MXPA00002115A - Uso de un productor de respuesta hipersensitiva de bacterias gram positivas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion esta dirigida al uso de una proteina o polipeptido de bacterias Gram positivas, tales como Clavibacterias michiganesis subsp. Sedeponicus, el cual produce una respuesta hipersensitiva en las plantas. Esta proteina o polipeptido se puede utilizar para conferir resistencia a enfermedad en plantas, para promover el crecimiento de las plantas, y/o para controlar insectos en las plantas. Esto se puede lograr aplicando el polipeptido o proteina productora de respuesta hipersensitiva en una forma no infecciosa a las plantas o semillas de plantas bajo condiciones efectivas para conferir resistencia a enfermedades, para promover el crecimiento de las plantas, y/o para controlar insectos en las plantas o en las plantas cultivadas a partir de las semillas de las plantas.

Description

USO DE UN PRODUCTOR DE RESPUESTA HIPERSENSI IVA DE BACTERIAS GRAM POSITIVAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona al uso de un productor ae respuesta hipersensitiva de bacterias Gram positivas, tal como la Cl avibacter mi chi ganens- s subsp. sepedoni cus, para la resistencia a enfermedades, mejora del crecimiento y control de insectos .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las interacciones entre patógenos bacterianos y sus huéspe .e. vegetales caen generalmente en dos categorías: (i) (patógeno-huésped) compatibles, que conllevan a un crecimiento bacteriano intercelular, desarrollo de síntomas, y desarrollo de enfermedad REF.: 32879 en la planta huésped y; (2) (patógeno-no huésped) incompatibles, resultando en la respuesta hipersensitiva, un tipo particular de interacción incompatible que ocurre sin síntomas de enfermedad progresiva. Durante las interacciones compatibles en las plantas huésped, las poblaciones bacterianas se incrementan dramáticamente y ocurren los síntomas progresivos. Durante las interacciones incompatibles, las poblaciones bacterianas no se incrementan, y los síntomas progresivos no ocurren.

La respuesta hipersensitiva ("HR") es una necrosis rápida, localizada que se asocia con la defensa activa de las plantas en defensa de muchos patógenos (Kiraly, Z., "Defenses. Triggered by the Invader: Hypersensitivity", páginas 201-224 in: Plant Disease: An Advanced Treatise, Vol. 5, J.G.Horsfall y E. B. Cowling, ed. Academic Press New York (1980); Klement, Z., "Hypersensitivity", páginas 149-177 in: Phytopathogenic Prokaryotes, Vol. 2, M S. Mount y G. H. Lacy, ed. Academic Press, New York (1982). La respuesta hipersensitiva producida por bacterias se observa fácilmente como un colapso de tejidos si se infiltran altas concentraciones (> 107 células/ml) de un patógeno con una gama limitada de huéspedes como es Pseudomonas syringae o Erwini a amyl ovora en las hojas de las plantas no huésped (la necrosis ocurre solamente en células aisladas de plantas con bajos niveles de inoculo) (Klemen, Z., "Rapid Detection of Pathogenicity of Phytopathogenic Pseudomonads ", Nature 199: 299-300; Klement, et al., "Hypersensitive Reaction Induced by Phytopathogenic Bacteria in the Tobacco Leaf"" Phytopathology 54: 474-477 (1963); Turner et al., "The Quantitative Relation Between Plant and Bacterial Cells Involved in the Hypersensitive Reaction", Phytopathology, 64: 885-890 (1974); Klement, Z., "Hypersensitivity" , páginas 149-177 in Phytopathogenic Prokaryotes, Vol. 2., M. S. Mount y G. H. Lacy, ed. Academic Press, New York (1982) . La capacidad para producir la respuesta hipersensitiva en un no-huésped y el patógeno en un huésped parecen estar ligados. Como se hace notar por Klement, Z., "Hypersensitivity", páginas 149-177 in Phytopathogenic Prokaryotes, Vol. 2., M. S. Mount y G. H. Lacy, ed. Academic Press, New York (1982), estos patógenos también causan necrosis fisiológicamente similares aunque retardadas en sus interacciones con huéspedes compatibles. Además, la habilidad para producir la respuesta hipersensitiva o patogénesis es dependiente de un juego común de genes, denotados hrp (Linsgren, P. B . , et al., "Gene Cluster of Pseudomonas syringae pv. 'phaseolicola ' Controls Pathogenicity of Bean Plants and Hypersensitivity on Nonhost Plants", J. Bacteriol. 168: 512-22 (1986); Willis, D. K., et al., "hrp Genes of Phytopathogenic Bacteria", Mol. Plant-Microbe Interact. 4: 132-138 (1991). Consecuentemente, la respuesta hipersensitiva puede guardar claves tanto de la naturaleza de la defensa de las plantas y del fundamento para la patogenicidad bacteriana.

Los genes hrp están generalizados en patógenos Gram negativos de las plantas, en. donde se agrupan, conservan, y en algunos casos son intercambiables (Willis, D. K., et al., "hrp Genes of Phytopathogenic Bacteria", Mol. Plant-Microbe Interact. 4: 132-138 (1991); Bonas U., "hrp Genes of phytopathogenic Bacteria", páginas 79-98 in: Current Topics in Microbiology and Immunology: Bacterial pathogenesis of Plants and Animáis - Molecular and Cellular Mechanis s, J. L. Dangl, ed. Springer- Verlag, Berlin (1994) . Varios genes hrp codifican para los componentes de una vía de secreción proteica similar a una utilizada por Yersinia , Shigella y Salmonella, spp. para secretar proteínas esenciales en las enfermedades animales (Van Gijsege'm et al., "Evolutionary Conservation of Pathogenicity Determinants Among Plant and Animal Pathogenic Bacteria", Trends Microbiol . , 1: 175-180 (1993) . Se ha mostrado que los genes hrp en E . amyl ovora , P. syringa e y P. solanacearum, con toda la producción y secreción de productores de proteínas ricos en glicina, de la respuesta hipersensitiva (He, S. Y., et al. "Pseudomonas Syringae pv. Syringae Harpinss: a Protein that is Secréted via the Hrp Pathway and Elicits the Hypersensitive Response in Plants" Cell, 73: 1255-1266 (1993), Wri, Z.-H., et al.,. "Hrpl of Erwini a amyl ovora Functions in Secretion of Harpin and is a Member of a New Protein Family" J. Bacteriol. 175: 7958-7967 (1993); Arlat, M., et al. "PopAl, a Protein Which Induces a Hypersensitive-like Response on Specific Petunia Genotypes, is Secreted via the Hrp Pathway of Pseudomonas solanacearum" , EMBO J. 13: 543-553 (1994) .

La primera de estas proteínas se descubrió en E. amylovo.ra Ea321, una bacteria que causa la rolla de plantas rosáceas, y que -se designó harpin (Wei, Z . -M., et al., "Harpin, Elicitor of the Hypersensitive Response Produced by the Plant Pathogen Erwinia amylovora", Science 257: 85-88 (1992) . Las mutaciones en el gen codificador para hrpN revelaron que se requiere harpin para E. amylovora para producir una respuesta hipersensitiva en hojas de tabaco no huéspedes en incitar síntomas de enfermedad en frutas de pera altamente susceptibles. La proteína GMI1000 PopAl de P. solanacearum tiene propiedades físicas similares y también produce la respuesta hipersensitiva en hojas de tabaco; el cual no es un huésped de esa cepa (Arlat et al. "PopAl, a Protein Which Induces a Hypersensitive-like Response on Specific Petunia Genotypes, i.s Secreted via the Hrp Pathway of Pseudomonas solanacearum", EMBO J. 13: 543-553 (1994) . Sin embargo, los mutantes de P. solanacearum popA aún producen la respuesta hipersensitiva del tabaco e incita enfermedad en el tomate. Por lo tanto, el papel de estos productores de respuesta hipersensitiva ricos en glicina puede variar ampliamente entre los patógenos Gram negativos de las plantas.

Se han aislado, clonado y secuenciado otros productores de respuesta hipersensitiva patogénicos de las plantas. Estos incluyen: Erwinia chrysanthemi (Bauer et al., " Erwi nia chrystan themi HarpinEch: Soft-Rot Pathogenesis, MPMI, 8(4): 484-91 (1995)); Erwi nia carotovora (Cui, et al., "The RsmA- Mutants_ of Erwinia carotovora subsp. carotovora Strain Ecc71 Overexpress hrpNEcc and Elicit a Hypersensitive Reaction-like Response in Tobacco Leaves", MPMI 9(7): 565-76 (1966)); Erwinia stewartii (Ahmad, et al., "Harpin is not Necessary for the Pathogenicity of Erwinia stewartii on Maize", 8th Int'l, Cong. Molec. Plant-microb. ínter. Julio 14-19 1996 y Ahmad, et al., "Harpin is not Necessary for the Pathogenicity of Erwinia stewartii on Maize", Ann. Mtg. Am. Phytopath. Soc. julio 27-31, 1996) ; y Pseudomonas syri ngae pv. syri nga e (WO 94/26782 para Cornell Research Foundation, Inc.).

La presente invención está dirigida al uso de un polipéptido o proteína productora de respuesta hipersensitiva de una bacteria Gram positiva.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN El polipéptido o proteína productora de la respuesta hipersensitiva de bacterias Gram positivas tales como Cl avibacter, particularmente Cl avibact et michiganensi s subsp. sepedoni cus, se puede utilizar para conferir una resistencia a enfermedades en las plantas, para estimular el crecimiento de la planta, y/o controlar a los insectos. Esto implica aplicar el polipéptido o proteína productora de la respuesta hipersensitiva en una forma no infecciosa a plantas o semillas de plantas bajo condiciones efectivas que confieran una resistencia a enfermedades, para promover el crecimiento de la planta y/o para controlar los insectos en plantas o plantas que se cultivan a partir de las semillas de las plantas.

Como una alternativa para aplicar el polipéptido o proteína productora de la respuesta hipersensitiva gram positivo a plantas o semillas de plantas a fin de conferir resistencia a enfermedades, para promover el crecimiento de la planta y/o controlar los insectos de las plantas o plantas cultivadas a partir de las semillas de las plantas, se pueden utilizar plantas o semillas de plantas transgénicas.

Cuando se utilizan plantas transgénicas, esto implica proporcionar una planta transgénica transformada con una molécula de ADN que codifica para el polipéptido o proteína gram positiva productora de respuesta hipersensitiva y cultivar a la planta bajo condiciones efectivas para conferir resistencia a enfermedades, promover el crecimiento de la planta, y/o para controlar a los insectos en las plantas o en las plantas cultivadas a partir de las semillas de las plantas. Alternativamente, una semilla de una planta transgénica transformada con la molécula de ADN que codifica para el polipéptido o proteína productora de respuesta hipersensitiva Gram positivo se puede proporcionar y colocar en la .tierra. Luego se propaga una planta bajo condiciones efectivas para conferir resistencia a enfermedades, para promover el crecimiento de la planta y/o controlar los insectos en plantas o plantas que se cultivan a partir de las semillas de plantas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona al uso del polipéptido o proteína productora de respuesta hipersensitiva de bacterias Gram positivas, tales como Clavibacter, particularmente Clavibacter michi ganensi s subsp. sepedoni cus, para resistencia a enfermedades, aumento del crecimiento, y control de insectos en las plantas. Este polipéptido o proteína productora de respuesta hipersensitiva se describe y se puede aislar según Nissinen, et al., " Clavibacter michigane?isi s subsp. sepedoni cus, Elicits a Hypersensitive Response in Tobacco and Secretes Hypersensitive Response-Inducing Protein (s)", Phytopathology, pp . 678-84 (1997). El gen que codifica para este polipéptido o proteína productora para la respuesta hipersensitiva se puede obtener mediante procedimientos que se conocen bien en la técnica. La .proteína se puede purificar a través de técnicas convencionales tales como la cromatografía o electroforésis . La secuencia terminal amino de la proteína se determina y utiliza para diseñar oligonucleótidos degenerados que se etiquetan y se utilizan como sondas para detectar una librería de clones. Se incorpora aquí para su referencia Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Sprimng Harbor New York (1989) . Se aisla y se secuencia ADN plásmido a partir de clones que se hibridan a la sonda terminal amino. La secuencia de la molécula de ADN se puede determinar utilizando ya sea métodos químicos (Maxam et al . , Proc . Nati . Acad. Sci. USA, 74: 560 (1977), ó métodos (Sanger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 74: 5463 (1977) enzimáticos .

Los fragmentos de la proteína o polipéptido productor de la respuesta hipersensi iva mencionados con anterioridad se abarcan mediante la presente invención.

Los fragmentos adecuados se pueden producir por medios diversos. En el primero, los subclones del gen que codifica para la proteína productora de la presente invención se producen mediante una manipulación genética molecular convencional al subclonar los fragmentos de genes. Luego se expresan los clones in vi tro o in vi vo en células bacterianas para producir un péptido o proteína menor la cual se puede analizar para su actividad productora según el procedimiento que se describe más adelante.

Como una alternativa, se pueden producir los fragmentos de la proteína productora mediante la digestión con enzimas proteolíticas de una proteína productora de longitud entera como la quimiotripsina o proteinasa A de Staphyl ococcus o tripsina. Las diferentes enzimas proteolíticas tienen la probabilidad de partir a las proteínas productoras en sus diferentes sitios basados en la secuencia de aminoácidos de la proteína productora. Algunos de los fragmentos que resultan a partir de la proteolísis pueden ser productores activos de resistencia.

En otro enfoque, basándose en el conocimiento de la estructura primaria de la proteína, se pueden sintetizar los fragmentos de la proteína productora utilizando la técnica de PCR .junto con juegos específicos de cebadores que se escogen para representar a las porciones particulares de la proteína. Estos se clonan después en un vector apropiado para la expresión incrementada de una protéína o péptido truncado.

También se puede utilizar la síntesis química para hacer fragmentos adecuados. Tal síntesis se lleva a cabo utilizando secuencias de aminoácidos conocidas para el polipéptido o proteína productora que se va a producir. Alternativamente, al someter a temperaturas y presiones elevadas un productor de longitud completa, éste producirá fragmentos. Estos fragmentos se pueden luego separar mediante procedimientos convencionales (por ejemplo, cromatografía y SDS-PAGE) .

Las variantes , también se pueden (alternativamente) modificar mediante por ejemplo, la supresión o adición de aminoácidos que tienen una influencia mínima en las propiedades, estructura secundaria y naturaleza hidropática del polipéptido.' Por ejemplo, un polipéptido se puede conjugar a una secuencia de señal (o líder) en el extremo ter inal-N de la proteína, la cual dirige la transferencia de la proteína de forma co-traduccional ó post-traduccional . El polipéptido también se puede conjugar a un ligador u otra secuencia para la facilidad de síntesis, purificación o identificación del polipéptido.

La proteína o polipéptido de la presente invención se produce preferiblemente en forma purificada (preferiblemente en un 80% y más preferiblemente aún en un 90% puro) mediante técnicas convencionales. De manera típica, la proteína o polipéptido de la presente invención se secreta al medio de crecimiento de las células recombinantes huésped.

Alternativamente, la proteína o polipéptido de la presente invención se produce pero no se secreta al medio de crecimiento. En semejantes casos, para aislar la proteína, la célula huésped (por ejemplo, E. coli ) que transporta un plásmido recombinante se propaga y se lisa mediante un tratamiento sónico, calor, presión diferencial, o tratamiento químico, y el homogenado se centrifuga para remover los restos bacterianos. Luego se somete el sobrenadante a una' precipitación secuencial de sulfato de amonio. La fracción que contiene el polipéptido o proteína de la presente invención se somete a .una filtración por gel en una columna de poliacrilamida o dextrán de un tamaño apropiado para separar las proteínas. Si es necesario, la fracción proteica puede purificarse aún más mediante un HPLC.

La molécula de ADN que codifica para la proteína o polipéptido productor de la respuesta hipersensitiva se puede incorporar en las células utilizando tecnología de ADN recombinante convencional. Generalmente, esto implica insertar a la molécula de ADN en un sistema de expresión al cual la molécula de ADN es heteróloga (es decir, en el que normalmente no está presente) . La molécula de ADN heteróloga se inserta en el sistema de expresión o en un vector con una orientación propia de homosentido y cuadro de lectura corecto. El vector contiene los elementos necesarios para la transcripción y la traducción de las secuencias insertadas codificadoras de proteína.

La. Patente de E. U. A. No. 4,237,224 de Cohén y Boyer describe la producción de los sistemas de expresión en forma de plásmidos recombinantes utilizando las divisiones de enzimas de restricción y ligación con ADN ligasa. . Estos . plásmidos recombinantes luego se introducen mediante medios de transformación y se replican mediante cultivos unicelulares que incluyen organismos procarióticos y células eucarióticas que se cultivan en cultivo de tejido.

Los genes recombinantes también se pueden introducir en virus, tales como el virus de la vacuna. Los virus recombinantes s'e pueden generar mediante la transfección de plásmidos en células infectadas con el virus.

Los vectores adecuados incluyen, pero no se limitan, a los siguientes vectores virales tales como el sistema de vector lambda gtll, gt WES.tB, Charon 4 y vectores plásmidos tales como el pBR322, pBR325,' pACYC177, pACYC1084, pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pLG339, pR290, pKC37, pKClOl, SV 40, pBluescript II SK +/- ó KS +/- (ver "Stratagene Cloning Systems" Catalog (1993) de Stratagene, La Jolla, Calif.),la cual se incorpora en la presente para su referencia, pQE, pIH821, pGEX, pET series (ver Studier et al., "Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Clones Genes.", Gene Expression Technology, vol. 185 (1990)), y cualquier derivado de esto. Las moléculas recombinantes se pueden introducir en las células por medio de la transformación - particularmente, la transducción, conjugación, movilización o electroporación. Las secuencias de ADN se clonan en el vector utilizando los procedimientos de clonación normales en la técnica, como se describe por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Laboratory, Cold Springs Harborm, New York (1989) .

Se puede utilizar una diversidad de sistemas de huésped-vector para expresar la(s) secuencia (s) codificadora (s) de proteína (s). Ante todo, el sistema de vector debe s,er compatible con la célula huésped utilizada. Los sistemas huésped-vector incluyen pero no se limitan a lo siguiente: bacterias transformadas con ADN bacteriófago, ADN plásmido, o ADN cósmido; a microorganismos tales como la levadura que contiene vectores de levadura; sistemas de células de mamífero infectadas con virus (por ejemplo, virus de la vacuna, adenovirus, etc.); sistemas de células de insectos infectadas con virus (por ejemplo, baculovirus) ; y células de plantas infectadas con bacterias. Los elementos de expresión de estos vectores varían en su fuerza y especificaciones. Dependiendo del sistema huésped-vector utilizado, cualquiera de muchos de elementos adecuados de transcripción y traducción se pueden utilizar.

Las diferentes señales genéticas y eventos de procesamiento controlan los variados niveles de expresión genética (por ejemplo, transcripción de ADN y ARN mensajero (ARNm) traducción) .

La transcripción de ADN es dependiente de la presencia de un promotor el cual es una secuencia de ADN que dirige la aglutinación de ARN polimerasa y por ello promueve la síntesis de ARNm. Las secuencias de ARN de promotores eucarióticos difieren de aquellas de los promotores procarióticos . Además, los promotores eucarióticos y las señales genéticas acompañantes pueden no ser reconocidas o pueden no funcionar en un sistema procariótico . Y, además, los promotores procarióticos no son reconocidos y no funcionan en' células eucarióticas.

De forma similar, la traducción del ARNm en procariontes depende de la presencia de señales procarióticas adecuadas que difieren de aquellas de las eucarióticas. La traducción eficiente del ARNm en procariontes requiere de un sitio de unión ribosomal llamado la secuencia de Shine-Dalgarno ("SD") en el ARNm. Esta secuencia es una secuencia corta de nucleótidos de un ARNm que se localiza antes de el codón iniciador, usualmente AUG, el cual codifica para la metionina terminal amino de la proteína. Las secuencias SD son complementarias al extremo 3' del ARNrl6S (ARN ribosomal) y probablemente promueve la unión del ARNr con los ribosomas mediante una duplicación con el ARNr para permitir la posición correcta del ribosoma. Para un repaso sobre cómo maximizar la expresión genética, ver a Roberts y Lauer, Methods in Enzimology, 68: 473 (1979) .

Los promotores varían en su "fuerza" (es decir, su habilidad para promover la transcripción) . Para los propósitos de expresar a un gen clonado, es deseable utilizar promotores fuertes a fin de' obtener un alto nivel de transcripción y, por lo tanto, de expresión del gen. Dependiendo del sistema de célula huésped utilizado, . se puede usar cualquiera de muchos promotores adecuados . Por ejemplo, cuando se clona en E. coli , sus bacteriófagos o plásmidos, promotores tales como el promotor fago T7, promotor lac, promotor trp, promotor recA, promotor ARN ribosomal, promotores PR y PL del colifago lambda y otros, influyen pero no se limitan a iacUV5, ompF, bl a , lpp, y similares, se pueden utilizar para dirigir los altos niveles de la transcripción de segmentos de ADN adyacentes. Adicionalmente, un promotor híbrido trp-lacUV5 ( tac) u otros promotores de E. coli producidos mediante técnicas de ADN recombinante u otras técnicas de ADN sintético se pueden utilizar para proporcionar la transcripción del gen insertado.

Se pueden escoger las cepas de células huésped bacterianas y los vectores de expresión los cuales inhiban la acción del promotor a menos que se induzcan específicamente. En ciertas operaciones, es necesaria la adición de los inductores específicos para una transcripción eficiente del ADN insertado. Por ejemplo, el operón lac se induce por la adición de lactosa o IPTG (isopropiltio-beta-D-galactósido) . Una diversidad de otros operones, tales .como trp, pro, etc., se encuentran bajo diferentes controles.

Las señales de iniciación específica también se requieren para una transcripción y traducción de genes eficiente en las células procarióticas. Estas señales de iniciación de transcripción y traducción pueden variar en "fuerza" como se mide por la cantidad de ARN mensajero génico específico y proteína sintetizada, respectivamente. El vector de expresión del ADN el cual contiene un promotor, también puede contener cualquier combinación de diversas señales de iniciación "fuertes" de transcripción y/o traducción. Por ejemplo, la traducción eficiente en E. coli requiere de una secuencia SD de aproximadamente 7-9 bases 5' al codón de iniciación ("ATG") para proporcionar un sitio de unión ribosomal. De esta manera, cualquier combinación de SD-ATG puede utilizarse por los ribosomas de células huésped. Semejantes combinaciones incluyen pero no se limitan a la combinación de SD-ATG a partir del gen ero ó el gen N del colífago lambda, o a partir de los genes del triptófano E, D, C, B ó A de E. coli . Además, se puede utilizar cualquier combinación de SD-ATG producida por AD? recombinante u .otras técnicas que involucran la incorporación de nucleótidos sintéticos .

Una vez que la molécula aislada de AD? que codifica para la proteína o polipéptido productor de la respuesta hipersensitiva que se ha clonado en un sistema^ de expresión, ésta se encuentra lista para ser incorporada en una, célula huésped. Semejante incorporación se puede llevar a cabo mediante las diversas formas de transformación que se advierten con anterioridad, dependiendo del sistema celular vector-huésped. Las células huésped adecuadas incluyen pero no se limitan a bacterias, virus, levaduras, células de mamífero, insectos, plantas, y similares .

La presente invención se relaciona a métodos para conferir la resistencia a enfermedades en las plantas, promover el crecimiento de la planta y/o efectuar un control de insectos en las plantas. Estos métodos incluyen aplicar una proteína o polipéptido productor de respuesta hipersensitiva en forma no infecciosa a la totalidad o parte de la planta o semilla de la planta bajo condiciones en donde la proteína o polipéptido. hace contacto con la totalidad o parte de la célula de la planta o la semilla de la planta. Alternativamente, el polipéptido c proteína productora de la respuesta hipersensitiva se puede aplicar a plantas de manera tal, que las semillas recuperadas a partir de las mismas plantas son capaces de conferir resistencia a las enfermedades de las plantas, de promover el crecimiento de la planta y/o de efectuar un control de insectos .

Como alternativa a la aplicación de una proteína o polipéptido productor de respuesta hipersensitiva a las plantas o semillas de las plantas a fin de conferir resistencia a enfermedades en las plantas, para promover el crecimiento de las plantas y/o para controlar los insectos en las plantas o las plantas que se hicieron crecer a partir de las semillas, se pueden utilizar plantas o semillas de plantas transgénicas. Cuando se utilizan plantas transgénicas, esto implica proporcionar una planta transgénica transformada con una molécula de ADN que codifica para una proteína o polipéptido productor de respuesta hipersensitiva y cultivar a la planta bajo condiciones efectivas para permitirle a la molécula de ADN conferir resistencia a enfermedades en las plantas, promover el crecimiento de las plantas y/o controlar los insectos. Alternativamente, se puede proporcionar una semilla de una planta transgénica transformada con una molécula de ADN que codifica para una proteína o polipéptido productor de respuesta hipersensitiva y plantarla en la tierra. Luego se propaga una planta a partir de la semilla de la planta bajo condiciones efectivas para permitirle a la molécula de ADN conferirle resistencia de enfermedades a las plantas', para promover el crecimiento de la planta y/o para controlar los insectos.

La modalidad de la presente invención en donde la proteína o polipéptido productor de respuesta hipersensitiva se aplica a la planta o a la semilla de la planta se puede llevar a cabo en diversas formas, que incluyen: 1) la aplicación de una proteína o polipéptido productor aislado; 2) la aplicación de bacterias que no causen enfermedad y que son transformadas con genes que codifican para un proteína o polipéptido productor de respuesta hipersensitiva; y 3) la aplicación de un bacteria que causa enfermedad en algunas especies de plantas (pero no en aquellas en las cuales se aplican) y que naturalmente contienen un gen que codifica para la proteína o polipéptido productor de respuesta hipersensitiva .

En una modalidad de la presente invención, la proteína o polipéptido productor de la respuesta hiperse.nsitiva de la presente invención se puede aislar a partir de su fuente bacteriana.

En otras modalidades de la presente invención, la proteína o polipéptido productor de la respuesta hipersensitiva de la presente invención se puede aplicar a plantas o semillas de plantas al aplicar bacterias que contienen los genes que codifican para la proteína o polipéptido productor de la respuesta hipersensitiva. Semejantes bacterias deben ser capaces de secretar o de exportar la proteína o polipéptido para que 'el productor pueda hacer contacto con las células de la planta o las semillas de la planta. En estas modalidades, la proteína o polipéptido productor de la respuesta hipersensitiva se produce por las bacterias en la planta o en las semillas o simplemente antes de la introducción de la bacteria a las plantas o las semillas de las plantas .

En una modalidad del modo de aplicación bacteriana de la presente invención, las bacterias no causan enfermedad y han sido transformadas (por ejemplo, de manera recombinante) con genes que codifican para una proteína o polipéptido productor de la respuesta hipersensitiva. Por ejemplo, E. coli , la cual no produce una respuesta hipersensitiva en las plantas, se puede transformar con genes que codifican para una proteína o polipéptido productor de una respuesta hipérsensitiva y luego aplicársele a las plantas. En esta modalidad de la presente invención también se pueden utilizar otras especies bacterianas aparte de E. coli .

En otra modalidad del modo de aplicación bacteriana de la presente invención, las bacterias sí causan enfermedad y naturalmente contienen al gen que codifica para una proteína o polipéptido productor de respuesta hipersensitiva. Los ejemplos de semejantes bacterias se mencionan con anterioridad. Sin embargo, en esta modalidad, éstas bacterias se aplican a plantas o -a sus semillas las cuales no son susceptibles a enfermedades que acarrea dicha bacteria.

El método de la presente invención se puede utilizar para tratar una amplia variedad de plantas o sus semillas para conferir resistencia a enfermedades, promover el crecimiento y/o el control de los insectos. Las plantas adecuadas incluyen dicotiledóneas y monocotiledóneas . De mayor particularidad, las plantas de cultivo útiles pueden incluir: alfalfa, arroz, trigo, cebada, centeno, algodón, girasol, cacahuate, maíz, papa, batata, frijol, c iciaro, achicoria, lechuga, endivia, col, coles de rucelas, oetabel, chiridia, nabo, coliflor, brócoli, nabo, rábano, espinaca, cebolla, ajo, berenjena, pimiento, cilantro, zanahoria, calabaza, calabacitas, calabacín, pepino, manzana, pera, meló:., cítricos, fresa, uva, frambuesa, pina, soya, tabaco, jitomate, sorgo, y caña de azúcar. Los ejemplos de plantas ornamentales adecuadas son: Arabidopsi s thali ana , Sai ntpa ulia , petunia, crisantemos, claveles, zinia, pastora roja y pelargonio .

Con respecto al uso de polipétido o proteína productora de la respuesta hipersensitiva de la presente invención para conferir resistencia a enfermedades, no se puede conferir una inmunidad absoluta en contra de la infección, pero la severidad de las enfermedades se reduce y el desarrollo de los síntomas se retrasa. El número de lesiones, tamaño de lesiones, y la extensión de la esporulación de los patógenos fúngales se disminuye en todos estos. Este método de conferir resistencia a enfermedades tiene el potencial de tratar enfermedades previamente intratables, de tratar las enfermedades sistemáticamente las cuales pudieran no ser tratadas de manera separada debido al costo, y evitar el uso de agentes infecciosos o de materiales ambientalmente dañinos .

El método para conferir resistencia patogénica a las -plantas según la presente invención es útil para conferir resistenci'a a una amplia variedad de patógenos que incluyen virus, bacterias y hongos. La resistencia, inter alia a los siguientes virus se puede lograr mediante el método de la presente invención: Vi rus del mosai co del tabaco y Virus del mosai co del j i tomate . La resistencia, inter alia a las siguientes también se puede .conferir a plantas según la presente invención: Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syringa e pv. tabaci y Xanthomonas campestri s pv. pelargonii . Las plantas se pueden hacer resistentes, inter alia a los siguientes hongos mediante el uso del método de la presente invención: Fusari um oxysporum y Phytoph thorai nfestans .

Con respecto a la utilizanción del polipéptido o proteína productora de respuesta hipersensitiva de la presente invención para promover el crecimiento dentro de la planta, se pueden lograr diversas formas de promoción o intensificación del crecimiento de la planta. Esto puede ocurrir tan pronto como comience el crecimiento de la planta a partir de las semillas o más adelante en la vida de la planta. Por ejemplo, el crecimiento de la planta según la presente invención abarca una mayor producción, cantidad incrementada de semillas producidas, porcentaje incrementado de las semillas germinadas, tamaño incrementado de la planta, mayor biomasa, más fruta y de mayor tamaño, una coloración más temprana de la fruta, una maduración más temprana de ía fruta o planta. Como resultado, la presente invención proporciona a los cultivadores un beneficio económico significativo. Por ejemplo, una germinación y maduración más temprana permite que se cultiven los cultivos en áreas en donde las temporadas cortas del cultivo de evitarían otra forma su crecimiento en esa localidad. El porcentaje incrementado de la germinación de las semillas resulta en una resistencia mejorada de los cultivos y en una utilización más eficiente de semillas. Una mayor producción, tamaño incrementado, y una producción mejorada de la biomasa permiten una generación mayor de ingresos a partir de un parcela de terreno dada.

Otro aspecto de la presente invención se dirige a efectuar cualquier forma de control de insectos para las plantas. Por ejemplo, el control de insectos según la presente invención abarca prevenir que los insectos hagan contacto con las plantas a las cuales se les ha aplicado el productor de respuesta hipersensitiva, previniendo un daño directo por parte de los insectos al dañarlas mediante la alimentación, al causar que los insectos se alejen de semejantes plantas, al matar a los insectos próximos a semejantes plantas, al interferir con la alimentación larvaria en semejantes plantas, al prevenir que los insectos colonizen a las plantas huésped, al previnir que los insectos colonizadores liberen fitotoxinas, etc. La presente invención también previene un daño por una enfermedad subsecuente en las plantas como resultado de una infección por insectos.

La presente invención es efectiva en contra de una amplia variedad de insectos. El pintón Europeo es una gran peste del maíz (maíz dulce y dentado) pero también se alimenta de más de 200 especies de plantas que incluyen judías verdes, haba, y alubias, frijoles de soya comestibles, pimientos, papa, y jitomate, además de muchas especies de algas. Las pestes adicionales de larvas de insectos alimentándose que dañan una amplia variedad de cultivos vegetales incluyen lo siguiente: gusano combatiente del betabel, gusano rizador de la calabaza, gusano de la oreja del maíz, gusano combatiente de otoño, polilla espalda de diamante, gusano de la raíz de la col, gusano de la cebolla, gusano de la semilla del maíz, gusano del pepinillo' (gusano del melón) , gusano del pimiento y verme del tomate. Colectivamente, este grupo de pestes de insectos representa el grupo de pestes de mayor importancia económica para la producción vegetal mundial .

El" método de la presente invención el cuál implica la aplicación de una proteína o polipéptido productor de respuesta hipersensitiva, se puede llevar a cabo a través de una variedad de procedimientos cuando toda o parte de la planta sea tratada, incluyendo las hojas, tallos, raíces, propágulos (por ejemplo, esquejes), etc. Esto puede (pero no necesita) incluir la infiltración de la proteína o polipéptido productor de la respuesta hipersensitiva en la planta. Los métodos adecuados de la aplicación incluyen aplicaciones tópicas, tales como atomización de alta o baja presión, así como inyección y abrasión de la hoja próxima cuando la aplicación del productor tenga lugar. Cuando se tratan las semillas de las plantas, según la modalidad de la aplicación de la presente invención, el polipéptido o proteína productora de la respuesta hipersensitiva se puede aplicar mediante procedimientos tópicos, tales como atomización de alta o baja presión, recubrimiento o inmersión, así como mediante inyección. Otros procedimientos de aplicación adecuados pueden proveerse mediante aquellos diestros en la técnica siempre y cuando sean capaces de efectuar contacto con la proteína o polipéptido productor de la respuesta hipersensitiva con las células de la planta o semillas de la planta. Una vez que se han tratado con el productor de respuesta hipersensitiva de la presente invención, las semillas se pueden plantar en tierra natural o artificial y se pueden cultivar utilizando procedimientos convencionales para producir las plantas. Luego de que las plantas se han propagado a partir • de las semillas tratadas según la presente invención, las plantas se pueden tratar con una o más aplicaciones del polipéptido o proteína productora de la respuesta hipersensitiva para conferirle a las plantas resistencia a enfermedades, para promover el crecimiento de la planta y/o controlar los insectos en las plantas.

La proteína o polipéptido productor de la respuesta hipersensitiva se puede aplicar a las plantas o semillas de las plantas según la presente invención solo o en mezcla con otros materiales. Alternativamente, la proteína o polipéptido productor de la respuesta hipersensitiva se puede aplicar de forma separada a las plantas con otros materiales que son aplicados en diferentes momentos.

Una composición adecuada para tratar a las plantas o a las semillas de las plantas según la modalidad de la aplicación de la presente invención contiene una proteína o polipéptido productor de la respuesta hipersensitiva en un portador. Los portadores adecuados incluyen agua, soluciones acuosas, pastas aguadas, o polvos secos. En esta modalidad, la composición contiene más de 500 nM de proteína o de polipéptido productor de la respuesta hipersensitiva.

Aunque no se requiere, esta composición puede contener aditivos adicionales que incluyan fertilizantes, como insecticidas, fungicidas, nematocidas, y mezclas de aquellos. Los fertilizantes adecuados incluyen (NH4) 2N0 . Un ejemplo de un insecticida adecuado es el Malathion. Los fungicidas útiles incluyen Captan.

Otros aditivos adecuados incluyen agentes' amortiguadores, agentes humectantes, agentes cobertores y agentes erosionadores . Estos materiales se pueden utilizar para facilitar el proceso de la presente invención. Además, la polipéptido productor de la respuesta hipersensitiva se puede aplicar a las semillas de las plantas con otras formulaciones convencionales de semillas y materiales de tratamiento, que incluyen barro y polisacáridos.

En la modalidad alternativa de la presente invención, que implica el uso de plantas transgénicas y semillas transgénicas, una polipéptido productor de la respuesta hipersensitiva no necesita ser aplicado de manera tópica a las plantas o semillas. En lugar de esto, las plantas transgénicas transformadas con una molécula de ADN que codifica para una polipéptido productor de la respuesta hipersensitiva se produce según los procedimientos que se conocen bien en la técnica.

El vector que se describe con anterioridad se puede microinyectar directamente en las células de la planta mediante el uso de micropipetas para transferir mecánicamente el ADN recombinante. Crossway, Mol. Gen. Genetics, 202: 179-85 (1985). El material genético puede transferirse dentro de las células de la planta utilizando glicol de polietileno. Krens, et al., Nature, 296: 72-74 (1982) .

Otro enfoque para transformar a las células de las plantas con un gen el cual imparte resistencia a los patógenos es el bombardeo de partículas (también conocido co o transformación biolística) de la célula huésped. Esto se puede lograr en una de varias formas. La primera implica el impulsar partículas inertes o biológicamente activas dentro de las 'células. Esta técnica se da a conocer en la Patente de E. U. A. No. 4,945,050, 5,036,006 y 5,100,792, todas de Sandford et al. Finalmente, este procedimiento implica impulsar a las células partículas inertes o biológicamente activas bajo condiciones efectivas para penetrar en la superficie externa de la célula y para que sean incorporadas al interior de ésta. Cuando se utilizan partículas inertes, el vector se puede introducir en la célula al recubrir las partículas con el vector que contiene el ADN heterólogo. Alternativamente, la célula objetivo se puede rodear por el vector para que el vector sea transportado dentro de la célula por la estela de la partícula. Las partículas biológicamente activas (por .ejemplo, células bacterianas deshidratadas que contienen el vector y el ADN heterólogo) pueden también incrustarse dentro de las células de las plantas.

Incluso otro método de introducción es la fusión de los protoplastos con otras entidades, ya sean minicélulas, células, lisosomas u otros cuerpos fusionables de superficie lípida. Fraley et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 79: 1859-63 (1982) .

La molécula de ADN también se puede introducir en las células de las plantas mediante una electroporación . Fro m et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82: 5824 (1985). En esta técnica, los protoplastos de las plantas se electroporan en la presencia de plásmidos que contienen el cartucho de expresión. Les impulsos eléctricos de un campo de fuerza ' alto permabilizan reversiblemente las biome branas permitiendo la introducción de los plásmidos. Los protoplastos electroforados de las plantas reforman la pared celular, la dividen y regeneran .

Otro metido de introducir a la molécula de ADN en las células de las plantas .es infectar a la célula de la planta con Agrobacteri um tumefaci ens o A. rhizogenes previamente transformados con el gen. Bajo condiciones apropiadas conocidas en la técnica, las células d-j las plantas transformadas se cultivan para formar orotes o raíces que más adelante se desarrollen como plantas. Generalmente, este pocedimiento implica inocular al tejido de la planta con una suspensión de bacterias e incubar el tejido durante 48 a 72 horas en un medio de regeneración sin antibicti. os de 25-26 "C.

El agrobacterio es un género gram negativo representativo de la familia Rhizobiaceae . Sus especies son responsables de la corona áspera (A. tumefaciens) y de la enfermedad de la raíz pelúcida (A. hi zogenes) . Las células de la plantas en los tumores de corona áspera y en raíz pelúcida se inducen para producir derivados de aminoácidos conocidos como opinas, los cuales solo se catabolizan por la bacteria. Los genes bacterianos responsables por la expresión de las opinas son una fuente conveniente de elementos de control para los cartuchos de expresión quimérica. Además, la valoración de la presencia de opinas se puede utilizar para identificar un tejido transformado. Las secuencias genéticas heterólogas se pueden introducir en las células de plantas apropiadas, por medio del plásmido Ti de A, t umefaci ens o del plásmido Ri de A. Rhi zogenes . El plásmido Ri ó Ti se transmite a las células de las plantas mediante una infección por Agrobacterium y se integra de forma estable en el genoma de la planta. J. Schell, Science, 237: 1176-83 (1987).

Luego de la transformación, las células de las plantas transformadas se deben regenerar. La regeneración de la planta a partir de protoplastos cultivados se describe en Evans et al., Handbook of Plant Cell Cultures, Vol. 1: (MacMillan Publishing, Co., New York, 1983); y Vasil I. R. (ed.), Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Acad. Press, Orlando, Vol. I, 1984 y Vol. III (1986) .

Se* sabe que prácticamente todas las plantas se pueden regenerar a partir de células o tejidos cultivados, que incluyen pero no se limitan, a todas las especies principales de caña de azúcar, betabel, algodón, árboles frutales y legumbres.

Los medios para la regeneración varían entre especies y especies de plantas, pero generalmente se proporciona primero una suspensión de protoplastos formados, o una caja de Petri que contenga explantas formadas. El tejido calloso se forma y se pueden inducir los brotes del tallo y subsecuentemente enraizar. Alternativamente, la formación embriónica se puede inducir en el tejido calloso. Estos embriones germinan como embriones naturales para formar las plantas. El medio de cultivo generalmente contiene varios aminoácidos y hormonas tales como la auxina y citocininas. También es ventajoso agregar ácido glutámico y prolina al medio, especialmente para tales especies como el maíz y la alfalfa. La regeneración eficiente dependerá del medio, del genotipo, y de la historia del cultivo. Si estas tres variables se controlan, la regeneración es usualmente reproducible y repetible.

Luego de que el cartucho de expresión se incorpora de manera estable en las plantas transgénicas, se puede transferir a otras plantas mediante una cruza sexual. Cualquiera de muchas técnicas normales de reproduccion.se puede utilizar, dependiendo de las especies a cruzar.

Toda vez que se han producido las plantas transgénicas de este tipo, las plantas en sí se pueden cultivar según el procedimiento convencional con la presencia del gen que codifica para el productor de la respuesta hipersensitiva dadndo como resultado una resistencia a enfermedades, una mejora del crecimiento y/o un control de insectos que pueden ser mediados por el ARN o que pueden resultar de la expresión de una proteína o polipéptido productor .

Cuando las semillas de las plantas y las plantas transgénicas se utilizan según la presente invención, se pueden tratar además con los mismos materiales que se utilizan para tratar a las plantas y semillas de las plantas a las cuales la proteína o polipéptido productor ce la respuesta hipersensitiva se aplica. Estos otros materiales, que incluyen los productores de la respuesta hipersensitiva, se pueden aplicar a las plantas y semillas transgénicas mediante los procedimientos mencionados con anterioridad, incluyendo la aspersión de alta o ba a presión, inyección, recubrimiento e inmersión. De manera similar, luego de que las plantas se han propagado a partir de las semillas de las plantas transgénicas, las plantas se pueden tratar con una o más aplicaciones del productor de la respuesta hipersensit ?v-: para conferirles resistencia a enfermedades, promover e^ crecimiento y/o controlar los insectos. Semejantes plantas pueden también tratarse con agentes convencionales para el tratamiento de plantas (por ejemplo, con insecticidas, fertilizantes etc.).

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método para conferir resistencia a enfermedades a las plantas caracterizado porque comprende : aplicar un polipéptido o proteína productora de la respuesta hipersensitiva de una bacteria Gram positiva, en una forma no infecciosa, a una planta o semilla de la planta bajo condiciones en donde la proteína o polipéptido hace contacto con las células de las plantas o las semillas de las plantas y que confiere resistencia a las enfermedades.

2. Un método en conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las plantas se tratan durante dicha aplicación.

3. Un método en conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las semillas de las plantas son tratadas durante esta aplicación, este método además comprende: plantar las semillas tratadas con el productor de respuesta hipersensitiva en una tierra natural o artificial y propagar las plantas a partir de las semillas plantadas en la tierra .

4. Un método en conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la bacteria Gram positiva es un Clavibacter.

5. Un método en conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el Cl avibacter es Clavibacter michiganensis subsp. sepedoni cus .

6. Un método para promover el crecimiento de la planta caracterizado porque comprende: aplicar un polipéptido o proteína productora de respuesta hipersensitiva de una bacteria Gram positiva, en una forma no infecciosa, a una planta o semilla de una planta bajo condiciones en donde la proteína o polipéptido hace contacto con las células de las plantas o las semillas de las plantas y promueve el crecimiento de la planta.

7. Un método en conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque las plantas son tratadas durante esta aplicación.

8. Un método en conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque las semillas de las plantas son tratadas durante esta aplicación, este método además comprende: plantar a las semillas tratadas con el productor de respuesta hipersensitiva en tierra natural o artificial y propagar las plantas a partir de las semillas plantadas en la tierra.

9. Un método en conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la bacteria Gram positiva es' un Clavibacter.

10. Un método en conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el Clavibacter es Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus .

11. Un método de control de insectos para plantas caracterizado porque comprende: aplicar un polipéptido o proteína productora de respuesta hipersensitiva de bacteria Gram positiva, en una .forma no infecciosa a una planta o semilla de una planta bajo condiciones en donde la proteína o polipéptido hace contacto con las células de las plantas o con las semillas de las plantas y que controla a los insectos.

12. Un método en conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque las plantas son tratadas durante la aplicación.

13. Un r método en conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque . las semillas de las plantas son tratadas durante esta aplicación, este método además comprende: plantar las semillas tratadas con el productor de respuesta hipersensitiva en una tierra natural o artificial y propagar a las plantas a partir de las semillas plantadas en la tierra.

14. Un método en conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la bacteria Gram positiva es un Clavibacter.

15. Un método en conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el Clavibacter es Clavibacter michiganensis subsp. sepedoni cus .