MXPA00001200A - Inductor de respuesta de hipersensibilidad de erwinia amylovora y su uso - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una proteína o polipéptido aislado que induce una respuesta de hipersensibilidad en plantas, asícomo una molécula de ADN aislada que codifica para la proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad. Esta proteína o polipéptido aislado y la molécula de ADN aislada, se pueden utilizar para impartir resistencia a enfermedades a plantas, para incrementar el crecimiento deplantas y/o para controlar insectos en plantas. Esto se puede lograr mediante la aplicación de la proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad, en una forma no infecciosa, a plantas o semillas de planta bajo condiciones efectivas para impartirle resistencia a enfermedades, para incrementar el crecimiento de plantas y/o para controlar insectos en las plantas o en las plantas crecidas a partir de las semillas de planta. Alternativamente, se pueden proporcionar plantas transgénicas o semillas de planta transgénicas transformadas con una molécula de ADN codifica para una proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad y las plantas transgénicas o las plantas provenientes de las semillas de planta transgénicas se hacen crecer bajo condiciones efectivas para impartirles resistencia a enfermedades, para incrementar el crecimiento y/o para controlar insectos en las plantas o en las plantas crecidas a partir de las semillas de planta.

Description

INDUCTOR DE RESPUESTA DE HIPERSENSIBILIDAD DE ERWINIA ?MXLOVORA Y SU USO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un inductor de respuesta de hipersensibilidad proveniente de Erwinia a ylovora y a su uso. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las interacciones entre patógenos bacterianos y sus huéspedes plantas, por lo general caen en dos categorías: (1) compatibles (patógeno-huésped) que causan crecimiento bacteriano intercelular, desarrollo de síntomas y desarrollo de enfermedad en la planta huésped; y (2) incompatibles (patógeno-no huésped) , dando como resultado la respuesta de hipersensibilidad, que es un tipo particular de interacción incompatible, sin síntomas de enfermedad progresiva. Durante las interacciones compatibles en las plantas huésped, las poblaciones bacterianas se incrementan drásticamente y se presentan síntomas progresivos. Durante las interacciones incompatibles, las poblaciones bacterianas no se incrementan y no se presentan síntomas progresivos. La respuesta de hipersensibilidad es una necrosis rápida y localizada que está asociada con la defensa activa de las plantas contra numerosos patógenos (Kiraly, Z., REF.: 32712 "Defenses Triggered by the Invader: Hypersensitivity", páginas 201-224 en: Plant Disease: An Advanced Treatise, Vol, 5, J. G. Horsfall y E. B. Co ling, ed. Acade ic Press, Nueva York (1980); Klement, Z., "Hypersensitivity", páginas 149-177 en: Phytopathogenic Prokaryotes, Vol. 2, M. S. Mount y G. H Lacy, ed. Academic Press, Nueva York (1982) ) . La respuesta de hipersensibilidad inducida por bacterias se observa fácilmente como un colapso tisular si altas concentraciones (> 10 células/ml) de un patógeno de rango limitado de huéspedes tal como Pseudomonas syringae o Erwinia amylovora se infiltran en las hojas de plantas no huéspedes (la necrosis ocurre sólo en células de plantas aisladas a menores niveles de inoculo) (Klement, Z., "Rapid Detection of Pathogenicity of Phytopathogenic Pseudomonads", Nature 199: 299-300; Klement, et al . , "Hypersensitive Reaction Induced by Phytopathogenic Bacteria in the Tobacco Leaf", Phytopathology 54: 474-477 (1963); Turner, et al . , "The Quantitative Relation Between Plant and Bacterial Cells Involved in the Hypersensitive Reaction", Phytopathology 64: 885-890 (1974); Klement, Z., "Hypersensitivity", páginas 149-177, en Phytopathogenic Prokaryotes, Vol. 2, M. S. Mount y G. H. Lacy, ed. Academic Press, Nueva York (1982) ) . Las capacidades de inducir la respuesta de hipersensibilidad en un no huésped y de ser patógeno en un huésped, parecen estar ligadas. Tal como observó Klement, Z., "Hypersensitivity", páginas 149-177, en Phytopathogenic Prokaryotes, Vol. 2, M. S. Mount y G. H. Lacy, ed. Academic Press, Nueva York, estos patógenos también causan necrosis fisiológicamente similares, aunque retardadas, en sus interacciones con huéspedes compatibles. Además, la capacidad de producir la respuesta de hipersdnsibilidad o patogénesis, depende de un conjunto común de genes, denominado hrp (Lindgren, P. B., et al . , "Gene Cluster of Pseudomonas syringae pv. "phaseolicola" Controls Pathogenicity of Bean Plants and Hypersensitivity on Nonhost Plants", J. Bacteriol. 168: 512-22 (1986); Willis, D. K. et al . , "hrp Genes of Phytopathogenic Bacteria", Mol. Plant-Microbe Interact., 4: 132-138 (1991)). En consecuencia, la respuesta de hipersensibilidad puede guardar indicios tanto de la naturaleza de la defensa de la planta como del fundamento de la patogenicidad bacteriana. Los genes hrp están ampliamente distribuidos en patógenos gram negativos de plantas, en donde están agrupados, conservados y en algunos casos son intercambiables (Willis, D. K. et al . , nhrp Genes of Phytopathogenic Bacteria", Mol. Plant-Microbe Ineteract., 4: 132-138 (1991); Bonas, U., "hrp Genes of Phytopathogenic Bacteria", páginas 79-98, en: Current Topics in Microbiology and Immunology: Bacterial Pathogenesis of Plants and Animáis - Molecular and Celular Mechanisms, J. L. Dangl, ed. Springer-Verlag, Berlín (1994) ) . Varios genes hrp codifican para componentes de una ruta de secreción proteica similar a la usada por Yersiniar Shigella y Salmonella spp. para secretar proteínas esenciales en enfermedades animales (Van Gijsege , et al . , "Evolutionary Conservation of Pathogenicity Deter inants Among Plant and Animal Pathogenic Bacteria", Trends Microbiol, 1: 175-180 (1993) ) . En E. amylovora , P. syringae y P. solanacearumr los genes hrp se ha demostrado que controlan la producción y secreción de inductores de proteína ricos en glicina de la respuesta de hipersensibilidad (He, S. Y., et al . , 2Psudomonas Syringae pv. Syringae Harpinpss : a Protein that is Secreted via the Hrp Pathway and Elicits the Hypersensitive Response in Plants", Cell, 73: 1255-1266 (1993), Wei, Z.-H., et al . , "Hrpl of Erwinia amylovora Functions in Secretion of Harpin and is a Member of a New Protein Family", J. Bacteriol, 175: 7958-7967 (1993); Arlat, M. et al . , "PopAl, a' Protein Which Induces a Hypersensitive-like Response on Specific Petunia Genotypes, is Secreted via the Hrp Pathway of Pseudomonas solanacearum" , EMBO, J. 13: 543-553 (1994)). La primera de estas proteínas fue descubierta en E. amylovora Ea321, que es una bacteria que causa la roya de fuego de plantas rosáceas y fue designada como harpina (Wei, Z'.-M., et al . , "Harpin, Elicitor of the Hypersensitive Response Produced by the plant Pathogen Erwinia amylovora " ', Science, 257: 85-88 (1992)). Mutaciones en el gen hrpN codificante revelaron que la harpina es requerida por E. amylovora para inducir una respuesta de hipersensibilidad en hojas de tabaco no huéspedes y provocar los síntomas de la enfermedad en la pera, que es altamente susceptible. La proteína PopAl de P. solanacearum GMI1000 tiene propiedades físicas similares y también induce la respuesta de hipersensibilidad en hojas de tabaco, las cuales no son un huésped para esta cepa (Arlat, et al . , "PopAl, a Protein Which Induces a Hypersensitive-like Response on Sepecific Petunia Genotypes, is Secreted via the Hrp Pathway of Psudomonas solanacearum", EMBO J. 13: 543-53 (1994)). Sin embargo, las mutantes de P. solanacearum popA todavía inducen la respuesta de hipersensibilidad en el tabaco y provocan la enfermedad en el jitomate. Así pues, la función de estos inductores de la respuesta de hipersensibilidad ricos en glicina puede variar ampliamente entre patógenos gram negativos de las plantas. Otros inductores de la respuesta de hipersensibilidad patógenos para plantas han sido aislados, clonados y secuenciados. Estos incluyen: Erwinia chrysanthemi (Bauer, et al . , "Erwinia chrysanthemi HarpinEch: Soft-Rot Pathogenesis", MPMI 8 (4) : 484-91 (1995)); Erwinia carotovora (Cui, et al . , "The RsmA Mutants of Erwinia carotovora subsp. carotovora Strain Ecc71 Overexpress hrpNEcc and Elicit a Hypersensitive Reaction-like Response in Tobacco Leaves", MPMI 9 (7) : 565-73 (1966)); Erwinia stewartii (Ahmad, et al . , "Harpin is not Necessary for the Pathogenicity of Erwinia stewartii on Maize", 8th Intfl. Cong. Molec. Plant-Microb. ínter., Julio 14-19, 1996 y Ahmad, et al . , "Harpin is not Necessary for the Pathogenicity of Erwinia stewartii on Maize", Ann. Mtg. Am. Phytopath. Soc., Julio 27-31, 1996) ; y Psudomonas syringae pv. syringae (Publicación Internacional WO 94/26782 de Cornell Research Foundation, Inc.). La presente invención presenta avances en el esfuerzo de identificar, clonar y secuenciar proteínas o péptidos inductores de respuesta de hipersensibilidad provenientes de patógenos de plantas. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una proteína o polipéptido aislado que induce una respuesta de hipersensibilidad en plantas, así como a una molécula de ADN aislado que codifica para la proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad.

La proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad se puede utilizar para impartirle resistencia a la enfermedad a plantas, para incrementar el crecimiento de plantas y/o para controlar insectos. Esto involucra la aplicación de la proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad, en una forma no infecciosa, a plantas o semillas de plantas, bajo condiciones efectivas para impartir resistencia a la enfermedad, para incrementar el crecimiento de la planta y/o para controlar insectos en plantas o plantas que crecen a partir de las semillas. Como alternativa a la aplicación de la proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad a plantas o semillas de plantas con el fin de impartirles resistencia a la enfermedad, . para incrementar el crecimiento de la planta y/o para controlar insectos en las plantas, se pueden utilizar plantas o semillas de planta transgénicas. Cuando se utilizan plantas transgénicas, esto involucra proporcionar una planta transgénica transformada con una molécula de ADN que codifica para una proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad y hacer crecer la planta bajo condiciones efectivas para impartirle resistencia a enfermedades, para incrementar el crecimiento de la planta y/o para controlar insectos en las plantas o plantas crecidas a partir de las semillas. Alternativamente, se puede proporcionar y plantar en el suelo una semilla de planta transgénica transformada con la molécula de ADN que codifica para la proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad. Después, la planta es propagada bajo condiciones efectivas para impartirle resistencia a enfermedades, para incrementar el crecimiento de la planta y/o para controlar insectos en las plantas o en las plantas crecidas a partir de las semillas. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Figuras 1A y B muestran la estructura molecular de la región del genoma de E. amylovora conteniendo el hrpW. La Figura 1A ilustra los cósmidos pCPP430 y pCPP450, que contienen la región reguladora y secretoria del grupo hrp de E. amylovora . Las flechas gruesas sobre las clonas de cósmido, indican las unidades transcripcionales, en donde se dan los nombres de los operones caracterizados anteriormente (Wei, et al . , Science, 257: 85-88 (1992); Zumoff, et al . , The hrp Gene Cluster of Erwinia amylovora, eds . Hennecke, H. & Verma, D.P.S. (Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Países Bajos), Vol. 1, pp. 53-60 (1991); Bogdavone, et al . , J. Bacteriol., 178: 1720-30 (1996) y Kim, et al . , ¿L Bacteriol. , 179: 1690-97 (1997), las cuales se incorporan en la presente como referencia) . La Figura IB muestra la ubicación del hrpW que codifica para una proteína rica en Gly y se utilizaron subclonas del pCPP1012 en el estudio. Las cajas y las flechas gruesas indican los genes o los marcos de lectura abierta; los triángulos obscuros son promotores putativos dependientes de HrpL. Sitios de restricción: B, Bamñl ; E, EcoRl ; H, íTindlII; Ea, Eagl ; Hp, Hpal . ~ La Figura 2 muestra la expresión del hrpW por un sistema de expresión génica dirigido por ARN polimerasa del T7. Carriles: 1, E. coli DH5a (pGPl-2/pBC SK (-) ) ; 2, E. coli DH5a(pGPl-2/pCPP1232) . La flecha entre los puntos 84 kD y 53 kD hacia la banda del carril 2, corresponde a la proteína HrpW. La Figura 3 muestra el alineamiento de la HrpW con las pectato liasas de Nectria Haematococca apareamiento tipo VI ( Fusari um solani f. sp. pisi ) y Erwinia carotovora subespecie carotovora . Las secuencias fueron alineadas con el programa PILEUP (paquete de software GCG, versión 7.3) con parámetros por definición y se editó un alineamiento manualmente utilizando el programa LINEUP del mismo paquete. Los residuos conservados están encerrados en cajas, las regiones altamente conservadas están subrayadas y las a-hélices potenciales de la HrpW están sombreadas. Las Figuras 4A y B son inmunoelectrotransferencias que muestran la producción y secreción dependiente de hrp de la proteína HrpW en E. amylovora . Carriles en la Figura 4: 1, E. coli DH5a(pGPl-2/pCPP1232) ; 2, HrpN; 3, preparación celular completa ("CP") de Ea321; 4, preparación de sobrenadante ("SP") de Ea321; 5, CP de Ea321-K49; 6, SP de Ea321-K49; 7, CP de Éa321-G84; 8, SP de Ea321-G84. Carriles de la Figura 4B: É. coli DH5a(pGPl-2/pCPP1232) ; 2, HrpN; 3, CP de Ea273; 4, ASP de Ea273; 5, CP de Ea321-K49; 6, SP de Ea321-K49; 7, CP de Ea321-G73; 8, SP de Ea321-G73. La Figura 5A muestra una hoja de tabaco que muestra una actividad inductora de respuesta de hipersensibilidad ("RH") residual de mutantes de hrpN y la RH inducida por HrpN y HrpW. Paneles: 1, E. soli DH5a(pCPP430) ; 2, E. coli DH5 (pCPP430-T5) ; 3, E. coli MC4100 (pCPP450) ; 4, E. coli MC4100 (pCPP450-T5) ; 5, solución reguladora de KP04 5 mM (pH 6.5); 6, E. amylovora Ea321; 7, E. amyl ovora Ea321-T5; 8, HrpN PILC (Preparación Inductora Libre de Células) (contiene 0.5 mg/ml de HrpN); 9, preparación de HrpW (0.5 mg/ml) eluída del gel que contiene proteínas de E. coli DH5a(pGPl-2/pCPP1232) ; 10, preparación hecha a partir de E. coli DH5a (pGPl-2/pBC SK (-) ) de la misma manera que en el carril 9. La fotografía fue tomada 3 días después de la infiltración.

La Figura 5B muestra la supresión de la RH inducida por HrpW por inhibidores del metabolismo de plantas. Paneles: solución reguladora de KPO4 1.5 mM (pH 6.5); 2, HrpW PILC; 3, HrpN PILC + cicloheximida; 4, HrpW PILC + LaCl3; 5, HrpW PILC + Na3V04; 6, HrpN PILC; 7, HrpN PILC + cicloheximida; 8, HrpN PILC + Na3V04; 9, PelE en Tris-HCl 10 mM (pH 7.8); 10, PelE + cicloheximida; 11, PelE + Na3V04. Las PILC contienen 0.1 mg/ml de HrpW del HrpN.

La fotografía de la hoja de tabaco fue tomada 36 horas después de la infiltración. La Figura 6 muestra una inmunoelectrotransferencia tipo Southern, la cual indica el hrpW de E. amyl ovora Ea321 está presente en otras bacterias. El ADN genómico de las cepas fue sondeado con un fragmento Hpal de 1.4 kb que contiene hrpW de Ea321. Carriles: 1, Ea321; 2, Ea266; 3, Ea273; 4, Ea246; 5, Ea510; 6, Ea528; 7, Ea574; 8, Ea546; 9, Ea557; 10, Ea562; 11, Ea587; 12, E. carotovora subespecie carotovora ATCC15713; 13, E. mallotivora 1818; 14, E. salicis 1822; 15, pCPP2157 de E. chrysantemi EC16. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una molécula de ADN aislada que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No. 1, tal como la siguiente: ATGTCAATTC TTACGCTTAA CAACAATACC TCGTCCTCGC CGGGTCTGTT CCAGTCCGGG 60 GGGGACAACG GGCTTGGTGG TC?TAATGCA AATTCTGCGT TGGGGCAACA ACCCATCGAT 120 CGGCAAACCA TTGAGCAAAT GGCTCAATTA TTGGCGGAAC TGTTAAAGTC ACTGCTATCG 180 CCACAATCAG GTAATGCGGC AACCGGAGCC GGTGGCAATG ACCAGACTAC AGGAGTTGGT 240 AACG TGGCG GCCTGAACGG ACGAAAAGGC ACAGCAGGAA CCACTCCCCA GTCTG?CAGT 300 CAGAACATGC TGAGTGAGAT GCCCAACAAC GGGCTGGATC AGGCCATCAC GCCCGATGGC 360 CAGGGCGGCG CGCAGATCGG CGATAATCCT TTACTGAA?G CCATGCTGAA GCTTATTGCA 420 CGCATGATGG ACGGCCAAAG CGATCAGTTT GGCCAACCTG GTACGGGCAA CAACAGTGCC 480 TCTTC GCTA CTTCTTCATC TGGCGGTT:" CGTGT AACG ATCTTATC?3 GGGGAAGGCC 540 r GGCA ACTCCCCT G CGSC?ACTAC TCTCCCGTCA GTAC TCT ?CCCCZT-CC ¿oo ACGC A?CGT CCCCTACCTC ACCCCTTGAT 7 CCC TCTT CTCCCAC ?A AGCAGCCGGG éí.0 GGC?GCACGC CGGTAACCGA TC?TC TGAC CC GTTGGTA GCGCGGGCAT CGGGGCCGGA 720 AATTOGGTG3 CCTTC?CCAG CGCCGGCGCT AATCAGACGG TGCTGC?TGA C?CCATTACC 780 rrr ?? GC :; CTCAGGTGTT TGATCCCAAA GGACAAACCT TCACCGCCGG TTCAGAATTA 840 G~CGAT3GC3 GCC?GTCTG? A?ACCAGAAA CrGCTCTTT? TACTGGAAÜA CGGTGCC?-C 900 CT3AAAAACG TCACCATGGG CGACGACGGG G GGATGGTA TTC?TCTr7A CGGTGATGCC 960 AAAAT? ACA ATC CACCT CAGCA?CGTG GGTG?GC?CG. CG TT?C GT TAAGCCAA?G 1020 G..-;"T~GG A AAAAATCCC? CCTTGAAATC AC AAC??TT C- CGAGC'? CGC TC~GAC ¿080 ?A ?TCGGG" ?GCTGAATGG CGATACTA?G CGGAGCCTT AG??CGTG?A GGCCAAAGAC ;I4O tr.-GGT?.rrt GT- TA G A- TAACC^CCGT CAACAGGGT AC?^-GATCG G?ATCTGAGG ;2O C?TATCAGCC CAGAA-JACGG 'IAAGTTGTC; TTCGTTAAAA CCGATAGC A GGGGCT??AC 1260 CT.-; %T?CC I GTG?T?TG G ?GTGGGTGAT GTTG??AACC ?GT?G?AACT GC GATGTCC I32C L_GAÍ, GA AGGTGGCTT »A A G U4-Í Véase el GenBank No. de Acceso U94513. La molécula de ADN aislada de la presente invención, codifica para una , proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad que cieñe la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No . 2 siguiente : Met Ser He Gly He Thr Pro Arg Pro Glr. Gln Thr Thr Thr Pro Leu 1G 15 Asp Phe Ser Ala Leu Ser Gly Lys Ser Pro Glp Pro Asn Thr Phe Gly 20 25 30 ?sp GlT. Ala He Tñr Pro Asp Gly Glr Gly Gly Gly Gln He Ql v As-. 115 120 ?:5 Asp Pro Leu Leu Lyc Ala Her Leu Lys Leu He Ala Arg Met Met Asi 130 13b 140 Gly Gln Ser Asp Gln Phe Gly Glp Pro Gly Thr Gly Asn Asn Se- Ala 145 IbO 155 ' 160 Ser Ser Gly Thr Ser Ser Ser Gly Gl Ser Pro Phe Asn Asp Leu Ser 165 17C 17s Gly Gly Lys Ser Pro /al Ser Thr P e Ser Pro Pro Ser Thr Pro Thr Ser Pro Thr Ser Pro 155 00 !0S Leu Asp ?ne Prc Ser Ser Pro Thr Lys Ala Ala GJ y Gly Ser > Pro 21 O 215 220 Val Thr Asp Hie Pro Asp Pro Val Gly Ser Ala Gly Il Glv Ala Gly -- -"> 30 2 2 í - 24C Asr. Ser Val Ale Phe Thr Ser A? Gly Ala Asn Glr. Tr.r a' e H" s 245 250 " ;55 Asp Tr-r He Thr Val Lys Ala Gly Gln Val Phe Asp Gly Lys Gly Gln 260 2S5 27C Thr Phe Thr Ala Gly Ser Glu Leu Gly Asp Gly Gly Gln Ser Glu Asn 275 280 285 Gln Lys Pro Leu Phe He Leu Glu Asp Gly Ala Ser Leu Lys Asn Val 290 295 300 Thr Me- Giy Asp Asp Gly Ala Asp Gly He His Leu Tyr Gly Asp Ala 30S 310 315 320 Lys T-le Asp Asn Leu. His Val Thr Asn Val Gly Glu Asp Ala He Thr 325 330 335 Val Lys Pro Asn Ser Ala Gly I.ys Lys Ser Kis Val Glu He Thr Asn 340 345 350 Ser Ser Phe Glu Eis Ala Ser Asp Lys He Leu Gln Leu Asn Ala Asp 355 360 365 Thr Asn Leu Ser Val Asp Asn Val l s Ala Lys Asp phe Gly Thr Phe 370 375 80 al Arq Thr Asn Gly Gly Glp Gln Gly ?sn Trp Asp Leu Asn Leu Ser 385 390 395 0 Q His He Ser Ala Glu Aep Gly Lys Phe Ser Phe Val Lys Ser Asp Ser 405 410 415 Glu Gly Leu Asp Val Asn Thr Ser Asp He Ser Leu Gly Asp Val Glu 420 425 430 Asn His Tyr vs Val Pro Met Ser Ala Asn Leu Lys Val Ala Glu 435 44 C 445 Esta proteina o polipéptido es acida, rica en glicina y serina y carece de cisteína. También . es termoestable, sensible a proteasas y es suprimida por inhibidores del metabolismo de las plantas. La proteina o polipéptido de la presente invención tiene un tamaño molecular predicho de aproximadamente 4.5 Da.

Los fragmentos del polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad anterior, quedan abarcados dentro de la presente invención. Se pueden producir fragmentos adecuados por varios medios. En el primero, subclonas del gen que codifica para la proteína inductora de la presente invención, se producen mediante manipulación genética molecular convencional, subclonando fragmentos génicos. Después, las subclonas se expresan in vi tro o in vivo en células bacterianas para obtener una pequeña proteína o péptido, el cual se puede probar con respecto a la inducción de actividad de conformidad con el procedimiento que se describe más adelante. Como alternativa, se pueden producir fragmentos de una proteína inductora por digestión de una proteína inductora de longitud completa con enzimas proteolíticas, tales como quimiotripsina o proteinasa A de Staphylococcus, o tripsina. Es probable que las diferentes enzimas proteolíticas rompan a las proteínas inductoras en diferentes sitios, basándose en la secuencia de aminoácidos de la proteína inductora. Algunos de los fragmentos que se obtienen de la proteolisis, pueden ser inductores activos de resistencia. En otro enfoque, basándose en el conocimiento de la estructura primaria de la proteína, se pueden sintetizar fragmentos del gen de la proteína inductora utilizando la técnica RCP (Reacción en cadena Catalizada por Polimerasa) , junto con conjuntos específicos de cebadores, seleccionados para representar porciones particulares de la proteína. Posteriormente, estos fragmentos se pueden clonar en un vector apropiado para incrementar la expresión de un péptido o proteína truncada. También se puede utilizar la síntesis química para preparar fragmentos adecuados. Tal síntesis se lleva a cabo utilizando secuencias de aminoácidos conocidas del inductor que se está preparando. Alternativamente, se somete un inductor de longitud completa a altas temperaturas y presiones, lo cual producirá fragmentos. Después, estos fragmentos se pueden separar por . los procedimientos convencionales (e.g,, cromatografía, EGPA-DSS) . Así mismo (o alternativamente) se pueden modificar variantes, por ejemplo, mediante la deleción o adición de aminoácidos que tengan una influencia mínima sobre las propiedades, estructura secundaria y naturaleza hidropática del polipéptido. Por ejemplo, un polipéptido se puede conjugar con una secuencia de señal (o líder) en el extremo N-terminal de la proteína, lo cual dirige, durante o después de la traducción, la transferencia de la proteína. El polipéptido también se puede conjugar con un ligando u otra secuencia para facilitar la síntesis, purificación o identificación del polípéptido. Las moléculas de ADN adecuadas son aquellas que se hibridizan con una molécula de ADN que comprende una secuencia nucleotídica de la SEQ ID No. 1, bajo condiciones estrictas. Un ejemplo de tales condiciones estrictas adecuadas es cuando la hibridación se lleva a cabo a 65°C durante 20 horas, en un medio que contiene NaCl 1 M, Tris-HCl 50 mM, pH 7.4, AEDT 10 mM, dodecilsulfato de sodio al 0.1%, ficol al 0.2%, polivinilpirrolidona al 0.2%, albúmina sérica bovina al 0.2%, 50 µg/ml de ADN de E. coli . Sin embargo, cualquier molécula de ADN que se hibridice con una molécula de ADN que comprenda la secuencia nucleotídica de la SEQ ID No. 1, bajo tales condiciones estrictas, no debe ser idéntica a los ácidos nucleicos que codifican para las proteínas o polipéptidos inductores de respuesta de hipersensibilidad de E. amylovora (tal como se describe en Wei, Z.-M., et al . , "Harpin, Elicitor of the Hypersensitive Response Produced by the Plant Pathogen Erwinia amylovora" , Science, 257: 85-88 (1992), la cual se incorpora en la presente como referencia) , Erwinia chrysanthemi (tal como se describe en Bauer, et al . , "Erwinia chrysantemi HarpinEch: Soft-Rot Pahtogenesis", MPMI, 8 (4) : 484-91 (1995), la cual se incorpora en la presente como referencia) , Erwinia carotovora (tal como se describe en Cui, et al . , "The RsmA- Mutants of Erwinia carotovora subsp. carotovora Strain Ecc71 Overexpress i?rpNEcc and Elicit a Hypersensitive Reaction-like Response in Tobacco Leaves", MPMI, 9 (7): 565-73 (1966), la cual se incorpora en la presente como referencia) , Erwinia stewartii (tal como se describe en Ahmad, et al . , "Harpin is not Necessary for the Pathogenicity of Erwinia steawartii on Maize", 8th Int'l. Cong. Molec. Plant-Microb. ínter., Julio 14-19, 1996 y Ahmad, et al . , "Harpin is not Necessary for the Pathogenicity of Erwinia stewartii on Maize", Ann. Mtg. Am. Phytopath . Soc . , Julio 27-31, 1996) , la cual se incorpora en la presente como referencia) y Pseudomonas syringae pv. syringae (Publicación Internacional WO 94/26782 de Cornell Research Foundation, Inc., la cual se incorpora en la presente como referencia) . La proteína o polipéptido de la presente invención de preferencia se produce en forma purificada (preferiblemente cuando menos aproximadamente 80%, de preferencia 90% de pureza) mediante las técnicas convencionales. Típicamente, la proteína o polipéptido de conformidad con la presente invención, se secreta en el medio de crecimiento de células huésped recombinantes. Alternativamente, la proteína o polipéptido de conformidad con la presente invención se produce, pero no se secreta, en el medio de crecimiento. En tales casos, para aislar la proteína, la célula huésped (e.g., E. coli) portadora de un piásmido recombinante se propaga, se lisa por sonicación, se calienta, se aplica presión diferencial o tratamiento químico y el homogeneizado se centrifuga para remover los restos'bacterianos . Después, el sobrenadante se somete a una precipitación secuencial con sulfato de amonio. La fracción que contiene el polipéptido o proteína de conformidad con la presente invención, se somete a filtración en gel en una columna de dextrán o poliacrilamida de tamaño apropiado, para separar las proteínas. Si es necesario, la fracción proteica puede ser purificada adicionalmente por CLAR (Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento) . La molécula de ADN que codifica para el polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad, se puede incorporar en células utilizando la tecnología convencional de ADN recombinante. Generalmente esto incluye insertar la molécula de ADN en un sistema de expresión al cual la molécula de ADN es heteróloga (i.e., normalmente no está presente). La molécula de ADN heteróloga es insertada en el sistema de expresión o vector, en una orientación de sentido apropiada y con un marco de lectura correcto. El vector contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de las secuencias codificadoras de proteína insertadas. La Patente Norteamericana No. 4,237,224 de Cohén y Boyer, la cual se incorpora en la presente como referencia, describe la producción de sistemas de expresión en forma de plásmidos recombinantes, utilizando rompimiento con enzimas de restricción y ligación con ADN ligasa. Estos plásmidos recombinantes, posteriormente, se introducen por medio de transformación y se replican en cultivos unicelulares incluyendo células de organismos procarióticos y eucarióticos crecidas en cultivo de tejidos. Los genes recombinantes también se pueden introducir en virus, tales como el virus vaccina. Los virus reco binantes se pueden generar por transcripción de plásmidos en células infectadas con virus. Los vectores adecuados incluyen, pero no se limitan a, los siguientes vectores virales tales como el sistema de vector lambda gtll, gt WES.tB, Charon 4 y vectores plasmídicos tales como pBR322, pBR325, pACYC177, PACYC1084, pUC8, pUC9, pUCld, pUC19, pLG339, pR290, pKC37, pKC37, pKClOl, SV 40, pBluescript II SK +/- o KS +/- (véase "Stratagene Cloning Systems" Catalog (1993) de Stratagene, La Jolla, Calif., EUA, la cual se incorpora en la presente como referencia), pQE, pIH821, pGEX, serie pET (véase F. W.

Studier et al . , "Use of T7 RNA Poly erase to Direct Expression of Cloned Genes", Gene Expression Technology, Vol. 185 (1990), la cual se incorpora en la presente como referencia) y cualquier derivado de los mismos. Las moléculas recombinantes se pueden introducir en células mediante transformación, particularmente transducción, conjugación, movilización o electroporación. Las secuencias de ADN se clonan en el vector utilizando los procedimientos de clonación estándar de la técnica, tales como los descritos por Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Laboratory, Cold Springs Harbor, Nueva York (1989), la cual se incorpora en la presente como referencia. Se puede utilizar una variedad de sistemas huésped-vector para expresar la secuencia o secuencias codificadoras de proteínas. Principalmente, el sistema vector debe ser compatible con la célula huésped utilizada. Los sistemas huésped-vector incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: bacterias transformadas con ADN de bacteriófagos, ADN de plásmidos o ADN de cós idos; microorganismos tales como levaduras que contienen vectores de levaduras; sistemas de células de mamíferos infectadas con virus (e.g., virus vaccinia, adenovirus, etc.); sistemas de células de insectos infectadas con virus (e.g., baculovirus) ; y células de planta infectadas con bacterias.

Los elementos de expresión de estos vectores varían en su fuerza y especificidad. Dependiendo del sistema huésped-vector utilizado, se puede utilizar cualquiera de un número de elementos de transcripción y traducción adecuados . Diferentes señales genéticas y eventos de procesamiento controlan muchos niveles de la expresión génica- (e.g. , transcripción del ADN y traducción del ARN mensajero (ARNm) ) . La transcripción del ADN depende de la presencia de un promotor, el cual es una secuencia de ADN que dirige la unión de la ARN polimerasa y por lo tanto promueve la síntesis de ARNm. Las secuencias de ADN de promotores eucarióticos difieren de aquellas de los promotores procarióticos . Además, los promotores eucarióticos y señales genéticas que los acompañan, podrían no ser reconocidos ni funcionar en un sistema procariótico y, además, los promotores procarióticos no son reconocidos y no funcionan en células eucarióticas . De manera similar, la traducción del ARNm en procariotes depende de la presencia de señales procarióticas apropiadas, las cuales difieren de aquellas de los eucariotes. La eficiente traducción del ARNm en procariotes, requiere un sitio de unión al ribosoma denominado secuencia de Shine-Dalgarno ("SD") en el ARNm. Esta secuencia es una pequeña secuencia nucleotídica del ARNm que está localizada antes del codón de inicio, normalmente AUG, la cual codifica para la metionina amino-terminal de la proteína. Las secuencias SD son complementarias al extremo 3' del 16S ARNr (ARN ribosomal) y probablemente promueven la unión del ARNm a los ribosomas duplicándose con el ARNr para permitir un posicionamiento correcto del ribosoma. Para mayor información sobre la maximización de la expresión génica, véase Roberts y Lauer, Methods in Enzymology, 68: 473 (1979), la cual se incorpora en la presente como referencia. Los promotores varían en su "fuerza" (i.e., su capacidad de promover la transcripción. Para propósitos de expresar un gen clonado, es deseable utilizar promotores fuertes con el fin de obtener un alto nivel de transcripción y, por ende, de expresión del gen. Dependiendo del sistema de células huésped utilizado, se puede utilizar cualquiera de un número de promotores adecuados. Por ejemplo, cuando se clona en E. coli, sus bacteriófagos o plásmidos, se pueden utilizar promotores tales como el promotor del fago T7, el promotor lac, promotor trp, promotor recA, promotor de ARN ríbosomal, promotores PR y P del colifago lambda y otros, incluyendo pero no limitándose a JacUV5, ompF, hla, lpp y similares, para dirigir altos niveles de transcripción de los segmentos de ADN adyacentes. Adicionalmente, se puede utilizar un promotor híbrido trp-lacüV5 ( tac) u otros promotores de E. coli producidos por ADN recombinante u otras técnicas de síntesis de ADN, para obtener la transcripción del gen insertado. Las cepas de células huésped bacterianas y los vectores de expresión se pueden seleccionar de tal manera que inhiban la acción del promotor a menos de que sea específicamente inducida. En ciertas operaciones, la adición de inductores específicos es necesaria para una eficiente transcripción del ADN insertado. Por ejemplo, el operen lac es inducido mediante la adición de lactosa o IPTG (isopropiltio-beta-D-galactósido) . Una variedad de otros operones, tales como trp, pro, etc., están bajo diferentes controles. También se requieren de . señales de iniciación específicas para la eficiente transcripción y traducción de genes en células procarióticas. Estas señales de iniciación de transcripción y traducción pueden variar de "fuerza", la cual es medida por la cantidad de ARN mensajero específico del gen y la cantidad de proteína sintetizada, respectivamente. El vector de expresión de ADN, que contiene un promotor, también puede contener cualquier combinación de varias señales "fuertes" de iniciación de transcripción y/o traducción. Por ejemplo, una traducción eficiente en E. coli requiere una secuencia SD de aproximadamente 7-9 bases hacia 5' con respecto al codón de iniciación ("ATG") , para obtener un sitio de unión al ribosoma. Así pues, cualquier combinación SD-ATG que pueda ser utilizada por los ribosomas de la célula huésped, puede ser empleada. Tales combinaciones incluyen, pero no se limitan a, la combinación SD-ATG del gen ero o del gen N del colifago lambda de genes de E. coli de triptofano E, D, C, o A. Adicionalmente, se puede utilizar cualquier combinación SD-ATG producida por ADN recombinante u otras técnicas que incluyen la incorporación de nucleótidos sintéticos. Una vez que la molécula aislada de ADN que codifica para el polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad ha sido clonada en un sistema de expresión, se puede incorporar fácilmente a una célula huésped. Tal incorporación se puede llevar a cabo mediante las diversas formas de transformación anteriormente descritas, dependiendo del sistema vector/huésped celular utilizado. Las células huésped adecuadas incluyen, pero no se limitan a, bacterias, virus, levaduras, células de mamíferos, de insectos, de plantas y similares. La presente invención además se refiere a métodos para impartir resistencia a enfermedades a plantas, incrementar el crecimiento de plantas y/o efectuar el control de insectos para plantas. Estos métodos incluyen la aplicación de un polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad en una forma no infecciosa, a la totalidad o una parte de una planta o de una semilla de planta, bajo condiciones en las cuales el polipéptido proteína entra en contacto con la totalidad o una parte de las células de la planta o de la semilla de planta. Alternativamente, la proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad se puede aplicar a plantas tales como semillas recuperadas de tales plantas, siendo capaces de impartir resistencia a enfermedades a las plantas, de incrementar el crecimiento de la planta y/o de efectuar un control de insectos. Como alternativa para la aplicación de un polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad en plantas o semillas de plantas, con el fin de impartirles resistencia a enfermedades, de tener un efecto sobre el crecimiento de la planta y/o para controlar insectos en las plantas crecidas a partir de las semillas, se pueden utilizar plantas transgénicas o semillas de plantas transgénicas. Cuando se utilizan plantas transgénicas, esto incluye proporcionar una planta transgénica transformada con una molécula de ADN que codifica para un polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad y hacer crecer la planta bajo condiciones efectivas para permitir que la molécula de ADN le imparta resistencia a enfermedades, que incremente el crecimiento de la planta y/o que efectúe un control de insectos. Alternativamente, se puede proporcionar una semilla de planta transgénica transformada con una molécula de ADN que codifica para un polipéptido o proteína inductsra de respuesta de hipersensibilidad y se puede plantar en el suelo. Después la planta se propaga a partir de la semilla plantada bajo condiciones efectivas para permitir que la molécula de ADN le imparta resistencia a enfermedades a la planta, incremente el crecimiento de la planta y/o controle insectos. La modalidad de la presente invención en donde se aplica el polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad a la planta o a la semilla de planta, se puede llevar a cabo de varias maneras, incluyendo: 1) la aplicación de un polipéptido o proteína inductora aislada; 2) la aplicación de bacterias que no causan enfermedad y que están transformadas con genes que codifican para un polipéptido o proteína mductora de respuesta de hipersensibilidad; y 3) la aplicación de bacterias que causan enfermedad en algunas especies de plantas (pero en aquella a la cual se aplica) y que contienen naturalmente un gen que codifica para el polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad.

En una modalidad de la presente invención, el polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad de conformidad con la presente invención, se puede aislar de Erwinia amylovora tal como se describe en los Ejemplos que se presentan más adelante. Sin embargo, de preferencia el polipéptido o proteína inductora de res"puesta de hipersensibilidad aislada de conformidad con " la presente invención, se produce de manera recombinante y se purifica de la manera anteriormente descrita. En otras modalidad de la presente invención, el polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad de conformidad con la presente invención, se puede aplicar a plantas o a semillas de plantas, mediante la inoculación de bacterias que contienen genes que codifican para el polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad. Tales bacterias deben ser capaces de secretar o exportar el polipéptido o proteína, de manera que el inductor pueda entrar en contacto con las células de la planta o de la semilla de planta. En estas modalidades, el péptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad es producido por las bacterias in planta o en las semillas o justo antes de la introducción de las bacterias a las plantas o a las semillas. En una modalidad de la aplicación bacteriana de la presente invención, las bacterias no causan la eternidad y han sido transformadas (e.g., por recombinación) con genes que codifican para un polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad. Por ejemplo, E. coli, la cual no induce una respuesta de hipersensibilidad en plantas, puede ser transformada con genes ~que codifican para un polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad y después se aplican a plantas. También se pueden utilizar otras especies bacterianas diferentes a E. coli en esta modalidad de la presente invención. Otra modalidad de la aplicación bacteriana de la presente invención, las bacterias causan enfermedad y contienen un gen natural que codifica para un polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad. Ejemplos de tales bacterias se presentaron anteriormente. Sin embargo, en esta modalidad, estas bacterias son aplicadas a plantas o a sus semillas que no son susceptibles de sufrir la enfermedad causada por las bacterias. Por ejemplo, Erwinia amylovora causa enfermedad en la manzana o en la pera, pero no en el jitomate. Sin embargo, tales bacterias inducirán una respuesta de hipersensibilidad en el frijol. De conformidad con esta modalidad de la presente invención, Erwinia amylovora se puede aplicar a plantas de jitomate o sus semillas para impartirles resistencia a enfermedades, incrementar el crecimiento o controlar insectos, sin causar una enfermedad en esa especie. El método de la presente invención se puede utilizar para tratar una amplia variedad de plantas o sus semillas, para impartirles resistencia a enfermedades, aumentar el crecimiento y/o controlar insectos. Algunas plantas adecuadas incluyen las dicotiledóneas y monocotiledóneas. Particularmente, las plantas de cultivo pueden incluir: alfalfa, arroz, trigo, cebada, centeno, algodón, girasol, cacahuate, maíz, papa, papa dulce, frijol, chícharo, achicoria, lechuga, endivia, col, col de Bruselas, remolacha, chirivía, nabo, coliflor, brócoli, rábano, espinaca, cebolla, ajo, berenjena, pimienta, cilantro, zanahoria, chayóte, calabaza, calabacín, pepino, manzana, pera, melón, cítricos, fresa, uva, frambuesa, pina, soya, tabaco, jitomate, sorgo y caña de azúcar. Ejemplos de plantas ornamentales adecuadas son: Arahidopsis thaliana , Saintpaulia , petunia, geranio, poinsettia, crisantemo, clavel y zinnia. Con respecto al uso de la proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad de la presente invención para impartir resistencia a enfermedades, no se puede conferir una inmunidad absoluta contra infecciones, pero la gravedad de la enfermedad se reduce y se retarda el desarrollo de los síntomas. El número de lesiones, el tamaño de las mismas y el grado de esporulación de patógenos fúngicos, todos ellos disminuyen. Este método para impartir resistencia a enfermedades tiene el potencial de tratar enfermedades previamente intratables, de tratar enfermedades sistémicamente, las cuales no se pueden tratar por separado debido al costo y evitar el uso de agentes infecciosos o materiales ambientalmente peligrosos. El método para impartir resistencia a patógenos a las plantas de conformidad con la presente invención, es útiles para impartir resistencia a una amplia variedad de patógenos, incluyendo virus, bacterias y hongos. ' La resistencia, inter alia, a los siguiente virus se puede alcanzar por el método de la presente invención: virus del mosaico del tabaco y virus del mosaico del tomate. La resistencia inter alia, a las siguientes bacterias también se puede impartir a las plantas de conformidad con la presente invención: Pseudomonas solancearum, Psudomonas syringae pv. tabaci y Xanthomonas campestris pv. pelargonii . Las plantas pueden volverse resistentes, inter alia, a los siguientes hongos mediante el uso del método de la presente invención: Fusari um oxysporum y Phytophthora infestans. Con respecto al uso de la proteína o péptido inductor de respuesta de hipersensibilidad de la presente invención para incrementar el crecimiento de plantas, se puede lograr el aumento o la promoción del crecimiento de varias formas de plantas. Esto puede ocurrir tan pronto como la planta empieza a crecer desde la semilla o en una etapa posterior de la vida de la planta. Por ejemplo, el crecimiento de planta de conformidad con la presente invención produce un mayor rendimiento, incrementa la cantidad de semillas producidas, incrementa el porcentaje de semillas germinadas, incrementa la biomasa, se obtienen más frutos y más grandes, se obtiene una coloración más temprana en los frutos y una maduración más tremprana en la planta y los frutos. Como resultado, la presente invención proporciona un beneficio económico significativo a los agricultores. Por ejemplo, la germinación temprana y la maduración temprana permiten que crezcan cultivos en áreas de temporada corta de crecimiento, en donde de otra manera no sería posible su cultivo en esa ubicación. El aumento del porcentaje de semillas germinadas, da como resultado mejores cosechas en pie y un uso más eficiente de las semillas. El mayor rendimiento, el incremento de tamaño y de la producción de biomasa, permiten generar mayores ingresos en una tierra dada. Otro aspecto de la presente invención se refiere a efectuar cualquier forma de control de insectos de plantas. Por ejemplo, el control de insectos de conformidad con la presente invención incluye prevenir que los insectos entren en contacto con las plantas a las cuales se ha aplicado el inductor de respuesta de hipersensibilidad, evitando el daño causado directamente por el insecto a las plantas por su alimentación, causando que los insectos se vayan desde estas plantas, matando a los insectos próximos a las plantas, interfiriendo con la alimentación de las larvas del insecto de tales plantas, evitando que los insectos colonicen a las plantas huésped, evitando que los insectos colonizadores liberen fitotoxinas, etc. La presente invención también previene los daños subsecuentes a una enfermedad de las plantas como resultado de una infestación por insectos. La presente invención es efectiva contra una amplia variedad de insectos. El gusano barrenador del maíz europeo es una de las principales plagas del maíz (maíz dentado y dulce) , pero también se alimenta de más de 200 especies de plantas, incluyendo la judía verde, el frijolillo, la alubia de lima y soyas comestibles, especies de pimienta, papa y jitomate más muchas especies de hierbas. Las plagas de larvas de insectos adicionales que dañan a una amplia variedad de cosechas de vegetales incluyen las siguientes: oruga negra de la remolacha, largarta de la col, gusano de la mazorca, gusano cogollero (oruga negra del maíz) , polilla de la col (polilla espalda de diamante) , gusanillo de la col, gusanillo de la cebolla, gusanillo de la semilla de maíz, gusano barrenador del pepino, gusanillo de la pimienta y gusanillo alfiler del jitomate. Colectivamente, este grupo de plagas de insectos representa el grupo económicamente más importante de plagas para la producción de vegetales a nivel mundial. *" El método de la presente invención que incluye la aplicación del polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad, se puede llevar a cabo a través de una variedad de procedimientos cuando se trata la totalidad o una parte de la planta, incluyendo las hojas, los tallos, las raíces, propárgulos (e.g., cortes), etc. Esto podría (pero no necesariamente) incluir la infiltración del polipéptido o proteína inductora .de respuesta de hipersensibilidad a la planta. Los métodos de aplicación adecuados incluyen rociado de alta o baja presión, inyección y abrasión de hojas antes de llevar a cabo la aplicación del inductor. Cuando se tratan semillas de plantas, de conformidad con la modalidad de aplicación de la presente invención, la proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad se puede aplicar por rociado de baja o alta presión, revestimiento, inmersión o inyección. Otros procedimientos de aplicación adecuados pueden ser ideados por los técnicos en la materia, siempre y cuando sean capaces de poner en contacto el polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad con células de la planta o semillas de la planta. Una vez tratadas con el inductor de respuesta de hipersensibilidad de la presente invención, las semillas se pueden plantar en suelo natural o artificial y cultivar utilizando los procedimientos convencionales para producir plantas". Después de que las plantas han sido propagadas a partir de las semillas tratadas de conformidad con la presente invención, las plantas se pueden tratar con una o más aplicaciones de la proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad, para impartirles resistencia a enfermedades, para incrementar el crecimiento de la planto y/o controlar los insectos en las plantas. El polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad se puede aplicar a .plantas o semillas de plantas, de conformidad con la presente invención, solo o mezclado con otros materiales. De manera alternativa, el polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad que puede aplicar por separado a plantas con otros materiales que son aplicados en diferentes momentos . Una composición adecuada para tratar plantas o semillas de plantas de conformidad con la modalidad de aplicación de la presente invención, contiene un polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad en un vehículo. Los vehículos adecuados incluyen agua, soluciones acuosas, lechadas o polvos deshidratados. En esta modalidad, la composición contiene más de 500 nM del polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad. Aunque no sea requerido, esta composición puede contener aditivos adicionales incluyendo fertilizantes, insecticidas, fungicidas, nematicidas y mezclas de los mismos. Los fertilizantes adecuados incluyen (NH4)2N03. Un ejemplo de un insecticida adecuado es el malatión. Los fungicidas útiles incluyen al Captan. Otros aditivos adecuados incluyen agentes reguladores de pH, agentes humectantes, agentes de revestimiento y agentes abrasivos. Estos materiales se pueden utilizar para facilitar el proceso de la presente invención. Además, el polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad se puede aplicar a semillas de plantas con otras formulaciones y materiales de tratamiento convencionales para semillas, incluyendo arcillas y polisacáridos. En la modalidad alternativa de la presente invención que incluye el uso de plantas transgénicas y semillas transgénicas, no es necesario aplicar de manera tópica a las plantas o a las semillas el polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad. En vez de esto, las plantas transgénicas transformadas con una molécula de ADN que codifica para un polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad son producidas de conformidad con los procedimientos conocidos en la técnica. El vector anteriormente descrito puede ser microiñyectado directamente en las células de la planta mediante el uso de micropipetas, para transferir mecánicamente el ADN recombinante. Cross ay, Mol. Gen. Genetics, 202: 179-85 (1985), la cual se incorpora en la presente como referencia. El material genético también se puede transferir a las células de la planta utilizando propilenglicol. Krens, et al . , Nature, 296: 72-74 (1982), la cual se incorpora en la presente como referencia. Otro enfoque para transformar las células de plantas con un gen que les imparte resistencia a los patógenos, es el bombardeo de partículas (también conocido como transformación biolística) de la célula huésped. Esto se puede llevar a cabo de varias maneras. La primera incluye impulsar partículas inertes o biológicamente activas en las células. Esta técnica se describe en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,945,050; 5,036,006 y 5,100,792; todas de Sanford et al . , las cuales se incorporan en la presente como referencia. En general, este procedimiento incluye impulsar partículas biológicamente activas o inertes en las células bajo condiciones efectivas para que penetren la superficie externa de la célula y para que se incorporen en el interior de la misma. Cuando se utilizan partículas inertes, el vector puede ser introducido en la célula mediante el revestimiento de las partículas con el vector conteniendo el ADN heterólogo. Alternativamente, la célula blanco puede ser rodeada por el vector de tal manera que el vector sea transportado hacia el interior de la célula por la partícula. Las partículas biológicamente activas (e.g., células bacterianas desecadas que contienen el vector y el ADN heterólogo) también se pueden impulsar hacia el interior de células de plantas. Todavía otro método de introducción es la fusión de protoplastos con otras entidades, ya sea minicélulas, células, lisosomas u otros cuerpos de superficie lipídica fusionables. Fraley, et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 79: 185963 (1982), la cual se incorpora en la presente como referencia. La molécula de ADN también se puede introducir en las células de planta por electroporación. Fro m et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 82: 5824 (1985), la cual se incorpora en la presente como referencia. En esta técnica se someten a electroporación protoplastos de la planta en presencia de plásmidos que contienen el cartucho de expresión. Se aplican impulsos eléctricos de alto campo de fuerza, los cuales permeabilizan de manera reversible las biomembranas, permitiendo la introducción de los plásmidos. Los protoplastos de planta sometidos a electroporación, reconforman la pared celular, se dividen y se regeneran. Otro método para introducir la molécula de ADN en las células de planta, es infectar una célula de planta con Agrobacteri um tumefaciens o A. rhizogenes, previamente transformadas con el gen. En condiciones apropiadas conocidas en la técnica, las células de planta transformadas se hacen crecer para formar brotes o raíces y desarrollarse hasta ser plantas adultas. En general, este procedimiento incluye inocular el tejido de la planta con una suspensión de bacterias e incubar el tejido durante 48 a 72 horas en un medio de regeneración, sin antibióticos a 25-28°C. Agrobacterium es un género representativo de la familia gra negativa Rhizobiaceae. Esta especie es responsable de agallas en corona (A. tumefaciens) y de la enfermedad de raíz pilosa (A. rhizogenes) . Las células de planta con tumores de agalla en corona y raíces pilosas, son inducidas a producir derivados de aminoácidos conocidos como opinas, las cuales son catabolizadas sólo por las bacterias. Los genes bacterianos responsables de la expresión de las opinas son una fuente conveniente de elementos de control para cartuchos de expresión quimérica. Además, la evaluación de la presencia de opinas se puede utilizar para identificar el tejido transformado. Las secuencias genéticas heterólogas se pueden introducir en las células de planta apropiadas, por medio del piásmido Ti de A. tumefaciens o del piásmido Ri de A. rhizoge~nes. El piásmido Ti o Ri es transmitido a las células de planta en la infección por Agrobacterium y se integra de manera estable al genoma de la planta. J. Schell, Science, 237: 1176-83 (1987), la cual se incorpora en la presente como referencia. Después de la transformación, las células de planta transformadas se deben regenerar. La regeneración de la planta a partir . de protoplastos cultivados se describe en Evans et al . , Handbook of Plant Cell Cultures, Vol. 1, MacMillan Publishing Co., Nueva York, 1983); y Vasil I. R. (ed.), Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Acad. Press, Orlando, vol. I (1984) y vol. III (1986), las cuales se incorporan en la presente como referencia. Es sabido que prácticamente todas las plantas pueden ser regeneradas a partir de células o tejidos cultivados, incluyendo pero no limitándose a, todas las principales especies de caña de azúcar, remolacha de azúcar, algodón, árboles frutales y legumbres.

Los mecanismos de regeneración varían de una especie a otra de plantas, pero en general se proporciona una suspensión de protoplastos transformados o una caja de petri que contenga explantes transformados. El callo tisular se forma y se puede inducir la formación de brotes en los callos y subsecuentemente se enraizan. Alternativamente, se puede inducir la formación de embriones en el tejido calloso. Estos embriones germinan como embriones naturales para formar plantas . El medio de cultivo generalmente contendrá varios aminoácidos y hormonas, tales como auxina y citocininas. También es ventajoso agregar ácido glutámico y prolina al medio, especialmente para especies tales como maíz y alfalfa. La eficiente regeneración dependerá del medio, del genotipo y del historial de cultivo. Si se controlan estas tres variables, entonces por lo general la regeneración es reproducible y repetible. Después de que el cartucho de expresión está incorporado de manera estable en las plantas transgénicas, éste se puede transferir a otras plantas por cruce sexual. Se puede utilizar cualquiera de un número de técnicas de reproducción, dependiendo de la especie a ser cruzada. Una vez que se producen plantas transgénicas de este tipo, las plantas mismas pueden ser cultivadas de conformidad con los procedimientos convencionales, con la presencia del gen que codifica para el inductor de respuesta de hipersensibilidad, dando como resultado la resistencia a enfermedades, un incremento de la planta y/o el control de insectos sobre la planta. Alternativamente, se colectan semillas transgénicas de las plantas transgénicas. Esta semillas posteriormente se pueden plantar en el suelo y cultivar utilizando los procedimientos convencionales para producir plantas transgénicas. Las plantas transgénicas se propagan a partir de semillas transgénicas plantadas bajo condiciones efectivas para impartir resistencia a enfermedades a las plantas, para incrementar su crecimiento y/o controlar los insectos. Toda vez que no se desea apegar a una teoría, tal resistencia a enfermedades, incremento del crecimiento y/o control de insectos, puede estar mediado por el ARN o puede ser el resultado de la expresión del polipéptido o proteína inductora. Cuando se utilizan plantas y semillas transgénicas de conformidad con la presente invención, adicionalmente pueden ser tratadas con los mismos materiales que se utilizan para el tratamiento de plantas y semillas, a las cuales se les aplica un polipéptido o proteína inductora de respuesta de hipersensibilidad. Estos otros materiales, incluyendo inductores de respuesta de hipersensibilidad, pueden ser aplicados a las plantas transgénicas y a las semillas transgénicas mediante los procedimientos anteriormente descritos, incluyendo rociado de alta o baja presión, inyección, revestimiento e inmersión. De manera similar, después de que las plantas han sido propagadas a partir de semillas de plantas transgénicas, las plantas se pueden tratar con una o más aplicaciones del inductor de respuesta de hipersensibilidad, para impartirles resistencia a enfermedades, incrementar el crecimiento y/o controlar insectos. Tales plantas también se pueden tratar con los agentes de tratamiento de plantas convencionales (e.g., insecticidas, fertilizantes, etc.). EJEMPLOS Ejemplo 1 - Cepas y plásmidos bacterianos. E. amylovora Ea321 y Ea273 son cepas de tipo silvestre que infectan plantas pomáceas (Beer et al . , The hrp Gene Cluster of Erwinia amylovora, eds . Hennecke, H. & Verma, D.P.S. (Klu er Academic Publishers, Dordrecht, Países Bajos), vol. 1, pp.53-50 (1991), la cual se incorpora en la presente como referencia) . Escherichia coli DH5a fue utilizada rutinariamente como huésped de plásmidos. El piásmido pCPP1012 es una subclona del pCPP430 y el pCPP1152, pCPP1218, pCPP1219 y pCPP1220 fueron construidos clonando fragmentos de restricción del pCPP1012 en el piásmido pBluescript KS (+ ) (Stratagene, La Jolla, CA) (Fig. IB) . El pCPP1227 fue clonado a partir del pCPP1220 en el mismo vector. Ejemplo 2 - Técnicas de biología molecular y análisis de secuencia. Se realizaron los procedimientos moleculares generales utilizando las técnicas estándar descritas (Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) (1989) , la cual se incorpora en la presente como referencia) . La secuenciación se realizó en un secuenciador de ADN automatizado ABI 373A en las instalaciones de Secuenciación de ADN del Programa' de Biotecnología de la Universidad de Cornell . Para los análisis de secuencia de ADN y proteínas, se utilizaron los paquetes del software GCG, versión.7.3 (Genetics Computer Group, Inc., Madison, WI) y DNASTAR (DNASTAR, Inc., Madison, WI) . Ejemplo 3 - Expresión del hrpW en E. coli . El fragmento iípal de 1.4 kb de pCPP1227 que contiene el hrpW, fue subclonado en el pBC SK(-) (Stratagene, La Jolla, CA) de tal modo que el hrpW quedara bajo el control del promotor T7F10. El piásmido resultante pCPP1232 (Fig. IB), fue introducido en una cepa de E. coli DH5a(pG01-2) (Tabor, et al . , Proc. Nati. Acad.

Sci . EUA, 82: 1074-78 (1985), la cual se incorpora en la presente como referencia) . Se incubaron las células a 42 °C para inducir la expresión del gen de la ARN polimerasa de T7 y las proteínas de nueva síntesis fueron radiomarcadas con 35S-Met de la manera descrita (Tabor, et al . , Proc.

Nati. Acad. Sci. EUA, 82: 1074-78 (1985), la cual se incorpora en la presente como referencia) . Las muestras resultantes se resuspendieron en una solución reguladora para degradación y se calentaron a 95°C durante 3 minutos antes de someterlas a una Electroforesis en Gel de Poliacrilamida con Dodecilsulfato de Sodio (EGPA-DSS) en un gel al 10%. Ejemplo 4 - Purificación de la HrpW. La HrpW, producida por un tratamiento de choque térmico de E. coli DH5a (pGPl-2, pCPP1232) a 42°C, fue purificada cortando el área del gen que contenía la HrpW, eluyendo la proteína con ELUTRAP (Scleicher & Schuell, Inc., Keene, NH) y desalinizando la solución que contenía la HrpW mediante el uso de una solución Centriprep-30 (Amicon, Inc., Beverly, MA) y solución reguladora de fosfato de potasio 5 mM (KP04) (pH 6.5). Alternativamente, las células de E. coli DH5a (pGPl-2, pCPP1232) inducidas por calor y concentradas 10 veces, fueron sonicadas en presencia de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM, se colocaron en un baño de agua en ebullición durante 10 minutos y se centrifugaron a 17,500 g durante 10 minutos. El sobrenadante fue desalinizado, dando como resultado una "preparación inductora libre de células (PILC) " de la HrpW. La PILC de HrpW se preparó de la misma manera a partir de una cepa de E. coli DH5a(pCPP2139) sobreproductora de HrpN. Ejemplo 5 - Inmunodetección de HrpW. Se prepararon anticuerpos policlonales contra HrpW en la Escuela de Medicina Veterinaria de la Universidad de Cornell, inyectando aproximadamente 10 µg de HrpW en un conejo tres veces a intervalos de 2-3 semanas. El antisuero fue colectado 2 semanas después de la inyección final y fue sometido a una absorción cruzada con un lisado termotratado de E. coli DH5a(pGPl-2, pBC SK(-)). Se hicieron crecer durante una noche en caldo Terrific cepas de E. amyl ovora Ea321Rp (un derivado resistente a la rifampicina de Ea321), Ea321-K49 (hrpL: :Tn 10-miniKm) (Wei, et al . , J . Bacteriol., 177: 6201-10 (1995), la cual se incorpora en la presente como referencia), Ea321-G84 (hrcC: : Tnb-gusAl) (Kim et al . , J. Bacteriol . , 179: 1690-97 (1997), la cual se incorpora en la presente como referencia) , Ea273p, Ea273-K49 y Ea273-G73 (hrcV: : Tn5-gusAl ) , se transfirieron a un medio mínimo hrp (Huynh, et al . , Science, 345: 1374-77 (1989), la cual se Q incorpora en la presente como referencia) a 1H10 ufc/ml y se incubaron a 20°C hasta que las bacterias crecieron a 1H10 ufc/ml. Los cultivos se centrifugaron a 17,500 g y la pella se resuspendió en solución reguladora de carga. El sobrenadante se hizo pasar a través de un filtro de membrana (tamaño de poro 0.2 µm; Whatman Inc., Fairfield, NJ) y después se agregó PMSF 1 mM y se concentró 100 veces utilizando Centricon-10 y Microcon-10 (Amicon, Inc., Beverly, MA) a 4°C. Tanto la fracción celular como el sobrenadante fueron sometidos a EGPA-DSS en un gel al 10%. Las proteínas del gel fueron transformadas en Immobilon-P (Millipore Co., Bedford, MA) y se realizaron análisis de inmunoelectrotransferencia tipo Western con un sistema (Sigma, St. Louis, MO) compuesto por anti-IgG de conejo conjugada con biotina, EstrAvidin y tabletas de BCIP/NBT para las cepas Ea273 y E. coli , y se utilizaron en un sistema Western-Light Plus (Tropix, Inc., Bedford, MA) para las cepas de Ea321. Ejemplo 6 - Generación de un fragmento N-terminal de HrpW. El pCPP1232 fue digerido con BamHI y BstEII y los extremos del fragmento de 4.1 kb se hicieron romos utilizando el fragmento de Klenow y se autoligaron. El piásmido resultante pCPP1254, el cual codifica para los 226 aminoácidos N-terminales de la HrpW y los residuos Ile-His derivados de la secuencia de vector, fue clonado en E. coli DH5a y después transferido a E. coli DH5a(pGPl-2) , generando la cepa E. coli DH5a (pGPl-2,pCPP1254) . Ejemplo 7 - Ensayos en plantas. La inducción de la RH fue probada mediante la infiltración de las preparaciones proteicas o bacterianas en el espacio intercelular de hojas de tabaco (Nicotiana tabacum L. ?xanti' ) y otras plantas (Kim, et al . , J^ Bacteriol., 179: 1690-97 (1997), la cual se incorpora en la presente como referencia) . Las células se hicieron crecer ya sea en caldo Luria (E. coli DH5a y MC4100) o en un medio mínimo hrp (E. amylovora Ea321 y Ea321-T5) (Huynh, et al . , Science, 345: 1374-77 (1989), la cual se incorpora en la presente como referencia) a 5H10 ufc/ml y se resuspendieron en solución reguladora 5 mM de KP04 (pH 6.5) o o hasta 2H10 ufc/ml (cepas de E. coli ) o hasta 5H10 ufc/ml (cepas de E. amylovora ) . Los inhibidores del metabolismo de plantas utilizados incluyeron cicloheximida a 10 µm, LaCl3 a 1 mM y Na3V04 a 50 µM. Ejemplo 8 - Inmunoelectrotransferencia tipo Southern. El ADN genómico fue digerido con .EcoRI, sometido a electroforesis en un gel de agarosa al 0.7%, se transfirió a una membrana Immobilon-N (Millipore Co., Bedford, MA) y se hibridizó con el fragmento Hpal de 1.4 kb marcado con 32P de pCPP1227, a 65°C durante 24 horas. La membrana se lavó dos veces con una solución de 2 H SCC y con DSS (dodecilsulfato de sodio) al 1.0% a 65°C y se lavó con 0.1 H SCC hasta que no se detectara radioactividad en la solución del lavado. Para las hibridaciones en condiciones poco estrictas, la membrana fue incubada a 50°C y lavada con 2 H SCC a 45°C. Ejemplo 9 - Ensayo de la HrpW con enzima péctica. Se centrifugaron células de E. coli DH5a (pGPl-2, pCPP1232) inducidas térmicamente hasta formar una pella, se resuspendieron en un décimo del volumen con solución reguladora _de KP04 5 mM (pH 6.5) ó Tris-HCl 10 mM (pH 8.5), se sonicaron en hielo, se centrifugaron y se probó la actividad PL en el sobrenadante. Así mismo, un sobrenadante de cultivo de la cepa Ea321 concentrado 50 veces fue incluido en la prueba. Se utilizó PelE de Erwinia Chrysantemi EC16 diluido en Tris-HCl 10 mM (pH 7.8) como control. Se inocularon 10 microlitros de cada preparación en placas de agar YC (Keen, et al . , J. Bacteriol., 159: 825-31 (1984), la cual se incorpora en la presente como referencia) conteniendo ya sea ácido poligalacturónico al 0.7% (Sigma, St . Louis, MO) o pectina al 0.7% (88% metoxilada; Sigma, St. Louis, MO) a pH 6.5, 8.0 ó 9.5 y en placas de agar semisólido de pectina (Starr, et al . , J. Microbiol. , 6: 379-86 (1977), la cual se incorpora en la presente como referencia) conteniendo pectina al 3% (88% metoxilada) a pH 6.5, 8.0 ó 9.5. Las placas se incubaron a 37 °C durante 24 horas, e inundaron con CaCl2 1 M y se examinaron en busca de la presencia de halos. Se realizaron análisis viscosimétricos (Bate a, D. F., Phytopathology, 53: 197-204 (1963), la cual se incorpora en la presente como referencia) y un procedimiento con ácido tiobarbitúrico modificado (Sherwood, R. T., Phytopathology, 56: 279-86 (1966), la cual se incorpora en la presente como referencia) utilizando ácido poligalacturónico al 1% ó pectina al 1% (68% metoxilada) en CaCl2 2.5 mM y Tris-HCl 100 mM, pH 9.5 como substratos. También se llevaron a cabo métodos supuestamente más sensibles que estos anteriores, incluyendo un procedimiento de isoelectroenfoque en gel y espectrofotometría. Se aplicaron 10 microlitros de las muestras sobre una capa de gel (Collmer, et al . , J. Bacteriol., 161: 913-20 (1985), la cual se incorpora en la presente como referencia) conteniendo pectina al 0.2% (88% metoxilada), agarosa al 1%, CaCl2 1.5 M y Tris-HCl 50 M (pH 8.8) y se envolvió con una película de plástico. El gel se incubó a 28°C durante 24 horas, se inundó con bromuro de hexadeciltrimetilamonio al 1% y se inspeccionó. Para ensayar la actividad PL a través de la generación de dobles enlaces, se mezclaron 1.9 mi de una solución de pectina al 0.1% (68% metoxilada) CaCl 5 mM y Tris-HCl 100 mM a pH 5.5 ó 9.5, con 100 µl de las muestras y se registraron los cambios de absorbancia a 232 nm durante 30 minutos de la manera descrita (Alfano, et al . , J. Bacteriol., 177: 4553-56 (1995), la cual se incorpora en la presente como referencia) . Ejemplo 10 - Identificación de un gen que codifica para una proteina rica en glicina. Las mutantes hrpN de pCPP430-T5 y pCPP450-T5 en E. coli, exhibieron una actividad inductora de RH residual (Fig. 5A, paneles 2 y 4), lo cual sugiere la existencia de otro inductor de RH en las clonas. El ADN cadena abajo del sitio hrpN, en donde se traslapan el pCPP430 y el pCPP450, por lo tanto, fue subclonado y se determinó su secuencia. Esto reveló cuatro marcos de lectura abierta, designados ORFA, ORFB, ORFC y hrpW (Fig. IB) . Se encontró un promotor putativo dependiente de HrpL (Boganove, et al . , J. Bacteriol., 178: 1720-30 (1996) y Kim, et al . , J . Bacteriol. , 179: 1690-97 (1997), las cuales se incorporan en la presente como referencia) CGGAACC-N4-C-N?0-CCACTCAAT, 58 pares de bases cadena arriba del codón de inicio hrpW, lo cual sugiere que la expresión del hrpW está controlada por la HrpL, que es un factor sigma alternativo (Wei, et al . , J. Bacteriol., 177: 6201-10 (1995), la cual se incorpora en la presente como referencia) . El hrpW en pCPP1232 (Fig. IB) fue expresado utilizando un sistema ARN polimerasa/promotor de T7 y se obtuvo como resultado una banda proteica específica con un peso molecular aparente de aproximadamente 60 kDa (Fig. 2) . Este tamaño es más grande que el esperado de 45 kDa. Sin embargo, se observó una banda del mismo tamaño en el sobrenadante de E. amylovora (Fig. 4) , lo cual indica que el tamaño aberrante de la proteína no es un artefacto de la clonación. Ejemplo 11 - Características predichas del producto hrpW. El hrpW fue deducido para codificar una proteína de 447 residuos de aa (aminoácidos) , la cual es acida (pl-4.5), hidrofílica, rica en Gly, Ser y Asn, baja en Glu, Arg, Trp y Tyr y carente de Cys (Fig. 3) . Estas propiedades son similares a las harpinas, aunque la estructura primaria de la HrpW pareció no ser homologa a ninguna de ellas. La secuencia de la HrpW sugiere que la proteína está compuesta por dos dominios: el dominio N-terminal rico en Gly y Ser, y el dominio C-terminal homólogo a las PL (véase más adelante) . Aproximadamente dos terceras partes de la Gly y Ser están localizadas en la región N-terminal. El contenido de Gly y Ser de los primeros 240 residuos de aa (aminoácidos) es de 17.5 y 14.2%, respectivamente. La región N-terminal se pudo dividir en cinco subregiones y contenía dos secuencias (residuos 40-59 y 131-145) que podrían formar a-hélices antipáticas. Los primeros 39 residuos del extremo N-terminal contienen mucha Gly, Ser, Leu y Asn, pero pocos aminoácidos aromáticos o con carga. De manera similar, la región que conecta las dos a-hélices potenciales tiene un alto contenido de Gly, Asn y Gln, pero no residuos aromáticos. Los residuos 146-232 contienen varias repeticiones de Ser/Thr-Pro/Ser/Thr-Pro/Ser/Thr, lo cual sugiere que esta región podría ser una región de ligadura (Gilkes, et al . , Microbiol. Rev., 55: 303-15 (1991), la cual se incorpora en la presente como referencia) . Ejemplo 12 - El extremo C-terminal de la HrpW es homólogo a las pectato liasas. Búsquedas en una base de datos utilizando los algoritmos BLAST y FASTA (Altschul, et al . , J. Mol. Biol.,, 215: 403-10 (1990) y Pearson, et al . , Proc. Nati., Acad. Sci. EUA, 85: 2444-48 (1988), las cuales se incorporan en la presente como referencia) indicaron que la región C-terminal de la HrpW es homologa a la PLA-D de Nectria haematococca apareamiento tipo VI ( Fusarium solani f. sp. pisi ) (González, et ai . , J. Bacteriol., 174: 6343-49 (1992), Guo, et al . , J. Bacteriol., 177: 7070-77 (1995), Guo, et al . , Arch. Biochem. Biophys., 323: 352-60 (1995) y Guo, et al . , Arch. Biochem. Biophys., 332: 305-12 (1996), las cuales se incorporan en la presente como referencia) . Los valores de BLAST P() y de FASTA E() de las búsquedas con los parámetros por omisión, fueron 4.0e-14 a 3.03-10 y 2.7e-08" a le-06, respectivamente. Basándose en alineamientos BESTFIT, la HrpW fue 27-33% idéntica a PLs fúngicas y los valores de Z fueron 8.14 a 13.3. Así mismo, la búsqueda en la base de datos con PLs de N. haematococca demostró que son homologas de la Pel-3 y PelB de Erwinia carotovora subespecie carotovora (Liu, et al . , Appl. Env. Microbiol., 60: 2545-52 (1994) y Heikinheimo, et al . , Mol. Plant-Microbe Interact., 8: 207-17 (1995), las cuales se incorporan en la presente como referencia) (los valores BLAST P() variaron de 9.0e-15 a 8.6e-10 y las identidades BESTFIT fueron 31-36%) . Estas PL fúngicas y Pel-3/PelB de E. carotovora, junto con la HrpW, forman una clase distinta a las otras familias de PL. Partiendo de un alineamiento de las proteínas, fueron reconocibles cinco bloques altamente conservados (Fig. 3) . Los siete miembros comparten 20 residuos idénticos, de los cuales cinco son Gly. El algoritmo PHD predijo &-hojas y rizos para lá región de .homología a PL de la HrpW, excepto para la secuencia en los residuos 329-336, la cual es propensa formar una a-hélice (Fig. 3) . De manera intrigante, la HrpW no contiene ningún residuo Cys, los cuales son conservados entre las PL en la clase. Además, la actividad de PL de la HrpW no pudo ser detectada utilizando las diversas pruebas descritas en materiales y métodos. Ejemplo 13 - La producción y secreción de la HrpW son dependientes de hrp. Una inmunoelectrotransferencia con anticuerpos antiHrpW, detectó HrpW sólo en el sobrenadante de preparaciones de E. amylovora Ea321 y Ea273, lo cual indica que la HrpW es secretada eficientemente (Fig. 4) . No se encontró HrpW en preparaciones de mutantes hrpL de Ea321-K49 y Ea73-K49, lo cual demuestra que la expresión del hrpW es dependiente de hrpL. Además, la HrpW no fue detectada o estuvo restringida a preparaciones de células completas de mutantes de secreción hrp de cepas Ea321-G84 y Ea273-G73, respectivamente. Así pues, la secreción de HrpW depende de la ruta Hrp. Los anticuerpos antiHrpW no reaccionaron con HrpW (Fig. 4, carril 2), lo cual sugiere deficiencias estructurales entre los dos inductores. Ejemplo 14 - La HrpW induce necrosis tisular rápida en plantas, de manera termoestable y sensible a proteasas. A partir de las propiedades predichas de la HrpW, se infiere que es inductora de RH. Para probar esta posibilidad, la proteina parcialmente purificada fue infiltrada en hojas de tabaco. El área infiltrada empezó a colapsarse después de 8-12 horas y se desarrolló una necrosis tisular típica, indistinguible de la causada por HrpN, de 24 a 36 horas después de la inoculación (Fig. 5A, panel 9) . La HrpW indujo necrosis tisular en el tabaco a concentraciones de 1.1 µM (50 µg/ml). La HrpW también causó necrosis en la violeta africana, geranio, jitomate, pimiento, Kalanchoe diagremontiana y Arabidopsis thaliana, pero no en soya. Una preparación tratada por calor de HrpW todavía causó necrosis rápida en hojas de tabaco, lo cual indica la naturaleza termoestable de la actividad (Fig. 5A, panel2) . Por otro lado, el tratamiento de la HrpW con 3 mg/ml de proteasa (tipo XIV; Sigma, St. Louis, MO) durante 1 hora, destruyó la actividad inductora de RH. Ejemplo 15 - La inducción por HrpW requiere el metabolismo de la planta. Un punto principal fue si la necrosis tisular causada por HrpW se debía a un mecanismo comparable con las harpinas (He, et al . , Cell, 73: 1255-66 (1993) y He, et al . , Mol. Plant-Microbe Interact., 7: 289-92 (1994), las cuales se incorporan en la presente como referencia) . - La coinfiltración de HrpW PILC con los inhibidores metabólicos cicloheximida, cloruro de lantano o vanadato de sodio (los blancos son el ribosoma 80S, los canales de Ca 2+, ATPasas/Y-fosfatasas, respectivamente) evitó la RH (Fig. 5B, paneles 3-5) , de manera similar a HrpN PILC con los inhibidores (Fig. 5B, paneles 7-8) . Esto indica que es necesario el metabolismo activo de la planta para que la HrpW induzca RH. Las hojas de tabaco infiltradas con PelE de E. chrysantemi EC16, también exhibieron necrosis tisular rápida ~ (Fig. 5B, panel 9) . Sin embargo, la necrosis causada por PelE ocurrió más rápido y el área colapsada estaba translúcida, más obscura, más suave y se rompía fácilmente, en comparación con la inducida por las harpinas. Además, la necrosis tisular inducida por PelE es independiente de la presencia de inhibidores (Fig. 5B, paneles 10-11) . Ejemplo 16 - La región N-terminal es suficiente para inducir RH. Se construyó un fragmento hrpW que codifica los 226 residuos N-terminales, designado HrpW (1-226) y se confirmó la producción de HrpW (1-226). Se desarrolló una RH típica de 24 a 36 horas después de la infiltración de la HrpW (1-226) PILC en hojas de tabaco, aunque la actividad fue más débil que aquella de la HrpW de longitud completa. Esta Hrp (1-226) se produce de manera estable e induce la RH independientemente de la región C-terminal que soporta la estructura de dos dominios de la HrpW, derivada de los datos de secuencia.

Ejemplo 17 - El hrpW es conservado entre cepas de E. amylovora.. Se examinó la presencia de hrpW en otras bacterias, por hibridación de tipo Southern. Bajo condiciones altamente estrictas, se observaron bandas únicas para cada una de las diez cepas de E. amylovora probadas . Los tamaños de las bandas de restricción sugirieron tres grupos diferentes. Cuando se probaron condiciones poco estrictas, fueron visibles bandas de hibridación de varias, otras especies de Erwinia, tales como E. carotovora y E. salicis y el pCPP2157, que es una clona que contiene el grupo de genes hrp de E. chrysantemi (Bauer, et al . , Mol. Plant-Microbe Interact., 8: 484-91 (1995) , la cual se incorpora en la presente como referencia) (Fig. 6) . Previamente, se conocía cuando mucho sólo una harpina por cada bacteria. Sin embargo, E. amylovora codifica para HrpW, una harpina distinta de la primera harpina descrita (HrpN; Wei, et al . , Science, 257: 85-88 (1992), la cual se incorpora en la presente como referencia) . El análisis Southern sugiere que el hrpW existe en varias otras especies de Erwinia, lo cual sugiere una función de la HrpW en la patogénesis. Además, la comparación de secuencias indicó que la EXP-60 (renombrada como HrpW de P. syringae pv. tomato (Yuan, et al . , J.

Bacteriol., 178: 6399-6402 (1996), la cual se incorpora en la presente como referencia) ) es homologa a la HrpW de E. amyl ovora . El análisis sugiere que la HrpW es una proteína de múltiples dominios que comprende el dominio N-terminal rico en Gly/Ser y el dominio C-terminal de homología con PL. Fue sorpresivo que la HrpW tuviera homología con las PL, debido a que E. amylovora se cree que no es pecolítica (Seemüller, et al . , Phytopathology, 66: 433-36 (1976), la cual se incorpora en la presente como referencia) . Además, no se ha sugerido ninguna función de enzima péctica para las harpinas (Alfano, et al . , Plant Cell, 8: 1683-98 (1996), la cual se incorpora en la presente como referencia) . Aunque no se detectó actividad PL, la HrpW no es el primer homólogo de PL para el cual no ha sido demostrada una actividad de enzima péctica. Algunas proteínas de polen de plantas son homologas a PL y se ha sospechado la función de enzima péctica por la expresión específica de pólenes de los genes codificantes (Wing, et al . , Plant Mol. Biol., 14: 17-28 (1990), la cual se incorpora en la presente como referencia) ; sin embargo, no presentan actividad enzimática detectable (Dircks, et al . , Plant Physiol. Biochem., 34: 509-20 (1996), la cual se incorpora en la presente como referencia) . La HrpW puede diferir en especificidad de substrato de sus homólogos o puede carecer de una función de enzima péctica, como las a-lactalbúminas, las cuales son homologas a las lisozimas, pero no tienen función de lisozima (McKenzie, et al . , Adv. Prot. Chem., 41: 173-315 (1991), la cual se incorpora en la presente como referencia) . Alternativamente, en vez de la función de liasa, la HrpW puede tener sólo una función de unión a substancias pécticas (Kurosky, et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 77: 3388-92 (1980), la cual se incorpora en la presente como referencia) . La HrpW es excepcional como homologa de PL en varios aspectos. No posee el péptido de señal N-terminal que es reconocido por la maquinaria de secuenciación; en vez de esto, es secretada por la ruta de tipo III. No contiene residuos Cys conservados en las PL, los cuales pueden tener funciones estructurales y funcionales. Además, la inducción de RH por la HrpW depende del metabolismo de la planta. Los datos de análisis Southern sugieren que E. carotovora tiene un homólogo de hrpW diferente al pel-3/pelB. Considerando su dependencia del sistema hrp y la falta de actividad PL detectable, la función de la HrpW en la patogénesis podría no ser la simple degradación de la pared celular para utilizarla como fuente de carbono; en vez de esto, a través de una posible actividad de enzima péctica o actividad de unión a la pared celular, podría ayudar a la proteína Hrp pilus (Roine, et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 94: 3459-64 (1997), la cual se incorpora en la presente como referencia) o a otras proteínas de patogenicidad/virulencia/avirulencia a pasar a través de la pared celular. Varios grupos evolutivamente relacionados de enzimas pécticas parecen basarse en comparaciones de aminoácidos y análisis estructurales: i) una clase denominada la "superfamilia de PL extracelular" (Henrissat, et al . , Plant Physiol., 107: 963-76 (1995) y las referencias que hay en ella, las cuales se incorporan en la presente como referencia) que incluye dos familias PL de bacterias patógenas de plantas, Bacill us subtilis y algunos hongos, PelX de E. carotovora, pectina liasas y proteínas de polen de plantas y de estilo de plantas; ii) una clase que comprende PLs periplásmicas de Yersinia pseudotuberculosis y E. carotovora (Hinton, et ai., Mol.

Microbiol. , 3, 1785-96 (1989), la cual se incorpora en la presente como referencia) y la KdgC de E. chrysantemi (Condemine, et al . , Mol. Microbiol., 5: 2191-2202 (1991), la cual se incorpora en la presente como referencia; iii) una clase que consiste de PLs de N. haematococca y la Pel-3/PelB de E. carotovora; iv) PelX y PelL de E. chrysantemi (Alfano, et al . , J. Bacteriol., 177: 4553-56 (1995) y Lojkowska, et al . , Microbiol., 16: 1183-95 (1995), las cuales se incorporan en la presente como referencia) y v) la PelZ recientemente reportada de E. chrysantemi y E. carotovora (Pissavin, et al . , J. Bacteriol., 178: 7187-96 (1996) , la cual se incorpora en la presente como referencia) . La tercera clase de grupo de homología todavía no ha sido reconocida como una familia de proteínas, aunque se han mencionado miembros en la literatura científica (Henrissat, et al . , Plant Physiol., 107: 963-76 (1995) y Liao, et al . , Mol. Plant-Microbe Interact. , 9: 14-21 (1996), las cuales se incorporan en la presente como referencia) . Por lo tanto, esta tercera clase a la cual la HrpW de E. amylovora pertenece, será referida como las "pectato liasas clase III" para diferenciarlas de las otras dos clases, las cuales serían denominadas "clase I" y "clase II". Los miembros de las "PLs clase III" parecen estar ampliamente distribuidos en patógenos de plantas. Además de la HrpW en P. syringae pv. tomato, E. chrysantemi tiene la Pell, la cual está muy estrechamente relacionada con la Pel-3/PelB de E. carotovora . Es enigmático cómo las harpinas son aparentemente heterogéneas en secuencia y posiblemente en estructura, y pueden inducir la misma respuesta en las plantas. La acción de "matar células" de las harpinas, no parece deberse al potencial enzimático o a una función tóxica tal como hacer poros en la membrana celular; la actividad RH es termoestable (Wei, et al . , Science, 257: 85-88 (1992); He, et al . , Cell, 73: 1255-66 (1993) y Arlat, et al . , EMBO J., 13: 543-53 (1994), las cuales se incorporan en la presente como referencia) , requiere del metabolismo de la planta (He, et al . , Cell, 73: 1255-66 (1993) y He, et al . , Mol. Plant-Microbe Interact . , 7: 289-92 (1994), las cuales se incorporan en la presente como referencia) y algunos fragmentos pueden inducir la reacción (Arlat, et al . , EMBO J., 13: 543-53 (1994); Alfano, et al . , Mol. Microbial., 19: 715-28 (1996) y Laby, et al . , Molecular Studies on Interactions Between Erwinia amylovora and Its Host and Non-Host Plants, Universidad de Cornell, Ithaca, NY (1997), las cuales se incorporan en la presente como referencia) . Las proteínas Avr inducen la RH en plantas portadoras de los correspondientes genes de resistencia (Staskawicz, et al . , Science, 268: 661-67 (1995), la cual se incorpora en la presente como referencia) . Parece menos probable que las harpinas evoquen la RH por el mismo tipo de mecanismo, aunque podrían ser compartidos algunos eventos de señalización cadena abajo. Los posibles mecanismos de señalización que conducen a la RH contra las harpinas, fueron discutidos por Novacky y colegas (Hoyos, et al . , Mol. Plant-Microbe Interact., 9: 608-16 (1996), la cual se incorpora en la presente como referencia) . Parece ser que la riqueza en Gly/Ser puede ser importante para la función inductora de RH de las harpinas, debido a que fragmentos no traslapados que inducen la RH incluyen a las regiones ricas Gly/Ser (Arlat, et al . , EMBO J. , 13: 543-53 (1994); Alfano, et al . , Mol. Microbial., 19: 715-28 (1996) y Laby, et al . , Molecular Studies on Interactions Between Erwinia amylovora and Its Host and Non-Host Plants, Universidad de Cornell, Ithaca, NY (1997), las cuales se incorporan en la presente como referencia) . En apoyo a esta hipótesis, una HrpW truncada conteniendo el dominio N-terminal rico en Gly/Ser, tiene actividad inductora de RH. Por otro lado, la inducción de RH por fragmentos es más débil en comparación con la proteína completa (Laby, et al . , Molecular Studies on Interactions Between Erwinia amylovora and Its Host and Non-Host Plants, Universidad de Cornell, Ithaca, NY (1997), las cuales se incorporan en la presente como referencia) , lo cual indica que otra u otras partes de las harpinas contribuyen a la potencia de la RH. Será de interés determinar si las proteínas ricas en glicina de la pared celular de las células de planta ("GRPs") , . en donde los genes que codifican para estas son expresados durante la xilogenesis y después de lesiones por infecciones virales (Showalter, A. M., Plant Cell, 5: 9-23 (1993), la cual se incorpora en la presente como referencia) , poseen la capacidad de causar la muerte celular.

Las harpinas parecen estar dirigidas hacia partes externas de las células de planta, tales como la pared celular. Estas pueden inducir RH cuando se aplican exógenamente al tejido de plantas por infiltración. Cuando se agregan harpinas a un cultivo de suspensión celular, hay un flujo de salida de K y la alcalinización del medio, lo cual es referido como reacción de intercambio ("XR") , seguida por la muerte celular (Wei, et al . , Science, 257: 85-88 (1992) y Popham, et al . , Physiol. Mol. Plant Pathol., 47: 39-50 (1995), las cuales se incorporan en la presente como referencia) . Sin embargo, la XR no ocurre en cultivos de protoplastos. Además, los anticuerpos contra la HrpZ localizan a la HrpZ fuera de las células de la planta y no es los protoplastos, y la alcalinización y la localización está bloqueada por un agente quelante que extrae el Ca 2+ y la pectina (Hoyos, et al . , Mol. Plant-Microbe Interact., 9: 608-16 (1996) , la cual se incorpora' en la presente como referencia) . La homología de la HrpW con las PL es consistente con un modelo en el cual el sitio de acción de la harpina es la pared celular de la célula de planta. Los sistemas tipo III de patógenos animales, secretan numerosas proteínas involucrada en la patogénesis (por ejemplo, véase Cornelis, et al . , Mol. Microbiol., 23: 861-67 (1997), la cual se incorpora en la presente como referencia) . Sin embargo, sólo hasta recientemente se ha demostrado que las harpinas son distribuidas por la maquinaria tipo III de los patógenos de plantas. Evidencia reciente sugiere que múltiples proteínas son secretadas a través de la ruta Hrp y que varias proteínas Avr son transformadas directamente en las células de planta, por la maquinaria de secreción de Hrp (Gopalan, et al . , Plan Cell, 8: 1095-1105 (1996); Leister, et al . , Proc. Nati. Acad. Sci . EUA, 93: 15497-15502 (1996); Scofield, et al . , Science, 274: 2063-65 (1996); Tang, et al . , Science, 274: 2060-63 (1996) y Van Den Ackerveken, et al . , Cell, 87: 1307-16 (1996) , las cuales se incorporan en la presente como referencia) . Es interesante que el gen hrpW esté flanqueado por dspE y ORFB (Fig. IB) , los cuales son homólogos del avrE de P. syringae y avrRxv de X. campestris pv. vesicatoria, respectivamente. El vínculo entre los genes de las harpinas y los homólogos sin huésped de genes avr, proporciona una pista acerca de las relaciones entre ellas en la patogénesis. Las harpinas podrían en realidad ser una clase de proteínas Avr, o las proteínas Avr podrían ser en realidad proteínas de virulencia. La proteína PopA de P. solanacearum GM11000, induce la RH sólo en líneas de petunia resistentes (Arlat, et al . , EMBO J. , 13: 543-53 (1994), la cual se incorpora en la presente como referencia) . Así mismo, la expresión del fenotipo Avr está controlada por el sistema hrp y algunos genes avr poseen virulencia o funciones de patogenicidad (Dangl, Curr. Top. Microbiol. Immunol . , 192: 99-118 (1994), la cual se incorpora en la presente como referencia) . De hecho, el gen dspE es un factor de patogenicidad. Así pues, la región- del genoma de E. amylovora en donde residen los genes de las harpinas y los homólogos avr, puede constituir un arsenal de proteínas utilizadas para bombardear diferentes partes de la célula huésped. El esclarecimiento de sus blancos específicos y sus efectos en la RH y en la patogénesis, será de primordial importancia para entender los mecanismos de las interacciones bacteria-planta. Aunque la presente invención ha sido descrita con detalle para el propósito de ilustración, debe entenderse que tales detalles son únicamente para ese propósito y que los técnicos en la materia pueden realizar variaciones sin apartarse del espíritu y los alcances de la presente invención, tal como queda definida por las siguientes reivindicaciones. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (39)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecedente, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Una molécula de ADN aislada, caracterizada porque codifica para una proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad, en donde la molécula de ADN aislada se selecciona del grupo que consiste de (a) una molécula de ADN que comprende la secuencia nucleotídica de la SEQ ID No. 1, (b) una molécula de ADN que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 2, (c) una molécula de ADN que se hibridiza con una molécula de ADN que comprende la secuencia nucleotídica de la SEQ ID No. 1, bajo condiciones estrictas y (d) una molécula de ADN complementaria a las moléculas de ADN de los incisos (a) , (b) y (c) .
2. 2. Una molécula de ADN aislada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de ADN es una molécula de ADN que comprende la secuencia nucleotídica de la SEQ ID No. 1.
3. 3. Una molécula de ADN aislada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de ADN es una molécula de ADN que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 2.
4. 4. Una molécula de ADN aislada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de ADN es una molécula de ADN que se hibridiza con una molécula de ADN que comprende la secuencia nucleotídica de la SEQ ID No. 1, bajo condiciones estrictas.
5. 5. Una molécula de ADN aislada de conformidad con la~ reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de ADN es una molécula de ADN complementaria a las moléculas de ADN de los incisos (a) , (b) y (c) .
6. 6. Un vector de expresión transformado con la molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1.
7. 7. Un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la molécula de ADN está en una orientación de sentido apropiada y con un marco de lectura correcto.
8. 8. Una célula huésped transformada con la molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1.
9. 9. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la célula huésped se selecciona del grupo que consiste de una célula de planta o un célula bacteriana.
10. 10. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la molécula de ADN es transformada con un vector de expresión.
11. 11. Una planta transgénica transformada con la molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1.
12. 12. Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la planta se selecciona del grupo que consiste de alfalfa, arroz, trigo, cebada, centeno, algodón, girasol, cacahuate, maíz, papa, papa dulce, frijol, chícharo, achicoria, lechuga, endivia, col, csl de Bruselas, remolacha, chirivía, nabo, coliflor, brócoli, rábano, espinaca, cebolla, ajo, berenjena, pimienta, cilantro, zanahoria, chayóte, calabaza, calabacín, pepino, manzana, pera, melón, cítricos, fresa, uva, frambuesa, piña, soya, tabaco, jitomate, sorgo y caña de azúcar.
13. 13. Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la planta se selecciona del grupo que consiste de Arabidopsis thaliana, Saíntpaulia, petunia, geranio, poinsettia, crisantemo, clavel y zinnia.
14. 14. Una semilla de planta transgénica transformada con la molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1.
15. 15. Una semilla de planta transgénica de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la semilla de planta se selecciona del grupo que consiste de alfalfa, arroz, trigo, cebada, centeno, algodón, girasol, cacahuate, maíz, papa, papa dulce, frijol, chícharo, achicoria, lechuga, endivia, col, col de Bruselas, remolacha, chirivía, nabo, coliflor, brócoli, rábano, espinaca, cebolla, ajo, berenjena, pimienta, cilantro, zanahoria, chayóte, calabaza, calabacín, pepino, manzana, pera, melón, cítricos, fresa, uva, frambuesa, piña, soya, tabaco, jitomate, sorgo y caña de azúcar. ~
16. 16. Una semilla de planta transgénica de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la semilla de planta se selecciona del grupo que consiste de ?rabidopsis thaliana, Saintpaulia, petunia, geranio, poinsettia, crisantemo, clavel y zinnia.
17. 17. Una proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad aislado, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de una proteína o polipéptido que tiene una secuencia .de aminoácidos que comprende la SEQ ID No. 2 y una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que se hibridiza con una molécula de ADN que comprende la secuencia nucleotídica de la SEQ ID No. 1.
18. 18. Una proteína o polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la proteína o polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID No. 2.
19. 19. Una proteína o polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la proteína o polipéptido es codificado por un ácido nucleico que se hibridiza con una molécula de ADN que comprende la secuencia nucleotídica de la SEQ ID No. 1.
20. 20. Un método para impartir resistencia a enfermedades a las plantas, caracterizado porque comprende: aplicar una proteína o polipéptido de conformidad con la"reivindicación 17 en una forma no infecciosa, a una planta o semilla de planta, bajo condiciones estrictas, para impartirle resistencia a enfermedades.
21. 21. Un método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque las plantas son tratadas durante la aplicación.
22. 22. Un método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque las semillas de planta son tratadas durante la aplicación, en donde el método además comprende: plantar las semillas tratadas con el inductor de respuesta de hipersensibilidad, en suelo natural o artificial y propagar las plantas a partir de las semillas plantadas en el suelo.
23. 23. Un método para incrementar el crecimiento de plantas, caracterizado porque comprende: aplicar una proteína o polipéptido de conformidad con la reivindicación 17 en una forma no infecciosa a la planta o a la semilla de planta, bajo condiciones efectivas para incrementar el crecimiento de la planta.
24. 24. Un método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque las plantas son tratadas durante la aplicación.
25. 25. Un método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque las semillas de planta son tratadas durante la aplicación, en donde el método además comprende: plantar las semillas tratadas con el inductor de respuesta de hipersensibilidad, en suelo natural o artificial y propagar las plantas a partir de las semillas plantadas en el suelo.
26. 26. Un método para controlar insectos de plantas, caracterizado porque comprende: aplicar una proteína o polipéptido de conformidad con la reivindicación 17 en una forma no infecciosa a una planta o semilla de planta, bajo condiciones efectivas para controlar insectos.
27. 27. Un método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque las plantas son tratadas durante la aplicación.
28. 28. Un método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque las semillas de planta son tratadas durante la aplicación, en donde el método además comprende: plantar las semillas tratadas con el inductor de respuesta de hipersensibilidad en suelo natural o artificial y propagar las plantas a partir de las semillas plantadas en el suelo.
29. 29. Un método para impartir resistencia a enfermedades a las plantas, caracterizado porque comprende: proporcionar una planta transgénica o semilla de planta transgénica transformada con una molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1 y hacer crecer la planta transgénica o plantas transgénicas producidas a partir de semillas de planta transgénica, bajo condiciones efectivas para impartirles resistencia a enfermedades.
30. 30. Un método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porgue se proporciona una planta transgénica.
31. 31. Un método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque se proporciona una semilla de planta transgénica.
32. 32. Un método para incrementar el crecimiento de plantas, caracterizado porque comprende: proporcionar una planta transgénica o semilla de planta transgénica transformada con una molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1 y hacer crecer la planta transgénica o plantas tránsgénicas producidas a partir de semillas de planta transgénicas, bajo condiciones efectivas para incrementar el crecimiento de la planta. —
33. 33. Un método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque se proporciona una planta transgénica.
34. 34. Un método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque se proporciona una semilla de planta transgénica.
35. 35. Un método para el control de insectos de plantas, caracterizado porque comprende: proporcionar una planta transgénica o semilla de planta transgénica transformada con una molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1 y hacer crecer la planta transgénica o plantas transgénicas producidas a partir de semillas de plantas transgénicas, bajo condiciones efectivas para controlar insectos.
36. 36. Un método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque se proporciona una planta transgénica.
37. 37. Un método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque se proporciona una semilla de planta transgénica.
38. 38. Una composición caracterizada porque comprende : una proteína o polipéptido de conformidad con la reivindicación 17 y ~ un vehículo.
39. 39. Una composición de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque además comprende un aditivo que se selecciona del grupo que consiste de fertilizantes, insecticidas, fungicidas, nematicidas y mezclas de los mismos. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una proteína o polipéptido aislado que induce una respuesta de hipersensibilidad en plantas, así como una molécula de ADN aislada que codifica para la proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad. Esta proteína o polipéptido aislado y la molécula de ADN aislada, se pueden utilizar para impartir resistencia a enfermedades a plantas, para incrementar el crecimiento de plantas y/o para controlar insectos en plantas. Esto se puede lograr mediante la aplicación de la proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad, en una forma no infecciosa, a plantas o semillas de planta bajo condiciones efectivas para impartirle resistencia a enfermedades, para incrementar el crecimiento de plantas y/o para controlar insectos en las plantas o en las plantas crecidas a partir de las semillas de planta. Alternativamente, se pueden proporcionar plantas transgénicas o semillas de planta transgénicas transformadas con una molécula de ADN que codifica para una proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad y las plantas transgénicas o las plantas provenientes de las semillas de planta transgénicas se hacen crecer bajo condiciones efectivas para impartirles resistencia a enfermedades, para incrementar el crecimiento y/o para controlar insectos en las plantas o en las plantas crecidas a partir de las semillas de planta.