KR100529261B1 - 식물에있어과민반응에의해유도되는내성 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 식물에 병원균 내성을 부여하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 비 감염성 형태의 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질을 식물의 세포에 접촉하는 상태로 식물에 적용하는 것을 포함하는 것을 포함한다. 본 발명은 병원균 내성 식물 및 식물에 병원균 내성을 부여하는 조성물에 관한 것이다.

Description

식물에 있어 과민 반응에 의해 유도되는 내성 {Hypersensitive Response Induced Resistance in Plants}
본 발명은 식물에 내성을 유도시키기 위해 과민 반응을 부여하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 USDA NRI 경쟁 연구 승인 번호 제91-37303-6430호에 의해 미국 정부의 지원으로 이루어졌다.
유기체는 외부 환경으로 부터의 자극을 인식 및 반응할 수 있도록 하는 복잡한 생화학적 경로의 배열을 진화시켰다. 이들 경로는 수용체 기관, 호르몬, 2차 메신저 및 효소 변형등을 포함한다. 현재까지, 비록 이러한 정보가 질병 감수성 및 내성의 이해를 위해 핵심적 내용이지만 병원균에 의하여 감염되었을 때 식물의 반응중에 활성화되는 시그날 전달 경로 (signal transduction pathway)에 대하여 알려진 바는 거의 없다. 식물 내성의 일반적인 유형은 병원균의 증식을 감염된 부위 주위의 작은 구역으로 제한하는 것이다. 많은 경우 이러한 제한은 숙주의 조직을 국부적으로 죽이는 방법(예를 들면 괴사(necrosis))으로 수행된다. 병원균 제한과 국부 조직 괴사법은 함께 과민 반응의 특징을 이룬다. 국부 방어 반응뿐 아니라, 많은 식물은 감염되지 않은 부분에서도 방어를 활성화하여 감염에 반응한다. 결국 모든 식물은 2차 감염에 더 내성을 갖는다. 이런 전신 획득 내성은 수 주이상 유지될 수 있으며 (R.E.F. Matthews, Plant Virology (Academic Pressm New York, ed. 2, 1981)) 종종 관련이 없는 병원균에 대하여도 교차 내성을 부여한다 (J. Kuc, in Innovative Approaches to Plant Disease Control, I. Chet, Ed. (Wiley, New Your, 1987) pp. 255-274, 본원에 참조문헌으로 삽임됨)
전신 획득 내성의 발현은 보통은 유독성인 바이러스 병원균이 면역된 조직에 침투하는 것이 실패로 돌아가는 것과 관계 있다 (Kuc, J., "Induced Immunity to Plant Disease," Bioscience, 32: 854-856(1982), 본원에 참조문헌으로 삽입됨). 전신 획득 내성의 확립은 세포벽에서 히드록시프롤린 수준과 퍼옥시다아제 활성의 조직적인 증가 (Smith, J. A., et al., "Comparative Study of Acidic Peroxidases Associated with Induced Resistance in Cucumber, Muskmelon and Watermelon," Physiol. Mol. Plant Pathol. 14: 329-338 (1988)), 본원에 참조문헌으로 삼입됨) 및 소위 전신 획득 내성 유전자의 9개 군의 한 세트의 발현 (Ward, E. R., et al., "Coordinate Gene Activity in Response to Agents that Induce Systemic Acquired Resistance," Plant Cell 3:49-59 (1991), 본원에 참조문헌으로 삽입됨)과 상호 관계가 있다. 이들 방어 유전자 군들 중 다섯은 생리학적 기능이 아직 확립되지 않은 발병과정-관련 단백질을 코딩한다. 그러나, 이들 단백질 중 몇몇은 시험관내에서 항진균작용 (Bol, J. F., et al., "Plant Pathologenesis-Related Proteins Induced by Virus Infection," Ann. Rev. Phytopathol. 28:113-38 (1990))을 가지며 트랜스제닉 (transgenic) 담배에서 콩 키티나아제 유전자의 항속적 (constitutive) 발현은 리조크토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani) 진균류에 의한 감염을 방지 (Broglei, K., et al., "Transgenic Plants with Enhanced Resistance to the Fungal Pathogens Rhizoctonia Solani," Science 254:1194-1197 (1991))할 수 있다. 이들 전신 획득 내성 단백질이 면역 상태에 기여할 수 있음을 제시한다 (Uknese, S., et al "Acquired Resistance in Arabidosis." Plant Cell 4:645-656 (1992)).
살리실산은 면역 반응 후에 내생적인 수준이 증가하고 (Malamy, J., et al., "Salicylic Acid: A Likely Endogenous Signal in the Resistance Response of Tobacco to Viral Infection," Science 250:1002-1004 (1990), 본원에 참조문헌으로 인용됨) 외생성인 살리실레이트는 전신 내성 획득 유전자 및 (Yalpani, N., et al., "Salicylic Acid is a Systemic Signal and an Inducer of Pathogenesis-Related Proteins in Virus-Infected Tobacco," Plant Cell 3:809-818 (1991), 본원에 참조문헌으로 인용됨) 획득 내성 (Uknes, S., et al., "Acquired Resistance in Arabidopsis," Plant Cell 4:645-656 (1992), 본원에 참조문헌으로 인용됨)을 유도하므로 전신 획득 내성의 유도에 있어서 시그날로서 역할을 하는 것으로 보인다. 아울러, 살리실레이트 히드록시라제를 코딩하는 박테리아 트랜스 유전자의 작용에 의하여 살리실레이트가 파괴된 트랜스제닉 담배 식물들은 전신 획득 내성을 보이지 않는다 (Gaffney, T., et al., "Requirement of Salicylic Acid for the Induction of Systemic Acquired Resistance," Science 261:754-296 (1993), 본원에 참조문헌으로 인용됨). 그러나, 이러한 효과는 전신 자극 기능보다는 국부적인 억제에 더 효과적이며 오이에서 시그날 전달의 상세한 반응속도법 분석은 살리실레이트가 장거리의 시그날 전달에는 필수적이지는 않을 수 있다는 것을 나타낸다 (Rasmussen, J. B., et al., "Systemic Induction of Salicylic Acid Accumulation in Cucumber after inoculation with Pseudomonas Syringae pv. Syringae," Plant Physiol. 97:1342-1347) (1991), 본원에 참조문헌으로 인용됨).
바이오틱 작용제를 사용한 면역이 많이 연구되고 있다. 녹색 콩을 재배종 -비병원균족들 (Rahe, J. E., "Induced Resistance in Phaseolus Vulgaris to Bean Anthracnose," Phytopathology 59:1641-5 (1969); Elliston, J., et al., "Induced Resistance to Anthracnose at a Distance from the Site of the Inducing Interaction," Phytopathology 61:1110-12 (1971); Skipp, R., et al., "Studies on Cross Protection in the Anthracnose Disease of Bean," Physiological Plant Pathology 3:299-313 (1973), 본원에 참조문헌으로 인용됨); 또는 증상이 나타나기 전에 숙주 세포에서 열에 의해 감쇠된 재배종-병원균족 (Rahe, J. E., et al., "Metabolic Nature of the Infection-Limiting Effect of Heat on Bean Anthracnose," Phytopathology 60:1005-9 (1970), 본원에 참조문헌으로 인용됨) 또는 콩의 비병원균들 중 하나에 의해 일차적으로 감염된 콜레토트리첨 린데무티아늄 (Colletotrichum lindemuthianum)의 배양된 병원균족들에 의해 유발되는 질병에 대항하기 위하여 전체적으로 면역시켰다. 오이의 탄저병 병원균인 콜레토트리첨 라게나리움 (Colletotrichum lagenarium)은 모든 콩 탄저병족에 대한 전체적인 방어의 유도체로서 비병원균족과 동등한 효과를 보였다. 방어는 C. 린데뮤티아늄 (C. lindemuthianum)의 하나 이상의 족에 대한 배양 내성내 뿐만 아니라 곰팡이의 모든 알려진 족에 민감한 배양액 내에 있는 C. 라게나리움 (C. lagenarium)에 의해 유도되었다 (Elliston, J., et al., "Protection of Bean Against Anthracnose by Colletotrichum Species Nonpathogenic on Bean," Phytopathologische Zeitschrift 86:117-26 (1976); Elliston, J., et al., "A Comparative Study on the Development of Compatible, Incompatible and Induced Incompatible Interactions Between Collectotrichum Species and Phaseolus Vulgaris," Phytopathologische Zeitschrift 87:289-303 (1976), 본원에 참조문헌으로 인용됨). 이러한 결과는 내성 유전자를 "보유"하고 있거나 또는 "결여"하고 있다고 보고된 제배품종 내에서 동일한 메카니즘이 유도될 수 있음을 암시한다 (Elliston, J., et al., "Relation of Phytoalexin Accumulation to Local and Systemic Protection of Bean Against Anthracnose," Phytopathologische Zeitschrift 88:114-30 (1977), 본원에 참조문헌으로 인용됨). C. 린데뮤티아늄의 모든 족에 민감한 재배품종은 병원균에 대한 내성 메카니즘을 위한 유전자가 결여되지 않았다.
쿡, 제이 등의 문헌 (Kuc, J., et al., "Protection of Cucumber Against Collectotrichum lagenarium by Colletotrichum lagenarium," Physiological Plant Pathology 7:195-9 (1975), 본원에 참조문헌으로 인용됨)은 동일진균에 의한 떡잎 또는 최초의 진정잎의 사전 접종에 의해 콜레토트리첨 라게나리움에 의해 유발되는 질병에 대하여 전신적으로 방어될 수 있다는 것을 보인다. 그 결과, 오이는 곰팡이, 박테리아 및 바이러스 질병에 대하여 먼저 국부적으로 곰팡이, 박테리아 또는 바이러스에 의하여 감염함으로써 전신적으로 방어되었다 (Hammerschmidt, R., et al., "Protection of Cucumbers Against Colletotrichum lagenarium and Cladosporium cucumerinum," Phytopathology 66:790-3 (1976); Jenns, A. E., et al., "Localized Infection with Tobacco Necrosis Virus Protects Cucumber Against Colletotrichum lagenarium," Physiological Plant Pathology 11:207-12 (1977); Caruso, F. L., et al. "Induced Resistance of Cucumber to Anthracnose and Angular Leaf Spot by Pseudomonas Lachrymans and Colletotrichum lagenarium," Physiological Plant Pathology 14:191-201 (1979); Staub, T., et al., "Systemic Protection of Cucumber Plants Against Disease Caused by Cladosporium cucumerinum and Colletotrichum lagenarium by Prior Localized Infection with Either Fungus," Physiological Plant Pathology, 17:389-93 (1980); Bergstrom, G. C., et al., "Effects of Local Infection of Cucumber by Colletotrichum lagenarium, Pseudomonas lachrymans or Tobacco Necrosis virus on Systemic Resistance to Cucumber Mosaic Virus," Phytopathology 72:922-6 (1982); Gessler, C., et al., "Induction of Resistance to Fusarium Wilt in Cucumber by Root and Foliar Pathogens," Phytopathology 72:1439-41 (1982); Basham, B., et al., "Tobacco Necrosis Virus Induces Systemic Resistance in Cucumbers Against Sphaerotheca Fuliginea," Physiological Plant Pathology 23:137-44 (1983), 본원에 참조문헌으로 인용됨). C. 라게나리움 또는 담배 괴사 바이러스의 감염에 의해 유도된 비특이적 방어는 편성기생충 또는 통성기생충 곰팡이, 국부 병변 및 전신 바이러스, 입고병 곰팡이 및 박테리아 등을 포함하는 13개 이상의 병원균에 대하여 효과적이다. 유사하게, 뿌리 병원균에 대해서도 방어가 유도되고 효과적이다. 수박 및 머스크 멜론을 포함하는 기타 호박종들이 C. 라게나리움에 대하여 전신적으로 방어된다 (Caruso, F. L., et al., "Protection of Watermelon and Muskmelon Against Colletotrichum lagenarium by Colletotrichum lagenarium," Phytopatholoqy 67:1285-9 (1977), 본원에 참조문헌으로 인용됨)
담배에서 많은 종류의 질병에 대해 전신적인 방어가 유도되었다 (Kuc, J., et al., "Immunization for Disease Resistance in Tobacco," Recent Advances in Tobacco Science 9:179-213 (1983), 본원에 참조문헌으로 인용됨). 담배 모자이크 바이러스에 의해 발생되는 괴사 병변은 바이러스에 의해 유발되는 질병에 대한 상단부 잎에서의 내성을 증진시킨다 (Ross, A. F., et al., "Systemic Acquired Resistance Induced by Localized Virus Infections in Plants," Virology 14:340-58 (1961); Ross, A. F., et al., "Systemic Effects of Local Lesion Formation," In: Viruses of Plants pp. 127-50 (1966), 본원에 참조문헌으로 삽입됨). 참깨 역병균 (Phytophthora parasitica var. nicotianas), 담배 역병균 (P. tabacina) 및 수도모나스 타바시 (Pseudomonas tabaci) 및 복숭아혹진딧물 (Myzus persicas)의 감소된 재생산 (Mcintyre, J. L., et al., "Induction of Localized and Systemic Protection Against Phytophthora Parasitica var. nicotianae by Tobacco Mosaic Virus infection of Tobacco Hypersensitive to the Virus," Physiological Plant Pathology 15:321-30 (1979); Mcintyre, J. L., et al., "Effects of Localized Infections of Nicotiana tabacum by Tobacco Mosaic Virus on Systemic Resistance Against Diverse Pathogens and an Insect," Phytopathology 71:297-301 (1981), which are hereby incorporated by reference). 가열처리하여 죽인 피. 타바시 (P. tabaci) (Lovrekovich, L., et al., "Induced Reaction Against Wildfire Disease in Tobacco Leaves Treated with Heat-Killed Bacteria," Nature 205:823-4 (1965), 본원에 참조문헌으로 인용됨), 및 수도모나스 솔란시아룸 (Pseudomonas solanacearum) (Sequeira, L, et al., "Interaction of Bacteria and Host Cell Walls: Its Relation to Mechanisms of Induced Resistance," Physiological Plant Pathology 10:43-50 (1977), 본원에 참조문헌으로 삽입됨)의 담배 잎 중으로의 침윤 (infiltration)은 침윤을 위하여 사용된 동일한 박테리아에 대한 내성을 유도한다. 또한, 담배 식물은 참깨 역병균 (P. parasitica var. nicotiana)에 대항하는 뿌리썩이선충병 (Pratylenchus penetrans)에 의해 보호된다 (McIntyre, J. L., et al. "Protection of Tobacco Against Phytophthora Parasitica Var. Nicotianae by Cultivar-Nonpathogenic Races, Cell-Free Sonicates and Pratylenchus Penetrans," Phytopathology 68:235-9 (1978), 본원에 참조문헌으로 인용됨).
크루이크생크 등의 문헌 [Cruikshank, I. A. M., et al., "The Effect of Stem Infestation of Tobacco with Peronospora Tabacina Adam on Foliage Reaction to Blue Mould," Journal of the Australian Institute of Agricultural Science 26:369-72 (1960), 본원에 참조문헌으로 인용됨]은 곰팡이에 의해 줄기가 감염되고 왜성 (矮性) 성장 및 조기 노령화를 수반하는 푸른 곰팡이에 대한 담배 잎의 면역에 대해 언급한 최초의 논문이다. 목질부 외부에 감염시키는 것은 발육 장애를 완화시킬 뿐 아니라 성장 및 발생을 촉진시킨다는 사실을 발견하였다. 온실 또는 옥외 실험에서 면역된 담배 식물은 기준 식물보다 약 40% 더 크고, 건조 중량이 40% 증가되었고, 생체중이 30% 증가되며, 4-6개의 잎을 더 가진다 (Tuzun, S., et al., "The Effect of Stem Injections with Peronospora Tabacina and Metalaxyl Treatment on Growth of Tobacco and Protection Against Blue Mould in the Field," Phytopathology 74:804 (1984), 본원에 참조문헌으로 인용됨). 이들 식물은 기준 식물보다 약 2-3주 일찍 꽃을 피웠다 (Tuzun, S., et al., "Movement of a Factor in Tobacco Infected with Peronospora Tabacina Adam which Systemically Protects Against Blue Mould," Physiological Plant Pathology 26:321-30 (1985), 본원에 참조문헌으로 인용됨).
전신 방어는 감염에 대하여 완벽한 면역을 주지는 못하나 질병의 정도는 완화시키며 증상의 진행을 지연시킨다. 병변의 수, 병변의 크기 및 곰팡이 병원균의 포자형성의 정도가 모두 감소하였다. 병에 걸린 구역도 90 % 이상 감소하였다.
오이에 대하여 초기 접종 후 3-6주의 추가 접종을 하였을 때 C. 라게나리움에 의해 유도된 면역은 개화 및 결실 동안 지속되었다 (Kuc, J., et al., "Aspects of the Protection of Cucumber Against Colletotrichum lagenarium by Colletotrichum lagenarium," Phytopathology 67:533-6 (1977), 본원에 참조문헌으로 인용됨). 방어는 일단 식물이 결실한 후에는 유도될 수 없다. 담배 식물은 P. 타바시나 (P. tabacina)의 포자낭으로 줄기를 감염시켜 성장 시기까지 면역화시켰다. 그러나, 전신 푸른 곰팡이 형성을 막기 위하여, 이 기술은 식물의 키가 20 ㎝이상일 때만 효과적이다.
면역된 오이 식물로부터 유도체 잎을 제거하는 것은 이미 존재하는 넓어진 잎의 면역 수준을 감소시키지 않았다. 그러나, 끝눈에 이어서 나타나는 잎들은 그 전 잎들보다 점점 방어력이 떨어진다 (Dean, R. A., et al., "Induced Systemic Protection in Cucumber: Time of Production and Movement of the `Signal`," Phytopathology 76:966-70 (1986), 본원에 참조문헌으로 인용됨). 담배 모자이크 바이러스에 의한 사전 감염에 의해 담배 모자이크 바이러스에 대해 면역화한 담배 (국부 병변 숙주)에서 유사한 결과가 로스, 에이. 에프에 의해 보고되어 있다 (Ross, A. F., "Systemic Effects of Local Lesion Formation," In: Viruses of Plants pp. 127-50 (1966), 본원에 참조문헌으로 인용됨). 반면에, 피. 타바시로 줄기가 감염된 담배 식물에서 절단된 어린 가지에서 자라난 새로운 잎은 상당한 방어력을 보인다 (Tuzun, S., et al., "Transfer of Induced Resistance in Tobacco to Blue Mould (Peronospora Tabacina Adam.) Via Callus," Phytopathology 75:1304 (1985), 본원에 참조문헌으로 인용됨). 면역된 식물의 잎으로부터 조직 배양액을 통해 재생된 식물은 면역되지 않은 식물의 잎에서 재생된 식물에 비하여 상당히 감소된 푸른 곰팡이를 보인다. 어린 재생체들은 단지 감소된 포자 형성을 보였다. 식물이 나이가 들어가면서 병변 발생 및 포자 형성 모두가 감소되었다. 다른 연구자들은 같은 결과를 얻지 못하였으나 비록 하나의 실험에서 포자 형성에 있어서의 감소는 보고되었다 (Lucas, J. A., et al., "Nontransmissibility to Regenerants from Protected Tobacco Explants of Induced Resistance to Peronospora Hyoscyami," Phytopathology 75:1222-5 (1985), 본원에 참조문헌으로 인용됨).
오이나 수박의 방어는 온실 및 옥외에서도 효과적이다 (Caruso, F. L., et al., "Field Protection of Cucumber Against Colletotrichum lagenarium by C. lagenarium," Phytopathology 67:1290-2 (1977), 본원에 참조문헌으로 인용됨). 한 실험에서 방어된 오이에 C. 라게나리움의 전체 병변 부분은 방어되지 않은 대조구 식물의 병변 부분보다 2% 정도 적었다. 유사하게, 방어되지 않고 감염된 수박 69개 중 47개가 죽은 반면 방어되고 감염된 식물 66개 중에 1개만 죽었다. 켄터키 및 푸에르토리코에서의 광범위한 범위의 실험에서는 P. 타바시나의 포자낭으로 담배의 줄기 감염이 최소한 푸른 곰팡이를 조절하는 데 있어서 최고의 살균제인 메탈라실만큼 유효하였다. 식물은 괴사된 부분 및 포자 형성의 정도를 기준으로 95 내지 99 % 방어 되었으며 치료된 담배에서 10 내지 25 %의 생산량 증가를 가져왔다.
박테리아 및 바이러스에 대해 유도된 내성은 질병 증상, 또는 병원균 증식 또는 이들 모두의 억제로 표현될 수 있음을 나타낸다 (Caruso, F. L., et al., "Induced Resistance of Cucumber to Anthracnose and Angular Leaf Spot by Pseudomonas Lachrymans and Colletotrichum lagenarium," Physiological Plant Pathology 14:191-201 (1979); Doss, M., et al., "Systemic Acquired Resistance of Cucumber to Pseudomonas lachrymans as Expressed in Suppression of Symptoms, but not in Multiplication of Bacteria," Acta Phytopathologia Academiae Scientiarum Hungaricae 16:(3-4), 269-72 (1981); Jenns, A. E., et al., "Non-Specific Resistance to Pathogens Induced Systemically by Local Infection of Cucumber with Tobacco Necrosis Virus, Colletotrichum lagenarium or Pseudomonas lachrymans," Phytopathologia Mediterranea 18:129-34 (1979), 본원에 참조문헌으로 삽입됨).
상기에서 기술한, 전신 획득 내성에 관한 연구는 식물을 감염성 병원균으로 감염시키는 것을 수반한다. 비록 이 영역에 관한 연구는 어떻게 전신 획득 내성 기능이 작용하는가에 대한 이해에는 유용하지만 이와 같은 식물-병원균 접촉은 식물을 약하게 하거나 죽일 수 있기 때문에 감염성 시료를 사용하여 내성을 유도하는 것은 상업적으로 유용하지 않다. 본 발명은 이러한 어려움을 해결하기 위함이다.
<발명의 요약>
본 발명은 식물에 병원균 내성을 부여하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질을 폴리펩티드 또는 단백질이 식물의 세포에 접촉하는 조건하에서 비 감염성 형태로 식물에 적용하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 비 감염성 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질과 접촉하는 세포를 갖는 병원균-내성 식물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 식물에 병원균 내성을 부여하기 위한 조성물에 관한 것이다. 조성물은 비 감염성이고 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질 및 담체를 포함한다.
본 발명은 이전에는 치료할 수 없었던 식물 질병들의 치료, 비용의 문제로 개별적으로 치료를 받기 원하지 않았던 전신 질병의 치료 및 질병 치료를 위해 감염성 시약의 사용을 피하는 것을 가능하게 한다. 본 발명은 치료를 목적으로 하는 식물에 또는 치료를 필요로 하는 부위에 가까이 위치한 식물들에 대해 병원성인 물질을 사용하지 않고도 내성을 부여할 수 있다. 본 발명은 생물 분해성 천연물을 사용하므로 주위 환경은 오염되지 않는다.
도 1은 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora)에 대한 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자군 (즉, hrpN)의 유전적 구조를 나타낸다. 제일 위의 선은 플라스미드 벡터 pCPP430의 제한 효소 맵을 나타낸다 (E는 Eco RI, B는 Bam HI이고 H는 Hind III임). 직사각형은 전사 단위를 나타내며 직사각형 아래의 화살표는 전사 방향을 표시한다. 긴 화살표는 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질의 최종적인 전사를 위해 필요한 구역을 나타낸다. pCPP430 hrpN은 hrpN이 전위체 TnStac의 삽입으로 인해 돌연변이된 pCPP430의 유도체이다.
도 2는 플라스미드 벡터 pCPP9의 맵이다. 중요한 특징은 결합을 위한 동원(mob) 사이트, λ의 부착 사이트(cos) 및 플라스미드의 안정한 유전성을 위한 분할 구역(par) 등이다. 도면에서 사용된 B는 BamHI, E는 EcoRI, H는 HindIII, P는 PstI, S는 Sall, Sm는 SmaI, oriV는 복제의 시작점, Spr는 스펙티노마이신 내성, Smr은 스트렙토마이신 내성을 나타낸다.
본 발명은 식물에 병원균 내성을 부여하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질을 식물 세포의 일부 또는 전체에 접촉하게 하는 조건하에서 비 감염된 형태로 식물의 일부 또는 전체에 적용하는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 비 감염성 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질과 접촉하는 세포를 가진 병원균 내성 식물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 식물에 병원균 내성을 부여하기 위한 조성물에 관한 것이다. 그 조성물은 비 감염성 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질 및 담체를 포함한다.
본 발명에서 사용한 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질은 여러 가지의 병원균에서 유래된 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질에 상응할 수 있다. 이런 폴리펩티드 또는 단백질은 유도체와 접촉하는 식물 조직내에 국부적 괴사를 유도할 수 있다. 바람직한 병원균은 어위니아 아밀로보아 (Erwinia amylovora), 어위니아 크리산테미 (Erwinia chrysanthemi), 수도모나스 시린게 (Pseudomonas syringae), 수도모나스 솔란시아룸 (Pseudomonas solancearum), 크산토모나스 캄페스트리스 (Xanthomonas campestris) 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 목적을 위하여 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질의 비 감염성 형태는 폴리펩티드나 단백질이 접촉하는 식물에 있어서 질병을 유발함 없이 과민 반응을 유도할 수 있다. 이는 다음과 같은 방법 1) 단리된 유도체 폴리펩티드 또는 단백질의 사용, 2) 질병을 유발하지 않으며, 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질 코딩 유전자로 형질전환된 박테리아의 사용 및 3) 그들이 사용되는 식물은 아니지만 일부 식물에서는 질병을 야기시키며 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질 코딩 유전자를 천연적으로 함유하는 박테리아의 사용으로 수행될 수 있다.
본 발명의 한 실시태양에서 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질이 그들의 상응하는 생물체로부터 단리할 수 있으며 식물에 사용될 수 있다. 이러한 단리 방법은 하기 인용 문헌에 기술된 바와 같이 공지되어 있다 [Arlat, M., F. Van Gijsegem, J. C. Huet, J. C. Pemollet, and C. A. Boucher, "PopA1, a Protein which Induces a Hypersensitive-like Response in Specific Petunia Genotypes is Secreted via the Hrp Pathway of Pseudomonas solanacearum," EMBO J. 13:543-553 (1994); He, S. Y., H. C. Huang, and A. Collmer, "Pseudomonas syringae pv. syringae HarpinPss : a Protein that is Secreted via the Hrp Pathway and Elicits the Hypersensitive Response in Plants," Cell 73:1255-1266 (1993); and Wei, Z. -M., R. J. Laby, C. H. Zumoff, D. W. Bauer, S. -Y. He, A. Collmer, and S. V. Beer, "Harpin Elicitor of the Hypersensitive Response Produced by the Plant Pathogen Erwinia amylovora, Science 257:85-88 (1992), 본원에 참조문헌으로 삽입됨]. 또한 본 출원에서 인용 문헌으로 삽입된 계류중인 미국 특허 출원 제08/200,024호와 제08/062,024호에서도 알 수 있다. 그러나 본 발명의 단리된 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질은 하기에서 기술한 바와 같이 재조합하여 제조되고 정제되는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 실시태양에 따르면 본 발명의 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질은 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질 코딩 유전자를 함유하는 박테리아를 사용하여 식물에 사용될 수 있다. 이와 같은 박테리아는 유도체가 식물 세포와 접촉할 수 있도록 폴리펩티드나 단백질을 분비할 수 있어야 한다. 이러한 실시태양에 따르면 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질은 플랜타 (planta)에 있거나 식물에 박테리아를 사용하기 바로 직전의 박테리아에 의해 제조된다.
본 발명의 박테리아 사용 형태의 한 실시태양에서는 박테리아는 질병을 유발하지 않으며 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질 코딩 유전자에 의해 재조합의 형태로 형질전환되었다 (예를 들어, 재조합적으로). 예를 들면, 식물에 과민 반응을 유도하지 않는 이 콜리 (E. coli)는 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질 코딩 유전자로 형질전환된 후 식물에 사용될 수 있다. 이 콜리 이외의 다른 박테리아 종들도 본발명의 이러한 실시태양에 사용될 수 있다.
본 발명의 박테리아 사용 형태중의 한 실시태양에서는 박테리아는 질병을 유발할 수 있고 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질 코딩 유전자를 천연적으로 포함한다. 이러한 박테리아의 예들은 상기한 바와 같다. 그러나, 이들 실시태양에서 이들 박테리아들은 박테리아에 의하여 운반되는 질병에 민감하지 않은 식물에 사용된다. 예를 들어, 어위니아 아밀로보라는 사과나 배에서는 질병을 유발하지만 토마토에서는 유발시키지 않는다. 그러나 이런 박테리아는 토마토에서 과민 반응을 유도시킨다. 따라서, 본 발명의 이들 실시태양과 관련하여 어위니아 아밀로보라는 이들 종에서는 질병의 유발없이 병원균 내성을 부여하기 위하여 토마토에 사용될 수 있다.
어위니아 크리산테미에서 만들어진 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질은 SEQ. 동정 번호 1에 대응하는 다음과 같은 아미노산 서열을 갖는다.
이 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질은 분자량이 34 kDa이고 열에 안정하고 글리신의 함량이 16 %를 초과하며 실질적으로 시스테인을 함유하고 있지 않다. 어위니아 크리산테미 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질은 다음과 같은 SEQ. 동정 번호 2에 대응하는 뉴클레오티드 서열을 가지는 DNA 분자에 의해 코딩된다.
어위니아 아밀로보라에서 만들어진 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질은 SEQ. 동정 번호 3에 대응하는 다음과 같은 아미노산 서열을 갖는다.
이 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질은 분자량이 37 kDa이고 약 4.3의 pI를 가지며, 100℃의 열에 10분 이상 안정하다. 이 과민 반응 유도체폴리펩티드 또는 단백질은 실질적으로 시스테인을 함유하고 있지 않다. 어위니아 아밀로보라에서 만들어진 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질은 인용 문헌 [Wei, Z. -M., R. J. Laby, C. H. Zumoff, D. W. Bauer, S. -Y. He, A. Collmer, and S. V. Beer, "Harpin, Elicitor of the Hypersensitive Response Produced by the Plant Patbogen Erwinia amylovora," Science 257:85-88 (1992), 본원에 참조문헌으로 인용됨] 중에 보다 상세히 기재되어 있다. 이 DNA 분자 코딩 폴리펩티드 또는 단백질은 다음과 같은 SEQ. 동정 번호 4에 대응하는 뉴클레오티드 서열을 가진다.
수도모나스 시린게에서 유래하는 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질은 SEQ. 동정 번호 5에 대응하는 다음과 같은 아미노산 서열을 갖는다.
이 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질은 분자량이 34 내지 35 kDa이고, 시스테인 및 티로신이 부족하며 글리신은 약 13.5 %로 풍부하다. 수도모나스 시린게에서 유래하는 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질은 인용 문헌 [Re, S. Y., H. C. Huang, and A. Collmer, "Pseudomonas syringae pv. syringae HarpinPss : a Protein that is Secreted via the Hrp Pathway and Elicits the Hypersensitive Response in Plants," Cell 73:1255-1266 (1993), 본원에 참조문헌으로 인용됨]에 잘 기재되어 있다. 수도모나스 시린게에서 유래하는 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 DNA 분자는 다음과 같은 SEQ. 동정 번호 6에 대응하는 뉴클레오티드 서열을 가진다.
수도모나스 솔란시아룸에서 유래하는 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질은 SEQ. 동정 번호 7에 대응하는 다음과 같은 아미노산 서열을 갖는다.
다음과 같은 SEQ. 동정 번호 8에 대응하는 뉴클레오티드 서열을 가지는 DNA 분자에 의하여 코딩된다.
수도모나스 솔란시아룸에 의해 유래하는 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질에 대한 추가적인 정보는 인용 문헌 [Arlat, M., F. Van Gijsegem, J. C. Huet, J. C. Pemollet, and C. A. Boucher, "PopA1, a Protein which Induces a Hypersensitive-like Response in Specific Petunia Genotypes, is Secreted via the Hrp Pathway of Pseudomonas solanacearum," EMBO J. 13:543-533 (1994), 본원에 참조문헌으로 인용됨]에 기재되어 있다.
크산토모나스 캄페스트리스 pv. 글리신에서 만들어진 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질은 SEQ. 동정 번호 9에 대응하는 다음과 같은 아미노산 서열을 갖는다.
이 서열은 크산토모나스 캄페스트리스 pv. 글리신에서 만들어진 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질에서 단지 26 잔기만을 가지는 아미노 말단 서열이다. 다른 크산토모나스 캄페스트리스 페토바에서 측정된 섬모 소단위(subunit) 단백질과 일치한다.
상기 유도체는 예시적이다. 다른 유도체는 유전자 코딩된 유도체가 발현되는 상태에서 과민 반응을 유도하는 박테리아의 배양을 통해 동정할 수 있다. 배양된 상등액에서 세포가 없는 제제를 그들을 적절한 식물 조직에 침투시킴으로써 유도체 활성 (즉, 국부 괴사)을 시험할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 다른 병원균의 전장 유도체의 단편 뿐아니라 상기 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질의 단편을 사용하는 것도 가능하다.
적합한 단편은 여러 방법을 통하여 제조할 수 있다. 먼저, 기지의 유도체 단백질을 코딩하는 유전자의 서브클론을 유전자 단편을 서브클로닝하여 통상의 분자 유전적 조작으로 제조한다. 그리고 나서, 서브클론을 생체 외에서 또는 박테리아 생체 내에서 하기에서 기술된 방법에 따라 유도체 활성을 시험할 수 있는 작은 단백질 또는 펩티드를 얻기 위하여 발현한다.
별법으로, 유도체 단백질의 단편은 키모트립신 또는 스타필로코코스 (Staphylococcus) 프로테이나제 A 또는 트립신과 같은 단백질 가수분해 효소의 작용으로 전장 유도체 단백질의 분해를 통하여 제조될 수 있다. 다른 단백질 가수 분해 효소는 유도체 단백질의 아미노산 서열에 근거한 다른 위치에서 유도체 단백질을 분해할 수 있다. 단백질 가수 분해에 의해 생성된 단편의 일부는 내성의 활성적 유도체일 수 있다.
단백질의 일차 구조에 바탕을 둔 다른 방법에서는 유도체 단백질 유전자의 단편은 단백질의 특정 부위를 나타내기 위하여 선택된 프라이머의 특정 세트와 함께 PCR 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 이들은 절단된 펩티드 또는 단백질의 발현 및 증식을 위한 적당한 벡터로 클론화된다.
변형체는 또한 (또는 별법으로), 예를 들면 폴리펩티드의 특성, 이차 구조 및 하이드로페틱한 특성에 영향을 최소화 할 수 있을 아미노산의 삭제나 첨가에 의하여 변형된다. 예를 들면, 폴리펩티드는 단백질의 N 말단 끝에서 번역과 동시에 또는 번역 후에 단백질의 전달을 지시하는 시그널 (또는 리더) 서열과 결합할 수 있다. 또한, 폴리펩티드는 그들의 합성, 정제 또는 동정의 용이함을 위하여 링커 또는 다른 서열과 결합할 수 있다.
본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드는 통상의 기술을 사용하여 바람직하게는 정제된 형태(바람직하게는 약 80 % 이상, 더 바람직하게는 90 %의 순도)로 제조된다. 일반적으로, 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드는 재조합 이. 콜리의 배양 배지 중으로 분비된다. 단백질을 분리하기 위하여, 재조합 플라스미드를 갖고 있는 이. 콜리 숙주 세포가 증식되고 균질화되고, 박테리아 잔해를 제거하기 위하여 균질액을 원심 분리시킨다. 이후, 상등액을 연속 황산 암모늄 침전법을 거치게 한다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 단백질을 함유하는 분획은 단백질을 분리하기 위해 적절한 크기의 덱스트란 또는 폴리아크릴아미드 칼럼 중에서 겔 여과를 시킨다. 필요한 경우 단백질 분획을 HPLC로 추가 정제할 수 있다.
과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 DNA 분자는 통상의 재조합 DNA 기술을 사용하여 세포내에 도입될 수 있다. 일반적으로 이것은 DNA 분자가 이종성인(즉, 일반적으로는 존재하지 않는) 발현 시스템으로 DNA 분자를 삽입시키는 것을 포함한다. 이종성 DNA 분자는 적당한 센스 방향과 올바른 판독틀로 발현 시스템 또는 벡터내로 삽입된다. 벡터는 삽입된 단백질 코딩 서열의 전사 및 번역을 위해 필요한 요소를 포함한다.
본 발명에서 인용 문헌으로 언급된 코헨 및 보이어 (Cohen and Boyer)의 미국 특허 제4,237,224호는 제한 효소 절단 및 DNA 리가아제에 의한 결합을 사용하는 재조합 플라스미드 형태의 발현 시스템의 제조를 기술하고 있다. 이들 재조합 플라스미드는 이후 형질전환법에 의해 도입되고 조직 배양에서 배양된 원핵 생물체 및 진핵 세포를 포함하는 단세포 배양액 중에서 복제된다.
재조합 유전자는 백신 바이러스와 같은 바이러스내로 도입될 수 있다. 재조합 바이러스들은 바이러스에 감염된 세포내로 플라스미드를 도입하므로서 만들 수 있다.
이에 한정되는 것은 아니지만, 적합한 벡터로는 람다 (lambda) 벡터 시스템 gt11, gt WES.tB, Charon 4과 같은 바이러스 벡터, pBR322, pBR325, pACYC177, pACYC184, pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pLG339, pR290, pKC37, pKC101, SV40, pBluescript II SK +/- 또는 KS +/- (see "Stratagene Cloning Systems" Catalog (1993) from Stratagene, La Jolla, Calif., 본원에 참조문헌으로 인용됨), pQE, pIH821, pGEX, pET 시리즈 (참조 F. W. Studier et. al., "Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes," Gene Expression Technology vol. 185 (1990), 본원에 참조문헌으로 인용됨) 및 이들의 다른 유도체와 같은 플라스미드 벡터를 포함한다. 재조합 분자는 형질전환, 특히 형질도입, 접합, 유동 또는 전기천공 (electroporation)에 의해 세포내로 삽입될 수 있다. DNA 서열은 (본 발명에서 인용 문헌으로 언급한 마니아티스 등에 의한 분자 클로닝: 실험 매뉴얼, 콜드 스프링 실험실, 콜드 스프링 하버, 뉴욕(1982)) 당업계에 알려진 표준 클로닝 절차를 사용하여 벡터 내로 클로닝된다.
단백질 코딩 서열을 발현시키기 위하여 다양한 숙주 벡터 시스템이 사용된다. 주로, 숙주 세포와 경쟁할 수 있는 벡터 시스템이 사용되어야 한다. 숙주 벡터 시스템은 다음에 한정되는 것은 아니며 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA로 형질 전환된 박테리아, 효모 벡터를 함유하는 효모와 같은 미생물, 바이러스 (예를 들어, 백신 바이러스, 아데노바이러스 등)로 감염된 포유류 세포, 바이러스 (예를 들어, 배큘로바이러스)에 감염된 곤충 세포 시스템 및 박테리아에 의해 감염된 식물 세포 등을 포함한다. 이들 벡터들의 발현 요소들은 그들의 강도 및 특이성에 있어서 다양하다. 사용되는 숙주 벡터 시스템에 따라 다수의 적합한 전사 및 번역 요소들 중에 임의의 것이 사용될 수 있다.
상이한 유전적 시그날 및 프로세싱 이벤트가 유전자 발현의 많은 수준 (예를들면 DNA 전사 및 메신저 RNA 번역)을 조절한다.
DNA의 전사는 RNA 폴리머라제의 결합을 지휘하며 이로 인해 mRNA의 합성을 촉진시키는 DNA 서열인 프로모터의 존재 여부에 의존한다. 진핵세포의 프로모터의 DNA서열은 원핵 세포의 프로모터와는 다르다. 게다가, 진핵 세포의 프로모터 및 동반하는 유전적 시그날은 원핵 시스템에서 인식되지 않을 수 있거나 기능을 발휘하지 못할 수 있으며, 아울러, 원핵 세포의 프로모터는 진핵세포에서 인식되지 않고 기능을 발휘하지 못한다.
원핵 세포에서 mRNA의 번역은 적절한 진핵 세포의 그것과 상이한 원핵적 시그날의 존재에 의존한다. 원핵세포에서 mRNA의 효과적인 번역은 mRNA상의 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno, "SD")라고 불리는 리보솜 결합 부분을 필요로 한다. 이 서열은 보통 AUG인 출발 코돈보다 앞에 위치하는 mRNA의 짧은 뉴클레오티드 서열이며 단백질의 아미노-말단 메티오닌을 코딩한다. SD 서열은 16S rRNA(리보좀 RNA)의 3'-말단에 상보적이며 리보솜을 정확히 위치시키는 rRNA와의 이중 나선화를 통해 mRNA의 리보솜으로의 결합을 촉진시킨다. 최대 유전자 발현을 알아보기 위하여는 인용 문헌 [Roberts and Lauer, Methods in Enzymology, 68:473 (1979), 본원에 참조문헌으로 인용됨]을 참고하라.
프로모터들은 그들의 "강도", 즉, 전사를 촉진할 수 있는 능력에 있어서 상이하다. 클론된 유전자를 발현시키는 경우, 높은 수준의 전사를 얻어 유전자를 발현시킬 수 있도록 하기 위하여 강한 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다. 사용되는 숙주 세포 시스템에 따라 다수의 적절한 프로모터중에 임의의 하나가 사용될 수 있다. 예를 들면 이. 콜리에 클로닝 할 경우 그 박테리오파지, 또는 플라스미드, T7 파아지 프로모터, lac 프로모터, trp 프로모터, recA 프로모터, 리보솜 RNA 프로모터, 콜리파아지 람다의 PR 및 PL 프로모터 및 이에 한정되는 것은 아니나, lacUV5, ompF, bla, lpp 등이 인접 DNA 단편의 전사 수준을 높게 하기 위하여 사용될 수 있다. 또한, 재조합 DNA 또는 다른 합성 DNA 기술에 의하여 제조된 혼성 trp-lacUV5(tac) 프로모터 또는 기타 이. 콜리 프로모터들이 삽입된 유전자의 전사를 제공하기 사용될 수 있다.
박테리아 숙주 세포 균주 및 발현 벡터는 특정적으로 유도되지 않을 경우 프로모터의 작용을 억제하는 것이 선택될 수 있다. 특정 실시에서, 삽입된 DNA의 효과적인 전사를 위하여 특정 유도체의 첨가가 필요하다. 예를들면, lac오페론은 락토스나 IPTG(이소프로필티오-베타-D-갈락토사이드)의 첨가로 유도된다. trp 또는 pro 등의 다양한 다른 오페론은 다른 조절 하에 있다.
또한, 특정 개시 신호가 원핵세포에서 효과적인 유전자 전사 및 번역을 위하여 필요하다. 이들 전사 및 번역 개시 신호는 합성된 유전자 특정 메신저 RNA 및 단백질의 각각의 양을 측정하여 "강도"를 변경할 수 있다. 프로모터를 함유하는 DNA 발현 벡터는 또한 다양한 "강한" 전사 및(또는) 번역 개시 시그날의 임의의 조합을 함유할 수 있다. 예를 들어, 이. 콜리에서 효과적인 번역을 위해서는 리보솜 결합 부위를 제공하기 위하여 개시 코돈(ATG)의 5'에 약 7 내지 9개의 샤인-달가노(SD) 서열을 필요로 한다. 그러므로, 숙주 세포 리보솜에 의해 사용될 수 있는 임의의 SD-ATG 조합이 사용될 수 있다. 여기에 한정되는 것은 아니며 이러한 조합은 콜리파아지 람다의 cro 유전자 또는 N 유전자 또는 이. 콜리의 트립토판 E, D, C, B 및 A 유전자에서 얻어진 SD-ATG조합을 포함한다. 추가적으로 재조합 DNA 또는 합성 뉴클레오티드의 도입을 포함하는 다른 기술에 의해 제조된 SD-ATG 조합이 사용될 수 있다.
과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 단리된 DNA분자는 일단 발현 시스템내로 클론되면 숙주 세포내로 용이하게 도입된다. 이런 도입은 벡터/숙주세포 시스템의 종류에 따라 상기한 여러 형태의 형질 전환에 의해 수행될 수 있다. 적합한 숙주 세포로는 이에 한정되는 것은 아니며 박테리아, 바이러스, 효모, 포유동물 세포, 곤충, 식물 등을 포함한다.
본 발명의 방법은 병원균 내성을 부여하기 위하여 여러 종류의 식물을 처리하는 데 사용될 수 있다. 적합한 식물은 쌍떡잎 식물 및 외떡잎 식물을 포함한다. 더 바람직하게는 유용한 농작 식물로는 쌀, 밀, 보리, 밀, 목화, 해바라기, 땅콩, 옥수수, 감자, 고구마, 콩, 완두콩, 상추, 양상추, 양배추, 콜리플라워, 브로콜리, 터닙, 무, 시금치, 양파, 마늘, 가지, 후추, 셀러리, 당근, 호박, 주키니, 오이, 사과, 배, 멜론, 딸기, 포도, 나무 딸기, 파인애플, 콩, 담배, 토마토, 소검 (sorghum) 및 사탕수수 등을 포함한다. 적합한 관상 식물의 예로는 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana), 세인트폴리아 (Saintpaulia), 페튜니아, 펠라고니움, 포인세티아, 크리산테뮴, 카네이션 및 지니아등이 있다.
본 발명에 의한 식물에 병원균 내성을 부여하는 방법은 바이러스, 박테리아 및 곰팡이를 포함하는 다양한 병원균에 대한 내성을 부여하는 데 유용하다.
그 중에서도 특히 다음의 바이러스, 즉 담배 모자이크 바이러스 및 토마토 모자이크 바이러스에 대한 내성이 본 발명의 방법에 의해 수행될 수 있다.
그 중에서도 특히 다음의 박테리아, 즉 수도모나스 솔란시아룸 (Pseudomonas solancearum), 수도모나스 시린게 pv 타바시 (Pseudomonas syringae pv. tabaci) 및 크산타모나스 캄페스트리스 pv. 펠라고니 (Xanthamonas campestris pv. pelargonii)에 대한 내성은 본 발명의 방법에 의해 식물에 부여될 수 있다.
그 중에서도 특히 다음의 곰팡이, 즉 푸사리움 옥시스포럼 (Fusarium oxysporum) 및 피토프토라 인페스탄스 (Phytophthora infestans)에 대해 본 발명의 방법을 사용하여 식물이 내성으로 될 수 있다.
본 발명의 방법은 처리되는 식물의 일부분 또는 전체에 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질을 적용하기 위한 여러 가지 방법을 통해 수행될 수 있다. 식물내로 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질을 삽입시키는 것을 반드시 필요로 하지는 않지만 포함할 수 있다. 적절한 적용 방법으로는 유도체를 적용하고 그 직후의 높은 또는 낮은 압력 분무법, 주입 및 잎 마찰법을 포함한다. 기타 적절한 사용법은 식물의 세포와 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질의 접촉을 효과있게 할 수 있는 당업자에 의해 유추될 수 있다.
과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질은 본 발명에 따라 단독으로 식물에만 또는 다른 물질들과 혼합하여 식물에 사용될 수 있다.
본 발명의 일면은 담체 내에 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질을 함유하는, 식물에 병원균 내성을 부여하기 위한 조성물을 포함한다. 적절한 운반체로는 물 또는 수용액을 포함한다. 본 실시예에서 조성물은 500 nM 이상의 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질을 함유한다.
반드시 필요한 것은 아니지만, 이 조성물은 추가적으로 비료, 살충제, 살균제 및 이들의 혼합물을 포함하는 첨가제를 함유할 수 있다. 적절한 비료로는 (NH4)2NO3이다. 적절한 살충제는 말라티온이다. 적절한 살균제로는 켑탄이다.
다른 적절한 첨가제로는 완충용액, 습윤제 및 마모 촉진제 등을 포함한다. 이들 물질은 본 발명의 방법을 용이하게 할 수 있게 하기 위하여 사용될 수 있다.
<실시예 1>
남부 박테리아 입고병에 대한 토마토의 하르핀(Harpin)-유도 내성(수도모나스 솔란시아룸)
온실에서 재배한 8ㅧ15 ㎝의 2주일 된 토마토 묘목을 다음과 같이 처리하였다. 20가지의 식물이 아래에 기술되어 있는 A에서 F로 표시된 여섯 단계를 위하여 사용되었다:
(A) 200 ㎍/㎖의 조원료 하르핀 제제 (즉, 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질) (Z-M. Wei, "Harpin, Elicitor of the Hypersensitive Response Produced by the Plant Pathogen Erwinia amylovora," Science 257:85-88 (1992), 본원에 참조문헌으로 인용됨) 중 약 100 ㎕를 각 묘목의 최하부 진피내로 삽입시킨다.
(B) (A)에서 사용된 동일한 하르핀 제제를 묘목의 잎 표면위에 400-메쉬의 카보런덤과 함께 분무하였고 엄지 손가락으로 부드럽게 문질렀다.
(C) 이. 콜리 DH5 (pCPP430)를 OD620= 0.7까지 LB 배지에서 배양시켰다 (도 1의 플라스미드 벡터 pCPP430의 맵 참조). 배양균을 원심분리하였고 5mM의 pH 6.5인 인산 칼륨 완충액에 재현탁시켰다. 세포 현탁액 약 100 ㎕를 묘목의 각 잎 속으로 삽입시켰다.
(D) 이. 콜리 DH5 (pCPP430::hrpN-) (도 1의 플라스미드 벡터 pCPP430::hrpN-의 맵 참조)를 (C)에서처럼 사용하였다. 세포를 배양하였고 (C)에서 기술된 것과 동일한 현탁액과 접종물양을 사용하였다.
(E) 이. 콜리 DH5(pCPP9)(도2 참조)의 경우 세포를 배양하였고 사용된 현탁액과 접종물의 양은 (C)에서 기술된 것과 같다.
(F) 5 mM인 인산 칼륨 완충액을 사용한 잎의 삽입은 (C)에서 기술한 바와 같다.
면역원 병원균 박테리아인 수도모나스 솔란시아룸 균주 K60을 OD620= 0.7(약 108 cfu/㎖)이 될 때까지 킹스 (King's) 배지 B에서 배양시켰다. 배양액을 원심 분리시키고 5 mM의 인산 칼륨 완충액 100배 부피에 재현탁시켜 최종 농도가 약 1ㅧ106 cfu/㎖이 되도록 하였다.
토마토 묘목을 하르핀 또는 박테리아로 처리하고 3 일 후, 뽑아서 뿌리를 약1㎝ 정도 가위로 절단하였다. 묘목을 3분 동안 피. 솔란시아룸 K60 현탁액에 침지시켰다. 접종된 식물을 같은 화분에 다시 심었다. 식물을 온실에 두었고 질병 발생을 접종 7일 후에 기록하였다.
A. 하르핀 처리 효과
24시간 후 하르핀 또는 이. 콜리 DH5 (pCPP430)이 삽입된 잎 부분만이 파괴되었다. 하르핀과 카보런덤으로 분무된 잎은 단지 반점이 있는 괴사 (necrosis)만을 보였다.
B. 남부 박테리아 입고병의 발생에 있어 하르핀 처리 효과
P. 솔란시아룸 K60으로 접종하고 1주일 후 하르핀을 삽입한 20개의 식물중에 어느 것도 어떤 증상도 보이지 않았다 (표 1). 20 개의 식물중 하나가 발육 장애 증상을 보였다. 그러나, 완충액이 삽입된 20 개의 식물중 7 개는 발육 장애 증상을 보였다. 이. 콜리 DH5(pCPP430-) (과민 붕괘를 유도할 수 없는 전이-인자 유도된 돌연변이체) 또는 이. 콜리 DH5(pCPP9)를 처리한 것은 완충액을 처리한 식물과 비교하여 큰 차이를 보이지 않았다. 이러한 결과는 하르핀 또는 하르핀을 생산하는 이. 콜리 DH5(pCPP430)이 토마토 식물에서 P. 솔란시아룸 K60에 의하여 유발되는 남부 박테리아 입고병에 대한 내성을 유도한다는 것을 제시한다.
P. 솔란시아룸 K60으로 접종시키고 7일 및 14일후의 토마토 묘목의 질병 발생
식물의 수
7일 후 14일 후
처리 발육 장애 건강한 것 발육 장애 건강한 것
A.하르핀 처리 0 20 2 18
B.하르핀 분무 1 19 3 17
C.이.콜리DH5(pCPP430) 2 18 3 17
D.이.콜리DH5(pCPP430-) 4 16 7 13
E.이.콜리DH5(pCPP9) 5 15 6+1 입고병 13
완충액 7 13 8+1 입고병 11
병원균처리안함 0 20 0 20
접종 4주 후, 하르핀 또는 이.콜리 DH5 (pCPP430)으로 처리된 식물은 완충액으로 처리된 식물보다 키도 크고 굵었다. 하르핀 또는 완충액을 투입시킨 10개의 식물의 평균 키가 표 2에 나타나 있다.
P. 솔란시아룸 K60으로 접종시키고 하르핀 또는 완충액으로 처리시킨 4주 후의 토마토 묘목의 키(㎝)
완충액 투입, 접종 안함 하르핀 투입, K60 접종 완충액 투입, K60접종
36 32 11
41 29 21
35 38 33
34 35 12
39 37 15
35 33 32
36 22 25
35 35 15
41 40 37
37 29 38
평균 36.9 평균 33 평균 23.9
<실시예 2>
남부 박테리아 입고병에 대한 토마토의 하르핀(Harpin)-유도 내성(수도모나스 솔란시아룸)
투입과 접종을 위해 사용된 방법은 피. 솔란시아룸 K60의 농도가 약 5ㅧ104 cfu/㎖라는 것을 제외하고는 실시예 1에서와 같다.
완충액 투입된 식물은 P. 솔란시아룸 K60으로 접종한 15일 후에 증상을 보였다. 20 개의 식물 중 6 개가 15 일 후에 발육 장애를 나타내었고 2 개의 식물만이 21 일 후에 입고병을 보였다. 입고병에 걸린 식물은 결국 죽었다. 그러나, 20개의 하르핀 처리된 식물 중 어느 것도 발육 장애를 보이는 것은 없었다. 접종 3주 후 하르핀 처리된 식물 20개 중 3개가 발육 장애를 보였다. 3주 후 식물은 유도된 내성을 상실할 수도 있음을 보인다. 처음의 실험에서 하르핀 처리된 식물은 완충액 처리된 식물보다 두께와 키에서 더 컸다.
<실시예 3>
남부 박테리아 입고병에 대한 토마토의 하르핀(Harpin)-유도 내성(수도모나스 솔란시아룸)
처리된 토마토 식물을 포함하는 포트에 P. 솔란시아룸 K60로 추가적으로 접종을 하는 것을 제외하고는 실시예 1과 유사하다.
하르핀을 2 주차 된 토마토 묘목에 투입하였다. 각 식물의 두 개의 패널(panel)로 농도가 약 200 ㎍/㎖인 상태로 인산 철 완충액에 현탁되어 있는 약 200㎕의 하르핀이 투입되었다. 20개의 토마토 묘목 전체에 투입하였다. 동일한 수의 토마토 묘목에 완충액을 투입하였다. 2일 후, 식물의 뿌리를 담구어서 P. 솔란시아룸 K60를 접종하였다. 하르핀 또는 완충액이 투입된 식물을 토양 혼합물로부터 들어내어 소량의 뿌리를 가위로 절단하였고 나머지 뿌리는 3분 동안 P. 솔란시아룸 K60 현탁액에 담구었다. 박테리아 세포 현탁액의 농도는 약 5ㅧ108 cfu/㎖ 이었다. 묘목을 동일한 포트에 다시 심었다. 박테리아 현탁액 3㎖를 추가로 각각의 4 인치의 포트(pot: 화분)의 토양에 추가하였다. 질병 발생을 1주일 후 측정하였다. 모든 실험은 온도를 조절하면서 온실에서 실시하였다.
3주 후, 20개의 완충액 투입 토마토 식물중에 11개가 죽었고 입고병이 있던 2개의 식물은 회복되었으며 나머지들은 심각한 발육 장애를 보였다. 단지 4개의 식물만 비접종된 토마토와 비교하여 정상적인 성장을 하였다. 그러나, 하르핀 처리된 식물은 건강하였고 3개의 식물은 발육 장애를 보였고 2개의 식물은 접종 3주 후에 입고병에 걸렸다. 이러한 결과는 아래 표 3에 정리하였다.
P. 솔란시아룸 K60에 의해 발생한 박테리아 입고병에 대한 토마토의 하르핀-유도 내성
접종 후 주차(weeks)
처리 1 주 후 2 주 후 3 주 후
하르핀
건강한 것 20 17 15
입고병 0 1 2
발육장애 0 2 3
완충액
건강한 것 8 5 4
입고병 8 12 13
발육장애 4 3 3
<실시예 4>
담배 모자이크 바이러스에 대한 담배의 하르핀-유도 내성
4 주차의 담배 묘목 (재배종, Xanthi, N 유전자 함유)의 낮은 위치의 잎의 하나의 판넬로 200 ㎍/㎖의 농도의 E. 아밀로보라 하르핀이 투입되었다. 3일 후 식물들을 담배 모자이크 바이러스("TMV")로 감염시킨다. 두 가지 농도(5 ㎍ 및 100 ㎍/㎖)의 바이러스가 사용되었다. 약 50 ㎕의 바이러스 현탁액을 하나의 담배 잎 상부에 뿌렸다. 잎에 400-메쉬의 카보런덤을 묻혀 잎을 부드럽게 문질렀다. 각 농도에서 3개의 식물을 실험하였다. 괴사 병변을 접종 4일 후 계수하였고 세 잎의 평균 수를 표4에 기록하였다. 일부 괴사 병변은 서로 합쳐지기 때문에 10일 후의 각각의 장애는 구별하기가 어렵다. 그러므로 기록된 병변의 수는 7일차에 기록된 것보다 적게 보일 수도 있다. 완충액이 처리된 잎에서의 괴사 병변의 크기는 하르핀 처리된 잎의 것보다 많이 크다.
5 ㎍/㎖의 바이러스로 접종된 TMV에 대한 담배의 하르빈-유도 내성
병변의 평균수/잎
처리 4일 7일 10일
하르핀 21 32 35
완충액 67 102 76
담배 바이러스 접종 농도가 100 ㎍/㎖인 경우 하르핀 처리된 담배 및 완충액 처리된 담배에서 발생하는 국부적 장애의 수에 있어서는 커다란 차이가 없었다.
<실시예 5>
푸사리움 입고병에 대한 토마토의 하르핀-유도 내성
6주된 토마토 식물을 실시예 3에서 기술된 것과 같이 하르핀으로 처리하였다. 진균류 병원균인 푸사리움 옥시스포럼 (Fusarium oxysporum)을 리마 빈 아가(Lima bean agar) 배지에서 27℃에서 5일 동안 배양하였다. 균사를 갖는 두 개의 완전 아가 플레이트를 20 ㎖의 5 mM의 인산 칼륨 완충액에서 2분 동안 혼합하였다. 하르핀 또는 완충액으로 처리된 토마토 식물의 뿌리를 포트의 토양 속으로 찔러 넣음으로써 상처를 가하였다. 이후, 4 인치 포트 각각의 토양에 진균 현탁액 3㎖를 부었다. 접종된 식물을 하루에 16시간 정도의 햇빛을 볼 수 있고 24℃를 유지하는 환경이 조절되는 방에 놓아두었다. 접중 7일 후 질병 발생을 기록하였다. 각각의 처리는 10개의 식물에 적용시켰으며 그 결과는 아래 표5와 같다.
토마토의 푸사리움 입고병에 대한 하르핀 또는 완충액처리의 효과
접종후 다음 기간에서 입고병 증상을 보이는 식물의 수 (10개 중에서)
처리 7일 10일 15일 20일
하르핀 1 2 4 4(1개 죽음)
완충액 3 6 7 7(4개 죽음)
<실시예 6>
담배 들블병에 대한 담배의 하르핀-유도 내성(P. syringae pv. tabaci)
20 ㎝ 높이의 4주차 담배 식물의 하단부 잎의 하나의 판넬로 하르핀이 투입되었다. 3일 후 P. 시린게 pv. 타바시의 현탁액을 상단부 잎의 하나의 판넬로 투입시켰다. 4일 후 질병 발생을 기록하였고 이는 표 6과 같다.
하르핀으로 하단부 잎을 처리한 후, P. 시린게 pv. 타바시를 접종한 토바코 잎에서 담배 들블병에 의한 감염 증상
P. S. 타바시의 농도 하르핀 처리 하르핀 비처리
104 cfu/ml 증상 없음 회저성 및 물흡수
105 cfu/ml 증상 없음 회저성 및 물흡수
106 cfu/ml 증상 없음 회저성 및 물흡수
107 cfu/ml 증상 없음 회저성 및 물흡수
108 cfu/ml 회저성 회저성 및 물흡수
<실시예 7>
박테리아 잎무늬병 (크산타모나스 캄페스트리스 pv. 펠라고니)에 대한 제라늄 (Pelargonium hortorum)의 하르핀-유도 내성
본 실험은 온실에서 인공 토양 혼합물로 된 4 인치 또는 6 인치의 포트에서 자란 제라늄의 뿌리를 절단하여 실시하였다. 각 식물의 하단부 잎에 pH가 6.5인 0.05 M의 인산 칼륨 완충액 (대조구) 또는 하르핀 또는 이. 콜리 DH5 (pCPP430) 현탁액을 침투시켰다. 2일 내지 7일 동안 투입을 시키고 모든 식물을 박테리아 잎 얼룩 병원균인 크산토모나스 캄페스트리스 pv. 펠라고니의 순수 배양액으로 접종을 하였다. 박테리아 현탁액 (5ㅧ106 cfu/ml)을 저압에서 식물의 상부 측 및 하부측의 잎 표면에 분무하였다. 각각의 처리는 표 7에서 A 와 B로 표시된 2개의 식물에 적용되었다. 식물들은 폐쇄된 방에 48시간 동안 시원한 안개 발생기에 의해 충분한 안개가 공급되는 상태로 보관되었다. 이후, 식물을 질병의 발생이 감지되기 전까지 23℃ 내지 32℃의 온도로 10일간 주위의 습도 및 온도에 노출되도록 온실의 벤치에 보관하였다.
제라늄의 박테리아 잎 얼룩병의 발생에 있어서 하르핀 및 어위니아 아밀로보라의 hrp 유전자군의 효과
처리와 크산타모나스 켐페스트리스 pv. 펠라고니로 접종한 시간 차이
처리 7일 5일 4일 3일 2일
식물 A B A B A B A B A B
완충액 3* 5 5 4 3 2 4 3 4 5
하르핀 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0
DH5(pCPP430) 0 0 NT NT 0 0 0 1 1 0
* 접종 10일 후 질병 증상(명백한 괴사, 백화 현상 또는 시들음)을 보이는 잎의 수
<실시예 8>
수도모나스 시린게 pv. 타바시에 의해 발생하는 들불병에 대한 내성을 유도하는 여러 가지 하르핀의 활성
담배 식물(니코티아나 타바쿰 var. 크산티)은 온실에서 재배하였다. 4주차의 각 식물의 하단부 잎의 하나의 판넬속으로 하르핀 제제를 투입시켰다. 12개의 식물들을 각각의 하르핀 제제로 처리하였고 하르핀을 준비하기 위하여 사용된 동일한 인산 칼륨 완충액으로 3개의 식물을 처리하였다. 과민 회저병은 하르핀 제제가 투입된 잎의 판넬에서 24시간 내에 발생하였다. 그러나 완충액이 처리된 것에서는 발생되지 않았다.
하르핀 처리 7, 10, 11 및 12일 후, 모든 식물은 상단부 잎의 투입 판넬을 통하여 104 내지 106세포/ml의 수도모나스 시린게 pv. 타바시 현탁액으로 접종하였다. 식물들은 온실에서 7일 동안 질병 발생이 감지되기 전까지 배양되었다. 그 결과는 표 8에서와 같다.
하르핀 출처 처리와 접종의 시간 차이(days)
12 11 10 7
log(접종) 4 5 6 4 5 6 4 5 6 4 5 6
무(완충액) + + ++ + + ++ + + ++ + + ++
P.시린게 - - + - - + - - + - - +
E.크리산테미 - - + - - + - - + - - +
E.아밀로보라 - - + - - - - - + - - +
-는 증상 없음
+는 들블병의 전형적인 황색 색무리를 갖는 회저병
++는 들불병의 전형적인 황색 색무리를 갖는 심한 회저병
그 결과 3 가지의 박테리아에서의 하르핀 제제는 들불병 병원균에 대한 내성 유도에 유효함을 나타내었다. 어느 한쪽의 하르핀만을 처리한 식물은 접종 농도가 낮을 경우에는 증상을 보이지 않았다. 높은 농도에서는 완충액을 처리한 식물이 하르핀을 처리한 식물보다 증상이 더 심했다.
<실시예 9>
피토프토라 인페스탄스 (Phytophtora infestans)에 의해 발생되는 후발 동고병에 대한 하르핀 유도 내성
후발 동고병은 감자 및 토마토에게 주로 해를 입힌다. 이는 지독한 아일랜드 감자 기근 현상의 주 원인이었다. 이 병원균에 대한 내성 유도에 있어서 하르핀의 활성을 온실에서 자란 토마토 묘목을 사용하여 실험하였다. 3주 된 묘목 (재배종, "Mama Mia" 높이 약 6 내지 8 인치)에 하르핀을 처리하고 계속하여 피토프토라 인페스탄스로 접종하였다. 각 식물의 하단부 잎의 두 개의 판넬을 통하여 하르핀 용액, 하르핀을 생산하거나 분비하는 이. 콜리 DH5 (pCPP430) 현탁액 또는 인산 칼륨 완충액을 투입하였다.
투입후 2, 3 또는 4 일 지나서 피토프토라 인페스탄스의 균사 현탁액으로 접종하였다. 토마토에 굉장히 유독한 균주 U.S. 7을 사용하였다. 균사 현탁액은 2개의 보리-옥수수 아가 배지를 부드럽게 혼합하여 만들었고, 곰팡이가 그 위에서 21℃에서 2주 동안 성장하였다. 처리된 식물당 하나의 잎의 윗면과 아랫면에 이 현탁액을 미술용 넓은 붓으로 바른다.
처리되고 접종된 식물을 높은 상대 습도를 유지하면서 온실에서 20℃ 내지 23℃의 온도를 유지하도록 특수 제작된 안개실에서 배양하였다. 수분은 정제된 물로 최대의 속도로 작동하는 여러 개의 시원한 안개 발생기에 의해 제공되었다. 피토프토라 인페스탄스로 접종한 13일 후 질병 발생을 조사하였으며 그 결과는 표 9와 같다. 각각의 처리는 4개의 식물 각각에 적용하였다.
접종 13일 후 토마토 앞에 존재하는 후발 동고병 장애 수
처리 처리와 접종 사이의 기간(days)
4 3 2
식물 A B C D A B C D A B C D
완충액 3 2 0 0 1 2 2 0 0 0 4 1
하르핀 0 0 1 0 0 0 0 1 2 1 0 0
DH5(pCPP430) 0 0 0 1 0 2 2 1 0 1 1 0
하르핀으로 처리한 경우 처리와 접종 사이의 기간이 어떠하든지 식물에서 발생하는 장애의 수가 줄었다. 후발 동고병으로 인한 장애의 수도 하르핀을 생산 또는 분비하는 DH5(pCPP430)로 전처리 함으로써 줄어들었다.
본 발명은 설명을 목적으로 상세하게 기술되었지만 이렇게 상세한 것은 단지 설명을 위한 것으로 이해되어야 하며 당업자들에 의해서는 다음의 청구항에 정의한 본 발명의 범위와 정신에 벗어남이 없이 다양한 변형이 가능하다.
서열 목록
(1) 일반 정보
i) 출원인: 코넬 리서치 파운데이션, 인크.
ii) 발명의 명칭: 식물에 있어서 과민 반응으로 유도된 내성
iii) 서열의 수: 9
iv) 연락 주소:
A. 수신인: 닉슨, 하그레이브, 데븐스 앤드 도일레 엘엘피
B. 스트리트: 클린튼 스퀘어, 피.오. 박스 1051
C. 시: 로체스터
D. 주: 뉴욕
E. 국가: 미국
F. 우편번호: 14603
v) 사용된 컴퓨터 종류
A. 미디엄 타입: 플로피 디스켓
B. 컴퓨터: 호환성 있는 IBM PC
C. 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS
D. 소프트 웨어: 페이턴트 인 릴리즈#1.0, 버전 #1.30
vi) 현재 출원 자료
A. 출원 번호:
B. 출원일:
C. 분류:
vii) 선출원 자료:
A. 출원 번호: 미국 08/475,775
B. 출원일: 1995년 6월 7일
viii) 변리사/에이젼트 정보:
A. 성명: 골드만, 마이클 엘.
B. 등록 번호: 30,727
C. 참조/도켓 번호: 19603/10051
ix) 원거리 통신 정보:
A. 전화: (716) 263-1304
B. 팩스: (716) 263-1600
(2) 서열 동정 번호 1:
I) 서열 특징:
A 길이: 338 아미노산
B. 타입: 아미노산
C. 나선:
D. 형태: 1차 구조(linear)
ii) 분자 타입: 단백질
xi) 서열도: 서열 동정 번호 1:
(2) 서열 동정 번호 2:
i) 서열 특징:
A 길이: 2141 염기쌍
B. 타입: 핵산
C. 나선: 단일 가닥
D. 형태: 1차 구조
ii) 분자 타입: DNA(게놈)
xi) 서열도: 서열 동정 번호 2:
(2) 서열 동정 번호 3:
i) 서열 특징:
A 길이: 385 아미노산
B. 타입: 아미노산
C. 나선:
D. 형태: 1차 구조
ii) 분자 타입: 단백질
xi) 서열도: 서열 동정 번호 3:
(2) 서열 동정 번호 4:
i) 서열 특징:
A 길이: 1158 염기쌍
B. 타입: 핵산
C. 나선: 단일 가닥
D. 형태: 1차 구조
ii) 분자 타입: DNA (게놈)
xi) 서열도: 서열 동정 번호 4:
(2) 서열 동정 번호 5:
i) 서열 특징:
A 길이: 341 아미노산
B. 타입: 아미노산
C. 나선:
D. 형태: 1차 구조
ii) 분자 타입: 단백질
xi) 서열도: 서열 동정 번호 5:
(2) 서열 동정 번호 6:
i) 서열 특징:
A 길이: 1026 염기쌍
B. 타입: 핵산
C. 나선: 단일 가닥
D. 형태: 1차 구조
ii) 분자 타입: DNA (게놈)
xi) 서열도: 서열 동정 번호 6:
(2) 서열 동정 번호 7:
i) 서열 특징:
A 길이: 344 아미노산
B. 타입: 아미노산
C. 나선:
D. 형태: 1차 구조
ii) 분자 타입: 단백질
xi) 서열도: 서열 동정 번호 7:
(2) 서열 동정 번호 8:
i) 서열 특징:
A 길이: 1035 염기쌍
B. 타입: 핵산
C. 나선: 단일 가닥
D. 형태: 1차 구조
ii) 분자 타입: DNA (게놈)
xi) 서열도: 서열 동정 번호 8:
(2) 서열 동정 번호 9:
i) 서열 특징:
A 길이: 26 아미노산
B. 타입: 아미노산
C. 나선:
D. 형태: 1차 구조
ii) 분자 타입: 펩티드
xi) 서열도: 서열 동정 번호 9:

Claims (27)

  1. 폴리펩티드 또는 단백질이 식물 세포에 접촉하는 조건하에서, 어위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora), 어위니아 크리산테미(Erwinia chrysanthemi), 수도모나스 시린게(Pseudomonas syringae), 수도모나스 솔란시아룸(Pseudomonas solancearum), 크산토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris)
    및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 병원균에서 유래된 비감염성 형태의 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질을 식물에 적용하는 것을 포함하는, 식물에 병원균 내성을 부여하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질은 어위니아 크리산테미에서 유래된 것에 해당되는 것인 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질은 서열 동정 번호 1에 해당되는 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
  4. 제 2항에 있어서, 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질은 분자량이 34kDa인 것인 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질은 어위니아 아밀로보라에서 유래된 것에 해당되는 것인 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질은 서열 동정 번호 3에 해당되는 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
  7. 제 5항에 있어서, 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질은 분자량이 37kDa인 것인 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질은 수도모나스 시린게에서 유래된 것에 해당되는 것인 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질은 서열 동정 번호 5에 해당되는 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
  10. 제 8항에 있어서, 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질은 분자량이 34-35kDa인 것인 방법.
  11. 제 1항에 있어서, 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질은 수도모나스 솔란시아룸에서 유래된 것에 해당되는 것인 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질은 서열 동정 번호 7에 해당되는 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
  13. 제 1항에 있어서, 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질은 크산토모나스 캄페스트리스에서 유래된 것에 해당되는 것인 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질은 서열 동정 번호 9에 해당되는 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
  15. 제 1항에 있어서, 식물은 쌍떡잎 및 외떡잎 식물로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 식물은 쌀, 밀, 보리, 호밀, 목화, 해바라기, 땅콩, 옥수수, 감자, 고구마, 콩류(bean), 완두콩, 치커리(chicory), 상추, 양상추, 양배추, 콜리플라워, 브로콜리, 터닢, 무, 시금치, 양파, 마늘, 가지, 후추, 셀러리, 당근, 스콰시(squash), 호박, 주키니, 오이, 사과, 배, 멜론, 딸기, 포도, 나무 딸기, 파인애플, 콩(soybean), 담배, 토마토, 소검(sorghum) 및 사탕수수로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  17. 제 15항에 있어서, 식물은 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 세인트폴리아(Saintpaulia), 페투니아(Petunia), 펠라고니움(Pelargonium), 포인세티아(poinsettia), 크리산테뭄(chrysanthemum), 카네이션(carnation) 및 지니아(zinnia)로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  18. 제 1항에 있어서, 식물이 내성을 가진 병원균은 바이러스, 박테리아, 곰팡이 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  19. 제 1항에 있어서, 상기 적용은 상기 적용이 행해질 때와 가까운 시간에 분무, 주사 또는 잎의 마찰을 통해 수행되는 것인 방법.
  20. 제 1항에 있어서, 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질은 담체를 추가로 포함하는 조성물로서 식물에 적용되는 것인 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 운반체가 물과 수용액으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  22. 제 20항에 있어서, 조성물은 500 nM 초과의 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질을 함유하는 것인 방법.
  23. 제 20항에 있어서, 조성물은 비료, 살충제, 살균제 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 첨가제를 추가로 포함하는 것인 방법.
  24. 제 1항에 있어서, 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질은 단리된 형태인 방법.
  25. 제 1항에 있어서, 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질은 질병을 유발하지 않고 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자로 전환된 박테리아로서 적용되는 것인 방법.
  26. 제 1항에 있어서, 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질은 일부 식물종에서는 질병을 유발하지만 이미 상기 적용을 행한 식물에서는 질병을 유발하지 않고, 과민 반응 유도체 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 박테리아로서 적용되는 것인 방법.
  27. 제 1항에 있어서, 상기 적용은 식물내로 폴리펩티드 또는 단백질을 침투시키는 것인 방법.
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