TW202304949A - 用於害蟲防治之ａｖ３突變多肽 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示新的殺昆蟲肽、多肽、蛋白、及核苷酸，其在培養物及植物中之表現，生產該等肽、多肽、蛋白、及核苷酸之方法，新製程，新生產技術，新調配物，及新有機體。本揭示案亦係關於被稱為Av3突變多肽(AMP)的突變體，該等突變體為自海葵蛇鎖海葵( Anemonia viridis)中分離的肽Av3之非天然存在經修飾形式。在本文中描述了編碼可用於防治昆蟲之AMP的多核苷酸，多核苷酸及肽之各種調配物及組合，及其使用方法。

Description

用於害蟲防治之AV3突變多肽
本發明描述並且主張新殺昆蟲蛋白、核苷酸、肽、其在植物中之表現、生產該等肽之方法、新製程、生產技術、新肽、新調配物、以及新的及已知有機體之組合，其與用於防治昆蟲之相關肽之預期產率相比產生更大產率。
在世界範圍內，有害昆蟲對人類健康及食品安全構成威脅。昆蟲對人類健康構成威脅，因為其為疾病之載體。最臭名昭著之昆蟲疾病載體中之一者為蚊子。瘧蚊屬( Anopheles)之蚊子為寨卡病毒(Zika virus)、基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)及瘧疾(一種由錐蟲屬 (Trypanosoma)之原生動物引起的疾病)之主要載體。另一種蚊子埃及伊蚊 (Aedes aegypti)為導致黃熱病及登革熱之病毒之主要載體。並且，伊蚊屬( Aedes)某些種蚊子亦為導致各種類型腦炎之病毒的載體。班氏吳策線蟲 (Wuchereria bancrofti)及馬來布魯絲蟲 (Brugia malayi)為引起絲蟲病之寄生蛔蟲，通常由庫蚊屬( Culex)、曼蚊屬( Mansonia)及瘧蚊屬之蚊子傳播。
與蚊子類似，雙翅目 (Diptera)之其他成員自遠古以來亦同樣困擾著人類。除了產生使人痛苦之叮咬外，馬蠅及鹿蠅傳播土拉菌病(土拉巴斯德菌 (Pasteurella tularensis))及炭疽(炭疽芽孢桿菌 (Bacillus anthracis))之細菌病原體，以及在熱帶非洲引起羅阿絲蟲病之寄生蟲蛔蟲(羅阿羅阿絲蟲(Loa loa))。
綠頭蠅(大頭金蠅 (Chrysomya megacephala))及蒼蠅(家蠅 (Musca domestica))會在一瞬間自腐肉及糞便起飛，然後降落在我們的家中及我們的食物上，在其航跡傳播痢疾、傷寒、霍亂、脊髓灰質炎、雅司病(yaws)、麻風病、及肺結核。
潛蠅屬 (Hippelates)之眼蚋可攜帶導緻雅司病之螺旋體病原體(細密螺旋體 (Treponema pertenue))，亦可能傳播結膜炎(紅眼病)。舌蠅屬 (Glossina)之采采蠅傳播引起非洲昏睡病之原生動物病原體(岡比亞錐蟲 (Trypanosoma gambiense)及羅得西亞錐蟲 (T. rhodesiense))。白蛉屬 (Phlebotomus)之沙蠅為一種在南美洲引起卡里翁氏病(Carrion's disease)(奧羅亞熱(Oroyofever))之細菌(桿菌狀巴爾通體 (Bartonella bacilliformis))的載體。在亞洲及北非之部分地區，其傳播導致沙蠅熱(白蛉熱(Pappataci fever))之病毒原以及導致利甚曼病之原生動物病原體(利甚曼原蟲屬 (Leishmania)某些種)。
人類食品安全亦受到昆蟲威脅。昆蟲害蟲任意地攻擊指定用於商業目的及個人用途之食物作物；事實上，昆蟲害蟲造成之損害可囊括有些不便到前者之經濟損失，再到後者之營養不良或飢餓等極端情況。昆蟲害蟲亦會對馴養動物造成應力及疾病。而且，由於全球旅行及氣候變化，曾經受地理及氣候邊界限制之昆蟲害蟲已經擴大了其範圍。
本揭示案描述具有針對一或多個昆蟲物種之殺昆蟲活性的Av3突變多肽(AMP)，該AMP包含與根據式(I)：X 1-S-C-C-P-C-Y-W-X 2-X 3-C-P-W-G-Q-X 4-C-Y-P-X 5-G-C-X 6-G-X 7-X 8-X 9-X 10之胺基酸序列至少95%一致之胺基酸序列；其中相對於在SEQ ID NO：1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；其中X 1為K、H、Q、T、S、N、E、I、L、或V；X 2為G、P、或A；X 3為G、或N；X 4為N或D；X 5為E、D、或N；X 6為S、D、G、T、V、或R；X 7為P或不存在；X 8為K、H、A、R、G、T、D、或不存在；X 9為G、V、或不存在；X 10為G、I、或不存在；或其農業上可接受之鹽。
另外，本揭示案描述包含一或多種AMP、基本上由其組成、或由其組成的組合或混合物。
另外，本揭示案描述包含一或多種AMP、基本上由其組成、或由其組成，並且進一步包含賦形劑之組成物。
此外，本揭示案描述可操作來編碼AMP之多核苷酸，該AMP包含與根據式(I)：X 1-S-C-C-P-C-Y-W-X 2-X 3-C-P-W-G-Q-X 4-C-Y-P-X 5-G-C-X 6-G-X 7-X 8-X 9-X 10之胺基酸序列至少95%一致之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成；其中相對於在SEQ ID NO：1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；其中X 1為K、H、Q、T、S、N、E、I、L、或V；X 2為G、P、或A；X 3為G、或N；X 4為N或D；X 5為E、D、或N；X 6為S、D、G、T、V、或R；X 7為P或不存在；X 8為K、H、A、R、G、T、D、或不存在；X 9為G、V、或不存在；X 10為G、I、或不存在；或其農業上可接受之鹽。
另外，本揭示案描述生產AMP之方法，該方法包括：(a)製備包含第一表現匣之載體，該第一表現匣包含可操作來編碼AMP之多核苷酸、或其互補核苷酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該AMP包含與根據式(I)：X 1-S-C-C-P-C-Y-W-X 2-X 3-C-P-W-G-Q-X 4-C-Y-P-X 5-G-C-X 6-G-X 7-X 8-X 9-X 10之胺基酸序列至少95%一致之胺基酸序列；其中相對於在SEQ ID NO：1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；其中X 1為K、H、Q、T、S、N、E、I、L、或V；X 2為G、P、或A；X 3為G、或N；X 4為N或D；X 5為E、D、或N；X 6為S、D、G、T、V、或R；X 7為P或不存在；X 8為K、H、A、R、G、T、D、或不存在；X 9為G、V、或不存在；X 10為G、I、或不存在；將載體引入宿主細胞中；及(c)在可操作來實現AMP之表現及分泌至生長培養基中之條件下，使宿主細胞在生長培養基中生長。
另外，本揭示案描述保護植物以免受昆蟲影響之方法，該方法包括：提供表現AMP、或其編碼多核苷酸之植物。
另外，本揭示案描述防治昆蟲之方法，其包括向該昆蟲提供在其基因組中包含穩定併入之表現匣的轉殖基因植物，其中該穩定併入表現匣包含可操作來編碼AMP之多核苷酸。
另外，本揭示案描述抗擊、防治、或抑制害蟲之方法，包括將殺害蟲有效量之一或多種AMP、或其一或多種農業上可接受之鹽的組合、混合物、或組成物，或包含該等物質之組合或組成物應用於害蟲、害蟲之所在地、害蟲之食物供應、害蟲之棲息地、或害蟲之繁殖地；易受害蟲侵襲的植物、種子、植物部分、植物之所在地、或植物之環境；易受害蟲侵襲的動物、動物之所在地、或動物之環境；或其組合。
另外，本揭示案描述包含可操作來編碼AMP之多核苷酸的載體，該AMP具有與如SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169中之任一者中所闡明之胺基酸序列至少90%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸。
另外，本揭示案提供具有與如下胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致之胺基酸序列的AMP：「KSCCPCYWGGCPWGQDCYPDGCDGPK」(SEQ ID NO：20)；「KSCCPCYWGGCPWGQNCYPNGCSGPK」(SEQ ID NO：24)；「KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCDGPK」(SEQ ID NO：25)；「KSCCPCYWPGCPWGQNCYPEGCSGPK」(SEQ ID NO：26)；「KSCCPCYWPGCPWGQNCYPEGCRGPD」(SEQ ID NO：35)「KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPG」(SEQ ID NO：36)；「KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCGGPG」(SEQ ID NO：38)；及「KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPKVG」(SEQ ID NO：40)。
另外，本揭示案描述包含可操作來編碼AMP之多核苷酸的載體，該AMP具有與如SEQ ID NO：25、36、38、及40中之任一者中所闡明之胺基酸序列至少90%一致的胺基酸。
另外，本揭示案描述酵母菌株，其包含：包含可操作來編碼AMP之多核苷酸的第一表現匣，該AMP包含與根據式(I)：X 1-S-C-C-P-C-Y-W-X 2-X 3-C-P-W-G-Q-X 4-C-Y-P-X 5-G-C-X 6-G-X 7-X 8-X 9-X 10之胺基酸序列至少90%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列；其中相對於在SEQ ID NO：1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；其中X 1為K、H、Q、T、S、N、E、I、L、或V；X 2為G、P、或A；X 3為G、或N；X 4為N或D；X 5為E、D、或N；X 6為S、D、G、T、V、或R；X 7為P或不存在；X 8為K、H、A、R、G、T、D、或不存在；X 9為G、V、或不存在；X 10為G、I、或不存在；或其互補核苷酸序列。
另外，本揭示案描述具有針對一或多個昆蟲物種之殺昆蟲活性的Av3突變多肽(AMP)，該AMP包含與根據式 (II)：K-S-C-C-P-C-Y-W-G-G-C-P-W-G-Q-X 1-C-Y-P-X 2-G-C-X 3-G-P-X 4-X 5-X 6之胺基酸序列至少95%一致之胺基酸序列；其中相對於在SEQ ID NO：1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；X 1為N或D；X 2為E、D、或N；X 3為S、D、R、或G；X 4為K、G、或D；X 5為V或不存在；X 6為G或不存在；或其農業上可接受之鹽。
另外，本揭示案描述包含一或多種AMP、基本上由其組成、或由其組成的組合或混合物，該AMP包含與根據式(II)：K-S-C-C-P-C-Y-W-G-G-C-P-W-G-Q-X 1-C-Y-P-X 2-G-C-X 3-G-P-X 4-X 5-X 6之胺基酸序列至少95%一致之胺基酸序列；其中相對於在SEQ ID NO：1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；X 1為N或D；X 2為E、D、或N；X 3為S、D、R、或G；X 4為K、G、或D；X 5為V或不存在；X 6為G或不存在；或其農業上可接受之鹽。
另外，本揭示案描述包含一或多種AMP、基本上由其組成、或由其組成的組成物，該AMP包含與根據式(II)：K-S-C-C-P-C-Y-W-G-G-C-P-W-G-Q-X 1-C-Y-P-X 2-G-C-X 3-G-P-X 4-X 5-X 6之胺基酸序列至少95%一致之胺基酸序列；其中相對於在SEQ ID NO：1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；X 1為N或D；X 2為E、D、或N；X 3為S、D、R、或G；X 4為K、G、或D；X 5為V或不存在；X 6為G或不存在；或其農業上可接受之鹽，其中組成物進一步包含賦形劑。
另外，本揭示案描述具有針對一或多個昆蟲物種之殺昆蟲活性的Av3突變多肽(AMP)，該AMP包含與在SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169中之任一者中闡明之胺基酸序列至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成。
另外，本揭示案描述具有針對一或多個昆蟲物種之殺昆蟲活性的Av3突變多肽(AMP)，該AMP包含與在SEQ ID NO：20、24-26、35-36、38、及40中之任一者中闡明之胺基酸序列至少95%一致的胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成。
另外，本揭示案描述具有針對一或多個昆蟲物種之殺昆蟲活性的Av3突變多肽(AMP)，該AMP包含與在SEQ ID NO：25、36、38、及40中之任一者中闡明之胺基酸序列至少95%一致之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成。
另外，本揭示案描述具有針對一或多個昆蟲物種之殺昆蟲活性的Av3突變多肽(AMP)，該AMP包含在SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169中之任一者中闡明之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成。
另外，本揭示案描述具有針對一或多個昆蟲物種之殺昆蟲活性的Av3突變多肽(AMP)，該AMP包含在SEQ ID NO：20、24-26、35-36、38、及40中之任一者中闡明之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成。
另外，本揭示案描述具有針對一或多個昆蟲物種之殺昆蟲活性的Av3突變多肽(AMP)，該AMP包含在SEQ ID NO：25、36、38、及40中之任一者中闡明之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成。
另外，本揭示案描述具有針對一或多個昆蟲物種之殺昆蟲活性的Av3突變多肽(AMP)，該AMP包含在SEQ ID NO：38中闡明之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2021年4月1日提出申請之美國臨時申請案第63/169,643號之權益及優先權，該申請案之揭示內容全文以引用方式併入本文。 序列
本申請案將序列表以全文引用方式併入，該序列表命名為「225312-505616_SequenceListing_ST25.txt」(71 KB)，其係於2022年3月29日下午5時零4分創建，並且以電子方式隨同提出申請。 定義
「5’末端」及「3’末端」係指核苷酸聚合物(例如，DNA)之方向性，亦即，端對端取向。多核苷酸之5’末端為具有第五碳之多核苷酸之末端。
「5’及3’同源性臂」或「5’及3’臂」或「左及右臂」係指與宿主有機體中之靶基因組序列及/或所關注內源性基因同源性地重組以便達成宿主有機體之染色體基因座之成功遺傳修飾的載體及/或靶向載體中之多核苷酸序列。
「添加劑」係指任何農業上可接受之添加劑。農業上可接受之添加劑包括但不限於崩解劑、分散添加劑、塗層添加劑、稀釋劑、界面活性劑、吸收促進添加劑、抗結塊添加劑、抗微生物劑(例如，防腐劑)、著色劑、乾燥劑、增塑劑及染料。
「比對」係指將兩個或兩個以上序列(例如，核苷酸、多核苷酸、胺基酸、肽、多肽、或蛋白序列)出於確定其彼此關係之目的來進行比較的方法。比對通常藉由應用各種演算法之電腦程式來執行，然而，亦可手動執行比對。比對程式通常重複進行序列之潛在比對並且使用取代表來將比對評分，該等取代表使用各種策略來達到潛在最佳比對評分。通常使用之比對演算法包括但不限於CLUSTALW (參見Thompson J. D., Higgins D. G., Gibson T. J., CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680, 1994)；CLUSTALV (參見Larkin M. A.等人, CLUSTALW2, ClustalW and ClustalX version 2, Bioinformatics 23(21): 2947-2948, 2007)；Mafft；Kalign；ProbCons；及T-Coffee (參見Notredame等人, T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments, Journal of Molecular Biology 302: 205-217, 2000)。實行前述演算法中之一或多者的示例性程式包括但不限於來自DNAStar (DNAStar, Inc. 3801 Regent St. Madison, Wis. 53705)之MegAlign、MUSCLE、T-Coffee、CLUSTALX、CLUSTALV、JalView、Phylip、及來自Accelrys (Accelrys, Inc., 10188 Telesis Ct, Suite 100, San Diego, Calif. 92121)之Discovery Studio。在一些實施例中，比對將「相位偏移」及/或「空位」引入所比較序列中之一者或兩者中以便最大限度地提高兩個序列之間之相似性，並且評分係指在數量上表現所比對序列之相關性的過程。
「劑」係指一或多種化學物質、分子、核苷酸、多核苷酸、肽、多肽、蛋白、毒物、殺昆蟲劑、殺害蟲劑、有機化合物、無機化合物、原核生物有機體、或真核生物有機體、及由此等物質產生之劑。
「農業上可接受之載劑」包括通常用於殺害蟲劑調配物技術中之所有佐劑、惰性組分、分散劑、界面活性劑、增黏劑、黏合劑等；此等為熟習殺害蟲劑調配技術者熟知的。
「農業上可接受之鹽」與醫藥學上可接受之鹽同義，並且如本文使用，係指藉由製得其酸式或鹼式鹽來修飾之化合物。
「農桿菌感染」意謂藉由使用農桿菌根癌農桿菌 (A. tumefaciens)或發根農桿菌 (A. rhizogenes)來將DNA引入植物細胞的植物轉型方法。
「α-MF信號」或「αMF分泌信號」係指將新生重組多肽引導至分泌途徑之蛋白。
「AMP」或「Av3突變多肽」或「Av3b突變多肽」或「Av3b突變肽」係指相對於在SEQ ID NO：1中闡明之胺基酸序列，具有一或多個突變之肽。在一些實施例中，AMP可具有根據式(I)之胺基酸序列： X 1-S-C-C-P-C-Y-W-X 2-X 3-C-P-W-G-Q-X 4-C-Y-P-X 5-G-C-X 6-G-X 7-X 8-X 9-X 10 式 (I)其中X 1為K、H、Q、T、S、N、E、I、L、或V；X 2為G、P、或A；X 3為G、或N；X 4為N或D；X 5為E、D、或N；X 6為S、D、G、T、V、或R；X 7為P或不存在；X 8為K、H、A、R、G、T、D、或不存在；X 9為G、V、或不存在；X 10為G、I、或不存在。
在其他實施例中，AMP具有根據式(II)之胺基酸序列： K-S-C-C-P-C-Y-W-G-G-C-P-W-G-Q-X 1-C-Y-P-X 2-G-C-X 3-G-P-X 4-X 5-X 6 式 (II)其中X 1為N或D；X 2為E、D、或N；X 3為S、D、R、或G；X 4為K、G、或D；X 5為V或不存在；X 6為G或不存在。
「AMP表現匣」係指一或多個調控元件諸如啟動子；增強子元件；mRNA穩定多聚腺苷酸信號；內部核糖體進入位點(IRES)；內含子；轉錄後調控元件；及可操作來編碼AMP例如AMP ORF之多核苷酸。例如，AMP表現匣之一實例為含有可操作來表現AMP之多核苷酸區段、ADH1啟動子、LAC4終止子、及α-MF分泌信號的一或多個DNA區段。AMP表現匣含有編碼AMP或AMP殺昆蟲蛋白必不可少的所有核酸。
「AMP ORF」係指可操作來編碼AMP或AMP殺昆蟲蛋白之多核苷酸。
「AMP ORF圖表」係指以圖表或等式形式來書寫的一或多個AMP ORF之組成。例如，「AMP ORF圖表」可使用在表現ORF內所包含之DNA區段之縮寫字或簡寫引用來書寫。因此，在一個實例中，「AMP ORF圖表」可藉由分別以等式形式將DNA區段圖示為「 ersp」(亦即，編碼ERSP多肽之多核苷酸序列)；「 連接子」或「 L」(亦即，編碼連接子多肽之多核苷酸序列)；「 sta」(亦即，編碼STA多肽之多核苷酸序列)，及「 amp」(亦即，編碼AMP之多核苷酸序列)來描述編碼ERSP、連接子、STA、及AMP之多核苷酸區段。AMP ORF圖表之實例為「 ersp- sta-( 連接子 i- amp j) N」、或「 ersp-(amp j- 連接子 i ) N-sta 」及/或其DNA區段之任何組合。
「AMP殺昆蟲蛋白」或「AMP殺昆蟲多肽」或「殺昆蟲蛋白」或「殺昆蟲多肽」係指包含(1)至少一種AMP、或兩種或兩種以上AMP；及(2)額外肽、多肽、或蛋白的任何蛋白、肽、多肽、胺基酸序列、組態、或排列。例如，在一些實施例中，相對於單獨AMP，此等額外肽、多肽、或蛋白具有當昆蟲暴露於AMP殺昆蟲蛋白時，增加昆蟲之死亡率及/或抑制生長；增加該AMP殺昆蟲蛋白例如在宿主細胞或表現系統中之表現；及/或影響AMP殺昆蟲蛋白之轉譯後處理的能力。在一些實施例中，AMP殺昆蟲蛋白可為包含兩種或兩種以上AMP之聚合物。在一些實施例中，AMP殺昆蟲蛋白可為包含兩種或兩種以上AMP之聚合物，其中AMP經由連接子肽例如可裂解及/或不可裂解連接子來可操作地連接。在一些實施例中，AMP殺昆蟲蛋白可指與一或多種蛋白諸如穩定域(STA)；內質網信號轉導蛋白(ERSP)；昆蟲可裂解或昆蟲不可裂解連接子(L)；及/或其任何其他組合可操作地連接的一或多種AMP。在一些實施例中，AMP殺昆蟲蛋白可為包含(1) AMP；及(2)額外肽、多肽、或蛋白例如ERSP；連接子；STA；UBI；或組胺酸標籤或類似標誌物的非天然存在蛋白。
「AMP構築體」係指可操作連接多肽區段(例如，AMP殺昆蟲蛋白)之肽、多肽、及/或模體的三維排列/取向。例如，AMP ORF可包括以下組分或模體中之一或多者：AMP；內質網信號肽(ERSP)；連接子肽(L)；轉譯穩定蛋白(STA)；或其任何組合。並且，如本文使用，術語「AMP構築體」用於描述結構模體之名稱及/或取向。換言之，AMP構築體描述在給定AMP ORF內所包含之組分或模體之排列及取向。例如，在一些實施例中，AMP構築體描述(不限於)以下AMP殺昆蟲蛋白中之一者的取向：ERSP-AMP；ERSP-(AMP) N；ERSP-AMP-L；ERSP-(AMP) N-L；ERSP-(AMP-L) N；ERSP-L-AMP；ERSP-L-(AMP) N；ERSP-(L-AMP) N；ERSP-STA-AMP；ERSP-STA-(AMP) N；ERSP-AMP-STA；ERSP-(AMP) N-STA；ERSP-(STA-AMP) N；ERSP-(AMP-STA) N；ERSP-L-AMP-STA；ERSP-L-STA-AMP；ERSP-L-(AMP-STA) N；ERSP-L-(STA-AMP) N；ERSP-L-(AMP) N-STA；ERSP-(L-AMP) N-STA；ERSP-(L-STA-AMP) N；ERSP-(L-AMP-STA) N；ERSP-(L-STA) N-AMP；ERSP-(L-AMP) N-STA；ERSP-STA-L-AMP；ERSP-STA-AMP-L；ERSP-STA-L-(AMP) N；ERSP-(STA-L) N-AMP；ERSP-STA-(L-AMP) N；ERSP-(STA-L-AMP) N；ERSP-STA-(AMP) N-L；ERSP-STA-(AMP-L) N；ERSP-(STA-AMP) N-L；ERSP-(STA-AMP-L) N；ERSP-AMP-L-STA；ERSP-AMP-STA-L；ERSP-(AMP) N-STA-LERSP-(AMP-L) N-STA；ERSP-(AMP-STA) N-L；ERSP-(AMP-L-STA) N；或ERSP-(AMP-STA-L) N；其中N為1至200範圍內之整數。亦參見「結構模體」。
「Av3突變多核苷酸」係指編碼任何AMP之多核苷酸序列。術語「Av3突變多核苷酸」在用於描述Av3突變多核苷酸序列，例如在AMP開放讀框(ORF)中所包含之序列、其在載體中之包涵物時，及/或在描述編碼殺昆蟲蛋白之多核苷酸時，以小寫字母來書寫並且用斜體字，例如，「 amp」及/或「 Amp」。
「應用(applying/application/apply)」或「投與(administering/administration/administer)」意謂分配及/或以其他方式提供，並且係指任何應用方法或投與途徑。例如，應用可指，例如，應用AMP或其農業上可接受之鹽；或應用AMP或其農業上可接受之鹽，及一或多種賦形劑，例如，可噴淋組成物、發泡體；燃燒調配物；織物處理；表面處理；分散劑；微膠囊化，及其類似劑。「共應用」或「共投與」意謂兩種或兩種以上組分同時應用或投與；或一或多種組分恰好在應用其他一或多種組分之前、或剛剛在其之後得以應用或投與。例如，在一些實施例中，第一AMP及第二AMP，其中第一及第二AMP可相同或不同，可同時或依序應用或投與。
「Av3b」係指具有野生型Av3肽之N末端突變及C末端突變的AMP，其中N末端突變產生相對於SEQ ID NO:172之R1K之胺基酸取代，並且C末端突變產生相對於SEQ ID NO:172之胺基酸缺失；因此，在Av3b肽中，野生型Av3肽胺基酸序列自「RSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPKV」(SEQ ID NO：172)變化為胺基酸序列：「KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK」(SEQ ID NO:1)。
「二元載體」或「二元表現載體」意謂可在大腸桿菌菌株及農桿菌菌株兩者中自身複製之表現載體。又，該載體含有藉由左及右邊界序列來支撐之DNA區域(經常被稱為t-DNA)，該區域藉由待複製並且藉由農桿菌來遞送至植物細胞中之致病基因來識別。
「bp」或「鹼基對」係指包含彼此鍵結來形成之兩個化學鹼基的分子。例如，DNA分子由兩個捲繞鏈組成，其中各鏈具有由交替去氧核醣及磷酸鹽基團產生之主鏈。四個鹼基中之一者附接至各去氧核醣，亦即，腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、或胸腺嘧啶(T)，其中腺嘌呤與胸腺嘧啶形成鹼基對，並且胞嘧啶與鳥嘌呤形成鹼基對。
「C端」或「C末端」係指定位於多肽之末端上之自由羧基(亦即，-COOH)。
「cDNA」或「複本DNA」或「互補DNA」係指與RNA分子互補之分子。在一些實施例中，cDNA可為單鏈或雙鏈。在一些實施例中，cDNA可為在藉由反轉錄酶來催化之反應中自單鏈RNA模板合成之雙鏈DNA。在其他實施例中，「cDNA」係指共有在天然成熟mRNA物質中存在之序列元件之排列的所有核酸，其中序列元件為外顯子及3’及5’非編碼區域。通常，在間插內含子藉由細胞核RNA剪接來移除的情況下，mRNA物質具有連續外顯子，以便產生編碼蛋白之連續開放讀框。在一些實施例中，「cDNA」係指與mRNA模板互補並且衍生之DNA。
「CEW」係指玉米穗蛾。
「可裂解連接子」 參見連接子。
「選殖」係指關於插入來自一個來源之DNA區段(例如，通常所關注基因，例如 amp)及將其與來自另一個來源之DNA區段(例如，通常載體，例如，質體)重組並且通常藉由將重組DNA轉型至細菌或酵母宿主中來引導重組DNA、或「重組體DNA」複製的過程及/或方法。
「編碼序列」或「CDS」係指在置於合適調控序列之控制下並且在必需轉錄及/或轉譯分子因子存在下，可轉錄(例如，在DNA的情況下)或轉譯(例如，在mRNA的情況下)成肽、多肽、或蛋白的多核苷酸或核酸序列。編碼序列之邊界藉由5’(胺基)末端之轉譯起始密碼子及3’(羧基)末端之轉譯終止密碼子來確定。轉錄終止序列通常位於編碼序列之3’。在一些實施例中，編碼序列可在5’及/或3’末端上藉由非轉譯區域來側接。在一些實施例中，編碼序列可用於產生肽、多肽、或蛋白產物。在一些實施例中，編碼序列可或可不融合至另一個編碼序列或定位信號，諸如細胞核定位信號。在一些實施例中，編碼序列可選殖至載體或表現構築體中、可整合至基因組中、或可作為DNA片段存在。
「密碼子最佳化」係指產生一或多個內源、天然、及/或野生型密碼子用最終仍然編碼相同胺基酸，但是在相應宿主中受青睞之密碼子來置換的基因。
「組合」係指將兩個或兩個以上單獨組分組合之結果。因此，如本文使用，「組合」係指兩個或兩個以上單獨組分，例如，AMP及額外組分的締合。因此，在一些實施例中，組合可指第一AMP、及一或多個額外AMP的締合；其中第一AMP與一或多個額外AMP相同或不同。在一些實施例中，組合可為例如混合物，或作為進一步包含一或多種賦形劑的組成物之一部分。在一些實施例中，組合可指同時、單獨、或依序應用兩個或兩個以上單獨組分(例如，第一AMP、及一或多個額外AMP；其中第一AMP與一或多個額外AMP相同或不同)。例如，在一些實施例中，「組合」係指同時應用第一AMP、及一或多個額外AMP兩者的結果；其中第一AMP與一或多個額外AMP相同或不同。在另一實施例中，「組合」係指單獨應用第一AMP、及一或多個額外AMP之結果；其中第一AMP與一或多個額外AMP相同或不同。在進一步實施例中，「組合」係指依序應用兩個或兩個以上單獨組分之結果，例如，首次應用第一AMP，繼之以其次應用一或多個額外AMP(其中第一AMP與一或多個額外AMP相同或不同)，或反之亦然。當應用係依序或分離時，應用第二組分之延遲不應使得失去該組合之有益作用。
「互補」係指如熟習此項技術者理解，兩個多核苷酸之相互作用表面的拓撲相容性或匹配在一起。因此，若兩個序列能夠彼此雜交以形成穩定反平行、雙鏈核酸結構，則其彼此「互補」。若第一多核苷酸之核苷酸序列與第二多核苷酸之多核苷酸結合配偶體之核苷酸序列基本上一致，或若第一多核苷酸可在嚴格雜交條件下雜交至第二多核苷酸，則第一多核苷酸與第二多核苷酸互補。因此，其序列為5’-TATAC-3’之多核苷酸與其序列為5’-GTATA-3’之多核苷酸互補。
「條件培養基」意謂由細胞來使用並且用細胞衍生材料來富集但是不含有細胞的細胞培養基。
「複本數」係指在任何時候，存在於宿主細胞中之載體、表現匣、擴增單元、基因或事實上任何規定核苷酸序列之一致複本之數目。例如，在一些實施例中，基因或另一個規定染色體核苷酸序列可以一個、兩個、或更多個複本存在於染色體中。自主複製載體可以每個宿主細胞一個、或幾百個複本存在。
「培養物」或「細胞培養物」係指將細胞保持於人工、活體外環境中。
「培養」係指有機體在各種培養基上或中之繁殖。例如，術語「培養」可意謂使細胞群體在合適條件下在液體或固體培養基中生長。在一些實施例中，培養係指所關注之異源多肽及/或其他所需最終產物(通常在容器或反應器中)之發酵重組生產。
「胱胺酸」係指氧化半胱胺酸二聚體。胱胺酸為經由兩個半胱胺酸分子之氧化來獲得之含硫胺基酸，並且用二硫鍵連接。
「確定成分培養基」意謂由已知化學組分組成但是不含有粗蛋白質提取物或副產物諸如酵母提取物或蛋白腖的培養基。
「簡併性」或「密碼子簡併性」係指一個胺基酸可藉由不同核苷酸密碼子來編碼的現象。因此，編碼蛋白或多肽之核酸分子的核酸序列可由於簡併性而導致變化。由於遺傳密碼之簡併性，許多核酸序列可編碼具有特定活性之給定多肽；此等功能等效變異體涵蓋在本文中。
「二硫鍵」或「二硫橋鍵」係指在兩個半胱胺酸胺基酸之間，藉由其側鏈上之兩個硫醇基團之偶合而產生的共價鍵。在一些實施例中，二硫鍵經由存在於多肽中之兩個不同硫醇基團(-SH)之氧化折疊而發生。在一些實施例中，多肽可包含至少六個不同硫醇基團(亦即，六個半胱胺酸殘基各自含有硫醇基團)；因而，在一些實施例中，多肽可形成零、一個、兩個、三個、或更多個分子內二硫鍵。
「雙重表現匣」係指在同一載體上所包含之兩個AMP表現匣。
「雙重轉殖基因肽表現載體」或「雙重轉殖基因表現載體」意謂含有AMP表現匣之兩個複本的酵母表現載體。
「DNA」係指可排列成單鏈或雙鏈形式之去氧核糖核酸，其包含一或多個去氧核糖核苷酸或核苷酸(亦即，腺嘌呤[A]、鳥嘌呤[G]、胸腺嘧啶[T]、或胞嘧啶[C])之聚合物。例如，一或多個核苷酸產生多核苷酸。
「dNTP」係指構成DNA及RNA之核苷三磷酸。
「內源性」係指天然地發生及/或存在於有機體中之多核苷酸、肽、多肽、蛋白、或過程，例如，在特定遺傳調處之前已經存在於宿主細胞中之分子或活性。
「增強子元件」係指可操作地連接至啟動子之DNA序列，其可相對於在不存在增強子元件時由啟動子產生之轉錄活性，對於啟動子發揮增加之轉錄活性。
「ER」或「內質網」為所有真核生物共有的亞細胞之細胞器，其中發生一些轉譯後修飾過程。
「ERSP」或「內質網信號肽」為胺基酸之N端序列，在編碼AMP之mRNA分子之蛋白轉譯期間，該序列藉由宿主細胞信號識別顆粒來識別並且結合，從而將蛋白轉譯核糖體/mRNA複合物移動至細胞質中之ER。結果為蛋白轉譯暫停直到其與ER對接為止，其中該轉譯繼續進行並且將所得蛋白注入ER中。
「 ersp」係指對肽ERSP進行編碼之多核苷酸。
「ER轉運」意謂將細胞表現蛋白運輸至ER中以便轉譯後修飾、分選及運輸。
「賦形劑」係指可添加至農業組成物、製劑、及/或調配物的任何農業或醫藥學上可接受之添加劑、載劑、界面活性劑、乳化劑、增稠劑、防腐劑、溶劑、崩解劑、助流劑、潤滑劑、稀釋劑、填充劑、增積劑、黏合劑、軟化劑、硬化劑、螯合劑、穩定劑、溶解劑、分散劑、懸浮劑、抗氧化劑、消毒劑、濕潤劑、潤濕劑、芳香劑、懸浮劑、色素、著色劑、等滲劑、黏度增強劑、黏膜黏著性劑、及/或其任何組合，其可適用於達成農業組成物、製劑、及/或調配物之特性之所需修飾。此等修飾包括但不限於物理穩定性、化學穩定性、殺害蟲功效、及/或其任何組合。
「表現匣」係指(1)所關注之DNA序列，例如，可操作來編碼AMP之多核苷酸；及以下中之一或多者：(2)啟動子、終止子、及/或增強子元件；(3)合適mRNA穩定多聚腺苷酸信號；(4)內部核糖體進入位點(IRES)；(5)內含子；及/或(6)轉錄後調控元件。(1)與(2)-(6)中之至少一者的組合被稱為「表現匣」。在一些實施例中，可存在選殖至載體中之許多表現匣。例如，在一些實施例中，可存在包含可操作來編碼AMP之多核苷酸的第一表現匣。在替代實施例中，存在各自包含可操作來編碼AMP之多核苷酸的兩個表現匣(亦即，雙重表現匣)。在其他實施例中，存在可操作來編碼AMP之三個表現匣(亦即，三重表現匣)。在一些實施例中，雙重表現匣可藉由將第二表現匣次選殖至含有第一表現匣之載體中來產生。在一些實施例中，三重表現匣可藉由將第三表現匣次選殖至含有第一及第二表現匣之載體中來產生。關於表現匣及選殖技術之方法在此項技術中為熟知的並且在本文中描述。亦參見AMP表現匣。
「FECT」意謂使用狐尾草嵌紋病毒的瞬時植物表現系統，其中披蓋蛋白基因及三重基因塊得以消除。
「發酵醪」係指用經轉型之宿主細胞(例如，可操作來表現本揭示案之AMP的酵母細胞)來接種並且消耗的廢發酵培養基，亦即，移除有機體之後的發酵培養基上清液。在一些實施例中，發酵醪係指在轉型宿主細胞發酵之後回收的溶液。術語「發酵」廣泛地係指在受控條件(例如，溫度、氧、pH、營養物、及其類似條件)下藉由微生物之有機物質(例如，碳源物)營養物質之酶促及厭氧或需氧分解，從而產生發酵產物(例如，一或多種本揭示案肽)。雖然如本文使用之發酵通常描述在厭氧條件下發生之過程，但是不希望該術語僅限於嚴格厭氧條件，因為本文使用之術語「發酵」亦可發生於在氧存在下發生之過程。
「GFP」意謂來自水母維多利亞水母 (Aequorea victoria)之綠色螢光蛋白。
「生長培養基」係指用於使細胞在活體外生長之營養物培養基。
「同源」係指兩個多肽之間或兩個核酸分子之間的序列相似性或序列一致性。當兩個比較序列中之位置同時藉由相同鹼或胺基酸單體亞單位來佔據時，例如，若兩個DNA分子中之每一者中之位置藉由腺嘌呤來佔據時，則該等分子在該位置處為同源的。兩個序列之間之同源性百分比隨著兩個序列共有之匹配或同源位置之數目除以所比較位置之數目×100而變化。因此，在一些實施例中，術語「同源」係指兩個多肽分子之間，或兩個核酸分子之間的序列相似性。當兩個比較序列中之位置同時藉由相同鹼或胺基酸單體亞單位來佔據時，例如，若兩個DNA分子中之每一者中之位置藉由腺嘌呤來佔據時，則該等分子在該位置處為同源的。兩個序列之間之同源性隨著兩個序列共有之匹配或同源位置之數目而變化。例如，若兩個序列中之10個位置中的6個匹配或同源，則兩個序列為60%同源的。舉例而言，DNA序列ATTGCC及TATGGC共有50%同源性。
可存在部分同源性，或完全同源性並且因此為一致的。「序列一致性」係指兩個或兩個以上核酸序列或兩個或兩個以上多肽序列之間之相關性的量度，並且作為關於總比較長度之百分比來給出。一致性計算考慮到具有一致性並且處於其相應更大序列中之相同相對位置中的彼等核苷酸殘基或胺基酸殘基。
「同源重組」係指一個DNA區段藉由具有一致或幾乎一致區域(同源)的另一個區段來取代之事件。例如，在一些實施例中，「同源重組」係指核苷酸序列在兩個類似或一致DNA分子之間進行交換的一種類型之遺傳重組。簡言之，同源重組藉由細胞來最廣泛地用於精確地修復在DNA之兩個鏈上發生的有害斷裂，其被稱為雙鏈斷裂。雖然同源重組在不同有機體及細胞類型之間廣泛地變化，但是大多數形式涉及相同基本步驟：在雙鏈斷裂發生之後，在被稱為切除之過程中，將在斷裂之5′末端周圍之DNA區段切去。在之後鏈侵入步驟中，斷裂DNA分子之突出3′末端然後「侵入」未斷裂的類似或一致DNA分子。鏈侵入之後，一系列其他事件可遵循兩個主要途徑中之任一者，亦即，雙鏈斷裂修復途徑，或合成依賴性鏈黏接途徑。同源重組在所有三個生命領域以及病毒中為保守的，表明其為幾乎普遍的生物機制。例如，在一些實施例中，同源重組可使用位點特異性整合(SSI)序列來發生，其中在核苷酸組成方面基本上相似的核酸序列之間，發生鏈交換跨越事件。此等跨越事件可在本發明之靶向構築體中所包含之序列(亦即，SSI序列)與內源性基因組核酸序列(例如，編碼肽亞單位之多核苷酸)之間發生。另外，在一些實施例中，可發生一個以上位點特異性同源重組事件為可能的，導致在靶向構築體中所包含之核酸序列置換存在於內源性基因組序列內之特定序列的置換事件。
「雜交(hybridize)」係指基於充分理解之序列互補性原則，一個單鏈多核苷酸黏接至另一個多核苷酸。在一些實施例中，另一個多核苷酸為單鏈多核苷酸。多核苷酸之間之雜交傾向視其環境之溫度及離子強度、多核苷酸之長度、及互補程度而定。此等參數對於雜交之效應在此項技術中為熟知的。
「雜交(hybridization)」係指多核苷酸之鏈經由鹼基配對來與互補鏈結合之任何過程。兩個單鏈多核苷酸當其形成雙鏈成對物時「雜交」。因此，如本文使用，術語「雜交」係指基於較好理解之序列互補性原則，一個單鏈多核苷酸黏接至另一個多核苷酸。在一些實施例中，另一個多核苷酸為單鏈多核苷酸。多核苷酸之間之雜交傾向視其環境之溫度及離子強度、多核苷酸之長度、及互補程度而定。此等參數對於雜交之效應在此項技術中為熟知的。當兩個單鏈多核苷酸雜交並且形成雙鏈成對物時，雙鏈區域可包括單鏈多核苷酸中之一者或兩者之全長，或一個單鏈多核苷酸之全部及另一個單鏈多核苷酸之子序列，或雙鏈區域可包括每一個多核苷酸之子序列。雜交亦包括形成含有某些失配之成對物，限制條件為兩個鏈仍然形成雙鏈螺旋。參見以下 「嚴格雜交條件」。
「IC 50」或「IC50」係指半最大抑制濃度，其為抑制生物過程達一半所需藥劑之數量的量測結果，由此提供該藥劑之效力之量度。
「一致性」係指兩個或兩個以上多肽序列或兩個或兩個以上多核苷酸序列之間之關係，如藉由比較該等序列來確定。術語「一致性」亦意謂視情況而定，多肽或多核苷酸序列之間之序列相關程度，如藉由成串的此等序列之間之匹配來確定。「一致性」及「相似性」可藉由熟習此項技術者已知的許多方法中之任一者來容易地計算，包括但不限於在以下中描述之方法：Computational Molecular Biology, Lesk, A. M.編, Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W.編, Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M.及Griffin, H. G.編, Humana Press, New Jersey, 1994:, Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987；及Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.及Devereux, J.編, M Stockton Press, New York, 1991；及Carillo, H.及Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)，其揭示內容以全文引用方式併入本文。此外，確定一致性及相似性之方法在可公開獲得電腦程式中編寫。例如在一些實施例中，確定兩個序列之間之一致性及相似性的方法包括但不限於GCG套裝程式(Devereux, J.等人, Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984))、BLASTP、BLASTN、及FASTA (Altschul, S. F.等人, J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990)。BLAST X程式可公開獲自NCBI及其他來源(BLAST Manual, Altschul, S.等人, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894；Altschul, S.等人, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)，其揭示內容以全文引用方式併入本文。
「活體內」係指植物或動物之活體(例如，動物、植物或細胞)及在植物或動物之活體內發生之過程或反應。
「無活性」係指某物不處於使用狀態中之情況，例如處於休眠狀態及/或不工作。例如，在用於基因之上下文中時或在涉及基因時，術語無活性意謂該基因不再主動地合成基因產物、使該基因產物轉譯成蛋白，或以其他方式使基因執行其正常功能。例如，在一些實施例中，術語無活性可指基因轉錄RNA失敗，RNA處理(例如，預mRNA處理；RNA剪接；或其他轉錄後修飾)失敗；干擾非編碼RNA成熟；干擾RNA輸出(例如，自細胞核至細胞質)；干擾轉譯；蛋白折疊；易位；蛋白傳送；及/或抑制及/或干擾參與任何前述過程之分子多核苷酸、肽、多肽、蛋白、轉錄因子、調節劑、抑制劑、或其他因子中之任一者。
「抑制(inhibiting/inhibit)」或「抗擊(combating/combat)」或「防治(controlling/control)」或此等術語之任何變化形式係指使得某事物(例如，害蟲之數目、害蟲之功能及/或活動、及/或害蟲對於易受其侵襲之植物或動物的有害影響)在規模、數量、強度、或程度上更小。例如，在一些實施例中，將殺害蟲有效量之AMP或其農業上可接受之鹽、或包含AMP或其農業上可接受之鹽的農業組成物應用至(i)害蟲、害蟲之所在地、害蟲之食物供應、害蟲之棲息地、或害蟲之繁殖地；(ii)易受害蟲侵襲的植物、種子、植物部分、植物之所在地、或植物之環境；(iii) 易受害蟲侵襲的動物、動物之所在地、或動物之環境；或(iv)其組合導致以下效果：相對於未暴露於殺害蟲有效量之AMP或其農業上可接受之鹽或包含AMP或其農業上可接受之鹽的農業組成物的害蟲之數目或其活動，害蟲之數目減少，或害蟲之活動受到抑制(例如，害蟲死亡、停止或減慢其運動；停止或減慢其攝食；停止或減慢其成長；例如在導航、定位食物、睡眠行為及/或交配方面變得混淆；無法化蛹(若適用)；干擾害蟲之繁殖；及/或阻止害蟲產生後代及/或阻止昆蟲產生可生育後代)。
在一些實施例中，抗擊、防治、或抑制害蟲包括任何可量測減少或完全抑制以便達成所需結果。例如，與未處理害蟲相比，用本揭示案之肽及/或組成物來處理之害蟲之數目或其活動可減少約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、或更多。如本文使用之約意謂在給定值之±10%，較佳±5%內。
因此，在一些實施例中，術語「抗擊、防治或抑制害蟲」係指相對於沒有接受殺害蟲有效量之本揭示案之AMP或其農業組成物的害蟲之數量，或害蟲活動(例如，運動；攝食；生長；例如關於導航、定位食物、睡眠行為、及/或交配之意識或警覺程度；化蛹(若適用)；繁殖；產生後代之能力及/或產生可生育後代之能力)的抑制，接受殺害蟲有效量之本揭示案之AMP或其農業組成物的害蟲之數量得以減少，或害蟲活動(例如，運動；攝食；生長；例如關於導航、定位食物、睡眠行為、及/或交配之意識或警覺程度；化蛹(若適用)；繁殖；產生後代之能力及/或產生可生育後代之能力)得以抑制至少約0.1%、至少約0.2%、至少約0.3%、至少約0.4%、至少約0.5%、至少約0.6%、至少約0.7%、至少約0.8%、至少約0.9%、至少約1%、至少約1.25%、至少約1.5%、至少約1.75%、至少約2%、至少約2.25%、至少約2.5%、至少約2.75%、至少約3%、至少約3.25%、至少約3.5%、至少約3.75%、至少約4%、至少約4.25%、至少約4.5%、至少約4.75%、至少約5%、至少約5.25%、至少約5.5%、至少約5.75%、至少約6%、至少約6.25%、至少約6.5%、至少約6.75%、至少約7%、至少約7.25%、至少約7.5%、至少約7.75%、至少約8%、至少約8.25%、至少約8.5%、至少約8.75%、至少約9%、至少約9.25%、至少約9.5%、至少約9.75%、至少約10%、至少約11%、至少約12%、至少約13%、至少約14%、至少約15%、至少約16%、至少約17%、至少約18%、至少約19%、至少約20%、至少約21%、至少約22%、至少約23%、至少約24%、至少約25%、至少約26%、至少約27%、至少約28%、至少約29%、至少約30%、至少約31%、至少約32%、至少約33%、至少約34%、至少約35%、至少約36%、至少約37%、至少約38%、至少約39%、至少約40%、至少約41%、至少約42%、至少約43%、至少約44%、至少約45%、至少約46%、至少約47%、至少約48%、至少約49%、至少約50%、至少約50%、至少約51%、至少約52%、至少約53%、至少約54%、至少約55%、至少約56%、至少約57%、至少約58%、至少約59%、至少約60%、至少約61%、至少約62%、至少約63%、至少約64%、至少約65%、至少約66%、至少約67%、至少約68%、至少約69%、至少約70%、至少約71%、至少約72%、至少約73%、至少約74%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約100%、或大於100%。
「不可操作」係指某物不起作用、出故障、或不再能夠起作用的情況。例如，在用於基因之上下文中時或在涉及基因時，術語不可操作意謂該基因永久或暫時地不再能夠像通常那樣起作用。例如，在一些實施例中，「不可操作」意謂基因不再能夠合成基因產物，使該基因產物轉譯成蛋白，或另外不能使基因執行其正常功能。例如，在一些實施例中，術語不可操作可指基因轉錄RNA失敗，RNA處理(例如，預mRNA處理；RNA剪接；或其他轉錄後修飾)失敗；干擾非編碼RNA成熟；干擾RNA輸出(例如，自細胞核至細胞質)；干擾轉譯；蛋白折疊；易位；蛋白傳送；及/或抑制及/或干擾參與任何前述過程之分子多核苷酸、肽、多肽、蛋白、轉錄因子、調節劑、抑制劑、或其他因子中之任一者。
「昆蟲」包括「昆蟲綱」中之所有有機體。術語「成蟲前」昆蟲係指成蟲期之前的任何形式之有機體，包括例如卵、幼蟲、及若蟲。如本文所用，術語「昆蟲」係指任何節肢動物及線蟲，包括蟎類及已知侵染所有作物、蔬菜及樹木之昆蟲，並且包括在林業、園藝及農業領域被視為害蟲的昆蟲。可用本文揭示之方法來保護之特定作物之實例為大豆、玉米、棉花、紫花苜蓿及蔬菜作物。在本文中附有特定作物及昆蟲之清單。
「昆蟲腸道環境」或「腸道環境」意謂在昆蟲或昆蟲幼蟲之前、中或後腸道內發現之特定pH及蛋白酶條件。
「昆蟲血淋巴環境」意謂在昆蟲或昆蟲幼蟲內發現之特定pH及蛋白酶條件。
「殺昆蟲活性」意謂在使昆蟲暴露於化合物、劑、或肽時或之後，昆蟲死亡、停止或減慢其運動；停止或減慢其攝食；停止或減慢其成長；變得混淆(例如在導航、定位食物、睡眠行為及/或交配方面)；無法化蛹(若適用)；干擾繁殖；及/或阻止昆蟲產生後代及/或阻止昆蟲產生可生育後代)。
「間插連接子」係指將蛋白之不同部分分離的蛋白中之較短肽序列，或置於ORF中之讀框中以便將上游與下游DNA序列分離的較短DNA序列。例如，在一些實施例中，可使用允許蛋白在轉譯期間達成其獨立二級及三級結構形成的間插連接子。在一些實施例中，間插連接子可對於植物細胞環境、昆蟲及/或鱗翅目腸道環境、及昆蟲血淋巴及鱗翅目血淋巴環境中之裂解具有抗性或易感性。
「經分離」係指將某物及/或組分自其自然環境中分離，例如，自給定屬類或物種中分離之毒素意謂該毒素與其自然環境分離。
「kb」係指千鹼基，亦即，1000個鹼基。如本文使用，術語「kb」意謂核酸分子之長度。例如，1 kb係指1000個核苷酸長度之核酸分子。1 kb長的雙鏈DNA之長度含有兩千個核苷酸(亦即，每一個鏈上有一千)。或者，1 kb長的單鏈RNA之長度含有一千個核苷酸。
「kDa」係指千道爾頓，等於1,000道爾頓之單位；「道爾頓」或「Da」為分子量(MW)之單位。
「KD 50」或「擊倒劑量50」或「癱瘓劑量50」或「PD 50」係指導致例如並且不限於家蠅(常見家蠅)群體、或埃及伊蚊(蚊子)群體之群體的50%癱瘓或停止運動所需要之中值劑量。
「敲入(Knock in/knock-in/knocks-in/knocking-in)」係指內源性基因用外源性或異源性基因或其部分來置換。例如，在一些實施例中，術語「敲入」係指藉由同源重組，將編碼所需蛋白之核酸序列引入靶基因座位，由此導致表現所需蛋白。在一些實施例中，「敲入」突變可修飾基因序列以便產生功能喪失型或功能獲得型突變。術語「敲入」可指將外源或異源多核苷酸序列或其片段引入基因組中的程序(例如，「他們執行敲入」或「他們敲入異源基因」)、或所得細胞及/或有機體(例如，「細胞為「敲入」細胞」或「動物為「敲入」動物)。
「剔除(knock out/knockout/knock-out/knocks-out/knocking-out)」係指部分或完全抑制藉由細胞中之內源性DNA序列來編碼之蛋白的表現基因產物(例如，mRNA)。在一些實施例中，「剔除」可藉由編碼肽、多肽、或蛋白之完整基因、或基因之一部分的靶向缺失來實現。因此，缺失可使得某個基因在完整有機體中之任何細胞及/或通常表現其之細胞中無活性、部分地無活性、不可操作、部分地不可操作、或以其他方式減少基因或其產物之表現。術語「剔除」可指使得內源性基因完全地或部分地無活性或不可操作的程序(例如，「他們執行剔除」或「他們剔除內源性基因」)，或所得細胞及/或有機體(例如，細胞為「剔除」細胞或動物為「剔除」動物)。
「 l」或「 連接子」係指編碼間插連接子肽之核苷酸。
「L」或「連接子」在適當的上下文中係指間插連接子肽，其將轉譯穩定蛋白(STA)與額外多肽，例如，AMP，及/或多個AMP連接。當涉及胺基酸，「L」亦可意謂白胺酸。
「LAC4終止子」或「Lac4終止子」係指包含衍生自乳酸克魯維斯酵母β-半乳糖苷酶基因之轉錄終止子序列的DNA區段。
「鱗翅目腸道環境」意謂在鱗翅目昆蟲或幼蟲之前、中或後腸道內發現之特定pH及蛋白酶條件。
「鱗翅目血淋巴環境」意謂在鱗翅目昆蟲或幼蟲內發現之特定pH及蛋白酶條件。
「LD 20」係指殺傷20%群體所需要之劑量。
「LD 50」係指致命劑量50，意謂殺傷50%群體所需要之劑量。
「連接子(linker/LINKER)」或「肽連接子」或「L」或「間插連接子」係指可操作來將兩個肽連接在一起的較短肽序列。連接子亦可指置於ORF之讀框中以便將上游與下游DNA序列分離的較短DNA序列。在一些實施例中，連接子可藉由昆蟲蛋白酶來裂解。在一些實施例中，連接子可允許蛋白在轉譯期間達成其獨立二級及三級結構形成。在一些實施例中，連接子可對於植物細胞環境、昆蟲及/或鱗翅目腸道環境、及/或昆蟲血淋巴及鱗翅目血淋巴環境中之裂解具有抗性或易感性。在一些實施例中，連接子可藉由蛋白酶來裂解，例如，在一些實施例中，連接子可藉由植物蛋白酶(例如，木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶、獼猴桃素、生薑蛋白酶、及/或卡多素(cardosin))、昆蟲蛋白酶、真菌蛋白酶、脊椎動物蛋白酶、無脊椎動物蛋白酶、細菌蛋白酶、哺乳動物蛋白酶、爬行動物蛋白酶、或鳥類蛋白酶來裂解。在一些實施例中，連接子可為可裂解或不可裂解的。在一些實施例中，連接子包含二元或三元區域，其中各區域可藉由至少兩種類型之蛋白酶來裂解：一者為昆蟲及/或線蟲蛋白酶並且另一者為人類蛋白酶。在一些實施例中，連接子可具有(至少)三個作用中之一者：在昆蟲腸道環境中裂解，在植物細胞中裂解，或被設計成不有意地裂解。
「害蟲之所在地」係指害蟲之棲息地；害蟲之食物供應；害蟲之繁殖地；害蟲經過或棲息之區域；被害蟲侵染、食用、使用之材料；及/或害蟲棲息、使用、存在或預期存在之任何環境。在一些實施例中，害蟲之所在地包括但不限於害蟲棲息地；害蟲食物供應；害蟲繁殖地；害蟲區域；害蟲環境；可能被害蟲經常光顧及/或侵染之任何表面或位置；易受害蟲侵襲之任何植物或動物、或植物或動物之所在地；及/或任何可能發現、預計會發現或可能受到害蟲侵襲之表面或位置。
「植物之所在地」係指植物生長之任何地方；播撒植物之任何植物繁殖材料之地方；將植物之植物繁殖材料放入土壤的任何地方；或任何儲存植物之區域，包括但不限於活植物及/或收穫之植物、葉子、種子、果實或其部分。
「動物之所在地」係指動物生活、進食、繁殖、睡眠或以其他方式存在之任何地方。
「培養基(medium)」(複數「培養基(media)」)係指用於在細胞培養物中培養細胞之營養溶液。
「MOA」係指作用機制。
「分子量(MW)」係指分子之質量或重量，通常以「道爾頓(Da)」或千道爾頓(kDa)為單位來量測。在一些實施例中，MW可使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，分析超速離心法、或光散射來計算。在一些實施例中，SDS-PAGE方法如下：所關注之樣品在具有一組分子量標準之凝膠上分離。使樣品運行，並且然後，將凝膠用所需染色劑來處理，隨後脫色約2至14小時。下一個步驟為確定標準及所關注蛋白之相對遷移距離( Rf)。遷移距離可使用以下等式來確定：
Figure 02_image001
式 (III)
隨後，MW之對數可基於對於標準中之條帶所獲得的值來確定；例如，在一些實施例中，將SDS變性多肽之分子量之對數及其相對遷移距離( Rf)在圖表中作圖。在將圖表作圖之後，插入衍生值提供未知蛋白條帶之分子量。
「模體」係指牽涉到具有某種生物學意義及/或發揮某種效應或涉及某個生物學過程的多核苷酸或多肽序列。
「多選殖位點」或「MCS」係指存在於載體上之DNA區段，其含有可插入所關注之DNA序列的許多限制位點。
「突變體」係指具有改變或變化(例如，在核苷酸序列或胺基酸序列中)的有機體、DNA序列、胺基酸序列、肽、多肽、或蛋白，該改變或變化導致該有機體及/或序列不同於與突變體進行比較的天然存在或野生型有機體、野生型序列、及/或參考序列。在一些實施例中，此改變或變化可為一或多個核苷酸及/或胺基酸取代或修飾(例如，缺失或添加)。在一些實施例中，一或多個胺基酸取代或修飾可為保守的；在本文中，相對於其非突變形式，「突變體」中之此保守胺基酸取代及/或修飾不實質性減少突變體之活性。例如，在一些實施例中，在與具有如藉由SEQ ID NO來指示之所揭示及/或請求保護序列的肽進行比較時，「突變體」具有一或多個保守胺基酸取代。
「N端」或「N末端」係指定位於多肽之開始或起始處之自由胺基(亦即，-NH 2)。
「NCBI」係指國家生物技術資訊中心。
「nm」係指奈米。
「非極性胺基酸」為呈弱疏水性之胺基酸並且包括甘胺酸、丙胺酸、脯胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、苯丙胺酸及甲硫胺酸。甘胺酸或gly為用於本發明之二肽的最佳非極性胺基酸。
「標準化肽產率」意謂條件培養基中之肽產率除以量測肽產率之時點的對應細胞密度。肽產率可藉由在單位體積中之所產生肽之質量來表示，例如，mg/升或mg/L，或藉由HPLC層析中之所產生肽之UV吸收峰面積來表示，例如，mAu.sec。細胞密度可藉由在600 nm之波長下之培養物之可見光吸收率(OD600)來表示。
「OD」係指光學密度。通常，OD使用分光光度計來量測。當量測細胞群體之隨著時間之生長時，OD600優於UV光譜；此歸因於在600 nm波長下，細胞不會像其在太多UV光下那樣受到傷害。
「OD660nm」或「OD 660nm」係指在660奈米(nm)下，在分光光度計中量測時，所量測液體樣品(例如，酵母細胞培養物)之光學密度。
「單字母代碼」意謂以其單字母代碼來列出以便區分蛋白之一級結構中之不同胺基酸的肽序列：丙胺酸=A，精胺酸=R，天冬醯胺=N，天冬胺酸=D，天冬醯胺或天冬胺酸=B，半胱胺酸=C，麩胺酸=E，麩醯胺酸=Q，麩醯胺酸或麩胺酸=Z，甘胺酸=G，組胺酸=H，異白胺酸=I，白胺酸=L，離胺酸=K，甲硫胺酸=M，苯丙胺酸=F，脯胺酸=P，絲胺酸=S，蘇胺酸=T，色胺酸=W，酪胺酸=Y，及纈胺酸=V。
「開放讀框」或「ORF」係指在轉譯起始信號(例如分別為AUG或ATG)與已知終止密碼子中之任何一者或多者之間的RNA或DNA序列之長度，其編碼一或多個多肽序列。換言之，ORF描述如自轉譯RNA代碼之核糖體視角所發現的參照架構，只要因為核糖體未遇到終止密碼子，核糖體能夠保持解讀(亦即，將胺基酸添加至新生蛋白)。因此，「開放讀框」或「ORF」係指在編碼序列之轉譯啟始與終止密碼子之間編碼的胺基酸序列。在本文中，術語「起始密碼子」及「終止密碼子」係指編碼序列中之三個相鄰核苷酸之單位(亦即，密碼子)，其指定蛋白質合成(mRNA轉譯)之相應啟始及鏈終止。
在一些實施例中，ORF為開始於起始密碼子(對於DNA而言，通常為ATG並且對於RNA而言為AUG)並且結束於終止密碼子(通常UAA、UAG或UGA)的密碼子之連續鏈段。在其他實施例中，ORF可為在轉譯起始信號(例如AUG或ATG)與已知終止密碼子中之任何一者或多者之間的RNA或DNA序列之長度，其中該長度之RNA或DNA序列編碼一或多個多肽序列。在一些其他實施例中，ORF可為編碼開始於ATG起始密碼子並且結束於TGA、TAA或TAG終止密碼子之蛋白的DNA序列。ORF亦可意謂DNA編碼的所轉譯蛋白。一般而言，基於「開放讀框」之最廣泛定義僅涵蓋不含有終止密碼子之一系列密碼子的事實，熟習此項技術者將術語「開放讀框」及「ORF」與術語「編碼序列」進行區分。因此，雖然ORF可含有內含子，但是編碼序列藉由參考可劃分成實際上藉由核糖體轉譯機制來轉譯成胺基酸之密碼子的彼等核苷酸(例如，串聯外顯子)來區分(亦即，編碼序列不含有內含子)；然而，如本文使用，術語「編碼序列」；「CDS」；「開放讀框」；及「ORF」可互換使用。
「可操作」係指被使用之能力、做某事之能力、及/或實現某個功能或結果之能力。例如，在一些實施例中，「可操作」係指多核苷酸、DNA序列、RNA序列、或其他核苷酸序列或基因編碼肽、多肽、及/或蛋白之能力。例如，在一些實施例中，多核苷酸可操作來編碼蛋白，此意味著多核苷酸含有賦予其產生蛋白(例如，藉由轉錄mRNA，進而轉譯成蛋白)之能力的資訊。
「可操作地連接」係指一種並置，其中以此方式描述之組分處於允許其以其規定方式來起作用之關係中。例如，在一些實施例中，可操作連接可指兩個或兩個以上DNA、肽、或多肽序列。在其他實施例中，可操作連接可意謂兩個相鄰DNA序列安置在一起以使得一個DNA序列之轉錄活化可作用於另一個DNA序列。在其他實施例中，術語「可操作連接」可指兩個或兩個以上肽及/或多肽，其中該兩個或兩個以上肽及/或多肽以產生單一多肽鏈之方式來連接；或者，術語可操作連接可指兩個或兩個以上肽以使得一個肽對於另一者發揮某種效應之方式來連接。在其他實施例中，可操作連接可指兩個相鄰DNA序列安置在一起以使得一者之轉錄活化可作用於另一者。
「出局重組(out-recombined/out-recombination)」係指在活體內同源重組期間，移除由兩個位點特異性重組位點(例如，與靶載體之同源性臂同源的靶基因之5’-及3’-核苷酸序列)來側接的基因及/或多核苷酸序列(例如，內源性基因、轉殖基因、異源多核苷酸等)。在一些實施例中，術語「出局重組」係指其中內源性基因例如在同源重組期間得以移除的過程。在其他實施例中，術語「出局重組」係指其中異源多核苷酸經由宿主細胞固有的分子機制來移除的過程。
「害蟲」包括但不限於昆蟲、真菌、細菌、線蟲、蟎蟲、蜱蟲、及其類似物。
「殺害蟲有效量」係指能夠實現以下中之一或多者的殺害蟲劑之量：引起至少一個害蟲死亡；或顯著地減少害蟲生長、攝食、或正常生理發育。此量變化取決於諸如例如待防治之特定目標害蟲，待處理之特定環境、位置、植物、作物、或農業場地，環境條件，及殺害蟲有效多肽組成物之方法、速率、濃度、穩定性、及應用數量的因素。調配物亦可考慮到氣候條件、環境考慮因素、及/或應用頻率及/或害蟲侵染之嚴重性而變化。
「醫藥學上可接受之鹽」與農業上可接受之鹽同義，並且如本文使用，係指藉由製得其酸式或鹼式鹽來修飾之化合物。
「植物」意謂完整植物、植物組織、植物細胞、植物部分、植物器官(例如，葉、莖、根、等)、種子、繁殖體、胚胎及其後代。植物細胞可分化或未分化(例如愈傷組織、懸浮培養細胞、原生質體、葉細胞、根細胞、韌皮部細胞、及花粉)。
「植物轉殖基因蛋白」意謂來自異源物種之蛋白，在將編碼該蛋白之DNA或RNA遞送至一個或多個植物細胞中之後，該蛋白在植物中表現。
「植物併入保護劑」或「PIP」意謂藉由轉殖基因植物來產生之殺昆蟲蛋白，及植物產生蛋白必不可少的遺傳物質。
「植物可裂解連接子」意謂可裂解連接子肽、或編碼可裂解連接子肽之核苷酸，其含有植物蛋白酶識別位點並且可在植物細胞中之蛋白表現過程期間得以裂解。
「植物再生培養基」意謂含有植物生長之必需元素及維生素及促進細胞再生至胚胎必不可少的植物激素的任何培養基，該胚胎可發芽並且產生源自組織培養之小植物。通常，培養基含有可選擇劑，轉殖基因細胞表現賦予針對該可選擇劑之抗性的選擇基因。
「質體」係指如下DNA區段，該區段充當所關注基因之載體，並且在轉型或轉染至有機體中時，可與宿主有機體無關地複製並且表現在質體內所包含之DNA序列。質體為一種類型之載體，並且可為「選殖載體」(亦即，用於選殖DNA片段且/或經由某種選擇指示劑來選擇帶有該質體之宿主群體的簡單質體)或「表現質體」(亦即，用於產生大量多核苷酸及/或多肽之質體)。
「極性胺基酸」為呈極性之胺基酸並且包括絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、組胺酸、色胺酸及酪胺酸；較佳極性胺基酸為絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、天冬醯胺及麩醯胺酸；其中絲胺酸為最高度較佳的。
「多核苷酸」係指任何長度的聚合物形式之核苷酸(例如，核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、或其類似物)；例如，兩個或兩個以上核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸之序列。如本文使用，術語「多核苷酸」包括雙及單鏈DNA，以及雙及單鏈RNA；其亦包括經修飾及未經修飾形式之多核苷酸(對於及涉及多核苷酸之修飾例如可包括甲基化、磷酸化、及/或加帽)。在一些實施例中，多核苷酸可為以下中之一者：基因或基因片段(例如，探針、引子、EST、或SAGE標籤)；基因組DNA；基因組DNA片段；外顯子；內含子；信使RNA(mRNA)；轉移RNA；核糖體RNA；核酶；cDNA；重組多核苷酸；分支多核苷酸；質體；載體；任何序列之分離DNA；任何序列之分離RNA；核酸探針；前述中之任一者之引子或擴增複本。
在其他實施例中，多核苷酸可指可操作來編碼基因之開放讀框的聚合物形式之核苷酸。
在一些實施例中，多核苷酸可指cDNA。
在一些實施例中，多核苷酸可具有任何三維結構並且可執行任何已知或未知功能。多核苷酸之結構亦可藉由其指示多核苷酸之方向性的5’-或3’-末端或終端來提及。單鏈多核苷酸中之相鄰核苷酸通常藉由其3’與5’碳之間之磷酸二酯鍵來連接。然而，亦可使用不同核苷酸間鍵，諸如包括亞甲基、胺基磷酸酯鍵等之鍵。此意謂相應5’及3’碳可在可被稱為5’及3’末端或終端的多核苷酸之任一末端處暴露。由於附接至彼等末端之化學基團，5’及3’末端亦可分別被稱為磷醯基(PO 4)及羥基(OH)末端。術語多核苷酸亦係指雙及單鏈分子兩者。除非另外規定或要求，否則製得或使用多核苷酸之任何實施例涵蓋雙鏈形式及已知或預測可構成該雙鏈形式之兩個互補單鏈形式中之每一者。
在一些實施例中，多核苷酸可包括經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及核苷酸類似物(包括具有非天然鹼基之核苷酸、具有經修飾天然鹼基諸如氮雜或去氮嘌呤等之核苷酸)。若存在對於核苷酸結構之修飾，則該等修飾可在組裝多核苷酸之前或之後賦予。
在一些實施例中，多核苷酸亦可在聚合之後，諸如藉由與標記組分偶聯來進一步修飾。另外，多核苷酸中之核苷酸之序列可藉由非核苷酸組分來中斷。多核苷酸之一或多個末端可受保護或以其他方式經修飾以便防止該末端以特定方式(例如形成共價鍵)與其他多核苷酸相互作用。
在一些實施例中，多核苷酸可由四個核苷酸鹼基之特定序列組成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鳥嘌呤(G)；及胸腺嘧啶(T)。當多核苷酸為RNA時，尿嘧啶(U)亦可例如作為胸腺嘧啶之天然置換物存在。尿嘧啶亦可用於DNA中。因此，術語「序列」係指多核苷酸或包含天然及非天然鹼基之任何核酸分子的字母表示。
術語「RNA分子」或核糖核酸分子係指具有核糖而非去氧核糖及通常尿嘧啶而非胸腺嘧啶作為嘧啶鹼基中之一者的多核苷酸。本發明之RNA分子通常為單鏈的，但是亦可為雙鏈的。在來自RNA樣品之RNA分子的情形下，RNA分子可包括自細胞核、粒線體或葉綠體中之DNA轉錄之單鏈分子，該等分子具有與其藉以被轉錄之DNA鏈互補的核苷酸鹼基之線性序列。
在一些實施例中，多核苷酸可進一步包含一或多個異源調控元件。例如，在一些實施例中，調控元件為一或多個啟動子；增強子；沉默子；操作子；剪接信號；多聚腺苷酸信號；終止信號；RNA輸出元件、內部核糖體進入位點(IRES)；聚U序列；或其組合。
「轉錄後調控元件」為在mRNA轉錄之後影響其的DNA區段及/或機制。轉錄後機制之機制包括剪接事件；加帽、剪接、及添加聚(A)尾，及熟習此項技術者已知之其他機制。
「啟動子」係指RNA聚合酶與其結合並且啟始基因之轉錄的DNA區域。
在此文件中，「蛋白」具有與「肽」及/或「多肽」相同的含義。
「比率」係指兩個數量之間之定量關係，顯示一個數值包含另一個數值的倍數或包含於另一個數值內的倍數。
「讀框」係指雙鏈DNA分子之六個可能讀框中之一者，在每個方向上有三個讀框。所使用之讀框確定在DNA分子之編碼序列內，哪些密碼子用於編碼胺基酸。在一些實施例中，讀框為將多核苷酸及/或核酸(例如，DNA或RNA)中之核苷酸序列劃分成一組連續、不重疊三聯體的方式。
「重組DNA」或「rDNA」係指包含兩個或兩個以上不同DNA區段的DNA。
「重組載體」意謂插入外來DNA的DNA質體載體。
「調控元件」係指控制核酸序列之表現及/或處理之某個態樣的遺傳元件。例如，在一些實施例中，調控元件可在轉錄及轉錄後水準下存在。調控元件可為順式調控元件 (CRE)、或反式調控元件(TRE)。在一些實施例中，調控元件可為一或多個啟動子；增強子；沉默子；操作子；剪接信號；多聚腺苷酸信號；終止信號；RNA輸出元件，內部核糖體進入位點(IRES)；聚U序列；及/或例如以組織特異性方式、時間依賴性方式來影響基因表現以便增加或減少表現及/或導致組成性表現的其他元件。
「限制酶」或「限制性核酸內切酶」係指在指定限制位點處使DNA裂解的酶。例如，限制酶可在EcoRI、SacII或BstXI限制位點處使質體裂解，從而使質體得以線性化，並且所關注之DNA得以連接。
「限制位點」係指包含4至8個核苷酸之序列，並且其序列藉由特定限制酶來識別的DNA上之位置。
「選擇基因」意謂賦予經遺傳修飾之有機體在選擇壓力下生長之優勢的基因。
「 sp.」或「sp.」係指物種。
「 ssp.」或「 subsp.」或「ssp.」或「subsp.」係指亞種。
「次選殖(subcloning/subcloned)」係指將DNA自一個載體轉移至另一個通常有利載體的過程。例如，在選擇用pKLAC1質體來轉型之酵母菌落之後，編碼突變AMP之多核苷酸可次選殖至pLB102質體中。
「SSI」為與上下文相關之縮寫字。在一些上下文中，其可指「位點特異性整合」，用於係指允許活體內同源重組在宿主有機體之基因組內之特定位點處發生的序列。因此，在一些實施例中，術語「位點特異性整合」係指將轉殖基因引導至宿主有機體之基因組中之目標位點的過程，從而允許將所關注之基因整合至宿主有機體之預先選擇基因組位置中。然而，在其他上下文中，SSI可指「在戶內表面噴淋」，其為將可變體積可噴淋體積之殺昆蟲劑應用於諸如牆壁、窗戶、地板及天花板的載體停留之表面上的技術。
「STA」或「轉譯穩定蛋白」或「穩定域」或「穩定蛋白」(在本文中可互換使用)意謂肽或蛋白具有足夠三級結構以使得其可在細胞中積聚而不被蛋白降解之細胞性過程所靶向。蛋白可為5與50之間之胺基酸長度。轉譯穩定蛋白藉由蛋白之DNA序列來編碼，該序列與ORF中之編碼殺昆蟲蛋白或AMP之序列可操作地連接。可操作連接之STA可處於AMP之上游或下游並且可在兩個序列(STA及AMP)之間具有任何間插序列，只要間插序列不導致任一DNA序列之碼組偏移。轉譯穩定蛋白亦可具有增加AMP橫過腸壁遞送並且進入昆蟲之血淋巴中的活性。
「 sta」意謂編碼轉譯穩定蛋白之核苷酸。
「嚴格雜交」或「嚴格雜交條件」係指多核苷酸(例如，核酸探針、引子或寡核苷酸)雜交至其通常處於複雜核酸混合物中之目標序列，但是不雜交至其他序列的條件。嚴格雜交條件為序列及長度依賴性的，並且取決於一定長度之核苷酸殘基上之一致性%(百分比)(或錯配%)。與較短序列相比，較長序列在更高溫度下特異性地雜交。一般而言，對於規定離子強度及pH而言，嚴格條件被選擇為比特定序列之熱熔點(Tm)低約5℃。嚴格條件亦可藉由添加諸如甲醯胺之去穩定劑來達成。在一些實施例中，本揭示案之多核苷酸可嚴格雜交至編碼AMP之多核苷酸、或其互補核苷酸序列。例如，在一些實施例中，本揭示案之多核苷酸可嚴格雜交至可操作來編碼具有如SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169中之任一者中所闡明之胺基酸序列之AMP的多核苷酸、或其互補核苷酸序列。
「結構模體」係指肽及/或多肽之三維排列、及/或可操作連接多肽區段之排列。例如，包含ERSP-STA-L-AMP之多肽具有ERSP模體、STA模體、連接子模體、及AMP多肽模體。
「易受害蟲侵襲」係指易受害蟲或害蟲感染之植物、或人類或動物患者或個體。
「毒素」係指毒液及/或毒物，尤其藉由某些動物、高等植物、及病原性細菌來產生之蛋白或偶聯蛋白。一般而言，術語「毒素」為保留天然產物，例如在蠍子、蜘蛛、蛇、毒蘑菇等中發現之分子及肽，而術語「毒物」保留用於例如人造化學殺害蟲劑之人造產物及/或人工產物。然而，如本文使用，術語「毒素」及「毒物」同義使用。
「轉染」及「轉型」均係指將外源及/或異源DNA或RNA(例如，含有編碼CRIP之多核苷酸的載體)引入宿主有機體(例如，原核生物或真核生物)中的過程。一般而言，熟習此項技術者有時保留術語「轉型」來描述其中將外源及/或異源DNA或RNA引入細菌細胞中之過程；並且保留術語「轉染」用於描述將外源及/或異源DNA或RNA引入真核細胞中之過程。然而，如本文使用，術語「轉型」及「轉染」同義使用，不論是否過程描述引入外源及/或異源DNA或RNA至原核生物(例如，細菌)或真核生物(例如，酵母、植物、或動物)中。
「轉殖基因」意謂轉型至有機體及/或來自該有機體之細胞中的異源及/或外源多核苷酸序列。
「轉殖基因宿主細胞」或「宿主細胞」意謂用基因來轉型並且經由額外選擇基因來選擇其轉殖基因狀態的細胞。
「轉殖基因植物」意謂自用外來DNA轉型以使得植物中之每個細胞含有該轉殖基因的單一細胞衍生的植物。
「瞬時表現系統」意謂將編碼經解毒植物病毒之DNA遞送至植物細胞中的基於根癌農桿菌之系統，在該細胞中，該病毒得以表現。植物病毒經工程化以便多達總可溶性蛋白(TSP)之40%的較高濃度來表現所關注蛋白。
「三重表現匣」係指在同一載體上所包含之三個AMP表現匣。
「TRBO」意謂使用其中病毒披蓋蛋白基因得以移除之菸草嵌紋病毒的瞬時植物表現系統。
「胰蛋白酶裂解」意謂使用蛋白酶胰蛋白酶(其識別暴露離胺酸及精胺酸胺基酸殘基)來在該裂解位點處分離可裂解連接子的活體外分析。其亦意謂裂解該位點之胰蛋白酶的行為。
「TSP」或「總可溶性蛋白」意謂可自植物組織樣品中提取並且溶解於提取緩衝液中的蛋白之總量。
「 var.」係指 品種或變種。術語「var.」用於指示位列於物種水準及/或亞種(當存在時)以下的分類類別。在一些實施例中，術語「var.」表示在次要但是永久或可遺傳特性方面，與相同亞種或物種之其他成員不同的成員。
「載體」係指接受可操作來編碼所關注之肽的異源多核苷酸(例如， amp)的DNA區段。異源多核苷酸被稱為「插入物」或「轉殖基因。」
「野生型(wild type/wild-type/wildtype)」或「WT」係指有機體、多核苷酸序列、及/或多肽序列在其天然存在之狀態或狀況中被發現及/或觀察到之表型及/或基因型(亦即，外觀或序列)。
「產率」係指肽之產量，並且增加之產率可意謂增加之生產量、增加之生產速率、及增加之平均或中值產率及更高產率之增加頻率。當如在「植物之產率」中，用於涉及植物作物生長及/或產量時，術語「產率」係指由植物產生之生物質的品質及/或數量。
在整個本說明書中，除非另外特別說明或上下文另外要求，否則提及單一步驟、組成物、群組步驟或組成物群組應理解為涵蓋一個及複數個(亦即，一或多個)步驟、組成物、群組步驟或組成物群組。
除非另外指示，否則本揭示案使用分子生物學、微生物學、病毒學、重組DNA技術、固相及液體核酸合成、溶液中之肽合成、固相肽合成、免疫學、細胞培養、及調配物之習知技術，加以適當實驗來執行。此等程序描述於例如Sambrook, Fritsch及Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, 第二版(1989)第I、II、及III卷全部；DNA Cloning: A Practical Approach, 第I及II卷(D. N. Glover編, 1985), IRL Press, Oxford全部文本；Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (M. J. Gait編, 1984) IRL Press, Oxford全部文本，尤其其中第1-22頁由Gait所著之論文；Atkinson等人第35-81頁；Sproat等人第83-115頁；及Wu等人第135-151頁；4. Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (B. D. Hames及S. J. Higgins編, 1985) IRL Press, Oxford全部文本；Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach (1986) IRL Press, Oxford全部文本；Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Methods In Enzymology (S. Colowick及N. Kaplan編, Academic Press, Inc.)全部文本；J. F. Ramalho Ortigao, 「The Chemistry of Peptide Synthesis」 In: Knowledge database of Access to Virtual Laboratory website (Interactiva, Germany)；Sakakibara, D., Teichman, J., Lien, E. Land Fenichel, R. L. (1976). Biochem. Biophys. Res. Commun. 73 336-342；Merrifield, R. B. (1963). J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154；Barany, G.及Merrifield, R. B. (1979) in The Peptides (Gross, E. and Meienhofer, 第3版)，第2卷，第1-284頁, Academic Press, New York. 12. Wiinsch, E.編(1974) Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie (Muler, E.編), 第15卷，第4版，第1部分及第2部分，Thieme, Stuttgart；Bodanszky, M. (1984) Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M.及Bodanszky, A. (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. (1985) Int. J. Peptide Protein Res. 25, 449-474; Handbook of Experimental Immunology, 第I-IV卷(D. M. Weir及C. C. Blackwell編, 1986, Blackwell Scientific Publications)；及Animal Cell Culture: Practical Approach, 第三版(John R. W. Masters編, 2000)；此等 參考文獻中之每一者以全文引用方式併入本文。
雖然本發明之揭示內容出於清楚及理解之目的而詳細描述，但是熟習此項技術者顯而易知可在隨附申請專利範圍之範圍內實施某些修改。本文引用之所有公開案及專利文件出於所有目的，以全文引用形式併入本文，其引用程度如同每一者經個別地指示一般。
在整個本說明書中，除非上下文另外要求，否則措詞「包含(comprise)」或諸如「包含(comprises)」或「包含(comprising)」之變化形式應理解為暗示包括所陳述步驟或要素或整數或步驟或要素或整數之群組但是不排除任何其他步驟或要素或整數或要素或整數之群組。
本文提及之所有專利申請案、專利案、及印刷出版物以全文引用方式併入，其引用程度如同個別公開案、專利案、或專利申請案各自特定地及個別地指示為以全文引用方式併入一般。並且，本文引用之所有專利申請案、專利案、及印刷出版物以全文引用方式併入本文，除了任何定義、標的物免責聲明、或拒絕承擔責任以外，並且除了所併入材料與本文中之明示揭示內容不一致以外，在此情況下以本揭示案中之措辭為準。 Av3b 突變肽 (AMP)
海葵蛇鎖海葵 (Anemonia viridis)具有其用來保衛自已的各種毒素：此等毒素中之一者為神經毒素「Av3」。Av3為一種III型海葵毒素，可抑制受體位點3處之電壓門控鈉(Na +)通道之失活，從而導致收縮性麻痺。Av3毒素與位點3之結合導致鈉通道之失活狀態變得不穩定，進而導致通道保持在開放位置中(參見Blumenthal等人，Voltage-gated sodium channel toxins: poisons, probes, and future promise. Cell Biochem Biophys. 2003; 38(2):215-38)。Av3對甲殼類動物及昆蟲鈉通道具有高選擇性，而對哺乳動物鈉通道具有低選擇性(參見Moran等人，Sea anemone toxins affecting voltage-gated sodium channels - molecular and evolutionary features, Toxicon. 2009年12月15日; 54(8): 1089–1101)。提供來自蛇鎖海葵之示例性Av3多肽，其具有胺基酸序列「RSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPKV」(SEQ ID NO:172)(NCBI登錄號P01535.1)。
在一些實施例中，野生型Av3可突變，例如，野生型Av3可具有N末端突變及C末端突變，其中N末端突變產生相對於SEQ ID NO:172之R1K之胺基酸取代，並且C末端突變產生相對於SEQ ID NO:172之胺基酸缺失；因此，野生型Av3肽胺基酸序列自「RSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPKV」(SEQ ID NO：172)變化為胺基酸序列：「KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK」(SEQ ID NO:1)。
當野生型Av3具有R1K突變及C末端缺失，產生具有胺基酸序列SEQ ID NO：1之肽時，所得肽被稱為「Av3b」。獲得Av3b之示例性方法在PCT申請案第PCT/US2019/051093號中揭示，其揭示內容以全文引用方式併入本文。
Av3b肽具有使其優於野生型Av3之特性。參見PCT/US2019/051093。然而，發明人已開發Av3b之新穎及創造性突變，導致肽具有合乎需要及意想不到的性質；此等突變肽被稱為Av3突變多肽(AMP)。 示例性 AMP
在一些實施例中，Av3突變多肽(AMP)可為不同於野生型Av3(SEQ ID NO:172)的突變體或變異體，例如，在一些實施例中，此變化可為胺基酸取代、胺基酸缺失/插入、或編碼AMP之多核苷酸之變化。此變化之結果為相對於WT Av3之非天然存在多肽及/或編碼該多肽之多核苷酸序列，該多肽具有針對一或多個昆蟲物種之殺昆蟲活性。
在一些實施例中，AMP可為不同於具有如SEQ ID NO：1中所闡明之胺基酸序列之Av3b肽的突變體或變異體。在一些實施例中，Av3b肽可藉由創建野生型Av3肽之N末端突變及C末端突變來產生，其中N末端突變產生相對於SEQ ID NO:172之R1K之胺基酸取代，並且C末端突變產生相對於SEQ ID NO:172之胺基酸缺失；因此，野生型Av3肽胺基酸序列可自「RSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPKV」(SEQ ID NO：172)變化為胺基酸序列：「KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK」(SEQ ID NO:1)。
在一些實施例中，具有針對一或多個昆蟲物種之殺昆蟲活性的Av3突變多肽(AMP)包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該胺基酸序列與根據式(I)：X 1-S-C-C-P-C-Y-W-X 2-X 3-C-P-W-G-Q-X 4-C-Y-P-X 5-G-C-X 6-G-X 7-X 8-X 9-X 10之胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致；其中相對於在SEQ ID NO：1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；其中X 1為K、H、Q、T、S、N、E、I、L、或V；X 2為G、P、或A；X 3為G、或N；X 4為N或D；X 5為E、D、或N；X 6為S、D、G、T、V、或R；X 7為P或不存在；X 8為K、H、A、R、G、T、D、或不存在；X 9為G、V、或不存在；X 10為G、I、或不存在；或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，具有針對一或多個昆蟲物種之殺昆蟲活性的Av3突變多肽(AMP)包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該胺基酸序列與根據式(II)：K-S-C-C-P-C-Y-W-G-G-C-P-W-G-Q-X 1-C-Y-P-X 2-G-C-X 3-G-P-X 4-X 5-X 6之胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致；其中相對於在SEQ ID NO：1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；X 1為N或D；X 2為E、D、或N；X 3為S、D、R、或G；X 4為K、G、或D；X 5為V或不存在；X 6為G或不存在；或其農業上可接受之鹽。
發明人評估Av3b肽之172個突變。下表提供具有賦予新穎及意想不到性質之突變的本文評估AMP之概述。表1提供相對於Av3b，賦予至少一種新穎性質之AMP的概述。表2提供相對於Av3b，賦予兩種或兩種以上新穎性質之AMP的概述。在本申請案末尾提供所評估之全部突變體的完整清單。
表 1. 具有相對於 Av3b ，賦予新穎及意想不到性質之突變的 Av3b 突變體之概述。表1提供相對於Av3b，賦予至少一種新穎性質之AMP的概述。性質包括：Y=產率；A=活性；S=一般穩定性；D=對於發酵培養基(發酵醪)中之蛋白分解降解的抗性；F=相對於Av3b之類似蛋白折疊(如經由圓二向色性來確定)；T=在54℃下熱穩定；P=在不同pH條件下穩定；G=在昆蟲腸道提取物中穩定。在本文中，當在相同條件下，與Av3b之產率或活性相比，給定肽之產率或活性相似、或更好時，將產率及活性評分。
名稱 SEQ ID NO. 序列 合意性質
Av3b 1 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK -
Av3bM5 6 KSCCPCYWPNCPWGQNCYPEGCSGPK Y
Av3bM19 20 KSCCPCYWGGCPWGQDCYPDGCDGPK Y, A, S, D
Av3bM23 24 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPNGCSGPK Y, A
Av3bM24 25 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCDGPK Y, A, S, D, G
Av3bM25 26 KSCCPCYWPGCPWGQNCYPEGCSGPK Y, A,
Av3bM27 28 KSCCPCYWAGCPWGQNCYPEGCSGPK A
Av3bM28 29 HSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK Y
Av3bM29 30 QSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK Y
Av3bM30 31 QSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPH Y
Av3bM31 32 TSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK Y
Av3bM32 33 SSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK Y
Av3bM33 34 SSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPT Y
Av3bM35 58 NSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK Y
Av3bM37 60 ESCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK Y
Av3bM39 62 ISCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK A
Av3bM40 63 LSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK A
Av3bM46 69 VSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK A
Av3bM85 108 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCGGPK A
Av3bM93 116 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCTGPK A
Av3bM96 119 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCVGPK A
Av3bM97 41 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPA A
Av3bM98 42 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPR D
Av3bM103 36 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPG D, F, T, P, G
Av3bM111 48 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPT A
Av3bM125 35 KSCCPCYWPGCPWGQNCYPEGCRGPD Y, D
Av3bM148 39 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPKG D
Av3bM163 168 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGP A
Av3bM164 169 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSG A
Av3bM165 40 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPKVG A, D, F, T, P
Av3bM168 54 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPKVI A
Av3bM170 38 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCGGPG A, D, F, T, P, G
表 2. 具有相對於 Av3b ，賦予新穎及意想不到性質之突變的 Av3b 突變體之概述。表2提供相對於Av3b，賦予兩種或兩種以上新穎性質之AMP的概述。性質包括：Y=產率；A=活性；S=一般穩定性；D=對於發酵醪中之蛋白分解降解的抗性；F=相對於Av3b之類似蛋白折疊(如經由圓二向色性來確定)；T=在54℃下熱穩定；P=在不同pH條件下穩定；G=在昆蟲腸道提取物中穩定。在本文中，當在相同條件下，與Av3b之產率或活性相比，給定肽之產率或活性相似、或更好時，將產率及活性評分。
名稱 SEQ ID NO. 序列 合意性質
Av3b 1 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK -
Av3bM19 20 KSCCPCYWGGCPWGQDCYPDGCDGPK Y, A, S, D
Av3bM23 24 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPNGCSGPK Y, A
Av3bM24 25 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCDGPK Y, A, S, D, G
Av3bM25 26 KSCCPCYWPGCPWGQNCYPEGCSGPK Y, A,
Av3bM103 36 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPG D, F, T, P, G
Av3bM125 35 KSCCPCYWPGCPWGQNCYPEGCRGPD Y, D
Av3bM165 40 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPKVG A, D, F, T, P
Av3bM170 38 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCGGPG A, D, F, T, P, G
在一些實施例中，本揭示案包含具有針對一或多個昆蟲物種之殺昆蟲活性的Av3突變多肽(AMP)、基本上由其組成、或由其組成，該AMP包含與前述表1提供之胺基酸序列中之任一者至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致的胺基酸序列。
在一些實施例中，本揭示案包含具有針對一或多個昆蟲物種之殺昆蟲活性的Av3突變多肽(AMP)、基本上由其組成、或由其組成，該AMP包含與前述表2提供之胺基酸序列中之任一者至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致的胺基酸序列。
在一些實施例中，本揭示案包含具有針對一或多個昆蟲物種之殺昆蟲活性的Av3突變多肽(AMP)、基本上由其組成、或由其組成，該AMP包含與根據式(I)：X 1-S-C-C-P-C-Y-W-X 2-X 3-C-P-W-G-Q-X 4-C-Y-P-X 5-G-C-X 6-G-X 7-X 8-X 9-X 10之胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致的胺基酸序列；其中相對於在SEQ ID NO：1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；其中X 1為K、H、Q、T、S、N、E、I、L、或V；X 2為G、P、或A；X 3為G、或N；X 4為N或D；X 5為E、D、或N；X 6為S、D、G、T、V、或R；X 7為P或不存在；X 8為K、H、A、R、G、T、D、或不存在；X 9為G、V、或不存在；X 10為G、I、或不存在；或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，本揭示案包含具有針對一或多個昆蟲物種之殺昆蟲活性的Av3突變多肽(AMP)、基本上由其組成、或由其組成，該AMP包含與根據式(II)：K-S-C-C-P-C-Y-W-G-G-C-P-W-G-Q-X 1-C-Y-P-X 2-G-C-X 3-G-P-X 4-X 5-X 6之胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致的胺基酸序列；其中相對於在SEQ ID NO：1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；X 1為N或D；X 2為E、D、或N；X 3為S、D、R、或G；X 4為K、G、或D；X 5為V或不存在；X 6為G或不存在；或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，AMP包含如SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169中之任一者中所闡明之胺基序列、基本上由其組成、或由其組成，或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，AMP包含如SEQ ID NO：20、24-26、35-36、38、及40中之任一者中所闡明之胺基序列、基本上由其組成、或由其組成，或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，AMP包含如SEQ ID NO：25、36、38、及40中之任一者中所闡明之胺基序列、基本上由其組成、或由其組成，或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，本揭示案之AMP可包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該胺基酸序列與胺基酸序列「KSCCPCYWGGCPWGQDCYPDGCDGPK」(SEQ ID NO：20)至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致，或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，本揭示案之AMP可包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該胺基酸序列與胺基酸序列「KSCCPCYWGGCPWGQNCYPNGCSGPK」(SEQ ID NO：24)至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致，或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，本揭示案之AMP可包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該胺基酸序列與胺基酸序列「KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCDGPK」(SEQ ID NO：25)至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致，或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，本揭示案之AMP可包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該胺基酸序列與胺基酸序列「KSCCPCYWPGCPWGQNCYPEGCSGPK」(SEQ ID NO：26)至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致，或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，本揭示案之AMP可包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該胺基酸序列與胺基酸序列「KSCCPCYWPGCPWGQNCYPEGCRGPD」(SEQ ID NO：35)至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致，或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，本揭示案之AMP可包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該胺基酸序列與胺基酸序列「KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPG」(SEQ ID NO：36)至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致，或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，本揭示案之AMP可包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該胺基酸序列與胺基酸序列「KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCGGPG」(SEQ ID NO：38)至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致，或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，本揭示案之AMP可包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該胺基酸序列與胺基酸序列「KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPKVG」(SEQ ID NO：40)至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致，或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，本揭示案之AMP可包含兩種或兩種以上AMP之均聚物或雜聚物、基本上由其組成、或由其組成，其中各AMP之胺基酸序列相同或不同。
在一些實施例中，本揭示案之AMP可包含作為包含藉由可裂解或不可裂解連接子來分隔之兩個或兩個以上AMP的融合蛋白的AMP、基本上由其組成、或由其組成，並且其中各AMP之胺基酸序列可相同或不同。
在一些實施例中，連接子為可裂解連接子。
在一些實施例中，連接子具有如SEQ ID NO：184-193中之任一者中所闡明之胺基酸序列。
在一些實施例中，連接子可在以下中之至少一者內部裂解：(i)昆蟲之腸道或血淋巴，及(ii)可在哺乳動物之腸道內部裂解。
關於連接子之詳細方法於下文描述。 編碼 AMP 之多核苷酸
在一些實施例中，本揭示案包含可操作來編碼Av3突變多肽(AMP)之多核苷酸、基本上由其組成、或由其組成。
在一些實施例中，本揭示案包含可操作來編碼AMP之多核苷酸、基本上由其組成、或由其組成，該AMP包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該胺基酸序列與根據式(I)：X 1-S-C-C-P-C-Y-W-X 2-X 3-C-P-W-G-Q-X 4-C-Y-P-X 5-G-C-X 6-G-X 7-X 8-X 9-X 10之胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致；其中相對於在SEQ ID NO：1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；其中X 1為K、H、Q、T、S、N、E、I、L、或V；X 2為G、P、或A；X 3為G、或N；X 4為N或D；X 5為E、D、或N；X 6為S、D、G、T、V、或R；X 7為P或不存在；X 8為K、H、A、R、G、T、D、或不存在；X 9為G、V、或不存在；X 10為G、I、或不存在；或其互補核苷酸序列。
在一些實施例中，本揭示案包含可操作來編碼AMP之多核苷酸、基本上由其組成、或由其組成，該AMP包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該胺基酸序列與根據式(II)：K-S-C-C-P-C-Y-W-G-G-C-P-W-G-Q-X 1-C-Y-P-X 2-G-C-X 3-G-P-X 4-X 5-X 6之胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致；其中相對於在SEQ ID NO：1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；X 1為N或D；X 2為E、D、或N；X 3為S、D、R、或G；X 4為K、G、或D；X 5為V或不存在；X 6為G或不存在；或其互補核苷酸序列。
在一些實施例中，多核苷酸可操作來編碼包含如SEQ ID NO: 6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169中之任一者中所闡明之胺基序列、基本上由其組成、或由其組成的AMP，或其互補核苷酸序列。
在一些實施例中，多核苷酸可操作來編碼包含如SEQ ID NO: 20、24-26、35-36、38、及40中之任一者中所闡明之胺基序列、基本上由其組成、或由其組成的AMP，或其互補核苷酸序列。
在一些實施例中，本揭示案之多核苷酸編碼AMP，其中多核苷酸在嚴格條件下雜交至編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：20、24-26、35-36、38、及40之AMP的多核苷酸，或其互補核苷酸序列。
在一些實施例中，多核苷酸可操作來編碼包含如SEQ ID NO: 25、36、38、及40中之任一者中所闡明之胺基序列、基本上由其組成、或由其組成的AMP，或其互補核苷酸序列。
核苷酸序列同源物，例如，藉由在嚴格雜交條件下雜交至在本申請案中揭示之每一個或任何序列之多核苷酸來編碼的AMP，亦為本揭示案之實施例。本揭示案亦提供偵測雜交至第二多核苷酸之第一多核苷酸的方法，其中第一多核苷酸(或其反向補體序列)編碼AMP或其片段，並且雜交至第二多核苷酸。在此情況下，在嚴格雜交條件下，第二多核苷酸可為可操作來編碼本揭示案之AMP的任何多核苷酸。
在一些實施例中，本揭示案之多核苷酸可嚴格雜交至編碼AMP之多核苷酸、或其互補序列，該AMP包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該胺基酸序列與根據式(I)：X1-S-C-C-P-C-Y-W-X2-X3-C-P-W-G-Q-X4-C-Y-P-X5-G-C-X6-G-X7-X8-X9-X10之胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致；其中相對於在SEQ ID NO：1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；其中X1為K、H、Q、T、S、N、E、I、L、或V；X2為G、P、或A；X3為G、或N；X4為N或D；X5為E、D、或N；X6為S、D、G、T、V、或R；X7為P或不存在；X8為K、H、A、R、G、T、D、或不存在；X9為G、V、或不存在；X10為G、I、或不存在。
在一些實施例中，本揭示案之多核苷酸可嚴格雜交至編碼AMP之多核苷酸、或其互補序列，該AMP包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該胺基酸序列與根據式(II)：K-S-C-C-P-C-Y-W-G-G-C-P-W-G-Q-X 1-C-Y-P-X 2-G-C-X 3-G-P-X 4-X 5-X 6之胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致；其中相對於在SEQ ID NO：1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；X 1為N或D；X 2為E、D、或N；X 3為S、D、R、或G；X 4為K、G、或D；X 5為V或不存在；X 6為G或不存在。
在一些實施例中，本揭示案之多核苷酸包含編碼AMP或其片段之多核苷酸區段、基本上由其組成、或由其組成，其中：(a)該AMP包含在SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、或168-169中闡明之胺基酸序列；或(b)該AMP包含與SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、或168-169具有至少80%、或85%、或90%、或95%、或98%、或99%、或約100%胺基酸序列一致性的胺基酸序列；或(c)該多核苷酸區段雜交至具有可操作來編碼具有如SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、或168-169中所闡明之胺基酸序列之AMP的多核苷酸區段的多核苷酸。
在一個實施例中，本揭示案提供包括使核酸樣品與核酸探針接觸的方法，該探針在嚴格雜交條件下與包含編碼如本文提供之AMP或其片段之多核苷酸區段的多核苷酸雜交，並且不在此等雜交條件下與不包含該區段之多核苷酸雜交，其中探針與編碼SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、或168-169中之任一者之多核苷酸，或編碼包含與SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、或168-169具有至少80%、或85%、或90%、或95%、或98%、或99%、或約100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的AMP的多核苷酸同源或互補。方法可進一步包括(a)使樣品及探針經受嚴格雜交條件；及(b)偵測探針與樣品之多核苷酸之雜交。
在一些實施例中，多核苷酸可操作來編碼可包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成之AMP，該胺基酸序列與胺基酸序列「KSCCPCYWGGCPWGQDCYPDGCDGPK」(SEQ ID NO：20)至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致，或其互補核苷酸序列。
在一些實施例中，多核苷酸可操作來編碼可包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成之AMP，該胺基酸序列與胺基酸序列「KSCCPCYWGGCPWGQNCYPNGCSGPK」 (SEQ ID NO: 24)至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致，或其互補核苷酸序列。
在一些實施例中，多核苷酸可操作來編碼可包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成之AMP，該胺基酸序列與胺基酸序列「KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCDGPK」 (SEQ ID NO: 25)至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致，或其互補核苷酸序列。
在一些實施例中，多核苷酸可操作來編碼可包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成之AMP，該胺基酸序列與胺基酸序列「KSCCPCYWPGCPWGQNCYPEGCSGPK」 (SEQ ID NO: 26)至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致，或其互補核苷酸序列。
在一些實施例中，多核苷酸可操作來編碼可包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成之AMP，該胺基酸序列與胺基酸序列「KSCCPCYWPGCPWGQNCYPEGCRGPD」 (SEQ ID NO: 35)至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致，或其互補核苷酸序列。
在一些實施例中，多核苷酸可操作來編碼可包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成之AMP，該胺基酸序列與胺基酸序列「KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPG」 (SEQ ID NO: 36)至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致，或其互補核苷酸序列。
在一些實施例中，多核苷酸可操作來編碼可包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成之AMP，該胺基酸序列與胺基酸序列「KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCGGPG」 (SEQ ID NO: 38)至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致，或其互補核苷酸序列。
在一些實施例中，多核苷酸可操作來編碼可包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成之AMP，該胺基酸序列與胺基酸序列「KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPKVG」 (SEQ ID NO: 40)至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致，或其互補核苷酸序列。
在一些實施例中，多核苷酸可操作來編碼可包含兩種或兩種以上AMP之均聚物或雜聚物、基本上由其組成、或由其組成的AMP，其中各AMP之胺基酸序列相同或不同。
在一些實施例中，多核苷酸可操作來編碼可包含作為包含藉由可裂解或不可裂解連接子來分隔之兩個或兩個以上AMP的融合蛋白的AMP、基本上由其組成、或由其組成的AMP，並且其中各AMP之胺基酸序列可相同或不同。
在一些實施例中，連接子為可裂解連接子。
在一些實施例中，連接子具有如SEQ ID NO：184-193中之任一者中所闡明之胺基酸序列。
在一些實施例中，連接子可在以下中之至少一者內部裂解：(i)昆蟲之腸道或血淋巴，及(ii)可在哺乳動物之腸道內部裂解。 AMP 殺昆蟲蛋白
在一些實施例中，AMP殺昆蟲蛋白可為包含以下之任何蛋白、肽、多肽、胺基酸序列、組態、構築體、或排列：(1)至少一種AMP、或兩種或兩種以上AMP；及(2)一或多種額外非AMP肽、多肽、或蛋白。例如，在一些實施例中，相對於單獨AMP，此等額外非AMP肽、多肽、或蛋白可具有增加暴露於AMP殺昆蟲蛋白之昆蟲之死亡率及/或抑制生長；增加該AMP殺昆蟲蛋白例如在宿主細胞中之表現；及/或影響AMP殺昆蟲蛋白之轉譯後處理的能力。
在一些實施例中，AMP殺昆蟲蛋白可為包含兩種或兩種以上AMP之聚合物。在其他實施例中，AMP殺昆蟲蛋白可為包含兩種或兩種以上AMP之聚合物，其中AMP經由連接子肽例如可裂解及/或不可裂解連接子來可操作地連接。在本文中，連接子肽屬如上所述之額外非AMP肽的類別。
在一些實施例中，AMP殺昆蟲蛋白可指與一或多種蛋白諸如穩定域(STA)；內質網信號轉導蛋白(ERSP)；昆蟲可裂解或昆蟲不可裂解連接子(L)；及/或其任何其他組合可操作地連接的一或多種AMP。
在一些實施例中，AMP殺昆蟲蛋白可為在正確地折疊或處於其最自然熱力學狀態中時，發揮針對一或多種昆蟲之殺昆蟲活性的胺基酸之聚合物。
在一些實施例中，AMP殺昆蟲蛋白可為包含不同的兩種或兩種以上AMP之聚合物。在其他實施例中，殺昆蟲蛋白可為相同的兩個或兩個以上AMP之聚合物。
在其他實施例中，AMP殺昆蟲蛋白可包含一或多種AMP，及可有助於AMP殺昆蟲蛋白之折疊的一或多種肽、多肽、或蛋白。
在一些實施例中，AMP殺昆蟲蛋白可包含一或多種AMP，及一或多種肽、多肽、或蛋白，其中一或多種肽、多肽、或蛋白為有助於穩定性或溶解性之蛋白標籤。在其他實施例中，肽、多肽、或蛋白可為有助於親和力純化之蛋白標籤。
在一些實施例中，AMP殺昆蟲蛋白可指與一或多種蛋白諸如穩定域(STA)；內質網信號轉導蛋白(ERSP)；昆蟲可裂解或昆蟲不可裂解連接子；一或多種異源肽；一或多種額外多肽；及/或其任何其他組合可操作地連接的一或多種AMP。在一些實施例中，殺昆蟲蛋白可包含一或多種如本文揭示之AMP。
在一些實施例中，AMP殺昆蟲蛋白可包含AMP均聚物，例如，作為相同AMP的兩個或兩個以上AMP單體。在一些實施例中，殺昆蟲蛋白可包含AMP雜聚物，例如，兩種或兩種以上AMP單體，其中AMP單體不同。
在一些實施例中，AMP殺昆蟲蛋白可包含具有在SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169中闡明之胺基酸序列的一或多種AMP、或其農業上可接受之鹽、基本上由其組成、或由其組成。在一些實施例中，AMP殺昆蟲蛋白可包含與SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%、至少99.9%、或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的AMP、或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，AMP殺昆蟲蛋白可包含具有在SEQ ID NO：20、24-26、35-36、38、及40中闡明之胺基酸序列的一或多種AMP、或其農業上可接受之鹽、基本上由其組成、或由其組成。在一些實施例中，AMP殺昆蟲蛋白可包含與SEQ ID NO：20、24-26、35-36、38、及40具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%、至少99.9%、或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的AMP、或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，AMP殺昆蟲蛋白可包含具有在SEQ ID NO：25、36、38、及40中闡明之胺基酸序列的一或多種AMP、或其農業上可接受之鹽、基本上由其組成、或由其組成。在一些實施例中，AMP殺昆蟲蛋白可包含與SEQ ID NO：25、36、38、及40具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%、至少99.9%、或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的AMP、或其農業上可接受之鹽。
連接子之實例包括但是不限於以下序列：IGER(SEQ ID NO:181)、EEKKN (SEQ ID NO:182)、及ETMFKHGL(SEQ ID NO:183)、或其組合。
在一些實施例中，連接子可為以下中之一或多者：ALKFLV (SEQ ID NO: 184)、ALKLFV (SEQ ID NO: 185)、IFVRLR (SEQ ID NO: 186)、LFAAPF (SEQ ID NO: 187)、ALKFLVGS (SEQ ID NO: 188)、ALKLFVGS (SEQ ID NO: 189)、IFVRLRGS (SEQ ID NO: 190)、LFAAPFGS (SEQ ID NO: 191)、LFVRLRGS (SEQ ID NO: 192)、及/或LGERGS (SEQ ID NO: 193)。
產生可裂解及不可裂解連接子之示例性方法可發現於美國專利申請案第15/727,277號；及PCT申請案第PCT/US2013/030042號中，其揭示內容以全文引用方式併入本文。
示例性ERSP及STA及其使用方法提供於美國專利第9,567,381中，其揭示內容以全文引用方式併入本文。
關於ERSP、STA、及連接子之詳細方法於下文描述。 產生AMP之方法
產生蛋白之方法在此項技術中為熟知的，並且存在各種可利用之技術。例如，在一些實施例中，蛋白可使用重組方法來產生、或化學合成。
在一些實施例中，本揭示案之AMP可使用產生蛋白之任何已知方法來創建。例如，在一些實施例中並且無限制地，AMP可使用重組表現系統諸如酵母表現系統或細菌表現系統來創建。然而，熟習此項技術者認識到可利用其他蛋白產生方法。
在一些實施例中，本揭示案包含使用重組表現系統來產生AMP之方法、基本上由其組成、或由其組成。
在一些實施例中，本揭示案包含產生AMP之方法、基本上由其組成、或由其組成，該方法包括：(a)製備包含第一表現匣之載體，該第一表現匣包含可操作來編碼AMP之多核苷酸、或其互補核苷酸序列、基本上由其組成、或由其組成，(b)將載體引入宿主細胞例如細菌或酵母、或昆蟲、或植物細胞、或動物細胞中；及(c)在可操作來實現AMP之表現及分泌至生長培養基中之條件下，使酵母菌株在生長培養基中生長。在一些相關實施例中，宿主細胞為酵母細胞。
本發明可在多種宿主細胞(參見以下宿主細胞部分)中實行。事實上，本發明之最終用戶可在他或她選擇的任何宿主細胞中實行其教示。因此，在一些實施例中，宿主細胞可為滿足最終用戶之要求的任何宿主細胞；亦即，在一些實施例中，AMP之表現可使用各種宿主細胞，並且按照本文中之教示來實現。例如，在一些實施例中，用戶可希望使用一種特定類型之宿主細胞(例如，酵母細胞或細菌細胞)而非另一種；給定宿主細胞之偏好可在可獲得性至成本之範圍內。
例如，在一些實施例中，本揭示案包含產生AMP之方法、基本上由其組成、或由其組成，該方法包括：(a)製備包含第一表現匣之載體，該第一表現匣包含可操作來編碼AMP之多核苷酸、或其互補核苷酸序列、基本上由其組成、或由其組成；(b)將載體引入宿主細胞例如細菌或酵母、或昆蟲、或植物細胞、或動物細胞中；及(c)在可操作來實現AMP之表現及分泌至生長培養基中之條件下，使酵母菌株在生長培養基中生長。在一些實施例中，宿主細胞為細菌細胞。
在一些實施例中，本揭示案包含產生AMP之方法、基本上由其組成、或由其組成，該方法包括：(a)製備包含第一表現匣之載體，該第一表現匣包含可操作來編碼AMP之多核苷酸、或其互補核苷酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該AMP包含胺基酸序列，該胺基酸序列與根據式(I)：X 1-S-C-C-P-C-Y-W-X 2-X 3-C-P-W-G-Q-X 4-C-Y-P-X 5-G-C-X 6-G-X 7-X 8-X 9-X 10之胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致；其中相對於在SEQ ID NO: 1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；其中X 1為K、H、Q、T、S、N、E、I、L、或V；X 2為G、P、或A；X 3為G、或N；X 4為N或D；X 5為E、D、或N；X 6為S、D、G、T、V、或R；X 7為P或不存在；X 8為K、H、A、R、G、T、D、或不存在；X 9為G、V、或不存在；X 10為G、I、或不存在；(b)將載體引入宿主細胞例如細菌或酵母、或昆蟲、或植物細胞、或動物細胞中；及(c)在可操作來實現AMP之表現及分泌至生長培養基中之條件下，使酵母菌株在生長培養基中生長。在一些相關實施例中，宿主細胞為酵母細胞。
在一些實施例中，本揭示案包含產生AMP之方法、基本上由其組成、或由其組成，該方法包括：(a)製備包含第一表現匣之載體，該第一表現匣包含可操作來編碼AMP之多核苷酸、或其互補核苷酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該AMP包含胺基酸序列，該胺基酸序列與根據式(II)：K-S-C-C-P-C-Y-W-G-G-C-P-W-G-Q-X 1-C-Y-P-X 2-G-C-X 3-G-P-X 4-X 5-X 6之胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致；其中相對於在SEQ ID NO: 1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；X 1為N或D；X 2為E、D、或N；X 3為S、D、R、或G；X 4為K、G、或D；X 5為V或不存在；(b)將載體引入宿主細胞例如細菌或酵母、或昆蟲、或植物細胞、或動物細胞中；及(c)在可操作來實現AMP之表現及分泌至生長培養基中之條件下，使酵母菌株在生長培養基中生長。在一些相關實施例中，宿主細胞為酵母細胞。
在一些實施例中，本揭示案包含產生AMP之方法、基本上由其組成、或由其組成，該方法包括：(a)製備包含第一表現匣之載體，該第一表現匣包含可操作來編碼AMP之多核苷酸、或其互補核苷酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該AMP包含胺基酸序列，該胺基酸序列與在SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169中之任一者中闡明之胺基酸序列中之任一者至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致；(b)將載體引入宿主細胞例如細菌或酵母、或昆蟲、或植物細胞、或動物細胞中；及(c)在可操作來實現AMP之表現及分泌至生長培養基中之條件下，使酵母菌株在生長培養基中生長。在一些相關實施例中，宿主細胞為酵母細胞。
在一些實施例中，本揭示案包含產生AMP之方法、基本上由其組成、或由其組成，該方法包括：(a)製備包含第一表現匣之載體，該第一表現匣包含可操作來編碼AMP之多核苷酸、或其互補核苷酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該AMP包含胺基酸序列，該胺基酸序列與在SEQ ID NO：20、24-26、35-36、38、及40中之任一者中闡明之胺基酸序列中之任一者至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致；(b)將載體引入宿主細胞例如細菌或酵母、或昆蟲、或植物細胞、或動物細胞中；及(c)在可操作來實現AMP之表現及分泌至生長培養基中之條件下，使酵母菌株在生長培養基中生長。在一些相關實施例中，宿主細胞為酵母細胞。
在一些實施例中，本揭示案包含產生AMP之方法、基本上由其組成、或由其組成，該方法包括：(a)製備包含第一表現匣之載體，該第一表現匣包含可操作來編碼AMP之多核苷酸、或其互補核苷酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該AMP包含胺基酸序列，該胺基酸序列與在SEQ ID NO：25、36、38、及40中之任一者中闡明之胺基酸序列中之任一者至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致；(b)將載體引入宿主細胞例如細菌或酵母、或昆蟲、或植物細胞、或動物細胞中；及(c)在可操作來實現AMP之表現及分泌至生長培養基中之條件下，使酵母菌株在生長培養基中生長。在一些相關實施例中，宿主細胞為酵母細胞。
在一些實施例中，產生AMP之方法產生均聚物，其中各AMP具有相同胺基酸序列。
在一些實施例中，產生AMP之方法產生均聚物，其中各AMP具有不同胺基酸序列。
在一些實施例中，產生AMP之方法，其中AMP為包含藉由可裂解或不可裂解連接子來分隔之兩個或兩個以上AMP的融合蛋白，並且其中各AMP之胺基酸序列可相同或不同。
在一些實施例中，產生AMP之方法，其中連接子為可裂解連接子。
在一些實施例中，產生AMP之方法，其中連接子具有如SEQ ID NO：184-193中之任一者中所闡明之胺基酸序列。
在一些實施例中，產生AMP之方法，其中連接子可在以下中之至少一者內部裂解：(i)昆蟲之腸道或血淋巴，及(ii)可在哺乳動物之腸道內部裂解。
在一些實施例中，產生AMP之方法提供載體，其中載體為質體。在一些實施例中，質體可包含α-MF信號。
在一些實施例中，本揭示案包含產生AMP之方法、基本上由其組成、或由其組成，該方法包括：(a)製備包含第一表現匣之載體，該第一表現匣包含可操作來編碼AMP之多核苷酸、或其互補核苷酸序列、基本上由其組成、或由其組成，(b)將載體引入宿主細胞中；及(c)在可操作來實現AMP之表現及分泌至生長培養基中之條件下，使宿主細胞在生長培養基中生長，其中將載體轉型至微生物例如酵母或細菌中。
在一些實施例中，宿主細胞可為酵母菌株。
在一些實施例中，酵母菌株選自屬於酵母屬 (Saccharomyces)、畢赤酵母屬 (Pichia)、克魯維酵母屬 (Kluyveromyces)、漢遜酵母屬 (Hansenula)、耶氏酵母屬 (Yarrowia)、或裂殖酵母屬 (Schizosaccharomyces)的任何物種。
在一些實施例中，酵母菌株選自由乳酸克魯維酵母 (Kluyveromyces lactis)、馬克斯克魯維酵母 (Kluyveromyces marxianus)、釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、及巴斯德畢赤酵母 (Pichia pastoris)組成之群。
在一些實施例中，酵母菌株為乳酸克魯維酵母。
在一些實施例中，酵母菌株為馬克斯克魯維酵母。
在一些實施例中，AMP分泌至生長培養基中。
在一些實施例中，在併入可操作來編碼AMP之聚核苷酸的合適轉型宿主細胞之細胞培養或發酵中，將AMP分泌至生長培養基中，其中AMP之表現提供以下產率：每公升酵母培養基至少70 mg/L、至少80 mg/L、至少90 mg/L、至少100 mg/L、至少110 mg/L、至少120 mg/L、至少130 mg/L、至少140 mg/L、至少150 mg/L、至少160 mg/L、至少170 mg/L、至少180 mg/L、至少190 mg/L、至少200 mg/L、至少500 mg/L、至少750 mg/L、至少1,000 mg/L、至少1,250 mg/L、至少1,500 mg/L、至少1,750 mg/L、至少2,000 mg/L、至少2,500 mg/L、至少3,000 mg/L、至少3,500 mg/L、至少4,000 mg/L、至少4,500 mg/L、至少5,000 mg/L、至少5,500 mg/L、至少6,000 mg/L、至少6,500 mg/L、至少7,000 mg/L、至少7,500 mg/L、至少8,000 mg/L、至少8,500 mg/L、至少9,000 mg/L、至少9,500 mg/L、至少10,000 mg/L、至少11,000 mg/L、至少12,000 mg/L、至少12,500 mg/L、至少13,000 mg/L、至少14,000 mg/L、至少15,000 mg/L、至少16,000 mg/L、至少17,000 mg/L、至少17,500 mg/L、至少18,000 mg/L、至少19,000 mg/L、至少20,000 mg/L、至少25,000 mg/L、至少30,000 mg/L、至少40,000 mg/L、至少50,000 mg/L、至少60,000 mg/L、至少70,000 mg/L、至少80,000 mg/L、至少90,000 mg/L、或至少100,000 mg/L之AMP。
在一些實施例中，培養基中之AMP之表現導致培養基中之單一AMP之表現。
在一些實施例中，培養基中之AMP之表現導致培養基中之包含兩種或兩種以上AMP多肽之AMP聚合物的表現。
在一些實施例中，載體包含兩個或三個表現匣，各表現匣可操作來編碼第一表現匣之AMP。
在一些實施例中，載體包含兩個或三個表現匣，各表現匣可操作來編碼第一表現匣之AMP，或不同表現匣之AMP。
在一些實施例中，本揭示案之表現匣可操作來編碼如SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169中之任一者中所闡明之AMP。
在一些實施例中，本揭示案之表現匣可操作來編碼如SEQ ID NO：20、24-26、35-36、38、及40中之任一者中所闡明之AMP。
在一些實施例中，本揭示案之表現匣可操作來編碼如SEQ ID NO:25、36、38，及40中之任一者中所闡明之AMP。 使野生型 Av3 蛋白分離並且突變
在各個示例性實施例中，AMP可藉由以下步驟來獲得：創建AMP多核苷酸序列，其繼而可藉由產生野生型Av3多核苷酸序列例如「RSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPKV」(SEQ ID NO：172)中之突變或Av3b多核苷酸序列，例如，「KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK」(SEQ ID NO:1)(亦即，創建AMP多核苷酸序列)來創建；將該AMP多核苷酸( amp)序列插入合適載體中；以使得編碼AMP之多核苷酸得以表現之方式來轉型宿主有機體；培養宿主有機體來產生所需量之AMP；然後自宿主有機體中及/或周圍純化AMP。
野生型蛇鎖海葵毒素，例如，Av3可使用熟習此項技術者已知之任何技術，自野生獲得之海葵中分離。例如，在一些實施例中，動物之毒素及/或毒液可根據美國專利申請案第US20200207818A1號；美國專利第5,989,857號；及Moran等人, Molecular analysis of the sea anemone toxin Av3 reveals selectivity to insects and demonstrates the heterogeneity of receptor site-3 on voltage-gated Na+ channels. Biochem. J. 2007;406:41-48所描述之方法來分離；其揭示內容以全文引用方式併入本文。
在一些實施例中，野生型Av3多核苷酸序列可使用針對Av3多核苷酸序列之引子探針篩選基因組文庫來獲得。或者，野生型Av3多核苷酸序列及/或AMP多核苷酸序列可化學合成。例如，野生型Av3多核苷酸序列及/或AMP多核苷酸序列可使用寡核苷酸合成方法諸如亞磷醯胺；三酯、亞磷酸酯、或H-膦酸酯方法來產生(參見Engels, J. W.及Uhlmann, E. (1989), Gene Synthesis [New Synthetic Methods (77)]. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 28: 716-734，其揭示內容以全文引用方式併入本文)。 化學合成 AMP 多核苷酸
在一些實施例中，編碼AMP之多核苷酸序列可使用商購多核苷酸合成服務諸如藉由Genewiz®(例如，TurboGENE TM；PriorityGENE；及FragmentGENE)，或Sigma-Aldrich®(例如，Custom DNA and RNA Oligos Design and Order Custom DNA Oligos)提供之服務來化學合成。產生DNA及或定製化學合成多核苷酸之示例性方法在此項技術中為熟知的，並且在1995年2月13日提出申請之美國專利第5,736,135號、第08/389,615號中示例性地提供，其揭示內容以全文引用方式併入本文。亦參見Agarwal等人, Chemical synthesis of polynucleotides. Angew Chem Int Ed Engl. 1972年6月; 11(6):451-9; Ohtsuka等人, Recent developments in the chemical synthesis of polynucleotides. Nucleic Acids Res. 1982年11月11日; 10(21): 6553–6570; Sondek及Shortle. A general strategy for random insertion and substitution mutagenesis: substoichiometric coupling of trinucleotide phosphoramidites. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992年4月15日; 89(8): 3581–3585; Beaucage S. L.等人, Advances in the Synthesis of Oligonucleotides by the Phosphoramidite Approach. Tetrahedron, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, NL, 第48卷, 第12期, 1992, 第2223-2311頁；Agrawal (1993) Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties; Methods in Molecular Biology 第20卷，其揭示內容以全文引用方式併入本文。
產生野生型Av3多核苷酸序列及/或Av3b多核苷酸序列中之突變可藉由熟習此項技術者熟知之各種手段來達成。誘變方法包括Kunkel方法；匣誘變；PCR定點誘變；「完美謀殺」技術( delitto perfetto)；使用PCR及一種可回收標誌物進行直接基因缺失及位點特異性誘變；以PCR及一種使用長同源區域之可回收標誌物進行直接基因缺失及位點特異性誘變；轉位「快速引入快速缺失(pop-in pop-out)」方法；及CRISPR-Cas 9。定點誘變之示例性方法可發現於Ruvkun及Ausubel, A general method for site-directed mutagenesis in prokaryotes. Nature. 1981年1月1日; 289(5793):85-8；Wallace等人, Oligonucleotide directed mutagenesis of the human beta-globin gene: a general method for producing specific point mutations in cloned DNA. Nucleic Acids Res. 1981年8月11日; 9(15):3647-56；Dalbadie-McFarland等人, Oligonucleotide-directed mutagenesis as a general and powerful method for studies of protein function. Proc Natl Acad Sci U S A. 1982年11月; 79(21):6409-13；Bachman. Site-directed mutagenesis. Methods Enzymol. 2013; 529:241-8；Carey等人, PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harb Protoc. 2013年8月1日; 2013(8):738-42；及Cong等人, Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 2013年2月15日; 339(6121):819-23中，所有前述參考文獻之揭示內容以全文引用方式併入本文。
化學合成多核苷酸允許產生DNA序列，其基於該序列內之核苷酸之排列(亦即，胞嘧啶[C]、鳥嘌呤[G]、腺嘌呤[A]或胸腺嘧啶[T]分子之排列)來定製以便產生所需多肽；自化學合成DNA多核苷酸來轉錄之mRNA序列可被轉譯成胺基酸序列，各胺基酸對應於mRNA序列中之密碼子。因此，自mRNA序列轉譯之多肽鏈之胺基酸組成可藉由更改確定20種胺基酸中之哪一種被添加至增長多肽之潛在密碼子來改變；因而，諸如插入、取代、缺失、及移碼之DNA中之突變可取決於潛在密碼子來導致胺基酸插入、取代、或缺失。
在一些實施例中，多核苷酸可化學合成，其中該多核苷酸具有一或多個突變。在一些實施例中，mRNA可自模板DNA序列創建。在其他實施例中，mRNA可選殖並且轉型至感受態細胞中。 重組表現、載體及轉型
自化學合成DNA多核苷酸序列及/或經由誘變來改變之野生型DNA多核苷酸序列來獲得AMP可藉由將DNA序列選殖至合適載體中來達成。存在可獲得之各種表現載體、宿主有機體、及熟習此項技術者已知之選殖策略。例如，載體可為質體，其可將待轉錄及轉譯之異源基因及/或表現匣引入酵母細胞中。術語「載體」用於係指核酸序列可插入其中以便引入細胞中的承載核酸分子，該序列可在該細胞中複製。載體可含有「載體元件」諸如複製起點(ORI)；賦予抗生素抗性以便允許選擇的基因；多選殖位點；啟動子區域；用於無細菌轉染之選擇標誌物；及引子結合位點。核酸序列可為「外源的」，此意味著對於將載體引入其中之細胞而言，該序列為外來的，或該序列與細胞中之序列為同源的，但是處於該序列通常不存在的宿主細胞核酸內之位置中。載體包括質體、黏接質體、病毒(噬菌體、動物病毒、及植物病毒)、及人工染色體(例如，YAC)。熟習此項技術者完全能夠勝任經由標準重組技術來構築載體，該等技術描述於Sambrook等人, 1989及Ausubel等人, 1996中，兩種參考文獻以全文引用方式併入本文。除了編碼AMP多核苷酸以外，載體可編碼靶向分子。靶向分子為將所需核酸引導至特定組織、細胞、或其他位置的分子。
在一些實施例中，本揭示案包含載體、基本上由其組成、或由其組成，該載體包含可操作來編碼本揭示案之AMP之多核苷酸。
在一些實施例中，本揭示案包含有包含可操作來編碼AMP之多核苷酸的載體、基本上由其組成、或由其組成，該AMP包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該胺基酸序列與根據式(I)：X 1-S-C-C-P-C-Y-W-X 2-X 3-C-P-W-G-Q-X 4-C-Y-P-X 5-G-C-X 6-G-X 7-X 8-X 9-X 10之胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致；其中相對於在SEQ ID NO: 1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；其中X 1為K、H、Q、T、S、N、E、I、L、或V；X 2為G、P、或A；X 3為G、或N；X 4為N或D；X 5為E、D、或N；X 6為S、D、G、T、V、或R；X 7為P或不存在；X 8為K、H、A、R、G、T、D、或不存在；X 9為G、V、或不存在；X 10為G、I、或不存在；或其互補核苷酸序列。
在一些實施例中，本揭示案包含載體、基本上由其組成、或由其組成，該載體包含可嚴格雜交至可操作來編碼AMP之多核苷酸或其區段的多核苷酸或其互補序列，該AMP包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該胺基酸序列與根據式(I)：X 1-S-C-C-P-C-Y-W-X 2-X 3-C-P-W-G-Q-X 4-C-Y-P-X 5-G-C-X 6-G-X 7-X 8-X 9-X 10之胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致；其中相對於在SEQ ID NO: 1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；其中X 1為K、H、Q、T、S、N、E、I、L、或V；X 2為G、P、或A；X 3為G、或N；X 4為N或D；X 5為E、D、或N；X 6為S、D、G、T、V、或R；X 7為P或不存在；X 8為K、H、A、R、G、T、D、或不存在；X 9為G、V、或不存在；X 10為G、I、或不存在。
在一些實施例中，本揭示案包含載體、基本上由其組成、或由其組成，該載體包含可嚴格雜交至可操作來編碼AMP之多核苷酸或其區段的多核苷酸或其互補序列，該AMP包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該胺基酸序列與根據式(II)：K-S-C-C-P-C-Y-W-G-G-C-P-W-G-Q-X 1-C-Y-P-X 2-G-C-X 3-G-P-X 4-X 5-X 6之胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致；其中相對於在SEQ ID NO: 1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；X 1為N或D；X 2為E、D、或N；X 3為S、D、R、或G；X 4為K、G、或D；X 5為V或不存在。
在一些實施例中，本揭示案包含有包含可操作來編碼AMP之多核苷酸的載體、基本上由其組成、或由其組成，該AMP包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該胺基酸序列與根據式(II)：K-S-C-C-P-C-Y-W-G-G-C-P-W-G-Q-X 1-C-Y-P-X 2-G-C-X 3-G-P-X 4-X 5-X 6之胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致；其中相對於在SEQ ID NO: 1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；X 1為N或D；X 2為E、D、或N；X 3為S、D、R、或G；X 4為K、G、或D；X 5為V或不存在；或其互補核苷酸序列。
在一些實施例中，本揭示案包含有包含可操作來編碼AMP之多核苷酸的載體、基本上由其組成、或由其組成，該AMP包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該胺基酸序列與SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169中之任一者中所闡明之胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致；或其互補核苷酸序列。
在一些實施例中，本揭示案包含有包含可操作來編碼AMP之多核苷酸的載體、基本上由其組成、或由其組成，該AMP包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該胺基酸序列與SEQ ID NO：20、24-26、35-36、38、及40中之任一者中所闡明之胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致；或其互補核苷酸序列。
在一些實施例中，本揭示案包含有包含可操作來編碼AMP之多核苷酸的載體、基本上由其組成、或由其組成，該AMP包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該胺基酸序列與SEQ ID NO：25、36、38、及40中之任一者中所闡明之胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致；或其互補核苷酸序列。
在一些實施例中，多核苷酸可操作來編碼包含如SEQ ID NO: 6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169中之任一者中所闡明之胺基序列、基本上由其組成、或由其組成的AMP，或其互補核苷酸序列。
在一些實施例中，多核苷酸可操作來編碼包含如SEQ ID NO: 20、24-26、35-36、38、及40中之任一者中所闡明之胺基序列、基本上由其組成、或由其組成的AMP，或其互補核苷酸序列。
在一些實施例中，多核苷酸可操作來編碼包含如SEQ ID NO: 25、36、38、及40中之任一者中所闡明之胺基序列、基本上由其組成、或由其組成的AMP，或其互補核苷酸序列。
在一些實施例中，可操作來編碼AMP或AMP殺昆蟲蛋白之多核苷酸、或其互補核苷酸序列可轉型至宿主細胞中。
在一些實施例中，可操作來編碼AMP或AMP殺昆蟲蛋白之多核苷酸、或其互補核苷酸序列可選殖至載體中，並且轉型至宿主細胞中。
在一些實施例中，AMP ORF可轉型至宿主細胞中。在一些實施例中，AMP ORF可選殖至載體(例如，質體)中並且隨後轉型至宿主細胞中。
除了可操作來編碼AMP(例如，AMP ORF)或AMP殺昆蟲蛋白之多核苷酸序列以外，被稱為調控元件之額外DNA區段可選殖至載體中，以便允許增強外來DNA或轉殖基因之表現；此等額外DNA區段之實例包括(1)啟動子、終止子、及/或增強子元件；(2)合適mRNA穩定多聚腺苷酸信號；(3)內部核糖體進入位點(IRES)；(4)內含子；及(5)轉錄後調控元件。所關注之DNA區段(例如， amp)與前述順式作用元件中之任一者的組合被稱為「表現匣」。
在一些實施例中，表現匣或AMP表現匣可含有可操作來編碼一或多種AMP、及/或一或多種AMP殺昆蟲蛋白的一或多個多核苷酸。
在一些實施例中，表現匣或AMP表現匣可含有可操作來編碼一或多種AMP、及/或一或多種AMP殺昆蟲蛋白的一或多個多核苷酸；及視情況，一或多種額外調控元件諸如：(1)啟動子、終止子、及/或增強子元件；(2)合適mRNA穩定多聚腺苷酸信號；(3)內部核糖體進入位點(IRES)；(4)內含子；及(5)轉錄後調控元件。
在一些實施例中，單一表現匣可含有前述調控元件中之一或多者、及可操作來表現AMP之多核苷酸。例如，在一些實施例中，AMP表現匣可包含可操作來編碼AMP之多核苷酸、及α-MF信號；Kex2位點；LAC4終止子；ADN1啟動子；及在5’末端及3’末端上，藉由LAC4啟動子來側接之乙醯胺酶(amdS)選擇標誌物。
在一些實施例中，可存在選殖至載體中之許多表現匣。例如，在一些實施例中，可存在包含可操作來表現AMP之多核苷酸的第一表現匣。在替代實施例中，存在可操作來編碼AMP之兩個表現匣(亦即，雙重表現匣)。在其他實施例中，存在可操作來編碼AMP之三個表現匣(亦即，三重表現匣)。
在一些實施例中，雙重表現匣可藉由將第二AMP表現匣次選殖至含有第一AMP表現匣之載體中來產生。
在一些實施例中，三重表現匣可藉由將第三AMP表現匣次選殖至含有第一及第二AMP表現匣之載體中來產生。
在一些實施例中，一個、兩個、三個、或更多個表現匣可選殖至載體中，其中各表現匣包含：(1)所關注之DNA序列，例如，可操作來編碼AMP之多核苷酸；及以下中之一或多者：(2)啟動子、終止子、及/或增強子元件；(3)合適mRNA穩定多聚腺苷酸信號；(4)內部核糖體進入位點(IRES)；(5)內含子；及/或(6)轉錄後調控元件。
在一些實施例中，一個、兩個、三個、或更多個表現匣可選殖至載體中，其中各表現匣包含編碼AMP之多核苷酸，其中AMP中之每一者相同或不同。
在一些實施例中，一個、兩個、三個、或更多個表現匣可選殖至載體中，其中各表現匣包含編碼AMP ORF之多核苷酸，其中AMP ORF中之每一者相同或不同。
在一些實施例中，使用各種選殖策略，及熟習此項技術者易於得到之商用選殖套組及材料，AMP多核苷酸可選殖至載體(例如，在此項技術中已知之選殖載體或表現載體)中。例如，AMP多核苷酸可使用諸如SnapFast、Gateway、TOPO、Gibson、LIC、InFusionHD、或Electra策略之策略來選殖至載體中。許多商購載體可用於產生AMP。例如，AMP多核苷酸可使用聚合酶鏈反應(PCR)來產生，並且在室溫下與pCR TMII-TOPO載體、或PCR TM2.1-TOPO®載體(可作為TOPO® TA Cloning®套組自Invitrogen購得)組合5分鐘；然後可將TOPO®反應物轉型至感受態細胞中，其可隨後基於變色來選擇(參見Janke等人，A versatile toolbox for PCR-based tagging of yeast genes: new fluorescent proteins, more markers and promoter substitution cassettes. Yeast. 2004年8月; 21(11):947-62；亦參見Adams等人Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbor, NY, 1997，其揭示內容以全文引用方式併入本文)。
在一些實施例中，編碼AMP或AMP之多個複本(相同或不同)的多核苷酸可選殖至載體諸如質體、黏接質體、病毒(噬菌體、動物病毒、及植物病毒)、及/或人工染色體(例如，YAC)中。
在一些實施例中，藉由執行以下步驟，編碼AMP之多核苷酸可插入載體中，例如，使用大腸桿菌作為宿主之質體載體：使用允許插入所關注之DNA區段必不可少的限制酶，消化約2至5 μg之載體DNA，隨後隔夜培育來實現完全消化(鹼性磷酸酶可用於將5’末端去磷酸化以避免自身連接/再環化)；凝膠純化經消化載體。隨後，經由PCR來擴增所關注之DNA區段，例如，編碼AMP之多核苷酸，並且使用熟習此項技術者已知之技術(例如，使用PCR洗滌套組)，將將任何過量酶、引子、未併入dNTP、失效PCR產物、及/或鹽自PCR反應中移除。藉由製備包含以下之混合物，將所關注之DNA區段連接至載體：約20 ng之載體；約100至1,000 ng所關注之DNA區段；2 μL 10x緩衝液(亦即，30 mM Tris-HCl 4 mM MgCl 2、26 μM NAD、1 mM DTT、50 μg/ml BSA, pH 8，在25℃下儲存)；1 μL T4 DNA連接酶；全部藉由添加H 2O來達到20 μL之總體積。然後，連接反應混合物可在室溫下培育2小時，或在16℃下培育隔夜。然後，例如使用電穿孔或化學方法，可將連接反應物(亦即，約1 μL)轉型至感受態細胞中，並且然後可執行菌落PCR來鑑別含有所關注之DNA區段的載體。
在一些實施例中，編碼AMP之多核苷酸(例如，AMP ORF)，與共同構成AMP表現匣之其他DNA區段一起，可被設計成自宿主酵母細胞中分泌。設計AMP表現匣之示例性方法如下：該匣可以信號肽序列開始，繼之以編碼Kex2裂解位點(離胺酸-精胺酸)之DNA序列，並且隨後繼之以AMP多核苷酸轉殖基因(AMP ORF)，並且在5’末端處添加甘胺酸-絲胺酸密碼子，並且最後在3’末端處添加終止密碼子。然後，所有此等元件在酵母細胞中，作為單一開放讀框(ORF)來表現為融合肽。α-配合因子(αMF)信號序列最頻繁地用於經由重組酵母之內源性分泌途徑來促進重組殺昆蟲肽之代謝處理，亦即，所表現融合肽通常進入內質網，其中α-配合因子信號序列藉由信號肽酶活性來移除，然後所得前殺昆蟲肽被轉運至高爾基體，其中以上提到之離胺酸-精胺酸二肽藉由Kex2內切蛋白酶來完全移除，然後成熟多肽(亦即，AMP)自細胞中分泌出來。
在一些實施例中，重組酵母細胞中之多肽表現水準可藉由基於特定宿主酵母物種來最佳化密碼子而得以增強。在給定宿主有機體之內源性開放讀框中觀察到之密碼子之天然發生頻率不一定針對高效率表現來最佳化。此外，不同酵母物種(例如，乳酸克魯維酵母、巴斯德畢赤酵母、釀酒酵母等)具有用於高效率表現之不同最佳密碼子。因此，對於包括對信號序列、Kex2裂解位點及AMP進行編碼之序列元件的AMP表現匣，應考慮密碼子最佳化，因為此等序列元件最初在重組酵母細胞中，作為一個融合肽來轉譯。
在一些實施例中，密碼子最佳化AMP表現匣可連接至酵母特異性表現載體中以便用於酵母表現。存在可用於酵母表現的許多表現載體，包括附加型載體及整合載體，並且其通常針對特定酵母菌株來設計。應鑒於用於肽產生之特定酵母表現系統來謹慎地選擇合適表現載體。在一些實施例中，可使用整合載體，該等載體整合至轉型酵母細胞之染色體中並且在細胞分裂及增殖之週期中保持穩定。整合DNA序列與轉型酵母物種中之目標基因組DNA基因座同源，並且此等整合序列包括pLAC4、25S rDNA、pAOX1、及TRP2等。殺昆蟲肽轉殖基因之位置可與整合DNA序列相鄰(嵌入載體)或在整合DNA序列內部(置換載體)。
在一些實施例中，表現載體或選殖載體可含有用於在大腸桿菌中製備DNA之大腸桿菌元件，例如，大腸桿菌複製起點、抗生素選擇標誌物等。在一些實施例中，載體可含有表現所關注之轉殖基因所需要的一系列序列元件，例如，轉錄啟動子、終止子、酵母選擇標誌物、與宿主酵母DNA同源之整合DNA序列等。存在可利用之許多合適酵母啟動子，包括天然及工程化啟動子，例如，酵母啟動子諸如pLAC4、pAOX1、pUPP、pADH1、pTEF、pGal1等並且在一些實施例中，可使用其他啟動子。
在一些實施例中，可使用諸如乙醯胺原營養選擇、吉歐黴素抗性選擇、遺傳黴素抗性選擇、諾爾絲菌素抗性選擇、尿嘧啶缺乏選擇之選擇方法、及/或其他選擇方法。例如，在一些實施例中，小巢狀麴黴 (Aspergillus nidulans) amdS基因可用作可選擇標誌物。使用可選擇標誌物之示例性方法可發現於美國專利第6,548,285號(1997年4月3日提出申請)；第6,165,715號(1998年6月22日提出申請)；及第6,110,707號(1997年1月17日提出申請)中，其揭示內容以全文引用方式併入本文。
在一些實施例中，編碼AMP之多核苷酸可插入pKLAC1載體中。pKLAC1可New England Biolabs® Inc.,(物品編號NEB #E1000)購得。pKLAC1載體被設計來實現重組蛋白(例如，AMP)酵母在乳酸克魯維酵母中之高水準表現。pKLAC1質體可單獨，或作為乳酸克魯維斯酵母蛋白表現套組之一部分訂購。pKLAC1質體可使用SacII或BstXI限制酶來線性化，並且具有αMF分泌信號下游之MCS。αMF分泌信號將重組蛋白引導至分泌途徑，然後經由Kex2裂解，由此產生所關注之肽，例如，AMP。Kex2為鈣依賴性絲胺酸蛋白酶，其涉及活化分泌途徑之前蛋白，並且為可購得的(PeproTech®；物品編號450-45)。
在一些實施例中，編碼AMP之多核苷酸可插入pLB102質體中，或在選擇用與編碼AMP之多核苷酸連接之pKLAC1質體來轉型之酵母菌落之後，將該多核苷酸次選殖至pLB102質體中。用與編碼AMP之多核苷酸連接之pKLAC1質體來轉型之酵母，例如乳酸克魯維斯酵母，可基於乙醯胺酶( amdS)來選擇，該酶允許轉型酵母細胞在含有乙醯胺作為其唯一氮源之YCB培養基中生長。
在一些實施例中，編碼AMP之多核苷酸可插入熟習此項技術者易於得到之其他商購質體及/或載體中，例如，質體可獲自Addgene(非營利性質體儲存庫)；GenScript®；Takara®；Qiagen®；及Promega TM。
在一些實施例中，用一或多個AMP表現匣來轉型之酵母細胞可以如下產率，在酵母培養物中產生AMP：每公升培養基至少70 mg/L、至少80 mg/L、至少90 mg/L、至少100 mg/L、至少110 mg/L、至少120 mg/L、至少130 mg/L、至少140 mg/L、至少150 mg/L、至少160 mg/L、至少170 mg/L、至少180 mg/L、至少190 mg/L 200 mg/L、至少500 mg/L、至少750 mg/L、至少1,000 mg/L、至少1,250 mg/L、至少1,500 mg/L、至少1,750 mg/L、至少2,000 mg/L、至少2,500 mg/L、至少3,000 mg/L、至少3,500 mg/L、至少4,000 mg/L、至少4,500 mg/L、至少5,000 mg/L、至少5,500 mg/L、至少6,000 mg/L、至少6,500 mg/L、至少7,000 mg/L、至少7,500 mg/L、至少8,000 mg/L、至少8,500 mg/L、至少9,000 mg/L、至少9,500 mg/L、至少10,000 mg/L、至少11,000 mg/L、至少12,000 mg/L、至少12,500 mg/L、至少13,000 mg/L、至少14,000 mg/L、至少15,000 mg/L、至少16,000 mg/L、至少17,000 mg/L、至少17,500 mg/L、至少18,000 mg/L、至少19,000 mg/L、至少20,000 mg/L、至少25,000 mg/L、至少30,000 mg/L、至少40,000 mg/L、至少50,000 mg/L、至少60,000 mg/L、至少70,000 mg/L、至少80,000 mg/L、至少90,000 mg/L、或至少100,000 mg/L之AMP。
在一些實施例中，包含可操作來表現AMP之多核苷酸的一或多個表現匣可插入載體中，產生以下範圍內之產率：每公升培養基(酵母發酵液之上清液)約100 mg/L之AMP至約100,000 mg/L；約110 mg/L至約100,000 mg/L；約120 mg/L至約100,000 mg/L；約130 mg/L至約100,000 mg/L；約140 mg/L至約100,000 mg/L；約150 mg/L至約100,000 mg/L；約160 mg/L至約100,000 mg/L；約170 mg/L至約100,000 mg/L；約180 mg/L至約100,000 mg/L；約190 mg/L至約100,000 mg/L；約200 mg/L至約100,000 mg/L；約250 mg/L至約100,000 mg/L；約500 mg/L至約100,000 mg/L；約750 mg/L至約100,000 mg/L；約1000 mg/L至約100,000 mg/L；約1000 mg/L至約100,000 mg/L；約1500 mg/L至約100,000 mg/L；約2000 mg/L至約100,000 mg/L；約2500 mg/L至約100,000 mg/L；約3000 mg/L至約100,000 mg/L；約3500 mg/L至約100,000 mg/L；約4000 mg/L至約100,000 mg/L；約4500 mg/L至約100,000 mg/L；約5000 mg/L至約100,000 mg/L；約5500 mg/L至約100,000 mg/L；約6000 mg/L至約100,000 mg/L；約6500 mg/L至約100,000 mg/L；約7000 mg/L至約100,000 mg/L；約7500 mg/L至約100,000 mg/L；約8000 mg/L至約100,000 mg/L；約8500 mg/L至約100,000 mg/L；約9000 mg/L至約100,000 mg/L；約9500 mg/L至約100,000 mg/L；約10000 mg/L至約100,000 mg/L；約10500 mg/L至約100,000 mg/L；約11000 mg/L至約100,000 mg/L；約11500 mg/L至約100,000 mg/L；約12000 mg/L至約100,000 mg/L；約12500 mg/L至約100,000 mg/L；約13000 mg/L至約100,000 mg/L；約13500 mg/L至約100,000 mg/L；約14000 mg/L至約100,000 mg/L；約14500 mg/L至約100,000 mg/L；約15000 mg/L至約100,000 mg/L；約15500 mg/L至約100,000 mg/L；約16000 mg/L至約100,000 mg/L；約16500 mg/L至約100,000 mg/L；約17000 mg/L至約100,000 mg/L；約17500 mg/L至約100,000 mg/L；約18000 mg/L至約100,000 mg/L；約18500 mg/L至約100,000 mg/L；約19000 mg/L至約100,000 mg/L；約19500 mg/L至約100,000 mg/L；約20000 mg/L至約100,000 mg/L；約20500 mg/L至約100,000 mg/L；約21000 mg/L至約100,000 mg/L；約21500 mg/L至約100,000 mg/L；約22000 mg/L至約100,000 mg/L；約22500 mg/L至約100,000 mg/L；約23000 mg/L至約100,000 mg/L；約23500 mg/L至約100,000 mg/L；約24000 mg/L至約100,000 mg/L；約24500 mg/L至約100,000 mg/L；約25000 mg/L至約100,000 mg/L；約25500 mg/L至約100,000 mg/L；約26000 mg/L至約100,000 mg/L；約26500 mg/L至約100,000 mg/L；約27000 mg/L至約100,000 mg/L；約27500 mg/L至約100,000 mg/L；約28000 mg/L至約100,000 mg/L；約28500 mg/L至約100,000 mg/L；約29000 mg/L至約100,000 mg/L；約29500 mg/L至約100,000 mg/L；約30000 mg/L至約100,000 mg/L；約30500 mg/L至約100,000 mg/L；約31000 mg/L至約100,000 mg/L；約31500 mg/L至約100,000 mg/L；約32000 mg/L至約100,000 mg/L；約32500 mg/L至約100,000 mg/L；約33000 mg/L至約100,000 mg/L；約33500 mg/L至約100,000 mg/L；約34000 mg/L至約100,000 mg/L；約34500 mg/L至約100,000 mg/L；約35000 mg/L至約100,000 mg/L；約35500 mg/L至約100,000 mg/L；約36000 mg/L至約100,000 mg/L；約36500 mg/L至約100,000 mg/L；約37000 mg/L至約100,000 mg/L；約37500 mg/L至約100,000 mg/L；約38000 mg/L至約100,000 mg/L；約38500 mg/L至約100,000 mg/L；約39000 mg/L至約100,000 mg/L；約39500 mg/L至約100,000 mg/L；約40000 mg/L至約100,000 mg/L；約40500 mg/L至約100,000 mg/L；約41000 mg/L至約100,000 mg/L；約41500 mg/L至約100,000 mg/L；約42000 mg/L至約100,000 mg/L；約42500 mg/L至約100,000 mg/L；約43000 mg/L至約100,000 mg/L；約43500 mg/L至約100,000 mg/L；約44000 mg/L至約100,000 mg/L；約44500 mg/L至約100,000 mg/L；約45000 mg/L至約100,000 mg/L；約45500 mg/L至約100,000 mg/L；約46000 mg/L至約100,000 mg/L；約46500 mg/L至約100,000 mg/L；約47000 mg/L至約100,000 mg/L；約47500 mg/L至約100,000 mg/L；約48000 mg/L至約100,000 mg/L；約48500 mg/L至約100,000 mg/L；約49000 mg/L至約100,000 mg/L；約49500 mg/L至約100,000 mg/L；約50000 mg/L至約100,000 mg/L；約50500 mg/L至約100,000 mg/L；約51000 mg/L至約100,000 mg/L；約51500 mg/L至約100,000 mg/L；約52000 mg/L至約100,000 mg/L；約52500 mg/L至約100,000 mg/L；約53000 mg/L至約100,000 mg/L；約53500 mg/L至約100,000 mg/L；約54000 mg/L至約100,000 mg/L；約54500 mg/L至約100,000 mg/L；約55000 mg/L至約100,000 mg/L；約55500 mg/L至約100,000 mg/L；約56000 mg/L至約100,000 mg/L；約56500 mg/L至約100,000 mg/L；約57000 mg/L至約100,000 mg/L；約57500 mg/L至約100,000 mg/L；約58000 mg/L至約100,000 mg/L；約58500 mg/L至約100,000 mg/L；約59000 mg/L至約100,000 mg/L；約59500 mg/L至約100,000 mg/L；約60000 mg/L至約100,000 mg/L；約60500 mg/L至約100,000 mg/L；約61000 mg/L至約100,000 mg/L；約61500 mg/L至約100,000 mg/L；約62000 mg/L至約100,000 mg/L；約62500 mg/L至約100,000 mg/L；約63000 mg/L至約100,000 mg/L；約63500 mg/L至約100,000 mg/L；約64000 mg/L至約100,000 mg/L；約64500 mg/L至約100,000 mg/L；約65000 mg/L至約100,000 mg/L；約65500 mg/L至約100,000 mg/L；約66000 mg/L至約100,000 mg/L；約66500 mg/L至約100,000 mg/L；約67000 mg/L至約100,000 mg/L；約67500 mg/L至約100,000 mg/L；約68000 mg/L至約100,000 mg/L；約68500 mg/L至約100,000 mg/L；約69000 mg/L至約100,000 mg/L；約69500 mg/L至約100,000 mg/L；約70000 mg/L至約100,000 mg/L；約70500 mg/L至約100,000 mg/L；約71000 mg/L至約100,000 mg/L；約71500 mg/L至約100,000 mg/L；約72000 mg/L至約100,000 mg/L；約72500 mg/L至約100,000 mg/L；約73000 mg/L至約100,000 mg/L；約73500 mg/L至約100,000 mg/L；約74000 mg/L至約100,000 mg/L；約74500 mg/L至約100,000 mg/L；約75000 mg/L至約100,000 mg/L；約75500 mg/L至約100,000 mg/L；約76000 mg/L至約100,000 mg/L；約76500 mg/L至約100,000 mg/L；約77000 mg/L至約100,000 mg/L；約77500 mg/L至約100,000 mg/L；約78000 mg/L至約100,000 mg/L；約78500 mg/L至約100,000 mg/L；約79000 mg/L至約100,000 mg/L；約79500 mg/L至約100,000 mg/L；約80000 mg/L至約100,000 mg/L；約80500 mg/L至約100,000 mg/L；約81000 mg/L至約100,000 mg/L；約81500 mg/L至約100,000 mg/L；約82000 mg/L至約100,000 mg/L；約82500 mg/L至約100,000 mg/L；約83000 mg/L至約100,000 mg/L；約83500 mg/L至約100,000 mg/L；約84000 mg/L至約100,000 mg/L；約84500 mg/L至約100,000 mg/L；約85000 mg/L至約100,000 mg/L；約85500 mg/L至約100,000 mg/L；約86000 mg/L至約100,000 mg/L；約86500 mg/L至約100,000 mg/L；約87000 mg/L至約100,000 mg/L；約87500 mg/L至約100,000 mg/L；約88000 mg/L至約100,000 mg/L；約88500 mg/L至約100,000 mg/L；約89000 mg/L至約100,000 mg/L；約89500 mg/L至約100,000 mg/L；約90000 mg/L至約100,000 mg/L；約90500 mg/L至約100,000 mg/L；約91000 mg/L至約100,000 mg/L；約91500 mg/L至約100,000 mg/L；約92000 mg/L至約100,000 mg/L；約92500 mg/L至約100,000 mg/L；約93000 mg/L至約100,000 mg/L；約93500 mg/L至約100,000 mg/L；約94000 mg/L至約100,000 mg/L；約94500 mg/L至約100,000 mg/L；約95000 mg/L至約100,000 mg/L；約95500 mg/L至約100,000 mg/L；約96000 mg/L至約100,000 mg/L；約96500 mg/L至約100,000 mg/L；約97000 mg/L至約100,000 mg/L；約97500 mg/L至約100,000 mg/L；約98000 mg/L至約100,000 mg/L；約98500 mg/L至約100,000 mg/L；約99000 mg/L至約100,000 mg/L；或約99500 mg/L至約100,000 mg/L之AMP。
在一些實施例中，包含可操作來表現AMP之多核苷酸的一或多個表現匣可插入載體中，產生以下範圍內之產率：每公升培養基(酵母發酵液之上清液)約100 mg/L之AMP至約100,000 mg/L；約100 mg/L至約99500 mg/L；約100 mg/L至約99000 mg/L；約100 mg/L至約98500 mg/L；約100 mg/L至約98000 mg/L；約100 mg/L至約97500 mg/L；約100 mg/L至約97000 mg/L；約100 mg/L至約96500 mg/L；約100 mg/L至約96000 mg/L；約100 mg/L至約95500 mg/L；約100 mg/L至約95000 mg/L；約100 mg/L至約94500 mg/L；約100 mg/L至約94000 mg/L；約100 mg/L至約93500 mg/L；約100 mg/L至約93000 mg/L；約100 mg/L至約92500 mg/L；約100 mg/L至約92000 mg/L；約100 mg/L至約91500 mg/L；約100 mg/L至約91000 mg/L；約100 mg/L至約90500 mg/L；約100 mg/L至約90000 mg/L；約100 mg/L至約89500 mg/L；約100 mg/L至約89000 mg/L；約100 mg/L至約88500 mg/L；約100 mg/L至約88000 mg/L；約100 mg/L至約87500 mg/L；約100 mg/L至約87000 mg/L；約100 mg/L至約86500 mg/L；約100 mg/L至約86000 mg/L；約100 mg/L至約85500 mg/L；約100 mg/L至約85000 mg/L；約100 mg/L至約84500 mg/L；約100 mg/L至約84000 mg/L；約100 mg/L至約83500 mg/L；約100 mg/L至約83000 mg/L；約100 mg/L至約82500 mg/L；約100 mg/L至約82000 mg/L；約100 mg/L至約81500 mg/L；約100 mg/L至約81000 mg/L；約100 mg/L至約80500 mg/L；約100 mg/L至約80000 mg/L；約100 mg/L至約79500 mg/L；約100 mg/L至約79000 mg/L；約100 mg/L至約78500 mg/L；約100 mg/L至約78000 mg/L；約100 mg/L至約77500 mg/L；約100 mg/L至約77000 mg/L；約100 mg/L至約76500 mg/L；約100 mg/L至約76000 mg/L；約100 mg/L至約75500 mg/L；約100 mg/L至約75000 mg/L；約100 mg/L至約74500 mg/L；約100 mg/L至約74000 mg/L；約100 mg/L至約73500 mg/L；約100 mg/L至約73000 mg/L；約100 mg/L至約72500 mg/L；約100 mg/L至約72000 mg/L；約100 mg/L至約71500 mg/L；約100 mg/L至約71000 mg/L；約100 mg/L至約70500 mg/L；約100 mg/L至約70000 mg/L；約100 mg/L至約69500 mg/L；約100 mg/L至約69000 mg/L；約100 mg/L至約68500 mg/L；約100 mg/L至約68000 mg/L；約100 mg/L至約67500 mg/L；約100 mg/L至約67000 mg/L；約100 mg/L至約66500 mg/L；約100 mg/L至約66000 mg/L；約100 mg/L至約65500 mg/L；約100 mg/L至約65000 mg/L；約100 mg/L至約64500 mg/L；約100 mg/L至約64000 mg/L；約100 mg/L至約63500 mg/L；約100 mg/L至約63000 mg/L；約100 mg/L至約62500 mg/L；約100 mg/L至約62000 mg/L；約100 mg/L至約61500 mg/L；約100 mg/L至約61000 mg/L；約100 mg/L至約60500 mg/L；約100 mg/L至約60000 mg/L；約100 mg/L至約59500 mg/L；約100 mg/L至約59000 mg/L；約100 mg/L至約58500 mg/L；約100 mg/L至約58000 mg/L；約100 mg/L至約57500 mg/L；約100 mg/L至約57000 mg/L；約100 mg/L至約56500 mg/L；約100 mg/L至約56000 mg/L；約100 mg/L至約55500 mg/L；約100 mg/L至約55000 mg/L；約100 mg/L至約54500 mg/L；約100 mg/L至約54000 mg/L；約100 mg/L至約53500 mg/L；約100 mg/L至約53000 mg/L；約100 mg/L至約52500 mg/L；約100 mg/L至約52000 mg/L；約100 mg/L至約51500 mg/L；約100 mg/L至約51000 mg/L；約100 mg/L至約50500 mg/L；約100 mg/L至約50000 mg/L；約100 mg/L至約49500 mg/L；約100 mg/L至約49000 mg/L；約100 mg/L至約48500 mg/L；約100 mg/L至約48000 mg/L；約100 mg/L至約47500 mg/L；約100 mg/L至約47000 mg/L；約100 mg/L至約46500 mg/L；約100 mg/L至約46000 mg/L；約100 mg/L至約45500 mg/L；約100 mg/L至約45000 mg/L；約100 mg/L至約44500 mg/L；約100 mg/L至約44000 mg/L；約100 mg/L至約43500 mg/L；約100 mg/L至約43000 mg/L；約100 mg/L至約42500 mg/L；約100 mg/L至約42000 mg/L；約100 mg/L至約41500 mg/L；約100 mg/L至約41000 mg/L；約100 mg/L至約40500 mg/L；約100 mg/L至約40000 mg/L；約100 mg/L至約39500 mg/L；約100 mg/L至約39000 mg/L；約100 mg/L至約38500 mg/L；約100 mg/L至約38000 mg/L；約100 mg/L至約37500 mg/L；約100 mg/L至約37000 mg/L；約100 mg/L至約36500 mg/L；約100 mg/L至約36000 mg/L；約100 mg/L至約35500 mg/L；約100 mg/L至約35000 mg/L；約100 mg/L至約34500 mg/L；約100 mg/L至約34000 mg/L；約100 mg/L至約33500 mg/L；約100 mg/L至約33000 mg/L；約100 mg/L至約32500 mg/L；約100 mg/L至約32000 mg/L；約100 mg/L至約31500 mg/L；約100 mg/L至約31000 mg/L；約100 mg/L至約30500 mg/L；約100 mg/L至約30000 mg/L；約100 mg/L至約29500 mg/L；約100 mg/L至約29000 mg/L；約100 mg/L至約28500 mg/L；約100 mg/L至約28000 mg/L；約100 mg/L至約27500 mg/L；約100 mg/L至約27000 mg/L；約100 mg/L至約26500 mg/L；約100 mg/L至約26000 mg/L；約100 mg/L至約25500 mg/L；約100 mg/L至約25000 mg/L；約100 mg/L至約24500 mg/L；約100 mg/L至約24000 mg/L；約100 mg/L至約23500 mg/L；約100 mg/L至約23000 mg/L；約100 mg/L至約22500 mg/L；約100 mg/L至約22000 mg/L；約100 mg/L至約21500 mg/L；約100 mg/L至約21000 mg/L；約100 mg/L至約20500 mg/L；約100 mg/L至約20000 mg/L；約100 mg/L至約19500 mg/L；約100 mg/L至約19000 mg/L；約100 mg/L至約18500 mg/L；約100 mg/L至約18000 mg/L；約100 mg/L至約17500 mg/L；約100 mg/L至約17000 mg/L；約100 mg/L至約16500 mg/L；約100 mg/L至約16000 mg/L；約100 mg/L至約15500 mg/L；約100 mg/L至約15000 mg/L；約100 mg/L至約14500 mg/L；約100 mg/L至約14000 mg/L；約100 mg/L至約13500 mg/L；約100 mg/L至約13000 mg/L；約100 mg/L至約12500 mg/L；約100 mg/L至約12000 mg/L；約100 mg/L至約11500 mg/L；約100 mg/L至約11000 mg/L；約100 mg/L至約10500 mg/L；約100 mg/L至約10000 mg/L；約100 mg/L至約9500 mg/L；約100 mg/L至約9000 mg/L；約100 mg/L至約8500 mg/L；約100 mg/L至約8000 mg/L；約100 mg/L至約7500 mg/L；約100 mg/L至約7000 mg/L；約100 mg/L至約6500 mg/L；約100 mg/L至約6000 mg/L；約100 mg/L至約5500 mg/L；約100 mg/L至約5000 mg/L；約100 mg/L至約4500 mg/L；約100 mg/L至約4000 mg/L；約100 mg/L至約3500 mg/L；約100 mg/L至約3000 mg/L；約100 mg/L至約2500 mg/L；約100 mg/L至約2000 mg/L；約100 mg/L至約1500 mg/L；約100 mg/L至約1000 mg/L；約100 mg/L至約1000 mg/L；約100 mg/L至約750 mg/L；約100 mg/L至約500 mg/L；約100 mg/L至約250 mg/L；約100 mg/L至約100 mg/L；或約100 mg/L至約110 mg/L之AMP。
在一些實施例中，包含可操作來表現AMP之多核苷酸的兩個表現匣可插入載體例如pKS022質體中，由此產生約2 g/L之AMP的產率(酵母發酵液之上清液)。或者，在一些實施例中，包含可操作來表現AMP之多核苷酸的三個表現匣可插入載體，例如pLB103bT質體中。
在一些實施例中，多個AMP表現匣可轉染至酵母中以便實現最佳化AMP轉殖基因之一或個複本整合至乳酸克魯維斯酵母基因組中。將多個AMP表現匣引入乳酸克魯維斯酵母基因組中之示例性方法如下：合成AMP表現匣DNA序列，其包含完整LAC4啟動子元件、密碼子最佳化AMP ORF元件及pLAC4終止子元件；將完整表現匣連接至在pLB10V5之pLAC4終止子下游的Sal I與Kpn I限制位點之間之pLB103b載體，由此產生雙重轉殖基因AMP表現載體pKS022；然後，雙重轉殖基因載體pKS022使用Sac II限制性核酸內切酶來線性化並且藉由電穿孔來轉型至乳酸克魯維斯酵母之YCT306菌株中。然後，所得酵母菌落在補充有5 mM乙醯胺之YCB瓊脂板上生長，僅表現乙醯胺酶之細胞可有效地使用乙醯胺作為代謝氮源。為了評估酵母菌落，可自pKS022酵母板採集約100至400個菌落。來自菌落之接種物各自在2.2 mL之規定乳酸克魯維斯酵母培養基中培養，其中添加2%糖醇作為碳源。伴以在280 rpm下振動，將培養物在23.5℃下培育六天，在此時點，培養物中之細胞密度達到其最大水準，如藉由600 nm下之光吸收率(OD600)指示。然後藉由在4,000 rpm下離心10分鐘，將細胞自培養物中移除，並且所得上清液(條件培養基)經由0.2 μM膜過濾以便進行HPLC產率分析。 化學合成 AMP
肽合成或化學合成或肽及/或多肽可用於產生AMP：此等方法可藉由熟習此項技術者，及/或經由使用商業供應商(例如，GenScript®；Piscataway, New Jersey)來執行。例如，在一些實施例中，化學肽合成可使用液相肽合成(LPPS)、或固相肽合成(SPPS)來達成。
在一些實施例中，肽合成可通常使用策略來達成，其中使後續胺基酸之羧基偶合至先前胺基酸之N端產生新生多肽鏈，該過程與在自然界中發生之多肽合成之類型相反。
肽去保護為多肽之化學合成中之重要第一步驟。肽去保護為胺基酸之反應性基團經由使用化學物來阻斷以便防止該胺基酸之官能基參與不當或非特定反應或副反應的過程；換言之，胺基酸「受保護」以免參與此等不良反應。
在合成肽鏈之前，胺基酸必須「去保護」以便允許鏈形成(亦即，胺基酸結合)。用於保護N末端之化學物包括9-茀基甲氧羰基(Fmoc)、及第三丁氧羰基(Boc)，其中之每一者可分別經由使用弱鹼(例如，哌啶)及適度地強酸(例如，三氟乙酸(TFA))來移除。
所需C端保護劑取決於所使用之化學肽合成策略之類型：例如，LPPS需要對C末端胺基酸進行保護，而SPPS由於充當保護基之固體支撐物而導致不需要此保護。側鏈胺基酸要求使用基於個別肽序列及N末端保護策略而有所不同的多種不同保護基；然而，通常，用於側鏈胺基酸之保護基基於第三丁基(tBu)或苄基(Bzl)保護基。
胺基酸偶合為肽合成程序中的下一個步驟。為了實現胺基酸偶合，輸入胺基酸之C末端羧酸必須活化：此舉可使用碳二亞胺諸如二異丙基碳二亞胺(DIC)、或二環己基碳二亞胺(DCC)來完成，該等碳二亞胺與輸入胺基酸之羧基反應以形成O-醯基異脲中間物。隨後，O-醯基異脲中間物經由藉由增長肽鏈之N端上之一級胺基實現的親核攻擊而被移置。藉由碳二亞胺來產生之反應性中間物可導致胺基酸之外消旋作用。為了避免胺基酸之外消旋作用，添加諸如1-羥基苯并三唑(HOBt)之試劑以便與O-醯基異脲中間物反應。可使用之其他偶合劑包括2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸(HBTU)，及苯并三唑-1-基-氧基-參(二甲基胺基)鏻六氟磷酸(BOP)，以及額外活化鹼基。最終，在胺基酸去保護及偶合之後，
在合成過程結束時，必須發生保護基自多肽中之移除，其為通常經由酸解來發生之過程。確定需要哪些試劑用於肽裂解隨著所使用之保護方案及總體合成方法而變化。例如，在一些實施例中，可使用溴化氫(HBr)；氟化氫(HF)；或三氟甲烷磺酸(TFMSA)來裂解Bzl及Boc基團。或者，在其他實施例中，諸如TFA之不太強的酸可實現tBut及Fmoc基團之酸解。最終，肽可基於肽之物理化學特性(例如，電荷、尺寸、疏水性等)來純化。可用於純化肽之技術包括純化技術包括反相層析(RPC)；尺寸排阻層析；分配層析；高效能液相層析(HPLC)；及離子交換層析(IEC)。
肽合成之示例性方法可發現於Anderson G. W.及McGregor A. C. (1957) T-butyloxycarbonylamino acids and their use in peptide synthesis. Journal of the American Chemical Society. 79, 6180-3；Carpino L. A. (1957) Oxidative reactions of hydrazines. Iv. Elimination of nitrogen from 1, 1-disubstituted-2-arenesulfonhydrazides1-4. Journal of the American Chemical Society. 79, 4427-31；McKay F. C.及Albertson N. F. (1957) New amine-masking groups for peptide synthesis. Journal of the American Chemical Society. 79, 4686-90；Merrifield R. B. (1963) Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. Journal of the American Chemical Society. 85, 2149-54；Carpino L. A.及Han G. Y. (1972) 9-fluorenylmethoxycarbonyl amino-protecting group. The Journal of Organic Chemistry. 37, 3404-9；及A Lloyd-Williams P.等人(1997) Chemical approaches to the synthesis of peptides and proteins. Boca Raton: CRC Press. 278；美國專利第3,714,140號(1971年3月16日提出申請)；第4,411,994號(1978年6月8日提出申請)；第7,785,832號(2006年1月20日提出申請)；第8,314,208號(2006年2月10日提出申請)；及第10,442,834號(2015年10月2日提出申請)；及美國專利申請案2005/0165215 (2004年12月23日提出申請)，其揭示內容以全文引用方式併入本文。 細胞培養及轉型技術
術語「轉型」及「轉染」均描述將外源及/或異源多核苷酸(例如，DNA或RNA)引入宿主有機體之過程。一般而言，熟習此項技術者有時保留術語「轉型」來描述其中將外源及/或異源多核苷酸(例如DNA或RNA)引入細菌細胞中之過程；並且保留術語「轉染」用於描述將外源及/或異源多核苷酸(例如DNA或RNA)引入真核細胞中之過程。然而，如本文使用，術語「轉型」及「轉染」同義使用，不論是否過程描述引入外源及/或異源DNA或RNA至原核生物(例如，細菌)或真核生物(例如，酵母、植物、或動物)中。
在一些實施例中，宿主有機體可用可操作來編碼AMP之多核苷酸來轉型。在一些實施例中，宿主有機體可為微生物，例如，細胞。
在一些實施例中，包含AMP表現匣之載體可選殖至表現質體中並且轉型至宿主細胞中。在一些實施例中，宿主細胞可選自本文所述任何宿主細胞。
在一些實施例中，宿主細胞可以使用以下方法來轉型：電穿孔；細胞擠壓；顯微注射；刺穿轉染；使用靜水壓力；聲孔效應；光學轉染；連續輸注；脂轉染；藉由使用病毒，諸如腺病毒、腺相關病毒、慢病毒、單純疱疹病毒及逆轉錄病毒；化學磷酸鹽方法；藉由DEAE-葡聚醣或聚乙烯亞胺(PEI)進行內吞；原生質體融合；流體動力輸送；磁轉染；核轉染；及/或其他。關於轉染及/或轉型技術之示例性方法可發現於Makrides (2003), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elvesier；Wong, TK及Neumann, E. Electric field mediated gene transfer. Biochem. Biophys. Res. Commun. 107, 584-587 (1982)；Potter及Heller, Transfection by Electroporation. Curr Protoc Mol Biol. 2003年5月；章節：單元-9.3；Kim及Eberwine, Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal Bioanal Chem. 2010年8月; 397(8): 3173-3178，此等參考文獻中之每一者以全文引用方式併入本文。
電穿孔為轉型宿主細胞之示例性方法。電穿孔為將電流應用於細胞，導致細胞膜變得具有滲透性的技術；此舉繼而允許將外源DNA引入細胞中。電穿孔為熟習此項技術者輕易已知的，並且達成電穿孔所需要之工具及裝置為市售的(例如，Gene Pulser Xcell™ Electroporation Systems, Bio-Rad®；Neon® Transfection System for Electroporation, Thermo-Fisher Scientific；及其他工具及/或裝置)。電穿孔之示例性方法在Potter及Heller, Transfection by Electroporation. Curr Protoc Mol Biol. 2003年5月；章節：單元-9.3；Saito (2015) Electroporation Methods in Neuroscience. Springer press; ；Pakhomov等人, (2017) Advanced Electroporation Techniques in Biology and Medicine. Taylor及Francis中示出；其揭示內容以全文引用方式併入本文。
在一些實施例中，電穿孔可用於將細胞用含有可操作來編碼一或多種AMP或AMP殺昆蟲蛋白之多核苷酸的一或多種載體來轉型。例如，在一些實施例中，電穿孔可用於將細胞用含有一或多種AMP表現匣之一或多種載體來轉型。 酵母轉型及培養方法之示例性描述
在一些實施例中，電穿孔可用於藉由包含一或多個AMP表現匣之一或多種載體來轉型酵母細胞，從而可以如下產率，在酵母培養物中產生AMP：每公升培養基至少70 mg/L、至少80 mg/L、至少90 mg/L、至少100 mg/L、至少110 mg/L、至少120 mg/L、至少130 mg/L、至少140 mg/L、至少150 mg/L、至少160 mg/L、至少170 mg/L、至少180 mg/L、至少190 mg/L 200 mg/L、至少500 mg/L、至少750 mg/L、至少1,000 mg/L、至少1,250 mg/L、至少1,500 mg/L、至少1,750 mg/L、至少2,000 mg/L、至少2,500 mg/L、至少3,000 mg/L、至少3,500 mg/L、至少4,000 mg/L、至少4,500 mg/L、至少5,000 mg/L、至少5,500 mg/L、至少6,000 mg/L、至少6,500 mg/L、至少7,000 mg/L、至少7,500 mg/L、至少8,000 mg/L、至少8,500 mg/L、至少9,000 mg/L、至少9,500 mg/L、至少10,000 mg/L、至少11,000 mg/L、至少12,000 mg/L、至少12,500 mg/L、至少13,000 mg/L、至少14,000 mg/L、至少15,000 mg/L、至少16,000 mg/L、至少17,000 mg/L、至少17,500 mg/L、至少18,000 mg/L、至少19,000 mg/L、至少20,000 mg/L、至少25,000 mg/L、至少30,000 mg/L、至少40,000 mg/L、至少50,000 mg/L、至少60,000 mg/L、至少70,000 mg/L、至少80,000 mg/L、至少90,000 mg/L、或至少100,000 mg/L之AMP。
在一些實施例中，電穿孔可用於將含有編碼AMP之多核苷酸的載體引入酵母中，例如，在一些實施例中，經由電穿孔，將AMP表現匣選殖至質體中，並且轉型至酵母細胞中。
在一些實施例中，藉由電穿孔將AMP表現匣選殖至質體中並且轉型宿主細胞(例如酵母細胞)藉由以下步驟來完成：將例如乳酸克魯維酵母、馬克斯克魯維酵母、釀酒酵母、畢赤酵母等之合適酵母物種接種約10-200 mL之酵母提取物蛋白腖葡萄糖(YEPD)，在30℃下、在振盪器上孵育直到酵母培養之指數期早期(例如約0.6至2 x 10 8個細胞/mL)；在無菌離心管中收穫酵母並且在4℃下以3000 rpm離心5分鐘(注意：在此過程中保持細胞冷卻)用40 mL冰冷無菌去離子水洗滌細胞，並以23,000 rpm將細胞沉澱5分鐘；重複洗滌步驟，並將細胞重新懸浮在20 mL之1M可發酵糖例如半乳糖、麥芽糖、乳三糖、蔗糖、果糖或葡萄糖及/或糖醇例如赤蘚糖醇、氫化澱粉水解物、異麥芽酮糖醇、乳糖醇、麥芽糖醇、甘露糖醇及木糖醇中，然後以3,000 rpm旋轉5分鐘；將細胞用適當體積之冰冷1M可發酵糖例如半乳糖、麥芽糖、乳三糖、蔗糖、果糖或葡萄糖及/或糖醇例如赤蘚糖醇、氫化澱粉水解物、異麥芽酮糖醇、乳糖醇、麥芽糖醇、甘露醇及木糖醇來重新懸浮，最終細胞密度為3x10 9細胞/mL；(1.5x10 9個細胞/mL至6x10 9個細胞/mL為可接受之細胞密度)；將40 µl酵母懸浮液與約1-4 µl(濃度為100-300ng/µl)含有編碼AMP之線性多核苷酸的載體(~1 µg)在預冷卻之0.2 cm電穿孔試管中接觸(注意：確保樣品與鋁試管之兩側接觸)；提供2000 V之單脈衝，以獲得RC電路5 ms之最佳時間常數，然後讓細胞在0.5 ml YED及0.5 mL 1M可發酵糖例如半乳糖、麥芽糖、乳三糖、蔗糖、果糖或葡萄糖及/或糖醇例如赤蘚糖醇、氫化澱粉水解物、異麥芽酮糖醇、乳糖醇、麥芽糖醇、甘露醇及木糖醇混合物中回收，然後鋪展到選擇性板上。
在一些實施例中，電穿孔可用於將包含編碼AMP之多核苷酸之載體引入酵母中，例如藉由電穿孔將AMP選殖至質體中並且轉型至乳酸克魯維酵母中可藉由以下步驟來完成：接種約10-200 mL之酵母提取物蛋白腖葡萄糖(YEPD)，在30℃下、在振盪器上孵育直到酵母培養之指數期早期(例如約0.6至2 x 10 8個細胞/mL)；在無菌離心管中收穫酵母並且在4℃下以3000 rpm離心5分鐘(注意：在此過程中保持細胞冷卻)，用40 mL冰冷無菌去離子水洗滌細胞，並以23,000 rpm將細胞沉澱5分鐘；重複洗滌步驟，並將細胞重新懸浮在20 mL之1M可發酵糖例如半乳糖、麥芽糖、乳三糖、蔗糖、果糖或葡萄糖及/或糖醇例如赤蘚糖醇、氫化澱粉水解物、異麥芽酮糖醇、乳糖醇、麥芽糖醇、甘露糖醇及木糖醇中，然後以3,000 rpm旋轉5分鐘；將細胞用適當體積之冰冷1M可發酵糖例如半乳糖、麥芽糖、乳三糖、蔗糖、果糖或葡萄糖及/或糖醇例如赤蘚糖醇、氫化澱粉水解物、異麥芽酮糖醇、乳糖醇、麥芽糖醇、甘露醇及木糖醇來重新懸浮，最終細胞密度為3x10 9個細胞/mL；將40 µl酵母懸浮液與約1-4 µl含有編碼AMP之線性多核苷酸的載體(~1 µg)在預冷卻之0.2 cm電穿孔試管中接觸(注意：確保樣品與鋁試管之兩側接觸)；提供2000 V之單脈衝，以獲得RC電路5 ms之最佳時間常數，然後讓細胞在0.5 ml YED及0.5 mL 1M可發酵糖例如半乳糖、麥芽糖、乳三糖、蔗糖、果糖或葡萄糖及/或糖醇例如赤蘚糖醇、氫化澱粉水解物、異麥芽酮糖醇、乳糖醇、麥芽糖醇、甘露醇及木糖醇混合物中回收，然後鋪展到選擇性板上。
在一些實施例中，使用本文描述之示例方法，亦即使用本揭示案之載體之酵母、及轉型及發酵方法可導致產生以下數量的AMP：每公升培養基至少70 mg/L、至少80 mg/L、至少90 mg/L、至少100 mg/L、至少110 mg/L、至少120 mg/L、至少130 mg/L、至少140 mg/L、至少150 mg/L、至少160 mg/L、至少170 mg/L、至少180 mg/L、至少190 mg/L 200 mg/L、至少500 mg/L、至少750 mg/L、至少1,000 mg/L、至少1,250 mg/L、至少1,500 mg/L、至少1,750 mg/L、至少2,000 mg/L、至少2,500 mg/L、至少3,000 mg/L、至少3,500 mg/L、至少4,000 mg/L、至少4,500 mg/L、至少5,000 mg/L、至少5,500 mg/L、至少6,000 mg/L、至少6,500 mg/L、至少7,000 mg/L、至少7,500 mg/L、至少8,000 mg/L、至少8,500 mg/L、至少9,000 mg/L、至少9,500 mg/L、至少10,000 mg/L、至少11,000 mg/L、至少12,000 mg/L、至少12,500 mg/L、至少13,000 mg/L、至少14,000 mg/L、至少15,000 mg/L、至少16,000 mg/L、至少17,000 mg/L、至少17,500 mg/L、至少18,000 mg/L、至少19,000 mg/L、至少20,000 mg/L、至少25,000 mg/L、至少30,000 mg/L、至少40,000 mg/L、至少50,000 mg/L、至少60,000 mg/L、至少70,000 mg/L、至少80,000 mg/L、至少90,000 mg/L、或至少100,000 mg/L之AMP。
在一些實施例中，藉由以下步驟，電穿孔可用於將包含編碼AMP之多核苷酸之載體引入植物原生質體中：在原生質體溶液(例如，約8 mL之10 mM 2-[ N-嗎啉基]乙烷磺酸(MES)，pH 5.5；0.01% (w/v)果膠酶；1% (w/v)離析酶；40 mM CaCl 2；及0.4 M甘露醇)中，孵育無菌植物材料，並且在30℃下，將混合物加入到旋轉振盪器中持續約3至6小時以產生原生質體；藉由80 μm目耐綸篩網過濾來去除碎屑；用約4 ml植物電穿孔緩衝液(例如5 mM CaCl 2；0.4 M甘露醇；及PBS)來沖洗篩網；將原生質體在無菌15 mL錐形離心管中合併，然後以約300 × g離心約5分鐘；離心後，棄去上清液，用5 mL植物電穿孔緩衝液洗滌；將原生質體以每毫升液體約1.5 x 10 6至2 x 10 6個原生質體重懸於植物電穿孔緩衝液中；將約0.5 mL原生質體懸浮液轉移到一個或多個電穿孔試管中，置於冰上，然後加入載體(注意：對於穩定轉型，載體應使用上述任何限制方法進行線性化，並且可以使用約1至10 μg載體；對於瞬時表現，載體可以保持在其超螺旋狀態，並且可以使用約10至40 μg載體)；混合載體及原生質體懸浮液；將試管放入電穿孔裝置中，並在約1至2 kV下衝擊一次或多次(在最佳化反應時，最初可使用3至25 μF之電容)；將試管放回冰上；在完全培養基中將轉型細胞稀釋20倍；及約48小時後收穫原生質體。 宿主細胞及宿主有機體
本揭示案之方法、組成物、AMP、及AMP殺昆蟲蛋白可在任何宿主有機體中實行。例如，在一些實施例中，宿主有機體可為細胞。在一些實施例中，細胞可為例如真核或原核細胞。
在一些實施例中，用於產生AMP或AMP殺昆蟲蛋白之宿主細胞為原核生物。例如，在一些實施例中，宿主細胞可為古細菌或真菌，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性有機體。適用細菌之實例包括埃希氏菌 (Escherichia)(例如，大腸桿菌 (E. coli))、芽胞桿菌(例如，枯草芽孢桿菌 (B. subtilis))、腸桿菌 (Enterobacteria)、假單胞菌 (Pseudomonas)種(例如，綠膿假單胞菌 (P. aeruginosa))、鼠傷寒沙門氏菌 (Salmonella typhimurium)、黏質沙雷氏菌 (Serratia marcescans)、克雷伯氏菌 (Klebsiella)、變形菌 (Proteus)、志賀氏菌 (Shigella)、根瘤菌(Rhizobia)、透明顫菌 (Vitreoscilla)、或副球菌 (Paracoccus)。
在一些實施例中，用於產生AMP或AMP殺昆蟲蛋白之宿主細胞可為單胞細胞。例如，在一些實施例中，宿主細胞可為細菌細胞諸如革蘭氏陽性細菌。
在一些實施例中，宿主細胞可為選自下列屬之細菌：暫定氯酸桿菌屬 (Candidatus Chloracidobacterium)、節桿菌屬 (Arthrobacter)、棒狀桿菌屬 (Corynebacterium)、弗蘭剋菌屬 (Frankia)、微球菌屬 (Micrococcus)、分枝桿菌屬 (Mycobacterium)、丙酸桿菌屬 (Propionibacterium)、鏈黴菌屬 (Streptomyces)、產水擬桿菌屬 (Aquifex Bacteroides)、卟啉單胞菌屬 (Porphyromonas)、擬桿菌屬 (Bacteroides)、卟啉單胞菌屬 、黃桿菌屬 (Flavobacterium)、衣原體屬、突柄桿菌屬 (Prosthecobacter)、疣微菌屬 (Verrucomicrobium)、綠屈撓菌屬 (Chloroflexus)、色球藻屬 (Chroococcus)、平裂藻屬 (Merismopedia)、聚球藻屬 (Synechococcus)、魚腥藻屬 (Anabaena)、念珠藻屬 (Nostoc)、螺旋藻屬 (Spirulina)、束毛藻屬 (Trichodesmium)、寬球藻屬 (Pleurocapsa)、原綠球藻 (Prochlorococcus)、原綠藻 (Prochloron)、芽孢桿菌、李斯特菌 (Listeria)、葡萄球菌 (Staphylococcus)、梭狀芽孢桿菌 (Clostridium)、脫鹵素桿菌屬 (Dehalobacter)、刺骨魚菌 (Epulopiscium)、瘤胃球菌屬 (Ruminococcus)、腸球菌 (Enterococcus)、乳酸桿菌屬 (Lactobacillus)、鏈球菌屬 (Streptococcus)、丹毒絲菌屬 (Erysipelothrix)、支原體屬 (Mycoplasma)、鉤端螺旋菌屬 (Leptospirillum)、硝化螺菌屬 (Nitrospira)、嗜熱脫硫桿菌屬 (Thermodesulfobacterium)、出芽菌屬 (Gemmata)、小梨形菌屬 (Pirellula)、浮黴狀菌屬 (Planctomyces)、柄桿菌屬 (Caulobacter)、農桿菌屬 (Agrobacterium)、慢生根瘤菌屬 (Bradyrhizobium)、布氏桿菌屬 (Brucella)、甲基桿菌屬 (Methylobacterium)、突柄微菌屬 (Prosthecomicrobium)、根瘤菌屬 (Rhizobium)、紅假單胞菌屬( Rhodopseudomonas)、中華根瘤菌屬( Sinorhizobium)、紅桿菌屬( Rhodobacter)、玫瑰桿菌屬( Roseobacter)、醋桿菌屬( Acetobacter)、紅螺菌屬( Rhodospirillum)、立克次體 (Rickettsia)、康氏立克次體 (Rickettsia conorii)、粒線體 、沃爾巴克氏體屬( Wolbachia)、赤細菌屬( Erythrobacter)、赤微菌屬( Erythromicrobium)、鞘氨醇單胞菌 (Sphingomonas)、產鹼桿菌屬( Alcaligenes)、伯克霍爾德菌 (Burkholderia)、纖毛菌屬( Leptothrix)、球衣細胞屬( Sphaerotilus)、硫桿菌屬( Thiobacillus)、奈瑟菌屬( Neisseria)、亞硝化單胞菌屬( Nitrosomonas)、披毛菌屬( Gallionella)、螺菌屬( Spirillum)、固氮弧菌屬( Azoarcus)、氣單胞菌屬( Aeromonas)、琥珀酸單胞菌屬( Succinomonas)、琥珀酸弧菌屬( Succinivibrio)、瘤胃桿菌屬( Ruminobacter)、亞硝化球菌屬( Nitrosococcus)、莢硫菌屬( Thiocapsa)、腸桿菌屬( Enterobacter)、埃希氏菌屬( Escherichia)、克雷伯氏菌屬( Klebsiella)、沙門氏菌屬( Salmonella)、志賀氏菌屬( Shigella)、威格爾斯沃思氏菌屬( Wigglesworthia)、耶爾森菌屬( Yersinia)、考克斯氏體屬( Coxiella)、軍團菌屬( Legionella)、鹽單胞菌屬( Halomonas)、巴氏桿菌屬( Pasteurella)、不動桿菌屬( Acinetobacter)、固氮菌屬( Azotobacter)、假單胞菌屬( Pseudomonas)、嗜冷桿菌屬( Psychrobacter)、貝氏硫細菌屬( Beggiatoa)、硫珠菌屬( Thiomargarita)、弧菌 (Vibrio)、黃單胞菌 (Xanthomonas)、蛭弧菌屬( Bdellovibrio)、彎曲桿菌 (Campylobacter)、螺桿菌 (Helicobacter)、黏球菌 (Myxococcus)、脫硫疊球菌屬( Desulfosarcina)、地桿菌屬( Geobacter)、脫硫單胞菌屬( Desulfuromonas)、疏螺旋體 (Borrelia)、鉤端螺旋體 (Leptospira)、密螺旋體 (Treponema)、石袍菌屬( Petrotoga)、棲熱袍菌屬( Thermotoga) 、奇異球菌 (Deinococcus)或棲熱菌 (Thermus) 。
在一些實施例中，用於產生AMP或AMP殺昆蟲蛋白之宿主細胞可選自以下細菌物種之一：嗜鹼芽孢桿菌 (Bacillus alkalophilus)、解澱粉芽孢桿菌 (Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢桿菌 (Bacillus brevis)、環狀芽孢桿菌 (Bacillus circulans)、凝結芽孢桿菌 (Bacillus coagulans)、燦爛芽孢桿菌 (Bacillus lautus)、遲緩芽孢桿菌 (Bacillus lentus)、地衣芽孢桿菌 (Bacillus licheniformis)、巨大芽孢桿菌 (Bacillus megaterium)、嗜熱脂肪芽孢桿菌 (Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)、蘇雲金芽孢桿菌 (Bacillus thuringiensis)、淺青紫鏈黴菌 (Streptomyces lividans)、鼠灰鏈黴菌 (Streptomyces murinus)、天藍色鏈黴菌 (Streptomyces coelicolor)、稍白鏈黴菌 (Streptomyces albicans)、灰色鏈黴菌 (Streptomyces griseus)、皺孢鏈黴菌 (Streptomyces plicatosporus)、艾伯特埃希菌( Escherichia albertii)、蟑螂埃希氏菌 (Escherichia blattae)、大腸桿菌 、費格森埃希菌( Escherichia fergusonii)、赫氏埃希菌( Escherichia hermannii)、塞內加爾埃希菌( Escherichia senegalensis)、傷口埃希氏菌( E scherichia vulneris)、松香假單胞菌 (Pseudomonas abietaniphila)、傘菌假單胞菌 (Pseudomonas agarici)、溶瓊脂糖假單胞菌 (Pseudomonas agarolyticus)、嗜鹼假單胞菌 (Pseudomonas alcaliphila)、食藻假單胞菌 (Pseudomonas alginovora)、安德森假單胞菌 (Pseudomonas andersonii)、南極假單胞菌 (Pseudomonas antarctica)、鐵角蕨假單胞菌 (Pseudomonas asplenii)、壬二酸假單胞菌 (Pseudomonas azelaica)、巴通假單胞菌 (Pseudomonas batumici)、北極假單胞菌 (Pseudomonas borealis)、油菜假單胞菌 (Pseudomonas brassicacearum)、裂解亞氯酸假單胞菌 (Pseudomonas chloritidismutans)、克氏假單胞菌 (Pseudomonas cremoricolorata)、嗜二萜假單胞菌 (Pseudomonas diterpeniphila)、 Pseudomonas filiscindens 、弗雷德里克斯堡假單胞菌 (Pseudomonas frederiksbergensis)、 Pseudomonas gingeri 、禾本假單胞菌 (Pseudomonas graminis)、格氏假單胞菌 (Pseudomonas grimontii)、鹽反硝化假單胞菌 (Pseudomonas halodenitrificans)、嗜鹽假單胞菌 (Pseudomonas halophila)、棲木假單胞菌 (Pseudomonas hibiscicola)、噬氫假單胞菌 (Pseudomonas hydrogenovora)、印度假單胞菌 (Pseudomonas indica)、日本假單胞菌 (Pseudomonas japonica)、傑氏假單胞菌 (Pseudomonas jessenii)、基爾假單胞菌 (Pseudomonas kilonensis)、韓國假單胞菌 (Pseudomonas koreensis)、林氏假單胞菌 (Pseudomonas lini)、蒼黃假單胞菌 (Pseudomonas lurida)、橙色假單胞菌 (Pseudomonas lutea)、劃界假單胞菌 (Pseudomonas marginata)、南方假單胞菌 (Pseudomonas meridiana)、中嗜酸假單胞菌 (Pseudomonas mesoacidophila)、海綿假單胞菌 (Pseudomonas pachastrellae)、帕勒隆尼氏假單胞菌 (Pseudomonas palleroniana)、副黃假單胞菌 (Pseudomonas parafulva)、孔雀尾假單胞菌 (Pseudomonas pavonanceae)、蛋白水解假單胞菌 (Pseudomonas proteolyica)、嗜冷假單胞菌 (Pseudomonas psychrophila)、耐冷假單胞菌 (Pseudomonas psychrotolerans)、 Pseudomonas pudica 、拉梭假單胞菌 (Pseudomonas rathonis)、 Pseudomonas reactans 、根際假單胞菌 (Pseudomonas rhizosphaerae)、薩氏假單胞菌 (Pseudomonas salmononii)、高溫假單胞菌 (Pseudomonas thermaerum)、嗜熱喜碳假單胞菌 (Pseudomonas thermocarboxydovorans)、耐熱假單胞菌 (Pseudomonas thermotolerans)、賽維瓦爾假單胞菌 (Pseudomonas thivervalensis)、陰城假單胞菌 (Pseudomonas umsongensis)、溫哥華假單胞菌 (Pseudomonas vancouverensis)、威斯康星假單胞菌 (Pseudomonas wisconsinensis)、黃色海假單胞菌 (Pseudomonas xanthomarina)、廈門假單胞菌 (Pseudomonas xiamenensis)、銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)、產鹼假單胞菌 (Pseudomonas alcaligenes)、鰻敗血假單胞菌 (Pseudomonas anguilliseptica)、香矛醇假單胞菌 (Pseudomonas citronellolis)、漸變黃假單胞菌 (Pseudomonas flavescens)、晉州假單胞菌 (Pseudomonas jinjuensis)、門多薩假單胞菌 (Pseudomonas mendocina)、硝基還原假單胞菌 (Pseudomonas nitroreducens)、食油假單胞菌 (Pseudomonas oleovorans)、類產鹼假單胞菌 (Pseudomonas pseudoalcaligenes)、食樹脂假單胞菌 (Pseudomonas resinovorans)、秸稈色假單胞菌 (Pseudomonas straminae)、桔黃假單胞菌 (Pseudomonas aurantiaca)、綠針假單胞菌 (Pseudomonas chlororaphis)、莓實假單胞菌 (Pseudomonas fragi)、隆德假單胞菌 (Pseudomonas lundensis)、腐臭假單胞菌 (Pseudomonas taetrolens)產氮假單胞菌 (Pseudomonas azotoformans)、布氏假單胞菌 (Pseudomonas brenneri)、松柏假單胞菌 (Pseudomonas cedrina)、結冰假單胞菌( Pseudomonas congelans)、皺褶假單胞菌 (Pseudomonas corrugata)、康氏假單胞菌 (Pseudomonas costantinii)、極端東方化假單胞菌 (Pseudomonas extremorientalis)、螢光假單胞菌 (Pseudomonas fluorescens)、閃光假單胞菌 (Pseudomonas fulgida)、蓋氏假單胞菌 (Pseudomonas gessardii)、黎巴嫩假單胞菌 (Pseudomonas libanensis)、孟氏假單胞菌 (Pseudomonas mandelii)、邊緣假單胞菌 (Pseudomonas marginalis)、地中海假單胞菌 (Pseudomonas mediterranea)、米氏假單胞菌 (Pseudomonas migulae)、黴味假單胞菌 (Pseudomonas mucidolens)、東方假單胞菌 (Pseudomonas orientalis)、草假單胞菌 (Pseudomonas poae)、霍氏假單胞菌 (Pseudomonas rhodesiae)、類黃假單胞菌 (Pseudomonas synxantha)、托拉氏假單胞菌 (Pseudomonas tolaasii)、平凡假單胞菌 (Pseudomonas trivialis)、維羅納假單胞菌 (Pseudomonas veronii) 、脫氮假單胞菌 (Pseudomonas denitrificans)、百日咳菌素原性假單胞菌 (Pseudomonas pertucinogena)、黃褐假單胞菌 (Pseudomonas fulva)、蒙氏假單胞菌 (Pseudomonas monteilii)、摩氏假單胞菌 (Pseudomonas mosselii)、棲稻假單胞菌 (Pseudomonas oryzihabitans)、香魚假單胞菌 (Pseudomonas plecoglossicida)、惡臭假單胞菌 (Pseudomonas putida)、巴利阿里假單胞菌 (Pseudomonas balearica)、淺黃色假單胞菌 (Pseudomonas luteola)、或施氏假單胞菌 (Pseudomonas stutzeri)、榛黃假單胞菌 (Pseudomonas avellanae)、大麻假單胞菌 (Pseudomonas cannabina)、番木瓜假單胞菌 (Pseudomonas caricapapyae)、菊苣假單胞菌 (Pseudomonas cichorii)、暈斑假單胞菌 (Pseudomonas coronafaciens)、褐鞘假單胞菌 (Pseudomonas fuscovaginae)、山黃麻假單胞菌 (Pseudomonas tremae)、或綠黃假單胞菌 (Pseudomonas viridiflava)。
在一些實施例中，用於產生AMP或AMP殺昆蟲蛋白之宿主細胞可為真核生物。
在一些實施例中，用於產生AMP或AMP殺昆蟲蛋白之宿主細胞可為屬以下進化枝之細胞：後鞭毛生物(Opisthokonta)；綠色植物科(Viridiplantae)(例如，藻類及植物)；變形蟲(Amebozoa)；絲足蟲類(Cercozoa)；囊泡蟲類(Alveolata)；海洋鞭毛蟲類(Marineflagellates)；不等鞭毛門(Heterokonta)；盤皺褶總門(Discicristata)；或古蟲界(Excavata)。
在一些實施例中，本文描述之程序及方法可使用作為例如後生動物(Metazoan)、領鞭毛類(Choanoflagellata)、或真菌之宿主細胞來完成。
在一些實施例中，本文描述之程序及方法可使用作為真菌之宿主細胞來完成。例如，在一些實施例中，宿主細胞可為屬真核生物門之細胞：子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、微孢子蟲(Microsporidia)、或接合菌類(Zygomycota)
在一些實施例中，本文描述之程序及方法可使用作為屬以下屬類之一的真菌的宿主細胞來完成：麴黴屬( Aspergillus)、枝孢菌( Cladosporium)、稻瘟菌( Magnaporthe)、羊肚菌( Morchella)、脈孢菌( Neurospora)、青黴菌( Penicillium)、酵母屬( Saccharomyces)、隱球菌( Cryptococcus)、或黑粉菌( Ustilago) 。
在一些實施例中，本文描述之程序及方法可使用作為屬以下物種之一的真菌的宿主細胞來完成：釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、布拉酵母 (Saccharomyces boulardi)、葡萄汁酵母( Saccharomyces uvarum) ；黃麴黴 (Aspergillus flavus)、土麴黴 (A. terreus)、泡盛麴黴 (A. awamori) ；高大枝孢菌( Cladosporium elatum)、草本枝孢菌( Cladosporium Herbarum)、球孢枝孢菌( Cladosporium Sphaerospermum) 、及芽枝狀枝孢菌( Cladosporium Cladosporioides) ；灰稻瘟菌( Magnaporthe grise)、米稻瘟菌( Magnaporthe oryzae)、嗜根稻瘟菌( Magnaporthe rhizophila) ；小羊肚菌( Morchella deliciosa)、春羊肚菌( Morchella esculenta)、尖頂羊肚菌( Morchella conica) ；粗糙脈孢菌( Neurospora crassa)、間型脈胞菌( Neurospora intermedia)、四孢脈孢菌( Neurospora tetrasperma) ；特異青黴菌( Penicillium notatum)、產黃青黴菌( Penicillium chrysogenum)、婁地青黴菌( Penicillium roquefortii)、或簡青黴 (Penicillium simplicissimum) 。
在一些實施例中，用於產生AMP或AMP殺昆蟲蛋白之宿主細胞可為屬以下屬類之一的真菌：麴黴屬( Aspergillus)、分枝孢子菌屬( Cladosporium)、稻瘟菌( Magnaporthe)、羊肚菌( Morchella)、脈孢菌( Neurospora)、青黴菌( Penicillium)、酵母屬( Saccharomyces)、隱球菌( Cryptococcus)、或黑粉菌( Ustilago) 。
在一些實施例中，用於產生AMP或AMP殺昆蟲蛋白之宿主細胞可為酵母菌科 (Saccharomycetaceae)之成員。例如，在一些實施例中，宿主細胞可為酵母菌科內之以下屬類之一：酒香酵母屬( Brettanomyces)、假絲酵母( Candida)、固囊酵母屬( Citeromyces)、兔糞酵母屬( Cyniclomyces)、德巴利酵母屬( Debaryomyces)、伊薩酵母屬( Issatchenkia)、哈薩克斯坦酵母( Kazachstania)、克魯維酵母屬( Kluyveromyces)、駒形氏酵母( Komagataella)、畢赤酵母 (Kuraishia)、拉錢斯氏酵母( Lachancea)、婁德羅菌屬( Lodderomyces)、那卡酵母菌( Nakaseomyces)、管囊酵母屬( Pachysolen)、畢赤酵母屬( Pichia)、酵母屬、斯帕塔夏孢菌( Spathaspora)、四角孢屬( Tetrapisispora)、範德華氏酵母屬( Vanderwaltozyma)、有孢酵母( Torulaspora)、擬威爾酵母( Williopsis)、接合酵母屬( Zygosaccharomyces)或接合有孢酵母( Zygotorulaspora)。
在一些實施例中，用於產生AMP或AMP殺昆蟲蛋白之宿主細胞可為以下之一：黃麴黴、土麴黴、泡盛麴黴、高大枝孢菌、草本枝孢菌、球孢枝孢菌、芽枝狀枝孢菌、灰稻瘟菌、米稻瘟菌、嗜根稻瘟菌、小羊肚菌、春羊肚菌、尖頂羊肚菌、粗糙脈孢菌、間型脈胞菌、四孢脈孢菌、特異青黴菌、產黃青黴菌、婁地青黴菌、或簡青黴 。
在一些實施例中，用於產生AMP或AMP殺昆蟲蛋白之宿主細胞可為假絲酵母屬內之物種。例如，宿主細胞可為以下之一：白假絲酵母( Candida albicans)、蝶角蛉假絲酵母( Candida ascalaphidarum)、兩棲假絲酵母( Candida amphixiae)、南極假絲酵母( Candida antarctica)、銀色假絲酵母( Candida argentea)、大西洋假絲酵母( Candida atlantica)、大氣假絲酵母( Candida atmosphaerica)、耳假絲酵母( Candida auris)、布蘭克假絲酵母( Candida blankii)、蟑螂假絲酵母( Candida blattae)、布拉卡假絲酵母( Candida bracarensis)、菠蘿假絲酵母( Candida bromeliacearum)、果生假絲酵母( Candida carpophila)、卡瓦哈爾假絲酵母( Candida carvajalis)、天牛假絲酵母( Candida cerambycidarum)、突眼長蝽假絲酵母( Candida chauliodes)、紫堇假絲酵母( Candida corydalis)、多西假絲酵母( Candida dosseyi)、杜氏假絲酵母( Candida dubliniensis)、工蟻假絲酵母( Candida ergatensis)、果假絲酵母( Candida fructus)、光滑假絲酵母( Candida glabrata)、發酵假絲酵母( Candida fermentati)、季也蒙假絲酵母( Candida guilliermondii)、希木龍假絲酵母( Candida haemulonii)、矮小假絲酵母( Candida humilis)、昆蟲館假絲酵母( Candida insectamens)、昆蟲假絲酵母( Candida insectorum)、間型假絲酵母( Candida intermedia)、傑弗里假絲酵母( Candida jeffresii)或乳酒假絲酵母( Candida kefyr)。
在一些實施例中，用於產生AMP或AMP殺昆蟲蛋白之宿主細胞可為克魯維酵母屬內之任何物種。
在一些實施例中，用於產生AMP或AMP殺昆蟲蛋白之宿主細胞可為克魯維酵母屬之物種，例如，宿主細胞可為以下之一：海泥克魯維酵母( Kluyveromyces aestuarii)、多布克魯維酵母( Kluyveromyces dobzhanskii)、乳酸克魯維酵母 、馬克斯克魯維酵母、非發酵克魯維酵母( Kluyveromyces nonfermentans)、或威克克魯維酵母( Kluyveromyces wickerhamii)。
在一些實施例中，用於產生AMP或AMP殺昆蟲蛋白之宿主細胞可為畢赤酵母屬內之物種。例如，宿主細胞可為以下之一：粉狀畢赤酵母 (Pichia farinose)、異常畢赤酵母 (Pichia anomala) ，黑氏畢赤酵母 (Pichia heedii)、季也蒙畢赤酵母 (Pichia guilliermondii) 、克魯維畢赤酵母 (Pichia kluyveri)、膜醭畢赤酵母 (Pichia membranifaciens)、挪威畢赤酵母 (Pichia norvegensis) 、奧默畢赤酵母 (Pichia ohmeri)、巴斯德畢赤酵母 (Pichia pastoris)、甲醇畢赤酵母 (Pichia methanolica)、或亞膜畢赤酵母 (Pichia subpelliculosa)。
在一些實施例中，用於產生AMP或AMP殺昆蟲蛋白之宿主細胞可為酵母屬內之物種。例如，宿主細胞可為以下之一：樹生酵母( Saccharomyces arboricolus)、貝酵母( Saccharomyces bayanus)、博伊丁酵母( Saccharomyces bulderi)、里約酵母( Saccharomyces cariocanus)、里約熱內盧酵母( Saccharomyces cariocus)、釀酒酵母 、釀酒酵母布拉亞種 (Saccharomyces cerevisiae var boulardii)、薛瓦酵母( Saccharomyces chevalieri)、大連酵母( Saccharomyces dairenensis)、葡萄酒酵母( Saccharomyces ellipsoideus)、真貝酵母( Saccharomyces eubayanus)、弱小酵母( Saccharomyces exiguous)、佛洛酵母( Saccharomyces florentinus)、脆壁酵母( Saccharomyces fragilis)、庫德里阿茲威氏酵母( Saccharomyces kudriavzevii)、馬丁酵母( Saccharomyces martiniae)、三方氏酵母( Saccharomyces mikatae)、摩納酵母( Saccharomyces monacensis)、 Saccharomyces norbensis 、奇異酵母( Saccharomyces paradoxus)、巴氏酵母( Saccharomyces pastorianus)、斯賓塞酵母( Saccharomyces spencerorum)、蘇黎世酵母( Saccharomyces turicensis)、單胞酵母( Saccharomyces unisporus)、葡萄汁酵母、或環帶酵母( Saccharomyces zonatus)。
在一些實施例中，本文描述之程序及方法可使用作為乳酸克魯維酵母、馬克斯克魯維酵母 、釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母、甲醇畢赤酵母、粟酒裂殖酵母( Schizosaccharomyces pombe)、或異常漢遜酵母( Hansenula anomala)之宿主細胞來完成。
使用酵母細胞作為產生重組AMP之宿主有機體為熟習此項技術者熟知的特殊方法。在一些實施例中，本文所述方法及組成物可使用任何酵母物種來執行，包括但不限於酵母、畢赤酵母、克魯維酵母、漢遜酵母、耶氏酵母或裂殖酵母屬之任何物種並且酵母物種包括任何酵母物種，例如選自以下菌株之釀酒酵母物種：INVSc1、YNN27、S150-2B、W303-1B、CG25、W3124、JRY188、BJ5464、AH22、GRF18、W303-1A及BJ3505。在一些實施例中，畢赤酵母物種之成員包括任何畢赤酵母物種，例如畢赤酵母物種巴斯德畢赤酵母，例如，巴斯德畢赤酵母選自以下菌株：Bg08、Y-11430、X-33、GS115、GS190、JC220、JC254、GS200、JC227、JC300、JC301、JC302、JC303、JC304、JC305、JC306、JC307、JC308、YJN165、KM71、MC100-3、SMD1163、SMD1165、SMD1168、GS241、MS105、任何 pep4剔除菌株及任何 prb1剔除菌株，以及選自以下菌株之巴斯德畢赤酵母：Bg08、X-33、SMD1168及KM71。在一些實施例中，任何克魯維酵母物種可用於完成本文描述方法，包括任何克魯維酵母物種，例如，乳酸克魯維酵母，並且吾人教導乳酸克魯維酵母菌株可但是不一定選自以下菌株：GG799、YCT306、YCT284、YCT389、YCT390、YCT569、YCT598、NRRLY-1140、MW98-8C、MS1、CBS293.91、Y721、MD2/1、PM6-7A、WM37、K6、K7、22AR1、22A295-1、SD11、MG1/2、MSK110、JA6、CMK5、HP101、HP108及PM6-3C，另外乳酸克魯維酵母物種選自GG799、YCT306及NRRLY-1140。
在一些實施例中，用於產生AMP或AMP殺昆蟲蛋白之宿主細胞可為米麴黴。
在一些實施例中，用於產生AMP或AMP殺昆蟲蛋白之宿主細胞可為日本麴黴 (Aspergillus japonicas)。
在一些實施例中，用於產生AMP或AMP殺昆蟲蛋白之宿主細胞可為黑麴黴。
在一些實施例中，用於產生AMP或AMP殺昆蟲蛋白之宿主細胞可為地衣芽孢桿菌 (Bacillus licheniformis)。
在一些實施例中，用於產生AMP或AMP殺昆蟲蛋白之宿主細胞可為枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)。
在一些實施例中，用於產生AMP或AMP殺昆蟲蛋白之宿主細胞可為里氏木黴 (Trichoderma reesei)。
在一些實施例中，本文描述之程序及方法可使用任何酵母物種來完成，包括但不限於任何漢遜酵母物種包括任何漢遜酵母物種及較佳多形漢遜酵母( Hansenula polymorpha)。在一些實施例中，本文描述之程序及方法可使用任何酵母物種來完成，包括但不限於任何耶氏酵母物種例如解脂耶氏酵母( Yarrowia lipolytica)。在一些實施例中，本文描述之程序及方法可使用任何酵母物種來完成，包括但不限於任何裂殖酵母物種包括任何裂殖酵母物種及較佳粟酒裂殖酵母( Schizosaccharomyces pombe)。
在一些實施例中，酵母物種諸如乳酸克魯維酵母、釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母、及其他酵母可用作宿主有機體。酵母細胞培養技術為熟習此項技術者熟知的。酵母細胞培養之示例性方法可發現於Evans, Yeast Protocols. Springer (1996)；Bill, Recombinant Protein Production in Yeast. Springer (2012)；Hagan等人, Fission Yeast: A Laboratory Manual, CSH Press (2016)；Konishi等人, Improvement of the transformation efficiency of Saccharomyces cerevisiaeby altering carbon sources in pre-culture. Biosci Biotechnol Biochem. 2014; 78(6):1090-3；Dymond, Saccharomyces cerevisiaegrowth media. Methods Enzymol. 2013; 533:191-204；Looke等人, Extraction of genomic DNA from yeasts for PCR-based applications. Biotechniques. 2011年5月；50(5):325-8；及Romanos等人, Culture of yeast for the production of heterologous proteins. Curr Protoc Cell Biol. 2014年9月2日; 64:20.9.1-16，其揭示內容以全文引用方式併入本文。
本文描述酵母細胞發酵培養基及基料之製法。 酵母菌株
本揭示案涵蓋產生可操作來表現AMP或AMP殺昆蟲蛋白之酵母菌株。例如，在一些實施例中，宿主細胞可用可操作來編碼AMP之多核苷酸來轉型(例如，使用本文所述任何載體)。在一些實施例中，該宿主細胞可為酵母菌株。
在一些實施例中，酵母菌株可藉由製備包含有包含可操作來表現AMP之多核苷酸或其互補核苷酸序列之第一表現匣的載體來產生。
在一些實施例中，本揭示案包含有包含以下之酵母菌株、基本上由其組成、或由其組成：包含可操作來編碼AMP之多核苷酸的第一表現匣，該AMP包含與根據式(I)：X 1-S-C-C-P-C-Y-W-X 2-X 3-C-P-W-G-Q-X 4-C-Y-P-X 5-G-C-X 6-G-X 7-X 8-X 9-X 10之胺基酸序列至少90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%一致的胺基酸序列；其中相對於在SEQ ID NO: 1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；其中X 1為K、H、Q、T、S、N、E、I、L、或V；X 2為G、P、或A；X 3為G、或N；X 4為N或D；X 5為E、D、或N；X 6為S、D、G、T、V、或R；X 7為P或不存在；X 8為K、H、A、R、G、T、D、或不存在；X 9為G、V、或不存在；X 10為G、I、或不存在；或其互補核苷酸序列。
在一些實施例中，本揭示案包含有包含以下之酵母菌株、基本上由其組成、或由其組成：包含可操作來編碼AMP之多核苷酸的第一表現匣，該AMP包含與根據式(II)：K-S-C-C-P-C-Y-W-G-G-C-P-W-G-Q-X 1-C-Y-P-X 2-G-C-X 3-G-P-X 4-X 5-X 6之胺基酸序列至少90%一致之胺基酸序列；其中相對於在SEQ ID NO：1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；X 1為N或D；X 2為E、D、或N；X 3為S、D、R、或G；X 4為K、G、或D；X 5為V或不存在；或其互補核苷酸序列。
在一些實施例中，本揭示案包含有包含以下之酵母菌株、基本上由其組成、或由其組成：包含可操作來編碼AMP之多核苷酸的第一表現匣，該AMP包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該胺基酸序列與根據式(I)：X 1-S-C-C-P-C-Y-W-X 2-X 3-C-P-W-G-Q-X 4-C-Y-P-X 5-G-C-X 6-G-X 7-X 8-X 9-X 10之胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致；其中相對於在SEQ ID NO: 1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；其中X 1為K、H、Q、T、S、N、E、I、L、或V；X 2為G、P、或A；X 3為G、或N；X 4為N或D；X 5為E、D、或N；X 6為S、D、G、T、V、或R；X 7為P或不存在；X 8為K、H、A、R、G、T、D、或不存在；X 9為G、V、或不存在；X 10為G、I、或不存在；或其互補核苷酸序列。
在一些實施例中，本揭示案包含有包含以下之酵母菌株、基本上由其組成、或由其組成：包含可操作來編碼AMP之多核苷酸的第一表現匣，該AMP包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該胺基酸序列與根據式(II)：K-S-C-C-P-C-Y-W-G-G-C-P-W-G-Q-X 1-C-Y-P-X 2-G-C-X 3-G-P-X 4-X 5-X 6之胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致；其中相對於在SEQ ID NO: 1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；X 1為N或D；X 2為E、D、或N；X 3為S、D、R、或G；X 4為K、G、或D；X 5為V或不存在；或其互補核苷酸序列。
在一些實施例中，酵母菌株包含實現AMP之合成的多核苷酸，其中AMP包含胺基序列、基本上由其組成、或由其組成，該胺基序列與在SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169中之任一者中闡明之胺基酸序列至少90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%，或其互補核苷酸序列。
在一些實施例中，酵母菌株包含實現AMP之合成的多核苷酸，其中AMP包含胺基序列、基本上由其組成、或由其組成，該胺基序列與在SEQ ID NO：20、24-26、35-36、38、及40中之任一者中闡明之胺基酸序列至少90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%，或其互補核苷酸序列。
在一些實施例中，酵母菌株可操作來編碼包含如SEQ ID NO: 25、36、38、及40中之任一者中所闡明之胺基序列、基本上由其組成、或由其組成的AMP，或其互補核苷酸序列。
在一些實施例中，酵母菌株選自屬於酵母屬、畢赤酵母屬、克魯維酵母屬、漢遜酵母屬、耶氏酵母屬、或裂殖酵母屬的任何物種。
在一些實施例中，酵母細胞選自由以下組成之群：乳酸克魯維酵母、馬克斯克魯維酵母 、釀酒酵母、及巴斯德畢赤酵母。
在一些實施例中，酵母細胞為乳酸克魯維酵母或馬克斯克魯維酵母。
在一些實施例中，酵母菌株可操作來表現AMP或AMP殺昆蟲蛋白，其中AMP為兩種或兩種以上AMP之均聚物或雜聚物，其中各AMP之胺基酸序列相同或不同。
在一些實施例中，酵母菌株可操作來表現AMP或AMP殺昆蟲蛋白，其中AMP為包含藉由可裂解或不可裂解連接子來分隔之兩個或兩個以上AMP的融合蛋白，並且其中各AMP之胺基酸序列可相同或不同。
在一些實施例中，連接子為可裂解連接子。
在一些實施例中，連接子具有如SEQ ID NO：184-193中之任一者中所闡明之胺基酸序列。
在一些實施例中，連接子可在以下中之至少一者內部裂解：(i)昆蟲之腸道或血淋巴，及(ii)可在哺乳動物之腸道內部裂解。
在一些實施例中，酵母菌株可操作來表現AMP或AMP殺昆蟲蛋白，其中載體為包含α-MF信號之質體。
在一些實施例中，酵母菌株可操作來表現AMP或AMP殺昆蟲蛋白，其中載體轉型至酵母菌株中。
在一些實施例中，酵母菌株可操作來表現AMP或AMP殺昆蟲蛋白，其中酵母菌株選自酵母、畢赤酵母、克魯維酵母、漢遜酵母、耶氏酵母或裂殖酵母屬之任何物種。
在一些實施例中，酵母菌株可操作來表現AMP或AMP殺昆蟲蛋白，其中酵母菌株選自由以下組成之群：乳酸克魯維酵母、馬克斯克魯維酵母 、釀酒酵母、及巴斯德畢赤酵母。
在一些實施例中，酵母菌株可操作來表現AMP或AMP殺昆蟲蛋白，其中酵母菌株為乳酸克魯維酵母。
在一些實施例中，酵母菌株可操作來表現AMP或AMP殺昆蟲蛋白，其中AMP之表現提供每公升培養基至少70 mg/L、80 mg/L、90 mg/L、100 mg/L、110 mg/L、120 mg/L、130 mg/L、140 mg/L、150 mg/L、160 mg/L、170 mg/L、180 mg/L、190mg/L、200 mg/L、500 mg/L、750 mg/L、1,000 mg/L、1,250 mg/L、1,500 mg/L、1,750 mg/L或至少20,000 mg/L、或更多AMP的產率。
在一些實施例中，酵母菌株可操作來表現AMP或AMP殺昆蟲蛋白，其中AMP之表現提供每公升培養基至少100 mg/L之AMP的產率。
在一些實施例中，酵母菌株可操作來表現AMP或AMP殺昆蟲蛋白，其中培養基中之AMP之表現導致培養基中之單一AMP之表現。
在一些實施例中，酵母菌株可操作來表現AMP或AMP殺昆蟲蛋白，其中培養基中之AMP之表現導致培養基中之包含兩種或兩種以上AMP多肽之AMP聚合物之表現。
在一些實施例中，酵母菌株可操作來表現AMP或AMP殺昆蟲蛋白，其中載體包含兩個或三個表現匣，各表現匣可操作來編碼第一表現匣之AMP。
在一些實施例中，酵母菌株可操作來表現AMP或AMP殺昆蟲蛋白，其中載體包含兩個或三個表現匣，各表現匣可操作來編碼第一表現匣之AMP，或不同表現匣之AMP。
在一些實施例中，酵母菌株可操作來表現AMP或AMP殺昆蟲蛋白，其中表現匣可操作來編碼如SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169中之任一者中所闡明之AMP。
在一些實施例中，酵母菌株可操作來表現AMP或AMP殺昆蟲蛋白，其中表現匣可操作來編碼如SEQ ID NO：20、24-26、35-36、38、及40中之任一者中所闡明之AMP。
在一些實施例中，酵母菌株可操作來表現AMP或AMP殺昆蟲蛋白，其中表現匣可操作來編碼如SEQ ID NO：25、36、38、及40中之任一者中所闡明之AMP。
任何前述方法，及/或本文描述之任何方法可用於產生如本文描述之AMP或AMP殺昆蟲蛋白中之一或多者。例如，本文描述之任何方法可用於產生在本揭示案中描述的AMP中之一或多者，例如，具有胺基酸序列SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169之AMP，其同樣地在本文中描述。 酵母轉型、 AMP 純化、及分析
酵母轉型之示例性方法如下：首先，將帶有AMP ORF之表現載體轉型至酵母細胞中；表現載體通常藉由特定限制酶裂解來線性化以便促進經由同源重組之染色體整合。然後，線性表現載體藉由化學或電穿孔轉型方法來轉型至酵母細胞中並且藉由同源重組來整合至酵母基因組之靶向基因座中。整合可在同一染色體基因座處發生多次；因此，轉型酵母細胞之基因組可含有AMP表現匣之多個複本。成功轉型酵母細胞可使用青睞工程化至表現載體中並且與AMP ORF共整合至酵母染色體中之選擇標誌物的生長條件來鑑別；此等標誌物之實例包括但不限於乙醯胺原營養、吉歐黴素抗性、遺傳黴素抗性、諾爾絲菌素抗性、及尿嘧啶原營養。
選擇標誌物在此項技術中為熟知的，並且任何此等熟知選擇標誌物可在本揭示案中實施。例如，在一些實施例中，選擇標誌物可為陽性選擇標誌物，或陰性選擇標誌物。陽性選擇標誌物允許選擇其中標誌物之基因產物得以表現的細胞。此通常包括使細胞與合適劑接觸，該劑僅針對陽性選擇標誌物之表現來殺傷或以其他方式選擇抗禦該等細胞。使用選擇標誌物之示例性方法揭示於美國專利第5,464,764號中，其揭示內容以全文引用方式併入本文。關於選擇標誌物之額外示例性描述及方法提供於Wigler等人, Cell 11:223 (1977)；Szybalska及Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992)；Lowy等人, Cell 22:817 (1980)；Wigler等人, Natl. Acad. Sci. USA 77:357 (1980)；O'Hare等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)；Mulligan及Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)；Wu及Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991)；Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993)；Mulligan, Science 260:926-932 (1993)；Morgan及Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993)；Santerre等人, Gene 30:147 (1984)；Ausubel等人 (編), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N Y (1993)；Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, N Y (1990)；第12章及第13章, Dracopoli等人 (編), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, N Y (1994)；Colberre-Garapin等人, J. Mol. Biol. 150:1 (1981)；美國專利第6,548,285號(1997年4月3日提出申請)；6,165,715 (1998年6月22日提出申請)；及第6,110,707號(1997年1月17日提出申請)，其揭示內容以全文引用方式併入。
由於不可預測及可變因素之影響，諸如基因及基因網路之表觀遺傳修飾，及經歷轉型程序之群體中之個別細胞中發生的整合事件之數目之變化，給定轉型過程之個別酵母菌落在其產生AMP ORF之能力方面有所不同。因此，帶有AMP轉殖基因之轉殖基因酵母菌落應針對高產率菌株來篩檢。用於此篩檢之兩種有效方法，各自取決於轉殖基因酵母之小規模培養物之生長來提供條件培養基樣品用於後續分析，使用反相HPLC或家蠅注射程序來分析來自陽性轉殖基因酵母菌落之條件培養基樣品。
可獲得轉殖基因酵母培養物，例如，使用各管添加5至10 mL確定成分培養基的14 mL圓底聚丙烯培養物管，或在各孔添加2.2 mL確定成分培養基的48孔深孔培養物板中。不含有粗蛋白質提取物或副產物諸如酵母提取物或蛋白腖的確定成分培養基用於培養物以便在收穫用於稍後篩檢步驟的條件培養基中減少蛋白背景。在最適溫度例如23.5℃下，針對乳酸克魯維斯酵母執行培養物約5-6天，直到達到最大細胞密度為止。AMP現在藉由轉型酵母細胞來產生並且自細胞中分泌至生長培養基。為了製備用於篩檢之樣品，藉由離心，將細胞自培養物中移除並且上清液收集為條件培養基，然後經由0.22 µm濾膜過濾來清潔，然後準備菌株篩檢。
在一些實施例中，用AMP轉型之陽性酵母菌落可經由推定酵母菌落之反相HPLC(rpHPLC)篩檢來篩檢。在此篩選方法中，可使用具有C18之鍵合相的HPLC分析管柱。乙腈及水用作移動相溶劑，並且設定於220 nm下之UV吸收率偵測器用於肽偵測。合適量之條件培養基樣品負載至rpHPLC系統中並且用移動相溶劑之線性梯度來溶析。HPLC層析中之殺昆蟲肽之相應峰面積用於量化條件培養基中之AMP濃度。使用相同HPLC方案，將已知量之純AMP在相同rpHPLC管柱中運行，以便確認肽之保留時間並且產生用於定量之標準肽HPLC曲線。
陽性乳酸克魯維斯酵母細胞之示例性反相HPLC篩檢過程如下：可將AMP ORF插入表現載體pKLAC1中，並且轉型至來自New England Biolabs, Ipswich, MA, USA之乳酸克魯維斯酵母菌株YCT306中。pKLAC1載體為整合表現載體。一旦AMP轉殖基因選殖至pKLAC1中並且轉型至YCT306中，其表現便藉由LAC4啟動子來控制。所得轉型菌落產生前肽原，其包含α-配合因子信號肽、Kex2裂解位點及成熟AMP。α-配合因子信號肽引導前肽原進入內源性分泌途徑，並且成熟AMP釋放至生長培養基中。
在一些實施例中，AMP表現之密碼子最佳化可在兩輪中執行，例如，在第一輪中，基於高表現DNA序列之一些共同特徵，設計表現α-配合因子信號肽、Kex2裂解位點及AMP的AMP ORF之多個變異體並且其表現水準在YCT306菌株乳酸克魯維斯酵母中評估，由此產生最初乳酸克魯維斯酵母表現演算法；在第二輪最佳化中，額外變異體AMP ORF可基於最初乳酸克魯維斯酵母表現演算法來設計以便進一步微調乳酸克魯維斯酵母表現演算法，並且鑑別用於在乳酸克魯維斯酵母中AMP表現之最佳ORF。在一些實施例中，來自前述最佳化之所得DNA序列可具有編碼α-MF信號肽、Kex2裂解位點及AMP之開放讀框，其可使用Hind III及Not I限制位點來選殖至pKLAC1載體中，產生AMP表現載體。
在一些實施例中，酵母巴斯德畢赤酵母可用AMP表現匣來轉型。轉型巴斯德畢赤酵母之示例性方法如下：酵母載體可用於將AMP表現匣轉型至巴斯德畢赤酵母中。載體可獲自熟習此項技術者已知之商業供應商。在一些實施例中，載體可為整合載體，並且可使用尿嘧磷核糖轉移酶啟動子(pUPP)來增強異源轉殖基因表現。在一些實施例中，載體可提供不同選擇策略；例如，在一些實施例中，載體之間之唯一差異可為一種載體可向宿主酵母提供G418抗性，而另一種載體可提供吉歐黴素抗性。在一些實施例中，編碼AMP之成對互補寡核苷酸可被設計及合成以便次選殖至兩個酵母表現載體中。雜交反應可藉由混合對應互補寡核苷酸至30 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl，pH 8中之20 µM之最終濃度(所有最終濃度)來執行，然後在95℃下培育20 min，隨後開始於92℃並且終止於17℃來培育9小時，並且每20 min，溫度下降3℃。雜交反應產生編碼AMP之DNA片段。兩個巴斯德畢赤酵母載體可用BsaI-HF限制酶來消化，並且然後使用標準程序，將反應之雙鏈DNA產物次選殖至線性化巴斯德畢赤酵母載體中。確認次純系之序列之後，質體等分部分可藉由電穿孔來轉染的巴斯德畢赤酵母菌株(例如，Bg08)中。所得轉型酵母可基於藉由工程化至載體中之元件所賦予之抗性(例如，在此實例中，針對吉歐黴素或G418)來選擇。
蛋白純化方法在此項技術中為熟知的，並且任何已知方法可用來純化及/或回收本揭示案之AMP。例如，在一些實施例中，以下程序例示合適純化程序：在免疫親和或離子交換管柱上進行分級；乙醇沉澱；反相HPLC；在矽膠、或陽離子交換樹脂諸如DEAE上進行層析；層析聚焦；SDS-PAGE；硫酸銨沉澱；使用例如Sephadex G-75之凝膠過濾；及其類似程序。在一些實施例中，本揭示案之蛋白可使用以下中之一者來純化；親和層析；離子交換層析；過濾；電泳；疏水性相互作用層析；凝膠過濾層析；反相層析；伴刀豆球蛋白A層析；及差異溶解。
示例性蛋白純化方法提供於：美國專利第6,339,142號；第7,585,955號；第8,946,395號；第9,067,990號；第10,246,484號；及Marshak等人, 「Strategies for Protein Purification and Characterization—A Laboratory Course Manual」 CSHL Press (1996)；其揭示內容以全文引用方式併入本文。 肽產率篩檢及評估
肽產率可藉由為熟習此項技術者已知之任何方法(例如，毛細管凝膠電泳(CGE)、西方墨點分析、及其類似方法)來確定。如本文描述並且在此項技術中已知之活性分析亦可提供關於肽產率之資訊。在一些實施例中，此等或任何其他在此項技術中已知之方法可用於評估肽產率。 定量分析
在一些實施例中，並且無限制地，AMP肽產率可使用以下來量測：HPLC；質譜(MS)及相關技術；LC/MS/MS；反相蛋白陣列(RPPA)；免疫組織化學；ELISA；懸浮珠粒陣列、質譜；斑點墨點；SDS-PAGE；毛細管凝膠電泳(CGE)；西方墨點分析；布拉德福德(Bradford)分析；量測260nm下之UV吸收；洛瑞(Lowry)分析；史密斯(Smith)銅/二辛可寧分析；分泌分析；皮爾斯(Pierce)蛋白分析；雙縮脲反應；及其類似。蛋白定量之示例性方法提供於Stoscheck, C. 1990 「Quantification of Protein」 Methods in Enzymology, 182:50-68；Lowry, O. Rosebrough, A., Farr, A.及Randall, R. 1951 J. Biol. Chem. 193:265；Smith, P.等人, (1985) Anal. Biochem. 150:76-85；Bradford, M. 1976 「A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding」Anal. Biochem. 72:248-254；Cabib, E.及Polacheck, I. 1984 「Protein assay for dilute solutions.」Methods in Enzymology, 104:318-328; Turcanu, Victor; Williams, Neil A. (2001). 「Cell identification and isolation on the basis of cytokine secretion: A novel tool for investigating immune responses.」Nature Medicine. 7(3): 373-376；美國專利第6,391,649號；其揭示內容以全文引用方式併入本文。
在其他實施例中，AMP肽產率可使用包括但不限於以下之方法來定量及/或評估：每體積培養物之重組蛋白質量(例如，每公升培養物之蛋白之公克或毫克數)；所確定的在細胞裂解之後獲得之重組蛋白不溶性沉澱物之百分比或分率(例如，適量上清液提取之重組蛋白/不溶性組分中之蛋白之量)；活性蛋白之百分比或分率(例如，在蛋白量中使用之活性蛋白之量/分析)；總細胞蛋白(tcp)百分比或分率；及/或蛋白/細胞之量及一定百分比或比率之乾生物量。
在一些實施例中，當產率按照培養物體積來表示時，可考慮培養物細胞密度，尤其在對不同培養物之間之產率進行比較時。
在一些實施例中，本揭示案提供產生總細胞蛋白(tcp)之至少約5%、至少約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、或更多的異源多肽的方法。「總細胞蛋白百分比」為佔聚集細胞蛋白之一定百分比的宿主細胞中之異源多肽之量。總細胞蛋白百分比之確定在此項技術中為熟知的。
「總細胞蛋白(tcp)」或「總細胞蛋白百分比(tcp%)」為佔聚集細胞蛋白之一定百分比的宿主細胞中之蛋白或多肽之量。確定總細胞蛋白百分比之方法在此項技術中為熟知的。
在一些實施例中，HPLC可用於量化肽產率。例如，在一些實施例中，肽產率可使用裝配有Onyx整體4.5 x 100mm，C18反相分析HPLC管柱及自動注入器之Agilent 1100 HPLC系統來定量。裝配有Onyx整體4.5 x 100mm，C18反相分析HPLC管柱及自動注入器之Agilent 1100 HPLC系統的示例性使用如下：來自轉型乳酸克魯維斯酵母細胞之過濾條件培養基樣品使用裝配有Onyx整體4.5 x 100 mm，C18反相分析HPLC管柱及自動注入器之Agilent 1100 HPLC系統藉由構成用於HPLC分析之兩種移動相溶劑的分析HPLC級水及含有0.1%三氟乙酸之乙腈來進行分析；兩個AMP或AMP殺昆蟲蛋白之峰面積使用HPLC層析來分析，然後用於計算條件培養基中之肽濃度，該等濃度可進一步標準化至對應最終細胞密度(如藉由OD600量測來確定)作為標準化肽產率。 活性分析
在一些實施例中，用AMP或AMP殺昆蟲蛋白來轉型之陽性酵母菌落可使用家蠅注射分析來篩檢。當以量測劑量經由背胸之體壁來注射時，AMP或AMP殺昆蟲蛋白可使家蠅癱瘓/殺傷。AMP或AMP殺昆蟲蛋白之功效可藉由分別導致經注射家蠅之50%擊倒比率或死亡率的肽中值癱瘓/致命劑量(PD 50/LD 50)來定義。純AMP或AMP殺昆蟲蛋白通常用於家蠅注射分析中來產生標準劑量-反應曲線，由此可確定PD 50/LD 50值。使用來自純AMP或AMP殺昆蟲蛋白之標準劑量-反應曲線之分析的PD 50/LD 50值，由轉型酵母產生之AMP或AMP殺昆蟲蛋白之定量可使用以對應條件培養基之連續稀釋液來執行之家蠅注射分析來達成。
示例性家蠅注射生物分析如下：將條件培養基連續稀釋以便產生來自家蠅注射生物分析之完全劑量-反應曲線。在注射之前，將成年家蠅(家蠅)用CO 2固定，並且將12-18 mg家蠅選擇用於注射。裝載有1 cc注射器及30號針之微量施藥器用於經由背胸之體壁，將每個蒼蠅0.5 µL劑量之連續稀釋條件培養基樣品注射至家蠅中。將注射家蠅安置在蓋子上具有潮濕濾紙及呼吸孔之封閉容器中，並且在注射後24小時，藉由擊倒比率或死亡率評分，對其進行檢查。計算標準化產率。肽產率意謂以mg/L為單位的條件培養基中之肽濃度。然而，肽產率不一定足以精確地比較菌株生產率。個別菌株可具有不同生長速率，由此在收穫培養物時，不同培養物可能在細胞密度方面會有所不同。具有高細胞密度之培養物可產生培養基中之肽之更高濃度，即使該菌株之肽生產率低於另一種具有更高生產率之菌株。因此，術語「標準化產率」藉由將肽產率除以對應培養物中之細胞密度來產生並且此允許菌株之間的肽生產率的更好比較。細胞密度藉由以「A」為單位(吸收率單位)的600 nm下之光吸收率來表示。
篩檢經歷用可操作來編碼AMP或AMP殺昆蟲蛋白之多核苷酸來轉型的酵母菌落可自數百個潛在菌落中鑑別高產率酵母菌株。當使用本文所述最佳化發酵培養基及發酵條件時，此等菌株可在生物反應器中發酵以便達成AMP或AMP殺昆蟲蛋白之至少多達4 g/L或至少多達3 g/L或至少多達2 g/L產率。更高產生率(以mg/L為單位來表示)可為約100 mg/L至約100,000 mg/L；或約100 mg/L至約90, 000 mg/L；或約100 mg/L至約80,000 mg/L；或約100 mg/L至約70,000 mg/L；或約100 mg/L至約60,000 mg/L；或約100 mg/L至約50,000 mg/L；或約100 mg/L至約40,000 mg/L；或約100 mg/L至約30,000 mg/L；或約100 mg/L至約20,000 mg/L；或約100 mg/L至約17,500 mg/L；或約100 mg/L至約15,000 mg/L；或約100 mg/L至約12,500 mg/L；或約100 mg/L至約10,000 mg/L；或約100 mg/L至約9,000 mg/L；或約100 mg/L至約8,000 mg/L；或約100 mg/L至約7,000 mg/L；或約100 mg/L至約6,000 mg/L；或約100 mg/L至約5,000 mg/L；或約100 mg/L至約3,000 mg/L；或約100 mg/L to 2,000 mg/L；或約100 mg/L to 1,500 mg/L；或約100 mg/L至1,000 mg/L；或約100 mg/L至750 mg/L；或約100 mg/L至500 mg/L；或約150 mg/L至100,000 mg/L；或約200 mg/L至100,000 mg/L；或約300 mg/L至100,000 mg/L；或約400 mg/L至100,000 mg/L；或約500 mg/L至100,000 mg/L；或約750 mg/L至100,000 mg/L；或約1,000 mg/L至100,000 mg/L；或約1,250 mg/L至100,000 mg/L；或約1,500 mg/L至100,000 mg/L；或約2,000 mg/L至100,000 mg/L；或約2,500 mg/L至100,000 mg/L；或約3,000 mg/L至100,000 mg/L；或約3,500 mg/L至100,000 mg/L；或約4,000 mg/L至100,000 mg/L；或約4,500 mg/L至100,000 mg/L；或約5,000 mg/L至100,000 mg/L；或約6,000 mg/L至100,000 mg/L；或約7,000 mg/L至100,000 mg/L；或約8,000 mg/L至100,000 mg/L；或約9,000 mg/L至100,000 mg/L；或約10,000 mg/L至100,000 mg/L；或約12,500 mg/L至100,000 mg/L；或約15,000 mg/L至100,000 mg/L；或約17,500 mg/L至100,000 mg/L；或約20,000 mg/L至100,000 mg/L；或約30,000 mg/L至100,000 mg/L；或約40,000 mg/L至100,000 mg/L；或約50,000 mg/L至100,000 mg/L；或約60,000 mg/L至100,000 mg/L；或約70,000 mg/L至100,000 mg/L；或約80,000 mg/L至100,000 mg/L；或約90,000 mg/L至100,000 mg/L；或所提供之任何值之任何範圍或甚至使用用於生產轉化前之肽的相同或相似生產方法，與使用轉化前之肽所達成之產率相比，達成更大產率。 培養及發酵條件
細胞培養技術在此項技術中為熟知的。在一些實施例中，培養方法及/或材料不可避免地需要基於所選擇宿主細胞來調適；並且，此等調適(例如，改變pH、溫度、培養基含量、及其類似條件)為熟習此項技術者熟知的。在一些實施例中，任何已知培養技術可用於產生本揭示案之AMP或AMP殺昆蟲蛋白。
示例性培養方法提供於美國專利第3,933,590號；第3,946,780號；第4,988,623號；第5,153,131號；第5,153,133號；第5,155,034號；第5,316,905號；第5,330,908號；第6,159,724號；第7,419,801號；第9,320,816號；第9,714,408號；及第10,563,169號；其揭示內容以全文引用方式併入本文。 酵母培養
酵母細胞培養技術為熟習此項技術者熟知的。示例性酵母細胞培養方法可發現於Evans, Yeast Protocols. Springer (1996)；Bill, Recombinant Protein Production in Yeast. Springer (2012)；Hagan等人, Fission Yeast: A Laboratory Manual, CSH Press (2016)；Konishi等人, Improvement of the transformation efficiency of Saccharomyces cerevisiaeby altering carbon sources in pre-culture. Biosci Biotechnol Biochem. 2014; 78(6):1090-3；Dymond, Saccharomyces cerevisiaegrowth media. Methods Enzymol. 2013; 533:191-204；Looke等人, Extraction of genomic DNA from yeasts for PCR-based applications. Biotechniques. 2011年5月; 50(5):325-8；及Romanos等人, Culture of yeast for the production of heterologous proteins. Curr Protoc Cell Biol. 2014年9月2日; 64:20.9.1-16，其揭示內容以全文引用方式併入本文。
酵母可在各種培養基中培養，例如，在一些實施例中，酵母可在基本培養基；YPD培養基；酵母合成缺素培養基；酵母氮源(具有或不具有胺基酸之YNB)；YEPD培養基；ADE D培養基；ADE DS"培養基；LEU D培養基；HIS D培養基；或礦物質鹽培養基中培養。
在一些實施例中，酵母可在基本培養基中培養。在一些實施例中，基本培養基成分可包含：2%糖；磷酸鹽緩衝液，pH 6.0；硫酸鎂；氯化鈣；硫酸銨；氯化鈉；氯化鉀；硫酸銅；硫酸錳；氯化鋅；碘化鉀；氯化鈷；鉬酸鈉；硼酸；氯化鐵；生物素；泛酸鈣；硫胺素；肌醇；菸鹼酸；及吡哆醇。
在一些實施例中，酵母可在YPD培養基中培養。YPD培養基包含細菌蛋白腖、酵母提取物、及葡萄糖。
在一些實施例中，酵母可在酵母合成缺素培養基中培養，該培養基可用於使用質體來轉型的在沒有特定培養基組分的情況下不能生長之營養缺陷型突變菌株分化，該質體允許該轉型體在缺少所需組分之培養基中生長。
在一些實施例中，酵母可使用包含氮、維生素、痕量元素、及鹽之酵母氮源(具有或不具有胺基酸之YNB)來培養。
在一些實施例中，培養基可為YEPD培養基，例如，包含2% D-葡萄糖、2% BACTO蛋白腖(Difco Laboratories, Detroit, MI)、1% BACTO酵母提取物(Difco)、0.004%腺嘌呤、及0.006% L-白胺酸之培養基；或其變化形式，其中碳源為糖醇，例如，甘油或山梨糖醇。
在一些實施例中，培養基可為ADE D培養基，例如，包含0.056%-Ade-Trp-Thr粉末、0.67%沒有胺基酸之酵母氮源、2% D-葡萄糖、及0.5% 200×色胺酸、蘇胺酸溶液之培養基；或其變化形式，其中碳源為糖醇，例如，甘油或山梨糖醇。
在一些實施例中，培養基可為ADE DS"培養基，例如，包含0.056%-Ade-Trp-Thr粉末、0.67%沒有胺基酸之酵母氮源、2% D-葡萄糖、0.5% 200×色胺酸、蘇胺酸溶液、及18.22% D-山梨醇之培養基；或其變化形式，其中碳源全部為糖醇，例如，甘油或山梨糖醇。
在一些實施例中，培養基可為LEU D培養基例如，包含0.052%-Leu-Trp-Thr粉末、0.67%沒有胺基酸之酵母氮源，2% D-葡萄糖、及0.5% 200×色胺酸、蘇胺酸溶液之培養基；或其變化形式，其中碳源為糖醇，例如，甘油或山梨糖醇。
在一些實施例中，培養基可為HIS D培養基，例如，包含0.052%-His-Trp-Thr粉末、0.67%沒有胺基酸之酵母氮源、2% D-葡萄糖、及0.5% 200×色胺酸、蘇胺酸溶液之培養基；或其變化形式，其中碳源為糖醇，例如，甘油或山梨糖醇。
在一些實施例中，可使用礦物質鹽培養基。礦物質鹽培養基由礦物質鹽及碳源諸如例如葡萄糖、蔗糖、或甘油組成。礦物質鹽培養基之實例包括例如M9培養基、假單胞菌培養基(ATCC 179)、及Davis及Mingioli培養基。參見Davis及Mingioli (1950) J. Bact. 60:17-28。用於製得礦物質鹽培養基之礦物質鹽包括尤其選自以下之彼等礦物質鹽，例如，磷酸鉀，硫酸銨或氯化銨，硫酸鎂或氯化鎂，及痕量礦物質諸如氯化鈣，硼酸鹽，及鐵、銅、錳、及鋅之硫酸鹽。通常，有機氮源諸如蛋白腖、胰腖、胺基酸、或酵母提取物不包含在礦物質鹽培養基中。替代地，使用無機氮源並且此可尤其選自以下之，例如，銨鹽、氨水、及氣態氨。礦物質鹽培養基通常含有葡萄糖或甘油作為碳源。
與礦物質鹽培養基相比，基本培養基亦可含有礦物質鹽及碳源，但是可補充有例如低水準之胺基酸、維生素、蛋白腖、或其他成分，然而此等成分以極小水準添加。培養基可使用在此項技術中，例如在美國專利申請公開案第2006/0040352號中描述之方法來製備，其揭示內容以全文引用方式併入本文。適用於本揭示案之方法的培養程序及礦物質鹽培養基的細節描述於Riesenberg, D等人, 1991, 「High cell density cultivation of Escherichia coli at controlled specific growth rate,」 J. Biotechnol. 20 (1):17-27中。
在一些實施例中，乳酸克魯維酵母在補充有2%葡萄糖、半乳糖、山梨糖醇、或甘油作為唯一碳源之基本培養基中生長。培養物在30℃下培育直到中期對數階段(24-48小時)為止，以便進行β-半乳糖苷酶量測，或在23.5℃下培育6天以便實現異源蛋白表現。
在一些實施例中，酵母細胞可在48孔深孔板中培養，該等板在接種之後用無菌、空氣可透蓋子來密封。在板上培養之酵母例如乳酸克魯維斯酵母之菌落可加以採集並且接種在具有每個孔2.2 mL培養基之深孔板中，該培養基由DMSor組成。接種深孔板可在23.5℃下，伴以280 rpm振盪在冷藏孵育器-振盪器中生長6天。接種後第6天，條件培養基藉由以4000 rpm離心10分鐘來收穫，隨後使用具有0.22 µM膜之濾板來過濾，並且過濾培養基經受HPLC分析。
在一些實施例中，酵母物種諸如乳酸克魯維酵母、釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母及其他酵母可用作宿主有機體，且/或酵母使用本文描述之方法來修飾。
溫度及pH條件取決於培養階段及所選擇宿主細胞物種來變化。細胞培養物中之變數諸如溫度及pH為熟習此項技術者容易已知的。
pH水準在酵母培養中為至關重要的。熟習此項技術者認識到培養過程不僅包括酵母培養物之起始而且包括培養物之保持。酵母培養物可在任何pH水準下起始，然而，由於隨著時間的推移，酵母培養物之培養基傾向於變得更具有酸性(亦即，降低pH)，因此必須注意在培養過程期間監測pH水準。
在本發明之一些實施例中，在基於所使用酵母物種、培養階段、及/或溫度來決定之pH水準下，酵母在培養基中生長。因此，在一些實施例中，pH水準可落在約2至約10之範圍內。熟習此項技術者認識到大多數微生物之最佳pH接近中性點(pH 7.0)。然而，在一些實施例中，一些真菌物種偏好酸性環境：因此，在一些實施例中，pH可在2至6.5範圍內。在一些實施例中，pH可在約4至約4.5範圍內。一些真菌物種(例如，黴菌)可在約2至約8.5之pH中生長，但是青睞酸性pH。參見Mountney及Gould, Practical food microbiology and technology. 1988. 第3版；及Pena等人, Effects of high medium pH on growth, metabolism and transport in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 2015年3月;15(2):fou005。
在其他實施例中，pH為約5.7至5.9、5.8至6.0、5.9至6.1、6.0至6.2、6.1至6.3、6.2至6.5、6.4至6.7、6.5至6.8、6.6至6.9、6.7至7.0、6.8至7.1、6.9至7.2、7.0至7.3、7.1至7.4、7.2至7.5、7.3至7.6、7.4至7.7、7.5至7.8、7.6至7.9、7.7至8.0、7.8至8.1、7.9至8.2、8.0至8.3、8.1至8.4、8.2至8.5、8.3至8.6、8.4至8.7、或8.5至8.8。
在一些實施例中，培養基之pH可為至少5.5。在其他態樣中，培養基可具有約5.5之pH水準。在其他態樣中，培養基可具有4與8之間之pH水準。在一些情況下，培養物保持在5.5與8之間之pH水準。在其他態樣中，培養基具有6與8之間之pH水準。在一些情況下，培養基具有保持在6與8之間之pH水準的pH水準。在一些實施例中，酵母生長及/或保持在6.1與8.1之間之pH水準下。在一些實施例中，酵母生長及/或保持在6.2與8.2之間之pH水準下。在一些實施例中，酵母生長及/或保持在6.3與8.3之間之pH水準下。在一些實施例中，酵母生長及/或保持在6.4與8.4之間之pH水準下。在一些實施例中，酵母生長及/或保持在5.5與8.5之間之pH水準下。在一些實施例中，酵母生長及/或保持在6.5與8.5之間之pH水準下。在一些實施例中，酵母生長在約5.6、5.7、5.8或5.9之pH水準下。在一些實施例中，酵母生長在約6之pH水準下。在一些實施例中，酵母生長在約6.5之pH水準下。在一些實施例中，酵母生長在約6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0之pH水準下。在一些實施例中，酵母生長在約7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、或8.0之pH水準下。在一些實施例中，酵母生長在8以上之水準下。
在一些實施例中，培養基之pH可在2至8.5之pH範圍內。在某些實施例中，pH為約4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、或8.8。
示例性酵母培養方法可發現於題為「Repressible yeast promoters」之美國專利第5,436,136號(1991年12月20日提出申請；受讓人Ciba-Geigy Corporation)；題為「Yeast expression systems, methods of producing polypeptides in yeast, and compositions relating to same」之美國專利第6,645,739號(2001年7月26日提出申請；受讓人Phoenix Pharmacologies, Inc., Lexington, KY)；及題為「Medium for yeasts」之美國專利第10,023,836號(2013年8月23日提出申請；受讓人Yamaguchi University)；其揭示內容以全文引用方式併入本文。 發酵
本揭示案涵蓋任何發酵形式之宿主有機體之培養物。例如，可在本文中使用分批、分批補料、半連續、及連續發酵模式。
發酵可以任何規模來執行。根據本揭示案涵蓋之方法及技術可用於任何規模之重組蛋白表現。因此，在一些實施例中，例如，可使用微升規模、毫升規模、厘升規模、及分升規模發酵體積，並且可使用1公升規模及更大發酵體積。
在一些實施例中，發酵體積等於或高於約1公升。例如，在一些實施例中，發酵體積為約1公升至約100公升。在一些實施例中，發酵體積為約1公升、約2公升、約3公升、約4公升、約5公升、約6公升、約7公升、約8公升、約9公升、或約10公升。在一些實施例中，發酵體積為約1公升至約5公升、約1公升至約10公升、約1公升至約25公升、約1公升至約50公升、約1公升至約75公升、約10公升至約25公升、約25公升至約50公升、或約50公升至約100公升在其他實施例中，發酵體積等於或高於5公升、10公升、15公升、20公升、25公升、50公升、75公升、100公升、200公升、500公升、1,000公升、2,000公升、5,000公升、10,000公升、或50,000公升。
在一些實施例中，發酵培養基可為用於使細胞生長及或保持之營養液。無限制地，此溶液通常提供來自以下類別中之一或多者的至少一種組分：(1)能量來源，通常呈碳源例如葡萄糖形式；(2)所有必需胺基酸，及通常二十種胺基酸之基本集合；(3)以低濃度需要之維生素及/或其他有機化合物；(4)游離脂肪酸或脂質，例如亞油酸；及(5)痕量元素，其中痕量元素定義為典型地以通常在微莫耳範圍內之極低濃度需要的無機化合物或天然存在之元素。
在一些實施例中，發酵培養基可與細胞培養基或本文所述任何其他培養基相同。在一些實施例中，發酵培養基可不同於細胞培養基。在一些實施例中，發酵培養基可改良以便適應蛋白之大規模生產。
在一些實施例中，發酵培養基可選擇性地補充有來自任何以下類別之一或多種組分：(1)激素及其他生長因子諸如血清、胰島素、運鐵蛋白、及其類似因子；(2)鹽，例如，鎂、鈣、及磷酸鹽；(3)緩衝劑，諸如HEPES；(4)核苷及鹼諸如腺苷、胸苷等；(5)蛋白及組織水解產物，例如可獲自純化明膠、植物材料、或動物副產物之蛋白腖或蛋白腖混合物；(6)抗生素，諸如慶大黴素(gentamycin)；及(7)細胞保護劑，例如普魯蘭尼克多元醇(pluronic polyol)。
在一些實施例中，發酵培養基之pH可使用為熟習此項技術者已知之pH緩衝劑及方法來保持。發酵期間之pH之控制亦可使用氨水來達成。在一些實施例中，發酵培養基之pH基於所使用有機體之較佳pH來選擇。因此，在一些實施例中，並且取決於宿主細胞及溫度，pH可在約至1至約10範圍內。
在一些實施例中，發酵培養基之pH可在2至8.5之pH範圍內。在某些實施例中，pH為約4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、或8.8。
在其他實施例中，pH為約5.7至5.9、5.8至6.0、5.9至6.1、6.0至6.2、6.1至6.3、6.2至6.5、6.4至6.7、6.5至6.8、6.6至6.9、6.7至7.0、6.8至7.1、6.9至7.2、7.0至7.3、7.1至7.4、7.2至7.5、7.3至7.6、7.4至7.7、7.5至7.8、7.6至7.9、7.7至8.0、7.8至8.1、7.9至8.2、8.0至8.3、8.1至8.4、8.2至8.5、8.3至8.6、8.4至8.7、或8.5至8.8。
在一些實施例中，例如，當使用大腸桿菌 (Escherichia coli/E. coli)時，視溫度而定，最佳pH範圍在6.5與7.5之間。
在其他實施例中，例如，當使用酵母菌株時，pH可在約4.0至8.0範圍內。
在一些實施例中，可使用中性pH，亦即，約7.0之pH。
熟習此項技術者認識到在發酵期間，pH水準可由於受質及代謝化合物之轉化及產生而出現偏差。
在一些實施例中，發酵培養基可用緩衝劑或其他化學物補充以避免pH之變化。例如，在一些實施例中，添加Ca(OH) 2、CaCO 3、NaOH、或NH 4OH可添加至發酵培養基以便中和在工業過程期間，例如在一些酵母物種中發生之酸性化合物之產生。
溫度為發酵過程中之另一個重要考慮因素；並且，如同pH考慮因素，溫度取決於所選擇宿主細胞之類型。
在一些實施例中，發酵溫度保持於約4℃至約42℃。在某些實施例中，發酵溫度為約4℃、約5℃、約6℃、約7℃、約8℃、約9℃、約10℃、約11℃、約12℃、約13℃、約14℃、約15℃、約16℃、約17℃、約18℃、約19℃、約20℃、約21℃、約22℃、約23℃、約24℃、約25℃、約26℃、約27℃、約28℃、約29℃、約30℃、約31℃、約32℃、約33℃、約34℃、約35℃、約36℃、約37℃、約38℃、約39℃、約40℃、約41℃、或約42℃。
在其他實施例中，發酵溫度保持在約25℃至約27℃、約25℃至約28℃、約25℃至約29℃、約25℃至約30℃、約25℃至約31℃、約25℃至約32℃、約25℃至約33℃、約26℃至約28℃、約26℃至約29℃、約26℃至約30℃、約26℃至約31℃、約26℃至約32℃、約27℃至約29℃、約27℃至約30℃、約27℃至約31℃、約27℃至約32℃、約26℃至約33℃、約28℃至約30℃、約28℃至約31℃、約28℃至約32℃、約29℃至約31℃、約29℃至約32℃、約29℃至約33℃、約30℃至約32℃、約30℃至約33℃、約31℃至約33℃、約31℃至約32℃、約30℃至約33℃、或約32℃至約33℃。
在其他實施例中，溫度在發酵期間改變，例如視發酵階段而定。
發酵可用熟習此項技術者已知之各種微生物來達成。用於擴大規模生產AMP或AMP殺昆蟲蛋白之合適微生物包括本文列出之任何微生物。在一些實施例中，微生物之非限制性實例包括以下屬之菌株：酵母屬某些種(包括但不限於釀酒酵母(麵包酵母)、糖化酵母( S. distaticus)、葡萄汁酵母)、克魯維酵母屬(包括但不限於馬克斯克魯維斯酵母、脆壁克魯維斯酵母( K. fragilis))、假絲酵母屬(包括但不限於擬熱帶假絲酵母( C. pseudotropicalis)、及甘藍假絲酵母( C. brassicae))、樹幹畢赤酵母 (Pichia stipitis)(休哈塔假絲酵母( Candida shehatae)之相關物)、棒孢 (Clavispora)屬(包括但不限於盧西坦棒孢酵母( C. lusitaniae)及仙人掌棒孢酵母( C. opuntiae))、管囊酵母( Pachysolen)屬(包括但不限於嗜鞣管囊酵母( P. tannophilus))、酒香酵母( Bretannomyces)屬(包括但不限於例如克勞森酒香酵母( B. clausenii)。其他合適微生物包括例如運動發酵單胞菌( Zymomonas mobilis) ，梭菌( Clostridium)某些種(包括但不限於熱纖梭菌( C. thermocellum)；糖丁基丙酮梭菌( C. saccharobutylacetonicum)、糖丁醇梭菌( C. saccharobutylicum)、紫色梭菌( C. Puniceum)、拜氏梭菌( C. beijernckii)、及丙酮丁醇梭菌( C. acetobutylicum))，花粉叢梗孢 (Moniliella pollinis)，切葉蜂叢梗孢 (Moniliella megachiliensis)，乳桿菌某些種，解脂耶氏酵母( Yarrowia lipolytica)，短梗黴 (Aureobasidium)物種，類絲孢酵母( Trichosporonoides)物種，變異三角酵母( Trigonopsis variabilis) ，絲孢酵母( Trichosporon)物種，乙醯阿布坦叢梗孢 (Moniliellaacetoabutans)物種，變異核瑚菌( Typhula variabilis) ，木蘭假絲酵母( Candida magnolias)，黑粉菌( Ustilaginomycetes)物種，築波假酵母菌( Pseudozyma tsukubaensis)，接合酵母( Zygosaccharomyces)、德巴利氏酵母( Debaryomyces)、漢遜酵母及畢赤酵母屬之酵母物種，及暗叢梗孢(dematioid)屬圓酵母( Torula)之真菌。參見 例如Philippidis, G. P., 1996, Cellulose bioconversion technology, in Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E.編, Taylor及Francis, Washington, D.C., 179-212。
發酵培養基可取決於宿主細胞及/或最終使用者之需要來選擇。除了例如碳以外的任何必要補充物亦可以合適濃度包含在內，單獨或作為與另一種補充物或培養基諸如複合氮源之混合物來引入。 酵母發酵
使用酵母之發酵方法為熟習此項技術者熟知的。在一些實施例中，分批發酵可根據本文提供之方法來使用；在其他實施例中，可使用連續發酵程序。
在一些實施例中，分批發酵方法可用於產生本揭示案之AMP。簡言之，分批發酵方法係指以封閉系統來執行之發酵類型，其中培養基之組成在開始發酵時確定並且在發酵期間不經受人為改變(亦即，培養基在開始發酵時用一或多種酵母細胞來接種，並且允許發酵在不被使用者中斷的情況下持續進行)。通常，在分批發酵系統中，系統之代謝產物及生物質組成物不斷地變化直至停止發酵時。在分批培養物內，酵母細胞經過靜態停滯期直至高生長對數期，並且最後直至生長速率減弱或停止的靜止期。若未處理，靜止期中之酵母細胞最終死亡。在分批方法中，對數期中之酵母細胞通常負責最終產物之大部分合成。
在一些實施例中，分批補料發酵可用於產生本揭示案之AMP。簡言之，分批補料發酵類似於典型分批方法(如上所述)，然而，分批補料方法中之受質在發酵進行時遞增地添加。當降解物阻遏可抑制酵母細胞代謝時，並且當使培養基中之受質之量受到限制合乎需要時，分批補料發酵為有用的。一般而言，分批補料系統中之受質濃度之量測結果基於反映代謝之可量測因子諸如pH、溶解氧、廢氣(例如，CO 2)之分壓力、及其類似因子之變化來估計。
在一些實施例中，分批補料發酵程序可用於產生AMP如下；在用N 2/CO 2混合物噴射之10 L生物反應器中，使用含有5 g/L磷酸鉀、2.5 g/L氯化銨、0.5 g/L硫酸鎂、及30 g/L玉米漿、及20 g/L之初始第一及第二碳源濃度的5 L發酵液，培養生產有機體(例如，經修飾之酵母細胞)。隨著經修飾之酵母細胞生長並且利用碳源，然後將額外70%碳源混合物以近似平衡碳源消耗之速率饋送至生物反應器中。生物反應器之溫度通常保持在30℃下。生長繼續大約24小時或更長，並且例如隨著細胞密度在約5與10 g/L之間，異源肽達到所需濃度。在培養期結束時，可將發酵罐內含物傳送穿過細胞分離單元諸如離心機以便移除細胞及細胞殘骸，並且發酵液可轉移至產物分離單元。異源肽之分離可藉由在此項技術中熟知之標準分離程序來發生。
在一些實施例中，連續發酵可用於產生本揭示案之AMP。簡言之，連續發酵係指使用開放系統之發酵，其中發酵培養基連續添加至生物反應器，並且同時將近似相等量之條件培養基移除以便進行處理。連續發酵通常將培養物保持於高密度下，在此高密度下，酵母細胞主要處於對數期生長中。通常，執行連續發酵方法來保持穩態生長條件，並且由於培養基取出所導致之酵母細胞損失相對於發酵中之細胞生長速率來得到平衡。
在一些實施例中，連續發酵方法可用於產生AMP如下；經修飾之酵母菌株可使用生物反應器設備及培養基組成物來培養，儘管其中初始第一及第二碳源為約例如30-50 g/L。當碳源耗盡時，相同組成物之饋送培養基以約0.5 L/hr與1 L/hr之間之速率來連續供應，並且將液體以相同速率取出。生物反應器中之異源肽濃度通常與細胞密度一起保持恆定。溫度通常保持於30℃下，並且通常根據需要，使用濃NaOH及HCl，將pH保持於約4.5。
在一些實施例中，在產生AMP時，生物反應器可連續操作例如約一個月，並且每天或根據需要獲取樣品以便確保目標化合物濃度之一致性。在連續模式中，當供應新的饋送培養基時，將發酵罐內含物不斷地移除。然後，在存在或不存在移除細胞及細胞殘骸的情況下，含有細胞、培養基、及異源肽之排出流可經受連續產物分離程序，並且可藉由在此項技術中熟知之將有機產物與所關注之肽分離的連續分離方法來執行。
在一些實施例中，可操作來表現AMP或AMP殺昆蟲蛋白之酵母細胞可例如使用分批補料過程在需氧生物反應器中生長。簡言之，用包含碳源及其他試劑之培養基，將反應器填充至約20%至約70%容量。使用一或多種如本文描述之化學物，保持溫度及pH。藉由與攪拌協調地，間歇地噴射空氣來保持氧水準。
例如，在一些實施例中，本揭示案提供在需氧生物反應器中使用分批補料過程之方法，其中反應器填充至約20%；21%；22%；23%；24%；25%；26%；27%；28%；29%；30%；31%；32%；33%；34%；35%；36%；37%；38%；39%；40%；41%；42%；43%；44%；45%；46%；47%；48%；49%；50%；51%；52%；53%；54%；55%；56%；57%；58%；59%；60%；61%；62%；63%；64%；65%；66%；67%；68%；69%；或70%容量。
在一些實施例中，本揭示案提供使用需氧生物反應器來產生AMP的分批補料發酵方法，其中培養基為豐富培養基。例如，在一些實施例中，碳源可為葡萄糖、山梨糖醇、或乳糖。
在一些實施例中，葡萄糖之量可為約2 g/L；3 g/L；4 g/L；5 g/L；6 g/L；7 g/L；8 g/L；9 g/L；10 g/L；11 g/L；12 g/L；13 g/L；14 g/L；15 g/L；16 g/L；17 g/L；18 g/L；19 g/L；20 g/L；21 g/L；22 g/L；23 g/L；24 g/L；25 g/L；26 g/L；27 g/L；28 g/L；29 g/L；或30 g/L培養基。
在一些實施例中，山梨糖醇之量可為約2 g/L；3 g/L；4 g/L；5 g/L；6 g/L；7 g/L；8 g/L；9 g/L；10 g/L；11 g/L；12 g/L；13 g/L；14 g/L；15 g/L；16 g/L；17 g/L；18 g/L；19 g/L；20 g/L；21 g/L；22 g/L；23 g/L；24 g/L；25 g/L；26 g/L；27 g/L；28 g/L；29 g/L；或30 g/L培養基。
在一些實施例中，乳糖之量可為約2 g/L；3 g/L；4 g/L；5 g/L；6 g/L；7 g/L；8 g/L；9 g/L；10 g/L；11 g/L；12 g/L；13 g/L；14 g/L；15 g/L；16 g/L；17 g/L；18 g/L；19 g/L；20 g/L；21 g/L；22 g/L；23 g/L；24 g/L；25 g/L；26 g/L；27 g/L；28 g/L；29 g/L；或30 g/L培養基。
在一些實施例中，本揭示案提供使用需氧生物反應器之分批補料發酵方法，其中培養基用磷酸、硫酸鈣、硫酸鉀、硫酸鎂七水合物、氫氧化鉀、及/或玉米漿中之一或多者來補充。
在一些實施例中，培養基可用約2 g/L；3 g/L；4 g/L；5 g/L；6 g/L；7 g/L；8 g/L；9 g/L；10 g/L；11 g/L；12 g/L；13 g/L；14 g/L；15 g/L；16 g/L；17 g/L；18 g/L；19 g/L；20 g/L；21 g/L；22 g/L；23 g/L；24 g/L；25 g/L；26 g/L；27 g/L；28 g/L；29 g/L；或30 g/L培養基之量的磷酸來補充。
在一些實施例中，培養基可用約0.05 g/L；0.15 g/L；0.25 g/L；0.35 g/L；0.45 g/L；0.55 g/L；0.65 g/L；0.75 g/L；0.85 g/L；0.95 g/L；1.05 g/L；1.15 g/L；1.25 g/L；1.35 g/L；1.45 g/L；1.55 g/L；1.65 g/L；1.75 g/L；1.85 g/L；1.95 g/L；2.05 g/L；2.15 g/L；2.25 g/L；2.35 g/L；2.45 g/L；2.55 g/L；2.65 g/L；2.75 g/L；2.85 g/L；或2.95 g/L培養基之量的硫酸鈣來補充。
在一些實施例中，培養基可用約2 g/L；2.5 g/L；3 g/L；3.5 g/L；4 g/L；4.5 g/L；5 g/L；5.5 g/L；6 g/L；6.5 g/L；7 g/L；7.5 g/L；8 g/L；8.5 g/L；9 g/L；9.5 g/L；10 g/L；10.5 g/L；11 g/L；11.5 g/L；12 g/L；12.5 g/L；13 g/L；13.5 g/L；14 g/L；14.5 g/L；15 g/L；15.5 g/L；16 g/L；16.5 g/L；17 g/L；17.5 g/L；18 g/L；18.5 g/L；19 g/L；19.5 g/L；或20 g/L培養基之量的硫酸鉀來補充。
在一些實施例中，培養基可用約0.25 g/L；0.5 g/L；0.75 g/L；1 g/L；1.25 g/L；1.5 g/L；1.75 g/L；2 g/L；2.25 g/L；2.5 g/L；2.75 g/L；3 g/L；3.25 g/L；3.5 g/L；3.75 g/L；4 g/L；4.25 g/L；4.5 g/L；4.75 g/L；5 g/L；5.25 g/L；5.5 g/L；5.75 g/L；6 g/L；6.25 g/L；6.5 g/L；6.75 g/L；7 g/L；7.25 g/L；7.5 g/L；7.75 g/L；8 g/L；8.25 g/L；8.5 g/L；8.75 g/L；9 g/L；9.25 g/L；9.5 g/L；9.75 g/L；10 g/L；10.25 g/L；10.5 g/L；10.75 g/L；11 g/L；11.25 g/L；11.5 g/L；11.75 g/L；12 g/L；12.25 g/L；12.5 g/L；12.75 g/L；13 g/L；13.25 g/L；13.5 g/L；13.75 g/L；14 g/L；14.25 g/L；14.5 g/L；14.75 g/L；或15 g/L培養基之量的硫酸鎂七水合物來補充。
在一些實施例中，培養基可用約0.25 g/L；0.5 g/L；0.75 g/L；1 g/L；1.25 g/L；1.5 g/L；1.75 g/L；2 g/L；2.25 g/L；2.5 g/L；2.75 g/L；3 g/L；3.25 g/L；3.5 g/L；3.75 g/L；4 g/L；4.25 g/L；4.5 g/L；4.75 g/L；5 g/L；5.25 g/L；5.5 g/L；5.75 g/L；6 g/L；6.25 g/L；6.5 g/L；6.75 g/L；或7 g/L培養基之量的氫氧化鉀來補充。
在一些實施例中，培養基可用約5 g/L；6 g/L；7 g/L；8 g/L；9 g/L；10 g/L；11 g/L；12 g/L；13 g/L；14 g/L；15 g/L；16 g/L；17 g/L；18 g/L；19 g/L；20 g/L；21 g/L；22 g/L；23 g/L；24 g/L；25 g/L；26 g/L；27 g/L；28 g/L；29 g/L；30 g/L；31 g/L；32 g/L；33 g/L；34 g/L；35 g/L；36 g/L；37 g/L；38 g/L；39 g/L；40 g/L；41 g/L；42 g/L；43 g/L；44 g/L；45 g/L；46 g/L；47 g/L；48 g/L；49 g/L；50 g/L；51 g/L；52 g/L；53 g/L；54 g/L；55 g/L；56 g/L；57 g/L；58 g/L；59 g/L；60 g/L；61 g/L；62 g/L；63 g/L；64 g/L；65 g/L；66 g/L；67 g/L；68 g/L；69 g/L；或70 g/L至培養基之量的玉米漿來補充。
在一些實施例中，反應器之溫度可保持在約15℃與約45℃之間。在一些實施例中，反應器可具有溫度約20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、或40℃。
在一些實施例中，pH可具有約3至約6之水準。在一些實施例中，pH可為3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、或6.0。
在一些實施例中，pH可經由添加一或多種化學物來保持在恆定水準下。例如，在一些實施例中，可添加氫氧化銨來保持pH。在一些實施例中，氫氧化銨可添加至約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、或20%氫氧化銨的培養基中之氫氧化銨水準。
在一些實施例中，氧水準可藉由噴射來保持。例如，在一些實施例中，藉由噴射0.5-1.5體積/體積/min之間之空氣並且藉由增加攪拌來保持10-30%之設定點，溶解氧可保持於恆定水準。
在一些實施例中，反應器之接種可基於包含約2.5 g/L至約50 g/L碳源例如葡萄糖、山梨糖醇、或乳糖之隔夜種子培養物來完成。在一些實施例中，隔夜種子培養物可包含玉米漿，例如，約2.5 g/L至約50 g/L玉米漿。
在一些實施例中，接種百分比可在初始填充體積之約5-20%的範圍內。接種之後，可向反應器饋送約50%至約80%選定碳源溶液一直到反應器充滿及/或達成所需上清液肽濃度為止。在一些實施例中，填充反應器所需要之時間可在約86小時至約160小時範圍內。在一些實施例中，達到預期肽濃度之所需數量可在約0.8 g/L至約1.2 g/L範圍內。發酵結束後，可將內含物傳送穿過細胞分離單元並且視情況濃縮，此舉取決於材料之規定用途。
本文提供酵母發酵培養基之額外製法。
酵母細胞發酵培養基及基料之製法描述如下；(1) MSM培養基製法；2 g/L檸檬酸鈉二水合物；1 g/L硫酸鈣二水合物(0.79 g/L無水硫酸鈣)；42.9 g/L磷酸二氫鉀；5.17 g/L硫酸銨；14.33 g/L硫酸鉀；11.7 g/L硫酸鎂七水合物；2 mL/L PTM1痕量鹽溶液；0.4 ppm生物素(來自500X，200 ppm基料)；1-2%純甘油或其他碳源。(2) PTM1痕量鹽溶液；硫酸銅-5H2O 6.0g；碘化鈉0.08 g；硫酸錳-H2O 3.0 g；鉬酸鈉-2H 2O 0.2 g；硼酸0.02 g；氯化鈷0.5 g；氯化鋅20.0 g；硫酸亞鐵-7H 2O 65.0 g；生物素0.2 g；硫酸5.0 ml；添加水至1公升之最終體積。乳酸克魯維斯酵母定義培養基(DMSor)之示例性組成物如下；11.83 g/L KH 2PO 4，2.299 g/L K 2HPO 4，20 g/L可發酵糖例如半乳糖、麥芽糖、乳三糖、蔗糖、果糖或葡萄糖及/或糖醇例如赤藻糖醇、氫化澱粉水解產物、異麥芽酮糖醇、乳糖醇、麥芽糖醇、甘露糖醇、及木糖醇，1 g/L MgSO 4.7H 2O，10 g/L (NH 4)SO 4，0.33 g/L CaCl 2.2H 2O，1 g/L NaCl，1 g/L KCl，5 mg/L CuSO 4.5H 2O，30 mg/L MnSO 4.H 2O，10 mg/L，ZnCl 2，1 mg/L KI，2 mg/L CoCl 2.6H 2O，8mg/L Na 2MoO 4.2H 2O，0.4 mg/L H 3BO 3，15 mg/L FeCl 3.6H 2O，0.8 mg/L生物素，20 mg/L泛酸鈣，15 mg/L硫胺素，16 mg/L肌醇，10 mg/L菸鹼酸，及4 mg/L吡哆醇。 肽降解
蛋白、多肽、及肽在生物樣品中並且在溶液中(例如，細胞培養物及/或發酵期間)降解。
偵測AMP肽降解之方法在此項技術中為熟知的。可在本文中使用偵測肽降解(例如，發酵期間)之任何熟知方法。
在一些實施例中，肽降解可使用以下來偵測：同位素標記技術；液相層析/質譜(LC/MS)；HPLC；放射性胺基酸併入及隨後例如經由閃爍計數來偵測；使用報導蛋白，例如，可(例如，藉由螢光、光譜、發光測定法等)來偵測之蛋白；一或多種生物發光蛋白及/或螢光蛋白及/或其融合物之螢光強度；脈衝追蹤分析(例如，用放射性胺基酸來脈衝標記細胞並且在與未標記前體一起追蹤的同時，跟蹤標記蛋白之衰減，及阻止蛋白合成並且量測總蛋白水準隨著時間之衰減)；放線菌酮追蹤分析；
在一些實施例中，分析可用於偵測肽降解，其中樣品與非螢光化合物接觸，該化合物可操作來與經由肽之降解而產生的該樣品中之游離一級胺反應，並且然後產生可定量並且與標準進行比較之螢光信號。根據本揭示案可用作游離胺之螢光標籤的非螢光化合物之實例為3-(4-羧基苯甲醯基)喹啉-2-甲醛(CBQCA)、螢光胺、及鄰酞二醛。
在一些實施例中，確定來自報導蛋白之讀出信號之方法取決於報導蛋白之性質。例如，對於螢光報導蛋白而言，讀出信號對應於螢光信號之強度。讀出信號可使用例如基於光譜、螢光測定、光度測定、及/或發光測定之方法及偵測系統來量測。此等方法及偵測系統在此項技術中為熟知的。
在一些實施例中，熟習此項技術者已知之標準免疫程序可用於偵測肽降解。例如，在一些實施例中，可使用利用可偵測抗體之免疫分析來偵測樣品中之肽降解。此等免疫分析包括例如凝集分析、ELISA、Pandex顯微螢光測定分析、流式細胞術、血清診斷分析、及免疫組織化學染色程序，該等分析全部在此項技術中為熟知的。在一些實施例中，一個樣品中之水準(例如，螢光)可與標準進行比較。抗體可藉由在此項技術中熟知之各種手段來變得可偵測。例如，可偵測標誌物可直接或間接地連接至抗體。可用標誌物包括例如放射性核苷酸、酶、螢光素、色原及化學發光標記物。
偵測肽降解之示例性方法提供於美國專利第5,766,927號；第7,504,253號；第9,201,073號；第9,429,566號；美國專利申請案20120028286；Eldeeb等人, A molecular toolbox for studying protein degradation in mammalian cells. J Neurochem. 2019年11月;151(4):520-533；及Buchanan等人, Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae.J Vis Exp. 2016; (110): 53975中，其揭示內容以全文引用方式併入本文。 農業上可接受之鹽
如本文使用，術語「醫藥學上可接受之鹽」與「農業上可接受之鹽」為同義的。
在一些實施例中，可利用本文所述AMP之農業上可接受之鹽、水合物、溶劑化物、晶體形式及個別異構物、鏡像異構物、互變異構物、非鏡像異構物及前藥。
在一些實施例中，本揭示案之農業上可接受之鹽具有母體化合物之所需藥理學活性。此等鹽包括：與無機酸形成之酸加成鹽；與有機酸形成之酸加成鹽；或當存在於母體化合物中之酸性質子藉由金屬離子例如鹼金屬離子、鋁離子來置換；或與有機鹼諸如乙醇胺及其類似物配位時形成之鹽。
在一些實施例中，農業上可接受之鹽包括習知毒性或無毒鹽。例如，在一些實施例中，常規無毒鹽包括諸如反丁烯二酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、氯化物、及其類似鹽。在一些實施例中，本揭示案之農業上可接受之鹽可藉由習知化學方法，自母體化合物合成。在一些實施例中，此等鹽可藉由使此等化合物之游離酸或鹼形式與化學計算量之合適鹼或酸在水中或在有機溶劑中，或在兩者之混合物中反應來製備。在一些實施例中，非水介質如醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇、或乙腈為較佳的。合適鹽之清單發現於Remington's Pharmaceutical Sciences, 第17版, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, 第1418頁中，其揭示內容以全文引用方式併入本文。
在一些實施例中，農業上可接受之鹽可為以下中之一者：鹽酸鹽；鈉；硫酸鹽；乙酸鹽；磷酸鹽或二磷酸鹽；氯化物；鉀；順丁烯二酸鹽；鈣；檸檬酸鹽；甲磺酸鹽；硝酸鹽；酒石酸鹽；鋁；或葡萄糖酸鹽。
在一些實施例中，可用於形成鹽的農業上可接受之酸之清單可為：乙醇酸；馬尿酸；氫溴酸；鹽酸；異丁酸；乳酸(DL)；乳糖醛酸；月桂酸；順丁烯二酸；蘋果酸(-L)；丙二酸；扁桃酸(DL)；甲磺酸；萘-1,5-二磺酸；萘-2-磺酸；菸鹼酸；硝酸；油酸；草酸；棕櫚酸；雙羥萘酸；磷酸；丙酸；焦麩胺酸(-L)；水楊酸；癸二酸；硬脂酸；丁二酸；硫酸；酒石酸(+L)；硫氰酸；甲苯磺酸( p)；十一碳烯酸；1-羥基-2-萘甲酸；2,2-二氯乙酸；2-羥基乙磺酸；2-側氧戊二酸；4-乙醯胺基苯甲酸；4-胺基水楊酸；乙酸；己二酸；抗壞血酸(L)；天冬胺酸(L)；苯磺酸；苯甲酸；樟腦酸(+)；樟腦-10-磺酸(+)；羊蠟酸(癸酸)；羊油酸(己酸)；羊脂酸(辛酸)；碳酸；肉桂酸；檸檬酸；環拉酸；十二烷基硫酸；乙烷-1,2-二磺酸；乙磺酸；甲酸；反丁烯二酸；黏酸；龍膽酸；葡庚糖酸(D)；葡萄糖酸(D)；葡萄糖醛酸(D)；麩胺酸；戊二酸；或甘油磷酸。
在一些實施例中，農業上可接受之鹽可為任何有機或無機加成鹽。
在一些實施例中，鹽可使用無機酸及有機酸作為游離酸。無機酸可為鹽酸、溴酸、硝酸、硫酸、高氯酸、磷酸等。有機酸可為檸檬酸、乙酸、乳酸、順丁烯二酸、反丁烯二酸、葡萄糖酸、甲烷磺酸、葡萄糖酸、丁二酸、酒石酸、半乳糖醛酸、雙羥萘酸、麩胺酸、天冬胺酸、草酸、(D)或(L)蘋果酸、順丁烯二酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、4-甲苯磺酸、水楊酸、檸檬酸、苯甲酸、丙二酸等。
在一些實施例中，鹽包括鹼金屬鹽(鈉鹽、鉀鹽等)及鹼土金屬鹽(鈣鹽、鎂鹽等)。例如，酸加成鹽可包括乙酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、碳酸氫鹽/碳酸鹽、硫酸氫鹽/硫酸鹽、硼酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、乙二磺酸鹽、乙磺酸鹽、甲酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡庚糖酸鹽、葡萄糖酸鹽、葡萄糖醛酸鹽、六氟磷酸鹽、海苯酸鹽、鹽酸鹽/氯化物、氫溴酸鹽/溴化物、氫碘酸/碘化物、羥乙基磺酸鹽、乳酸鹽、蘋果酸鹽、順丁烯二酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、甲基硫酸鹽、萘二甲酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、乳清酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、磷酸鹽/磷酸氫鹽/磷酸二氫鹽、蔗糖鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、甲苯磺酸鹽、三氟乙酸鹽、鋁、精胺酸、苯乍生、鈣、膽鹼、二乙胺、二乙醇胺、甘胺酸、離胺酸、鎂、葡甲胺、乙醇胺、鉀、鈉、緩血酸胺、鋅鹽等，並且尤其可使用鹽酸鹽或三氟乙酸鹽。
在其他實施例中，農業上可接受之鹽可為具有酸之鹽，該酸諸如乙酸、丙酸、丁酸、甲酸、三氟乙酸、順丁烯二酸、酒石酸、檸檬酸、硬脂酸、丁二酸、乙基琥珀酸、乳糖醛酸、葡萄糖酸、葡庚糖酸、苯甲酸、甲磺酸、乙磺酸、2-羥基乙磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、十二烷基硫酸、蘋果酸、天冬胺酸、麩胺酸、己二酸、半胱胺酸、N-乙醯半胱胺酸、鹽酸、氫溴酸、磷酸、硫酸、氫碘酸、菸鹼酸、草酸、苦味酸、硫氰酸、十一烷酸、聚丙烯酸鹽或羧乙烯基聚合物。
在一些實施例中，農業上可接受之鹽可自無機或有機鹼來製備。衍生自無機鹼之鹽包括但不限於鈉、鉀、鋰、銨、鈣、鎂、亞鐵、鋅、銅、錳、鋁、正鐵、錳鹽、及其類似鹽。較佳無機鹽為銨、鈉、鉀、鈣、及鎂鹽。衍生自有機鹼之鹽包括但不限於以下之鹽：一級、二級、及三級胺，經取代胺包括天然存在之經取代胺，及環狀胺，包括異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二甲基胺基乙醇、緩血酸胺、離胺酸、精胺酸、組胺酸、咖啡因、普魯卡因、海巴明、膽鹼、甜菜鹼、乙二胺、葡糖胺、N-烷基葡糖胺、可可鹼、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、及其類似物。較佳有機鹼為異丙胺、二乙胺、乙醇胺、哌啶、緩血酸胺、及膽鹼。
在一些實施例中，農業上可接受之鹽係指在合理的醫學判斷之範疇內，適用於與人類及低等動物之組織接觸而無不當毒性、刺激、過敏反應及其類似反應，且與合理的效益/風險比率相稱之彼等鹽。農業上可接受之鹽在此項技術中為熟知的。例如，S. M. Berge等人在J. Pharmaceutical Sciences, 66: 1–19 (1977)中詳細地描述農業上可接受之鹽，其揭示內容以全文引用方式併入本文。
在一些實施例中，本揭示案之鹽可在本發明化合物之最終分離及純化期間原位製備，或藉由使游離鹼官能基與合適有機酸反應來單獨地製備。農業上可接受之無毒酸加成鹽之實例為與諸如鹽酸、氫溴酸、磷酸、硫酸、及過氯酸之無機酸，或與諸如乙酸、草酸、順丁烯二酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸、或丙二酸之有機酸，或藉由使用諸如離子交換之用於此項技術中的其他方法所形成之具有胺基之鹽。其他農業上可接受之鹽包括己二酸鹽、海藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬胺酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙烷磺酸鹽、甲酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、葡糖酸鹽、半硫酸鹽(hemisulfate)、庚酸鹽、己酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基-乙烷磺酸鹽、乳糖酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、順丁烯二酸鹽、丙二酸鹽、甲烷磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽(pamoate)、果膠酸鹽(pectinate)、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、丁二酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、對甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽、戊酸鹽、及其類似鹽。代表性鹼或鹼土金屬鹽包括鈉鹽、鋰鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、及其類似鹽。其他農業上可接受之鹽適當時包括無毒銨、四級銨及使用平衡離子形成之胺陽離子，該等平衡離子諸如鹵化物、氫氧化物、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低級烷基磺酸根及芳基磺酸根。
醫藥學上可接受之鹽之示例性描述提供於P. H. Stahl及C. G. Wermuth, (編者), Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, John Wiley & Sons, 8月23日(2002)中，其揭示內容以全文引用方式併入本文。 AMP 併入植物或其部分中
本文所述AMP、及/或包含至少一種本文所述AMP之殺昆蟲蛋白可併入植物、植物組織、植物細胞、植物種子、及/或其植物部分中，以便穩定或瞬時表現AMP或AMP殺昆蟲蛋白、及/或編碼該蛋白之多核苷酸序列。
在一些實施例中，AMP或AMP殺昆蟲蛋白可使用在此項技術中已知的重組技術來併入植物中。在一些實施例中，AMP或AMP殺昆蟲蛋白可呈可包含一或多種AMP單體之殺昆蟲蛋白形式。
如本文使用，相對於轉殖基因植物、植物組織、植物細胞、及植物種子，術語「AMP」亦涵蓋AMP殺昆蟲蛋白，並且「AMP多核苷酸」類似地亦用於涵蓋可操作來表現及/或編碼包含一或多種AMP之殺昆蟲蛋白的多核苷酸或多核苷酸之群。
將AMP併入植物中之目標為經由昆蟲消耗在昆蟲所消耗之植物組織中表現之轉殖基因AMP，將AMP及/或AMP殺昆蟲蛋白遞送至害蟲。藉由昆蟲自其食物中消耗AMP(例如，經由昆蟲食用以AMP來轉型之轉殖基因植物)後，所消耗之AMP可具有抑制生長、削弱運動、或甚至殺傷昆蟲之能力。因此，表現AMP多核苷酸及/或AMP多肽之轉殖基因植物可在各種植物組織中表現該AMP多核苷酸/多肽，該等組織包括但不限於：表皮(例如，葉肉)；周皮；韌皮部；木質部；薄壁組織；厚角組織；厚壁組織；及一級及二級分生組織。例如，在一些實施例中，編碼AMP之多核苷酸序列可操作地連接至含有磷酸烯醇丙酮酸羧激酶啟動子之調控區，導致AMP在植物之葉肉組織中之表現。
表現AMP及/或可操作來表現AMP之多核苷酸的轉殖基因植物可藉由熟習此項技術者熟知之各種方法及方案中之任一者來產生；本發明之此等方法不要求使用將核苷酸構築體引入植物之特定方法，僅要求核苷酸構築體可進入植物之至少一個細胞之內部。將核苷酸構築體引入植物中之方法在此項技術中為已知的，包括但不限於穩定轉型方法、瞬時轉型方法、及病毒介導方法。「轉殖基因植物」或「轉型植物」或「穩定轉型」植物或細胞或組織係指將外源核酸序列或DNA片段併入或整合至植物細胞中之植物。此等核酸序列包括外源性、或不存在於未轉型植物細胞中之序列，以及可為內源性、或存在於未轉型植物細胞中之序列。「異源」通常係指對於其存在於其中之細胞或天然基因組之一部分而言，並非內源性的核酸序列，並且該等序列藉由感染、轉染、顯微注射、電穿孔、顯微投射、或類似技術來添加至細胞。
植物細胞之轉型可藉由在此項技術中已知的多種技術中之一者來完成。通常，表現所關注之外源或異源肽或多肽(例如，AMP)之構築體含有驅動基因之轉錄的啟動子，以及允許轉錄終止及多聚腺苷酸化之3’非轉譯區。此等構築體之設計及組織在此項技術中為熟知的。在一些實施例中，基因可經工程化以使得將所得肽分泌，或以其他方式在植物細胞內，被靶向輸送至特定區域及/或細胞器。例如，基因可經工程化以便含有促進將肽轉移至內質網之信號肽。將植物表現匣工程化以便含有內含子亦可為較佳的，以使得需要內含子之mRNA處理以便進行表現。
通常，植物表現匣可插入植物轉型載體中。此植物轉型載體可包含達成植物轉型所需要之一或多個DNA載體。例如，利用包含一個以上連續DNA區段之植物轉型載體在此項技術中為常見實務。此等載體在此項技術中通常被稱為「二元載體」。二元載體以及具有輔助質體之載體最經常用於農桿菌介導之轉型，其中達成有效轉型所需要之DNA區段之尺寸及複雜性為相當大的，並且將功能分開至單獨DNA分子上為有利的。二元載體通常包含：含有T-DNA轉移所需要之順式作用序列(諸如左邊界及右邊界)的質體載體，經工程化以便能夠在植物細胞中表現之可選擇標誌物，及「所關注基因」(經工程化以便能夠在需要產生轉殖基因植物之植物細胞中表現之基因)。細菌複製所需要之序列亦存在於此質體載體上。順式作用序列以允許有效轉移至植物細胞中及在其中表現之方式來排列。例如，可選擇標誌基因及AMP位於左與右邊界之間。通常，第二質體載體含有介導自農桿菌至植物細胞之T-DNA轉移的反式作用因子。此質體經常含有毒性功能(Vir基因)，該等功能允許藉由農桿菌來感染植物細胞，及藉由在邊界序列處裂解及vir介導之DNA轉移來使DNA轉移，如在此項技術中所理解(Hellens及Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451)。多種類型之農桿菌菌株(例如，LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105等)可用於植物轉型。第二質體載體並非藉由諸如顯微投射、顯微注射、電穿孔、聚乙二醇等之其他方法來轉型植物必不可少的。
通常，植物轉型方法涉及將異源DNA轉移至目標植物細胞(例如，未成熟或成熟胚胎、懸浮培養物、未分化愈傷組織、原生質體等)中，隨後應用最大臨限水準之合適選擇(取決於可選擇標誌基因)以便自未轉型細胞沉澱之群中，回收轉型植物細胞。外植體通常轉移至新鮮供應之相同培養基並且常規地培養。隨後，在安置於補充有最大臨限水準之選擇劑之再生培養基上之後，轉型細胞分化成枝條。枝條然後轉移至選擇性生根培養基以便回收生根枝條或小植物。轉殖基因小植物然後生長為成熟植物並且產生可生育種子(例如Hiei等人(1994) The Plant Journal 6:271-282；Ishida等人(1996) Nature Biotechnology 14:745-750)。外植體通常轉移至新鮮供應之相同培養基並且常規地培養。產生轉殖基因植物之技術及方法的一般描述發現於Ayres及Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 and Bommineni and Jauhar (1997) Maydica 42:107-120中。因為轉型材料含有許多細胞，所以轉型及未轉型細胞均存在於任何一片所討論目標愈傷組織或生理組織或細胞群中。殺傷未轉型細胞及允許轉型細胞增殖之能力產生轉型植物培養物。通常，移除未轉型細胞之能力為快速回收轉型植物細胞及成功產生轉殖基因植物的限制因素。
轉型方案以及將核苷酸序列引入植物中之方案可取決於定為轉型之目標的植物或植物細胞之類型，亦即，單子葉植物或雙子葉植物而變化。產生轉殖基因植物可藉由多種方法之一來執行，包括但不限於顯微注射、電穿孔、直接基因轉移、藉由農桿菌將異源DNA引入植物細胞中(農桿菌介導轉型)、用附著至粒子之異源外來DNA來轟擊植物細胞、彈道粒子加速、氣溶膠束轉型、Lec1轉型、及轉移DNA之各種其他非粒子引導介導方法。示例性轉型方案揭示於美國公開申請案第20010026941號；美國專利第4,945,050號；國際公開案第WO91/00915號；及美國公開申請案第2002015066號，其揭示內容以全文引用方式併入本文。
葉綠體亦可容易地轉型，並且關於葉綠體之轉型的方法在此項技術中為已知的。參見，例如，Svab等人(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530；Svab及Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917；Svab及Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606，其揭示內容以全文引用方式併入本文。葉綠體轉型方法依賴於含有可選擇標誌物之DNA之粒子槍遞送及經由同源重組來將DNA靶向輸送至質體基因組。另外，藉由細胞核編碼及質體引導RNA聚合酶之組織優先表現來進行沉默質體攜帶轉殖基因之轉錄活化，從而可完成質體轉型。此系統報導於McBride等人(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305。
將異源外來DNA整合至植物細胞中之後，熟習此項技術者可然後將最大臨限水準合適選擇化學/試劑(例如，抗生素)應用於培養基中以便殺傷未轉型細胞，並且藉由將該等存活細胞定期轉移至新鮮培養基，使在此選擇處理中存活之推定轉型細胞分離並且生長。藉由連續繼代及用合適選擇來激發，熟習此項技術者鑑別用質體載體來轉型之細胞並且使其繁殖。然後，分子及生物化學方法可用於確認轉殖基因植物之基因組中之所關注整合異源基因的存在。
已轉型之細胞可根據熟習此項技術者已知之習知方法來生長成植物。參見，例如，McCormick等人(1986) Plant Cell Reports 5:81-84，其揭示內容以全文引用方式併入本文。然後，此等植物可生長，並且用相同轉型品系或不同品系來授粉，並且對具有所需表型特徵之組成性表現的所得雜交體進行鑑別。可生長兩個或兩個以上世代以便確保所需表型特徵之表現得以穩定地保持並且遺傳，然後將種子收穫以便確保所需表型特徵之表現得以達成。以此方式，本揭示案提供具有穩定併入其基因組中之本發明核苷酸構築體，例如，本發明表現匣的轉型種子(亦被稱為「轉殖基因種子」)。
在各種實施例中，本揭示案提供AMP殺昆蟲蛋白，其充當如上所述昆蟲蛋白水解酶、蛋白酶及肽酶(在本文中統稱為「蛋白酶」)之受質。
在一些實施例中，可以接受AMP表現之轉殖基因植物或其部分可以包括：苜蓿、香蕉、大麥、豆、西蘭花、捲心菜、油菜、胡蘿蔔、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、鷹嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三葉草、棉花、葫蘆、黃瓜、花旗松、茄子、桉樹、亞麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭菜、生菜、火炬松、小米、瓜類、堅果、燕麥、橄欖、洋蔥、觀賞植物、棕櫚、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松樹、馬鈴薯、白楊、南瓜、新西蘭輻射松、蘿蔔、油菜籽、水稻、砧木、黑麥、紅花、灌木、高粱、美國長葉松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、香楓、甘藷、柳枝稷、茶、菸草、番茄、黑小麥、草坪草、西瓜及小麥植物。
在一些實施例中，轉殖基因植物可自最初用本文所述DNA構築體來轉型之細胞生長。在其他實施例中，轉殖基因植物可在特定組織、或植物部分，例如，葉子、主幹、花朵、萼片、果實、根部、種子、或其組合中表現所編碼之AMP。
在一些實施例中，植物、植物組織、植物細胞、植物種子、或其部分可用AMP或其編碼多核苷酸來轉型，其中AMP具有與根據式(I)：X 1-S-C-C-P-C-Y-W-X 2-X 3-C-P-W-G-Q-X 4-C-Y-P-X 5-G-C-X 6-G-X 7-X 8-X 9-X 10之胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致的胺基酸序列；其中相對於在SEQ ID NO: 1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；其中X 1為K、H、Q、T、S、N、E、I、L、或V；X 2為G、P、或A；X 3為G、或N；X 4為N或D；X 5為E、D、或N；X 6為S、D、G、T、V、或R；X 7為P或不存在；X 8為K、H、A、R、G、T、D、或不存在；X 9為G、V、或不存在；X 10為G、I、或不存在；或其互補核苷酸序列。
在一些實施例中，植物、植物組織、植物細胞、植物種子、或其部分可用AMP或其編碼多核苷酸來轉型，其中AMP具有與根據式(II)：K-S-C-C-P-C-Y-W-G-G-C-P-W-G-Q-X 1-C-Y-P-X 2-G-C-X 3-G-P-X 4-X 5-X 6之胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致的胺基酸序列；其中相對於在SEQ ID NO: 1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；X 1為N或D；X 2為E、D、或N；X 3為S、D、R、或G；X 4為K、G、或D；X 5為V或不存在；或其互補核苷酸序列。
在一些實施例中，本揭示案包含植物、植物組織、植物細胞、植物種子、或其部分、基本上由其組成、或由其組成，該植物、植物組織、植物細胞、植物種子、或其部分包含一或多種AMP、或其編碼多核苷酸、基本上由其組成、或由其組成，該AMP包含根據式(I)：X 1-S-C-C-P-C-Y-W-X 2-X 3-C-P-W-G-Q-X 4-C-Y-P-X 5-G-C-X 6-G-X 7-X 8-X 9-X 10之胺基酸序列；其中相對於在SEQ ID NO：1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；其中X 1為K、H、Q、T、S、N、E、I、L、或V；X 2為G、P、或A；X 3為G、或N；X 4為N或D；X 5為E、D、或N；X 6為S、D、G、T、V、或R；X 7為P或不存在；X 8為K、H、A、R、G、T、D、或不存在；X 9為G、V、或不存在；X 10為G、I，或不存在。
在一些實施例中，本揭示案包含植物、植物組織、植物細胞、植物種子、或其部分、基本上由其組成、或由其組成，該植物、植物組織、植物細胞、植物種子、或其部分包含一或多種AMP、或其編碼多核苷酸、基本上由其組成、或由其組成，該AMP包含根據式(II)：K-S-C-C-P-C-Y-W-G-G-C-P-W-G-Q-X 1-C-Y-P-X 2-G-C-X 3-G-P-X 4-X 5-X 6之胺基酸序列；其中相對於在SEQ ID NO:1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；X 1為N或D；X 2為E、D、或N；X 3為S、D、R、或G；X 4為K、G、或D；X 5為V或不存在。
在一些實施例中，植物、植物組織、植物細胞、或植物種子可用AMP來轉型，該AMP包含如SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169中之任一者中所闡明之胺基序列、基本上由其組成、或由其組成。
在一些實施例中，植物、植物組織、植物細胞、或植物種子可用AMP來轉型，該AMP包含如SEQ ID NO：20、24-26、35-36、38、及40中之任一者中所闡明之胺基序列、基本上由其組成、或由其組成。
在一些實施例中，植物、植物組織、植物細胞、或植物種子可用AMP來轉型，該AMP包含如SEQ ID NO：25、36、38、及40中之任一者中所闡明之胺基序列、基本上由其組成、或由其組成。
在一些實施例中，植物、植物組織、植物細胞、植物種子、或其部分可用AMP或其編碼多核苷酸來轉型，其中AMP具有與以下胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致的胺基酸序列：「KSCCPCYWGGCPWGQDCYPDGCDGPK」 (SEQ ID NO: 20)。
在一些實施例中，植物、植物組織、植物細胞、植物種子、或其部分可用AMP或其編碼多核苷酸來轉型，其中AMP具有與以下胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致的胺基酸序列：「KSCCPCYWGGCPWGQNCYPNGCSGPK」 (SEQ ID NO: 24)。
在一些實施例中，植物、植物組織、植物細胞、植物種子、或其部分可用AMP或其編碼多核苷酸來轉型，其中AMP具有與以下胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致的胺基酸序列：「KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCDGPK」 (SEQ ID NO: 25)。
在一些實施例中，植物、植物組織、植物細胞、植物種子、或其部分可用AMP或其編碼多核苷酸來轉型，其中AMP具有與以下胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致的胺基酸序列：「KSCCPCYWPGCPWGQNCYPEGCSGPK」 (SEQ ID NO: 26)。
在一些實施例中，植物、植物組織、植物細胞、植物種子、或其部分可用AMP或其編碼多核苷酸來轉型，其中AMP具有與以下胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致的胺基酸序列：「KSCCPCYWPGCPWGQNCYPEGCRGPD」 (SEQ ID NO: 35)。
在一些實施例中，植物、植物組織、植物細胞、植物種子、或其部分可用AMP或其編碼多核苷酸來轉型，其中AMP具有與以下胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致的胺基酸序列：「KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPG」 (SEQ ID NO: 36)。
在一些實施例中，植物、植物組織、植物細胞、植物種子、或其部分可用AMP或其編碼多核苷酸來轉型，其中AMP具有與以下胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致的胺基酸序列：「KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCGGPG」 (SEQ ID NO: 38)。
在一些實施例中，植物、植物組織、植物細胞、植物種子、或其部分可用AMP或其編碼多核苷酸來轉型，其中AMP具有與以下胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致的胺基酸序列：「KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPKVG」 (SEQ ID NO: 40)。
在一些實施例中，植物、植物組織、植物細胞、植物種子、或其部分可用AMP或其編碼多核苷酸來轉型，其中多核苷酸可操作來編碼兩種或兩種以上AMP之均聚物或雜聚物，其中各AMP之胺基酸序列相同或不同。
在一些實施例中，植物、植物組織、植物細胞、植物種子、或其部分可用AMP或其編碼多核苷酸來轉型，其中多核苷酸可操作來編碼AMP，其為包含藉由可裂解或不可裂解連接子來分隔之兩個或兩個以上AMP的融合蛋白，並且其中各AMP之胺基酸序列可相同或不同。
在一些實施例中，連接子為可裂解連接子。
在一些實施例中，連接子具有如SEQ ID NO：184-193中之任一者中所闡明之胺基酸序列。
在一些實施例中，連接子可在以下中之至少一者內部裂解：(i)昆蟲之腸道或血淋巴，及(ii)可在哺乳動物之腸道內部裂解。
在一些實施例中，植物、植物組織、植物細胞、或植物種子可用AMP來轉型，其中AMP具有任何前述AMP(例如，在表1或表2中列舉之一或多個AMP)之胺基酸序列、或其編碼多核苷酸。
在一些實施例中，植物、植物組織、植物細胞、或植物種子可用AMP來轉型，該AMP具有選自由SEQ NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169組成之群的胺基酸序列、或其編碼多核苷酸。
在一些實施例中，植物、植物組織、植物細胞、或植物種子可用AMP來轉型，該AMP具有選自由SEQ NO：20、24-26、35-36、38、及40組成之群的胺基酸序列、或其編碼多核苷酸。
在一些實施例中，植物、植物組織、植物細胞、或植物種子可用AMP來轉型，該AMP具有選自由SEQ NO：25、36、38、及40組成之群的胺基酸序列、或其編碼多核苷酸。
在一些實施例中，植物、植物組織、植物細胞、或植物種子可用AMP來轉型，其中AMP為兩種或兩種以上AMP多肽之均聚物或雜聚物，其中各AMP之胺基酸序列相同或不同，或其編碼多核苷酸。
任何前述方法、及/或本文描述之任何方法可用於將如本文描述之AMP或AMP殺昆蟲蛋白中之一或多者併入植物或其植物部分中。例如，本文描述之任何方法可用於將在本揭示案中描述的AMP中之一或多者併入植物中，例如，具有胺基酸序列SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169之AMP，其同樣地在本文中描述。 併入植物中之多核苷酸、由其表現之蛋白
關於異質多肽在轉殖基因植物中之表現的難題為在宿主有機體中表現後，保持所引入多肽之所需效應(例如，殺昆蟲活性)；保持此效應之一種方法為經由使用可操作連接內質網信號肽(ERSP)來增加正確蛋白折疊之機會。保持轉殖基因蛋白之效應的另一種方法為併入轉譯穩定蛋白(STA)。
使用如上所述之任何轉染方法，植物可用編碼包含一或多種AMP之AMP或AMP殺昆蟲蛋白的DNA序列來瞬時或穩定轉染。或者，植物可用編碼AMP之多核苷酸來轉染，其中該AMP可操作地連接至可操作來編碼內質網信號肽(ERSP)；連接子，轉譯穩定蛋白(STA)；或其組合的多核苷酸。例如，在一些實施例中，轉殖基因植物或植物基因組可用編碼內質網信號肽(ERSP)；AMP；及/或間插連接子肽(連接子或L)之多核苷酸序列來轉型，由此導致自待在轉型植物中表現之異質DNA來轉錄mRNA，並且隨後，該mRNA得以轉譯成肽。 內質網信號肽(ERSP)
將重組蛋白亞細胞靶向輸送至ER可經由使用可操作地連接至該重組蛋白之ERSP來達成；此允許此等蛋白之正確組裝及/或折疊，及此等重組蛋白在植物中之較高水準積聚。關於將宿主蛋白區域化成細胞內存儲空間之示例性方法揭示於McCormick等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(2):703-708, 1999；Staub等人, Nature Biotechnology 18:333-338, 2000；Conrad等人, Plant Mol. Biol. 38:101-109, 1998；及Stoger等人, Plant Mol. Biol. 42:583-590, 2000，其揭示內容以全文引用方式併入本文。因此，達成重組蛋白之正確組裝及/或折疊的一種方法為將內質網信號肽(ERSP)可操作地連接至所關注之重組蛋白。
在一些實施例中，將包括內質網信號肽(ERSP)之肽可操作地連接至AMP(稱為ERSP-AMP)，其中該ERSP為該肽之N末端。在一些實施例中，ERSP肽為3個至60個之間之胺基酸長度、5個至50個之間之胺基酸長度、20個至30個之間之胺基酸長度。
在一些實施例中，AMP ORF開始於其5’末端處之 ersp。為了使AMP在其自轉殖基因植物表現時得以正確地折疊及起作用，其必須具有與編碼AMP之多核苷酸在碼組中融合的 ersp核苷酸。在細胞轉譯過程期間，藉由與被稱為信號識別粒子之細胞組分結合，轉譯ERSP可引導所轉譯之AMP插入植物細胞之內質網(ER)中。在ER內，ERSP肽藉由信號肽酶來裂解並且將AMP釋放至ER中，其中AMP在轉譯後修飾過程，例如，形成二硫鍵期間得以正確地折疊。無需任何額外保留蛋白信號，蛋白經由ER來傳送至高爾基體，其中其最終分泌至質膜外部並且進入質外體空間。AMP可在質外體空間中有效地積聚以便達到植物中之殺昆蟲劑量。
ERSP肽在植物轉譯AMP複合物之N末端區域處並且ERSP部分由約3至60個胺基酸組成。在一些實施例中，其為5至50個胺基酸。在一些實施例中，其為10至40個胺基酸，但是最經常由15至20個；20至25個；或25至30個胺基酸組成。ERSP為所謂信號肽，因為其引導蛋白之運輸。信號肽亦可被稱為靶向信號、信號序列、運送肽、或定位信號。用於ER轉運之信號肽通常為15至30個胺基酸殘基長度並且具有三重組織，該組織包含藉由帶正電荷之胺基末端及極性、但是不帶電荷之羧基末端區域來側接的疏水性殘基之核心。(Zimmermann等人, 「Protein translocation across the ER membrane,」 Biochimica et Biohysica Acta, 2011, 1808: 912-924)。
許多ERSP為已知的。不需要ERSP衍生自植物ERSP，非植物ERSP亦對本文所述程序有效。然而，許多植物ERSP為熟知的，並且吾人在本文中描述一些植物衍生ERSP。例如，在一些實施例中，ERSP可為大麥α-澱粉酶信號肽(BAAS)，其源自植物大麥 (Hordeum vulgare)，並且具有如下胺基酸序列：「MANKHLSLSLFLVLLGLSASLASG」(SEQ ID NO:173)。
自已知表現及釋放至植物之質外體空間中的蛋白之基因組序列來選擇的植物ERSP包括諸如BAAS、胡蘿蔔伸展蛋白、及菸草PR1之實例。以下參考文獻提供進一步描述，並且以全文引用方式併入本文：De Loose, M.等人「The extensin signal peptide allows secretion of a heterologous protein from protoplasts」 Gene, 99 (1991) 95-100；De Loose, M.等人描述來自皺葉菸草 (Nicotiana plumbaginifolia)之延伸部分編碼基因之結構分析，其序列含有用於將蛋白轉運至內質網之典型信號肽；Chen, M.H.等人「Signal peptide-dependent targeting of a rice alpha-amylase and cargo proteins to plastids and extracellular compartments of plant cells」 Plant Physiology, 2004年7月; 135(3): 1367-77。Epub 2004年7月2日Chen, M.H.等人藉由分析在具有及不具有其信號肽的情況下，α-澱粉酶在轉殖基因菸草中之表現，研究α-澱粉酶在植物細胞中之亞細胞定位。此等參考文獻及其他文獻教導及揭示可用於本文所述方法、程序及肽、蛋白及核苷酸複合物及構築體中之信號肽。
在一些實施例中，ERSP可包括但是不限於以下中之一者：BAAS；菸草伸展蛋白信號肽；經修飾之菸草伸展蛋白信號肽；或來自阿希刺柏 (Juniperus ashei)之Jun a 3信號肽。例如，在一些實施例中，植物可用編碼在本文中描述為內質網信號肽(ERSP)之任何肽、及AMP的核苷酸來轉型。
菸草伸展蛋白信號肽模體為另一種示例性類型之ERSP。參見Memelink等人, the Plant Journal, 1993, V4: 1011-1022；Pogue GP等人, Plant Biotechnology Journal, 2010, V8: 638-654，其揭示內容以全文引用方式併入本文。
在一些實施例中，AMP ORF可具有可操作來編碼菸草伸展蛋白信號肽模體之核苷酸序列。在一個實施例中，AMP ORF可編碼根據SEQ ID NO:174之伸展蛋白模體。在另一實施例中，AMP ORF可編碼根據SEQ ID NO:175之伸展蛋白模體。
如何產生具有伸展蛋白信號模體之實施例的示例性實例如下：使用具有四個合成DNA引子之寡核苷酸延伸PCR來設計編碼伸展蛋白模體之DNA序列(例如，SEQ ID NO:176或SEQ ID NO:177展示之DNA序列)；可使用以伸展蛋白DNA序列來充當模板的PCR，添加末端位點諸如限制位點，例如，5’末端處之Pac I限制位點，及3’末端處之GFP序列之5’末端，並且產生片段；該片段用作正向PCR引子以便擴增編碼AMP ORF之DNA序列，例如包含於pFECT載體中之「 gfp-l-amp」，由此產生編碼(自N’至C’末端)「ERSP-GFP-L-AMP」之AMP ORF，其中ERSP為伸展蛋白。然後，所得DNA序列可選殖至FECT載體之Pac I及Avr II限制位點中以便產生用於GFP融合AMP之瞬時植物表現的pFECT-AMP載體。
在一些實施例中，示例性表現系統可包括將含有AMP ORF之FECT表現載體轉型至農桿菌GV3101中，並且將轉型GV3101注射至菸草葉子中以便瞬時表現AMP ORF。 轉譯穩定蛋白(STA)
轉譯穩定蛋白(STA)可增加植物組織中之AMP之量。AMP ORF中之一者，亦即，ERSP-AMP，可足以在轉染植物中表現正確折疊之AMP；然而，在一些實施例中，有效保護植物避免害蟲破壞可能需要植物表現之AMP有所積累。藉由正確構築之AMP ORF之轉染，轉殖基因植物可表現及積累更大量之正確折疊AMP。當植物積累更大量之正確折疊AMP時，其可更容易地抵抗、抑制、及/或殺傷攻擊及侵蝕植物之害蟲。一種增加在轉殖基因組織中之多肽之積聚的方法為經由使用轉譯穩定蛋白(STA)。轉譯穩定蛋白可用於顯著增加植物組織中之AMP之積聚，並且由此增加用AMP轉染之植物關於害蟲抗性之功效。轉譯穩定蛋白為具有足夠三級結構以使得其可在細胞中積聚而不被蛋白降解之細胞性過程所靶向的蛋白。
在一些實施例中，轉譯穩定蛋白可為另一個蛋白之域，或其可包含整個蛋白序列。在一些實施例中，轉譯穩定蛋白可在5與50個胺基酸、50至250個胺基酸(例如，GNA)、250至750個胺基酸(例如，殼質酶)及750至1500個胺基酸(例如，增強素)之間。
轉譯穩定蛋白之一個實施例可為包含至少一種AMP之融合蛋白之聚合物。本文提供轉譯穩定蛋白之特定實例以便示出轉譯穩定蛋白之用途。該實例不意欲以任何方式限制本揭示案或申請專利範圍。可用轉譯穩定蛋白在此項技術中為熟知的，並且此類型之任何蛋白可如本文揭示來使用。評估及測試肽之產生的程序在此項技術中已知並且在本文中描述。一種轉譯穩定蛋白之一個實例為綠色螢光蛋白(GFP)(SEQ ID NO:178；NCBI登錄號P42212.1)。
在一些實施例中，包含內質網信號肽(ERSP)之蛋白可操作地連接至AMP，其進而可操作地連接至轉譯穩定蛋白(STA)。在本文中，此組態稱為ERSP-STA-AMP或ERSP-AMP-STA，其中該ERSP為該蛋白之N末端並且該STA可在AMP之N末端側(上游)，或AMP之C末端側(下游)。在一些實施例中，包含本文所述任何ERSP或AMP的稱為ERSP-STA-AMP或ERSP-AMP-STA的蛋白，可操作地連接至STA，例如，所描述或由此文件教導之任何轉譯穩定蛋白，包括GFP(綠色螢光蛋白；SEQ ID NO:178；NCBI登錄號P42212)，或Jun a 3 (阿希刺柏；SEQ ID NO:179；NCBI登錄號P81295.1)。
轉譯穩定蛋白之額外實例可發現於以下參考文獻中，其揭示內容以全文引用方式併入本文：Kramer, K.J.等人「Sequence of a cDNA and expression of the gene encoding epidermal and gut chitinases of Manduca sexta」 Insect Biochemistry and Molecular Biology，第23卷，第6期，1993年9月，第691-701頁。Kramer, K.J.等人將來自菸草天蛾幼蟲菸草天蛾(Manduca sexta)之殼質酶編碼cDNA分離並且測序。Hashimoto, Y.等人「Location and nucleotide sequence of the gene encoding the viral enhancing factor of the Trichoplusia ni granulosis virus」 Journal of General Virology, (1991), 72, 2645-2651。此等參考文獻及其他文獻教導及揭示可用於本文所述方法、程序及肽、蛋白及核苷酸複合物及構築體中之轉譯穩定蛋白。
在一些實施例中，可使用含有STA之AMP ORF，將AMP ORF轉型至植物，例如，菸草植物本氏菸 (Nicotiana benthamiana)中。例如，在一些實施例中，STA可為Jun a 3。成熟Jun a 3為約30 kDa植物保護蛋白，對於一些人而言，其亦為變應原。Jun a 3由阿希刺柏樹產生並且在一些實施例中，可用作轉譯穩定蛋白(STA)。在一些實施例中，Jun a 3胺基酸序列可為SEQ ID NO:179展示之序列。在其他實施例中，Jun a 3胺基酸序列可為SEQ ID NO:180展示之序列。 連接子
連接子蛋白有助於構成AMP ORF之不同模體的正確折疊。本發明所描述之AMP ORF亦在編碼AMP( amp)與轉譯穩定蛋白( sta)之多核苷酸序列之間併入編碼間插連接子肽之多核苷酸序列，或若表現ORF涉及多個AMP域表現，則在對編碼AMP之多個多核苷酸序列，亦即， (l-amp) N 或 (amp-l) N 進行編碼的多核苷酸序列之間進行併入。間插連接子肽(連接子或L或連接)分離所表現AMP構築體之不同部分，並且在表現過程期間，有助於複合物之不同部分之正確折疊。在所表現AMP構築體中，可涉及不同間插連接子肽以便分離不同功能域。在一些實施例中，連接子連接至AMP並且此二價基團可重複多達10(N=1-10)及可能甚至超過10次(例如，N=200)以便促進正確折疊之AMP在待保護之植物中之積聚。
在一些實施例中，間插連接子肽可為1個與30個之間之胺基酸長度。然而，其不一定為植物中表現之AMP之必需部件。
在一些實施例中，AMP殺昆蟲蛋白包含至少一個可操作地連接至可裂解肽之AMP。在其他實施例中，AMP殺昆蟲蛋白包含至少一個可操作地連接至不可裂解肽之AMP。
可裂解連接子肽可在AMP ORF中被設計成將AMP自所表現AMP複合物中正確地釋放於轉型植物中，以及改良AMP向植物提供的關於害蟲破壞之防護。一種類型之間插連接子肽為植物可裂解連接子肽。此類型之連接子肽可在植物轉譯後修飾期間，自所表現AMP ORF複合物中完全移除。因此，在一些實施例中，在植物中之轉譯後修飾期間，藉由此類型之間插連接子肽來連接之正確折疊AMP可自所表現AMP ORF複合物中釋放於植物細胞中。
另一種類型之可裂解間插連接子肽在植物中之表現過程期間為不可裂解的。然而，其具有對於絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸蛋白酶或金屬蛋白酶具有特異性之蛋白酶裂解位點。該類型之可裂解連接子肽可藉由發現於昆蟲及鱗翅目腸道環境及/或昆蟲血淋巴及鱗翅目血淋巴環境中之蛋白酶來消化以便將AMP釋放於昆蟲腸道或血淋巴中。使用藉由本揭示案教導之資訊，熟習此項技術者可常規地產生或發現適用於本發明中之連接子之其他實例。
在一些實施例中，AMP ORF可含有可裂解類型之間插連接子，例如，SEQ ID NO:181列出之類型，其具有胺基酸密碼「IGER」(SEQ ID NO:181)。此間插連接子或連接子之分子量為473.53道爾頓。在其他實施例中，間插連接子肽(連接子)亦可為不具有任何類型蛋白酶裂解位點之肽，亦即，不可裂解間插連接子肽，例如，連接子「EEKKN」(SEQ ID NO：182)或「ETMFKHGL」(SEQ ID NO:183)。
在一些實施例中，AMP殺昆蟲蛋白可具有兩個或兩個以上可裂解肽，其中殺昆蟲蛋白包含昆蟲可裂解連接子(L)，該昆蟲可裂解連接子在碼組中與包含(AMP-L) n之構築體融合，其中「n」為1至200、或1至100、或1至10範圍內之整數。在另一實施例中，本文所述AMP殺昆蟲蛋白包含內質網信號肽(ERSP)，該肽與可操作地連接至昆蟲可裂解連接子(L)之AMP及/或重複構築體(L-AMP) n或(AMP-L) n可操作地連接，其中n為1至200、或1至100、或1至10範圍內之整數。
在一些實施例中，包含內質網信號肽(ERSP)之蛋白可操作地連接至AMP及間插連接子肽(L或連接子)；此構築體稱為ERSP-L-AMP、或ERSP-AMP-L，其中該ERSP在該蛋白之N末端，並且該L或連接子可在AMP之N末端側(上游)，或AMP之C末端側(下游)。包含本文所述任何ERSP或AMP的稱為ERSP-L-AMP、或ERSP-AMP-L之蛋白可具有可為不可裂解連接子肽、或可裂解連接子肽的連接子「L」，並且其可在蛋白表現過程期間，在植物細胞中裂解，或可在昆蟲腸道環境及/或血淋巴環境中裂解。
在一些實施例中，AMP殺昆蟲蛋白可包含本文所述或由此文件教導的任何間插連接子肽(連接子或L)，包括但不限於以下序列：IGER(SEQ ID NO:181)、EEKKN(SEQ ID NO:182)、及ETMFKHGL(SEQ ID NO:183)、或其組合。
在一些實施例中，連接子可為以下中之一或多者：ALKFLV (SEQ ID NO: 184)、ALKLFV (SEQ ID NO: 185)、IFVRLR (SEQ ID NO: 186)、LFAAPF (SEQ ID NO: 187)、ALKFLVGS (SEQ ID NO: 188)、ALKLFVGS (SEQ ID NO: 189)、IFVRLRGS (SEQ ID NO: 190)、LFAAPFGS (SEQ ID NO: 191)、LFVRLRGS (SEQ ID NO: 192)、及/或LGERGS (SEQ ID NO: 193)。
在各種實施例中，示例性殺昆蟲蛋白可包括包含以下之蛋白構築體：(ERSP)-(AMP-L) n；(ERSP)-(L)-(AMP-L) n；(ERSP)-(L-AMP) n；(ERSP)-(L-AMP) n-(L)；其中n為1至200或1至100、或1至10範圍內之整數。在如上所述各個相關實施例中，AMP為Av3b突變肽，L為不可裂解或可裂解肽，並且n為1至200範圍內之整數，較佳1至100範圍內之整數，並且更佳1至10範圍內之整數。在一些實施例中，AMP殺昆蟲蛋白可含有相同或不同的AMP肽，及相同或不同的昆蟲可裂解肽。在一些實施例中，C末端AMP在其C端與可操作來在昆蟲腸道環境中裂解之可裂解肽可操作地連接。在一些實施例中，N末端AMP在其N端與可操作來在昆蟲腸道環境中裂解之可裂解肽可操作地連接。
發現於昆蟲腸道環境中之一些可獲得蛋白酶及肽酶取決於昆蟲之生命期，因為此等酶經常在空間上及在時間上表現。昆蟲之消化系統由消化道及相關腺體組成。食物進入嘴部並且與可或可不含有消化蛋白酶及肽酶之分泌物混合。前腸及後腸起源於外胚層。前腸通常充當未加工食物之儲存庫。自前腸，離散食物團進入中腸(中體腔或消化器官)。中腸為食物營養之消化及吸收場所。一般而言，中腸內之某些蛋白酶及肽酶之存在遵循腸道之pH值。人類腸胃系統中之某些蛋白酶及肽酶可包括：胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、彈性蛋白酶、羧肽酶、胺肽酶、及二肽酶。
昆蟲腸道環境包括在消化期間，肽及蛋白在其中得以降解的食草動物物種中之消化系統區域。發現於昆蟲腸道環境中之一些可獲得蛋白酶及肽酶可包括：(1)絲胺酸蛋白酶；(2)半胱胺酸蛋白酶；(3)天冬胺酸蛋白酶，及(4)金屬蛋白酶。
食植物昆蟲之消化系統中之兩個主要蛋白酶類別為絲胺酸及半胱胺酸蛋白酶。Murdock等人(1987)進行屬鞘翅目之各種害蟲之中腸酶的詳盡研究，而Srinivasan等人(2008)報導屬鱗翅目之各種害蟲之中腸酶。已知絲胺酸蛋白酶支配幼蟲腸道環境並且佔鱗翅目中之總消化活動之約95%，而鞘翅目物種具有更寬範圍之佔優勢腸道蛋白酶，包括半胱胺酸蛋白酶。
木瓜蛋白酶家族含有具有各種活性之肽酶，包括具有廣泛特異性之內肽酶(諸如木瓜蛋白酶)、具有非常窄特異性之內肽酶(諸如甘胺醯內肽酶)、胺基肽酶、二肽基-肽酶、及具有內肽酶及外肽酶活性之肽酶(諸如組織蛋白酶B及H)。發現於各種昆蟲之中腸內之其他示例性蛋白酶包括胰蛋白酶樣酶，例如胰蛋白酶及糜蛋白酶、胃蛋白酶、羧肽酶-B及胺基三肽酶。
絲胺酸蛋白酶廣泛地分佈於幾乎所有動物及微生物中(Joanitti等人，2006)。在高等有機體中，幾乎2%之基因編碼此等酶(Barrette-Ng等人，2003)。對於其宿主有機體之維持及存活實質上必不可少的，絲胺酸蛋白酶在許多生物過程中發揮關鍵作用。絲胺酸蛋白酶經典地藉由其受質特異性來分類，尤其藉由是否P1處之殘基為胰蛋白酶樣(在P1處，較佳為Lys/Arg)、糜蛋白酶樣(在P1處，較大疏水性殘基諸如Phe/Tyr/Leu)、或彈性蛋白酶樣(在P1處，較小疏水性殘基諸如Ala/Val)(藉由Tyndall等人修正，2005)。絲胺酸蛋白酶為一種類別之蛋白分解酶，其核心催化機制由作為「催化三聯體」之三個不變殘基組成，天冬胺酸、組胺酸及獨特反應性絲胺酸，後者產生其名稱。Asp-His-Ser三聯體可發現於至少四個不同結構情形中(Hedstrom，2002)。絲胺酸蛋白酶之此等四個家族以糜蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶Y、及Clp蛋白酶為代表。已最詳細研究之糜蛋白酶樣家族之三個絲胺酸蛋白酶為糜蛋白酶、胰蛋白酶、及彈性蛋白酶。最近，具有新穎催化三聯體及二聯體之絲胺酸蛋白酶由於其在消化中之作用而被發現，包括Ser-His-Glu、Ser-Lys/His、His-Ser-His、及N末端Ser。
發現於昆蟲之腸道環境中的一種類別之經充分研究之消化酶為半胱胺酸蛋白酶之類別。術語「半胱胺酸蛋白酶」意欲描述在酶之催化位點處具有半胱胺酸殘基之高度反應性硫醇基的蛋白酶。有證據表明，許多食植物昆蟲及植物寄生線蟲至少部分地依賴於中腸半胱胺酸蛋白酶來進行蛋白消化。此等包括但不限於半翅目(Hemiptera)，尤其南瓜蟲(南瓜緣蝽 (Anasa tristis))；綠色臭蟲(擬綠蝽 (Acrosternum hilare))；豆蜂緣蝽 (Riptortus clavatus)；以及迄今為止檢查的幾乎所有鞘翅目，尤其科羅拉多馬鈴薯甲蟲(馬鈴薯葉甲 (Leptinotarsa deaemlineata))；三線馬鈴薯甲蟲(三線負泥蟲 (Lema trilineata))；蘆筍甲蟲(石刁柏負泥蟲 (Crioceris asparagi))；墨西哥豆甲蟲(墨西哥豆象 (Epilachna varivestis))；紅麵粉甲蟲 (赤擬穀盜 (Triolium castaneum))；混合麵粉甲蟲(雜擬穀盜 (Tribolium confusum))；跳蚤甲蟲(凹脛跳甲 (Chaetocnema)某些種、跳甲 (Haltica)某些種及毛跳甲 (Epitrix)某些種)；玉米根蟲(葉甲 (Diabrotica)某些種)；豇豆象鼻蟲(四紋豆象 (Callosobruchus aculatue))；棉鈴象鼻蟲(棉鈴象甲 (Antonomus grandis))；水稻象鼻蟲(米象 (Sitophilus oryza))；玉米象鼻蟲(玉米象 (Sitophilus zeamais))；糧倉象鼻蟲(穀象 (Sitophilus granarius))；埃及苜蓿象鼻蟲(紫苜蓿葉象 (Hypera postica))；豆象鼻蟲(菜豆象 (Acanthoseelides obtectus)))；小螟蟲(穀蠹 (Rhyzopertha dominica))；黃粉蟲(黃粉甲 (Tenebrio molitor))；纓翅目 (Thysanoptera)，尤其西部花薊馬(西花薊馬 (Franklini ella occidentalis))；雙翅目(Diptera)，尤其潛葉蟲某些種 (三葉草斑潛蠅 (Liriomyza trifolii))；植物寄生線蟲，尤其馬鈴薯胞囊線蟲 (球異皮線蟲( Globodera)某些種)、甜菜胞囊線蟲(甜菜異皮線蟲 (Heterodera schachtii))及根結線蟲(根結線蟲 (Meloidogyne)某些種)。
另一類別之消化酶為天冬胺酸蛋白酶。術語「天冬胺酸蛋白酶」意欲描述在酶之催化位點處具有兩個高度反應性天冬胺酸殘基之蛋白酶並且最經常藉由其經由胃酶抑素之特異性抑制來表徵，該胃酶抑素為幾乎所有已知天冬胺酸蛋白酶之低分子量抑制劑。有證據表明，許多食植物昆蟲部分地依賴於中腸天冬胺酸蛋白酶以便最經常與半胱胺酸蛋白酶聯合來進行蛋白消化。此等包括但不限於半翅目(尤其長紅獵蝽 (Rhodnius prolixus))及臭蟲(床蝨 (Cimex)某些種)以及瘤蝽科 (Phymatidae)、蝽科 (Pentatomidae)、長蝽科 (Lygaeidae)及負子蝽科 (Belostomatidae)科之成員；在芫菁科 (Meloidae)、葉甲科 (Chrysomelidae)、瓢蟲科 (Coccinelidae)及豆象科 (Bruchidae)中之鞘翅目，均屬於扁蟲下目 (Cucujiformia)系列，尤其科羅拉多馬鈴薯甲蟲(馬鈴薯葉甲(Leptinotarsa decemlineata))三線馬鈴薯甲蟲(三線負泥蟲( Lematri lineata))；南部及西部玉米根蟲(十一星黃瓜甲蟲 (Diabrotica undecimpunctata)及玉米根葉甲 (D. virgifera))、棉鈴象鼻蟲(棉鈴象甲 (Anthonomus grandis))、南瓜蟲(南瓜緣蝽( Anasatritis))；跳蚤甲蟲(十字花菜跳甲 (Phyllotreta crucifera))、豆象甲蟲(四紋豆象 (Callosobruchus maculatus))、墨西哥豆甲蟲(墨西哥豆象 (Epilachna varivestis))、大豆潛葉蟲(大豆潛葉蟲 (Odontota horni))、具緣斑蝥(原野豆芫菁 (Epicauta pesifera))及紅麵粉甲蟲(赤擬穀盜( Triolium castaneum))；雙翅目，尤其蒼蠅(家蠅 (Musca domestica))。參見 Terra及Ferreira (1994) Comn. Biochem. Physiol. 109B: 1-62; Wolfson及Murdock (1990) J. Chem. Ecol. 16: 1089-1102。
間插連接子肽之其他實例可發現於以下參考文獻中，其以全文引用方式併入本文：發現植物表現絲胺酸蛋白酶抑制劑前體含有藉由六個相同連接子肽來分離之五種均質蛋白抑制劑，如藉由Heath等人「Characterization of the protease processing sites in a multidomain proteinase inhibitor precursor from Nicotiana alata」 European Journal of Biochemistry, 1995; 230: 250-257所揭示。綠色螢光蛋白經由六種不同連接子之折疊行為之比較在Chang, H.C.等人「De novo folding of GFP fusion proteins: high efficiency in eukaryotes but not in bacteria」 Journal of Molecular Biology, 2005年10月21日; 353(2): 397-409中進行研究。藉由Daskalova, S.M.等人「Engineering of N. benthamianaL. plants for production of N-acetylgalactosamine-glycosylated proteins」 BMC Biotechnology, 2010年8月24日; 10: 62，證明人類GalNAc-Ts家族之同功異型物GalNAc-T2在本氏菸 (N. benthamiana)植物中表現後保持其定位及功能性。內源性質體蛋白行進穿過質體微管結構之能力在Kwok, E.Y.等人「GFP-labelled Rubisco and aspartate aminotransferase are present in plastid stromules and traffic between plastids」 Journal of Experimental Botany, 2004年3月; 55(397): 595-604. Epub 2004年1月30日中得到證明。關於使用一種蚊子十肽激素，胰蛋白酶調節抑制因子(TMOF)來對菸草嵌紋病毒(TMV)病毒顆粒之表面進行工程化的報導由Borovsky, D.等人「Expression of Aedes trypsin-modulating oostatic factor on the virion of TMV: A potential larvicide」 Proc Natl Acad Sci, 2006年12月12日; 103(50): 18963–18968作出。此等參考文獻及其他文獻教導及揭示可用於本文所述方法、程序及肽、蛋白及核苷酸複合物及構築體中之間插連接子。 AMP ORF及AMP構築體
「AMP ORF」係指編碼AMP、及/或一或多種穩定蛋白、分泌信號、或目標引導信號例如ERSP或STA之核苷酸，並且定義為具有被轉譯之能力的ORF中之核苷酸。因此，「AMP ORF圖表」係指以圖表或等式形式來書寫的一或多個AMP ORF之組成。例如，「AMP ORF圖表」可使用在表現ORF內所包含之DNA區段之縮寫字或簡寫引用來書寫。因此，在一個實例中，「AMP ORF圖表」可藉由分別以等式形式將DNA區段圖示為「 ersp」(亦即，編碼ERSP多肽之多核苷酸序列)；「 連接子」或「 L」(亦即，編碼連接子多肽之多核苷酸序列)；「 sta」(亦即，編碼STA多肽之多核苷酸序列)，及「 amp」(亦即，編碼AMP之多核苷酸序列)來描述編碼ERSP、連接子、STA、及AMP之多核苷酸區段。AMP ORF圖表之實例為「 ersp- sta-( 連接子 i- amp j) N」、或「 ersp-(amp j- 連接子 i ) N-sta 」及/或其DNA區段之任何組合。
以下等式描述編碼ERSP、STA、連接子、及AMP的AMP ORF之兩個實例： ersp-sta-l-amp或 ersp-amp-l-sta
在一些實施例中，本文所述AMP開放讀框(ORF)為使得植物能夠表現mRNA之多核苷酸序列，該mRNA進而轉譯成肽，該等肽正確地折疊，且/或積累至該等蛋白提供足以抑制及/或殺傷一或多種害蟲之劑量的程度。在一個實施例中，蛋白AMP ORF之實例可為Av3b突變多核苷酸( amp)，「 ersp」(亦即，編碼ERSP多肽之多核苷酸序列)「 連接子」(亦即，編碼連接子多肽之多核苷酸序列)，「 sta」(亦即，編碼STA多肽之多核苷酸序列)，或其任何組合，並且可以下列等式形式來描述： ersp- sta-( 連接子 i- amp j) n、或 ersp-(amp j- 連接子 i ) n-sta
多核苷酸等式之前述示例性實施例導致以下蛋白複合物得以表現：ERSP-STA-(連接子 I-AMP J) N，其含有四個可能肽組分，其中破折號分隔各個組分。 ersp之核苷酸組分為編碼植物內質網轉運信號肽(ERSP)之多核苷酸區段。 sta之組分為編碼轉譯穩定蛋白(STA)之多核苷酸區段，該蛋白有助於在植物中表現之AMP之積聚，然而，在一些實施例中，包含 sta可在AMP ORF中並非必要的。 連接子 i之組分為編碼間插連接子肽(L或連接子)之多核苷酸區段，該肽將AMP與包含於ORF中之其他組分、及轉譯穩定蛋白分離。下標字母「i」指示在一些實施例中，不同類型之連接子肽可用於AMP ORF中。組分「 amp」指示編碼AMP之多核苷酸區段。下標「j」指示不同多核苷酸可包含於AMP ORF中。例如，在一些實施例中，多核苷酸序列可編碼具有不同胺基酸取代之AMP。下標「 n」，如在「( 連接子 i- amp j) n」中展示，指示核苷酸編碼間插連接子肽及AMP之結構可在同一AMP ORF中之同一開放讀框中重複「n」次，其中「n」可為1至10之任何整數；「n」可為1至10，尤其「n」可為1、2、3、4、或5，並且在一些實施例中「n」為6、7、8、9或10。重複序列可含有編碼不同間插連接子(連接子)及不同AMP之多核苷酸區段。包括同一AMP ORF內之重複序列的不同多核苷酸區段都在同一轉譯碼組中。在一些實施例中，可能不需要在AMP ORF中包含 sta多核苷酸。例如， ersp多核苷酸序列可直接連接至編碼沒有連接子之AMP變異體多核苷酸的多核苷酸。
在前述示例性等式中，編碼多肽「AMP」之多核苷酸「 amp」可為編碼本文所述任何AMP之多核苷酸序列，例如，包含與根據式(I)：X 1-S-C-C-P-C-Y-W-X 2-X 3-C-P-W-G-Q-X 4-C-Y-P-X 5-G-C-X 6-G-X 7-X 8-X 9-X 10之胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致的胺基酸序列的AMP;其中相對於在SEQ ID NO:1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；其中X 1為K、H、Q、T、S、N、E、I、L、或V；X 2為G、P、或A；X 3為G、或N；X 4為N或D；X 5為E、D、或N；X 6為S、D、G、T、V、或R；X 7為P或不存在；X 8為K、H、A、R、G、T、D、或不存在；X 9為G、V、或不存在；X 10為G、I、或不存在；或其互補核苷酸序列。
在前述示例性等式中，編碼多肽「AMP」之多核苷酸「 amp」可為編碼本文所述任何AMP之多核苷酸序列，例如，包含與根據式(II)：K-S-C-C-P-C-Y-W-G-G-C-P-W-G-Q-X 1-C-Y-P-X 2-G-C-X 3-G-P-X 4-X 5-X 6之胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致的胺基酸序列的AMP；其中相對於在SEQ ID NO:1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；X 1為N或D；X 2為E、D、或N；X 3為S、D、R、或G；X 4為K、G、或D；X 5為V或不存在；或其互補核苷酸序列。
在一些實施例中， amp多核苷酸、或可操作來編碼AMP之多核苷酸可編碼AMP，該AMP包含與根據式(I)：X 1-S-C-C-P-C-Y-W-X 2-X 3-C-P-W-G-Q-X 4-C-Y-P-X 5-G-C-X 6-G-X 7-X 8-X 9-X 10之胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致的胺基酸序列；其中相對於在SEQ ID NO:1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；其中X 1為K、H、Q、T、S、N、E、I、L、或V；X 2為G、P、或A；X 3為G、或N；X 4為N或D；X 5為E、D、或N；X 6為S、D、G、T、V、或R；X 7為P或不存在；X 8為K、H、A、R、G、T、D、或不存在；X 9為G、V、或不存在；X 10為G、I、或不存在；或其互補核苷酸序列。
在一些實施例中， amp多核苷酸、或可操作來編碼AMP之多核苷酸可編碼AMP，該AMP包含與根據式(II)：K-S-C-C-P-C-Y-W-G-G-C-P-W-G-Q-X 1-C-Y-P-X 2-G-C-X 3-G-P-X 4-X 5-X 6之胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致的胺基酸序列；其中相對於在SEQ ID NO:1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；X 1為N或D；X 2為E、D、或N；X 3為S、D、R、或G；X 4為K、G、或D；X 5為V或不存在；或其互補核苷酸序列。
在一些實施例中， amp多核苷酸、或可操作來編碼AMP之多核苷酸可編碼AMP，該AMP包含與如在SEQ ID NOs: 6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169中之任一者中闡明之胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致的胺基酸序列：
在一些實施例中，多核苷酸可操作來編碼具有以下AMP構築體取向及/或排列之AMP殺昆蟲蛋白：ERSP-AMP；ERSP-(AMP) N；ERSP-AMP-L；ERSP-(AMP) N-L；ERSP-(AMP-L) N；ERSP-L-AMP；ERSP-L-(AMP) N；ERSP-(L-AMP) N；ERSP-STA-AMP；ERSP-STA-(AMP) N；ERSP-AMP-STA；ERSP-(AMP) N-STA；ERSP-(STA-AMP) N；ERSP-(AMP-STA) N；ERSP-L-AMP-STA；ERSP-L-STA-AMP；ERSP-L-(AMP-STA) N；ERSP-L-(STA-AMP) N；ERSP-L-(AMP) N-STA；ERSP-(L-AMP) N-STA；ERSP-(L-STA-AMP) N；ERSP-(L-AMP-STA) N；ERSP-(L-STA) N-AMP；ERSP-(L-AMP) N-STA；ERSP-STA-L-AMP；ERSP-STA-AMP-L；ERSP-STA-L-(AMP) N；ERSP-(STA-L) N-AMP；ERSP-STA-(L-AMP) N；ERSP-(STA-L-AMP) N；ERSP-STA-(AMP) N-L；ERSP-STA-(AMP-L) N；ERSP-(STA-AMP) N-L；ERSP-(STA-AMP-L) N；ERSP-AMP-L-STA；ERSP-AMP-STA-L；ERSP-(AMP) N-STA-L ERSP-(AMP-L) N-STA；ERSP-(AMP-STA) N-L；ERSP-(AMP-L-STA) N；或ERSP-(AMP-STA-L) N；其中N為1至200範圍內之整數。
任何前述方法、及/或本文描述之任何方法可用於將一或多個多核苷酸併入植物或其植物部分中，該多核苷酸可操作來表現如本文描述之AMP或AMP殺昆蟲蛋白中之任何一者或多者；例如，具有胺基酸序列SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169之一或多種AMP或AMP殺昆蟲蛋白，其同樣地在本文中描述。
本揭示案可用於轉型任何植物物種，包括但不限於單子葉植物及雙子葉植物。轉殖基因方法或PEP將為特別有用方法之作物包括但不限於：苜蓿、棉花、番茄、玉米、小麥、玉米、甜玉米、紫苜蓿、大豆、高粱、豌豆、亞麻籽、紅花、油菜籽、油菜、水稻、大豆、大麥、向日葵、樹木(包括針葉及落葉)、花卉(包括商業化及溫室種植之彼等)、羽扇豆、柳枝稷、甘蔗、土豆、西紅柿、菸草、十字花科植物、辣椒、甜菜、大麥及油菜、蕓苔屬、黑麥、小米、花生、甘藷、木薯、咖啡、椰子、菠蘿、柑橘樹、可可、茶、香蕉、鱷梨、無花果、番石榴、芒果、橄欖、木瓜、腰果、澳洲堅果、杏仁、燕麥、蔬菜、觀賞植物及針葉樹。 用多核苷酸來轉型植物
在一些實施例中，如以上及在本文中所述之AMP ORF及AMP構築體可選殖至任何植物表現載體中以便AMP在植物中瞬時或穩定表現。
瞬時植物表現系統可用於針對在植物中之一些特定AMP表現，即時最佳化AMP ORF之結構，包括必要的一些組分、一些組分之密碼子最佳化、各組分之順序之最佳化等。瞬時植物表現載體經常衍生自植物病毒基因組。由於植物病毒之感染性質，植物病毒載體提供在植物中之快速及較高水準外來基因表現的優勢。植物病毒基因組之全長可用作載體，但是通常，使例如外殼蛋白之病毒組分缺失，並且將轉殖基因ORF次選殖在彼位置中。AMP ORF可次選殖至此部位中以便產生病毒載體。此等病毒載體可以機械方式引入植物中，因為其例如經由植物傷口、噴塗等而本身具有感染性。其亦可經由農桿菌感染，藉由將病毒載體選殖至冠癭細菌根癌農桿菌、或發根細菌發根農桿菌 (Agrobacterium rhizogenes)之T-DNA中來轉染至植物中。AMP在此載體中之表現藉由RNA病毒之複製來控制，並且病毒轉譯成用於複製之mRNA藉由強病毒啟動子，例如，來自花椰菜嵌紋病毒之35S啟動子來控制。具有AMP ORF之病毒載體通常選殖至二元載體之T-DNA區域中，該載體可在大腸桿菌菌株及農桿菌菌株兩者中自身複製。植物之瞬時轉染可藉由用含有用於AMP表現之病毒載體的農桿菌細胞來浸潤植物葉子而進行。在瞬時轉型植物中，通常外來蛋白表現由於轉錄後基因緘默(PTGS)而停止一段較短時間。有時，需要將PTGS抑制蛋白基因與驅動AMP ORF之表現的相同類型之病毒載體一起瞬時共轉型至植物中。此舉改良及延長植物中之AMP之表現。最通常使用之PTGS抑制蛋白為自番茄叢矮病毒(TBSV)發現之P19蛋白。
在一些實施例中，植物之瞬時轉染可藉由將編碼AMP之多核苷酸與易於得到載體(參見上文及本文所述)中之任一者重組來達成，並且使用標誌物或信號(例如，GFP發射)來確認。在一些實施例中，瞬時轉染植物可藉由將編碼AMP之多核苷酸與編碼GFP-雜交體融合蛋白之DNA在載體中重組，並且使用被設計來靶向表現之不同FECT載體，將該載體轉染至植物(例如，菸草)中來產生。在一些實施例中，編碼AMP之多核苷酸可與用於APO(非原質體定位)積累之pFECT載體；用於CYTO(細胞質定位)積累之pFECT載體；或用於ER(內質網定位)積累之具有ersp之pFECT載體重組。
示例性瞬時植物轉型策略為使用植物病毒載體之農桿菌感染，此舉歸因於其高效率、簡易性、及低成本。在一些實施例中，菸草嵌紋病毒過度表現系統可用於以AMP來將植物瞬時轉型。參見TRBO, Lindbo JA, Plant Physiology, 2007, V145: 1232-1240，其揭示內容以全文引用方式併入本文。
TRBO DNA載體具有用於農桿菌感染之T-DNA區域，其含有驅動菸草嵌紋病毒RNA之表現之CaMV 35S啟動子，而沒有編碼病毒披蓋蛋白之基因。另外，此系統使用「解毒」病毒基因組，因此可有效地預防病毒植物至植物傳遞。
在另一實施例中，FECT病毒瞬時植物表現系統可用於以AMP來將植物瞬時轉型。參見Liu Z及Kearney CM, BMC Biotechnology, 2010, 10:88，其揭示內容以全文引用方式併入本文。FECT載體具有用於農桿菌感染之T-DNA區域，其含有驅動狐尾草嵌紋病毒RNA之表現之CaMV 35S啟動子，而沒有編碼病毒披蓋蛋白之基因及三重基因塊。另外，此系統使用「解毒」病毒基因組，因此可有效地預防病毒植物至植物傳遞。為了有效地表現所引入異源基因，FECT表現系統另外需要共表現P19，一種來自番茄叢矮病毒之RNA緘默抑制蛋白，以便預防所引入T-DNA之轉錄後基因緘默(PTGS)(TRBO表現系統不需要共表現P19)。
在一些實施例中，AMP ORF可被設計來編碼可如下描述之一系列轉譯融合結構模體：N’-ERSP-STA-L-AMP-C’其中「N’」及「C’」分別指示N末端及C末端胺基酸，並且ERSP模體可為大麥α-澱粉酶信號肽(BAAS)(SEQ ID NO:173)；穩定蛋白(STA)可為GFP(SEQ ID NO:178)；連接子肽「L」可為IGER(SEQ ID NO:81)在一些實施例中， ersp-sta-l-ampORF可化學合成以便包括限制位點，例如在其5’末端處之Pac I限制位點，及在其3’末端處之Avr II限制位點。在一些實施例中，AMP ORF可選殖至FECT表現載體(pFECT)之Pac I及Avr II限制位點中以便產生用於FECT瞬時植物表現系統之AMP表現載體(pFECT-AMP)。為了最大限度地提高FECT表現系統中之表現，一些實施例可使表現RNA緘默抑制蛋白P19之FECT載體(pFECT-P19)得以產生，以便用於共轉型。
在一些實施例中，載體可經重組以便用於TRBO瞬時植物表現系統中，例如，藉由執行常規PCR程序並且將Not I限制位點添加至如上所述AMP ORF之3’末端，然後將AMP ORF選殖至TRBO表現載體(pTRBO-AMP)之Pac I及Not I限制位點中。
在一些實施例中，根癌農桿菌菌株例如商購GV3101細胞可用於使用一或多種瞬時表現系統例如FECT及TRBO表現系統，將AMP ORF在植物組織(例如，菸草葉子)中進行瞬時表現。此瞬時轉染方案之示例性說明包括以下：GV3101之隔夜培養物可用於接種200 mL Luria-Bertani (LB)培養基；可允許細胞生長至對數期，具有0.5與0.8之間之OD600；然後，細胞可藉由在4℃下以5000 rpm離心10分鐘來沉澱；然後，細胞可用10 mL預冷TE緩衝液(Tris-HCl 10 mM，EDTA 1mM，pH 8.0)來洗滌一次，然後再懸浮於20 mL LB培養基中；然後，GV3101細胞再懸浮液可以250 µL部分分裝於1.5 mL微管中；然後，等分部分可在液體氮中快速冷凍並且儲存於-80℃冷凍器下用於將來轉型。然後，pFECT-AMP及pTRBO-AMP載體可使用如下冷凍-解凍方法來轉型至感受態GV3101細胞中：將所儲存的感受態GV3101細胞在冰上解凍並且與1至5 µg純DNA(pFECT-AMP或pTRBO-AMP載體)混合。將細胞-DNA混合物保持在冰上5分鐘，轉移至-80℃持續5分鐘，並且在37℃水浴中培育5分鐘。然後，冷凍-解凍處理細胞在1 mL LB培養基中稀釋並且在室溫下，在擺動輥道上振盪2至4小時。然後，將細胞-DNA混合物之200 µL等分部分與合適抗生素一起散佈至LB瓊脂板上(10 µg/mL利福平、25 µg/mL慶大黴素、及50 µg/mL卡那徽素可用於pFECT-AMP轉型及pTRBO-AMP轉型兩者)並且在28℃下培育兩天。然後，將所產生轉型菌落採集並且在LB培養基之6 mL等分部分中與合適抗生素一起培養，以便進行轉型DNA分析並且製得轉型GV3101細胞之甘油基料。
在一些實施例中，植物組織例如菸草葉子之瞬時轉型可使用以3 mL無針注射器來注射葉子而執行。在一示例性實例中，將轉型GV3101細胞與合適抗生素(如上所述)一起塗抹至LB板上並且在28℃下培育兩天。將轉型GV3101細胞之菌落接種至5 ml之LB-MESA培養基(補充有10 mM MES，及20 μM乙醯丁香酮之LB培養基)及如上所述相同抗生素，並且在28℃下生長隔夜。將隔夜培養物之細胞藉由在5000 rpm下離心10分鐘來收集並且再懸浮於誘導培養基(10 mM MES、10 mM MgCl 2、100 μM乙醯丁香酮)中，最終OD600為1.0。然後，在室溫下，將細胞在誘導培養基中培育2小時至隔夜，並且然後準備瞬時轉型菸草葉子。藉由使用無附接針之3 mL注射器來注射，可將經處理細胞浸潤至本氏菸植物之附接葉子的下側。
在一些實施例中，可藉由用pFECT-AMP或pTRBO-AMP來轉染一個GV3101細胞群體並且用pFECT-P19來另一個群體，將兩個細胞群體以相等量混合在一起，以便藉由以3 mL注射器注射來浸潤菸草葉子，從而完成瞬時轉型。
穩定整合可操作來編碼AMP之多核苷酸對於本揭示案而言亦為可能的，例如，AMP ORF亦可使用穩定植物轉型技術來整合至植物基因組中，並且因此AMP可在植物中穩定地表現並且在各個世代之間，保護轉型植物。對於穩定轉型植物，AMP表現載體可為圓形或線性。AMP ORF、AMP表現匣、及/或用於穩定植物轉型之具有編碼AMP之多核苷酸的載體應基於熟習此項技術者已知之知識，及/或藉由使用預測性載體設計工具諸如Gene Designer 2.0 (Atum Bio)；VectorBuilder (Cyagen)；SnapGene® viewer；GeneArtTM Plasmid Construction Service (Thermo-Fisher Scientific)；及/或其他商購質體設計服務來謹慎地設計以便在植物中最佳表現。參見 Tolmachov, Designing plasmid vectors. Methods Mol Biol. 2009; 542:117-29。AMP之表現通常藉由促進在轉殖基因植物之一些、或所有細胞中轉錄的啟動子來控制。啟動子可為強植物病毒啟動子，例如，來自花椰菜嵌紋病毒(CaMV)之組成性35S啟動子；其亦可為強植物啟動子，例如，來自擬南芥之氫過氧化物裂解酶啟動子(pHPL)；來自大豆之櫓豆聚泛素(Gmubi)啟動子；來自不同植物物種(大米、玉米、馬鈴薯等)之泛素啟動子等。A植物轉錄終止子經常出現在ORF之終止密碼子之後以便停止RNA聚合酶及mRNA之轉錄。為了評估AMP表現，報導基因可包含於AMP表現載體中，例如，用於GUS染色分析之β-葡糖醛酸酶基因(GUS)、用於在UV光下進行綠色螢光偵測之綠色螢光蛋白(GFP)基因等。對於轉型植物之選擇，選擇標誌基因通常包含於AMP表現載體中。在一些實施例中，標誌基因表現產物可向轉型植物提供針對特定抗生素例如卡那徽素、潮黴素等，或特定除草劑例如草甘磷等之抗性。若採用農桿菌感染技術用於植物轉型，則T-DNA左邊界及右邊界序列亦包含於AMP表現載體中以便將T-DNA部分傳送至植物中。
所構築AMP表現載體可使用許多轉染技術來轉染至植物細胞或組織中。農桿菌感染為使用根癌農桿菌菌株或發根農桿菌菌株來使植物轉型的非常普遍方法。粒子轟擊(亦被稱為基因炮、或生物槍法)技術亦為植物轉染之非常常見方法。其他不太常見轉染方法包括組織電穿孔、碳化矽鬚晶、直接注射DNA等。轉染之後，將轉染植物細胞或組織安置於植物再生培養基上以便使成功轉染植物細胞或組織再生至轉殖基因植物。
轉型植物之評估可在DNA層面、RNA層面及蛋白層面下來完成。穩定轉型植物可在所有此等水準下評估並且瞬時轉型植物通常僅在蛋白層面下評估。為了確保AMP ORF整合至穩定轉型植物之基因組中，基因組DNA可自穩定轉型植物組織中提取以便使用PCR或南方墨點來分析。穩定轉型植物中之AMP之表現可在RNA層面下評估，例如，藉由使用北方墨點或RT-PCR，分析自轉型植物組織提取之總mRNA。轉型植物中之AMP之表現亦可在蛋白層面下直接評估。存在評估轉型植物中之AMP之表現的許多方法。若報導基因包含在AMP ORF中，則可執行報導基因分析，例如，在一些實施例中，可使用GUS報導基因表現之GUS染色分析、GFP報導基因表現之綠色螢光偵測分析、螢光素酶報導基因表現之螢光素酶分析、及/或其他報導技術。
在一些實施例中，總蛋白可自轉型植物組織中提取以便使用評估樣品中之總蛋白水準之Bradford分析來直接評估AMP之表現。
在一些實施例中，可採用分析HPLC層析技術、西方墨點技術、或iELISA分析來定性或定量評估自轉型植物組織中提取之總蛋白樣品中之AMP。AMP表現亦可藉由在昆蟲生物分析中，使用自轉型植物組織提取之總蛋白樣品來評估，例如，在一些實施例中，轉型植物組織或整個轉型植物本身可用於昆蟲生物測定中，以便評估AMP表現及其向植物提供保護之能力。
在一些實施例中，本揭示案之植物、植物組織、植物細胞、植物種子、或其部分可包含一或多種AMP，或其編碼多核苷酸，該AMP包含胺基酸序列，其至少 確認成功轉型
將異源外來DNA引入植物細胞中之後，異源基因在植物基因組中之轉型或整合藉由各種方法來確認，諸如分析與整合基因相關之核酸、蛋白及代謝物。
PCR分析為針對併入基因之存在，在移植至土壤中之前的較早階段，對轉型細胞、組織或枝條進行篩選的快速方法(Sambrook及Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)。PCR使用對於所關注基因或農桿菌載體背景等具有特異性之寡核苷酸引子來執行。
植物轉型可藉由基因組DNA之南方墨點分析來確認(Sambrook及Russell，2001，同上)。通常，總DNA自轉型植物提取，用合適限制酶來消化，在瓊脂糖凝膠中分級並且轉移至硝化纖維素或耐綸膜。然後，根據標準技術(Sambrook及Russell，2001，同上)，膜或「印跡」用例如放射性標記 32P靶DNA片段來探測以便確認所引入基因整合至植物基因組中。
在北方墨點分析中，根據在此項技術中常規使用之標準程序(Sambrook及Russell，2001，同上)，RNA自轉型植物之特定組織中分離，在甲醛瓊脂糖凝膠中分級，並且轉漬至耐綸過濾器上。然後，藉由在此項技術中已知之方法(Sambrook及Russell，2001，同上)，使過濾器雜交至衍生自AMP之放射性探針，對編碼AMP之多核苷酸來編碼之RNA之表現進行測試。
藉由使用結合至存在於AMP上之一或多個抗原決定基的抗體的標準程序(Sambrook及Russell，2001，同上)，可對於轉殖基因植物執行西方墨點法、生物化學分析及其類似分析，以便確認由AMP基因編碼之蛋白之存在。
已開發許多標誌物來確定植物轉型之成功，例如，對於氯黴素、胺基糖苷G418、潮黴素、或類似物之抗性。編碼涉及葉綠體代謝之產物的其他基因亦可用作可選擇標誌物。例如，提供對於諸如草甘磷、溴苯腈、或咪唑啉酮之植物除草劑之抗性的基因可為尤其適用的。此等基因已經報導(Stalker等人(1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314(溴苯腈抗性腈水解酶基因)；及Sathasivan等人(1990) Nucl. Acids Res. 18:2188(AHAS咪唑啉酮抗性基因)。另外，本文揭示之基因可用作評估細菌、酵母、或植物細胞之轉型的標誌物。偵測植物、植物器官(例如，葉子、莖、根等)、種子、植物細胞、繁殖芽體、胚胎或其子代中之轉殖基因之存在的方法在此項技術中為熟知的。在一個實施例中，轉殖基因之存在藉由測試殺害蟲活性來偵測。
表現AMP及/或其編碼多核苷酸之可生育植物可針對殺害蟲活性來測試，並且展示最佳活性之植物被選擇來進一步育種。在此項技術中可獲得分析害蟲活性之方法。一般而言，將蛋白混合並且用於進食分析中。參見，例如Marrone等人(1985) J. of Economic Entomology 78:290-293。
在一些實施例中，評估瞬時轉染程序之成功可基於報導基因例如GFP之表現來確定。在一些實施例中，GFP可在用FECT及/或TRBO載體來轉型之菸草葉子中，在UV光下偵測。
在一些實施例中，AMP表現可在植物(例如，菸草)中定量地評估。示出菸草植物中之AMP量化的示例性程序如下：藉由用1000 µL吸移管尖端之較大開口，將葉子衝孔，收集轉型葉子組織之100 mg圓盤。將所收集葉子組織放置於具有5/32”直徑不銹鋼磨球之2 mL微管中，並且在-80℃下冷凍1小時，然後使用Troemner-Talboys高通量均化器來均化。隨後，將750 µL冰冷TSP-SE1提取溶液(磷酸鈉溶液50 mM，1:100稀釋蛋白酶抑制劑混合物，EDTA 1mM，DIECA 10mM，PVPP 8%，pH 7.0)添加至管中並且渦旋。然後，將微管在室溫下保持靜止15分鐘，然後在4℃下以16,000 g離心15分鐘；獲得100 µL所得上清液並且負載至預Sephadex G-50充填柱中之0.45 µm Millipore MultiScreen過濾器微量滴定板中，其中在底部具有空的接收Costar微量滴定板。然後，在4℃下，將微量滴定板以800 g離心2分鐘。然後，所得過濾溶液，在本文中被稱為菸草葉子之總可溶性蛋白提取物(TSP提取物)，準備定量分析。
在一些實施例中，TSP提取物之總可溶性蛋白濃度可使用Pierce Coomassie Plus蛋白分析來估計。具有已知濃度之BSA蛋白標準可用於產生蛋白定量標準曲線。例如，可將2 µL之各TSP提取物混合至Coomassie Plus蛋白分析套組之200 µL顯色試劑(CPPA試劑)中並且培育10分鐘。然後，可藉由使用SpectroMax-M2板讀取器，使用SoftMax Pro作為控制軟體，讀取OD595，從而評估顯色反應。在來自分別經由FECT及TRBO來轉型之植物的TSP提取物中，總可溶性蛋白之濃度可為約0.788 ± 0.20 µg/µL或約0.533 ± 0.03 µg/µL，並且結果可用於計算用於iELISA分析的TSP中之表現AMP之百分比(%TSP)。
在一些實施例中，間接ELISA(iELISA)分析可用於定量評估用FECT及/或TRBO表現系統來瞬時轉型之菸草葉子中之AMP含量。使用iELISA來量化AMP之示例性實例如下：在Immulon 2HD 96孔板之孔中，5 µL葉子TSP提取物用95 µL之CB2溶液(Immunochemistry Technologies)稀釋，並且必要時執行連續稀釋；然後，在黑暗中，在室溫下，允許自提取物樣品獲得之葉子蛋白塗佈孔壁3小時，並且然後隨後移除CB2溶液；各孔用200 µL PBS(Gibco)洗滌兩次；將150 µL阻滯溶液(用5%脫脂奶粉來阻滯PBS中之BSA)添加至各孔並且在黑暗中，在室溫下培育1小時；移除阻滯溶液，PBS洗滌孔之後，100 µL針對AMP之一級抗體(定製抗體可自ProMab Biotechnologies, Inc.購得；GenScript®；或使用熟習此項技術者易於得到之知識來培育)；將在阻滯溶液中以1:250稀釋度來稀釋之抗體添加至各孔並且在黑暗中，在室溫下培育1小時；將一級抗體移除並且各孔用PBS洗滌4次；將100 µL之HRP偶聯二級抗體(亦即，針對用於產生一級抗體之宿主物種的抗體，其在阻滯溶液中以1:1000稀釋度來使用)添加至各孔並且在黑暗中，在室溫下培育1小時；將二級抗體移除並且孔用100 µL PBS洗滌；將受質溶液(ABTS過氧化物酶受質溶液A及溶液B，KPL之1:1混合物)添加至各孔，並且顯色反應進行直到出現足夠顯色為止；將100 µL過氧化物酶停止溶液添加至各孔來終止反應；使用SpectroMax-M2板讀取器，以SoftMax Pro用作控制軟體，板中之各反應混合物之光吸收率在405 nm下讀取；連續稀釋已知濃度之純AMP樣品可以如上在iELISA分析中所述相同的方式來處理，以便產生質量-吸收率標準曲線用於數量分析。在來自FECT轉型菸草之葉子TSP提取物中，所表現AMP可藉由iELISA以約3.09±1.83 ng/µL來偵測到；並且在來自TRBO轉型菸草之葉子TSP提取物中，以約3.56±0.74 ng/µL偵測到。或者，對於FECT轉型植物而言，所表現AMP可為約0.40%總可溶性蛋白(%TSP)並且在TRBO轉型植物中，為約0.67% TSP。
在一些實施例中，本揭示案提供植物、植物組織、植物細胞、植物種子、或其部分，該植物、植物組織、植物細胞、植物種子、或其部分包含一或多種AMP、或其編碼多核苷酸、基本上由其組成、或由其組成，該AMP包含與根據式(I)：X 1-S-C-C-P-C-Y-W-X 2-X 3-C-P-W-G-Q-X 4-C-Y-P-X 5-G-C-X 6-G-X 7-X 8-X 9-X 10之胺基酸序列至少90%一致之胺基酸序列；其中相對於在SEQ ID NO:1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；其中X 1為K、H、Q、T、S、N、E、I、L、或V；X 2為G、P、或A；X 3為G、或N；X 4為N或D；X 5為E、D、或N；X 6為S、D、G、T、V、或R；X 7為P或不存在；X 8為K、H、A、R、G、T、D、或不存在；X 9為G、V、或不存在；X 10為G、I、或不存在。
在一些實施例中，本揭示案提供植物、植物組織、植物細胞、植物種子、或其部分，該植物、植物組織、植物細胞、植物種子、或其部分包含一或多種AMP、或其編碼多核苷酸、基本上由其組成、或由其組成，該AMP包含與根據式(II)：K-S-C-C-P-C-Y-W-G-G-C-P-W-G-Q-X 1-C-Y-P-X 2-G-C-X 3-G-P-X 4-X 5-X 6之胺基酸序列至少90%一致之胺基酸序列；其中相對於在SEQ ID NO:1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；X 1為N或D；X 2為E、D、或N；X 3為S、D、R、或G；X 4為K、G、或D；X 5為V或不存在。
在一些實施例中，植物、植物組織、植物細胞、植物種子、或其部分具有AMP，其中AMP包含如SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169中之任一者中所闡明之胺基序列、基本上由其組成、或由其組成。
在一些實施例中，植物、植物組織、植物細胞、植物種子、或其部分具有AMP，其中AMP包含如SEQ ID NO：20、24-26、35-36、38、及40中之任一者中所闡明之胺基序列、基本上由其組成、或由其組成。
在一些實施例中，植物、植物組織、植物細胞、植物種子、或其部分具有AMP，其中AMP包含如SEQ ID NO：25、36、38、及40中之任一者中所闡明之胺基序列、基本上由其組成、或由其組成。
在一些實施例中，植物、植物組織、植物細胞、植物種子、或其部分具有AMP，其中AMP進一步包含兩種或兩種以上AMP之均聚物或雜聚物，其中各AMP之胺基酸序列相同或不同。
在一些實施例中，植物、植物組織、植物細胞、植物種子、或其部分具有AMP，其中AMP為包含藉由可裂解或不可裂解連接子來分隔之兩個或兩個以上AMP的融合蛋白，並且其中各AMP之胺基酸序列可相同或不同。
在一些實施例中，植物、植物組織、植物細胞、植物種子、或其部分具有AMP，其中連接子可在昆蟲之腸道或血淋巴、或哺乳動物之腸道內部裂解。
本文所述任何連接子可用於前述植物、植物組織、植物細胞、植物種子、或其植物部分中。 混合物、組成物、及調配物
如本文使用，「v/v」或「%v/v」或「體積比率」係指溶液之體積濃度(「v/v」代表體積比率)。在本文中，當溶液之兩個組分為液體時，可使用v/v。例如，當50 mL之成分X用50 mL水來稀釋時，在100 mL之總體積中，存在50 mL之成分X；因此，此可表示為「成分X 50% v/v」。體積比率百分比(% v/v)計算如下：(溶質之體積(mL)/溶液之體積(100 mL))；例如，% v/v=溶質之mL/100 mL溶液。
如本文使用，「w/w」或「%w/w」或「重量比率」係指溶液之重量濃度，亦即，重量比率百分比(「w/w」代表重量比率)。在本文中，w/w表示100 g溶液或混合物中之成分之克數(g)。例如，由30 g成分X、及70 g水組成之混合物表示為「成分X 30% w/w」。重量比率百分比(% w/w)計算如下：(溶質之重量(g)/溶液之重量(g)) x 100；或(溶質之質量(g)/溶液之質量(g)) x 100。
如本文使用，「w/v」或「% w/v」或「重量與體積之比率」係指溶液之質量濃度，亦即，重量與體積之比率百分比(「w/v」代表重量與體積之比率)。在本文中，w/v表示100 mL溶液中之成分之克數(g)。例如，若使用1 g成分X來構成100 mL之總體積，則產生「成分X之1% w/v溶液」。重量與體積之比率百分比(% w/v)計算如下：(溶質之質量(g)/溶液之體積(mL)) x 100。
本文所述任何AMP或AMP殺昆蟲蛋白(例如，具有如SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169中所闡明之胺基酸序列的AMP，或其農業上可接受之鹽)可用於產生混合物及/或組成物，其中該混合物及/或組成物由至少一種AMP組成。
在一些實施例中，本揭示案包含組合、混合物、或組成物、基本上由其組成、或由其組成，該組合、混合物、或組成物包含一或多種AMP、一或多種AMP殺昆蟲蛋白、及/或其組合，基本上由其組成，或由其組成。
在一些實施例中，本發明涵蓋一或多種AMP、一或多種AMP殺昆蟲蛋白、及/或其組合的混合物。例如，在一些實施例中，一或多種AMP、一或多種AMP殺昆蟲蛋白、及/或其組合可以不同比例來摻合在一起。
在一些實施例中，本發明涵蓋組合一或多種AMP、一或多種AMP殺昆蟲蛋白、及/或其組合。例如，在一些實施例中，一或多種AMP、一或多種AMP殺昆蟲蛋白、及/或其組合可以組合形式提供於例如同一容器中，或不同容器中。
在一些實施例中，本發明涵蓋一或多種AMP、一或多種AMP殺昆蟲蛋白、及/或其組合之組成物。例如，在一些實施例中，一或多種AMP、一或多種AMP殺昆蟲蛋白、及/或其組合可以進一步包含賦形劑之組成物來提供。
在一些實施例中，組合、混合物、或組成物包含具有針對一或多個昆蟲物種之殺昆蟲活性的Av3突變多肽(AMP)、基本上由其組成、或由其組成，該AMP包含胺基酸序列，該胺基酸序列與表1提供之胺基酸序列中之任一者至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致。
在一些實施例中，組合、混合物、或組成物包含具有針對一或多個昆蟲物種之殺昆蟲活性的Av3突變多肽(AMP)、基本上由其組成、或由其組成，該AMP包含胺基酸序列，該胺基酸序列與表2提供之胺基酸序列中之任一者至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致。
在一些實施例中，組合、混合物、或組成物包含具有針對一或多個昆蟲物種之殺昆蟲活性的AMP、基本上由其組成、或由其組成，該AMP包含胺基酸序列，該胺基酸序列與根據式(I)：X 1-S-C-C-P-C-Y-W-X 2-X 3-C-P-W-G-Q-X 4-C-Y-P-X 5-G-C-X 6-G-X 7-X 8-X 9-X 10之胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致；其中相對於在SEQ ID NO:1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；其中X 1為K、H、Q、T、S、N、E、I、L、或V；X 2為G、P、或A；X 3為G、或N；X 4為N或D；X 5為E、D、或N；X 6為S、D、G、T、V、或R；X 7為P或不存在；X 8為K、H、A、R、G、T、D、或不存在；X 9為G、V、或不存在；X 10為G、I、或不存在；或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，組合、混合物、或組成物包含具有針對一或多個昆蟲物種之殺昆蟲活性的AMP、基本上由其組成、或由其組成，該AMP包含胺基酸序列，該胺基酸序列與根據式(II)：K-S-C-C-P-C-Y-W-G-G-C-P-W-G-Q-X 1-C-Y-P-X 2-G-C-X 3-G-P-X 4-X 5-X 6之胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致；其中相對於在SEQ ID NO:1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；X 1為N或D；X 2為E、D、或N；X 3為S、D、R、或G；X 4為K、G、或D；X 5為V或不存在；或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，組合、混合物、或組成物包含AMP、基本上由其組成、或由其組成，該AMP具有如SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169中之任一者中所闡明之胺基序列，或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，組合、混合物、或組成物包含AMP、基本上由其組成、或由其組成，該AMP具有如SEQ ID NO：20、24-26、35-36、38、及40中之任一者中所闡明之胺基序列，或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，組合、混合物、或組成物包含AMP、基本上由其組成、或由其組成，該AMP具有如SEQ ID NO：25、36、38、及40中之任一者中所闡明之胺基序列，或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，本揭示案之組合、混合物、或組成物可包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該胺基酸序列與胺基酸序列「KSCCPCYWGGCPWGQDCYPDGCDGPK」(SEQ ID NO：20)至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致，或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，本揭示案之組合、混合物、或組成物可包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該胺基酸序列與胺基酸序列「KSCCPCYWGGCPWGQDCYPDGCDGPK」(SEQ ID NO：20)至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致，或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，本揭示案之組合、混合物、或組成物可包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該胺基酸序列與胺基酸序列「KSCCPCYWGGCPWGQNCYPNGCSGPK」 (SEQ ID NO: 24)至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致，或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，本揭示案之組合、混合物、或組成物可包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該胺基酸序列與胺基酸序列「KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCDGPK」 (SEQ ID NO: 25)至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致，或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，本揭示案之組合、混合物、或組成物可包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該胺基酸序列與胺基酸序列「KSCCPCYWPGCPWGQNCYPEGCSGPK」 (SEQ ID NO: 26)至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致，或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，本揭示案之組合、混合物、或組成物可包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該胺基酸序列與胺基酸序列「KSCCPCYWPGCPWGQNCYPEGCRGPD」 (SEQ ID NO: 35)至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致，或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，本揭示案之組合、混合物、或組成物可包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該胺基酸序列與胺基酸序列「KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPG」 (SEQ ID NO: 36)至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致，或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，本揭示案之組合、混合物、或組成物可包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該胺基酸序列與胺基酸序列「KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCGGPG」 (SEQ ID NO: 38)至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致，或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，本揭示案之組合、混合物、或組成物可包含胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該胺基酸序列與胺基酸序列「KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPKVG」 (SEQ ID NO: 40)至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致，或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，本揭示案之組合、混合物、或組合物可包含AMP、基本上由其組成、或由其組成，其中該AMP為兩種或兩種以上AMP之均聚物或雜聚物，其中各AMP之胺基酸序列相同或不同。
在一些實施例中，本揭示案之組合、混合物、或組合物可包含AMP、基本上由其組成、或由其組成，該AMP為包含藉由可裂解或不可裂解連接子來分隔之兩個或兩個以上AMP的融合蛋白，並且其中各AMP之胺基酸序列可相同或不同。
在一些實施例中，本揭示案之組合、混合物、或組合物可包含具有連接子之AMP、基本上由其組成、或由其組成，其中連接子為可裂解連接子。
在一些實施例中，本揭示案之組合、混合物、或組合物可包含具有連接子之AMP、基本上由其組成、或由其組成，其中連接子具有如SEQ ID NO：184-193中之任一者中所闡明之胺基酸序列。
在一些實施例中，本揭示案之組合、混合物、或組合物可包含具有連接子之AMP、基本上由其組成、或由其組成，其中連接子可在以下中之至少一者內部裂解：(i)昆蟲之腸道或血淋巴，及(ii)可在哺乳動物之腸道內部裂解。
用本文所述可操作來表現AMP之多核苷酸來轉型之任何組成物、產品、蛋白、多肽、肽、及/或植物可用於防治害蟲、其生長、及/或由其作用所造成之破壞，尤其其對於植物之破壞。
包含AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽的組成物，例如，農用化學品組成物，可包括但不限於氣溶膠及/或氣溶膠化產品，例如，噴霧劑、薰蒸劑、散劑、粉劑、及/或氣體；拌種劑；經口製劑(例如，昆蟲食物等)；表現及/或產生AMP、AMP殺昆蟲蛋白、及/或AMP ORF(瞬時及/或穩定)之轉殖基因有機體，例如，植物或動物。
組成物可配製為散劑、粉劑、丸粒劑、顆粒、噴霧劑、乳液、膠質、溶液、或此等類似者，並且可藉由諸如乾燥、凍乾、均質化、萃取、過濾、離心、沉澱、或濃縮包含多肽之細胞培養物之習知手段來製備。在含有至少一種此類殺害蟲多肽之所有此等組成物中，多肽可以約1重量%至約99重量%之濃度存在。
在一些實施例中，本文所述殺害蟲組成物可藉由將AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽與所需農業上可接受之載劑一起配製來產生。在投與之前，組成物可以諸如凍乾、冷凍乾燥、乾燥之合適手段，或在水性載劑、介質或合適稀釋劑諸如鹽水及/或其他緩衝劑中配製。在一些實施例中，配製組成物可呈粉劑或粒狀材料、或油(植物油或礦物油)中之懸浮液、或水或油/水乳液形式，或呈可濕潤散劑，或與適合於農業應用之任何其他載體材料組合。合適農業載劑可為固體或液體並且在此項技術中為熟知的。在一些實施例中，調配物可與一或多種固體或液體佐劑混合並且藉由各種手段來製備，例如，使用習知調配技術，將殺害蟲組成物與合適佐劑均勻混合、摻合及/或研磨。合適調配物及應用方法描述於美國專利第6,468,523號，其揭示內容全文以引用方式併入本文。
在一些實施例中，組成物可包含AMP及賦形劑、基本上由其組成、或由其組成。
在一些實施例中，組成物可包含AMP殺昆蟲蛋白及賦形劑、基本上由其組成、或由其組成。
在一些實施例中，組成物可包含AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽、及賦形劑、基本上由其組成、或由其組成。
在一些實施例中，本揭示案之組成物可包含：AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽、及賦形劑；其中AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽呈總組成物之約0.000001% w/w至約99.9% w/w，或總組成物之約0.01%至約99.9%；約0.02%至約99.9%；約0.03%至約99.9%；約0.04%至約99.9%；約0.05%至約99.9%；約0.06%至約99.9%；約0.07%至約99.9%；約0.08%至約99.9%；約0.09%至約99.9%；約0.1%至約99.9%；約0.2%至約99.9%；約0.3%至約99.9%；約0.4%至約99.9%；約0.5%至約99.9%；約0.6%至約99.9%；約0.7%至約99.9%；約0.8%至約99.9%；約0.9%至約99.9%；約1%至約99.9%；約2%至約99.9%；約3%至約99.9%；約4%至約99.9%；約5%至約99.9%；約6%至約99.9%；約7%至約99.9%；約8%至約99.9%；約9%至約99.9%；約10%至約99.9%；約11%至約99.9%；約12%至約99.9%；約13%至約99.9%；約14%至約99.9%；約15%至約99.9%；約16%至約99.9%；約17%至約99.9%；約18%至約99.9%；約19%至約99.9%；約20%至約99.9%；約21%至約99.9%；約22%至約99.9%；約23%至約99.9%；約24%至約99.9%；約25%至約99.9%；約26%至約99.9%；約27%至約99.9%；約28%至約99.9%；約29%至約99.9%；約30%至約99.9%；約31%至約99.9%；約32%至約99.9%；約33%至約99.9%；約34%至約99.9%；約35%至約99.9%；約36%至約99.9%；約37%至約99.9%；約38%至約99.9%；約39%至約99.9%；約40%至約99.9%；約41%至約99.9%；約42%至約99.9%；約43%至約99.9%；約44%至約99.9%；約45%至約99.9%；約46%至約99.9%；約47%至約99.9%；約48%至約99.9%；約49%至約99.9%；約50%至約99.9%；約51%至約99.9%；約52%至約99.9%；約53%至約99.9%；約54%至約99.9%；約55%至約99.9%；約56%至約99.9%；約57%至約99.9%；約58%至約99.9%；約59%至約99.9%；約60%至約99.9%；約61%至約99.9%；約62%至約99.9%；約63%至約99.9%；約64%至約99.9%；約65%至約99.9%；約66%至約99.9%；約67%至約99.9%；約68%至約99.9%；約69%至約99.9%；約70%至約99.9%；約71%至約99.9%；約72%至約99.9%；約73%至約99.9%；約74%至約99.9%；約75%至約99.9%；約76%至約99.9%；約77%至約99.9%；約78%至約99.9%；約79%至約99.9%；約80%至約99.9%；約81%至約99.9%；約82%至約99.9%；約83%至約99.9%；約84%至約99.9%；約85%至約99.9%；約86%至約99.9%；約87%至約99.9%；約88%至約99.9%；約89%至約99.9%；約90%至約99.9%；約91%至約99.9%；約92%至約99.9%；約93%至約99.9%；約94%至約99.9%；約95%至約99.9%；約96%至約99.9%；約97%至約99.9%；約98%至約99.9%；或約99%至約99.9% w/w範圍內之量。
在一些實施例中，本揭示案之組成物包含：AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽、及賦形劑，其中AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽之濃度按重量計在總組合或組成物之約0.1%至約99.9%；約1%至約99.9%；約2%至約99.9%；約3%至約99.9%；約4%至約99.9%；約5%至約99.9%；約6%至約99.9%；約7%至約99.9%；約8%至約99.9%；約9%至約99.9%；約10%至約99.9%；約11%至約99.9%；約12%至約99.9%；約13%至約99.9%；約14%至約99.9%；約15%至約99.9%；約16%至約99.9%；約17%至約99.9%；約18%至約99.9%；約19%至約99.9%；約20%至約99.9%；約21%至約99.9%；約22%至約99.9%；約23%至約99.9%；約24%至約99.9%；約25%至約99.9%；約26%至約99.9%；約27%至約99.9%；約28%至約99.9%；約29%至約99.9%；約30%至約99.9%；約31%至約99.9%；約32%至約99.9%；約33%至約99.9%；約34%至約99.9%；約35%至約99.9%；約36%至約99.9%；約37%至約99.9%；約38%至約99.9%；約39%至約99.9%；約40%至約99.9%；約41%至約99.9%；約42%至約99.9%；約43%至約99.9%；約44%至約99.9%；約45%至約99.9%；約46%至約99.9%；約47%至約99.9%；約48%至約99.9%；約49%至約99.9%；約50%至約99.9%；約51%至約99.9%；約52%至約99.9%；約53%至約99.9%；約54%至約99.9%；約55%至約99.9%；約56%至約99.9%；約57%至約99.9%；約58%至約99.9%；約59%至約99.9%；約60%至約99.9%；約61%至約99.9%；約62%至約99.9%；約63%至約99.9%；約64%至約99.9%；約65%至約99.9%；約66%至約99.9%；約67%至約99.9%；約68%至約99.9%；約69%至約99.9%；約70%至約99.9%；約71%至約99.9%；約72%至約99.9%；約73%至約99.9%；約74%至約99.9%；約75%至約99.9%；約76%至約99.9%；約77%至約99.9%；約78%至約99.9%；約79%至約99.9%；約80%至約99.9%；約81%至約99.9%；約82%至約99.9%；約83%至約99.9%；約84%至約99.9%；約85%至約99.9%；約86%至約99.9%；約87%至約99.9%；約88%至約99.9%；約89%至約99.9%；約90%至約99.9%；約91%至約99.9%；約92%至約99.9%；約93%至約99.9%；約94%至約99.9%；約95%至約99.9%；約96%至約99.9%；約97%至約99.9%；約98%至約99.9%；或約99%至約99.9% wt/wt範圍內。
在一些實施例中，本揭示案之組成物包含：AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽、及賦形劑，其中AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽之濃度在總組成物之約0.1%至約99%；約0.1%至約98%；約0.1%至約97%；約0.1%至約96%；約0.1%至約95%；約0.1%至約94%；約0.1%至約93%；約0.1%至約92%；約0.1%至約91%；約0.1%至約90%；約0.1%至約89%；約0.1%至約88%；約0.1%至約87%；約0.1%至約86%；約0.1%至約85%；約0.1%至約84%；約0.1%至約83%；約0.1%至約82%；約0.1%至約81%；約0.1%至約80%；約0.1%至約79%；約0.1%至約78%；約0.1%至約77%；約0.1%至約76%；約0.1%至約75%；約0.1%至約74%；約0.1%至約73%；約0.1%至約72%；約0.1%至約71%；約0.1%至約70%；約0.1%至約69%；約0.1%至約68%；約0.1%至約67%；約0.1%至約66%；約0.1%至約65%；約0.1%至約64%；約0.1%至約63%；約0.1%至約62%；約0.1%至約61%；約0.1%至約60%；約0.1%至約59%；約0.1%至約58%；約0.1%至約57%；約0.1%至約56%；約0.1%至約55%；約0.1%至約54%；約0.1%至約53%；約0.1%至約52%；約0.1%至約51%；約0.1%至約50%；約0.1%至約49%；約0.1%至約48%；約0.1%至約47%；約0.1%至約46%；約0.1%至約45%；約0.1%至約44%；約0.1%至約43%；約0.1%至約42%；約0.1%至約41%；約0.1%至約40%；約0.1%至約39%；約0.1%至約38%；約0.1%至約37%；約0.1%至約36%；約0.1%至約35%；約0.1%至約34%；約0.1%至約33%；約0.1%至約32%；約0.1%至約31%；約0.1%至約30%；約0.1%至約29%；約0.1%至約28%；約0.1%至約27%；約0.1%至約26%；約0.1%至約25%；約0.1%至約24%；約0.1%至約23%；約0.1%至約22%；約0.1%至約21%；約0.1%至約20%；約0.1%至約19%；約0.1%至約18%；約0.1%至約17%；約0.1%至約16%；約0.1%至約15%；約0.1%至約14%；約0.1%至約13%；約0.1%至約12%；約0.1%至約11%；約0.1%至約10%；約0.1%至約9%；約0.1%至約8%；約0.1%至約7%；約0.1%至約6%；約0.1%至約5%；約0.1%至約4%；約0.1%至約3%；約0.1%至約2%；約0.1%至約1%；或約0.1%至約0.5% wt/wt範圍內。
在一些實施例中，本揭示案之組成物包含：AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽、及賦形劑，其中AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽之濃度按重量計在總組成物之約0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, or 99.9%範圍內。
在一些實施例中，本揭示案之組成物可包含：AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽、及賦形劑；其中賦形劑呈總組成物之約0.000001% w/w至約99.9% w/w，或總組成物之約0.01%至約99.9%；約0.02%至約99.9%；約0.03%至約99.9%；約0.04%至約99.9%；約0.05%至約99.9%；約0.06%至約99.9%；約0.07%至約99.9%；約0.08%至約99.9%；約0.09%至約99.9%；約0.1%至約99.9%；約0.2%至約99.9%；約0.3%至約99.9%；約0.4%至約99.9%；約0.5%至約99.9%；約0.6%至約99.9%；約0.7%至約99.9%；約0.8%至約99.9%；約0.9%至約99.9%；約1%至約99.9%；約2%至約99.9%；約3%至約99.9%；約4%至約99.9%；約5%至約99.9%；約6%至約99.9%；約7%至約99.9%；約8%至約99.9%；約9%至約99.9%；約10%至約99.9%；約11%至約99.9%；約12%至約99.9%；約13%至約99.9%；約14%至約99.9%；約15%至約99.9%；約16%至約99.9%；約17%至約99.9%；約18%至約99.9%；約19%至約99.9%；約20%至約99.9%；約21%至約99.9%；約22%至約99.9%；約23%至約99.9%；約24%至約99.9%；約25%至約99.9%；約26%至約99.9%；約27%至約99.9%；約28%至約99.9%；約29%至約99.9%；約30%至約99.9%；約31%至約99.9%；約32%至約99.9%；約33%至約99.9%；約34%至約99.9%；約35%至約99.9%；約36%至約99.9%；約37%至約99.9%；約38%至約99.9%；約39%至約99.9%；約40%至約99.9%；約41%至約99.9%；約42%至約99.9%；約43%至約99.9%；約44%至約99.9%；約45%至約99.9%；約46%至約99.9%；約47%至約99.9%；約48%至約99.9%；約49%至約99.9%；約50%至約99.9%；約51%至約99.9%；約52%至約99.9%；約53%至約99.9%；約54%至約99.9%；約55%至約99.9%；約56%至約99.9%；約57%至約99.9%；約58%至約99.9%；約59%至約99.9%；約60%至約99.9%；約61%至約99.9%；約62%至約99.9%；約63%至約99.9%；約64%至約99.9%；約65%至約99.9%；約66%至約99.9%；約67%至約99.9%；約68%至約99.9%；約69%至約99.9%；約70%至約99.9%；約71%至約99.9%；約72%至約99.9%；約73%至約99.9%；約74%至約99.9%；約75%至約99.9%；約76%至約99.9%；約77%至約99.9%；約78%至約99.9%；約79%至約99.9%；約80%至約99.9%；約81%至約99.9%；約82%至約99.9%；約83%至約99.9%；約84%至約99.9%；約85%至約99.9%；約86%至約99.9%；約87%至約99.9%；約88%至約99.9%；約89%至約99.9%；約90%至約99.9%；約91%至約99.9%；約92%至約99.9%；約93%至約99.9%；約94%至約99.9%；約95%至約99.9%；約96%至約99.9%；約97%至約99.9%；約98%至約99.9%；或約99%至約99.9% w/w範圍內之量。
在一些實施例中，本揭示案之組成物包含：AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽、及賦形劑，其中賦形劑之濃度在總組合或組成物之約0.1%至約99.9%；約1%至約99.9%；約2%至約99.9%；約3%至約99.9%；約4%至約99.9%；約5%至約99.9%；約6%至約99.9%；約7%至約99.9%；約8%至約99.9%；約9%至約99.9%；約10%至約99.9%；約11%至約99.9%；約12%至約99.9%；約13%至約99.9%；約14%至約99.9%；約15%至約99.9%；約16%至約99.9%；約17%至約99.9%；約18%至約99.9%；約19%至約99.9%；約20%至約99.9%；約21%至約99.9%；約22%至約99.9%；約23%至約99.9%；約24%至約99.9%；約25%至約99.9%；約26%至約99.9%；約27%至約99.9%；約28%至約99.9%；約29%至約99.9%；約30%至約99.9%；約31%至約99.9%；約32%至約99.9%；約33%至約99.9%；約34%至約99.9%；約35%至約99.9%；約36%至約99.9%；約37%至約99.9%；約38%至約99.9%；約39%至約99.9%；約40%至約99.9%；約41%至約99.9%；約42%至約99.9%；約43%至約99.9%；約44%至約99.9%；約45%至約99.9%；約46%至約99.9%；約47%至約99.9%；約48%至約99.9%；約49%至約99.9%；約50%至約99.9%；約51%至約99.9%；約52%至約99.9%；約53%至約99.9%；約54%至約99.9%；約55%至約99.9%；約56%至約99.9%；約57%至約99.9%；約58%至約99.9%；約59%至約99.9%；約60%至約99.9%；約61%至約99.9%；約62%至約99.9%；約63%至約99.9%；約64%至約99.9%；約65%至約99.9%；約66%至約99.9%；約67%至約99.9%；約68%至約99.9%；約69%至約99.9%；約70%至約99.9%；約71%至約99.9%；約72%至約99.9%；約73%至約99.9%；約74%至約99.9%；約75%至約99.9%；約76%至約99.9%；約77%至約99.9%；約78%至約99.9%；約79%至約99.9%；約80%至約99.9%；約81%至約99.9%；約82%至約99.9%；約83%至約99.9%；約84%至約99.9%；約85%至約99.9%；約86%至約99.9%；約87%至約99.9%；約88%至約99.9%；約89%至約99.9%；約90%至約99.9%；約91%至約99.9%；約92%至約99.9%；約93%至約99.9%；約94%至約99.9%；約95%至約99.9%；約96%至約99.9%；約97%至約99.9%；約98%至約99.9%；或約99%至約99.9% wt/wt範圍內。
在一些實施例中，本揭示案之組成物包含：AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽、及賦形劑，其中賦形劑之濃度在總組成物之約0.1%至約99%；約0.1%至約98%；約0.1%至約97%；約0.1%至約96%；約0.1%至約95%；約0.1%至約94%；約0.1%至約93%；約0.1%至約92%；約0.1%至約91%；約0.1%至約90%；約0.1%至約89%；約0.1%至約88%；約0.1%至約87%；約0.1%至約86%；約0.1%至約85%；約0.1%至約84%；約0.1%至約83%；約0.1%至約82%；約0.1%至約81%；約0.1%至約80%；約0.1%至約79%；約0.1%至約78%；約0.1%至約77%；約0.1%至約76%；約0.1%至約75%；約0.1%至約74%；約0.1%至約73%；約0.1%至約72%；約0.1%至約71%；約0.1%至約70%；約0.1%至約69%；約0.1%至約68%；約0.1%至約67%；約0.1%至約66%；約0.1%至約65%；約0.1%至約64%；約0.1%至約63%；約0.1%至約62%；約0.1%至約61%；約0.1%至約60%；約0.1%至約59%；約0.1%至約58%；約0.1%至約57%；約0.1%至約56%；約0.1%至約55%；約0.1%至約54%；約0.1%至約53%；約0.1%至約52%；約0.1%至約51%；約0.1%至約50%；約0.1%至約49%；約0.1%至約48%；約0.1%至約47%；約0.1%至約46%；約0.1%至約45%；約0.1%至約44%；約0.1%至約43%；約0.1%至約42%；約0.1%至約41%；約0.1%至約40%；約0.1%至約39%；約0.1%至約38%；約0.1%至約37%；約0.1%至約36%；約0.1%至約35%；約0.1%至約34%；約0.1%至約33%；約0.1%至約32%；約0.1%至約31%；約0.1%至約30%；約0.1%至約29%；約0.1%至約28%；約0.1%至約27%；約0.1%至約26%；約0.1%至約25%；約0.1%至約24%；約0.1%至約23%；約0.1%至約22%；約0.1%至約21%；約0.1%至約20%；約0.1%至約19%；約0.1%至約18%；約0.1%至約17%；約0.1%至約16%；約0.1%至約15%；約0.1%至約14%；約0.1%至約13%；約0.1%至約12%；約0.1%至約11%；約0.1%至約10%；約0.1%至約9%；約0.1%至約8%；約0.1%至約7%；約0.1%至約6%；約0.1%至約5%；約0.1%至約4%；約0.1%至約3%；約0.1%至約2%；約0.1%至約1%；或約0.1%至約0.5% wt/wt範圍內。
在一些實施例中，本揭示案之組成物包含：AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽、及賦形劑，其中賦形劑之濃度按重量計在總組成物之約0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%範圍內。 可噴霧組成物
本揭示案之噴霧劑產品之實例可包括用於農業使用之田地可噴霧調配物及用於在住宅或商用空間之內部空間使用的室內噴霧劑。在一些實施例中，包含AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽的住宅噴霧劑或空間噴霧劑可用於減少或消除內部空間中之昆蟲害蟲。
室內表面噴霧(SSI)為一種將可變體積可噴霧體積之殺昆蟲劑應用至載體停留之室內表面例如牆壁、窗戶、地板及天花板上的技術。可變體積可噴霧之主要目標為減少昆蟲害蟲(例如，蒼蠅、跳蚤、蜱蟲或蚊子載體)之壽命，從而減少或中斷疾病傳播。次要效果為減少處理區域內之昆蟲害蟲之密度。SSI可用作防治昆蟲害蟲載體疾病的方法，諸如萊姆病、沙門氏菌、基孔肯雅病毒、寨卡病毒及瘧疾，亦可用於管理昆蟲載體攜帶之寄生蟲，諸如利甚曼病及恰加斯病。容納寨卡病毒、基孔肯雅病毒、及瘧疾之許多蚊子載體包括內住性蚊子載體，其在吸血之後停留於房屋內部。對於經由使用包含AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽、及賦形劑之可噴霧組成物之室內表面噴霧(SSI)的防治，此等蚊子為尤其敏感的。顧名思義，SSI涉及使用後效殺昆蟲劑，將該組成物應用於房屋之牆壁及其他表面。
在一個實施例中，包含AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽、及賦形劑之組成物將與此等表面接觸之昆蟲害蟲擊倒。SSI不直接防止人們被蚊子叮咬。實際上，其通常在昆蟲害蟲吸血之後停留在噴霧表面上時，對昆蟲害蟲進行防治。因此，SSI防止將感染傳播給其他人。為了有效，SSI必須應用於某個區域中之非常高比例之家庭(通常大於40-80%)。因此，根據本發明之具有良好殘留效力及可接受氣味之噴霧劑特別適合作為綜合昆蟲害蟲載體管理或防治解決方案之組成部分。
與要求例如如同油漆一樣，使活性AMP或AMP殺蟲蛋白結合至住宅表面(諸如牆壁或天花板)的SSI相反，本發明之空間噴霧產品依賴於產生意欲在給定時間段內在一定體積之空氣中分佈的較大數量之較小殺昆蟲液滴。當此等液滴遇到目標昆蟲害蟲時，其會釋放擊倒有效劑量之AMP或AMP殺昆蟲蛋白以防治昆蟲害蟲。用於產生空間噴霧之傳統方法包括熱霧化(由此產生包含AMP、AMP殺昆蟲蛋白或其農業上可接受之鹽的組成物的厚雲，從而產生濃霧)及超低體積(ULV)，其中由冷的機械氣溶膠發生器來產生液滴。亦可以使用即用型氣溶膠，例如氣溶膠罐。
因為可以在任何一次性時間內處理較大區域，所以上述方法為快速減少特定區域飛蟲數量的非常有效方法。而且，由於來自應用之殘留活性非常有限，因此必須每隔5-7天重複一次才能完全有效。此方法在需要迅速減少害蟲數量的流行病情況下特別有效。因此，它可用於城市登革熱防治活動。
有效的空間噴霧通常取決於以下具體原則。目標昆蟲通常飛過噴霧雲(或者有時在暴露表面上休息時受到影響)。因此，噴霧液滴與目標昆蟲之間的接觸效率為至關重要的。此舉藉由確保噴霧液滴在最佳時間段內保持空氣傳播並且其含有正確劑量之殺蟲劑來達成。此等兩個問題在很大程度上藉由最佳化液滴尺寸來得到解決。如果液滴太大，其會過快地落到地面上，並且不會穿透植被或在應用過程中遇到的其他障礙物(限制有效應用面積)。如果此等較大液滴中之一者遇到個別昆蟲，則其亦「過度殺傷」，因為按照個別昆蟲而言，較高劑量會得以釋放。如果液滴太小，則由於空氣動力學，其可能不會沉積在目標昆蟲上(無撞擊)，或者其可以被對流氣流向上攜帶到大氣中。用於空間噴霧應用之液滴之最佳大小為具有10-25微米之體積中值直徑(VMD)的液滴。
在一些實施例中，可噴霧組成物可含有約0.005 wt%至約99 wt%範圍內之量的AMP、或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，可噴霧組成物可含有約0.005 wt%至約99 wt%範圍內之量的AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽。 發泡體
包含AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽、及賦形劑的本揭示案之活性組成物可以基於氣溶膠應用，包括氣溶膠化發泡體應用之噴霧劑產品形式來提供。加壓罐為用於形成氣溶膠之典型載體。使用與AMP或AMP殺昆蟲蛋白相容之氣溶膠推進劑。較佳地，使用液化氣體型推進劑。
合適推進劑包括壓縮空氣、二氧化碳、丁烷及氮氣。活性化合物組成物中之推進劑之濃度為吡啶組成物之約5重量百分數至約40重量百分數，較佳包含AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽、及賦形劑之約15重量百分數至約30重量百分數。
在一個實施例中，包含AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽的調配物亦可包含一或多種發泡劑。可使用之發泡劑包括月桂醇聚醚硫酸鈉、椰油醯胺DEA、及椰油醯胺丙基甜菜鹼。較佳地，月桂醇聚醚硫酸鈉、椰油醯胺DEA及椰油醯胺丙基組合使用。活性化合物組成物中之發泡劑之濃度為組成物之約10重量百分數至約25重量百分數，更佳15重量百分數至20重量百分數。
當此等調配物用於不含有發泡劑之氣溶膠應用中時，本揭示案之活性組成物可在不需要直接在使用之前混合的情況下使用。然而，含有發泡劑之氣溶膠調配物需要直接在使用之前加以混合(亦即，振盪)。另外，若含有發泡劑之調配物長時間使用，其可需要在使用期間，在週期性時間間隔下額外混合。
在一些實施例中，氣溶膠化發泡體可含有約0.005 wt%至約99 wt%範圍內之量的AMP、或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，氣溶膠化發泡體可含有約0.005 wt%至約99 wt%範圍內之量的AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽。 燃燒調配物
在一些實施例中，亦可以用活性AMP或AMP殺昆蟲蛋白組成物，藉由使用含有該組成物之燃燒調配物，例如蠟燭、發煙線圈或一炷香來處理住宅區域。例如，該組成物可以配製成家用產品，例如「加熱的」空氣清新劑，其中殺昆蟲組成物在加熱(例如電加熱或燃燒)時得以釋放。包含AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽的本揭示案之活性化合物組成物可以呈氣溶膠、蚊香、及/或汽化器或霧化器之噴霧劑產品形式來提供。
在一些實施例中，燃燒調配物可含有約0.005 wt%至約99 wt%範圍內之量的AMP、或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，燃燒調配物可含有約0.005 wt%至約99 wt%範圍內之量的AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽。 織物處理
在一些實施例中，可製造含有殺害蟲有效組成物的織物及服裝，該組成物包含AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽、及賦形劑。在一些實施例中，本文所述聚合材料、纖維、紗線、織物、網、或基材中之AMP或AMP殺昆蟲蛋白之濃度可在例如0.05至15重量百分數，較佳0.2至10重量百分數，更佳0.4至8重量百分數，尤其0.5至5諸如1至3重量百分數之相對寬濃度範圍內變化。
類似地，包含AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽、及賦形劑之組成物(不論用於處理表面或塗佈纖維、紗線、網、織物)之濃度可在例如0.1至70重量百分數，諸如0.5至50重量百分數，較佳1至40重量百分數，更佳5至30重量百分數，尤其10至20重量百分數之相對寬濃度範圍內變化。
AMP或AMP殺昆蟲蛋白之濃度可根據應用領域來選擇以使得關於擊倒功效、耐久性及毒性之要求得到滿足。亦可以調整材料之特性，因此可以此方式來獲得定製的紡織織物。
因此，AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽之有效量可取決於特定使用模式、最需要防治之昆蟲害蟲及使用AMP或AMP殺昆蟲蛋白之環境。因此，達成昆蟲害蟲防治之AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽之有效量為足夠的。
在一些實施例中，織物處理可含有約0.005 wt%至約99 wt%範圍內之量的AMP、或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，織物處理可含有約0.005 wt%至約99 wt%範圍內之量的AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽。 表面處理組成物
在一些實施例中，本揭示案提供用於塗佈建築物內部之牆壁、地板及天花板，並且用於塗佈基材或非生物材料的包含AMP及賦形劑、或包含AMP殺昆蟲蛋白及賦形劑之組成物或調配物。包含AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽、及賦形劑之本發明組成物可使用已知技術，為了心中之目的來製備。包含AMP殺昆蟲蛋白及賦形劑之組成物製劑可被配製成亦含有黏合劑以便促進化合物結合至表面或其他基材。可用於結合之試劑在此項技術中為已知的並且往往為聚合形式的。與纖維、紗線、織物或網相比，適合於應用於具有特定孔隙率及/或結合特性之牆壁表面的組成物的黏合劑之類型為不同的，因此，基於已知教示，熟習此項技術者基於所需表面及/或基材來選擇合適黏合劑。
典型黏合劑為聚乙烯醇、改性澱粉、聚丙烯酸乙烯酯、聚丙烯酸、聚乙酸乙烯酯共聚物、聚胺基甲酸酯及改性植物油。合適黏合劑可包括衍生自多種聚合物及共聚物及其組合之膠乳分散體。作為本發明組成物中之黏合劑來使用之合適膠乳包含苯乙烯、烷基苯乙烯、異戊二烯、丁二烯、丙烯腈低級烷基丙烯酸酯、氯乙烯、偏氯乙烯、低級羧酸之乙烯基酯及α,β-烯系不飽和羧酸的聚合物及共聚物，包括其中含有共聚合之三個或更多個不同單體物種的聚合物，以及聚矽氧或聚胺甲酸酯之後分散懸浮液。用於使活性成分結合至其他表面之聚四氟乙烯(PTFE)聚合物亦可為合適的。
在一些實施例中，表面處理組成物可含有約0.005 wt%至約99 wt%範圍內之量的AMP、或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，表面處理組成物可含有約0.005 wt%至約99 wt%範圍內之量的AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽。 分散劑
在一些示範性實施例中，根據本揭示案之殺昆蟲調配物可由以下組成：AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽、及賦形劑、稀釋劑或載劑(例如水)、聚合物黏合劑、及/或額外組分諸如分散劑、聚合劑、乳化劑、增稠劑、乙醇、香料、或在此項技術中已知之用於製備可噴霧殺昆蟲劑之任何其他惰性賦形劑。
在一些實施例中，包含AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽、及賦形劑之組成物可以許多不同形式或調配物類型諸如懸浮液或膠囊懸浮液來製備。並且熟習此項技術者可基於特定AMP或AMP殺昆蟲蛋白之性質、其用途、以及其應用類型來製備相關組成物。例如，用於本揭示案之方法、實施例、及其他態樣中之AMP或AMP殺昆蟲蛋白可囊封於懸浮液或膠囊懸浮液調配物中。囊封AMP或AMP殺昆蟲蛋白可提供經改良之耐洗牢度、以及更長活性期。調配物可基於有機物或基於水，較佳基於水。
在一些實施例中，分散劑可含有約0.005 wt%至約99 wt%範圍內之量的AMP、或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，分散劑可含有約0.005 wt%至約99 wt%範圍內之量的AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽。 微膠囊化
適合用於根據本揭示案之組成物及方法中之微膠囊化AMP或AMP殺昆蟲蛋白可用在此項技術中已知之任何合適技術來製備。例如，先前已開發用於將材料微膠囊化之各種過程。此等過程可劃分三個類別：物理方法、相分離、及界面反應。在物理方法類別中，使微膠囊壁材料及核心顆粒在實體上結合在一起並且使壁材料圍繞核心顆粒流動以形成微膠囊。在相分離類別中，微膠囊藉由使核心材料乳化或分散於不可混合連續相中來形成，壁材料溶解於該連續相中並且導致其諸如藉由凝聚而在實體上與連續相分離，並且沉積在核心顆粒周圍。在界面反應類別中，藉由使核心材料乳化或分散於不可混合連續相中，然後導致界面聚合反應在核心顆粒之表面處發生，從而形成微膠囊。存在於微膠囊中之AMP或AMP殺昆蟲蛋白之濃度可在微膠囊之0.1至60重量%之間變化。
在一些實施例中，微膠囊可含有約0.005 wt%至約99 wt%範圍內之量的AMP、或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，微膠囊可含有約0.005 wt%至約99 wt%範圍內之量的AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽。 調配物、分散劑、套組、及其成分
用於根據本揭示案之組成物(包含AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽、及賦形劑)、方法、實施例及其他態樣中之調配物可藉由將所有成分與水一起混合，及視情況使用合適混合及/或分散聚集物來形成。通常，此調配物在10至70℃，較佳15至50℃，更佳20至40℃之溫度下形成。一般而言，包含(A)、(B)、(C)、及/或(D)中之一或多者的調配物為可能的，其中可使用：AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽(作為殺害蟲劑)(A)；固體聚合物(B)；視情況選用之額外添加劑(D)；並且將其在水性組分(C)中分散。若黏合劑存在於本揭示案之組成物(包含AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽、及賦形劑)中，較佳使用先前單獨製備的聚合物黏合劑(B)於水中之分散液以及AMP或AMP殺昆蟲蛋白(A)於水中之水性調配物。此等單獨調配物可含有使相應調配物中之(A)及/或(B)穩定化的額外添加劑並且可購得。在第二過程步驟中，添加此等原始調配物及視情況額外水(組分(C))。又，基於前述方案的上述成分之組合同樣為可能的，例如，使用(A)及/或(B)之預形成分散液並且將其與固體(A)及/或(B)混合。聚合物黏合劑(B)之分散液可為已經由化學品製造商製成之預製造分散液。
另外，使用「手工製造」分散液，亦即，由最終使用者小規模製成之分散液亦在本揭示案之範圍內。此等分散液可藉由提供約20%黏合劑(B)於水中之混合物，將混合物加熱至90℃至100℃之溫度及強烈地攪拌混合物幾小時來產生。可將調配物製造為最終產品以使得其可由最終使用者容易地用於根據本揭示案之過程。並且，當然類似地可製造濃縮物，其可由最終使用者用額外水(C)來稀釋至供使用之所需濃度。
在一實施例中，適合於SSI應用之組成物(包含AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽、及賦形劑)或塗佈調配物(包含AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽、及賦形劑)含有活性成分及載劑諸如水，並且亦可具有一或多種選自分散劑、潤濕劑、防凍劑、增稠劑、防腐劑、乳化劑及黏合劑或黏著劑之共調配物。
在一些實施例中，AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽之示例性固體調配物通常研磨至所需粒徑，諸如通常3至20，較佳5至15，尤其7至12 µm之粒徑分佈d(0.5)。
此外，可將調配物以套組形式裝運至最終使用者，該套組至少包含有包含AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽(A)的第一組分；及包含至少一種聚合物黏合劑(B)的第二組分。此外添加劑(D)可為套組之第三單獨組分，或可已經與組分(A)及/或(B)混合。最終使用者可藉由僅將水(C)添加至套組之組分並且混合來製備供使用之調配物。套組之組分亦可為水中之調配物。當然可將一種組分之水性調配物與其他組分之乾燥調配物組合。舉例而言，套組可由以下組成：AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽(A)及視情況水(C)的一種調配物；及至少一種聚合物黏合劑(B)、作為組分(C)之水及視情況組分(D)的第二單獨調配物。
組分(A)、(B)、(C)及視情況(D)之濃度藉由熟習此項技術者取決於用於塗佈/處理之技術來選擇。通常，基於組成物之重量，AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽(A)之量可多達50，較佳1至50，諸如10至40，尤其15至30重量百分數。基於組成物之重量，聚合物黏合劑(B)之量可在0.01至30，較佳0.5至15，更佳1至10，尤其1至5重量百分數範圍內。基於組成物之重量，若存在，通常額外組分(D)之量為0.1至20，較佳0.5至15重量百分數。基於組成物之重量，若存在，顏料及/或染料及/或香料之合適量通常為0.01至5，較佳0.1至3，更佳0.2至2重量百分數。準備使用之典型調配物包含0.1至40，較佳1至30百分數之組分(A)、(B)、及視情況(D)，其餘量為水(C)。待藉由最終使用者來稀釋之濃縮物之典型濃度可包含5至70，較佳10至60百分數之組分(A)、(B)、及視情況(D)，其餘量為水(C)。 示例性混合物、組成物、產品、及轉殖基因有機體
本揭示案涵蓋含有、或在轉殖基因有機體的情況下，表現或以其他方式產生一或多種AMP、或一或多種AMP殺昆蟲蛋白的混合物、組成物、產品、及轉殖基因有機體。
在一些實施例中，示例性混合物由以下組成：(1)AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽；及(2)賦形劑(例如，本文所述任何賦形劑)。
在一些實施例中，本揭示案之混合物由以下組成：(1)一或多種AMP、一或多種AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽；及(2)一或多種賦形劑(例如，本文所述任何賦形劑)。
在一些實施例中，本揭示案之混合物由以下組成：(1)一或多種AMP、一或多個AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽；及(2)一或多種賦形劑(例如，本文所述任何賦形劑)；其中前述(1)或(2)中之任一者可同時或依序使用。
使用AMP、或AMP殺昆蟲蛋白(如本文描述)之任何組合、混合物、產品、多肽及/或植物可用於防治害蟲、其生長、及/或由其作用所造成之破壞，尤其其對於植物之破壞。
包含AMP或AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽、及賦形劑的組成物可包括農用化學品組成物。例如，在一些實施例中，農用化學品組成物可包括但是不限於氣溶膠及/或氣溶膠化產品(例如，噴霧劑、薰蒸劑、散劑、粉劑、及/或氣體)；拌種劑；經口製劑(例如，昆蟲食物等)；或瞬時及/或穩定地表現及/或產生AMP或AMP殺昆蟲蛋白的轉殖基因有機體(例如，細胞、植物、或動物)。
在一些實施例中，本揭示案之活性成分可以組成物形式來應用並且可與其他非活性化合物同時或順次地應用於作物區域或待處理之植物。此等化合物可以為化肥、除草劑、冷凍保護劑、界面活性劑、洗滌劑、肥皂、休眠油、聚合物、及/或延時釋放或可生物降解之載體調配物，該等調配物允許在單次應用後對目標區域進行長期給藥。若需要，此等非活性化合物中之一或多者可與調配物技術中通常使用之其他農業上可接受之載劑、界面活性劑或應用促進佐劑一起製備。合適載劑及佐劑可為固體或液體並且對應於通常用於調配物技術中之物質，例如天然或再生礦物物質、溶劑、分散劑、潤濕劑、增黏劑、黏合劑或化肥。同樣，調配物可製備成可食用「誘餌」或製成害蟲「誘捕器」以允許殺害蟲調配物之目標害蟲進食或攝取。
應用由藉由本文描述之本揭示案方法所產生的AMP或AMP殺昆蟲蛋白或其農業上可接受之鹽、及賦形劑組成之本揭示案之活性成分或本揭示案之農用化學品組成物的方法包括葉子應用、種子塗佈及土壤應用。在一些實施例中，應用次數及應用速率取決於相應害蟲之侵染強度。
包含AMP或AMP殺昆蟲蛋白或其農業上可接受之鹽及賦形劑之組成物可配製為散劑、粉劑、丸粒劑、顆粒、噴霧劑、乳液、膠質、溶液、或此等類似者，並且可藉由諸如乾燥、凍乾、均質化、萃取、過濾、離心、沉澱、或濃縮包含多肽之細胞培養物之習知手段來製備。在含有至少一種此類殺害蟲多肽的所有此等組成物中，多肽可以約1重量%至約99重量%之濃度存在。
在一些實施例中，含有AMP或AMP殺昆蟲蛋白(或其農業上可接受之鹽)之組成物可預防性地應用於環境區域以便預防例如鱗翅目及/或鞘翅目害蟲之敏感性害蟲的侵染，該害蟲可在給定區域中藉由本發明方法來殺死或減少數量。在一些實施例中，害蟲攝取或與殺害蟲有效量之多肽接觸。
在一些實施例中，本文所述殺害蟲組成物可藉由將AMP或AMP殺昆蟲蛋白或其農業上可接受之鹽轉型細菌、酵母、或其他細胞、晶體及/或孢子懸浮液、或分離蛋白組分與所需農業上可接受之載劑一起配製來製成。在投與之前，組成物可以諸如凍乾、冷凍乾燥、乾燥之合適手段，或在水性載劑、介質或合適稀釋劑諸如鹽水及/或其他緩衝劑中配製。在一些實施例中，配製組成物可呈粉劑或粒狀材料、或油(植物油或礦物油)中之懸浮液、或水或油/水乳液形式，或呈可濕潤散劑，或與適合於農業應用之任何其他載體材料組合。合適農業載劑可為固體或液體並且在此項技術中為熟知的。在一些實施例中，調配物可與一或多種固體或液體佐劑混合並且藉由各種手段來製備，例如，使用習知調配技術，將殺害蟲組成物與合適佐劑均勻混合、摻合及/或研磨。合適調配物及應用方法描述於美國專利第6,468,523號，其揭示內容全文以引用方式併入本文。 使用本揭示案之方法
使用本揭示案之任何方法，例如，保護植物、植物部分、及種子之方法；或使用混合物及組成物之方法可使用如本文描述之AMP或AMP殺昆蟲蛋白中之任何一者或多者來實行。例如，使用如本文描述之本揭示案的任何方法可使用例如具有選自SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169中之任一者之胺基酸序列的一或多種AMP來實行，其同樣地在本文中描述。 保護植物、植物部分、及種子之方法
在一些實施例中，本揭示案提供防治農學及/或非農學應用中之無脊椎害蟲的方法，包括使無脊椎害蟲或其環境、包括植物表面之固體表面、或其部分與殺害蟲有效量之本發明AMP中之一或多者、一或多種AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽接觸。
在一些實施例中，本揭示案提供防治農學及/或非農學應用中之無脊椎害蟲的方法，包括使無脊椎害蟲或其環境、包括植物表面之固體表面、或其部分與殺害蟲有效量之包含至少一種本發明AMP及賦形劑之組成物接觸。
在一些實施例中，本揭示案提供防治農學及/或非農學應用中之無脊椎害蟲的方法，包括使無脊椎害蟲或其環境、包括植物表面之固體表面、或其部分與殺害蟲有效量之包含至少一種本發明AMP殺昆蟲蛋白及賦形劑之組成物接觸。
包含(1)至少一種本發明AMP；兩種或兩種以上本揭示案之AMP；AMP殺昆蟲蛋白；兩種或兩種以上AMP殺昆蟲蛋白；或其農業上可接受之鹽；及(2)賦形劑的合適組成物之實例包括待以下列形式遞送的與非活性成分一起配製之該等組成物：液體溶液、乳液、散劑、顆粒、奈米顆粒、微粒、或其組合。
在一些實施例中，為了達成與本發明之化合物、混合物、或組成物接觸以便保護農田作物免受無脊椎害蟲影響，化合物或組成物通常應用於種植之前的種子作物、作物植物之葉子(例如，葉子、莖、花朵、果實)、或將作物種植之前或之後的土壤或其他生長培養基。
接觸方法之一個實施例為噴霧。或者，包含AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽、及賦形劑之顆粒組成物可應用於植物葉子或土壤。藉由使植物與以液體調配物之土壤浸液、顆粒調配物形式來應用於土壤的包含本發明化合物之組成物接觸、育苗箱處理或浸漬移植物，本發明化合物亦可經由植物吸收來有效地遞送。呈土壤浸透液體調配物形式的本揭示案之組成物為值得注意的。包括使無脊椎害蟲或其環境與生物學上有效量之AMP或AMP殺昆蟲蛋白接觸的防治無脊椎害蟲之方法亦為值得注意的。進一步值得注意地，在一些示例性實施例中，示例性方法涵蓋土壤環境，其中組成物以土壤浸液調配物形式來應用於土壤。應進一步注意AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽亦可藉由局部應用於侵染場所而產生效力。其他接觸方法包括藉由直接及殘留噴霧、空中噴霧、凝膠、種子塗佈、微膠囊、全身吸收、誘餌、耳標、大丸劑、噴霧器、薰蒸劑、氣溶膠、粉劑及許多其他方法來應用本發明之化合物或組成物。接觸方法之一實施例為包含本發明之化合物或組合物的在尺寸上穩定之肥料顆粒、棒或錠劑。本發明化合物亦可浸漬至用於製造無脊椎動物防治裝置之材料中(例如，昆蟲網、塗覆至衣服上、應用至蠟燭調配物中及其類似方法)。
在一些實施例中，AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽亦可用於保護種子免受無脊椎害蟲影響之拌種劑中。在本揭示案及申請專利範圍之上下文中，處理種子意謂使種子與通常配製為本發明之組成物的生物學上有效量之AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽接觸。此種子處理保護種子免受無脊椎土壤害蟲影響並且通常亦可保護自發芽種子發育之秧苗的與土壤接觸之根部及其他植物部分。種子處理亦可藉由發育植物內之AMP或AMP殺昆蟲蛋白之易位來提供葉子之保護。拌種劑可應用於所有類型之種子，包括經基因轉型來表現特殊性狀之植物藉以發芽之種子。另外，AMP或AMP殺昆蟲蛋白可轉型至已經轉型之植物或其部分，例如植物細胞、或植物種子，例如，表現提供對於草甘磷之抗性的除草劑抗性諸如草甘磷乙醯轉移酶之彼等植物或其部分。
種子處理之一方法為藉由在播下種子之前，向種子噴淋或噴撒AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽(亦即，呈包含AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽及賦形劑之配製組成物或混合物形式)。被配製用於種子處理之組成物通常由AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽、及成膜劑或黏合劑組成。因此，通常，種子塗佈組成物本揭示案組成生物學上有效量AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽，及成膜劑或黏合劑。種子可藉由將可流動懸浮液濃縮物直接噴淋至種子之滾床中，然後將種子乾燥來塗佈。或者，可將其他調配物類型諸如潤濕散劑、溶液、懸乳劑、可乳化濃縮物及水中之乳液噴淋至種子上。此過程尤其適用於在種子上塗覆薄膜塗佈。各種塗佈機器及過程可為熟習此項技術者利用。合適過程包括P. Kosters等人Seed Treatment: Progress and Prospects, 1994 BCPC專著第57期、及其中列出之參考文獻中列出之過程，其揭示內容以全文引用方式併入本文。
經處理之種子通常包含約0.01 g至1 kg/100 kg種子(亦即，處理之前的種子之約0.00001至1重量%)範圍內之量的AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽。經配製用於種子處理之可流動懸浮液通常包含約0.5至約70%之活性成分、約0.5至約30%之成膜黏著劑、約0.5至約20%之分散劑、0至約5%之增稠劑、0至約5%之顏料及/或染料、0至約2%之消泡劑、0至約1%之防腐劑、及0至約75%之揮發性液體稀釋劑。
在一些實施例中，本發明提供防治昆蟲之方法，包括向該昆蟲提供在其基因組中包含穩定併入之表現匣的轉殖基因植物，其中該穩定併入之表現匣包含可操作來編碼AMP之多核苷酸。
在一些實施例中，本揭示案提供防治昆蟲及/或防止害蟲之方法，其中害蟲選自由以下組成之群：阿赫瑪天蛾(天蛾幼蟲) (葡萄蔓天蛾 (Eumorpha achemon))；苜蓿粉蝶(紋黃豆粉蝶 (Colias eurytheme))；粉斑螟(乾果斑螟 (Caudra cautella))；鱷梨捲蛾(白紋捲蛾( Amorbia humerosana))；黏蟲(灰翅夜蛾屬( Spodoptera)某些種，例如甜菜夜蛾 (exigua)、草地貪夜蛾 (frugiperda)、海灰翅夜蛾 (littoralis)、白點黏蟲 (Pseudaletia unipuncta))；洋薊羽蛾( Platyptilia carduidactyla)；阿德利亞毛蟲(大配片舟蛾 (Datana major))；蓑蛾(常綠樹頓袋蛾屬( Thyridopteryxephemeraeformis ))；蔗扁蛾(木豹蛾 (Hypercompe scribonia))；黃斑蕉弄蝶( Erionota thrax)；黑頭食心蟲(西黑頭長翅捲蛾 (Acleris gloverana))；加州槲蛾( Phryganidia californica)；白斑春尺蠖( Paleacrita merriccata)；櫻實小捲蛾(櫻小食心蟲 (Grapholita packardi))；中國標記蛾(露尾萍螟 (Nymphula stagnata))；柑橘夜蛾( Xylomyges curialis)；蘋果蠹蛾( Cydia pomonella)；蔓越莓果蟲( Acrobasis vaccinii)；橫條紋卷葉菜蟲( Evergestis rimosalis)；切根蟲(夜蛾 (Noctuid)物種，小地老虎 (Agrotis ipsilon))；花旗松毒蛾(黃杉合毒蛾 (Orgyia pseudotsugata))；艾羅蛾(天蛾幼蟲) (木薯天蛾 (Erinnyis ello))；榆樹尺蠖(榆秋黃尺蛾 (Ennomos subsignaria))；歐洲葡萄蔓蛾(鮮食葡萄小捲蛾 (Lobesia botrana))；歐洲弄蝶(無斑豹弄蝶 (Thymelicus lineola))；埃塞克斯弄蝶；榛小捲蛾( Melissopus latiferreanus))；榛樹捲葉蛾(薔薇黃捲蛾 (Archips rosanus))；果樹捲葉蛾( Archips argyrospilia))；葡萄捲葉蛾( Paralobesia viteana))；葡萄灰黑螟(荷蘭石竹小捲蛾( Platynota stultana)))；葡萄葉雕葉蟲( Harrisina americana)；苜蓿綠夜蛾( Plathypena scabra))；綠條犀額蛾(粉色楓蛾( Dryocampa rubicunda))；Gummosos -Batrachedra comosae(Hodges)；舞毒蛾( Lymantria dispar)；鐵杉尺蠖( Lambdina fiscellaria)；天蛾幼蟲(菸草天蛾屬( Manduca)某些種)；菜青蟲(菜粉蝶 (Pieris rapae))；愛歐蛾(巨斑刺蛾 (Automeris io))；短葉松芽捲蛾(賈克松色捲蛾( Choristoneura pinus))；蘋果淺褐捲葉蛾(蘋淡褐捲蛾( Epiphyas postvittana))；瓜蟲(絹野螟( Diaphania hyalinata))；含羞草結網蟲(含羞草雕蛾( Homadaula anisocentra))；斜帶狀捲葉蛾(玫瑰色捲蛾 (Choristoneura rosaceana))；夾竹桃蛾( Syntomeida epilais)；雜食性捲葉蛾( Playnota stultana)；雜食尺蠖( Sabulodes aegrotata)；桔鳳蝶(美洲大芷鳳蝶 (Papilio cresphontes))；甜橙捲葉蛾(橘帶捲蛾( Argyrotaenia citrana))；東方果蛾(梨小食心蟲( Grapholita molesta))；桃條麥蛾幼蟲(桃條麥蛾 (Anarsia lineatella))；松蝴蝶(美洲松粉蝶 (Neophasia menapia))；豆莢蠕蟲；紅色帶狀捲葉蛾(紅帶捲蛾( Argyrotaenia velutinana))；紅疣天社蛾(紅山背舟蛾 (Schizura concinna))；皮蟲複合物(各種鱗翅類)；鞍背刺蛾( Sibine stimulea)；鞍突出刺蛾鞍斑美洲舟蛾 (Heterocampa guttivitta))；鹽澤燈蛾( Estigmene acrea)；草地螟(草螟( Crambus)某些種)；尺蠖(榆秋黃尺蛾 (Ennomos subsignaria))；秋尺蠖(波林尺蠖 (Alsophila pometaria))；雲杉捲葉蛾(雲杉色捲蛾 (Choristoneura fumiferana))；天幕毛蟲(各種枯葉蛾科( Lasiocampidae))；菠蘿褐灰蝶(Geyr) ( Thecla basilides)；菸草天蛾幼蟲(菸草天蛾( Manduca sexta))；菸葉螟(菸草粉斑螟 (Ephestia elutella))；簇絨蘋果食芽蛾(蘋白小捲蛾 (Platynota idaeusalis))；樹枝蛀蟲(桃條麥蛾 (Anarsia lineatella))；豆雜色夜蛾(疆夜蛾 (Peridroma saucia))；雜色捲葉蛾( Platynota flavedana)；藜豆毛蟲(大豆夜蛾 (Anticarsia gemmatalis))；胡桃天社蛾(核桃配片舟蛾 (Datana integerrima))；結網蟲(美國白蛾 (Hyphantria cunea))；老年毒蛾(西部櫟柳毒蛾 (Orgyia vetusta))；玉米草螟(南方玉米螟 (Diatraea crambidoides))；玉米穗蛾；甘薯小象蟲；胡椒莖象甲；桔根象甲；草莓根象甲；美核桃象甲)；榛象甲；稻水象甲；苜蓿葉象甲；三葉草象鼻蟲；茶穿孔蛀蟲；根象甲；甘蔗犀金龜；咖啡果小蠹；早熟禾象甲(早熟禾象鼻蟲 (Listronotus maculicollis))；紫絨鰓角金龜( Maladera castanea)；歐金龜( Rhizotroqus majalis)；綠花金龜( Cotinis nitida)；日本金龜子(日本弧麗金龜 (Popillia japonica))；五月或六月金龜子(食葉鰓金龜屬( Phyllophaga))；圓頭犀金龜(北方方頭甲 (Cyclocephala borealis))；東方麗金龜(東方異麗金龜 (Anomala orientalis))；圓頭無斑犀金龜(淺黃方頭甲 (Cyclocephala lurida))；穀象(象蟲總科 (Curculionoidea))；埃及伊蚊；玉米幹夜蛾 (Busseola fusca)；二化螟 (Chilo suppressalis)；尖音庫蚊 (Culex pipiens)；致倦庫蚊 (Culex quinquefasciatus)；玉米根葉甲 (Diabrotica virgifera)；小蔗桿草螟 (Diatraea saccharalis)；棉鈴蟲 (Helicoverpa armigera)；穀實夜蛾 (Helicoverpa zea)；菸芽夜蛾 (Heliothis virescens)；馬鈴薯葉甲 (Leptinotarsa decemlineata)；亞洲玉米螟 (Ostrinia furnacalis)；歐洲玉米螟 (Ostrinia nubilalis)；棉紅鈴蟲 (Pectinophora gossypiella)；印度穀螟 (Plodia interpunctella)；小菜蛾 (Plutella xylostella)； 大豆尺夜蛾 (Pseudoplusia includens)；甜菜夜蛾 (Spodoptera exigua)；草地貪夜蛾 (Spodoptera frugiperda)；棉貪夜蛾 (Spodoptera littoralis)；粉紋夜蛾 (Trichoplusia ni)；及榆黃瑩葉甲 (Xanthogaleruca luteola)。 使用混合物及組成物之方法
在一些實施例中，本發明提供抗擊、防治、或抑制害蟲之方法，包括將殺害蟲有效量之包含AMP、AMP殺昆蟲蛋白、及/或其組合、基本上由其組成、或由其組成之組合、混合物、或組成物應用於(i)害蟲、害蟲之所在地、害蟲之食物供應、害蟲之棲息地、或害蟲之繁殖地；(ii)易受害蟲侵襲的植物、種子、植物部分、植物之所在地、或植物之環境；(iii)易受害蟲侵襲的動物、動物之所在地、或動物之環境；或(iv)(i)-(iii)中之任一者之組合。
在一些實施例中，本揭示案提供使用包含(1)AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽；及(2)賦形劑之混合物來防治昆蟲的方法，其中AMP選自本文所述AMP之一或任何組合，例如，具有針對一或多個昆蟲物種之殺昆蟲活性的AMP，該AMP包含與根據式(I)：X 1-S-C-C-P-C-Y-W-X 2-X 3-C-P-W-G-Q-X 4-C-Y-P-X 5-G-C-X 6-G-X 7-X 8-X 9-X 10之胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致的胺基酸序列；其中相對於在SEQ ID NO：1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；其中X 1為K、H、Q、T、S、N、E、I、L、或V；X 2為G、P、或A；X 3為G、或N；X 4為N或D；X 5為E、D、或N；X 6為S、D、G、T、V、或R；X 7為P或不存在；X 8為K、H、A、R、G、T、D、或不存在；X 9為G、V、或不存在；X 10為G、I、或不存在；或其農業上可接受之鹽；並且其中該方法包括，製備混合物，將然後該混合物應用於(i)昆蟲、昆蟲之所在地、昆蟲之食物供應、昆蟲之棲息地、或昆蟲之繁殖地；(ii)易受昆蟲侵襲的植物、種子、植物部分、植物之所在地、或植物之環境；(iii)易受昆蟲侵襲的動物、動物之所在地、或動物之環境；或(iv) (i)-(iii)中之任一者之組合。
在一些實施例中，本揭示案提供使用包含(1)AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽；及(2)賦形劑之混合物來防治昆蟲的方法，其中AMP選自本文所述AMP之一或任何組合，例如，具有針對一或多個昆蟲物種之殺昆蟲活性的AMP，該AMP包含與根據式(II)：K-S-C-C-P-C-Y-W-G-G-C-P-W-G-Q-X 1-C-Y-P-X 2-G-C-X 3-G-P-X 4-X 5-X 6之胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致的胺基酸序列；其中相對於在SEQ ID NO:1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；X 1為N或D；X 2為E、D、或N；X 3為S、D、R、或G；X 4為K、G、或D；X 5為V或不存在；或其農業上可接受之鹽；並且其中該方法包括製備混合物，然後將該混合物應用於(i)害蟲、害蟲之所在地、害蟲之食物供應、害蟲之棲息地、或害蟲之繁殖地；(ii)易受害蟲侵襲的植物、種子、植物部分、植物之所在地、或植物之環境；(iii)易受害蟲侵襲的動物、動物之所在地、或動物之環境；或(iv) (i)-(iii)中之任一者之組合。
在一些實施例中，本揭示案提供使用包含(1)AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽；及(2)賦形劑之混合物來防治昆蟲的方法，其中AMP選自本文所述AMP之一或任何組合，例如，具有針對一或多個昆蟲物種之殺昆蟲活性的AMP，該AMP包含與在SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169中闡明之胺基酸序列中之任一者至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致的胺基酸序列；或其農業上可接受之鹽；並且其中該方法包括製備混合物，將然後該混合物應用於昆蟲之所在地。
在一些實施例中，本揭示案提供使用混合物來防治昆蟲之方法，該混合物包含：(1)AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽，及(2)賦形劑；其中昆蟲選自由以下組成之群：阿赫瑪天蛾(天蛾幼蟲) (葡萄蔓天蛾)；苜蓿粉蝶(紋黃豆粉蝶)；粉斑螟(乾果斑螟)；鱷梨捲蛾(白紋捲蛾)；黏蟲(灰翅夜蛾屬某些種，例如甜菜夜蛾、草地貪夜蛾、海灰翅夜蛾、白點黏蟲)；洋薊羽蛾；阿德利亞毛蟲(大配片舟蛾)；蓑蛾(頓袋蛾)；蔗扁蛾(木豹蛾)；黃斑蕉弄蝶；黑頭食心蟲(西黑頭長翅捲蛾)；加州槲蛾；白斑春尺蠖；櫻實小捲蛾(櫻小食心蟲)；中國標記蛾(露尾萍螟)；柑橘夜蛾；蘋果蠹蛾；蔓越莓果蟲；橫條紋卷葉菜蟲；切根蟲(夜蛾物種，小地老虎)；花旗松毒蛾(黃杉合毒蛾)；艾羅蛾(天蛾幼蟲) (木薯天蛾)；榆樹尺蠖(榆秋黃尺蛾)；歐洲葡萄蔓蛾(鮮食葡萄小捲蛾)；歐洲弄蝶(無斑豹弄蝶)；埃塞克斯弄蝶；美國白蛾)；榛樹捲葉蛾(薔薇黃捲蛾)；果樹捲葉蛾)；葡萄捲葉蛾)；葡萄灰黑螟(荷蘭石竹小捲蛾)；葡萄葉雕葉蟲；苜蓿綠夜蛾)；綠條犀額蛾(粉色楓蛾)；Gummosos -Batrachedra comosae(Hodges)；舞毒蛾；鐵杉尺蠖；天蛾幼蟲(菸草天蛾屬某些種)；菜青蟲(菜粉蝶)；愛歐蛾(巨斑刺蛾)；短葉松芽捲蛾(賈克松色捲蛾)；蘋果淺褐捲葉蛾(蘋淡褐捲蛾)；瓜蟲(絹野螟)；含羞草結網蟲(含羞草雕蛾)；斜帶狀捲葉蛾(玫瑰色捲蛾)；夾竹桃蛾；雜食性捲葉蛾；雜食尺蠖；桔鳳蝶(美洲大芷鳳蝶)；甜橙捲葉蛾(橘帶捲蛾)；東方果蛾(梨小食心蟲)；桃條麥蛾幼蟲(桃條麥蛾)；松蝴蝶(美洲松粉蝶)；豆莢蠕蟲；紅色帶狀捲葉蛾(紅帶捲蛾)；紅疣天社蛾(紅山背舟蛾)；皮蟲複合物(各種鱗翅類)；鞍背刺蛾；鞍突出刺蛾(鞍斑美洲舟蛾)；鹽澤燈蛾；草地螟(草螟某些種)；尺蠖(榆秋黃尺蛾)；秋尺蠖(波林尺蠖)；雲杉捲葉蛾(雲杉色捲蛾)；天幕毛蟲(各種枯葉蛾科)；菠蘿褐灰蝶(Geyr)；菸草天蛾幼蟲(菸草天蛾)；菸葉螟(菸草粉斑螟)；簇絨蘋果食芽蛾(蘋白小捲蛾)；樹枝蛀蟲(桃條麥蛾)；豆雜色夜蛾(疆夜蛾)；雜色捲葉蛾；藜豆毛蟲(大豆夜蛾)；胡桃天社蛾(核桃配片舟蛾)；結網蟲(美國白蛾)；老年毒蛾(西部櫟柳毒蛾)；玉米草螟(南方玉米螟)；玉米穗蛾；甘薯小象蟲；胡椒莖象甲；桔根象甲；草莓根象甲；美核桃象甲)；榛象甲；稻水象甲；苜蓿葉象甲；三葉草象鼻蟲；茶穿孔蛀蟲；根象甲；甘蔗犀金龜；咖啡果小蠹；早熟禾象甲(早熟禾象鼻蟲)；紫絨鰓角金龜；歐金龜；綠花金龜；日本金龜子(日本弧麗金龜)；五月或六月金龜子(食葉鰓金龜屬)；圓頭犀金龜(北方方頭甲)；東方麗金龜(東方異麗金龜)；圓頭無斑犀金龜(淺黃方頭甲)；穀象(象蟲總科)；埃及伊蚊；玉米幹夜蛾；二化螟；尖音庫蚊；致倦庫蚊；玉米根葉甲；小蔗桿草螟；棉鈴蟲；穀實夜蛾；菸芽夜蛾；馬鈴薯葉甲；亞洲玉米螟；歐洲玉米螟；棉紅鈴蟲；印度穀螟；小菜蛾；大豆尺夜蛾；甜菜夜蛾；草地貪夜蛾；棉貪夜蛾；粉紋夜蛾；及榆黃瑩葉甲。
在一些實施例中，本揭示案提供保護植物以免受昆蟲影響之方法，包括提供表現一或多種AMP、一或多種AMP殺昆蟲蛋白、或其編碼多核苷酸之植物。
在一些實施例中，本揭示案提供保護植物以免受昆蟲影響之方法，包括提供表現AMP、或其編碼多核苷酸之植物，其中該AMP包含與根據式(I)：X 1-S-C-C-P-C-Y-W-X 2-X 3-C-P-W-G-Q-X 4-C-Y-P-X 5-G-C-X 6-G-X 7-X 8-X 9-X 10之胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致之胺基酸序列；其中相對於在SEQ ID NO:1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；其中X 1為K、H、Q、T、S、N、E、I、L、或V；X 2為G、P、或A；X 3為G、或N；X 4為N或D；X 5為E、D、或N；X 6為S、D、G、T、V、或R；X 7為P或不存在；X 8為K、H、A、R、G、T、D、或不存在；X 9為G、V、或不存在；X 10為G、I、或不存在；或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，本揭示案提供保護植物以免受昆蟲影響之方法，包括提供表現AMP、或其編碼多核苷酸之植物，其中該AMP包含與根據式(II)：K-S-C-C-P-C-Y-W-G-G-C-P-W-G-Q-X 1-C-Y-P-X 2-G-C-X 3-G-P-X 4-X 5-X 6之胺基酸序列至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.6%一致、至少99.7%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致、或100%一致之胺基酸序列；其中相對於在SEQ ID NO:1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該多肽包含至少一個胺基酸取代；X 1為N或D；X 2為E、D、或N；X 3為S、D、R、或G；X 4為K、G、或D；X 5為V或不存在；或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，本揭示案提供保護植物以免受昆蟲影響之方法，包括提供表現AMP、或其編碼多核苷酸之植物，其中AMP具有如SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169中之任一者中所闡明之胺基酸序列，或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，本揭示案提供保護植物以免受昆蟲影響之方法，包括提供表現AMP、或其編碼多核苷酸之植物，其中AMP具有如SEQ ID NO：20、24-26、35-36、38、及40中之任一者中所闡明之胺基酸序列，或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，本揭示案提供保護植物以免受昆蟲影響之方法，包括提供表現AMP、或其編碼多核苷酸之植物，其中AMP具有如SEQ ID NO：25、36、38、及40中之任一者中所闡明之胺基酸序列，或其農業上可接受之鹽。
在一些實施例中，本揭示案提供保護植物以免受昆蟲影響之方法，包括提供表現AMP、或其編碼多核苷酸之植物，其中多核苷酸編碼具有如SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169中之任一者中所闡明之胺基酸序列的AMP，或其互補核苷酸序列。
在一些實施例中，本揭示案提供保護植物以免受昆蟲影響之方法，包括提供表現AMP、或其編碼多核苷酸之植物，其中多核苷酸編碼具有如SEQ ID NO: 20、24-26、35-36、38、及40中之任一者中所闡明之胺基酸序列的AMP，或其互補核苷酸序列。
在一些實施例中，本揭示案提供保護植物以免受昆蟲影響之方法，包括提供表現AMP、或其編碼多核苷酸之植物，其中多核苷酸編碼具有如SEQ ID NO：25、36、38、及40中之任一者中所闡明之胺基酸序列的AMP，或其互補核苷酸序列。
在一些實施例中，本揭示案提供保護植物以免受昆蟲影響之方法，包括提供表現AMP、或其編碼多核苷酸之植物，其中AMP進一步包含兩種或兩種以上AMP之均聚物或雜聚物，其中各AMP之胺基酸序列相同或不同。
在一些實施例中，本揭示案提供保護植物以免受昆蟲影響之方法，包括提供表現AMP、或其編碼多核苷酸之植物，其中AMP為包含藉由可裂解或不可裂解連接子來分隔之兩個或兩個以上AMP的融合蛋白，並且其中各AMP之胺基酸序列可相同或不同。
在一些實施例中，本揭示案提供保護植物以免受昆蟲影響之方法，包括提供表現AMP、或其編碼多核苷酸之植物，其中AMP為包含藉由可裂解連接子來分隔之兩個或兩個以上AMP的融合蛋白。在一些實施例中，連接子具有如SEQ ID NO：184-193中之任一者中所闡明之胺基酸序列。
在一些實施例中，本揭示案提供保護植物以免受昆蟲影響之方法，包括提供表現AMP、或其編碼多核苷酸之植物，其中AMP為包含藉由連接子來分隔之兩個或兩個以上AMP的融合蛋白，其中連接子可在以下中之至少一者內部裂解：(i)昆蟲之腸道或血淋巴，及(ii)可在哺乳動物之腸道內部裂解。
在一些實施例中，本揭示案提供防治昆蟲之方法，包括向該昆蟲提供在其基因組中包含穩定併入之表現匣的轉殖基因植物，其中該穩定併入之表現匣包含可操作來編碼AMP之多核苷酸。
在一些實施例中，本揭示案提供抗擊、防治、或抑制害蟲之方法，包括應用殺害蟲有效量之包含(1)AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽；及(2)賦形劑之混合物；其中AMP選自本文所述AMP之一或任何組合，例如，具有在SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169中闡明之胺基酸序列之AMP，或其農業上可接受之鹽；其中混合物應用於(i)害蟲、害蟲之所在地、害蟲之食物供應、害蟲之棲息地、或害蟲之繁殖地；(ii)易受害蟲侵襲的植物、種子、植物部分、植物之所在地、或植物之環境；(iii)易受害蟲侵襲的動物、動物之所在地、或動物之環境；或(iv) (i)-(iii)中之任一者之組合。
在一些實施例中，本揭示案提供抗擊、防治、或抑制害蟲之方法，包括將殺害蟲有效量之包含(1)AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽；及(2)賦形劑之混合物應用於(i)害蟲、害蟲之所在地、害蟲之食物供應、害蟲之棲息地、或害蟲之繁殖地；(ii)易受害蟲侵襲的植物、種子、植物部分、植物之所在地、或植物之環境；(iii)易受害蟲侵襲的動物、動物之所在地、或動物之環境；或(iv) (i)-(iii)中之任一者之組合，其中害蟲選自由以下組成之群：阿赫瑪天蛾(天蛾幼蟲) (葡萄蔓天蛾)；苜蓿粉蝶(紋黃豆粉蝶)；粉斑螟(乾果斑螟)；鱷梨捲蛾(白紋捲蛾)；黏蟲(灰翅夜蛾屬某些種，例如甜菜夜蛾、草地貪夜蛾、海灰翅夜蛾、白點黏蟲)；洋薊羽蛾；阿德利亞毛蟲(大配片舟蛾)；蓑蛾(頓袋蛾)；蔗扁蛾(木豹蛾)；黃斑蕉弄蝶；黑頭食心蟲(西黑頭長翅捲蛾)；加州槲蛾；白斑春尺蠖；櫻實小捲蛾(櫻小食心蟲)；中國標記蛾(露尾萍螟)；柑橘夜蛾；蘋果蠹蛾；蔓越莓果蟲；橫條紋卷葉菜蟲；切根蟲(夜蛾物種，小地老虎)；花旗松毒蛾(黃杉合毒蛾)；艾羅蛾(天蛾幼蟲) (木薯天蛾)；榆樹尺蠖(榆秋黃尺蛾)；歐洲葡萄蔓蛾(鮮食葡萄小捲蛾)；歐洲弄蝶(無斑豹弄蝶)；埃塞克斯弄蝶；美國白蛾)；榛樹捲葉蛾(薔薇黃捲蛾)；果樹捲葉蛾)；葡萄捲葉蛾)；葡萄灰黑螟(荷蘭石竹小捲蛾)；葡萄葉雕葉蟲；苜蓿綠夜蛾；綠條犀額蛾(粉色楓蛾)；Gummosos -Batrachedra comosae(Hodges)；舞毒蛾；鐵杉尺蠖；天蛾幼蟲(菸草天蛾屬某些種)；菜青蟲(菜粉蝶)；愛歐蛾(巨斑刺蛾)；短葉松芽捲蛾(賈克松色捲蛾)；蘋果淺褐捲葉蛾(蘋淡褐捲蛾)；瓜蟲(絹野螟)；含羞草結網蟲(含羞草雕蛾)；斜帶狀捲葉蛾(玫瑰色捲蛾)；夾竹桃蛾；雜食性捲葉蛾；雜食尺蠖；桔鳳蝶(美洲大芷鳳蝶)；甜橙捲葉蛾(橘帶捲蛾)；東方果蛾(梨小食心蟲)；桃條麥蛾幼蟲(桃條麥蛾)；松蝴蝶(美洲松粉蝶)；豆莢蠕蟲；紅色帶狀捲葉蛾(紅帶捲蛾)；紅疣天社蛾(紅山背舟蛾)；皮蟲複合物(各種鱗翅類)；鞍背刺蛾；鞍突出刺蛾(鞍斑美洲舟蛾)；鹽澤燈蛾；草地螟(草螟某些種)；尺蠖(榆秋黃尺蛾)；秋尺蠖(波林尺蠖)；雲杉捲葉蛾(雲杉色捲蛾)；天幕毛蟲(各種枯葉蛾科)；菠蘿褐灰蝶(Geyr)；菸草天蛾幼蟲(菸草天蛾)；菸葉螟(菸草粉斑螟)；簇絨蘋果食芽蛾(蘋白小捲蛾)；樹枝蛀蟲(桃條麥蛾)；豆雜色夜蛾(疆夜蛾)；雜色捲葉蛾；藜豆毛蟲(大豆夜蛾)；胡桃天社蛾(核桃配片舟蛾)；結網蟲(美國白蛾)；老年毒蛾(西部櫟柳毒蛾)；玉米草螟(南方玉米螟)；玉米穗蛾；甘薯小象蟲；胡椒莖象甲；桔根象甲；草莓根象甲；美核桃象甲)；榛象甲；稻水象甲；苜蓿葉象甲；三葉草象鼻蟲；茶穿孔蛀蟲；根象甲；甘蔗犀金龜；咖啡果小蠹；早熟禾象甲(早熟禾象鼻蟲)；紫絨鰓角金龜；歐金龜；綠花金龜；日本金龜子(日本弧麗金龜)；五月或六月金龜子(食葉鰓金龜屬)；圓頭犀金龜(北方方頭甲)；東方麗金龜(東方異麗金龜)；圓頭無斑犀金龜(淺黃方頭甲)；穀象(象蟲總科)；埃及伊蚊；玉米幹夜蛾；二化螟；尖音庫蚊；致倦庫蚊；玉米根葉甲；小蔗桿草螟；棉鈴蟲；穀實夜蛾；菸芽夜蛾；馬鈴薯葉甲；亞洲玉米螟；歐洲玉米螟；棉紅鈴蟲；印度穀螟；小菜蛾；大豆尺夜蛾；甜菜夜蛾；草地貪夜蛾；棉貪夜蛾；粉紋夜蛾；及榆黃瑩葉甲。 作物及害蟲
可以藉由此等方法來防治之特定作物害蟲及昆蟲包括：網翅目( Dictyoptera)(蟑螂)；等翅目( Isoptera)(白蟻)；直翅目( Orthoptera)(蝗蟲、蚱蜢及蟋蟀)；雙翅目( Diptera)(家蠅、蚊子、采采蠅、大蚊及果蠅)；膜翅目( Hymenoptera)(螞蟻、黃蜂、蜜蜂、鋸蠅、姬蜂及癭蜂)；蝨目( Anoplura)(咬蝨及吸血蝨)；蚤目( Siphonaptera)(跳蚤)；及半翅目( Hemiptera)(臭蟲及蚜蟲)，以及蛛形綱動物(蜱蟲及蟎蟲)，以及此等有機體中之各者所攜帶之寄生蟲。
「害蟲」包括但不限於：昆蟲、真菌、細菌、線蟲、蟎蟲、蜱蟲、及其類似者。
昆蟲害蟲包括但不限於選自鞘翅目、雙翅目、膜翅目、鱗翅目、食毛目 (Mallophaga)、同翅目( Homoptera)、半翅目、直翅目( Orthroptera)、纓翅目、皮翅目 (Dermaptera)、等翅目、蝨目、蚤目、毛翅目 (Trichoptera)及其類似目之昆蟲。更具體而言，昆蟲害蟲包括鞘翅目、鱗翅目、及雙翅目。
具有用本文所述殺昆蟲肽處理之合適農業、家庭及/或醫學/獸醫重要性的昆蟲包括但不限於以下類別及目之成員： 鞘翅目包括肉食亞目 (Adephaga)及多食亞目 (Polyphaga)。肉食亞目包括步甲總科( Caraboidea)及豉甲總科 (Gyrinoidea)。多食亞目包括水龜蟲總科 (Hydrophiloidea)、隱翅蟲總科( Staphylinoidea)、花螢總科( Cantharoidea)、郭公蟲總科( Cleroidea)、叩頭蟲總科 (Elateroidea)、花甲總科 (Dascilloidea)、泥甲總科 (Dryopoidea)、丸甲總科 (Byrrhoidea)、扁甲總科( Cucujoidea)、芫菁總科( Meloidea)、花蚤科 Mordelloidea、擬步行蟲總科 (Tenebrionoidea)、長蠹總科( Bostrichoidea)、金龜子總科( Scarabaeoidea)、天牛總科( Cerambycoidea)、葉甲總科( Chrysomeloidea)、及象蟲總科 (Curculionoidea)。步甲總科包括虎甲科 (Cicindelidae)、步甲科 (Carabidae)、及龍蝨科 (Dytiscidae)。豉甲總科包括豉甲科 (Gyrinidae)。水龜蟲總科包括水龜蟲科 (Hydrophilidae)。隱翅蟲總科包括葬甲科 (Silphidae)及隱翅蟲科( Staphylinidae)。花螢總科( Cantharoidea)包括花螢科( Cantharidae)及螢科 (Lampyridae)。郭公蟲總科包括郭公蟲科( Cleridae)及皮蠹科( Dermestidae)。叩頭蟲總科包括叩頭蟲科 (Elateridae)及吉丁蟲科 (Buprestidae)。扁甲總科包括瓢蟲科 (Coccinellidae)。芫菁總科包括芫菁科 (Meloidae)。擬步行蟲總科包括擬步行蟲科。金龜子總科包括黑蜣科 (Passalidae)及金龜子科 (Scarabaeidae)。天牛總科包括天牛科( Cerambycidae)。葉甲總科包括葉甲科。象蟲總科包括象蟲科( Curculionidae)及小蠹科 (Scolytidae)。
鞘翅目之實例包括但不限於：美國扁豆象鼻蟲菜豆象 (Acanthoscelides obtectus)、葉甲楊毛臀螢葉甲 (Agelastica alni)、叩頭蟲(直條叩甲 (Agriotes lineatus)、暗色叩頭蟲( Agriotes obscurus)、二色叩頭蟲 (Agriotes bicolor))、穀物甲蟲背圓粉扁蟲( Ahasverus advena)、夏季金龜子馬鈴薯鰓金龜 (Amphimallon solstitialis)、家具甲蟲家具竊蠹 (Anobium punctatum)、花象屬( Anthonomus )某些種(象鼻蟲)、侏儒甜菜甲蟲甜菜隱食甲 (Atomaria linearis)、地毯甲蟲 (圓皮蠹屬( Anthrenus)某些種、毛皮蠹屬( Attagenus)某些種)、豇豆象鼻蟲四紋豆象 (Callosobruchus maculates)、乾果甲蟲醬曲露尾甲 (Carpophilus hemipterus)、甘藍莢象甲白菜籽龜象 (Ceutorhynchus assimilis)、油菜冬季莖象鼻蟲 Ceutorhynchus picitarsis 、線蟲菸草金針蟲( Conoderus vespertinus)及法利寬胸叩甲 (Conoderus falli)、香蕉象鼻蟲泥汙根頸象 (Cosmopolites sordidus)、新西蘭草金龜褐新西蘭肋翅鰓角金龜 (Costelytra zealandica)、六月甲蟲綠花金龜( Cotinis nitida)、向日葵莖象鼻蟲密點細枝象 (Cylindrocopturus adspersus)、火腿皮蠹(larder beetle/ Dermestes lardarius) 、玉米根蟲(corn rootworm/ Diabrotica virgifera) 、西方玉米根蟲 (Diabrotica virgifera virgifera)、及巴貝里葉甲 (Diabrotica barberi)、墨西哥豆甲蟲墨西哥豆瓢蟲 (Epilachna varivestis)、舊宅蛀蟲北美家天牛 (Hylotropes bajulus)、紫花苜蓿象鼻蟲紫苜蓿象甲 (Hypera postica)、發亮蛛甲裸蛛甲 (Gibbium psylloides)、菸草甲蟲菸草竊蠹 (Lasioderma serricorne)、科羅拉多馬鈴薯甲蟲馬鈴薯葉甲 (Leptinotarsa decemlineata)、粉蠹甲蟲 (粉蠹 (Lyctus)某些種)、油菜花露尾甲(pollen beetle /Meligethes aeneus) 、常見金龜子五月鰓金龜 (Melolontha melolontha)、美洲蛛甲(American spider beetle/ Mezium americanum) 、金黃蛛甲(golden spider beetle/ Niptus hololeucus) 、穀物甲蟲鋸穀盜 (Oryzaephilus surinamensis)及大眼鋸穀盜 (Oryzaephilus mercator)、葡萄黑象甲黑葡萄耳象 (Otiorhynchus sulcatus)、芥菜甲蟲辣根猿葉甲( Phaedon cochleariae)、十字花科植物跳甲十字花菜跳甲( Phyllotreta cruciferae)、黃條跳甲黃曲條菜跳甲( Phyllotreta striolata)、甘藍莖跳甲油菜蘭跳甲( Psylliodes chrysocephala)、蛛甲屬( Ptinus )某些種(蛛甲)、較小穀物蛀蟲穀蠹( Rhizopertha dominica)、豌豆象直條根瘤象 (Sitona lineatus)、稻穀甲蟲米象 (Sitophilus oryzae)及穀象 (Sitophilus granaries)、紅色向日葵籽象鼻蟲黃褐小爪象 (Smicronyx fulvus)、藥房甲蟲藥材甲 (Stegobium paniceum)、黃粉蟲甲蟲黃粉甲 (Tenebrio molitor)、麵粉甲蟲赤擬穀盜 (Tribolium castaneum)及雜擬穀盜 (Tribolium confusum)、倉庫及櫥櫃甲蟲 (斑皮蠹屬( Trogoderma)某些種)、及向日葵甲蟲(sunflower beetle/ Zygogramma exclamationis) 。
皮翅目(蠼螋)之實例包括但不限於：歐洲球螋(European earwig / Forficula auricularia) 、條紋蠼螋紅蠼螋 (Labidura riparia) 。
網翅目( Dictyoptera)之實例包括但不限於：東方蜚蠊(oriental cockroach / Blatta orientalis) 、德國蟑螂德國小蠊 (Blatella germanica)、馬德拉蜚蠊(Madeira cockroach/ Leucophaea maderae)、美洲大蠊(American cockroach / Periplaneta americana) 、及菸色大蠊黑胸大蠊 (Periplaneta fuliginosa) 。
倍足綱 (Diplopoda)之實例包括但不限於：斑點蛇千足蟲(spotted snake millipede/ Blaniulus guttulatus) 、平脊千足蟲(flat-back millipede / Brachydesmus superus) 、及溫室千足蟲溫室馬陸 (Oxidus gracilis) 。
雙翅目包括長角亞目 (Nematocera)、短角亞目 (Brachycera)、及環裂亞目 (Cyclorrhapha)。長角亞目包括大蚊科( Tipulidae)、毛蠓科 (Psychodidae)、蚊科 (Culicidae)、蠓科 (Ceratopogonidae)、搖蚊科 (Chironomidae)、蚋科 (Simuliidae)、毛蚊科 (Bibionidae)、及癭蚊科 (Cecidomyiidae)。短角亞目包括水虻科 (Stratiomyidae)、虻科 (Tabanidae)、劍虻科 (Therevidae)、食蟲虻科 (Asilidae)、擬食蟲虻科 (Mydidae)、蜂虻科 (Bombyliidae)、及長足虻科 (Dolichopodidae)。環裂亞目包括無縫組 (Aschiza)及無縫組 (Aschiza)。無縫組包括蚤蠅科( Phoridae)、食蚜蠅科( Syrphidae)、及眼蠅科( Conopidae)。無縫組包括無翅瓣類 (Acalyptratae)及有瓣類 (Calyptratae)。無翅瓣類包括斑蠅科( Otitidae)、實蠅科( Tephritidae)、潛蠅科( Agromyzidae)、及果蠅科( Drosophilidae)。有瓣類包括蝨蠅科( Hippoboscidae)、狂蠅科( Oestridae)、寄蠅科( Tachinidae)、花蠅科( Anthomyiidae)、家蠅科( Muscidae)、麗蠅科( Calliphoridae)、及麻蠅科( Sarcophagidae)。
雙翅目之實例包括但不限於：家蠅( Musca domestica)、非洲瘤蠅(嗜人瘤蠅 (Cordylobia anthropophaga))、蠓蟲(庫蠓屬( Culicoides)某些種)、蜜蜂蝨(蜂蝨蠅屬( Braula)某些種)、甜菜潛葉花蠅甜菜蠅 (Pegomyia betae)、黑蠅(黑蚋屬( Cnephia)某些種、真蚋屬( Eusimulium)某些種、蚋屬( Simulium)某些種)、膚蠅(黃蠅屬( Cuterebra)某些種、胃蠅屬( Gastrophilus)某些種、狂蠅屬( Oestrus)某些種)、大蚊(大蚊屬( Tipula)某些種)、眼疾蠅(潛蠅屬( Hippelates)某些種)、污穢繁殖蒼蠅(麗蠅屬( Calliphora)某些種、廁蠅屬( Fannia)某些種、水虻屬( Hermetia)某些種、綠蠅屬( Lucilia)某些種、蠅屬( Musca)某些種、腐蠅屬( Muscina)某些種、綠蠅屬( Phaenicia)某些種、伏蠅屬( Phormia)某些種)、肉蠅(麻蠅屬( Sarcophaga)某些種、汙蠅屬( Wohlfahrtia)某些種)；掠蠅瑞典桿蠅 (Oscinella frit)、果蠅(寡鬃實蠅屬( Dacus)某些種、果蠅屬某些種)、頭部及乳房蒼蠅(齒股蠅屬( Hydrotaea)某些種)、小麥癭蚊(hessian fly / Mayetiola destructor) 、角蠅及水牛虻(黑角蠅屬( Haematobia)某些種)、馬及鹿蠅(斑虻屬( Chrysops)某些種、麻虻屬( Haematopota)某些種、虻屬( Tabanus)某些種)、蝨蠅(羊蝨蠅屬( Lipoptena)某些種、擬蝨蠅屬( Lynchia)某些種、及偽沼蝨蠅 (Pseudolynchia)某些種)、地中海果蠅(蠟實蠅屬( Ceratitis)某些種)、蚊子(伊蚊屬( Aedes)某些種、瘧蚊屬( Anopheles)某些種、庫蚊屬( Culex)某些種、鱗蚊屬( Psorophora)某些種)、白蛉(白蛉屬( Phlebotomus)某些種、羅蛉屬( Lutzomyia)某些種)、螺旋蠅(蛆症金蠅 (Chtysomya bezziana)及嗜人錐蠅 (Cochliomyia hominivorax))、綿羊蜱(蜱蠅屬( Melophagus)某些種)；廄螫蠅(螫蠅屬( Stomoxys)某些種)、采采蠅(舌蠅屬( Glossina)某些種)、及牛皮瘤蠅(皮下蠅屬( Hypoderma)某些種)。
等翅目(白蟻)之實例包括但不限於：來自草白蟻科(Hodotermitidae)、木白蟻科(Kalotermitidae)、澳白蟻科(Mastotermitidae)、犀白蟻科(Rhinotennitidae)、毛白蟻科(Serritermitidae)、白蟻科(Termitidae)、及原白蟻科(Termopsidae)之物種。
異翅目之實例包括但不限於：床蝨溫帶臭蟲 (Cimex lectularius)、棉椿象中間棉紅蝽 (Dysdercus intermedius)、蘇恩害蟲 麥扁盾蝽 (Eurygaster integriceps)、牧草盲蝽 Lygus lineolaris 、喜綠蝽花角綠蝽 (Nezara antennata)、南方喜綠蝽稻綠蝽 (Nezara viridula)、及錐蝽(triatomid bugs / Panstrogylus megistus) 、厄瓜多爾紅獵蝽 (Rhodnius ecuadoriensis)、蒼白紅獵蝽 (Rhodnius pallescans)、長紅獵蝽 (Rhodnius prolixus)、壯紅獵蝽 (Rhodnius robustus)、二分錐蝽 (Triatoma dimidiata)、侵擾錐獵蝽 (Triatoma infestans)、及泥色錐蝽 (Triatoma sordida) 。
同翅目之實例包括但不限於：橘紅圓蚧紅腎圓盾蚧 (Aonidiella aurantii)、蠶豆蚜 甜菜蚜 (Aphis fabae)、棉蚜或甜瓜蚜棉蚜 (Aphis gossypii)、蘋蚜蘋果蚜 (Aphis pomi)、柑橘剌粉蝨黑刺粉蝨 (Aleurocanthus spiniferus)、夾竹桃 圓蚧常春藤圓盾蚧、甘薯粉蝨(sweet potato whitefly/ Bemesia tabaci) 、甘藍蚜蟲(cabbage aphid / Brevicoryne brassicae) 、梨黃木蝨(pear psylla/ Cacopsylla pyricola) 、醋栗蚜蟲茶藨隱瘤蚜 (Cryptomyzus ribis)、葡萄根瘤蚜(grape phylloxera/ Daktulosphaira vitifoliae) 、柑橘木蝨(citrus psylla / Diaphorina citri) 、馬鈴薯葉蟬蠶蟲小綠葉蟬 (Empoasca fabae)、蠶豆葉蟬茄小綠葉蟬( Empoasca solana)、葡萄葉蟬假眼小綠葉蟬 (Empoasca vitis)、綿蚜蘋果綿蚜 (Eriosoma lanigerum)、歐洲果圓蚧(European fruit scale Eulecanium corni)、桃大尾蚜(mealy plum aphid/ Hyalopterus arundinis)、灰飛蝨(small brown planthopper/ Laodelphax striatellus) 、馬鈴薯蚜蟲馬鈴薯長管蚜 (Macrosiphum euphorbiae)、桃蚜(green peach/aphid Myzus persicae) 、黑尾葉蟬(green rice leafhopper Nephotettix cinticeps) 、褐飛蝨(brown planthopper/ Nilaparvata lugens) 、成癭蚜蟲(癭綿蚜屬某些種)、蛇麻疣額蚜忽布疣蚜 (Phorodon humuli)、粟縊蚜禾穀縊管蚜 (Rhopalosiphum padi)、黑圓蚧黑蠟蚧 (Saissetia oleae)、綠蟲麥二叉蚜 (Schizaphis graminum)、穀類蚜蟲麥長管蚜 (Sitobion avenae)、及溫室粉蝨(greenhouse whitefly / Trialeurodes vaporariorum) 。
等足綱之實例包括但不限於：常見鼠婦蟲(common pillbug/ Armadillidium vulgare)及常見潮蟲(common woodlouse/ Oniscus asellus) 。
鱗翅目包括鳳蝶科( Papilionidae)、粉蝶科( Pieridae)、灰蝶科( Lycaenidae)、蛺蝶科( Nymphalidae)、斑蝶科( Danaidae)、眼蝶科( Satyridae)、弄蝶科( Hesperiidae)、天蛾科( Sphingidae)、天蠶蛾科( Saturniidae)、尺蛾科( Geometridae)、燈蛾科( Arctiidae)、夜蛾科( Noctuidae)、毒蛾科( Lymantriidae)、透翅蛾科( Sesiidae)、及穀蛾科( Tineidae)。
鱗翅目之實例包括但不限於：蘋果小捲蛾( Adoxophyes orana /summer fruit tortrix moth)、小地老虎( Agrotis ipsolon /black cutworm)、果樹褐捲葉蛾( Archips podana/fruit tree tortrix moth)、梨潛葉蟲( Bucculatrix pyrivorella/pear leafminer)、棉葉穿孔蟲( Bucculatrix thurberiella/cotton leaf perforator)、松尺蠹( Bupalus piniarius/pine looper)、蘋果蠹蛾( Carpocapsa pomonella/codling moth)、二化螟( Chilo suppressalis/striped rice borer)、東部雲杉蚜蟲( Choristoneura fumiferana/eastern spruce budworm)、向日葵細捲葉蛾( Cochylis hospes/banded sunflower moth)、西南玉米螟( Diatraea grandiosella/southwestern corn borer)、埃及棉鈴蟲( Earls insulana/Egyptian bollworm)、地中海粉螟( Euphestia kuehniella/Mediterranean flour moth)、歐洲葡萄漿果蛾( Eupoecilia ambiguella/European grape berry moth)、棕尾蛾( Euproctis chrysorrhoea/brown-tail moth)、東方毒蛾( Euproctis subflava/oriental tussock moth)、大蠟螟( Galleria mellonella/greater wax moth)、棉鈴蟲( Helicoverpa armigera/cotton bollworm)、穀實夜蛾 (Helicoverpa zea)(棉鈴蟲)、菸草夜蛾幼蟲( Heliothis virescens/tobacco budworm)、褐織葉蛾( Hofmannophila pseudopretella/brown house moth)、向日葵螟( Homeosoma electellum/sunflower moth)、東方茶樹捲蛾( Homona magnanima/oriental tea tree tortrix moth)、斑點幕狀潛葉蟲( Lithocolletis blancardella/spotted tentiform leafminer)、舞毒蛾( Lymantria dispar/gypsy moth)、黃褐天幕毛蟲( Malacosoma neustria/tent caterpillar)、甘藍夜蛾 (Mamestra brassicae/cabbage armyworm)、披肩黏蟲( Mamestra configurata/Bertha armyworm)、天蛾幼蟲菸草天蛾( Manduca sexta)及番茄天蛾( Manuduca quinquemaculata)、冬尺蠖 (Operophtera brumata/winter moth)、歐洲玉米螟( Ostrinia nubilalis/European corn borer)、松美蛾( Panolis flammea/pine beauty moth)、棉紅鈴蟲( Pectinophora gossypiella/pink bollworm)、柑橘潛葉蛾( Phyllocnistis citrella/citrus leafminer)、菜白蝶( Pieris brassicae/cabbage white butterfly)、小菜蛾( Plutella xylostella/diamondback moth)、大豆尺蠖( Rachiplusia ni/soybean looper)、黃熊蛾( Spilosoma virginica/yellow bear moth)、甜菜黏蟲( Spodoptera exigua/beet armyworm)、草地貪夜蛾( Spodoptera frugiperda/fall armyworm)、棉葉蟲( Spodoptera littoralis/cotton leafworin)、普通地老虎( Spodoptera litura/common cutworm)、黃色條紋黏蟲( Spodoptera praefica/yellowstriped armyworm)、棉卷葉螟( Sylepta derogata/cotton leaf roller)、負袋夜蛾( Tineola bisselliella/webbing clothes moth)、袋穀蛾( Tineola pellionella/case-making clothes moth)、歐洲橡樹捲葉蟲( Tortrix viridana/European oak leafroller)、粉紋夜蛾( Trichoplusia ni/cabbage looper)及小貂蛾( Yponomeuta padella/small ermine moth)。
直翅目之實例包括但不限於：普通蟋蟀(common cricket/ Acheta domesticus)、樹蝗蟲 (螞蚱 (Anacridium)某些種)、遷徙蝗蟲(migratory locust/ Locusta migratoria)、雙條紋蚱蜢(twostriped grasshopper/ Melanoplus bivittatus)、差異蚱蜢(differential grasshopper/ Melanoplus dfferentialis)、紅腿蚱蜢(redlegged grasshopper/ Melanoplus femurrubrum)、遷徙蚱蜢(migratory grasshopper/ Melanoplus sanguinipes)、北方螻蛄(northern mole cricket/ Neocurtilla hexadectyla)、紅蝗蟲(red locust/ Nomadacris septemfasciata)、短翅螻蛄(shortwinged mole cricket/ Scapteriscus abbreviatus)、南部螻蛄(southern mole cricket/ Scapteriscus borellii)、黃褐色螻蛄(tawny mole cricket/ Scapteriscus vicinus)及沙漠蝗蟲(desert locust/ Schistocerca gregaria)。
虱目( Phthiraptera)之實例包括但不限於：牛咬蝨(cattle biting louse/ Bovicola bovis)、咬蝨(畜蝨屬( Damalinia)某些種)、貓蝨(cat louse/ Felicola subrostrata)、短鼻牛蝨(shortnosed cattle louse/ Haematopinus eloysternus)、牛尾蝨(tail-switch louse/ Haematopinus quadriperiussus)、豬蝨(hog louse/ Haematopinus suis)、面蝨(face louse/ Linognathus ovillus)、足蝨(foot louse/ Linognathus pedalis)、狗吸血蝨(dog sucking louse/ Linognathus setosus)、長鼻牛蝨(long-nosed cattle louse/ Linognathus vituli)、雞體蝨(chicken body louse/ Menacanthus stramineus)、雞羽蝨(poultry shaft louse/ Menopon gallinae)、人體蝨(human body louse/ Pediculus humanus)、陰蝨(pubic louse/ Phthirus pubis)、小藍牛蝨(little blue cattle louse/ Solenopotes capillatus)及狗咬蝨(dog biting louse/ Trichodectes canis)。
齧蟲目( Psooptera)之實例包括但不限於：書蝨嗜卷書虱 (Liposcelis bostrychophila)、脫色粉齧蟲( Liposcelis decolor)、嗜蟲書虱 (Liposcelis entomophila)及塵虱 (Trogium pulsatorium) 。蚤目之實例包括但不限於：鳥蚤雞角葉蚤( Ceratophyllus gallinae)、狗蚤狗櫛頭蚤( Ctenocephalides canis)、貓蚤貓櫛頭蚤( Ctenocephalides felis)、人蚤(human flea/ Pulex irritans)及東方鼠蚤印度鼠蚤( Xenopsylla cheopis)。
綜合綱 (Symphyla)之實例包括但不限於：花園綜合綱無斑點么蚰 (Scutigerella immaculata) 。
纓尾目( Thysanura)之實例包括但不限於：灰色衣魚(gray silverfish/ Ctenolepisma longicaudata)、四線衣魚(four-lined silverfish/ Ctenolepisma quadriseriata)、普通衣魚(common silverfish/ Lepisma saccharina)及家衣魚(firebrat/ Thermobia domestica)；
纓翅目之實例包括但不限於：菸草薊馬(tobacco thrips/ Frankliniella fusca)、花薊馬(flower thrips/ Frankliniella intonsa)、西部花薊馬(western flower thrips/ Frankliniella occidentalis)、棉花芽薊馬(cotton bud thrips/ Frankliniella schultzei)、帶狀溫室薊馬(banded greenhouse thrips/ Hercinothrips femoralis)、大豆薊馬(soybean thrips/ Neohydatothrips variabilis)、凱利柑橘薊馬(Kelly's citrus thrips/ Pezothrips kellyanus)、鱷梨薊馬(avocado thrips/ Scirtothrips perseae)、甜瓜薊馬(melon thrips/ Thrips palmi)、及洋蔥薊馬(onion thrips/ Thrips tabaci)。
線蟲之實例包括但不限於：寄生線蟲，例如根結線蟲、胞囊線蟲及損傷線蟲，包括異皮線蟲某些種、根結線蟲某些種及球異皮線蟲某些種；尤其胞囊線蟲之成員，包括但不限於：大豆胞囊線蟲( Heterodera glycines/soybean cyst nematode)；甜菜胞囊線蟲( Heterodera schachtii/beet cyst nematode)；穀物胞囊線蟲( Heterodera avenae/cereal cyst nematode)；及馬鈴薯金線蟲 (Globodera rostochiensis)及馬鈴薯白線蟲 (Globodera pailida)(馬鈴薯胞囊線蟲)。損傷線蟲包括但不限於：短體線蟲 (Pratylenchus)某些種。
對本揭示內容敏感之其他昆蟲物種包括：引起公眾及動物健康問題之節肢動物害蟲，例如蚊子，例如來自伊蚊、瘧蚊及庫蚊屬之蚊子，來自蜱、跳蚤及蒼蠅等。
在一個實施例中，可以使用AMP、AMP殺昆蟲蛋白或其農業上可接受之鹽來治療體外寄生蟲。體外寄生蟲包括但不限於：跳蚤、蜱、疥癬、蟎蟲、蚊子、騷擾及叮咬蒼蠅、蝨子，以及包含一種或多種上述體外寄生蟲之組合。術語「跳蚤」包括常見或次要蚤目寄生跳蚤種類，尤其櫛頭蚤屬( Ctenocephalides)物種，尤其貓櫛頭蚤 (C. felis)及犬櫛頭蚤 (C. canis)、大鼠跳蚤(印度鼠蚤( Xenopsylla cheopis))及人蚤(human flea/ Pulex irritans)。
本揭示案可用於防治、抑制、及/或殺滅主要作物之昆蟲害蟲，例如，在一些實施例中，主要作物及相應害蟲包括但不限於：玉米：歐洲玉米螟( Ostrinia nubilalis，European corn borer)；小地老虎( Agrotis ipsilon，black cutworm)；穀實夜蛾( Helicoverpa zea，corn earworm)；草地貪夜蛾( Spodoptera frugiperda，fall armyworm)；西南玉米螟( Diatraea grandiosella，southwestern corn borer)；南美玉米苗斑螟( Elasmopalpus lignosellus，lesser cornstalk borer)；小蔗桿草螟( Diatraea saccharalis，surgarcane borer)；玉米根葉甲( Diabrotica virgifera，western corn rootworm)；長角葉甲( Diabrotica longicornis barberi, northern corn rootworm)；十一星黃瓜甲蟲( Diabrotica undecimpunctata howardi, southern corn rootworm)；叩頭蟲屬(Melanotus)某些種，線蟲；圓頭犀金龜( Cyclocephala borealis, northern masked chafer (蠐螬))；圓頭無斑犀金龜( Cyclocephala immaculata, southern masked chafer(蠐螬))；日本金龜子( Popillia japonica, Japanese beetle)；玉米跳甲( Chaetocnema pulicaria, corn flea beetle)；玉米象蟲( Sphenophorus maidis, maize billbug)；玉米蚜( Rhopalosiphum maidis, corn leaf aphid)；玉米根蚜( Anuraphis maidiradicis, corn root aphid)；麥長椿象( Blissus leucopterus leucopterus, chinch bug)；紅腿蚱蜢( Melanoplus femurrubrum, redlegged grasshopper)；遷徙蚱蜢( Melanoplus sanguinipes, migratory grasshopper)；種蠅( Hylemya platura, seedcorn maggot)；玉米斑潛蠅( Agromyza parvicornis,corn blot leafminer)；美洲錐尾薊馬( Anaphothrips obscrurus, grass thrips)；竊葉蟻( Solenopsis milesta, thief ant)；二斑葉蟎( Tetranychus urticae, twospotted spider mite)；高粱：斑禾草螟( Chilo partellus, sorghum borer)；草地貪夜蛾( Spodoptera frugiperda, fall armyworm)；穀實夜蛾( Helicoverpa zea, corn earworm)；南美玉米苗斑螟( Elasmopalpus lignosellus, lesser cornstalk borer)；粒膚地老虎( Feltia subterranea, granulate cutworm)；蠐螬( Phyllophaga crinita, white grub)；偽金針蟲屬(Eleodes)、寬胸叩甲屬(Conoderus)、及擬步蟲(Aeolus)某些種，線蟲；橙足負泥蟲( Oulema melanopus, cereal leaf beetle)；玉米跳甲( Chaetocnema pulicaria, corn flea beetle)；玉米象蟲( Sphenophorus maidis, maize billbug)；玉米蚜( Rhopalosiphum maidis, corn leaf aphid)；甘蔗黃蚜( Sipha flava, yellow sugarcane aphid)；麥長椿象( Blissus leucopterus leucopterus, chinch bug)；高梁癭蚊( Contarinia sorghicola, sorghum midge)；朱砂葉蟎( Tetranychus cinnabarinus, carmine spider mite)；二斑葉蟎( Tetranychus urticae, twospotted spider mite)；小麥：一星黏蟲( Pseudaletia unipunctata, army worm)；草地貪夜蛾( Spodoptera frugiperda, fall armyworm)；南美玉米苗斑螟( Elasmopalpus lignosellus, lesser cornstalk borer)；西部地老虎( Agrotis orthogonia, western cutworm)；南美玉米苗斑螟( Elasmopalpus lignosellus, lesser cornstalk borer)；橙足負泥蟲( Oulema melanopus, cereal leaf beetle)；車軸草葉象蟲( Hypera punctata, clover leaf weevil)；十一星黃瓜甲蟲( Diabrotica undecimpunctata howardi, southern corn rootworm)；俄國小麥蚜蟲；麥二叉蚜( Schizaphis graminum, greenbug)；麥長管蚜( Macrosiphum avenae, English grain aphid)；紅腿蚱蜢( Melanoplus femurrubrum, redlegged grasshopper)；差異蚱蜢( Melanoplus differentialis, differential grasshopper)；遷徙蚱蜢( Melanoplus sanguinipes, migratory grasshopper)；小麥癭蚊( Mayetiola destructor, Hessian fly)；麥紅吸漿蟲( Sitodiplosis mosellana, wheat midge)；麥稈蠅( Meromyza americana, wheat stem maggot)；麥種蠅( Hylemya coarctata, wheat bulb fly)；菸草薊馬( Frankliniella fusca, tobacco thrip)；麥莖蜂( Cephus cinctus, wheat stem sawfly)；麥癭蟎( Aceria tulipae, wheat curl mite)；向日葵：向日葵芽蛾( Suleima helianthana, sunflower bud moth)；向日葵螟( Homoeosoma electellum, sunflower moth)；向日葵葉甲( Zygogramma exclamationis, sunflower beetle)；胡蘿蔔金龜( Bothyrus gibbosus, carrot beetle)；向日葵籽癭蚊( Neolasioptera murtfeldtiana, sunflower seed midge)；棉花：菸芽夜蛾，棉花蚜蟲；穀實夜蛾、棉鈴蟲；甜菜夜蛾( Spodoptera exigua, beet armyworm)；棉紅鈴蟲( Pectinophora gossypiella, pink bollworm)；棉鈴象甲( Anthonomus grandis, boll weevil)；棉蚜( Aphis gossypii, cotton aphid)；棉跳盲蝽( Pseudatomoscelis seriatus, cotton fleahopper)；紋翅粉虱( Trialeurodes abutilonea, banded winged whitefly)；牧草盲蝽( Lygus lineolaris, tarnished plant bug)；紅腿蚱蜢( Melanoplus femurrubrum, redlegged grasshopper)；差異蚱蜢( Melanoplus differentialis, differential grasshopper)；洋蔥薊馬( Thrips tabaci, onion thrips)；菸草薊馬( Franklinkiella fusca, tobacco thrip)；朱砂葉蟎( Tetranychus cinnabarinus, carmine spider mite)；二斑葉蟎( Tetranychus urticae, twospotted spider mite)；稻：小蔗桿草螟( Diatraea saccharalis, sugarcane borer)；草地貪夜蛾( Spodoptera frugiperda, fall armyworm)；穀實夜蛾( Helicoverpa zea, corn earworm)；葡萄肖葉甲( Colaspis brunnea, grape colaspis)；稻水象( Lissorhoptrus oryzophilus, rice water weevil)；稻象 (Sitophilus oryzae, rice weevil)；黑尾葉蟬( Nephotettix nigropictus, rice leafhopper)；麥長椿象( Blissus leucopterus, chinch bug)；喜綠蝽( Acrosternum hilare, green stink bug)；大豆：大豆夜蛾( Pseudoplusia includens, soybean looper)；藜豆毛蟲( Anticarsia gemmatalis, velvet bean caterpillar)；苜蓿綠夜蛾( Plathypena scabra, green clover worm)；歐洲玉米螟( Ostrinia nubilalis, European corn borer)；小地老虎( Agrotis ipsilon, black cutworm)；甜菜夜蛾( Spodoptera exigua, beet armyworm)；菸芽夜蛾、棉花蚜蟲；穀實夜蛾、棉鈴蟲；墨西哥豆甲蟲( Epilachna varivestis, Mexican bean beetle)；桃蚜( Myzus persicae, green peach aphid)；馬鈴薯葉蟬( Empoasca fabae, potato leafhopper)；喜綠蝽( Acrosternum hilare, green stink bug)；紅腿蚱蜢( Melanoplus femurrubrum, redlegged grasshopper)；差異蚱蜢( Melanoplus differentialis, differential grasshopper)；種蠅( Hylemya platura, seedcorn maggot)；大豆薊馬( Sericothrips variabilis, soybean thrips)；洋蔥薊馬( Thrips tabaci, onion thrips)；土耳其斯坦葉蟎( Tetranychus turkestani, strawberry spider mite)；二斑葉蟎( Tetranychus urticae, twospotted spider mite)；大麥：歐洲玉米螟( Ostrinia nubilalis, European corn borer)；小地老虎( Agrotis ipsilon, black cutworm)；麥二叉蚜( Schizaphis graminum, greenbug)；麥長椿象( Blissus leucopterus leucopterus, chinch bug)；喜綠蝽( Acrosternum hilare, green stink bug)；褐臭蝽( Euschistus servus, brown stink bug)；種蠅( Delia platura, seedcorn maggot)；小麥癭蚊( Mayetiola destructor, Hessian fly)；麥岩蟎( Petrobia latens, brown wheat mite)；油菜：甘藍蚜蟲( Brevicoryne brassicae, cabbage aphid)；跳甲( Phyllotreta cruciferae, Flea beetle)；披肩黏蟲( Mamestra configurata, Bertha armyworm)；小菜蛾( Plutella xylostella, Diamond-back moth)；地種蠅屬(Delia )某些種，根蛆。
在一些實施例中，AMP、AMP殺昆蟲蛋白、或其農業上可接受之鹽可用來治療前述昆蟲中之任何一者或多者、或本文所述任何昆蟲。
對本揭示內容敏感之昆蟲包括但不限於諸如以下之族：蜚蠊目( Blattaria)、鞘翅目、彈尾目( Collembola)、雙翅目、棘口吸蟲目( Echinostomida)、半翅目、膜翅目、等翅目、鱗翅目、脈翅目( Neuroptera)、直翅目、桿形目( Rhabditida)、蚤目，及纓翅目。屬物種如下所示：黑地狼夜蛾 (Actebia fennica)、小地老虎 (Agrotis ipsilon)、黃地老虎 (A. segetum)、大豆夜蛾 (Anticarsia gemmatalis)、橘帶捲蛾( Argyrotaenia citrana)、菜粉蝶 (Artogeia rapae)、中國桑蠶 (Bombyx mori)、玉米幹夜蛾 (Busseola fusca)、馬氏丁字灰蝶 (Cacyreus marshalli)、二化螟 (Chilo suppressalis)、雲杉色捲蛾 (Choristoneura fumiferana)、西部雲杉色捲蛾 (C. occidentalis)、賈克松色捲蛾( C. pinus pinus)、玫瑰色捲蛾 (C. rosacena)、稻縱卷葉野螟 (Cnaphalocrocis medinalis)、爻紋皮細蛾( Conopomorpha cramerella)、斜紋捲蛾( Ctenopseustis obliquana)、蘋果蠹蛾( Cydia pomonella)、大紅斑蝶 (Danaus plexippus)、小蔗桿草螟 (Diatraea saccharalis)、西南玉米螟( D. grandiosella)、翠紋鑽夜蛾 (Earias vittella)、南美玉米苗斑螟 (Elasmolpalpus lignoselius)、甘薯桿螟( Eldana saccharina)、地中海粉螟( Ephestia kuehniella)、菜豆葉小捲蛾( Epinotia aporema)、蘋果褐捲蛾( Epiphyas postvittana)、大蠟螟( Galleria mellonella)、屬–種穀實夜蛾 (Helicoverpa zea)、澳大利亞棉鈴蟲 (H. punctigera)、棉鈴蟲 (H. armigera)、菸芽夜蛾 (Heliothis virescens)、美國白蛾 (Hyphantria cunea)、鐵杉尺蠖( Lambdina fiscellaria)、大豆食心蟲( Leguminivora glycinivorella)、鮮食葡萄小捲蛾 (Lobesia botrana)、舞毒蛾( Lymantria dispar)、森林天幕毛蟲( Malacosoma disstria)、甘藍夜蛾 (Mamestra brassicae)、蓓帶夜蛾 (M. configurata)、菸草天蛾( Manduca sexta)、稻卷葉蟲( Marasmia patnalis)、豆野螟( Maruca vitrata)、白斑合毒蛾( Orgyia leucostigma)、歐洲玉米螟 (Ostrinia nubilalis)、亞洲玉米螟 (O. furnacalis)、蘋果褐捲蛾( Pandemis pyrusana)、棉紅鈴蟲 (Pectinophora gossypiella)、咖啡潛葉蛾( Perileucoptera coffeella)、馬鈴薯麥蛾( Phthorimaea operculella)、淺綠頭捲葉蛾( Planotortrix octo)、雜食捲葉蛾( Platynota stultana)、菜白蝶 (Pieris brassicae)、印度穀斑螟( Plodia interpunctella)、小菜蛾 (Plutella xylostella)、大豆尺夜蛾 (Pseudoplusia includens)、向日葵尺蠖( Rachiplusia nu)、三化螟( Scirpophaga incertulas)、跗毛蛀莖夜蛾 (Sesamia calamistis)、維吉尼亞雪燈蛾( Spilosoma virginica)、甜菜夜蛾 (Spodoptera exigua)、草地貪夜蛾 (Spodoptera frugiperda)、棉貪夜蛾 (Spodoptera littoralis)、莎草黏蟲( Spodoptera exempta)、斜紋夜蛾 (Spodoptera litura)、馬鈴薯莖蛾( Tecia solanivora)、松異舟蛾( Thaumetopoea pityocampa)、粉紋夜蛾 (Trichoplusia ni)、鹿蝙蝠蛾( Wiseana cervinata)、 Wiseana copularis、 Wiseana jocosa、蜚蠊目小蠊屬( Blattaria blattella)、彈尾目奇跳蟲屬( Collembola xenylla)、彈尾目符跳屬( Collembola folsomia)、白符跳( Folsomia candida)、棘口吸蟲目片吸蟲屬( Echinostomida fasciola)、半翅目突角長蝽屬( Hemiptera oncopeltus)、半翅目粉蝨屬( Hemiptera bemisia)、半翅目長管蚜屬( Hemiptera macrosiphum)、半翅目縊管蚜屬( Hemiptera rhopalosiphum)、半翅目瘤額蚜屬( Hemiptera myzus)、膜翅目松葉蜂屬( Hymenoptera diprion)、膜翅目蜜蜂屬( Hymenoptera apis)、膜翅目長體繭蜂屬( Hymenoptera Macrocentrus)、膜翅目懸繭蜂屬( Hymenoptera Meteorus)、膜翅目金小蜂屬( Hymenoptera Nasonia)、膜翅目水蟻屬( Hymenoptera Solenopsis)、等足目鼠婦屬( Isopoda porcellio)、等翅目散白蟻屬( Isoptera reticulitermes)、 Orthoptera Achta、前氣門目葉蟎屬( Prostigmata tetranychus)、桿形目擬麗突屬( Rhabitida acrobeloides)、桿形目新桿狀線蟲( Rhabitida caenorhabditis)、 Rhabitida distolabrellus、 Rhabitida panagrellus、桿形目銼齒線蟲( Rhabitida pristionchus)、桿形目短體線蟲( Rhabitida pratylenchus)、桿形目鉤口線蟲屬( Rhabitida ancylostoma)、桿形目日圓線蟲屬( Rhabitida nippostrongylus)、 Rhabitida panagrellus、桿形目血矛線蟲屬( Rhabitida haemonchus)、桿形目根結線蟲屬( Rhabditida meloidogyne)、及蚤目櫛頭蚤屬( Siphonaptera ctenocephalides)。
本揭示案提供植物轉型方法，其可用於轉型任何植物物種，包括但不限於單子葉植物及雙子葉植物。轉殖基因方法將為特別有用方法之作物包括但不限於：苜蓿、棉花、番茄、玉米、小麥、玉米、甜玉米、紫苜蓿、大豆、高粱、豌豆、亞麻籽、紅花、油菜籽、油菜、水稻、大豆、大麥、向日葵、樹木(包括針葉及落葉)、花卉(包括商業化及溫室種植之彼等)、羽扇豆、柳枝稷、甘蔗、土豆、西紅柿、菸草、十字花科植物、辣椒、甜菜、大麥及油菜、蕓苔屬、黑麥、小米、花生、甘藷、木薯、咖啡、椰子、菠蘿、柑橘樹、可可、茶、香蕉、鱷梨、無花果、番石榴、芒果、橄欖、木瓜、腰果、澳洲堅果、杏仁、燕麥、蔬菜、觀賞植物及針葉樹。
本揭示案提供植物轉型方法，其可用於轉型任何植物物種，包括但不限於單子葉植物及雙子葉植物。轉殖基因方法或植物併入保護劑(PIP)將為特別有用方法之作物包括但不限於：苜蓿、棉花、番茄、玉米、小麥、玉米、甜玉米、紫苜蓿、大豆、高粱、豌豆、亞麻籽、紅花、油菜籽、油菜、水稻、大豆、大麥、向日葵、樹木(包括針葉及落葉)、花卉(包括商業化及溫室種植之彼等)、羽扇豆、柳枝稷、甘蔗、土豆、西紅柿、菸草、十字花科植物、辣椒、甜菜、大麥及油菜、蕓苔屬、黑麥、小米、花生、甘藷、木薯、咖啡、椰子、菠蘿、柑橘樹、可可、茶、香蕉、鱷梨、無花果、番石榴、芒果、橄欖、木瓜、腰果、澳洲堅果、杏仁、燕麥、蔬菜、觀賞植物及針葉樹。
在一些實施例中，本揭示案之組成物、混合物及/或方法可應用於選自由以下組成之群之昆蟲及/或害蟲之所在地：尺蠖；雜食性捲葉蛾；天蛾幼蟲；菜青蟲；菱紋背蛾；苜蓿綠夜蛾；結網蟲；鹽澤燈蛾；黏蟲；切根蟲；橫條紋卷葉菜蟲；豆莢蠕蟲；藜豆毛蟲；大豆尺蠖；番茄螟蛉；豆雜色夜蛾；瓜蟲；皮蟲複合物；果樹捲葉蛾；柑橘夜蛾；夜蛾；桔鳳蝶；柑橘夜蛾；紅疣天社蛾；天幕毛蟲；美國白蛾；胡桃天社蛾；尺蠖幼蟲；舞毒蛾；雜色捲葉蛾；紅色帶狀捲葉蛾；簇絨蘋果食芽蛾；東方果蛾)；榛樹捲葉蛾；斜帶狀捲葉蛾；蘋果蠹蛾；樹枝蛀蟲；葡萄葉雕葉蟲；葡萄灰黑螟；阿赫瑪天蛾(天蛾幼蟲)；甜橙捲葉蛾；菸草夜蛾幼蟲)；葡萄捲葉蛾；尺蠖；苜蓿粉蝶；棉鈴蟲；頭蛾；鱷梨捲蛾；雜食尺蠖；艾羅蛾(天蛾幼蟲)；愛歐蛾；夾竹桃蛾；阿德利亞毛蟲；天蛾幼蟲；捲葉蛾；黃斑蕉弄蝶；Batrachedra comosae(Hodges)；特格拉蛾；洋薊羽蛾；薊蝴蝶；蓑蛾；春及秋尺蠖；榆樹尺蠖；加州槲蛾；松蝴蝶；雲杉捲葉蛾；鞍突出刺蛾；花旗松毒蛾；老年毒蛾；黑頭食心蟲；含羞草結網蟲；短葉松芽捲蛾；鞍背刺蛾；綠條犀額蛾；或鐵杉尺蠖。
在一些實施例中，本揭示案之肽、蛋白、組成物、混合物及/或方法可應用於選自由以下組成之群之昆蟲及/或害蟲之所在地：阿赫瑪天蛾(天蛾幼蟲) (葡萄蔓天蛾)；苜蓿粉蝶(紋黃豆粉蝶)；粉斑螟(乾果斑螟)；鱷梨捲蛾(白紋捲蛾)；黏蟲(灰翅夜蛾屬某些種，例如甜菜夜蛾、草地貪夜蛾、海灰翅夜蛾、白點黏蟲)；洋薊羽蛾；阿德利亞毛蟲(大配片舟蛾)；蓑蛾(頓袋蛾)；蔗扁蛾(木豹蛾)；黃斑蕉弄蝶；黑頭食心蟲(西黑頭長翅捲蛾)；加州槲蛾；白斑春尺蠖；櫻實小捲蛾(櫻小食心蟲)；中國標記蛾(露尾萍螟)；柑橘夜蛾；蘋果蠹蛾；蔓越莓果蟲；橫條紋卷葉菜蟲；切根蟲(夜蛾物種，小地老虎)；花旗松毒蛾(黃杉合毒蛾)；艾羅蛾(天蛾幼蟲) (木薯天蛾)；榆樹尺蠖(榆秋黃尺蛾)；歐洲葡萄蔓蛾(鮮食葡萄小捲蛾)；歐洲弄蝶(無斑豹弄蝶)；埃塞克斯弄蝶；美國白蛾；榛樹捲葉蛾(薔薇黃捲蛾)；果樹捲葉蛾；葡萄捲葉蛾( Paralobesia viteana))；葡萄灰黑螟(荷蘭石竹小捲蛾( Platynota stultana)))；葡萄葉雕葉蟲；苜蓿綠夜蛾；綠條犀額蛾(粉色楓蛾)；Gummosos-Batrachedra Comosae (Hodges)；舞毒蛾；鐵杉尺蠖；天蛾幼蟲(菸草天蛾屬某些種)；菜青蟲(菜粉蝶)；愛歐蛾(巨斑刺蛾)；短葉松芽捲蛾(賈克松色捲蛾)；蘋果淺褐捲葉蛾(蘋淡褐捲蛾)；瓜蟲(絹野螟)；含羞草結網蟲(含羞草雕蛾)；斜帶狀捲葉蛾(玫瑰色捲蛾)；夾竹桃蛾；雜食性捲葉蛾；雜食尺蠖；桔鳳蝶(美洲大芷鳳蝶)；甜橙捲葉蛾(橘帶捲蛾)；東方果蛾(梨小食心蟲)；桃條麥蛾幼蟲(桃條麥蛾)；松蝴蝶(美洲松粉蝶)；豆莢蠕蟲；紅色帶狀捲葉蛾(紅帶捲蛾)；紅疣天社蛾(紅山背舟蛾)；皮蟲複合物(各種鱗翅類)；鞍背刺蛾；鞍突出刺蛾(鞍斑美洲舟蛾)；鹽澤燈蛾；草地螟(草螟某些種)；尺蠖(榆秋黃尺蛾)；秋尺蠖(波林尺蠖)；雲杉捲葉蛾(雲杉色捲蛾)；天幕毛蟲(各種枯葉蛾科)；菠蘿褐灰蝶(Geyr)；菸草天蛾幼蟲(菸草天蛾)；菸葉螟(菸草粉斑螟)；簇絨蘋果食芽蛾(蘋白小捲蛾)；樹枝蛀蟲(桃條麥蛾)；豆雜色夜蛾(疆夜蛾)；雜色捲葉蛾；藜豆毛蟲(大豆夜蛾)；胡桃天社蛾(核桃配片舟蛾)；結網蟲(美國白蛾)；老年毒蛾(西部櫟柳毒蛾)；玉米草螟(南方玉米螟)；玉米穗蛾；甘薯小象蟲；胡椒莖象甲；桔根象甲；草莓根象甲；美核桃象甲)；榛象甲；稻水象甲；苜蓿葉象甲；三葉草象鼻蟲；茶穿孔蛀蟲；根象甲；甘蔗犀金龜；咖啡果小蠹；早熟禾象甲(早熟禾象鼻蟲)；紫絨鰓角金龜；歐金龜；綠花金龜；日本金龜子(日本弧麗金龜)；五月或六月金龜子(食葉鰓金龜屬)；圓頭犀金龜(北方方頭甲)；東方麗金龜(東方異麗金龜)；圓頭無斑犀金龜(淺黃方頭甲)；穀象(象蟲總科)；埃及伊蚊；玉米幹夜蛾；二化螟；尖音庫蚊；致倦庫蚊；玉米根葉甲；小蔗桿草螟；棉鈴蟲；穀實夜蛾；菸芽夜蛾；馬鈴薯葉甲；亞洲玉米螟；歐洲玉米螟；棉紅鈴蟲；印度穀螟；小菜蛾；大豆尺夜蛾；甜菜夜蛾；草地貪夜蛾；棉貪夜蛾；粉紋夜蛾；及榆黃瑩葉甲。
在一些實施例中，本揭示案之肽、蛋白、組成物、混合物及/或方法可應用於選自由以下組成之群之甲蟲成蟲之所在地：紫絨鰓角金龜( Maladera castanea)；金斑橡樹蛀蟲( Agrilus coxalis auroguttatus)；綠花金龜( Cotinis nitida)；日本金龜子(日本弧麗金龜 (Popillia japonica))；五月或六月金龜子(食葉鰓金龜屬( Phyllophaga))；東方麗金龜(東方異麗金龜 (Anomala orientalis))；及/或無患子蛀蟲( Agrilus prionurus)。
在一些實施例中，本揭示案之組成物、混合物及/或方法可應用於選自由以下組成之群的作為幼蟲(一化性蠐螬)之昆蟲及/或害蟲之所在地：早熟禾象甲(早熟禾象鼻蟲 (Listronotus maculicollis))；紫絨鰓角金龜( Maladera castanea)；歐金龜( Rhizotroqus majalis)；綠花金龜( Cotinis nitida)；日本金龜子(日本弧麗金龜 (Popillia japonica))；五月或六月金龜子(食葉鰓金龜屬( Phyllophaga))；圓頭犀金龜 (北方方頭甲 (Cyclocephala borealis))；東方麗金龜(東方異麗金龜 (Anomala orientalis))；圓頭無斑犀金龜(淺黃方頭甲 (Cyclocephala lurida))；及穀象(象蟲總科 (Curculionoidea))。 實例
本說明書之實例不意欲並且不應用於限制本發明；其僅提供用於說明本發明。 實例 1. Av3b
Av3為由蛇鎖海葵 (Anemonia viridis)(另外以其普通名稱溝迎風海葵(Snakelocks anemone)為已知的)所產生的一種III型海葵毒素。提供來自蛇鎖海葵之示例性Av3多肽，其具有胺基酸序列「RSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPKV」(SEQ ID NO:172)(NCBI登錄號P01535.1)。野生型Av3可突變，例如在一些實施例中，野生型Av3可具有N末端突變及C末端突變，其中N末端突變產生相對於SEQ ID NO:172之R1K之胺基酸取代，並且C末端突變產生相對於SEQ ID NO:172之胺基酸缺失；因而，野生型Av3肽胺基酸序列自「RSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPKV」(SEQ ID NO:172)改變為胺基酸序列「KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK」(SEQ ID NO:1)。術語「Av3b」係指具有前述突變之實施例。
獲得Av3b之示例性方法揭示於PCT申請案第PCT/US2019/051093號中，其揭示內容以全文引用方式併入本文。
雖然Av3b展現相對於野生型Av3之極好性質(參見PCT/US2019/051093)，但是重組蛋白之工業生產仍然存在多個難題。事實上，與生產所需重組蛋白相關之製造過程之擴大可能既昂貴又復雜，需要考慮之問題太多。例如，重組蛋白生產中之常見難題包括例如重組蛋白在純化過程中不能結合管柱；宿主蛋白裂解不良(例如，在細菌表現系統中)；蛋白分泌不良(例如，在酵母表現系統中)；蛋白降解；不當內源蛋白之共純化；重組蛋白之沉澱及/或不當凝聚；折疊不正確；穩定性低；表現不佳；活性減少；不合意轉譯後修飾；以及熟習此項技術者已知之其他難題。參見 例如S. Rudge及M. Ladisch, Industrial Challenges of Recombinant Proteins. Adv Biochem Eng Biotechnol. 2020;171:1-22；及Palomares等人, Production of recombinant proteins: challenges and solutions. Methods Mol Biol. 2004;267:15-52。因此，鑑於上述難題(以及其他人未能提出解決方案)，該行業仍然存在長期需求。 單突變體能量狀態(ΔΔG)分析
為了識別具有理想特性並克服蛋白生產中之難題的Av3b突變體，使用Cyrus Biotechnology (https://cad.cyrusbio.com/) 提供之在線Rosetta蛋白建模程式進行了單突變體能量狀態(ΔΔG)分析。
在分析中，除了六個半胱胺酸殘基外，Av3b一級序列中之每個殘基都被突變為19個可能胺基酸，除了其本身外分別在聚矽氧中使用Rosetta ΔΔG演算法。對於每個突變，計算折疊Av3b肽與折疊單突變肽之間之吉布斯自由能變化差(ΔΔG)。所有可能突變之ΔΔG組成Av3b肽之ΔΔG圖，其可為後續蛋白工程化提供指導。
「ΔΔG」或「Delta Delta G」或「DDG」為預測點突變如何影響蛋白穩定性之有用度量。在本文中，ΔΔG表示吉布斯自由能變化之變化，亦即其為折疊與展開狀態之間的能量變化(ΔG折疊)，以及當存在點突變時該ΔG折疊的變化的量度。吉布斯自由能為在恆壓下發生之自發反應最小化的熱力學量；吉布斯自由能可以用以下等式來表示：(G) = 焓(H) - 溫度(T) x 熵(S)。參見Atkins及de Paula, Physical Chemistry, 第7版(2002)，其揭示內容以全文引用方式併入本文。因此，化學過程中吉布斯自由能之變化(亦即ΔG)隨著反應焓變ΔH、反應熵變ΔS及反應溫度T而變化：Δ G=ΔH−TΔS 。
突變體能量分析揭示了幾個可能影響穩定性之胺基酸殘基及位置。參見下表。
表 3. 單突變體能量狀態(ΔΔG)分析之結果。No. =位置編號；Org. =原始胺基酸殘基。ΔΔG ˂ -3指示可使蛋白穩定的胺基酸取代。-3至3之間的ΔΔG指示具有平均低能量狀態之胺基酸取代。ΔΔG ˃指示不穩定的胺基酸取代。粗體單元格顯示DDG ＜ -3。
No. Org. A R N D C E Q G H I L K M F P S T W Y V
1 K -0.2 -0.4 -0.6 -0.7 0.59 -0.7 -0.4 -0.2 0.08 -0.3 0.06   -2.3 1.12 -7.3 -0.9 -0.3 1.41 0.72 0.08
2 S 2.69 2.21 1.65 2.68 2.58 2.57 2.76 2.76 3.31 2.73 3.04 2.35 2.13 2.45 -8.6   -0.9 2.42 2.17 2.71
3 C                                                            
4 C                                                            
5 P 1.71 2.21 0.28 0.99 2.27 0.57 2.02 3.25 3.29 0.86 0.02 2.14 1.28 -0.1   2.48 1.22 3.81 -0.5 0.85
6 C                                                            
7 Y 0.26 0.41 -0 0.67 1.71 -0.3 0.07 2.35 0.12 0.99 -0.4 -0.4 0.62 -0.2 0.69 0.49 0.64 -0.1   0.67
8 W -0.8 -0.9 -2.1 -0.6 0.18 -1.1 -1.4 1.26 -2.3 -2 -1.9 -1.2 -1.4 -1.9 -0.3 -0.6 -1.2   -2.2 -1.9
9 G -2.3 -0.7 -0.7 -0.1 0.1 -0.3 -2.3   -0.5 3.83 3.85 -0.3 -1.8 -0.5 -8.4 -0.7 3.53 -1.3 -1.2 2.83
10 G -0.9 -1 -3.5 -3.5 -0.4 -2.5 -1.5   -2 -1 -2.1 -1.7 -1.2 -1.9 -7.2 -1.6 -1.9 -1.5 -2.1 -1.2
11 C                                                            
12 P -3.2 -3.6 -4 -3 -1.6 -1.7 -4 -2.4 1.58 -2.2 -2.3 -1.8 -4.5 2.13   0.63 1.68 -0.8 1.2 -1.7
13 W 0.19 0.14 -1.3 -0.8 1.33 -1.7 -0.9 1.24 -1 0.17 -0.8 -0.6 0.5 -0.8 10.2 0.01 -0.1   -1.1 0.26
14 G 0.68 15 19.1 25 13.8 19.8 17   21.4 31.3 27.9 12.1 13.3 19 16.1 11.2 19.6 22.7 19.4 23.9
15 Q -0.3 -0.3 -1 -0.7 1.06 -0.6   1 -0.4 2.37 -0.7 -0.4 0.63 0.45 3.79 -0.2 -0.1 1.28 0.06 0.6
16 N 2.21 1.75   0.16 2.95 2.13 1.77 4.49 0.56 2.28 0.85 1.68 1.51 0.15 0.64 2.13 1.49 0.79 -0 2.2
17 C                                                            
18 Y 6.23 7.17 6.08 12.4 4.87 11.1 7.08 16.1 3.59 9.63 5.66 10.5 5.45 -0.9 21.1 7.38 5.24 1.28   6.21
19 P 4.24 4.52 4.26 2.61 5.82 3.94 0.96 5.3 4.97 4.74 3.83 3.59 1.58 3.67   3.59 4.11 4.37 4.3 3.71
20 E 1.59 1.09 0.54 0.59 2.57   0.46 2.24 0.6 3.18 0.41 0.23 0.95 0.24 9.97 1.39 1.29 1.46 -0.3 1.48
21 G 5.65 10.1 5.58 5.6 10.1 9.55 6.3   8.69 13.7 9.33 6.26 11.2 9.88 6.34 3.14 8.82 9.93 7.86 13.8
22 C                                                            
23 S 0.75 -0.9 -0.2 -0.1 1.86 -0.1 0.43 0.78 0.51 1.26 0.5 -0.5 0.82 0.63 3.25   0.42 1.51 0.24 0.92
24 G 5.5 18 28.6 22.4 21.6 23.2 45.3   31.4 36.1 43.6 20.2 21.8 26.1 5.44 9.82 24.5 32.1 30.8 31.3
25 P 3.72 -1.8 3.88 2.36 5.57 1.4 3.77 -0.2 3.54 5.68 3.98 1.47 2.64 4.27   2.45 2.74 3.53 3.95 3.75
26 K -0.4 -0.3 -2 0.87 0.29 -0.6 -1 0.49 -1.6 0.3 -0.2   -0.1 -1.4 0.2 -0.8 -1.2 -0.2 -0.1 -0.6
實例 2. 產生候選突變體：第一輪
為了設計新Av3b突變肽(AMP)，選擇Av3b之非必需殘基作為突變靶標，並使用Av3b之ΔΔG圖作為基於多種不同工程策略的所有選定靶標殘基之突變選擇指導，然後Cyrus Biotechnology(https://cad.cyrusbio.com)提供的Rosetta Relax演算法應用於所有可能突變，得到具有不同穩定性(藉由ΔΔG量測)之Av3b突變體。選擇最穩定突變體進行測試以確定對肽產率之影響。亦採用了其他突變策略；例如，靶向參與二硫鍵形成之殘基的突變。下表列出了在第一輪突變中評估之所有突變體。
如下進行Av3b突變肽之產生：首先，產生可操作以表現給定Av3b突變肽胺基酸序列的表現乳酸克魯維酵母酵母菌株。接下來，每個突變構築體之DNA密碼子都針對乳酸克魯維酵母表現進行了最佳化。最後基於pLB103b2T4酵母表現載體來生成肽表現載體，其中Av3b突變肽表現為分泌肽，卡那黴素抗性基因向表現菌株提供遺傳黴素(G418)抗性。
藉由用限制酶SacII消化來將表現載體線性化；然後藉由電穿孔將得到的線性質體轉型至乳酸克魯維酵母細胞中。採集至少16個所得陽性轉型菌落用於產率分析。所採集轉型體用於接種48孔深孔培養板之培養孔，其中各孔含有2.2 mL培養基(DMSor)：2 g/L Solulys 095K、11.83 g/L KH 2PO 4、2.299 g/L K 2HPO 4、40 g/L山梨糖醇、1 g/L MgSO 4.7H 2O、10 g/L (NH 4)SO 4、0.33 g/L CaCl 2.2H 2O、1 g/L NaCl、1 g/L KCl、5 mg/L CuSO 4.5H 2O、30 mg/L MnSO 4.H 2O、10 mg/L ZnCl 2、1 mg/L KI、2 mg/L CoCl 2.6H 2O、8 mg/L Na 2MoO 4.2H 2O、0.4 mg/L H 3BO 3、15 mg/L FeCl 3.6H 2O、0.8 mg/L生物素、20 mg/L泛酸鈣、15 mg/L硫胺素、16 mg/L肌醇、10 mg/ L菸鹼酸、及4 mg/L吡哆醇。
用無菌透氣密封件密封深孔培養板，並在23.5℃、250 rpm下培養6天。培養6天後，將深孔培養板以4000 rpm旋轉10分鐘，收集細胞沉澱及上清液，將細胞沉澱再懸浮於1mL 20%甘油中，以便在-80℃冷凍器中長期保存菌株。上清液含有所表現Av3b突變肽，隨後進行rpHPLC評估以確定肽產率。
為了運行rpHPLC，將上清液經由0.2 µm濾膜過濾；然後，將300 µL過濾後之上清液轉移至500 µL 96孔板中，使用由Chromeleon 7軟體控制之Ultramate 3000 HPLC系統(ThermoFisher®)進行rpHPLC分析。使用具有0.1%三氟乙酸之水及乙腈作為流動相，使用整體式C18管柱進行rpHPLC。使用23-37%乙腈之溶析方案用於肽純化，其中肽在32-35%乙腈範圍內溶析。來自HPLC層析之相應Av3b突變體峰面積用於計算肽產率。
在HPLC分析中觀察到之峰藉由rpHPLC純化並使用聯線配備Agilent HPLC系統之Waters/Micromass ESI-TOF質譜儀來進行LC/MS鑑定。LC/MS結果證實了新的突變胺基酸序列。
表 4. 第一輪突變體列表。顯示相對於野生型Av3之突變。增加之產率係相對於Av3b表現而言的：Y =是；N =否。
名稱 胺基酸序列 突變 增加產率
Av3b KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK R1K, Δ C末端 NA
Av3bM1 KSACPCYWGGAPWGQNCYPEGCSGPK C3A, C11A N
Av3bM2 KSPCPCYWGGAPWGQNCYPEGCSGPK C3P, C11A N
Av3bM3 KSNCPCYWGGTPWGQNCYPEGCSGPK C3N, C11T N
Av3bM4 PSCCPCYWPNCPWGQNCYPEGCSGPK K1P, G9P, G10N N
Av3bM5 KSCCPCYWPNCPWGQNCYPEGCSGPK G9P, G10N Y
Av3bM6 TSCCPCYWPYCPWGQNCYPEGCSGPT K1T, G9P, G10Y, K26T N
Av3bM7 TSCCPCYWPYCPWGQNCYPEGCSGPR K1T, G9P, G19Y, K26R N
Av3bM8 TSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPT K1T, K26R N
Av3bM9 TSCCPCYWGGCPWGTTCYPNGCDGPT K1T, Q15T, N16T, E20N, S23D, K26T N
Av3bM10 TSCCPCYWGGCPWGQTCYPNGCDGPT K1T, N16T, E20N, S23D, K26T N
Av3bM11 TSCCPCYWGGCPWGQTCYPNGCDGPR K1T, N16T, E20N, S23D, K26R N
Av3bM12 TSCCPCYWGGCPWGTTCYPNGCDGST K1T, Q15T, N16T, E20N, S23D, P25S, K26T N
Av3bM13 TSCCPCYWGGCPWGQTCYPNGCDGST K1T, N16T, E20N, S23D, P25S, K26T N
Av3bM14 TSCCPCYWGGCPWGQTCYPNGCDGSE K1T, N16T, E20N, S23D, P25S, K26E N
Av3bM15 TSCCPCYWGGCPWGTTCYPNGCDGSR K1T, Q15T, N16T, E20N, S23D, P25S, K26R N
Av3bM16 TSCCPCYWGGCPWGQTCYPNGCDGSR K1T, N16T, E20N, S23D, P25S, K26R N
Av3bM17 KSCAPCYWGGAPWGQNCYPEGCSGPK C4A, C11A N
Av3bM18 KSACPCYWGGCPWGQNAYPEGCSGPK C3A, C17A N
如以上及 圖 1展示，鑑定了領先候選突變體Av3bM5。Av3bM5具有胺基酸序列「KSCCPCYWPNCPWGQNCYPEGCSGPK」(SEQ ID NO:6)，並且具有相對於野生型序列之G9P、G10N突變。 圖 1。
因此，因為Av3bM5突變體導致相對於Av3b之產率增加，此突變體用作意欲進一步增加產率及/或殺昆蟲活性之第二輪突變中之其他突變的起點。 實例 3. 產生候選突變體：第二輪
在上述第一輪突變之結果之後，採用了額外突變策略。此等突變策略包括：肽之非關鍵位置之突變；集中在G9、G10位之突變；以及N端及C端之突變。下面依次論述每種突變策略。 非關鍵突變
Av3b序列為「KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK」(SEQ ID NO: 1)。Av3b具有疏水性菸鹼乙醯膽鹼(NaCh)結合表面，其涉及位置P5、Y7、W8、P12及W13處之殘基。Av3b藥效團不同於其他NaCh位點III毒素，後者利用帶電胺基酸進行結合。基於結合殘基之特性，以及在DDG分析中鑑定為中等能量狀態突變之彼等殘基，鑑定了六個非關鍵殘基以供進一步分析：S2、Q15、N16、E20、S23及P25。在突變體Av3bM19至Av3bM24中檢查了此等非關鍵殘基，以尋找可能導致產率提高之突變。 G9-G10突變體
在初始單突變體能量狀態(ΔΔG)分析期間，突變G9P、G10N (Av3bM5)顯示出提高之產率。為了進一步檢查肽之此位置，進行了以G9及G10為重點的Rosetta relax設計，產生了3個突變體Av3bM25至Av3bM27。
在Rosetta relax設計下，使用Rosetta程式介面選擇候選殘基及所需突變胺基酸；然後指示該程式運行「relax設計」，其中該程式將對基於Av3b結構之折疊後的所有不同突變組合進行結構的簡單全原子細化。該程式將給出每個突變肽之ΔΔG值，從而指示突變體之穩定性。如果突變體不穩定(如其高ΔΔG值所示)，此突變體不太可能在酵母中產生高產率。因此，選擇在relax設計下指示之最穩定突變體用於進一步研究高產率候選突變體。 末端突變體
提出N末端及/或C末端離胺酸作為Av3b降解之靶點。因此，評估此等胺基酸來確定K1或K26突變體可以抵抗降解之程度。在本文中，執行末端突變之Rosetta relax設計，產生六個突變體Av3bM28至Av3bM33。
經由前述突變策略來鑑定之新突變體提供於下表中。
表 5. 第二 輪 突變體 列表。
名稱 胺基酸序列 突變 策略
Av3bM19 KSCCPCYWGGCPWGQDCYPDGCDGPK N16D, E20D, S23D 非關鍵
Av3bM20 KSCCPCYWGGCPWGTTCYPNGCDGPK Q15T, N16T, E20N, S23D
Av3bM21 KSCCPCYWGGCPWGTNCYPEGCSGPK Q15T
Av3bM22 KSCCPCYWGGCPWGQTCYPEGCSGPK N16T
Av3bM23 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPNGCSGPK E20N
Av3bM24 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCDGPK S23D
Av3bM25 KSCCPCYWPGCPWGQNCYPEGCSGPK G9P G9-G10
Av3bM26 KSCCPCYWPPCPWGQNCYPEGCSGPK G9P, G10P
Av3bM27 KSCCPCYWAGCPWGQNCYPEGCSGPK G9A
Av3bM28 HSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK K1H 末端突變體
Av3bM29 QSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK K1Q
Av3bM30 QSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPH K1Q, K26H
Av3bM31 TSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK K1T
Av3bM32 SSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK K1S
Av3bM33 SSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPT K1S, K26T
實例 4. 新突變體之產率
靶突變體之表現載體藉由用限制酶SacII消化來線性化；然後，藉由電穿孔將所得線性質體轉型至乳酸克魯維斯酵母細胞中；採集至少16個所得陽性轉型菌落用於產率分析。然後，所採集轉型體用於接種48孔深孔培養板之培養孔，其中各孔含有2.2 mL培養基(DMSor)：2 g/L Solulys 095K、11.83 g/L KH 2PO 4、2.299 g/L K 2HPO 4、40 g/L山梨糖醇、1 g/L MgSO 4.7H 2O、10 g/L (NH 4)SO 4、0.33 g/L CaCl 2.2H 2O、1 g/L NaCl、1 g/L KCl、5 mg/L CuSO 4.5H 2O、30 mg/L MnSO 4.H 2O、10 mg/L ZnCl 2、1 mg/L KI、2 mg/L CoCl 2.6H 2O、8 mg/L Na 2MoO 4.2H 2O、0.4 mg/L H 3BO 3、15 mg/L FeCl 3.6H 2O、0.8 mg/L生物素、20 mg/L泛酸鈣、15 mg/L硫胺素、16 mg/L肌醇、及10 mg/ L菸鹼酸、及4 mg/L吡哆醇。
用無菌透氣密封件密封深孔培養板，並在23.5℃、250 rpm下培養6天。培養6天後，將深孔培養板以4000 rpm旋轉10分鐘，收集細胞沉澱及上清液，將細胞沉澱再懸浮於1mL 20%甘油中，以便在-80℃冷凍器中長期保存菌株。然後，含有所表現突變肽之上清液經受rpHPLC評估以便確定肽產率。
為了運行rpHPLC，將上清液經由0.2 µm濾膜過濾。然後，將300 µL過濾後之上清液轉移至500 µL 96孔板中，使用由Chromeleon 7軟體控制之Ultramate 3000 HPLC系統(ThermoFisher®)進行rpHPLC分析。使用具有0.1%三氟乙酸之水及乙腈作為流動相，經由整體式C18管柱進行rpHPLC。使用23-37%乙腈之溶析方案用於肽純化，其中肽在32-35%乙腈範圍內溶析。
為了計算突變肽產率，先前產生之Av3b肽質量及其HPLC峰面積關係用於基於來自HPLC層析之相應Av3b突變體峰面積來計算產率。
評估新突變體之產率及活性。突變肽在乳酸克魯維斯酵母表現系統中表現。然後，新突變體之產率相對於Av3b表現菌株來標準化。 圖 2。在本文中，給定新突變菌株之平均產率相對於Av3b生產菌株之平均產率來標準化，並且比率得以展示( 圖 2中之藍色條)。
在本文中，在第二輪突變中產生之所有新突變體展示增加之產率，除了Av3bM20、Av3bM22、及Av3bM26以外。 實例 5. 家蠅分析
執行家蠅注射分析來確定新突變體之活性。成年家蠅用CO 2固定10分鐘，然後轉移至CO 2盤以便保持固定。採集體重在12-20 mg之間之蒼蠅進行注射。將新突變體及Av3b對照用水稀釋至適當注射劑量。接下來，使用帶有1 cc全玻璃注射器及30 號直針之手動微量施藥器，將0.5 µL肽溶液注射到每隻家蠅之背胸。然後將經注射之蒼蠅轉移至具有濕#4過濾紙之2盎司透明部分容器。在注射後5小時，評估蒼蠅擊倒。然後，使用5小時之蒼蠅擊倒評分，給定新突變體之活性相對於Av3b生產菌株(對照)之活性來標準化。擊倒評分之比率(新突變體KD/Av3b KD)呈現於 圖 2中(紅色條)。
家蠅分析之結果示出Av3bM19、Av3bM23、Av3bM24、Av3bM25及Av3bM28具有經改良之產率，儘管未同時出現家蠅擊倒活性之減少。此外，Av3bM27之行為類似於Av3b。 圖 2。
表 6. 第二輪突變體之產率及活性。粗體突出的突變體展示相對於Av3b之增加之產率，同時保持殺昆蟲活性。
名稱 胺基酸序列 突變 產率 活性
Av3bM19 KSCCPCYWGGCPWGQDCYPDGCDGPK N16D, E20D, S23D 是 是
Av3bM20 KSCCPCYWGGCPWGTTCYPNGCDGPK Q15T, N16T, E20N, S23D 否 否
Av3bM21 KSCCPCYWGGCPWGTNCYPEGCSGPK Q15T 是 否
Av3bM22 KSCCPCYWGGCPWGQTCYPEGCSGPK N16T 否 否
Av3bM23 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPNGCSGPK E20N 是 是
Av3bM24 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCDGPK S23D 是 是
Av3bM25 KSCCPCYWPGCPWGQNCYPEGCSGPK G9P 是 是
Av3bM26 KSCCPCYWPPCPWGQNCYPEGCSGPK G9P, G10P 否 否
Av3bM27 KSCCPCYWAGCPWGQNCYPEGCSGPK G9A 是 是
Av3bM28 HSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK K1H 是 是
Av3bM29 QSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK K1Q 是 否
Av3bM30 QSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPH K1Q, K26H 是 否
Av3bM31 TSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK K1T 是 否
Av3bM32 SSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK K1S 是 否
Av3bM33 SSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPT K1S, K26T 是 否
在第二輪突變中，展示突變體Av3bM19、Av3bM23、Av3bM24、Av3bM25、及Av3bM28具有相對於Av3b之增加之產率、及殺昆蟲活性。新突變體Av3bM27具有與Av3b類似的產率及殺昆蟲活性。 圖 2。
本文測試之Av3b突變體之完全產率及家蠅注射分析活性結果提供於 圖 3-9中。產率及穀實夜蛾(玉米穗蛾或「CEW」)注射分析結果呈現於 圖 10-11中。穀實夜蛾注射分析方法於下文描述。 實例 6. 發酵期間之 Av3b 突變體穩定性
使用酵母菌株生產重組肽為生物技術工業中之一種常用技術，其方法在此項技術中為熟知的。然而，與生產重組蛋白相關之難題之一為防止其意外蛋白分解降解。參見 例如Fricke, J.等人Designing a fully automated multi-bioreactor plant for fast DoE optimization of pharmaceutical protein production. Biotechnol. J. 8, 738-747。因此，防止此蛋白分解降解為該行業仍有待滿足之重要目標及長期需求。
為了測試Av3b在生產過程中之穩定性，使用如本文所述發酵條件進行穩定性發酵分析。
大規模產生Av3b肽期間產生的發酵醪含有使Av3b降解的蛋白分解酶。觀察到Av3b之降解發生在pH 6.5，然而，降解發生在pH 4.5時要慢得多。此外，當Av3b包含在pH為4.5或pH為6.5之緩衝溶液中時，Av3b顯示為穩定的。另外，高壓蒸氣處理發酵醪消除Av3b之降解；並且添加EDTA同樣地減少發酵醪中之Av3b降解之量。因此，此等觀察結果指示在發酵過程期間可自酵母細胞產生之一些蛋白酶可造成Av3b之降解。 圖 3。
如 圖 12中示出，在Av3b發酵過程期間，酵母菌株不僅產生Av3b，而且可能分泌具有使Av3b裂解之能力的一些蛋白酶，如80小時之後Av3b產量減少來指示。然而，較低pH值可以替代地抑制蛋白酶活性，或減少細胞中蛋白酶分泌。
預防合意重組蛋白之蛋白分解降解的一種方法為設計包含剔除有害蛋白酶之酵母。另一方法為設計抵抗降解，且/或減少蛋白酶到達潛在裂解位點的肽。因此，採取以下兩個策略：首先，鑑別及剔除來自酵母細胞之致降解性蛋白酶；並且其次，重新工程化Av3肽來避免蛋白酶進入。 實例 7. 鑑別 Av3b 降解產物
為了鑑別Av3b降解產物，執行反相HPLC(rpHPLC)。Av3b發酵醪之層析指示在主要Av3b峰之後，存在3個額外峰(被鑑別為DP1、DP2及DP3)。 圖 13。
將峰收集並且藉由液相層析/質譜(LC/MS)來分析。LC/MS分析指示DP1為Av3b之兩個C末端截短產物之混合物：ΔK26及ΔP25-ΔK26，其中後者為存在之主要物質。DP2被鑑別為K26截短產物。並且，DP3未藉由LC/MS來鑑別。此等資料指示羧基-肽酶可能造成發酵期間之Av3b降解。 圖 13。 實例 8. 鑑別 Av3b 發酵醪中之蛋白酶
來自Av3b生產菌株之發酵醪使用AKTA Pure 25快速蛋白液相層析(FPLC)系統(貨號29018226 Cytiva, Global Life Sciences Solutions USA LLC, 100 Results Way, Marlborough, MA 01752, USA)，並且使用預充填Superdex Increase 200GL尺寸排阻管柱(貨號28990944；Cytiva, Global Life Sciences Solutions USA LLC, 100 Results Way, Marlborough, MA 01752, USA)來分級。
簡言之，GE AKTA Pure 25 FPLC系統用於收集Av3b醪流份。所使用管柱為預充填尺寸排阻管柱(GE, Superdex Increase 200GL，尺寸：10x300 mm，床體積24 mL；分離蛋白尺寸：10,000至600,000道爾頓 最大負載體積：0.5 mL)。校準及溶析緩衝液如下：MES緩衝液：2-( N-嗎啉基)乙磺酸(MES) 50 mM，NaCl 150 mM，pH 6.0。
在獲得27℃，pH 6.5下培養之酵母菌株「pKS022-YCT-38-14」(Av3b生產菌株)菌株之發酵醪批料之樣品。降解在發酵過程期間72小時開始，並且在發酵過程結束時，發酵醪中之Av3b之最終量為0 g/L。
使用pH 6.0之MES緩衝液，執行溶析，以便進行流份收集；向200 µL所有收集流份加入HPLC純化Av3b (10 µg)至最終0.05 µg/µL，並且在37℃下培育40小時，然後進行Av3b降解之HPLC評估。 圖 14。
四個流份展示蛋白酶活性：流份#8、#9、#12及#13。使用200 µL流份#8之Av3b培育之後的HPLC層析展示於 圖 15中。如 圖 15展示，發生某個水準之降解，由此導致釋放一些降解峰。
使用200 µL流份#9之Av3b培育之後的HPLC層析展示於 圖 16中。如 圖 16展示，與流份#8相比，發生更高比率之降解，並且類似地存在一些降解峰之釋放。
使用200 µL流份#12之Av3b培育之後的HPLC層析展示於 圖 17中。如 圖 17展示，在四個活性流份中，在流份#12中觀察到最高比率之降解；類似地在本文中，存在一些降解峰之釋放。
使用200 µL流份#13之Av3b培育之後的HPLC層析展示於 圖 18中。如 圖 18展示，發生某個水準之降解，導致釋放一些降解峰，儘管峰概況相對於流份之其餘部分為稍微不同的。
將含有約150 kD之尺寸之蛋白的流份#8及#9組合以便進行MS/MS分析。流份#12及#13具有17 kD與45 kD之間之尺寸的蛋白，並且同樣地組合以便進行MS/MS分析
為了更精確將蛋白酶自Av3b發酵醪中分離，Av3b發酵醪經受DEAE陰離子交換，繼之以尺寸排阻層析(SEC)快速蛋白液相層析(FPLC)。在本文中，將在發酵過程期間具有完全Av3b降解並且pH調整至pH 6.0的25 mL Av3b發酵醪負載至含有2 mL DEAE(陰離子交換樹脂)之層析管柱上；管柱用1M NaCl/100 mM Tris HCl pH 6溶析，隨後收集流份。流份之蛋白酶活性藉由加入Av3b肽並且在30℃，pH 6.0下培育16小時來評估。將活性流份(各自5 mL)彙集並且使用10K MWCO膜來濃縮至0.56 mL。
然後執行向陰離子交換彙集流份加入Av3b來評估降解。在本文中，彙集來自陰離子交換之所有活性流份並且濃縮之後，將純化Av3b加入濃縮池中並且在室溫下培育隔夜。Av3b在隔夜培育之後完全消失，並且置換成以下：(1)PK-A(其中C-Lys得以裂解之Av3b，Av3b-1)，主要峰；及(2)PK-B(其中C-Pro-Lys得以裂解之Av3b，Av3b-2)，次要峰。 圖 19。
然後執行使用AKTA FPLC系統之尺寸排阻層析以便進一步分級來自陰離子交換層析之活性池。來自DEAE層析之濃縮活性池使用尺寸排阻層析藉由以MES緩衝液作為移動相之AKTA FPLC系統，遵循如上所述程序來進一步分級。在加入Av3b降解分析中，發現四個流份為活性的。 圖 20。
SEC流份8-11在37℃下培育18小時之後，具有部分Av3b降解( 圖 21)；SEC流份12-13培育18小時在37℃下之後，具有完全Av3b降解( 圖 22)；SEC流份14在37℃下培育18小時之後，具有完全Av3b降解( 圖 23)；並且SEC流份15-17在37℃下培育18小時之後，具有完全Av3b降解( 圖 24)。用於MS/MS之四次收集如下：流份池#12及#13、#15、#16及#17。然而，流份#14展示強烈蛋白酶活性，根據FPLC層析，其為流份#15中之峰之一部分。因此，其不包含於MS/MS分析之樣品中。
隨後，主動地裂解所加入Av3b的自FPLC分離之流份藉由串聯質譜(MS/MS)來分析。
串聯質譜(MS/MS)為給予一組質譜方法之名稱，其中將自樣品產生之「母體或前體」離子片段化以便產生一或多個「片段或產物」離子，其隨後藉由第二MS程序來進行質量分析。MS/MS方法可用於分析複雜混合物，尤其生物樣品，部分地因為MS/MS之選擇性可最大限度地減少在分析之前之廣泛樣品洗滌之需求。在MS/MS方法之一實例中，前體離子自樣品中產生並且穿過第一濾質器以便選擇具有特定質荷比之彼等離子。然後將此等離子片段化，通常藉由在合適離子容納裝置中與中性氣體分子碰撞，以便產生產物(片段)離子，其質譜藉由電子倍增器偵測器來記錄。由此產生之產物離子光譜指示前體離子之結構，並且兩個階段之質量過濾可排除離子干擾存在於複雜混合物之習知質譜中之物質。
串聯質譜(MS/MS)之示例性描述提供於美國專利第6,107,623號；及第9,091,695號中，其揭示內容以全文引用方式併入本文。
如上所述來自直接Av3b醪層析之FPLC流份及DEAE陰離子交換流份池之FPLC流份的六個FPLC樣品使用MS/MS針對蛋白酶，尤其來自乳酸克魯維斯酵母之蛋白酶來進行評估。發現來自6個樣品之總計201種蛋白。其中，8種為乳酸克魯維斯酵母相關蛋白酶，其在下表中概述。
表 7. MS/MS 分析之結果。包含於此表中之資訊獲自KEGG、Uniprot、及MEROPS。
蛋白酶類型 蛋白酶名稱 基因名稱 蛋白尺寸 基因組基因座 細胞位置 裂解位點(P1) 最佳pH
金屬蛋白酶 Ape2胺肽酶 Ape2/YKL157W 859 AA或94 kD KLLA0_C11033g 粒線體細胞壁分泌 N-Leu及N-Lys ~7.2
Ape3、或胺肽酶Y Ape3/YBR286W 525 AA、或58 kD KLLA0_D06424g 空泡 N-AA (優先)、釋放N末端離胺酸。K(A, R, N, C, Q, L, M, F, P, S, Y) 空泡6.2
mername-AA063肽酶、胺肽酶、或肽水解酶 N/A (LAP1?) 373 AA、或41 kD KLLA0_A02013g 乳酸克魯維斯酵母中之未鑑別蛋白(序列與釀酒酵母之LAP1同源) 白胺酸胺肽酶? K (A, C, E, G, H, I, L, R, M, F, P, V) 未知
絲胺酸蛋白酶 組織蛋白酶A或羧肽酶C、或羧肽酶Y PRC1/ YMR297W 535 AA、或59 kD KLLA0_A09977g 空泡、胞外區或分泌 C末端AA, A (I, L, M, F, V, G) 空泡6.2
羧肽酶 Atg42/YBR139W 491 AA或54 kD KLLA0_E17821g 空泡 C末端AA 空泡6.2
塞里維辛(cerevisin)或蛋白酶B PRB1/YEL060C 561 AA或62 kD KLLA0_D00979g 空泡 K(R, Y, L, F, Q) 空泡6.2
天冬胺醯蛋白酶 糖蛋白酶或PEP4 PEP4/YPL154C 409 AA、或45 kD KLLA0_D05929g 空泡 K (N, T, W, Q, L, F, Y, E) 空泡6.2
未知 未知 未知 248 AA、或27 kD KLLA0_A03377g 未知 未知 未知
實例 9. 剔除蛋白酶
基於MS/MS結果，在流份中發現三種羧基蛋白酶：prb1、prc1及atg42。
為了評估蛋白酶對於Av3b之降解發揮之作用，蛋白酶prb1及prc1各自剔除如下：首先，pKLAC1質體獲自New England Biolabs® Inc.，(物品編號(NEB#E1000)。pKLAC1質體被設計來藉由整合至乳酸克魯維斯酵母細胞中之染色體B之pLAC4基因座中，完成酵母物種乳酸克魯維酵母中之重組蛋白之高水準表現。
使用pKLAC1質體作為起始載體，如 圖 26展示藉由將3’-及5’-pLAC4同源重組序列置換成用於pcr1剔除之3’-及5’-prc1同源重組序列來設計乳酸克魯維斯酵母(Kl)prc1剔除整合載體「pKlDprc1」。載體被設計來藉由將額外5’-prc1同源序列連接至3’-prc1同源序列，完成乙醯胺( amdS)選擇標誌物自身出局重組。pKlDprc1載體藉由SacII消化來線性化，然後轉型至乳酸克魯維斯酵母之YCT306菌株中。乙醯胺( amdS)用作陽性選擇標誌物，整合至酵母基因組prc1基因座中並且將部分prc1(剔除)置換成AmdS之選擇標誌物，由此產生菌株「VSTLB9a」。菌株VSTLB9a含有異源AmdS匣，其被設計來藉由與pKlprc1載體中之兩個同源pcr1 5’-片段側接來進行自身出局重組。VSTLB9a菌株之AmdS出局重組使用氟乙醯胺來反選擇，該氟乙醯胺對於具有AmdS表現之VSTLB9a菌株呈毒性。此等兩步菌株修飾過程產生菌株「VSTLB09」，其使pcr1基因得以剔除，並且在基因組中沒有任何異源基因。 圖 25描繪剔除設計策略。 圖 26示出pKlprc1質體之圖譜。
乳酸克魯維斯酵母prc1基因編碼蛋白酶、組織蛋白酶A、羧肽酶C、或羧肽酶Y。參見 ，例如NCBI基因ID：2896412；NCBI蛋白ID：XP_451436；UniProt ID: Q6CXA3。乳酸克魯維斯酵母prc1基因在乳酸克魯維斯酵母基因組之染色體A中(以5’至3’取向)位於位置876594 - 878201 bp之間，具有KLLA0_A09977g之指派基因組條目(基因座條目) (總共1608 bp)。乳酸克魯維斯酵母prc1基因之實例提供於SEQ ID NO：199中。
絲胺酸棕櫚醯轉移酶基因在乳酸克魯維斯酵母prc1基因之上游(5’上游)，並且在其與prc1之間具有1239 bp非轉錄區。未表徵基因在乳酸克魯維斯酵母prc1之下游(3’下游)，並且在其與prc1之間具有362 bp非轉錄區(包括用於prc1之終止子及用於未知基因之啟動子)。
為了剔除乳酸克魯維斯酵母prc1基因而不影響相鄰基因，pKlDprc1質體之5’整合區段包含5’-prc1之500 bp區段；並且3’整合區段具有3’-prc1之500 bp。 圖 27。
為了產生prc1剔除菌株，乳酸克魯維斯酵母細胞用如上所述剔除載體來轉型，然後在選擇VSTLB9a菌株之酵母碳基(YCB)+乙醯胺培養基中生長。甘油基料自陽性菌落中產生，並且提取gDNA用於qPCR分析。
prc1基因之qPCR引子如下： rt-Klprc1-LB1: GTACGCATCGGGCCAAGATTTCC (SEQ ID NO: 194) rt-Klprc1-LB2: CGGTTAGACCGTTACCGATAAGAACAGAAG (SEQ ID NO: 195)。
將陽性純系鑑別並且藉由將酵母塗鋪至YCB+乙醯胺板上來純化。基於乙醯胺選擇，八個菌落被鑑別為對於pcr1剔除而言呈陽性；將此八個純系採集(指定為VSTLB09a-1至8)並且在5 mL之DMSor培養基中培養。在8個陽性菌株中，VSTLB09a-2及VSTLB09a-6藉由qPCR來鑑別為具有prc1之成功剔除。 圖 28。將菌株VSTLB09a-2及6塗鋪於YCT-Amd瓊脂板上以便進行菌株純化。
採集來自菌株中之每一者的三個菌落，並且在DMSor中培養以便進行qPCR篩檢。甘油基料自培養物中產生，並且提取gDNA。執行qPCR純化篩檢，指示所有6個菌落包含所需pcr1剔除。 圖 29。在6個菌落中，選擇VSTLB09a-6-1用於異源AmdS基因匣之出局重組。
圖 29描繪用於剔除乳酸克魯維斯酵母prc1基因之qPCR純化篩檢的結果。Y軸示出相對定量(「RQ」)、或2 -ΔΔϹt。在本文中，YCT306用作展示存在一個prc1基因複本的校準菌株。URA3用作參考基因。插圖示出純系VSTLB09a-6-1及YCT306之擴增曲線。用於URA3之引子如下： rt-URA3c-LB1：正向引子TTCCAAGGGTTCTCTAGCACACGG (SEQ ID NO: 196) rt-URA3c-LB2：反向引子CCTACACCTGGGGTCATGATTAGCC (SEQ ID NO: 197)。
在本文中，所使用參考基因為URA3，具有如上所述引子。AmdS qPCR引子如下： rt-AmdS-LB1：正向AAGGGAACTCGATGAATACTACGCAAAGC (SEQ ID NO: 198)；及 rt-AmdS-LB2：反向CGTACTTGTTTAGCCATGAGATGTAGCCC (SEQ ID NO: 199)。
然後，VSTLB09a-6-1在非選擇性DMSor中培養以實現出局重組，從而移除 amdS標誌物。4天之後，將VSTLB09a-6-1培養物塗鋪至YPGly + 100 ppm Famd板上以便選擇出局重組細胞(1000、或5000個細胞/板)。另外4天之後，形成較小菌落。
採集總共10個菌落並且在DMSor中培養以便進行「VSTLB09」菌株之初級篩檢，從而自VSTLB09a-6-1之菌株中篩檢 amdS出局重組。三天後，甘油基料自所有菌株中產生，並且提取gDNA以便進行qPCR分析。
隨後，VSTLB09菌株之qPCR初級篩檢根據如上所述方法來執行，其中使用兩個參考：證明prc1剔除之YCT306參考；及 amdS出局重組之VSTLB09a-6-1 gDNA參考。
如 圖 30展示，所有10個「VSTLB09」菌落使prc1基因得以剔除。並且，如 圖 31展示，VSTLB09-1、-2、-4、-5、-6、-7、及-8菌落具有較低 amdS信號，指示出局重組及非出局重組菌株之混合物。VSTLB09-3、-9、及-10具有較高 amdS信號，指示非出局重組。 圖 31。VSTLB09-1具有 amdS之最低信號，並且經儲存及處理以便進行純化。
以上使用之相同策略用於剔除prb1，由此產生prb1/prc1雙重剔除菌株。乳酸克魯維斯酵母prb1基因編碼一種與釀酒酵母蛋白酶塞里維辛(cerevisin)同源之蛋白酶，蛋白酶B。參見 ，例如，NCBI基因ID：2892752；NCBI蛋白ID：XP_453114；UniProt ID: A0A3G9K911。乳酸克魯維斯酵母prb1基因 在乳酸克魯維斯酵母基因組之染色體D中(以5’至3’取向)位於位置86703 - 88388 bp之間，具有KLLA0_D00979g之指派基因組條目(基因座條目) (總共1686 bp)。示例性乳酸克魯維斯酵母prb1基因提供於SEQ ID NO：201中。
為了用Av3b轉殖基因來轉型prc1/prb1剔除菌株，將Av3b表現載體pKS022轉型至prb1/prc1雙重剔除菌株中；此舉導致產生既沒有prb1亦沒有prc1表現之新Av3b表現菌株。
簡言之，將Av3b轉殖基因引入乳酸克魯維斯酵母基因組中之示例性方法如下：合成包含完整LAC4啟動子元件、密碼子最佳化AV3B ORF元件及pLAC4終止子元件之Av3b表現匣DNA序列；將完整表現匣連接至在pLAC4終止子下游的Sal I與Kpn I限制位點之間之pLB103b載體中，由此產生Av3b表現載體pKS022。然後，pKS022載體使用Sac II限制性核酸內切酶來線性化並且藉由電穿孔來轉型至乳酸克魯維斯酵母之YCT306菌株中。然後，所得酵母菌落在補充有5 mM乙醯胺之YCB瓊脂板上生長，僅表現乙醯胺酶之細胞可有效地使用乙醯胺作為代謝氮源。為了評估酵母菌落，可自pKS022酵母板採集約100個菌落。來自菌落之接種物各自在2.2 mL之確定成分之乳酸克魯維斯酵母培養基中培養，其中添加2%糖醇作為碳源。伴以在280 rpm下振動，將培養物在23.5℃下培育六天，在此時點，培養物中之細胞密度達到其最大水準，如藉由600 nm下之光吸收率(OD600)指示。然後藉由在4,000 rpm下離心10分鐘，將細胞自培養物中移除，並且所得上清液(條件培養基)經由0.2 μM膜過濾以便進行HPLC產率分析。
剔除prb1及prc1導致Av3b降解減少。 圖 32示出當prc1及prb1存在時之Av3b之降解概況。如 圖 33展示，prb1/prc1剔除菌株導致Av3b更少降解。因此，用prb1/prc1剔除Av3b表現菌株來發酵導致Av3b降解減少，然而，降解未完全防止。此等結果指示除了prb1及prc1以外，亦可涉及其他未鑑別羧基蛋白酶。 實例 10. Av3b 突變體穩定性
基於突變體Av3bM19、Av3bM23、Av3bM24、Av3bM25、及Av3bM28具有相對於Av3b之增加之產率，及殺昆蟲活性(如以上展示)，選擇此等突變體以供後續穩定性研究。製得突變體Av3bM19、Av3bM23、Av3bM24、Av3bM25、及Av3bM28之方法在實例2中描述。此等突變體、其突變之概述呈現於下表中。
表 8. 在穩定性研究中評估之突變體之概述。評估突變體Av3bM19、Av3bM23、Av3bM24、Av3bM25、及Av3bM28。加下劃線並且呈粗體之殘基示出突變位置。具有呈粗體名稱之突變體為基於初始肽量及剩餘量，展現發酵醪中之增加之穩定性的彼等突變體。亦參見 圖 34。
名稱 序列 突變 SEQ ID NO.
Av3bM19 KSCCPCYWGGCPWGQ D CYP D GC D GPK N16D, E20D, S23D 20
Av3bM23 KSCCPCYWGGCPWGQNCYP N GCSGPK E20N 24
Av3bM24 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGC D GPK S23D 25
Av3bM25 KSCCPCYW P GCPWGQNCYPEGCSGPK G9P 26
Av3bM28 H SCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK K1H 29
為了確定新突變體之穩定性，將Av3bM19、Av3bM23、Av3bM24、Av3bM25、Av3bM27、及Av3bM28純化並且在Av3b發酵醪中培育。突變體藉由使用GE SP-Sephadex C-25管柱之陽離子交換層析來純化。管柱首先用pH 3.0之30 mM檸檬酸鈉緩衝液來校準。然後，將含有分泌突變肽之培養物上清液負載至管柱中以便使突變肽結合至樹脂。然後，管柱用30 mM檸檬酸鈉緩衝液，pH 3.0洗滌，隨後用30 mM乙酸鈉，pH 4.0洗滌。隨後，結合突變肽藉由1 M或2 M NaCl與30 mM乙酸鈉，pH 4.0來溶析。然後，使用1 kD截止旋轉濃縮器，將溶析物濃縮並且緩衝液交換至30 mM乙酸鈉，pH 4.0。
純化之後，突變體Av3bM19、Av3bM23、Av3bM24、Av3bM25、Av3bM27、及Av3bM28中之每一者藉由將其加入pH 6.5之Av3b菌株發酵醪中來評估穩定性。作為陰性對照，評估pH 4.0緩衝液中之Av3b。作為陽性對照，純化Av3b藉由加入pH 6.5之相同Av3b發酵醪中來評估。所有穩定性實驗在室溫下執行。在以下培育時間：0、15、39、62.5及144小時，樣品獲自如上所述之處理；樣品經由rpHPLC來評估以便確定在此過程期間發生之肽峰面積變化。相對於開始之剩餘肽量藉由針對每次處理，將不同時間之峰面積相對於0小時之峰面積來標準化來確定。降解趨勢藉由相對剩餘肽量趨勢之條形圖來視覺化。
如 圖 34展示，與對照Av3b相比，Av3bM19及Av3bM24展示對於酵母發酵醪蛋白酶裂解之更大抗性。所有其他突變體展示與Av3b類似之降解概況。在本文中，每一組條形圖表示特定肽/處理。各組中之各條形圖表示與開始肽量相比的相對肽量。
在本文中，當在pH 4緩衝液中培育時，Av3b展示肽沒有損失(指示Av3b對照之穩定性)。在「Av3b ctl」組中，將Av3b加入Av3b發酵醪中，其含有分泌蛋白酶，進而導致Av3b肽之降解或損失。隨著培育時間增加，Av3b肽之相對量減少，指示發酵醪中之Av3b肽損失或降解。對於其他組，觀察到類似結果。 圖 34之Y軸示出在各組中，與開始量相比的相對肽量(作為HPLC中之肽峰面積)。肽量藉由HPLC峰面積來表示；因此，相對數量衍生自相對於開始時間(0小時)，在不同時間之峰面積之標準化。
後續輪之穩定性評估著眼於Av3bM19及Av3bM24來執行；此輪實驗之確認Av3bM19及Av3bM24具有對於發酵醪裂解之經改良之抗性。 圖 35。在本文中，穩定性分析如前所述來執行，然而，肽量在0、24、48、106、144、及248小時評估。 圖 36示出與隨著時間之推移的剩餘肽有關的此穩定性分析之結果。 實例 11. 發酵醪中 Av3b 突變體之蛋白分解抗性
在發酵醪中培育時，突變體Av3bM19及M24抵抗降解。選擇Av3bM19及M24，因為其展示比Av3b可能更高之產率。如 圖 34展示，僅M19及M24展示經改良之穩定性；因而，選擇其用於本文中之更詳細研究。
在加入pH 6.5之pKS022-YCT-38-14(Av3b生產菌株)發酵醪中之後，發現Av3b降解並且在Av3b發酵醪中培育10天之後最終消失，具有46小時之半降解時間。意外地，發現兩種突變體Av3bM19(相對於Av3b之突變N16D、E20D、S23D)及Av3bM24(相對於Av3b之突變S23D)抵抗Av3b發酵醪中之降解。
圖 37示出描繪Av3b生產發酵醪中之Av3b突變體之降解的圖表。在本文中，證明Av3b具有46.34小時之半降解時間。相比之下，突變體Av3bM19(KSCCPCYWGGCPWGQDCYPDGCDGPK；SEQ ID NO：20)，具有長得多的降解時間：666小時。同樣地，突變體Av3bM24(KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCDGPK；SEQ ID NO：25)具有652小時之半降解時間。此等結果示出突變體Av3bM19及Av3bM24極大地減慢發酵醪中之相應Av3b突變體之降解。
Av3bM19及Av3bM24含有S23D突變；因此，或許帶負電荷S23D突變可以保護帶正電荷C末端離胺酸避免經由靜電相互作用之裂解。然而，基於Av3b NMR結構，此等兩個殘基彼此相距很遠(16.5 A)；因此，除非存在允許由突變產生之殘基之間變得更接近的某種構形變化，否則預期沒有電相互作用。 圖 38。 實例 12. 位置 23 與 26 之間的靜電相互作用
為了確認是否S23D(帶負電荷)及K26(帶正電荷)可能形成靜電相互作用之假設，設計另一個突變體Av3bM125，其具有胺基酸序列：KSCCPCYWPGCPWGQNCYPEGCRGPE(SEQ ID NO：35)。Av3bM125具有在兩個位置之間交換的殘基電荷，亦即，具有S23R(帶正電荷而非負電荷)及K26D(帶負電荷而非正電荷)。
將Av3bM125加入pH 6.5之發酵醪中，並且其在發酵醪中之穩定性使用Av3b肽作為對照來評估。與Av3b肽相比，AV3bM125展示極大地改良之降解抗性。在本文中，與相同處理中之Av3b之56小時半降解時間相比，Av3bM125具有369小時之半降解時間。 圖 39。
圖 40示出展示在室溫及pH 6.5下，Av3b發酵醪中之Av3bM125之穩定性的圖表。第一組條形圖示出Av3b在pH 4緩衝液中為穩定的。第二組條形圖示出Av3b對照。第三組條形圖示出Av3bM125。自左至右，各條形圖對應於時間0、18、42、76、112、及164小時。
前述圖式中展示之結果指示在Av3b序列中之位置23與26之間，可能存在靜電相互作用。 實例 13. Av3b 突變體在發酵條件中之蛋白分解抗性
基於獲自Av3b菌株發酵醪(以上展示)之MS/MS資料，prb1及prc1被鑑別為造成自細胞分泌之Av3b肽降解之可能羧基蛋白酶。因此，產生具有prb1/prc1剔除背景之Av3b表現菌株以便防止發酵期間之Av3b降解。然而，如以上展示，使用prb1/prc1剔除Av3b表現菌株之發酵揭示Av3b之降解得以減少但是未完全防止，指示除了prb1及prc1以外，亦可涉及其他未識別之羧基蛋白酶。
並且，雖然Av3bM19及Av3bM24中之突變均極大地減緩其在發酵醪中之降解，但是降解最終發生；因此，實行額外突變來確定是否可進一步改良降解抗性。
下表中之突變體針對發酵醪中之穩定性來進行評估。發酵條件及HPLC分析如上所述來執行。突變體生產菌株使用YCT306乳酸克魯維斯酵母菌株來產生。突變體之產生如實例2描述來執行；發酵條件使用如上關於Av3b生產菌株所述之相同發酵過程來執行，其中pH控制於pH 6.5處。在本文描述之發酵條件中，Av3b肽展示發酵期間之降解，導致預期Av3b峰之後的額外HPLC峰。參見 圖 12 及 13。為了鑑別具有蛋白分解抗性之突變體，突變菌株在與Av3b相同之發酵條件下生長，並且樣品經受整個發酵過程。在發酵過程之140小時獲得之樣品在rpHPLC中分析。
表 9. 在發酵醪穩定性研究中評估之 Av3b 突變體。具有粗體展示之名稱的Av3b突變體在Av3b發酵醪中培育之後，在培育140小時之後，不顯示降解。
名稱 序列 SEQ ID NO 降解 ?
Av3bM97 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPA 41 是
Av3bM98 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPR 42 否
Av3bM99 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPN 43 是
Av3bM100 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPD 44 是
Av3bM101 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPE 45 是
Av3bM102 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPQ 46 是
Av3bM103 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPG 36 否
Av3bM104 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPH 47 是
Av3bM111 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPT 48 是
Av3bM146 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGGV 49 是
Av3bM147 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGRV 50 是
Av3bM148 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPKG 51 否
Av3bM156 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCDGPA 52 是
Av3bM157 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCDGPT 53 是
Av3bM165 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPKVG 40 否
Av3bM168 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPKVI 54 是
Av3bM169 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCTGPG 37 是
Av3bM170 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCGGPG 38 否
Av3bM171 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCDGPG 55 是
Av3bM172 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCDGP 56 是
展示上表列出之突變體之發酵穩定性之結果的HPLC層析圖展示於 圖 41-60中。如前述圖式展示，突變體Av3bM98、Av3bM103、Av3bM148、Av3bM165、及Av3bM170不顯示任何降解產物。 實例 14. C 末端甘胺酸突變體防止降解
發現Av3b之C末端殘基突變成甘胺酸提供發酵期間之C末端裂解的防護。發現具有K26G之C末端突變的三個Av3b突變體防止降解，亦即，具有胺基酸序列KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPG(SEQ ID NO：36)之Av3bM103； 具有胺基酸序列KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCTGPG(SEQ ID NO：37)之Av3bM169；及 具有胺基酸序列KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCGGPG(SEQ ID NO：38)之Av3bM170。
另外，具有V27G突變並且具有胺基酸序列KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPKG(SEQ ID NO：39)之突變體Av3bM148，以及將甘胺酸添加至C端並且具有胺基酸序列KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPKVG(SEQ ID NO：40)之突變體Av3bM165亦展示具有沒有明顯降解產物的HPLC峰。參見 圖 47 、圖 55 、圖 57 、及圖 58。 實例 15. 菌株產率比較
前述實驗產生四個候選Av3b突變肽：Av3bM24；Av3bM165；Av3bM103；及Av3bM170。深孔板培養如下所述來執行，以便比較並且分級上述候選者之產率。深孔板培養執行如下：無菌48孔5 mL錐形底深孔板在生物安全罩中製備。隨後，將2.2 mL培養基吸移至培養板之每個孔中。來自酵母菌株瓊脂板之單一菌落使用200 µL吸移管尖端來採集並且接種至板之一個孔中之培養基中直到所有孔接種為止。然後，接種板用透氣密封件來密封並且在23.5℃下以250 rpm來安置於振盪器中持續6天，或在27℃下持續4天，以便評估肽產率。
深孔培養之結果呈現於下表中。
表 10. 比較 Av3b 突變體之產率的深孔培養物。發酵產率為基於甘油基料產率之結果的發酵條件中之預測產率。
名稱 甘油基料產率 發酵產率(g/L) 12 基因複本產率(g/L)
Av3b 100% 1.2 1.2
Av3bM24 109% 1.3 1.2
Av3bM165 24% 0.3 0.395
Av3bM103 84% 1.0 0.476
Av3bM170 95% 1.14 0.938
圖 61展示了示出在兩個不同溫度23.5℃及27℃下，與整合至來自48孔深孔板培養物之表現菌株基因組中之Av3b肽轉殖基因之複本數相關的肽產率的圖表，從而可藉由每個整合肽基因之產率來更好地預測新肽品系之產率。產率藉由產生線性擬合曲線，並且將擬合曲線延伸至如表10指示之12個整合基因複本之點來計算。
關於12基因複本產率結果，來自各菌株之多個轉型體菌落針對產率及整合基因複本來進行分析。因為來自相同轉型板之不同菌落含有不同數目之整合Av3突變基因複本，所以可產生產率與基因複本之間之關係。在1至12之整合基因複本數目範圍內，觀察到產率與整合基因複本數目之間之線性關係，以致於整合至細胞基因組中之基因複本愈多，可觀察到之產率愈大。因此，各菌株之線性關係可延伸至12整合基因複本，其為吾人當前Av3b生產菌株中之整合Av3b基因複本數目並且可針對突變體菌株藉由菌落篩檢來達成，以便當突變體生產菌株在基因組中具有12整合基因複本時，發現理論產率為多少；在本文中，所有突變菌株產率相對於Av3b菌株產率來標準化以便產生Av3b突變體相對於Av3b之產率比。在發酵中，Av3b菌株之常規平均產率為1.2 g/L：因此突變菌株產率使用1.2 g/L產率比來估計。
如本文示出，除了Av3bM165以外，Av3b突變體之產率具有與原始Av3b菌株類似的產率。 實例 16. DASbox 發酵
DASbox®為平行生物反應器系統(Eppendorf, 175 Freshwater Blvd, Enfield, CT 06082, USA)。本文使用之DASbox系統含有8個具有250 mL容量之發酵容器，允許8個小規模發酵同時操作。DASbox發酵操作根據製造商說明書，並且使用本文所述發酵條件來執行。
Av3b突變體之篩檢使用分批補料過程在需氧生物反應器中進行。反應器最初用含有5-20 g/L碳源諸如葡萄糖、山梨糖醇、或乳糖，5-20 g/L磷酸，0.1-1.5 g/L硫酸鈣，5-15 g/L硫酸鉀，0.5-10 g/L硫酸鎂七水合物，1-5 g/L氫氧化鉀，及10-60 g/L玉米漿之富培養基來填充至約45%容量。反應器之溫度在發酵持續時間中保持在25-35℃之間。藉由添加15%氫氧化銨，pH在4-5.5之間保持恆定。藉由噴射0.5-1.5體積/體積/min之間之空氣並且藉由增加攪拌來保持10-30%之設定點，溶解氧可保持恆定。
反應器之接種來自含有5-40 g/L之碳源諸如葡萄糖、山梨糖醇、或乳糖，及5-40 g/L玉米漿之隔夜種子培養物。接種百分比在初始填充體積之約5-20%的範圍內。一旦接種，向反應器饋送70%選定碳源溶液一直到反應器充滿及/或達成所需上清液肽濃度為止，分別為大約96-140小時及0.8-1.2 g/L。
發酵操作之後，經由HPLC及LC/MS來偵測Av3b及Av3bM24菌株中之降解。 圖 62-63。
然而，經由HPLC及LC/MS，在Av3bM165、Av3bM103及Av3bM170菌株中未偵測到降解。 圖 64-66。 實例 17. 鱗翅目注射分析
對穀實夜蛾(玉米穗蛾或「CEW」)及草地貪夜蛾(草地黏蟲或「FAW」)實施注射分析。注射液包含為了到達計劃劑量而與水組合之給定Av3b突變肽。Av3b突變體包括Av3bM24；Av3bM165；Av3bM103；及Av3bM170。Av3b用作對照。
劑量計算使用下式來進行：
Figure 02_image003
式 (IV)
昆蟲用根據製造商說明書由通用鱗翅目飼料(Frontier Scientific, Newark, DE 19713，貨號F9772)來製備之人工飼料來飼養。為了執行昆蟲注射生物分析，將5 mL熱飼料分配至飼養盤(Bio-Service Inc., Bio-RT-32)之孔中，其中每次注射處理8個孔。然後，允許熱飼料冷卻及凝固。隨後，將第三齡期幼蟲在冰上培育以便將其固定。注射液在具有注射溶液(＞100 µL)之手動微量施藥器上以具有30號直針之1 cc全玻璃注射器來製備。將氣泡自注射器中移除，並且將注射器設置於微量施藥器上。注射體積在微量施藥器中調整至2 µL。
為了注射幼蟲，將昆蟲撿起並且放置在接近於注射針。允許針穿透幼蟲之第三腹足之角質層。然後，將微量施藥器之注射按鈕旋轉以便將2 µL溶液注射至來自第三腹足之血淋巴中。注射之後，幼蟲保持在針上幾秒以便確保注射溶液得以吸收。然後，將幼蟲輕輕地自針上移除並且安置於製備盤之孔中，其中每個孔具有5 mL固化飼料。最後，托盤用通氣孔塞來密封。
注射幼蟲在28℃下在昆蟲孵育器中培育，並且在注射後24小時基於其狀況來評分。昆蟲狀況分類如下：活著(行走、進食、正常行為)；受影響(表現出毒性症狀，例如震顫、扭動、步態不平衡或其組合)，擊倒(儘管輕輕一戳便能夠移動但癱瘓)；及死的(不動、變色或其組合)。注射分析之KD 50結果提供於下表中。
表 11. 鱗翅目注射分析之結果。
名稱 以pmol/g 為單位之KD 50
CEW FAW
Av3b 367 ± 166 (N=6) 883 ± 25 (N=2)
Av3bM24 428 ± 131 (N=4) 949
Av3bM165 389 578
Av3bM103 518 ± 390 (N=2) 879
Av3bM170 104 495 ± 148 (N=2)
如上表中之KD 50結果展示，Av3bM24；Av3bM165；及Av3bM103具有與Av3b類似的擊倒效應。然而，Av3bM170在CEW及FAW中分別需要104 pmol/g及495±148 pmol/g之低得多的劑量。 實例 18. 圓二向色性分析
圓二向色性(CD)為吸收光譜方法。CD使用左及右圓偏振光之差異吸收。由於此現象而獲得之光譜被稱為CD光譜，其中CD信號按照毫度(mdeg)來表示。
光學活性對掌性分子優先地吸收一個方向之圓偏振光；並且此吸收之差異，亦即，左或右圓偏振光之差異可加以量測及定量。紫外(UV) CD可用於確定蛋白二級結構之態樣，例如，α螺旋、β折疊、無規捲曲等。例如，CD之最廣泛使用應用中之一者為評估是否蛋白正確地折疊，及/或是否給定突變影響蛋白之穩定性或構形。參見 N. Greenfield, Using circular dichroism spectra to estimate protein secondary structure, Nat Protoc. 2006; 1(6): 2876–2890。
JASCO J-1500 CD光譜儀(JASCO, 28600 Mary’s Court, Easton, MD 21601 USA)用於量測Av3bM24、Av3bM165、Av3bM103、及Av3bM170肽之CD光譜及二級結構資訊(以Av3b作為比較物)。肽在10 mM Na 3PO 4溶液，pH 5.9中製備，並且負載至用於量測CD光譜之比色管中。量測以具有1 nm間隔的180 nm至250 nm範圍內之光波長掃描來進行；溫度以2℃間隔，自20℃逐漸變化至98℃。
對於所有肽偵測到之大多數二級結構為無規捲曲結構，亦即，肽展示沒有熟知特定二級折疊模式之二級結構。 圖 67。
所有候選肽展示無規捲曲結構：Av3b、Av3bM165、Av3bM103及Av3bM170都具有此類似無規捲曲結構。Av3b、Av3bM165、Av3bM103及Av3bM170具有約198 nm之主要(-)橢圓率，而Av3bM24具有約202 nm及更窄之主要(-)橢圓率。 圖 67。
CD分析之結果指示肽具有相似折疊結構。Av3bM24亦具有無規捲曲結構，然而，其結構不同於其他者，指示Av3bM24折疊可稍微不同於所分析其他肽而發生。因此，Av3bM24之不同無規捲曲結構可解釋與Av3b、Av3bM165、Av3bM103及Av3bM170相比，其熱穩定性更小之原因。
肽之CD熔融溫度如下：Av3b = 69.3℃；Av3bM24 = 80℃；Av3bM165 = 80℃；Av3bM103 = 82℃；及Av3bM170 = 70℃。通常，蛋白在更高CD熔融溫度下為不穩定的。隨著溫度增加，將蛋白結構保持在一起之相互作用最終中斷，從而導致蛋白變性。與折疊蛋白相比，變性的及/或未折疊的蛋白具有非常不同之CD信號。本文示出之此CD熔融溫度指示預期蛋白得以展開之臨界溫度。因此，更高CD熔融溫度指示自結構觀點，熱穩定性更強之蛋白。 實例 19. 54℃ 下之熱穩定性
在54℃下，在pH 4.0溶液中，執行Av3b、Av3bM24、Av3bM165、Av3bM103、及Av3bM170之熱穩定性研究持續0、3、7、10、12、及14天，使用咖啡因內部控制來消除由蒸發引起之變化。在具有pH 4.0之乙酸鈉緩衝液(NaOAc)之1.5 mL微管中製備1 mL樣品，其含有0.1 µg/µL肽、及0.025 µg/µL咖啡因。樣品在54℃下，在乾燥混合器中培育。在0、3、7、10、12、及14天，20 µL之各樣品經由分析rpHPLC系統來分析以便評估肽損失。各樣品包含固定量咖啡因，用於補償由於蒸發引起之體積變化所導致的肽HPLC UV吸收峰變化。 圖 68。
如 圖 68展示，Av3b、Av3bM165及Av3bM170在54℃下，在溶液(pH 4)中穩定至少14天。然而，Av3bM24不穩定，因為到第3天觀察到其降解，但是第3天之後，降解極大地減緩。意外地，在此實驗中，亦發現Av3bM103降解。在本文中，Av3bM103在54℃下非常穩定且持續7天，在此時點其突然降解。 圖 68。
第14天肽之肽變化如下：Av3b = +8.3%；Av3bM24 = -29.5%；Av3bM165 = +4.2%；Av3bM103 = -64.1%；及Av3bM170 = +4.6%。
在本文中，第14天之肽變化係指在54℃熱處理之後，由HPLC指示之肽質量變化。肽質量由HPLC峰面積來表示，並且根據以下等式來計算：
Figure 02_image005
式 (V)
因此，「+」意謂質量增加(可能為由於蒸發所導致的假像)，並且「-」意謂質量損失。
本文示出之結果證明在54℃下，Av3b、Av3bM165及Av3bM170為熱穩定的，而Av3bM24及Av3bM103為熱不穩定的。因此，在結合以上提供之實例來理解時，此等結果指示Av3bM24關於溫度可為不穩定的，但是其對於蛋白酶裂解而言為更穩定的。 實例 20. Av3b 突變體在 pH 條件下之穩定性
Av3bM24、Av3bM165、Av3bM103、及Av3bM170之樣品在96孔板中製備，各孔含有300 µL溶液，其包含0.1 µg/µL肽及0.025 µg/µL咖啡因(用於控制蒸發)及pH 3.1至pH 9.6範圍內之緩衝液。
將板安置在室溫下。在約16天時，20 µL之各樣品用分析rpHPLC系統來分析以便確定肽損失。各樣品包含固定量咖啡因，用於補償由於蒸發引起之體積變化所導致的肽HPLC UV吸收峰變化。
如 圖 69-72展示，Av3bM24、Av3bM165、Av3bM103、及Av3bM170在廣泛範圍之pH條件下，並且持續至少16天為穩定的。 實例 21. Av3b 突變體在昆蟲腸道提取物中之穩定性
為了測試Av3b突變體在鱗翅目害蟲之腸道酶中之穩定性，自穀實夜蛾(玉米穗蛾或「CEW」)來製備腸道提取物。玉米穗蛾昆蟲以卵形式購自Benzon Research (Carlisle, PA)。孵化的幼蟲以人工飼料培育直到4/5齡期(20 mm長)為止，然後將腸分離。腸提取之前，幼蟲使用CO 2來麻醉。然後，幼蟲在頭部及尾部固定於解剖板上。使用解剖剪，將角質層切口。然後，將解剖剪插入切口中並且角質層縱向沿著昆蟲。然後，將角質層小心地拉回並且用針別住以便展現消化道。使用DI水，將昆蟲充分地沖洗以便移除血淋巴。
自幼蟲中提取昆蟲腸之後，將其以15000 rpm旋轉5分鐘。所得上清液為用於確定肽穩定性之「昆蟲腸道提取物」。Av3b突變肽與腸道提取物混合至2 µg/µL之最終體積，並且在室溫下培育。在0-100小時之間之時間點，將6 µL給定樣品與93 µL dH2O混合，隨後添加1 µL之2%三氟乙酸溶液以便停止反應。然後，樣品藉由rpHPLC來分析以便確定腸道提取物處理期間之肽損失。
昆蟲腸道提取物分析之結果展示於 圖 73中。如本文示出，Av3bM24對於穀實夜蛾腸道提取物消化期間之降解最具有抗性。Av3b、Av3bM103及Av3bM170亦都對於穀實夜蛾腸道提取物中之降解具有抗性，具有7與8小時之間之降解半期。在培育期間，Av3bM165在穀實夜蛾腸道提取物中迅速地轉化成Av3b肽，具有5.3分鐘之半轉化時間。 圖 73。 實例 22. 所評估突變體之概述
下表提供本文評估之突變體之概述。
表 12. 所評估 Av3b 突變體之概述。具有粗體展示之名稱的突變體為具有相對於Av3b之一或多個合意性質的彼等Av3b突變肽。性質包括：Y=產率；A=活性；E =表現；S=一般穩定性；D=對於發酵培養基(發酵醪)中之蛋白分解降解的抗性；F=相對於Av3b之類似蛋白折疊(如經由圓二向色性來確定)；T=在54℃下熱穩定；P=在不同pH條件下穩定；G=在昆蟲腸道提取物中穩定。在本文中，當在相同條件下，與Av3b之產率或活性相比，給定肽之產率或活性相似、或更好時，將產率及活性評分。
名稱 SEQ ID NO. 序列 合意性質
Av3b 1 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK -
Av3bM1 2 KSACPCYWGGAPWGQNCYPEGCSGPK -
Av3bM2 3 KSPCPCYWGGAPWGQNCYPEGCSGPK -
Av3bM3 4 KSNCPCYWGGTPWGQNCYPEGCSGPK -
Av3bM4 5 PSCCPCYWPNCPWGQNCYPEGCSGPK -
Av3bM5 6 KSCCPCYWPNCPWGQNCYPEGCSGPK Y
Av3bM6 7 TSCCPCYWPYCPWGQNCYPEGCSGPT -
Av3bM7 8 TSCCPCYWPYCPWGQNCYPEGCSGPR -
Av3bM8 9 TSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPT -
Av3bM9 10 TSCCPCYWGGCPWGTTCYPNGCDGPT -
Av3bM10 11 TSCCPCYWGGCPWGQTCYPNGCDGPT -
Av3bM11 12 TSCCPCYWGGCPWGQTCYPNGCDGPR -
Av3bM12 13 TSCCPCYWGGCPWGTTCYPNGCDGST -
Av3bM13 14 TSCCPCYWGGCPWGQTCYPNGCDGST -
Av3bM14 15 TSCCPCYWGGCPWGQTCYPNGCDGSE -
Av3bM15 16 TSCCPCYWGGCPWGTTCYPNGCDGSR -
Av3bM16 17 TSCCPCYWGGCPWGQTCYPNGCDGSR -
Av3bM17 18 KSCAPCYWGGAPWGQNCYPEGCSGPK -
Av3bM18 19 KSACPCYWGGCPWGQNAYPEGCSGPK -
Av3bM19 20 KSCCPCYWGGCPWGQDCYPDGCDGPK Y, A, S, D
Av3bM20 21 KSCCPCYWGGCPWGTTCYPNGCDGPK -
Av3bM21 22 KSCCPCYWGGCPWGTNCYPEGCSGPK -
Av3bM22 23 KSCCPCYWGGCPWGQTCYPEGCSGPK -
Av3bM23 24 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPNGCSGPK Y, A
Av3bM24 25 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCDGPK Y, A, S, D,G
Av3bM25 26 KSCCPCYWPGCPWGQNCYPEGCSGPK Y, A
Av3bM26 27 KSCCPCYWPPCPWGQNCYPEGCSGPK -
Av3bM27 28 KSCCPCYWAGCPWGQNCYPEGCSGPK A
Av3bM28 29 HSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK Y
Av3bM29 30 QSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK Y
Av3bM30 31 QSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPH Y
Av3bM31 32 TSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK Y
Av3bM32 33 SSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK Y
Av3bM33 34 SSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPT Y
Av3bM34 57 ASCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK -
Av3bM35 58 NSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK Y
Av3bM36 59 DSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK -
Av3bM37 60 ESCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK Y
Av3bM38 61 GSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK -
Av3bM39 62 ISCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK A
Av3bM40 63 LSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK A
Av3bM41 64 MSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK -
Av3bM42 65 FSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK -
Av3bM43 66 PSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK -
Av3bM44 67 WSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK -
Av3bM45 68 YSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK -
Av3bM46 69 VSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPK A
Av3bM47 70 KSCCPCYWRGCPWGQNCYPEGCSGPK -
Av3bM48 71 KSCCPCYWNGCPWGQNCYPEGCSGPK -
Av3bM49 72 KSCCPCYWDGCPWGQNCYPEGCSGPK -
Av3bM50 73 KSCCPCYWEGCPWGQNCYPEGCSGPK -
Av3bM51 74 KSCCPCYWQGCPWGQNCYPEGCSGPK -
Av3bM52 75 KSCCPCYWHGCPWGQNCYPEGCSGPK -
Av3bM53 76 KSCCPCYWIGCPWGQNCYPEGCSGPK -
Av3bM54 77 KSCCPCYWLGCPWGQNCYPEGCSGPK -
Av3bM55 78 KSCCPCYWKGCPWGQNCYPEGCSGPK -
Av3bM56 79 KSCCPCYWMGCPWGQNCYPEGCSGPK -
Av3bM57 80 KSCCPCYWFGCPWGQNCYPEGCSGPK -
Av3bM58 81 KSCCPCYWSGCPWGQNCYPEGCSGPK -
Av3bM59 82 KSCCPCYWTGCPWGQNCYPEGCSGPK -
Av3bM60 83 KSCCPCYWWGCPWGQNCYPEGCSGPK -
Av3bM61 84 KSCCPCYWYGCPWGQNCYPEGCSGPK -
Av3bM62 85 KSCCPCYWVGCPWGQNCYPEGCSGPK -
Av3bM63 86 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPAGCSGPK -
Av3bM64 87 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPRGCSGPK -
Av3bM65 88 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPDGCSGPK -
Av3bM66 89 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPQGCSGPK -
Av3bM67 90 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPGGCSGPK -
Av3bM68 91 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPHGCSGPK -
Av3bM69 92 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPIGCSGPK -
Av3bM70 93 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPLGCSGPK -
Av3bM71 94 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPKGCSGPK -
Av3bM72 95 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPMGCSGPK -
Av3bM73 96 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPFGCSGPK -
Av3bM74 97 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPPGCSGPK -
Av3bM75 98 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPSGCSGPK -
Av3bM76 99 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPTGCSGPK -
Av3bM77 100 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPWGCSGPK -
Av3bM78 101 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPYGCSGPK -
Av3bM79 102 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPVGCSGPK -
Av3bM80 103 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCAGPK -
Av3bM81 104 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCRGPK -
Av3bM82 105 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCNGPK -
Av3bM83 106 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCEGPK -
Av3bM84 107 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCQGPK -
Av3bM85 108 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCGGPK A
Av3bM86 109 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCHGPK -
Av3bM87 110 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCIGPK -
Av3bM88 111 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCLGPK -
Av3bM89 112 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCKGPK -
Av3bM90 113 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCMGPK -
Av3bM91 114 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCFGPK -
Av3bM92 115 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCPGPK -
Av3bM93 116 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCTGPK A
Av3bM94 117 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCWGPK -
Av3bM95 118 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCYGPK -
Av3bM96 119 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCVGPK A
Av3bM97 41 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPA A
Av3bM98 42 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPR D
Av3bM99 43 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPN -
Av3bM100 44 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPD -
Av3bM101 45 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPE -
Av3bM102 46 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPQ -
Av3bM103 36 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPG D, F, T, P, G
Av3bM104 47 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPH -
Av3bM105 120 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPI -
Av3bM106 121 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPL -
Av3bM107 122 KSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPM -
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如以上展示，本揭示案提供Av3突變多肽之許多實例，以及哪些突變提供意想不到之性質，及哪些突變不提供意想不到之性質。
圖 1描繪基於以下設計之Av3b突變菌株Av3bM1-Av3bM18之產率：(1)二硫鍵模式自抑制劑胱胺酸結(ICK)模體改變至二硫化物定向β髮夾(DDH)模體(在方框1指示之圖表部分中展示)；(2)基於Rosetta蛋白模擬軟體之能量有效設計(在方框2指示之圖表部分中展示)；及(3)基於Rosetta蛋白模擬軟體之著眼於非必需殘基之最能量有效突變設計(在方框3指示之圖表部分中展示)。突變菌株中之每一者在圓括號中鑑別(例如，「M1」=Av3bM1等)。 圖 2描繪Av3b突變體Av3bM19-Av3bM33之產率及活性。突變肽在乳酸克魯維斯酵母 (K. lactis)表現系統中表現。給定突變體之產率及活性相對於Av3b表現菌株來標準化，並且比率以條形圖展示。 圖 3示出Av3突變體Av3bM34-Av3bM46之產率及活性。突變肽在乳酸克魯維斯酵母表現系統中表現。給定突變體之產率及活性相對於Av3b表現菌株來標準化，並且比率以條形圖展示。活性在家蠅注射分析中評估。 圖 4示出Av3突變體Av3bM47-Av3bM62之產率及活性。突變肽在乳酸克魯維斯酵母表現系統中表現。給定突變體之產率及活性相對於Av3b表現菌株來標準化，並且比率以條形圖展示。活性在家蠅注射分析中評估。 圖 5示出Av3突變體Av3bM63-Av3bM79之產率及活性。突變肽在乳酸克魯維斯酵母表現系統中表現。給定突變體之產率及活性相對於Av3b表現菌株來標準化，並且比率以條形圖展示。活性在家蠅注射分析中評估。 圖 6示出Av3突變體Av3bM80-Av3bM96之產率及活性。突變肽在乳酸克魯維斯酵母表現系統中表現。給定突變體之產率及活性相對於Av3b表現菌株來標準化，並且比率以條形圖展示。活性在家蠅注射分析中評估。 圖 7示出Av3突變體Av3bM97-Av3bM114之產率及活性。突變肽在乳酸克魯維斯酵母表現系統中表現。給定突變體之產率及活性相對於Av3b表現菌株來標準化，並且比率以條形圖展示。活性在家蠅注射分析中評估。 圖 8示出Av3突變體Av3bM115-Av3bM126之產率及活性。突變肽在乳酸克魯維斯酵母表現系統中表現。給定突變體之產率及活性相對於Av3b表現菌株來標準化，並且比率以條形圖展示。活性在家蠅注射分析中評估。 圖 9示出Av3突變體Av3bM151-Av3bM162之產率及活性。突變肽在乳酸克魯維斯酵母表現系統中表現。給定突變體之產率及活性相對於Av3b表現菌株來標準化，並且比率以條形圖展示。活性在家蠅注射分析中評估。 圖 10示出Av3突變體Av3bM163-Av3bM168之產率及活性。突變肽在乳酸克魯維斯酵母表現系統中表現。給定突變體之產率及活性相對於Av3b表現菌株來標準化，並且比率以條形圖展示。在本文中，活性在穀實夜蛾 (Helicoverpa zea)(玉米穗蛾或「CEW」)注射分析中評估。 圖 11示出Av3突變體Av3bM169-Av3bM172之產率及活性。突變肽在乳酸克魯維斯酵母表現系統中表現。給定突變體之產率及活性相對於Av3b表現菌株來標準化，並且比率以條形圖展示。在本文中，活性在穀實夜蛾(玉米穗蛾或「CEW」)注射分析中評估。 圖 12描繪展示在不同pH條件下發酵期間之Av3b肽產率的圖表。Y軸表示以g/L為單位之發酵醪上清液中之Av3b肽濃度。X軸表示發酵時間(EFT：有效發酵時間)。除了pH以外，四次發酵同時使用相同條件來執行。pH條件為：pH對照、pH4.5、及pH6.5。各pH條件具有兩個重複發酵。V2=pH 6.5(淡藍色線)；V3=pH 4.5(紫色線)；V4=pH 4.5(棕色線)；V5=pH 6.5(深藍色線)。 圖 13描繪鑑別發酵期間之Av3b降解產物的rpHPLC層析圖。樣品在發酵結束時分析，並且發酵持續約120小時。在主要Av3b峰之後，存在3個額外峰(被鑑別為DP1、DP2及DP3)。DP1為Av3b之兩個C末端截短產物之混合物：ΔK26及ΔP25-ΔK26，其中後者為存在之主要物質。DP2被鑑別為K26截短產物。DP3未藉由LC/MS來鑑別。此等資料指示羧基-肽酶可能造成發酵期間之Av3b降解。 圖 14描繪自Av3b發酵醪樣品收集之發酵醪之流份之FPLC尺寸排阻層析。流份使用具有Superdex Increase 200GL管柱之GE AKTA Pure 25系統來收集。 圖 15描繪展示圖14展示之流份#8之蛋白酶活性的層析。在本文中，向流份#8加入Av3b肽。流份#8展示弱的蛋白酶活性，顯示某個水準之Av3b降解及降解峰之釋放。 圖 16描繪展示圖14展示之流份#9之蛋白酶活性的層析。在本文中，向流份#9加入Av3b肽。與流份#8相比，流份#9展示導致Av3b降解及降解峰之釋放的更強蛋白酶活性。 圖 17描繪展示圖14展示之流份#12之蛋白酶活性的層析。在本文中，向流份#12加入Av3b肽。在四個活性流份中，流份#12具有最高比率之降解，如Av3b峰減少及降解峰之釋放指示。 圖 18描繪展示圖14展示之流份#13之蛋白酶活性的層析。在本文中，向流份#13加入Av3b肽。流份#13展示發生某個水準之降解，導致釋放一些降解峰，儘管峰概況相對於流份之其餘部分為稍微不同的 圖 19描繪展示流份池之蛋白酶活性的層析，該池將自Av3b發酵醪之DEAE陰離子交換(IE)層析之溶析收集之所有蛋白酶活性流份加以組合。如圖表展示，在室溫下，在流份池中培育隔夜之後，Av3b完全轉化成降解峰A(Av3b Deg PkA)及峰B(Av3b Deg PkB)。 圖 20描繪使用具有Superdex Increase 200GL管柱之GE AKTA Pure25系統，自Av3b發酵醪之DEAE陰離子交換層析之溶析來收集之蛋白酶活性流份池的FPLC尺寸排阻層析。 圖 21描繪展示在向流份加入Av3b肽之後，如圖20中示出之流份#8至#11之流份池之蛋白酶活性的層析。峰指示Av3b峰之降解、及降解峰之釋放。「Frac」意謂流份。 圖 22描繪展示在向流份加入Av3b肽之後，如圖20中示出之流份#12至#13之流份池之蛋白酶活性的層析。在此處，峰指示Av3b肽峰完全轉化至降解峰。 圖 23描繪展示在加入Av3b肽之後，如圖20中示出之流份#14之蛋白酶活性的層析。在此處，峰指示Av3b肽峰完全轉化至降解峰。 圖 24描繪展示在加入Av3b肽之後，分別如圖20中示出之流份#15、#16、及#17之蛋白酶活性的層析。峰指示Av3b峰轉化至降解峰。 圖 25描繪羧基蛋白酶prc1之剔除策略。「VSTLB09」係指陽性酵母菌株。為了剔除prc1，使用反選擇同源重組策略。將經設計之剔除載體整合至酵母基因組prc1基因座中並且將部分prc1(剔除)用AmdS之選擇標誌物來置換。異源AmdS匣被設計來藉由與兩個同源pcr1 5’-片段側接來進行自身出局重組。此等兩步菌株修飾過程產生「VSTLB09」，係指沒有任何異源基因之陽性pcr1剔除酵母菌株。 圖 26示出pKlprc1質體之質體圖譜。 圖 27描繪pKlDprc1質體之5’-及3’-同源性臂，及整合策略。在本文中，rt-Klprc1-LB1係指用於prc1剔除評估之qPCR正向引子；Klprc1係指乳酸克魯維斯酵母prc1；並且rt-klprc1-LB2係指用於prc1剔除評估之qPCR反向引子。 圖 28描繪評估乳酸克魯維斯酵母prc1基因之剔除的qPCR結果。在本文中，YCT306用作展示存在一個prc1基因複本的校準菌株。菌株VSTLB9a-2及6展示prc1基因之成功剔除。 圖 29描繪針對剔除乳酸克魯維斯酵母prc1基因之qPCR純化篩檢的結果。Y軸示出相對定量(「RQ」)、或2 -ΔΔϹt。在本文中，YCT306用作展示存在一個prc1基因複本的校準菌株。URA3用作參考基因。插圖示出純系VSTLB09a-6-1及YCT306之擴增曲線。 圖 30示出針對VSTLB09菌株之乳酸克魯維斯酵母prc1剔除的qPCR初級篩檢之結果。Y軸示出相對定量(「RQ」)、或2 -ΔΔϹt。酵母菌株YCT306用作參考。 圖 31示出VSTLB09菌株中之 amdS之出局重組之qPCR初級篩檢之結果。Y軸示出相對定量(「RQ」)、或2 -ΔΔϹt。酵母菌株YCT306用作參考。 圖 32示出在發酵過程期間118小時採樣之Av3b表現菌株發酵醪之HPLC層析圖。在主要Av3b峰之後，存在3個額外峰(被鑑別為降解P1、P2及P3)。 圖 33示出在發酵過程期間118小時採樣之prb1/prc1 Av3b剔除菌株發酵醪之HPLC層析圖。在本文中，相對於Av3b表現菌株，降解減少，然而，仍然存在一些降解，如藉由圓圈中之峰來指示。 圖 34描繪展示給定突變體之肽穩定性的圖表，亦即，Av3bM19(「M19」)；Av3bM23(「M23」)；Av3bM24(「M24」)；Av3bM25(「M25」)；Av3bM27(「M27」)；Av3bM28(「M28」)；在pH6.5下加入Av3b發酵醪中之Av3b肽對照；及加入pH4緩衝液中之Av3b。Y軸為與各組中之肽之開始量相比的相對肽量(呈HPLC中之肽峰面積)。肽量藉由HPLC峰面積來表示。各條形圖表示在對應時間點，亦即，0、15、39、62.5、及144小時，給定突變體之相對於Av3b之肽量。方框指示陽性(Av3b)及陰性(pH4緩衝液)對照。例如，「pH4緩衝液」組為在pH4緩衝液中培育之Av3b肽。此對照組中之所有條形圖具有相似高度，指示Av3b肽在整個培育期期間未降解。在「Av3b ctl」組中，將Av3b加入Av3b發酵醪中；隨著培育時間增加，Av3b肽之相對量減少，指示醪中之Av3b肽損失或降解。 圖 35描繪展示加入pH6.5下之Av3b發酵醪中之給定突變體的肽穩定性的圖表。自左至右分組為：(1)加入pH4緩衝液中之Av3b；(2)Av3b對照；(3)Av3bM19(「M19」)；及(4)Av3bM24(「M24」)。各條形圖表示相對於其開始量，及時間點：0、24、48、106、144、及248小時之肽量。在本文中，「pH4緩衝液」組為在pH4緩衝液中培育之Av3b肽。Y軸為與各組中之肽之開始量相比的相對肽量(呈HPLC中之肽峰面積)。肽量藉由HPLC峰來表示。 圖 36示出隨著時間的推移，發酵醪中之Av3bM19及Av3bM24之降解。Y軸為與肽之開始量相比的相對肽量(呈HPLC中之肽峰面積)。如本文示出，在248小時，剩餘95%之Av3bM19肽，並且剩餘84%之Av3bM24肽。248小時之後，剩餘3.8%之Av3b。 圖 37示出描繪Av3b生產發酵醪中之Av3b突變體之降解的圖表。Av3b具有46.34小時之半降解時間。突變體Av3bM19具有長得多的降解時間，具有666小時之半降解時間。同樣地，突變體Av3bM24具有652小時之半降解時間。 圖 38示出使用Rosetta蛋白模型化程式及PyMol來創建之計算Av3bM24 3D結構。 圖 39示出描繪Av3b生產發酵醪中之Av3b突變體之降解的圖表。Av3b具有56.087小時之半降解時間。突變體Av3bM125具有長得多的降解時間，具有369小時之半降解時間。 圖 40描繪展示在室溫及pH 6.5下，Av3b發酵醪中之Av3bM125之穩定性的圖表。Y軸示出相對於其開始量的肽之量。第一組條形圖示出pH 4緩衝液中之Av3bM125之穩定性。第二組條形圖示出pH 6.5下之發酵醪中之Av3b降解。第三組條形圖示出Av3bM125。各條形圖對應於自左至右0、18、42、76、112、及164小時之時間。 圖 41示出來自在發酵過程期間119.5小時獲得之突變菌株發酵樣品之Av3b突變體Av3bM97的HPLC層析圖。圓圈指示降解產物。 圖 42示出來自在發酵過程期間119.5小時獲得之突變菌株發酵樣品之Av3b突變體Av3bM98的HPLC層析圖。在本文中，沒有降解產物。 圖 43示出來自在發酵過程期間119.5小時獲得之突變菌株發酵樣品之Av3b突變體Av3bM99的HPLC層析圖。圓圈指示降解產物。 圖 44示出來自在發酵過程期間119.5小時獲得之突變菌株發酵樣品之Av3b突變體Av3bM100的HPLC層析圖。圓圈指示降解產物。 圖 45示出來自在發酵過程期間119.5小時獲得之突變菌株發酵樣品之Av3b突變體Av3bM101的HPLC層析圖。圓圈指示降解產物。 圖 46示出來自在發酵過程期間119.5小時獲得之突變菌株發酵樣品之Av3b突變體Av3bM102的HPLC層析圖。圓圈指示降解產物。 圖 47示出來自在發酵過程期間119.5小時獲得之突變菌株發酵樣品之Av3b突變體Av3bM103的HPLC層析圖。 圖 48示出來自在發酵過程期間119.5小時獲得之突變菌株發酵樣品之Av3b突變體Av3bM104的HPLC層析圖。圓圈指示降解產物。 圖 49示出來自在發酵過程期間119.5小時獲得之突變菌株發酵樣品之Av3b突變體Av3bM111的HPLC層析圖。圓圈指示降解產物。 圖 50示出來自在發酵過程期間119.5小時獲得之突變菌株發酵樣品之Av3b突變體Av3bM146的HPLC層析圖。圓圈指示降解產物。 圖 51示出來自在發酵過程期間119.5小時獲得之突變菌株發酵樣品之Av3b突變體Av3bM147的HPLC層析圖。圓圈指示降解產物。 圖 52示出來自在發酵過程期間119.5小時獲得之突變菌株發酵樣品之Av3b突變體Av3bM148的HPLC層析圖。 圖 53示出來自在發酵過程期間119.5小時獲得之突變菌株發酵樣品之Av3b突變體Av3bM156的HPLC層析圖。圓圈指示降解產物。 圖 54示出來自在發酵過程期間119.5小時獲得之突變菌株發酵樣品之Av3b突變體Av3bM157的HPLC層析圖。圓圈指示降解產物。 圖 55示出來自在發酵過程期間119.5小時獲得之突變菌株發酵樣品之Av3b突變體Av3bM165的HPLC層析圖。 圖 56示出來自在發酵過程期間119.5小時獲得之突變菌株發酵樣品之Av3b突變體Av3bM168的HPLC層析圖。圓圈指示降解產物。 圖 57示出來自在發酵過程期間119.5小時獲得之突變菌株發酵樣品之Av3b突變體Av3bM169的HPLC層析圖。圓圈指示降解產物。 圖 58示出來自在發酵過程期間119.5小時獲得之突變菌株發酵樣品之Av3b突變體Av3bM170的HPLC層析圖。 圖 59示出來自在發酵過程期間119.5小時獲得之突變菌株發酵樣品之Av3b突變體Av3bM171的HPLC層析圖。圓圈指示降解產物。 圖 60示出來自在發酵過程期間119.5小時獲得之突變菌株發酵樣品之Av3b突變體Av3bM172的HPLC層析圖。圓圈指示降解產物。 圖 61展示了示出在兩個不同溫度23.5℃及27℃下，與整合至表現菌株基因組中之Av3b肽轉殖基因之複本數相關的肽產率的圖表，從而可藉由每個整合肽基因之產率來更好地預測新肽品系之產率。產率藉由產生線性擬合曲線，並且將擬合曲線延伸至12個整合基因複本之點來計算。 圖 62示出在小規模發酵操作中培育之Av3b表現菌株pKS022-YCT-38-14之HPLC層析圖。 圖 63示出在小規模發酵操作中培育之Av3bM24突變菌株之HPLC層析圖。 圖 64示出在小規模發酵操作中培育之Av3bM165突變菌株之HPLC層析圖。 圖 65示出在小規模發酵操作中培育之Av3bM103突變菌株之HPLC層析圖。 圖 66示出在小規模發酵操作中培育之Av3bM170突變菌株之HPLC層析圖。 圖 67描繪圓二向色性(CD)分析之結果。表示CD信號之CD光譜在Y軸上以毫度(mdeg)來展示，其係用具有如X軸展示之180 nm至250 nm之波長的UV光來掃描。 圖 68描繪在54℃下對於pH4.0乙酸鈉(NaOAc)緩衝溶液中之Av3b、Av3bM24、Av3bM165、Av3bM103、及Av3bM170執行0、3、7、10、12、及14天之熱穩定性分析之結果，該分析使用咖啡因內部控制來消除由蒸發引起之變化。剩餘Av3bM百分比(%)示出相對於初始量的在給定日之剩餘肽之量，如藉由HPLC峰面積來量測。 圖 69示出384小時之後，在3.1至pH9.6之pH範圍內之Av3bM24之穩定性。在本文中，相對峰係指相對於開始HPLC峰面積的不同時間點之峰面積。 圖 70示出16小時之後，在3.1至pH9.6之pH範圍內之Av3bM165之穩定性。 圖 71示出15小時之後，在3.1至pH 9.6之pH範圍內之Av3bM165之穩定性。 圖 72示出16小時之後，在3.1至pH 9.6之pH範圍內之Av3bM170之穩定性。 圖 73描繪穀實夜蛾腸道提取物(GE)中之Av3b突變體之降解。所測試之突變體為Av3bM24；Av3bM165；Av3bM103；Av3bM170，及Av3b作為比較物。 

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          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys 
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          Lys Ser Pro Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Ala Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys 
                      20                  25      
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          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys 
                      20                  25      
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          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys 
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          <![CDATA[<400>  6]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Pro Asn Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
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          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys 
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          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Thr 
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          Thr Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Pro Tyr Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
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          <![CDATA[<400>  9]]>
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          Thr Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Thr Thr 
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          Cys Tyr Pro Asn Gly Cys Asp Gly Pro Arg 
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  13]]>
          Thr Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Thr Thr 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Asn Gly Cys Asp Gly Ser Thr 
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  14]]>
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          <![CDATA[<400>  15]]>
          Thr Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Thr 
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          Cys Tyr Pro Asn Gly Cys Asp Gly Ser Glu 
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          <![CDATA[<400>  16]]>
          Thr Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Thr Thr 
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          Cys Tyr Pro Asn Gly Cys Asp Gly Ser Arg 
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          <![CDATA[<400>  17]]>
          Thr Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Thr 
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          Cys Tyr Pro Asn Gly Cys Asp Gly Ser Arg 
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          <![CDATA[<400>  18]]>
          Lys Ser Cys Ala Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Ala Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys 
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          <![CDATA[<400>  19]]>
          Lys Ser Ala Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
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          Ala Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  20]]>
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          Cys Tyr Pro Asp Gly Cys Asp Gly Pro Lys 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  21]]>
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM20]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Thr Thr 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Asn Gly Cys Asp Gly Pro Lys 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM21]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Thr Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys 
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          <![CDATA[<400>  23]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Thr 
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          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys 
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          <![CDATA[<400>  24]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Asn Gly Cys Ser Gly Pro Lys 
                      20                  25      
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          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Asp Gly Pro Lys 
                      20                  25      
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          <![CDATA[<400>  26]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Pro Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys 
                      20                  25      
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          <![CDATA[<400>  27]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Pro Pro Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  28]]>
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          <![CDATA[<400>  28]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Ala Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  29]]>
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          <![CDATA[<400>  29]]>
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          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys 
                      20                  25      
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM29]]>
          <![CDATA[<400]]>>  30]]&gt;
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          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  31]]>
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          <![CDATA[<400>  31]]>
          Gln Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro His 
                      20                  25      
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          <![CDATA[<400>  32]]>
          Thr Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys 
                      20                  25      
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          <![CDATA[<400>  33]]>
          Ser Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  34]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM33]]>
          <![CDATA[<400>  34]]>
          Ser Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Thr 
                      20                  25      
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          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  M125]]>
          <![CDATA[<400>  35]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Pro Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Arg Gly Pro Asp 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  36]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  M103]]>
          <![CDATA[<400>  36]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Gly 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  37]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  M169]]>
          <![CDATA[<400>  37]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Thr Gly Pro Gly 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  38]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  M170]]>
          <![CDATA[<400>  38]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Gly Gly Pro Gly 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  39]]>
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          <![CDATA[<223>  M148]]>
          <![CDATA[<400>  39]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys Gly 
                      20                  25          
          <![CDATA[<210>  40]]>
          <![CDATA[<211>  28]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  M165]]>
          <![CDATA[<400>  40]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys Val Gly 
                      20                  25              
          <![CDATA[<210>  41]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM97]]>
          <![CDATA[<400>  41]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Ala 
                      20                  25      
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          <![CDATA[<211>  26]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM98]]>
          <![CDATA[<400>  42]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Arg 
                      20                  25      
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          <![CDATA[<211>  26]]>
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          <![CDATA[<223>  Av3bM99]]>
          <![CDATA[<400>  43]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Asn 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  44]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM100]]>
          <![CDATA[<400>  44]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Asp 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  45]]>
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          <![CDATA[<213>  人工序列(Arti]]>ficial Sequence)
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          <![CDATA[<223>  Av3bM101]]>
          <![CDATA[<400>  45]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Glu 
                      20                  25      
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          <![CDATA[<211>  26]]>
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          <![CDATA[<400>  46]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Gln 
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          <![CDATA[<400>  47]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro His 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  48]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM111]]>
          <![CDATA[<400>  48]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Thr 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  49]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM146]]>
          <![CDATA[<400>  49]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Gly Val 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  50]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM147]]>
          <![CDATA[<400>  50]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Arg Val 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  51]]>
          <![CDATA[<211>  27]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM148]]>
          <![CDATA[<400>  51]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys Gly 
                      20                  25          
          <![CDATA[<210>  52]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM156]]>
          <![CDATA[<400>  52]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Asp Gly Pro Ala 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  53]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM157]]>
          <![CDATA[<400>  53]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Asp Gly Pro Thr 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  54]]>
          <![CDATA[<211>  28]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM168]]>
          <![CDATA[<400>  54]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys Val Ile 
                      20                  25              
          <![CDATA[<210>  55]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM171]]>
          <![CDATA[<400>  55]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Asp Gly Pro Gly 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  56]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM172]]>
          <![CDATA[<400>  56]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Asp Gly Pro 
                      20                  25  
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          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM34]]>
          <![CDATA[<400>  57]]>
          Ala Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  58]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM35]]>
          <![CDATA[<400>  58]]>
          Asn Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  59]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM36]]>
          <![CDATA[<400>  59]]>
          Asp Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  60]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM37]]>
          <![CDATA[<400>  60]]>
          Glu Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  61]]>
          <![CDATA[<21]]>1>  26]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;212&gt;  PRT]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;213&gt;  人工序列(Artificial Sequence)]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  Av3bM38]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;400&gt;  61]]&gt;
          <br/>
          <br/><![CDATA[Gly Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
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          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  62]]>
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<22]]>0>]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  Av3bM39]]&gt;
          <br/>
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          <br/>
          <br/><![CDATA[Ile Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  63]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM40]]>
          <![CDATA[<400>  63]]>
          Leu Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  64]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM41]]>
          <![CDATA[<400>  64]]>
          Met Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  65]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>]]>  PRT
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM42]]>
          <![CDATA[<400>  65]]>
          Phe Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  66]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial S]]>equence)
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM43]]>
          <![CDATA[<400>  66]]>
          Pro Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  67]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM44]]>
          <![CDATA[<400>  67]]>
          Trp Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  68]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM45]]>
          <![CDATA[<400>  68]]>
          Tyr Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  69]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM46]]>
          <![CDATA[<400>  69]]>
          Val Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
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                      20                  25      
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          Cys Tyr Pro Leu Gly Cys Ser Gly Pro Lys 
                      20                  25      
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          1               5                   10                  15      
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                      20                  25      
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          Cys Tyr Pro Met Gly Cys Ser Gly Pro Lys 
                      20                  25      
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          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  104]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM82]]>
          <![CDATA[<400>  105]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
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          <![CDATA[<400>  107]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
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          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM85]]>
          <![CDATA[<400>  108]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
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          <![CDATA[<400>  109]]>
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          1               5                   10                  15      
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          <![CDATA[<400>  110]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
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          <![CDATA[<400>  111]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Leu Gly Pro Lys 
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          <![CDATA[<400>  112]]>
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          <![CDATA[<400>  113]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Met Gly Pro Lys 
                      20                  25      
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          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
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          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Thr Gly Pro Lys 
                      20                  25      
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          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Lys 
                      20                  25      
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          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Tyr Gly Pro Lys 
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          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Val Gly Pro Lys 
                      20                  25      
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          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Ile 
                      20                  25      
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          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Met 
                      20                  25      
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          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Phe 
                      20                  25      
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          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Ser 
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          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
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          <![CDATA[<400>  127]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
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          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
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          <![CDATA[<400>  128]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
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          <![CDATA[<400>  130]]>
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          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Pro Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
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          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM120]]>
          <![CDATA[<400>  134]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Pro Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>(Artificial Sequence)
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  135]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
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          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
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          <![CDATA[<400>  136]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
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                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  137]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM123]]>
          <![CDATA[<400>  137]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Pro Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Asp 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  138]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Arg Gly Pro Asp 
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          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Arg Gly Pro Glu 
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          His Ser Cys Cys Pro Cys Gly Asp Gly Gly Cys Pro Asn Gly Gln Arg 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Asp Gly Pro Lys 
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          <![CDATA[<400>  148]]>
          His Ser Cys Cys Pro Cys Phe Asp Gly Gly Cys Pro Phe Gly Gln Arg 
          1               5                   10                  15      
          Cys Phe Pro Glu Gly Cys Asp Gly Pro Lys 
                      20                  25      
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          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Asp Gly Pro Lys 
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          Cys Gly Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys 
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          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Trp Trp Gly Gly Cys Asp Trp Gly Gln Asp 
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          Cys Gly Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys 
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          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys His Thr Gly Gln Asp 
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          Cys Gly Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys 
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          <![CDATA[<400>  153]]>
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          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Asp Gly Pro Lys 
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          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys Val 
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          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Met Lys Val 
                      20                  25          
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          <![CDATA[<211>  27]]>
          <![CDATA[<21]]>2>  PRT]]&gt;
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          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  Av3bM149]]&gt;
          <br/>
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          <br/>
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          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
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          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys Ile 
                      20                  25          
          <![CDATA[<210>  158]]>
          <![CDATA[<211]]>>  26]]&gt;
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          <br/>&lt;![CDATA[&lt;213&gt;  人工序列(Artificial Sequence)]]&gt;
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          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  Av3bM151]]&gt;
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          <![CDATA[<210>  159]]>
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          <![CDATA[<400>  159]]>
          Ile Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Asp Gly Pro Lys 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  160]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM153]]>
          <![CDATA[<400>  160]]>
          Leu Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Asp Gly Pro Lys 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  161]]>
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          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM154]]>
          <![CDATA[<400>  161]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gln Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Asp Gly Pro Lys 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  162]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM155]]>
          <![CDATA[<400>  162]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Pro Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Asp Gly Pro Lys 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  163]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序]]>列(Artificial Sequence)
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          <![CDATA[<400>  163]]>
          Val Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Pro Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Arg Gly Pro Asp 
                      20                  25      
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          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
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          <![CDATA[<223>  Av3bM159]]>
          <![CDATA[<400>  164]]>
          Ile Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Pro Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Arg Gly Pro Asp 
                      20                  25      
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM160]]>
          <![CDATA[<400>  165]]>
          Leu Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Pro Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Arg Gly Pro Asp 
                      20                  25      
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          <![CDATA[<400>  166]]>
          Val Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Pro Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Thr Gly Pro Thr 
                      20                  25      
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          <![CDATA[<400>  167]]>
          Val Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Pro Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Thr Gly Pro Lys 
                      20                  25      
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          <![CDATA[<211>  25]]>
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          <br/>
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          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro 
                      20                  25  
          <![CDATA[<210>  169]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  169]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly 
                      20                  
          <![CDATA[<210>  170]]>
          <![CDATA[<211>  28]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM166]]>
          <![CDATA[<400>  170]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys Val Gln 
                      20                  25              
          <![CDATA[<210>  171]]>
          <![CDATA[<211>  28]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Av3bM167]]>
          <![CDATA[<400>  171]]>
          Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys Val Asp 
                      20                  25              
          <![CDATA[<210>  172]]>
          <![CDATA[<211>  27]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  蛇鎖海葵(Anemonia viridis)]]>
          <![CDATA[<400>  172]]>
          Arg Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys Val 
                      20                  25          
          <![CDATA[<210>  173]]>
          <![CDATA[<211>  24]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大麥(Hordeum vulgare)]]>
          <![CDATA[<400>  173]]>
          Met Ala Asn Lys His Leu Ser Leu Ser Leu Phe Leu Val Leu Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Leu Ser Ala Ser Leu Ala Ser Gly 
                      20                  
          <![CDATA[<210>  174]]>
          <![CDATA[<211>  27]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  皺葉菸草(Nicotiana plumbaginifolia)]]>
          <![CDATA[<400>  174]]>
          Glu Met Gly Lys Met Ala Ser Leu Phe Ala Ser Leu Leu Val Val Leu 
          1               5                   10                  15      
          Val Ser Leu Ser Leu Ala Ser Glu Ser Ser Ala 
                      20                  25          
          <![CDATA[<210>  175]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  皺葉菸草(Nicotiana plumbaginifolia)]]>
          <![CDATA[<400>  175]]>
          Met Gly Lys Met Ala Ser Leu Phe Ala Thr Phe Leu Val Val Leu Val 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Ser Leu Ala Ser Glu Ser Ser Ala 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  176]]>
          <![CDATA[<211>  78]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  皺葉菸草(Nicotiana plumbaginifolia)]]>
          <![CDATA[<400>  176]]>
          atgggtaaga tggcttctct gtttgcttct ctgctggttg ttctggtttc tctgtctctg       60
          gcttctgaat cttctgct                                                     78
          <![CDATA[<210>  177]]>
          <![CDATA[<211>  78]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  皺葉菸草(Nicotiana plumbaginifolia)]]>
          <![CDATA[<400>  177]]>
          atgggtaaga tggcttctct gtttgctact tttctggttg ttctggtttc tctgtctctg       60
          gcttctgaat cttctgct                                                     78
          <![CDATA[<210>  178]]>
          <![CDATA[<211>  238]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  維多利亞水母(Aequorea victoria)]]>
          <![CDATA[<400>  178]]>
          Ala Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val 
          1               5                   10                  15      
          Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu 
                      20                  25                  30          
          Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys 
                  35                  40                  45              
          Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe 
              50                  55                  60                  
          Ser Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg 
          65                  70                  75                  80  
          His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg 
                          85                  90                  95      
          Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val 
                      100                 105                 110         
          Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile 
                  115                 120                 125             
          Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn 
              130                 135                 140                 
          Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val 
                          165                 170                 175     
          Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro 
                      180                 185                 190         
          Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser 
                  195                 200                 205             
          Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val 
              210                 215                 220                 
          Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 
          225                 230                 235             
          <![CDATA[<210>  179]]>
          <![CDATA[<211>  224]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  阿希刺柏(Juniperus ashei)]]>
          <![CDATA[<400>  179]]>
          Lys Phe Asp Ile Lys Asn Gln Cys Gly Tyr Thr Val Trp Ala Ala Gly 
          1               5                   10                  15      
          Leu Pro Gly Gly Gly Lys Arg Leu Asp Gln Gly Gln Thr Trp Thr Val 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Ala Ala Gly Thr Ala Ser Ala Arg Phe Trp Gly Arg Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Cys Thr Phe Asp Ala Ser Gly Lys Gly Ser Cys Gln Thr Gly Asp Cys 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Gln Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Ala Val Pro Ala Thr Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Glu Tyr Thr Gln Ser Asp Gln Asp Tyr Tyr Asp Val Ser Leu Val 
                          85                  90                  95      
          Asp Gly Phe Asn Ile Pro Leu Ala Ile Asn Pro Thr Asn Ala Gln Cys 
                      100                 105                 110         
          Thr Ala Pro Ala Cys Lys Ala Asp Ile Asn Ala Val Cys Pro Ser Glu 
                  115                 120                 125             
          Leu Lys Val Asp Gly Gly Cys Asn Ser Ala Cys Asn Val Phe Lys Thr 
              130                 135                 140                 
          Asp Gln Tyr Cys Cys Arg Asn Ala Tyr Val Asp Asn Cys Pro Ala Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Asn Tyr Ser Lys Ile Phe Lys Asn Gln Cys Pro Gln Ala Tyr Ser Tyr 
                          165                 170                 175     
          Ala Lys Asp Asp Thr Ala Thr Phe Ala Cys Ala Ser Gly Thr Asp Tyr 
                      180                 185                 190         
          Ser Ile Val Phe Cys Met Ala Arg Val Ser Glu Leu Ala Phe Leu Leu 
                  195                 200                 205             
          Ala Ala Thr Leu Ala Ile Ser Leu His Met Gln Glu Ala Gly Val Val 
              210                 215                 220                 
          <![CDATA[<210>  180]]>
          <![CDATA[<211>  225]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  阿希刺柏(Juniperus ashei)]]>
          <![CDATA[<400>  180]]>
          Met Ala Arg Val Ser Glu Leu Ala Phe Leu Leu Ala Ala Thr Leu Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ile Ser Leu His Met Gln Glu Ala Gly Val Val Lys Phe Asp Ile Lys 
                      20                  25                  30          
          Asn Gln Cys Gly Tyr Thr Val Trp Ala Ala Gly Leu Pro Gly Gly Gly 
                  35                  40                  45              
          Lys Arg Leu Asp Gln Gly Gln Thr Trp Thr Val Asn Leu Ala Ala Gly 
              50                  55                  60                  
          Thr Ala Ser Ala Arg Phe Trp Gly Arg Thr Gly Cys Thr Phe Asp Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Gly Lys Gly Ser Cys Gln Thr Gly Asp Cys Gly Gly Gln Leu Ser 
                          85                  90                  95      
          Cys Thr Val Ser Gly Ala Val Pro Ala Thr Leu Ala Glu Tyr Thr Gln 
                      100                 105                 110         
          Ser Asp Gln Asp Tyr Tyr Asp Val Ser Leu Val Asp Gly Phe Asn Ile 
                  115                 120                 125             
          Pro Leu Ala Ile Asn Pro Thr Asn Ala Gln Cys Thr Ala Pro Ala Cys 
              130                 135                 140                 
          Lys Ala Asp Ile Asn Ala Val Cys Pro Ser Glu Leu Lys Val Asp Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Cys Asn Ser Ala Cys Asn Val Phe Lys Thr Asp Gln Tyr Cys Cys 
                          165                 170                 175     
          Arg Asn Ala Tyr Val Asp Asn Cys Pro Ala Thr Asn Tyr Ser Lys Ile 
                      180                 185                 190         
          Phe Lys Asn Gln Cys Pro Gln Ala Tyr Ser Tyr Ala Lys Asp Asp Thr 
                  195                 200                 205             
          Ala Thr Phe Ala Cys Ala Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Ile Val Phe Cys 
              210                 215                 220                 
          Pro 
          225 
          <![CDATA[<210>  181]]>
          <![CDATA[<211>  4]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IGER]]>
          <![CDATA[<400>  181]]>
          Ile Gly Glu Arg 
          1               
          <![CDATA[<210>  182]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  EEKKN]]>
          <![CDATA[<400>  182]]>
          Glu Glu Lys Lys Asn 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  183]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  ETMFKHGL]]>
          <![CDATA[<400>  183]]>
          Glu Thr Met Phe Lys His Gly Leu 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  184]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequen]]>ce)
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子]]>
          <![CDATA[<400>  184]]>
          Ala Leu Lys Phe Leu Val 
          1               5       
          <![CDATA[<210>  185]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子]]>
          <![CDATA[<400>  185]]>
          Ala Leu Lys Leu Phe Val 
          1               5       
          <![CDATA[<210>  186]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子]]>
          <![CDATA[<400>  186]]>
          Ile Phe Val Arg Leu Arg 
          1               5       
          <![CDATA[<210>  187]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子]]>
          <![CDATA[<400>  187]]>
          Leu Phe Ala Ala Pro Phe 
          1               5       
          <![CDATA[<210>  188]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子]]>
          <![CDATA[<400>  188]]>
          Ala Leu Lys Phe Leu Val Gly Ser 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  189]]>
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子]]>
          <![CDATA[<400>  190]]>
          Ile Phe Val Arg Leu Arg Gly Ser 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  191]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子]]>
          <![CDATA[<400>  191]]>
          Leu Phe Ala Ala Pro Phe Gly Ser 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  192]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence]]>)
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子]]>
          <![CDATA[<400>  192]]>
          Leu Phe Val Arg Leu Arg Gly Ser 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  193]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子]]>
          <![CDATA[<400>  193]]>
          Leu Gly Glu Arg Gly Ser 
          1               5       
          <![CDATA[<210>  194]]>
          <![CDATA[<211>  23]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  rt-Klprc1-LB1]]>
          <![CDATA[<400>  194]]>
          gtacgcatcg ggccaagatt tcc                                               23
          <![CDATA[<210>  195]]>
          <![CDATA[<211>  30]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  rt-Klprc1-LB2]]>
          <![CDATA[<400>  195]]>
          cggttagacc gttaccgata agaacagaag                                        30
          <![CDATA[<210>  196]]>
          <![CDATA[<211>  24]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  rt-URA3c-LB1]]>
          <![CDATA[<400>  196]]>
          ttccaagggt tctctagcac acgg                                              24
          <![CDATA[<210>  197]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  rt-URA3c-LB2]]>
          <![CDATA[<400>  197]]>
          cctacacctg gggtcatgat tagcc                                             25
          <![CDATA[<210>  198]]>
          <![CDATA[<211>  29]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  rt-AmdS-LB1：正向]]>
          <![CDATA[<400>  198]]>
          aagggaactc gatgaatact acgcaaagc                                         29
          <![CDATA[<210>  199]]>
          <![CDATA[<211>  29]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  rt-AmdS-LB2：反向]]>
          <![CDATA[<400>  199]]>
          cgtacttgtt tagccatgag atgtagccc                                         29
          <![CDATA[<210>  200]]>
          <![CDATA[<211>  1608]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)]]>
          <![CDATA[<400>  200]]>
          atgagaactg ctagtgtttt gtgtgctttg gctggttgcg cgtccgcttt aagcgttcaa       60
          aataagttac caggaagaac tgccttggat aaagcaattg acgctttagg gttaagttca      120
          tctgatgttt taagctctct tcctaaccat ttgaagaccg cttggaacga aatggggatg      180
          ttgttcccac aagaagctgg tcaattggag tttttatcca aaccaagagg taagattacc      240
          aagcacgata agtgggatta cgtggtgaaa ccagagagtt tcgtttctac tgcaaacgtt      300
          aacaacgata acgttgggaa ctaccaattg cgtgtgaaga agattaagga ccctaaggtc      360
          ttgggtgtgg acccagatgt taagcaatac tctggttatt tggacgttga agatgaggat      420
          aagcatttct tttattggtt ctttgaatcc agaaacgatc caaagaatga ccctatcatt      480
          ctttggttga acggtggccc tggttgttct tctttgaccg gtttgttctt cgaattgggt      540
          ccatcttctg ttggtgaaga gattaaacca atttacaacc cacattcttg gaatagtaac      600
          gcttctgtga tctttttgga tcaaccagtt aacgttggtt actcttattc ttcctctgaa      660
          ggtgtctcaa acaccgttgc tgccggtaaa gacgtttacg cattcttgca attgttcttc      720
          caacaattcc cagagtacgc atcgggccaa gatttccata tcgctggtga atcttatgct      780
          ggtcattata tcccagtgtt cgctactgaa attttatctc atccaactga agaacgttct      840
          ttcaacttga cttctgttct tatcggtaac ggtctaaccg atccattaag ccaatatcca      900
          tactacgaac caatggcttg tggtgaaggt ggtgaaccat ccgtattgga accagaacaa      960
          tgtgacaata tgttggaaac tttaccaaga tgtctaaact tgatccaatc ctgttacgaa     1020
          tacgaatccg tttggtcttg tgttccagcc tccatctatt gtaataacgc tcaaatgggt     1080
          ccttatcaaa gtactggtaa gaacgtttac gatattcgta aagaatgtca aggtgaattg     1140
          tgttacgatg aaatgaaata catggacgaa tatttgaact tggatttcgt taaggaagcc     1200
          gttggtgctg aagttgacaa ctatgaatcg tgtaacttcg acattaacag aaacttctta     1260
          tttgcaggtg attggatgaa accataccac aagcacgtta ccgaattgtt ggaacaagat     1320
          cttccagttc taatttacgc aggtgacaag gatttcatct gtaactggtt gggtaaccaa     1380
          gcttggacca acttattgcc atataaggat gccgaagaat ttgctaaaca accagttaag     1440
          aattgggtta cttctgttgg taagaaggcc ggtaaggtta agaactttga caagttcacc     1500
          ttcctaagag tatacggtgc tggacacatg gtaccattcg accaaccaga aaatgctttg     1560
          gatatggtta atgactgggt taacggtaag tttgacttcg agcattag                  1608
          <![CDATA[<210>  201]]>
          <![CDATA[<211>  1686]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)]]>
          <![CDATA[<400>  201]]>
          atgaagttcg aaaatacatt attgactata accgcattgt ctaccgtggc tactgctttg       60
          gttatccctg aagttaatag ggaaaacaag catggtgaca agagcgttgc catcaaagat      120
          catgcttctt ctgatttgga taagcctcaa catcatgcta atggcaaggc tcgttctaag      180
          tctcgtggtc gctgcgcaga ctccaagaaa ttcgacaagc tacgtccagt cgacgatgct      240
          tcagctattt tagctccact ttctacagtt aatgatattg ccaacaagat tcctaatcgt      300
          tacatcattg tctttaagaa agatgcctct gcagatgaag tgaagttcca tcaagaacta      360
          gtctctgtcg aacatgccaa ggcactaggt tccttagctg acaatgaccc attcttcaca      420
          gcaacttccg gtgaacatag tgaatttggt gtcaaagcac actctttgga aggtggtatt      480
          caagactctt ttgatattgc cggttccctt tctggttatg ttggctactt cacaaaagaa      540
          gttatcgatt tcatcagaag aagcccattg gttgaatttg ttgaagaaga ttctatggtt      600
          ttctctaata gtttcaatac ccaaaacagt gctccttggg gtctagctcg tatttctcat      660
          cgtgaaaagt tgaatttagg atctttcaac aagtacttgt atgatgatga cgctggtaaa      720
          ggtgttactg cttacgttgt tgacactggt gtcaatgtta accataagga ctttgatggc      780
          agagctgttt ggggtaagac tattccaaaa gatgatccag atgtagatgg aaatggtcac      840
          ggtacccact gtgctggtac catcggttcg gttcattatg gtgttgctaa gaatgctgat      900
          atagttgccg ttaaggtttt gagatctaat ggttctggta ccatgtctga tgttgttaaa      960
          ggtgtcgaat atgttgccga agcacacaag aaagctgttg aagaacaaaa gaaagggttc     1020
          aagggttcaa ctgctaacat gtctttgggt ggtggtaaat ctccagcctt ggatttggcc     1080
          gtcaacgccg ctgttaaggc aggtgttcat tttgctgttg ctgccggtaa tgagaaccaa     1140
          gatgcttgta acacttcgcc tgccgcggct gagaatgcta tcacggttgg tgcctccaca     1200
          ttaagtgatg aaagagctta cttttccaat tggggtaaat gtgtcgacat ctttggtccg     1260
          ggtttgaata tcttatctac ctacattggt tctgatactg ctactgctac cttgtctggt     1320
          acttctatgg ccactcctca tgttgtcggt ttgctaacat atttcttgtc cttgcaacca     1380
          gatgctgata gtgaatattt ccatgccgct ggcggtatta ctccttccca actcaagaag     1440
          aagttaattg atttctctac taagaacgta ttgtccgatc tacctgaaga taccgtgaac     1500
          tacttgattt acaacggtgg tggtcaagat ttggatgacc tatggggtaa ggattactct     1560
          attggaaaag aaccatctgc caaccctgaa ttcagcttgg aaagcttgat taactctttg     1620
          gattcaaaga ctgatgctat ctttgacgac gttagacagt tgttggacca atttaatatc     1680
          atctaa                                                                1686
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Claims (85)

  1. 一種具有針對一或多個昆蟲物種之殺昆蟲活性的Av3突變多肽(AMP)，該AMP包含與根據式(I)：X 1-S-C-C-P-C-Y-W-X 2-X 3-C-P-W-G-Q-X 4-C-Y-P-X 5-G-C-X 6-G-X 7-X 8-X 9-X 10之胺基酸序列至少95%、96%、97%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；其中相對於在SEQ ID NO: 1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該AMP包含至少一個胺基酸取代；其中X 1為K、H、Q、T、S、N、E、I、L、或V；X 2為G、P、或A；X 3為G、或N；X 4為N或D；X 5為E、D、或N；X 6為S、D、G、T、V、或R；X 7為P或不存在；X 8為K、H、A、R、G、T、D、或不存在；X 9為G、V、或不存在；X 10為G、I、或不存在；或其農業上可接受之鹽。
  2. 如請求項1之AMP，其中該AMP包含如SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169中之任一者中所闡明之胺基序列、基本上由其組成、或由其組成，或其農業上可接受之鹽。
  3. 如請求項1之AMP，其中該AMP包含如SEQ ID NO：25、36、38、及40中之任一者中所闡明之胺基序列、基本上由其組成、或由其組成，或其農業上可接受之鹽。
  4. 如請求項1之AMP，其中該AMP為兩種或兩種以上AMP之均聚物或雜聚物，其中各AMP之胺基酸序列相同或不同。
  5. 如請求項1之AMP，其中該AMP為包含藉由可裂解或不可裂解連接子來分隔之兩個或兩個以上AMP的融合蛋白，並且其中各AMP之胺基酸序列可相同或不同。
  6. 如請求項5之AMP，其中該連接子為可裂解連接子。
  7. 如請求項6之AMP，其中該連接子具有如SEQ ID NO：184-193中之任一者中所闡明之胺基酸序列。
  8. 如請求項7之AMP，其中該連接子可在以下中之至少一者內部裂解：(i)昆蟲之腸道或血淋巴，及(ii)可在哺乳動物之腸道內部裂解。
  9. 一種組合或混合物，其包含兩種或兩種以上如請求項1-8中任一項之AMP、基本上由其組成、或由其組成。
  10. 一種組成物，其包含一或多種如請求項1-8中任一項之AMP、基本上由其組成、或由其組成。
  11. 如請求項10之組合物，其進一步包含賦形劑。
  12. 一種可操作來編碼AMP之多核苷酸，該AMP包含與根據式(I)：X 1-S-C-C-P-C-Y-W-X 2-X 3-C-P-W-G-Q-X 4-C-Y-P-X 5-G-C-X 6-G-X 7-X 8-X 9-X 10之胺基酸序列至少95%一致之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成；其中相對於在SEQ ID NO: 1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該AMP包含至少一個胺基酸取代；其中X 1為K、H、Q、T、S、N、E、I、L、或V；X 2為G、P、或A；X 3為G、或N；X 4為N或D；X 5為E、D、或N；X 6為S、D、G、T、V、或R；X 7為P或不存在；X 8為K、H、A、R、G、T、D、或不存在；X 9為G、V、或不存在；X 10為G、I、或不存在；或其互補多核苷酸序列。
  13. 如請求項12之多核苷酸，其中該多核苷酸編碼AMP，該AMP包含如SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169中之任一者中所闡明之胺基序列、基本上由其組成、或由其組成。
  14. 如請求項12之多核苷酸，其中該多核苷酸編碼AMP，該AMP包含如SEQ ID NO：25、36、38、及40中之任一者中所闡明之胺基序列、基本上由其組成、或由其組成。
  15. 一種產生AMP之方法，該方法包括： (a)     製備包含第一表現匣之載體，該第一表現匣包含可操作來編碼AMP之多核苷酸、或其互補核苷酸序列、基本上由其組成、或由其組成，該AMP包含與根據式(I)：X 1-S-C-C-P-C-Y-W-X 2-X 3-C-P-W-G-Q-X 4-C-Y-P-X 5-G-C-X 6-G-X 7-X 8-X 9-X 10之胺基酸序列至少95%一致之胺基酸序列；其中相對於在SEQ ID NO: 1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該AMP包含至少一個胺基酸取代；其中X 1為K、H、Q、T、S、N、E、I、L、或V；X 2為G、P、或A；X 3為G、或N；X 4為N或D；X 5為E、D、或N；X 6為S、D、G、T、V、或R；X 7為P或不存在；X 8為K、H、A、R、G、T、D、或不存在；X 9為G、V、或不存在；X 10為G、I、或不存在； (b)     將該載體引入宿主細胞中；及 (c)     在可操作來實現該AMP之表現及分泌至生長培養基中之條件下，使該宿主細胞在生長培養基中生長。
  16. 如請求項15之方法，其中該AMP包含如SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169中之任一者中所闡明之胺基序列、基本上由其組成、或由其組成。
  17. 如請求項15之方法，其中該AMP包含如SEQ ID NO：25、36、38、及40中之任一者中所闡明之胺基序列、基本上由其組成、或由其組成。
  18. 如請求項15之方法，其中該AMP為兩種或兩種以上AMP之均聚物或雜聚物，其中各AMP之胺基酸序列相同或不同。
  19. 如請求項18之方法，其中該AMP為包含藉由可裂解或不可裂解連接子來分隔之兩個或兩個以上AMP的融合蛋白，並且其中各AMP之胺基酸序列可相同或不同。
  20. 如請求項19之方法，其中該連接子為可裂解連接子。
  21. 如請求項20之方法，其中該連接子具有如SEQ ID NO：184-193中之任一者中所闡明之胺基酸序列。
  22. 如請求項21之方法，其中該連接子可在以下中之至少一者內部裂解：(i)昆蟲之腸道或血淋巴，及(ii)可在哺乳動物之腸道內部裂解。
  23. 如請求項15之方法，其中該載體為包含α-MF信號之質體。
  24. 如請求項15之方法，其中該宿主細胞為酵母菌株。
  25. 如請求項24之方法，其中該酵母菌株選自屬於酵母屬( Saccharomyces)、畢赤酵母屬( Pichia)、克魯維酵母屬( Kluyveromyces)、漢遜酵母屬( Hansenula)、耶氏酵母屬( Yarrowia)、或裂殖酵母屬( Schizosaccharomyces)的任何物種。
  26. 如請求項25之方法，其中該酵母菌株選自由乳酸克魯維酵母 (Kluyveromyces lactis)、馬克斯克魯維酵母 (Kluyveromyces marxianus)、釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、及巴斯德畢赤酵母 (Pichia pastoris)組成之群。
  27. 如請求項26之方法，其中該酵母菌株為乳酸克魯維酵母。
  28. 如請求項15之方法，其中該AMP分泌至該生長培養基中。
  29. 如請求項15之方法，其中AMP之表現提供以下產率：每公升酵母培養基至少70 mg/L、至少80 mg/L、至少90 mg/L、至少100 mg/L、至少110 mg/L、至少120 mg/L、至少130 mg/L、至少140 mg/L、至少150 mg/L、至少160 mg/L、至少170 mg/L、至少180 mg/L、至少190 mg/L、至少200 mg/L、至少500 mg/L、至少750 mg/L、至少1,000 mg/L、至少1,250 mg/L、至少1,500 mg/L、至少1,750 mg/L、至少2,000 mg/L、至少2,500 mg/L、至少3,000 mg/L、至少3,500 mg/L、至少4,000 mg/L、至少4,500 mg/L、至少5,000 mg/L、至少5,500 mg/L、至少6,000 mg/L、至少6,500 mg/L、至少7,000 mg/L、至少7,500 mg/L、至少8,000 mg/L、至少8,500 mg/L、至少9,000 mg/L、至少9,500 mg/L、至少10,000 mg/L、至少11,000 mg/L、至少12,000 mg/L、至少12,500 mg/L、至少13,000 mg/L、至少14,000 mg/L、至少15,000 mg/L、至少16,000 mg/L、至少17,000 mg/L、至少17,500 mg/L、至少18,000 mg/L、至少19,000 mg/L、至少20,000 mg/L、至少25,000 mg/L、至少30,000 mg/L、至少40,000 mg/L、至少50,000 mg/L、至少60,000 mg/L、至少70,000 mg/L、至少80,000 mg/L、至少90,000 mg/L、或至少100,000 mg/L之AMP。
  30. 如請求項15之方法，其中該培養基中之AMP之表現導致該培養基中之單一AMP之表現。
  31. 如請求項15之方法，其中該培養基中之AMP之表現導致該培養基中之包含兩種或兩種以上AMP多肽之AMP聚合物的表現。
  32. 如請求項15之方法，其中該載體包含兩個或三個表現匣，各表現匣可操作來編碼該第一表現匣之AMP。
  33. 如請求項15之方法，其中該載體包含兩個或三個表現匣，各表現匣可操作來編碼該第一表現匣之AMP，或不同表現匣之AMP。
  34. 如請求項32或33之方法，其中該表現匣可操作來編碼如SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169中之任一者中所闡明之AMP。
  35. 如請求項32或33之方法，其中該表現匣可操作來編碼如SEQ ID NO：25、36、38、及40中之任一者中所闡明之AMP。
  36. 一種保護植物以免受昆蟲影響之方法，該方法包括：提供表現AMP、或其編碼多核苷酸之植物。
  37. 如請求項36之方法，其中該AMP包含與根據式(I)：X 1-S-C-C-P-C-Y-W-X 2-X 3-C-P-W-G-Q-X 4-C-Y-P-X 5-G-C-X 6-G-X 7-X 8-X 9-X 10之胺基酸序列至少95%一致之胺基酸序列；其中相對於在SEQ ID NO: 1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該AMP包含至少一個胺基酸取代；其中X 1為K、H、Q、T、S、N、E、I、L、或V；X 2為G、P、或A；X 3為G、或N；X 4為N或D；X 5為E、D、或N；X 6為S、D、G、T、V、或R；X 7為P或不存在；X 8為K、H、A、R、G、T、D、或不存在；X 9為G、V、或不存在；X 10為G、I、或不存在。
  38. 如請求項37之方法，其中該AMP包含如SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169中之任一者中所闡明之胺基序列。
  39. 如請求項37之方法，其中該AMP包含如SEQ ID NO：25、36、38、及40中之任一者中所闡明之胺基序列。
  40. 如請求項37之方法，其中該AMP進一步包含兩種或兩種以上AMP之均聚物或雜聚物，其中各AMP之胺基酸序列相同或不同。
  41. 如請求項37之方法，其中該AMP為包含藉由可裂解或不可裂解連接子來分隔之兩個或兩個以上AMP的融合蛋白，並且其中各AMP之胺基酸序列可相同或不同。
  42. 如請求項41之方法，其中該連接子為可裂解連接子。
  43. 如請求項42之方法，其中該連接子具有如SEQ ID NO：184-193中之任一者中所闡明之胺基酸序列。
  44. 如請求項43之方法，其中該連接子可在以下中之至少一者內部裂解：(i)昆蟲之腸道或血淋巴，及(ii)可在哺乳動物之腸道內部裂解。
  45. 如請求項36之方法，其中該等昆蟲選自由以下組成之群：葡萄蔓天蛾 (Eumorpha achemon)；紋黃豆粉蝶 (Colias eurytheme)；乾果斑螟 (Caudra cautella)；白紋捲蛾( Amorbia humerosana)；白點黏蟲( Pseudaletia unipuncta)；洋薊羽蛾( Platyptilia carduidactyla)；大配片舟蛾 (Datana major)；頓袋蛾 (Thyridopteryx ephemeraeformis)；木豹蛾 (Hypercompe scribonia)；黃斑蕉弄蝶 (Erionota thrax)；西黑頭長翅捲蛾 (Acleris gloverana)；加州槲蛾( Phryganidia californica)；白斑春尺蠖 (Paleacrita merriccata)；櫻小食心蟲 (Grapholita packardi)；露尾萍螟 (Nymphula stagnata)；柑橘夜蛾 (Xylomyges curialis)；蘋果蠹蛾( Cydia pomonella)；蔓越莓果蟲( Acrobasis vaccinii)；橫條紋卷葉菜蟲( Evergestis rimosalis)；夜蛾 (Noctuid)物種，小地老虎 (Agrotis ipsilon)；黃杉合毒蛾 (Orgyia pseudotsugata)；木薯天蛾 (Erinnyis ello)；榆秋黃尺蛾 (Ennomos subsignaria)；鮮食葡萄小捲蛾 (Lobesia botrana)；無斑豹弄蝶 (Thymelicus lineola)；榛小捲蛾 (Melissopus latiferreanus)；薔薇黃捲蛾 (Archips rosanus)；果樹捲葉蛾( Archips argyrospilia)；葡萄捲葉蛾( Paralobesia viteana)；荷蘭石竹小捲蛾( Platynota stultana)；葡萄葉雕葉蟲( Harrisina americana)；苜蓿綠夜蛾 (Plathypena scabra)；粉色楓蛾( Dryocampa rubicunda)； Batrachedra comosae；舞毒蛾( Lymantria dispar)；鐵杉尺蠖 (Lambdina fiscellaria)；番茄天蛾( Manduca quinquemaculata)；菸草天蛾 (Manduca sexta)；菜粉蝶 (Pieris rapae)；巨斑刺蛾 (Automeris io)；賈克松色捲蛾( Choristoneura pinus)；蘋淡褐捲蛾( Epiphyas postvittana)；絹野螟( Diaphania hyalinata)；含羞草雕蛾( Homadaula anisocentra)；玫瑰色捲蛾 (Choristoneura rosaceana)；夾竹桃蛾( Syntomeida epilais)；雜食性捲葉蛾( Playnota stultana)；雜食尺蠖 (Sabulodes aegrotata)；美洲大芷鳳蝶 (Papilio cresphontes)；橘帶捲蛾( Argyrotaenia citrana)；梨小食心蟲( Grapholita molesta)；桃條麥蛾 (Anarsia lineatella)；美洲松粉蝶 (Neophasia menapia)；紅帶捲蛾( Argyrotaenia velutinana)；紅山背舟蛾 (Schizura concinna)；鞍背刺蛾( Sibine stimulea)；鞍斑美洲舟蛾 (Heterocampa guttivitta)；鹽澤燈蛾( Estigmene acrea)；草螟屬( Crambus)某些種；榆秋黃尺蛾；波林尺蠖 (Alsophila pometaria)；雲杉色捲蛾 (Choristoneura fumiferana)；枯葉蛾科( Lasiocampidae)某些種；菠蘿褐灰蝶 (Thecla basilides)；菸草粉斑螟 (Ephestia elutella)；蘋白小捲蛾 (Platynota idaeusalis)；桃條麥蛾 (Anarsia lineatella)；疆夜蛾 (Peridroma saucia)；雜色捲葉蛾( Platynota flavedana)；大豆夜蛾 (Anticarsia gemmatalis)；核桃配片舟蛾 (Datana integerrima)；美國白蛾 (Hyphantria cunea)；西部櫟柳毒蛾 (Orgyia vetusta)；南方玉米螟 (Southern Diatraea crambidoides)；甘薯小象蟲( Cylas formicarius)；胡椒花象甲 (Anthonomus eugenii)；蔗根非耳象 (Diaprepes abbreviatus)；草莓根耳象 (Otiorhynchus ovatus)；美核桃象 (Curculio caryae)；榛象甲 (Curculio occidentis)；稻根象 (Lissorhoptrus oryzophilus)；苜蓿葉象甲 (Hypera postica)；車軸草葉象蟲( Hypera zoilus)；小圓胸小蠹 (Euwallacea fornicatus)；甘蔗犀金龜 (Euetheola humilis)；咖啡果小蠹 (Hypothenemus hampei)；早熟禾象鼻蟲 (Listronotus maculicollis)；紫絨鰓角金龜 (Maladera castanea)；歐金龜 (Rhizotroqus majalis)；綠花金龜 (Cotinis nitida)；日本弧麗金龜 (Popillia japonica)；食葉鰓金龜屬( Phyllophaga)某些種；北方方頭甲 (Cyclocephala borealis)；東方異麗金龜 (Anomala orientalis)；淺黃方頭甲 (Cyclocephala lurida)；牧草長喙象 (Sphenophorus parvulus)；尖長喙象 (Sphenophorus apicalis)；南方玉米長喙象 (Sphenophorus cariosus)；不對稱長喙象 (Sphenophorus inaequalis)；微小長喙象 (Sphenophorus minimus)；埃及伊蚊 (Aedes aegypti)；玉米幹夜蛾 (Busseola fusca)；二化螟 (Chilo suppressalis)；尖音庫蚊 (Culex pipiens)；致倦庫蚊 (Culex quinquefasciatus)；玉米根葉甲 (Diabrotica virgifera)；小蔗桿草螟 (Diatraea saccharalis)；棉鈴蟲 (Helicoverpa armigera)；穀實夜蛾 (Helicoverpa zea)；菸芽夜蛾 (Heliothis virescens)；馬鈴薯葉甲 (Leptinotarsa decemlineata)；亞洲玉米螟 (Ostrinia furnacalis)；歐洲玉米螟 (Ostrinia nubilalis)；棉紅鈴蟲 (Pectinophora gossypiella)；印度穀螟 (Plodia interpunctella)；小菜蛾 (Plutella xylostella)；大豆尺夜蛾 (Pseudoplusia includens)；甜菜夜蛾 (Spodoptera exigua)；草地貪夜蛾 (Spodoptera frugiperda)；棉貪夜蛾 (Spodoptera littoralis)；粉紋夜蛾 (Trichoplusia ni)；及榆黃瑩葉甲 (Xanthogaleruca luteola)。
  46. 如請求項45之方法，其中該等昆蟲選自由以下組成之群：埃及伊蚊；玉米幹夜蛾；二化螟；尖音庫蚊；致倦庫蚊；玉米根葉甲；小蔗桿草螟；棉鈴蟲；穀實夜蛾；菸芽夜蛾；馬鈴薯葉甲；亞洲玉米螟；歐洲玉米螟；棉紅鈴蟲；印度穀螟；小菜蛾；大豆尺夜蛾；甜菜夜蛾；草地貪夜蛾；棉貪夜蛾；粉紋夜蛾；及榆黃瑩葉甲。
  47. 一種防治昆蟲之方法，其包括向該昆蟲提供在其基因組中包含穩定併入之表現匣的轉殖基因植物，其中該穩定併入之表現匣包含可操作來編碼AMP之多核苷酸。
  48. 一種抗擊、防治、或抑制害蟲之方法，其包括將殺害蟲有效量之如請求項1-8中任一項之Av3突變多肽(AMP)、如請求項9之組合或混合物、或如請求項10-11中任一項之組合物應用於該害蟲、害蟲之所在地、害蟲之食物供應、害蟲之棲息地、或害蟲之繁殖地；易受害蟲侵襲的植物、種子、植物部分、植物之所在地、或植物之環境；易受害蟲侵襲的動物、動物之所在地、或動物之環境；或其組合。
  49. 如請求項48之方法，其中該害蟲選自由以下組成之群：葡萄蔓天蛾；紋黃豆粉蝶；乾果斑螟；白紋捲蛾；白點黏蟲；洋薊羽蛾；大配片舟蛾；頓袋蛾；木豹蛾；黃斑蕉弄蝶；西黑頭長翅捲蛾；加州槲蛾；白斑春尺蠖；櫻小食心蟲；露尾萍螟；柑橘夜蛾；蘋果蠹蛾；蔓越莓果蟲；橫條紋卷葉菜蟲；夜蛾物種，小地老虎；黃杉合毒蛾；木薯天蛾；榆秋黃尺蛾；鮮食葡萄小捲蛾；無斑豹弄蝶；榛小捲蛾；薔薇黃捲蛾；果樹捲葉蛾；葡萄捲葉蛾；荷蘭石竹小捲蛾；葡萄葉雕葉蟲；苜蓿綠夜蛾；粉色楓蛾； Batrachedra comosae；舞毒蛾；鐵杉尺蠖；番茄天蛾；菸草天蛾；菜粉蝶；巨斑刺蛾；賈克松色捲蛾；蘋淡褐捲蛾；絹野螟；含羞草雕蛾；玫瑰色捲蛾；夾竹桃蛾；雜食性捲葉蛾；雜食尺蠖；美洲大芷鳳蝶；橘帶捲蛾；梨小食心蟲；桃條麥蛾；美洲松粉蝶；紅帶捲蛾；紅山背舟蛾；鞍背刺蛾；鞍斑美洲舟蛾；鹽澤燈蛾；草螟屬某些種；榆秋黃尺蛾；波林尺蠖；雲杉色捲蛾；枯葉蛾科某些種；菠蘿褐灰蝶；菸草粉斑螟；蘋白小捲蛾；桃條麥蛾；疆夜蛾；雜色捲葉蛾；大豆夜蛾；核桃配片舟蛾；美國白蛾；西部櫟柳毒蛾；南方玉米螟；甘薯小象蟲；胡椒花象甲；蔗根非耳象；草莓根耳象；美核桃象；榛象甲；稻根象；苜蓿葉象甲；車軸草葉象蟲；小圓胸小蠹；甘蔗犀金龜；咖啡果小蠹；早熟禾象鼻蟲；紫絨鰓角金龜；歐金龜；綠花金龜；日本弧麗金龜；食葉鰓金龜屬某些種；北方方頭甲；東方異麗金龜；淺黃方頭甲；牧草長喙象；尖長喙象；南方玉米長喙象；不對稱長喙象；微小長喙象；埃及伊蚊；玉米幹夜蛾；二化螟；尖音庫蚊；致倦庫蚊；玉米根葉甲；小蔗桿草螟；棉鈴蟲；穀實夜蛾；菸芽夜蛾；馬鈴薯葉甲；亞洲玉米螟；歐洲玉米螟；棉紅鈴蟲；印度穀螟；小菜蛾；大豆尺夜蛾；甜菜夜蛾；草地貪夜蛾；棉貪夜蛾；粉紋夜蛾；及榆黃瑩葉甲。
  50. 如請求項49之方法，其中該害蟲選自由以下組成之群：埃及伊蚊；玉米幹夜蛾；二化螟；尖音庫蚊；致倦庫蚊；玉米根葉甲；小蔗桿草螟；棉鈴蟲；穀實夜蛾；菸芽夜蛾；馬鈴薯葉甲；亞洲玉米螟；歐洲玉米螟；棉紅鈴蟲；印度穀螟；小菜蛾；大豆尺夜蛾；甜菜夜蛾；草地貪夜蛾；棉貪夜蛾；粉紋夜蛾；及榆黃瑩葉甲。
  51. 一種載體，其包含可操作來編碼AMP之多核苷酸，該AMP具有與SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169中之任一者中所闡明之胺基酸序列至少95%一致的胺基酸序列。
  52. 一種載體，其包含可操作來編碼AMP之多核苷酸，該AMP具有與SEQ ID NO：25、36、38、及40中之任一者中所闡明之胺基酸序列至少95%一致的胺基酸序列。
  53. 一種酵母菌株，其包含：包含可操作來編碼AMP之多核苷酸的第一表現匣，該AMP包含與根據式(I)：X 1-S-C-C-P-C-Y-W-X 2-X 3-C-P-W-G-Q-X 4-C-Y-P-X 5-G-C-X 6-G-X 7-X 8-X 9-X 10之胺基酸序列至少95%一致之胺基酸序列；其中相對於在SEQ ID NO: 1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該AMP包含至少一個胺基酸取代；其中X 1為K、H、Q、T、S、N、E、I、L、或V；X 2為G、P、或A；X 3為G、或N；X 4為N或D；X 5為E、D、或N；X 6為S、D、G、T、V、或R；X 7為P或不存在；X 8為K、H、A、R、G、T、D、或不存在；X 9為G、V、或不存在；X 10為G、I、或不存在；或其互補核苷酸序列。
  54. 如請求項53之酵母菌株，其中該AMP包含如SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169中之任一者中所闡明之胺基序列。
  55. 如請求項53之酵母菌株，其中該AMP包含如SEQ ID NO：25、36、38、及40中之任一者中所闡明之胺基序列。
  56. 如請求項53之酵母菌株，其中該酵母菌株選自屬於酵母屬、畢赤酵母屬、克魯維酵母屬、漢遜酵母屬、耶氏酵母屬、或裂殖酵母屬的任何物種。
  57. 如請求項56之酵母菌株，其中該酵母細胞選自由以下組成之群：乳酸克魯維酵母、馬克斯克魯維酵母 、釀酒酵母、及巴斯德畢赤酵母。
  58. 如請求項57之酵母菌株，其中該酵母細胞為乳酸克魯維酵母或馬克斯克魯維酵母。
  59. 一種具有針對一或多個昆蟲物種之殺昆蟲活性的Av3突變多肽(AMP)，該AMP包含與根據式(II)：K-S-C-C-P-C-Y-W-G-G-C-P-W-G-Q-X 1-C-Y-P-X 2-G-C-X 3-G-P-X 4-X 5-X 6之胺基酸序列至少95%一致之胺基酸序列；其中相對於在SEQ ID NO: 1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該AMP包含至少一個胺基酸取代；X 1為N或D；X 2為E、D、或N；X 3為S、D、R、或G；X 4為K、G、或D；X 5為V或不存在；X 6為G或不存在；或其農業上可接受之鹽。
  60. 如請求項59之AMP，其中該AMP包含如SEQ ID NO：20、24-26、35-36、38、及40中之任一者中所闡明之胺基序列、基本上由其組成、或由其組成，或其農業上可接受之鹽。
  61. 如請求項59之AMP，其中該AMP為兩種或兩種以上AMP之均聚物或雜聚物，其中各AMP之胺基酸序列相同或不同。
  62. 如請求項59之AMP，其中該AMP為包含藉由可裂解或不可裂解連接子來分隔之兩個或兩個以上AMP的融合蛋白，並且其中各AMP之胺基酸序列可相同或不同。
  63. 如請求項62之AMP，其中該連接子為可裂解連接子。
  64. 如請求項63之AMP，其中該連接子具有如SEQ ID NO：184-193中之任一者中所闡明之胺基酸序列。
  65. 如請求項64之AMP，其中該連接子可在以下中之至少一者內部裂解：(i)昆蟲之腸道或血淋巴，及(ii)可在哺乳動物之腸道內部裂解。
  66. 一種組合或混合物，其包含兩種或兩種以上如請求項59-65中任一項之AMP、基本上由其組成、或由其組成。
  67. 一種組成物，其包含一或多種如請求項59-65中任一項之AMP、基本上由其組成、或由其組成。
  68. 如請求項67之組合物，其進一步包含賦形劑。
  69. 一種具有針對一或多個昆蟲物種之殺昆蟲活性的Av3突變多肽(AMP)，該AMP包含與在SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169中之任一者中闡明之胺基酸序列至少95%一致之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成。
  70. 一種具有針對一或多個昆蟲物種之殺昆蟲活性的Av3突變多肽(AMP)，該AMP包含與在SEQ ID NO：20、24-26、35-36、38、及40中之任一者中闡明之胺基酸序列至少95%一致之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成。
  71. 一種具有針對一或多個昆蟲物種之殺昆蟲活性的Av3突變多肽(AMP)，該AMP包含與在SEQ ID NO：25、36、38、及40中之任一者中闡明之胺基酸序列至少95%一致之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成。
  72. 一種具有針對一或多個昆蟲物種之殺昆蟲活性的Av3突變多肽(AMP)，該AMP包含在SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169中之任一者中闡明之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成。
  73. 一種具有針對一或多個昆蟲物種之殺昆蟲活性的Av3突變多肽(AMP)，該AMP包含在SEQ ID NO：20、24-26、35-36、38、及40中之任一者中闡明之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成。
  74. 一種具有針對一或多個昆蟲物種之殺昆蟲活性的Av3突變多肽(AMP)，該AMP包含在SEQ ID NO：25、36、38、及40中之任一者中闡明之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成。
  75. 如請求項74之Av3突變多肽(AMP)，其中該AMP具有如SEQ ID NO: 25中所闡明之胺基酸。
  76. 如請求項74之Av3突變多肽(AMP)，其中該AMP具有如SEQ ID NO: 36中所闡明之胺基酸。
  77. 如請求項74之Av3突變多肽(AMP)，其中該AMP具有如SEQ ID NO: 38中所闡明之胺基酸。
  78. 如請求項74之Av3突變多肽(AMP)，其中該AMP具有如SEQ ID NO: 40中所闡明之胺基酸。
  79. 一種具有針對一或多個昆蟲物種之殺昆蟲活性的Av3突變多肽(AMP)，該AMP包含在SEQ ID NO：38中闡明之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成。
  80. 一種抗擊、防治、或抑制害蟲之方法，其包括將殺害蟲有效量之如請求項59-65、69-79中任一項之Av3突變多肽(AMP)、如請求項66之組合或混合物、或如請求項67-68中任一項之組合物應用於該害蟲、害蟲之所在地、害蟲之食物供應、害蟲之棲息地、或害蟲之繁殖地；易受害蟲侵襲的植物、種子、植物部分、植物之所在地、或植物之環境；易受害蟲侵襲的動物、動物之所在地、或動物之環境；或其組合。
  81. 如請求項80之方法，其中該害蟲選自由以下組成之群：葡萄蔓天蛾；紋黃豆粉蝶；乾果斑螟；白紋捲蛾；白點黏蟲；洋薊羽蛾；大配片舟蛾；頓袋蛾；木豹蛾；黃斑蕉弄蝶；西黑頭長翅捲蛾；加州槲蛾；白斑春尺蠖；櫻小食心蟲；露尾萍螟；柑橘夜蛾；蘋果蠹蛾；蔓越莓果蟲；橫條紋卷葉菜蟲；夜蛾物種，小地老虎；黃杉合毒蛾；木薯天蛾；榆秋黃尺蛾；鮮食葡萄小捲蛾；無斑豹弄蝶；榛小捲蛾；薔薇黃捲蛾；果樹捲葉蛾；葡萄捲葉蛾；荷蘭石竹小捲蛾；葡萄葉雕葉蟲；苜蓿綠夜蛾；粉色楓蛾； Batrachedra comosae；舞毒蛾；鐵杉尺蠖；番茄天蛾；菸草天蛾；菜粉蝶；巨斑刺蛾；賈克松色捲蛾；蘋淡褐捲蛾；絹野螟；含羞草雕蛾；玫瑰色捲蛾；夾竹桃蛾；雜食性捲葉蛾；雜食尺蠖；美洲大芷鳳蝶；橘帶捲蛾；梨小食心蟲；桃條麥蛾；美洲松粉蝶；紅帶捲蛾；紅山背舟蛾；鞍背刺蛾；鞍斑美洲舟蛾；鹽澤燈蛾；草螟屬某些種；榆秋黃尺蛾；波林尺蠖；雲杉色捲蛾；枯葉蛾科某些種；菠蘿褐灰蝶；菸草粉斑螟；蘋白小捲蛾；桃條麥蛾；疆夜蛾；雜色捲葉蛾；大豆夜蛾；核桃配片舟蛾；美國白蛾；西部櫟柳毒蛾；南方玉米螟；甘薯小象蟲；胡椒花象甲；蔗根非耳象；草莓根耳象；美核桃象；榛象甲；稻根象；苜蓿葉象甲；車軸草葉象蟲；小圓胸小蠹；甘蔗犀金龜；咖啡果小蠹；早熟禾象鼻蟲；紫絨鰓角金龜；歐金龜；綠花金龜；日本弧麗金龜；食葉鰓金龜屬某些種；北方方頭甲；東方異麗金龜；淺黃方頭甲；牧草長喙象；尖長喙象；南方玉米長喙象；不對稱長喙象；微小長喙象；埃及伊蚊；玉米幹夜蛾；二化螟；尖音庫蚊；致倦庫蚊；玉米根葉甲；小蔗桿草螟；棉鈴蟲；穀實夜蛾；菸芽夜蛾；馬鈴薯葉甲；亞洲玉米螟；歐洲玉米螟；棉紅鈴蟲；印度穀螟；小菜蛾；大豆尺夜蛾；甜菜夜蛾；草地貪夜蛾；棉貪夜蛾；粉紋夜蛾；及榆黃瑩葉甲。
  82. 如請求項81之方法，其中該害蟲選自由以下組成之群：埃及伊蚊；玉米幹夜蛾；二化螟；尖音庫蚊；致倦庫蚊；玉米根葉甲；小蔗桿草螟；棉鈴蟲；穀實夜蛾；菸芽夜蛾；馬鈴薯葉甲；亞洲玉米螟；歐洲玉米螟；棉紅鈴蟲；印度穀螟；小菜蛾；大豆尺夜蛾；甜菜夜蛾；草地貪夜蛾；棉貪夜蛾；粉紋夜蛾；及榆黃瑩葉甲。
  83. 一種可操作來在嚴格雜交條件下與編碼AMP之多核苷酸區段雜交的多核苷酸，該AMP包含與根據式(I)：X 1-S-C-C-P-C-Y-W-X 2-X 3-C-P-W-G-Q-X 4-C-Y-P-X 5-G-C-X 6-G-X 7-X 8-X 9-X 10之胺基酸序列至少95%、96%、97%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成；其中相對於在SEQ ID NO: 1中闡明之突變Av3胺基酸序列，該AMP包含至少一個胺基酸取代；其中X 1為K、H、Q、T、S、N、E、I、L、或V；X 2為G、P、或A；X 3為G、或N；X 4為N或D；X 5為E、D、或N；X 6為S、D、G、T、V、或R；X 7為P或不存在；X 8為K、H、A、R、G、T、D、或不存在；X 9為G、V、或不存在；X 10為G、I、或不存在；或其互補多核苷酸序列。
  84. 如請求項83之多核苷酸，其中該多核苷酸區段編碼AMP，該AMP包含如SEQ ID NO：6、20、24-26、28-36、38-42、48、54、58、60、62-63、69、108、116、119、及168-169中之任一者中所闡明之胺基序列、基本上由其組成、或由其組成。
  85. 如請求項83之多核苷酸，其中該多核苷酸區段編碼AMP，該AMP包含如SEQ ID NO：25、36、38、及40中之任一者中所闡明之胺基序列、基本上由其組成、或由其組成。
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