleibende Harz gekoppelt, wodurch t-Boc-[Des Gly¹]Mag 1-OCH₂PAM-Harz erzeugt wurde, und erneut wurde etwa die Hälfte davon (792 mg, Trockengewicht) entfernt und beiseite gestellt. Ein Glycin und ein Methionin wurden an das verbleibende Harz gekoppelt, um, nach Trocknung 661 mg von [Met]Mag 1-OCH₂PAM-Harz zu erzeugen. Jedes Harz wurde dann unabhängig entschützt und gespalten, wobei die in Beispiel 3 beschriebene Vorgehensweise angewandt wurde, mit der Ausnahme, dass auch 3 mg an 2-Mercaptopyridin als ein Abfangmittel während der HF-Spaltung zugesetzt wurden, wodurch man, jeweilig, 430 mg (92 %), 350 mg (84 %) bzw. 250 mg (69 %) an [Des Gly¹, Des Ile²)]Mag 1-OH, [Des Gly¹]Mag 1-OH (AMPPP #24, hergestellt zu Referenzzwecken) bzw. [Met]Mag 1-OH, in Form ihrer Hydrofluoridsalze, erhielt. Die Peptide wurden gereinigt und in ihre Acetatformen, vermutlich die Hexaacetate, umgewandelt, wobei das Verfahren von Beispiel 4 angewandt wurde. Eine HPLC-Analyse zeigte an, dass sie jeweilig zu etwa 78 %, 48 % bzw. 66 % rein waren.
BEISPIEL 11 – HERSTELLUNG VON [Ala¹³,Ala¹⁸]Mag 1-OH (AMPPP #26), Met[Ala¹³, Ala¹⁸]Mag 1-OH (AMPPP #27) und [Ala¹⁸]Mag 1-OH (AMPPP #28)
Unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Verfahrens wurde das Segment Lys¹⁴ bis Ser²³ von [Ala¹⁸]Mag 1 auf PAM-Harz synthetisiert, wobei von 0,601 mmol t-Boc-Ser(Bzl) ausgegangen wurde. Etwa ein Drittel dieses Peptid-Harzes wurde entfernt und in ein anderes Reaktionsgefäß gebracht, und die Kopplung wurde fortgesetzt, wodurch man 832 mg (Trockengewicht) an [Ala¹⁸]Mag 1-OCH₂PAM-Harz herstellte. Das in dem Gefäß verbleibende Harz wurde gekoppelt, bis das Segment, t-Boc-[Ala¹⁸]Mag 1-OCH₂PAM-Harz, hergestellt war. Etwa die Hälfte von diesem Harz wurde entfernt (683 mg, Trockengewicht), und ein Methionin wurde an das verbleibende Harz gekoppelt, um 542 mg (Trockengewicht) von Met[Ala¹³, Ala¹⁸]Mag 1-OCH₂PAM-Harz herzustellen. Jedes der drei Harze wurde dann unabhängig entschützt und gespalten, wobei das in Beispiel 10 beschriebene Vorgehen angewandt wurde, wodurch man jeweils 285 mg (66 %), 259 mg (72 %) bzw. 104 mg (37 %) an [Ala¹⁸]Mag 1-OH, [Ala¹³,Ala¹⁸]Mag 1-OCH bzw. Met[Ala¹³,Ala¹⁸]Mag 1-OH als deren Hydrofluoridsalze erhielt. Die Peptide wurden gereinigt und in ihre Acetatformen, vermutlich die Hexaacetate, umgewandelt, wobei das Verfahren vom Beispiel 4 angewandt wurde. Eine HPLC-Analyse zeigte an, dass sie jeweilig zu etwa 73 %, 65 % bzw. 67 % rein waren.
BEISPIEL 12 – ANTIBAKTERIELLE BIOASSAYS
Erwinia carotovora carotovora, Stamm SR319 (Ecc SR319), wurde auf eine Platte von LB-Agar ausgestrichen und über Nacht bei 28°C wachsen gelassen. Nach 24 Stunden wurde eine Öse an Ecc SR319 von der Agarplatte abgenommen und wurde zu 3 ml Luria-Nährmedium (10 g Bacto-Trypton, 5 g Bacto-Hefeextrakt und 10 g Natriumchlorid pro Liter Lösung; autoklaviert, steril) in einem mit Deckel versehenen sterilen 10-ml-Reagenzglas zugesetzt. Diese Kultur wurde über Nacht wachsen gelassen, bevor ihre optische Dichte bei 630 nm unter Verwendung eines Dynatech MR600-Mikroplatten-Lesegeräts (Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria, VA) aufgezeichnet wurde. Eine Portion der Übernachtkultur wurde mit Luria-Nährmedium eingestellt, um eine Kultur mit einer optischen Dichte bei 630 nm von 0,2 zu erhalten. Etwa 250 Mikroliter dieser Kultur wurden zu 2250 Mikrolitern Luria-Nährmedium in einem mit Deckel versehenen, sterilen 10-ml-Reagenzglas gegeben, bevor diese verdünnte Kultur 3 Stunden lang bei 28°C in einem Schüttelinkubator wachsen gelassen wurde. Die optische Dichte bei 630 nm der frisch gezüchteten Kultur wurde aufgezeichnet, und eine Portion dieser Kultur in der mittellogarithmischen Wachstumsphase wurde 1000-fach mit Luria-Nährmedium zu einer ungefähren Konzentration von etwa 10⁵ Koloniebildenden Einheiten pro ml Kultur verdünnt. Etwa 85 Mikroliter dieser verdünnten Kultur wurden in 12 Vertiefungen in einer 96-Vertiefungs-Mikrotiterplatte für jedes zu testende AMPPP zugegeben, wobei 1-4 Wiederholungsansätze von 12 Vertiefungen für jedes AMPPP innerhalb eines einzelnen Experiments angefertigt wurden. Stammlösungen von jedem AMPPP wurden bei einer Konzentration von 1 mg/ml hergestellt, und 0-15 Mikroliter jeder Peptid-Stammlösung wurden in eine einzelne Vertiefung in der Mikrotiterplatte zugesetzt, gefolgt von einem ausreichendem Volumen an Wasser, um das Gesamt-Vertiefungsvolumen auf 100 Mikroliter zu bringen. Typische geassayte Peptidvolumina beliefen sich auf 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 und 15 Mikroliter, was einer Peptid-Endkonzentration im Bereich von 0-150 Mikrogramm/ml entspricht. Die Mikrotiterplatten wurden mit Parafilm versiegelt und 44 Stunden lang auf einer Schüttelplattform bei 28°C inkubiert. Die optische Dichte jeder Ecc SR319-Kulturvertiefung wurde nach 20 Stunden und dann nach 44 Stunden aufgezeichnet. Eine "minimale vollständig inhibitorische Konzentration" (MCIC) wurde dann für jeden Wiederholungsansatz mit variierenden Peptidkonzentrationen für jedes AMPPP ermittelt, wobei die MCIC als die niedrigste Peptidkonzentration, bei welcher kein bakterielles Wachstum beobachtet wurde, definiert ist. Die Tabelle I listet mittlere MCIC-Werte auf, welche nach 20 Stunden Behandlung aus mindestens drei Wiederholungsexperimenten mit jedem AMPPP berechnet wurden. "Met(S) (O)" und "Met (R) (O)" betreffen die enantiomeren Formen eines Methioninsulfoxid-Restes.
Obwohl die meisten der in Tabelle I aufgelisteten AMPPP-Verbindungen im Anschluss an Umkehrphasen-HPLC-Reinigung zu mehr als 95 % homogen waren, waren die AMPPPs #5 und #23-28 lediglich zu 50-80 % rein im Anschluss an eine partielle Reinigung und Salzaustausch durch Ionenaustausch-Chromatographie. TABELLE I

* Für Vergleichszwecke

Viele der AMPPPs, wie Nr. 4, 5, 6, 7, 8, 12, 13, 14, 15 und 22 waren gegenüber Ecc SR319, selbst bei höheren Konzentrationen als 150 Mikrogramm AMPPP/ml, nicht wirksam.
BEISPIEL 13 – ANTI-PILZ-BIOASSAY
Pilze werden auf einem passenden Medium, in diesem Fall einer Kartoffel-Dextrose-Agarplatte, mehrere Wochen lang wachsen gelassen. Am Ende dieser Zeitdauer wurde die Platte mit etwa 5 ml sterilem destilliertem Wasser überschwemmt, um Sporen zu ernten. Die Sporenkonzentration wurde durch Verwendung eines Hämozytometers bestimmt, und die Sporensuspension wurde in einem sterilen Röhrchen bei 4°C aufbewahrt, bis sie benötigt wurde. 82 Mikroliter Kartoffel-Dextrose-Nährmedium und 3 Mikroliter Sporensuspension (mit einem Bereich von 10⁵ bis 10⁷ Sporen insgesamt) wurden dann in 12 Vertiefungen in einer 96-Vertiefungs-Mikrotiterplatte für jedes zu testende AMPPP zugesetzt, wobei 1-4 Wiederholungsansätze der 12 Vertiefungen für jedes AMPPP innerhalb eines einzelnen Experiments angefertigt wurden. In mehreren Fällen wurde mehr als eine Sporenkonzentration verwendet, um die Wirksamkeit bestimmter AMPPPs als Funktion der Anzahl von Ziel-Sporen zu bestimmen. Stammlösungen von jedem AMPPP wurden bei einer Konzentration von 1 mg/ml hergestellt, und 0-15 Mikroliter jeder Peptid-Stammlösung wurden in eine Einzelvertiefung in der Mikrotiterplatte zugesetzt, gefolgt von einem ausreichendem Volumen an Wasser, um das Gesamt-Vertiefungsvolumen auf 100 Mikroliter einzustellen. Typische Peptidvolumina, welche geassayt wurden, beliefen sich auf 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 und 15 Mikroliter, was einer Peptid-Endkonzentration im Bereich von 0-150 Mikrogramm/ml entspricht. Die Mikrotiterplatten wurden mit Parafilm versiegelt und 48 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das Pilzwachstum wurde nach 24 und 48 Stunden durch ein Mikroskop unter Verwendung einer 4 ×- und/oder 10 ×-Objektivlinse beobachtet. Das Ausmaß der Sporen-Keimung und des Pilzwachstums wurde als eine qualitative Messung an jedem Beobachtungszeitpunkt unter Verwendung eines Systems von Plus- und Minuszeichen aufgezeichnet: [–] bedeutete, dass keine Keimung aufgetreten ist, [+] stand für die Anfänge von Myzelium-Wachstum mit dem Gesamtaussehen eines losen Maschenwerks, und [+++] bedeutete ein dichtes Myzelium-Wachstum mit dem Gesamtaussehen eines dicken undurchsichtigen Maschenwerks. Der MCIC-Wert für jedes getestete AMPPP wurde dann aufgezeichnet, wobei der MCIC-Wert definiert ist als die niedrigste Peptid-Konzentration, bei der keine Sporen-Auskeimung aufgetreten ist (Bewertung = [–]). Die Tabelle II listet mittlere MCIC-Werte auf, welche nach 24 Stunden langer Behandlung aus mindestens drei Wiederholungsansätzen mit jedem AMPPP für jeden von zwei oder drei getesteten pflanzenpathogenen Pilzen berechnet wurden: Alternaria alternata, P3 Fusarium und Trichoderma reesei. Die Identität von AMPPPs in der Tabelle II ist die gleiche, wie in Tabelle I ausführlich angegeben. TABELLE II

* Für Vergleichszwecke
NT = nicht getestet

Es besteht eine gewisse Variabilität in der Antwort unter den drei getesteten pflanzenpathogenen Pilzen, aber im Allgemeinen waren nahezu alle der getesteten AMPPPs gegenüber allen getesteten Pilzen bei irgendeiner Behandlungsdosis im Bereich von 9-150 Mikrogramm AMPPP/ml aktiv. Die Ausnahmen hinsichtlich der gegen Pilze wirksamen AMPPPs waren AMPPP 4 für sowohl P3-Fusarium als auch Trichoderma reesei, sowie AMPPP 5 für P3-Fusarium. Viele der AMPPP-Verbindungen waren ungefähr so wirksam gegen pflanzenpathogene Pilze wie gegen das Bakterium Ecc-SR319 (zum Beispiel AMPPPs 1, 16, 18, 19 und 21), wohingegen bestimmte AMPPP-Verbindungen viel effektiver gegen pflanzenpathogene Pilze als gegen das Bakterium Ecc SR319 waren. Die letztgenannte Kategorie schließt, ohne aber darauf eingeschränkt zu sein, die AMPPPs 2, 6-9, 12-15, 17 und 22 ein.
Man bemerke, dass eine gewisse Variabilität zwischen Experimenten auftritt und auf Unterschiede im biologischen Testmaterial zurückführbar ist.
Die meisten der AMPPPs gemäß der vorliegenden Erfindung sind wirksam gegen pflanzenpathogene Pilze, Bakterien oder beides. Manche AMPPPs, wie die AMPPPs 11, 18 und 19, waren aktiver als natürliches Magainin 2 gegen Ecc SR319. Andere waren lediglich geringfügig weniger aktiv (AMPPP 21). Diese selbigen Verbindungen verloren nicht signifikant an Anti-Pilz-Aktivität. Überraschenderweise zeigten andere AMPPPs, wie die AMPPPs 12-15, 17 und 20, einen dramatischen Verlust an Aktivität gegenüber pflanzenpathogenen Bakterien, aber behielten eine substanzielle Aktivität gegen pflanzenpathogene Pilze bei. Diese Verbindungen sind von großer Bedeutung im Zusammenhang mit dem Schutz von Pflanzen vor Pflanzenpathogenen, weil die Biospezifität einen Schutz gegen Pilze ohne Bedrohung gewisser nutzbringender Bakterien im Erdreich oder der Umwelt gestattet.
BEISPIEL 14 – MESSUNG DER RESISTENZ GEGENÜBER PROTEOLYTISCHEM ABBAU
Um die Empfindlichkeit von Magainin-Peptiden gegenüber extrazellulären Proteasen zu bestimmen und die Stelle der Prozessierung durch diese Proteasen zu ermitteln, wurde ein System entworfen, um extrazelluläres Fluid aus Blättern von Mais, Tabak und Kartoffel zu erhalten und dieses) zum Testen der Stabilität von Magainin-Analogen zu verwenden.
Extrazelluläres Fluid (ECF) wurde gemäß Z. Klemmt, siehe oben, durch Schneiden von Zwischen-Venen-Stücken aus Tabakblättern erhalten, wonach sie in entionisiertem Wasser gespült wurden. Die Segmente wurden in Wasser in einem Vakuum-Exsikkator untergetaucht, und ein Vakuum wurde während 5 bis 10 Minuten angelegt. Das Vakuum wurde langsam abgelassen, die Blätter wurden trocken-getupft, und vier bis fünf Stücke wurden eingerollt und in die Trommel einer 50 ml großen Einwegspritze eingebracht, welche derartig zurechtgeschnitten war, dass sie in der Lage war, in einen Ausschwingbecher-Zentrifugenrotor zu passen. Die Spritzen-Trommel wurde in ein 50 ml großes konisches Schraubdeckel-Zentrifugenröhrchen eingebracht und in einem Ausschwingbecher-Rotor bei 500 × g während 30 Minuten zentrifugiert. Die Flüssigkeit wurde gewonnen und 10 Minuten lang in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde bei –80°C aufbewahrt und in anschließenden Experimenten verwendet.
Um die Stabilität der Magainin-Analoge gegenüber extrazellulären Pflanzenproteasen zu testen, wurden 20 Mikrogramm des Magainin-Peptid-Analogs (1 mg/ml) mit 0,1, 2,5, 5, 10 % extrazellulärem Fluid in 50 mM Tris, pH 7,4, inkubiert. Nach Inkubation bei 37°C während einer Stunde wurden die Proteasen durch die Zugabe von TFA zu einem Endvolumen von 1 % inaktiviert.
Peptide wurden durch Umkehrphasen-Chromatographie auf einer 4,6 mm × 250 mm großen Vydac-C-4-Proteinsäule (Nest Group, Southboro, MA) unter Verwendung eines Gradienten von 0 bis 60 % Acetonitril in 0,1 % TFA auf einem Hewlett-Packard HP 1090-Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographen (Hewlett-Packard, Avondale, PA) analysiert. Als die Menge an ECF erhöht wurde, wurde es beobachtet, dass zwei früh eluierende Peaks aus dem Eltern-Peak erzeugt wurden. Diese Peptide wurden mittels FAB-MS und Aminosäure-Analyse gereinigt und analysiert. Die Ergebnisse zeigten unter anderem an, dass das am frühesten eluierende Peptid-Fragment die Reste Gly¹ bis Xaa⁷ waren. Die in der Tabelle III gezeigten Werte repräsentieren den Prozentsatz der Fläche im Eltern-Peak und dem Gly¹-Xaa⁷-Peak, erhalten nach Inkubation des angegebenen AMPPPs mit 2,5 % ECF, im Verhältnis zur Fläche des AMPPP-Eltern-Peaks ohne zugesetztes ECF. Die Ergebnisse zeigen, dass die Modifikation von AMPPPs durch Substitution mit Arg, Lys oder Phe an Position 7 und Glu an Position 8 eine signifikante Resistenz gegen Proteolyse an der Xaa⁷-Xaa⁸-Peptidbindung vorsieht.
TABELLE III
BEISPIEL 15 – DER EFFEKT VON ECF AUF ANTI-PILZ-AKTIVITÄTEN VON AMPPPs
Es ist ausschlaggebend, den Effekt von pflanzlichen proteolytischen Enzymen auf die AMPPP-Aktivität zu verstehen, weil jedwedes AMPPP, welches auf Nutzpflanzen angewandt wird, in Kontakt mit Pflanzengeweben und jeglichen assoziierten Pflanzenproteasen stehen wird. Es ist wichtig, die Bioaktivität eines AMPPP, welches von einer oder mehreren Pflanzenproteasen gespalten werden kann, zu untersuchen und zu erkennen, dass ein derartiges Ereignis stattgefunden hat. Ein Extrakt von extrazellulärem Fluid (ECF), wie beschrieben in Beispiel 14, ist ein nützliches Reagenz bei der Bestimmung eines derartigen Verlusts an antimikrobieller Aktivität von AMPPPs aufgrund von Exposition an Pflanzenproteasen im extrazellulären Kompartiment von Pflanzengeweben. Bioassay-Experimente wurden mit 300-1000 vorgekeimten P3 Fusarium-Sporen, im Wesentlichen wie beschrieben im Beispiel 13, für verschiedene AMPPPs ausgeführt, welche an ECF aus mehreren Nutzpflanzenspezies exponiert wurden oder an verbrauchte Medien exponiert wurden, abgesammelt als Überstand aus zentrifugierten, 3 Tage alten P3-Fusarium-Kulturen, welche in Kartoffel-Dextrose-Nährmedium (PDB bzw. potato dextrose broth), Mais-Stengel-Medium (CSM bzw. corn stalk medium) oder Wasser wachsen gelassen worden waren, wie es nachstehend ausführlich angegeben wird. Der einzige größere Unterschied im verwendeten Bioassay-Verfahren zu demjenigen, welches in Beispiel 13 beschrieben ist, bestand darin, dass der Bioassay in einem Gesamt-Kulturvolumen von 10 Mikrolitern anstatt von 100 Mikrolitern durchgeführt wurde. ECF war in diesen Bioassays bei einer Endkonzentration von 10 % (v/v) vorhanden, und wurde gleichzeitig mit einem AMPPP zu den Fusarium-Sporen bei verschiedenen AMPPP-Konzentrationen zugegeben. Die Bioassay-Ergebnisse aus diesen Tests wurden interpretiert, wie beschrieben in Beispiel 13, und eine ungefähre prozentuale Reduktion der Anti-Pilz-Aktivität für jedes AMPPP wurde aus dem Vergleich der "minimalen vollständig inhibitorischen Konzentration" (MCIC) mit und ohne Zugabe von ECF erhalten. Die prozentuale Reduktion wird berechnet als (MCIC₊ -MCIC/MCIC₊). Die Tabelle IV fasst die Ergebnisse dieser Tests mit verschiedenen AMPPP-Verbindungen zusammen. Im Allgemeinen wurde die Aktivität aller AMPPPs durch das Vorliegen von ECF inhibiert. Die Wahrscheinlichkeit, dass die Inhibition auf der proteolytischen Aktivität beruhte, welche in den ECF-Proben vorhanden war, wurde durch die Beobachtung unterstützt, dass eine Behandlung des ECF mit 2 % Phenylmethylsulfonylfluorid, einem bekannten protein-reduzierenden Mittel, oder eine Erhitzung des ECF in einem kochenden Wasserbad während 10 Minuten, das Vermögen des ECF, Anti-Pilz-Aktivität von AMPPP zu inhibieren, eliminierte. TABELLE IV

* Zu Vergleichszwecken

BEISPIEL 16 – ANALYSE VON PROTEASEN, WELCHE VON PFLANZEN- UND PILZZELLEN SEZERNIERT WERDEN
Extrazelluläre Protease-Reagenz-Lösungen können auch aus Gewebekultur-Medien und Pilzkultur-Medien hergestellt und wie in Beispiel 14 für die Bestimmung der Resistenz gegenüber proteolytischem Abbau verwendet werden. Es gibt mehrere Vorteile der Verwendung von Proteasen, welche aus Gewebekultur-Medien abgesammelt werden. Spezifisch neigen die Konzentration und die Inhalte von aufeinanderfolgenden Ansätzen dazu, konsistenter zu sein, und das Verfahren in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung gestattet das Absammeln von Proteasen aus einer größeren Vielfalt von Pflanzen und Pflanzenpathogenen. Es ist deshalb möglich, die proteolytische Resistenz eines AMPPP sowohl gegen Wirtsorganismus-Proteasen als auch Proteasen eines Pflanzenpathogens in Betrachtung zu ziehen.
Diese proteasehaltigen Reagenzien werden durch Entfernen der Zellen aus Medien durch Zentrifugation und Einstellen des Überstands auf 50 mM Tris, pH 7,4, durch 20-faches Verdünnen einer 1 M Tris-pH 7,4-Stammlösung erhalten.
BEISPIEL 17 – SAUERSTOFFENTWICKLUNGS-BIOASSAY AUF PHYTOTOXIZITÄT
Die folgende Vorgehensweise für die Präparation von Chloroplasten zur Verwendung in einer Sauerstoffelektrode ist ähnlich zu derjenigen von Gupta et al., "Plant Phys." 89, (1989) 753-761. Spinat (Spinacia oleracea L. var. 'Melody') wurde in 1:1-Torf/Vermiculite-Blumentopfgemisch in einer Wachstumskammer mit einer 10-stündigen Lichtperiode wachsen gelassen. Die Kammertemperatur wurde während der Wachstumsperiode bei 21 °C (Tag) und 16°C (Nacht) gehalten. Alle Pflanzen wurden nach 6-8 Wochen Wachstum für die Chloroplasten-Isolierung verwendet.
Um eine angereicherte Chloroplasten-Fraktion zu erhalten, wurden etwa 12 g entrippte Spinatblätter gründlich gewaschen und getrocknet. Die Blätter wurden dann in kleine Stücke von jeweils etwa 1/2 Quadrat-Inch zerschnitten und wurden in ein kleines Mixer-Gefäß eingebracht, enthaltend 50 ml gekühltes Homogenisierungsmedium (0,33 M Sorbitol, 50 mM Hepes-NaOH, pH 6,8, 2 mM Na₂EDTA, 1 mM MnCl₂, 1 mM MgCl₂). Das Gewebe wurde zweimal während 3-sekündigen Intervallen bei Hochgeschwindigkeit in einem Mixer vermengt. Das resultierende Homogenat wurde durch vier Schichten Käsetuch und zwei Schichten "Miracloth" (Behring Diagnostics, La Jolla, CA) in zwei gekühlte 30 ml große Glas-Zentrifugenröhrchen hinein filtriert. Die filtrierte Lösung wurde 1,0 Minuten lang bei 750 g (2200 U/min.) in einem JS 13.1-Ausschwingbecher-Rotor in einer Beckman-J2-21M-Zentrifuge (Beckman Instruments, Inc., Somerset, NJ) zentrifugiert. Der Überstand wurde dann dekantiert, und das Pellet wurde durch Verwirbeln bei 0°C vorsichtig resuspendiert. Etwa 15 ml Homogenisierungsmedium wurden in jedes Röhrchen mit Chloroplasten zugegeben, bevor die Chloroplasten auf einen 40%igen Percoll-Gradienten (6 ml Percoll, 9 ml Homogenisierungsmedium und 0,03 g Rinderserumalbumin) in einem 30-ml-Glaszentrifugenröhrchen aufgeschichtet wurden. Diese Röhrchen wurden 4,0 Minuten lang bei 2500 g (4000 U/min.) in einem JS 13.1-Ausschwingbecher-Rotor in einer Beckman-J2-21M-Zentrifuge zentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde in einer kleinen Menge Homogenisierungsmedium (etwa 500 Mikroliter) resuspendiert.
Die Plastiden-Konzentration wurde allgemein auf einer Chlorophyll-Basis ausgedrückt. Das Chlorophyll wird mittels des Verfahrens von Arnon (Plant Phys., 24, (1949) 1-14) bestimmt. Etwa 50 Mikroliter Chloroplasten-Stammsuspension wurden zu 10 ml 80%igem Aceton zugesetzt, und diese Lösung wurde 5,0 Minuten lang im Dunklen inkubiert und dann 5,0 Minuten lang bei 500 g (1630 U/min.) in einer Beckman-GP-Zentrifuge zentrifugiert. Die Extinktion bzw. Absorption der Aceton-Chloroplasten-Lösung wurde bei 645 nm bei 663 nm und bei 730 nm überwacht. Die Chlorophyll-Konzentration wurde dann berechnet als 10 × [(Absorption bei 645 nm × 20,2) + (Absorption bei nm × 8,02) – Hintergrund bei 730 nm]. Dies ergab die Menge an Chlorophyll in Mikrogramm für die ursprünglichen 50 Mikroliter Chloroplasten. Die Konzentration an Chloroplasten wurde dann mit Homogenisierungsmedium so eingestellt, dass 50 Mikroliter Suspension 26 Mikrogramm Chlorophyll enthalten. Diese Chloroplasten waren lediglich für 1 ½ bis 2 Stunden aktiv und wurden deshalb unverzüglich eingesetzt.
Eine Sauerstoffelektrode (Hansatech Instruments Ltd., Kings Lynn, Norfolk, England) wurde verwendet, um die Sauerstoffentwicklung aus isolierten Chloroplasten zu messen. Für eine ausführliche Erörterung des Verfahrens siehe D. Walker, oben. Eine gesättigte KCl-Lösung wurde in die Elektrodenvertiefung eingebracht, und 1 Quadrat-Inch Rollenpapier oder Linsenpapier wurde so in die Elektrodenvertiefung eingebracht, dass es KCl aufsaugte und eine Ionenbrücke bildete. 1 Quadrat-Inch von Teflonmembran wurde dann angefertigt, wobei darauf geachtet wurde, deren Oberfläche nicht zu berühren, und wurde über dem vollgesogenen Papier plaziert. Unter Verwendung des Membran-Applikators wurde ein O-Ring über den Kopf der Elektrode plaziert, wodurch Papier und Membran über der Elektrode befestigt wurden. Die CB-1D-Steuerungsbox wurde angeschaltet, und das System wurde eine Stunde lang vor der Kalibrierung aufwärmen gelassen. Das System wurde dann unter Verwendung von luftgesättigtem Wasser (heftiges Schütteln einer Waschflasche von entionisiertem Wasser) kalibriert. Unter Verwendung des Verstärkungs-Schalters wurde die Ausgabe anschließend so eingestellt, dass der Schreibstift auf dem Bandschreiber bei der maximalen Diagramm-Höhe war. Um sämtliche Luft aus dem Wasser in der Küvette zu entfernen und den Bandschreiber auf Null einzustellen, wurden etwa 2-3 mg Natriumdithionit zugegeben, und es wurde beobachtet, wie der Plotter-Schreibstift sich zum Tiefstand des Graphen bewegte. Wenn die Steigung der Linie instabil war, wurden die Membran und das Papier entfernt, und das Einrichten der Sauerstoffelektrode wurde von neuem begonnen.
Um einen Phytotoxizitäts-Bioassay mit der Sauerstoffelektrode auszuführen, wurden die folgenden Komponenten in die Sauerstoffelektroden-Küvette zugesetzt: 855 Mikroliter Assay-Medium (Homogenisationsmedium, eingestellt auf pH 7,6, plus 25 mM NaH₂PO₄), 50 Mikroliter 0,1 M frisches NaHCO₃, 20 Mikroliter Katalase (insgesamt 49,6 Units/Mikroliter) und 50 Mikroliter Chloroplasten-Suspension (zuletzt zugegeben). Dann wurde die Lichtquelle zur Elektrode eingeschaltet. Eine anfängliche Verzögerungsphase wurde beobachtet, als sich das Chloroplasten-System äquilibrierte. Wenn die anfängliche Verzögerungsphase größer als eine Minute war, dann wurden die für die Chloroplasten-Isolierung verwendeten Pflanzen als unangemessen beurteilt. In produktiven Experimenten wurde eine gleichbleibende Rate der Sauerstoffentwicklung während 2-3 Minuten etabliert, dann wurden 25 Mikroliter Lösung, welche Peptid enthielten, unter Verwendung einer Hamilton-Spritze zugesetzt. Die Sauerstoffentwicklungsrate wurde 4 Minuten lang nach der Peptidzugabe überwacht. Die Verringerung in der Rate der Sauerstoffentwicklung in diesen Experimenten nach der Zugabe eines Peptides wurde durch Vergleichen der Steigung der Bandschreiber-Ausgabekurve vor der Zugabe des Peptids mit der Steigung der Kurve bei einem vorgegebenen Zeitpunkt nach der Zugabe des Peptids bestimmt. Die Ergebnisse wurden hinsichtlich des Chlorophyll-Gehalts normiert, da eine gewisse Variabilität zwischen Experimenten hinsichtlich der Chloroplastenkonzentration in der beleuchteten Reaktionskammer herrschte. Die Normierung wurde durchgeführt mittels Dividieren der Steigung durch die Chlorophyll-Konzentration, welche in Milligramm ausgedrückt wurde. Das Endergebnis wurde als Prozentsatz der Inhibition der Sauerstoffentwicklung ausgedrückt, abgeleitet durch Dividieren der Rate der Sauerstoffentwicklung nach Zugeben des Peptids durch die anfängliche Kontroll-Rate der Sauerstoffentwicklung, und Multiplizieren dieser Zahl mit 100.
Die Tabelle V fasst Beobachtungen an mehreren AMPPPs für Chloroplasten zusammen, welche an Peptide bei einer Endkonzentration von 16 μM exponiert wurden. Mittelwerte und Standardabweichungen wurden aus 4-15 Wiederholungs-Assays mit jedem AMPPP berechnet. Kontroll-Sauerstoffentwicklungsraten lagen im Bereich von 72-283 μmol O₂/Stunde/mg Chlorophyll. Mehrere Peptide wurden in jedem Experiment untersucht, um die Tag-zu-Tag-Variabilität der Ergebnisse zu minimieren. Die Identität der einzelnen AMPPPs, wie aufgelistet, entspricht den Peptiden, welche in der Tabelle II von Beispiel 4 aufgelistet sind. TABELLE V

* Zu Vergleichszwecken

BEISPIEL 18 – KONSTRUKTION VON SYNTHETISCHEM [(f)Met]-MAGAININ-2-GEN UND ETABLIERUNG DES SYNTHETISCHEN GENS IN ESCHERICHIA COLI
Ein synthetisches [(f)Met]-Magainin 2-Gen wird auf der Grundlage des universellen genetischen Codes und einer bakteriellen Codon-Verwendungs-Tabelle (siehe H. A. DeBoer und R. A. Kastelein, "Biased codon usage: an exploration of its role in optimization of translation", in Maximizing Gene Expression [Hrsg.: W. S. Reznikoff und L. Gold; Butterworth, Boston, 1986], S. 225-285, und J. Brosius, "Expression vectors employing lambda-, lac- und lpp-derived promoters", in Vectors: a Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses [Hrsg.: R. L. Rodriguez und D. T. Denhardt; Butterworth, Boston, 1988]. S. 205-225) und mit flankierenden nicht-gleichen EcoRI- und HindIII-Restriktions-Endonuklease-Erkennungssequenzen für eine zweckmäßige gerichtete Insertion in die Polylinker-Region des kommerziell erhältlichen bakteriellen Plasmids pKK223-3 (Pharmacia Inc., Piscataway, NJ), welches fähig zur regulierten Expression ist, entworfen. Die regulierte Expression des synthetischen Gens ist wünschenswert, um nachteilige Effekte auf das Wachstum der Wirtszellen wegen toxischer Aktivität von (f)Met-Magainin 2 zu vermeiden. Das synthetische Gen beinhaltet ATG als das erste Codon, welches an eine Magainin 2 kodierende DNA-Sequenz angehängt wird, um eine Expression dieses Peptids in dem genetisch gut definierten Bakterium Escherichia coli zu erlauben. Das synthetische Gen wird aus zwei Oligonukleotiden zusammengebaut werden, welche auf einem Applied Biosystems Modell 391 PCR-Mate-Oligonukleotid-Synthesizer unter Anwendung von Beta-Cyanoethyl-Phosphoramidit-Chemie hergestellt wurden. Die Sequenz der zwei synthetischen Oligonukleotide, welche zur Herstellung des synthetischen Gens zusammengebaut werden, wird die folgende sein
1-3 Mikrogramm von jedem der obenstehenden Oligonukleotide werden in 15 Mikrolitern sterilem destilliertem Wasser vereinigt, wozu 2 Mikroliter 10 × Linker-Kinase-Puffer (siehe T. Maniatis et al., Molecular Cloning, S.125; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982) und 2 Mikroliter 4 mM ATP zugesetzt werden. Diese Lösung wird auf 65 -70°C während 2-3 Minuten erwärmt und über eine Dauer von mindestens 45 Minuten langsam auf Raumtemperatur abgekühlt, um den Oligonukleotiden zu gestatten, sich aneinander anzulagern. Ein Mikroliter T4-Polynukleotid-Kinase (Bethesda Research Labs; mindestens 10 U/Mikroliter (U = Units)) wird zu der abgekühlten Mischung zugesetzt, und die Lösung wird 60 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Die Reaktionsmischung wird dann während 5 Minuten auf 65°C erwärmt, um das Kinase-Enzym zu inaktivieren.
Fünf Mikrogramm des Plasmids pKK223-3 werden bis zur Vollständigkeit in einem Gesamtvolumen von 15 Mikrolitern mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII (New England Biolabs) gemäß den Spezifikationen der Hersteller oder bekannten Verfahren, T. Maniatis et al., "Molecular Cloning", siehe oben, auf S. 98-106, verdaut. Dann werden der Reihe nach 29 Mikroliter Wasser, 5 Mikroliter 10 × T4-DNA-Ligase-Puffer (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT) und 1 Mikroliter alkalische Phosphatase aus Kälberdarm (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN; 1 U/Mikroliter) zu der Restriktionsverdau-Mischung zugesetzt. Diese Phosphatase-Reaktionsmischung wird bei 37°C während 30 Minuten, danach bei 65°C während 15 Minuten inkubiert, bevor die Phosphatase-Reaktionsmischung zweimal mit 50 Mikrolitern Phenol:Chloroform (1:1), äquilibriert gegen 10 mM Tris-HCl, 1 mM Na₂EDTA, extrahiert wird. Acht Mikroliter 5 M Ammoniumacetat und 150 Mikroliter 100%iger Ethanol bei –20°C werden dann zu der wässrigen Reaktionsmischung zugegeben, und die Probe wird 10 Minuten lang bei –20°C stehen gelassen, bevor sie 30 Minuten lang in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge bei 4°C zentrifugiert wird. Der Überstand wird verworfen, und das Pellet wird 3-5 Minuten lang unter Vakuum getrocknet. Das getrocknete Pellet wird dann in 10 Mikrolitern sterilem destilliertem Wasser resuspendiert, und die gesamte Probe wird in einem 0,8%igen Agarosegel mit 1 Mikrogramm/ml Ethidiumbromid in 1 × TBE-Puffer (89 mM Tris-OH, 89 mM Borsäure, pH 8,3, 2,5 mM Na₂EDTA) elektrophoretisch behandelt. Lineare Volllängen-pKK223-3-Plasmid-DNA wird unter Ultraviolettlicht von langer Wellenlänge sichtbar gemacht, und die lineare DNA-Bande wird mit einer Rasierklinge aus dem Gel ausgeschnitten. Gereinigte lineare Plasmid-DNA wird aus dieser Probe unter Verwendung von Gene-Clean (Bio 101, La Jolla, CA) gemäß den Spezifikationen des Herstellers oder ähnlichen Vorgehensweisen, wie Größenausschluss-Chromatographie; siehe Maniatis et al., siehe oben, S. 464-467, erhalten.
Lineare, Phosphatase-behandelte pKK223-3-DNA und angelagerte Oligonukleotide werden in einem Molverhältnis von 1:10 unter Verwendung von wenigstens 0,5 Mikrogramm pKK223-3-DNA in einer Lösung gemischt, welche 16 Mikroliter DNA in Wasser enthält. Dann werden 2 Mikroliter 10 × Ligase-Puffer (International Biotechnologies Inc.) und 2 Mikroliter T4-DNA-Ligase (New England Biolabs; 400 000 U/Mikroliter) zugegeben. Diese Ligations-Reaktionsmischung wird über Nacht bei 14-15°C inkubiert.
Kompetente Zellen des Escherichia coli-Stamms IG109 (I. Goldberg et al., "Cloning and expression of a collagen-analog-encoding synthetic gene in Escherichia coli, Gene 80, 1989, 305-314) werden durch herkömmliche Methoden hergestellt (siehe T. Maniatis, et al., op. cit., S. 250). Zwei Mikroliter der Ligationsreaktionsmischung werden auf Eis mit 100 Mikrolitern kompetenten Zellen gemischt, und die Mischung wird 30-60 Minuten lang auf Eis gelassen. Die Transformationsmischung wird dann 60 Sekunden lang bei 42°C erwärmt, zwei weitere Minuten lang auf Eis gekühlt, und dann werden 500 Mikroliter LB-Nährmedium (T. Maniatis et al., op. cit., S. 440) zugesetzt. Diese Zellmischung wird 45 Minuten lang bei 37°C inkubiert, die Zellen werden kurz abzentrifugiert, und der Überstand wird mit 200 Mikrolitern frischem LB-Nährmedium ersetzt. Portionen des resuspendierten Zellpellets werden dann auf LB/Ampicillin-Agar-Selektionsplatten ausplattiert, und die Platten werden über Nacht bei 37°C inkubiert. Auf den Selektionsplatten am nächsten Tag vorgefundene Bakterienkolonien werden durchrastert, um die Gegenwart des rekombinanten Plasmids durch Herstellen von Plasmid-Mini-Preps (T. Maniatis et al., op. cit., S. 368-369), Verdauen eines Teils jeder Plasmid-Mini-Prep mit EcoRI- und HindIII-Restriktionsenzymen und Analysieren der Verdauprodukte auf einem analytischen 0,8%igen Agarosegel in 1 × TBE-Puffer zu bestätigen.
Die regulierte Expression des synthetischen Gens für [(f)Met]-Magainin 2 wird durch Fermentieren eines rekombinanten Bakterienklons bei 37°C und Erhöhen der Temperatur der Kultur auf 42°C während 2-60 Minuten erreicht. Die Temperatur der Kultur kann dann 30-90 Minuten lang auf 37°C verringert werden, bevor die Zellen geerntet werden. Die bakterielle Zellpaste kann darin durch eine "French"-Presse hindurchgeleitet werden, und das [(f)Met]-Magainin 2 wird durch herkömmliche Methoden gereinigt; siehe zum Beispiel Kapitel 16 von Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg.: F. M. Ausubel et al.; Wiley Interscience, 1988.
BEISPIEL 19 – HERSTELLUNG VON AMPPPS ZUM VERGLEICH
Eine Reihe von Peptiden, welche zu den in dieser Erfindung beschriebenen AMPPP-Verbindungen verwandt sind, wurden für Vergleichszwecke erfordert. Magainin 2-OH (AMPPP #1) und Magainin 1-OH (AMPPP #2) wurden von Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, gekauft oder wurden unter Anwendung der in den Beispielen 1 und 3 beschriebenen Vorgehensweisen hergestellt. [Pro¹⁰]Mag 2-OH (AMPPP #4) wurde durch das in Beispiel 4 angegebene Verfahren synthetisiert, wurde jedoch durch präparative HPLC unter Verwendung von Bedingungen gereinigt, welche ähnlich zu denjenigen sind, die in Beispiel 3 angegeben werden. Die diastereomeren Sulfoxide [Met²¹(S) (O)]Mag 2-OH und [Met²¹ (R) (O)]Mag 2-OH (AMPPPs #6 und #7, die Stereochemie ist willkürlich zugewiesen) wurden durch präparative HPLC als Nebenprodukte aus der Synthese von Magainin 2 isoliert. [Des Met²¹]Mag 1-OH (AMPPP #8) wurde auf die gleiche Weise wie AMPPP #4 hergestellt. [Ala¹³, Ala¹⁸]Mag 2-OH (AMPPP #10) wurde durch das Verfahren von Beispiel 5 hergestellt. [Des Ser²³]Mag 2-OH (AMPPP #21) wurde in Beispiel 9 hergestellt. [Des Gly¹]Mag 1-OH (AMPPP #24) wurde in Beispiel 10 hergestellt. Mag 2-NH₂ (AMPPP #29) wurde von Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA erworben. Weil alle diese Peptide durch HPLC unter Verwendung von Wasser/Acetonitril, enthaltend 0,1 % TFA, gereinigt wurden, wird angenommen, dass sie sämtlich in der Form ihrer Trifluoracetat-Salze vorlagen. Alle der Peptide wurden mittels HPLC analysiert, und von ihnen wurde festgestellt, zu wenigstens 94 % rein zu sein.
Die Prinzipien, bevorzugten Ausführungsformen und Arten zur Ausübung der vorliegenden Erfindung sind in der vorangehenden Patentschrift beschrieben worden.

Claims

Ein antimikrobielles Peptid umfassend die Aminosequenz Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Xaa⁶-Xaa⁷-Xaa⁸-Ala-Xaa¹⁰-Xaa¹¹-Phe-Xaa¹³-Lys-Ala-Phe-Val-Xaa¹⁸-Xaa¹⁹-Ile-Xaa²¹-Lys-Xaa²³ worin: – Xaa⁶ ist Leu, – Xaa⁷ ist Lys oder Arg, – Xaa⁸ ist Glu, – Xaa¹⁰ ist eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gly, Leu, Val, Ala, Met, Thr, Ser, Trp, Tyr, Gln, Lys, Asn, Glu, His, Asp und Arg; – Xaa¹¹ ist eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Met, Trp, Tyr, Gln, Lys, His, Ser und Arg; – Xaa¹³ ist eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ala, Gly, Leu, Ile, Trp, Phe, Val; – Xaa¹⁸ ist eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ala, Gly, Thr, Trp, Tyr, Asp, Glu, Lys, Arg, Gln, His und Met; – Xaa¹⁹ ist eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ala und Glu; – Xaa²¹ ist eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Arg, Asp, His, Glu, Lys, Gln, Tyr, Thr, Trp, Met, Pro, 3Hyp, 4Hyp und Ala; – Xaa²³ ist eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ser, Thr, Val, Ala, Leu, Ile, Trp, Phe, His, Gln, Pro, 3Hyp, 4Hyp und Tyr, worin das Peptid eine gesteigerte Resistenz gegenüber proteolytischem Abbau durch extrazelluläre Pflanzenproteasen im Vergleich zu natürlichem Magainin 1 oder natürlichem Magainin 2 zeigt.
Ein antimikrobiotisches Peptid umfassend die Aminosequenz Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Xaa⁶-Xaa⁷-Xaa⁸-Ala-Xaa¹⁰-Xaa¹¹-Phe-Xaa¹³-Lys-Ala-Phe-Val-Xaa¹⁸-Xaa¹⁹-Ile-Xaa²¹-Asn-Xaa²³ worin: – Xaa⁶ ist Leu, – Xaa⁷ ist Lys oder Arg, – Xaa⁸ ist Glu, – Xaa¹⁰ ist eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gly, Leu, Val, Ala, Met, Thr, Ser, Trp, Tyr, Gln, Lys, Asn, Glu, His, Asp und Arg; – Xaa¹¹ ist eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Met, Trp, Tyr, Gln, Lys, His, Ser und Arg; – Xaa¹³ ist eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ala, Gly, Leu, Ile, Trp, Phe, Val; – Xaa¹⁸ ist eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ala, Gly, Thr, Trp, Tyr, Asp, Glu, Lys, Arg, Gln, His und Met; – Xaa¹⁹ ist eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ala und Glu; – Xaa²¹ ist eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Arg, Asp, His, Glu, Lys, Gln, Tyr, Thr, Trp, Met, Pro, 3Hyp, 4Hyp und Ala; – Xaa²³ ist eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ser, Thr, Val, Ala, Leu, Ile, Trp, Phe, His, Gln, Pro, 3Hyp, 4Hyp und Tyr, worin das Peptid eine gesteigerte Resistenz gegenüber proteolytischem Abbau durch extrazelluläre Pflanzenproteasen im Vergleich zu natürlichem Magainin 1 oder natürlichem Magainin 2 zeigt.
Peptid nach Anspruch 1 oder 2, worin das Carboxylende amidiert ist.
Peptid nach Anspruch 1 umfassend die Aminosequenz: Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-Xaa⁷-Glu-Ala-Gly-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-Gly-Glu-Ile-Met-Lys-Ser worin Xaa⁷ Arg oder Lys ist.
Peptid nach Anspruch 2 umfassend die Aminosäuresequenz: Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-Xaa⁷-Glu-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-Gly-Glu-Ile-Met-Asn-Ser worin Xaa⁷ Arg oder Lys ist.
Peptid nach Anspruch 4 umfassend die Aminosäuresequenz: Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-Arg-Glu-Ala-Gly-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-Gly-Glu-Ile-Met-Lys-Ser.
Peptid nach Anspruch 5 umfassend die Aminosäuresequenz: Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-Arg-Glu-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-Gly-Glu-Ile-Met-Asn-Ser.
Peptid nach einem der Ansprüche 1, 2, 4 und 5 weiterhin umfassend einen N-terminalen Met- oder (f)Met-Rest.
Peptid mit einer Länge von 21 bis 24 Aminosäureresten einschließlich der Aminosäuresequenz: Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-Arg-Glu-Ala-Gly-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-Gly-Glu-Ile-Met.
Peptid nach Anspruch 9 umfassend die Aminosäuresequenz: Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-Arg-Glu-Ala-Gly-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-Gly-Glu-Ile-Met-Lys.
Peptid nach Anspruch 9 umfassend einen N-terminalen Met- oder (f)Met-Rest.