DE69635307T2

DE69635307T2 - Induzierte widerstandsfähigkeit gegen überempfindlichkeitsreaktionen bei pflanzen

Info

Publication number: DE69635307T2
Application number: DE69635307T
Authority: DE
Inventors: Zhong-Min Wei; V. Steven BEER
Original assignee: Cornell Research Foundation Inc
Current assignee: Cornell Research Foundation Inc
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-05
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2016-06-06
Also published as: NZ309611A; AU714512B2; PL323823A1; CN1131663C; AU5982196A; CA2223616A1; EP0871354A1; CA2223616C; US5776889A; PL182459B1; US5859324A; WO1996039802A1; EP0871354A4; JP3961023B2; ES2248810T3; KR100529261B1; BR9609073A; DE69635307D1; FI974430A0; MX9709781A

Description

Diese Erfindung wurde mit der Unterstützung der U.S.-Regierung unter der USDA NRI Competitive Research Grant Nr. 91-37303-6430 gemacht.
GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verleihung von induzierter Widerstandsfähigkeit gegen Überempfindlichkeitsreaktionen bei Pflanzen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Lebende Organismen haben eine vielschichtige Menge an biochemischen Wegen entwickelt, die sie in die Lage versetzen, Signale der Umwelt zu erkennen und darauf zu reagieren. Diese Wege schließen Rezeptororgane, Hormone, sekundäre Botenstoffe und enzymatische Modifikationen ein. Gegenwärtig ist wenig über die Signaltransduktionswege bekannt, die während der Reaktion einer Pflanze auf den Angriff durch Pathogene aktiviert werden, obwohl dieses Wissen für das Verständnis der Anfälligkeit für Krankheiten und der Resistenz gegenüber diesen von zentraler Bedeutung ist. Eine übliche Form der Pflanzenresistenz besteht in der Beschränkung der Pathogenproliferation auf einen kleinen Bereich, der die Infektionsstelle umgibt. In vielen Fällen geht diese Beschränkung mit dem örtlichen Absterben (d.h. Nekrose) von Geweben des Wirts einher. Die Beschränkung der Pathogene und das örtliche Absterben von Gewebe charakterisieren zusammen die Überempfindlichkeitsreaktion. Ergänzend zu lokalen Abwehrreaktionen reagieren viele Pflanzen auf Infektionen, indem sie Abwehrmechanismen in nicht infizierten Teilen der Pflanze aktivieren. Als Folge davon ist die gesamte Pflanze gegenüber einer sekundären Infektion resistenter. Diese systemisch erworbene Resistenz kann mehrere Wochen oder länger anhalten (R.E.F. Matthews, Plant Virology (Academic Press, New York, 2. Auflage; 1981)) und sie verleiht eine kreuzweise Resistenz gegenüber nicht verwandten Pathogenen (J. Kuc, in Innovative Approaches to Plant Disease Control, I. Chet. Hrsgb. (Wiley, New York, 1987), Seiten 255–274.
Die Äußerung der systemisch erworbenen Resistenz ist mit dem Versagen von normalerweise virulenten Pathogenen verknüpft, in das immunisierte Gewebe einzudringen (Kuc, J., „Induced Immunity to Plant Disease", Bioscience, 32: 854–856 (1982)). Die Begründung der systemisch erworbenen Resistenz steht in Wechselbeziehung mit systemischen Erhöhungen bei den Hydroxyprolinwerten der Zellwand und der Peroxidase-Aktivität (Smith, J. A., et al. „Comparative Study of Acidic Peroxidases Associated with Induced Resistance in Cucumber, Muskmelon and Watermelon," Physiol. Mol. Plant Pathol. 14: 329–338 (1988)) und mit der Äußerung einer Gruppe von neun Familien von so genannten systemisch erworbenen Resistenz-Genen (Ward, E. R., et. al., „Coordinate Gene Activity in Response to Agents that Induce Systemic Acquired Resistance," Plant Cell 3: 49–59 (1991)). Fünf dieser Abwehrgenfamilien kodieren mit der Pathogenese verbundene Proteine, deren physiologische Funktionen nicht begründet wurden. Einige dieser Proteine besitzen jedoch in vitro fungizide Aktivität (Bol, J. F., et al., „Plant Pathogenesis-Related Proteins Induced by Virus Infection," Ann. Rev. Phytopathol. 28: 113–38 (1990) und die konstitutive Äußerung eines Bohnen-Chitanase-Gens in transgenen Tabakpflanzen schützt vor Infektionen durch den Pilz Rhizoctonia solani (Broglie, K., et al., „Transgenic Plants with Enhanced Resistance to the Fungal Pathogen Rhizoctonia Solani," Science 254: 1194–1197 (1991)), wobei darauf hingewiesen wird, dass diese Proteine mit systemisch erworbener Resistenz zu dem immunisierten Status beitragen können (Uknes, S., et. al., „Acquired Resistance in Arabidopsis," Plant Cell 4: 645–656 (1992)).
Salizylsäure scheint eine Signalfunktion bei der Induktion von systemisch erworbener Resistenz zu spielen, da die endogenen Werte nach der Immunisierung ansteigen (Malamy, J., et. al., „Salicylic Acid: A Likely Endogenous Signal in the Resistance Response of Tobacco to Viral Infection," Science 250: 1002–1004 (1990)) und exogenes Salizylat induziert Gene mit systemisch erworbener Resistenz (Yalpani, N. et al., „Salicylic Acid is a Systemic Signal and an Inducer of Pathogenesis-Related Proteins in Virus-infected Tobacco," Plant Cell 3: 809–818 (1991)), und erworbene Resistenz (Uknes, S., et al., „Acquired Resistance in Arabidopsis," Plant Cell 4: 645–656 (1992)). Ferner entfalten transgene Tabakpflanzen, bei denen Salizylat durch die Wirkung eines bakteriellen Transgens zerstört wird, das Salizylat-Hydroxylase kodiert, keine systemisch erworbene Resistenz (Gaffney, T., et al., „Requirement of Salicylic Acid for the Induction of Systemic Acquired Resistance," Science 261: 754–296 (1993)). Dieser Effekt spiegelt jedoch eher die Inhibition einer lokalen Signalfunktion wider als die einer systemischen Signalfunktion, und eine detaillierte Analyse der Signalübertragung bei Gurken deutet darauf hin, dass Salizylat nicht wesentlich für die Fernsignalisierung sein kann (Rasmussen, J. B., et al., „Systemic Induction of Salicylic Acid Accumulation in Cucumber after Inoculation with Pseudomonas Syringae pv. Syringae," Plant Physiol. 97: 1342–1347) (1991)).
Die Immunisierung unter Verwendung von biotischen Wirkstoffen wurde eingehend untersucht. Grüne Bohnen wurden systematisch gegen die Krankheit immunisiert, die durch kultivar-pathogene Gattungen des Colletotrichum lindemuthianum hervorgerufen wird, durch die zeitlich vorhergehende Infektion mit kultivarnichtpathogenen Gattungen (Rahe, J. E., „Induced Resistance in Phaseolus Vulgaris to Bean Anthracnose," Phytopathology 59: 1641–5 (1969); Elliston, J., et al., „Induced Resistance to Anthracnose at a Distance from the Site of the Inducing Interaction," Phytopathology 61: 1110–12 (1971); Skipp, R., et al., „Studies on Cross Protection in the Anthracnose Disease of Bean," Physiological Plant Pathology 3: 299–313 (1973)), mit kultivar-pathogenen Gattungen, die durch Hitze im Gewebe des Wirts vor dem Auftreten der Symptome abgeschwächt werden (Rahe, J. E., et al., „Metabolic Nature of the Infection-Limiting Effect of Heat on Bean Anthracnose," Phytopathology 60: 1005–9 (1970)), oder mit Nichtpathogenen der Bohnenpflanze. Das Pathogen der Brennfleckenkrankheit der Gurke, Colletotrichum lagenarium, war als Induktionsmittel eines systemischen Schutzes gegenüber allen Gattungen der Brennfleckenkrankheit der Gurke genauso wirksam wie nichtpathogene Gattungen. Schutz wurde durch C. lagenarium induziert, in Kultivars, die gegen eine oder gegen mehrere Gattungen des C. lindemuthianum resistent sind, sowie in Kultivars, die anfällig für alle bekannten Gattungen des Pilzes sind, und auf die entsprechend als „fehlende genetische Resistenz" gegenüber dem Pathogen Bezug genommen wurde (Elliston, J., et al. „Protection of Bean Against Anthracnose by Colletotrichum Species Nonpathogenic on Bean," Phytopathologische Zeitschrift 86: 117–26 (1976): Elliston, J., et al., „A Comparative Study on the Development of Compatible, Incompatible and Induced Incompatible Interactions Between Colletotrichum Species and Phaseolus Vulgaris," Phytopathologische Zeitschrift 87: 289–303 (1976)). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die gleichen Mechanismen in Kultivaren induziert werden können, die als Gene „mit" Resistenz und als Gene „ohne" Resistenz bekannt sind (Elliston, J. et al., „Relation of Phytoalexin Accumulation to Local and Systemic Protection of Bean Against Anthracnose." Phytopathologische Zeitschrift 88: 114–30 (1977)). Ebenso ist es ersichtlich, dass es den Kultivaren, die gegenüber allen Gattungen des C. lindemuthianum anfällig sind, nicht an Genen für die Resistenzmechanismen gegen das Pathogen fehlt.
Kuc, J., et al., „Protection of Cucumber Against Collectotrichum Lagenarium by Colletotrichum Lagenarium." Physiological Plant Pathology 7: 195–9 (1975)) zeigte, dass Gurkenpflanzen systemisch gegen die Krankheit geschützt werden konnte, die von dem Colletotrichum lagenarium hervorgerufen wird, durch die zeitlich vorhergehende Inokulation der Cotyledone oder des ersten wirklichen Blattes mit dem gleichen Pilz. Daran anschließend wurden die Gurkenpflanzen systemisch gegen Pilz-, Bakterien- und Viren-Krankheiten geschützt, durch die vorher lokalisierte Infektion mit einem Pilz, einem Bakterium oder einem Virus (Hammerschmidt, R., et al., „Protection of Cucumbers Against Colletotrichum Lagenarium and Cladosporium Cucumerinum," Phytopathology 66: 790–3 (1976); Jenns, A. E., et al., „Localized Infection with Tobacco Necrosis Virus Protects Cucumber Against Colletotrichum Lagenarium," Physiological Plant Pathology 11: 207–12 (1977); Caruso, F. L., et al. „Induced Resistance of Cucumber to Anthracnose and Angular Leaf Spot by Pseudomonas Lachrymans und Colletotrichum Lagenarium," Physiological Plant Pathology 14: 191–201 (1979); Staub, T., et al., „Systemic Protection of Cucumber Plants Against Disease Caused by Cladosporium Cucumerinum und Colletotrichum Lagenarium by Prior Localized Infection with Either Fungus," Physiological Plant Pathology 17: 389–93 (1980); Bergstrom, G. C. et al., „Effects of Local Infection of Cucumber by Colletotrichum Lagenarium, Pseudomonas Lachrymans or Tobacco Necrosis Virus on Systemic Resistance to Cucumber Mosaic Virus," Phytopathology 72: 922–6 (1982); Gessler, C., et al. „Induction of Resistance to Fusarium Wilt in Cucumber by Root and Foliar Pathogens," Phytopathology 72: 1439–41 (1982); Basham, B., et al., „Tobacco Necrosis Virus Induces Systemic Resistance in Cucumbers Against Sphaerotheca Fuliginea," Physiological Plant Pathology 23: 137–44 (1983)).
Der nicht spezifische Schutz, der durch die Infektion mit C. lagenarium oder mit dem Tabak-Nekrose-Virus induziert wurde, war gegen mindestens 13 Pathogene wirksam, wobei obligatorische und fakultative parasitäre Pilze, lokale Läsionen und systemische Viren, Welkpilze und Bakterien eingeschlossen sind. In ähnlicher Weise wurde ein Schutz durch Wurzelpathogene induziert, und er war ebenso gegen Wurzelpathogene wirksam. Andere Kürbisgewächse, wobei die Wassermelone und die Moschusmelone eingeschlossen sind, wurden systemisch gegen C. lagenarium geschützt (Caruso; F. L., et al., „Protection of Watermelon and Muskmelon Against Colletotrichum Lagenarium by Colletotrichum Lagenarium," Phytopathology 67: 1285–9 (1977)).
Ebenso wurde ein systematischer Schutz in Tabakpflanzen gegen eine große Vielfalt an Krankheiten induziert (Kuc, J., et al., „Immunization for Disease Resistance in Tobacco," Recent Advances in Tobacco Science 9: 179–213 (1983)). Durch den Tabakmosaikvirus hervorgerufene nekrotische Läsionen erhöhen die Resistenz in den oberen Blättern gegenüber der Krankheit, die durch den Virus hervorgerufen wird (Ross, A. F., et al., Systemic Acquired Resistance Induced by Localized Virus Infections in Plants," Virology 14: 340–58 (1961), Ross, A. F., et al., „Systemic Effects of Local Lesion Formation," In: Viruses of Plants Seiten 127–50 (1966)). Phytophthora parasitica var. nicotianae, P. tabacina und Pseudomonas tabaci und die reduzierte Reproduktion der Blattlaus Mazus persicae (McIntyre, J. L., et al., „Induction of Localized and Systemic Protection Against Phytophthora Parasitica var. nicotianae by Tobacco Mosaic Virus Infection of Tobacco Hypersensitive to the Virus," Physiological Plant Pathology 15: 321–30 (1979); McIntyre, J. L., et al., „Effects of Localized infections of Nicotiana Tabacum by Tobacco Mosaic Virus on Systemic Resistance Against Diverse Pathogens and an Insect," Phytopathology 71: 297–301 (1981)). Die Infiltration von durch Hitze abgetöteten P. tabaci (Lovrekovich, L., et al., „Induced Reaction Against Wildfire Disease in Tobacco Leaves Treated with Heat-Killed Bacteria," Nature 205: 823–4 (1965)) und Pseudomonas solanacearum (Sequeira, L, et al., „Interaction of Bacteria and Host Cell Walls: Its Relation to Mechanisms of Induced Resistance," Physiological Plant Pathology 10: 43–50 (1977)) in Tabakblätter induzierte Resistenz gegen das gleiche Bakterium, das für die Infiltration benutzt wurde. Tabakpflanzen wurden ebenso durch den Nematoden Pratylenchus penetrans gegen P. parasitica var. nicotiana geschützt (McIntyre, J. L., et al. „Protection of Tobacco Against Phytophthora Parasitica Var. Nicotianae by Cultivar-Nonpathogenic Races, Cell-Free Sonicates and Pratylenchus Penetrans," Phytopathology 68: 235–9 (1978)).
Cruikschank, I.A.M., et al., „The Effect of Stem Infestation of Tobacco with Peronospora Tabacina Adam on Foliage Reaction to Blue Mould," Journal of the Australian Institute of Agricultural Science 26: 369–72 (1960) waren die ersten, die von der Immunisierung von Tabakblättern gegen Blauschimmel (d.h. P. tabacina) durch Injektion in den Pflanzenstiel mit dem Pilz berichteten, was ebenso Hemmungen in der Entwicklung und vorzeitiges Altern involvierte. Vor kurzem wurde entdeckt, dass die Injektion außerhalb des Xylems nicht nur Hemmungen im Wachstum verminderte, sondern auch das Wachstum und die Entwicklung förderte. Immunisierte Tabakpflanzen waren sowohl bei Experimenten im Gewächshaus als auch bei Experimenten im Freien ungefähr um 40% größer, hatte eine 40-prozentige Zunahme im Trockengewicht und eine 30-prozentige Zunahme im Frischgewicht, und vier- bis sechsmal mehr Blätter als die Kontrollpflanzen (Tuzun, S., et al., „The Effect of Stem injections with Peronospora Tabacina and Metalaxyl Treatment on Growth of Tobacco and Protection Against Blue Mould in the Field," Phytopathology 74: 804 (1984)). Diese Pflanzen blühten ungefähr zwei bis drei Wochen früher als die Kontrollpflanzen (Tuzun, S., et al., „Movement of a Factor in Tobacco Infected with Peronospora Tabacina Adam which Systemically Protects Against Blue Mould," Physiological Plant Pathology 26: 321–30 (1985)).
Der systemische Schutz verleiht keine absolute Immunität gegen Infektionen, aber er reduziert die Schwere der Krankheit und verzögert die Entwicklung der Symptome. Die Anzahl der Läsionen, die Größe der Läsion und die Ausdehnung der Sporenbildung der Pilzpathogene sind alle vermindert. Der erkrankte Bereich kann um mehr als 90% reduziert werden.
Wenn den Gurkenpflanzen drei bis sechs Wochen nach der Anfangsinokulation eine „Booster"-Inokulation gegeben wurde, dauerte die durch C. lagenarium induzierte Immunisierung während der Blütezeit und während der Fruchtzeit an (Kuc, J., et al., „Aspects of the Protection of Cucumber Against Colletotrichum Lagenarium by Colletotrichum Lagenarium." Phytopathology 67: 533–6 (1977)). Der Schutz konnte nicht induziert werden, nachdem die Pflanzen Früchte angesetzt hatten. die Tabakpflanzen wurden für die Wachstumsperiode durch Injektion in den Pflanzenstiel mit Sporangia von P. tabacina immunisiert. Zur Verhinderung der systemischen Entwicklung von Blauschimmel war diese Technik jedoch nur wirksam, wenn die Pflanzen mehr als 20 cm hoch waren.
Die Entfernung des Auslöserblattes von den immunisierten Gurkenpflanzen reduzierte nicht den Grad der Immunisierung der bereits vorhandenen entfalteten Blätter. Blätter, die anschließend von der Spitzenknospe zum Vorschein kamen, waren jedoch fortschreitend weniger geschützt als ihre Vorgänger (Dean, R. A., et al., „Induced Systemic Protection in Cucumber: Time of Production and Movement of the „Signal"," Phytopathology 76: 966–70 (1986)). Ähnliche Ergebnisse wurden berichtet von Ross, A. F., „Systemic Effects of Local Lesion Formation," In: Viruses of Plaats Seiten 127–50 (1966) mit Tabakpflanzen (örtliche Läsion Wirt), die gegen das Tabakmosaikvirus durch die zeitlich vorhergehende Infektion mit dem Tabakmosaikvirus immunisiert wurden. Im Gegensatz dazu waren neue Blätter, die von Ablegern zum Vorschein kamen, die von Tabakpflanzen exzidiert wurden, die durch die Injektion mit P. tabacina in den Pflanzenstiel immunisiert wurden, im hohen Maße geschützt (Tuzun, S., et al., „Transfer of Induced Resistance in Tobacco to Blue Mould (Peronospora Tabacina Adam.) Via Callus," Phytopathology 75: 1304 (1985)). Pflanzen, die über eine Gewebekultur von Blättern von immunisierten Pflanzen regeneriert wurden, zeigten eine signifikante Reduzierung bei dem Blauschimmel, verglichen mit Pflanzen, die von Blättern von nicht immunisierten Eltern regeneriert wurden. Junge Regeneranten wiesen nur eine reduzierte Sporenbildung auf. Beim Altern der Pflanzen waren sowohl die Entwicklung von Läsionen als auch die Sporenbildung reduziert. Andere Forscher kamen jedoch nicht zur gleichen Schlussfolgerung, obwohl von einer signifikanten Reduzierung bei der Sporenbildung bei einem Experiment berichtet wurde (Lucas, J. A., et al., „Nontransmissibility to Regenerants from Protected Tobacco Explants of Induced Resistance to Peronospora Hyoscyami," Phytopathology 75: 1222–5 (1985)).
Der Schutz der Gurke und der Wassermelone ist im Gewächshaus und im Freien wirksam (Caruso, F. L., et al., „Field Protection of Cucumber Against Colletotrichum Lagenarium by C. Lagenarium," Phytopathology 67: 1290–2 (1977)). Bei einem Experiment war der ganze Läsionsbereich von C. lagenarium auf der geschützten Gurkenpflanze um 2% geringer als bei ungeschützten Kontrollpflanzen. In ähnlicher Weise starben nur 1 von 66 der geschützten befallenen Pflanzen ab, wohingegen 47 von 69 der ungeschützten befallenen Wassermelonen abstarben. Bei extensiven Feldversuchen in Kentucky und in Puerto Rico war die Injektion von Sporangia des P. tabacina in den Stiel der Tabakpflanze bei der Kontrolle von Blauschimmel mindestens genauso wirksam wie das beste Fungizid Metalaxyl: Die Pflanzen waren zu 95–99% geschützt, basierend auf dem Nekrosebereich und dem Grad der Sporenbildung, was zu einer Erhöhung des Ertrages bei den behandelten Tabakpflanzen um 10–25% führte.
Die induzierte Widerstandsfähigkeit gegen Bakterien und Viren scheint als eine Unterdrückung der Krankheitssymptome oder der Pathogenmultiplizierung oder in beidem ausgedrückt zu werden (Caruso, F. L., et al., „Induced Resistance of Cucumber to Anthracnose and Angular Leaf Spot by Pseudomonas Lachrymans and Colletotrichum Lagenarium," Physiological Plant Pathology 14: 191–201 (1979); Doss, M., et al., „Systemic Acquired Resistance of Cucumber to Pseudomonas Lachrymans as Expressed in Suppression of Symptoms, but not in Multiplication of Bacteria," Acta Phytopathologia Academiae Scientiarum Hungaricae 16: (3–4), 269–72 (1981); Jenns, A. E., et al., „Non-Specific Resistance to Pathogens Induced Systemically by Local Infection of Cucumber with Tobacco Necrosis Virus, Colletotrichum Lagenarium or Pseudomonas Lachrymans," Phytopathologia Mediterranea 18: 129–34 (1979)).
Wie oben beschrieben umfasst die Forschung, die die systemisch erworbene Resistenz umfasst, die Infektion von Pflanzen mit infektiösen Pathogenen. Obwohl die Untersuchungen auf diesem Gebiet für das Verständnis nützlich sind, wie die systemisch erworbene Resistenz funktioniert, ist die Hervorrufung einer solchen Resistenz mit infektiösen Wirkstoffen kommerziell nicht brauchbar, weil der Kontakt mit Pflanzenpathogenen die Pflanzen schwächen oder abtöten kann. Die vorliegende Erfindung ist darauf gerichtet, diesen Mangel zu überwinden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verleihung von pathogener Resistenz an Pflanzen. Dieses Verfahren umfasst die Anwendung eines isolierten hyperempfindlichen reaktionsauslösenden Polypeptids, Proteins oder Bakteriums, die keine Krankheit auslösen und mit einem Gen transformiert sind, welches den hyperempfindlichen Auslöser der Reaktion bei einer Pflanze kodiert, unter Bedingungen, bei denen das Polypeptid oder das Protein die Zellen der Pflanze berührt.
Ebenso werden pathogenresistente Pflanzen mit Zellen gezeigt, die in Kontakt mit einem nicht infektiösen hyperempfindlichen reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein stehen.
Die vorliegende Erfindung kann eine Zusammensetzung zur Verleihung von pathogener Resistenz an Pflanzen umfassen. Die Zusammensetzung schließt ein nicht infektiöses hyperempfindliches reaktionsauslösendes Polypeptid oder Protein und einen Träger ein.
Die vorliegende Erfindung besitzt das Potenzial zur: Behandlung von Pflanzenkrankheiten, die vorher nicht zu behandeln waren; systemischen Behandlung von Krankheiten, die man aufgrund der Kosten nicht einzeln behandeln wollen würde; und zur Vermeidung der Benutzung von infektiösen Wirkstoffen zur Behandlung von Krankheiten. Die vorliegende Erfindung kann Resistenz verleihen, ohne die Verwendung von Wirkstoffen, die pathogen für die zu behandelnden Pflanzen sind oder für die Pflanzen, die sich in der Nähe von den behandelten Pflanzen befinden. Da die vorliegende Erfindung die Verwendung eines natürlichen Produkts umfasst, das vollständig biologisch abbaubar ist, wird die Umwelt nicht kontaminiert.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die genetische Anordnung des Gen-Clusters, welches das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein für Erwinia amylovora (d.h. hrpN). kodiert. Die obere Reihe zeigt die Restriktions-Enzym-Abbildung des Plasmid-Vektors pCPP430, wobei E = EcoRI, B = BamHI, und H = HindIII ist. Die Rechtecke stellen transkriptionale Einheiten dar, und die Pfeile unter den Rechtecken geben die Richtung der Transkription an. Der größere Pfeil gibt den Bereich an, der für die letzte Transkription des hyperempfindlichen reaktionsauslösenden Polypeptids oder Proteins erforderlich ist. pCPP430 hrpN ist das Derivat von pCPP430, bei dem hrpN durch die Insertion des Transposors TnStac mutiert ist.
2 ist eine Abbildung des Plasmid-Vektors pCPP9. Signifikante Leistungsmerkmale sind die Mobilisierungs-(mob)Stelle zur Konjugation; die Kohäsionsstelle von λ(cos); und die Region zur Partition (par) zur stabilen Vererbung des Plasmids. B, BamHI; E, EcorRI; H, HindIII; P, PstI; S, SalI; Sm, SmaI; oriV, Ursprung der Replikation; Sp^r, spectinomycine Resistenz; Sm^r, streptomycine Resistenz.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verleihung von pathogener Resistenz an Pflanzen. Dieses Verfahren umfasst die Anwendung eines isolierten hyperempfindlichen reaktionsauslösenden Polypeptids, Proteins oder Bakteriums, die keine Krankheit auslösen und mit einem Gen transformiert sind, welches den hyperempfindlichen Auslöser der Reaktion bei der gesamten Pflanze oder bei Teilen der Pflanze kodiert, unter Bedingungen, bei denen das Polypeptid oder das Protein die Zellen der Pflanze berührt.
Ebenso werden pathogenresistente Pflanzen mit Zellen gezeigt, die in Kontakt mit einem nicht infektiösen hyperempfindlichen reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein stehen.
Die vorliegende Erfindung kann eine Zusammensetzung zur Verleihung von pathogener Resistenz an Pflanzen umfassen. Die Zusammensetzung schließt ein nicht infektiöses hyperempfindliches reaktionsauslösendes Polypeptid oder Protein und einen Träger ein.
Die hyperempfindlichen reaktionsauslösenden Polypeptide oder Proteine, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können hyperempfindlichen reaktionsauslösenden Polypeptiden oder Proteinen entsprechen, die von einer Vielfalt von Pathogenen abstammen. Diese Polypeptide oder Proteine sind in der Lage, örtliche Nekrosen in dem Pflanzengewebe auszulösen, das mit dem Auslöser in Kontakt gekommen ist. Bevorzugte Pathogene schließen Erwinia amylovora, Erwinia chrysanthemi, Pseudomonas syringae, Pseudomonas solanacearum, Xanthomonas campestris oder Mischungen davon ein.
Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die hyperempfindlichen reaktionsauslösenden Polypeptide oder Proteine von ihren entsprechenden Organismen isoliert werden und auf die Pflanzen angewendet werden. Solche Isolationsverfahren sind wohl bekannt, wie beschrieben in Arlat, M., F. Van Gijsegem, J. C. Huet, J. C. Pemollet, und C. A. Boucher, „PopA1, a Protein which Induces a Hypersensitive-like Response in Specific Petunia Genotypes is Secreted via the Hrp Pathway of Pseudomonas solanacearum," EMBO J. 13: 543–553 (1994); He, S. Y., H. C. Huang, und A. Collmer, „Pseudomonas syringae pv. syringae Harpin_Pss: a Protein that is Secreted via the Hrp Pathway and Elicits the Hypersensitive Response in Plants," Cell 73: 1255–1266 (1993); und Wei, Z.-M., R. J. Laby, C. H. Zumoff, D. W. Bauer, S.-Y. He, A. Collmer, und S. V. Beer, „Harpin Elicitor of the Hypersensitive Response produced by the Plant Pathogen Erwinia amylovora," Science 257: 85–88 (1992). Sehen Sie auch die noch offene U.S. Patentanmeldung mit den laufenden Nummern 08/200,024 und 08/062,024. Vorzugsweise werden die hyperempfindlichen reaktionsauslösenden Polypeptide oder Proteine, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, rekombinant und gereinigt hergestellt, so wie unten beschrieben.
Bei anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein auf Pflanzen angewendet werden, indem Bakterien angewendet werden, die Gene enthalten, die das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein kodieren. Diese Bakterien müssen in der Lage sein, das Polypeptid oder das Protein zu sekretieren oder zu exportieren, so dass der Auslöser die Pflanzenzellen berühren kann. Bei diesen Ausführungsformen wird das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein durch das Bakterium in planta hergestellt oder just vor der Einführung des Bakteriums in die Pflanzen.
Bei einer Ausführungsform des Bakterienanwendungsmodus der vorliegenden Erfindung löst das Bakterium keine Krankheit aus, und es wurde mit Genen transformiert (z.B. rekombinant), die ein hyperempfindliches reaktionsauslösendes Polypeptid oder Protein kodieren. Zum Beispiel kann E. coli, das keine Überempfindlichkeitsreaktion bei Pflanzen auslöst, mit Genen transformiert werden, die ein hyperempfindliches reaktionsauslösendes Polypeptid oder Protein kodieren, und es kann dann auf die Pflanzen angewendet werden. Bakterienspezies (andere als E. coli) können ebenso bei dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein von Erwinia chrysanthemi besitzt eine Aminosäuresequenz, die der SEQ. ID. No. 1 entspricht, so wie sie im Folgenden dargestellt wird:
Das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein besitzt eine Molmasse von 34 kDa, ist hitzebeständig, besitzt einen Glycin-Gehalt von mehr als 16 und enthält im Wesentlichen kein Cystein. Das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein der Erwinia chrysanthemi wird durch ein DNA-Molekül kodiert, das eine Nukleotidsequenz besitzt, die der SEQ. ID. No. 2 entspricht, so wie sie im Folgenden dargestellt wird:
Das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein von Erwinia amylovora besitzt eine Aminosäuresequenz, die der SEQ. ID. No. 3 entspricht, so wie sie im Folgenden dargestellt wird:
Das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein besitzt eine Molmasse von ungefähr 37 kDa, es hat einen pl von ungefähr 4,3 und ist bei 100°C für mindestens 10 Minuten hitzebeständig. Dieses hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein besitzt im Wesentlichen kein Cystein. Das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein der Erwinia amylovora wird ausführlicher beschrieben in Wei, Z.-M., R. J. Laby, C. H. Zumoff, D. W. Bauer, S.-Y. He, A. Collmer, und S. V. Beer, „Harpin, Elicitor of the Hypersensitive Response Produced by the Plant Pathogen Erwinia amylovora," Science 257: 85–88 (1992). Das DNA-Molekül, das dieses Polypeptid oder Protein kodiert, besitzt eine Nukleotidsequenz, die der SEQ. ID. No. 4 entspricht, so wie sie im Folgenden dargestellt wird:
Das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein von Pseudomonas syringae besitzt eine Aminosäuresequenz, die der SEQ. ID. No. 5 entspricht, so wie sie im Folgenden dargestellt wird:
Das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein besitzt eine Molmasse von 34–35 kDa. Es ist reich an Glycin (ungefähr 13,5%) und es fehlt ihm Cystein und Tyrosin. Weitere Informationen über den hyperempfindlichen Auslöser von Pseudomonas syringae findet man in He, S. Y., H. C. Huang, und A. Collmer, „Pseudomonas syringae pv. syringae Harpin_Pss: a Protein that is Secreted via the Hrp Pathway and Elicits the Hypersensitive Response in Plants," Cell 73: 1255–1266 (1993). Das DNA-Molekül, das den hyperempfindlichen Auslöser von Pseudomonas syringae kodiert, besitzt eine Nukleotidsequenz, die der SEQ. ID. No. 6 entspricht, so wie sie im Folgenden dargestellt wird:
Das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein von Pseudomonas solanacearum besitzt eine Aminosäuresequenz, die der SEQ. ID. No. 7 entspricht, so wie sie im Folgenden dargestellt wird:
Es ist durch das DNA-Molekül kodiert, das eine Nukleotidsequenz besitzt, die der SEQ. ID. No. 8 entspricht, so wie sie im Folgenden dargestellt wird:
Weitere Informationen zu dem hyperempfindlichen reaktionsauslösenden Polypeptid oder Protein von Pseudomonas solanacearum sind aufgeführt in Arlat, M., F. Van Gijsegem, J. C. Huet, J. C. Pemollet, und C. A. Boucher, „PopA1, a Protein which Induces a Hypersensitive-like Response in Specific Petunia Genotypes is Secreted via the Hrp Pathway of Pseudomonas solanacearum," EMBO J. 13: 543–553 (1994).
Das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein von Xanthomonas campestris pv. Glycinen besitzt eine Aminosäuresequenz, die der SEQ. ID. No. 9 entspricht, so wie sie im Folgenden dargestellt wird:
Diese Sequenz ist eine Amino-Terminal-Sequenz, die 26 Residuen nur von dem hyperempfindlichen reaktionsauslösenden Polypeptid oder Protein der Xanthomonas campestris pv. Glycinen besitzt. Sie passt zu fimbrialen Untereinheit-Proteinen, die in anderen Tanthomouas campestris Pathovaren bestimmt sind.
Die obigen Auslöser sind exemplarisch. Andere Auslöser können identifiziert werden, indem Bakterien gezüchtet werden, die eine hyperempfindliche Reaktion auslösen, bei der Gene expressiert werden, die einen Auslöser kodieren. Zellfreie Präparate von Kulturüberschüssen können auf Auslöseraktivität (d.h. örtliche Nekrose) getestet werden, indem sie dazu verwendet werden, geeignetes Pflanzengewebe zu infiltrieren.
Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist es ebenso möglich, Fragmente der oben erwähnten hyperempfindlichen reaktionsauslösenden Polypeptide oder Proteine zu verwenden, als auch Fragmente von Gesamtlängen-Auslösern von anderen Pathogenen.
Geeignete Fragmente können auf verschiedene Art und Weise hergestellt werden. Bei der ersten werden Subklone von dem Gen; das ein bekanntes Auslöserprotein kodiert, durch eine herkömmliche molekulargenetische Manipulation durch Subklonierung von Genfragmenten hergestellt. Die Subklone werden dann in Bakterienzellen in vitro oder in vivo expressiert, um ein kleineres Protein oder Peptid hervorzubringen, das auf Auslöseraktivität gemäß dem unten beschriebenen Verfahren getestet werden kann.
Als eine Alternative können die Fragmente eines Auslöserproteins durch Digestion eines Gesamtlängen-Auslöserproteins mit proteolytischen Enzymen hergestellt werden, wie zum Beispiel Chymtrypsin oder Staphylococcus Proteinase A, oder Trypsin. Verschiedene proteolytische Enzyme sind dazu geeignet, Auslöserproteine an verschiedenen Stellen abzuspalten, die auf der Aminosäuresequenz des Auslöserproteins basieren. Einige der Fragmente, die aus der Proteolyse hervorgehen können aktive Auslöser der Resistenz sein.
Bei einem anderen Ansatz, der auf der Kenntnis der Primärstruktur des Proteins basiert, können Fragmente des Auslöserproteingens synthetisiert werden, indem die PCR-Technik angewendet wird, zusammen mit spezifischen Sätzen von Primären, die ausgewählt sind, um die besonderen Teile des Proteins zu repräsentieren. Dies würde dann in einen geeigneten Vektor geklont, zur Erhöhung und zur Expression eines gestutzten Peptids oder Proteins.
Varianten können zum Beispiel ebenso (oder alternativ) durch die Entfernung oder Hinzufügung von Aminosäuren modifiziert werden, die einen minimalen Einfluss auf die Eigenschaften, die sekundäre Struktur und die hydropathische Natur des Polypeptids haben. Zum Beispiel kann ein Polypeptid zu einer Signal-(oder Leader-)Sequenz an dem N-terminal Ende des Proteins konjugiert werden, das co-translational oder posttranslational den Transfer des Proteins leitet. Das Polypeptid kann ebenso mit einem Linker oder mit einer anderen Sequenz konjugiert werden, zur Erleichterung der Synthese, der Reinigung oder der Identifizierung des Polypeptids.
Das bei der vorliegenden Erfindung verwendete Protein oder Polypeptid wird vorzugsweise durch herkömmliche Techniken in gereinigter Form hergestellt (vorzugsweise bei ungefähr 80%, in bevorzugterer Weise bei 90%, rein). Typischerweise wird das bei der vorliegenden Erfindung verwendete Protein oder Polypeptid in das Wachstumsmedium von rekombinanter E. Coli. sekretiert. Zur Isolierung des Proteins wird die E. coli Wirtszelle, die ein rekombinantes Plasmid trägt, verbreitet und homogenisiert, und das Homogenat wird zentrifugiert, um bakterielle Anhäufungen zu entfernen. Der Überschuss wird dann einer sequenziellen Ammoniumsulfat-Präzipitation unterzogen. Die Fraktion, die das bei der vorliegenden Erfindung verwendetet Polypeptid oder Protein enthält, wird einer Gelfiltration in einer Dextran- oder Polyacrylamid-Kolonne in geeigneter Größe unterzogen, um die Proteine zu separieren. Falls erforderlich kann die Proteinfraktion noch weiter durch HPLC gereinigt werden.
Das DNA-Molekül, das das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein kodiert, kann in Zellen eingefügt werden, indem herkömmliche rekombinante DNA-Technologie verwendet wird. Im Allgemeinen schließt dies die Einführung des DNA-Moleküls in ein Expressionssystem ein, zu dem das DNA-Molekül heterolog ist (d.h. normalerweise nicht vorhanden). Das DNA-Molekül wird in der Orientierung zur richtigen Richtung und im korrekten Leserahmen in ein Expressionssystem oder in einen Vektor eingeführt. Der Vektor enthält die notwendigen Bestandteile. für die Transkription und für die Translation der eingeführten proteinkodierenden Sequenzen.
Das U.S. Patent Nr. 4,237,224 von Cohen und Boyer beschreibt die Herstellung von Expressionssystemen in der Form von rekombinanten Plasmiden, unter Verwendung der Abspaltung von Restriktionsenzymen und der Ligierung mit DNA-Ligase. Diese rekombinanten Plasmide werden dann in einzellige Kulturen, die auf Gewebekulturen gezüchtete prokaryontische und eukaryontische Zellen einschließen, mittels Transformation eingeführt und dort repliziert.
Rekombinante Gene können ebenso in Viren eingeführt werden, wie zum Beispiel Vaccinia Viren. Rekombinante Viren können durch Transektion von Plasmiden in mit dem Virus infizierte Zellen erzeugt werden.
Geeignete Vektoren schließen die folgenden Viralvektoren ein, sind aber nicht darauf beschränkt, wie zum Beispiel das Lambda-Vektorsystem gt11, gt WES.tB, Charon 4 und Plasmid-Vektoren, wie zum Beispiel pBR322, pBR325, pACYC177, pACYC184, pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pLG339, pR290, pKC37, PKC101, SV40, pBluescript II SK +/– oder KS +/– (siehe „Stratagene Cloning Systems" Catalog (1993) von Stratagene, La Jolla, Calif), pQE, pIH821, pGEX, pET-Serien (siehe F. W. Studier et. al., „Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes." Gene Expression Technology vol. 185 (1990)) und jedes Derivate davon. Rekombinante Moleküle können über Transformation, insbesondere Transduktion, Konjugation, Mobilisation oder Elektroporation in die Zellen eingeführt werden. Die DNA-Sequenzen werden in Vektoren geklont, indem Standard-Klonverfahren nach dem Stand der Technik verwendet werden, wie sie von Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Laboratory, Cold Springs Harbor, New York (1982) beschrieben werden.
Eine Vielzahl von Wirtsvektorsystemen kann verwendet werden, um die proteinkodierende Sequenz(en) zu expressieren. Zunächst muss das Vektorsystem mit der verwendeten Wirtszelle kompatibel sein. Wirtsvektorsysteme schließen das Folgende ein, sind aber nicht darauf beschränkt: mit Bakteriophag-DNA, Plasmid-DNA oder Cosmid-DNA transformierte Bakterien; Mikroorganismen wie zum Beispiel Hefe, die Hefevektoren enthalten; mit einem Virus infizierte (z.B. Vaccinia Virus, Adenovirus, usw.) Säugetierzellsysteme; mit einem Virus infizierte (z.B. Baculovirus) Insektenzellsysteme; und mit Bakterien infizierte Pflanzenzellen. Die Expressionsbestandteile variieren in ihrer Stärke und in ihren Spezifitäten. Abhängig von dem verwendeten Wirtsvektorsystem kann jede von einer Anzahl an geeigneten Transkriptions- und Translationsbestandteile verwendet werden.
Verschiedene genetische Signale und Verfahrensvorgänge steuern viele Ebenen der Genexpression (z.B. DNA-Transkription und Messenger RNA (mRNA) Translation).
Die Transkription von DNA ist abhängig von dem Vorhandensein eines Promotors, der eine DNA-Sequenz ist, die die Verbindung von RNA Polymerase leitet und auf diese Weise die mRNA-Synthese fördert. Die DNA-Sequenzen von eukaryontischen Promotoren weichen von denen von prokaryontischen Promotoren ab. Ferner können eukaryontische Promotoren und die sie begleitenden Signale in einem prokaryontischen System nicht erkannt werden oder können nicht darin funktionieren und ferner können prokaryontische Promotoren nicht in eukaryontischen Zellen erkannt werden und können nicht darin funktionieren.
In ähnlicher Weise hängt die Translation von mRNA in Prokaryonten von dem Vorhandensein von den eigenen prokaryontischen Signalen ab, die von denen der Eukaryonten abweichen. Die effiziente Translation von mRNA in Prokaryonten erfordert eine Ribosomverbindungsstelle, die Shine-Dalgarno („SD") Sequenz auf der mRNA genannt wird. Diese Sequenz ist eine kurze Nukleotidsequenz von mRNA, die sich vor dem Startcodon befindet, für gewöhnlich AUG, das das Amino-terminal-Methionin des Protein kodiert. Die SD-Sequenzen sind zu dem 3'-end der 16S rRNA (ribosomale RNA) ergänzend und fördern wahrscheinlich die Verbindung von mRNA mit Ribosomen durch die Duplexierung mit der rRNA, um die korrekte Positionierung des Ribosoms zu ermöglichen. Für einen Überblick zur Maximierung der Genexpression, siehe Roberts und Lauer, Methods in Enzymology, 68: 473 (1979).
Promotoren variieren hinsichtlich ihrer „Stärke" (d.h. hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die Transkription zu fördern). Zu dem Zweck der Expressierung von klonierten Genen ist es wünschenswert, starke Promotoren zu verwenden, um einen hohen Grad an Transkription und folglich an Expression des Gens zu erlangen. Abhängig von dem verwendeten Wirtszellensystem kann jeder von einer Anzahl an Promotoren verwendet werden. Zum Beispiel beim Klonen von E. coli, deren Bakteriophagen oder Plasmide, Promotoren wie zum Beispiel den T7-Phagen-Promotor, lac Promotor, trp Promotor, recA Promotor, ribosomale RNA Promotor, der P_R und P_L Promotor von Coliphag Lambda und andere, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: lacUV5, ompF, bla, lpp, und Ähnliche können verwendet werden, um hohe Grade an Transkription von angrenzenden DNA-Segmenten zu leiten. Ergänzend können ein Hybrid trp-lacUV5 (tac) Promotor oder andere E. coli Promotoren, die von rekombinanter DNA- oder anderen synthetischen DNA-Techniken produziert werden, angewendet werden, um die Transkription des eingefügten Gens zu besorgen.
Bakterielle Wirtszellensorten und Expressionsvektoren können ausgewählt werden, was die Wirkung des Promotors gehemmt wird, es sei denn, dass er spezifisch induziert wird. Bei gewissen Vorgängen ist für eine effiziente Transkription von eingefügter DNA die Zugabe von Induktionsmitteln erforderlich. So wird zum Beispiel das lac-Operon durch die Zugabe von Laktose oder von IPTG (isopropylthio-beta-D-galactosid) induziert. Eine Vielzahl von anderen Operons, wie zum Beispiel trp, pro, usw. liegen unter unterschiedlichen Steuerungen.
Ebenso sind für eine effiziente Gentranskription und Gentranslation in prokaryontischen Zellen spezifische Auslösesignale erforderlich. Diese Transkriptions- und Translations-Auslösesignale können in der „Stärke" variieren, so wie sie jeweils anhand der Menge an genspezifischer messenger RNA und an synthetisiertem Protein gemessen wird. Der DNA-Expressionsvektor, der einen Promotor enthält, kann auch jede Verbindung von verschiedenen „starken" Transkriptions- bzw. Translations-Auslösesignalen enthalten. Effiziente Translation in E. coli erfordert zum Beispiel eine Shine-Dalgarno (SD) Sequenz von ungefähr 7 bis 9 Basen 5' für das Auslösecodon (ATG), um deine Ribosomverbindungsstelle zu besorgen. Folglich kann jede SD-ATG-Verbindung, die von Wirtszellenribosomen verwendet werden kann, eingesetzt werden. Solche Verbindungen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf SD-ATG-Verbindungen von dem cro-Gen oder dem N-Gen von Coliphag-Lambda oder von dem E. coli Tryptophan E-, D-, C-, B- oder A-Genen. Ergänzend kann jede SD-ATG-Verbindung verwendet werden, die von rekombinanter DNA oder mit anderen Techniken, die die Einfügung von synthetischen Nukleotiden einschließen, hergestellt sind.
Nachdem das isolierte DNA-Molekül, das das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein kodiert, in ein Expressionssystem geklont wurde, ist es bereit, in eine Wirtszelle eingefügt zu werden. Diese Einfügung kann über verschiedene Formen der oben beschriebenen Transformation durchgeführt werden, abhängig von dem Vektor/Wirt-Zellensystem. Geeignete Wirtszellen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Bakterien, Viren, Hefe, Säugetierzellen, Insektenzellen, Pflanzenzellen und Ähnliches.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um eine große Vielzahl an Pflanzen zu behandeln, um pathogene Resistenz zu verleihen. Geeignete Pflanzen schließen zweikeimblättrige und einkeimblättrige Pflanzen ein. Ganz im Besonderen können Nutzpflanzen einschließen: Reis, Weizen, Gerste, Roggen, Baumwolle, Sonnenblume, Erdnuss, Getreide, Kartoffel, Süßkartoffel, Bohne, Erbse, Chicorée, Kopfsalat, Endiviensalat, Kohl, Blumenkohl, Broccoli, Rübe, Rettich/Radieschen, Spinat, Zwiebel, Knoblauch, Aubergine, Pfeffer, Sellerie, Karotte, Kürbis, Gartenkürbis, Zucchini, Gurke, Apfel, Birne, Melone, Erdbeere, Weintraube, Himbeere, Ananas, Sojabohne, Tabak, Tomate, Sorgum und Zuckerrohr. Beispiele für geeignete Zierpflanzen sind: Arabidopsis thaliana, Saintpaulia, Petunie, Pelargonie, Poinsettia, Chrysantheme, Nelke und Zinnie.
Das Verfahren, das Pflanzen Resistenz gegenüber Pathogenen verleiht, gemäß der Erfindung ist nützlich bei der Verleihung von Resistenz gegenüber einer Vielzahl von Pathogenen, wobei Viren, Bakterien und Pilze mit eingeschlossen sind.
Inter alia kann durch das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung Resistenz gegenüber den folgenden Viren erlangt werden: Tabakmosaikvirus und Tomatenmosaikvirus.
Ebenso kann inter alia durch das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung Resistenz gegenüber den folgenden Bakterien verliehen werden: Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syringae pv. tabaci und Xanthamonas campestris pv. pelargonii.
Pflanzen können durch die Verwendung des Verfahrens nach der vorliegenden Erfindung inter alia gegenüber den folgenden Pilzen resistent gemacht werden: Fusarium oxysporum und Phytophthora infestans.
Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung kann über eine Vielzahl von Prozeduren zur Anwendung des hyperempfindlichen reaktionsauslösenden Polypeptids oder Proteins auf die gesamte oder auf Teile der zu behandelnden Pflanze durchgeführt werden. Dies kann (muss aber nicht) die Infiltration des hyperempfindlichen reaktionsauslösenden Polypeptids oder Proteins in die Pflanze umfassen. Geeignete Anwendungsverfahren schließen Spritzen mit hohem und niedrigem Druck, Einspritzen und Blattabschabung zeitnah zu dem Zeitpunkt, zu dem die Auslöseranwendung stattfindet, ein. Andere geeignete Anwendungsverfahren kann sich ein Fachmann vorstellen, vorausgesetzt, dass sie in der Lage sind, den Kontakt zwischen dem hyperempfindlichen reaktionsauslösenden Polypeptid oder Protein und den Pflanzenzellen zu bewirken.
Das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein kann gemäß der vorliegenden Erfindung allein oder in einer Mischung mit anderen Stoffen auf Pflanzen angewendet werden.
Die vorliegende Erfindung kann eine Zusammensetzung, die Pflanzen Resistenz gegenüber Pathogenen verleiht, enthalten, die ein hyperempfindliches reaktionsauslösendes Polypeptid oder Protein auf einem Träger umfasst. Geeignete Träger schließen Wasser oder wässerige Lösungen ein. Bei dieser Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung mehr als 500 nM des hyperempfindlichen reaktionsauslösenden Polypeptids oder Proteins.
Auch wenn dies nicht erforderlich ist, kann die Zusammensetzung zusätzliche Additive enthalten, die Dünger, Insektizide, Fungizide und Mischungen davon einschließen. Geeignete Dünger schließen (NH₄)₂NO₃ ein. Ein Beispiel für ein geeignetes Insektizid ist Malathion. Nützliche Fungizide schließen Captan ein.
Andere geeignete Additive schließen Puffermittel, Netzmittel, Abreibmittel ein. Diese Stoffe können verwendet werden, um das Verfahren der vorliegenden Erifndung zu erleichtern.
BEISPIELE
Beispiel 1 – Harpin-induzierte Resistenz der Tomatenpflanze gegen die Südliche Bakterielle Welkekrankheit (Pseudomonas solanacearum)
Zwei Wochen alte Tomatensämlinge, gezüchtet auf 8 × 15 cm Flächen im Treibhaus, wurden wie folgt behandelt: 20 Pflanzen wurden für jede der sechs Behandlungen verwendet, die mit A bis F bezeichnet wurden und wie folgt beschrieben sind:

(A) Um die 100 μl eines 200 μg/ml unbehandelten Harpin-(d.h. hyperempfindliches reaktionsauslösendes Polypeptid oder Protein)Präparats (Z-M. Wei, „Harpin, Elicitor of the Hypersensitive Response Produced by the Plant Pathogen Erwinia amy lovoxa," Science 257: 85–88 (1992)) wurde in das unterste wirkliche Blatt jedes Sämlings infiltriert.
(B) Das gleiche wie bei (A) verwendete Harpin-Präparat wurde mit 400-Maschen Carborundum auf die Blattoberfläche der Sämlinge gesprüht und dann mit dem Daumen leicht eingerieben.
(C) E. coli DHS(pCPP430)(Siehe 1 für Abbildung des Plasmidvektors pCPP430) wurde in einem LB-Medium zu OD₆₂₀ = 0,7 gezüchtet. Die Kultur wurde zentrifugiert und dann in 5 mM eines Kaliumphosphatpuffers pH 6,5 resuspensiert. Ungefähr 100 μl der Zellsuspension wurden in jedes Blatt der Sämlinge infiltriert.
(D) E. coli DH5(pCPP430::hrpN^–)(Siehe 1 für Abbildung des Plasmidvektors pCPP430::hrpN^–) wurde so wie bei (C) verwendet. Die Zellen wurden gezüchtet und die Suspension und die Menge des verwendeten Inokulums waren die gleichen wie die unter (C) beschriebenen.
(E) Für E. coli DH5(pCPP9)(Siehe 2), die Zellen wurden gezüchtet und die Suspension und die Menge des verwendeten Inokulums waren die gleichen wie die unter (C) beschriebenen.
(F) Die Infiltration von Blättern mit 5 mM Kaliumphosphatpuffer war wie unter (C) beschrieben.

Das pathogene Bakterium zur Untersuchung Pseudomonas solanacearum Sorte K60 wurde in dem King's Medium B zu OD₆₂₀ = 0,7 (ungefähr 10⁸ cfu/ml) gezüchtet. Die Kultur wurde zentrifugiert und in 100 Volumen von 5 mM eines Kaliumphosphatpuffers zu einer endgültigen Konzentration von ungefähr 1 × 10⁶ cfu/ml resuspensiert.
Drei Tage nachdem die Tomatensämlinge mit Harpin oder Bakterien behandelt wurden, wurden sie hochgezogen und ungefähr ein cm der Wurzeln wurden mit einer Schere abgeschnitten. Die Sämlinge wurden dann für 3 Minuten in eine Suspension von P. solanacearum K60 eingetaucht. Die inokulierten Pflanzen wurden wieder in dieselben Töpfe gepflanzt. Die Pflanzen wurden in dem Treibhaus belassen und die Krankheitsvorfälle wurden 7 Tage nach der Inokulation aufgezeichnet.
A. Wirkung der Behandlung mit Harpin
Nach 24 Stunden waren nur die Blattteile kollabiert, die mit Harpin oder mit E. coli DHS(pCPP430) infiltriert worden waren. Die mit Harpin und Carborundum bespritzten Blätter wiesen nur fleckige Nekrose auf.
B. Wirkung der Behandlung mit Harpin auf die Entwicklung der Südlichen Bakteriellen Welke.
Keine der 20 mit Harpin infiltrierten Pflanzen zeigte nach einer Woche nach der Inokulation mit P. solanacearum K60 (Tabelle 1) irgendwelche Symptome auf. Jedoch zeigten 7 der 20 mit Puffer infiltrierten Pflanzen Symptome der Verkümmerung auf. Die Behandlung mit E. coli DH5(pCPP430') (ein über ein Transposon induzierter Mutant, der unfähig ist, den hyperempfindlichen Kollaps auszulösen) oder mit E. coli DH5(pCPP9) zeigte keine signifikanten Unterschiede verglichen mit den mit Puffer behandelten Pflanzen auf.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die durch Harpin oder durch E. coli DH5(pCPP430), die Harpin produziert, in den Tomatenpflanzen induzierte Resistenz gegen die südliche bakterielle Welkekrankheit durch P. solanacearum K60 verursacht wird.
Tabelle 1.
Vier Wochen nach der Inokulation waren die mit Harpin oder mit E. coli DH5(pCPP430) behandelten Pflanzen großer und ausgebildeter als die mit Puffer behandelten Pflanzen. Die durchschnittlichen Höhen von 10 Pflanzen, die mit Harpin oder Puffer infiltriert wurden, sind in der Tabelle 2 wiedergegeben.
Tabelle 2.
Beispiel 2 – Harpin-induzierte Resistenz der Tomatenpflanze gegen die Südliche Bakterielle Welkekrankheit Pseudomonas solanacearum
Alle zur Infiltration und Inokulation verwendeten Verfahren waren die gleichen wie die in Beispiel 1 beschriebenen, außer dass die Konzentration von Pseudomonas solanacearum K60 ungefähr 5 × 10⁴ cfu/ml betrug.
Die mit Puffer infiltrierten Pflanzen zeigten 15 Tage nach der Inokulation mit Pseudomonas solanacearum K60 Symptome auf. Sechs von 20 Pflanzen zeigten nach 15 Tagen Symptome der Verkümmerung auf; 2 Pflanzen waren nach 21 Tagen verwelkt. Die verwelkten Pflanzen starben schließlich ab. Von den 20 mit Harpin behandelten Pflanzen zeigte jedoch keine Symptome der Verkümmerung auf. Drei Wochen nach Inokulation zeigten 3 der 20 mit Harpin behandelten Pflanzen Symptome der Verkümmerung auf. Es ist möglich, dass die Pflanzen nach drei Wochen ihre induzierte Resistenz verloren haben können. Wie bei dem ersten Experiment waren der Umfang und die Höhe der mit Harpin behandelten Pflanzen größer als die der mit Puffer behandelten Pflanzen.
Beispiel 3 – Harpin-induzierte Resistenz der Tomatenpflanze gegen die Südliche Bakterielle Welkekrankheit Pseudomonas solanacearum
Dieses Experiment war dem des Beispiel 1 ähnlich, außer dass den Töpfen, die die behandelten Tomatenpflanzen enthielten, ein zusätzliches Inokulum von Pseudomonas solanacearum K60 hinzugefügt wurde.
Den zwei Wochen alten Tomatensämlingen wurde Harpin infiltrert. Zwei Felder von jeder Pflanze wurden mit ungefähr 200 μl in 5 mM eines Kaliumphosphatpuffers bei einer Konzentration von ungefähr 200 μg/ml suspensierten Harpin infiltriert. Insgesamt wurden 20 Tomatensämlinge infiltriert. Die gleiche Anzahl an Tomatensämlingen wurde mit Puffer infiltriert. Nach zwei Tagen wurden die Pflanzen durch Eintauchen der Wurzeln mit Pseudomonas solanacearum K60 inokuliert. Die mit Harpin oder Puffer infiltrierten Pflanzen wurden aus der Bodenmischung herausgezogen und geringe Mengen der Wurzeln wurden mit einer Schere abgeschnitten und die verbleibenden Wurzeln wurden für drei Minuten in eine Suspension aus P. solanacearum K60 getaucht. Die Konzentration der bakteriellen Zellsuspension lag bei ungefähr 5 × 10⁸ cfu/ml. Die Sämlinge wurden in dieselben Töpfe zurückgepflanzt. Zusätzliche 3 ml der bakteriellen Suspension wurden dem Boden jedes einzelnen Topfs mit einem Durchmesser von 10 cm hinzugefügt. Nach einer Woche wurden die Krankheitsvorfälle gezählt. Alle Experimente wurden im Treibhaus mit beschränkter Temperatursteuerung durchgeführt.
Nach drei Wochen waren 11 der 20 mit Puffer infiltrierten Tomatenpflanzen abgestorben und 2 verwelkte Pflanzen hatten sich wieder erholt, blieben aber schwer verkümmert. Nur 4 Pflanzen wuchsen im Vergleich zu nicht inokulierten Tomatenpflanzen normal. Drei Wochen nach der Inokulation stellten sich jedoch 15 der mit Harpin behandelten Pflanzen als gesund heraus; drei Pflanzen waren verkümmert und zwei Pflanzen waren verwelkt. Diese Ergebnisse werden in der unten stehenden Tabelle 3 zusammengefasst.
Tabelle 3.
Beispiel 4 – Harpin-induzierte Resistenz der Tabakpflanze gegen das Tabakmosaikvirus
Ein Feld eines unteren Blattes von vier Wochen alten Tabaksämlingen (Kultivar, Xanthi mit N-Gen) wurden mit E. amylovora Harpin bei der Konzentration von 200 μg/ml infiltriert. Nach drei Tagen wurden die Pflanzen mit dem Tabakmosaikvirus („TMV") getestet. Zwei Konzentrationen des Virus (5 μg und 100 μg/ml) wurden verwendet. Ungefähr 50 μl der Virussuspension wurden auf ein oberes Tabakblatt aufgebracht. Das Blatt wurde mit 400-Maschen Carborundum bestäubt und die Blätter wurden leicht eingerieben. Jede Konzentration wurde auf diesen Pflanzen getestet. Vier Tage nach der Inokulation und an zwei nachfolgenden Tagen wurden nekrotische Läsionen gezählt und der Mittelwert auf drei Blättern wird mitgeteilt (Tabelle 4). Am 10. Tag war es schwierig, die einzelnen Läsionen zu unterscheiden, weil einige der nekrotischen Läsionen miteinander verschmolzen waren. Daher erschien die Anzahl der gezählten Läsionen weniger als die Anzahl der am 7. Tag gezählten Läsionen. Die Größe der mit Buffer behandelten Blätter war viel größer als die der mit Harpin behandelten Blätter.
Tabelle 4.
Es gab keinen signifikanten Unterschied hinsichtlich der Anzahl von örtlichen Läsionen, die sich auf den mit Harpin oder mit Buffer behandelten Tabakpflanzen entwickelten, wenn die Tabakmosaikvirus-Inokulum-Konzentration 100 μg/ml betrug.
Beispiel 5 – Harpin-induzierte Resistenz der Tomatenpflanze gegen die Fusarium-Welkekrankheit
Sechs Wochen alte Tomatenpflanzen wurden so wie in Beispiel 3 beschrieben mit Harpin behandelt. Das Pilzpathogen Fusarium oxysporum wurde für 5 Tage bei 27°C auf einem Lima-Bohnen-Agar-Medium gezüchtet. Zwei ganze Agar-Platten mit Mycelia wurden für 2 Minuten in 20 ml von 5 mM Kaliumphosphatpuffer vermischt. Die Wurzeln der mit Harpin oder mit Puffer behandelten Tomatenpflanzen wurden durch das Hineinstoßen mit einem Holzpfahl in den Boden der Töpfe verwundet. Dann wurde die Pilzsuspension auf den Boden jedes 10-cm-Topfes ausgegossen. Die inokulierten Pflanzen verblieben bei 24°C mit 16 Stunden Tageslicht in einer geregelten Klimakammer. 7 Tage nach der Inokulation wurden die Krankheitsvorfälle gezählt. Jede Behandlung wurde auf 10 Pflanzen angewendet. Die Ergebnisse werden in der unten stehenden Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5.
Beispiel 6 – Harpin-induzierte Resistenz der Tabakpflanze gegen die Wildfeuerkrankheit (Pseudomonas syringae pv. tabaci).
Harpin wurde in einzelne Felder der unteren Blätter von vier Wochen alten Tabakpflanzen (20 cm hoch) infiltriert. Nach drei Tagen wurden Suspensionen von Pseudomonas syringae pv. tabaci in einzelne Felder der unteren Blätter infiltriert. Vier Tage später wurden die Krankheitsvorfälle gezählt, so wie in Tabelle 6 dargestellt.
Tabelle 6.
Beispiel 7 – Harpin-induzierte Resistenz der Geranienpflanze (Pelargonium hortorum) gegen die Bakterielle Schwarzblättrigkeit (Xanthamonas campestris pv. pelargonii)
Dieses Experiment wurde mit Ablegern mit Wurzeln von der in einzelnen 10-cm- oder 15-cm-Töpfen in einer künstlichen Bodenmischung in einem Treibhaus gezüchteten Geranie gemacht. Zwei untere Blätter jeder Pflanze wurden entweder mit 0,05 M Kaliumphosphatpuffer pH 6,5 (Kontrolle) oder mit Harpin oder mit einer Suspension von Escherichia coli DH5(pCPP430)(der gesamte geklonte hrp Gen-Cluster von E. amylovora) infiltriert. Zwei bis sieben auf die Infiltration folgenden Tage wurden alle Pflanzen mit einer reinen Kultur des bakteriellen Pathogens der Schwarzblättrigkeit, Xanthamonas campestris pv. pelargonii, inokuliert. Eine Suspension von Bakterien (5 × 10⁶ cfu/ml) wurde bei niedrigem Druck sowohl über die oberen als auch über die unteren Blattoberflächen der Pflanzen atomisiert. Jede Behandlung wurde auf zwei Pflanzen angewendet (in der Tabelle 7 mit „A" und „B" bezeichnet). Die Pflanzen wurden für 48 Stunden mit einer von einer Kühl-Nebel-Nebelmaschine zugeführten supplementären Benebelung in einer geschlossenen Kammer gehalten. Dann wurden die Pflanzen für 10 Tage, der Raumfeuchtigkeit und einer Temperatur von zwischen 23°C bis 32°C ausgesetzt, auf einer Treibhausbank gehalten, bevor die Krankheitsentwicklung bewertet wurde. Tabelle 7.

* Die Zahlen in der Tabelle geben die Anzahl der Blätter wieder, die Krankheitssymptome aufweisen (ausgedrückt in Nekrose, Chlorose oder Welke) 10 Tage auf die Inokulation folgend

Beispiel 8 – Wirksamkeit von verschiedenen Harpins bei der Induzierung von Resistenz gegen die Wildfeuerkrankheit, die von Pseudomonas syringae pv. tabaci verursacht wird
Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum var. Xanthi) wurden im Treibhaus gezüchtet. Im Alter von 4 Wochen wurden Harpin-Präparate in ein einzelnes Feld von zwei unteren Blättern jeder Pflanze infiltriert. Zwölf Pflanzen wurden mit jedem Harpin-Präparat behandelt und drei wurden mit dem gleichen Kaliumphosphatpuffer behandelt, das auch zur Präparierung der Harpine benutzt wurde. Die hyperempfindliche Nekrose entwickelte sich in den Feldern der mit Harpin-Präparaten infiltrierten Blätter innerhalb von 24 Stunden, aber nicht in denen mit Puffer infiltrierten Blättern.
7, 10, 11 und 12 Tage nach der Harpin-Behandlung wurden alle Pflanzen mit Suspensionen von 10⁴ bis 10⁶ Zellen/ml von Pseudomonas syringae pv. tabaci durch die Infiltrierung von Feldern auf den oberen Blättern inokuliert. Die Pflanzen wurden für 7 Tage im Treibhaus inkubiert, bevor die Krankheitsentwicklung evaluiert wurde. Die Ergebnisse sind wie in Tabelle 8 folgt tabellarisch angeordnet.
Tabelle 8.
Die Ergebnisse indizieren, dass die Harpin-Präparate von den drei Bakterien hinsichtlich der Induzierung von Resistenz gegenüber dem Pathogen der Wildfeuerkrankheit wirksam sind. Die mit jedem Harpin behandelten Pflanzen zeigten keine Symptome mit den verwendeten zwei unteren Inokulum-Konzentrationen. Bei der höheren Konzentration waren die Symptome bei den mit Buffer behandelten Pflanzen schwerer als bei den mit Harpin behandelten Pflanzen.
Beispiel 9 – Harpin-induzierte Resistenz gegen die Mehltaukrankheit, die von Phytophthora infestans verursacht wird.
Das Pathogen des Mehltaus befällt in erster Linie Kartoffel- und Tomatenpflanzen. Es war für die berüchtigte Irische Kartoffelknappheit verantwortlich. Die Wirksamkeit von Harpin hinsichtlich der Induzierung von Resistenz gegenüber diesem Pathogen wurde an im Traubhaus gezüchteten Tomatensämlingen getestet. Drei Wochen alte Sämlinge (Kultivar „Mama Mia", ungefähr 6 bis 8 Inches hoch) wurden mit Harpin behandelt und anschließend mit Phythophthora infestans inokuliert. Zwei Felder eines unteren Blattes jeder Pflanze wurden mit einer Harpin-Lösung infiltriert, eine Lösung aus Escherichia coli DH5(pCPP430), die Harpin oder Kaliumphosphatpuffer produziert und sekretiert.
Zwei, drei oder vier Tage nach der Infiltration wurden die Pflanzen mit einer mycelialen Lösung von Phytophthora infestans inokuliert. Die Sorte U.S. 7 wurde verwendet, die gegenüber Tomatenpflanzen hoch virulent ist. Die myceliale Lösung wurde durch die leichte Vermischung der Inhalte von zwei Gerstenmehl-Agar-Platten hergestellt, auf und in denen der Pilz 2 Wochen lang bei 21°C gezüchtet wurde. Die Lösung wurde auf die Ober- und die Unterseite eines Blattes pro behandelter Pflanze mit einem breiten Künstlermalerpinsel aufgebracht.
Die behandelten und inokulierten Pflanzen wurden in einer speziell konstruierten Nebelkammer, die dazu ausgelegt ist, um im Treibhaus eine Temperatur von 20–23°C aufrechtzuerhalten, inkubiert, während eine hohe relative Luftfeuchtigkeit aufrechterhalten wurde. Die Feuchtigkeit wurde von mehreren bei maximaler Leistung auf der Basis von gereinigtem Wasser arbeitenden Kühl-Nebel-Nebelmaschine besorgt. Die Krankheitsvorfälle wurden 13 Tage nach der Inokulation mit Phytophthora infestans evaluiert, und die Ergebnisse sind in der Tabelle 9 tabellarisch angeordnet. Jede Behandlung wurde auf für einzelne Pflanzen angewendet.
Tabelle 9.
Die Behandlung mit Harpin reduzierte die Anzahl der Läsionen, die sich auf den Pflanzen bei allen Intervallen zwischen Behandlung und Inokulation entwickelten. Die Anzahl der Mehltau-Läsionen, die sich entwickelten, wurden ebenso durch die vorherige Behandlung mit DH5(pCPP430), das Harpin produziert und sekretiert, reduziert.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein Verfahren, das Pflanzen Resistenz gegenüber Pathogenen verleiht, welches umfasst: Anwendung an der Pflanze entweder eines/r isolierten hyperempfindlichen reaktionsauslösenden Polypeptids, Proteins oder Bakteriums, die keine Krankheit auslösen und mit einem Gen transformiert sind, welches das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein kodiert, wobei diese Anwendung unter Bedingungen durchgeführt wird, bei denen das Polypeptid oder das Protein die Zellen der Pflanze berührt.
Ein Verfahren nach Anspruch 1, wobei das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein demjenigen entspricht, das von einen Pathogen stammt, das aus der Gruppe ausgewählt wurde, bestehend aus: Erwinia amylovora, Erwinia chrysanthemi, Pseudomonas syringae, Pseudomonas solanacearum, Xanthomonas campestris und Mischungen davon.
Ein Verfahren nach Anspruch 2, wobei das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein demjenigen entspricht, das von Erwinia chrysanthemi stammt.
Ein Verfahren nach Anspruch 3, wobei das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein eine Aminosäuresequenz besitzt, die SEQ. ID Nr. 1 entspricht.
Ein Verfahren nach Anspruch 3, wobei das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein eine Molmasse von 34 kDa besitzt.
Ein Verfahren nach Anspruch 2, wobei das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein demjenigen entspricht, das von Erwinia amylovora stammt.
Ein Verfahren nach Anspruch 6, wobei das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein eine Aminosäuresequenz besitzt, die SEQ. ID Nr. 3 entspricht.
Ein Verfahren nach Anspruch 6, wobei das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein eine Molmasse von 37 kDa besitzt.
Ein Verfahren nach Anspruch 2, wobei das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein demjenigen entspricht, das von Pseudomonas syringae stammt.
Ein Verfahren nach Anspruch 9, wobei das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein eine Aminosäuresequenz besitzt, die SEQ. ID Nr. 5 entspricht.
Ein Verfahren nach Anspruch 9, wobei das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein eine Molmasse von 34–35 kDa besitzt.
Ein Verfahren nach Anspruch 2, wobei das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein demjenigen entspricht, das von Pseudomonas solanacearum stammt.
Ein Verfahren nach Anspruch 12, wobei das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein eine Aminosäuresequenz besitzt, die SEQ. ID Nr. 7 entspricht.
Ein Verfahren nach Anspruch 2, wobei das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein demjenigen entspricht, das von Xanthomonas campestris stammt.
Ein Verfahren nach Anspruch 14, wobei das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein eine Aminosäuresequenz besitzt, die SEQ. ID Nr. 9 entspricht.
Ein Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Pflanze aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus zweikeimblättrigen und einkeimblättrigen Pflanzen besteht.
Ein Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Pflanze aus einer Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Reis, Weizen, Gerste, Roggen, Baumwolle, Sonnenblume, Erdnuss, Getreide, Kartoffel, Süßkartoffel, Bohne, Erbse, Chicorée, Kopfsalat, Endiviensalat, Kohl, Blumenkohl, Broccoli, Rübe, Rettich/Radieschen, Spinat, Zwiebel, Knoblauch, Aubergine, Pfeffer, Sellerie, Karotte, Kürbis, Gartenkürbis, Zucchini, Gurke, Apfel, Birne, Melone, Erdbeere, Weintraube, Himbeere, Ananas, Sojabohne, Tabak, Tomate, Sorgum und Zuckerrohr.
Ein Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Pflanze aus einer Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Arabidopsis thaliana, Saintpaulia, Petunie, Pelargonie, Poinsettia, Chrysantheme, Nelke und Zinnie.
Ein Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Pathogen, gegenüber dem die Pflanze resistent ist, aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus Viren, Bakterien, Pilzen und deren Kombinationen besteht.
Ein Verfahren nach Anspruch 1, wobei genannte Anwendung durch Spritzen, Einspritzen oder Blattabschabung zeitnah zu dem Zeitpunkt, zu dem die Anwendung stattfindet, durchgeführt wird.
Ein Verfahren nach Anspruch 1, wobei das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein als eine Zusammensetzung, die ferner einen Träger umfasst, an den Pflanzen angewendet wird.
Ein Verfahren nach Anspruch 21, wobei der Träger aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasser und einer wässerigen Lösung besteht.
Ein Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Zusammensetzung mehr als 500 nM des hyperempfindlichen reaktionsauslösenden Polypeptids oder Proteins umfasst.
Ein Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Zusammensetzung ferner Additive enthält, die von einer Gruppe ausgewählt sind, die aus einem Dünger, einem Insektizid, einem Fungizid und Mischungen davon besteht.
Ein Verfahren nach Anspruch 1, wobei die genannte Anwendung eine Infiltration des Polypeptids oder des Proteins in die Pflanze verursacht.
Verwendung entweder eines/r isolierten hyperempfindlichen reaktionsauslösenden Polypeptids, Proteins oder Bakteriums, die keine Krankheit auslösen und mit einem Gen transformiert sind, welches das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein kodiert, um Pflanzen Resistenz gegenüber Pathogenen zu verleihen.
Verwendung nach Anspruch 26, die die Anwendung des hyperempfindlichen reaktionsauslösenden Polypeptids oder Proteins an der Pflanze in einer nicht-infektiösen Form einschließt, unter Bedingungen, bei denen das Polypeptid oder das Protein die Zellen der Pflanze berührt.
Verwendung nach Anspruch 27, wobei genannte Anwendung durch Spritzen, Einspritzen oder Blattabschabung zeitnah zu dem Zeitpunkt, zu dem die Anwendung stattfindet, durchgeführt wird.
Verwendung nach Anspruch 27, wobei das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein als eine Zusammensetzung, die ferner einen Träger umfasst, an den Pflanzen angewendet wird.
Verwendung nach Anspruch 26, wobei das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein demjenigen entspricht, das von einen Pathogen stammt, das aus der Gruppe ausgewählt wurde, bestehend aus: Erwinia amylovora, Erwinia chrysanthemi, Pseudomonas syringae, Pseudomonas solanacearum, Xanthomonas campestris und Mischungen davon.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein demjenigen entspricht, das von Erwinia chrysanthemi stammt.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein demjenigen entspricht, das von Erwinia amylovora stammt.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein demjenigen entspricht, das von Pseudomonas syringae stammt.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein demjenigen entspricht, das von Pseudomonas solanacearum stammt.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei das hyperempfindliche reaktionsauslösende Polypeptid oder Protein demjenigen entspricht, das von Xanthomonas campestris stammt.
Verwendung nach Anspruch 29, wobei der Träger aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasser und einer wässerigen Lösung besteht.
Verwendung nach Anspruch 29, wobei die Zusammensetzung mehr als 500 nM des hyperempfindlichen reaktionsauslösenden Polypeptids oder Proteins umfasst.
Verwendung nach Anspruch 29, wobei die Zusammensetzung ferner Additive enthält, die von einer Gruppe ausgewählt sind, die aus einem Dünger, einem Insektizid, einem Fungizid und Mischungen davon besteht.