MXPA00001201A - Inductor de respuesta de hipersensibilidad proveniente de pseudomonas syringae y su uso - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una proteína o polipéptido aislado que induce una respuesta de hipersensibilidad en plantas, asícomo una molécula de ADN aislado que codifica para la proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad. Esta proteína o polipéptido aislado y la molécula de ADN aislada, se pueden utilizar para impartir resistencia a enfermedades a plantas, para incrementar el crecimiento de plantas y/o para controlar insectos en plantas. Esto se puede lograr mediante la aplicación de la proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad , en una forma no infecciosa, a plantas o semillas de planta bajo condiciones efectivas para impartirle resistencia a enfermedades, para incrementar el crecimiento de plantas y/o para controlar insectos en las plantas o en las plantas crecidas a partir de las semillas de planta. Alternativamente, se pueden proporcionar plantas transgénicas o semillas de planta transgénicas transformadas con una molécula de ADN que codifica para una proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad y las plantas transgénicas o las plantas provenientes de las semillas de planta transgénicas se hacen crecer bajo condiciones efectivas para impartirles resistencia a enfermedades, para incrementar el crecimiento y/o para controlar insectos en las plantas crecidas a partir de las semillas de planta.

Description

INDUCTOR DE RESPUESTA DE HIPERSENSIBILIDAD PROVENIENTE DE PSEÜDCMONAS SYRINGAE Y SU USO CAMPO DE IA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un inductor de respuesta de hipersensibilidad proveniente de Psudomonas syringae y a su uso. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las interacciones entre patógenos bacterianos y sus huéspedes plantas, por lo general caen en dos categorías: (1) compatibles (patógeno-huésped) que causan crecimiento bacteriano intercelular, desarrollo de síntomas y desarrollo de enfermedad en la planta huésped; y (2) incompatibles (patógeno-no huésped) , dando como resultado la respuesta de hipersensibilidad, que es un tipo particular de interacción incompatible, sin síntomas de enfermedad progresiva. Durante las interacciones compatibles en las plantas huésped, las poblaciones bacterianas se incrementan drásticamente y se presentan síntomas progresivos. Durante las interacciones incompatibles, las poblaciones bacterianas no se incrementan y no se presentan síntomas progresivos. La respuesta de hipersensibilidad ("RH") es una necrosis rápida y localizada que está asociada con la defensa activa de las plantas contra numerosos patógenos REF.: 32707 (Kiraly, Z., "Defenses Triggered by the Invader: Hypersensitivity", páginas 201-224 en: Plant Disease: An Advanced Treatise, Vol, 5, J. G. Horsfall y E. B. Cowling, ed. Academic Press, Nueva York (1980); Klement, Z., "Hypersensitivity", páginas 149-177 en: Phytopathogenic Prokaryotes, Vol. 2, M. S. Mount y G. H Lacy, ed. Academic Press, Nueva York (1982) ) . La respuesta de hipersensibilidad inducida por bacterias se observa fácilmente como un colapso tisular si altas concentraciones (> 10 células/ml) de un patógeno de rango limitado de huéspedes tal como Pseudomonas syringae o Erwinia amylovora se infiltran en las hojas de plantas no huéspedes (la necrosis ocurre sólo en células de plantas aisladas a menores niveles de inoculo) (Klement, Z., "Rapid Detection of Pathogenicity of Phytopathogenic Pseudomonads", Nature 199: 299-300; Klement, et al . , "Hypersensitive Reaction Induced by Phytopathogenic Bacteria in the Tobacco Leaf", Phytopathology 54: 474-477 (1963); Turner, et al . , "The Quantitative Relation Between Plant and Bacterial Cells Involved in the Hypersensitive Reaction", Phytopathology 64: 885-890 (1974); Klement, Z., "Hypersensitivity", páginas 149-177, en Phytopathogenic Prokaryotes, Vol. 2, M.

S. Mount y G. H. Lacy, ed. Academic Press, Nueva York (1982)). Las capacidades de inducir la respuesta de hipersensibilidad en un no huésped y de ser patógeno en un huésped, parecen estar ligadas. Tal como observó Klement, Z., "Hypersensitivity", páginas 149-177, en Phytopathogenic Prokaryotes, Vol. 2, M. S. Mount y G. H. Lacy, ed. Academic Press, Nueva York, estos patógenos también causan necrosis fisiológicamente similares, aunque retardadas, en sus interacciones con huéspedes compatibles. Además, la capacidad de producir la respuesta de hipersensibilidad o patogénesis, depende de un conjunto común de genes, denominado hrp (Lindgren, P. B., et al . , "Gene Cluster of Pseudomonas syringae pv. "phaseolicola" Controls Pathogenicity of Bean Plants and Hypersensitivity on Nonhost Plants", J. Bacteriol. 168: 512-22 (1986); illis, D. K. et al . , "hrp Genes of Phytopathogenic Bacteria", Mol . Plant-Microbe Interact., 4: 132-138 (1991)). En consecuencia, la respuesta de hipersensibilidad puede guardar indicios tanto de la naturaleza de la defensa de la planta como del fundamento de la patogenicidad bacteriana. Los genes hrp están ampliamente distribuidos en patógenos gram negativos de plantas, en donde están agrupados, conservados y en algunos casos son intercambiables (Willis, D. K. et al . , "hrp Genes of Phytopathogenic Bacteria", Mol. Plant-Microbe Ineteract., 4: 132-138 (1991); Bonas, U., "hrp Genes of Phytopathogenic Bacteria", páginas 79-98, en: Current Topics in Microbiology and Immunology: Bacterial Pathogenesis of Plants and Animáis - Molecular and Celular Mechanisms, J. L. Dangl, ed. Springer-Verlag, Berlín (1994) ) . Varios genes iirp codifican para componentes de una ruta de secreción proteica similar a la usada por Yersinia, Shigella y Salmonella spp. para secretar proteínas esenciales en enfermedades animales (Van Gijsegem, et al . , "Evolutionary Conservation of Pathogenicity Determinants Among Plant and Animal Pathogenic Bacteria", Trends Microbiol, 1: 175-180 (1993) ) . En E. amylovora , P. syringae y P. solanacearum, los genes hrp se ha demostrado que controlan la producción y secreción de inductores de proteína ricos en glicina de la respuesta de hipersensibilidad (He, S. Y., et al . , 2Psudomonas Syringae pv. Syringae HarpinPss : a Protein that is Secreted via the Hrp Pathway and Elicits the Hypersensitive Response in Plants", Cell, 73: 1255-1266 (1993), Wei, Z.-H., et al . , "Hrpl of Erwinia amylovora Functions in Secretion of Harpin and is a Member of a New Protein Family", J. Bacteriol, 175: 7958-7967 (1993); Arlat, M. et al . , "PopAl, a Protein Which Induces a Hypersensitive-like Response on Specific Petunia Genotypes, is Secreted via the Hrp Pathway of Pseudomonas solanacearum", EMBO, J. 13: 543-553 (1994)). La primera de estas proteínas fue descubierta en E. amylovora Ea321, que es una bacteria que causa la roya de fuego de plantas rosáceas y fue designada como harpina (Wei, Z.-M., et al . , "Harpin, Elicitor of the Hypersensitive Response Produced by the plant Pathogen Erwinia amylovora" , Science, 257: 85-88 (1992)). Mutaciones en el gen hrpN codificante revelaron que la harpina es requerida por E. amylovora para inducir una respuesta de hipersensibilidad en hojas de tabaco no huéspedes y provocar los síntomas de la enfermedad en la pera, que es altamente susceptible. La proteína PopAl de P. solanacearum GMI1000 tiene propiedades físicas similares y también induce la respuesta de hipersensibilidad en hojas de tabaco, las cuales no son un huésped para esta cepa (Arlat, et al . , "PopAl, a Protein Which Induces a Hypersensitive-like Response on Sepecific Petunia Genotypes, is Secreted via the Hrp Pathway of Psudomonas solanacearum", EMBO J. 13: 543-53 (1994)). Sin embargo, las mutantes de P. solanacearum popA todavía inducen la respuesta de hipersensibilidad en el tabaco y provocan la enfermedad en el jitomate. Así pues, la función de estos inductores de la respuesta de hipersensibilidad ricos en glicina puede variar ampliamente entre patógenos gram negativos de las plantas. Otros inductores de la respuesta de hipersensibilidad patógenos para plantas han sido aislados, clonados y secuenciados. Estos incluyen: Erwinia chrysanthemi (Bauer, et al . , "Erwinia chrysanthemi HarpinEch: Soft-Rot Pathogenesis", MPMI 8 (4) : 484-91 (1995)); Erwinia carotovora (Cui, et al . , "The RsmA" Mutants of 'Erwinia carotovora subsp. carotovora Strain Ecc71 Overexpress rpNEcc and Elicit a Hypersensitive Reaction-like Response in Tobacco Leaves", MPMI 9 (7) : 565-73 (1966)); Erwinia stewartii (Ahmad, et al . , "Harpin is not Necessary for the Pathogenicity of Erwinia stewartii on Maize", 8th Intfl. Cong. Molec. Plant-Microb. ínter., Julio 14-19, 1996 y Ahmad, et ai., "Harpin is not Necessary for the Pathogenicity of Erwinia stewartii on Maize", Ann. Mtg. Am. Phytopath. Soc., Julio 27-31, 1996) ; y Psudomonas syringae pv. syringae (Publicación Internacional WO 94/26782 de Cornell Research Foundation, Inc.). La presente invención presenta avances en el esfuerzo de identificar, clonar y secuenciar proteínas o péptidos inductores de respuesta de hipersensibilidad provenientes de patógenos de plantas. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una proteína o polipéptido aislado que induce una respuesta de hipersensibilidad en plantas, así como a una molécula de ADN aislado que codifica para la proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad.

La proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad se puede utilizar para impartirle resistencia a la enfermedad a plantas, para incrementar el crecimiento de plantas y/o para controlar insectos. Esto involucra la aplicación de la proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad, en una forma no infecciosa, a plantas o semillas de plantas, bajo condiciones efectivas para impartir resistencia a la enfermedad, para incrementar el crecimiento de la planta y/o para controlar insectos en plantas o plantas que crecen a partir de las semillas. Como alternativa a la aplicación de la proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad a plantas o semillas de plantas con el "fin de impartirles resistencia a la enfermedad, .para incrementar el crecimiento de la planta y/o para controlar insectos en las plantas, se pueden utilizar plantas o semillas de planta transgénicas. Cuando se utilizan plantas transgénicas, esto involucra proporcionar una planta transgénica transformada con una molécula de ADN que codifica para una proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad y hacer crecer la planta bajo condiciones efectivas para impartirle resistencia a enfermedades, para incrementar el crecimiento de la planta y/o para controlar insectos en las plantas o plantas crecidas a partir de las semillas. Alternativamente, se puede proporcionar y plantar en el suelo una semilla de planta transgénica transformada con la molécula de ADN que codifica para la proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad. Después, la planta es propagada bajo condiciones efectivas para impartirle resistencia a enfermedades, para incrementar el crecimiento de la planta y/o para controlar insectos en las plantas o en las plantas crecidas a partir de las semillas. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra la inhibición de la RH inducida en tabaco por P. fl uorescens (pHIRll) mediante la expresión en células transformadas de P. syringae pv. tomato DC300 hrpW. A la izquierda se muestran derivados del vector pML 123 portadores de la región hrpW, dos de los cuales tienen inserciones O Spr en el sitio indicado. A la derecha se muestran los efectos en la hoja de tabaco de células de P. fluorescens portadoras de estas construcciones, 24 horas después de la inoculación a una Q concentración de 5 x 10 células/ml. Las Figuras 2A-C muestra un mapa físico de la región hrpW de P. syringae pv. tomato DC3000, su conservación con una región correspondiente en P. syringae pv. syringae B728a, y características estructurales de la HrpW. La Figura 2A muestra un mapa físico del genoma de DC3000 adyacente al grupo de genes hrp, en donde las 54 flechas blancas denotan promotores s putativos y las flechas negras denotan promotores HrpL-dependientes putativos que controlan las unidades transcripcionales previamente definidas (Lorang, J. M., et al . , Mol. Plant-Microbe Interact., 8: 49-57 (1995), la cual se incorpora en la presente como referencia) . Los genes hrpR y hrpS codifican para proteínas reguladoras y están localizados en el extremo derecho del grupo hrp. Los números en las cajas arriba del mapa indican el porcentaje de identidad del ADN de la cepa DC3000 con secuencias de ADN de la cepa B728A arreglada en colinearidad parcial. En la Figura 2B, el diagrama de HrpW indica los dominios similar al inductor de respuesta de hipersensibilidad y similar a pectato liasa ("Peí") . El fragmento del dominio inductor de respuesta de hipersensibilidad, dirigido contra Hisg, generado por subclona por RCP (Reacción en Cadena catalizada por Polimerasa) , abarca los aminoácidos 1-186; el dominio Peí dirigido a Hisß tiene los aminoácidos 187-425. La Figura 2C muestra la secuencia de la región en medio del HrpW que contiene 6 repeticiones ricas en glicina (véase la caja) , con repeticiones similares en las proteínas HrpZ provenientes de P. syringae pv. tomato ("Pto") y P. syringae pv. syringae ("Pss") alineadas abajo. Se introdujeron guiones cuando fue necesario para preservar el alineamiento. La Figura 3 muestra la hibridación del hrpW bajo condiciones altamente estrictas a ADN total de otros patógenos bacterianos de plantas. El ADN de los patógenos indicados fue aislado, digerido con EcoRI , separado en un gel de agarosa al 0.5%, transferido a una membrana Immobilon-N e hibridizado con una subclona de hrpW marcada con P a 62 °C. Abreviaturas: Pto, P. syringae pv. patomato; Psy, P. syringae pv. syringae; Pgy, P. syringae pv. glicinea; Ppp, P. syringae pv. papulans; Ppi, P. syringae pv. pisi ; Pph, P. syringae pv. phaseolicola; Pta, P. syringae pv. tabaci ; Pvf, P. viridi flava; Rso, Ralstonia solanacearum; Xam, Xanthomonas campestris pv. amoracieae; Xvs, X. campenstris pv. vesicatoria; Ea, Erwinia amylovora; Eca, E. carotovora ; Ech, E. chrysanthemi . Las Figuras 4A-B muestran el análisis de EGPA-DSS (Electroforesis en Gel de Poliacrilamida con Dsdecilsulfato de Sodio) e inmunoelectrotransferencia (inmunoblot) de preparaciones que contienen HrpW y su dominio inductor de respuesta de hipersensibilidad y fragmentos del dominio Peí. En la Figura 4A, el HrpW de longitud completa dirigido a HÍS6 y los dos fragmentos de dominio fueron parcialmente purificados por cromatografía Ni-NTA, se separaron por EGPA-DSS y se tiñeron con Azul de Coomassie R250. La flecha indica el HrpW de longitud completa, el cual es producido en cantidades muy bajas. Carriles: 1, fragmento del dominio Peí; 2, fragmento del dominio inductor de respuesta de hipersensibilidad; 3, HrpW. En la Figura ~4B, también se visualizaron los mismos derivados de HrpW en inmunoelectrotransferencias con anticuerpos anti-HrpW utilizados en conjunto con el ensayo de quimioluminiscencia de tipo Western-Light . Carriles: 4, fragmento del dominio Peí; 5, fragmento del dominio inductor de respuesta de hipersensibilidad; 6, HrpW. Las figuras 5A-5F, muestran la inducción en hojas de tabaco de muerte de tejido activo, indicativa de la RH por preparaciones libres de células que contienen HrpW y el fragmento N-terminal. Las preparaciones proteicas analizadas en la Fig. 4 se infiltraron en hojas de tabaco, en algunos casos con cloruro de lantano 1.0 mM. Las hojas fueron fotografiadas 48 horas después. Paneles: A., P. syringae pv. syringae 61 HrpZ (0.12 µg/ml); B, HrpW; C, fragmento del dominio harpina del HrpW (0.22 µg/ml); D, HrpZ + cloruro de lantano; E, HrpW + cloruro de lantano; F, fragmento del dominio Peí de HrpW (1.40 µg/ml).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una molécula de ADN aislada que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No. 1, tal como la siguiente: TCCACTTCGC TGATTTTGAA ATTGGCAGAT TCATAGAAAC GTTCAGGTGT OGAAATCAGG 60 CTGAGTGCGC AGATTTCGTT GATAAGGGTG TGGTACTGGT CATTGTTGGT CATTTCAAGG 120 CCTCTGAGTG CGGTGCGGAG CAATACCAGT CTTCCTGC G GCG GTGCAC ACTGAGTCGC 180 AGGCATAGGC ATTTCAGTTC CTTGCGTTGG TTGGGCATAT AAAAAAAGGA ACTTTTAAAA 240 ACAGTGCAAT GAGATGCCGG CAAAACGGGA ACCGGTCGCT GCGCTTTGCC ACTCACTTCG 300 AGCAAGCTCA ACCCCAAACA TCCACATCCC TATCGAACGG ACAGCGATAC GGCCACTTGC 360 TCTGGTAAAC CCTGGAGCTG GCGTCGGTCC AATTGCCCAC TTAGCGAGGT AACGCAGCAT -320 GAG ATCGGC ATCACACCCC GGCCGCAACA GACCACCACG CCACTCGATT TTTCGGCGCT 4 B C AAGCGGCAAG AGTCCTCAAC CAAACACGTT CGGCGAGCAG AACACTCAGC AAGCGATCGA 54 o CCCGAGTGCA CTGTTGTTCG GCAGCGACAC ACAGAAAGAC GTCAACTTCG GCACGCCCGA 600 CAGCACCGTC CAGAATCCGC AGGACGCCAG CAAGCCCAAC GACAGCCAGT CCAACATCGC eeo TAAATTGATC AGTGCATTGA TCATGTCGTT GCTGCAGATG CTCACCAACT CCAATAAAAA 720 GCAGGACACC AATCAGGAAC AGCCTGATAG CCAGGCTCCT TTCCAGAACA ACGGCGGGCT 780 CGGTACACCG TCGCCCGATA GCGGGGGCGG CGGTACACCG GATGCGACAG GTGGCGGCGG 840 CGGTGATACG CCAAGCGCAA CAGGCGGTGG CGGCGGTGAT ACTCCGACCG CAACAGGCGG 900 TGGCGGCAGC GsTGGCGGCG GCACACCCAC TGCAACAGGT GGCGGCAGCG GTGGCACACC 60 CACTGCAACA GGCGGTGCCG AGGGTGGCGT AACACCGCAA ATCACTCCGC AGTTGGCCAA 1020 CCCTAACCGT ACCTCAGGTA CTGGCTCGGT CTCGCACACC GCAGGTTCTA CCGAGCAAGC 1080 CGGCAAGATC AATGTGCTGA AAGACACCAT CAAGGTCGGC GCTGGCGAAG TCTTTGACGG 1140 CCACGGCGCA ACCTTCACTG CCGACAAATC TATGGGTAAC GGAGACCAGG GCGAAAATCA 1200 GAAGCCCATG TTCGAGCTGG CTGAAGGCGC TACGTTGAAG AATGTGAACC TGGGTGAGAA 1260 CGAGGTCGAT GGCATCCACG TGAAAGCCAA AAACGCTCAG GAAGTCACCA TTGACAACGT 1320 GCATGCCCAG AACGTCGGTG AAGACCTGAT TACGGTCAAA GGCGAGGGAG GCGCAGCGGT 1380 CACTAATCTG AACATCAAGA ACAGCAGTGC CAAAGGTGCA GACGACAAGG TTGTCCAGCT 1440 CAACGCCAAC ACTCACTT3A AAATCGACAA CTTCAAGGCC GACGATTTCG GCACGATGGT 1500 TCCCACCAAC GGTGGCAAGC AGTTTGATGA CATGAGCATC GAGCTGAACG GCATCGAAGC 1560 TAACCACGGC AACTTCGCCC TGGTGAAAAG CGACAGTGAC GATCTGAAG: TGGCAACGGG 1620 CAACATCGCC ATGACCGACG TCAAACACGC CTACGATAAA ACCCAGGCAT CGACCCAAC? 1680 CACCGAGCTT TGAATCCAGA CAAGTAGCTT GAAAAAAGGG GGTGGACTC 1729 Esta molécula de ADN se conoce como el gen dspE. Esta molécula de ADN aislada de la presente invención, codifica para una proteína o polipéptido que induce una respuesta de hipersensibilidad de patógeno de plantas, teniendo la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 2, tal como la siguiente: Met Ser lie Gly He Thr Pro Arg Pro Gln Gln Thr Thr Thr Pro Leu 1 5 10 15 Asp Phe Ser Ala Leu Ser Gly Lys Ser Pro Glp Pro Asn Thr Phe Gly 20 25 30 Glu Gln Asn Thr Gln Gln Ala He Asp Pro Ser Ala Leu Leu Phe Gly 35 40 45 Ser Asp Thr Gln Lys Asp Val Asn Phe Gly Thr Pro Asp Ser Thr Val 50 55 60 Gln Asn Pro Gln Asp Ala Ser Lys Pro Asn Asp Ser Gln Ser Asn He 65 70 7S 80 Ala Lye Leu He Ser Ala Leu He Met Ser Leu Leu Gln Met Leu Thr 85 90 95 Asn Ser Asn Lys Lys Glp Asp Thr Asn Gln Glu Gln Pro Asp Ser Gln 100 105 110 Ala Pro Phe Gln Asn ?sn Gly Gly Leu Gly Thr Pro Ser Ala Asp Ser 115 2.20 125 Gly Gly Gly Gly Thr Pro Asp Ala Thr Gly Gly Gly Gly Gly Asp Thr 130 135 140 Pro ser Ala Thr Gly Gly Gly Gly Gly Asp Thr Pro Thr Ala Thr Gly 145 150 155 160 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Pro Thr Ala Thr Gly Gly Gly 165 170 175 Ser Gly Gly Thr Pro Thr Ala Thr Gly Gly Gly Glu Gly Gly Val Thr 180 185 190 Pro sln He Thr Pro Gln Leu Ala Asn Pro Asn Arg Thr Ser Gly Thr 195 200 205 Gly Ser Val Ser Asp Thr Ala Gly Ser Thr Glu Gln Ala Gly Lys He 210 215 220 Asn Val Val Lys Asp Thr He Lys Val Gly Ala Gly Glu Val Phe Asp 225 230 235 240 Gly His Gly Ala Thr Phe Thr Ala Asp Lys Ser Met Gly Asn Gly Asp 24.5 250 255 Gln Gly Glu Asn Gln Lys Pro Met Phe Glu Leu Ala Glu sly Ala Thr 260 265 270 Leu Lys Asn Val Asn Leu Gly Glu A=n Glu Val Asp Gly He His Val 275 280 285 Lye Ala Lys Asn Ala Gln Glu Val Thr He Asp Asn Val His Ala ßln 290 295 300 Asn Val Gly Glu Asp Leu He Thr Val Lys Gly Glu Gly Gly Ala Ala 305 310 315 320 Val Thr Asn Leu Asn He Lys Asn Ser Ser Ala Lys Gly Ala Asp Asp 325 330 335 Lys Val Val Gln Leu Asn Ala Asn Thr His Leu Lys He A=p Asn Phe 340 345 350 Lys Ala Asp Asp Phe Gly Thr Met Val Arg Thr Asn Gly sly Lys Glp 355 360 365 Phe Asp Asp Met Ser He Glu Leu Asp Gly He Glu Ala Asn Has Gly 370 375 380 Lys Phe Ala Leu Val Lys Ser Asp Ser Asp Asp Leu Lys Leu Ala Thr 385 390 395 00 Gly Asn He Ala Met Thr Asp Val Ly= His Ala Tyr Asp Lys Thr Gln 405 410 415 Ala Ser Thr Glp His Thr Glu Leu 420 Esta proteína o polipéptido es de aproximadamente 42.9 kDa. Los fragmentos del polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad anterior, quedan abarcados dentro de la presente invención. Se pueden producir fragmentos adecuados por varios medios. En el primero, subclonas del gen que codifica para la proteína inductora de la presente invención, se producen mediante manipulación genética molecular convencional, subclonando fragmentos genicos. Después, las subclonas se expresan in vitro o in vivo en células bacterianas para obtener una pequeña proteína o péptido, el cual se puede probar con respecto a la inducción de actividad de conformidad con el procedimiento que se describe más adelante. Como alternativa, se pueden producir fragmentos de una proteína inductora por digestión de una proteína inductora de longitud completa con enzimas proteolíticas, tales como qu i iotripsina o proteinasa A de Staphylococcus, o tripsina. Es probable que las diferentes enzimas proteolíticas rompan a las proteínas inductoras en diferentes sitios, basándose en la secuencia de aminoácidos de la proteína inductora . Algunos de los fragmentos que se obtienen de la proteolisis, pueden ser inductores activos de resistencia . En otro enfoque, basándose en el conocimiento de la estructura primaria de la proteína, se pueden sintetizar fragmentos del gen de la proteína inductora utilizando la técnica RCP, j unto con conjuntos específicos de cebadores , seleccionados para representar porciones particulares de la proteína . Posteriormente, estos fragmentos se pueden clonar en un vector apropiado para incrementar la expresión de un péptido o proteína truncada . También se puede utilizar la síntesis química para preparar fragmentos adecuados. Tal síntesis se lleva a cabo utilizando secuencias de aminoácidos conocidas del inductor que se está preparando. Alternativamente, se somete un inductor de longitud completa a altas temperaturas y presiones, lo cual producirá fragmentos . Después, estos fragmentos se pueden separar por los procedimientos convencionales (e.g. , cromatografía, EGPA-DSS) . Así mismo (o alternativamente) se pueden modificar variantes , por ej emplo, mediante la deleción o adición de aminoácidos que tengan una influencia mínima sobre las propiedades, estructura secundaria y naturaleza hidropática del polipéptido. Por ejemplo, un polipéptido se puede conjugar con una secuencia de señal (o líder) en el extremo N-terminal de la proteína, lo cual dirige, durante o después de la traducción, la transferencia de la proteína. El polipéptido también se puede conjugar con un ligando u otra secuencia para facilitar la síntesis, purificación o identificación del polipéptido. Las moléculas de ADN adecuadas son aquellas que se hibridizan con una molécula de ADN que comprende una secuencia nucleotídica de la SEQ ID No. 1, bajo condiciones estrictas. Un ejemplo de tales condiciones altamente estrictas adecuadas es cuando la hibridación se lleva a cabo a 65°C durante 20 horas, en un medio que contiene NaCl 1 M, Tris-HCl 50 mM, pH 7.4, AEDT 10 mM, dodecilsulfato de sodio al 0.1%, ficol al 0.2%, polivinilpirrolidona al 0.2%, albúmina sérica bovina al 0.2%, 50 µg/ml de ADN de E. coli . Sin embargo, cualquier molécula de ADN que se hibridice con una molécula de ADN que comprenda la secuencia nucleotídica de la SEQ ID No. 1, bajo tales condiciones estrictas, no debe ser idéntica a los ácidos nucleicos que codifican para las proteínas o polipéptidos inductores de respuesta de hipersensibilidad de E. amylovora (tal como se describe en Wei, Z.-M./ et al . , "Harpin, Elicitor of the Hypersensitive Response Produced by the Plant Pathogen Erwinia amylovora" , Science, 257: 85-88 (1992), la cual se incorpora en la presente como referencia) , Erwinia chrysanthemi (tal como se describe en Bauer, et al . , "Erwinia chrysantemi HarpinEch: Soft-Rot Pahtogenesis", MPMI, 8 (4) : 484-91 (1995), la cual se incorpora en la presente como referencia) , Erwinia carotovora (tal como se describe en Cuí, et al . , "The RsmA Mutants of Erwinia carotovora subsp. carotovora Strain Ecc71 Overexpress ?rpNEcc and Elicit a Hypersensitive Reaction-like Response in Tobacco Leaves", MPMI, 9 (7): 565-73 (1966), la cual se incorpora en la presente como referencia) , Erwinia stewartii (tal como se describe en Ahmad, et al . , "Harpin is not Necessary for the Pathogenicity of Erwinia steawartii on Maize", 8th Int'l. Cong. Molec. Plant-Microb. ínter., Julio 14-19, 1996 y Ahmad, et al . , "Harpin is not Necessary for the Pathogenicity of Erwinia stewartii on Maize", Ann. Mtg. Am.

Phytopath. Soc . , Julio 27-31, 1996) , la cual se incorpora en la presente como referencia) y Pseudomonas syringae pv. syringae (Publicación Internacional WO 94/26782 de Cornell Research Foundation, Inc., la cual se incorpora en la presente como referencia) . La proteína o polipéptido de la presente invención de preferencia se produce en forma purificada (preferiblemente cuando menos aproximadamente 80%, de preferencia 90% de pureza) mediante las técnicas convencionales. Típicamente, la proteína o polipéptido de conformidad con la presente invención, se secreta en el medio de crecimiento de células huésped recombinantes. Alternativamente, la proteína o polipéptido de conformidad con la presente invención se produce, pero no se secreta, en el medio de crecimiento. En tales casos, para aislar la proteína, la célula huésped (e.g., E. coli ) portadora de un plásmido recombinante se propaga, se lisa por sonicación, se calienta, se aplica presión diferencial o tratamiento químico y el homogeneizado se centrifuga para remover los restos bacterianos. Después, el sobrenadante se somete a una precipitación secuencial con sulfato de amonio. La fracción que contiene el polipéptido o proteína de conformidad con la presente invención, se somete a filtración en gel en una columna de dextrán o poliacrilamida de tamaño apropiado, para separar las proteínas. Si es necesario, la fracción proteica puede ser purificada adicionalmente por CLAR (Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento) . La molécula de ADN que codifica para el polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad, se puede incorporar en células' utilizando la tecnología convencional de ADN recombinante. Generalmente esto incluye insertar la molécula de ADN en un sistema de expresión al cual la molécula de ADN es heteróloga (i.e., normalmente no está presente). La molécula de ADN heteróloga es insertada en el sistema de expresión o vector, en una orientación de sentido apropiada y con un marco de lectura correcto. El vector contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de las secuencias codificadoras de proteína insertadas. La Patente Norteamericana No. 4,237,224 de Cohén y Boyer, la cual se incorpora en la presente como referencia, describe la producción de sistemas de expresión en forma de plásmidos recombinantes, utilizando rompimiento con enzimas de restricción y ligación con ADN ligasa. Estos plásmidos recombinantes, posteriormente, se introducen por medio de transformación y se replican en cultivos unicelulares incluyendo células de organismos procarióticos y eucarióticos crecidas en cultivo de tejidos. Los genes recombinantes también se pueden introducir en virus, tales como el virus vaccina. Los virus recombinantes se pueden generar por transcripción de plásmidos en células infectadas con virus. Los vectores adecuados incluyen, pero no se limitan a, los siguientes vectores virales tales como el sistema de vector lambda gtll, gt WES.tB, Charon 4 y vectores plasmídicos tales como pBR322, pBR325, pACYC177, PACYC1084, pUC8, pUC9, pUCld, pUC19, pLG339, pR290, pKC37, pKC37, pKClOl, SV 40, pBluescript II SK +/- o KS +/- (véase "Stratagene Cloning Systems" Catalog (1993) de Stratagene, La Jolla, Calif., EUA, la cual se incorpora en la presente como referencia) , pQE, pIH821, pGEX, serie pET (véase F. W. Studier et al . , "Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes", Gene Expression Technology, Vol. 185 (1990), la cual se incorpora en la presente como referencia) y cualquier derivado de los mismos. Las moléculas recombinantes se pueden introducir en células mediante transformación, particularmente transducción, conjugación, movilización o electroporación. Las secuencias de ADN se clonan en el vector utilizando los procedimientos de clonación estándar de la técnica, tales como los descritos por Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Laboratory, Cold Springs Harbor, Nueva York (1989), la cual se incorpora en la presente como referencia. Se puede utilizar una variedad de sistemas huésped-vector para expresar la secuencia o secuencias codificadoras de proteínas. Principalmente, el sistema vector debe ser compatible con la célula huésped utilizada. Los sistemas huésped-vector incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: bacterias transformadas con ADN de bacteriófagos, ADN de plásmidos o ADN de cósmidos; microorganismos tales como levaduras que contienen vectores de levaduras; sistemas de células de mamíferos infectadas con virus (e.g., virus vaccinia, adenovirus, etc.); sistemas de células de insectos infectadas con virus (e.g., baculovirus); y células de planta infectadas con bacterias. Los elementos de expresión de estos vectores varían en su fuerza y especificidad. Dependiendo del sistema huésped-vector utilizado, se puede utilizar cualquiera de un número de elementos de transcripción y traducción adecuados. Diferentes señales genéticas y eventos de procesamiento controlan muchos niveles de la expresión génica (e.g., transcripción del ADN y traducción del ARN mensajero (ARNm) ) . La transcripción del ADN depende de la presencia de un promotor, el cual es una secuencia de ADN que dirige la unión de la ARN polimerasa y por lo tanto promueve la síntesis de ARNm. Las secuencias de ADN de promotores eucarióticos difieren de aquellas de los promotores procarióticos. Además, los promotores eucarióticos y señales genéticas que los acompañan, podrían no ser reconocidos ni funcionar en un sistema procariótico y, además, los promotores procarióticos no son reconocidos y no funcionan en células eucarióticas. De manera similar, la traducción del ARNm en procariotes depende de la presencia de señales procarióticas apropiadas, las cuales difieren de aquellas de los eucariotes. La eficiente traducción del ARNm en procariotes, requiere un sitio de unión al ribosoma denominado secuencia de Shine-Dalgarno ("SD") en el ARNm. Esta secuencia es una pequeña secuencia nucleotídica del ARNm que está localizada antes del codón de inicio, normalmente AUG, la cual codifica para la metionina a ino-terminal de la proteína. Las secuencias SD son complementarias al extremo 3' del 16S ARNr (ARN ribosomal) y probablemente promueven la unión del ARNm a los ribosomas duplicándose con el ARNr para permitir un posicionamiento correcto del ribosoma. Para mayor información sobre- la maximización de la expresión génica, véase Roberts y Lauer, Methods in Enzymology, 68: 473 (1979), la cual se incorpora en la presente como referencia. Los promotores varían en su "fuerza" (i.e., su capacidad de promover la transcripción. Para propósitos de expresar un gen clonado, es deseable utilizar promotores fuertes con el fin de obtener un alto nivel de transcripción y, por ende, . de expresión del gen. Dependiendo del sistema de células huésped utilizado, se puede utilizar cualquiera de un número de promotores adecuados. Por ejemplo, cuando se clona en E. coli, sus bacteriófagos o plásmidos, se pueden utilizar promotores tales como el promotor del fago T7, el promotor lac, promotor trp, promotor recA, promotor de ARN ribosomal, promotores PR y P del colifago lambda y otros, incluyendo pero no limitándose a iacUV5, ompF, bla, Ipp y similares, para dirigir altos niveles de transcripción de los segmentos de ADN adyacentes. Adicionalmente, se puede utilizar un promotor híbrido trp-lacüV5 ( tac) u otros promotores de E. coli producidos por ADN recombinante u otras técnicas de síntesis de ADN, para obtener la transcripción del gen insertado. Las cepas de células huésped bacterianas y los vectores de expresión se pueden seleccionar de tal manera que inhiban la acción del promotor a menos de que sea específicamente inducida. En ciertas operaciones, la adición de inductores específicos es necesaria para una eficiente transcripción del ADN insertado. Por ejemplo, el operón lac es inducido mediante la adición de lactosa o IPTG (isopropiltio-beta-D-galactósido) . Una variedad de otros operones, tales como trp, pro, etc., están bajo diferentes controles. También se requieren de señales de iniciación específicas para la eficiente transcripción y traducción de genes en células procarióticas. Estas señales de iniciación de transcripción y traducción pueden variar de "fuerza", la cual es medida por la cantidad de ARN mensajero específico del gen y la cantidad de proteína sintetizada, respectivamente. El vector de expresión de ADN, que contiene un promotor, también puede contener cualquier combinación de varias señales "fuertes" de iniciación de transcripción y/o traducción. Por ejemplo, una traducción eficiente en E. coli requiere una secuencia SD de aproximadamente 7-9 bases hacia 5' con respecto al codón de iniciación ("ATG") , para obtener un sitio de unión al ribosoma. Así pues, cualquier combinación SD-ATG que pueda ser utilizada por los ribosomas de la célula huésped, puede ser empleada. Tales combinaciones incluyen, pero no se limitan a, la combinación SD-ATG del gen ero o del gen N del colifago lambda de genes de E. coli de triptofano E, D, C, o A. Adicionalmente, se puede utilizar cualquier combinación SD-ATG producida por AD? recombinante u otras técnicas que incluyen la incorporación de nucleótidos sintéticos . Una vez que la molécula aislada de AD? que codifica para el polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad ha sido clonada en un sistema de expresión, se puede incorporar fácilmente a una célula huésped. Tal incorporación se puede llevar a cabo mediante las diversas formas de transformación anteriormente descritas, dependiendo del sistema vector/huésped celular utilizado. Las células huésped adecuadas incluyen, pero no se limitan a, bacterias, virus, levaduras, células de mamíferos, de insectos, de plantas y similares. La presente invención además se refiere a métodos para impartir resistencia a enfermedades a plantas, incrementar el crecimiento de plantas y/o efectuar el control de insectos para plantas. Estos métodos incluyen la aplicación de un polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad en una forma no infecciosa, a la totalidad o una parte de una planta o de una semilla de planta, bajo condiciones en las cuales el polipéptido proteína entra en contacto con la totalidad o una parte de las células de la planta o de la semilla de planta. Alternativamente, la proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad se puede aplicar a plantas tales como semillas recuperadas de. tales plantas, siendo capaces de impartir resistencia a enfermedades a las plantas, de incrementar el crecimiento de la planta y/o de efectuar un control de insectos. Como alternativa para la aplicación de un polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad en plantas o semillas de plantas, con el fin de impartirles resistencia a enfermedades, de tener un efecto sobre el crecimiento de la planta y/o para controlar insectos en las plantas crecidas a partir de las semillas, se pueden utilizar plantas transgénícas o semillas de plantas transgénicas. Cuando se utilizan plantas transgénicas, esto incluye proporcionar una planta transgénica transformada con una molécula de ADN que codifica para un polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad y hacer crecer la planta bajo condiciones efectivas para permitir que la molécula de ADN le imparta resistencia a enfermedades, que incremente el crecimiento de la planta y/o que efectúe un control de insectos. Alternativamente, se puede proporcionar una semilla de planta transgénica transformada con una molécula de ADN que codifica para un polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad y se puede plantar en el suelo. Después la planta se propaga a partir de la semilla plantada bajo condiciones efectivas para permitir que la molécula de ADN le imparta resistencia a enfermedades a la planta, incremente el crecimiento de la planta y/o controle insectos. La modalidad de la presente invención en donde se aplica el polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad a la planta o a la semilla de planta, se puede llevar a cabo de varias maneras, incluyendo: 1) . la aplicación de un polipéptido o proteína inductora aislada; 2) la aplicación de bacterias que no causan enfermedad y que están transformadas con genes que codifican para un polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad; y 3) la aplicación de bacterias que causan enfermedad en algunas especies de plantas (pero en aquella a la cual se aplica) y que contienen naturalmente un gen que codifica para el polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad. En una modalidad de la presente invención, el polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad de conformidad con la presente invención, se puede aislar de Psudomonas syringae pv. tomato tal como se describe en los Ejemplos que se presentan más adelante. Sin embargo, de preferencia el polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad aislada de conformidad con la presente invención, se produce de manera recombinante y se purifica de la manera anteriormente descrita. En otras modalidad de la presente invención, el polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad de conformidad con la presente invención, se puede aplicar a plantas o a semillas de plantas, mediante la inoculación de bacterias que contienen genes que codifican para el polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad. Tales bacterias deben ser capaces de secretar o exportar el polipéptido o proteína, de manera que el inductor pueda entrar en contacto con las células de la planta o de la semilla de planta. En estas modalidades, el péptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad es producido por las bacterias in planta o en las semillas o justo antes de la introducción de las bacterias a las plantas o a las semillas. En una modalidad de la aplicación bacteriana de la presente invención, las bacterias no causan la eternidad y han sido transformadas (e.g., por recombinación) con genes • que codifican para un polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad. Por ejemplo, E. coli, la cual no induce una respuesta de hipersensibilidad en plantas, puede ser transformada con genes que codifican para un polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad y después se aplican a plantas. También se pueden utilizar otras especies bacterianas diferentes a E.. coli en esta modalidad de la presente invención. Otra modalidad de la aplicación bacteriana de la presente invención, las bacterias causan enfermedad y contienen un gen natural que codifica para un polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad. Ejemplos de tales bacterias se presentaron anteriormente. Sin embargo, en esta modalidad, estas bacterias son aplicadas a plantas o a sus semillas que no son susceptibles de sufrir la enfermedad causada por las bacterias. Por ejemplo, Pseudomonas syringae pv. tomato causa enfermedad en el jitomate, pero no en el frijol. Sin embargo, tales bacterias inducirán una respuesta de hipersensibilidad en el frijol. De conformidad con esta modalidad de la presente invención, Pseudomonas syringae pv. tomato se puede aplicar a plantas de frijol o sus semillas para impartirles resistencia a enfermedades, incrementar el crecimiento o controlar insectos, sin causar una enfermedad en esa especie. El método de la presente invención se puede utilizar para tratar una amplia variedad de plantas o sus semillas, para impartirles resistencia a enfermedades, aumentar el crecimiento y/o controlar insectos. Algunas plantas adecuadas incluyen las dicotiledóneas y monocotiledóneas. Particularmente, las plantas de cultivo pueden incluir: alfalfa, arroz, trigo, cebada, centeno, algodón, girasol, cacahuate, maíz, papa, papa dulce, frijol, chícharo, achicoria, lechuga, endivia, col, col de Bruselas, remolacha, chirivía, nabo, coliflor, brócoli, rábano, espinaca, cebolla, ajo, berenjena, pimienta, cilantro, zanahoria, chayóte, calabaza, calabacín, pepino, manzana, pera, melón, cítricos, fresa, uva, frambuesa, pina, soya, tabaco, jitomate, sorgo y caña de azúcar. Ejemplos de plantas ornamentales adecuadas son: Arabidopsis thaliana , Saintpaulia , petunia, geranio, poinsettia, crisantemo, clavel y zinnia.

Con respecto al uso de la proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad de la presente invención para impartir resistencia a enfermedades, no se puede conferir una inmunidad absoluta contra infecciones, pero la gravedad de la enfermedad se reduce y se retarda el desarrollo de los síntomas. El número de lesiones, el tamaño de las mismas y el grado de esporulación de patógenos fúngicos, todos ellos disminuyen. Este método para impartir resistencia a enfermedades tiene el potencial de tratar enfermedades previamente intratables, de tratar enfermedades sistémicamente, las cuales no se pueden tratar por separado debido al costo y evitar el uso de agentes infecciosos o materiales ambientalmente peligrosos. El método para impartir resistencia a patógenos a las plantas de conformidad con la .presente invención, es útiles para impartir resistencia a una amplia variedad de patógenos, incluyendo virus, bacterias y hongos. La resistencia, Ínter alia, a los siguiente virus se puede alcanzar por el método de la presente invención: virus del mosaico del tabaco y virus del mosaico del tomate. La resistencia inter alia, a las siguientes bacterias también se puede impartir a las plantas de conformidad con la presente invención: Pseudomonas solancearum, Psudomonas syringae pv. tabaci y Xanthomonas campestris pv. pelargonii . Las plantas pueden volverse resistentes, inter alia, a los siguientes hongos mediante el uso del método de la presente invención: Fusarium oxysporum y Phytophthora infestans. Con respecto al uso de la proteína o péptido inductor de respuesta de hipersensibilidad de la presente invención para incrementar el crecimiento de plantas, se puede lograr el aumento o la promoción del crecimiento de varias formas de plantas. Esto puede ocurrir tan pronto como la planta empieza a crecer desde la semilla o en una etapa posterior de la vida de la planta. Por ejemplo, el crecimiento de planta de conformidad con la presente invención produce un mayor rendimiento, incrementa ' la cantidad de semillas producidas, incrementa el porcentaje de semillas germinadas, incrementa la biomasa, se obtienen más frutos y más grandes, se obtiene una coloración más temprana en los frutos y una maduración más tremprana en la planta y los frutos. Como resultado, la presente invención proporciona un beneficio económico significativo a los agricultores. Por ejemplo, la germinación temprana y la maduración temprana permiten que crezcan cultivos en áreas de temporada corta de crecimiento, en donde de otra manera no sería posible su cultivo en esa ubicación. El aumento del porcentaje de semillas germinadas, da como resultado mejores cosechas en pie y un uso más eficiente de las semillas. El mayor rendimiento, el incremento de tamaño y de la producción de biomasa, permiten generar mayores ingresos en una tierra dada. Otro aspecto de la presente invención se refiere a efectuar cualquier forma de control de insectos de plantas. Por ejemplo, el control de insectos de conformidad con la presente invención incluye prevenir que los insectos entren en contacto con las plantas a las cuales se ha aplicado el inductor de respuesta de hipersensibilidad, evitando el daño causado directamente por el insecto a las plantas por su alimentación, causando^ que los insectos se vayan desde estas plantas, matando a los insectos próximos a las plantas, interfiriendo con la alimentación de las larvas del insecto de tales plantas, evitando que los insectos colonicen a las plantas huésped, evitando que los insectos colonizadores liberen fitotoxinas, etc. La presente invención también previene los daños subsecuentes a una enfermedad de las plantas como resultado de una infestación por insectos. La presente invención es efectiva contra una amplia variedad de insectos. El gusano barrenador del maíz europeo es una de las principales plagas del maíz (maíz dentado y dulce) , pero también se alimenta de más de 200 especies de plantas, incluyendo la judía verde, el frijolillo, la alubia de lima y soyas comestibles, especies de pimienta, papa y jitomate más muchas especies de hierbas. Las plagas de larvas de insectos adicionales que dañan a una amplia variedad de cosechas de vegetales incluyen las siguientes: oruga negra de la remolacha, largarta de la col, gusano de la mazorca, gusano cogollero (oruga negra del maíz), polilla de la col (polilla espalda de diamante) , gusanillo de la col, gusanillo de la cebolla, gusanillo de la semilla de maíz, gusano barrenador del pepino, gusanillo de la pimienta y gusanillo alfiler del jitomate. Colectivamente, este grupo de plagas de insectos representa el grupo económicamente más importante de plagas para la producción de vegetales a nivel mundial. El método de la presente invención que incluye la aplicación del polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad, se puede llevar a cabo a través de una variedad de procedimientos cuando se trata la totalidad o una parte de la planta, incluyendo las hojas, los tallos, las raices, propárgulos (e.g., cortes), etc. Esto podría (pero no necesariamente) incluir la infiltración del polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad a la planta. Los métodos de aplicación adecuados incluyen rociado de alta o baja presión, inyección y abrasión de hojas antes de llevar a cabo la aplicación del inductor. Cuando se tratan semillas de plantas, de conformidad con la modalidad de aplicación de ' la presente invención, la proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad se puede aplicar por rociado de baja o alta presión, revestimiento, inmersión o inyección. Otros procedimientos de aplicación adecuados pueden ser ideados por los técnicos en la materia, siempre y cuando sean capaces de poner en contacto el polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad con células de la planta o semillas de la planta. Una vez tratadas con el inductor de respuesta de hipersensibilidad de la presente invención, las semillas se pueden plantar en suelo natural o artificial y cultivar utilizando los procedimientos convencionales para producir plantas. Después de que las plantas han sido propagadas a partir de las semillas tratadas de conformidad con la presente invención, las plantas se pueden tratar con una o más aplicaciones de la proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad, para impartirles resistencia a enfermedades, para incrementar el crecimiento de la planto y/o controlar los insectos en las plantas. El polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad se puede aplicar a plantas o semillas de plantas, de conformidad con la presente invención, solo o mezclado con otros materiales. De manera alternativa, el polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad que puede aplicar por separado a plantas con otros materiales que son aplicados en diferentes momentos . Una composición adecuada para tratar plantas o semillas de plantas de conformidad con la modalidad de aplicación . de la presente invención, contiene un polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad en un vehículo. Los vehículos adecuados incluyen agua, soluciones acuosas, lechadas o polvos deshidratados. En esta modalidad, la composición contiene más de 500 nM del polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad. Aunque no sea requerido, esta composición puede contener aditivos adicionales incluyendo fertilizantes, insecticidas, fungicidas, nematicidas y mezclas de los mismos. Los fertilizantes adecuados incluyen (NH4)2N03. Un ejemplo de un insecticida adecuado es el malatión. Los fungicidas útiles incluyen al Captan. Otros aditivos adecuados incluyen agentes reguladores de pH, agentes humectantes, agentes de revestimiento y agentes abrasivos. Estos materiales se pueden utilizar para facilitar el proceso de la presente invención. Además, el polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad se puede aplicar a semillas de plantas con otras formulaciones y materiales de tratamiento convencionales para semillas, incluyendo arcillas y polisacáridos.

En la modalidad alternativa de la presente invención que incluye el uso de plantas transgénicas y semillas transgénicas, no es necesario aplicar de manera tópica a las plantas o a las semillas el polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad. En vez de esto, las plantas transgénicas transformadas con una molécula de ADN que codifica para un polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad son producidas de conformidad con los procedimientos conocidos en la técnica. El vector anteriormente descrito puede ser microinyectado directamente en las células de la planta mediante el uso de micropipetas, para transferir mecánicamente el ADN recombinante. Cross ay, Mol. Gen. Genetics, 202: 179-85 (1985), la cual se incorpora en la presente como referencia. El material genético también se puede transferir a las células de la planta utilizando propilenglicol. Krens, et al . , Nature, 296: 72-74 (1982), la cual se incorpora en la presente como referencia. Otro enfoque para transformar las células de plantas con un gen que les imparte resistencia a los patógenos, es el bombardeo de partículas (también conocido como transformación biolística) de la célula huésped. Esto se puede llevar a cabo de varias maneras. La primera incluye impulsar partículas inertes o biológicamente activas en las células. Esta técnica se describe en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,945,050; 5,036,006 y 5,100,792; todas de Sanford et al . , las cuales se incorporan en la presente como referencia. En general, este procedimiento incluye impulsar partículas biológicamente activas o inertes en las células bajo condiciones efectivas para que penetren la superficie externa de la célula y para que se incorporen en el interior de la misma. Cuando se utilizan partículas inertes, el vector puede ser introducido en la célula mediante el revestimiento de las partículas con el vector conteniendo el ADN heterólogo. Alternativamente, la célula blanco puede ser rodeada por el vector de tal manera que el vector sea transportado hacia el interior de la célula por la partícula. Las partículas biológicamente activas (e.g., células bacterianas desecadas que contienen el vector y el ADN heterólogo) también se pueden impulsar hacia el interior de células de plantas. Todavía otro método de introducción es la fusión de protoplastos con otras entidades, ya sea minicélulas, células, lisosomas u otros cuerpos de superficie lipídica fusionables. Fraley, et al . , Proc . Nati. Acad. Sci. EUA, 79: 185963 (1982), la cual se incorpora en la presente como referencia. La molécula de ADN también se puede introducir en las células de planta por electroporación. Fromm et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 82: 5824 (1985), la cual se incorpora en la presente como referencia. En esta técnica se someten a electroporación protoplastos de la planta en presencia de plásmidos que contienen el cartucho de expresión. Se aplican impulsos eléctricos de alto campo de fuerza, los cuales permeabilizan de manera reversible las biomembranas, permitiendo la introducción de los plásmidos. Los protoplastos de planta sometidos a electroporación, reconforan la pared celular, se dividen y se regeneran. Otro método para introducir la molécula de ADN en las células de planta, es infectar una célula de planta con Agrobacterium tumefaciens o A. rhizogenes, previamente transformadas con el gen. En condiciones apropiadas conocidas en la técnica, las. células de planta transformadas se hacen crecer para formar brotes o raíces y desarrollarse hasta ser plantas adultas. En general, este procedimiento incluye inocular el tejido de la planta con una suspensión de bacterias e incubar el tejido durante 48 a 72 horas en un medio de regeneración, sin antibióticos a 25-28°C. Agrobacteri um es un género representativo de la familia gram negativa Rhizobiaceae . Esta especie es responsable de agallas en corona (A. tumefaciens) y de la enfermedad de raíz pilosa (A. rhizogenes) . Las células de planta con tumores de agalla en corona y raíces pilosas, son inducidas a producir derivados de aminoácidos conocidos como opinas, las cuales son catabolizadas sólo por las bacterias. Los genes bacterianos responsables de la expresión de las opinas son una fuente conveniente de elementos de control para cartuchos de expresión quimérica. Además, la evaluación de la presencia de opinas se puede utilizar para identificar el tejido transformado. Las secuencias genéticas heterólogas se pueden introducir en las células de planta apropiadas, por medio del plásmido Ti de A. tumefaciens o del plásmido Ri de A. rhizogenes. El plásmido Ti o Ri es transmitido a las células de planta en la infección por Agrobacterium y se integra de manera estable al genoma de la planta. J. Schell, Science, 237: 1176-83 (1987), la cual se incorpora en la presente como referencia. Después de la transformación, las células de planta transformadas se deben regenerar. La regeneración de la planta a partir de protoplastos cultivados se describe en Evans et al . , Handbook of Plant Cell Cultures, Vol. 1, MacMillan Publishing Co., Nueva York, 1983); y Vasil I. R. (ed.), Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Acad. Press, Orlando, vol. I (1984) y vol. III (1986), las cuales se' incorporan en la presente como referencia.

Es sabido que prácticamente todas las plantas pueden ser regeneradas a partir de células o tejidos cultivados, incluyendo pero no limitándose a, todas las principales especies de caña de azúcar, remolacha de azúcar, algodón, árboles frutales y legumbres. Los mecanismos de regeneración varían de una especie a otra de plantas, pero en general se proporciona una suspensión de protoplastos transformados o una caja de petri que contenga explantes transformados. El callo tisular se forma y se puede inducir la formación de brotes en los callos y subsecuentemente se enraizan. Alternativamente, se puede inducir la formación de embriones en el tejido calloso. Estos embriones germinan como embriones naturales para formar plantas. El medio.de cultivo generalmente contendrá varios aminoácidos y hormonas, tales como auxina y citocininas. También es ventajoso agregar ácido glutámico y prolina al medio, especialmente para especies tales como maíz y alfalfa. La eficiente regeneración dependerá del medio, del genotipo y del historial de cultivo. Si se controlan estas tres variables, entonces por lo general la regeneración es reproducible y repetible. Después de que el cartucho de expresión está incorporado de manera estable en las plantas transgénicas, éste se puede transferir a otras plantas por cruce sexual.

Se puede utilizar cualquiera de un número de técnicas de reproducción, dependiendo de la especie a ser cruzada. Una vez que se producen plantas transgénicas de este tipo, las plantas mismas pueden ser cultivadas de conformidad con los procedimientos convencionales, con la presencia del gen que codifica para el inductor de respuesta de hipersensibilidad, dando como resultado la resistencia a enfermedades, un incremento de la planta y/o el control de insectos sobre la planta. Alternativamente, se colectan semillas transgénicas de las plantas transgénicas. Esta semillas posteriormente se pueden plantar en el suelo y cultivar utilizando los procedimientos convencionales para producir plantas transgénicas. Las plantas transgénicas se propagan a partir de semillas transgénicas plantadas bajo condiciones efectivas para impartir resistencia a enfermedades a las plantas, para incrementar su crecimiento y/o controlar los insectos. Toda vez que no se desea apegar a una teoría, tal resistencia a enfermedades, incremento del crecimiento y/o control de insectos, puede estar mediado por el ARN o puede ser el resultado de la expresión del polipéptido o proteína inductora. Cuando se utilizan plantas y semillas transgénicas de conformidad con la presente invención, adícionalmente pueden ser tratadas con los mismos materiales que se utilizan para el tratamiento de plantas y semillas, a las cuales se les aplica un polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad. Estos otros materiales, incluyendo inductores de respuesta de hipersensibilidad, pueden ser aplicados a las plantas transgénicas y a las semillas transgénicas mediante los procedimientos anteriormente descritos, incluyendo rociado de alta o baja presión, inyección, revestimiento e inmersión. De manera similar, después de que las plantas han sido propagadas a partir de semillas de plantas transgénicas, las plantas se pueden tratar con una o más aplicaciones del inductor de respuesta de hipersensibilidad, para impartirles resistencia a enfermedades, incrementar el crecimiento y/o controlar insectos. Tales plantas también se pueden tratar con los agentes de tratamiento de plantas convencionales (e.g., insecticidas, fertilizantes, etc.). EJEMPLOS Ejemplo 1 - Cepas, plásmidos y medios bacterianos. Se hicieron crecer de manera rutinaria cepas de E. coli en medio LM (Hanahan, D. (1985) en DNA Cloning: A Practical Approach, ed. Glover, D. M. (IRL Press, Oxford), pp. 109-135, la cual se incorpora en la presente como referencia) o Terrific broth (Sambrook, J., Fritsch, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning, Segunda Edición, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) , pp. 109-135 (1989)), la cual se incorpora en la presente como referencia, a 37 °C. Las cepas de E. coli principalmente utilizadas para construir plásmidos fueron las cepas de DH5a y DG5aF' IQ (Life Techologies, Grand Island, NY) . Para manipulaciones de ADN estándar, se utilizaron los vector pBluescript II de Stratagene (La Jolla, CA, EUA) . Se hicieron P. syringae pv. tomato DC3000 (Preston, G., Mol. Plant-Microbe Interact., 8: 717-32 (1995), la cual se incorpora en la presente como referencia) y P. fl uorescens 55 (Huang, H. C, J. Bactiorl., 170: 4748-56 (1988), la cual se incorpora en la presente como referencia) en caldo King B (King, E. O., J. Lab. Med., 22: 301-07 (1954) la cual se incorpora en la presente como referencia) o en medio mínimo de fructosa desrepresor de hrp (Huynh, T. V., Science, 245: 1374-77 (1989), la cual se incorpora en la presente como referencia) a 30°C. Se utilizaron antibióticos a las siguientes concentraciones (µg/ml) : ampicilina, 100; gentamicina, 10; kanamicina, 50; rifampicina, 100; estreptomicina, 50 y tetraciclina, 20. Ejemplo 2 - Manipulaciones de ADN. Las manipulaciones del ADN y las reacciones de RCP se realizaron de conformidad con los protocolos estándar (Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. Molecular Cloning, Segunda Edición, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) (1989) ; Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., y WHITE, T. J. PCR Protocols. (Academic Press, San Diego) (1990) , las cuales se incorporan en la presente como referencia) . Se compraron cebadores de oligonucleótidos para secuenciación o para RCP en Life Technologies. En las reacciones de RCP se utilizó Pfu polimerasa (Stratagene) . Toda la secuenciación de ADN se realizó en el Centro de Biotecnología de Cornell con un secuenciador automático de ADN, modelo 373A (Applied Biosystems, Foster City, CA) . La secuencia de ADN se analizó con el paquete de software Genetics computer Group versión 7.3 (Devereaux, J., Gene, 12: 387-95 (1984), la cual se incorpora en la presente como referencia) y con el paquete DNASTAR (Madison, Wl) . La secuencia de ADN de hrpW fue depositada en el banco de genes GenBank, con el número de acceso AF005221. Ejemplo 3 - Evaluaciones de las plantas. Se hicieron crecer las plantas de tabaco, (Nicotiana tabacum L. "Xanthi") y jitomate (Lycopersicum esculentum Mili. "Moneymaker") y se inocularon con bacterias de la manera anteriormente descrita (Gopalan, S., Plant Cell, 8: 1095-05 (1996), la cual se incorpora en la presente como referencia) . Para los ensayos de virulencia, se infiltraron suspensiones bacterianas conteniendo 10 células/ml en hojas del jitomate y se supervisaron diariamente durante un periodo de 5 días en busca del desarrollo de síntomas y multiplicación bacteriana. Ejemplo 4 - Aislamiento de ADN que flanquea el hrp en P. syringae pv. tomato DC3000. Se sometió a una digestión parcial el ADN total de P. syringae pv. tomato DC3000 con la enzima Sau3A, se ligó en sitio BamEI del vector cósmido pCPP47 (Bauer, D. W., Mol. Plant-Microbe Interact., 10: 369-79 (1997), la cual se incorpora en la presente como referencia) y se empacó en partículas de fagos con el extracto de Gigapack III Gold (Stratagene) . Se transfirieron aproximadamente 800 colonias bacterianas a membranas de hibridación de selección de colonias/placas (DuPont NEN Research Products, Boston, MA) y se sondearon en condiciones altamente estrictas con un fragmento PstI marcado con 32P conteniendo hrpR de P. syringae pv. syringae 61 , lo cual produjo un cósmido de hibridación pCPP2357. Se subclonó un fragmento del pCPP2357 de 6.5 kb cortado con £coRI, en el pML123 (Labes, M., Gene, 89: 37-46 (1990), la cual se incorpora en la presente como referencia), produciendo el pCPP2373. Los pCPP2374 y pCPP2375 fueron construidos mediante la digestión parcial del pCPP2373 con la enzima Mfel e insertando un fragmento .EcoRI portador del fragmento OSpr proveniente del pHP45O en el hrpW o en la unidad de transcripción IV (Prentki, P., Gene, 29: 303-13 (1984), la cual se incorpora en la presente como referencia) . También se preparó una biblioteca de cósmidos en el pCPP47 proveniente del ADN total de P. syringae pv. syringae B728A, utilizando la misma estrategia. Ejemplo 5 - Manchas de ADN en gel. El ADN total (2 µg) fue digerido con la enzima EcoRI y separado por electroforesis en geles de agarosa al 0.5%. El ADN fue transferido a una membrana Immobilon-N (Millipore Co. Bedford, MA) e hibridizado a 62°C durante 8 horas en solución de hibridación HYB-9 (GENTRA Systems, Research Triangle Park, NC) , con un fragmento hrpW de 1.3 kb amplificado por RCP, que estaba marcado con 32P, utilizando el paquete Prime-It II (Stratagene) . Las membranas se lavaron 4 veces con DSS al 1.0% y IX de SSC, seguido por 2 lavados con DSS al 1.0% y 0.2 X de SSC. Las membranas fueron expuestas a una película de rayos X OMAT durante 4 a 12 horas. Ejemplo 6 - Preparación de HrpW y derivados. La secuencia codificadora completa para la HrpW fue amplificada por RCP a partir del pCPP2368, con los cebadores 5N-ATGAGGATCCAGCATCGGCATCACACCC-3N (denominado Wl) (SEQ ID No. 3) y 5N-ATGAAAGCTTAAGCTCGGTGTGTTGGGT-N3 (denominado W2) (SEQ ID No.' 4), los cuales contienen los sitios BairiRI y HindIII, respectivamente. El ADN que codifica para los 186 aminoácidos N-terminales de la HrpW, fue amplificado por RCP a partir del pCPP2368 utilizando el cebador Wl y el cebador 5N-ATGAAAGCTTGCCACCGCCTGTTGAAGT-3N (SEQ ID No. 5), el cual contiene el sitio ÍTindlII. El ADN que codifica para los 236 aminoácidos C-terminales de la r HrpW, fue amplificado por RCP a partir del pCPP2368, con el cebador 5N-ATGAGGATCCGAGGGTGGCTAACACG-3N (SEQ ID No. 6), el cual contiene un sitio BamRI y el cebador W2. Los productos amplificados correspondientes a la HrpW de longitud completa, a las porciones N-terminal y C-terminal de la HrpW fueron clonadas directamente en los sitios BaOHI y ff?ndIII del pQE30 (Qiagen) , obteniéndose los pCPP2377, pCPP2378 y pCPP2379, respectivamente. Los procedimientos utilizados para aislar proteínas dirigidas a His utilizando columnas de Ni-NTA (Qiagen) ya han sido descritos (Alfano, J. R., Mol. Microbiol., 19: 715-28 (1996), la cual se incorpora en la presente como referencia) . Se hace crecer E. coli ABLE K (Stratagene) en medio M9 (Sambrook, J., Molecular Cloning, Segunda Edición, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), la cual se incorpora en la presente como referencia) , suplementado con glucosa (0.2%), casaminoácidos (0.02%) y tiamina (1 µg/ml), se utilizó para obtener la HiSß-HrpW debido a su aparente toxicidad. Se realizaron análisis de EGPA-DSS e inmunoelectrotransferencia utilizando anticuerpos antiHrpZ y antiHrpW obtenidos previamente (He, S. Y., Cell, 73: 1255-66 (1993); Yuan, J., J. Bacteriol., 178: 6399-6402 (1996), las cuales se incorporan en la presente como referencia) y el sistema de detección de quimioluminiscencia de tipo Western-Light (Chemiluminescent Detection System) (Tropix, Bedford, MA) y una película de rayos X OMAT (Kodak, Rochester, NY) , de la manera anteriormente indicada (Alfano, J. R., et al . , Mol . Microbiol . , 19: 715-28 (1996), la cual se incorpora en la presente como referencia) . Ejemplo 7 - Construcción de mutaciones de hrpZ y hrpW y mutagénesis de intercambio de marcador de P. syrxngae pv. tomato DC3000. Para construir la mutación de hrpZ de P. syringae pv. tomato DC3000, se eliminó un fragmento interno del hrpZ, de 603 pb cortado Clal, del pCPP2334, un derivado de LITMUS 28 (New England Biolabs) que contiene hrpA y hrpZ, produciéndose el pCPP2336. Un derivado nptll carente de un terminador de transcripción, fue amplificado por RCP a partir del pCPP2988 (Alfano, J. R., et al . , Mol. Microbiol. , 19: 715-28 (1996), la cual se incorpora en la presente como referencia) , con los cebadores 5N-CCATCGATGGTGGTGGCGATAGCTAGACTTGG-3N (SEQ ID No. 7) y 5N-CCATCGATGGTCTCGTGATGGCAGGTTG-3N (SEQ ID No. 8) y se clonó en el sitio único Clal del pCPP2336 en la orientación correcta. Un fragmento BglII/ífindlII de la construcción resultante pCPP2338 portadora de la mutación hrpZ, fue intercambiado por el fragmento BgilI/i?indlII portado en el pCPP2340, produciéndose el pCPP2342. Un fragmento EcoRI de 5.3 kb del pCPP2342 portador de la mutación hrpZ, fue clonado en el plásmido de amplio rango de huéspedes pRK415 (Keen, N. T., et al . , Gene, 70: 191-97 (1988), la cual se incorpora en la presente como referencia) , produciéndose el PCPP2344. Un fragmento £coRI de 8.5 kb del pCPP2375 portador hrpW interrumpido con un fragmento OSpr, fue subclonado en el pRK415, produciéndose el pCPP2376. Se sometieron a electroporación por separado, el pCPP2376 y el pCPP2344 en P. syringae pv. tomato DC3000. La pérdida del plásmido y retención del marcador se realizaron de la manera anteriormente descrita (Alfano, J. R., et al . , Mol . Microbiol. , 19: 715-28 (1996), la cual se incorpora en la presente como referencia) . Ejemplo 8 - hrpW expresado en trans elimina la capacidad de P. fluorescens (pHIRll) para inducir la RH. Para identificar cualquier gen similar a inductor de respuesta de hipersensibilidad en el ADN que flanquea a hrpR de P. syringae pv. toma to DC3000, se aisló el cósmido pCPP23557, el cual contiene esta región en el vector pCPP47. Se construyeron una serie de subclonas en pML123 y se seleccionaron en busca de fenotipos inductores de respuesta de hipersensibilidad potenciales: (i) la capacidad de promover la actividad inductora de RH en el tabaco en células de P. fluorescens portadoras de pCPP2274, un derivado AhrpZ del pHIRll (Gopalan, S., et al . , Plant Cell, 8: 1095-105 (1996), la cual se incorpora en la presente como referencia) y (ii) la interferencia con la actividad inductora de RH de células de P. fluorescens portadoras del pHIRll de tipo silvestre (Alfano, J. R. et al . , Mol. Microbiol., 19: 715-28 (1996), la cual se incorpora en la presente como referencia) . Ninguna subclona tuvo el primer fenotipo, pero una, la pCPP2373, tuvo el segundo. La pCPP2373 contiene un fragmento EcoRI de 6.5 kb proveniente de pCPP2357, que tiene las unidades de transcripción IV y V (Lorang, J. M., et al . , Mol. Plant-Microbe Interact., 8: 49-57 (1995), la cual se incorpora en la presente como referencia) y eliminaron la actividad inductora de RH de P. fl uorescens (pHIRll) (Fig. 1). Para determinar cuál unidad de transcripción fue responsable del fenotipo, se insertó un fragmento OSpr en los sitios mfel en las unidades de transcripción IV y V, para construir el pCPP2374 y pCPP2375, respectivamente. Ambos plásmidos fueron transformados en células de P. fluorescens (pHIRll) , las cuales posteriormente fueron infiltradas en hojas de tabaco. Sólo el pCPP2375 bloqueó la inducción de RH (Fig. 1) , lo cual indica que la unidad de transcripción V codifica para una proteína con una de las características de la HrpZ. Ejemplo 9 - La secuencia de ADN del hrpW predice una proteína tanto con un dominio inductor de respuesta de hipersensibilidad, como con un dominio Peí. Se determinó la secuencia completa de ADN de la unidad de transcripción V, revelando un fragmento ORF de 1,275 pb el cual fue designado como hrpW. El gen está precedido por un promotor hrp (Lorang, J. M., et al . , Mol. Plant-Microbe Interact., 8: 49-57 (1995), la cual se incorpora en la presente como referencia) y es seguido por un terminador rho-independiente (Fig. 2A) . La secuencia N-terminal predicha de la HrpW, casa con la de la EXP-60, que es una de la cinco proteínas de P. syringae pv. tomato DC3000 secretadas por Hrp, identificadas por Yuan y He (Yuan, J., et al . , J. Bacteriol., 178: 6399-402 (1996), la cual se incorpora en la presente como referencia) . El hrpW está flanqueado por operones transcritos en direcciones divergentes y parece ser un operón monocistrónico. Al igual que los inductores de respuesta de hipersensibilidad, la ' proteína predicha HrpW de 42.9 kDa es acida, rica en glicina, carece de cisteína y es deficiente en aminoácidos aromáticos. La secuencia de la proteína predicha de HrpW revela cuando menos dos dominios distintos (Fig. 2B) . Un dominio similar a inductor de respuesta de hipersensibilidad (aminoácidos 1-186) es rico en glutamina, serina y glicina. La región 119-186 contiene seis repeticiones ricas en glicina imperfectas, con muchos residuos ácidos y polares, las cuales se alinean con repeticiones similares en las proteínas HrpZ de syringae pv. tomato y syringae pv. syringae (Fig. 2C) . La unidad TPS/DAT en esta región, se predice que tiene una estructura ß-hoja, en donde un lado de la ß-hoja tiene todos los residuos treonina y serina y las repeticiones de glicina se predice que son puntos de torsión mediante el algoritmo- de Garnier-Robson (Plasterer, T. N., en Methods in Molecular Biology, vol. 70, ed. Swindell, S.R. (Humana Press, Totawa, NJ) , pp. 227-239 (1997), la cual se incorpora en la presente como referencia). Las ß-hojas y puntos de torsión alternantes pueden formar una estructura de ß-barril. Las búsquedas en bases de datos utilizando el BLAST (Altschul, S. F., et al . , J. Mol. Biol., 215: 403-10 (1990), la cual se incorpora en la presente como referencia) no revelaron proteínas con similitud significativa al dominio inductor de respuesta de hipersensibilidad.

En contraste, los 236 aminoácidos C-terminales de la HrpW son similares a varios dominios Pels de hongos de Nectria haematococca apareamiento tipo IV (Fusari um solani f. sp. písi) y similares al dominio Peí bacteriano de E. carotovora . Por ejemplo, la HrpW muestra identidades de 32.5% con la PelC de N. haematococca (Guo, W., et al . , Arhc. Biochem. Biophys., 323: 352-60 (1995), la cual se incorpora en la presente como referencia) y 21.2% con la Pel-3 de E. carotovora (Liu, Y., et al . , App1. Environ. Microbiol. , 60: 2545-52 (1994), la cual se incorpora en la presente como referencia) . La secuencia de aminoácidos de las Peí en este grupo no es similar a la mayoría de las Peí conocidas y se sabe poco acerca del sitio activo o de la estructura terciaria de las proteínas de este grupo (Henrissat, B., et al . , Plant Physiol., 107: 963-76 (1995), la cual se incorpora en la presente como referencia) . Ejemplo 10 - La HrpW aparece ampliamente distribuida en bacterias patógenas de plantas y está en una región conservada entre dos patovares de P. syringae. La distribución del hrpW y la conservación de la región hrpW fueron examinadas por inmunoelectrotransferencia de AD? en gel y análisis de secuencia de AD?. El ORF del hrpW fue amplificado por RCP y se utilizó como sonda para una hibridación por inmunoelectrotransferencia en gel en condiciones altamente estrictas con ADN digerido con .EcoRI de patógenos de plantas gram negativos necrogénicos, representativos (Fig. 3) . La sonda hrpW se hibridizó con cuando menos una banda distinta de cada uno de los patovares de P. syringae probados: cepas glicinea , papulans, psis, phaseolicola , tabaci y syringae B728a y 61 (débilmente) . También se observó hibridación con P. viridiflava Ralstonia (Pseudomonas) solanacearum (débilmente) y Xanthomonas ca pestris patsvares amoraciae y vesicatoria . No se observó hibridación con ADN de Erwinia spp. Esta región en syringae pv. syringae B728a, fue examinada adicionalmente aislando el cósmido pCPP2347, el cual es portador de ADN hibridizante con hrpR y hrpW. El mapeo de restricción y el análisis parcial de secuencia de ADN indicaron que esta región es altamente conservada en estos dos patovares de P. syringae y que la HrpW de syringae pv. syringae B728a también es portador de un dominio Peí (Fig. 2A) . Ejemplo 11 - El HrpW y su dominio inductor de respuesta de hipersensibilidad, inducen necrosis similar a RH en hojas de tabaco, pero el HrpW y el dominio Peí carecen de actividad Peí detectable. Se construyeron subclonas por RCP de hrpW en pQE30, para permitir la producción de derivados de HrpW y los dos fragmentos de dominio portadores de marcas Hisß N-terminal. Estas proteínas de fusión fueron parcialmente purificadas por cromatografía en Ni-NTA y se analizaron por EGPA-DSS y por inmunoelectrotransferencia, con anticuerpos contra proteínas secretadas por Hrp de syringae pv. tomato DC3000 (Fig. 4) . Los anticuerpos antiHrpW se unieron al HrpW de longitud completa y a ambos fragmentos, pero la unión al fragmento del dominio inductor de la respuesta de hipersensibilidad fue notablemente más débil. Las transformantes productoras de HrpW fueron altamente inestables para mantener el plásmido. Así pues, los niveles de HrpW fueron muy bajos y la cromatografía Ni-NTA produjo una preparación que sólo estaba parcialmente enriquecida con HrpW. Sin embargo, la preparación de HrpW indujo una necrosis similar a ("RH") (respuesta de hipersensibilidad) en hojas de .tabaco, la cual era visiblemente diferente de la necrosis inducida por el HrpZ de syringae pv. syringae 61 solamente porque se desarrolló aproximadamente 12 horas después (Fig. 5) . La actividad inductora fue termoestable y sensible a proteasas y las preparaciones de vectores control no produjeron respuesta. El fragmento del dominio inductor de respuesta de hipersensibilidad parcialmente purificado, también indujo una necrosis que era ligeramente retrasada y esta respuesta, de manera similar a la inducida por HrpZ, pudo ser inhibida por cloruro de lantano 1.0 mM, que es un bloqueador del canal de calcio (Fig. 5) . Así pues, la necrosis inducida por el dominio harpina HrpW, es una respuesta activa en plantas. En contraste, el PelE purificado de E. chrysanthemi, obtenido en E. coli JA-221(pPEL748) (Keen, N. T., et al . , J. Bacteriol., 168: 595-606 (1986) , la cual se incorpora en la presente como referencia) , indujo una necrosis negra y macerada, la cual no era inhibida con cloruro de lantano 1.0 M, vanadato de sodio 50 µM o cicloheximida 100 µM. Esto es consistente con la expectativa de que las enzimas pécticas matan por lisis a los protoplastos turgentes a través de las paredes celulares debilitadas, en vez de mediante una inducción de la muerte celular programada. Además, el fragmento del dominio Peí no indujo una respuesta visible en el tejido de tabaco infiltrado. Las tres proteínas fueron analizadas en cuanto a la actividad Peí utilizando el ensayo sensible a A230 para productos pécticos 4, 5-insaturados (Collmer, A., et al . , Meth. Enzymol., 161: 329-35 (1988), la cual se incorpora en la presente como referencia) . No se detectó actividad a pesar de probar con ácido poligalacturónico y un derivado metilesterificado al 31% como substratos, CaCl2 y MnCl2 como cofactores y varios niveles de pH. Ejemplo 12 - La capacidad de una mutante hrpZ hrpW de syringae pv. tomato DC3000 para inducir la RH, se reduce substancialmente. Se utilizó una mutagénesis de intercambio de marcador para construir mutantes de syringae pv. tomato CUCPB5094 (AhrpZ: : nptII) , CUCPB5095 ( hrpW: :OSpr (m abd/cycOB5985 *AhrpZ: : nptll hrpW: :OSpr) . La mutación AhrpZ: : npt II es funcionalmente no polar y todas las construcciones mutantes fueron confirmadas por manchas de ADN en gel e inmunoelectrotransferencias . Se infiltraron hojas de tabaco con P. syringae pv. tomato DC3000 y con los tres derivados mutantes, a dos niveles de inoculo y se examinaron 48 horas después determinando el porcentaje de tejido infiltrado que se encontró necrótico (Tabla 1) . Tabla 1. Frecuencia reducida de inducción de respuesta de hipersensibilidad en hojas de tabaco por mutantes hrpZ y hrpW de P. syringae pv. tomato DC3000. syringae pv. Genotipo relevante Nivel de inoculo tomato (células/ml) cepa 1 x 10' 5 x 10' DC3000 tipo silvestre 17/19c 18/18 CUCPB5094 ehrpZ: : nptll 12/ 15 13/13 CUCPB4096 rpüOSpr 13/ 15 13/13 CUCPB5095 ehrpZ: : npt JIhrpfvOSpr 1/1 15/18 El número de paneles inoculados que mostraron más del 50% de colapso en relación con el número total inoculado 48 horas después de la inoculación.

Sólo la mutante hrpZhrpW fue significativamente reducida en cuanto a la frecuencia con la cual induce una RH fuerte. Para determinar si esta mutante tenía una virulencia reducida, se inocularon hojas de jitomate con la mutante y con la cepa DC3000 de tipo silvestre y se supervisó la producción de síntomas y la multiplicación bacteriana durante un periodo de 5 días. No se observó ninguna diferencia. Para identificar un segundo inductor de respuesta de hipersensibilidad anticipado en P. syringae, se seleccionó ADN de la región del gen hrp de P. syringae pv. tomato DC3000 en busca de genes con fenotipos similares al inductor de respuesta de hipersensibilidad. El hrpW presentó el fenotipo esperado, pero paradójico, de interferir con la inducción de RH cuando se expresaba en trans y se encontró que era idéntico a la unidad V transcripcional previamente identificada y que codificaba para la proteína EXP-60 secretada por Hrp previamente identificada (Lorang, J. M., et al . , Mol. Plant-Microbe Interact., 8: 49-57 (1995); Yuan, J., et al . , J^ Bacteriol., 178: 6399-402 (1996), las cuales se incorporan en la presente como referencia) . Varias características del hrpW y su producto son relevantes para responder preguntas acerca de la función de los inductores de respuesta de hipersensibilidad, el mecanismo por el cual proteínas "Avr" promotoras de parásitos son transferidas a través de la pared celular de la planta hacia el interior de las células de la planta y la conservación y organización de los loci de virulencia en bacterias patógenas de plantas. La HrpW tiene varias características generales de inductor de respuesta de hipersensibilidad, incluyendo la composición de aminoácidos, termoestabilidad, movilidad inesperadamente baja en EGPA-DSS y la capacidad de que proteínas de longitud completa y proteínas truncadas induzcan la RH (Alfano, J. R., et al . , Plant Cell, 8: 1683-98 (1996); He, S. Y., et al . , Cell, 73: 1255-66 (1993); Wei, Z. M., et al . , Science, 257: 85-8 (1992); Alfano, J. R., et al . , Mol. Microbio,!., 19: 715-28 (1996), las cuales se incorporan en la presente como referencia) . La HrpW también tiene 6 repeticiones ricas en glicina que son similares a una secuencia repetida encontrada en la HrpZ y son parecidas a las de la estructura rica en repeticiones de la HrpZ (Alfano, J. R., et al . , Mol . Microbiol. , 19: 715-28 (1996), la cual se incorpora en la presente como referencia) . La falta general de residuos de cisteína en los inductores de respuesta de hipersensibilidad, es particularmente sorprendente en la HrpW, debido a que la comparación con sus homologas fúngicas y bacterianas Peí, revela que todos los 6 residuos de cisteína conservados en aquellas proteínas han sido substituidos en la HrpW. Todas estas propiedades hacen surgir la posibilidad de que los inductores de respuesta de hipersensibilidad, como la proteína FlgM de Salmonella typhimuri um, pueden estar en un estado desdoblado en ausencia de su substrato o de su blanco (Daughdrill, G. W., et al . , Nature Struct. Biol., 4: 285-91 (1997), la cual se incorpora en la presente como referencia) . Esto parece ser importante para la FlgM, debido a las coacciones espaciales en el movimiento de las proteínas globulares a través del flagelo. Con los inductores de respuesta de hipersensibilidad, un estado desdoblado probablemente es más importante para penetrar en la matriz de la pared celular de las células de plantas que para la translocación a través de la ruta Hrp, ya que se piensa que varias proteínas Avr que viajan la ruta hacia el interior de las células de las plantas, son relativamente grandes y ricas en cisteína. La capacidad de las proteínas HrpZ y HrpW de P. syringae para inducir la RH cuando son infiltradas al tejido de hojas de tabaco, podría no reflejar directamente la función biológica, debido a que las proteínas Avr actualmente parecen ser tanto esenciales como suficientes (una vez distribuidas en el citoplasma de la planta) para inducir la RH bacteriana (Alfano, J. R., et al . , Plant Cell, 8: 1683-98 (1996), la cual se incorpora en la presente como referencia) . Por lo tanto, la hipersensibilidad de muchas plantas a los inductores de respuesta de hipersensibilidad, puede ser un subproducto de la actividad principal de estas proteínas en modificar localmente la estructura de la pared celular de la planta en apoyo a la . diseminación de la proteína "Avr" promotora de parásitos. Varias líneas de evidencia sugieren que los inductores de respuesta de hipersensibilidad de P. syringae pueden ser un componente extracelular del sistema de secreción Hrp: (i) el hrpZ está localizado dentro de un operón de secreción de hrp que parece conservado entre los patovares de P. syringae (Preston, G., et al . , Mol. Plant-Microbe Interact., 8: 717-32 (1995), la cual se incorpora en la presente como referencia) , y el hrpW (por el contrario a los genes avr típicos) parece ser tanto conservado como ligado al grupo hrp; (ii) mientras que las proteínas Avr parecen ser secretadas fuera del citoplasma bacteriano, sólo al contacto con el huésped (de manera análoga a la secreción de tipo III dependiente de contacto de las proteínas efectoras Yop de Yersinia (Cornelis, G. R., et al . , Mol. Microbiol., 23: 861-67, (1997), la cual se incorpora en la presente como referencia) , la HrpZ y HrpW son secretadas cuando el sistema Hrp es activado transcripcionalmente, lo cual sugiere que pueden ser componentes del aparato de traslocación; (iii) el hallazgo de que la expresión en trans de hrpZ o hrpW inhibe la actividad inductora de RH de bacterias de tipo silvestre, es consistente con el hecho de que los inductores de respuesta de hipersensibilidad son componentes de un ensamblaje proteico estequiométricamente sensible; (iv) la HrpZ se asocia con las paredes en vez de con las membranas, de las células de planta, y la proteína no induce respuesta en protoplastos que no tienen pared (Hoyos, M. E., et al . , Mol. Plant-Microbe Interact., 9: 608-16 (1996), la cual se incorpora en la presente como referencia) ; (v) la presencia de un dominio Peí en HrpW sugiere que existe una interacción con la fracción péctica de la pared celular, que es el componente que controla la porosidad de la matriz (Baron-Epel, O., et al . , Planta, 175: 389-95 (1988), la cual se incorpora en la presente como referencia) . La creciente evidencia de que las proteínas Avr grandes, e.g., AvrBs3 (125 kDa) (Van den Ackerveken, et al . , Cell, 87: 1307-16 (1996), la cual se incorpora en la presente como referencia) , son distribuidas hacia el citoplasma de la célula de planta, sugiere que el sistema Hrp puede abrir un canal a través de la pared celular de la planta. La proteína HrpW no tiene actividad Peí detectable. También pueden encontrarse homólogos de Peí sin actividad detectable in vitro en el polen y en tejidos de estilo de varias plantas y la conservación de los residuos catalíticos en estas proteínas sugiere una función enzimática críptica (Henrissat, B., et al . , Plant Physiiol., 107: 963-76 (1995), la cual se incorpora en la presente como referencia) . La falta de actividad Peí detectable en la HrpW no es de sorprender, dado el parasitismo biotrófico de P. syringae y los efectos dañinos de las Peí típicas en los tejidos de plantas. Sin embargo, la conservación del dominio Peí de las proteínas HrpW de P. syringae y de E. amyl ovora, sugiere que estas proteínas tienen una función relacionada con Peí. En contraste,- la extrema variación de los dominios inductores activos argumenta contra un fundamento enzimático para la actividad inductora de las proteínas. La mutación de la unidad de transcripción V no reduce la RH ni los fenotipos de virulencia de P. syringae pv. tomato DC3000 (Lorang, J. M., et al . , Mol. Plant-Microbe Interact., 8: 49-57 (1995), la cual se incorpora en la presente como referencia) y la mutante hrpZhrpW fue significativamente reducida sólo en su fenotipo RH (aunque el ensayo de virulencia probablemente pudo presentar una leve reducción) . Una interpretación de estas observaciones es que P. syringae produce proteínas similares a inductores de' respuesta de hipersensibilidad adicionales, análogas a las isoenzimas Peí múltiples de E. chrysanthemi y E. carotovora (Barras, F., et al . , Annu. Rev. Phytopathol . , 32: 201-34 (1994), la cual se incorpora en la presente como referencia) . Posiblemente como resultado de la coevolución huésped-parásito o de la complejidad estructural de la pared celular, la redundancia (o especialización sutil) puede ser característica de los sistemas de virulencia que interactúan extensamente con la pared celular de células de planta. La presencia de secuencias que se hibridizan con hrpW en varias otras bacterias patógenas de plantas, particularmente P. viridiflava y X. campestris, es significativa por varias razones. Puesto que hrpW no se híbridiza con el ADN de E. amylovora o de E. carotovora, las cuales se sabe que producen un inductor de respuesta de hipersensibilidad y un Peí similares, respectivamente, la hibridación con P. viridiflava y X. campestris sugiere que estas bacterias producen una proteína que es altamente similar a la HrpW. Esto, a su vez, implica que P. viridiflava tiene un sistema. Hrp y que X. campestris produce un inductor de respuesta de hipersensibilidad. Aunque el sistema Hrp de X. campestris ha sido extensamente caracterizado (Bonas, U. en "Current Topics in Microbiology and Immunology", Vol. 192: Bacterial Pathogenesis of Plants and Animáis - Molecular and Cellular Mechanisms, ed.

Dangl, J. L., (Springer-Verlag, Berlín), pp. 79-98 (1994), la cual se incorpora en la presente como referencia) , no se ha encontrado un inductor de respuesta de hipersensibilidad ni otra proteína que sea secretada por el sistema Hrp en cultivo. El hrpW debe ser útil como sonda para clonar a partir de X. campestris un gen que codifica para tal proteína. El concepto de isla de patogenicidad predice que el grupo de genes hrp está localizado en una región más grande enriquecida con genes relacionados con virulencia (Groisman, E. A., et al . , Cell, 87: 791-94 (1996); Alfano, J. R., et al . , Plant Cell, 8: 1683-98 (1996), las cuales se incorporan en la presente como referencia) . Algunas partes de la región de virulencia se esperaría que fueran portadoras de genes codificadores de efectores que fueran "activables" para permitir una rápida coevolución del parásito con el huésped. El locus hrmAlavrPphE en el extremo opuesto y del grupo hrp del hrpR, proporciona un ejemplo de esto. Otras regiones más conservadas serían portadoras de genes relacionados con funciones parasitarias esenciales tales como la distribución de proteínas efectoras (e.g., "Avr") hacia el interior de la célula huésped. La comparación de P. syringae patovares tomato y syringae indica que el hrpW está ubicado en tal región. Colectivamente, estas observaciones sugieren una función muy importante de la HrpW en la patogenicidad bacteriana para las plantas . Aunque tanto los inductores de respuesta de hipersensibilidad como las proteínas Avr deben viajar por la ruta tipo III, éstas difieren mucho en sus propiedades estructurales, en su capacidad de ser secretadas en cultivo y en sus efectos de determinación de rango de huéspedes y otros atributos de virulencia. El descubrimiento de un inductor de respuesta de hipersensibilidad de P. syringae con un dominio Peí, proporciona evidencia adicional de que también difieren en su sitio de acción, en donde muchas proteínas Avr actúan dentro de las células de las plantas y los inductores de respuesta de hipersensibilidad lo hacen afuera. Aunque la presente invención ha sido descrita con detalle para el propósito de ilustración, debe entenderse que tales detalles son únicamente para ese propósito y que los técnicos en la materia pueden realizar variaciones sin apartarse del espíritu y los alcances de la presente invención, tal como queda definida por las siguientes reivindicaciones. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecedente, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Una molécula de ADN aislada, caracterizada porque codifica para una proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad, en donde la molécula de ADN aislada se selecciona del grupo que consiste de (a) una molécula de ADN que comprende la secuencia nucleotídica de la SEQ ID No. 1, (b) una molécula de ADN que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 2, (c) una molécula de ADN que se hibridiza con una molécula de ADN que comprende la secuencia nucleotídica de la SEQ ID No. 1, bajo condiciones estrictas y (d) una molécula de ADN complementaria a las moléculas de ADN de los incisos (a) , (b) y (c) .
2. 2. Una molécula de ADN aislada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de ADN es una molécula de ADN que comprende la secuencia nucleotídica de la SEQ ID No. 1.
3. 3. Una molécula de ADN aislada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de ADN es una molécula de ADN que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 2.
4. 4. Una molécula de ADN aislada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de ADN es una molécula de ADN que se hibridiza con una molécula de ADN que comprende la secuencia nucleotídica de la SEQ ID No. 1, bajo condiciones estrictas.
5. 5. Una molécula de ADN aislada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de ADN es una molécula de ADN complementaria a las moléculas de ADN de los incisos (a) , (b) y (c) .
6. 6. Un vector de expresión transformado con la molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1. . Un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la molécula de ADN está en una orientación de sentido apropiada y con un marco de lectura correcto. 8. Una célula huésped transformada con la molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1. 9. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la célula huésped se selecciona del grupo que consiste de una célula de planta o un célula bacteriana. 10. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la molécula de ADN es transformada con un vector de expresión. 11. Una planta transgénica transformada con la molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1. 12. Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porgue la planta se selecciona del grupo que consiste de alfalfa, arroz, trigo, cebada, centeno, algodón, girasol, cacahuate, maíz, papa, papa dulce, frijol, chícharo, achicoria, lechuga, endivia, col, col de Bruselas, remolacha, chirivía, nabo, coliflor, brócoli, rábano, espinaca, cebolla, ajo, berenjena, pimienta, cilantro, zanahoria, chayóte, calabaza, calabacín, pepino, manzana, pera, melón, cítricos, fresa, uva, frambuesa, piña, soya, tabaco, jitomate, sorgo y caña de azúcar. 13. Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la planta se selecciona del grupo que consiste de Arabidopsis thaliana , Saintpaulia, petunia, geranio, poinsettia, crisantemo, clavel y zinnia. 14. Una semilla de planta transgénica transformada con la molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1. 15. Una semilla de planta transgénica de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la semilla de planta se selecciona del grupo que consiste de alfalfa, arroz, trigo, cebada, centeno, algodón, girasol, cacahuate, maíz, papa, papa dulce, frijol, chícharo, achicoria, lechuga, endivia, col, col de Bruselas, remolacha, chirivía, nabo, coliflor, brócoli, rábano, espinaca, cebolla, ajo, berenjena, pimienta, cilantro, zanahoria, chayóte, calabaza, calabacín, pepino, manzana, pera, melón, cítricos, fresa, uva, frambuesa, piña, soya, tabaco, jitomate, sorgo y caña de azúcar. 16. Una semilla de planta transgénica de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la semilla de planta se selecciona del grupo que consiste de Arabidopsis thaliana, Saintpaulia, petunia, geranio, poinsettia, crisantemo, clavel y zinnia. 1
7. 7. Una proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad aislado, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de una proteina o polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID No. 2 y una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que se hibridiza con una molécula de ADN que comprende la secuencia nucleotídica de la SEQ ID No. 1. 1
8. 8. Una proteína o. polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la proteína o polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID No. 2. 1
9. 9. Una proteína o polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la proteína o polipéptido es codificado por un ácido nucleico que se hibridiza con una molécula de ADN que comprende la secuencia nucleotídica de la SEQ ID No. 1. 20. Un método para impartir resistencia a enfermedades a las plantas, caracterizado porque comprende: aplicar una proteína o polipéptido de conformidad con la reivindicación 17 en una forma no infecciosa, a una planta o semilla de planta, bajo condiciones estrictas, para impartirle resistencia a enfermedades. 21. Un método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque las plantas son tratadas durante la aplicación. 22. Un método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque las semillas de planta son tratadas durante la aplicación, en donde el método además comprende: plantar las semillas tratadas con el inductor de respuesta de hipersensibilidad, en suelo natural o artificial y propagar las plantas a partir de las semillas plantadas en el suelo. 23. Un método para incrementar el crecimiento de plantas, caracterizado porque comprende: aplicar una proteína o polipéptido de conformidad con la reivindicación 17 en una forma no infecciosa a la planta o a la semilla de planta, bajo condiciones efectivas para incrementar el crecimiento de la planta. 24. Un método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque las plantas son tratadas durante la aplicación. 25. Un método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque las semillas de planta son tratadas durante la aplicación, en donde el método además comprende: plantar las semillas tratadas con el inductor de respuesta de hipersensibilidad, en suelo natural o artificial y propagar las plantas a partir de las semillas plantadas en el suelo. 26. Un método para controlar insectos de plantas, caracterizado porque comprende: aplicar una proteína o polipéptido de conformidad con la reivindicación 17 en una forma no infecciosa a una planta o semilla de planta, bajo condiciones efectivas para controlar insectos. 27. Un método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque las plantas son tratadas durante la aplicación. 28. Un método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque las semillas de planta son tratadas durante la aplicación, en donde el método además comprende: plantar las semillas tratadas con el inductor de respuesta de hipersensibilidad en suelo natural o artificial y propagar las plantas a partir de las semillas plantadas en el suelo. 29. Un método para impartir resistencia a enfermedades a las plantas, caracterizado porque comprende: proporcionar una planta transgénica o semilla de planta transgénica transformada con una molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1 y hacer crecer la planta transgénica o plantas transgénicas producidas a partir de semillas de planta transgénica, bajo condiciones efectivas para impartirles resistencia a enfermedades. 30. Un método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque se proporciona una planta transgénica. 31. Un método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque se proporciona una semilla de planta transgénica. 32. Un método para incrementar el crecimiento de plantas, caracterizado porque comprende: proporcionar una planta transgénica o semilla de planta transgénica transformada con una molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1 y hacer crecer la planta transgénica o plantas transgénicas producidas a partir de semillas de planta transgénicas, bajo condiciones efectivas para incrementar el crecimiento de la planta. 33. Un método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque se proporciona una planta transgénica. 34. Un método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque se proporciona una semilla de planta transgénica. 35. Un método para el control de insectos de plantas, caracterizado porque comprende: proporcionar una planta transgénica o semilla de planta transgénica transformada con una molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1 y hacer crecer la planta transgénica o plantas transgénicas producidas a partir de semillas de plantas transgénicas, bajo condiciones efectivas para controlar insectos. 36. Un método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque se proporciona una planta transgénica. 37. Un método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque se proporciona una semilla de planta transgénica. 38. Una composición caracterizada porque comprende: una proteína o polipéptido de conformidad con la reivindicación 17 y un vehículo. 39. Una composición de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque además comprende un aditivo que se selecciona del grupo que consiste de fertilizantes, insecticidas, fungicidas, nematicidas y mezclas de los mismos. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una proteína o polipéptido aislado que induce una respuesta de hipersensibilidad en plantas, así como una molécula de ADN aislada que codifica para la proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad. Esta proteína o polipéptido aislado y la molécula de ADN aislada, se pueden utilizar para impartir resistencia a enfermedades a plantas, para incrementar el crecimiento de plantas y/o para controlar insectos en plantas. Esto se puede lograr mediante la aplicación de la proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad, en una forma no infecciosa, a plantas o semillas de planta bajo condiciones efectivas para impartirle resistencia a enfermedades, para incrementar el crecimiento de plantas y/o para controlar insectos en las plantas o en las plantas crecidas a partir de las semillas de planta. Alternativamente, se pueden proporcionar plantas transgénicas o semillas de planta transgénicas transformadas con una molécula de ADN que codifica para una proteína . o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad y las plantas transgénicas o las plantas provenientes de las semillas de planta transgénicas se hacen crecer bajo condiciones efectivas para impartirles resistencia a enfermedades, para incrementar el crecimiento y/o para controlar insectos en las plantas o en las plantas crecidas a partir de las semillas de planta.