BR112020005730A2 - proteínas de fusão, membro da família bacillus cereus, fragmentos de exosporium, formulação, semente de planta e métodos para estimular o crescimento de plantas e para entregar uma enzima - Google Patents

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Abstract

São fornecidas proteínas de fusão contendo uma sequência de alvejamento, proteína de exosporium ou fragmento de proteína de exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. As proteínas de fusão compreendem ainda uma enzima com atividade ACC desaminase, uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma quitosanase, uma protease, uma glucanase, uma fitase, uma fosfatase ácida, uma pectinase, uma mananase e/ou uma proteína expansina. Também são fornecidos membros da família Bacillus cereus recombinante que expressam as proteínas de fusão, fragmentos de exosporium derivados dos membros da família Bacillus cereus recombinante e formulações contendo os membros da família Bacillus cereus recombinante ou fragmentos de exosporium. As sementes de plantas tratadas com os membros da família Bacillus cereus recombinante, fragmentos de exosporium ou formulações também são fornecidas. A invenção refere-se ainda a métodos para estimular o crescimento de plantas e/ou promover a saúde de plantas usando os membros da família Bacillus cereus recombinante, fragmentos de exosporium ou formulações.

Description

“PROTEÍNAS DE FUSÃO, MEMBRO DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS, FRAGMENTOS DE EXOSPORIUM, FORMULAÇÃO, SEMENTE DE PLANTA E MÉTODOS PARA ESTIMULAR O CRESCIMENTO DE PLANTAS E PARA ENTREGAR UMA ENZIMA” CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A presente invenção refere-se a proteínas de fusão contendo uma sequência de alvejamento, proteína de exosporium ou fragmento de proteína de exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. As proteínas de fusão compreendem ainda uma enzima com atividade ACC desaminase, uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma quitosanase, uma protease, uma glucanase, uma fitase, uma fosfatase ácida, uma pectinase, uma mananase e/ou uma proteína expansina. A invenção refere-se ainda a membros da família Bacillus cereus recombinante que expressam as proteínas de fusão, fragmentos de exosporium derivados dos membros da família Bacillus cereus recombinante e formulações contendo os membros da família Bacillus cereus recombinante ou fragmentos de exosporium. As sementes de plantas tratadas com os membros da família Bacillus cereus recombinante, fragmentos de exosporium ou formulações também são fornecidas. Os aditivos para alimentação animal e composições para alimentação animal compreendendo os membros da família Bacillus cereus recombinante ou fragmentos de exosporium derivados dos membros da família Bacillus cereus recombinante também são fornecidos. A invenção refere-se ainda a métodos para estimular o crescimento de plantas e/ou promover a saúde de plantas usando os membros da família Bacillus cereus recombinante, fragmentos de exosporium ou formulações. Também são fornecidos métodos para entrega de enzimas a um animal usando os membros da família Bacillus cereus recombinante ou fragmentos de exosporium derivados dos membros da família Bacillus cereus recombinante.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0002] Dentro da zona que circunda as raízes de uma planta, há uma região chamada rizosfera. Na rizosfera, bactérias, fungos e outros organismos competem pelos nutrientes e pela ligação às estruturas radiculares da planta. Bactérias e fungos prejudiciais e benéficos podem ocupar a rizosfera. As bactérias, fungos e o sistema radicular da planta podem ser influenciados pelas ações de peptídeos, enzimas e outras proteínas na rizosfera. O aumento do solo ou o tratamento de plantas com alguns desses peptídeos, enzimas ou outras proteínas teria efeitos benéficos nas populações gerais de bactérias e fungos benéficos do solo, criaria um ambiente geral mais saudável para o crescimento das plantas, melhoraria o crescimento das plantas e proporcionaria a proteção das plantas contra certos patógenos bacterianos e fúngicos. No entanto, tentativas anteriores para introduzir peptídeos, enzimas e outras proteínas no solo para induzir esses efeitos benéficos sobre as plantas têm sido dificultados pela baixa sobrevivência de enzimas, proteínas e peptídeos em solo. Além disso, a prevalência de proteases naturalmente presentes no solo pode levar à degradação das proteínas no solo. O ambiente em torno das raízes de uma planta (a rizosfera) é uma mistura única de bactérias, fungos, nutrientes e raízes que possui qualidades diferentes das do solo nativo. A relação simbiótica entre esses organismos é única e pode ser alterada para melhor com a inclusão de proteínas exógenas. A alta concentração de fungos e bactérias na rizosfera causa degradação ainda maior de proteínas devido a níveis anormalmente altos de proteases e outros elementos prejudiciais às proteínas no solo. Além disso, enzimas e outras proteínas introduzidas no solo podem se dissipar rapidamente das raízes das plantas.
[0003] Assim, existe uma necessidade na técnica de um método para fornecer efetivamente peptídeos, enzimas e outras proteínas às plantas (por exemplo, ao sistema radicular da planta) e estender o período de tempo durante o qual essas moléculas permanecem ativas. Além disso, existe uma necessidade na técnica de um método de alvejar seletivamente esses peptídeos, enzimas e proteínas para a rizosfera e para plantar folhas e raízes de plantas em particular.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0004] Uma proteína de fusão é fornecida. A proteína de fusão compreende uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. A proteína de fusão também compreende uma enzima com atividade de 1- aminociclopropano-1-carboxilato (ACC-desaminase) desaminase. A enzima com atividade de ACC desaminase compreende:
[0005] uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos uma substituição de aminoácidos em relação à sequência de uma enzima D-cisteína desulfidrase do tipo selvagem ou ACC desaminase de uma bactéria do gênero Bacillus, em que a substituição de aminoácidos resulta em atividade aumentada de ACC desaminase em comparação com a atividade de ACC-desaminase da enzima D-cisteína- desulfidrase do tipo selvagem ou ACC-desaminase nas mesmas condições;
[0006] uma enzima Bacillus ;
[0007] uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 242-245;
[0008] ou uma combinação de qualquer um das mesmas.
[0009] Outra proteína de fusão é fornecida. A proteína de fusão compreende uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. A proteína de fusão também compreende uma fosfolipase. A fosfolipase:
[0010] compreende uma fosfolipase B;
[0011] compreende uma fosfolipase C, a fosfolipase C compreendendo uma fosfolipase C beta 1, uma fosfolipase C beta 2, uma fosfolipase C beta 3, uma fosfolipase C beta 4, uma fosfolipase C delta 1, uma fosfolipase C delta 3, uma fosfolipase C delta 4, uma fosfolipase C épsilon 1, uma fosfolipase C gama 1, uma fosfolipase C gama 2, uma fosfolipase C eta 1, uma fosfolipase C eta 2, uma fosfolipase C zeta 1 ou uma combinação de qualquer uma das mesmas;
[0012] compreende uma fosfolipase D, a fosfolipase D compreendendo uma fosfolipase D1, uma fosfolipase D2, um membro 3 da fosfolipase D, um membro 4 da fosfolipase D, um membro 5 da fosfolipase D, um membro 6 da fosfolipase D ou uma combinação de qualquer um dos mesmos;
[0013] compreende uma fosfolipase A2, em que a fosfolipase A2 compreende uma fosfolipase A2 do Grupo IIA, uma fosfolipase A2 do Grupo IIC, uma fosfolipase A2 do Grupo IID, uma fosfolipase A2 do Grupo IIE, uma fosfolipase A2 do Grupo IIF, uma fosfolipase A2 do Grupo III, uma fosfolipase A2 do Grupo IVA, uma fosfolipase A2 do Grupo IVB, uma fosfolipase A2 do Grupo IVC, uma fosfolipase A2 do Grupo IVD, uma fosfolipase A2 do Grupo IVE, uma fosfolipase A2 do Grupo VIF, uma fosfolipase A2 do Grupo V, uma fosfolipase A2 do Grupo VI, uma fosfolipase A2 do Grupo VII, uma fosfolipase A2 do Grupo X, uma fosfolipase A2 do Grupo XIIA, uma fosfolipase A2 do Grupo XIIB, uma fosfolipase A2 do Grupo XV, uma fosfolipase A2 do Grupo XVI, ou uma combinação das mesmas;
[0014] compreende uma 1-alquil-2- acetilglicerofosfocololina esterase;
[0015] compreende uma fosfatidilinositol desacilase;
[0016] compreende uma fosfolipase C fosfatidilinoslitol-específico;
[0017] compreende uma esfingomielina fosfodiesterase;
[0018] compreende uma esfingomielina fosfodiesterase D;
[0019] compreende uma alquilglicerofosfoetanolamina fosfodiesterase;
[0020] compreende uma fosfolipase C de glicoproteína de superfície variante;
[0021] compreende uma glicosilfosfatidilinositol fosfolipase D;
[0022] compreende uma N-acetilfosfatidiletanolamina hidrolisante fosfolipase D;
[0023] compreende uma fosfatidilinositol diacilglicerol-liase;
[0024] compreende uma glicosilfosfatidilinositol diacilglicerol-liase;
[0025] compreende um domínio de fosfolipase do tipo patatina contendo proteína 2 (PNPLA2);
[0026] compreende um domínio de fosfolipase do tipo patatina contendo proteína 3 (PNPLA3);
[0027] compreende uma fosfolipase de Streptomyces;
[0028] compreende uma fosfolipase de Clostridium;
[0029] compreende uma fosfolipase de Acidovorax;
[0030] compreendendo fosfolipase de Listeria;
[0031] compreende uma fosfolipase de Bacillus cereus;
[0032] compreende uma fosfolipase de Bacillus licheniformis;
[0033] compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 252-260 e 373-375;
[0034] consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250 ou 251;
[0035] ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.
[0036] Outra proteína de fusão é fornecida. A proteína de fusão compreende uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. A proteína de fusão compreende ainda uma lipase. A lipase compreende:
[0037] uma lipase de éster carboxílico;
[0038] uma diacilglicerol lipase alfa;
[0039] uma diacilglicerol lipase beta;
[0040] uma lipase A;
[0041] uma lipase hepática;
[0042] uma lipase sensível a hormônios;
[0043] uma lipase gástrica;
[0044] uma lipase endotelial;
[0045] um membro da lipase H;
[0046] um membro da família lipase I;
[0047] um membro da família lipase J;
[0048] um membro da família lipase K;
[0049] um membro da família lipase M;
[0050] um membro da família lipase N;
[0051] uma lipase lipoproteica;
[0052] uma lipase monoglicerídica;
[0053] uma proteína 2 relacionada à lipase pancreática;
[0054] uma proteína 3 relacionada à lipase pancreática;
[0055] uma lipase de acilglicerol;
[0056] uma galactolipase;
[0057] uma lipase lipoproteica;
[0058] uma lipase de Burkholderia cepacia;
[0059] uma lipase de Burkholderia stearothermophilus;
[0060] uma lipase de Pseudomonas;
[0061] uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 262-266;
[0062] ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.
[0063] Outra proteína de fusão é fornecida. A proteína de fusão compreende uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína de exosporium que alveja ada proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. A proteína de fusão também compreende uma xilanase. A xilanase compreende:
[0064] uma beta-xilanase;
[0065] uma xilanase de Caldicellulosiruptor;
[0066] uma xilanase de Bacillus;
[0067] uma xilanase de Neocallimastix;
[0068] uma xilanase de Thermomyces;
[0069] uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 267-273;
[0070] ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.
[0071] Uma proteína de fusão adicional é fornecida. A proteína de fusão compreende uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. A proteína de fusão também compreende uma xilosidase. A xilosidase compreende:
[0072] uma xilosidade de Caldicellulosiruptor saccharolyticus;
[0073] uma xilosidase de Bacillus pumilus;
[0074] uma xilosidase de Bacillus subtilis;
[0075] uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 274-276;
[0076] ou uma combinação das mesmas.
[0077] Outra proteína de fusão é fornecida. A proteína de fusão compreende uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. A proteína de fusão compreende ainda uma lactonase. A lactonase compreende:
[0078] uma lactonase de Bacillus;
[0079] uma lactonase de Agrobacterium;
[0080] uma lactonase de Rhodococcus;
[0081] uma lactonase de Streptomyces;
[0082] uma lactonase de Arthrobacter;
[0083] uma lactonase de Sphingomonas;
[0084] uma lactonase de Pseudomonas;
[0085] uma lactonase de Klebsiella;
[0086] uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 277 ou 278;
[0087] ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.
[0088] Outra proteína de fusão é fornecida. A proteína de fusão compreende uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. A proteína de fusão também compreende uma quitosanase. A quitosanase:
[0089] compreende uma exo-1,4-beta-D- glucosaminidase;
[0090] compreende uma endo-1,4-beta-d- glucosaminidase;
[0091] compreende uma quitosanase de Streptomyces;
[0092] compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 280;
[0093] consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 279;
[0094] ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.
[0095] Uma proteína de fusão adicional é fornecida. A proteína de fusão compreende uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. A proteína de fusão também compreende uma protease. A protease compreende:
[0096] uma protease de asparagina;
[0097] uma protease de Bacillus;
[0098] uma protease de Aspergillus;
[0099] uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 303-306;
[0100] ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.
[0101] Outra proteína de fusão é fornecida. A proteína de fusão compreende uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. A proteína de fusão compreende ainda uma glucanase. A glucanase:
[0102] compreende uma alfa-1,6-glucanase;
[0103] compreende uma beta 1,3/1,4 glucanase;
[0104] compreende uma xiloglucano: xiloglucosil transferase;
[0105] compreende uma ciclo-heptaglucanase;
[0106] compreende uma oligoxiloglucano beta- glicosidase;
[0107] compreende uma ciclohexaglucanase;
[0108] compreende uma xiloglucanase;
[0109] compreende uma 1,4-beta-celobiosidase de celulose;
[0110] compreende uma glucano endo-1,3-beta-D- glucosidase;
[0111] compreende uma ciclomaltodextrinase;
[0112] compreende uma glucano 1,3-beta- glucosidase;
[0113] compreende uma endo-1,3-alfa-glucosidase;
[0114] compreende uma endo-1,3(4)-beta- glucanase;
[0115] compreende uma liquenase;
[0116] compreende uma laminarinase;
[0117] compreende uma glucano 1,4-beta- glucosidase;
[0118] compreende uma glucano endo-1,6-beta- glucosidase;
[0119] compreende uma glucano 1,3-alfa- glucosidase;
[0120] compreende uma amilopectinase;
[0121] compreende uma amiloglucanase;
[0122] compreende uma amiloglucosidase;
[0123] compreende uma glucanase de Acidothermus;
[0124] compreende uma glucanase de Aspergillus;
[0125] compreende uma glucanase de Paenibacillus;
[0126] compreende uma glucanase de Helix;
[0127] compreende uma glucanase de Bacillus circulans;
[0128] compreende uma glucanase de Bacillus lichenformis;
[0129] compreende uma glucanase de Clostridium;
[0130] compreende uma beta-1,4-endoglucanase de Trichoderma reesei;
[0131] compreende uma amilase de Bacillus subtilis;
[0132] compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 281–292 e 295–302;
[0133] consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 293 ou 294;
[0134] ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.
[0135] Ainda outra proteína de fusão é fornecida. A proteína de fusão compreende uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. A proteína de fusão também compreende uma proteína expansina. A proteína expansina compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 316.
[0136] Uma proteína de fusão adicional é fornecida. A proteína de fusão compreende uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. A proteína de fusão também compreende uma fitase. A fitase compreende:
[0137] uma fitase de Triticum;
[0138] uma fitase de Bacillus;
[0139] uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 313-315 e 380;
[0140] ou uma combinação das mesmas.
[0141] Outra proteína de fusão é fornecida. A proteína de fusão compreende uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. A proteína de fusão também compreende uma fosfatase ácida. A fosfatase ácida compreende:
[0142] uma fosfatase ácida de Triticum;
[0143] uma fosfatase ácida de Bacillus;
[0144] uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos
90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs: 311, 312 e 378;
[0145] ou uma combinação das mesmas.
[0146] Ainda outra proteína de fusão é fornecida. A proteína de fusão compreende uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. A proteína de fusão compreende ainda uma pectinase. A pectinase compreende uma pectolase.
[0147] Uma proteína de fusão adicional é fornecida. A proteína de fusão compreende uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. A proteína de fusão também compreende uma mananase.
[0148] É fornecido um membro da família Bacillus cereus recombinante. O membro da família Bacillus cereus recombinante expressa uma proteína de fusão. A proteína de fusão pode ser qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas.
[0149] Fragmentos de exosporium são fornecidos. Os fragmentos de exosporium são derivados de um membro da família Bacillus cereus recombinante. O membro da família Bacillus cereus recombinante pode ser qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinante aqui descritos. Os fragmentos de exosporium podem compreender qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas.
[0150] Uma formulação é fornecida. A formulação compreende qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinante aqui descritos. A formulação compreende ainda um veículo agricolamente aceitável.
[0151] Outra formulação é fornecida. A formulação compreende fragmentos de exosporium derivados de qualquer membro da família Bacillus cereus recombinante aqui descrito. A formulação compreende ainda um veículo agricolamente aceitável.
[0152] Ainda outra formulação é fornecida. A formulação compreende um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão. Alternativamente, ou além disso, a formulação compreende fragmentos de exosporium derivados de um membro da família Bacillus cereus que expressa uma proteína de fusão. A proteína de fusão compreende uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. A proteína de fusão também compreende uma fosfatase ácida. A formulação compreende ainda uma segunda enzima.
[0153] Ainda outra formulação é fornecida. A formulação compreende um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão. Alternativamente, ou além disso, a formulação compreende fragmentos de exosporium derivados de um membro da família Bacillus cereus que expressa uma proteína de fusão. A proteína de fusão compreende uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. A proteína de fusão também compreende uma fosfolipase C. A formulação compreende ainda uma segunda enzima.
[0154] Uma semente de planta tratada é fornecida. A semente da planta pode ser tratada com qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinante aqui descritos. O membro recombinante da família Bacillus cereus pode expressar qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas.
[0155] Outra semente de planta tratada é fornecida. A semente da planta pode ser tratada com qualquer um dos fragmentos de exosporium aqui descritos. Os fragmentos de exosporium podem ser derivados de qualquer membro da família Bacillus cereus aqui descrito. Os fragmentos de exosporium podem compreender qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas.
[0156] Ainda outra semente de planta tratada é fornecida. A semente da planta pode ser tratada com qualquer uma das formulações aqui descritas.
[0157] É fornecido um aditivo de ração animal. O aditivo de ração animal pode compreender qualquer membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas. Alternativamente, ou além disso, o aditivo para ração animal pode compreender fragmentos de exosporium derivados de qualquer membro da família Bacillus cereus que expressa qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas.
[0158] Uma composição de ração animal também é fornecida. A composição de ração animal compreende ração animal e qualquer membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão aqui descrita. Alternativamente, ou além disso, a composição de ração animal pode compreender ração animal e fragmentos de exosporium derivados de qualquer membro da família Bacillus cereus recombinante aqui descrito.
[0159] É fornecido um método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a saúde das plantas. O método compreende a aplicação de um membro da família recombinante Bacillus cereus a um meio de crescimento de plantas, a uma planta, a uma semente de planta ou uma área ao redor de uma planta ou a uma semente de planta. O membro da família recombinante Bacillus cereus pode compreender qualquer um dos membros da família recombinante Bacillus cereus aqui descritos. O membro recombinante da família Bacillus cereus pode expressar qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas.
[0160] Outro método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a saúde das plantas é fornecido. O método compreende a aplicação de fragmentos de exosporium a um meio de crescimento vegetal, a uma planta, a uma semente de planta ou a uma área circundante a uma planta ou a uma semente de planta. Os fragmentos de exosporium podem compreender fragmentos de exosporium derivados de qualquer membro da família Bacillus cereus recombinante aqui descrito. Os fragmentos de exosporium podem compreender qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas.
[0161] Ainda é fornecido outro método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a saúde das plantas. O método compreende a aplicação de uma formulação a um meio de crescimento vegetal, a uma planta, a uma semente de planta ou a uma área circundante a uma planta ou a uma semente de planta. A formulação pode compreender qualquer uma das formulações descritas aqui.
[0162] Outro método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a saúde das plantas é fornecido. O método compreende a aplicação de um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão a um meio de crescimento vegetal, a uma planta, a uma semente de planta ou a uma área ao redor de uma planta ou a uma semente de planta. A proteína de fusão compreende uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. A proteína de fusão compreende ainda uma xilosidase, uma histidina protease, uma fosfatase ácida ou uma combinação de qualquer uma delas.
[0163] Ainda é fornecido outro método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a saúde das plantas. O método compreende a aplicação de fragmentos de exosporium derivados de esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão em um meio de crescimento de plantas, uma planta, uma semente de planta ou uma área ao redor de uma planta ou uma semente de planta. A proteína de fusão compreende uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. A proteína de fusão compreende ainda uma xilosidase, uma histidina protease, uma fosfatase ácida ou uma combinação de qualquer uma delas.
[0164] Um outro método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a saúde das plantas é fornecido. O método compreende a aplicação de um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão a um meio de crescimento vegetal, a uma planta, a uma semente de planta ou a uma área ao redor de uma planta ou a uma semente de planta. A proteína de fusão compreende uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. A proteína de fusão compreende ainda uma fosfatase ácida. O método compreende ainda a aplicação de uma segunda enzima ao meio de crescimento da planta, à planta, à semente da planta ou à área circundante à planta ou à semente da planta.
[0165] Outro método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a saúde das plantas é fornecido. O método compreende a aplicação de fragmentos de exosporium derivados de esporos de um Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão em um meio de crescimento de plantas, em uma planta, uma semente de planta ou em uma área ao redor de uma planta ou em uma semente de planta. A proteína de fusão compreende uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. A proteína de fusão compreende ainda uma fosfatase ácida. O método compreende ainda a aplicação de uma segunda enzima ao meio de crescimento da planta, à planta, à semente da planta ou à área circundante à planta ou à semente da planta.
[0166] Outro método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a saúde das plantas é fornecido. O método compreende a aplicação de um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão a um meio de crescimento vegetal, a uma planta, a uma semente de planta ou a uma área ao redor de uma planta ou a uma semente de planta. A proteína de fusão compreende uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. A proteína de fusão compreende ainda uma fosfolipase C. O método compreende ainda a aplicação de uma segunda enzima ao meio de crescimento da planta, à planta, à semente da planta ou à área circundante à planta ou à semente da planta.
[0167] Outro método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a saúde das plantas é fornecido. O método compreende a aplicação de fragmentos de exosporium derivados de esporos de um Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão em um meio de crescimento de plantas, em uma planta, uma semente de planta ou em uma área ao redor de uma planta ou em uma semente de planta. A proteína de fusão compreende uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. A proteína de fusão compreende ainda uma fosfolipase C. O método compreende ainda a aplicação de uma segunda enzima ao meio de crescimento da planta, à planta, à semente da planta ou à área circundante à planta ou à semente da planta.
[0168] É fornecido um método para entregar uma enzima a um animal. O método compreende alimentar ao animal qualquer membro da família Bacillus cereus recombinante que expresse uma proteína de fusão aqui descrita. Alternativamente, ou além disso, o método compreende alimentar os animais com fragmentos de exosporium derivados de esporos de qualquer membro da família recombinante de Bacillus cereus que expressam uma proteína de fusão aqui descrita.
[0169] Outros objetos e características serão em parte aparentes e em parte apontados a seguir.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0170] Figuras 1A e 1B mostram os alinhamentos da sequência de aminoácidos de uma porção terminal amino da cepa Sterne BclA deBacillus anthracise com a região correspondente de várias proteínas de exosporium de membros da família Bacillus cereus.
[0171] A Figura 2 mostra resultados ilustrativos de microscopia fluorescente para a expressão de proteínas de fusão contendo várias proteínas de exosporium ligadas a um repórter mCherry no exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante.
[0172] A Figura 3 é uma micrografia eletrônica de transmissão mostrando fragmentos de exosporium e um esporo do membro da família Bacillus cereus do qual o exosporium foi perdido, gerado usando um membro da família recombinante Bacillus cereus com uma mutação knock-out do seu gene CotE.
[0173] A Figura 4 é uma fotografia de um gel de SDS- PAGE mostrando um padrão marcador de proteína (faixa 1) e proteínas de fragmentos de exosporium gerados usando um membro da família Bacillus cereus recombinante com uma mutação knock-out do seu gene CotE (faixa 2).
[0174] A Figura 5 fornece dados que ilustram a atividade enzimática de uma fosfatase ácida em fragmentos de exosporium derivados de um membro da família Bacillus cereus com uma mutação knock-out do seu gene CotE.
[0175] A Figura 6 fornece uma micrografia eletrônica de transmissão mostrando: (A) esporos intactos de Bacillus thuringiensis BT013A cercados por exosporium anexado; (B) esporos de uma cepa knockout para ExsY de Bacillus thuringiensis BT013A, com exosporium destacado; e (C) esporos de uma cepa knockout para CotE de Bacillus thuringiensis BT013A, com exosporium destacado.
[0176] A Figura 7 fornece uma imagem de microscopia de fluorescência mostrando a detecção de bactérias endofíticas isoladas do interior de plantas de milho tratadas com Bacillus thuringiensis EE-B00184 expressando uma proteína de fusão compreendendo os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1 e eGFP. As setas indicam esporos únicos.
[0177] A Figura 8 fornece uma fotografia mostrando a fluorescência de colônias bacterianas contendo membros da família recombinante Bacillus cereus que expressam uma proteína de fusão compreendendo os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1 e eGFP, isolados do interior de plantas de milho cultivadas a partir de sementes revestidas com as bactérias recombinantes.
[0178] A Figura 9 representa uma curva padrão que representa a absorvância média observada após a geração de um produto colorido a partir da reação dos padrões α-KB (eixo geométrico x) com dinitro- hidrozina (DNH).
[0179] A Figuraq 10 fornece resultados ilustrativos da atividade da enzima ACC desaminase para esporos não transformados, esporos que expressam uma D-cisteína desulfidrase e esporos que expressam uma ACC desaminase.
[0180] A Figura 11 representa uma curva padrão que traça absorvância média de várias concentrações de p-nitrofenol (pNP).
[0181] Figuras 12 e 13 fornecem dados ilustrativos da atividade da fosfolipase C (PLC) para esporos que expressam vários construtos enzimáticos do PLC.
DEFINIÇÕES
[0182] Quando os artigos “um”, “uma”, “o/a” e “dito/dita” são usados aqui, significam “pelo menos um” ou “um ou mais”, a menos que seja indicado de outra forma.
[0183] O termo "membro da família Bacillus cereus", conforme usado aqui, refere-se a qualquer espécie de Bacillus que é capaz de produzir um exosporium. Assim, a família de bactérias Bacillus cereus inclui as espécies Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus samanii, Bacillus gaemokensis, Bacillus weihenstephensis e Bacillus toyoiensis. Os membros da família Bacillus cereus também são referidos na técnica como "Bacillus cereus sensu lato”.
[0184] Os termos ”que compreende", ”que inclui" e ”que tem" destinam-se a ser inclusivos e significam que pode haver outros elementos além dos elementos listados.
[0185] O termo "enzima livre", conforme usado aqui, refere-se a uma preparação de enzima que é substancialmente livre de células intactas. O termo "enzima livre" inclui, mas não está limitado a, extratos celulares brutos contendo uma enzima, enzima parcialmente purificada, substancialmente purificada ou purificada. As enzimas livres podem opcionalmente ser imobilizadas em uma matriz ou suporte químico para permitir a liberação controlada da enzima. O termo "imobilização", conforme usado aqui, em referência à imobilização de uma enzima em uma matriz ou suporte refere-se à ligação da enzima à matriz ou suporte, de modo que a enzima seja mantida na matriz ou suporte ou liberada do suporte por um período de tempo controlado, em vez de se dissipar no ambiente de maneira descontrolada. Matrizes e suportes ilustrativos incluem, entre outros, carvão vegetal, biocarvão, nanocarbono, ágarose, alginato, celulose, derivado de celulose, sílica, plástico, aço inoxidável, vidro, poliestireno, cerâmica, dolomita, argila e terra de diatomáceas, talco, um polímero, uma goma, um material dispersável em água e combinações de qualquer um dos mesmos.
[0186] O termo "foliar" usado aqui com relação à aplicação de enzimas ou microorganismos recombinantes em plantas significa que a enzima ou microorganismo recombinante é aplicado a uma ou mais porções aéreas da planta, incluindo caules, folhas, frutas, flores ou outras porções aéreas expostas da planta.
[0187] O termo "proteína de fusão", conforme aqui utilizado, refere-se a uma proteína que tem uma sequência polipeptídica que compreende sequências derivadas de duas ou mais proteínas separadas. Uma proteína de fusão pode ser gerada pela união de uma molécula de ácido nucleico que codifica todo ou parte de um primeiro polipeptídeo com uma molécula de ácido nucleico que codifica todo ou parte de um segundo polipeptídeo para criar uma sequência de ácido nucleico que, quando expressa, produz um único polipeptídeo com propriedades funcionais derivadas de cada uma das proteínas originais.
[0188] O termo "taxa de germinação", conforme usado aqui, refere-se ao número de sementes que germinam durante um período de tempo específico. Por exemplo, uma taxa de germinação de 85% indica que 85 de 100 sementes germinam durante um determinado período de tempo.
[0189] O termo "inativar" ou "inativação", conforme usado aqui, em referência à inativação de esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante significa que os esporos são incapazes de germinar ou que os esporos podem germinar, mas são danificados, tal que a germinação não resulte em uma bactéria viva. Os termos “parcialmente inativo” ou “inativação parcial” significam que uma porcentagem dos esporos está inativada, mas alguns esporos mantêm a capacidade de germinar e retornar a um estado vivo e replicante. O termo "inativação genética" refere-se à inativação de esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante por uma mutação do DNA do esporo que resulta na inativação completa ou parcial do esporo. Os termos "inativação física" e "inativação química" se referem à inativação de esporos usando qualquer meio físico ou químico, por exemplo, por tratamento térmico, irradiação gama, irradiação de raios-x, irradiação por UV-A, irradiação por UV-B ou tratamento com um solvente como glutaraldeído, formaldeído, peróxido de hidrogênio, ácido acético, alvejante, clorofórmio, fenol ou qualquer combinação dos mesmos.
[0190] Os termos "sequência nativa", "sequência de aminoácidos nativa", "sequência de tipo selvagem" e "sequência de aminoácidos de tipo selvagem" são usados de forma intercambiável aqui para se referir a uma sequência de aminoácidos, pois existe em uma proteína que ocorre naturalmente.
[0191] Um "meio de crescimento vegetal" inclui qualquer material capaz de suportar o crescimento de uma planta.
[0192] Os termos "promover o crescimento das plantas" e "estimular o crescimento das plantas" são usados de forma intercambiável e se referem à capacidade de acentuar ou aumentar pelo menos uma dentre altura, peso, tamanho das folhas, tamanho das raízes, tamanho dos frutos ou tamanho do caule, e/ou a capacidade de aumentar o rendimento de proteínas da planta e/ou aumentar o rendimento da colheita.
[0193] O termo "recombinante", conforme usado em referência às bactérias aqui descritas, abrange bactérias com qualquer modificação genética em comparação com bactérias do tipo selvagem do mesmo tipo, incluindo bactérias que foram modificadas para deletar um gene ou uma parte de um gene (por exemplo, bactérias que têm um “knock-out” de um gene), bem como bactérias que foram modificadas para expressar um peptídeo ou proteína exógena.
[0194] O termo "rizosfera" é usado de forma intercambiável com "zona de raiz" para denotar aquele segmento do solo que circunda as raízes de uma planta e é influenciado por elas.
[0195] O termo "quantidade sinergisticamente eficaz", conforme usado aqui, refere-se a uma quantidade de uma primeira substância (por exemplo, uma primeira enzima) que quando usada em combinação com uma segunda substância (por exemplo, uma segunda enzima) produz um efeito biológico que é maior que a soma dos efeitos biológicos de cada uma das respectivas primeira e segunda substâncias quando utilizadas isoladamente.
[0196] O termo "sequência de alvejamento”conforme aqui utilizado, refere-se a uma sequência polipeptídica que, quando presente como parte de um polipeptídeo mais longo ou de uma proteína, resulta na localização do polipeptídeo mais longo ou da proteína em um local subcelular específico. As sequências de alvejamento descritas neste documento resultam na localização de proteínas no exosporium de um membro da família Bacillus cereus.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. PROTEÍNAS DE FUSÃO PARA EXPRESSÃO EM MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS
[0197] A presente invenção refere-se a proteínas de fusão compreendendo uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína de exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. As proteínas de fusão compreendem ainda uma ACC desaminase, uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma quitosanase, uma protease, uma glucanase, uma fitase, uma fosfatase ácida, uma pectinase, uma mananase e/ou uma proteína expansina. Quando expressas em bactérias do membro da família Bacillus cereus, essas proteínas de fusão são alvejadas para a camada de exosporium do esporo e estão fisicamente orientadas, de tal modo que a enzima com atividade de ACC-desaminase, a fosfolipase, a lipase, a xilanase, o xilosidase, o lactonase, a quitosanase, a protease, a glucanase, a proteína expansina, a fitase, a fosfatase ácida, a pectinase ou a mananase seja exibida na parte externa do esporo.
[0198] Esse sistema de exibição do exosporium de Bacillus (BEMD) pode ser usado para entregar as ACC desaminases, fosfolipases, lipases, xilanases, xilosidases, lactonases, quitosanases, proteases, glucanases, fitases, fosfatases ácidas, pectinases,, as mananases e/ou as proteínas da expansina para plantas (por exemplo, para plantar folhagem, frutas, flores, caules ou raízes) ou para um meio de crescimento de plantas, como o solo. Enzimas e proteínas entregues ao solo ou a outro meio de crescimento de plantas dessa maneira persistem e exibem atividade no solo por longos períodos de tempo. A introdução de bactérias recombinantes da família Bacillus cereus que expressam as proteínas de fusão aqui descritas no solo ou na rizosfera de uma planta leva a uma melhoria benéfica do crescimento da planta em muitas condições diferentes do solo. O uso do BEMD para criar essas enzimas permite que continuem exercendo seus resultados benéficos para a planta e a rizosfera nos primeiros meses de vida da planta.
[0199] Além disso, como é descrito mais adiante, o sistema BEMD pode ser modificado de modo que o exosporium do membro da família Bacillus cereus recombinante possa ser removido do esporo, gerando fragmentos de exosporium contendo as proteínas de fusão. Os fragmentos de exosporium também podem ser usados para fornecer as ACC desaminases,
fosfolipases, lipases, xilanases, xilosidases, lactonases, quitosanases, proteases, glucanases, fitases, fosfatases ácidas, pectinases, mananases, e/ou as proteínas expansinas para plantas em uma preparação sem células. A. SEQUÊNCIAS DE ALVEJAMENTO, PROTEÍNAS DE EXOSPORIUM
E FRAGMENTOS DE PROTEÍNAS DE EXOSPORIUM PARA ALVEJAR ENZIMAS COM ATIVIDADE DE ACC DESAMINASE, FOSFOLIPASES, LIPASES, XILANASES, XILOSIDASES, LACTONASES, QUITOSANASES, PROTEASES, GLUCANASES, FITASES, FOSFATASES ÁCIDAS, PECTINASES, MANASES E PROTEÍNAS EXPANSINAS AO EXOSPORIUM DE UM MEMBRO DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS
[0200] Para facilitar a referência, descrições das sequências de aminoácidos para as sequências de alvejamento, proteínas de exosporium e fragmentos de proteínas de exosporium que podem ser usadas para alvejar enzimas ou proteínas (por exemplo, enzimas com atividade ACC desaminase, fosfolipases, lipases, xilanases, xilosidases, lactonases, quitosanases, proteases, glucanases, fitases, fosfatases ácidas, pectinases, mananases e/ou proteínas expansinas) ao exosporium de membros da família Bacillus cereus, são fornecidas na Tabela 1, juntamente com as SEQ ID NOs. TABELA 1. SEQUÊNCIAS DE PEPTÍDEOS E
PROTEÍNAS USADAS PARA ALVEJAR PROTEÍNAS OU PEPTÍDEOS DE INTERESSE PARA O EXOSPORIUM DE MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS
CEREUS Proteína, fragmento de proteína ou sequência de SEQ ID alvejamento NO. AA 1-41 de BclA (Sterne de B. anthracis) 1 BclA de comprimento total (Sterne de B. anthracis) 2 AA 1-33 de BetA/BAS3290 (Sterne de B. anthracis) 3 BetA/BAS3290 de comprimento total (Sterne de B. anthracis) 4 Met + AA 2-43 de BAS4623 (Sterne de B. anthracis) 5
BAS4623 de comprimento total (Sterne de B. anthracis) 6 AA 1-34 de BclB (Sterne de B. anthracis) 7 BclB de comprimento total (Sterne de B. anthracis) 8 AA 1-30 de BAS1882 (Sterne de B. anthracis) 9 BAS1882 de comprimento total (Sterne de B. anthracis) 10 AA 1-39 do gene 2280 (B. weihenstephensis KBAB4) 11 KBAB4 do gene 2280 de comprimento total (B. weihenstephensis 12 KBAB4) AA 1-39 do gene 3572 (B. weihenstephensis KBAB4) 13 KBAB4 do gene 3572 de comprimento total (B. weihenstephensis 14 KBAB4) AA 1-49 de Peptídeo Líder do Exosporium (B. cereus VD200) 15 Peptídeo Líder de Exosporium de comprimento total (B. cereus 16 VD200) AA 1-33 do Peptídeo Líder de Exosporium (B. cereus VD166) 17 Peptídeo Líder de Exosporium de comprimento total (B. cereus 18 VD166) AA 1-39 da proteína hipotética IKG_04663 (B. cereus VD200) 19 Proteína hipotética IKG_04663, parcial (B. cereus VD200) 20 AA 1-39 da proteína YVTN β-hélice (B. weihenstephensis 21 KBAB4) Proteína KBAB4 da YVTN β-hélice de comprimento total (B. 22 weihenstephensis KBAB4) AA 1–30 da proteína hipotética bcerkbab4_2363 23 (B. weihenstephensis KBAB4) Proteína hipotética de comprimento total bcerkbab4_2363 24 KBAB4 (B. weihenstephensis KBAB4) AA 1–30 da proteína hipotética bcerkbab4_2131 25 (B. weihenstephensis KBAB4)
Proteína hipotética de comprimento total bcerkbab4_2131 26 (B. weihenstephensis KBAB4) AA 1-36 de colágeno contendo repetição de hélice tripla 27 (B. weihenstephensis KBAB4) Colágeno KBAB4 contendo repetição de hélice tripla de 28 comprimento total AA 1-39 da proteína hipotética bmyco0001_21660 (B. mycoides 29 2048) Proteína hipotética de comprimento total bmyco0001_21660 (B. 30 mycoides 2048) AA 1-30 de proteína hipotética bmyc0001_22540 (B. mycoides 31 2048) Proteína hipotética de comprimento total bmyc0001_22540 (B. 32 mycoides 2048) AA 1-21 de proteína hipotética bmyc0001_21510 (B. mycoides 33 2048) Proteína hipotética de comprimento total bmyc0001_21510 (B. 34 mycoides 2048) AA 1–22 da proteína de repetição da hélice tripla com colágeno 35 (B. thuringiensis 35646) Proteína de repetição de hélice tripla de colágeno de 36 comprimento total (B. thuringiensis 35646) AA 1-35 da proteína hipotética WP_69652 (B. cereus) 43 Proteína hipotética de comprimento total WP_69652 (B. cereus) 44 AA 1-41 do líder de exosporium WP016117717 (B. cereus) 45 Líder de exosporium de comprimento total WP016117717 (B. 46 cereus) AA 1-49 do peptídeo de exosporium WP002105192 (B. cereus) 47 Peptídeo de exosporium de comprimento total WP002105192 (B. 48 cereus)
AA 1-38 da proteína hipotética WP87353 (B. cereus) 49 Proteína hipotética de comprimento total WP87353 (B. cereus) 50 AA 1-39 do peptídeo de exosporium 02112369 (B. cereus) 51 Peptídeo de exosporium de comprimento total 02112369 (B. 52 cereus) AA 1-39 da proteína do exosporium WP016099770 (B. cereus) 53 Proteína de exosporium de comprimento total WP016099770 54 (SEQ ID NO: 54) AA 1–36 da proteína hipotética YP006612525 (B. thuringiensis) 55 Proteína hipotética de comprimento total YP006612525 (B. 56 thuringiensis) AA 1-136 da proteína hipotética TIGR03720 (B. mycoides) 57* Proteína hipotética de comprimento total TIGR03720 (B. 58* mycoides) AA 1-36 da proteína de domínio de repetição com hélice tripla de 59 colágeno (B. cereus ATCC 10987) Proteína de domínio de repetição de hélice tripla de colágeno de 60 comprimento total (B. cereus ATCC 10987) AA 1-39 de proteína semelhante ao colágeno (B. cereus E33L) 61 Proteína tipo colágeno de comprimento total (B. cereus E33L) 62 AA 1-41 de colágeno contendo repetição de hélice tripla 63 (B. weihenstephanensis KBAB4) Colágeno contendo repetição de hélice tripla de comprimento 64 total (B. weihenstephanensis KBAB4) AA 1–30 da proteína hipotética BALH_2230 65 (Cepa B. thuringiensis Al Hakam) Proteína hipotética de comprimento total BALH_2230 66
(Cepa B. thuringiensis Al Hakam) AA 1-33 de colágeno contendo repetição de hélice tripla (B. 67 cereus ATCC 14579) Colágeno contendo repetição de hélice tripla de comprimento 68 total (B. cereus ATCC 14579) AA 1-44 de repetição de hélice tripla de colágeno (B. cereus) 69 Repetição de hélice tripla de colágeno de comprimento total (B. 70 cereus) AA 1-38 de colágeno contendo repetição de hélice tripla (B. 71 cereus ATCC 14579) Colágeno contendo repetição de hélice tripla de comprimento 72 total (B. cereus ATCC 14579) AA 1–30 da proteína hipotética BCZK1835 (B. cereus E33L) 73 Proteína hipotética de comprimento total BCZK1835 (B. cereus 74 E33L) AA 1-48 de colágeno contendo repetição de hélice tripla 75 (B. weihenstephanensis KBAB4) Colágeno contendo repetição de hélice tripla de comprimento 76 total (B. weihenstephanensis KBAB4) AA 1–30 de colágeno contendo repetição de hélice tripla (B. 77 cereus ATCC 14579) Colágeno contendo repetição de hélice tripla de comprimento 78 total (B. cereus ATCC 14579) AA 1-39 da proteína hipotética BC4725 (B. cereus ATCC 14579) 79 Proteína hipotética BC4725 de comprimento total (B. cereus 80 ATCC 14579) AA 1-44 da proteína hipotética BCZK4476 (B. cereus E33L) 81 Proteína hipotética de comprimento total BCZK4476 (B. cereus 82 E33L)
AA 1–40 de colágeno contendo repetição em hélice tripla 83 (Cepa B. anthracis “Ames Ancestor”) Colágeno contendo repetição de hélice tripla de comprimento 84 total (Cepa B. anthracis “Ames Ancestor”) AA 1-34 da proteína BclA (cepa B. thuringiensis serovar 85 konkukian 97-27) Proteína BclA de comprimento total (cepa B. thuringiensis 86 serovar konkukian 97-27) AA 1-34 de proteína hipotética conservada (B. cereus ATCC 87 10987) Proteína hipotética conservada de comprimento total (B. cereus 88 ATCC 10987) AA 1-34 de colágeno contendo repetição de hélice tripla (B. 89 cereus ATCC 14579) Colágeno contendo repetição de hélice tripla de comprimento 90 total (B. cereus ATCC 14579) AA 1-99 da sequência parcial do peptídeo líder de exosporium 91 (B. cereus) Sequência parcial do peptídeo líder do exosporium (B. cereus) 92 AA 1-136 da proteína hipotética ER45_27600, sequência parcial 93 (B. weihenstephanensis) Proteína hipotética ER45_27600, sequência parcial (B. 94 weihenstephanensis) AA 1-196 de BclA (B. anthracis Sterne) 95 Met + AA 20–35 de BclA (B. anthracis Sterne) 96 Met + AA 12–27 de BetA/BAS3290 (B. anthracis Sterne) 97 Met + AA 18–33 do gene 2280 (B. weihenstephensis KBAB4) 98 Met + AA 18–33 do gene 3572 (B. weihenstephensis KBAB4) 99
Met + AA 12–27 do peptídeo líder de exosporium (B. cereus 100 VD166) Met + AA 18–33 da proteína YVTN β-hélice 101 (B. weihenstephensis KBAB4) Met + AA 9–24 da proteína hipotética bcerkbab4_2363 102 (B. weihenstephensis KBAB4) Met + AA 9–24 da proteína hipotética bcerkbab4_2131 103 (B. weihenstephensis KBAB4) Met + AA 9–24 da proteína hipotética bmyc0001_22540 (B. 104 mycoides 2048) Met + AA 9–24 de BAS1882 (B. anthracis Sterne) 105 Met + AA 20–35 do líder de exosporium WP016117717 (B. 106 cereus) Met + AA 9–24 da proteína hipotética BALH_2230 107 (Cepa B. thuringiensis Al Hakam) InhA de comprimento total (B. mycoides) 108 BAS1141 de comprimento total (ExsY) (B. anthracis Sterne) 109 BAS1144 de comprimento total (BxpB/ExsFA) (B. anthracis 110 Sterne) BAS1145 de comprimento total (CotY) (B. anthracis Sterne) 111 BAS1140 de comprimento total (B. anthracis Sterne) 112 ExsFB de comprimento total (B. anthracis H9401) 113 InhA1 de comprimento total (B. thuringiensis HD74) 114 ExsJ de comprimento total (B. cereus ATCC 10876) 115 ExsH de comprimento total (B. cereus) 116 YjcA de comprimento total (B. anthracis Ames) 117 YjcB de comprimento total (B. anthracis) 118 BclC de comprimento total (B. anthracis Sterne) 119 Fosfatase ácida de comprimento total 120 (Cepa Bacillus thuringiensis serovar konkukian 97-27)
InhA2 de comprimento total (B. thuringiensis HD74) 121 InhA3 de comprimento total (B. mycoides) 122 Met + AA 23–38 de BAS4623 (B. anthracis Sterne) 371 Met + AA 13–28 de BclB (B. anthracis Sterne) 372 Variante de Cot Y (Bacillus anthracis) 381 BclA (Bacillus thuringiensis) 382 Aminoácidos 1-166 de BclA (Bacillus thuringiensis) 383 BclA (Bacillus anthracis) 384 AA 1-196 de BclA (Bacillus anthracis) 385 AA = aminoácidos * A proteína hipotética B. mycoides TIGR03720 possui 100% de identidade de sequência com a proteína hipotética B. mycoides WP003189234. Assim, as SEQ ID NOs: 57 e 58 representam também aminoácidos 1-136 da proteína hipotéticaB. mycoides WP003189234 e proteína hipotética B. mycoides WP003189234 de comprimento total, respectivamente.
[0201] Bacillus é um gênero de bactérias em forma de bastonete. A família de bactérias Bacillus cereus inclui qualquer espécie de Bacillus capaz de produzir um exosporium. Assim, a família de bactérias Bacillus cereus inclui as espécies Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus samanii, Bacillus gaemokensis, Bacillus weihenstephensis e Bacillus toyoiensis. Sob condições ambientais estressantes, as bactérias da família Bacillus cereus sofrem esporulação e formam endósporos ovais que podem permanecer inativos por longos períodos de tempo. A camada mais externa dos endósporos é conhecida como exosporium e compreende uma camada basal cercada por uma estrutura externa de projeções pilosas. Os filamentos na estrutura tipo pilosa são predominantemente formados pela glicoproteína BclA do tipo colágeno, enquanto a camada basal é composta por várias proteínas diferentes. Outra proteína relacionada ao colágeno, BclB, também está presente no exosporium e é exposta nos endósporos dos membros da família Bacillus cereus. Demonstrou- se que BclA, o principal constituinte da estrutura de superfície, está ligado ao exosporium com seu terminal amino (terminal N) posicionado na camada basal e seu terminal carbóxi (terminal C) se estendendo para fora do esporo.
[0202] Foi revelado anteriormente que certas sequências das regiões N-terminais de BclA e BclB poderiam ser usadas para alvejar um peptídeo ou proteína ao exosporium de um endosporo de um membro da família Bacillus cereus (consulte as Publicações de Pedidos de Patente Nos. US 2010/0233124 e 2011/0281316 e Thompson et al., Targeting of the BclA and BclB proteins to the Bacillus anthracis spore surface, Molecular Microbiology 70 (2): 421–34 (2008)). Verificou-se também que a proteína BetA/BAS3290 de Bacillus anthracis se localizava no exosporium. As sequências de alvejamento adicionais, bem como proteínas de exosporium e fragmentos de proteínas de exosporium, que podem ser incorporadas a uma proteína de fusão e usadas para alvejar um peptídeo ou proteína de interesse para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante, são descritas nas Publicações de Pedido de Patente nos 2016/0031948 e 2016/0108096, que são incorporados por referência aqui na sua totalidade.
[0203] Em particular, os aminoácidos 20-35 do BclA da cepa Bacillus anthracis Sterne foram suficientes para atingir o exosporium. Um alinhamento de sequências de aminoácidos 1-41 de BclA (SEQ ID NO: 1) com as correspondentes regiões N-terminais de várias outras proteínas de exosporium da família Bacillus cereus e proteínas da família Bacillus cereus com sequências relacionadas é mostrado nas Figuras 1A e 1B. Como pode ser visto nas Figuras 1A e 1B, há uma região de alta homologia entre todas as proteínas na região correspondente aos aminoácidos 20–41 de BclA. No entanto, nessas sequências, os aminoácidos correspondentes aos aminoácidos 36-41 de BclA contêm estrutura secundária e não são necessários para a localização da proteína de fusão no exosporium. A região da sequência de alvejamento conservada de BclA (aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1) é mostrada em negrito nas Figuras 1A e 1B. Uma região mais altamente conservada, abrangendo os aminoácidos 25-35 de BclA dentro da sequência de alvejamento, está sublinhada nas sequências nas Figuras 1A e 1B e é a sequência de reconhecimento para ExsFA/BxpB/ExsFB e homólogos, que direcionam e montam as proteínas descritas na superfície do exosporium. As sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs. 3, 5 e 7 na Figura 1A são os aminoácidos 1-33 da cepa de Bacillus anthracis Sterne BetA/BAS3290, uma metionina seguida pelos aminoácidos 2-43 da cepa de Bacillus anthracis Sterne BAS4623 e os aminoácidos 1-34 da cepa de Bacillus anthracis Sterne estirpe BclB, respectivamente. (Para o BAS4623, verificou-se que a substituição da valina presente na posição 1 na proteína nativa por uma metionina resultou em melhor expressão). Como pode ser visto na Figura 1A, cada uma dessas sequências contém uma região conservada correspondente aos aminoácidos 20–35 de BclA (SEQ ID NO: 1; mostrado em negrito) e uma região mais altamente conservada correspondente aos aminoácidos 20–35 de BclA (sublinhado).
[0204] As proteínas adicionais dos membros da família Bacillus cereus também contêm a região de alvejamento conservada. Em particular, nas Figuras 1A e 1B, a SEQ ID NO: 9 são os aminoácidos 1-30 da cepa de Bacillus anthracis Sterne BAS1882, SEQ ID NO: 11 são aminoácidos 1- 39 do produto do gene 2280 de Bacillus weihenstephensis KBAB4, SEQ ID NO: 13 são os aminoácidos 1-39 do produto do gene 3572 de Bacillus weihenstephensis KBAB4, SEQ ID NO: 15 são os aminoácidos 1-49 do peptídeo líder de exosporium de Bacillus cereus VD200, SEQ ID NO: 17 são os aminoácidos 1-33 do peptídeo líder de exosporium de Bacillus cereus VD166, SEQ ID NO: 19 são os aminoácidos 1–39 da proteína hipotética IKG_04663 de Bacillus cereus VD200, SEQ ID NO: 21 são os aminoácidos 1–39 da proteína de hélice Bacillus weihenstephensis KBAB4 YVTN, SEQ ID NO: 23 são os aminoácidos 1-30 da proteína hipotética de Bacillus weihenstephensis KBAB4 bcerkbab4_2363, SEQ ID NO: 25 são aminoácidos 1-30 da proteína hipotética de Bacillus weihenstephensis KBAB4 bcerkbab4_2363, SEQ ID NO: 25 são os aminoácidos 1-30 da proteína hipotética de Bacillus weihenstephensis KBAB4 bcerkbab4_2131, SEQ ID NO: 27 são os aminoácidos 1-36 do colágeno contendo repetição de hélice tripla de Bacillus weihenstephensis, SEQ ID NO: 29 são os aminoácidos 1-39 da proteína hipotética de Bacillus mycoides 2048 bmyco0001_21660, SEQ ID NO: 31 são os aminoácidos 1-30 da proteína hipotética de Bacillus mycoides 2048 bmyc0001_22540, SEQ ID NO: 33 são os aminoácidos 1-21 da proteína hipotética Bacillus mycoides 2048 bmyc0001_21510, SEQ ID NO: 35 são os aminoácidos 1–22 da proteína de repetição da hélice tripla de colágeno de Bacillus thuringiensis 35646, SEQ ID NO: 43 são os aminoácidos 1–35 da proteína hipotética Bacillus cereus WP_69652, SEQ ID NO: 45 são os aminoácidos 1–41 do líder de exosporium de Bacillus cereus WP016117717, SEQ ID NO: 47 são os aminoácidos 1–49 do peptídeo de exosporium de Bacillus cereus WP002105192, SEQ ID NO: 49 são os aminoácidos 1–38 da proteína hipotética de Bacillus cereus WP87353, SEQ ID NO: 51 são os aminoácidos 1-39 do peptídeo de exosporium de Bacillus cereus 02112369, SEQ ID NO: 53 são os aminoácidos 1-39 da proteína de exosporium de Bacillus cereus WP016099770, SEQ ID NO: 55 são os aminoácidos 1-36 da proteína hipotética de Bacillus thuringiensis YP006612525, SEQ ID NO: 57 são os aminoácidos 1–136 da proteína hipotética de Bacillus mycoides TIGR03720, SEQ ID NO: 59 são aminoácidos 1–36 da proteína de domínio de repetição de hélice tripla de colágeno de B. cereus ATCC 10987, SEQ ID NO: 61 são os aminoácidos 1-39 da proteína semelhante ao colágeno de B. cereus E33L, SEQ ID NO: 63 são os aminoácidos 1-41 do colágeno contendo repetição de hélice tripla de B. weihenstephanensis KBAB4, SEQ ID NO: 65 são os aminoácidos 1-30 da cepa de B. thuringiensis.
A proteína hipotética Al Hakam BALH_2230, SEQ ID NO: 67 são os aminoácidos 1-33 do colágeno contendo repetição de hélice tripla de B. cereus ATCC 14579, SEQ ID NO: 69 são os aminoácidos 1-44 da repetição de hélice tripla com colágeno de B. cereus, SEQ ID NO: 71 são os aminoácidos 1-38 do colágeno contendo repetição em hélice tripla com B. cereus ATCC 14579, SEQ ID NO: 73 são os aminoácidos 1-30 da proteína hipotética BCZK1835 de B. cereus E33L, a SEQ ID NO: 75 são os aminoácidos 1-48 do colágeno contendo repetição em hélice tripla com B. weihenstephanensis, SEQ ID NO: 77 são os aminoácidos 1-30 do colágeno contendo repetição em hélice tripla em B. cereus ATCC 14579, a SEQ ID NO: 79 são os aminoácidos 1–39 da proteína hipotética BC4725 de B. cereus
ATCC 14579, SEQ ID NO: 81 são os aminoácidos 1–44 da proteína hipotética BCZK4476 de B. cereus E33L, SEQ ID NO: 83 são aminoácidos 1–40 da cepa B. anthracis. Colágeno contendo repetição em hélice tripla “Ames Ancestor”, SEQ ID NO: 85 são os aminoácidos 1-34 da cepa de B. thuringiensis serovar konkukian. 97-27 da proteína BclA, SEQ ID NO: 87 são os aminoácidos 1-34 da proteína hipotética conservada ATCC 10987 de B. cereus, SEQ ID NO: 89 são os aminoácidos 1-34 do colágeno contendo repetição em hélice tripla ATCC 14579 de B. cereus, SEQ ID NO: 91 são os aminoácidos 1-99 da sequência parcial do peptídeo líder de B. cereus exosporium e SEQ ID NO: 93 são os aminoácidos 1-136 da proteína hipotética ER45_27600 de B. weihenstephanensis. Conforme mostrado nas Figuras 1A e 1B, cada uma das regiões N-terminais dessas proteínas contém uma região que é conservada com os aminoácidos 20 a 35 de BclA (SEQ ID NO: 1) e uma região mais altamente conservada correspondente aos aminoácidos 25-35 de BclA.
[0205] Os aminoácidos 1-41 de BclA de B. thuringiensis (SEQ ID NO: 382) e os aminoácidos 1-41 de BclA de B. anthracis (SEQ ID NO: 384) são idênticos à SEQ ID NO: 2 e, portanto, não são representados na Figura
1.
[0206] Qualquer porção de BclA que inclua os aminoácidos 20–35 pode ser usada para alvejar uma proteína de fusão ao exosporium. Além disso, as proteínas de exosporium de comprimento total ou fragmentos de proteína do exosporium podem ser usadas para alvejar as proteínas de fusão para o exosporium. Assim, o BclA de comprimenton total ou um fragmento de BclA que inclui os aminoácidos 20–35 podem ser usados para alvejar para o exosporium. Por exemplo, o BclA de comprimento total (SEQ ID NO: 2, 382 ou _384) ou um fragmento de tamanho médio de BclA que não possui o terminal carboxi, como SEQ ID NO: 95 ou 385 (aminoácidos 1-196 de BclA) ou 383 (aminoácidos 1-166 de BclA) pode ser usado para alvejar as proteínas de fusão para o exosporium. Os fragmentos de tamanho médio, como os fragmentos de SEQ ID NO: 95, 383 e 385, possuem menos estrutura secundária do que BclA de comprimento total e foram considerados adequados para uso como uma sequência de alvejamento. A sequência de alvejamento também pode compreender porções muito mais curtas de BclA, que incluem os aminoácidos 20-35, como a SEQ ID NO: 1 (aminoácidos 1-41 de BclA), os aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1, aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 96 (um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos 20-35 de BclA). Os fragmentos ainda mais curtos de BclA, que incluem apenas alguns dos aminoácidos 20–35, também exibem a capacidade de alvejar proteínas de fusão para o exosporium. Por exemplo, a sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 22-31 da SEQ ID NO: 1, aminoácidos 22-33 da SEQ ID NO: 1 ou aminoácidos 20-31 da SEQ ID NO: 1.
[0207] Alternativamente, qualquer porção de BetA/BAS3290, BAS4623, BclB, BAS1882, o produto de gene KBAB4 2280, o produto de gene KBAB4 3572, peptídeo líder de exosporium de B. cereus VD200, peptídeo líder de exosporium de B. cereus VD166, proteína hipotética de B. cereus VD200 IKG_04663, proteína B-hélice de B. weihenstephensis KBAB4 YVTN, B. weihenstephensis KBAB4 proteína hipotética bcerkbab4_2363, proteína hipotética de B. weihenstephensis KBAB4 bcerkbab4_2131, colágeno contendo repetição de hélice tripla de B. weihenstephensis KBAB4, proteína hipotética de B. mycoides 2048 bmyco0001_21660, proteína hipotética de B. mycoides 2048 bmyc0001_22540, proteína hipotética de B. mycoides 2048 bmyc0001_21510, proteína de repetição de hélice tripla de coloágeno de B. thuringiensis 35646, proteína hipotética B. cereus WP_69652, líder exosporium B. cereus WP016117717, B. cereus peptídio exosporium WP002105192, proteína hipotéticaB. cereus WP87353, peptídio exosporium B. cereus 02112369, proteína exosporium B. cereus proteína hipotética WP016099770, B. thuringiensis YP006612525, proteína hipotética B. mycoides TIGR03720, proteína de domínio repetido com hélice tripla de colágeno B. cereus ATCC 10987, proteína semelhante a colágeno B. cereus E33L, colágeno contendo repetição de hélice tripla de B. weihenstephanensis KBAB4, proteína hipotética Al Hakam da cepa B. thuringiensis BALH_2230, colágeno contendo repetição em hélice tripla de B. cereus ATCC 14579, repetição em hélice tripla em colágeno de B. cereus, colágeno contendo repetição em hélice tripla de B. cereus ATCC 14579, proteína hipotética de B. cereus E33L BCZK1835, colágeno contendo repetição em hélice tripla de B. weihenstephanensis KBAB4, colágeno contendo repetição em hélice tripla de B. cereus ATCC 14579, proteína hipotética BC4725 de B. cereus ATCC 14579, proteína hipotética BCZK4476 de B. cereus E33L. Colágeno contendo repetição em hélice tripla "Ames Ancestor", cepa B. thuringiensis serovar konkukian Proteína 97-27 BclA, proteína hipotética conservada de B. cereus ATCC 10987, colágeno contendo repetição de hélice tripla de B. cereus ATCC 14579, sequência parcial de peptídeo líder de exosporium de B. cereus ou proteína hipotética de B. weihenstephanensis ER45_27600 que inclui os aminoácidos correspondentes aos aminoácidos 20- 35 do BclA podem servir como a sequência de alvejamento.
[0208] Como pode ser visto a partir da Figura 1A, aminoácidos 12–27 de BetA/BAS3290, aminoácidos 23–38 de BAS4623, aminoácidos 13–28 de BclB, aminoácidos 9–24 de BAS1882, aminoácidos 18– 33 do produto genético KBAB4 2280, aminoácidos 18–33 do produto genético KBAB4 3572, aminoácidos 28–43 do B. cereus VD200 peptídeo líder de exosporium, aminoácidos 12–27 do peptídeo líder de exosporium de B. cereus VD166, aminoácidos 18–33 da proteína hipotética de B. cereus VD200 IKG_04663, aminoácidos 18–33 da proteína β-hélice de B. weihenstephensis KBAB4 YVTN, aminoácidos 9–24 da proteína hipotética de B. weihenstephensis KBAB4 bcerkbab4_2363, aminoácidos 9–24 da proteína hipotética de B. weihenstephensis KBAB4 bcerkbab4_2131, aminoácidos 15–30 do colágeno contendo repetição de hélice tripla de B. weihenstephensis KBAB4, aminoácidos 18–33 da proteína hipotética de B. mycoides 2048 bmyco0001_21660, aminoácidos 9–24 da proteína hipotética de B. mycoides 2048bmyc0001_22540, aminoácidos 1–15 da proteína hipotética de B. mycoides 2048 bmyc0001_21510, aminoácidos 1–16 da proteína de repetição de hélice tripla de colágeno de B. thuringiensis 35646, aminoácidos 14–29 da proteína hipotética de B. cereus WP_69652, aminoácidos 20–35 do líder de exosporium de B. cereus WP016117717, aminoácidos 28–43 do peptídeo de exosporium de B.
cereus WP002105192, aminoácidos 17–32 da proteína hipotética de B. cereus WP87353, aminoácidos 18–33 do peptídeo de exosporium de B. cereus 02112369, aminoácidos 18–33 da proteína de exosporium de B. cereus WP016099770, aminoácidos 15–30 da proteína hipotética de B. thuringiensis YP006612525 e aminoácidos 115–130 da proteína hipotética de B. mycoides TIGR03720 correspondem aos aminoácidos 20–35 de BclA.
Como pode ser visto na Figura 1B, os aminoácidos 15-30 da proteína de domínio repetido de hélice tripla de colágeno de B. cereus ATCC 10987, aminoácidos 18-33 de proteína tipo colágeno de B. cereus E33L, aminoácidos 20-35 do colágeno contendo repetição de hélice tripla de B. weihenstephanensis KBAB4, aminoácidos 9-24 da proteína hipotética Al Hakam da cepa B. thuringiensis BALH_2230, aminoácidos 12-27 do colágeno contendo repetição de hélice tripla de B. cereus ATCC 14579, aminoácidos 23-38 do colágeno contendo repetição de hélice tripla de B. cereus, aminoácidos 17-32 do colágeno contendo repetição de hélice tripla de B. cereus ATCC 14579, aminoácidos 9-24 da proteína hipotética E33L de B. cereus E33L BCZK1835, aminoácidos 27-42 do colágeno contendo repetição de hélice tripla de B. weihenstephanensis KBAB4, aminoácidos 9-24 do colágeno contendo repetição de hélice tripla de B. cereus ATCC 14579, aminoácidos 18-33 da proteína hipotética BC4725 de B. cereus ATCC 14579, aminoácidos 23-38 da proteína hipotética BCZK4476 de B. cereus E33L, aminoácidos 19-34 do coágeno contendo repetição de hélice tripla da cepa de B. anthracis. “Ames Ancestor”, aminoácidos 13–28 da cepa B. thuringiensis serovar konkukian. 97- 27 BclA, aminoácidos 13 a 28 da proteína hipotética conservada de B. cereus ATCC 10987, aminoácidos 13 a 28 do colágeno contendo repetição de hélice tripla de B. cereus ATCC 14579, aminoácidos 78-93 da sequência parcial de peptídeo líder de exosporium de B. cereus e os aminoácidos 115 a 130 da proteína hipotética ER45_27600 de B. weihenstephanensis correspondem aos aminoácidos 20 a 35 do BclA.
Assim, qualquer porção dessas proteínas que inclui os aminoácidos correspondentes listados acima pode servir como a sequência de alvejamento.
[0209] Além disso, qualquer sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos 20-35 de BclA, ou qualquer um dos aminoácidos correspondentes listados acima, pode servir como a sequência de alvejamento.
[0210] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1, aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 96, aminoácidos 22-31 da SEQ ID NO : 1, aminoácidos 22-33 da SEQ ID NO: 1 ou aminoácidos 20-31 da SEQ ID NO: 1. Alternativamente, a sequência de alvejamento pode consistir nos aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1, aminoácidos 20-35 na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 96. Alternativamente, a sequência de alvejamento pode consistir nos aminoácidos 22-31 da SEQ ID NO: 1, aminoácidos 22-33 da SEQ ID NO: 1 ou aminoácidos 20-31 da SEQ ID NO: 1. Como alternativa, a proteína do exosporium pode compreender BclA de comprimento total (SEQ ID NO: 2) ou o fragmento de proteína do exosporium pode compreender um fragmento de tamanho médio de BclA que não possui o terminal carbóxi, como SEQ ID NO: 95 (aminoácidos 1–196 de BclA). Alternativamente, o fragmento de proteína do exosporium pode consistir em SEQ ID NO: 95.
[0211] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 1; aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 1; aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 1; aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 1; ou aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 1.
[0212] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 3, os aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 3 ou a SEQ ID NO: 3, ou a proteína do exosporium pode compreender BetA/BAS3290 de comprimento total (SEQ ID NÃO: 4). Também foi descoberto que um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos 12–27 de BetA/BAS3290 pode ser usado como uma sequência de alvejamento. Assim, a sequência de alvejamento pode compreender a SEQ ID NO: 97. Alternativamente, a sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 14–23 da SEQ ID NO: 3, aminoácidos 14– 25 da SEQ ID NO: 3 ou aminoácidos 12–23 da SEQ ID NO: 3.
[0213] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 3; aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 3; aminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 3; ou aminoácidos 10–27 da SEQ ID NO: 3.
[0214] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 1-38 da SEQ ID NO: 5, aminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 371 (um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos 23 –38 de BAS4623) ou a proteína do exosporium pode compreender BAS4623 de comprimento total (SEQ ID NO: 6).
[0215] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 5; aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 5; aminoácidos 8-38 da SEQ ID NO: 5; aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 5; aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 5; ou aminoácidos 20-38 da SEQ ID NO: 5.
[0216] Alternativamente, a sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 1–28 da SEQ ID NO: 7, aminoácidos 13–28 da SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 372 (um resíduo de metionina ligado ao aminoácidos 13-28 de BclB) ou a proteína do exosporium podem compreender BclB de comprimento total (SEQ ID NO: 8).
[0217] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 7; aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 7; aminoácidos 8-28 da SEQ ID NO: 7; ou aminoácidos 10–28 da SEQ ID NO: 7.
[0218] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 9, os aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 9 ou a SEQ ID NO: 9 ou a proteína do exosporium pode compreender BAS1882 de comprimento total (SEQ ID NO: 10). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos 9–24 de BAS1882 pode ser usado como uma sequência de alvejamento. Assim, a sequência de alvejamento pode compreender a SEQ ID NO: 105.
[0219] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 2–24 da SEQ ID NO: 9; aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 9; ou aminoácidos 8–24 da SEQ ID NO: 9.
[0220] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 11, os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 11 ou a SEQ ID NO: 11, ou a proteína do exosporium pode compreender o produto genético de comprimento total de B. weihenstephensis KBAB4 2280 (SEQ ID NO: 12). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos 18–33 do produto do gene de B. weihenstephensis KBAB4 2280 pode ser usado como uma sequência de alvejamento. Assim, a sequência de alvejamento pode compreender a SEQ ID NO: 98.
[0221] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 11; aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 11; aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 11; aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 11; ou aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 11.
[0222] A sequência de alvejamento também pode compreender os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 13, os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 13 ou a SEQ ID NO: 13, ou a proteína do exosporium pode compreender o produto genético de comprimento total de B. weihenstephensis KBAB4 3572 (SEQ ID NO: 14). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos 18–33 do produto do gene de B. weihenstephensis KBAB4 3572 pode ser usado como uma sequência de alvejamento. Assim, a sequência de alvejamento pode compreender a SEQ ID NO: 99.
[0223] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 13; aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 13; aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 13; aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 13; ou aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 13.
[0224] Alternativamente, a sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 1-43 da SEQ ID NO: 15, os aminoácidos 28- 43 da SEQ ID NO: 15 ou a SEQ ID NO: 15, ou a proteína do exosporium pode compreender o peptídeo líder de exosporium de comprimento total de B. cereus VD200(SEQ ID NO: 16).
[0225] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 15; aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 15;
aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 15; aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 15; aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 15; aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 15; ou aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 15.
[0226] A sequência de alvejamento também pode compreender os aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 17, os aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 17 ou a SEQ ID NO: 17, ou a proteína do exosporium pode compreender o peptídeo líder de exosporium de comprimento total de B. cereus VD166 (SEQ ID NO: 18). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos 12– 27 do peptídeo líder de exosporium de B. cereus VD166 pode ser usado como uma sequência de alvejamento. Assim, a sequência de alvejamento pode compreender a SEQ ID NO: 100.
[0227] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 17; aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 17; aminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 17; ou aminoácidos 10–27 da SEQ ID NO: 17.
[0228] A sequência de alvejamento também pode compreender os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 19, os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 19 ou a SEQ ID NO: 19, ou a proteína do exosporium pode compreender a proteína hipotética de comprimento total de B. cereus VD200 IKG_04663(SEQ ID NO: 20).
[0229] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 19; aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 19; aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 19; aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 19; ou aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 19.
[0230] Alternativamente, a sequência de alvejamento compreende os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 21, os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 21 ou a SEQ ID NO: 21, ou a proteína do exosporium pode compreender a proteína β-hélice de comprimento total de B. weihenstephensis KBAB4 YVTN β-propeller (SEQ ID NO: 22). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos 18–33 da proteína β-hélice de B. weihenstephensis KBAB4 YVTN pode ser usado como uma sequência de alvejamento. Assim, a sequência de alvejamento pode compreender a SEQ ID NO: 101.
[0231] A sequência de alvejamento pode compreender aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 21; aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 21; aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 21; aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 21; ou aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 21.
[0232] A sequência de alvejamento também pode compreender os aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 23, os aminoácidos 9- 24 da SEQ ID NO: 23 ou a SEQ ID NO: 23, ou a proteína do exosporium pode compreender a proteína hipotética de comprimento total de B. weihenstephensis KBAB4 bcerkbab4_2363 (SEQ ID NO: 24). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos 9–24 da proteína hipotética baberkbab4_2363 de B. weihenstephensis KBAB4 pode ser usado como uma sequência de alvejamento. Assim, a sequência de alvejamento pode compreender a SEQ ID NO: 102.
[0233] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 23; aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 23; ou aminoácidos 8–24 da SEQ ID NO: 23.
[0234] A sequência de alvejamento compreende os aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 25, os aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 25 ou a SEQ ID NO: 25, ou a proteína do exosporium pode compreender a proteína hipotética de comprimento total de B. weihenstephensis KBAB4 bcerkbab4_2131 (SEQ ID NO: 26). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos 9-24 da proteína hipotética baberkbab4_2131 de B. weihenstephensis KBAB4 pode ser usado como uma sequência de alvejamento. Assim, a sequência de alvejamento pode compreender a SEQ ID NO: 103.
[0235] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 2–24 da SEQ ID NO: 25; aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 25; ou aminoácidos 8–24 da SEQ ID NO: 25.
[0236] Alternativamente, a sequência de alvejamento compreende os aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 27, os aminoácidos 15-30 da SEQ ID NO: 27 ou a SEQ ID NO: 27, ou a proteína do exosporium pode compreender o colágeno contendo repetição de hélice tripla de comprimento total de B. weihenstephensis KBAB4(SEQ ID NO: 28).
[0237] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 27; aminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 27; aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 27; ou aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 27.
[0238] A sequência de alvejamento também pode compreender os aminoácidos 1 a 33 da SEQ ID NO: 29, os aminoácidos 18 a 33 da SEQ ID NO: 29 ou a SEQ ID NO: 29 ou a proteína do exosporium pode compreender a proteína hipotética 2048 de comprimento total de B. mycoides bmyco0001_21660 (SEQ ID NO: 30).
[0239] A sequência de alvejamento pode compreender aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 29; aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 29; aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 29; aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 29; ou aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 29.
[0240] A sequência de alvejamento também pode compreender os aminoácidos 1 a 24 da SEQ ID NO: 31, os aminoácidos 9 a 24 da SEQ ID NO: 31 ou a SEQ ID NO: 31 ou a proteína do exosporium pode compreender a proteína hipotética 2048 de comprimento total de B. mycoides bmyc0001_22540 (SEQ ID NO: 32). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos 9-24 da proteína hipotética de B. mycoides 2048 bmyc0001_22540 pode ser usado como uma sequência de alvejamento. Assim, a sequência de alvejamento pode compreender a SEQ ID NO: 104.
[0241] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 2–24 da SEQ ID NO: 31; aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 31; ou aminoácidos 8–24 da SEQ ID NO: 31.
[0242] Alternativamente, a sequência de alvejamento compreende os aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 33, ou a proteína do exosporium compreende a proteína hipotética de comprimento total de B. mycoides 2048 bmyc0001_21510 (SEQ ID NO: 34).
[0243] A sequência de alvejamento também pode compreender os aminoácidos 1-16 da SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 35, ou a proteína do exosporium pode compreender a proteína de repetição de hélice tripla de colágeno de comprimento total de B. thuringiensis 35646 (SEQ ID NO: 36).
[0244] A sequência de alvejamento pode compreender aminoácidos 1-29 de SEQ ID NO: 43, os aminoácidos 14-29 da SEQ ID NO: 43, ou SEQ ID NO: 43, ou a proteína de exosporium pode compreender a proteína hipotética de comprimento total de B. cereus WP_69652 (SEQ ID NO: 44).
[0245] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 2 a 29 da SEQ ID NO: 43; aminoácidos 5 a 29 da SEQ ID NO: 43; aminoácidos 8 a 29 da SEQ ID NO: 43; ou aminoácidos 10 a 29 da SEQ ID NO:
43.
[0246] Alternativamente, a sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 45, os aminoácidos 20- 35 da SEQ ID NO: 45 ou a SEQ ID NO: 45, ou a proteína do exosporium pode compreender o líder de exosporium de comprimento total de B. cereus WP016117717 (SEQ ID NO: 46). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos 20–35 do líder de exosporium de B. cereus WP016117717 pode ser usado como uma sequência de alvejamento. Assim, a sequência de alvejamento pode compreender a SEQ ID NO: 106.
[0247] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 45; aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 45; aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 45; aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 45; ou aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 45.
[0248] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 1-43 da SEQ ID NO: 47, os aminoácidos 28-43 da SEQ ID NO: 47 ou a SEQ ID NO: 47, ou a proteína do exosporium pode compreender o peptídeo de exosporium de comprimento total de B. cereus WP002105192 (SEQ ID NO: 48).
[0249] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 47; aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 47; aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 47; aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 47;
aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 47; aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 47; ou aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 47.
[0250] A sequência de alvejamento pode compreender amino ácidos 1-32 de SEQ ID NO: 49, os aminoácidos 17-32 da SEQ ID NO: 49, ou SEQ ID NO: 49, ou a proteína de exosporium pode compreender a proteína hipotética de comprimento total de B. cereus WP87353 (SEQ ID NO: 50).
[0251] A sequência de alvejamento pode compreender aminoácidos 2 a 32 da SEQ ID NO: 49; aminoácidos 5 a 32 da SEQ ID NO: 49; aminoácidos 8 a 32 da SEQ ID NO: 49; aminoácidos 10 a 32 da SEQ ID NO: 49; ou aminoácidos 15 a 32 da SEQ ID NO: 49.
[0252] Alternativamente, a sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 51, os aminoácidos 18- 33 da SEQ ID NO: 51 ou a SEQ ID NO: 51, ou a proteína do exosporium pode compreender o peptídeo de exosporium de comprimento total de B. cereus 02112369(SEQ ID NO: 52).
[0253] A sequência de alvejamento pode compreender aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 51; aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 51; aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 51; aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 51; ou aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 51.
[0254] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 53, os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 53 ou a SEQ ID NO: 53, ou a proteína do exosporium pode compreender a proteína do exosporium de comprimento total de B. cereus WP016099770 (SEQ ID NO: 54).
[0255] A sequência de alvejamento pode compreender aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 53; aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 53; aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 53; aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 53; ou aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 53.
[0256] Alternativamente, a sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 55, os aminoácidos 15- 30 da SEQ ID NO: 55 ou da SEQ ID NO: 55, ou a proteína do exosporium pode compreender a proteína hipotética de comprimento total de B. thuringiensis YP006612525 (SEQ ID NO: 56).
[0257] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 55; aminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 55; aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 55; ou aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 55.
[0258] A sequência de alvejamento pode compreender aminoácidos 1-130 de SEQ ID NO: 57, aminoácidos 115-130 da SEQ ID NO: 57 ou da SEQ ID NO: 57, ou a proteína de exosporium pode compreender a proteína hipotética de comprimento total de B. mycoides TIGR03720 (SEQ ID NO: 58).
[0259] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 2-130 da SEQ ID NO: 57; aminoácidos 5-130 da SEQ ID NO: 57; aminoácidos 10-130 da SEQ ID NO: 57; aminoácidos 20-130 da SEQ ID NO: 57; aminoácidos 30-130 da SEQ ID NO: 57; aminoácidos 40-130 da SEQ ID NO: 57; aminoácidos 50-130 da SEQ ID NO: 57; aminoácidos 60-130 da SEQ ID NO: 57; aminoácidos 70-130 da SEQ ID NO: 57; aminoácidos 80-130 da SEQ ID NO: 57; aminoácidos 90-130 da SEQ ID NO: 57; aminoácidos 100-130 da SEQ ID NO: 57; ou aminoácidos 110-130 da SEQ ID NO: 57.
[0260] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 59; ou SEQ ID NO: 59; ou a proteína do exosporium pode compreender a proteína de domínio de repetição de hélice tripla de colágeno de comprimento total de B. cereus ATCC 10987 (SEQ ID NO: 60).
[0261] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 2 a 30 da SEQ ID NO: 59; aminoácidos 4 a 30 da SEQ ID NO: 59; ou aminoácidos 6 a 30 da SEQ ID NO: 59.
[0262] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 61; aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 61; ou SEQ ID NO: 61; ou a proteína do exosporium pode compreender a proteína do tipo colágeno de comprimento total de B. cereus E33L (SEQ ID NO: 62).
[0263] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 2 a 33 da SEQ ID NO: 61; aminoácidos 5 a 33 da SEQ ID NO: 61;
aminoácidos 10 a 33 da SEQ ID NO: 61; ou aminoácidos 15 a 33 da SEQ ID NO:
61.
[0264] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 63; ou SEQ ID NO: 63; ou a proteína do exosporium pode compreender colágeno contendo repetição de hélice tripla de comprimento total de B. weihenstephanensis KBAB4 (SEQ ID NO: 64).
[0265] A sequência de alvejamento pode compreender aminoácidos 2 a 35 da SEQ ID NO: 63; aminoácidos 5 a 35 da SEQ ID NO: 63; aminoácidos 8 a 35 da SEQ ID NO: 63; aminoácidos 10 a 35 da SEQ ID NO: 63; ou aminoácidos 15 a 35 da SEQ ID NO: 63.
[0266] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 65; ácidos 9 a 24 da SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 65; ou SEQ ID NO: 107; ou a proteína do exosporium pode compreender a proteína hipotética de comprimento total da cepa de B. thuringiensis Al Hakam BALH_2230 (SEQ ID NO: 66).
[0267] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 2–24 da SEQ ID NO: 65; ou aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 65.
[0268] A sequência de alvejamento pode compreender aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 67; aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 67 ou da SEQ ID NO: 67; ou a proteína do exosporium pode compreender colágeno contendo repetição de hélice tripla de comprimento total de B. cereus ATCC 14579 (SEQ ID NO: 68).
[0269] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 2 a 27 da SEQ ID NO: 67; aminoácidos 5 a 27 da SEQ ID NO: 67; ou aminoácidos 10 a 27 da SEQ ID NO: 67.
[0270] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 1-38 da SEQ ID NO: 69; aminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 69; ou SEQ ID NO: 69; ou a proteína do exosporium pode compreender colágeno de repetição de hélice tripla de comprimento total de B. cereus (SEQ ID NO: 70).
[0271] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 2 a 38 da SEQ ID NO: 69; aminoácidos 5 a 38 da SEQ ID NO: 69;
aminoácidos 10 a 38 da SEQ ID NO: 69; ou aminoácidos 15 a 38 da SEQ ID NO:
69.
[0272] A proteína do exosporium pode compreender colágeno contendo repetição de hélice tripla de comprimento total de B. cereus ATCC 14579(SEQ ID NO: 72).
[0273] A sequência de alvejamento pode compreender a SEQ ID NO: 73, ou a proteína do exosporium pode compreender a proteína hipotética de comprimento total de B. cereus E33L BCZK1835(SEQ ID NO: 74).
[0274] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 1-42 da SEQ ID NO: 75; aminoácidos 27-42 da SEQ ID NO: 75; ou SEQ ID NO: 75; ou a proteína do exosporium pode compreender colágeno contendo repetição de hélice tripla de comprimento total de B. weihenstephanensis KBAB4 (SEQ ID NO: 76).
[0275] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 2 a 42 da SEQ ID NO: 75; aminoácidos 5 a 42 da SEQ ID NO: 75; aminoácidos 10 a 42 da SEQ ID NO: 75; aminoácidos 15 a 42 da SEQ ID NO: 75; aminoácidos 20 a 42 da SEQ ID NO: 75; ou aminoácidos 25 a 42 da SEQ ID NO: 75.
[0276] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 1–24 da SEQ ID NO: 77; aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 77 ou da SEQ ID NO: 77; ou a proteína do exosporium pode compreender colágeno contendo repetição de hélice tripla de comprimento total de B. cereus ATCC 14579 (SEQ ID NO: 78).
[0277] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 2–24 da SEQ ID NO: 77; ou aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 77;
[0278] A proteína do exosporium pode compreender a proteína hipotética de comprimento total de B. cereus ATCC 14579 BC4725 (SEQ ID NO: 80).
[0279] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 1-38 da SEQ ID NO: 81; aminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 81 ou da SEQ ID NO: 81; ou a proteína do exosporium pode compreender a proteína hipotética de comprimento total de B. cereus E33L BCZK4476 (SEQ ID NO: 82).
[0280] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 81; aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 81; aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 81; aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 81; ou aminoácidos 20-38 da SEQ ID NO: 81.
[0281] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 1-34 da SEQ ID NO: 83; ou SEQ ID NO: 83; ou a proteína do exosporium pode compreender o colágeno contendo repetição de hélice tripla da cepa de B. anthracis 'Ames Ancestor' (SEQ ID NO: 84).
[0282] A proteína do exosporium pode compreender a cepa de comprimento total de B. thuringiensis serovar konkukian. Proteína 97- 27 BclA (SEQ ID NO: 86).
[0283] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 1–28 da SEQ ID NO: 87; aminoácidos 13-28 da SEQ ID NO: 87 ou da SEQ ID NO: 87; ou a proteína do exosporium pode compreender a proteína hipotética conservada de comprimento total de B. cereus ATCC 10987 (SEQ ID NO: 88).
[0284] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 2–28 da SEQ ID NO: 87; aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 87; ou aminoácidos 10–28 da SEQ ID NO: 87.
[0285] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 1–28 da SEQ ID NO: 89 ou da SEQ ID NO: 89; ou a proteína do exosporium pode compreender colágeno contendo repetição de hélice tripla de comprimento total de B. cereus ATCC 14579 (SEQ ID NO: 90).
[0286] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 2–28 da SEQ ID NO: 89; aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 89; ou aminoácidos 10–28 da SEQ ID NO: 89.
[0287] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 1-93 da SEQ ID NO: 91; ou SEQ ID NO: 91; ou a proteína do exosporium pode compreender a sequência parcial do peptídeo líder de exosporium de B. cereus (SEQ ID NO: 92).
[0288] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 2 a 93 da SEQ ID NO: 91; aminoácidos 10 a 93 da SEQ ID NO: 91; aminoácidos 20 a 93 da SEQ ID NO: 91; aminoácidos 30 a 93 da SEQ ID NO: 91; aminoácidos 40 a 93 da SEQ ID NO: 91; aminoácidos 50 a 93 da SEQ ID NO: 91; ou aminoácidos 60 a 93 da SEQ ID NO: 91.
[0289] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 1–130 da SEQ ID NO: 93 ou da SEQ ID NO: 93; ou a proteína do exosporium pode compreender a sequência parcial da proteína hipotética de B. weihenstephanensis) ER45_27600 (SEQ ID NO: 94).
[0290] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 2 a 130 da SEQ ID NO: 93; aminoácidos 10 a 130 da SEQ ID NO: 93; aminoácidos 20 a 130 da SEQ ID NO: 93; ou aminoácidos 30 a 130 da SEQ ID NO: 93.
[0291] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 382, aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 382, SEQ ID NO: 382 ou SEQ ID NO: 383.
[0292] A sequência de alvejamento pode compreender os aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 384, aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 384, SEQ ID NO: 384 ou SEQ ID NO: 385.
[0293] Além disso, como ilustrado nos Exemplos fornecidos abaixo, verificou-se que sequências menores que os aminoácidos 20- 35 de BclA podem ser usadas para alvejar uma proteína de fusão ao exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. Em particular, os aminoácidos 20-33 de BclA, aminoácidos 20-31 de BclA, aminoácidos 21-33 de BclA ou aminoácidos 23-31 de BclA podem ser usados para alvejar uma proteína de fusão ao exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. Assim, a sequência de alvejamento pode consistir nos aminoácidos 20-33 da SEQ ID NO: 1, aminoácidos 20-31 da SEQ ID NO: 1, aminoácidos 21-33 da SEQ ID NO: 1 ou aminoácidos 23-31 da SEQ ID NO: 1. As regiões correspondentes de qualquer uma das SEQ ID NOs mostradas nas Figuras 1A e 1B também podem ser usadas para alvejar uma proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. Por "regiões correspondentes", entende-se que quando as sequências estão alinhadas com a SEQ ID NO: 1, como mostrado nas Figuras 1A e 1B, as regiões das outras sequências de aminoácidos que se alinham com os aminoácidos da SEQ ID NO: são as "regiões correspondentes" dessas sequências. Assim, por exemplo, os aminoácidos 12-25 da SEQ ID NO: 3, os aminoácidos 23-36 da SEQ ID NO: 5, os aminoácidos 13-26 da SEQ ID NO: 7, etc., podem ser utilizados para atingir uma proteína de fusão ao exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante, uma vez que essas regiões se alinham aos aminoácidos 20–33 da SEQ ID NO: 1, como mostrado na Figura 1A.
[0294] Regiões ainda mais curtas nos aminoácidos 20-35 de BclA também podem ser usadas para alvejar uma proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. Em particular, qualquer sequência de aminoácidos que inclui os aminoácidos 25-30 da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes de qualquer uma das sequências mostradas nas Figuras 1A e 1B pode ser usada. Um indivíduo versado reconhecerá que, começando com os aminoácidos 25-30 da SEQ ID NO: 1 ou a região correspondente de qualquer uma das sequências mostradas nas Figuras 1A e 1B, aminoácidos adicionais podem ser adicionados ao terminal amino, ao terminal carbóxi ou aos terminais amino e carbóxi para criar uma sequência de alvejamento que será eficaz para alvejar uma proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante.
[0295] Além disso, pode ser facilmente observado pelo alinhamento da sequência nas Figuras 1A e 1B que, enquanto os aminoácidos 20-35 do BclA são conservados e os aminoácidos 25 a 35 são mais conservados, pode ocorrer algum grau de variação nessa região sem afetar a capacidade da sequência de alvejamento de alvejar uma proteína para o exosporium. As Figuras 1A e 1B listam a porcentagem de identidade de cada um dos aminoácidos correspondentes de cada sequência aos aminoácidos 20-35 do
BclA (“20 a 35% de identidade”) e aos aminoácidos 25-35 do BclA (“25 a 35% de identidade"). Assim, por exemplo, em comparação com os aminoácidos 20-35 de BclA, os aminoácidos correspondentes de BetA/BAS3290 são aproximadamente 81,3% idênticos, os aminoácidos correspondentes de BAS4623 são aproximadamente 50,0% idênticos, os aminoácidos correspondentes de BclB são aproximadamente 43,8% idênticos, os aminoácidos correspondentes de BAS1882 são cerca de 62,5% idênticos, os aminoácidos correspondentes do produto do gene KBAB4 2280 são cerca de 81,3% idênticos e os aminoácidos correspondentes do produto do gene KBAB4 3572 são cerca de 81,3% idênticos. As identidades de sequência nessa região para as demais sequências estão listadas nas Figuras 1A e 1B.
[0296] Com relação aos aminoácidos 25-35 de BclA, os aminoácidos correspondentes de BetA/BAS3290 são aproximadamente 90,9% idênticos, os aminoácidos correspondentes de BAS4623 são aproximadamente 72,7% idênticos, os aminoácidos correspondentes de BclB são aproximadamente 54,5% idênticos, os aminoácidos correspondentes de BAS1882 são cerca de 72,7% idênticos, os aminoácidos correspondentes do produto do gene KBAB4 2280 são cerca de 90,9% idênticos e os aminoácidos correspondentes do produto do gene KBAB4 3572 são cerca de 81,8% idênticos. As identidades de sequência nessa região para as demais sequências estão listadas nas Figuras 1A e 1B.
[0297] Assim, a sequência de alvejamento pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 43% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 54%. Alternativamente, a sequência de alvejamento consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e possuindo pelo menos cerca de 43% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos cerca de 54%.
[0298] A sequência de alvejamento também pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de
50% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 63%. Alternativamente, a sequência de alvejamento consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e possuindo pelo menos cerca de 50% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos cerca de 63%.
[0299] A sequência de alvejamento também pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 50% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 72%. Alternativamente, a sequência de alvejamento consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e possuindo pelo menos cerca de 50% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos cerca de 72%.
[0300] A sequência de alvejamento também pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 56% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 63%. Alternativamente, a sequência de alvejamento consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e possuindo pelo menos cerca de 56% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos cerca de 63%.
[0301] A sequência de alvejamento pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 62% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 72%. Alternativamente, a sequência de alvejamento pode consistir em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e possuindo pelo menos cerca de 62% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 da SEQ ID NO: 1 é pelo menos cerca de 72%.
[0302] A sequência de alvejamento pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 68% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25 a 35 é de pelo menos cerca de 81%. Alternativamente, a sequência de alvejamento consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e possuindo pelo menos 68% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25 a 35 é pelo menos cerca de 81%.
[0303] A sequência de alvejamento também pode compreender uma sequência de amino com pelo menos cerca de 75% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 72%. Alternativamente, a sequência de alvejamento consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e possuindo pelo menos cerca de 75% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 da SEQ ID NO : 1 é pelo menos cerca de 72%.
[0304] A sequência de alvejamento também pode compreender uma sequência de amino com pelo menos cerca de 75% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 81%. Alternativamente, a sequência de alvejamento consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e possuindo pelo menos cerca de 75% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 da SEQ ID NO : 1 é pelo menos cerca de 81%.
[0305] A sequência de alvejamento também pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 81% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25 a 35 é de pelo menos cerca de 81%. Alternativamente, a sequência de alvejamento consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e possuindo pelo menos cerca de
81% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25 a 35 é pelo menos cerca de 81%.
[0306] A sequência de alvejamento pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 81% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 90%. Alternativamente, a sequência de alvejamento consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e possuindo pelo menos cerca de 81% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos cerca de 90%.
[0307] O versado reconhecerá que variantes das sequências acima também podem ser usadas como sequências de alvejamento, desde que a sequência de alvejamento compreenda os aminoácidos 20-35 de BclA, os aminoácidos correspondentes de BetA/BAS3290, BAS4263, BclB, BAS1882, o produto do gene KBAB4 2280, ou o produto do gene KBAB 3572, ou uma sequência compreendendo qualquer uma das identidades de sequência observadas acima para os aminoácidos 20-35 e 25-35 de BclA está presente.
[0308] Certas proteínas exosporium da família Bacillus cereus que não possuem regiões com homologia com os aminoácidos 25–35 de BclA também podem ser usadas para alvejar um peptídeo ou proteína ao exosporium de um membro da família Bacillus cereus. Em particular, as proteínas de fusão podem compreender uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 108 (B. mycoides InhA), uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 109 (B. anthracis Sterne BAS1141 (ExsY)), uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 110 (B. anthracis Sterne BAS1144 (BxpB/ExsFA)), uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 111 (B. anthracis Sterne BAS1145 (CotY)), uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 112 (B. anthracis Sterne BAS1140), uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 113 (B. anthracis H9401 ExsFB), uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 114 (B. thuringiensis HD74 InhA1), uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 115 (B. cereus ATCC 10876 ExsJ), uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 116 (B. cereus ExsH), uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 117 (B. anthracis Ames YjcA), uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 118 (B. anthracis YjcB), uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 119 (B. anthracis Sterne BclC), uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 120 (fosfatase ácida da cepa Bacillus thuringiensis serovar konkukian 97-27), uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 121 (B. thuringiensis HD74 InhA2), uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 122 (B. mycoides InhA3) ou uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 381 (Variante CotY de B. anthracis). A inclusão de uma proteína do exosporium compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 108-122 ou 381 nas proteínas de fusão aqui descritas resultará no alvejamento para o exosporium de um membro da família B. cereus.
[0309] Além disso, proteínas exosporium possuindo um alto grau de identidade de sequência com qualquer uma das proteínas exosporium de comprimento total ou os fragmentos de proteína do exosporium descritos acima também podem ser usadas para alvejar um peptídeo ou proteína ao exosporium de um membro da família Bacillus cereus. Assim, a proteína de fusão pode compreender uma proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122 e 381.
[0310] Alternativamente, a proteína de fusão pode compreender uma proteína do exosporium com pelo menos 90% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122 e 381.
[0311] A proteína de fusão pode compreender uma proteína do exosporium com pelo menos 95% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122 e 381.
[0312] A proteína de fusão pode compreender uma proteína do exosporium com pelo menos 98% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122 e 381.
[0313] A proteína de fusão pode compreender uma proteína do exosporium com pelo menos 99% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122 e 381.
[0314] A proteína de fusão pode compreender uma proteína do exosporium com 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122 e 381.
[0315] Qualquer uma das sequências de alvejamento, proteínas exosporuim ou fragmentos de proteína do exosporium pode ser usada para alvejar qualquer proteína ou peptídeo de interesse, incluindo, porém sem limitação, às enzimas e proteínas expansinas aqui descritas, ao exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante.
[0316] Por exemplo, qualquer uma das sequências de alvejamento, proteínas exosporium ou fragmentos de proteínas exosporium (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs. 381–385) pode ser usado para alvejar uma proteína ou peptídeo de interesse (por exemplo, uma endoglucanase como a endoglucanase da SEQ ID NO: 293; uma fosfolipase como a fosfolipase da SEQ ID NO: 250; uma xiloglucanase como a xiloglucanase da SEQ ID NO: 300; uma protease como a protease da SEQ ID NO: 303 ou 304; ou uma ACC desaminase como a ACC desaminase da SEQ ID NO: 249) para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante.
[0317] Durante a esporulação de um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas, o motivo alvo, a proteína do exosporium ou o fragmento de proteína do exosporium é reconhecido pela maquinaria de montagem de exosporium de esporos e direcionado ao exosporium, resultando na exibição da proteína ou porção peptídica de interesse da proteína de fusão (por exemplo, a enzima que possui atividade ACC-desaminase, a fosfolipase, a lipase, a xilanase, a xilosidase, a lactonase, a quitosanase, a protease, a glucanase, a fitase, a fosfatase ácida, a enzima pectinase, mananase ou proteína expansina) na parte externa do esporo.
[0318] Como ilustrado adicionalmente pelos Exemplos fornecidos abaixo, o uso de diferentes sequências de alvejamento permite o controle do nível de expressão da proteína de fusão na superfície do esporo do membro da família Bacillus cereus. O uso de algumas das sequências de alvejamento descritas neste documento resultará em um nível mais alto de expressão da proteína de fusão, enquanto o uso de outras sequências de alvejamento resultará em níveis mais baixos de expressão da proteína de fusão na superfície do esporo.
[0319] Em qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas, a sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium pode compreender a sequência de aminoácidos GXT no seu terminal carboxi, em que X é qualquer aminoácido.
[0320] Em qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas, a sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium, pode compreender um resíduo de alanina na posição da sequência de alvejamento que corresponde ao aminoácido 20 da SEQ ID NO:
1.
[0321] Em qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas, a sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium pode compreender ainda um resíduo de metionina, serina ou treonina na posição de aminoácido imediatamente anterior ao primeiro aminoácido da sequência de alvejamento, proteína do exosporium, ou fragmento de proteína do exosporium ou na posição da sequência de alvejamento que corresponde ao aminoácido 20 da SEQ ID NO: 1.
B. ACC DESAMINASES, FOSFOLIPASES, LIPASES, XILANASES, XILOSIDASES, LACTONASES, QUITOSANASES, PROTEASES, GLUCANASES, FITASES, FOSFATASES ÁCIDAS, PECTINASES, MANANASES E PROTEÍNAS DE EXPANSÃO
[0322] As proteínas de fusão podem compreender uma enzima com atividade ACC desaminase, fosfolipase, lipase, xilanase, xilosidase, lactonase, quitosanase, protease, glucanase, fitase, fosfatase ácida, pectinase, mananase e/ou uma proteína expansina. Para facilitar a referência, sequências ilustrativas para enzimas ACC desaminase modificadas e do tipo selvagem, bem como sequências para outras enzimas e proteínas expansinas que podem ser usadas em conexão com as proteínas de fusão, membros da família Bacillus cereus recombinante, fragmentos de exosporium, formulações, sementes e métodos aqui descritos, são fornecidos abaixo. 1 D-CISTEÍNA DESSULFIDRASES E ACC
DESAMINASES
[0323] As proteínas de fusão podem compreender uma enzima com atividade de ACC desaminase. As ACC desaminases e as D-cisteína dessulfidrases (DCD) geralmente têm sequências de aminoácidos semelhantes e podem ter atividades enzimáticas sobrepostas, podendo atuar tanto como substrato de 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) quanto de D-cisteína.
Algumas enzimas têm apenas uma dessas atividades, enquanto outras são capazes de atuar tanto como ACC desaminases quanto como D--cisteína dessulfidrases. As ACC desaminases clivam em amônia e alfa-cetobutirato, enquanto as D-cisteína dessulfidrases convertem D-cisteína em piruvato, H2S e amônia. A ACC é o precursor imediato do etileno, que pode causar efeitos indesejáveis nas plantas se presente em níveis elevados.
[0324] Assim, uma enzima com atividade aumentada de ACC desaminase seria benéfica para uso na agricultura, a fim de reduzir os níveis de ACC e, assim, reduzir os níveis de etileno. A aplicação de ACC desaminase a um meio de crescimento vegetal, a uma planta, a uma semente de planta ou a uma área circundante a uma planta ou a uma semente de planta pode estimular o crescimento da planta, promover a saúde da planta (por exemplo, aumentando a absorção de nutrientes) e retardando o amadurecimento da fruta. Esses efeitos, por sua vez, levam ao aumento de produtividade, vigor no início da estação e resistência das plantas às tensões no início da estação. As ACC desaminases também podem proteger as plantas dos patógenos, bem como do estresse abiótico.
[0325] Como explicado em mais detalhes abaixo, podem ser feitas mutações em enzimas que exibem atividade de D-cisteína dessulfidrase e/ou de ACC-desaminase, a fim de aumentar a atividade de ACC desaminase da enzima. Todas as plantas produzem ACC e respondem ao etileno e, portanto, essas enzimas ACC desaminase modificadas têm ampla aplicabilidade.
[0326] A ACC desaminase de ocorrência natural não é uma proteína secretada. As ACC desaminases são encontradas em muitos tipos de micro-organismos, incluindo bactérias dos Phyla Bacteriodetes, Firmicutes, Actinobacteria e bactérias dos gêneros Pseudomonas, Bacillus, Rhizobium, Bradyrhizobium, entre outras. No entanto, as ACC desaminases encontradas nessas bactérias são intracelulares e têm exposição limitada ao substrato ACC das plantas hospedeiras que colonizam. A exibição de uma enzima com atividade de ACC desaminase na parte externa dos esporos de membros da família Bacillus cereus usando o sistema BEMD aqui descrito permite um maior contato entre a enzima e seu substrato após a aplicação dos esporos a um meio de crescimento de plantas, uma planta, uma semente de planta ou uma área em torno de uma planta ou semente de planta.
[0327] Para facilitar a referência, as sequências nucleotídicas ilustrativas de D-cisteína dessulfidrase e 1-aminociclopropano-1- carboxilato-desaminase (ACC-desaminase) são fornecidas na Tabela 2 abaixo, juntamente com suas SEQ ID NOs. A Tabela 3 abaixo fornece as sequências de aminoácidos correspondentes para as sequências de nucleotídeos listadas na Tabela 2. A mutação de certos aminoácidos em uma enzima D-cisteína dessulfidrase ou ACC desaminase do tipo selvagem pode resultar em uma enzima com atividade aumentada da ACC desaminase em comparação com a atividade de ACC desaminase da enzima do tipo selvagem nas mesmas condições.
[0328] Na Tabela 2, SEQ ID NOs. 234-237 são sequências nucleotídicas para enzimas do tipo selvagem que exibem atividade de ACC desaminase e D-cisteína dessulfidrase, e SEQ ID NOs. 238–241 são sequências de nucleotídeos que codificam versões correspondentes dessas enzimas com duas substituições de aminoácidos em relação à sequência do tipo selvagem que resultam em aumento da atividade da ACC desaminase. Assim, por exemplo, a SEQ ID NO: 234 fornece a sequência de nucleotídeos para uma enzima do tipo selvagem e a SEQ ID NO: 238 fornece a sequência de nucleotídeos para a mesma enzima em que a sequência de nucleotídeos foi alterada para codificar uma enzima com dois aminoácidos substituições relativas à enzima codificada pela SEQ ID NO: 234. Da mesma forma, a SEQ ID NO: 235 fornece a sequência de nucleotídeos para uma enzima do tipo selvagem e a SEQ ID NO: 239 fornece a sequência de nucleotídeos para a mesma enzima em que a sequência de nucleotídeos foi alterada para codificar uma enzima com duas substituições de aminoácidos em relação à enzima codificada pela SEQ ID NO:
235. Da mesma forma, a SEQ ID NO: 236 é uma sequência do tipo selvagem e a SEQ ID NO: 240 fornece a sequência alterada correspondente, e a SEQ ID NO
237 é uma sequência do tipo selvagem e a SEQ ID NO: 241 fornece a sequência alterada correspondente.
[0329] Na Tabela 3, as SEQ ID NOs. 242–245 são sequências de aminoácidos para enzimas do tipo selvagem que exibem tanto a atividade da ACC desaminase quanto da D -cisteína dessulfidrase, e as SEQ ID NOs. 246-249 são sequências de aminoácidos para as versões correspondentes dessas enzimas, com duas substituições de aminoácidos em relação à sequência do tipo selvagem que resultam em aumento da atividade enzimática. Assim, a SEQ ID NO: 242 é uma sequência do tipo selvagem e a SEQ ID NO: 246 fornece a sequência de aminoácidos para a mesma enzima que possui as duas substituições de aminoácidos em relação à sequência do tipo selvagem. As SEQ ID NOs. 243 e 247, 244 e 248 e 245 e 249 estão relacionados entre si da mesma maneira. Os aminoácidos substituídos são mostrados nas SEQ ID NOs. 246-249 na Tabela 3, em texto em negrito e sublinhado.
TABELA 2. SEQUÊNCIAS DE NUCLEOTÍDEOS PARA D-
CISTEÍNA DESSULFIDRASES E ACC DESAMINASES Enzima SEQ ID NO. D-cisteína dessulfidrase (ACC deaminase nativa 1b) 234 (Bacillus thuringiensis, tipo selvagem) D-cisteína dessulfidrase (ACC deaminase nativa 2b) 235 (Bacillus pseudomycoides, tipo selvagem) D-cisteína dessulfidrase (ACC deaminase nativa 3b) 236
(Bacillus thuringiensis, tipo selvagem) D-cisteína dessulfidrase (ACC deaminase) (CÓDIGO ID: E195) 237 (Bacillus thuringiensis, tipo selvagem) D-cisteína dessulfidrase (ACC deaminase nativa 1b) 238 (Bacillus thuringiensis, com mutações) D-cisteína dessulfidrase (ACC deaminase nativa 2b) 239 (Bacillus pseudomycoides, com mutações) D-cisteína dessulfidrase (ACC deaminase nativa 3b) 240 (Bacillus thuringiensis, com mutações) ACC desaminase (D-cisteína dessulfidrase) (CÓDIGO ID: D406) 241 (Bacillus thuringiensis, com mutações) TABELA 3. SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS PARA D-
CISTEÍNA DESSULFIDRASES E ACC DEAMINASES Enzima (SEQ ID NO) Sequência de aminoácidos D-cisteína dessulfidrase MNLAKFPRKKYTESYTPIEKLNNFSEALGGPTIYFKRDDLL (ACC deaminase nativa GLTAGGNKTRKLEFLVADAEAKGADTLITAGGIQSNHCRL 1b) TLAAAVKEKMKCILVLEEGLEPEEKPDFNGNYFLYHLLGA Do tipo selvagem ENVIVVPNGADLMEEMHKVAKEVSEKGNTPYVIPVGGSN
[0330] Bacillus PTGAMGYVACAQEIMAQSFDQGIDFSTVVCVSGSAGMHA thuringiensis GLITGFAGTQSHIPVIGINVSRGKAEQEEKVAKLVDETSAH (SEQ ID NO: 242) VGIPNFIPRDAVTCFDEYVGPGYALPTPEMVEAVQLLAKT
EGILLDPVYTGKAVAGLIDLIKKGTFNKEDNILFVHSGGSPA
LYANTSLFA D-cisteína dessulfidrase MNLAKFPRKKYTESYTPIEKLNHFSEVLGGPSIYFKRDDLL (ACC deaminase nativa GLTAGGNKTRKLEFLVADAQAKGVDTLITAGGIQSNHCRL 2b) TLAAAVKEKMKCILVLEEGLEPEEKPDFNGNYFLYHLLGA Do tipo selvagem ENVIVVPNGTDLMDEMQKVAKEVTEKGHTPYVIPVGGSN Bacillus pseudomycoides PTGAMGYIACAEEIMAQSFEQGIDFNAVVCVSGSGGMHA (SEQ ID NO: 243) GLITGFYGRQTGIPIIGMNVSRGKAEQEEKVCKLVQETSA
HVGIPNSIPREAVTCFDEYVGPGYALPTPEMVEAVQLLAK TEGILLDPVYTGKAVAGLIDIIRKGTFKKEDNILFVHSGGSP
ALYANTSLFS D-cisteína dessulfidrase MNLAKFPRKKYTESYTPIEKLNNFSEVLGGPTIYFKRDDLL (ACC deaminase nativa GLTAGGNKTRKLEFLVADAQAKGADTLITAGGIQSNHCRL 3b) do tipo selvagem TLAAAVKEKMKCILVLEEGLEPEEKPDFNGNYFLYHLLGA Bacillus thuringiensis ENVIVVPNGADLMEEMHKVAKEVSEKGNTPYVIPVGGSN (SEQ ID NO: 244) PTGAMGYVACAQEIMAQSFEQGIDFSSVVCVSGSGGMH
AGLITGFAGTQSHIPVIGINVSRGKAEQEEKVAKLVDETSA HVGIPNFISRDAVTCFDQYVGPGYALPTQEMVEAVQLLAK TEGILLDPVYTGKAVAGLIDLIKKGTFNKEDNILFVHSGGSP
ALYANTSLFA D-cisteína dessulfidrase MNLAKFPRKKYTESYTPIEKLNNFSEALGGPTIYFKRDDLL (ACC desaminase) GLTAGGNKTRKLEFLVADAQEKGADTLITAGGIQSNHCRL
Bacillus thuringiensis TLAAAVKEKMKCILVLEEGLEPEEKRDFNGNYFLYHLLGA Do tipo selvagem ENVIVVPNGADLMEEMNKVAKEVSEKGSTPYVIPVGGSN (CÓDIGO ID: E195) PTGAMGYVACAQEIMAQSFEQGIDFSSVVCVSGSGGMH (SEQ ID NO: 245) AGLITGFSGTQSHIPVIGINVSRGKAEQEEKVAKLVDETSA
HVGIPNFISRDAVTCFDEYVGPGYALPTPEMVEAVQLLAK TEGILLDPVYTGKAVAGLIDLIRKGKFNKEDNILFVHSGGSP
ALYANTSLFA D-cisteína dessulfidrase MNLAKFPRKKYTESYTPIEKLNNFSEALGGPTIYFKRDDLL (ACC deaminase nativa GLTAGGNKTRKLEFLVADAEAKGADTLITAGGIQSNHCRL 1b) TLAAAVKEKMKCILVLEEGLEPEEKPDFNGNYFLYHLLGA Com mutações ENVIVVPNGADLMEEMHKVAKEVSEKGNTPYVIPVGGSN Bacillus thuringiensis PTGAMGYVACAQEIMAQSFDQGIDFSTVVCVSGSAGMHA (SEQ ID NO: 246) GLITGFAGTQSHIPVIGINVSRGKAEQEEKVAKLVDETSAH
VGIPNFIPRDAVTCFDEYVGPGYALPTPEMVEAVQLLAKT EGILLDPVYEGKAVAGLIDLIKKGTFNKEDNILFVHLGGSPA
LYANTSLFA D-cisteína dessulfidrase MNLAKFPRKKYTESYTPIEKLNHFSEVLGGPSIYFKRDDLL (ACC deaminase nativa GLTAGGNKTRKLEFLVADAQAKGVDTLITAGGIQSNHCRL 2b) TLAAAVKEKMKCILVLEEGLEPEEKPDFNGNYFLYHLLGA Com mutações ENVIVVPNGTDLMDEMQKVAKEVTEKGHTPYVIPVGGSN Bacillus pseudomycoides PTGAMGYIACAEEIMAQSFEQGIDFNAVVCVSGSGGMHA (SEQ ID NO: 247) GLITGFYGRQTGIPIIGMNVSRGKAEQEEKVCKLVQETSA
HVGIPNSIPREAVTCFDEYVGPGYALPTPEMVEAVQLLAK TEGILLDPVYEGKAVAGLIDIIRKGTFKKEDNILFVHLGGSP
ALYANTSLFS D-cisteína dessulfidrase MNLAKFPRKKYTESYTPIEKLNNFSEVLGGPTIYFKRDDLL (ACC deaminase nativa GLTAGGNKTRKLEFLVADAQAKGADTLITAGGIQSNHCRL 3b) com mutações TLAAAVKEKMKCILVLEEGLEPEEKPDFNGNYFLYHLLGA Bacillus thuringiensis ENVIVVPNGADLMEEMHKVAKEVSEKGNTPYVIPVGGSN (SEQ ID NO: 248) PTGAMGYVACAQEIMAQSFEQGIDFSSVVCVSGSGGMH
AGLITGFAGTQSHIPVIGINVSRGKAEQEEKVAKLVDETSA HVGIPNFISRDAVTCFDQYVGPGYALPTQEMVEAVQLLAK TEGILLDPVYEGKAVAGLIDLIKKGTFNKEDNILFVHLGGSP
ALYANTSLFA ACC desaminase MNLAKFPRKKYTESYTPIEKLNNFSEALGGPTIYFKRDDLL (D-cisteína dessulfidrase) GLTAGGNKTRKLEFLVADAQEKGADTLITAGGIQSNHCRL Bacillus thuringiensis, com TLAAAVKEKMKCILVLEEGLEPEEKRDFNGNYFLYHLLGA mutações) ENVIVVPNGADLMEEMNKVAKEVSEKGSTPYVIPVGGSN (CÓDIGO ID: D406) PTGAMGYVACAQEIMAQSFEQGIDFSSVVCVSGSGGMH (SEQ ID NO: 249) AGLITGFSGTQSHIPVIGINVSRGKAEQEEKVAKLVDETSA
HVGIPNFISRDAVTCFDEYVGPGYALPTPEMVEAVQLLAK TEGILLDPVYEGKAVAGLIDLIRKGKFNKEDNILFVHLGGSP ALYANTSLFA
2 FOSFOLIPASES
[0331] As fosfolipases são enzimas que clivam os fosfolipídios. Diferentes tipos de fosfolipases clivam fosfolípidos em posições diferentes. As fosfolipases A1, A2 e B clivam as cadeias acil SN-1 e/ou SN-2, resultando na liberação de ácidos graxos e lisofosfolipídios. A fosfolipase C (PLC) e a fosfolipase D (PLD) atuam no grupo principal do fosfolípido. PLCs clivam fosfolipídios em diacilglicerídeos e fosfatos do grupo principal. Os PLDs clivam fosfolipídios em ácido fosfatídico e no grupo principal. Muitas fosfolipases estão associadas à membrana. No entanto, algumas fosfolipases são secretadas e outras localizadas intracelularmente. As fosfolipases em geral desempenham papéis importantes nas vias de transdução de sinal e podem ser encontradas em uma ampla gama de organismos, incluindo bactérias, leveduras, plantas, animais e vírus.
[0332] A fosfolipase C (EC 3.1.4.3) divide os fosfolípidos imediatamente antes do grupo fosfato em diacilgliceróis e o correspondente grupo principal fosfatos. A fosfolipase C é caracterizada pelo local de clivagem no fosfolipídeo (a ligação fósforo-oxigênio no lado da cadeia de carbono da cabeça do fosfato), que a distingue de outras fosfolipases. Os ativadores gerais da classe de enzimas PLC incluem tipicamente subunidades de proteína G heterotriméricas, proteína tirosina cinases, pequenas proteínas G, cálcio (Ca2+) e fosfolipídios.
[0333] A fosfolipase D (EC 3.1.4.4) é outra enzima da superfamília da fosfolipase. O principal substrato da fosfolipase D (PLD) é a fosfatidilcolina, que é hidrolisada para produzir uma molécula de sinal ácido fosfatídico e colina solúvel. A fosfolipase D está envolvida no tráfico de membranas, reorganização citoesquelética, endocitose mediada por receptores, exocitose e migração celular.
[0334] No solo, as fosfolipases podem decompor fosfolipídios naturalmente no solo (por exemplo, fosfolipídios de detritos de plantas e/ou micróbios lisados) e liberar grupos de ácidos graxos e fosfolipídeos. Os grupos fosfolipídicos atuam como reservatórios naturais de excesso de fosfato, que é um nutriente extraível valioso para plantas e micróbios, e a conversão de fosfolipídios em ácido fosfatídico por fosfolipases é a primeira etapa antes que o grupo fosfato possa ser liberado da molécula.
[0335] Além disso, as plantas secretam fosfolipídios da calota radicular durante o desenvolvimento das raízes na rizosfera. Esses fosfolipídios, juntamente com polissacarídeos e monossacarídeos complexos, recrutam micróbios e fungos benéficos para as raízes/rizosfera da planta e também fornecem uma fonte de nutrientes para os micróbios. As plantas também usam os fosfolipídios segregados como tensoativos segregados naturais, o que permite à planta o acesso a nutrientes adicionais que estão ligados ao solo, como o fosfato. A conversão de fosfolipídios em ácido fosfatídico mantém as propriedades do tensoativo, permitindo simultaneamente a liberação de nutrientes no solo.
[0336] As fosfolipases podem ser usadas para qualquer um dos propósitos de estimular o crescimento da planta ou promover a saúde da planta aqui descritos, mas são especialmente adequados para estimular o crescimento da planta, aumentar a captação de nutrientes e/ou aumentar o desenvolvimento e a nodulação das raízes. O aumento da nodulação das raízes aumenta a capacidade da planta de formar relações simbióticas com microrganismos fixadores de nitrogênio no solo, resultando em aumento da captação de nitrogênio e aumento das taxas de crescimento. Esses efeitos também levam à diminuição da suscetibilidade a estresses ambientais, como a seca.
[0337] Para facilitar a referência, as sequências ilustrativas de aminoácidos fosfolipase são fornecidas na Tabela 4 abaixo, juntamente com suas SEQ ID NOs. TABELA 4. SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS PARA
FOSFOLIPASES Enzima (SEQ ID NO) Sequência de aminoácidos
Fosfolipase C HENDGGQRFGVIPRW Bacillus thuringiensis SAEDKHKEGVNSHLWIVNRAIDIMSRNTTLVKQDRVA (CÓDIGO ID: E143) LLNEWRTELENGIYAADYENPYYDNSTFASHFYDPDN (SEQ ID NO: 250) GKTYIPYAKQAKETGAKYFKLAGESYKNKDMQQAFFY
LGLSLHYLGDVNQPMHAANFTNLSYPQGFHSKYENF VDTIKDNYKVTDGNGYWNWKGTNPEDWIHGAAVVAK QDYAGIVNDNTKDWFVRAAVSQEYADKWRAEVTPM
TGKRLMDAQRVTAGYIQLWFDTYGDR Fosfolipase C SAEDKHKEGVNSHLWIVNRAIDIMSRNTTLVKQDRVA Bacillus thuringiensis LLNEWRTELENGIYAADYENPYYDNSTFASHFYDPDN (sem propeptídeo) GKTYIPYAKQAKETGAKYFKLAGESYKNKDMQQAFFY (CÓDIGO ID: E144) LGLSLHYLGDVNQPMHAANFTNLSYPQGFHSKYENF (SEQ ID NO: 251) VDTIKDNYKVTDGNGYWNWKGTNPEDWIHGAAVVAK
QDYAGIVNDNTKDWFVRAAVSQEYADKWRAEVTPM
TGKRLMDAQRVTAGYIQLWFDTYGDR Fosfolipase C HENDGGQRFGVIPRWSAEDKHKEGVNSHLWIVNRAI (Fosfolipase C DIMSRNTTLVKQDRVALLNEWRTELENGIYAADYENP dependente de zinco YYDNSTFASHFYDPDNGKTYIPYAKQAKETGAKYFKL (toxina alfa)) AGESYKNKDMKQAFFYLGLSLHYLGDVNQPMHAANF
[0338] Bacillus TNLSYPQGFHSKYENFVDTIKDNYKVTDGNGYWNWK thuringiensis serovar GTNPEDWIHGAAVVAKQDYAGIVNDNTKDWFVRAAV israelensis 4T7 SQEYADKWRAEVTPMTGKRLMDAQRVTAGYIQLWF (SEQ ID NO: 252) DTYGNR Hidrólise da fosfolipase C ASTNQNDTLKVMTHNVYMLSTNLYPNWGQTERADLI ((nSMase) da GAADYIKNQDVVILNEVFDNSASDRLLGNLKKEYPNQ esfingomielina em TAVLGRSSGSEWDKKLGNYSSSTPEDGGVAIVSKWP ceramida e fosforilcolina) IAEKIQYVFAKGCGPDNLSNKGFVYTKIKKNDRFIHVIG Bacillus thuringiensis THLQAEDSMCGKTSPASVRTNQLKEIQDFIKNKNIPN serovar israelensis 4T7 NEYVLIGGDMNVNKINAENKNDSEYTSMFKTLNASVP (SEQ ID NO: 253) SYTGHTATWDATTNSIAKYNFPDSPAEYLDYIIASKDH
ANPSYIENKVLQPKSPQWTVTSWFQKYTYNDYSDHY
PVEATISMK Fosfolipase C (fosfolipase HENDGGSKIKIVHRWSAEDKHKEGVNSHLWIVNRAIDI C dependente de zinco MSRNTTLVKQDRVAQLNEWRTELENGIYAADYENPY (toxina alfa)) YDNSTFASHFYDPDNGKTYIPFAKQAKETGAKYFKLA Bacillus cereus ATCC GESYKNKDMKQAFFYLGLSLHYLGDVNQPMHAANFT 10987 NLSYPQGFHSKYENFVDTIKDNYKVTDGNGYWNWK (SEQ ID NO: 254) GTNPEEWIHGAAVVAKQDYSGIVNDNTKDWFVKAAV
SQEYADKWRAEVTPMTGKRLMDAQRVTAGYIQLWF
DTYGDR Fosfolipase C DGKIDGTGTHAMIVTQGVSILENDLSKNEPESVRKNLE Cepa de Clostridium ILKENMHELQLGSTYPDYDKNAYDLYQDHFWDPDTD perfringens 13 (C. welchii) NNFSKDNSWYLAYSIPDTGESQIRKFSALARYEWQR Tipo I GNYKQATFYLGEAMHYFGDIDTPYHPANVTAVDSAG
[0339] (SEQ ID NO: 255) HVKFETFAEERKEQYKINTAGCKTNEDFYADILKNKDF
NAWSKEYARGFAKTGKSIYYSHASMSHSWDDWDYA AKVTLANSQKGTAGYIYRFLHDVSEGNDPSVGKNVKE LVAYISTSGEKDAGTDDYMYFGIKTKDGKTQEWEMD NPGNDFMTGSKDTYTFKLKDENLKIDDIQNMWIRKRK YTAFPDAYKPENIKIIANGKVVVDKDINEWISGNSTYNI
K Fosfolipase D pld55 TTGTPAFLHGVASGDPLPDGVLLWTRVTPTADATPG Streptomyces SGLGPDTEVGWTVATDKAFTNVVAKGSTTATAASDH chromofuscus TVKADIRGLAPATDHWFRFSAGGTDSPAGRARTAPA (CÓDIGO ID: D409) ADAAVAGLRFGVVSCANWEAGYFAAYRHLAARGDLD (SEQ ID NO: 256) AWLHLGDYIYEYGAGEYGTRGTSVRSHAPAHEILTLA
DYRVRHGRYKTDPDLQALHAAAPVVAIWDDHEIANDT WSGGAENHTEGVEGAWAARQAAAKQAYFEWMPVR PAIAGTTYRRLRFGKLADLSLLDLRSFRAQQVSLGDG DVDDPDRTLTGRAQLDWLKAGLKSSDTTWRLVGNSV MIAPFAIGSLSAELLKPLAKLLGLPQEGLAVNTDQWDG YTDDRRELLAHLRSNAIRNTVFLTGDIHMAWANDVPV NAGTYPLSASAATEFVVTSVTSDNLDDLVKVPEGTVS ALASPVIRAANRHVHWVDTDRHGYGVLDITAERAQM DYYVLSDRTQAGATASWSRSYRTRSGTQRVERTYDP
E Fosfolipase C específica HENDGGSKIKIVHRWSAEDKHKEGVNSHLWIVNRAIDI para fosfatidilcolina MSRNKTLVKQDRVALLNEWRTELENGIYAADYENPY Bacillus cereus YDNSTFASHFYDPDNGKTYIPYAKQAKETGAKYFKLA (SEQ ID NO: 257) GESYKNKDMKQAFFYLGLSLHYLGDVNQPMHAANFT
NLSYPQGFHSKYENFVDTIKDNYKVTDGNGYWNWK GTNPEDWIHGAAVVAKQDYAGIVNDNTKDWFVRAAV SQEYADKWRAEVTPMTGKRLMDAQRVTAGYIQLWF
DTYGDR Fosfolipase C específica MRNKKLILKLFICSTIFITFVFALHDKRVVAASSVNELEN para fosfatidilinositol WSKWMQPIPDNIPLARISIPGTHDSGTFKLQNPIKQV Bacillus cereus WGMTQEYDFRYQMDHGARIFDIRGRLTDDNTIVLHH (SEQ ID NO: 258) GPLYLYVTLHEFINEAKQFLKDNPSETIIMSLKKEYED
MKGAENSFSSTFEKNYFVDPIFLKTEGNIKLGDARGKI VLLKRYSGSNESGGYNNFYWPDNETFTTTVNKNVNV TVQDKYKVSYDEKVKSIKDTINETMNNSEDLNHLYINF TSLSSGGTAWNSPYYYASYINPEIAAYIKQENPKRVG
WVIQDYISDKWSPILYQEVIRTNKSL Fosfolipase D (PLD) de MSGGHRVALLQGSAELFSALVADMDAALSDIQFETYI Acidovorax avenae FDCTGSGADIAEALIRAARRGVRVHLVVDGVGTGRLC (SEQ ID NO: 259) SPWPERFEEAGVRMQVYSPLGPLGLLLPRRWRRLH
RKLCVVDGCVLYCGGINVLDDLHDPNHGALESPRFDF AVRVEGRLVEEAGEAMEQVWWRLQATRDARQRRLA DLMCDLRAAAQARQAERLAREAAPGGAAAAHGLRA GLLLRDNLRNRSRIERAYRRAIGNARHEVIIANAYFLP GRKLRHALVLAARRGVRVRLLLQGRYEYFMQYHAAR PVYGALLAAGVEIHEYAPSFLHAKVAVIDAQGEHPWA TVGSSNLDPLSMLLAREANVVVEDAGFARALRARLVD AMEHAGRQLDPQAYGARPWGQRLRDRVAFALMRLA
LWVTGSRY Fosfolipase D clsB MVPLMIMVCFLILLLALDFHFGRKAFEKKAYEPVFSEK Bacillus licheniformis KSDIELIHNGEDLCERLLDDIRQAESSVHVMFYIVKND (CÓDIGO ID: E229) DISLEFLKVLKDKAKSGVCVRLLIDRIGAMKVKKKTLS (SEQ ID NO: 260) GLKQSGVHVFFANKPGFPYFFYRLNARNHRKIAVIDG
KIGYVGGFNIAKEYLGKKAEFGPWKDYHLRMTGEGV ADLQHIFISDFKREAPQAKPANSVFPPLQQGAVTHTT HATKGFSLEEKYISFIEQAKERIMICTPYYIPSPALQQA VLSARERGVIVSVLVPMKPDHPLVKEAAYTHFPALLKA GCYIYRYYRGFYHAKALIVDDRHVMIGTSNFDNRSLFL NDEVNVVIHDKDWTKQFFDVVKESIEHAELLTKERYA
KRPVMQRPVEWLAKSISFFL Fosfolipase C CCDEYLQTPAAPHDIDSKLPHKLS Listeria monocytogenes WSADNPTNTDVNTHYWLFKQAEKILAKDVNHMRANL (CÓDIGO ID: D474) MNELKKFDKQIAQGIYDADHKNPYYDTSTFLSHFYNP (SEQ ID NO: 373) DRDNTYLPGFANAKITGAKYFNQSVTDYREGKFDTAF
YKLGLAIHYYTDISQPMHANNFTAISYPPGYHCAYENY VDTIKHNYQATEDMVAKRFCSDDVKDWLYENAKRAK ADYPKIVNAKTKKSYLVGNSEWKKDTVEPTGARLRDS
QQTLAGFLEFWSKKTNE Fosfolipase C WSADNPTNTDVNTHYWLFKQAEKILAKDVNHMRANL Listeria monocytogenes MNELKKFDKQIAQGIYDADHKNPYYDTSTFLSHFYNP (sem propeptídeo) DRDNTYLPGFANAKITGAKYFNQSVTDYREGKFDTAF (CÓDIGO ID: D475) YKLGLAIHYYTDISQPMHANNFTAISYPPGYHCAYENY (SEQ ID NO: 374) VDTIKHNYQATEDMVAKRFCSDDVKDWLYENAKRAK
ADYPKIVNAKTKKSYLVGNSEWKKDTVEPTGARLRDS
QQTLAGFLEFWSKKTNE Fosfolipase C específica ASSVNELENWSKWMQPIPDNIPLARISIPGTHDSGTFK para fosfatidilinositol de LQNPIKQVWGMTQEYDFRYQMDHGARIFDIRGRLTD Bacillus thuringiensis DNTIVLHHGPLYLYVTLHEFINEAKQFLKDNPSETIIMS (SEQ ID NO: 375) LKKEYEDMKGAEDSFSSTFEKNYFVDPIFLKTEGNIKL
GDARGKIVLLKRYSGSNESGGYNNFYWPDNETFTTT VNKNVNVTVQDKYKVSYDEKVKSIKDTINETMNNSED LNHLYINFTSLSSGGTAWNSPYYYASYINPEIAAYIKQE NPKRVGWVIQDYISDKWSPILYQEVIRANKSLIKE
[0340] As sequências de aminoácidos nativas das fosfolipases das SEQ ID NOs. 250 e 252 incluem a sequência do peptídeo sinal MKKKVLALAAAITLVAPLQSVAFA (SEQ ID NO: 317) no terminal amino da sequência, que precede imediatamente o primeiro aminoácido das SEQ ID NOs. 250 e 252. Esse peptídeo sinal não está incluído nas SEQ ID NOs. 250 e 252. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 317, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino das fosfolipases da SEQ ID NO:
250 ou 252, ou no terminal amino de qualquer um dos outros enzimas ou proteínas expansinas aqui descritas. Quando o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 317 está incluído no terminal amino da fosfolipase da SEQ ID NO: 250, essa enzima é aqui referida pelos códigos de identificação E95, E62 ou E80.
[0341] A sequência de aminoácidos nativa da fosfolipase da SEQ ID NO: 250 também inclui um propeptídeo (HENDGGQRFGVIPRW, SEQ ID NO: 261). Esse propeptídeo está sublinhado na sequência da SEQ ID NO: 250 mostrada na Tabela 4 acima. Esse propeptídeo pode estar presente, como mostrado na SEQ ID NO: 250 na Tabela 4 acima, ou opcionalmente pode ser removido como mostrado na SEQ ID NO: 251 na Tabela 4 acima.
[0342] A sequência de aminoácidos nativa da fosfolipase da SEQ ID NO: 373 inclui um propeptídeo (CCDEYLQTPAAPHDIDSKLPHKLS, SEQ ID NO: 388). Esse propeptídeo está sublinhado na sequência da SEQ ID NO: 373 mostrada na Tabela 4 acima. Esse propeptídeo pode estar presente, como mostrado na SEQ ID NO: 373 na Tabela 4 acima, ou pode opcionalmente ser removido como mostrado na SEQ ID NO: 374 na Tabela 4 acima.
[0343] A sequência de aminoácidos nativa da fosfolipase da SEQ ID NO: 253 inclui o peptídeo sinal MKGKLLKGVLSLGVGLGALYSGTSAQAE (SEQ ID NO: 318) no terminal amino da sequência, imediatamente anterior ao primeiro aminoácido da SEQ ID NO:
253. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 253. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 318, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da fosfolipase da SEQ ID NO: 253, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas da expansina aqui descrito.
[0344] A sequência de aminoácidos nativa da fosfolipase da SEQ ID NO: 254 inclui o peptídeo sinal MKKKVLALAAAITVVAPLQSVAFA (SEQ ID NO: 319) no terminal amino da sequência, imediatamente antes do primeiro aminoácido da SEQ ID NO: 254. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 254. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 319, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da fosfolipase da SEQ ID NO: 254, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas de expansina descritas aqui.
[0345] A sequência de aminoácidos nativa da fosfolipase de SEQ ID NO: 255 inclui o peptídeo sinal MKRKICKALICATLATSLWAGASTKVYAW (SEQ ID NO: 320) no terminal amino da sequência, que precede imediatamente o primeiro aminoácido da SEQ ID NO:
255. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 255. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 320, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da fosfolipase da SEQ ID NO: 255, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas da expansina aqui descrito.
[0346] A sequência de aminoácidos nativa da fosfolipase da SEQ ID NO: 256 inclui o peptídeo sinal MLAGPLAAALPARA (SEQ ID NO: 321) no terminal amino da sequência, imediatamente antes do primeiro aminoácido da SEQ ID NO: 256. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 256. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 321, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da fosfolipase da SEQ ID NO: 256 ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas da expansina aqui descrito.
[0347] Alternativamente, o peptídeo sinal MTSRYRSSEAHQGLASFSPRRRTVVKAAAATAVLAGPLAAALPARA (SEQ ID NO: 322) pode opcionalmente ser adicionado à SEQ ID NO: 256, no terminal amino da sequência, imediatamente antes do primeiro aminoácido da SEQ ID NO: 256. O peptídeo sinal da SEQ ID NO: 322 também pode opcionalmente ser incluído no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas de expansina aqui descritas.
[0348] A sequência de aminoácidos nativa da fosfolipase da SEQ ID NO: 257 inclui o peptídeo sinal MKKKVLALAAAITLVAPLQNVAFA (SEQ ID NO: 323) no terminal amino da sequência, imediatamente antes do primeiro aminoácido da SEQ ID NO: 257. Este peptídeo sinal não está incluído em SEQ ID NO: 257. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 323, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da fosfolipase da SEQ ID NO: 257 ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas de expansina aqui descritas.
[0349] A sequência de aminoácidos nativa da fosfolipase da SEQ ID NO: 373 inclui o peptídeo sinal MKFKNVVLGMCLTASVLVFPVTIKANA (SEQ ID NO: 376) no terminal amino da sequência, imediatamente antes do primeiro aminoácido da SEQ ID NO: 373. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 373. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 376, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da fosfolipase da SEQ ID NO: 373 ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas da expansina aqui descrito. Quando o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 376 está incluído no terminal amino da fosfolipase da SEQ ID NO: 373, esta enzima é aqui referida pelo código identificação D473.
[0350] A sequência de aminoácidos nativa da fosfolipase da SEQ ID NO: 375 inclui o peptídeo sinal MSNKKLILKLFICSTIFITFVFALHDKQVVA (SEQ ID NO: 377) no terminal amino da sequência, imediatamente antes do primeiro aminoácido da SEQ ID NO: 375. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 375. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 377 ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da fosfolipase da SEQ ID NO: 375 ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas de expansina aqui descritas. Quando o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 377 está incluído no terminal amino da fosfolipase da SEQ ID NO: 375, esta enzima é aqui referida pelo CÓDIGO IDentificação E258. 3 LIPASES
[0351] As lipases são enzimas que exercem sua atividade enzimática nos lipídios, cortando as cadeias de ácidos graxos de moléculas lipídicas maiores, como triglicerídeos. As lipases são uma classe de enzimas que têm a capacidade de atuar na interface entre as fases aquosa e orgânica. As lipases catalisam principalmente a hidrólise de ligações éster em substratos lipídicos insolúveis em água (por exemplo, derivados de comprimento de cadeia acil mais longos).
[0352] As lipases podem ser usadas para qualquer um dos propósitos de estimular o crescimento da planta ou promover a saúde da planta aqui descritos, mas são particularmente adequados para estimular o crescimento da planta e aumentar a absorção de nutrientes. Esses efeitos, por sua vez, levam ao aumento da produção agrícola, ao aumento do vigor no início da estação e à menor suscetibilidade das plantas a estresses no início da estação.
[0353] Para facilitar a referência, as sequências ilustrativas de aminoácidos lipase são fornecidas na Tabela 5 abaixo, juntamente com suas SEQ ID NOs. TABELA 5. SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS PARA
LIPASES Enzima (SEQ ID NO) SEQ ID NO. Lipase 1 (4Q7 BG78_03400) de Bacillus thuringiensis serovar 262 israelensis 4Q7 Lipase 2 (Bsub168 estA) da cepa de Bacillus subtilis da 263 subespécie subtilis 168 Lipase (Burkholderia cepacia) 264 Lipase (Pseudomonas fluorescens) 265 Lipase (Burkholderia stearothermophilus) 266
[0354] A sequência de aminoácidos nativa da lipase da SEQ ID NO: 263 inclui o peptídeo sinal MKFVKRRIIALVTILMLSVTSLFALQPSAKA (SEQ ID NO: 324) no terminal amino da sequência, imediatamente antes do primeiro aminoácido da SEQ ID NO: 263. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 263. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 324, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da lipase da SEQ ID NO: 263, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas da expansina aqui descrito.
[0355] A sequência de aminoácidos nativa da lipase da SEQ ID NO: 264 inclui o peptídeo sinal
MARTMRSRVVAGAVACAMSIAPFAGTTAVMTLATTHAAMAATAP (SEQ ID NO: 325) no terminal amino da sequência, imediatamente antes do primeiro aminoácido da SEQ ID NO: 264. Este peptídeo sinal não está incluído em SEQ ID NO: 264. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 325, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da lipase da SEQ ID NO: 264 ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas de proteínas expansinas aqui descritas.
[0356] A sequência de aminoácidos nativa da lipase da SEQ ID NO: 265 inclui o peptídeo sinal MGIFDYKNLGTEGSKTLFADAMA (SEQ ID NO: 326) no terminal amino da sequência, imediatamente antes do primeiro aminoácido da SEQ ID NO: 265. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 265. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 326, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da SEQ ID NO: 265, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas de expansina aqui descritas. 4 XILANASES
[0357] As xilanases (EC 3.2.1.8) são uma classe de enzimas que atuam no polissacarídeo xilano, um açúcar comum encontrado nas plantas e no solo. Os xilanos consistem em uma cadeia principal de xilose ligada a β-1,4 na qual moléculas individuais de xilose são frequentemente decoradas com ácido metil glucurônico e arabinose. Os arabinoxilanos são as hemiceluloses primárias em tecidos monocotiledôneos maduros. As xilanases catalisam a clivagem das ligações β-1,4 internas entre duas moléculas de xilose nas cadeias principais de polissacarídeos.
[0358] As xilanases podem ser usadas como tratamento de sementes, fornecidas ao meio de crescimento da planta (por exemplo, na aplicação de sulcos ou como uma alteração no solo) ou aplicadas como tratamento foliar nas plantas para gerar cadeias menores de açúcar que podem ser absorvidas pela planta ou usado para alimentar o microbioma circundante.
[0359] Para facilitar a referência, as sequências ilustrativas de aminoácidos de xilanase são fornecidas na Tabela 6 abaixo, juntamente com suas SEQ ID NOs.
TABELA 6. SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS PARA
XILANASES Enzima SEQ ID NO. β-xilanase 3 (CsacDSM8903 2408) 267 (Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903) β-xilanase 2 (Bsub168 xynA) (cepa de Bacillus subtilis subespécie 268 subtilis 168) (CÓDIGO ID: E146) β-xilanase 1 (Bsub168 xynD) (cepa de Bacillus subtilis 269 subespéciesubtilis 168) β-xilanase 4 (Bstearo xynA) 270 Geobacillus stearothermophilus (Bacillus stearothermophilus) Xilanase (Thermomyces lanuginosus) 271 β-xilanase (Neocallimastix patriciarum) 272 Xilanase (Xyn C) (cepa Bacillus subtilis 168) (CÓDIGO ID: E232) 273
[0360] A sequência de aminoácidos nativa da xilanase de SEQ ID NO: 267 inclui o peptídeo sinal MCENLEMLNLSLAKTYKDYFKIGAAVTA (SEQ ID NO: 327) no terminal amino da sequência, que precede imediatamente o primeiro aminoácido da SEQ ID NO: 267. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 267. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 327, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da xilanase da SEQ ID NO: 267, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas da expansina aqui descrito.
[0361] A sequência de aminoácidos nativa da xilanase de SEQ ID NO: 268 inclui o peptídeo sinalMFKFKKNFLVGLSAALMSISLFSATASA (SEQ ID NO: 328) no terminal amino da sequência, que precede imediatamente o primeiro aminoácido da SEQ ID NO: 268. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 268. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 238, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da xilanase da SEQ ID NO: 268 ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas da expansina aqui descrito. Onde a xilanase da SEQ ID NO: 268 inclui o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 328 no seu terminal amino, esta enzima é aqui referida pelo CÓDIGO ID E100.
[0362] A sequência de aminoácidos nativa da xilanase da SEQ ID NO: 269 inclui o peptídeo sinal MRKKCSVCLWILVLLLSCLSGKSAYA (SEQ ID NO: 329) no terminal amino da sequência, imediatamente antes do primeiro aminoácido da SEQ ID NO: 269. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 269. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 329, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da xilanase da SEQ ID NO: 269 ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas da expansina aqui descrito.
[0363] A sequência de aminoácidos nativa da xilanase de SEQ ID NO: 270 inclui o peptídeo sinal MKLKKKMLTLLLTASMSFGLFGATSSA (SEQ ID NO: 330) no terminal amino da sequência, que precede imediatamente o primeiro aminoácido da SEQ ID NO: 270. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 270. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 330, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da xilanase da SEQ ID NO: 270, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas da expansina aqui descrito.
[0364] A sequência de amino ácido nativa sequência da xilanase da SEQ ID NO: 273 inclui o peptídeo sinal MIPRIKKTICVLLVCFTMLSVMLGPGATEVLA (SEQ ID NO: 331) no terminal amino da sequência, que precede imediatamente o primeiro aminoácido da SEQ ID NO: 273. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 273. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 331, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da xilanase da SEQ ID NO: 273, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas da expansina aqui descrito. 5 XILOSIDASES
[0365] As xilosidases (EC 3.2.1.37) são uma classe de enzimas que separam moléculas de xilose únicas de fragmentos mais curtos de xilana, um polissacarídeo comum encontrado nas plantas e no solo. Os xilanos consistem em uma cadeia principal de xilose ligada a β-1,4 na qual moléculas individuais de xilose são frequentemente decoradas com ácido metil glucurônico e arabinose. Os arabinoxilanos são as hemiceluloses primárias em tecidos monocotiledôneos maduros. As xilosidases catalisam a clivagem das ligações β- 1,4 terminais na cadeia principal da xilose dos xilanos.
[0366] As xilosidases podem ser usadas como tratamento de sementes, fornecidas ao meio de crescimento das plantas (por exemplo, na aplicação de sulcos ou emendas no solo) ou aplicadas como tratamento foliar nas plantas para gerar cadeias menores de açúcar que podem ser absorvidas pela planta ou usado para alimentar o microbioma circundante.
[0367] Para facilitar a referência, as sequências ilustrativas de aminoácidos de xilosidase são fornecidas na Tabela 7 abaixo, juntamente com suas SEQ ID NOs. TABELA 7. SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS PARA
XILOSIDASES Enzima SEQ ID NO. Xilosidase (CsacDSM8903 2404) 274 (Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903) Xilosidase (B) (Bacillus pumilus cepa IPO) (CÓDIGO ID: E194) 275 Xilosidase (B) (Bacillus subtilis cepa 168) (CÓDIGO ID: E175) 276 6 LACTONASES
[0368] As lactonases podem ser usadas para qualquer um dos propósitos de estimular o crescimento da planta ou promover a saúde da planta aqui descritos, mas são especialmente adequados para diminuir a suscetibilidade das plantas a patógenos. As lactonases também são descritas como lactilases acil-homoserina e são metaloenzimas produzidas por certas espécies de bactérias. Por exemplo, as lactonases podem ser encontradas em bactérias dos Phyla Bacteriodetes, Firmicutes, Actinobacteria e em bactérias dos gêneros Pseudomonas e Bacillus, entre outras. As lactonases têm como alvo e inativam as lactonas aciladas da homoserina. As lactonases hidrolisam as ligações éster de pequenas moléculas semelhantes a hormônios, comumente conhecidas como homoserina lactonas. Na hidrólise dessas ligações de lactona, a lactonase age para impedir que essas lactonas de homoserina se liguem aos seus alvos regulados pela transcrição e, assim, interferem na detecção do quorum. No entanto, a secreção de lactonase de bactérias que ocorrem naturalmente que colonizam o solo ou as plantas é limitada e induzível e, portanto, seria desejável fornecer níveis mais altos de lactonase ao ambiente de uma planta.
[0369] As lactonases podem ser aplicadas a plantas (por exemplo, foliarmente ou como tratamento de sementes) ou a um meio de crescimento de plantas, a fim de reduzir os níveis de lactonas no ambiente. Sem estar vinculado a nenhuma teoria em particular, acredita-se que essa redução no nível de lactonas possa, por sua vez, levar à redução de doenças das plantas, bem como a um aumento secundário no crescimento e desenvolvimento das plantas.
[0370] Para facilitar a referência, as sequências ilustrativas de aminoácidos da lactonase são fornecidas na Tabela 8 abaixo, juntamente com suas SEQ ID NOs. TABELA 8. SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS PARA
LACTONASES Enzima (SEQ ID NO) SEQ ID NO. Lactonase (AiiA) (Bacillus thuringiensis, cepa B184) (CÓDIGO ID: 277 H51) Lactonase (AiiA) (Bacillus pseudomycoides cepa B30) 278
7 QUITOSANASES
[0371] As quitosanases podem ser usadas para qualquer um dos propósitos de estimular o crescimento da planta ou promover a saúde da planta aqui descritos, mas são especialmente adequados para aumentar a captação de nutrientes e o crescimento da planta. Isso, por sua vez, leva ao aumento da produção agrícola, ao aumento do vigor no início da temporada e à menor suscetibilidade a estresses no início da estação. As quitosanases também são úteis para proteger as plantas dos patógenos.
[0372] Para facilitar a referência, as sequências ilustrativas de aminoácidos da quitosanase são fornecidas na Tabela 9 abaixo, juntamente com suas SEQ ID NOs. TABELA 9. SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS PARA
QUITOSANASES Enzima (SEQ ID NO) SEQ ID NO. Quitosanase (Bsub168 csn) (Bacillus subtilis subespécie Subtilis 279 cepa 168) Quitosanase (Streptomyces espécies N174) 280
[0373] A sequência de aminoácidos nativa da quitosanase de SEQ ID NO: 279 inclui o peptídeo sinal MKISMQKADFWKKAAISLLVFTMFFTLMMSETVFA (SEQ ID NO: 332) no terminal amino da sequência, que precede imediatamente o primeiro aminoácido da SEQ ID NO: 279. Esse peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 279. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 332, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da quitosanase da SEQ ID NO: 279 ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas da expansina aqui descrito.
[0374] A sequência de aminoácidos nativa da quitosanase da SEQ ID NO: 280 inclui o peptídeo sinal MHSQHRTARIALAVVLTAIPASLATAGVGYASTQASTAVK (SEQ ID NO: 333)
no terminal amino da sequência, imediatamente anterior ao primeiro aminoácido da SEQ ID NO: 280. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 280. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 333, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da quitosanase da SEQ ID NO: 280, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas da expansina aqui descrito. 8 GLUCANASES
[0375] As glucanases usam água para quebrar as ligações químicas entre as moléculas individuais de glicose nos glucanos, que são polissacarídeos de cadeia longa. Os glucanos podem ser divididos em dois tipos, alfa glucano, constituído principalmente por cadeias alfa de moléculas de glicose, e beta glucanos, constituídos principalmente por cadeias beta de moléculas de glicose. Os alfa glucanos comuns incluem dextranos, glicogênios, pulalanos e amido. Os alfa glucanos geralmente incluem combinações de alfa 1,4; alfa 1,6 e/ou alfa 1,3 glucanos e ramificações. As glucanases específicas para a clivagem das ligações alfa são chamadas alfa-glucanases. Beta glucanases são específicas para ligações beta entre glucanos. Os beta-glucanos comuns incluem celulose, laminarina, liquenina e zimosan. Beta-glucanos são comumente encontrados com b1,3; ligações b1,4 e/ou b1,6 entre moléculas de glicose. As glucanases podem ser "exo" ou "endo", dependendo da localização da clivagem do polissacarídeo. Alfa, beta, exo- e endo-glucanases são eficazes para estimular o crescimento das plantas.
[0376] β-1,4-endoglucanases compreendem uma classe de enzimas (EC 3.2.1.4), que funcionam na endo-hidrólise das ligações (1→4)-β-D-glucosídicas em celulose, liquenina e cereais β-D-glucanos e, portanto, são eficazes para a decomposição de uma variedade de polissacarídeos que são componentes da parede celular da planta.
[0377] As xiloglucanases (EC 3.2.1.151) compreendem uma classe de enzimas que catalisam a clivagem de oligossacarídeos de xiloglucano. Os xiloglucanos consistem na cadeia principal de glicose ligada a β-1,4, decorada principalmente com xilose ligada a α-1,6. Os xiloglucanos são as hemiceluloses primárias em plantas dicotiledôneas. As xiloglucanases catalisam a endo-hidrólise das ligações β-1,4 internas na cadeia principal da glicose dos xiloglucanos. Isso resulta em misturas específicas de oligossacarídeos resultantes da clivagem em locais específicos, geralmente resíduos de glucosil não ramificados.
[0378] As liquenases (EC 3.2.1.73) são uma classe de enzimas também conhecida como β-1,3-1,4-endoglucanase que catalisa especificamente a clivagem das ligações β-1,4 precedidas por uma ligação β-1,3 em uma espinha dorsal do glucano. Os glucanos ligados às misturas consistem apenas em monômeros de glicose, que estão ligados pelas ligações β-1,4 e β- 1,3. Glucanos ligados mistos ocorrem em sementes monocotiledôneas e nas paredes celulares do desenvolvimento de tecidos monocotiledôneas, como milho e trigo.
[0379] As glucanases podem ser usadas para qualquer um dos propósitos de estimular o crescimento da planta ou promover a saúde da planta aqui descritos, mas são particularmente úteis para aumentar a captação de nutrientes e estimular o crescimento da planta. Isso, por sua vez, leva ao aumento da produção agrícola, ao aumento do vigor no início da temporada e à menor suscetibilidade a estresses no início da estação. As glucanases também podem ser usadas para proteger as plantas de patógenos e reduzir a suscetibilidade a um estresse ambiental em uma planta.
[0380] Para facilitar a referência, as sequências ilustrativas de aminoácidos glucanase são fornecidas na Tabela 10 abaixo, juntamente com suas SEQ ID NOs.
TABELA 10. SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS PARA
GLUCANASES Enzima SEQ ID NO. Endo-1,4-β-D-glucanase (Acidothermus cellulolyticus) 281 Endoglucanase I (Trichoderma reesei) 282 Endoglucanase II (Trichoderma reesei) 283 Endoglucanase IV (Trichoderma reesei) 284 Endoglucanase V (Trichoderma reesei) 285 Endoglucanase VII (Trichoderma reesei) 286 beta-1,4-endoglucanase (Trichoderma reesei) 287 Celobio-hidrolase I (Trichoderma reesei) 288 Celobio-hidrolase II (Trichoderma reesei) 289 beta-glucosidase I (Trichoderma reesei) 290 beta-glucosidase II (Trichoderma reesei) 291 exo-1,3-β-D-glucanase (Aspergillus oryzae) 292 Endoglucanase β-1,4 (Bacillus subtilis subespécie Subtilis cepa 293 168) (CÓDIGO ID: E112) Endoglucanase B1,4 294 (Bacillus subtilis subespécie Subtilis cepa 168, sem domínio de ligação a carboidratos) Liquenase (Bsub 168 bglS) (Bacillus subtilis subespécie Subtilis 295 cepa 168) Liquenase (β-1,3-1,4-endoglucanase) licB (Código ID: D436) 296 (Clostridium thermocellum ATCC 27405) Beta-(1,3) endoglucanase (BglH) (Bacillus circulans cepa 297 IAM1165) Beta-(1,3) glucosidase (GclA) (Bacillus circulans cepa WL-12) 298 Xiloglucanase XG5 (domínio catalítico) (Paenibacillus pabuli) 299 (CÓDIGO ID: D381) Xiloglucanase XG12 (domínio catalítico) (Bacillus licheniformis) 300 (CÓDIGO ID: E149) β-1,3-D-glucanase (Helix pomatia) 301 Amilase (amyE) (Bacillus subtilis 168) 302
[0381] A sequência de aminoácidos nativa da glucanase de SEQ ID NO: 293 inclui o peptídeo sinal MKRSISIFITCLLITLLTMGGMIASPASA (SEQ ID NO: 334) no terminal amino da sequência, que precede imediatamente o primeiro aminoácido da SEQ ID NO: 293 Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 293. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 334, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da glucanase da SEQ ID NO: 293, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas da expansina aqui descrito. Quando o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 334 está incluído no terminal amino da SEQ ID NO: 293, esta enzima é aqui referida pelo CÓDIGO ID E94.
[0382] O domínio de ligação a carboidratos pode opcionalmente ser removido da glucanase da SEQ ID NO: 293 truncando os últimos 167 aminoácidos da proteína. A SEQ ID NO: 294 fornece a sequência para esta glucanase em que o domínio de ligação a carboidratos foi removido. O peptídeo sinal nativo (SEQ ID NO: 334) não está incluído na SEQ ID NO: 294. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 334, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da glucanase da SEQ ID NO: 294. Quando o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 334 está incluído no terminal amino da SEQ ID NO: 294, esta enzima é aqui referida pelo CÓDIGO ID EE113.
[0383] A sequência de aminoácidos nativa da glucanase de SEQ ID NO: 295 inclui o peptídeo sinal MPYLKRVLLLLVTGLFMSLFAVTATASA (SEQ ID NO: 335) no terminal amino da sequência, que precede imediatamente o primeiro aminoácido da SEQ ID NO:
295. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 295. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 335, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da glucanase da SEQ ID NO: 295, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas da expansina aqui descrito. Quando o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 335 está incluído no terminal amino da SEQ ID NO: 295, esta enzima é aqui referida pelo CÓDIGO ID E111.
[0384] A sequência de aminoácidos nativa da glucanase da SEQ ID NO: 296 inclui o peptídeo sinal MKNRVISLLMASLLLVLSVIVAPFYKA (SEQ ID NO: 336) no terminal amino da sequência, imediatamente antes do primeiro aminoácido da SEQ ID NO: 296. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 296. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 336, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da glucanase da SEQ ID NO: 296 ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas da expansina aqui descrito.
[0385] A sequência de aminoácidos nativa da glucanase da SEQ ID NO: 297 inclui o peptídeo sinal MKRSQTSEKRYRQRVLSLFLAVVMLASIGLLPTSKVQA (SEQ ID NO: 337) no terminal amino da sequência, imediatamente antes do primeiro aminoácido da SEQ ID NO: 297. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 297. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 337, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da glucanase da SEQ ID NO: 297, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas da expansina aqui descrito.
[0386] A sequência de aminoácidos nativa da glucanase de SEQ ID NO: 298 inclui o peptídeo sinal MKPSHFTEKRFMKKVLGLFLVVVMLASVGVLPTSKVQA (SEQ ID NO: 338) no terminal amino da sequência, que precede imediatamente o primeiro aminoácido da SEQ ID NO: 298. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 298. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 338, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da glucanase da SEQ ID NO: 298, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas da expansina aqui descrito.
[0387] A sequência de aminoácidos nativa da glucanase da SEQ ID NO: 299 inclui o peptídeo sinal MFKKWKKFGISSLALVLVAAVAFTGWSAKASA (SEQ ID NO: 339) no terminal amino da sequência, imediatamente anterior ao primeiro aminoácido da SEQ ID NO: 299. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 299. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 339, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da glucanase da SEQ ID NO: 299 ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas de expansina aqui descritas.
[0388] A sequência de aminoácidos nativa da glucanase da SEQ ID NO: 300 inclui o peptídeo sinal
MKNNHLLKSILLWGAVCIIVLAGPLSAFA (SEQ ID NO: 340) no terminal amino da sequência, imediatamente antes do primeiro aminoácido da SEQ ID NO: 300. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 300. No entanto, o peptídeo sinal de SEQ ID NO: 340, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da glucanase da SEQ ID NO: 300 ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas de expansina aqui descritas.
[0389] A sequência de aminoácidos nativa da glucanase de SEQ ID NO: 302 inclui o peptídeo sinal MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASA (SEQ ID NO: 341) no terminal amino da sequência, que precede imediatamente o primeiro aminoácido da SEQ ID NO: 302. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 302. No entanto, o peptídeo sinal de SEQ ID NO: 341, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da glucanase da SEQ ID NO: 302, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas de expansina aqui descritas. 9 PROTEASES
[0390] As proteases podem ser usadas para qualquer um dos propósitos de estimular o crescimento da planta ou promover a saúde da planta aqui descritos, mas são particularmente úteis para aumentar a captação de nutrientes e estimular o crescimento da planta. Isso, por sua vez, leva ao aumento da produção agrícola, ao aumento do vigor no início da temporada e à menor suscetibilidade a estresses no início da estação. As proteases também são úteis para proteger as plantas dos patógenos.
[0391] Para facilitar a referência, as sequências ilustrativas de aminoácidos de protease são fornecidas na Tabela 11 abaixo, juntamente com suas SEQ ID NOs. TABELA 11. SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS PARA
PROTEASES Enzima SEQ ID NO.
Protease 1 (Bsub168 aprX) (Bacillus subtilis subespécie Subtilis 303 cepa 168) Protease 2 (Bsub168 vpr) (Bacillus subtilis subespécie Subtilis 304 cepa 168) Protease 3 (Engyodontium album (Tritirachium album)) 305 Protease (aminopeptidase) (Aspergillus saitoi) 306
[0392] A sequência de aminoácidos nativa da protease de SEQ ID NO: 304 inclui o peptídeo sinal MKKGIIRFLLVSFVLFFALSTGITGVQA (SEQ ID NO: 342) no terminal amino da sequência, que precede imediatamente o primeiro aminoácido da SEQ ID NO: 304. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 304. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 342, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da protease da SEQ ID NO: 304, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas da expansina aqui descrito.
[0393] A sequência de aminoácidos nativa da protease da SEQ ID NO: 306 inclui o peptídeo sinal MVVFSKTAALVLGLSTAVSA (SEQ ID NO: 343) no terminal amino da sequência, imediatamente antes do primeiro aminoácido da SEQ ID NO: 306. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 306. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 343, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da protease da SEQ ID NO: 306, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou expansina proteínas aqui descritas. 10 MANANASES
[0394] As mananases (EC 3.2.1.78) são uma classe de enzimas que catalisam a clivagem das ligações β-1,4 internas entre unidades de monossacarídeos em polissacarídeos de manose/glicose da cadeia principal, como mananos. Os mangananos são constituintes menores da parede celular de plantas superiores e consistem em uma cadeia principal de manose ligada a β-1,4, que pode conter monômeros de glicose ligados a β-1,4. Os monômeros de manose individuais podem ainda ser decorados com monômeros de galactose. Os pequenos açúcares que são liberados dos polissacarídeos pela ação das mananases podem ser absorvidos pelas plantas como fontes de carbono e também podem alimentar os micróbios inerentes que cercam a planta.
[0395] Para facilitar a referência, as sequências ilustrativas de aminoácidos da mananase são fornecidas na Tabela 12 abaixo, juntamente com suas SEQ ID NOs. TABELA 12. SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS PARA
MANANASES Enzima SEQ ID NO. Mananase (man5A) (Bacillus circulans) (CÓDIGO ID: E196) 307 Mananase (gmuG) (Bacillus subtilis cepa 168) (CÓDIGO ID: 308 E177)
[0396] A sequência de aminoácidos nativa da mananase da SEQ ID NO: 307 inclui o peptídeo sinal MAKLQKGTILTVIAALMFVILGSAAPKAAA (SEQ ID NO: 344) no terminal amino da sequência, imediatamente anterior ao primeiro aminoácido da SEQ ID NO:
307. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 307. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 344, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da mananase da SEQ ID NO: 307 ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou expansina proteínas aqui descritas.
[0397] A sequência de aminoácidos nativa da mananase da SEQ ID NO: 308 inclui o peptídeo sinal MFKKHTISLLIIFLLASAVLAKPIEA (SEQ ID NO: 345) no terminal amino da sequência, imediatamente antes do primeiro aminoácido da SEQ ID NO: 308. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 308. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 345, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da mananase da SEQ ID NO: 308 ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou expansina proteínas aqui descritas. 11 PECTINASES
[0398] As pectinases atuam na pectina e nos polissacarídeos relacionados para liberar pequenos açúcares. Especificamente, as pectina-liases (EC 4.2.2.10), também denominadas pectolases, e as endopoligalacturonases (EC 3.2.1.15) são duas classes de enzimas que catalisam a clivagem das ligações β-1,4 internas nas cadeias principais de galacturonan. Os galacturonanos são encontrados dentro das paredes celulares das plantas. No entanto, eles são conhecidos principalmente como pectina, que é o principal constituinte da lamela média. Os galacturonanos consistem principalmente em monômeros de ácido galacturônico ligados a α-1,4, que podem ser esterificados e extensivamente decorados. Os pequenos açúcares que são liberados dos polissacarídeos pela ação das pectinases podem ser absorvidos pelas plantas como fonte de carbono e também podem alimentar os micróbios inerentes à planta.
[0399] Para facilitar a referência, as sequências ilustrativas de aminoácidos da pectinase são fornecidas na Tabela 13 abaixo, juntamente com suas SEQ ID NOs. TABELA 13. SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS PARA
PECTINASES Enzima SEQ ID NO. Pectolase (endopoligalacturonase) (Aspergillus niger cepa SC323) 309 Pectina-liase pelB (Bacillus subtilis cepa 168) (CÓDIGO ID: E176) 310
[0400] A sequência de aminoácidos nativa da pectolase da SEQ ID NO: 309 inclui o peptídeo sinal MPSAKPLFCLATLAGAALA (SEQ ID NO: 346) no terminal amino da sequência, imediatamente antes do primeiro aminoácido da SEQ ID NO: 309. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 309. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 346, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da pectolase da SEQ ID NO: 309 ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou expansina proteínas aqui descritas. Onde a pectolase da SEQ ID NO: 309 inclui o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 346 no seu terminal amino, esta enzima é aqui referida pelo Código ID D405.
[0401] A sequência de aminoácidos nativa da pectolase da SEQ ID NO: 310 inclui o peptídeo sinal MKRLCLWFTVFSLFLVLLPGKALG (SEQ ID NO: 347) no terminal amino da sequência, imediatamente antes do primeiro aminoácido da SEQ ID NO: 310. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 310. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 347, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da pectolase da SEQ ID NO: 310 ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou expansina proteínas aqui descritas. 12 FOSFATASES ÁCIDAS
[0402] As fosfatases ácidas atuam em formas insolúveis e menos solúveis de fosfatos no solo e as liberam para absorção pelas plantas. A fosfatase ácida é uma família de enzimas expressas amplamente em reinos. Essas enzimas catalisam não especificamente a hidrólise de monoésteres e anidridos do ácido fosfórico para produzir fosfato inorgânico e são distintas de outras fosfatases devido à sua atividade em condições ácidas. As fosfatases ácidas vegetais foram localizadas no citosol, vacúolos e paredes celulares e são importantes para a mobilização de fosfatos orgânicos no solo. As fosfatases ácidas hidrolisam fitinas, ATP, fosfatos proteicos, fosfatos nucleotídicos e têm papel nas reações metabólicas gerais.
[0403] Para facilitar a referência, as descrições das sequências ilustrativas de aminoácidos da fosfatase ácida são fornecidas na Tabela 14 abaixo, juntamente com suas SEQ ID NOs. TABELA 14. SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS PARA
FOSFATASES ÁCIDAS Enzima SEQ ID NO. Fosfatase ácida (Triticum aestivum) 311 Fosfatase ácida (Triticum aestivum) 312 Fosfatase ácida (Bacillus thuringiensis) (CÓDIGO ID: E252) 378
[0404] A sequência de aminoácidos nativa da fosfatase ácida da SEQ ID NO: 311 inclui o peptídeo sinal
MARGSMAAVLAVLAVAALRCAPAAA (SEQ ID NO: 348) no terminal amino da sequência, imediatamente antes do primeiro aminoácido da SEQ ID NO: 311. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 311. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 348, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da fosfatase ácida da SEQ ID NO: 311, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas de expansina aqui descritas.
[0405] A sequência de aminoácidos nativa da fosfatase ácida da SEQ ID NO: 312 inclui o peptídeo sinal MRGLGFAALSLHVLLCLANGVSSRRTSSYV (SEQ ID NO: 349) no terminal amino da sequência, imediatamente anterior ao primeiro aminoácido da SEQ ID NO: 312. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 312. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 349, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da fosfatase ácida da SEQ ID NO: 312, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas de expansina aqui descritas.
[0406] A sequência de aminoácidos nativa da fosfatase ácida da SEQ ID NO: 378 inclui o peptídeo sinal MKMKRGITTLLSVAVLSTSLVACSGTPEKTVA (SEQ ID NO: 379) no terminal amino da sequência, imediatamente anterior ao primeiro aminoácido da SEQ ID NO: 378. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 378. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 379, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da fosfatase ácida da SEQ ID NO: 378 ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou expansina proteínas aqui descritas.
[0407] 13 FITASES
[0408] As fitases atuam nos ácidos fitáticos do solo, uma fonte de fosfato livre para o crescimento das plantas. As fitases removem fosfatos selecionados dos ácidos fíticos, e os fosfatos liberados podem ser absorvidos pelas plantas próximas.
[0409] Para facilitar a referência, as descrições das sequências ilustrativas de aminoácidos fitase são fornecidas na Tabela 15 abaixo, juntamente com suas SEQ ID NOs. TABELA 15. SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS PARA
FITASES Enzima SEQ ID NO. Fitase (Triticum aestivum) 313 Fitase (Triticum aestivum) 314 Fitase (Triticum aestivum) 315 Fitase (Bacillus subtilis estirpe 168) (CÓDIGO ID: E246) 380
[0410] A sequência de aminoácidos nativa da fitase de SEQ ID NO: 313 inclui o peptídeo sinal MWWGSLRLLLLLAAAVAA (SEQ ID NO: 350) no terminal amino da sequência, imediatamente antes do primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 313. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 313. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 350, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da fitase da SEQ ID NO: 313, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas de expansina aqui descritas.
[0411] A sequência de aminoácidos nativa da fitase de SEQ ID NO: 314 inclui o peptídeo sinal MWWGSLRLLLLLAAAVAA (SEQ ID NO: 350) no terminal amino da sequência, imediatamente antes do primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 314. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 314. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 350, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da fitase da SEQ ID NO: 314 ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas de expansina aqui descritas.
[0412] A sequência de aminoácidos nativa da fitase de SEQ ID NO: 315 inclui o peptídeo sinal MGIWRGSLPLLLLAA (SEQ ID NO: 351) no terminal amino da sequência, imediatamente antes do primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 315. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 315. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 351, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da fitase da SEQ ID NO: 315 ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou expansina proteínas aqui descritas.
[0413] A sequência de aminoácidos nativa da fitase de SEQ ID NO: 380 inclui o peptídeo sinal MKVPKTMLLSTAAGLLLSLTATSVSA (SEQ ID NO: 354) no terminal amino da sequência, imediatamente antes do primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 380. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 380. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 354, ou outro peptídeo sinal, pode ser opcionalmente incluído no terminal amino da fitase da SEQ ID NO: 380, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas da expansina aqui descrito. 14 PROTEÍNAS EXPANSINAS
[0414] As proteínas expansinas ajudam as paredes das plantas a se expandirem durante o crescimento da planta. Expansinas são, portanto, particularmente úteis em qualquer um dos métodos para estimular o crescimento das plantas aqui descritos.
[0415] Para facilitar a referência, uma sequência ilustrativa de aminoácidos de expansina é fornecida na Tabela 16 abaixo, juntamente com suas SEQ ID NOs. TABELA 16. SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS PARA UMA
EXPANSINA Proteína Expansina SEQ ID NO. Expansina (Bsub168 exlX) (Bacillus subtilis subespécie 316 Subtilis cepa 168)
[0416] A sequência de aminoácidos nativa da proteína expansina da SEQ ID NO: 316 inclui o peptídeo sinal MKKIMSAFVGMVLLTIFCFSPQASA (SEQ ID NO: 352) no terminal amino da sequência, imediatamente antes do primeiro aminoácido da SEQ ID NO: 316. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 316. No entanto, o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 352, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da protease da SEQ ID NO: 316, no terminal amino de qualquer uma das enzimas aqui descritas, ou no terminal amino de outra proteína expansina. 15 PEPTÍDEOS SINAL
[0417] Como descrito acima, muitas das sequências de aminoácidos nativas das enzimas e proteínas da expansina incluem peptídeos sinal. Quando uma proteína de fusão compreende uma enzima ou proteína expansina cuja sequência nativa inclui um peptídeo sinal, a proteína enzima ou expansina pode ser utilizada sem o peptídeo sinal. Alternativamente, o peptídeo sinal nativo (ou outro peptídeo sinal) pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da sequência da enzima ou proteína da expansina, imediatamente antes do primeiro aminoácido da sequência da enzima ou da expansina.
[0418] Além disso, um peptídeo sinal pode opcionalmente ser incluído no terminal amino das enzimas ou proteínas expansinas cujas sequências nativas não incluem um peptídeo sinal.
[0419] Para facilitar a referência, as sequências de aminoácidos para peptídeos sinal ilustrativos que podem ser adicionados a qualquer uma das enzimas ou proteínas de expansina descritas aqui são fornecidas abaixo na Tabela 17. Qualquer um dos peptídeos sinal listadas na Tabela 17 a seguir pode ser adicionado no terminal amino de qualquer uma das enzimas ou proteínas expansina aqui descritas.
TABELA 17. SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS PARA
PEPTÍDEOS SINAL Espécies de Origem para Peptídeo Sinal SEQ ID NO. Bacillus thuringiensis 317 Bacillus thuringiensis serovar israelensis 4Q7 318 Bacillus cereus ATCC 10987 319 Clostridium perfingens 320 Streptomyces chromofuscus 321 Streptomyces chromofuscus 322 Bacillus cereus 323 Bacillus subtilis subespécie subtilis cepa 168 324 Burkholderia cepacia 325 Pseudomonas fluorescens 326 Caldicellulosiruptor saccharolyticus 327 Bacillus subtilis subespécie subtilis cepa 168 328 Bacillus subtilis subespécie subtilis cepa 168 329 Geobacillus stearothermophilus (Bacillus stearothermophilus) 330 Bacillus subtilis estirpe 168 331 Bacillus subtilis subespécie subtilis cepa 168 332 Streptomyces species N174 333 Bacillus subtilis subespécie subtilis cepa 168 334 Bacillus subtilis subespécie subtilis cepa 168 335 Clostridium thermocellum ATCC 27405 336 Bacillus circulans 337 Bacillus circulans 338 Paenibacillus pabuli 339 Bacillus licheniformis 340 Bacillus subtilis 168 341 Bacillus subtilis subespécie subtilis cepa 168 342 Aspergillus saitoi 343 Bacillus circulans 344 Bacillus subtilis cepa 168 345 Aspergillus niger 346 Bacillus subtilis cepa 168 347 Triticum aestivum 348 Triticum aestivum 349 Triticum aestivum 350 Triticum aestivum 351 Bacillus subtilis subespécie subtilis cepa 168 352 Bacillus subtilis subespécie subtilis cepa 168 353 Bacillus subtilis subespécie subtilis cepa 168 354 Bacillus subtilis subespécie subtilis cepa 168 355 Bacillus thuringiensis 356 Bacillus thuringiensis 357 Bacillus thuringiensis 358 Bacillus pseudomycoides 359 Bacillus thuringiensis serovar israelensis 4Q7 360 Listeria monocytogenes 376 Bacillus thuringiensis 377 Bacillus thuringiensis 379
C. PROTEÍNAS DE FUSÃO PARA A EXPRESSÃO EM MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS RECOMBINANTE
[0420] São fornecidas proteínas de fusão compreendendo uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. As proteínas de fusão compreendem ainda uma enzima com atividade ACC desaminase, uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma quitosanase, uma protease, uma glucanase, uma fitase, uma fosfatase ácida, uma pectinase, uma mananase e/ou uma proteína expansina.
[0421] Em qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas, a proteína de fusão pode compreender: (1) uma sequência de alvejamento compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 43% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 são pelo menos cerca de 54%; (2) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1; (3) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1; (4) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 1; (5) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 2; (6) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2 a 35 da SEQ ID NO: 1; (7) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 5 a 35 da SEQ ID NO: 1; (8) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 8 a 35 da SEQ ID NO: 1; (9) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 10 a 35 da SEQ ID NO: 1; (10) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 1; (11) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 3; (12) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 12–27 da SEQ ID NO: 3; (13) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 3; (14) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 4; (15) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 3; (16) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 3; (17) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 8–27 da SEQ ID NO: 3; (18) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 10–27 da SEQ ID NO: 3; (19) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1-38 da SEQ ID NO: 5; (20) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 5; (21) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 5; (22) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 6; (23) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 5; (24) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 5; (25) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 8-38 da SEQ ID NO: 5; (26) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 5; (27) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 5; (28) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 20-38 da SEQ ID NO: 5; (29) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1–28 da SEQ ID NO: 7; (30) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 13–28 da SEQ ID NO: 7; (31) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 7; (32) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 8; (33) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2- 28 da SEQ ID NO: 7; (34) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 7; (35) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 8–28 da SEQ ID NO: 7; (36) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 10–28 da SEQ ID NO: 7; (37) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 9; (38) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 9–24 da SEQ ID NO: 9; (39) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID
NO: 9; (40) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 10; (41) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2- 24 da SEQ ID NO: 9; (42) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 9; (43) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 8–24 da SEQ ID NO: 9; (44) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 11; (45) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 11; (46) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 11; (47) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 12; (48) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2- 33 da SEQ ID NO: 11; (49) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 11; (50) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 11; (51) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 11; (52) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 11; (53) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 13; (54) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 13; (55) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 13; (56) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 14; (57) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 13; (58) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 13; (59) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 13; (60) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 13; (61) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 13; (62) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1-43 da SEQ ID NO: 15; (63) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 28-43 da SEQ ID NO: 15; (64)
uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 15; (65) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 16; (66) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 15; (67) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 15; (68) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 15; (69) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 15; (70) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 15; (71) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 15; (72) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 15; (73) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 17; (74) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 12–27 da SEQ ID NO: 17; (75) uma sequência de alvejamento compreendendo SEQ ID NO: 17; (76) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 18; (77) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 17; (78) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 17; (79) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 8–27 da SEQ ID NO: 17; (80) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 10–27 da SEQ ID NO: 17; (81) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 19; (82) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 19; (83) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 19; (84) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 20; (85) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 19; (86) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 19; (87) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 19; (88) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 19; (89) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 19; (90) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 21; (91) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 21; (92) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 21; (93) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 22; (94) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 21; (95) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 21; (96) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 21; (97) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 21; (98) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 21; (99) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1–24 da SEQ ID NO: 23; (100) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 9 a 24 da SEQ ID NO: 23; (101) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 23; (102) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 24; (103) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 23; (104) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 23; (105) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 8–24 da SEQ ID NO: 23; (106) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1–24 da SEQ ID NO: 25; (107) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 9–24 da SEQ ID NO: 25; (108) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 25; (109) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 26; (110) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 25; (111) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 25; (112) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 8–24 da SEQ ID NO: 25; (113) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 27; (114) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 15-30 da SEQ ID NO: 27; (115) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 27; (116) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 28; (117) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 27; (118) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 27; (119) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 27; (120) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 27; (121) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 29; (122) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 29; (123) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 29; (124) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 30; (125) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 29; (126) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 29; (127) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 29; (128) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 29; (129) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 29; (130) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1–24 da SEQ ID NO: 31; (131) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 9–24 da SEQ ID NO: 31; (132) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 31; (133) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 32; (134) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 31; (135) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 31; (136) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 8–24 da SEQ ID NO: 31; (137) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1–15 da SEQ ID NO: 33; (138) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 33; (139) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 34; (140) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1-16 da SEQ ID NO: 35; (141) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 35; (142) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 36; (143) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1–29 da SEQ ID NO: 43; (144) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 14–29 da SEQ ID NO: 43; (145) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 43; (146) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 44; (147) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2-29 da SEQ ID NO: 43; (148) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 5-29 da SEQ ID NO: 43; (149) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 8–29 da SEQ ID NO: 43; (150) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 10–29 da SEQ ID NO: 43; (151) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 45; (152) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 45; (153) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 45; (154) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 46; (155) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 45; (156) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 5 a 35 da SEQ ID NO: 45; (157) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 8 a 35 da SEQ ID NO: 45; (158) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 45; (159) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 45; (160) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1-43 da SEQ ID NO: 47; (161) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 28-43 da SEQ ID NO: 47; (162) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 47; (163) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 48; (164) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 47; (165) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 47; (166) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 47; (167) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 47; (168) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 47; (169) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 47; (170) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 47; (171) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1-32 da SEQ ID NO: 49; (172) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 17-32 da SEQ ID NO: 49; (173) uma sequência de alvejamento compreendendo SEQ ID NO: 49; (174) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 50; (175) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2-32 da SEQ ID NO: 49; (176) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 5-32 da SEQ ID NO: 49; (177) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 8-32 da SEQ ID NO: 49; (178) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 10-32 da SEQ ID NO: 49; (179) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 15-32 da SEQ ID NO: 49; (180) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 51; (181) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 51; (182) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 51; (183) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 52; (184) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 51; (185) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 51; (186) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 51; (187) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 51; (188) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 51; (189) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 53; (190) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 53; (191) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 53; (192) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 54; (193) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 53; (194) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 53; (195) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 53; (196) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 53; (197) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 53; (198) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 55; (199) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 15-30 da SEQ ID NO: 55; (200) uma sequência de alvejamento compreendendo SEQ ID NO: 55; (201) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 56; (202) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 55; (203) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 55; (204) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 55; (205) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 55; (206) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1–130 da SEQ ID NO: 57; (207) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 115-130 da SEQ ID NO: 57; (208) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 57; (209)
uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 58; (210) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2-130 da SEQ ID NO: 57; (211) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 5-130 da SEQ ID NO: 57; (212) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 10-130 da SEQ ID NO: 57; (213) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 20-130 da SEQ ID NO: 57; (214) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 30-130 da SEQ ID NO: 57; (215) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 40-130 da SEQ ID NO: 57; (216) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 50-130 da SEQ ID NO: 57; (217) uma sequência de alvejamento compreiaminoácidos singulares 60-130 da SEQ ID NO: 57; (218) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 70-130 da SEQ ID NO: 57; (219) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 80-130 da SEQ ID NO: 57; (220) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 90-130 da SEQ ID NO: 57; (221) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 100-130 da SEQ ID NO: 57; (222) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 110-130 da SEQ ID NO: 57; (223) um fragmento de proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 95; (224) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 96; (225) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 97; (226) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 98; (227) uma sequência de alvejamento compreendendo SEQ ID NO: 99; (228) uma sequência de alvejamento compreendendo SEQ ID NO: 100; (229) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 101; (230) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 102; (231) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 103; (232) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 104; (233) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 105; (234) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 106; (235) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 108; (236) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 109; (237) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 110; (238) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 111; (239) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 112; (240) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 113; (241) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 114; (242) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 115; (243) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 116; (244) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 117; (245) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 118; (246) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 119; (247) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 120; (248) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 121; (249) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 22-31 da SEQ ID NO: 1; (250) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 22-33 da SEQ ID NO: 1; (251) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 20-31 da SEQ ID NO: 1; (252) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 14–23 da SEQ ID NO: 3; (253) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 14–25 da SEQ ID NO: 3; (254) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 12–23 da SEQ ID NO: 3; (255) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 59; (256) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 59; (257) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 60; (258) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2 a 30 da SEQ ID NO: 59; (259) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 4-30 da SEQ ID NO: 59; (260) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 6–30 da SEQ ID NO: 59; (261) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 61; (262) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 61; (263) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 61; (264) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 62; (265) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 61; (266) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 61; (267) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 61; (268) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 61; (269) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 63; (270) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 63; (271) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 64; (272) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2–35 da SEQ ID NO: 63; (273) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 5 a 35 da SEQ ID NO: 63; (274) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 8 a 35 da SEQ ID NO: 63; (275) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 10 a 35 da SEQ ID NO: 63; (276) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 63; (277) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 65; (278) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 9 a 24 da SEQ ID NO: 65; (279) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 65; (280) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 66; (281) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 107; (282) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 65; (283) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 65; (284) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 67; (285) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 12–27 da SEQ ID NO: 67; (286) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 67; (287) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 68; (288) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2–27 da SEQ ID NO: 67; (289) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 67; (290) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 10–27 da SEQ ID NO: 67; (291) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1-38 da SEQ ID NO: 69; (292) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 69; (293) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 69; (294) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 70; (295) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 69; (296) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 69; (297) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 69; (298) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 69; (299) uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 72; (300) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 73; (301) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 74; (302) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1-42 da SEQ ID NO: 75; (303) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 27-42 da SEQ ID NO: 75; (304) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 75; (305) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 76; (306) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2-42 da SEQ ID NO: 75; (307) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 5-42 da SEQ ID NO: 75; (308) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 10-42 da SEQ ID NO: 75; (309) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 15-42 da SEQ ID NO: 75; (310) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 20-42 da SEQ ID NO: 75; (311) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 25-42 da SEQ ID NO: 75; (312) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 77; (313) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 9–24 da SEQ ID NO: 77; (314) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 77; (315) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 78; (316) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 77; (317) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 77; (318) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 80; (319) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1-38 da SEQ ID NO: 81; (320) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 81; (321) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 81; (322) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 82; (323) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 81; (324) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 81; (325) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 81; (326) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 81; (327) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 20-38 da SEQ ID NO: 81; (328) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1-34 da SEQ ID NO: 83; (329) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 83; (330) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 84; (331) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 86; (332) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1-28 da SEQ ID NO: 87; (333) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 13–28 da SEQ ID NO: 87; (334) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 87; (335) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 88; (336) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 87; (337) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 87; (338) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 10–28 da SEQ ID NO: 87; (339) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1–28 da SEQ ID NO: 89; (340) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 89; (341) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 90; (342) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 89; (343) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 89; (344) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 10–28 da SEQ ID NO: 89; (345) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1-93 da SEQ ID NO: 91; (346) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 91; (347) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 92; (348) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2-93 da SEQ ID NO: 91; (349) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 10-93 da SEQ ID NO: 91; (350) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 20-93 da SEQ ID NO: 91; (351) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 30-93 da SEQ ID NO: 91; (352) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 40-93 da SEQ ID NO: 91; (353) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 50-93 da SEQ ID NO: 91; (354) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 60-93 da SEQ ID NO: 91; (355) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1–130 da SEQ ID NO: 93; (356) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 93; (357) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 94; (358) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 2-130 da SEQ ID NO: 93; (359) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 10-130 da SEQ ID NO: 93; (360) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 20-130 da SEQ ID NO: 93; (361) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 30-130 da SEQ ID NO: 93; (362) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 122; (363) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 20- 33 da SEQ ID NO: 1; (364) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 21-33 da SEQ ID NO: 1; (365) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 23-31 da SEQ ID NO: 1; (366) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 1–15 da SEQ ID NO: 96; (367) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 96; (368) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 12-25 da SEQ
ID NO: 3; (369) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 13- 25 da SEQ ID NO: 3; (370) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 15–23 da SEQ ID NO: 3; (371) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 1–15 da SEQ ID NO: 97; (372) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 98; (373) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 23-36 da SEQ ID NO: 5; (374) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 23-34 da SEQ ID NO: 5; (375) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 24- 36 da SEQ ID NO: 5; (376) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 26-34 da SEQ ID NO: 5; (377) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 13–26 da SEQ ID NO: 7; (378) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 13–24 da SEQ ID NO: 7; (379) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 14–26 da SEQ ID NO: 7; (380) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 16–24 da SEQ ID NO: 7; (381) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 9–22 da SEQ ID NO: 9; (382) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 9; (383) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 10–22 da SEQ ID NO: 9; (384) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 12-20 da SEQ ID NO: 9; (385) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 1–15 da SEQ ID NO: 105; (386) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 105; (387) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 11; (388) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 18–29 da SEQ ID NO: 11; (389) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 11; (390) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 1–15 da SEQ ID NO: 98; (391) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 98; (392) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 13; (393) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 18–29 da SEQ ID NO: 13; (394) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 13; (395) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 21–29 da SEQ ID NO: 13; (396) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 1–15 da SEQ ID NO: 99; (397) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 99; (398) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 28-41 da SEQ ID NO: 15; (399) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 28-39 da SEQ ID NO: 15; (400) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 29-41 da SEQ ID NO: 15; (401) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 31-39 da SEQ ID NO: 15; (402) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 12-25 da SEQ ID NO: 17; (403) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 13–25 da SEQ ID NO: 17; (404) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 1–15 da SEQ ID NO: 100; (405) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 19; (406) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 18–29 da SEQ ID NO: 19; (407) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 19; (408) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 21–29 da SEQ ID NO: 19; (409) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 21; (410) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 18–29 da SEQ ID NO: 21; (411) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 21; (412) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 21–29 da SEQ ID NO: 21; (413) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 1–15 da SEQ ID NO: 101; (414) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 101; (415) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 9–22 da SEQ ID NO: 23; (416) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 23; (417) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 10–22 da SEQ ID NO: 23; (418) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 12-20 da SEQ ID NO: 23; (419) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 1–15 da SEQ ID NO: 102; (420) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 102; (421) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 9–22 da SEQ ID NO: 25; (422) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 25; (423) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 10–22 da SEQ ID NO: 25; (424) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 12-20 da SEQ ID NO: 25; (425) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 1–15 da SEQ ID NO: 103; (426) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 103; (427) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 15–28 da SEQ ID NO: 27; (428) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 15–26 da SEQ ID NO: 27; (429) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 16–28 da SEQ ID NO: 27; (430) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 18–26 da SEQ ID NO: 27; (431) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 1–15 da SEQ ID NO: 104; (432) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 104; (433) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 33; (434) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 1-11 da SEQ ID NO: 33; (435) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 3-11 da SEQ ID NO: 33; (436) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 1–14 da SEQ ID NO: 35; (437) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 1-12 da SEQ ID NO: 35; (438) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 2-14 da SEQ ID NO: 35; (439) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 14–27 da SEQ ID NO: 43; (440) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 14-25 da SEQ ID NO: 43; (441) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 15–27 da SEQ ID NO: 43; (442) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 20-33 da SEQ ID NO: 45; (443) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 20-31 da SEQ ID NO: 45; (444) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 21-33 da SEQ ID NO: 45; (445) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 1–15 da SEQ ID NO: 106; (446) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 106; (447) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 28-41 da SEQ ID NO: 47; (448) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 28-39 da SEQ ID NO: 47; (449) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 53; (450) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 18–29 da SEQ ID NO: 53; (451) uma sequência de alvejamento consistindo nos aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 53; (452) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 61; (453) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 18–29 da SEQ ID NO: 61; (454) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 61; (455) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 9–22 da SEQ ID NO: 65; (456) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 65; (457) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 10–22 da SEQ ID NO: 65; (458) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1–15 da SEQ ID NO: 107; (459) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 107; (460) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 12–25 da SEQ ID NO: 67; (461) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 12–23 da SEQ ID NO: 67; (462) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 13–25 da SEQ ID NO: 67; (463) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 15–23 da SEQ ID NO: 67; (464) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 23-36 da SEQ ID NO: 69; (465) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 23-34 da SEQ ID NO: 69; (466) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 24-36 da SEQ ID NO: 69; (467) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 26-34 da SEQ ID NO: 69; (468) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 27-40 da SEQ ID NO: 75; (469) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 27-38 da SEQ ID NO: 75; (470) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 9–22 da SEQ ID NO: 77; (471) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 77; (472) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 10–22 da SEQ ID NO: 77; (473) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 12-20 da SEQ ID NO: 77; (474) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 23-36 da SEQ ID NO: 81; (475) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 23-34 da SEQ ID NO: 81; (476) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 24-36 da SEQ ID NO: 81; (477) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 26-34 da SEQ ID NO: 81; (478) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 13–26 da SEQ ID NO: 87; (479) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 13–24 da SEQ ID NO: 87; ou (480) uma sequência de alvejamento compreendendo os aminoácidos 14–26 da SEQ ID NO: 87; (481) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 371; (482) uma sequência de alvejamento compreendendo a SEQ ID NO: 372; (483) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 381; (484) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 382; (485) um fragmento de proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 383; (486) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 384; ou (487) um fragmento de proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 385.
[0422] Por exemplo, a sequência de alvejamento pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 50% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 63%.
[0423] Alternativamente, a sequência de alvejamento pode consistir em uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 50% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 63%.
[0424] A sequência de alvejamento pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 50% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 72%.
[0425] Alternativamente, a sequência de alvejamento pode consistir em uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 50% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 72%.
[0426] A sequência de alvejamento pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 56% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 63%.
[0427] Alternativamente, a sequência de alvejamento pode consistir em uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 56% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 63%.
[0428] A sequência de alvejamento pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 62% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 72%.
[0429] Alternativamente, a sequência de alvejamento pode consistir em uma sequência de amino tendo pelo menos cerca de 62% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 72%.
[0430] A sequência de alvejamento pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 68% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 81%.
[0431] Alternativamente, a sequência de alvejamento pode consistir em uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 68% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 81%.
[0432] A sequência de alvejamento pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 75% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 72%.
[0433] Alternativamente, a sequência de alvejamento pode consistir em uma sequência de amino com pelo menos cerca de 75% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 72%.
[0434] A sequência de alvejamento pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 75% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 81%.
[0435] Alternativamente, a sequência de alvejamento pode consistir em uma sequência de amino com pelo menos cerca de 75% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 81%.
[0436] A sequência de alvejamento pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 81% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 81%.
[0437] Alternativamente, a sequência de alvejamento pode consistir em uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 81% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 81%.
[0438] A sequência de alvejamento pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 81% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 90%.
[0439] Alternativamente, a sequência de alvejamento pode consistir em uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 81% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 90%.
[0440] Por exemplo, a sequência de alvejamento pode consistir em: (a) uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e possuindo pelo menos cerca de 43% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25 –35 é pelo menos cerca de 54%; (b) aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1; (c) aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1; (d) SEQ ID NO: 1; (e) SEQ ID NO: 96; ou (f) SEQ ID NO: 120.
[0441] Em qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas, a proteína de fusão pode compreender uma proteína do exosporium ou um fragmento de proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120 e
121.
[0442] A proteína de fusão pode compreender uma proteína do exosporium ou um fragmento de proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120 e 121.
[0443] A proteína de fusão pode compreender uma proteína do exosporium ou um fragmento de proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120 e 121.
[0444] A proteína de fusão pode compreender uma proteína do exosporium ou um fragmento de proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120 e 121.
[0445] A proteína de fusão pode compreender uma proteína do exosporium ou um fragmento de proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120 e 121.
[0446] Em qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas, a proteína de fusão pode compreender uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 60, 62, 64, 66, 68, 70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 ou 122.
[0447] A proteína de fusão pode compreender uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 60, 62, 64, 66, 68, 70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 ou 122.
[0448] A proteína de fusão pode compreender uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 60, 62, 64, 66, 68, 70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 ou 122.
[0449] A proteína de fusão pode compreender uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 60, 62, 64, 66, 68, 70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 ou 122.
[0450] A proteína de fusão pode compreender uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com
100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 60, 62, 64, 66, 68, 70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 ou 122.
[0451] Em qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas, a proteína de fusão pode compreender uma proteína do exosporium ou um fragmento de proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 381-385.
[0452] A proteína de fusão pode compreender uma proteína do exosporium ou um fragmento de proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 381-385
[0453] A proteína de fusão pode compreender uma proteína do exosporium ou um fragmento de proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 98% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 381-385
[0454] A proteína de fusão pode compreender uma proteína do exosporium ou um fragmento de proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 99% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 381-385
[0455] A proteína de fusão pode compreender uma proteína do exosporium ou um fragmento de proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 381-385.
[0456] Em qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas, a sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium pode compreender a sequência de aminoácidos GXT no seu terminal carboxi, em que X é qualquer aminoácido.
[0457] Em qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas, a sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium pode compreender um resíduo de alanina na posição da sequência de alvejamento que corresponde ao aminoácido 20 da SEQ ID NO: 1.
[0458] Em qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas, a sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium pode compreender ainda um resíduo de metionina, serina ou treonina na posição de aminoácido imediatamente anterior ao primeiro aminoácido da sequência de alvejamento, proteína do exosporium, ou fragmento de proteína do exosporium ou na posição da sequência de alvejamento que corresponde ao aminoácido 20 da SEQ ID NO: 1.
1. PROTEÍNAS DE FUSÃO QUE COMPREENDEM UMA
ENZIMA COM ATIVIDADE DE ACC DESAMINASE
[0459] São fornecidas proteínas de fusão compreendendo uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro recombinante da família Bacillus cereus e uma enzima com atividade de 1-aminociclopropano-1-carboxilato desaminase (ACC desaminase).
[0460] Onde a proteína de fusão compreende uma enzima com atividade de ACC desaminase, a enzima que possui atividade de ACC desaminase pode compreender uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos uma substituição de aminoácidos em relação à sequência de uma enzima D-cisteína desulfidrase de tipo selvagem ou enzima ACC desaminase a partir de uma bactéria do gênero Bacillus, em que a substituição de aminoácidos resulta em aumento da atividade da ACC desaminase em comparação com a atividade da ACC desaminase da enzima D- cisteína dessulfidrase de tipo selvagem ou enzima ACC desaminase nas mesmas condições.
[0461] Por exemplo, a sequência de aminoácidos da enzima pode compreender duas substituições de aminoácidos em relação à sequência da enzima D-cisteína dessulfidrase ou enzima ACC desaminase, em que resultam as substituições de aminoácidos em aumento da atividade da ACC desaminase em comparação com a atividade da enzima do tipo selvagem sob as mesmas condições.
[0462] A sequência de aminoácidos da enzima pode compreender uma substituição do resíduo de treonina na posição 290 da SEQ ID NO: 242 por um resíduo de ácido glutâmico e uma substituição do resíduo de serina na posição 317 da SEQ ID NO: 242 por um resíduo de leucina.
[0463] A sequência de aminoácidos da enzima pode compreender uma substituição do resíduo de treonina na posição 290 da SEQ ID NO: 243 por um resíduo de ácido glutâmico e uma substituição do resíduo serina na posição 317 da SEQ ID NO: 243 por um resíduo de leucina.
[0464] A sequência de aminoácidos da enzima pode compreender uma substituição do resíduo de treonina na posição 290 da SEQ ID NO: 244 por um resíduo de ácido glutâmico e uma substituição do resíduo serina na posição 317 da SEQ ID NO: 244 por um resíduo de leucina.
[0465] A sequência de aminoácidos da enzima pode compreender uma substituição do resíduo de treonina na posição 290 da SEQ ID NO: 245 por um resíduo de ácido glutâmico e uma substituição do resíduo de serina na posição 317 da SEQ ID NO: 245 por um resíduo de leucina.
[0466] A enzima pode compreender SEQ ID NO: 246, 247, 248 ou 249.
[0467] Por exemplo, a enzima pode compreender a SEQ ID NO: 249.
[0468] Alternativamente, a enzima pode consistir em SEQ ID NO: 246, 247, 248 ou 249.
[0469] Por exemplo, a enzima pode consistir na SEQ ID NO: 249.
[0470] Alternativamente ou adicionalmente, a enzima com atividade de ACC desaminase pode compreenderuma enzima Bacillus (por exemplo, uma enzima deBacillus thuringiensis ou uma enzima deBacillus pseudomycoides).
[0471] Alternativamente ou adicionalmente, a enzima com a atividade de ACC desaminase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação a qualquer uma de SEQ ID NOs. 242-245.
[0472] Alternativamente ou adicionalmente, a enzima com a atividade de ACC desaminase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação a qualquer uma de SEQ ID NOs. 242-245.
[0473] Alternativamente ou adicionalmente, a enzima com a atividade de ACC desaminase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação a qualquer uma de SEQ ID NOs. 242-245.
[0474] Alternativamente ou adicionalmente, a enzima com a atividade de ACC desaminase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação a qualquer uma de SEQ ID NOs. 242-245.
[0475] Alternativamente ou adicionalmente, a enzima com a atividade de ACC desaminase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação a qualquer uma de SEQ ID NOs. 242-245.
[0476] Alternativamente ou adicionalmente, a enzima com a atividade de ACC desaminase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação a qualquer uma de SEQ ID NOs. 242-245.
[0477] Alternativamente ou adicionalmente, a enzima com a atividade de ACC desaminase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação a qualquer uma de SEQ ID NOs. 242-245.
[0478] Alternativamente ou adicionalmente, a enzima com a atividade de ACC desaminase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação a qualquer uma de SEQ ID NOs. 242-245.
[0479] A enzima com a atividade de ACC desaminase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 100% de identidade em relação a qualquer uma de SEQ ID NOs. 242-245.
[0480] Por exemplo, a enzima pode compreender a SEQ ID NO: 245.
[0481] Alternativamente, a enzima pode consistir na SEQ ID NO: 245.
2. PROTEÍNAS DE FUSÃO QUE COMPREENDEM
UMA FOSFOLIPASE
[0482] São fornecidas proteínas de fusão compreendendo uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro recombinante da família Bacillus cereus e uma fosfolipase.
[0483] Onde a proteína de fusão compreende uma fosfolipase, a fosfolipase pode compreender uma fosfolipase B.
[0484] Por exemplo, a fosfolipase B pode compreender uma fosfolipase B1.
[0485] Onde a proteína de fusão compreende uma fosfolipase, a fosfolipase pode compreender uma fosfolipase C. A fosfolipase C compreende uma fosfolipase C beta 1, uma fosfolipase C beta 2, uma fosfolipase C beta 3, uma fosfolipase C beta 4, uma fosfolipase C beta 4, uma fosfolipase C delta 1, uma fosfolipase C delta 3, uma fosfolipase C delta 4, uma fosfolipase C épsilon 1, uma fosfolipase C gama 1, uma fosfolipase C gama 2, uma fosfolipase C eta 1, uma fosfolipase C eta 1, uma fosfolipase C eta 2, uma fosfolipase C zeta 1 ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.
[0486] Onde a proteína de fusão compreende uma fosfolipase, a fosfolipase pode compreender uma fosfolipase D. A fosfolipase D compreende uma fosfolipase D1, uma fosfolipase D2, um membro 3 da fosfolipase D, um membro 4 da fosfolipase D, um membro 5 da fosfolipase D,
um membro 6 da fosfolipase D ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.
[0487] Onde a proteína de fusão compreende uma fosfolipase, a fosfolipase pode compreender uma fosfolipase A2. A fosfolipase A2 compreende uma fosfolipase A2 do Grupo IIA, uma fosfolipase A2 do Grupo IIC, uma fosfolipase A2 do Grupo IID, uma fosfolipase A2 do Grupo IIE, uma fosfolipase A2 do Grupo IIF, uma fosfolipase A2 do Grupo III, uma fosfolipase A2 do Grupo IVA, uma fosfolipase A2 do Grupo IVB, uma fosfolipase A2 do Grupo IVC, uma fosfolipase A2 do Grupo IVD, uma fosfolipase A2 do Grupo IVE, uma fosfolipase A2 do Grupo VIF, uma fosfolipase A2 do Grupo V, uma fosfolipase A2 do Grupo VI, uma fosfolipase A2 do Grupo VII, uma fosfolipase A2 do Grupo X, uma fosfolipase A2 do Grupo XIIA, uma fosfolipase A2 do Grupo XIIB, uma fosfolipase A2 do Grupo XV, uma fosfolipase A2 do Grupo XVI, ou uma combinação das mesmas.
[0488] Onde a proteína de fusão compreende uma fosfolipase, a fosfolipase pode compreender uma esterase de 1-alquil-2- acetilglicerofosfocololina.
[0489] Onde a proteína de fusão compreende uma fosfolipase, a fosfolipase pode compreender uma fosfatidilinositol desacilase.
[0490] Onde a proteína de fusão compreende uma fosfolipase, a fosfolipase pode compreender uma fosfolipase C específica para fosfatidilinoslitol. Por exemplo, a fosfolipase C específica para fosfatidilinoslitol pode compreender uma fosfolipase C específica para fosfatidilinoslitol de Bacillus thuringiensis.
[0491] Onde a proteína de fusão compreende uma fosfolipase, a fosfolipase pode compreender uma fosfodiesterase de esfingomielina.
[0492] Onde a proteína de fusão compreende uma fosfolipase, a fosfolipase pode compreender uma esfingomielina fosfodiesterase D.
[0493] Onde a proteína de fusão compreende uma fosfolipase, a fosfolipase pode compreender uma alquilglicerofosfoetanolamina de fosfodiesterase.
[0494] Onde a proteína de fusão compreende uma fosfolipase, a fosfolipase pode compreender uma glicoproteína variante de superfície fosfolipase C.
[0495] Onde a proteína de fusão compreende uma fosfolipase, a fosfolipase pode compreender uma glicosilfosfatidilinositol fosfolipase D.
[0496] Onde a proteína de fusão compreende uma fosfolipase, a fosfolipase pode compreender uma fosfolipase D de N- acetilfosfatidiletanolamina hidrolisante.
[0497] Onde a proteína de fusão compreende uma fosfolipase, a fosfolipase pode compreender uma fosfatidilinositol diacilglicerol- liase.
[0498] Onde a proteína de fusão compreende uma fosfolipase, a fosfolipase pode compreender uma glicosilfosfatidilinositol diacilglicerol-liase.
[0499] Onde a proteína de fusão compreende uma fosfolipase, a fosfolipase pode compreender um domínio de fosfolipase do tipo patatina contendo a proteína 2 (PNPLA2).
[0500] Onde a proteína de fusão compreende uma fosfolipase, a fosfolipase pode compreender um domínio de fosfolipase do tipo patatina contendo a proteína 3 (PNPLA3).
[0501] Onde a proteína de fusão compreende uma fosfolipase, a fosfolipase pode compreender uma fosfolipase de Streptomyces.
[0502] Onde a proteína de fusão compreende uma fosfolipase, a fosfolipase pode compreender uma fosfolipase de Clostridium. Por exemplo, a fosfolipase pode compreender uma fosfolipase de Streptomyces chromofuscus (por exemplo, uma fosfolipase de Streptomyces chromofuscus).
[0503] Onde a proteína de fusão compreende uma fosfolipase, a fosfolipase pode compreender uma fosfolipase de Acidovorax. Por exemplo, a fosfolipase pode compreender uma fosfolipase de Clostridium perfringens (por exemplo, uma fosfolipase C de Clostridium perfringens).
[0504] Onde a proteína de fusão compreende uma fosfolipase, a fosfolipase pode compreender uma fosfolipase de Listeria. Por exemplo, a fosfolipase pode compreender uma fosfolipase de Listeria monocytogenes (por exemplo, uma fosfolipase C de Listeria monocytogenes).
[0505] Onde a proteína de fusão compreende uma fosfolipase, a fosfolipase pode compreender uma fosfolipase de Bacillus cereus. Por exemplo, a fosfolipase pode compreender uma fosfolipase C específica para a fosfatidilcolina de Bacillus cereus ou uma fosfolipase C específica para a fosfatidilinositol de Bacillus cereus.
[0506] Onde a proteína de fusão compreende uma fosfolipase, a fosfolipase pode compreender uma fosfolipase de Bacillus licheniformis.
[0507] Onde a proteína de fusão compreende uma fosfolipase, a fosfolipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 252-260 e 373-375.
[0508] Por exemplo, a fosfolipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 252-260 e 373-375.
[0509] A fosfolipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 252-260 e 373-375.
[0510] A fosfolipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 252-260 e 373-375.
[0511] A fosfolipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 252-260 e 373-375.
[0512] A fosfolipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 252-260 e 373-375.
[0513] A fosfolipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 252-260 e 373-375.
[0514] A fosfolipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 252-260 e 373-375.
[0515] A fosfolipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 252-260 e 373-375.
[0516] Onde a proteína de fusão compreende uma fosfolipase, a fosfolipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 373-375.
[0517] Por exemplo, a fosfolipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 373-375.
[0518] A fosfolipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 373-375.
[0519] A fosfolipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 373-375.
[0520] A fosfolipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 373-375.
[0521] A fosfolipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 373-375.
[0522] A fosfolipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 373-375.
[0523] A fosfolipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 373-375.
[0524] A fosfolipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 373-375.
[0525] Onde a proteína de fusão compreende uma fosfolipase, a fosfolipase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250 ou 251.
[0526] Por exemplo, a fosfolipase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250 ou 251.
[0527] A fosfolipase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250 ou 251.
[0528] A fosfolipase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250 ou 251.
[0529] A fosfolipase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250 ou 251.
[0530] A fosfolipase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250 ou 251.
[0531] A fosfolipase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250 ou 251.
[0532] A fosfolipase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250 ou 251.
[0533] A fosfolipase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250 ou 251.
[0534] Onde a proteína de fusão compreende uma fosfolipase, a fosfolipase pode consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250.
[0535] Por exemplo, a fosfolipase pode consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250.
[0536] Por exemplo, a fosfolipase pode consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250.
[0537] Por exemplo, a fosfolipase pode consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250.
[0538] Por exemplo, a fosfolipase pode consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250.
[0539] Por exemplo, a fosfolipase pode consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250.
[0540] Por exemplo, a fosfolipase pode consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250.
[0541] Por exemplo, a fosfolipase pode consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250.
[0542] A fosfolipase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250.
[0543] Onde a proteína de fusão compreende uma fosfolipase, a fosfolipase pode consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 251.
[0544] Por exemplo, a fosfolipase pode consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 251.
[0545] Por exemplo, a fosfolipase pode consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 251.
[0546] Por exemplo, a fosfolipase pode consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 251.
[0547] Por exemplo, a fosfolipase pode consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 251.
[0548] Por exemplo, a fosfolipase pode consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 251.
[0549] Por exemplo, a fosfolipase pode consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 251.
[0550] Por exemplo, a fosfolipase pode consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 251.
[0551] A fosfolipase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 251.
[0552] Onde a proteína de fusão compreende uma fosfolipase, a fosfolipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256 ou 260.
[0553] Por exemplo, a fosfolipase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256 ou 260.
[0554] A fosfolipase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256 ou 260.
[0555] A fosfolipase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256 ou 260.
[0556] A fosfolipase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256 ou 260.
[0557] A fosfolipase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256 ou 260.
[0558] A fosfolipase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256 ou 260.
[0559] A fosfolipase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256 ou 260.
[0560] A fosfolipase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256 ou 260.
[0561] Onde a proteína de fusão compreende uma fosfolipase, a fosfolipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256.
[0562] Por exemplo, a fosfolipase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256.
[0563] A fosfolipase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256.
[0564] A fosfolipase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256.
[0565] A fosfolipase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256.
[0566] A fosfolipase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256.
[0567] A fosfolipase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256.
[0568] A fosfolipase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256.
[0569] A fosfolipase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256.
3. PROTEÍNAS DE FUSÃO QUE COMPREENDEM
UMA LIPASE
[0570] São fornecidas proteínas de fusão compreendendo uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro recombinante da família Bacillus cereus e uma lipase.
[0571] Onde a proteína de fusão compreende uma lipase, a lipase pode compreender uma lipase de éster carboxílico.
[0572] Onde a proteína de fusão compreende uma lipase, a lipase pode compreender uma alfa lipase de diacilglicerol.
[0573] Onde a proteína de fusão compreende uma lipase, a lipase pode compreender uma beta lipase de diacilglicerol.
[0574] Onde a proteína de fusão compreende uma lipase, a lipase pode compreender uma lipase A.
[0575] Onde a proteína de fusão compreende uma lipase, a lipase pode compreender uma lipase hepática.
[0576] Onde a proteína de fusão compreende uma lipase, a lipase pode compreender uma lipase sensível a hormônios.
[0577] Onde a proteína de fusão compreende uma lipase, a lipase pode compreender uma lipase gástrica.
[0578] Onde a proteína de fusão compreende uma lipase, a lipase pode compreender uma lipase endotelial.
[0579] Onde a proteína de fusão compreende uma lipase, a lipase pode compreender lipase de membro H.
[0580] Onde a proteína de fusão compreende uma lipase, a lipase pode compreender um membro I da família da lipase.
[0581] Onde a proteína de fusão compreende uma lipase, a lipase pode compreender um membro J da família da lipase.
[0582] Onde a proteína de fusão compreende uma lipase, a lipase pode compreender um membro K da família lipase.
[0583] Onde a proteína de fusão compreende uma lipase, a lipase pode compreender um membro M da família lipase.
[0584] Onde a proteína de fusão compreende uma lipase, a lipase pode compreender um membro N da família lipase.
[0585] Onde a proteína de fusão compreende uma lipase, a lipase pode compreender uma lipoproteína lipase.
[0586] Onde a proteína de fusão compreende uma lipase, a lipase pode compreender uma lipase monoglicerídica.
[0587] Onde a proteína de fusão compreende uma lipase, a lipase pode compreender uma proteína relacionada à lipase pancreática 2.
[0588] Onde a proteína de fusão compreende uma lipase, a lipase pode compreender uma proteína relacionada à lipase pancreática 3.
[0589] Onde a proteína de fusão compreende uma lipase, a lipase pode compreender uma lipase de acilglicerol.
[0590] Onde a proteína de fusão compreende uma lipase, a lipase pode compreender uma galactolipase.
[0591] Onde a proteína de fusão compreende uma lipase, a lipase pode compreender uma lipoproteína lipase.
[0592] Onde a proteína de fusão compreende uma lipase, a lipase pode compreender uma lipase de Burkholderia cepacia.
[0593] Onde a proteína de fusão compreende uma lipase, a lipase pode compreender uma lipase Burkholderia stearothermophilus.
[0594] Onde a proteína de fusão compreende uma lipase, a lipase pode compreender a lipase de Pseudomonas.
[0595] Onde a proteína de fusão compreende uma fosfolipase, a fosfolipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 262-266.
[0596] Por exemplo, a lipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 262-266.
[0597] A lipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 262-266.
[0598] A lipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 262-266.
[0599] A lipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 262-266.
[0600] A lipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 262-266.
[0601] A lipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 262-266.
[0602] A lipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 262-266.
[0603] A lipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 262-266.
4. PROTEÍNAS DE FUSÃO QUE COMPREENDEM
UMA XILANASE
[0604] São fornecidas proteínas de fusão compreendendo uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro recombinante da família Bacillus cereus e uma xilanase.
[0605] Onde a proteína de fusão compreende uma xilanase, a xilanase pode compreender uma beta-xilanase.
[0606] Por exemplo, a beta-xilanase pode compreender uma endo-1,4-beta-xilanase de glucuronoarabinoxilano, uma exo-1,4-beta- xilanase, uma endo-1,4-beta-xilanase ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.
[0607] Onde a proteína de fusão compreende uma xilanase, a xilanase pode compreender uma xilanase de Caldicellulosiruptor (por exemplo, uma xilanase de Caldicellulosiruptor saccharolyticus).
[0608] Onde a proteína de fusão compreende uma xilanase, a xilanase pode compreender uma xilanase de Bacillus (por exemplo, uma Bacillus subtilis ou xilanase de Bacillus stearothermophilus).
[0609] Onde a proteína de fusão compreende uma xilanase, a xilanase pode compreender uma xilanase de Neocallimastix (por exemplo, uma xilanase de Neocallimastix patriciarum).
[0610] Onde a proteína de fusão compreende uma xilanase, a xilanase pode compreender uma xilanase de Thermomyces (por exemplo, uma xilanase de Thermomyces lanuginosus).
[0611] Onde a proteína de fusão compreende uma xilanase, a xilanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 267-
273.
[0612] Por exemplo, a xilanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 267-273.
[0613] A xilanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 267-273.
[0614] A xilanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 267-273.
[0615] A xilanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 267-273.
[0616] A xilanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 267-273.
[0617] A xilanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 267-273.
[0618] A xilanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 267-273.
[0619] A xilanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 267-273.
[0620] Onde a proteína de fusão compreende uma xilanase, a xilanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 268 ou 273.
[0621] Por exemplo, a xilanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 268 ou 273.
[0622] A xilanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 268 ou 273.
[0623] A xilanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 268 ou 273.
[0624] A xilanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 268 ou 273.
[0625] A xilanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 268 ou 273.
[0626] A xilanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 268 ou 273.
[0627] A xilanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 268 ou 273.
[0628] A xilanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 268 ou 273.
[0629] Onde a proteína de fusão compreende uma xilanase, a xilanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 268.
[0630] Por exemplo, a xilanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 268.
[0631] A xilanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 268.
[0632] A xilanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 268.
[0633] A xilanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 268.
[0634] A xilanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 268.
[0635] A xilanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 268.
[0636] A xilanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 268.
[0637] A xilanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 268.
5. PROTEÍNAS DE FUSÃO QUE COMPREENDEM
UMA XILOSIDASE
[0638] São fornecidas proteínas de fusão que compreendem uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro recombinante da família Bacillus cereus e uma xilosidase.
[0639] Nos casos em que a proteína de fusão compreende uma xilosidase, a xilosidase pode compreender uma xilosidade de Caldicellulosiruptor saccharolyticus.
[0640] Onde a proteína de fusão compreende uma xilosidase, a xilosidase pode compreender uma xilosidade de Bacillus pumilus.
[0641] Onde a proteína de fusão compreende uma xilosidase, a xilosidase pode compreender uma xilosidade de Bacillus subtilis.
[0642] Onde a proteína de fusão compreende uma xilosidase, a xilosidasepode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 274-276.
[0643] Por exemplo, a xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 274-276.
[0644] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 274-276.
[0645] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 274-276.
[0646] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 274-276.
[0647] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 274-276.
[0648] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 274-276.
[0649] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 274-276.
[0650] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 274-276.
[0651] Onde a proteína de fusão compreende uma xilosidase, a xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 275.
[0652] Por exemplo, a xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 275.
[0653] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 275.
[0654] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 275.
[0655] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 275.
[0656] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 275.
[0657] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 275.
[0658] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 275.
[0659] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 275.
[0660] Onde a proteína de fusão compreende uma xilosidase, a xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 276.
[0661] Por exemplo, a xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 276.
[0662] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 276.
[0663] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 276.
[0664] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 276.
[0665] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 276.
[0666] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 276.
[0667] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 276.
[0668] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 276.
6. PROTEÍNAS DE FUSÃO QUE COMPREENDEM
UMA LACTONASE
[0669] São fornecidas proteínas de fusão compreendendo uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro recombinante da família Bacillus cereus e uma lactonase.
[0670] Onde a proteína de fusão compreende uma lactonase, a lactonase pode compreender uma Bacillus lactonase (por exemplo, uma lactonase de Bacillus thuringiensis, uma lactonase de Bacillus pseudomycoides ou uma combinação das mesmas).
[0671] Por exemplo, a lactonase pode compreender uma lactonase AiiA.
[0672] Onde a proteína de fusão compreende uma lactonase, a lactonase pode compreender uma lactonase de Agrobacterium.
[0673] Onde a proteína de fusão compreende uma lactonase, a lactonase pode compreender uma lactonase de Rhodococcus.
[0674] Onde a proteína de fusão compreende uma lactonase, a lactonase pode compreender uma lactonase de Streptomyces.
[0675] Onde a proteína de fusão compreende uma lactonase, a lactonase pode compreender uma lactonase de Arthrobacter.
[0676] Onde a proteína de fusão compreende uma lactonase, a lactonase pode compreender uma lactonase de Sphingomonas.
[0677] Onde a proteína de fusão compreende uma lactonase, a lactonase pode compreender uma lactonase de Pseudomonas.
[0678] Onde a proteína de fusão compreende uma lactonase, a lactonase pode compreender uma lactonase de Klebsiella.
[0679] Por exemplo, a lactonase pode compreender uma lactonase de Agrobacterium, uma lactonase de Rhodococcu, uma lactonase de Streptomyces, uma lactonase de Arthrobacter, uma lactonase de Sphingomonas, uma lactonase de Pseudomonas, uma lactonase de Pseudomonas, uma lactonase de Klebsiella ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.
[0680] Onde a proteína de fusão compreende uma lactonase, a lactonase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 277 ou 278.
[0681] Por exemplo, a lactonase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 277 ou 278.
[0682] A lactonase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 277 ou 278.
[0683] A lactonase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 277 ou 278.
[0684] A lactonase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 277 ou 278.
[0685] A lactonase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 277 ou 278.
[0686] A lactonase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 277 ou 278.
[0687] A lactonase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 277 ou 278.
[0688] A lactonase pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 277 ou 278.
[0689] Sempre que a proteína de fusão compreende uma lactonase, a lactonase pode compreender uma lactonase que é específico para uma molécula de sinalização de homoserina lactona bacteriana.
7. PROTEÍNAS DE FUSÃO QUE COMPREENDEM
UMA QUITOSANASE
[0690] São fornecidas proteínas de fusão que compreendem uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro recombinante da família Bacillus cereus e uma quitosanase.
[0691] Onde a proteína de fusão compreende uma quitosanase, a quitosanase pode compreender uma exo-1,4-beta-D- glucosaminidase.
[0692] Onde a proteína de fusão compreende uma quitosanase, a quitosanase pode compreender uma endo-1,4-beta-d- glucosaminidase.
[0693] Onde a proteína de fusão compreende uma quitosanase, a quitosanase pode compreender uma quitosanase de Streptomyces.
[0694] Onde a proteína de fusão compreende uma quitosanase, a quitosanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 280.
[0695] Por exemplo, a quitosanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 280.
[0696] A quitosanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO:
280.
[0697] A quitosanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO:
280.
[0698] A quitosanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO:
280.
[0699] A quitosanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO:
280.
[0700] A quitosanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO:
280.
[0701] A quitosanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO:
280.
[0702] A quitosanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 280.
[0703] Onde a proteína de fusão compreende uma quitosanase, a quitosanase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO:
279.
[0704] Por exemplo, a quitosanase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 279.
[0705] A quitosanase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 279.
[0706] A quitosanase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 279.
[0707] A quitosanase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 279.
[0708] A quitosanase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 279.
[0709] A quitosanase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 279.
[0710] A quitosanase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 279.
[0711] A quitosanase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 279.
[0712] Onde a proteína de fusão compreende uma quitosanase, a quitosanase pode consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 279.
[0713] Por exemplo, a quitosanase pode consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 279.
[0714] A quitosanase pode consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO:
279.
[0715] A quitosanase pode consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO:
279.
[0716] A quitosanase pode consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO:
279.
[0717] A quitosanase pode consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO:
279.
[0718] A quitosanase pode consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO:
279.
[0719] A quitosanase pode consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO:
279.
[0720] A quitosanase pode consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 100% de identidade em relação à SEQ ID NO:
279.
8. PROTEÍNAS DE FUSÃO QUE COMPREENDEM
UMA GLUCANASE
[0721] São fornecidas proteínas de fusão compreendendo uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro recombinante da família Bacillus cereus e uma glucanase.
[0722] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase pode compreender uma alfa-1,6-glucanase.
[0723] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase pode compreender uma beta 1,3/1,4 glucanase.
[0724] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase pode compreender um xiloglucano: xiloglucosil transferase.
[0725] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase pode compreender uma ciclo-heptaglucanase.
[0726] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase pode compreender uma oligoxiloglucana beta- glicosidase.
[0727] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase pode compreender uma ciclo-hexaglucanase.
[0728] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase pode compreender uma xiloglucanase.
[0729] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase pode compreender uma celulose 1,4-beta- celobiosidase.
[0730] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase pode compreender um glucano endo-1,3-beta-D- glucosidase.
[0731] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase pode compreender uma ciclomaltodextrinase.
[0732] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase pode compreender um glucano 1,3-beta-glucosidase.
[0733] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase pode compreender um glucano endo-1,3-alfa- glucosidase.
[0734] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase pode compreender uma endo-1,3 (4)-beta-glucanase.
[0735] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase pode compreender uma liquenase.
[0736] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase pode compreender uma laminarinase.
[0737] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase pode compreender um glucano 1,4-beta-glucosidase.
[0738] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase pode compreender um glucano endo-1,6-beta- glucosidase.
[0739] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase pode compreender um glucano 1,3-alfa-glucosidase.
[0740] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase pode compreender uma amilopectinase.
[0741] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase pode compreender uma amiloglucanase.
[0742] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase pode compreender uma amiloglucosidase.
[0743] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase pode compreender uma glucanase de Acidothermus.
[0744] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase pode compreender uma glucanase de Aspergillus.
[0745] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase pode compreender uma glucanase de Paenibacillus.
[0746] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase pode compreender uma glucanase de Helix.
[0747] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase pode compreender uma glucanase de Bacillus circulans.
[0748] Quando a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase pode compreender uma glucanase de Bacillus lichenformis.
[0749] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase pode compreender uma glucanase de Clostridium.
[0750] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase pode compreender uma beta-1,4-endoglucanase de Trichoderma reesei.
[0751] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase pode compreender uma amilase de Bacillus subtilis.
[0752] Por exemplo, em qualquer uma das proteínas de fusão que compreendem uma glucanase, a glucanase pode compreender uma glucanase de Acidothermus, uma glucanase de Aspergillus, uma glucanase de Paenibacillus, uma glucanase de Helix, uma glucanase de Bacillus lichenformis, uma glucanase de Clostridium, uma beta-1,4-endoglucanase de Trichoderma reesei, uma amilase de Bacillus subtilis ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.
[0753] Onde a glucanase compreende uma glucanase de Helix, uma glucanase de Helix pode compreender uma glucanase de Helix pomatia (por exemplo, uma beta-1,3-endoglucanase de Helix pomatia).
[0754] Quando a glucanase compreende uma glucanase de Acidothermus, uma glucanase de Acidothermus pode compreender uma glucanase de Acidothermus cellulolyticus (por exemplo, uma beta-1,4 endoglucanase de Acidothermus cellulolyticus).
[0755] Onde a glucanase compreende uma glucanase de Clostridium, a glucanase de Clostridium pode compreender uma glucanase de Clostridium thermocellum.
[0756] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 281–292 e 295–302.
[0757] Por exemplo, a glucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 281–292 e 295–302.
[0758] A glucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 281–292 e 295–302.
[0759] A glucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 281–292 e 295–302.
[0760] A glucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 281–292 e 295–302.
[0761] A glucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 281–292 e 295–302.
[0762] A glucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 281–292 e 295–302.
[0763] A glucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 281–292 e 295–302.
[0764] A glucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 281–292 e 295–302.
[0765] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 281–292, 295–296 e 298–302.
[0766] Por exemplo, a glucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 281–292, 295–296 e 298–302.
[0767] A glucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 281–292, 295–296 e 298–302.
[0768] A glucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 281–292, 295–296 e 298–302.
[0769] A glucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 281–292, 295–296 e 298–302.
[0770] A glucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 281–292, 295–296 e 298–302.
[0771] A glucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 281–292, 295–296 e 298–302.
[0772] A glucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 281–292, 295–296 e 298–302.
[0773] A glucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 281–292, 295–296 e 298–302.
[0774] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299 ou 300.
[0775] Por exemplo, a glucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299 ou 300.
[0776] A glucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299 ou 300.
[0777] A glucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299 ou 300.
[0778] A glucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299 ou 300.
[0779] A glucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299 ou 300.
[0780] A glucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299 ou 300.
[0781] A glucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299 ou 300.
[0782] A glucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299 ou 300.
[0783] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 293 ou 294.
[0784] Por exemplo, a glucanase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 293 ou 294.
[0785] A glucanase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 293 ou 294.
[0786] A glucanase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 293 ou 294.
[0787] A glucanase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 293 ou 294.
[0788] A glucanase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 293 ou 294.
[0789] A glucanase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 293 ou 294.
[0790] A glucanase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 293 ou 294.
[0791] A glucanase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 293 ou 294.
[0792] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase pode consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 293 ou 294.
[0793] Por exemplo, a glucanase pode consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 293 ou 294.
[0794] A glucanase pode consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 293 ou 294.
[0795] A glucanase pode consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 293 ou 294.
[0796] A glucanase pode consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 293 ou 294.
[0797] A glucanase pode consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 293 ou 294.
[0798] A glucanase pode consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 293 ou 294.
[0799] A glucanase pode consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 293 ou 294.
[0800] A glucanase pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 293 ou 294.
[0801] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase compreende adequadamente uma xiloglucanase.
[0802] Quando a glucanase compreende uma xiloglucanase, a xiloglucanase pode compreender uma endo-beta-1,4-glucanase específica para xiloglucano, uma exo-beta-1,4-glucanase específica para xiloglucano ou uma combinação dos mesmos.
[0803] Onde a glucanase compreende uma xiloglucanase, a xiloglucanase pode compreender uma xiloglucanase de Paenibacillus (por exemplo, uma xiloglucanase de Paenibacillus pabuli) ou uma xiloglucanase de Bacillus (por exemplo, uma xiloglucanase de Bacillus lichenformis).
[0804] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase adequadamente compreende uma liquenase.
[0805] Por exemplo, onde a glucanase compreende uma liquenase, a liquenase pode compreender uma liquenase de Bacillus subtilis ou uma liquenase de Clostridium thermocellum.
[0806] Onde a proteína de fusão compreende uma glucanase, a glucanase adequadamente compreende uma amilase de Bacillus subtilis.
9. PROTEÍNAS DE FUSÃO QUE COMPREENDEM
UMA PROTEASE
[0807] São fornecidas proteínas de fusão compreendendo uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro recombinante da família Bacillus cereus e uma protease.
[0808] Onde a proteína de fusão compreende uma protease, a protease pode compreender uma protease de asparagina.
[0809] Onde a proteína de fusão compreende uma protease, a protease pode compreender uma protease de Bacillus.
[0810] Por exemplo, a protease pode compreender uma protease de Bacillus subtilis.
[0811] Onde a proteína de fusão compreende uma protease, a protease pode compreender uma protease de Aspergillus.
[0812] Onde a proteína de fusão compreende uma protease, a protease pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 303-306.
[0813] Por exemplo, a protease pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 303-306.
[0814] A protease pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 303-306.
[0815] A protease pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 303-306.
[0816] A protease pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 303-306.
[0817] A protease pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 303-306.
[0818] A protease pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 303-306.
[0819] A protease pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 303-306.
[0820] A protease pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 303-306.
[0821] Onde a proteína de fusão compreende uma protease, a protease pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 305 ou 306.
[0822] Por exemplo, a protease pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 305 ou 306.
[0823] A protease pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 305 ou 306.
[0824] A protease pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 305 ou 306.
[0825] A protease pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 305 ou 306.
[0826] A protease pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 305 ou 306.
[0827] A protease pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 305 ou 306.
[0828] A protease pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 305 ou 306.
[0829] A protease pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 305 ou 306.
[0830] Onde a proteína de fusão compreende uma protease, a protease pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 304.
[0831] Quando a proteína de fusão compreende uma protease, a protease preferencialmente não consiste em uma metionina aminopeptidase.
[0832] Quando a proteína de fusão compreende uma protease, a protease preferencialmente não compreende uma metionina aminopeptidase.
10. AS PROTEÍNAS DE FUSÃO QUE
COMPREENDEM UMA MANANASE
[0833] São fornecidas proteínas de fusão que compreendem uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão ao exosporium de um membro recombinante da família Bacillus cereus e uma mananase.
[0834] Por exemplo, onde a proteína de fusão compreende uma mananase, a mananase pode compreender uma mananase de Bacillus.
[0835] Onde a proteína de fusão compreende uma mananase, a mananase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307 ou 308.
[0836] Por exemplo, a mananase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307 ou 308.
[0837] A mananase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307 ou 308.
[0838] A mananase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307 ou 308.
[0839] A mananase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307 ou 308.
[0840] A mananase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307 ou 308.
[0841] A mananase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307 ou 308.
[0842] A mananase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307 ou 308.
[0843] A mananase pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307 ou 308.
11. PROTEÍNAS DE FUSÃO QUE COMPREENDEM
UMA PECTINASE
[0844] São fornecidas proteínas de fusão compreendendo uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro recombinanate da família Bacillus cereus e uma pectinase.
[0845] Onde a proteína de fusão compreende uma pectinase, a pectinase compreende uma pectolase.
[0846] Por exemplo, a pectolase pode compreender uma pectolase de Aspergillus ou uma pectolase de Bacillus.
[0847] Alternativamente ou adicionalmente, a pectolase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 309 ou 310.
[0848] Por exemplo, a pectolase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 309 ou 310.
[0849] A pectolase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 309 ou 310.
[0850] A pectolase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 309 ou 310.
[0851] A pectolase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 309 ou 310.
[0852] A pectolase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 309 ou 310.
[0853] A pectolase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 309 ou 310.
[0854] A pectolase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 309 ou 310.
[0855] A pectolase pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 309 ou 310.
12. PROTEÍNAS DE FUSÃO QUE COMPREENDEM
UMA FOSFATASE ÁCIDA
[0856] São fornecidas proteínas de fusão compreendendo uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante e uma fosfatase ácida.
[0857] Quando a proteína de fusão compreende uma fosfatase ácida, a fosfatase ácida pode compreender uma fosfatase ácida de Triticum. Por exemplo, a fosfatase ácida pode compreender uma fosfatase ácida de Triticum aestivum.
[0858] Alternativamente ou além disso, onde a proteína de fusão compreende uma fosfatase ácida, a fosfatase ácida pode compreender uma fosfatase ácida de Bacillus. Por exemplo, a fosfatase ácida pode compreender uma fosfatase ácida de Bacillus thuringiensis.
[0859] Alternativamente ou adicionalmente, onde a proteína de fusão compreende uma fosfatase ácida, a fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, em pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade ou 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs: 311, 312 e 378.
[0860] Por exemplo, a fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311.
[0861] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311.
[0862] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311.
[0863] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311.
[0864] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311.
[0865] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311.
[0866] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311.
[0867] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311.
[0868] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade em relação à SEQ ID NO:
311.
[0869] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 312.
[0870] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 312.
[0871] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 312.
[0872] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 312.
[0873] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 312.
[0874] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 312.
[0875] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 312.
[0876] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 312.
[0877] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade em relação à SEQ ID NO:
312.
[0878] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 378.
[0879] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 378.
[0880] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 378.
[0881] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 378.
[0882] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 378.
[0883] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 378.
[0884] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 378.
[0885] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 378.
[0886] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade em relação à SEQ ID NO:
378.
13. PROTEÍNAS DE FUSÃO QUE COMPREENDEM
UMA FITASE
[0887] São fornecidas proteínas de fusão compreendendo uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro recombinante da família Bacillus cereus e uma fitase.
[0888] Onde a proteína de fusão compreende uma fitase, a fitase pode compreender uma fitase de Triticum. Por exemplo, a fitase pode compreender uma fitase de Triticum aestivum.
[0889] Alternativamente, ou além disso, a fitase pode compreender uma fitase de Bacillus. Por exemplo, a fitase pode compreender uma fitase de Bacillus thuringiensis.
[0890] Alternativamente ou adicionalmente, a fitase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 313-315 e 380.
[0891] Por exemplo, a fitase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 313-315 e 380.
[0892] A fitase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 313-315 e 380.
[0893] A fitase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 313-315 e 380.
[0894] A fitase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 313-315 e 380.
[0895] A fitase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 313-315 e 380.
[0896] A fitase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 313-315 e 380.
[0897] A fitase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 313-315 e 380.
[0898] A fitase pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 313-315 e 380.
[0899] Alternativamente ou adicionalmente, a fitase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO. 380.
[0900] Por exemplo, a fitase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO. 380.
[0901] A fitase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO. 380.
[0902] A fitase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO. 380.
[0903] A fitase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO. 380.
[0904] A fitase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO. 380.
[0905] A fitase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO. 380.
[0906] A fitase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO. 380.
[0907] A fitase pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade em relação à SEQ ID NO. 380.
14. PROTEÍNAS DE FUSÃO QUE COMPREENDEM
UMA PROTEÍNA DE EXPANSINA
[0908] São fornecidas proteínas de fusão que compreendem uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante e uma proteína expansina.
[0909] Onde a proteína de fusão compreende uma proteína expansina, a proteína expansina pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 316.
[0910] Por exemplo, a expansina pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 316.
[0911] A expansina pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 316.
[0912] A expansina pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 316.
[0913] A expansina pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 316.
[0914] A expansina pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 316.
[0915] A expansina pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 316.
[0916] A expansina pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 316.
[0917] A expansina pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 316.
15. INCLUSÃO OPCIONAL DE PEPTÍDEOS SINAL
NAS PROTEÍNAS DE FUSÃO
[0918] Em qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas, qualquer um dos peptídeos sinal aqui descritos pode estar presente.
[0919] Onde o peptídeo sinal está presente, ele é, de preferência, presente no terminal amino da enzima possuindo atividade de ACC desaminase, a fosfolipase, a lipase, a xilanase, a xilosidase, a lactonase, a quitosanase, a protease, a glucanase, a fitase, a fosfatase ácida, a pectinase, ao mananase ou a proteína expansina.
[0920] O peptídeo sinal de preferência imediatamente precede o primeiro aminoácido da atividade da enzima ACC desaminase possuindo, a fosfolipase, a lipase, a xilanase, a xilosidase, a lactonase, a quitosanase, a protease, a glucanase, a fitase, a fosfatase ácida, a pectinase, a mananase ou a proteína expansina.
[0921] Assim, por exemplo, uma proteína de fusão compreendendo a sequência de alvejamento da SEQ ID NO: 96 e a liquenase da SEQ ID NO: 295 pode ter as seguintes estruturas, mostradas com e sem a sequência sinal (por exemplo, a sequência sinal da SEQ ID NO: 335):
[0922] Sem sequência sinal: SEQ ID NO: 96-SEQ ID NO:
295.
[0923] Com sequência sinal: SEQ ID NO: 96-SEQ ID NO: 335-SEQ ID NO: 295
[0924] Assim, em qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas, a enzima possuindo atividade de ACC desaminase, a fosfolipase, a lipase, a xilanase, a xilosidase, a lactonase, a quitosanase, a protease, a glucanase, a proteína da expansina, a fitase, a fosfatase ácida, a pectinase ou a mananase podem ainda compreender um peptídeo sinal.
[0925] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, o peptídeo sinal pode estar presente no terminal amino da enzima com atividade de ACC desaminase, fosfolipase, lipase, xilanase, xilosidase, lactonase, quitosanase, protease, glucanase, proteína expansina, fitase, fosfatase ácida, pectinase ou mananase.
[0926] Em qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas compreendendo um peptídeo sinal, o peptídeo sinal pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 317-360 e 376-379.
[0927] Por exemplo, o peptídeo sinal pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 317-360 e 376-379.
[0928] Por exemplo, o peptídeo sinal pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 317-360 e 376-379.
[0929] O peptídeo sinal pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 317-360 e 376-379.
[0930] O peptídeo sinal pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 317-360 e 376-379.
[0931] O peptídeo sinal pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 317-360 e 376-379.
[0932] O peptídeo sinal pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 317-360 e 376-379.
[0933] O peptídeo sinal pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 317-360 e 376-379.
[0934] O peptídeo sinal pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 317-360 e 376-379.
[0935] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 252. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 317 no seu terminal amino.
[0936] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 252. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 317 no seu terminal amino.
[0937] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 252. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 317 no seu terminal amino.
[0938] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 252. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 317 no seu terminal amino.
[0939] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 252. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 317 no seu terminal amino.
[0940] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 252. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 317 no seu terminal amino.
[0941] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 252. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 317 no seu terminal amino.
[0942] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 252. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 317 no seu terminal amino.
[0943] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 252. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 317 no seu terminal amino.
[0944] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 253. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 318 no seu terminal amino.
[0945] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 253. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 318 no seu terminal amino.
[0946] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 253. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 318 no seu terminal amino.
[0947] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos
85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 253. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 318 no seu terminal amino.
[0948] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 253. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 318 no seu terminal amino.
[0949] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 253. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 318 no seu terminal amino.
[0950] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 253. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 318 no seu terminal amino.
[0951] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 253. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 318 no seu terminal amino.
[0952] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 253. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 318 no seu terminal amino.
[0953] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 254. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 319 no seu terminal amino.
[0954] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 254. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 319 no seu terminal amino.
[0955] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 254. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 319 no seu terminal amino.
[0956] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 254. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 319 no seu terminal amino.
[0957] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 254. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 319 no seu terminal amino.
[0958] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 254. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 319 no seu terminal amino.
[0959] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 254. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 319 no seu terminal amino.
[0960] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 254. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 319 no seu terminal amino.
[0961] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 254. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 319 no seu terminal amino.
[0962] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 255. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 320 no seu terminal amino.
[0963] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 255. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 320 no seu terminal amino.
[0964] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 255. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 320 no seu terminal amino.
[0965] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 255. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 320 no seu terminal amino.
[0966] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 255. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 320 no seu terminal amino.
[0967] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 255. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 320 no seu terminal amino.
[0968] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 255. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 320 no seu terminal amino.
[0969] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 255. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 320 no seu terminal amino.
[0970] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 255. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 320 no seu terminal amino.
[0971] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 321 no seu terminal amino.
[0972] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 321 no seu terminal amino.
[0973] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 321 no seu terminal amino.
[0974] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 321 no seu terminal amino.
[0975] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 321 no seu terminal amino.
[0976] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 321 no seu terminal amino.
[0977] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos
98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 321 no seu terminal amino.
[0978] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 321 no seu terminal amino.
[0979] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 321 no seu terminal amino.
[0980] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 322 no seu terminal amino.
[0981] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 322 no seu terminal amino.
[0982] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 322 no seu terminal amino.
[0983] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 322 no seu terminal amino.
[0984] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 322 no seu terminal amino.
[0985] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 322 no seu terminal amino.
[0986] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 322 no seu terminal amino.
[0987] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 322 no seu terminal amino.
[0988] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 322 no seu terminal amino.
[0989] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 257. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 323 no seu terminal amino.
[0990] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 257. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 323 no seu terminal amino.
[0991] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 257. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 323 no seu terminal amino.
[0992] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos
85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 257. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 323 no seu terminal amino.
[0993] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 257. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 323 no seu terminal amino.
[0994] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 257. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 323 no seu terminal amino.
[0995] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 257. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 323 no seu terminal amino.
[0996] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 257. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 323 no seu terminal amino.
[0997] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 257. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 323 no seu terminal amino.
[0998] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 373. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 376 no seu terminal amino.
[0999] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 373. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 376 no seu terminal amino.
[1000] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 373. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 376 no seu terminal amino.
[1001] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 373. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 376 no seu terminal amino.
[1002] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 373. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 376 no seu terminal amino.
[1003] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 373. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 376 no seu terminal amino.
[1004] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 373. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 376 no seu terminal amino.
[1005] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 373. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 376 no seu terminal amino.
[1006] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 373. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 376 no seu terminal amino.
[1007] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 375. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 377 no seu terminal amino.
[1008] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 375. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 377 no seu terminal amino.
[1009] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 375. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 377 no seu terminal amino.
[1010] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 375. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 377 no seu terminal amino.
[1011] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 375. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 377 no seu terminal amino.
[1012] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 375. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 377 no seu terminal amino.
[1013] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 375. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 377 no seu terminal amino.
[1014] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 375. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 377 no seu terminal amino.
[1015] A proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 375. A fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 377 no seu terminal amino.
[1016] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma lipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 263. A lipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 324 no seu terminal amino.
[1017] A proteína de fusão pode compreender uma lipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 263. A lipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 324 no seu terminal amino.
[1018] A proteína de fusão pode compreender uma lipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 263. A lipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 324 no seu terminal amino.
[1019] A proteína de fusão pode compreender uma lipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 263. A lipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 324 no seu terminal amino.
[1020] A proteína de fusão pode compreender uma lipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 263. A lipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 324 no seu terminal amino.
[1021] A proteína de fusão pode compreender uma lipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 263. A lipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 324 no seu terminal amino.
[1022] A proteína de fusão pode compreender uma lipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 263. A lipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 324 no seu terminal amino.
[1023] A proteína de fusão pode compreender uma lipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 263. A lipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 324 no seu terminal amino.
[1024] A proteína de fusão pode compreender uma lipase compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 263. A lipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 324 no seu terminal amino.
[1025] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma lipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 264. A lipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 325 no seu terminal amino.
[1026] A proteína de fusão pode compreender uma lipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 264. A lipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 325 no seu terminal amino.
[1027] A proteína de fusão pode compreender uma lipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 264. A lipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 325 no seu terminal amino.
[1028] A proteína de fusão pode compreender uma lipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 264. A lipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 325 no seu terminal amino.
[1029] A proteína de fusão pode compreender uma lipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 264. A lipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 325 no seu terminal amino.
[1030] A proteína de fusão pode compreender uma lipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 264. A lipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 325 no seu terminal amino.
[1031] A proteína de fusão pode compreender uma lipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 264. A lipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 325 no seu terminal amino.
[1032] A proteína de fusão pode compreender uma lipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 264. A lipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 325 no seu terminal amino.
[1033] A proteína de fusão pode compreender uma lipase compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 264. A lipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 325 no seu terminal amino.
[1034] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma lipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 265. A lipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 326 no seu terminal amino.
[1035] A proteína de fusão pode compreender uma lipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 265. A lipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 326 no seu terminal amino.
[1036] A proteína de fusão pode compreender uma lipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 265. A lipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 326 no seu terminal amino.
[1037] A proteína de fusão pode compreender uma lipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 265. A lipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 326 no seu terminal amino.
[1038] A proteína de fusão pode compreender uma lipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 265. A lipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 326 no seu terminal amino.
[1039] A proteína de fusão pode compreender uma lipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 265. A lipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 326 no seu terminal amino.
[1040] A proteína de fusão pode compreender uma lipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 265. A lipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 326 no seu terminal amino.
[1041] A proteína de fusão pode compreender uma lipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 265. A lipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 326 no seu terminal amino.
[1042] A proteína de fusão pode compreender uma lipase compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 265. A lipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 326 no seu terminal amino.
[1043] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 267. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 327 no seu terminal amino.
[1044] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 267. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 327 no seu terminal amino.
[1045] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 267. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 327 no seu terminal amino.
[1046] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 267. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 327 no seu terminal amino.
[1047] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 267. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 327 no seu terminal amino.
[1048] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 267. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 327 no seu terminal amino.
[1049] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 267. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 327 no seu terminal amino.
[1050] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 267. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 327 no seu terminal amino.
[1051] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 267. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 327 no seu terminal amino.
[1052] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 268. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 328 no seu terminal amino.
[1053] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 268. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 328 no seu terminal amino.
[1054] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 268. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 328 no seu terminal amino.
[1055] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 268. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 328 no seu terminal amino.
[1056] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 268. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 328 no seu terminal amino.
[1057] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 268. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 328 no seu terminal amino.
[1058] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 268. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 328 no seu terminal amino.
[1059] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 268. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 328 no seu terminal amino.
[1060] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 268. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 328 no seu terminal amino.
[1061] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 269. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 329 no seu terminal amino.
[1062] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 269. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 329 no seu terminal amino.
[1063] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 269. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 329 no seu terminal amino.
[1064] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 269. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 329 no seu terminal amino.
[1065] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 269. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 329 no seu terminal amino.
[1066] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 269. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 329 no seu terminal amino.
[1067] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98%
de identidade em relação à SEQ ID NO: 269. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 329 no seu terminal amino.
[1068] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 269. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 329 no seu terminal amino.
[1069] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 269. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 329 no seu terminal amino.
[1070] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 270. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 330 no seu terminal amino.
[1071] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 270. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 330 no seu terminal amino.
[1072] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 270. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 330 no seu terminal amino.
[1073] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 270. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 330 no seu terminal amino.
[1074] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 270. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 330 no seu terminal amino.
[1075] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 270. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 330 no seu terminal amino.
[1076] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 270. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 330 no seu terminal amino.
[1077] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 270. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 330 no seu terminal amino.
[1078] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 270. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 330 no seu terminal amino.
[1079] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 273. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 331 no seu terminal amino.
[1080] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 273. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 331 no seu terminal amino.
[1081] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 273. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 331 no seu terminal amino.
[1082] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%
de identidade em relação à SEQ ID NO: 273. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 331 no seu terminal amino.
[1083] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 273. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 331 no seu terminal amino.
[1084] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 273. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 331 no seu terminal amino.
[1085] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 273. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 331 no seu terminal amino.
[1086] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 273. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 331 no seu terminal amino.
[1087] A proteína de fusão pode compreender uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 273. A xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 331 no seu terminal amino.
[1088] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma quitosanase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 279. A quitosanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 332 no seu terminal amino.
[1089] A proteína de fusão pode compreender uma quitosanase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 279. A quitosanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 332 no seu terminal amino.
[1090] A proteína de fusão pode compreender uma quitosanase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 279. A quitosanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 332 no seu terminal amino.
[1091] A proteína de fusão pode compreender uma quitosanase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 279. A quitosanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 332 no seu terminal amino.
[1092] A proteína de fusão pode compreender uma quitosanase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 279. A quitosanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 332 no seu terminal amino.
[1093] A proteína de fusão pode compreender uma quitosanase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 279. A quitosanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 332 no seu terminal amino.
[1094] A proteína de fusão pode compreender uma quitosanase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 279. A quitosanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 332 no seu terminal amino.
[1095] A proteína de fusão pode compreender uma quitosanase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 279. A quitosanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 332 no seu terminal amino.
[1096] A proteína de fusão pode compreender uma quitosanase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 279. A quitosanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 332 no seu terminal amino.
[1097] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma quitosanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 280. A quitosanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 333 no seu terminal amino.
[1098] A proteína de fusão pode compreender uma quitosanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 280. A quitosanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 333 no seu terminal amino.
[1099] A proteína de fusão pode compreender uma quitosanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 280. A quitosanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 333 no seu terminal amino.
[1100] A proteína de fusão pode compreender uma quitosanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 280. A quitosanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 333 no seu terminal amino.
[1101] A proteína de fusão pode compreender uma quitosanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 280. A quitosanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 333 no seu terminal amino.
[1102] A proteína de fusão pode compreender uma quitosanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos
95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 280. A quitosanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 333 no seu terminal amino.
[1103] A proteína de fusão pode compreender uma quitosanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 280. A quitosanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 333 no seu terminal amino.
[1104] A proteína de fusão pode compreender uma quitosanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 280. A quitosanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 333 no seu terminal amino.
[1105] A proteína de fusão pode compreender uma quitosanase compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 280. A quitosanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 333 no seu terminal amino.
[1106] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma glucanase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 294. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 334 no seu terminal amino.
[1107] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 294. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 334 no seu terminal amino.
[1108] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 294. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 334 no seu terminal amino.
[1109] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 294. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 334 no seu terminal amino.
[1110] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 294. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 334 no seu terminal amino.
[1111] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 294. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 334 no seu terminal amino.
[1112] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 294. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 334 no seu terminal amino.
[1113] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 294. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 334 no seu terminal amino.
[1114] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 294. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 334 no seu terminal amino.
[1115] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 295. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 335 no seu terminal amino.
[1116] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 295. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 335 no seu terminal amino.
[1117] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 295. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 335 no seu terminal amino.
[1118] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 295. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 335 no seu terminal amino.
[1119] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 295. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 335 no seu terminal amino.
[1120] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 295. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 335 no seu terminal amino.
[1121] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 295. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 335 no seu terminal amino.
[1122] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 295. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 335 no seu terminal amino.
[1123] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 295. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 335 no seu terminal amino.
[1124] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 296. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 336 no seu terminal amino.
[1125] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 296. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 336 no seu terminal amino.
[1126] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 296. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 336 no seu terminal amino.
[1127] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 296. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 336 no seu terminal amino.
[1128] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 296. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 336 no seu terminal amino.
[1129] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 296. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 336 no seu terminal amino.
[1130] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos
98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 296. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 336 no seu terminal amino.
[1131] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 296. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 336 no seu terminal amino.
[1132] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 296. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 336 no seu terminal amino.
[1133] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 297. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 337 no seu terminal amino.
[1134] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 297. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 337 no seu terminal amino.
[1135] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 297. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 337 no seu terminal amino.
[1136] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 297. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 337 no seu terminal amino.
[1137] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 297. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 337 no seu terminal amino.
[1138] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 297. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 337 no seu terminal amino.
[1139] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 297. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 337 no seu terminal amino.
[1140] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 297. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 337 no seu terminal amino.
[1141] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 297. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 337 no seu terminal amino.
[1142] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 298. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 338 no seu terminal amino.
[1143] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 298. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 338 no seu terminal amino.
[1144] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 298. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 338 no seu terminal amino.
[1145] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos
85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 298. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 338 no seu terminal amino.
[1146] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 298. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 338 no seu terminal amino.
[1147] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 298. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 338 no seu terminal amino.
[1148] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 298. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 338 no seu terminal amino.
[1149] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 298. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 338 no seu terminal amino.
[1150] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 298. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 338 no seu terminal amino.
[1151] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 339 no seu terminal amino.
[1152] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 339 no seu terminal amino.
[1153] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 339 no seu terminal amino.
[1154] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 339 no seu terminal amino.
[1155] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 339 no seu terminal amino.
[1156] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 339 no seu terminal amino.
[1157] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 339 no seu terminal amino.
[1158] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 339 no seu terminal amino.
[1159] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 339 no seu terminal amino.
[1160] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 300. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 340 no seu terminal amino.
[1161] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 300. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 340 no seu terminal amino.
[1162] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 300. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 340 no seu terminal amino.
[1163] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 300. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 340 no seu terminal amino.
[1164] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 300. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 340 no seu terminal amino.
[1165] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 300. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 340 no seu terminal amino.
[1166] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 300. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 340 no seu terminal amino.
[1167] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 300. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 340 no seu terminal amino.
[1168] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 300. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 340 no seu terminal amino.
[1169] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 302. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 341 no seu terminal amino.
[1170] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 302. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 341 no seu terminal amino.
[1171] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 302. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 341 no seu terminal amino.
[1172] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 302. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 341 no seu terminal amino.
[1173] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 302. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 341 no seu terminal amino.
[1174] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 302. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 341 no seu terminal amino.
[1175] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos
98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 302. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 341 no seu terminal amino.
[1176] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 302. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 341 no seu terminal amino.
[1177] A proteína de fusão pode compreender uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 302. A glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 341 no seu terminal amino.
[1178] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma protease compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 304. A protease compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 342 no seu terminal amino.
[1179] A proteína de fusão pode compreender uma protease compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 304. A protease compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 342 no seu terminal amino.
[1180] A proteína de fusão pode compreender uma protease compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 304. A protease compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 342 no seu terminal amino.
[1181] A proteína de fusão pode compreender uma protease compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 304. A protease compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 342 no seu terminal amino.
[1182] A proteína de fusão pode compreender uma protease compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 304. A protease compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 342 no seu terminal amino.
[1183] A proteína de fusão pode compreender uma protease compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 304. A protease compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 342 no seu terminal amino.
[1184] A proteína de fusão pode compreender uma protease compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 304. A protease compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 342 no seu terminal amino.
[1185] A proteína de fusão pode compreender uma protease compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 304. A protease compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 342 no seu terminal amino.
[1186] A proteína de fusão pode compreender uma protease compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 304. A protease compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 342 no seu terminal amino.
[1187] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma protease compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 306. A protease compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 343 no seu terminal amino.
[1188] A proteína de fusão pode compreender uma protease compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 306. A protease compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 343 no seu terminal amino.
[1189] A proteína de fusão pode compreender uma protease compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 306. A protease compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 343 no seu terminal amino.
[1190] A proteína de fusão pode compreender uma protease compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%
de identidade em relação à SEQ ID NO: 306. A protease compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 343 no seu terminal amino.
[1191] A proteína de fusão pode compreender uma protease compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 306. A protease compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 343 no seu terminal amino.
[1192] A proteína de fusão pode compreender uma protease compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 306. A protease compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 343 no seu terminal amino.
[1193] A proteína de fusão pode compreender uma protease compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 306. A protease compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 343 no seu terminal amino.
[1194] A proteína de fusão pode compreender uma protease compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 306. A protease compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 343 no seu terminal amino.
[1195] A proteína de fusão pode compreender uma protease compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 306. A protease compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 343 no seu terminal amino.
[1196] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma mananase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307. A mananase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 344 no seu terminal amino.
[1197] A proteína de fusão pode compreender uma mananase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307. A mananase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 344 no seu terminal amino.
[1198] A proteína de fusão pode compreender uma mananase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307. A mananase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 344 no seu terminal amino.
[1199] A proteína de fusão pode compreender uma mananase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307. A mananase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 344 no seu terminal amino.
[1200] A proteína de fusão pode compreender uma mananase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307. A mananase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 344 no seu terminal amino.
[1201] A proteína de fusão pode compreender uma mananase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307. A mananase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 344 no seu terminal amino.
[1202] A proteína de fusão pode compreender uma mananase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307. A mananase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 344 no seu terminal amino.
[1203] A proteína de fusão pode compreender uma mananase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307. A mananase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 344 no seu terminal amino.
[1204] A proteína de fusão pode compreender uma mananase compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307. A mananase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 344 no seu terminal amino.
[1205] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma mananase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 308. A mananase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 345 no seu terminal amino.
[1206] A proteína de fusão pode compreender uma mananase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 308. A mananase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 345 no seu terminal amino.
[1207] A proteína de fusão pode compreender uma mananase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 308. A mananase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 345 no seu terminal amino.
[1208] A proteína de fusão pode compreender uma mananase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 308. A mananase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 345 no seu terminal amino.
[1209] A proteína de fusão pode compreender uma mananase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 308. A mananase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 345 no seu terminal amino.
[1210] A proteína de fusão pode compreender uma mananase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 308. A mananase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 345 no seu terminal amino.
[1211] A proteína de fusão pode compreender uma mananase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 308. A mananase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 345 no seu terminal amino.
[1212] A proteína de fusão pode compreender uma mananase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 308. A mananase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 345 no seu terminal amino.
[1213] A proteína de fusão pode compreender uma mananase compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 308. A mananase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 345 no seu terminal amino.
[1214] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma pectolase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 309. A pectolase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 346 no seu terminal amino.
[1215] A proteína de fusão pode compreender uma pectolase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 309. A pectolase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 346 no seu terminal amino.
[1216] A proteína de fusão pode compreender uma pectolase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 309. A pectolase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 346 no seu terminal amino.
[1217] A proteína de fusão pode compreender uma pectolase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 309. A pectolase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 346 no seu terminal amino.
[1218] A proteína de fusão pode compreender uma pectolase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 309. A pectolase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 346 no seu terminal amino.
[1219] A proteína de fusão pode compreender uma pectolase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 309. A pectolase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 346 no seu terminal amino.
[1220] A proteína de fusão pode compreender uma pectolase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98%
de identidade em relação à SEQ ID NO: 309. A pectolase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 346 no seu terminal amino.
[1221] A proteína de fusão pode compreender uma pectolase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 309. A pectolase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 346 no seu terminal amino.
[1222] A proteína de fusão pode compreender uma pectolase compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 309. A pectolase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 346 no seu terminal amino.
[1223] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma pectolase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 310. A pectolase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 347 no seu terminal amino.
[1224] A proteína de fusão pode compreender uma pectolase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 310. A pectolase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 347 no seu terminal amino.
[1225] A proteína de fusão pode compreender uma pectolase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 310. A pectolase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 347 no seu terminal amino.
[1226] A proteína de fusão pode compreender uma pectolase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 310. A pectolase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 347 no seu terminal amino.
[1227] A proteína de fusão pode compreender uma pectolase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 310. A pectolase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 347 no seu terminal amino.
[1228] A proteína de fusão pode compreender uma pectolase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 310. A pectolase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 347 no seu terminal amino.
[1229] A proteína de fusão pode compreender uma pectolase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 310. A pectolase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 347 no seu terminal amino.
[1230] A proteína de fusão pode compreender uma pectolase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 310. A pectolase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 347 no seu terminal amino.
[1231] A proteína de fusão pode compreender uma pectolase compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 310. A pectolase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 347 no seu terminal amino.
[1232] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma fosfatase ácida compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311. A fosfatase ácida compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 348 no seu terminal amino.
[1233] A proteína de fusão pode compreender uma fosfatase ácida compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311. A fosfatase ácida compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 348 no seu terminal amino.
[1234] A proteína de fusão pode compreender uma fosfatase ácida compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311. A fosfatase ácida compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 348 no seu terminal amino.
[1235] A proteína de fusão pode compreender uma fosfatase ácida compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311. A fosfatase ácida compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 348 no seu terminal amino.
[1236] A proteína de fusão pode compreender uma fosfatase ácida compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311. A fosfatase ácida compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 348 no seu terminal amino.
[1237] A proteína de fusão pode compreender uma fosfatase ácida compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311. A fosfatase ácida compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 348 no seu terminal amino.
[1238] A proteína de fusão pode compreender uma fosfatase ácida compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311. A fosfatase ácida compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 348 no seu terminal amino.
[1239] A proteína de fusão pode compreender uma fosfatase ácida compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311. A fosfatase ácida compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 348 no seu terminal amino.
[1240] A proteína de fusão pode compreender uma fosfatase ácida compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311. A fosfatase ácida compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 348 no seu terminal amino.
[1241] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma fosfatase ácida compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 312. A fosfatase ácida compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 349 no seu terminal amino.
[1242] A proteína de fusão pode compreender uma fosfatase ácida compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 312. A fosfatase ácida compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 349 no seu terminal amino.
[1243] A proteína de fusão pode compreender uma fosfatase ácida compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 312. A fosfatase ácida compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 349 no seu terminal amino.
[1244] A proteína de fusão pode compreender uma fosfatase ácida compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 312. A fosfatase ácida compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 349 no seu terminal amino.
[1245] A proteína de fusão pode compreender uma fosfatase ácida compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 312. A fosfatase ácida compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 349 no seu terminal amino.
[1246] A proteína de fusão pode compreender uma fosfatase ácida compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 312. A fosfatase ácida compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 349 no seu terminal amino.
[1247] A proteína de fusão pode compreender uma fosfatase ácida compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 312. A fosfatase ácida compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 349 no seu terminal amino.
[1248] A proteína de fusão pode compreender uma fosfatase ácida compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 312. A fosfatase ácida compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 349 no seu terminal amino.
[1249] A proteína de fusão pode compreender uma fosfatase ácida compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 312. A fosfatase ácida compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 349 no seu terminal amino.
[1250] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma fosfatase ácida compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 378. A fosfatase ácida compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 379 no seu terminal amino.
[1251] A proteína de fusão pode compreender uma fosfatase ácida compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 378. A fosfatase ácida compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 379 no seu terminal amino.
[1252] A proteína de fusão pode compreender uma fosfatase ácida compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 378. A fosfatase ácida compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 379 no seu terminal amino.
[1253] A proteína de fusão pode compreender uma fosfatase ácida compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 378. A fosfatase ácida compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 379 no seu terminal amino.
[1254] A proteína de fusão pode compreender uma fosfatase ácida compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 378. A fosfatase ácida compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 379 no seu terminal amino.
[1255] A proteína de fusão pode compreender uma fosfatase ácida compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 378. A fosfatase ácida compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 379 no seu terminal amino.
[1256] A proteína de fusão pode compreender uma fosfatase ácida compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 378. A fosfatase ácida compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 379 no seu terminal amino.
[1257] A proteína de fusão pode compreender uma fosfatase ácida compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 378. A fosfatase ácida compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 379 no seu terminal amino.
[1258] A proteína de fusão pode compreender uma fosfatase ácida compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 378. A fosfatase ácida compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 379 no seu terminal amino.
[1259] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 313. A fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 350 no seu terminal amino.
[1260] A proteína de fusão pode compreender uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 313. A fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 350 no seu terminal amino.
[1261] A proteína de fusão pode compreender uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 313. A fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 350 no seu terminal amino.
[1262] A proteína de fusão pode compreender uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 313. A fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 350 no seu terminal amino.
[1263] A proteína de fusão pode compreender uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 313. A fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 350 no seu terminal amino.
[1264] A proteína de fusão pode compreender uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 313. A fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 350 no seu terminal amino.
[1265] A proteína de fusão pode compreender uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 313. A fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 350 no seu terminal amino.
[1266] A proteína de fusão pode compreender uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 313. A fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 350 no seu terminal amino.
[1267] A proteína de fusão pode compreender uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 313. A fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 350 no seu terminal amino.
[1268] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 314. A fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 350 no seu terminal amino.
[1269] A proteína de fusão pode compreender uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 314. A fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 350 no seu terminal amino.
[1270] A proteína de fusão pode compreender uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 314. A fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 350 no seu terminal amino.
[1271] A proteína de fusão pode compreender uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 314. A fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 350 no seu terminal amino.
[1272] A proteína de fusão pode compreender uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 314. A fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 350 no seu terminal amino.
[1273] A proteína de fusão pode compreender uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 314. A fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 350 no seu terminal amino.
[1274] A proteína de fusão pode compreender uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 314. A fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 350 no seu terminal amino.
[1275] A proteína de fusão pode compreender uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 314. A fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 350 no seu terminal amino.
[1276] A proteína de fusão pode compreender uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 314. A fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 350 no seu terminal amino.
[1277] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 315. A fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 351 no seu terminal amino.
[1278] A proteína de fusão pode compreender uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 315. A fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 351 no seu terminal amino.
[1279] A proteína de fusão pode compreender uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 315. A fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 351 no seu terminal amino.
[1280] A proteína de fusão pode compreender uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 315. A fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 351 no seu terminal amino.
[1281] A proteína de fusão pode compreender uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 315. A fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 351 no seu terminal amino.
[1282] A proteína de fusão pode compreender uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 315. A fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 351 no seu terminal amino.
[1283] A proteína de fusão pode compreender uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 315. A fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 351 no seu terminal amino.
[1284] A proteína de fusão pode compreender uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 315. A fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 351 no seu terminal amino.
[1285] A proteína de fusão pode compreender uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 315. A fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 351 no seu terminal amino.
[1286] Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 380. A fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 354 no seu terminal amino.
[1287] A proteína de fusão pode compreender uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 380. A fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 354 no seu terminal amino.
[1288] A proteína de fusão pode compreender uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 380. A fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 354 no seu terminal amino.
[1289] A proteína de fusão pode compreender uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 380. A fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 354 no seu terminal amino.
[1290] A proteína de fusão pode compreender uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 380. A fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 354 no seu terminal amino.
[1291] A proteína de fusão pode compreender uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 380. A fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 354 no seu terminal amino.
[1292] A proteína de fusão pode compreender uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 380. A fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 354 no seu terminal amino.
[1293] A proteína de fusão pode compreender uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 380. A fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 354 no seu terminal amino.
[1294] A proteína de fusão pode compreender uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 380. A fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 354 no seu terminal amino. Onde a proteína de fusão compreende um peptídeo sinal, a proteína de fusão pode compreender uma proteína expansina compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 316. A proteína expansina compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 352 no seu terminal amino.
[1295] A proteína de fusão pode compreender uma proteína de expansina compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 316. A proteína expansina compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 352 no seu terminal amino.
[1296] A proteína de fusão pode compreender uma proteína de expansina compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 316. A proteína expansina compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 352 no seu terminal amino.
[1297] A proteína de fusão pode compreender uma proteína de expansina compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 316. A proteína expansina compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 352 no seu terminal amino.
[1298] A proteína de fusão pode compreender uma proteína de expansina compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 316. A proteína expansina compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 352 no seu terminal amino.
[1299] A proteína de fusão pode compreender uma proteína de expansina compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 316. A proteína expansina compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 352 no seu terminal amino.
[1300] A proteína de fusão pode compreender uma proteína de expansina compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 316. A proteína expansina compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 352 no seu terminal amino.
[1301] A proteína de fusão pode compreender uma proteína de expansina compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 316. A proteína expansina compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 352 no seu terminal amino.
[1302] A proteína de fusão pode compreender uma proteína de expansina compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 316. A proteína expansina compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 352 no seu terminal amino. D. MÉTODOS PARA FAZER AS PROTEÍNAS DE
FUSÃO
[1303] Qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas pode ser preparada usando métodos padrão de clonagem e biologia molecular conhecidos na técnica. Por exemplo, um gene que codifica uma proteína ou peptídeo de interesse (por exemplo, uma enzima com atividade de ACC desaminase, fosfolipase, lipase, xilanase, xilosidase, lactonase, quitosanase, protease, glucanase, proteína expansina, uma fitase, fosfatase, pectinase ou mananase) pode ser amplificada por reação em cadeia da polimerase (PCR) e ligada ao código de DNA para qualquer uma das sequências de alvejamento, proteínas exosporium ou fragmentos de proteína do exosporium aqui descritos, para formar um DNA molécula que codifica a proteína de fusão. A molécula de DNA que codifica a proteína de fusão pode ser clonada em qualquer vetor adequado, por exemplo, um vetor plasmídico. O vetor compreende adequadamente um local de clonagem múltiplo no qual a molécula de DNA que codifica a proteína de fusão pode ser facilmente inserida. O vetor também contém adequadamente um marcador selecionável, como um gene de resistência a antibióticos, de modo que bactérias transformadas, transfectadas ou acasaladas com o vetor possam ser prontamente identificadas e isoladas. Onde o vetor é um plasmídeo, o plasmídeo também adequadamente compreende uma origem de replicação. Alternativamente, o DNA que codifica a proteína de fusão pode ser integrado ao DNA cromossômico do membro da família B. cereus ou do hospedeiro da bactéria formadora de esporos.
E. ETIQUETAS, MARCADORES E LIGANTES QUE PODEM SER INCLUÍDOS NAS PROTEÍNAS DE FUSÃO
[1304] Qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas também pode compreender sequências polipeptídicas adicionais que não fazem parte da sequência de alvejamento, proteína do exosporium, fragmento de proteína do exosporium ou a enzima que possui atividade de ACC desaminase, fosfolipase, lipase, xilanase, xilosidase, lactonase, quitosanase, protease, glucanase, proteína expansina, fitase, fosfatase ácida, pectinase ou mananase. Por exemplo, a proteína de fusão pode incluir etiquetas ou marcadores para facilitar a purificação ou visualização da proteína de fusão (por exemplo, um marcador de poli-histidina ou uma proteína fluorescente como GFP ou YFP) ou visualização de esporos recombinantes do membro da família Bacillus cereus que expressam a proteína de fusão.
[1305] A expressão de proteínas de fusão no exosporium de um membro da família Bacillus cereus usando as sequências de alvejamento, proteínas exosporium e fragmentos de proteínas exosporium aqui descritas é aprimorada devido à falta de estrutura secundária nos terminais amino dessas sequências, o que permite o dobramento nativo das proteínas fundidas e retenção de atividade. O dobramento adequado pode ser aprimorado ainda mais pela inclusão de um ligante curto de aminoácidos entre a sequência de alvejamento, proteína do exosporium, fragmento de proteína do exosporium, proteína de revestimento de esporos e a enzima que possui atividade de ACC desaminase, fosfolipase, lipase, xilanase, xilosidase, lactonase, quitosanase, protease, glucanase, proteína expansina, fitase, fosfatase ácida, pectinase ou mananase.
[1306] Assim, qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas pode compreender um ligante de aminoácidos entre a sequência de alvejamento, a proteína do exosporium ou o fragmento de proteína do exosporium e a enzima com atividade de ACC desaminase, fosfolipase, lipase, xilanase, xilosidase, lactonase, quitosanase, protease, glucanase, proteína expansina, fitase, fosfatase ácida, pectinase ou mananase.
[1307] O ligante pode compreender um ligante de polialanina ou um ligante de poliglicina. Um ligante compreendendo uma mistura de resíduos de alanina e glicina também pode ser usado.
[1308] Por exemplo, em uma proteína de fusão em que a sequência de alvejamento compreende a SEQ ID NO: 1, uma proteína de fusão pode ter uma das seguintes estruturas:
[1309] Sem ligante: SEQ ID NO: 1 - POI
[1310] Ligante de Alanina: SEQ ID NO: 1–An–POI
[1311] Ligaante de glicina: SEQ ID NO: 1–Gn–POI
[1312] Ligante misto de Alanina e Glicina: SEQ ID NO: 1-(A/G)n-POI
[1313] onde An, Gn e (A/G)n são qualquer número de alaninas, qualquer número de glicina ou qualquer número de uma mistura de alaninas e glicina, respectivamente. Por exemplo, n pode ser de 1 a 25 e é de preferência 6 a 10. Onde o ligante compreende uma mistura de resíduos de alanina e glicina, qualquer combinação de resíduos de glicina e alanina pode ser usada. Nas estruturas acima, "POI" significa "proteína de interesse" e representa a enzima que possui atividade de ACC desaminase, fosfolipase, lipase, xilanase, xilosidase, lactonase, quitosanase, protease, glucanase, proteína expansina, fitase, fosfatase ácida, pectinase ou mananase.
[1314] Alternativamente ou adicionalmente, o ligante pode compreender um site de reconhecimento de protease. A inclusão de um local de reconhecimento de protease permite a remoção alvo, após a exposição a uma protease que reconheça o local de reconhecimento de protease, da enzima possuindo atividade de ACC-desaminase, fosfolipase, lipase, xilanase, xilosidase, lactonase, quitosanase, protease, glucanase, proteína expansina, fitase, fosfatase ácida, pectinase ou mananase.
[1315] Onde a proteína de fusão compreende um ligante e um peptídeo sinal, o ligante seria tipicamente terminal amino ao peptídeo sinal. Por exemplo, onde a proteína de fusão compreende a SEQ ID NO: 96, um ligante de polialanina, a sequência de sinal da SEQ ID NO: 335 e a liquenase da SEQ
ID NO: 295, esses elementos seriam tipicamente dispostos na seguinte ordem dentro da proteína de fusão, indo do terminal amino da proteína de fusão para o terminal carbóxi: SEQ ID NO: 96– An–SEQ ID NO: 335–SEQ ID NO: 295.
II. HOSPEDEIROS DE MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS RECOMBINANTE PARA EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS DE FUSÃO
[1316] A invenção refere-se ainda a membros da família Bacillus cereus recombinante que expressam uma proteína de fusão. A proteína de fusão pode ser qualquer uma das proteínas de fusão descritas na Seção I acima.
[1317] O membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender qualquer espécie de Bacillus capaz de produzir um exosporium. Por exemplo, o membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus samanii, Bacillus gaemokensis, Bacillus weihenstephensis, Bacillus toyoiensis, ou uma combinação destes. O membro da família Bacillus cereus recombinante compreende adequadamente Bacillus thuringiensis ou Bacillus mycoides.
[1318] Para gerar um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão, qualquer membro da família Bacillus cereus pode ser conjugado, transduzido ou transformado com um vetor que codifica a proteína de fusão usando métodos padrão conhecidos na técnica (por exemplo, por eletroporação). As bactérias podem então ser rastreadas para identificar transformantes por qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, onde o vetor inclui um gene de resistência a antibióticos, as bactérias podem ser rastreadas quanto à resistência a antibióticos. Alternativamente, o DNA que codifica a proteína de fusão pode ser integrado ao DNA cromossômico de um hospedeiro membro da família B. cereus. O membro da família recombinante Bacillus cereus pode então ser exposto a condições que induzirão a esporulação. As condições adequadas para induzir a esporulação são conhecidas na técnica. Por exemplo, o membro da família Bacillus cereus recombinante pode ser semeado em placas de ágar e incubado a uma temperatura de cerca de 30 °C por vários dias (por exemplo, 3 dias).
[1319] Assim, o membro da família Bacillus cereus recombinante pode estar na forma de um esporo.
[1320] As cepas inativadas, cepas não tóxicas ou cepas manipuladas geneticamente de qualquer uma das espécies acima também podem ser adequadamente utilizadas. Por exemplo, um Bacillus thuringiensis que não possui a toxina Cry pode ser usado. Alternativamente ou adicionalmente, uma vez gerados os esporos recombinantes da família B. cereus que expressam a proteína de fusão, eles podem ser inativados para impedir germinação adicional uma vez em uso. Qualquer método para inativar esporos bacterianos que é conhecido na técnica pode ser usado. Os métodos adequados incluem, sem limitação, tratamento térmico, irradiação gama, radiação de raios X, radiação UV-A, radiação UV-B, tratamento químico (por exemplo, tratamento com glutaraldeído, formaldeído, peróxido de hidrogênio, ácido acético, alvejante ou qualquer combinação) ou uma combinação dos mesmos. Em alternativa, podem ser utilizados esporos derivados de cepas não toxigénicas, ou cepas inactivadas genética ou fisicamente.
[1321] Assim, o membro da família recombinante Bacillus cereus pode estar na forma de um esporo, em que o esporo é inativado.
[1322] O membro da família Bacillus cereus recombinante pode coexpressar duas ou mais de qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas. Por exemplo, o membro da família recombinante Bacillus cereus pode coexpressar pelo menos uma proteína de fusão que compreende uma xiloglucanase juntamente com uma proteína de fusão que compreende uma mananase.
[1323] Muitas cepas de membros da família Bacillus cereus têm atributos benéficos inerentes. Por exemplo, algumas linhagens têm efeitos promotores de crescimento de plantas. Outras cepas são endofíticas.
Algumas cepas são endofíticas e têm efeitos promotores de crescimento de plantas.
[1324] Assim, qualquer um dos membros da família recombinante de Bacillus cereus aqui descritos pode compreender uma cepa de bactérias promotoras de crescimento de plantas, uma cepa endofítica de bactérias ou uma cepa de bactérias que é tanto promotora de crescimento de plantas quanto endofítica.
[1325] A cepa de bactérias promotoras de crescimento de plantas pode compreender uma cepa de bactérias que produz uma toxina inseticida (por exemplo, uma toxina Cry), produz um composto fungicida (por exemplo, uma β-1,3-glucanase, uma quitosanase, uma lyticase ou uma combinação de qualquer um deles), produz um composto nematocida (por exemplo, uma toxina Cry), produz um composto bacteriocida, é resistente a um ou mais antibióticos, compreende um ou mais plasmídeos de replicação livre, liga-se a raízes de plantas, coloniza raízes de plantas, formas biofilmes, solubiliza nutrientes, secreta ácidos orgânicos ou qualquer combinação dos mesmos.
[1326] Por exemplo, o membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender: (a) Bacillus mycoides BT155 (NRRL Nº B- 50921), (b) Bacillus mycoides EE118 (NRRL Nº B-50918), (c) Bacillus mycoides EE141 (NRRL Nº B-50916), (d) Bacillus mycoides BT46-3 (NRRL No B-50922), (e) Bacillus cereus membro da família EE128 (NRRL Nº B-50917), (f) Bacillus thuringiensis BT013A (NRRL Nº B-50924), (g) membro da família Bacillus cereus EE349 (NRRL Nº B-50928), (h) membro da família Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119), (i) Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120), (j) Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121), (k) membro da família Bacillus cereus EE439 (NRRL B-50979); (l) Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B- 50974); (m) Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977); (n) Bacillus thuringiensis EE319 (NRRL B-50983); (o) Bacillus mycoides EE116 (NRRL Nº B-50919); ou (p) Bacillus thuringiensis EE-B00184 (NRRL B-67122). Por exemplo, o membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender Bacillus thuringiensis
BT013A (NRRL Nº B-50924) ou de Bacillus cereus membro da família EE349 (NRRL Nº B-50928).
[1327] Cada uma das cepas (a) a (g) e (o) foi depositada no Serviço de Pesquisa Agrícola (ARS) do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA), com o endereço 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 EUA, em 10 de março de 2014 e é identificado pelo número de depósito NRRL fornecido entre parênteses.Bacillus thuringiensis BT013A também é conhecido como Bacillus thuringiensis 4Q7. Cada uma das cepas (h) a (j) foi depositada no USDA ARS em 19 de agosto de 2015 e é identificada pelo número de depósito NRRL entre parênteses. Cada uma das cepas (k), (l) e (m) foi depositada no USDA ARS em 10 de setembro de 2014 e é identificada pelo número de depósito NRRL fornecido entre parênteses. A cepa (n) foi depositada no USDA ARS em 17 de setembro de 2014 e é identificada pelo número de depósito NRRL fornecido entre parênteses. A cepa (p) foi depositada no USDA ARS em 19 de agosto de 2015 e é identificada pelo número de depósito NRRL fornecido entre parênteses. Certifica-se que os depósitos foram feitos de acordo com os termos do Tratado de Budapeste e que: (i) durante a pendência deste pedido de patente, o acesso para os organismos depositados será conferido ao Comissário mediante pedido; (ii) todas as restrições à disponibilidade para o público dos materiais depositados serão irrevogavelmente removidas após concessão da patente, sob a 37 CFR § 1.808 (b); (iii) o depósito será mantido por um período de 30 anos ou 5 anos após o último pedido ou para a vida efetiva da patente, o que for maior; e (iv) o depósito será substituído se algum dia se tornar inviável.
[1328] Essas cepas foram isoladas das rizosferas de várias plantas vigorosas ou do interior das plantas (para cepas endofíticas) e foram identificadas por suas sequências 16S rRNA (listadas abaixo na Tabela 18) e por ensaios bioquímicos. As cepas foram identificadas pelo menos à sua designação por gênero por meio de bioquímica convencional e indicadores morfológicos. Os ensaios bioquímicos para cepas Gram-positivas confirmadas, como Bacillus, incluíram crescimento em meio PEA e ágar nutriente, exame microscópico, crescimento em meio NaCl a 5% e 7,5%, crescimento a pH 5 e pH 9, crescimento a 42 °C e 50 °C, a capacidade de produzir ácido após fermentação com celobiose, lactose, glicerol, glicose, sacarose, d-manitol e amido; produção de pigmentos fluorescentes; hidrólise de gelatina; redução de nitrato; produção de catalase, hidrólise de amido; reação de oxidase, produção de urease e motilidade. A identificação dessas cepas e a demonstração de seus efeitos promotores de crescimento de plantas e/ou capacidade de crescer endofiticamente são descritas mais adiante nos Exemplos a seguir.
TABELA 18. SEQUÊNCIAS DE 16S RRNA PARCIAIS
PARA MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS Cepa SEQ ID NO. para sequência parcial de RNA ribossômico 16S Bacillus mycoides EE118 200 Bacillus mycoides EE141 201 Bacillus mycoides BT46-3 202 Membro da família Bacillus cereus 203 EE128 Membro da família Bacillus cereus 204 EE349 Bacillus mycoides BT155 205 Membro da família Bacillus cereus 206 EE439 Bacillus thuringiensis EE417 207 Bacillus cereus EE444 208 Bacillus thuringiensis EE319 209 Bacillus thuringiensis EE-B00184 210 Bacillus mycoides EE-B00363 211 Bacillus pseudomycoides EE-B00366 212 Membro da família Bacillus cereus 213 EE-B00377 Bacillus thuringiensis BT013A 214 Bacillus mycoides EE116 215
[1329] Cada membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender uma cepa endofítica de bactérias. Por exemplo, a cepa endofítica de bactérias pode compreender o membro da família Bacillus cereus EE349, o membro da família Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444 ou Bacillus thuringiensis EE319, Bacillus thuringiensis EE-B00184, membro da família Bacillus cereus EE- B00377; Bacillus pseudomycoides EE-B00366; ou Bacillus mycoides EE- B00363.
[1330] O membro da família Bacillus cereus EE349 também é uma cepa de bactérias promotoras de crescimento de plantas e é descrito acima. Como discutido mais adiante nos Exemplos abaixo, também foi descoberto que o membro da família Bacillus cereus EE349 é endofítico.
[1331] O membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender uma mutação inativadora no gene BclA, no gene CotE ou no gene CotO (por exemplo, um nocaute no gene BclA, no gene CotE ou no gene CotO). Por exemplo, o membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender uma mutação inativadora no seu gene BclA (por exemplo, um knockout no gene BclA). Verificou-se que a expressão de proteínas de fusão em um membro da família Bacillus cereus recombinante possuindo uma tal mutação resulta em níveis aumentados de expressão da proteína de fusão.
[1332] Como descrito mais abaixo na Seção IV, o membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender uma mutação ou outra modificação que permita a coleta de fragmentos de exosporium compreendendo as proteínas de fusão de esporos do membro da família Bacillus cereus recombinante. III. PROMOTORES PARA EXPRESSÃO DE
PROTEÍNAS DE FUSÃO EM MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS RECOMBINANTE
[1333] O DNA que codifica as proteínas de fusão usadas nos membros da família Bacillus cereus recombinante, fragmentos de exosporium, formulações, sementes de plantas e métodos aqui descritos está adequadamente sob o controle de um promotor de esporulação que causará expressão da proteína de fusão no exosporium de um endósporo do membro da família B. cereus (por exemplo, um promotor bclA nativo de um membro da família B. cereus).
[1334] Assim, qualquer uma das proteínas de fusão descritas acima na Seção I pode ser expressa no membro da família Bacillus cereus recombinante sob o controle de um promotor de esporulação que é nativo da sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium da proteína de fusão, ou uma porção desse promotor.
[1335] Qualquer uma das proteínas de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor de esporulação de alta expressão.
[1336] O promotor de esporulação de alta expressão pode compreender uma sequência promotora de polimerase específica para esporulação de sigma-K.
[1337] Para facilitar a referência, as sequências ilustrativas de nucleotídeos para promotores que podem ser usadas para expressar qualquer uma das proteínas de fusão em um membro da família Bacillus cereus recombinante são fornecidas na Tabela 19 abaixo, juntamente com suas SEQ ID NOs. A Tabela 19 também fornece sequências promotoras mínimas ilustrativas para muitos dos promotores. Na Tabela 19, as sequências promotoras da polimerase específicas da esporulação do sigma-K nos promotores são indicadas por texto em negrito e sublinhado. Várias das sequências têm múltiplas sequências de sigma K que se sobrepõem. As sobreposições são indicadas com sublinhado duplo na tabela. As sequências promotoras estão imediatamente a montante do códon de início para cada um dos genes indicados. Por outras palavras, nas sequências mostradas na Tabela 19 abaixo, o último nucleótido da sequência promotora precede imediatamente o primeiro nucleótido do codão de iniciação para a região codificante do gene que codifica a proteína indicada.
TABELA 19. SEQUÊNCIAS PROMOTORAS PARA
EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO EM MEMBROS DA FAMÍLIA
BACILLUS CEREUS RECOMBINANTE Promotor Sequência Promotora (SEQ ID NO) Promotor ExsY TTTCTTAATCCTTTACCCTTTACTTTTGTAAAAGTTGATACACTTCCA (B. cereus TCCGGCTCTGTAATTTCTAATTCATCAATAAATGGTCTTCGCAAAAA F837/76) GCCTGTAATTTTATCATAAACAATTAAACGAGTGAGCCTAAAAGCAG (SEQ ID NO: 37) CTAACGCGAAAATAAAAAATAAAAGCCAGCTTGTAAACAGCATAATT
CCACCTTCCCTTATCCTCTTTCGCCTATTTAAAAAAAGGTCTTGAGA TTGTGACCAAATCTCCTCAACTCCAATATCTTA
TTAATGTAAATACAAACAAGAAGATAAGGA Promotor mínimo ACCAAATCTCCTCAACTCCAATATCTTA ExsY TTAATGTAAATACAAACAAGAAGATAAGGA (B. cereus F837/76) (SEQ ID NO: 38) Promotor ACCACCTACCGACGATCCAATCTGTACATTCCTAGCTGTACCAAAT ExsFA/BxpB GCAAGATTAATATCGACTAACACTTGTCTTACTGTTGATTTAAGTTG (B. anthracis CTTCTGTGCGATTCAATGCTTGCGTGATGTTACGATTTAAAACTAAA Sterne) TAATGAGCTAAGCATGGATTGGGTGGCAGAATTATCTGCCACCCAA (SEQ ID NO: 39) TCCATGCTTAACGAGTATTATTATGTAAATTTCTTAAAATTGGGAACT
TGTCTAGAACATAGAACCTGTCCTTTTCATTAACTG
AAAGTAGAAACAGATAAAGGAGTGAAAAAC Promotor mínimo ACATAGAACCTGTCCTTTTCATTAACTGAAAGTAGAAACAGATAAAG ExsFA/BxpB (B. GAGTGAAAAAC anthracis Sterne) (SEQ ID NO: 40) Promotor TAGAAGAAGAACGCCGACTACTTTATGTCGCAATTACACGGGCGAA CotY/CotZ (B. AGAAGAACTTTACATTTCCTCTCCGCAATTTTTTAGAGGAAAAAAAT anthracis Sterne) TAGATATATCTCGTTTTTTATACACTGTGCGAAAAGATTTACCTGAAA (SEQ ID NO: 41) AGACATCCACTAAATAAGGATGTCTTTTTTTATATTGTATTATGTACA
TCCCTACTATATAAATTCCCTGCTTTTATCGTAAGAATTAACGTAATA TCAACCATATCCCGTTCATATTGTA
GTAGTGTATGTCAGAACTCACGAGAAGGAGTGAACATA Promotor mínimo TCAACCATATCCCGTTCATATTGTAGTAGTGTATGTCAGAACTCACG CotY/CotZ (B. AGAAGGAGTGAACATA anthracis Sterne) (SEQ ID NO: 42) Promotor CotO TAACTCAATCTTAAGAGAAATTGAGGAGCGCGCACCACTTCGTCGT (B. cereus) ACAACAACGCAAGAAGAAGTTGGGGATACAGCAGTATTCTTATTCA (SEQ ID NO: 123) GTGATTTAGCACGCGGCGTAACAGGAGAAAACATTCACGTTGATTC
AGGGTATCATATCTTAGGATAAATATAATATTAATTTTAAAGGACAA TCTCTACATGTTGAGATTGTCCTTTTTATTTGTTCTTAGAAAGAACGA TTTTTAACGAAAGTTCTTACCACGTTATGAATATAAGTATAATAGTAC
ACGATTTATTCAGCTACGT Promotor mínimo ACGTTGATTCAGGGTATCATATCTTAGGATAAATATAATATTAATTT CotO (B. cereus) TAAAGGACAATCTCTACATGTTGAGATTGTCCTTTTTATTTGTTCTTA (SEQ ID NO: 124) GAAAGAACGATTTTATAGTATATATATATATATATATATATATATATAT
ATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATA Promotor ExsFB CATAAAAATCTACTTTTCTTGTCAAAGAGTATGCTTATATGCGTGCT (B. cereus CTTTTTATTTGGTTTTCTTTCATTTCTAAATAACATTTTCAACTCTATT F837/76) CATACTATTCTTTCAACTTTAGGTTACAAACTATTTCTGTAAGCGTAG
(SEQ ID NO: 125) TGTTTCTTTTGTACTATAGGCAGTTAGTTTTATCCATAACAGTACACC
TCTGCACTATTCACTATAAATTTTCATATATTATATTGTGCTTGTCCA AAACATGTGGTTATTACTCACGCGATCTAA
ATGAAAGAAAGGAGTGAAAAT Promotor mínimo ACTATTCACTATAAATTTTCATATATTATATTGTGCTTGTCCAAAACA ExsFB (B. cereus TGTGGTTATTACTCACGCGATCTAAATGAAAGAAAGGAGTGAAAAT F837/76) (SEQ ID NO: 126) Promotor InhA1 AATACATGATAATGAAATCCGATTTTGTGTTTTATATAGTGAATTATC (B. thuringiensis AAATATTGTGTAGATGAAACAAAGATAAAATCCCCATTAAACTCCCT serovar kurstaki CTATGGAAATTATAAATTGTTCGATAAAAACTTTCAATATTTTCAGAA cepa HD-1) AACATTGTTGAATTGTGATATATTCGTATGCTAACTATGAAATTTTTA (SEQ ID NO: 127) CAAATATATTAAAAACATTA
CATAATATGACTAAATATTGAAAAAATATTGAATTTTTAATAAAATTT
AATTTGTAATACATATTATTTATTAGGGGAGGAAATAAGGG Promotor mínimo AAAATTTAATTTGTAATACATATTATTTATTAGGGGAGGAAATAAGG de InhA1 (B. G thuringiensis serovar kurstaki cepa HD-1) (SEQ ID NO: 128) Promotor InhA2 AATTGTGCATATTGTCTTTTAAATTTTCTATCTAAGTTATTTAATATAT (B. mycoides cepa AATAAATAACTCTTTTTTGTGAGTTTTTTTGATACGAGGTAAATAATC 219298) AGTACAGGGTCTGACCAGAGGACTGGAGGGCATGATTCTATAAGG (SEQ ID NO: 129) GAATATTTACTATTCCATGATTATAGAACTATGTCTTTTTTATTGTATA
TAGAAGGGGGGATAGGTCTATATTATAGAACTTATATATATTGTGCA TTCCATATTATCAATTATCTAAATTTTAAGTCTTGTTACAATTAATAA
GGGAGGAAATAGTA Promotor mínimo ACTTATATATATTGTGCATTCCATATTATCAATTATCTAAATTTTAAG de InhA2 (B. TCTTGTTACAATTAATAAGGGAGGAAATAGTA mycoides cepa 219298) (SEQ ID NO: 130) Promotor ExsJ (B. AATGACGTTTTCAAGTTTGATTATCATTCATGTTTCCTATTTTAAGAG thuringiensis AAACATATAACTCAACTACTTTTTTCAATGGCATCTTTTATAGTACTT serovar kurstaki) AGAATAGGAAAACACTCAACTATAAGAAAAGTAAGGAGGAAATAA (SEQ ID NO: 131) Promotor mínimo ACTACTTTTTTCAATGGCATCTTTTATAGTACTTAGAATAGGAAAACA ExsJ (B. CTCAACTATAAGAAAAGTAAGGAGGAAATAA thuringiensis serovar kurstaki) (SEQ ID NO: 132) Promotor ExsH ATATGCTAATGCTTAGTTTTTATACTCAAGTTAAAATGTGCTTTTGGA (B. cereus CCTAAGAGATAAACGTGGAAAAATAAAATAAACTCTTAAGTTTAGG F837/76) TGTTTAATCTAAGCAGTCAATTATTAAAAACATATAATTAATATGTGA (SEQ ID NO: 133) GTCATGAACATAATTAAATAATGTTTTCAAGTTTAATTATCGTTCATG
TTTCCTATTTTAAGCAGAACAAATAACTCAATTACTTTTTTCGATTGG ATCTTTTTTAACTCTTATAATAGGAAAACACTCAACTATAAAAATAAG
TAAGGAGGAAATAA Promotor mínimo AATATGTGAGTCATGAACATAATTAAATAATGTTTTCAAGTTTAATTA ExsH (B. cereus TCGTTCATGTTTCCTATTTTAAGCAGAACAAATAACTCAATTACTTTT F837/76) TTCGATTGGATCTTTTTATACTTATAATAGGAAAACAGATATAAAAGA (SEQ ID NO: 134) Promotor YjcA TATAAAATAAAAGGGCGTGTATTTGCTACTGATGCAGTATTGTGTGC
GCCTAAAAATGGAATTTCACAACCAGATCCACATGTTGTTGTAGAAC
(B. thuringiensis AATCTTGTAATTCATTGATGAATTTTACAACGTCAACTACACAATGA serovar kurstaki GAAGAGCCATGGTGTTTATTTTCGTTACAACTCATTAATGTCACTCC cepa HD73) TTATCTTCTTGTTTGTATTTACATTAATAAGATATTGGAGTTGAGGA (SEQ ID NO: 135) GATTTGGTCACAATCTCAAGACCTTTTTTTTAAATAGGCGAAAGAGG
ATAAGGGAAGGTGGAATT Promotor mínimo TCTTGTTTGTATTTACATTAATAAGATATTGGAGTTGAGGAGATTTG YjcA GTCACAATCTCAAGACCTTTTTTTTAAATAGGCGAAAGAGGATAAGG (B. thuringiensis GAAGGTGGAATT serovar kurstaki cepa HD73) (SEQ ID NO: 136) Promotor YjcB ATCAACTTTTACAAAAGTAAAGGGTAAAGGATTAAGAAAGTGGATTG (B. thuringiensis GCGAATTATTAAGCTGTTATTGGTGTACAGGTGTATGGGTTAGTGC serovar kurstaki TTTTTTATTAGTTTTATATAATTGGATTCCGATCGTTGCAGAGCCGTT cepa HD73) ACTTGCATTATTAGCTATTGCAGGAGCAGCAGCAATCATTGAAACG (SEQ ID NO: 137) ATTACAGGATATTTTATGGGAGAATAATATATTTTCATAATACGAGA
AAAAGCGGAGTTTAAAAGAATGAGGGAACGGAAATAAAGAGTTGTT
CATATAGTA AATAGACAGAA Promotor mínimo ACGGAAATAAAGAGTTGTT CATATAGTA AATAGACAGAA YjcB (B. thuringiensis serovar kurstaki cepa HD73) (SEQ ID NO: 138) Promotor BclC TGAAGTATCTAGAGCTAATTTACGCAAAGGAATCTCAGGACAACAC (B. anthracis TTTCGCAACACCTATATTTTAAATTTAATAAAAAAAGAGACTCCGGA Sterne) GTCAGAAATTATAAAGCTAGCTGGGTTCAAATCAAAAATTTCACTAA (SEQ ID NO: 139) AACGATATTATCAATACGCAGAAAATGGAAAAAACGCCTTATCATAA
GGCGTTTTTTCCATTTTTTCTTCAAACAAACGATTTTACTATGACCAT TTAACTAATTTTTGCATCTACTATGATGAGTTTCATTCACATTCTCAT
TAGAAAGGAGAGATTTA Promotor mínimo ACCATTTAACTAATTTTTGCATCTACTATGATGAGTTTCATTCACATT BclC CTCATTAGAAAGGAGAGATTTA (B. anthracis Sterne) (SEQ ID NO: 140) Promotor AcpC GACTATGTTTATTCAGGATAAAATATAGCACTACACTCTCTCCTCTT (B. cereus ATTATGTAGCATCTCTCTAATCCATCATTTGTTTCATTTAGTTAAAAT F837/76) TGTAAATAAAATCACATGATTTGTCAATTATAATTGTCATTTCGACAA (SEQ ID NO: 141) TTAAACTTGTCAAAATAATTCTCATCATTTTTTCTCATCTTTCTAATAT
AGGACATACTACTATATATACAAAAGACAATATGCAAATGTTCATAC AAAAAATATTATTTTTCGATATATAATA
TTAACTGATTTTCTAACATCAAGGAGGGTACAT Promotor mínimo AGACAATATGCAAATGTTCATACAAAAAATATTATTTTTCGA AcpC (B. cereus TATATAATA TTAACTGATTTTCTAACATCAAGGAGGGTACAT F837/76) (SEQ ID NO: 142) Promotor InhA3 ATAGTGAGTAATATGGTAATCCATAGATTAAATAGTATAGAAAATAT (B. thuringiensis TTAATTCTTATTTTTATTAAAAAAGCATGAATCCCAGATTTACTGGGT serovar kurstaki TTTGATTGTAACTAAGAACATATAAAATTCACTGTTATTTATAGGAG cepa HD73) AGTCTGTTTGTTTTTATATCTTATGTATTTCACCCTGCATAAAAAA (SEQ ID NO: 143) ATATTTCTCAACATTTTATTTGTTGAAAAATATTGAATATTCGTATTAT
AACGAATATTATGTTGTTATCGGCAAAAAACGATAATTTGCAGACAC TGGGGAGGAAATACA
Promotor mínimo TCTTATGTATTTCACCCTGCATAAAAAAATATTTCTCAACATTT de InhA3 (B. TATTTGTTGAAAAATATTGAATATTCGTATTATAACGAATATTA thuringiensis TGTTGTTATCGGCAAAAAACGATAATTTGCAGACACTGGGGAG serovar kurstaki GAAATACA cepa HD73) (SEQ ID NO: 144) Promotor de CTTCGTCAGCAATAAGTGTGAGCGGAGAATTGGTTGATCTTGGCTT Alanina racemase TACAATTGGAGCATTGACGAAAGACTCTTTAACGTGGTCGCATAAC 1 (B. cereus GGAGTAGAATATATGCTCGTGTCTAAAGGTTTAGAGCCGAAGGAGC F837/76) TATTAATGGTTGCTCGTTCAGTTACAGAGAAGCAAGTGAAGTAAACT (SEQ ID NO: 145) TCTTAGACGTGGTGATATATGTGCACCACGTCTTTTCTTAGTTTGAA
GGGTGGATTTCATAAAAGAAGCATATAAAAGAATAAGCTTCGCAT
ATCGTGTATAAGGAAGTGTATTT Alanina racemase ATAAAAGAATAAGCTTCG CATATCGTG TATAAGGAAGTGTATTT 1 promotor mínimo (B. cereus F837/76) (SEQ ID NO: 146) Promotor de CATTTCAAATAATGAACGCTTCGATTGAATCGGAGCTATTTTCAAAT Alanina racemase CAATTTCAGTATATTGATCCAGCATTTGAATAGAAGTATCAACAGCA 2 (B. thuringiensis ACTTTAAGTTGATGCAATGCAGATTGTACAAACATTGTAATTCTCCT serovar kurstaki CTTCTCCGTATATAATAGTTTCTTGAGGGTATTATATCATGCTCAAA cepa HD73) ATTCCGAAAATTCTAGTAGTTTGACTAGCATATTGAAAAGTATTATA (SEQ ID NO: 147) TTGTAAAAGGTCATATGAAACGTGAAATAGAATGGAATGCAATTATT
GAGTTAGGAGTTAGACCA Alanina racemase TTATATTGTAAAAGGTCATATGAAACGTGAAATAGAATGGAATGCA 2 promotor ATTATTGAGTTAGGAGTTAGACCA mínimo (B. thuringiensis serovar kurstaki cepa HD73) (SEQ ID NO: 148) Promotor BclA (B. ATCGATGGAACCTGTATCAACCACTATAATTTCATCCACAATTTTTTC cereus F837/76) AACTGAGTCTAAACAACGGGCTATTGTCTTCTCCTCATCTCGAACAA (SEQ ID NO: 149) TCATACATAAACTAATTGTAATTCCTTGCTTGTTCAACATAATCACC
CTCTTCCAAATCAATCATATGTTATACATATACTAAACTTTCCATTTT TTTAAATTGTTCAAGTAGTTTAAGATTTCTTTTCAATAATTCAAATGT CCGTGTCATTTTCTTTCGGTTTTGCATCTACTA
TATAATGAACGCTTTATGGAGGTGAATTT Promotor mínimo AATCAATCATATGTTATACATATACTAAACTTTCCATTTTTTAAATTG de BclA (B. cereus TTCAAGTAGTTTAAGATTTCTTTTCAATAATTCAAATGTCCGTGTCAT F837/76) TTTCTTTCGGTTTTGCATCTACTA (SEQ ID NO: 150) TATAATGAACGCTTTATGGAGGTGAATTT Promotor BclB (B. GACCTGTAAGTCTGTAGGGAAGAATAATTTCAAGAGCCAGTGATAA thuringiensis TAGATTTTTTGTTTTTTCATTCTTATCTTGAATATAAATCACCTCATCT serovar konkukian TTTAATTAGAACGTAACCAATTTAGTATTTTGAAATAGAGCTATCATT cepa 97-27) TTATAATATGAATACTACTAGTTATAGAAACGGCAAAAAGTTTAATAT (SEQ ID NO: 151) ATGTAAAAATCATTTGGATATGAAAAAAGTAGCCATAGATTTTTTCG
AAATGATAAATGTTTTATTTTGTTAATTAGGAAACAAAAATGTGGAAT
GAGGGGGATTTAA Promotor mínimo ATATGAAAAAAGTAGCCATAGATTTTTTCGAAATGATAAATGTTTTAT de BclB (B. TTGTTAATTAGGAAACAAAAATGTGGAATGAGGGGGATTTAA thuringiensis serovar konkukian cepa 97-27)
(SEQ ID NO: 152) Promotor BxpA TTTTCATCTGCTACATCGTGAAGTAATGCTGCCATTTCAATTATAAA (B. anthracis cepa ACGATTTCCTCCTTCTTGCTCGGATAAAGAAATCGCCAGTTTATGTA Sterne) CACGCTCAATATGATACCAATCATGCCCACTGGCATCTTTTTCTAAA (SEQ ID NO: 153) ATATGTTTTACAAAAGTAATTGTTTTTTCTATCTTTTCTTGTTTTGTCA
TTTTATCTTCACCCAGTTACTTATTGTAACACGCCCGCATTTTTTCAT CACATATTTTCTTGTCCGCCCATACACTAGGTGGTAGGCATCATCA
TGAAGGAGGAATAGAT Promotor mínimo ACATATTTTCTTGTCCGCCCATACACTAGGTGGTAGGCATCATCAT BxpA (B. GAAGGAGGAATAGAT anthracis cepa Sterne) (SEQ ID NO: 154) Promotor BclE (B. GGTGACGACAACATATACAAGAGGCACTCCTGCTGGTACTGTAAC anthracis AGGAACAAATATGGGGCAAAGTGTAAATACATCGGGTATAGCACAA Sterne) GCTGTCCCGAATACAGATAATATGGATTCAACGGCGGGACTCCCTT (SEQ ID NO: 155) AAGAAATTAGGGGAGTCTTTATTTGGAAAAAGAGCTTATGTTACATA
AAAACAGGAGTAATTGTTTTAAAAGTAGTATTGGTGACGTTGTTAGA AAATACAATTTAAGTAGAAGGTGCGTTTTTATATGAAATATATTT
TATAGCTGTACTTTACCTTTCAAG Promotor mínimo ACAAGCTGTCCCGAATACAGATAATATGGATTCAACGGCGGGACT de BclE (B. CCCTTAAGAAATTAGGGGAGTCTTTATTTGGAAAAAGAGCTTATGTT anthracis ACATAAAAACAGGAGTAATTGTTTTAAAAGTAGTATTGGTGACGTTG Sterne) TTAGAAAATACAATTTAAGTAGAAGGTGCGTTTTTATATGAAATATA (SEQ ID NO: 156) TTTTATAGCTGTACTTTACCTTTCAAG Promotor BetA ATTTATTTCATTCAATTTTTCCTATTTAGTACCTACCGCACTCACAAA (B. anthracis AAGCACCTCTCATTAATTTATATTATAGTCATTGAAATCTAATTTAAT Sterne) GAAATCATCATACTATATGTTTTATAAGAAGTAAAGGTACCATACTT (SEQ ID NO: 157) AATTAATACATATCTATACACTTCAATATCACAGCATGCAGTTGAATT
ATATCCAACTTTCATTTCAAATTAAATAAGTGCCTCCGCTATTGTGAA TGTCATTTACTCTCCCTACTACATTTAATA
ATTATGACAAGCAATCATAGGAGGTTACTAC Promotor mínimo TAAGAAGTAAAGGTACCATACTTAATTAATACATATCTATACACTTC BetA AATATCACAGCATGCAGTTGAATTATATCCAACTTTCATTTCAAATTA (B. anthracis AATAAGTGCCTCCGCTATTGTGAATGTCATTTACTCTCCCTACTACA Sterne) TTTAATA ATTATGACAAGCAATCATAGGAGGTTACTAC (SEQ ID NO: 158) Promotor CotE (B. AGTTGTACAAGAATTTAAATCTTCACAAACATATGTAAATGACTTAC cereus AH820) TACAGCTAGTTGCAAGTACGATTTCTAACAACGTAACAGATGAAATA (SEQ ID NO: 159) TTAATTTCAACTAATGGCGATGTATTGAAGGGTGAAACGGGCGCAG
CGGTAGAAAGTAAAAAAGGAAATTGTGGTTGTTAAAGAGATGTCGA AATGACATCTCTTTTTTTAGTGGATTAAACGTAAGTTCTTCTCAAAAA AAGAATGACACATTCCGCTATTGTCACGCATATGATT
AAGTGAATAGTGATTGAGGAGGGTTACGA Promotor mínimo ACATTCCGCTATTGTCACGCATATGATTAAGTGAATAGTGATTGAG de CotE (B. GAGGGTTACGA cereus AH820) (SEQ ID NO: 160) Promotor ExsA AACGTTATTAGCGTAGACAAACAAGTAACGGCAGAAGCAGTTCTTG (B. cereus cepa CATTAAATCGTATGTTAGAGCGTGTGTAAAGCAACGGTATTCCCGT ATCC 10876) TGCTTTTTTTCATACATATAATCATAACGAGAACGAAATGGGCATAC (SEQ ID NO: 161) ATTGTTTTGAAGAAATCATTGTGGTTCTTTATGCTTATTCCACTTCGA
ATGATATTGAAAATCGAAGAAGTGATAAAAGTAAAAAGAAGTTAATG TTATTTAGAAAGAGTTACTTCATGAGATTTGTTACTTATAGATAAGTT
A TACAGGAGGGGGAAAAT Promotor mínimo TCATGAGATTTGTTACTTATAGATAAGTTATACAGGAGGGGGAAAA ExsA(B. cereus T cepa ATCC 10876) (SEQ ID NO: 162) Promotor ExsK AAGCCGCGGTCAATGCTGTATATGCAAATAAGATTGCAGCTTTACC (B. thuringiensis TGAAGAAGAGCGTGATAGCTTCATTGCTGAAAAACGAGAAGAGTAT serovar konkukian AAGAAAGATATTGATATTTACCATTTAGCATCAGAGATGGTCATTGA cepa 97-27) TGGTATTGTTCATCCAAACAATTTAAGAGAAGAGTTAAAAGGACGAT (SEQ ID NO: 163) TCGAAATGTATATGAGTAAATATCAAGTATTTACGGATCGTAAACAT
CCTGTTTATCCAGTTTAAAAGCCCTATTTAGGGCTTTCTTGCTCAAA
AAGTTAAGGAGGGGAAAACA Promotor mínimo TCAAGTATTTACGGATCGTAAACATCCTGTTTATCCAGTTTAAAAGC ExsK (B. CCTATTTAGGGCTCTTCTTGCTCAAAAAGTTAAGGAGGGGAAAACA thuringiensis serovar konkukian cepa 97-27) (SEQ ID NO: 164) Promotor ExsB AGGATTTCAGTGGGACGCCTCCTCTCTTCTTACATTAAATTAATCAT (B. cereus ACTATAAAATGAAAGAAATGAAATGAAAAATAGCGGAAAAATCAGAA F837/76) ATTTTTTCTGGTAGTATACAATATGTTACAATAAGCTTTGTCAATGA (SEQ ID NO: 165) AAGAAGGAATTCCGTGCAATGCACGGGAGAGGTTCGCGAACTCCC
TCTATAAAAAACTATGGAAACAACAATATCTTTAGGTATTGTTTTGTT TTTTTATTGTGACAGTTCAAGAACGTTCTTTCTTCTTATTCGTAGTAG
AGAAGGAGAATGAGTGAA Promotor mínimo ACTATGGAAACAACAATATCTTTAGGTATTGTTTTGTTTTTTTATTGT ExsB (B. cereus GACAGTTCAAGAACGTTCTTTCTTCTTCTTCTTATTCGTAGTAGAGA F837/76) AGGAGAATGAGTGAA (SEQ ID NO: 166) Promotor YabG TTTTGCACAACGCCGTAAAACTTTAATGAATAATTTATCAAATAATT (B. cereus AH820) TAAATGGTTTCCCGAAAGATAAAGAGCTGTTGGATCGAATTTTAACA (SEQ ID NO: 167) GAAGTAGGAATTGATCCAAAACGAAGAGGCGAAACGCTATCTATCG
AAGAGTTTGCGACATTAAGTAATGCATTAGTTCTTCATAAGTTATCA TAAGAATACAAAAGGGACAGTTCAATTTGAACTGTCCCTTTTGTCAC CTTTCTCCTCCTAAATTCATACTTTA
AAAACAGGTAAGATGGCCTAACGAGTTTGGAGGTAGGAGA Promotor mínimo TCTCCTCCTAAATTCATACTTTAAAAACAGGTAAGATGGCCTAACGA YabG (B. cereus GTTTGGAGGTAGGAGA AH820) (SEQ ID NO: 168) Promotor Tgl (B. GGAAACAGAAGTCATCCCATTTGAAAATGCAGCAGGTCGTATTATA thuringiensis GCTGATTTCGTTATGGTTTATCCGCCAGGGATTCCAATCTTTACTCC serovar konkukian GGGGGAAATTATTACACAAGACAACTTAGAGTATATTCGTAAAAACT cepa 97-27) TAGAAGCAGGTTTACCTGTACAAGGTCCTGAAGATATGACATTACA (SEQ ID NO: 169) AACATTACGCGTGATCAAAGAGTACAAGCCTATCAGTTGATAGGCT
TTTTTTCACCCTTTTTCCCTTTTCTCATACGATA
TTATGTAATGTAACGTATAGGTGGGGATACTACT Promotor mínimo ACCCTTTTTCCCTTTTCTCATACGATATTATGTAATGTAACGTATAG de Tgl (B. GTGGGGATACTACT thuringiensis serovar konkukian cepa 97-27) (SEQ ID NO: 170)
Promotor de ATTGTGGACCCTTAGCTCAGCTGGTTAGAGCAGACGGCTCATAACC superóxido GTCCGGTCGTAGGTTCGAGTCCTACAGGGTCCATATCCATTTCACA dismutase TGTTTATTATGTCGGCAGGAAGCTTCCTTGTAGAAGGGAGCTTTTTT (SODA1) (B. TATGAAATATATGAGCATTTTAATTGAAATGAAGTGGGAATTTTGCT cereus F837/76) ACTTTAATGATAGCAAGACAATGTGATTTATTTGTTTGCACCCTATG (SEQ ID NO: 171) GCAATTAGGGTAGAATGAAGTTGTATGTCACTTAAGTGGCAATACA
TAAACTG GGAGGAATATAACA Promotor mínimo ACTTAAGTGGCAATA CATAAACTG GGAGGAATATAACA de superóxido dismutase (SODA1) (B. cereus F837/76) (SEQ ID NO: 172) Promotor de AATATAACAGAAAATTCTGATGTTTTTTCAAATCCTATAATAAGGAGT superóxido GTTCCGTATGATGCCTTTATATTTTCCGGAAGATAAAACAGAATATA dismutase TTATTCCAGGGATTGTTTGTGTTCTATTTATCATCGGTGCGATTGCT (SODA2) (B. ACGTGGCGTATGTTCATTCGTGTATCAAAACGAGAAGCAGAGCGAT cereus AH820) TACAGAAAGTTGAAGAAAAGCTGTTAGCTGAAAAGAAACAGTAACT (SEQ ID NO: 173) CATTTTTGTATGTTTCCCTCTATGCTCGGACAATCTAAGGGCAGAAT
GTATTTTGGAGGGAATGAA Promotor mínimo TCCGGAAGATAAAACAGAATATATTATTCCAGGGATTGTTTGTGTTC de superóxido TATTTATCATCGGTGCGATTGCTACGTGGCGTATGTTCATTCGTGTA dismutase TCAAAACGAGAAGCAGAGCGATTACAGAAAGTTGAAGAAAAGCTGT (SODA2) (B. TAGCTGAAAAGAAACAGTAACTCATTTTTGTATGTTTCCCTCTATGC cereus AH820) TCGGACAATCTAAGGGCAGAATGTATTTTGGAGGGAATGAA (SEQ ID NO: 174) Promotor BclA TAATCACCCTCTTCCAAATCAATCATATGTTATACATATACTAAACT (B. anthracis TTCCATTTTTTTAAATTGTTCAAGTAGTTTAAGATTTCTTTTCAATAAT Sterne) TCAAATGTCCGTGTCATTTTCTTTCGGTTTTGCATCTACTATATAAT (SEQ ID NO: 175) GAACGCTTTATGGAGGTGAATTT Promotor AATTACATAACAAGAACTACATTAGGGAGCAAGCAGTCTAGCGAAA BAS1882 (B. GCTAACTGCTTTTTTATTAAATAACTATTTTATTAAATTTCATATATAC anthracis Sterne) AATCGCTTGTCCATTTCATTTGGCTCTACCCACGCATTTACTATTAG (SEQ ID NO: 176) TAATATGAATTTTTCAGAGGTGGATTTTATT Promotor do gene CTATGATTTAAGATACACAATAGCAAAAGAGAAACATATTATA 3572 TAACGATAAATGAAACTTATGTATATGTATGGTAACTGTATATATTAC (B. TACAATACAGTATACTCATAGGAGGTAGGT weihenstephensis KBAB 4) (SEQ ID NO: 177) Promotor de GGTAGGTAGATTTGAAATATGATGAAGAAAAGGAATAACTAAAAGG proteína YVTN β- AGTCGATATCCGACTCCTTTTAGTTATAAATAATGTGGAATTAGAGT hélice ATAATTTTATATAGGTATATTGTATTAGATGAACGCTTTATCCTTTAA (B. TTGTGATTAATGATGGATTGTAAGAGAAGGGGCTTACAGTCCTTTTT weihenstephensis TTATGGTGTTCTATAAGCCTTTTTAAAAGGGGTACCACCCCACACCC KBAB 4) AAAAACAGGGGGGGTTATAACTACATATTGGATGTTTTGTAACGTAC (SEQ ID NO: 178) AAGAATCGGTATTAATTACCCTGTAAATAAGTTATGTGTATATAAGG
TAACTTTATATATTCTCCTACAATAAAATAAAGGAGGTAATAAA Promotor Cry1A AACCCTTAATGCATTGGTTAAACATTGTAAAGTCTAAAGCATGGATA (B. thuringiensis ATGGGCGAGAAGTAAGTAGATTGTTAACACCCTGGGTCAAAAATTG HD-73) ATATTTAGTAAAATTAGTTGCACTTTGTGCATTTTTTCATAAGATGAG (SEQ ID NO: 179) TCATATGTTTTAAATTGTAGTAATGAAAAACAGTATTATATCATAATG
AATTGGTATCTTAATAAAAGAGATGGAGGTAACTTA
Promotor ExsY TAATTCCACCTTCCCTTATCCTCTTTCGCCTATTTAAAAAAAGGTCTT (B. thuringiensis GAGATTGTGACCAAATCTCCTCAACTCCAATATCTTATTAATGTAAA serovar konkukian TACAAACAAGAAGATAAGGA cepa 97-27) (SEQ ID NO: 180) Promotor CotY AGGATGTCTTTTTTTATATTGTATTATGTACATCCCTACTATATAAAT (B. thuringiensis TCCCTGCTTTTATCGTAAGAATTAACGTAATATCAACCATATCCCGG Al Hakam) CATATTGTA (SEQ ID NO: 181) GTAGTGTATGTCAGAACTCACGAGAAGGAGTGAACATAA Promotor YjcA TTAATGTCACTCCTTATCTTCTTGTTTGTATTTACATTAATAAGATAT (B. thuringiensis TGGAGTTGAGGAGATTTGGTCACAATCTCAAGACCTTTTTTAAATAG serovar kurstaki GCGAAAGAGGATAAGGGAAGGTGGAATT cepa HD73) (SEQ ID NO: 182) Promotor YjcB ATATATTTTCATAATACGAGAAAAAGCGGAGTTTAAAAGAATGAGGG (B. thuringiensis AACGGAAATAAAGAGTTGTT CATATAGTA AATAGACAGAA serovar kurstaki cepa HD73) (SEQ ID NO: 183) Promotor AAACTAAATAATGAGCTAAGCATGGATTGGGTGGCAGAATTATCTG ExsFA/BxpB CCACCCAATCCATGCTTAACGAGTATTATTATGTAAATTTCTTAAAA (B. thuringiensis TTGGGAACTTGTCTAGAACATAGAACCTGTCCTTTTCATTAACTGAA Al Hakam) AGTAGAAACAGATAAAGGAGTGAAAAC (SEQ ID NO: 184) Promotor de ATTCACTACAACGGGGATGAGTTTGATGCGGATACATATGAGAAGT Ramnose ACCGGAAAGTGTTTGTAGAACATTACAAAGATATATTATCTCCATCA (B. thuringiensis TAAAGGAGAGATGCAAAG Al Hakam) (SEQ ID NO: 185) Promotor CotO CGCGCACCACTTCGTCGTACAACAACGCAAGAAGAAGTTGGGG (B. anthracis ATACAGCAGTATTCTTATTCAGTGATTTAGCACGCGGCGTAAC Sterne) AGGAGAAAACATTCACGTTGATTCAGGGTATCATATCTTAGGA (SEQ ID NO: 186) TAAATATAATATTAATTTTAAAGGACAATCTCTACATGTTGAG
ATTGTCCTTTTTATTTGTTCTTAGAAAGAACGATTTTTAACGAA AGTTCTTACCACGTTATGAATATAAGTATAATAGTACACGATTT
ATTCAGCTACGTA Promotor Sigma K TATATCATATGTAAAATTAGTTCTTATTCCCACATATCATATAGAATC (B. anthracis GC Sterne) CATATTATACATGCAGAAAACTAAGTATGGTATTATTCTTAAATTGTT (SEQ ID NO: 187) TAGCACCTTCTAATATTACAGATAGAATCCGTCATTTTCAACAGTGA
ACATGGATTTCTTCTGAACACAACTCTTTTTCTTTCCTTATTTCCAAA
AAGAAAAGCAGCCCATTTTAAAATACGGCTGCTTGTAATGTACATTA Promotor InhA1 TATCACATAACTCTTTATTTTTAATATTTCGACATAAAGTGAAACTTT (B. thuringiensis AATCAGTGGGGGCTTTGTTCATCCCCCCACTGATTATTAATTGAACC Al Hakam) AAGGGATAAAAAGATAGAGGGTCTGACCAGAAAACTGGAGGGCAT (SEQ ID NO: 188) GATTCTATAACAAAAAGCTTAATGTTTATAGAATTATGTCTTTTTATA
TAGGGAGGGTAGTAAACAGAGATTTGGACAAAAATGCACCGATTTA
TCTGAATTTTAAGTTTTATAAAGGGGAGAAATG Operon 1 da ATTTTTTACTTAGCAGTAAAACTGATATCAGTTTTACTGCTTTTTCAT glicosil TTTTAAATTCAATCATTAAATCTTCCTTTTCTACATAGTCATAATGTT transferase do GTATGACATTCCGTAGGAGGCACTTATA cluster BclA
(B. thuringiensis serovar konkukian cepa 97-27) (SEQ ID NO: 189) Operon 2 da ACATAAATTCACCTCCATAAAGCGTTCATTATATAGTAGATGC glicosil AAAACCGAAAGAAAATGACACGGACATTTGAATTATTGAAAA transferase do GAAATCTTAAACTACTTGAACAATTTAAAAAAATGGAAAGTTT cluster BclA AGTATATGTATAACATATGATTGATTTGGAAGAGGGTGATTA (B. thuringiensis serovar kurstaki cepa HD73) (SEQ ID NO: 190) Promotor de TTCTATTTTCCAACATAACATGCTACGATTAAATGGTTTTTTGC glicosil AAATGCCTTCTTGGGAAGAAGGATTAGAGCGTTTTTTTATAGA transferase AACCAAAAGTCATTAACAATTTTAAGTTAATGACTTTTTTGTTT (B. thuringiensis GCCTTTAAGAGGTTTTATGTTACTATAATTATAGTATCAGGTAC Al Hakam) TAATAACAAGTATAAGTATTTCTGGGAGGATATATCA (SEQ ID NO: 191)
[1338] As sequências promotoras da polimerase específicas da esporulação do sigma-K nas sequências promotoras mostradas na Tabela 19 resultam em altos níveis de expressão da proteína de fusão durante a esporulação tardia. A sequência de consenso para a sequência promotora da polimerase específica para esporulação de sigma-K é CATANNNTN (SEQ ID NO: 361); no entanto, essa sequência pode compreender até duas mutações e ainda ser funcional. A sequência promotora da polimerase específica para esporulação de sigma-K é geralmente encontrada a montante do local de ligação ao ribossomo (RBS).
[1339] Os promotores com um alto grau de identidade de sequência com qualquer uma das sequências mostradas acima na Tabela 19 também podem ser usados para expressar as proteínas de fusão.
[1340] Por exemplo, a proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 80% de identidade em relação a uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NOs: 37-42 e 123-191.
[1341] A proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 85% de identidade em relação a uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NOs: 37-42 e 123-191.
[1342] A proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade em relação a uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NOs: 37-42 e 123-191.
[1343] A proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 95% de identidade em relação a uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NOs: 37-42 e 123-191.
[1344] A proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 98% de identidade em relação a uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NOs: 37-42 e 123-191.
[1345] A proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 99% de identidade em relação a uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NOs: 37-42 e 123-191.
[1346] A proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor compreendendo uma sequência de ácido nucleico com 100% de identidade em relação a uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NOs: 37-42 e 123-191.
[1347] Por exemplo, a proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor de BclA (por exemplo, SEQ ID NO: 149, 150, 175, 189 ou 190), um promotor de CotY (por exemplo, SEQ ID NO: 41, 42 ou 181), um promotor ExsY (por exemplo, SEQ ID NO: 37, 38 ou 180) ou um promotor de ramnose (por exemplo, SEQ ID NO: 185) ou um promotor com um alto grau de identidade de sequência com qualquer um desses promotores.
[1348] Assim, por exemplo, a proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 80% de identidade com uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NOs: 37, 38, 41, 42, 149, 150, 175, 180, 181, 185, 189 ou 190.
[1349] A proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 85% de identidade com uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NOs: 37, 38, 41, 42, 149, 150, 175, 180, 181, 185, 189 ou 190.
[1350] A proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade com uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NOs: 37, 38, 41, 42, 149, 150, 175, 180, 181, 185, 189 ou 190.
[1351] A proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 95% de identidade com uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NOs: 37, 38, 41, 42, 149, 150, 175, 180, 181, 185, 189 ou 190.
[1352] A proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 98% de identidade com uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NOs: 37, 38, 41, 42, 149, 150, 175, 180, 181, 185, 189 ou 190.
[1353] A proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 99% de identidade com uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NOs: 37, 38, 41, 42, 149, 150, 175, 180, 181, 185, 189 ou 190.
[1354] A proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor compreendendo uma sequência de ácido nucleico com 100% de identidade com uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NOs: 37, 38, 41, 42, 149, 150, 175, 180, 181, 185, 189 ou 190.
[1355] A proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor compreendendo uma sequência promotora de polimerase específica para esporulação de sigma-K, em que a sequência ou sequências promotoras de polimerase específicas para esporulação de sigma-K têm 100% de identidade com os nucleotídeos correspondentes de qualquer uma das SEQ ID NOs : 37-42 e 123-191.
[1356] As proteínas de fusão podem ser expressas sob o controle de um promotor que é nativo da sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium da proteína de fusão. Assim, por exemplo, onde a sequência de alvejamento é derivada de BclA, a proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor BclA nativo (por exemplo, SEQ ID NO: 149, 150, 175, 189 ou 190).
[1357] A Tabela 19 também fornece sequências promotoras mínimas ilustrativas. As proteínas de fusão podem ser expressas sob qualquer uma destas sequências promotoras mínimas.
[1358] Além disso, a proteína de fusão pode ser expressa sob uma porção de qualquer um dos promotores listados acima na Tabela 19, desde que a porção do promotor inclua uma sequência promotora de polimerase específica para esporulação de sigma-K. Por exemplo, a proteína de fusão pode ser expressa sob uma região promotora que compreende os primeiros 25, 50, 100, 150, 200, 250 ou 300 nucleotídeos a montante do códon de partida, desde que essa região compreenda uma esporulação sigma-K sequência promotora específica da polimerase.
IV. MUTAÇÕES E OUTRAS ALTERAÇÕES GENÉTICAS NOS MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS RECOMBINANTE QUE PERMITEM A COLETA DE EXOSPORIUM E FRAGMENTOS DE EXOSPORIUM GRATUITOS DERIVADOS DE TAIS MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS RECOMBINANTE
[1359] Conforme descrito a seguir, os membros da família recombinante Bacillus cereus que expressam proteínas de fusão que compreendem uma proteína ou peptídeo de interesse (por exemplo, uma enzima com atividade de ACC desaminase, uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase,
uma xilosidase, uma lactonase, uma quitosanase, uma protease, uma glucanase, uma fitase, uma fosfatase ácida, uma pectinase, uma mananase e/ou uma proteína expansina) e uma sequência de alvejamento, uma proteína do exosporium ou um fragmento de proteína do exosporium que tem como alvo a proteína de fusão para o exosporium de o membro da família Bacillus cereus recombinante pode ser usado para vários propósitos, incluindo a entrega de proteínas ou peptídeos de plantas, sementes, meio de crescimento vegetal ou área circundante a uma semente ou planta (por exemplo, via encharcamento do solo, aplicação foliar ou como tratamento de sementes). No entanto, em alguns casos, a presença dos microrganismos vivos pode não ser desejável e, em vez disso, seria desejável separar o esporo vivo das proteínas de fusão no exosporium na superfície externa do esporo. Por exemplo, em algumas aplicações, será desejável aumentar a atividade enzimática sem se preocupar com a integridade dos esporos. Em tais situações, o uso de fragmentos de exosporium que foram separados dos esporos pode ser preferido sobre o uso de microrganismos vivos possuindo a enzima em seu exosporium.
[1360] Além disso, para alguns usos, pode ser desejável reduzir a densidade do produto. Nesses casos, seria desejável separar o esporo denso do exosporium (contendo as proteínas de fusão). Além disso, em algumas circunstâncias, a presença de esporos vivos levaria a um potencial crescimento bacteriano em um produto, o que seria indesejável para algumas aplicações.
[1361] Mutações ou outras alterações genéticas (por exemplo, superexpressão de uma proteína) podem ser introduzidas nos membros da família Bacillus cereus recombinante que permitem que o exosporium livre seja separado dos esporos do membro da família Bacillus cereus recombinante. Esse processo de separação produz fragmentos de exosporium que contêm as proteínas de fusão, mas que são substancialmente livres dos próprios esporos. Por "substancialmente livre de esporos" significa que, uma vez que o exosporium livre é separado dos esporos, é obtida uma preparação que contém menos de 5% em volume de esporos, preferencialmente menos de 3% em volume de esporos, ainda mais preferencialmente menos 1%
em volume de esporos e, mais preferencialmente, não contém esporos ou, se estiverem presentes, são indetectáveis. Esses fragmentos de exosporium podem ser utilizados no lugar dos próprios membros da família Bacillus cereus recombinante em qualquer uma das formulações, sementes de plantas e métodos aqui descritos.
[1362] Fragmentos de exosporium derivados de esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante podem ser utilizados em qualquer uma das formulações, sementes de plantas e métodos aqui descritos. O membro da família Bacillus cereus recombinante expressa qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas. O membro da família Bacillus cereus recombinante também compreende uma mutação ou expressa uma proteína, em que a expressão da proteína é aumentada em comparação com a expressão da proteína em um membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem nas mesmas condições. A mutação ou a expressão aumentada da proteína resulta em esporos de membros da família Bacillus cereus com um exosporium que é mais fácil de remover do esporo em comparação com o exosporium de um esporo do tipo selvagem.
[1363] O membro da família Bacillus cereus recombinante: (i) pode compreender uma mutação no gene CotE; (ii) pode expressar uma proteína ExsY, em que a expressão da proteína ExsY é aumentada em comparação com a expressão da proteína ExsY em um membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem sob as mesmas condições e em que a proteína ExsY compreende uma carboxi etiqueta terminal compreendendo uma proteína globular; (iii) pode expressar uma proteína BclB, em que a expressão da proteína BclB é aumentada em comparação com a expressão da proteína BclB em um membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem sob as mesmas condições; (iv) pode expressar uma proteína YjcB, em que a expressão da proteína YjcB é aumentada em comparação com a expressão da proteína YjcB em um membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem sob as mesmas condições; (v) pode compreender uma mutação em Gene ExsY; (vi)
pode compreender uma mutação no gene CotY; (vii) pode compreender uma mutação no gene ExsA; ou (viii) pode compreender uma mutação no gene CotO.
[1364] O membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender uma mutação no gene CotE, como um knockout no gene CotE ou uma forma negativa dominante do gene CotE. A mutação no gene CotE pode inibir parcial ou completamente a capacidade do CotE de anexar o exosporium ao esporo.
[1365] O membro da família Bacillus cereus recombinante pode expressar uma proteína ExsY. A proteína ExsY compreende uma etiqueta do terminal carboxi compreendendo uma proteína globular (por exemplo, uma proteína verde fluorescente (GFP) ou uma variante da mesma), e a expressão da proteína ExsY é aumentada em comparação com a expressão da proteína ExsY em um ambiente selvagem membro da família Bacillus cereus nas mesmas condições. A proteína globular pode ter um peso molecular entre 25 kDa e 100 kDa. A expressão da proteína ExsY compreendendo a etiqueta do terminal carbóxi compreendendo uma proteína globular pode inibir a ligação da proteína ExsY aos seus alvos no exosporium.
[1366] O membro da família Bacillus cereus recombinante pode expressar uma proteína BclB. A expressão da proteína BclB pode resultar na formação de um exosporium frágil. A expressão da proteína BclB pode ser aumentada em comparação com a expressão da proteína BclB em um membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem sob as mesmas condições.
[1367] O membro da família recombinante Bacillus cereus pode expressar uma proteína YjcB. A expressão da proteína YjcB pode fazer com que o exosporium se forme em pedaços e não em uma estrutura completa. A expressão da proteína YjcB pode ser aumentada em comparação com a expressão da proteína YjcB em um membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem sob as mesmas condições.
[1368] O membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender uma mutação no gene ExsY, como um knockout no gene ExsY. A mutação no gene ExsY pode inibir parcial ou completamente a capacidade do ExsY de completar a formação do exosporium ou anexar o exosporium ao esporo.
[1369] O membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender uma mutação no gene CotY, tal como um knockout no gene CotY. A mutação no gene CotY pode resultar na formação de um exosporium frágil.
[1370] O membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender uma mutação no gene ExsA, tal como um knockout no gene ExsA. A mutação no gene ExsA pode resultar na formação de um exosporium frágil.
[1371] O membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender uma mutação no gene CotO, como um knockout no gene CotO ou uma forma negativa dominante do gene CotO. A mutação no gene CotO pode causar a formação de exosporium em tiras.
[1372] Para facilitar a referência, descrições de sequências ilustrativas para CotE, ExsY, BclB, YjcB, Cotj, ExsA e CotO são fornecidas na Tabela 20 abaixo. TABELA 20. SEQUÊNCIAS DE PROTEÍNAS QUE
PODEM SER MUTADAS OU ALTERADAS GENETICAMENTE PARA
PERMITIR A COLETA DE EXOSPORIUM LIVRE Proteína SEQ ID NO. CotE, grupo Bacillus cereus 192 ExsY, Bacillus thuringiensis 193 BclB, variante 1, Bacillus anthracis Sterne 194 BclB, variante 2, Bacillus anthracis Sterne 195 YjcB, Variante 1, Bacillus cereus 196 YjcB, Variante 2, Bacillus cereus 197 CotY, Bacillus cereus 198 CotO, Bacillus anthracis 199
[1373] Os fragmentos de exosporium podem ser preparados a partir de qualquer um desses membros da família Bacillus cereus recombinante e usados para vários propósitos, conforme descrito mais adiante.
Onde o membro recombinante da família Bacillus cereus expressa uma proteína de fusão, os fragmentos de exosporium compreenderão as proteínas de fusão. Após a purificação dos fragmentos de exosporium que contêm as proteínas de fusão dos esporos, é obtida uma preparação de proteínas sem células na qual as proteínas de fusão são estabilizadas e suportadas através de ligações covalentes aos fragmentos de exosporium.
[1374] Para remover o exosporium dos esporos dos membros da família recombinante Bacillus cereus que apresentam mutações ou outras alterações genéticas que permitem a coleta de exosporium livre, uma suspensão dos esporos pode ser sujeita a centrifugação ou filtração para produzir fragmentos de exosporium que são separados de os esporos. Onde o membro da família Bacillus cereus recombinante expressa uma proteína de fusão, os fragmentos de exosporium compreenderão a proteína de fusão.
[1375] Uma suspensão compreendendo os esporos pode ser submetida a centrifugação, seguida pela coleta do sobrenadante. O sobrenadante compreende os fragmentos do exosporium e é substancialmente livre de esporos.
[1376] Alternativamente, uma suspensão compreendendo os esporos pode ser submetida a filtração, seguida pela coleta do filtrado. O filtrado compreende os fragmentos do exosporium e é substancialmente livre de esporos.
[1377] A suspensão de esporos pode ser agitada ou interrompida mecanicamente antes da centrifugação ou filtração.
[1378] Os fragmentos de exosporium também podem ser separados dos esporos por centrifugação em gradiente, purificação por afinidade ou permitindo que os esporos se depositem na suspensão.
[1379] Devido às fortes ligações covalentes entre as proteínas de fusão e os fragmentos de exosporium, as proteínas de fusão tornam-se resistentes ao calor. A resistência ao calor das proteínas de fusão ligadas aos fragmentos de exosporium permite que sejam utilizadas em aplicações que requerem proteínas ou enzimas resistentes ao calor.
[1380] São fornecidos fragmentos de exosporium derivados de um membro da família Bacillus cereus recombinante.
[1381] Os fragmentos de exosporium podem ser derivados de qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinante que compreendem qualquer uma das mutações ou outras alterações genéticas descritas aqui que permitem a coleta de exosporium livre.
[1382] Os fragmentos de exosporium podem compreender qualquer uma das proteínas de fusão descritas acima na Seção I. V. FORMULAÇÕES
[1383] Uma formulação é fornecida. A formulação compreende qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinante aqui descritos. A formulação compreende ainda um veículo agricolamente aceitável.
[1384] Outra formulação é fornecida. A formulação compreende fragmentos de exosporium derivados de qualquer membro da família Bacillus cereus recombinante aqui descrito. A formulação compreende ainda um veículo agricolamente aceitável.
[1385] Em qualquer uma das formulações, a proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase C específica para fosfatidilcolina de Bacillus cereus e a formulação pode ainda compreender uma mananase ou uma xiloglucanase.
[1386] Em qualquer uma das formulações, a proteína de fusão pode compreender uma mananase e a formulação pode compreender ainda uma fosfolipase C específica de fosfatidilcolina de Bacillus cereus.
[1387] Em qualquer uma das formulações, a proteína de fusão pode compreender uma xiloglucanase e a formulação pode compreender ainda uma fosfolipase C específica de fosfatidilcolina de Bacillus cereus.
[1388] Em qualquer uma das formulações em que a formulação compreende uma fosfolipase C específica para fosfatidilcolina de Bacillus cereus e uma mananase ou uma xiloglucanase, a fosfolipase C específica para fosfatidilcolina de Bacillus cereus pode compreender SEQ ID NO:
257.
[1389] Em qualquer uma das formulações em que a formulação compreende uma fosfolipase C específica para a fosfatidilcolina de Bacillus cereus e uma mananase ou uma xiloglucanase, a mananase pode compreender a SEQ ID NO: 307.
[1390] Em qualquer uma das formulações em que a formulação compreende uma fosfolipase C específica para a fosfatidilcolina de Bacillus cereus e uma mananase ou uma xiloglucanase, a xiloglucanase pode compreender a SEQ ID NO: 299.
[1391] Também podem ser usadas sequências de aminoácidos com um alto grau de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 257, 307 e/ou 299. Assim, por exemplo, a fosfolipase C específica para a fosfatidilcolina de Bacillus cereus pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 257; a mananase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307; e/ou a xiloglucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade para a SEQ ID NP: 299.
[1392] Em qualquer uma das formulações em que a proteína de fusão compreende uma fosfolipase C específica para a fosfatidilcolina de Bacillus cereus e a formulação compreende ainda uma mananase ou uma xiloglucanase, a mananase ou a xiloglucanase também podem ser parte de uma proteína de fusão. Quando a mananase ou a xiloglucanase fazem parte de uma proteína de fusão, a proteína de fusão pode ser co-expressa no mesmo membro da família Bacillus cereus recombinante que a fosfolipase C. específica da fosfatidilcolina. Alternativamente ou adicionalmente, a formulação pode compreender um segundo Bacillus cereus recombinante membro da família que expressa uma proteína de fusão compreendendo a mananase ou a xiloglucanase.
[1393] Alternativamente ou adicionalmente, em qualquer uma das formulações em que a proteína de fusão compreende uma fosfolipase C específica para fosfatidilcolina de Bacillus cereus e a formulação compreende ainda uma mananase ou uma xiloglucanase, a mananase ou a xiloglucanase podem estar na forma de uma enzima livre.
[1394] Em qualquer uma das formulações em que a proteína de fusão compreende uma mananase e a formulação compreende ainda uma fosfolipase C específica para fosfatidilcolina de Bacillus cereus, a fosfolipase C específica para fosfatidilcolina de Bacillus cereus também pode ser parte de uma proteína de fusão. Onde a fosfolipase C específica para a fosfatidilcolina do Bacillus cereus faz parte de uma proteína de fusão, a proteína de fusão pode ser co-expressa no mesmo membro da família Bacillus cereus recombinante que a mananase. Alternativamente ou adicionalmente, a formulação pode compreender um segundo membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão compreendendo a fosfolipase C específica de fosfatidilcolina de Bacillus cereus.
[1395] Alternativamente ou adicionalmente, em qualquer uma das formulações em que a proteína de fusão compreende uma mananase e a formulação compreende ainda uma fosfolipase C específica de fosfatidilcolina de Bacillus cereus, a fosfolipase C específica de fosfatidilcolina de Bacillus cereus pode estar na forma de uma enzima livre.
[1396] Em qualquer uma das formulações em que a proteína de fusão compreende uma xiloglucanase e a formulação compreende ainda uma fosfolipase C específica de fosfatidilcolina de Bacillus cereus, a fosfolipase C específica de fosfatidilcolina de Bacillus cereus também pode ser parte de uma proteína de fusão. Onde a fosfolipase C específica da fosfatidilcolina de Bacillus cereus faz parte de uma proteína de fusão, a proteína de fusão pode ser coexpressa no mesmo membro da família Bacillus cereus recombinante que a xiloglucanase. Alternativamente ou adicionalmente, a formulação pode compreender um segundo membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão compreendendo a fosfolipase C específica de fosfatidilcolina de Bacillus cereus.
[1397] Alternativamente ou adicionalmente, em qualquer uma das formulações em que a proteína de fusão compreende uma xiloglucanase e a formulação compreende ainda uma fosfolipase C específica para fosfatidilcolina de Bacillus cereus, a fosfolipase C específica para fosfatidilcolina de Bacillus cereus pode estar na forma de uma enzima livre.
[1398] Em qualquer das formulações em que a formulação compreende um específico-fosfatidilcolina Bacillus cereus fosfolipase C e uma mananase, a fosfolipase C e a mananase estão de preferência presentes em quantidades sinergisticamente eficazes.
[1399] Em qualquer das formulações em que a formulação compreende um específico-fosfatidilcolina Bacillus cereus fosfolipase C e um xiloglucanase, a fosfolipase C e a xiloglucanase estão de preferência presentes em quantidades sinergisticamente eficazes.
[1400] Em qualquer uma das formulações, a proteína de fusão pode compreender uma xiloglucanase e a formulação pode ainda compreender uma mananase.
[1401] Em qualquer uma das formulações, a proteína de fusão pode compreender uma mananase e a formulação pode ainda compreender uma xiloglucanase.
[1402] Em qualquer uma das formulações em que a formulação compreende uma xiloglucanase e uma mananase, a xiloglucanase pode compreender a SEQ ID NO: 299.
[1403] Em qualquer uma das formulações em que a formulação compreende uma xiloglucanase e uma mananase, a mananase pode compreender a SEQ ID NO: 307.
[1404] Também podem ser usadas sequências de aminoácidos com um alto grau de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 299 e/ou 307. Assim, a mananase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307; e/ou a xiloglucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade para a SEQ ID NP: 299.
[1405] Em qualquer uma das formulações em que a proteína de fusão compreende uma xiloglucanase e a formulação compreende ainda uma mananase, a mananase também pode ser parte de uma proteína de fusão. Quando a mananase faz parte de uma proteína de fusão, a proteína de fusão pode ser coexpressa no mesmo membro da família Bacillus cereus recombinante que a xiloglucanase. Alternativamente ou adicionalmente, a formulação pode compreender um segundo membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão compreendendo a mananase.
[1406] Alternativamente ou adicionalmente, em qualquer uma das formulações em que a proteína de fusão compreende uma xiloglucanase e a formulação compreende ainda uma mananase, a mananase pode estar na forma de uma enzima livre.
[1407] Em qualquer uma das formulações em que a proteína de fusão compreende uma mananase e a formulação compreende ainda uma xiloglucanase, a xiloglucanase também pode ser parte de uma proteína de fusão. Onde a xiloglucanase faz parte de uma proteína de fusão, a proteína de fusão pode ser co-expressa no mesmo membro da família Bacillus cereus recombinante que a mananase. Alternativamente ou adicionalmente, a formulação pode compreender um segundo membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão compreendendo a xiloglucanase.
[1408] Alternativamente ou adicionalmente, em qualquer uma das formulações em que a proteína de fusão compreende uma mananase e a formulação compreende ainda uma xiloglucanase, a xiloglucanase pode estar na forma de uma enzima livre.
[1409] Em qualquer uma das formulações compreendendo uma xiloglucanase e uma mananase, a xiloglucanase e a mananase estão preferencialmente presentes em quantidades sinergisticamente eficazes.
[1410] Em qualquer uma das formulações, a proteína de fusão pode compreender uma fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 311, e a formulação pode ainda compreender uma fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 312.
[1411] Em qualquer uma das formulações em que a proteína de fusão compreende uma fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 311 e a formulação compreende ainda uma fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 312, a fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 312 também pode ser parte de uma fusão proteína. Em que a fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 312 é parte de uma proteína de fusão, a proteína de fusão pode ser co-expressa no mesmo membro da família Bacillus cereus recombinante que a fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 311. Alternativamente ou adicionalmente, a formulação pode compreender um segundo membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão compreendendo a fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 312.
[1412] Alternativamente ou adicionalmente, em qualquer uma das formulações em que a proteína de fusão compreende uma fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 311 e a formulação compreende ainda uma fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 312, a fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 312 pode ser sob a forma de uma enzima livre.
[1413] Em qualquer uma das formulações, a proteína de fusão pode compreender uma fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 312, e a formulação pode ainda compreender uma fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 311.
[1414] Em qualquer uma das formulações em que a proteína de fusão compreende uma fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 312 e a formulação compreende ainda uma fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 311, a fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 311 também pode ser parte de uma fusão proteína. Em que a fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 311 faz parte de uma proteína de fusão, a proteína de fusão pode ser co-expressa no mesmo membro da família Bacillus cereus recombinante que a fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 312. Alternativamente ou adicionalmente, a formulação pode compreender um segundo membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão compreendendo a fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 311.
[1415] Alternativamente ou adicionalmente, em qualquer uma das formulações em que a proteína de fusão compreende uma fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 312 e a formulação compreende ainda uma fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 311, a fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 311 pode ser sob a forma de uma enzima livre.
[1416] Outra formulação é fornecida. A formulação compreende um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão. Alternativamente ou adicionalmente, a formulação compreende fragmentos de exosporium derivados de um membro da família Bacillus cereus que expressa uma proteína de fusão. A proteína de fusão compreende uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. A proteína de fusão compreende ainda uma fosfatase ácida. A formulação compreende ainda uma segunda enzima.
[1417] A segunda enzima compreende adequadamente uma lipase, uma fosfolipase, uma glucanase, uma xilanase, uma pectinase, uma mananase, uma liquenase ou uma combinação de qualquer uma delas. A lipase, fosfolipase, glucanase, xilanase, pectinase, mananase ou liquenase podem compreender qualquer uma das lipases, fosfolipases, glucanases, xilanases, pectinases, mananases ou liquenases aqui descritas.
[1418] A fosfatase ácida compreende adequadamente uma fosfatase ácida de Triticum aestivum.
[1419] Por exemplo, a fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311 ou 312.
[1420] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311 ou 312.
[1421] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311 ou 312.
[1422] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311 ou 312.
[1423] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311 ou 312.
[1424] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311 ou 312.
[1425] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311 ou 312.
[1426] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311 ou 312.
[1427] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311 ou 312.
[1428] Outra formulação é fornecida. A formulação compreende um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão. Alternativamente ou adicionalmente, a formulação compreende fragmentos de exosporium derivados de um membro da família Bacillus cereus que expressa uma proteína de fusão. A proteína de fusão compreende uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. A proteína de fusão compreende ainda uma fosfolipase C. A formulação compreende ainda uma segunda enzima.
[1429] Em qualquer uma das formulações em que a proteína de fusão compreende uma fosfolipase C, a fosfolipase C pode compreender uma fosfolipase C. de Bacillus thuringiensis.
[1430] Em qualquer uma das formulações em que a proteína de fusão compreende uma fosfolipase C, a fosfolipase C pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250 ou SEQ ID NO: 251.
[1431] A fosfolipase C pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250 ou SEQ ID NO: 251.
[1432] A fosfolipase C pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250 ou SEQ ID NO: 251.
[1433] A fosfolipase C pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250 ou SEQ ID NO: 251.
[1434] A fosfolipase C pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250 ou SEQ ID NO: 251.
[1435] A fosfolipase C pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250 ou SEQ ID NO: 251.
[1436] A fosfolipase C pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250 ou SEQ ID NO: 251.
[1437] A fosfolipase C pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250 ou SEQ ID NO: 251.
[1438] A fosfolipase C pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250 ou SEQ ID NO: 251.
[1439] Em qualquer uma das formulações em que a proteína de fusão compreende uma fosfolipase C, a fosfolipase C pode consistir essencialmente em SEQ ID NO: 250 ou SEQ ID NO: 251.
[1440] Em qualquer uma das formulações em que a proteína de fusão compreende uma fosfolipase C, a fosfolipase C pode consistir em SEQ ID NO: 250 ou SEQ ID NO: 251.
[1441] A segunda enzima compreende adequadamente uma xilogluconase ou uma mananase.
[1442] Quando a segunda enzima compreende uma xilogluconase, a xilogluconase pode compreender uma xilogluconase de Paenibacillus pabuli ou uma xilogluconase de Bacillus licheniformis.
[1443] Quando a segunda enzima compreende uma xilogluconase, a xilogluconase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299 ou 300.
[1444] A xilogluconase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299 ou 300.
[1445] A xilogluconase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299 ou 300.
[1446] A xilogluconase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299 ou 300.
[1447] A xilogluconase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299 ou 300.
[1448] A xilogluconase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299 ou 300.
[1449] A xilogluconase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299 ou 300.
[1450] A xilogluconase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299 ou 300.
[1451] A xilogluconase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299 ou 300.
[1452] A xilogluconase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299 ou 300.
[1453] A fosfolipase C pode compreender a SEQ ID NO: 250 e a xilogluconase pode compreender a SEQ ID NO: 299. Alternativamente,
a fosfolipase C pode compreender a SEQ ID NO: 250 e a xilogluconase pode compreender a SEQ ID NO: 300.
[1454] Em qualquer uma das formulações aqui descritas compreendendo uma fosfolipase C e uma segunda enzima compreendendo uma xilogluconase, a fosfolipase C e a xilogluconase podem estar presentes em quantidades sinergicamente eficazes.
[1455] Quando a segunda enzima compreende uma mananase, a mananase pode compreender uma Bacillus circulans mananase ou uma Bacillus subtilis mannase.
[1456] Alternativamente ou adicionalmente, quando a segunda enzima compreende uma mananase, a mananase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307 ou 308.
[1457] A mananase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307 ou 308.
[1458] A mananase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307 ou 308.
[1459] A mananase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307 ou 308.
[1460] A mananase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307 ou 308.
[1461] A mananase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307 ou 308.
[1462] A mananase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307 ou 308.
[1463] A mananase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307 ou 308.
[1464] A mananase pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307 ou 308.
[1465] Em qualquer uma das formulações descritas aqui compreendendo uma fosfolipase C e uma segunda enzima compreendendo uma mananase, a fosfolipase C pode compreender a SEQ ID NO: 250 e a mananase pode compreender a SEQ ID NO: 308. Alternativamente, a fosfolipase C pode compreender a SEQ ID NO: 250 e a mananase pode compreender a SEQ ID NO: 307.
[1466] Em qualquer uma das formulações aqui descritas compreendendo uma fosfolipase C e uma segunda enzima compreendendo uma mananase, a fosfolipase C e a mananase podem estar presentes em quantidades sinergisticamente eficazes.
[1467] Qualquer uma das formulações descritas aqui pode ainda compreender um agroquímico. Agroquímicos adequados são descritos abaixo na Seção IX.
[1468] Qualquer uma das formulações descritas aqui pode ainda compreender um fertilizante, um bioestimulante ou uma combinação dos mesmos. Fertilizantes e bioestimulantes adequados são descritos abaixo na Seção IX. VI. SEMENTES TRATADAS
[1469] Uma semente de planta tratada é fornecida. A semente da planta pode ser tratada com qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinante aqui descritos. O membro recombinante da família Bacillus cereus pode expressar qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas.
[1470] Outra semente de planta tratada é fornecida. A semente da planta pode ser tratada com qualquer um dos fragmentos de exosporium aqui descritos. Os fragmentos de exosporium podem ser derivados de qualquer membro da família Bacillus cereus aqui descrito. Os fragmentos de exosporium podem compreender qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas.
[1471] Ainda outra semente de planta tratada é fornecida. A semente da planta pode ser tratada com qualquer uma das formulações aqui descritas.
[1472] Em qualquer uma das sementes de plantas tratadas, as sementes de plantas podem ser revestidas com o membro da família recombinante Bacillus cereus, os fragmentos de exosporium ou a formulação.
[1473] Os membros da família Bacillus cereus recombinante, fragmentos de exosporium ou formulações podem ser usados como tratamentos de sementes, por exemplo, coberturas ou revestimentos de sementes. As formulações de cobertura ou revestimento de sementes podem estar na forma de uma formulação de veículo líquido, uma formulação de pasta ou uma formulação em pó.
[1474] As formulações de cobertura ou revestimento de sementes podem ser aplicadas com aditivos convencionais que são fornecidos para fazer com que o tratamento de sementes tenha qualidades pegajosas para colar e revestir as sementes. Os aditivos adequados compreendem: talcos, grafites, gomas, polímeros estabilizadores, polímeros de revestimento, polímeros de acabamento, agentes antiderrapantes para fluxo e plantabilidade de sementes, agentes cosméticos e materiais celulósicos, como carboximetil celulose e similares.
[1475] As formulações de tratamentos de sementes podem ainda compreender agentes corantes e/ou outros aditivos.
[1476] Os membros da família Bacillus cereus recombinante, fragmentos de exosporium ou formulações da invenção podem ser aplicados como tratamentos de sementes por si mesmos ou podem ser aplicados com outros agroquímicos, como fungicidas, inseticidas, inoculantes, reguladores de crescimento de plantas, micróbios promotores de crescimento de plantas, fertilizantes, melhoradores de fertilizantes, nutrientes de sementes,
agentes de biocontrole, antídotos herbicidas e tratamentos de doenças de plântulas e com outros tratamentos convencionais de sementes.
[1477] A(s) formulação(ões) de tratamento de sementes podem ser aplicadas às sementes em um veículo adequado, como água ou pó. As sementes podem então secar e plantar da maneira convencional. Os membros da família Bacillus cereus recombinante ou fragmentos de exosporium podem ser aplicados diretamente à semente como uma solução ou em combinação com outros aditivos disponíveis no mercado. Por exemplo, os membros da família Bacillus cereus recombinante ou fragmentos de exosporium podem ser aplicados em combinação com o veículo aceitável (oou veículos aceitáveis) para plântulas (por exemplo, um veículo líquido ou um veículo sólido).
[1478] Soluções contendo os membros da família Bacillus cereus recombinante ou fragmentos de exosporium podem ser pulverizadas ou de outro modo aplicadas à semente (por exemplo, em uma pasta de sementes ou em uma imersão de sementes).
[1479] Os materiais sólidos ou secos que contêm membros da família Bacillus cereus recombinante ou fragmentos de exosporium também são úteis para promover a germinação, crescimento e proteção eficazes das mudas durante o estabelecimento inicial das mudas.
[1480] Os membros da família Bacillus cereus recombinante ou fragmentos de exosporium podem ser usados com um veículo solubilizante, como água, um tampão (por exemplo, tampão de citrato ou fosfato), outros agentes de tratamento (por exemplo, álcool ou outro solvente) e/ou qualquer outro agente solúvel.
[1481] Além disso, pequenas quantidades de intensificadores de agentes de secagem, como álcoois inferiores, etc., podem ser usadas em formulações de revestimento de sementes.
[1482] Tensoativos, emulsificantes e conservantes também podem ser adicionados em níveis relativamente baixos (por exemplo, cerca de 0,5% p/v ou menos), a fim de melhorar a estabilidade do produto de revestimento de sementes.
[1483] As sementes podem ser tratadas usando uma variedade de métodos incluindo, porém sem limitação, vertendo, bombeamento, garoa, ou pulverizando uma solução aquosa contendo os membros da família Bacillus cereus recombinante ou fragmentos de exosporium sobre ou mais de uma semente; ou pulverizar ou aplicar as membros da família Bacillus cereus recombinante ou fragmentos de exosporium sobre uma camada de sementes, quer com ou sem a utilização de um sistema transportador.
[1484] Os dispositivos de mistura úteis para o tratamento de sementes incluem, mas não estão limitados a, copos, bacias de mistura, tambores de mistura e dispositivos de aplicação de fluidos que incluem bacias ou tambores usados para conter a semente durante o revestimento.
[1485] Após o tratamento das sementes, as sementes podem ser secas ao ar ou opcionalmente uma corrente de ar seco pode ser usada para auxiliar na secagem dos revestimentos das sementes.
[1486] Os tratamentos de sementes que contêm membros da família Bacillus cereus recombinante ou fragmentos de exosporium podem ser aplicados usando qualquer máquina de tratamento de sementes disponível comercialmente ou também com qualquer(quaisquer) método(s) não comercial(ais) aceitável(eis), como o uso de seringas ou qualquer outra semente dispositivo de tratamento. VII. MÉTODOS PARA ESTIMULAR O CRESCIMENTO DAS PLANTAS E/OU PROMOVER A SAÚDE DAS PLANTAS
[1487] É fornecido um método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a saúde das plantas. O método compreende a aplicação de um membro da família recombinante Bacillus cereus a um meio de crescimento de plantas, a uma planta, a uma semente de planta ou uma área ao redor de uma planta ou a uma semente de planta. O membro da família recombinante Bacillus cereus pode compreender qualquer um dos membros da família recombinante Bacillus cereus aqui descritos. O membro recombinante da família Bacillus cereus pode expressar qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas.
[1488] Outro método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a saúde das plantas é fornecido. O método compreende a aplicação de fragmentos de exosporium a um meio de crescimento vegetal, a uma planta, a uma semente de planta ou a uma área circundante a uma planta ou a uma semente de planta. Os fragmentos de exosporium podem compreender fragmentos de exosporium derivados de qualquer membro da família Bacillus cereus recombinante aqui descrito. Os fragmentos de exosporium podem compreender qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas.
[1489] Ainda é fornecido outro método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a saúde das plantas. O método compreende a aplicação de uma formulação a um meio de crescimento vegetal, a uma planta, a uma semente de planta ou a uma área circundante a uma planta ou a uma semente de planta. A formulação pode compreender qualquer uma das formulações descritas aqui.
[1490] Em qualquer um dos métodos para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a saúde das plantas, a proteína de fusão pode compreender uma fosfolipase C específica à fosfatidilcolina de Bacillus cereus e o método pode ainda compreender a aplicação de uma mananase ou uma xiloglucanase ao meio de crescimento vegetal, planta, planta semente ou área circundante à planta ou à semente da planta.
[1491] Em qualquer um dos métodos para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a saúde das plantas, a proteína de fusão pode compreender uma mananase e o método pode ainda compreender a aplicação de uma fosfolipase C específica para a fosfatidilcolina de Bacillus cereus ao meio de crescimento vegetal, planta, semente de planta ou área circundante à planta ou à semente da planta.
[1492] Em qualquer um dos métodos para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a saúde das plantas, a proteína de fusão pode compreender uma xiloglucanase e o método pode ainda compreender a aplicação de uma fosfolipase C específica para a fosfatidilcolina de Bacillus cereus ao meio de crescimento vegetal, planta, semente de planta ou área circundante à planta ou à semente da planta.
[1493] Em qualquer um dos métodos que compreende a aplicação de uma fosfolipase C específica da fosfatidilcolina de Bacillus cereus e uma mananase ou uma xiloglucanase, a fosfolipase C específica da fosfatidilcolina de Bacillus cereus pode compreender a SEQ ID NO: 257.
[1494] Em qualquer um dos métodos que compreende a aplicação de uma fosfolipase C específica de fosfatidilcolina de Bacillus cereus e uma mananase ou uma xiloglucanase, a mananase pode compreender a SEQ ID NO: 307.
[1495] Em qualquer um dos métodos que compreende a aplicação de uma fosfolipase C específica para fosfatidilcolina de Bacillus cereus e uma mananase ou uma xiloglucanase, a xiloglucanase pode compreender a SEQ ID NO: 299.
[1496] Também podem ser usadas sequências de aminoácidos com um alto grau de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 257, 307 e/ou 299. Assim, por exemplo, a fosfolipase C específica para a fosfatidilcolina de Bacillus cereus pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 257; a mananase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307; e/ou a xiloglucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade para a SEQ ID NP: 299.
[1497] Em qualquer um dos métodos em que a proteína de fusão compreende uma fosfolipase C específica para a fosfatidilcolina de Bacillus cereus e o método compreende ainda a aplicação de uma mananase ou uma xiloglucanase, a mananase ou a xiloglucanase também podem ser parte de uma proteína de fusão. Quando a mananase ou a xiloglucanase fazem parte de uma proteína de fusão, a proteína de fusão pode ser co-expressa no mesmo membro da família Bacillus cereus recombinante que a fosfolipase C. específica da fosfatidilcolina. Alternativamente ou adicionalmente, o método pode compreender a aplicação de um segundo Bacillus recombinante membro da família cereus que expressa uma proteína de fusão compreendendo a mananase ou a xiloglucanase.
[1498] Alternativamente ou adicionalmente, em qualquer um dos métodos em que a proteína de fusão compreende uma fosfolipase C específica à fosfatidilcolina de Bacillus cereus e o método compreende ainda a aplicação de uma mananase ou uma xiloglucanase, a mananase ou a xiloglucanase pode estar na forma de uma enzima livre.
[1499] Em qualquer um dos métodos em que a proteína de fusão compreende uma mananase e o método compreende ainda a aplicação de uma fosfolipase C específica para fosfatidilcolina de Bacillus cereus, a fosfolipase C específica para fosfatidilcolina de Bacillus cereus também pode ser parte de uma proteína de fusão. Onde a fosfolipase C específica para a fosfatidilcolina do Bacillus cereus faz parte de uma proteína de fusão, a proteína de fusão pode ser co-expressa no mesmo membro da família Bacillus cereus recombinante que a mananase. Alternativamente ou adicionalmente, o método pode compreender a aplicação de um segundo membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão compreendendo a fosfolipase C específica de fosfatidilcolina de Bacillus cereus.
[1500] Alternativamente ou adicionalmente, em qualquer um dos métodos em que a proteína de fusão compreende uma mananase e o método compreende ainda a aplicação de uma fosfolipase C específica de fosfatidilcolina de Bacillus cereus, a fosfolipase C específica de fosfatidilcolina de Bacillus cereus pode estar na forma de uma enzima livre.
[1501] Em qualquer um dos métodos em que a proteína de fusão compreende uma xiloglucanase e o método compreende ainda a aplicação de uma fosfolipase C específica para fosfatidilcolina de Bacillus cereus, a fosfolipase C específica para fosfatidilcolina de Bacillus cereus também pode ser parte de uma proteína de fusão. Onde a fosfolipase C específica da fosfatidilcolina de Bacillus cereus faz parte de uma proteína de fusão, a proteína de fusão pode ser coexpressa no mesmo membro da família Bacillus cereus recombinante que a xiloglucanase. Alternativamente ou adicionalmente, o método pode compreender a aplicação de um segundo membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão compreendendo a fosfolipase C específica de fosfatidilcolina de Bacillus cereus.
[1502] Alternativamente ou adicionalmente, em qualquer um dos métodos em que a proteína de fusão compreende uma xiloglucanase e o método compreende ainda a aplicação de uma fosfolipase C específica para fosfatidilcolina de Bacillus cereus, a fosfolipase C específica para fosfatidilcolina de Bacillus cereus pode estar na forma de uma enzima livre.
[1503] Em qualquer um dos métodos que compreendem a aplicação de uma específica-fosfatidilcolina Bacillus cereus fosfolipase C e uma mananase, a fosfolipase C e a mananase estão de preferência presentes em quantidades sinergisticamente eficazes.
[1504] Em qualquer um dos métodos que compreende a aplicação de uma fosfolipase C específica para fosfatidilcolina e uma xiloglucanase de Bacillus cereus, a fosfolipase C e a xiloglucanase estão preferencialmente presentes em quantidades sinergicamente eficazes.
[1505] Em qualquer um dos métodos para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a saúde das plantas, a proteína de fusão pode compreender uma xiloglucanase e o método pode ainda compreender a aplicação de uma mananase ao meio de crescimento da planta, planta, semente de planta ou área ao redor da planta ou plantar sementes.
[1506] Em qualquer um dos métodos para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a saúde das plantas, a proteína de fusão pode compreender uma mananase e o método pode ainda compreender a aplicação de uma xiloglucanase ao meio de crescimento da planta, planta, semente de planta ou área ao redor da planta ou plantar sementes.
[1507] Em qualquer método que compreende a aplicação de uma xiloglucanase e uma mananase, a xiloglucanase pode compreender a SEQ ID NO: 299.
[1508] Em qualquer método que compreende a aplicação de uma xiloglucanase e uma mananase, a mananase pode compreender a SEQ ID NO: 307.
[1509] Também podem ser usadas sequências de aminoácidos com um alto grau de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 299 e/ou 307. Assim, a mananase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307; e/ou a xiloglucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299.
[1510] Em qualquer um dos métodos em que a proteína de fusão compreende uma xiloglucanase e o método compreende ainda a aplicação de uma mananase, a mananase também pode ser parte de uma proteína de fusão. Quando a mananase faz parte de uma proteína de fusão, a proteína de fusão pode ser coexpressa no mesmo membro da família Bacillus cereus recombinante que a xiloglucanase. Alternativamente ou adicionalmente, o método pode compreender a aplicação de um segundo membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão compreendendo a mananase.
[1511] Alternativamente ou adicionalmente, em métodos em que a proteína de fusão compreende uma xiloglucanase e o método compreende ainda a aplicação de uma mananase, a mananase pode estar na forma de uma enzima livre.
[1512] Em qualquer um dos métodos em que a proteína de fusão compreende uma mananase e o método compreende ainda a aplicação de uma xiloglucanase, a xiloglucanase também pode ser parte de uma proteína de fusão. Onde a xiloglucanase faz parte de uma proteína de fusão, a proteína de fusão pode ser co-expressa no mesmo membro da família Bacillus cereus recombinante que a mananase. Alternativamente ou adicionalmente, o método pode compreender a aplicação de um segundo membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão compreendendo a xiloglucanase.
[1513] Alternativamente ou adicionalmente, em qualquer um dos métodos em que a proteína de fusão compreende uma mananase e o método compreende ainda a aplicação de uma xiloglucanase, a xiloglucanase pode estar na forma de uma enzima livre.
[1514] Em qualquer um dos métodos compreendendo a aplicação de uma xiloglucanase e uma mananase, a xiloglucanase e a mananase estão preferencialmente presentes em quantidades sinergisticamente eficazes.
[1515] Em qualquer um dos métodos para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a saúde das plantas, a proteína de fusão pode compreender uma fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 311, e o método pode ainda compreender a aplicação de uma fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 312 à planta meio de crescimento, planta, semente de planta ou área ao redor da planta ou da semente da planta.
[1516] Em qualquer um dos métodos em que a proteína de fusão compreende uma fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 311 e o método compreende ainda a aplicação de uma fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 312, a fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 312 também pode ser parte de um proteína de fusão. Em que a fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 312 é parte de uma proteína de fusão, a proteína de fusão pode ser co-expressa no mesmo membro da família Bacillus cereus recombinante que a fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 311.
Alternativamente ou adicionalmente, o método pode compreender a aplicação de um segundo membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão compreendendo a fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 312.
[1517] Alternativamente ou adicionalmente, em qualquer um dos métodos em que a proteína de fusão compreende uma fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 311 e o método compreende ainda a aplicação de uma fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 312, a fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 312 pode estar na forma de uma enzima livre.
[1518] Em qualquer um dos métodos para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a saúde das plantas, a proteína de fusão pode compreender uma fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 312, e o método pode ainda compreender a aplicação de uma fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 311 à planta meio de crescimento, planta, semente de planta ou área ao redor da planta ou da semente da planta.
[1519] Em qualquer um dos métodos em que a proteína de fusão compreende uma fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 312 e o método compreende ainda a aplicação de uma fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 311, a fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 311 também pode ser parte de um proteína de fusão. Em que a fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 311 faz parte de uma proteína de fusão, a proteína de fusão pode ser co-expressa no mesmo membro da família Bacillus cereus recombinante que a fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 312. Alternativamente ou adicionalmente, o método pode compreender a aplicação de um segundo membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão compreendendo a fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 311.
[1520] Alternativamente ou adicionalmente, em qualquer um dos métodos em que a proteína de fusão compreende uma fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 312 e o método compreende ainda a aplicação de uma fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 311, a fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 311 pode estar na forma de uma enzima livre.
[1521] Outro método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a saúde das plantas é fornecido. O método compreende a aplicação de um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão a um meio de crescimento vegetal, a uma planta, a uma semente de planta ou a uma área ao redor de uma planta ou a uma semente de planta. A proteína de fusão compreende uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. A proteína de fusão compreende ainda uma xilosidase, uma histidina protease, uma fosfatase ácida ou uma combinação de qualquer uma delas.
[1522] Ainda é fornecido outro método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a saúde das plantas. O método compreende a aplicação de fragmentos de exosporium derivados de esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão em um meio de crescimento de plantas, uma planta, uma semente de planta ou uma área ao redor de uma planta ou uma semente de planta. A proteína de fusão compreende uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. A proteína de fusão compreende ainda uma xilosidase, uma histidina protease, uma fosfatase ácida ou uma combinação de qualquer uma delas.
[1523] Por exemplo, a proteína de fusão pode compreender uma xilosidase.
[1524] Quando a proteína de fusão compreende uma xilosidase, a xilosidase pode compreender uma Caldicellulosiruptor saccharolyticus xylosidase, uma Bacillus pumilus xylosidase, Bacillus subtilis xylosidase ou uma combinação dos mesmos.
[1525] Onde a proteína de fusão compreende uma xilosidase, a xilosidasepode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 274-276.
[1526] A xilosidase pode compreender um aminoácido sequência com pelo menos 75% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 274-276.
[1527] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 274-276.
[1528] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 274-276.
[1529] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 274-276.
[1530] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácido com pelo menos 95% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 274-276.
[1531] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 274-276.
[1532] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 274-276.
[1533] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 274-276.
[1534] A proteína de fusão pode compreender uma protease histidina.
[1535] A proteína de fusão pode compreender uma fosfatase ácida.
[1536] Um outro método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a saúde das plantas é fornecido. O método compreende a aplicação de um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão a um meio de crescimento vegetal, a uma planta, a uma semente de planta ou a uma área ao redor de uma planta ou a uma semente de planta. A proteína de fusão compreende uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. A proteína de fusão compreende ainda uma fosfatase ácida. O método compreende ainda a aplicação de uma segunda enzima ao meio de crescimento da planta, à planta, à semente da planta ou à área circundante à planta ou à semente da planta.
[1537] Outro método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a saúde das plantas é fornecido. O método compreende a aplicação de fragmentos de exosporium derivados de esporos de um Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão em um meio de crescimento de plantas, em uma planta, uma semente de planta ou em uma área ao redor de uma planta ou em uma semente de planta. A proteína de fusão compreende uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. A proteína de fusão compreende ainda uma fosfatase ácida. O método compreende ainda a aplicação de uma segunda enzima ao meio de crescimento da planta, à planta, à semente da planta ou à área circundante à planta ou à semente da planta.
[1538] Em qualquer um dos métodos que compreende a aplicação de uma segunda enzima ao meio de crescimento da planta, a planta, a semente da planta ou a área circundante à planta ou a semente da planta, a segunda enzima compreende adequadamente uma lipase, uma fosfolipase, uma glucanase, uma xilanase, uma pectinase, uma mananase, uma liquenase, uma xilogluconase ou uma combinação de qualquer uma delas.
[1539] Em qualquer um dos métodos em que a proteína de fusão compreende uma fosfatase ácida, a fosfatase ácida pode compreender uma fosfatase ácida de Triticum aestivum.
[1540] Em qualquer um dos métodos em que a proteína de fusão compreende uma fosfatase ácida, a fosfatase ácida pode compreender a sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311 ou 312.
[1541] A fosfatase ácida pode compreender a sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311 ou 312.
[1542] A fosfatase ácida pode compreender a sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311 ou 312.
[1543] A fosfatase ácida pode compreender a sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311 ou 312.
[1544] A fosfatase ácida pode compreender a sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311 ou 312.
[1545] A fosfatase ácida pode compreender a sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311 ou 312.
[1546] A fosfatase ácida pode compreender a sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311 ou 312.
[1547] A fosfatase ácida pode compreender a sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311 ou 312.
[1548] A fosfatase ácida pode compreender a sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311 ou 312.
[1549] Um outro método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a saúde das plantas é fornecido. O método compreende a aplicação de um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão a um meio de crescimento vegetal, a uma planta, a uma semente de planta ou a uma área ao redor de uma planta ou a uma semente de planta. A proteína de fusão compreende uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. A proteína de fusão compreende ainda uma fosfolipase C. O método compreende ainda a aplicação de uma segunda enzima ao meio de crescimento da planta, à planta, à semente da planta ou à área circundante à planta ou à semente da planta.
[1550] Outro método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a saúde das plantas é fornecido. O método compreende a aplicação de fragmentos de exosporium derivados de esporos de um Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão em um meio de crescimento de plantas, em uma planta, uma semente de planta ou em uma área ao redor de uma planta ou em uma semente de planta. A proteína de fusão compreende uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante. A proteína de fusão compreende ainda uma fosfolipase C. O método compreende ainda a aplicação de uma segunda enzima ao meio de crescimento da planta, à planta, à semente da planta ou à área circundante à planta ou à semente da planta.
[1551] Em qualquer um dos métodos em que a proteína de fusão compreende uma fosfolipase C, a fosfolipase C pode compreender uma fosfolipase C de Bacillus thuringiensis.
[1552] Em qualquer um dos métodos em que a proteína de fusão compreende uma fosfolipase C, a fosfolipase C pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250 ou SEQ ID NO: 251.
[1553] A fosfolipase C pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250 ou SEQ ID NO: 251.
[1554] A fosfolipase C pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250 ou SEQ ID NO: 251.
[1555] A fosfolipase C pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250 ou SEQ ID NO: 251.
[1556] A fosfolipase C pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250 ou SEQ ID NO: 251.
[1557] A fosfolipase C pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250 ou SEQ ID NO: 251.
[1558] A fosfolipase C pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250 ou SEQ ID NO: 251.
[1559] A fosfolipase C pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250 ou SEQ ID NO: 251.
[1560] A fosfolipase C pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250 ou SEQ ID NO: 251.
[1561] Em qualquer um dos métodos em que a proteína de fusão compreende uma fosfolipase C, a fosfolipase C pode consistir essencialmente em SEQ ID NO: 250 ou SEQ ID NO: 251.
[1562] Em qualquer um dos métodos em que a proteína de fusão compreende uma fosfolipase C, a fosfolipase C pode consistir em SEQ ID NO: 250 ou SEQ ID NO: 251.
[1563] Em qualquer um dos métodos que compreende a aplicação de uma segunda enzima ao meio de crescimento da planta, a planta, a semente da planta ou a área ao redor da planta ou a semente da planta, a segunda enzima pode compreender uma xilogluconase ou uma mananase.
[1564] Quando a segunda enzima compreende uma xilogluconase, a xilogluconase pode compreender uma xilogluconase de Paenibacillus pabuli ou uma xilogluconase de Bacillus licheniformis.
[1565] Quando a segunda enzima compreende uma xilogluconase, a xilogluconase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299 ou 300.
[1566] A xilogluconase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299 ou 300.
[1567] A xilogluconase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299 ou 300.
[1568] A xilogluconase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299 ou 300.
[1569] A xilogluconase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299 ou 300.
[1570] A xilogluconase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299 ou 300.
[1571] A xilogluconase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299 ou 300.
[1572] A xilogluconase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299 ou 300.
[1573] A xilogluconase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299 ou 300.
[1574] A xilogluconase pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299 ou 300.
[1575] Nos métodos, a fosfolipase C pode compreender a SEQ ID NO: 250 e a xilogluconase pode compreender a SEQ ID NO: 299. Alternativamente, a fosfolipase C pode compreender a SEQ ID NO: 250 e a xilogluconase pode compreender a SEQ ID NO: 300.
[1576] Em quaisquer métodos ou formulações aqui descritos compreendendo uma fosfolipase C e uma segunda enzima compreendendo uma xilogluconase, a fosfolipase C e a xilogluconase podem estar presentes em quantidades sinergicamente eficazes.
[1577] Quando a segunda enzima compreende uma mananase, a mananase pode compreender uma Bacillus circulans mananase ou uma Bacillus subtilis mannase.
[1578] Alternativamente ou adicionalmente, quando a segunda enzima compreende uma mananase, a mananase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307 ou 308.
[1579] A mananase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307 ou 308.
[1580] A mananase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307 ou 308.
[1581] A mananase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307 ou 308.
[1582] A mananase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307 ou 308.
[1583] A mananase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307 ou 308.
[1584] A mananase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307 ou 308.
[1585] A mananase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307 ou 308.
[1586] A mananase pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307 ou 308.
[1587] Em qualquer uma das formulações ou métodos aqui descritos compreendendo uma fosfolipase C e uma segunda enzima compreendendo uma mananase, a fosfolipase C pode compreender a SEQ ID NO: 250 e a mananase pode compreender a SEQ ID NO: 308. Alternativamente, a fosfolipase C pode compreender a SEQ ID NO: 250 e a mananase pode compreender a SEQ ID NO: 307.
[1588] Em qualquer uma das formulações ou métodos aqui descritos compreendendo uma fosfolipase C e uma segunda enzima compreendendo uma mananase, a fosfolipase C e a mananase podem estar presentes em quantidades sinergisticamente eficazes.
[1589] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, o método pode ainda compreender a inativação do membro da família Bacillus cereus recombinante antes da aplicação do membro da família Bacillus cereus recombinante ao meio de crescimento da planta, à planta, à semente da planta ou à área circundante à planta ou ao plantar sementes.
[1590] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, o método pode compreender a aplicação do membro da família Bacillus cereus recombinante, os fragmentos de exosporium ou a formulação ao meio de crescimento da planta.
[1591] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, envolvendo o uso de um meio de crescimento de plantas, o meio de crescimento de plantas pode compreender solo, água, uma solução aquosa, areia, cascalho, um polissacarídeo, cobertura morta, composto, turfa, palha, toras, argila, farelo de soja, extrato de levedura ou uma combinação dos mesmos.
[1592] Um meio de crescimento da planta pode compreender um fertilizante.
[1593] Um meio de crescimento das plantas pode consistir essencialmente em um fertilizante.
[1594] Qualquer um dos métodos aqui descritos pode ainda compreender a suplementação do meio de crescimento da planta com um substrato para uma enzima. Os substratos adequados incluem, entre outros, triptofano, um adenosina monofosfato, um adenosina difosfato, um adenosina trifosfato (por exemplo, adenosina-3-trifosfato), um polifosfato, uma refeição proteica, um trimetafosfato, uma celulose, uma metilcelulose, uma quitina, uma quitosana, um derivado de celulose, um fosfato, uma gordura, uma cera, um fosfolípido, um ácido fítico ou uma combinação de qualquer um deles.
[1595] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, o método pode compreender a aplicação do membro da família Bacillus cereus recombinante, os fragmentos de exosporium ou a formulação à planta.
[1596] Por exemplo, o método pode compreender a aplicação do membro da família Bacillus cereus recombinante, os fragmentos de exosporium ou a formulação nas raízes da planta.
[1597] Alternativamente ou adicionalmente, o método pode compreender a aplicação do membro da família Bacillus cereus recombinante, dos fragmentos de exosporium ou da formulação foliarmente.
[1598] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, o método pode compreender a aplicação do membro da família Bacillus cereus recombinante, os fragmentos de exosporium ou a formulação à semente da planta.
[1599] Onde o método compreende a aplicação do membro da família Bacillus cereus recombinante, os fragmentos de exosporium ou a formulação à semente da planta, a aplicação do membro da família Bacillus cereus recombinante, os fragmentos de exosporium ou a formulação à semente da planta pode compreender: (a) aplicação membro da família Bacillus cereus recombinante, fragmentos de exosporium ou a formulação da semente da planta no momento do plantio; ou (b) revestimento da semente da planta com o membro da família recombinante Bacillus cereus, os fragmentos de exosporium ou a formulação.
[1600] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, o método pode ainda compreender a aplicação de um agroquímico ao meio de crescimento da planta, à planta, à semente da planta ou à área circundante à planta ou à semente da planta. Agroquímicos adequados são descritos abaixo na Seção IX.
[1601] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, o método pode ainda compreender aplicar um fertilizante, um bioestimulante ou uma combinação dos mesmos ao meio de crescimento da planta, à planta, à semente da planta ou à área circundante à planta ou à semente da planta. Fertilizantes e bioestimulantes adequados são descritos na Seção IX abaixo.
[1602] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, as plantas cultivadas na presença do membro da família Bacillus cereus recombinante, os fragmentos de exosporium ou a formulação podem exibir crescimento aumentado em comparação com as plantas cultivadas na ausência da enzima, da proteína expansina ou da microrganismo, nas mesmas condições.
[1603] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, as sementes às quais o membro da família Bacillus cereus recombinante, os fragmentos de exosporium ou a formulação foram aplicadas podem exibir taxas de germinação aumentadas em comparação com as sementes às quais a enzima ou microorganismo não foi aplicado, sob a mesmas condições.
[1604] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, as plantas cultivadas na presença do membro da família Bacillus cereus recombinante, os fragmentos de exosporium ou a formulação podem exibir um aumento na captação de nutrientes em comparação com as plantas cultivadas na ausência da enzima, da proteína expansina ou o microrganismo, nas mesmas condições.
[1605] Em qualquer um dos métodos descritos aqui, as plantas cultivadas na presença do membro da família Bacillus cereus recombinante, os fragmentos de exosporium ou a formulação podem exibir suscetibilidade reduzida a um patógeno em comparação com as plantas cultivadas na ausência da enzima ou do microorganismo, sob as mesmas condições.
[1606] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, as plantas cultivadas na presença do membro da família Bacillus cereus recombinante, os fragmentos de exosporium ou a formulação podem exibir suscetibilidade reduzida a um estresse ambiental (por exemplo, seca, inundação, calor, congelamento, sal, metais, pH baixo, pH alto ou uma combinação de qualquer um deles) em comparação com plantas cultivadas na ausência da enzima ou do microorganismo, nas mesmas condições.
[1607] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, as plantas cultivadas na presença do membro da família Bacillus cereus recombinante, os fragmentos de exosporium ou a formulação podem exibir um aumento no teor de nutrientes em comparação com as plantas cultivadas na ausência da enzima, da proteína expansina ou o microrganismo, nas mesmas condições.
[1608] O nutriente pode compreender, por exemplo, um polissacarídeo, uma proteína, ácido fítico, um fosfato, um fosfolípido ou uma combinação de qualquer um deles.
[1609] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, as plantas cultivadas na presença do membro da família Bacillus cereus recombinante, os fragmentos de exosporium ou a formulação exibem pode aumentar a nodulação da raiz em comparação com as plantas cultivadas na ausência da enzima ou do microorganismo, sob a mesmas condições.
[1610] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, as plantas cultivadas na presença do membro da família Bacillus cereus recombinante, os fragmentos de exosporium ou a formulação podem exibir amadurecimento mais lento dos frutos em comparação com as plantas cultivadas na ausência da enzima ou do microorganismo, sob a mesmas condições.
[1611] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, as plantas cultivadas na presença do membro da família Bacillus cereus recombinante, os fragmentos de exosporium ou a formulação podem exibir maior rendimento de colheita em comparação com as plantas cultivadas na ausência da enzima, da proteína expansina ou o microrganismo, nas mesmas condições.
[1612] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, as plantas cultivadas na presença do membro da família Bacillus cereus recombinante, os fragmentos de exosporium ou a formulação podem exibir senescência foliar alterada em comparação com as plantas cultivadas na ausência da enzima ou do microorganismo, sob a mesmas condições. VIII. ADITIVOS PARA RAÇÕES PARA ANIMAIS,
COMPOSIÇÕES PARA RAÇÕES PARA ANIMAIS E MÉTODOS PARA ENTREGAR UMA ENZIMA A UM ANIMAL
[1613] As enzimas alimentares fornecem um meio para aumentar a utilização e nutrição dos alimentos em animais agrícolas. As enzimas podem ser usadas para aumentar o desempenho animal e os benefícios à saúde.
Além disso, a utilização de enzimas como aditivos para a ração animal pode melhorar a utilização da ração, aumentando o valor nutritivo das matérias-primas para ração animal. As enzimas aqui descritas, incluindo, porém sem limitação, a fitases, xilanases, glucanases, xiloglucanases, mananases, fosfolipases, liquenases, xilosidases, pectolases, fosfatases e lactonases, podem fornecer propriedades promotoras de crescimento das plantas. Essas enzimas selecionadas também são enzimas aditivas úteis para a ração animal que podem ser fornecidas como um complemento à ração animal para aumentar o desempenho animal e os benefícios à saúde. As enzimas aditivas para ração, conforme descrito, podem ser usadas para melhorar a digestibilidade da ração, aumentando assim a eficiência da utilização da ração. A utilização aprimorada da ração fornece aos animais um meio para melhor utilizar os nutrientes das plantas obtidos de fontes alimentares, como cereais (cevada, trigo, centeio, aveia, milho) e pastagens ou fenos de forragem, como a alfafa.
[1614] As enzimas aqui descritas são particularmente úteis como aditivos para ração, devido à sua estabilidade, o que lhes permite permanecer com a ração durante todo o processo digestivo. As enzimas também não são tão facilmente absorvidas pelo epitélio (o que reduziria sua capacidade de continuar digerindo substratos-alvo em todo o estômago e intestinos, à medida que as condições se tornassem mais favoráveis à atividade enzimática).
[1615] Qualquer uma das enzimas descritas aqui pode ser usada como aditivos alimentares fornecidos em plantas de colheita como tratamento foliar pré-colheita ou como um tratamento por pulverização pós- colheita aplicado diretamente à planta ou parte da planta. Alternativamente ou além disso, qualquer uma das enzimas pode ser aplicada diretamente nas vitaminas e/ou pré-misturas minerais que são adicionadas à ração animal. Alternativamente ou além disso, as enzimas podem ser adicionadas diretamente à ração, antes, durante ou após o processamento da ração. Fornecidas em qualquer um desses tipos de tratamento, as enzimas são úteis para apoiar a saúde intestinal e o desempenho em animais agrícolas e de companhia, incluindo, porém sem limitação, aves, suínos, gado leiteiro e de corte, cavalos,
cabras, ovelhas, cães, gatos, peixes, coelhos, roedores e outros alimentos para animais. Algumas das vantagens oferecidas são menores custos de alimentação e maior utilização e absorção de nutrientes, incluindo a captação de minerais e nutrientes essenciais (por exemplo, cálcio, zinco, cobalto, magnésio, ferro). O aumento da utilização e absorção de nutrientes pode provocar aumentos de suporte no ganho de peso diário e na saúde geral dos animais. O uso de enzimas como aditivos para a ração animal também pode reduzir os custos da ração e também geralmente melhorar o impacto ambiental na produção animal.
[1616] Uma ou mais das enzimas descritas neste documento podem ser usadas sequencialmente ou simultaneamente para fornecer benefícios nutricionais aprimorados a um animal agrícola ou animal doméstico. As enzimas descritas são classificadas pelos tipos de substratos em que trabalham. Por exemplo, as proteases decompõem as proteínas em aminoácidos, tornando-as mais disponíveis para utilização e absorção pelo animal se fornecidas em uma planta ou alimento derivado de uma planta ou parte da planta.
[1617] Classes individuais de enzimas que podem ser usadas como aditivos para a ração animal ou na ração animal são descritas mais adiante. Essas enzimas são úteis para superar as limitações impostas à digestão animal devido à insuficiência de enzimas digestivas que quebram ligações químicas específicas que se ligam e impedem a liberação de nutrientes. A. FITASES
[1618] A fitase é uma enzima que decompõe as moléculas de fitato, uma forma de fósforo encontrada nas plantas que não está disponível naturalmente para o animal. As fitases, portanto, proporcionam benefícios, aprimorando a liberação de fósforo disponível, o que, por sua vez, leva ao aumento do crescimento animal. A fitase (por exemplo, a fitase E246) permite que o animal absorva mais fósforo quando fornecido em uma planta ou na parte da planta usada na alimentação ou em um aditivo alimentar. B. XILANASES E GLUCANASES
[1619] Xilanase e glucanase quebram polissacarídeos não amiláceos, liberando energia da porção fibrosa de grãos e subprodutos de grãos. As glucanases decompõem a fração insolúvel de uma ração, como os caules de milho alimentados a animais ruminantes, como laticínios e bovinos. Tais fardos de caule de milho são geralmente fornecidos como alimento suplementar ao gado durante os meses de inverno. Xilanases (por exemplo, as xilanases E100, E146 ou E232) e glucanases (por exemplo, a glucanase E94) podem ser usadas para aumentar a qualidade da alimentação dos fardos, aumentando a energia e a nutrição fornecidas ao animal. Além disso, essas enzimas podem ser adicionadas aos fardos de caules de milho e usadas para reduzir os custos gerais de ração no inverno. Da mesma forma, xilanases e glucanases podem ser usadas como enzimas aditivas em forragens em pastagens (como alfafa) e outras gramíneas e fenos. C. XILOGLUCANASES
[1620] O xiloglucano é uma enzima que decompõe os xiloglucanos (endo-hidrólise das ligações 1,4--D-glucosídicas no xiloglucano). As xiloglucanases também podem melhorar a hidrólise geral de materiais lignocelulósicos. As xiloglucanases (por exemplo, as xiloglucanases E149 e D381) podem ser usadas na quebra de polissacarídeos, liberando carboidratos mais úteis para o animal. D. MANANASES
[1621] A beta-mananase está envolvida na hidrólise de resíduos terminais de beta-D-manose não redutores nos beta-D-manosídeos. As beta-mananases (por exemplo, as mananases E177 e E196) podem ser usadas para melhorar a produção e o desempenho quando adicionadas às dietas para aves e suínos. As enzimas mananase podem ser usadas como enzimas aditivas na alimentação para melhorar o desempenho medido pelo ganho de peso, conversão alimentar e a saúde geral de aves, suínos e outros animais. E. FOSFOLIPASES
[1622] As fosfolipases compreendem uma classe de enzimas associadas à membrana que clivam os fosfolipídios imediatamente antes do grupo fosfato. Eles podem ser usados como aditivos para alimentos lácteos e para apoiar a saúde e o desempenho intestinais. Além disso, as fosfolipases podem ser usadas para apoiar a produtividade de animais sob estresse, proporcionando assim maior lucratividade.
[1623] As enzimas fosfolipase C e fosfolipase D são exemplos de fosfolipases que são úteis como aditivos alimentares. As enzimas da fosfolipase C (PLC) são capazes de hidrolisar o fosfatidilinositol, resultando na liberação de diacilglicerol e inositol 1,4,5-trifosfato (IP3). Dois exemplos de enzimas PLC são as fosfilipases E143 e E95 derivadas de Bacillus thuringiensis aqui descritas. Exemplos adicionais de enzimas PLC incluem os da Listeria aqui descritos. Em particular, Listeria monocytogenes secreta uma fosfolipase C específica para fosfatidilinositol (PI-PLC). Essa enzima pode ser expressa usando um sinal secretório e uma sequência de propeptídeo (código identificação D473), pode ser expressa apenas com um propeptídeo (código identificação D474) ou pode ser expressa sem o sinal ou propetídeo (código identificação D475). O PI-PLC (por exemplo, E258) se liga firmemente aos fosfolipídios aniônicos (como aqueles que contêm grupos principais de fosfometil) e pode formar complexos agregados com esses lipídios aniônicos e fornecidos aos animais para melhorar a digestibilidade da gordura e como um complemento nutricional. Outras fosfolipases, como a fosfolipase D (por exemplo, E229 e D409), onde o substrato principal é a fosfatidilcolina, hidrolisam os fosfolipídios para produzir a molécula de sinal ácido fosfatídico (PA) e a colina, que é um nutriente semelhante a vitamina solúvel em água e pode ser usado beneficiar prontamente a nutrição animal. F. LIQUENASES
[1624] A liquenase é uma enzima que hidrolisa as ligações (1->4) -beta-D-glucosídica em beta-D-D-glucanos contendo ligações (1- >3)- e (1->4). As liquenases atuam sobre a liquenina e os beta-D-glucanos dos cereais. A liquenina é um complexo glucano ou amido. Alimentos para cereais, como milho e outros grãos, são usados como fonte de alimentação comum para muitos animais agrícolas e domésticos. As liquenases (por exemplo, as liquenas
E111 e D436) que hidrolisam formas de beta-glucanas dos cereais, não só podem fornecer uma qualidade prebiótica maior aos grãos de cereais, mas também podem contribuir com uma qualidade imunoestimulante para os grãos, tornando-os um aditivo alimentar benéfico.
G. XILOSIDASE
[1625] As xilosidases catalisam a hidrólise de xilooligossacarídeos de cadeia curta de suas extremidades não redutoras em xilose. Mais especificamente, as xilosidases (por exemplo, as xilosidases E175 e E194) hidrolisam (1->4)-beta-D-xilanos para remover os resíduos de D-xilose dos terminais não redutores do oligossacarídeo. As xilosidases também podem hidrolisar xilobiose, um dissacarídeo de monômeros de xilose com uma ligação beta 1,4 entre eles. A D-xilose resultante é um açúcar pentose obtido a partir da porção rica em xilano da hemicelulose, presente nas paredes das células das plantas e nas fibras, que pode ser usada em rações e alimentos para animais para aumentar o ganho de peso em animais sob regimes alimentares controlados. H. PECTOLASE
[1626] A pectolase é uma pectinase, um tipo de enzima que degrada a pectina. A pectolase (por exemplo, as pectolases E176 e D405) catalisa a clivagem eliminativa do éster metílico de alfa (- (1-4)-D galacturonano para render oligossacarídeos com grupos 4-desoxi-6-O-metil--D-galact-4- enuronosila nas suas extremidades não redutoras. As pectolases são as únicas pectinases conhecidas capazes de degradar pectinas altamente esterificadas (como as encontradas em frutas) em pequenas moléculas e são capazes de quebrar as paredes celulares, liberando assim os polissacarídeos mais disponíveis em energia e que desempenham papéis funcionais na nutrição animal. I. FOSFATASES ÁCIDAS
[1627] A fosfatase ácida (AcPC) é uma enzima que hidrolisa os fosfatos orgânicos a um pH ácido. A hidrólise de ésteres de fosfato é uma etapa importante no metabolismo. AcPCs secretados (por exemplo, o E252 AcPC) são enzimas relativamente inespecíficas que parecem ser importantes na hidrólise e mobilização de fósforo a partir de fosfomonoésteres extracelulares. Essas enzimas podem ser usadas como um complemento para animais e rações para animais que são mais nutricionalmente eficientes ao liberar fósforo. J. LACTONASE
[1628] As lactonases (também denominadas acil- homoserina lactonases) são metaloenzimas. A lactonase (por exemplo, a lactonase H51) hidrolisa a ligação éster do anel de homoserina lactona das homoserinas lactonas aciladas. Ao hidrolisar a ligação lactona, a lactonase pode impedir que essas moléculas sinalizadoras das bactérias se liguem aos seus reguladores transcricionais-alvo. O aumento da atividade da lactonase nos aditivos alimentares pode ser benéfico para o controle de infecções bacterianas em animais, inibindo a atividade de detecção de quorum. K. ADITIVOS PARA RAÇÕES PARA ANIMAIS E
COMPOSIÇÕES PARA RAÇÕES PARA ANIMAIS COMPREENDENDO MEMBROS DA FAMÍLIABACILLUS CEREUS RECOMBINANTE
[1629] É fornecido um aditivo de ração animal. O aditivo para ração animal compreende qualquer membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão aqui descrita. Alternativamente, ou além disso, o aditivo para ração animal compreende fragmentos de exosporium derivados de qualquer membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão aqui descrita.
[1630] Uma composição de ração animal é fornecida. A composição de ração animal compreende ração animal e qualquer membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão aqui descrita. Alternativamente ou adicionalmente, a composição de ração animal compreende fragmentos de ração animal e exosporium derivados de qualquer membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão aqui descrita.
[1631] O aditivo para alimentação animal ou a composição para alimentação animal pode ainda compreender um transportador adequado para a ingestão por um animal de gado ou animal doméstico.
[1632] O veículo pode compreender amido, álcool polivinílico, uma dextrina, um calcário, sacarose, talco, celulose ou uma combinação de qualquer um deles.
[1633] Quando o transportador compreende dextrina, a dextrina pode compreender maltodextrina, ciclodextrina ou uma combinação dos mesmos.
[1634] Por exemplo, o veículo pode compreender álcool polivinílico e celulose.
[1635] A alimentação animal na composição de alimentação animal pode compreender forragem.
[1636] Quando a ração animal compreende forragem, a forragem pode compreender feno, palha, silagem, ração comprimida, ração peletizada, óleo, grão, grão germinado, leguminosa (por exemplo, soja), uma fração insolúvel de um cultivo (por exemplo, talos de milho), um resíduo de colheita ou uma combinação de qualquer um deles.
[1637] “Resíduo da colheita” refere-se aos materiais deixados em um campo agrícola ou pomar após a colheita ter sido colhida (resíduo do campo) e os materiais deixados após o processamento da colheita (resíduo do processo). Os resíduos da colheita incluem, mas não se limitam a, talos, caules, folhas, vagens, cascas, bagaço, melaço, raízes, cascas (por exemplo, cascas de banana), material de cervejaria usado e material de biocombustível gasto. Um exemplo de resíduo de colheita que pode ser usado na composição de ração animal é o topo e as folhas da cana-de-açúcar.
[1638] Alternativamente, ou adicionalmente, a ração animal pode compreender um cereal. Por exemplo, o cereal pode compreender cevada, trigo, centeio, aveia, milho, arroz, milho, sorgo ou uma combinação de qualquer um deles.
L. MÉTODOS PARA ENTREGA DE ENZIMAS A UM ANIMAL
[1639] É fornecido um método para entregar uma enzima a um animal. O método compreende alimentar o animal com qualquer membro da família Bacillus cereus recombinante que expresse qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas. Alternativamente ou adicionalmente, o método compreende alimentar os fragmentos de exosporium animal derivados de qualquer membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas.
[1640] O membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa qualquer proteína de fusão aqui descrita pode ser fornecido em um aditivo para ração animal ou em uma composição para ração animal. Por exemplo, o método pode compreender a alimentação de qualquer um dos aditivos ou composições de ração animal aqui descritos para o animal.
[1641] Alternativamente, ou adicionalmente, o método pode compreender a aplicação do membro da família Bacillus cereus recombinante ou dos fragmentos de exosporium a uma planta, a uma semente de planta ou a um resíduo de colheita e a alimentação da planta, semente de planta ou resíduo de colheita ao animal.
[1642] O método pode compreender a aplicação do membro da família Bacilllus cereus recombinante ou dos fragmentos de exosporium à planta ou semente da planta antes da colheita. Alternativamente, o método pode compreender a aplicação do membro da família Bacilllus cereus recombinante ou dos fragmentos de exosporium na planta ou semente da planta após a colheita.
[1643] A planta ou semente de planta pode compreender soja, cevada, trigo, centeio, aveia, arroz, milho, sorgo, grama ou alfafa ou semente de planta, ou uma combinação de qualquer uma delas.
[1644] O animal pode compreender um animal de gado ou um animal doméstico. Por exemplo, o animal pode compreender aves, suínos,
gado, um cavalo, uma cabra, uma ovelha, um cachorro, um gato, um peixe, um coelho ou um roedor. IX. VEÍCULOS E AGROQUÍMICOS
[1645] Como descrito acima, as formulações aqui descritas compreendem um veículo agricolamente aceitável.
[1646] O veículo agricolamente aceitável pode compreender um dispersante, um tensoativo (por exemplo, um óleo de petróleo pesado, um destilado de petróleo pesado, um éster de ácido graxo poliol, um éster de ácido graxo polietoxilado, um aril alquil polioxietileno glicol, um acetato de alquil amina, um alquil aril sulfonato, um álcool poli-hídrico, um fosfato de alquila ou uma combinação de qualquer um deles), um aditivo (por exemplo, um óleo, uma goma, uma resina, uma argila, um polioxietileno glicol, um terpeno, um orgânico viscoso, um éster de ácido graxo, um álcool sulfatado, um alquilsulfonato, um sulfonato de petróleo, um sulfato de álcool, um diamato de alquilbutano de sódio, um poliéster de dioato de tiobutano de sódio, um derivado de benzeno acetonitrilo, um material proteico ou uma combinação de qualquer um deles), água, um espessante (um alquilsulfonato de cadeia longa de polietileno glicol, um oleato de polioxietileno ou uma combinação de qualquer um deles), um agente antiaglomerante (por exemplo, sal de sódio, carbonato de cálcio, terra de diatomácea ou uma combinação de qualquer um deles), um resíduo breakdow n produto, uma formulação de compostagem, uma aplicação granular, terra de diatomáceas, um óleo, um agente corante, um estabilizador, um conservante, um polímero, um revestimento ou uma combinação de qualquer um deles.
[1647] Quando o veículo agricolamente aceitável compreende um tensoativo, o tensoativo pode compreender um tensoativo não iônico.
[1648] Onde o veículo agricolamente aceitável compreende um aditivo e o aditivo compreende um material proteico, o material proteico pode compreender um produto lácteo, farinha de trigo, farelo de soja,
sangue, albumina, gelatina, farelo de alfafa, extrato de levedura ou uma combinação de qualquer um deles.
[1649] Onde o veículo agricolamente aceitável compreende um agente antiaglomerante e o agente antiaglomerante compreende um sal de sódio, o sal de sódio pode compreender um sal de sódio de monometil naftaleno sulfonato, um sal de sódio de dimetil naftaleno sulfonato, um sulfito de sódio, um sulfato de sódio ou uma combinação de qualquer um deles.
[1650] O veículo agricolamente aceitável pode compreender vermiculita, carvão vegetal, lama prensa de carbonatação de fábrica de açúcar, casca de arroz, carboximetilcelulose, turfa, perlita, areia fina, carbonato de cálcio, farinha, alúmen, amido, talco, polivinilpirrolidona ou uma combinação de qualquer um deles.
[1651] Qualquer uma das formulações descritas aqui pode compreender uma formulação de revestimento de sementes (por exemplo, uma solução aquosa ou à base de óleo para aplicação em sementes ou uma formulação em pó ou granular para aplicação em sementes), uma formulação líquida para aplicação em plantas ou crescimento de plantas meio (por exemplo, uma formulação concentrada ou pronta para uso) ou uma formulação sólida para aplicação em plantas ou em um meio de crescimento de plantas (por exemplo, uma formulação granular ou um agente em pó).
[1652] Como descrito acima, qualquer uma das formulações descritas aqui pode compreender um agroquímico.
[1653] Da mesma forma, qualquer um dos métodos aqui descritos pode ainda compreender a aplicação de um agroquímico no meio de crescimento da planta, na planta, na semente da planta ou na área ao redor da planta ou na semente da planta.
[1654] O agroquímico pode compreender um fertilizante, um material fertilizante de micronutrientes, um inseticida, um nematicida, um herbicida, uma alteração no crescimento das plantas, um fungicida, um inseticida, um moluscicida, um algicida, um inoculante bacteriano, um inoculante fúngico, um hormônio vegetal, ou uma combinação de qualquer um deles.
[1655] Onde o agroquímico compreende um inoculante bacteriano, o inoculante bacteriano pode compreender uma cepa de bactérias promotoras de crescimento de plantas, uma cepa endofítica de bactérias ou uma cepa de bactérias que é tanto promotora de crescimento de plantas quanto endofítica. Por exemplo, a cepa de bactérias pode produzir uma toxina inseticida (por exemplo, uma toxina Cry), pode produzir um composto fungicida (por exemplo, uma β-1,3-glucanase, uma quitosanase, uma lyticase ou uma combinação de qualquer uma delas), pode produzir um composto nematicida (por exemplo, uma toxina Cry), pode produzir um composto bacteriocida, pode ser resistente a um ou mais antibióticos, pode compreender um ou mais plasmídeos de replicação livre, pode se ligar a raízes de plantas, pode colonizar raízes de plantas, pode formam biofilmes, podem solubilizar nutrientes, podem secretar ácidos orgânicos ou uma combinação de qualquer um deles.
[1656] Onde o agroquímico compreende um inoculante bacteriano, o inoculante bacteriano pode compreender:
[1657] (a) Bacillus aryabhattai CAP53 (NRRL Nº B- 50819);
[1658] (b) Bacillus aryabhattai CAP56 (NRRL Nº B- 50817);
[1659] (c)Bacillus flexus BT054 (NRRL Nº B-50816);
[1660] (d) Paracoccus kondratievae NC35 (NRRL Nº B- 50820);
[1661] (e)Bacillus mycoides BT155 (NRRL Nº B-50921);
[1662] (f) Enterobacter cloacae CAP12 (NRRL Nº B- 50822);
[1663] (g) Bacillus nealsonii BOBA57 (NRRL Nº B- 50821);
[1664] (h) Bacillus mycoides EE118 (NRRL Nº B-50918);
[1665] (i) Bacillus subtilis EE148 (NRRL Nº B-50927);
[1666] (j) Alcaligenes faecalis EE107 (NRRL No. B- 50920);
[1667] (k) Bacillus mycoides EE141 (NRRL No. B-50916);
[1668] (l) Bacillus mycoides BT46-3 (NRRL No. B-50922);
[1669] (m) Membro da família Bacillus cereus EE128 (NRRL Nº B-50917);
[1670] (n) Paenibacillus massiliensis BT23 (NRRL Nº B- 50923);
[1671] (o) Membro da família Bacillus cereus EE349 (NRRL Nº B-50928);
[1672] (p) Bacillus subtilis EE218 (NRRL Nº B-50926);
[1673] (q) Bacillus megaterium EE281 (NRRL No.B- 50925);
[1674] (r) Membro da família Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119);
[1675] (s) Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120);
[1676] (t) Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121);
[1677] (u) Bacillus pumilus EE-B00143 (NRRL B-67123);
[1678] (v) Bacillus thuringiensis EE-B00184 (NRRL B- 67122);
[1679] (w) Bacillus mycoides EE116 (NRRL Nº B-50919);
[1680] (x) Membro da família Bacillus cereus EE417 (NRRL Nº B-50974);
[1681] (y) Lysinibacillus fusiformis EE442 (NRRL Nº B- 50975);
[1682] (z) Lysinibacillus sphaericus EE443 (NRRL Nº B- 50976);
[1683] (aa) Membro da família Bacillus cereus EE444 (NRRL Nº B-50977);
[1684] (bb) Bacillus subtilis EE405 (NRRL Nº B-50978);
[1685] (cc) Membro da família Bacillus cereus EE439 (NRRL Nº B-50979);
[1686] (dd) Bacillus megaterium EE385 (NRRL Nº B- 50980);
[1687] (ee) Espécie Bacillus EE387 (NRRL Nº B-50981);
[1688] (ff) Bacillus circulans EE388 (NRRL Nº B-50982);
[1689] (gg) Bacillus thuringiensis EE319 (NRRL Nº B- 50983);
[1690] (hh) Bacillus thuringiensis BT013A (NRRL Nº B- 50924);
[1691] ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.
[1692] Cada uma dessas cepas foi depositada no Serviço de Pesquisa Agrícola (ARS) do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA), com o endereço 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 EUA, e são identificadas pelos números de depósito NRRL fornecidos em parênteses. As cepas (a) - (d), (f) e (g) foram depositadas em 7 de março de
2013. As cepas (e), (h) - (q), (w) e (hh) foram depositadas em 10 de março de
2014. As cepas (x) - (ff) foram depositadas em 10 de setembro de 2014. A cepa (gg) foi depositada em 17 de setembro de 2014. As cepas (r) - (v) foram depositadas em 19 de agosto de 2015. Bacillus thuringiensis BT013A também é conhecido como Bacillus thuringiensis 4Q7.
[1693] Certifica-se que os depósitos foram feitos de acordo com os termos do Tratado de Budapeste e que: (i) durante a pendência deste pedido de patente, o acesso para os organismos depositados será conferido ao Comissário mediante pedido; (ii) todas as restrições à disponibilidade para o público dos materiais depositados serão irrevogavelmente removidas após concessão da patente, sob a 37 CFR § 1.808 (b); (iii) o depósito será mantido por um período de 30 anos ou 5 anos após o último pedido ou para a vida efetiva da patente, o que for maior; e(iv) o depósito será substituído se algum dia se tornar inviável.
[1694] O isolamento e caracterização dessas cepas é descrito abaixo nos Exemplos. As sequências parciais de RNA ribossômico 16S para cada uma das linhagens (e), (h), (k) - (m), (o), (r) - (t), (v) - (x), (aa), (cc), (gg) e (hh) são fornecidos acima na Tabela 18. As sequências parciais de RNA ribossômico 16S para cada uma das linhagens (a) - (d), (f), (g), (i), (j), (n), (p), (q), (u), (y), (z), (bb) e (dd) - (ff) são fornecidos na Tabela 21 abaixo. TABELA 21. SEQUÊNCIAS PARCIAIS DE RNA RIBOSSÔMICO 16S Cepa SEQ ID NO. para sequência parcial de RNA ribossômico 16S Bacillus megaterium EE385 216 Bacillus sp. EE387 217 Bacillus circulans EE38 218 Bacillus subtilis EE405 219 Lysinibacillus fusiformis EE442 220 Lysinibcaillus sphaericus EE443 221 Bacillus aryabhattai CAP53 222 Bacillus aryabhattai CAP56 223 Bacillus flexus BT054 224 Paracoccus kondratievae NC35 225 Enterobacter cloacae CAP12 226 Bacillus nealsonii BOBA57 227 Bacillus subtilis EE148 228 Alcaligenes faecalis EE107 229 Paenibacillus massiliensis BT23 230 Bacillus subtilis EE218 231 Bacillus megaterium EE281 232 Bacillus pumilus EE-B00143 233
[1695] Onde o agroquímico compreende um fertilizante, o fertilizante pode compreender um fertilizante líquido ou seco.
[1696] Onde o agroquímico compreende um material fertilizante de micronutrientes, o material fertilizante de micronutrientes pode compreender ácido bórico, um borato, uma frita de boro, sulfato de cobre, uma frita de cobre, um quelato de cobre, um decahidrato de tetraborato de sódio, sulfato de ferro, óxido de ferro, ferro sulfato de amônio, uma frita de ferro, um quelato de ferro, um sulfato de manganês, um óxido de manganês, um quelato de manganês, um cloreto de manganês, uma frita de manganês, um molibdato de sódio, ácido molibdânico, um sulfato de zinco, um óxido de zinco, um carbonato de zinco, uma frita de zinco, fosfato de zinco, um quelato de zinco ou uma combinação de qualquer um deles.
[1697] Onde o agroquímico compreende um fertilizante, o fertilizante pode compreender sulfato de amônio, nitrato de amônio, nitrato de sulfato de amônio, cloreto de amônio, bissulfato de amônio, polissulfeto de amônio, tiossulfato de amônio, amônia aquosa, amônia anidra, polifosfato de amônio, sulfato de alumínio, nitrato de cálcio, cálcio nitrato, sulfato de cálcio, magnesita calcinada, calcário calcítico, óxido de cálcio, nitrato de cálcio, calcário dolomítico, cal hidratada, carbonato de cálcio, fosfato de diamônio, fosfato monoamônio, nitrato de magnésio, sulfato de magnésio, nitrato de potássio, cloreto de potássio, sulfato de potássio e magnésio, sulfato de potássio, nitratos de sódio, calcário magnesiano, magnésia, uréia, uréia-formaldeídos, nitrato de uréia e amônio, uréia revestida com enxofre, uréia revestida com polímero, diobéia de isobutilideno, K2SO4-2MgSO4, cainita, silvinita, cieserita, sais de Epsom, elementar enxofre, marga, conchas de ostras moídas, farinha de peixe, bolos de óleo, esterco de peixe, farinha de sangue, fosfato de rocha, super pho esfatos, escórias, farinhas de ossos, cinzas de madeira, esterco, guano de morcego, turfa, composto, areia verde, farelo de algodão, farelo de penas, farelo de caranguejo, emulsão de peixe, emulsão de peixe, ácido húmico ou uma combinação de qualquer um deles.
[1698] Onde o agroquímico compreende um inseticida, o inseticida pode compreender um organofosfato, um carbamato, um piretróide, um acaricida, um alquil ftalato, ácido bórico, um borato, um fluoreto, enxofre, uma uréia substituída haloaromática, um éster de hidrocarboneto, um biocombustível. inseticida à base de plantas ou uma combinação de qualquer um deles.
[1699] Onde o agroquímico compreende um herbicida, o herbicida pode compreender um composto clorofenoxi, um composto nitrofenólico, um composto nitrocresólico, um composto dipiridil, uma acetamida, um ácido alifático, um anilida, uma benzamida, um ácido benzóico, um derivado do ácido benzoico, anísico ácido, um derivado do ácido anísico, um benzonitrila, dióxido de benzotiadiazinona, um tiocarbamato, um carbamato, um carbanilato, cloropiridinil, um derivado de ciclohexenona, um derivado de dinitroaminobenzeno, um composto de fluorodinitrotoluidina, isoxazolidinona, isotazilopamina, fosfato, um ftalato, um composto de ácido picolínico, uma triazina, um triazol, uma uracila, um derivado de ureia, endotal, clorato de sódio ou uma combinação de qualquer um deles.
[1700] Onde o agroquímico compreende um herbicida, o herbicida pode compreender 2,4-D, 2,4-DB, acetoclor, acifluorfeno, alacloro, ametrina, atrazina, aminopiralid, benefício, bensulfuron, bensulida, bentazon, bromacil, bromoxinil, butilato, carfentrazona, clorimuron, cloro-sulfurão, clododim, clomazona, clomazona cloransulam, cicloato, DCPA, desmedifame, dicamba, diclobenil, diclofop, diclosulam, diflufenzopir, dimetenamida, diquat, diuron, DSMA, endothall, EPTC, etalfluralina, etofumesato, fenoxaprop, fluazifam-P, flazifaz-P, flazifaz-P, flazifaz-P, flazifaz-P, flazifaz-P, flazifaz-P, flazazamida Fluometurão, fluroxipir, fomesafena, foramsulfurão, glufosinato, glifosato, halossulfurão, hexazinona, imazamethabenz, imazamox, imazapic, imazaquin, imazetapir, isoxabeno, isoxaflutol, lactofeno, lactofeno, linuron, mesaclor, MSMA, napropamida, naptalam, nicossulfurão, norflurazon, orazalin, oxadiazon, oxifluorfena, paraquat, ácido pelargônico, pendimetalina, fenmedifame, picloram, primisulfurão, prodiamina, prometrina, pronamida, propanil, prosulfurão, pirazon, piritiobac, quinclorac, quizalofop, rimsulfuron, setoxidim, siduron, simazina, sulfentrazona, sulfometurão, sulfossulfurão, tebuthiuron, terbacil, tiazopir, trifluorurodon, triobenciclifen, triobenciclifen, triobenciclifen ou uma combinação de qualquer um deles.
[1701] Onde o agroquímico compreende um fungicida, o fungicida pode compreender um benzeno substituído, um tiocarbamato, um etileno bis-ditiocarbamato, uma tioftalidamida, um composto de cobre, um composto de organomercúrio, um composto de organotina, um composto de cádmio, anilazina, benomil, ciclo-hexamida, dodino, etridiazol, iprodiona, metlaxil, tiamimefon, triforina ou uma combinação de qualquer um deles.
[1702] Onde o agroquímico compreende um fungicida, o fungicida pode compreender aldimorfe, ampropilfos, potássio de ampropilfos, andoprim, anilazina, azaconazol, azoxistrobina, benalaxil, benodanil, benomil, benzamacril, benzamacril-isobutila, bialafos, binapacril, bifenila, bitertanol, blasticidina-S, boscalide, bromuconazol, bupirimato, butiobato, polissulfeto de cálcio, capsimicina, captafol, captan, carbendazim, carvon, quinometionato, clobentiazona, clorfenazol, cloroneb, cloropicrina, clorotalonil, clozolinato, clozilacon, cufraneb, cimoxanil, ciproconazol, ciprodinil, ciprofuramol, debacarb, diclorofeno, diclobutrazol, dicloflolorodimodazina, diclodinodazol, dicloforazina, diclodinodazol, dicloforazina, dinocap, difenilamina, dipirithiona, ditalimfos, ditianona, dodemorfe, dodino, drazoxolona, edifenfos, epoxiconazol, etaconazol, etirimol, etridiazol, famoxadona, fenapanil, fenarimol, fenbucinodinoxin, feno- fenidin, feno-fenidin, fenodimidina ferbam, ferimzona, fluazinam, flumetover, fluoromida, fluquinconazol, flurprimidol, flusilazol, flusulfamida, flutolanil, flutriafol, folpet, fospetil-alumínio, fosetil-sódio, ftalida, fuberidazol, furalaxil, furametpir, furcarazaz, furconet, furcarazaz guazatina, hexaclorobenzeno, hexaconazol, himexazol, imazalil, imibenconazol, iminoctadina, albesilato de iminoctadina, triacetato de iminoctadina, iodocarbe, iprobenfos (IBP), iprodiona, irumamicina, isoprotiolano, isovalediona, kasugamicina, kresoxim-metil, preparações de cobre, como: hidróxido de cobre, óxido de cobre, sulfato de cobre, naften de cobre mistura de oxina-cobre e Bordeaux, mancopper, mancozeb, maneb, meferimzona, mepanipirim, mepronil, metconazol, metassulfocarbe, metfuroxam, metiram, metomeclam, metsulfovax, mildiomicin, miclobutanil, miclozolin, níquel dimopilditiocarbama, oxamocarbe, ácido oxolínico, oxicarboxim, oxifentinina, paclobutrazol, pefurazoato, penconazol, pencicuron, fosdifeno, pimaricina, piperalina, polioxina, polioxorim, probenazol, procloraz, procimidona, propamocarb, propanosina-pirazina, propiconazina- piroxazina, piroquilon, piroxifur, quinconazol, quintozeno (PCNB), preparações de enxofre e enxofre, tebuconazol, tecloftal am, tecnazeno, tetciclase, tetraconazol, tiabendazol, tiofen, tifluzamida, tiofanato-metil, tioximida, tolclofos- metil, tolilfluanida, triadimefona, triadimenol, triazbutil, triazoxida, triclamifaz,
triclaziflazina, triclaziflazina, vinclozolina, viniconazol, zarilamida, zineb, ziram e também Dagger G, OK-8705, OK-8801, a-(1,1-dimetiletil)-(3-(2-fenoxietil)-1H- 1,2,4-triazol-1-etanol, a-(2,4-diclorofenil)-[3-fluoro-3-propil-1 H--1,2,4-triazol-1- etanol, a-(2,4-diclorofenil)-[3-metoxi-a-metil-1 H-1,2,4-triazol e-1 -etanol, a-(5- metil -1,3-dioxan-5-il)-[3-[[4-(trifluorometil) -fenil]-metileno]-1 H-1,2,4-triazol-1- etanol, (5RS,6RS)-6-hidroxi-2,2,7,7-tetrametil-5-(1 H-1,2,4-triazol-1-il)-3- octanona, (E)-a-(metoxiimino)-N-metil-2-fenoxi-fenilacetamida, carbamato de 1- isopropil{2-metil-1-[[[1-(4-metilfenil)-etil]-amino]-carbonil]-propil}, 1-(2,4- diclorofenil)-2-(1 H-1,2,4-triazol-1-il)-etanona-O-(fenil metil)-oxima, 1-(2-metil-1- naftalenil)-1 H-pirrol-2,5-diona, 1-(3,5-diclorofenil)-3-(2-propenil)-2,5- pirrolidindiona, 1-[(diiodometil)-sulfonil]-4-metil-benzeno, 1-[[2-(2,4-diclorofenil)- 1, 3-dioxolan-2-il]-metil]-1 H-imidazol, 1-[[2-(4-clorofenil)-3-feniloxiranil]-metil]-1 H-1,2,4-triazol, 1-[1-[2-[(2,4-diclorofenil)-metoxi]-fenil]-ethenil]-1 H-imidazol, 1- metil -5-nonil-2-(fenilmetil)-3-pirroIidinol, 2',6'-dibromo-2-metil-4'-trifluorometoxi- 4'-trifluoro-metil-1, 3-tiazol -carboxanilida, 2,2-dicloro-N-[1-(4-clorofenil)-etil]-1- etil-3-metil-ciclopropanecarboxamida, 2,6-dicloro-5-(metiltio)-4-pirimidinil- tiocianato, 2,6-dicloro-N-(4-trifluorometilbenzil)-benzamida, 2,6-dicloro-N-[[4- (trifluorometil)-fenil]-metil]-benzamida, 2-(2,3,3-triiodo-2-propenil)-2H-tetrazol, 2- [(1-metiletil)-sulfonil]-5-(triclorometil)-1,3,4-tiadiazol, 2-[[6-deoxi-4-O-(4-O-metil- (3-D-glicopiranosil)-a-D-glucopiranosil]-amino]-4-metoxi-1 H-pirrolo [2,3- d]pirimidina-5-carbonitrila, 2-aminobutano, 2-bromo-2-(bromometil)- pentanodinitrila, 2-cloro-N-(2,3-di-hidro-1,1,3-trimetil-1 H-inden-4-il)-3- piridinacarboxamida, 2-cloro-N-(2,6-dimetilfenil)-N-(isotiocianatometil)- acetamida, 2-fenilfenol (OPP), 3,4-dicloro-1-[4-(difluorometoxi)-fenil]-pirrol-2,5- diona, 3,5-dicloro-N-[ciano[(1-metil-2-propinil)-oxi]-metil]-benzamida, 3-(1,1- dimetilpropil-1-oxo-1H-indeno-2-carbonitrila, 3-[2-(4-clorofenil)-5-etoxi-3- isoxazolidinil]-piridina, 4-cloro-2-ciano-N,N-dimetil-5-(4-metilfenil)-1H-imidazol-l- sulfonamida, 4-metil-tetrazolo[1,5-a]quinazolin-5(4H)-ona, sulfato de 8-(1,1- dimetiletil)-N-etil-N-propil-1,4-dioxaspiro[4, 5]decano-2-metanamina, 8- hidroxiquinolina, hidrazida de 9H-xanteno-2-[(fenilamino)-carbonil]-9-carboxílico, bis-(1-metiletil)-3-metil-4-[(3-metilbenzoil)-oxi]-2,5-tiofenodicarboxilato, cis-1-(4-
clorofenil)-2-(1 H-1,2,4-triazol-1-il)-ciclo-heptanol, cloridrato de cis-4-[3-[4-(1,1- dimetilpropil)-fenil-2-metilpropil]-2,6-dimetil-morfeolina, acetato de etil [(4- clorofenil)-azo]-ciano, bicarbonato de potássio, sal de metanotetratiol-sódico, metil 1-(2,3-di-hidro-2,2-dimetil-inden-1-il)-1 H-imidazol-5-carboxilato, metil N- (2,6-dimetilfenil)-N-(5-isoxazolilcarbonil)-DL-alaninato, metil N-(cloroacetil)-N- (2,6-dimetilfenil)-DL-alaninato, N-(2,3-dicloro-4-hidroxifenil)-1-metil-ciclo- hexanocarboxamida, N-(2,6-dimetil fenil)-2-metoxi-N-(tetra-hidro-2-oxo-3- furanil)-acetamida, N-(2,6-dimetil fenil)-2-metoxi-N-(tetra-hidro-2-oxo-3-tienil)- acetamida, N-(2-cloro-4-nitrofenil)-4-metil-3-nitro-benzenosulfonamida, N-(4- ciclohexilfenil)-1,4,5,6-tetra-hidro-2-pirimidinamina, N-(4-hexilfenil)-1,4,5,6-tetra- hidro-2-pirimidinamina, N-(5-cloro-2-metilfenil)-2-metoxi-N-(2-oxo-3- oxazolidinil)-acetamida, N-(6-metoxi)-3-piridinil)-ciclopropanocarboxamida, N- [2,2,2-tricloro-1-[(cloroacetil)-amino]-etil]-benzamida, N-[3-cloro-4,5-bis(2- propiniloxi)-fenil]-N'-metoxi-metanimidamida, sal de N-formil-N-hidroxi-DL- alanina sódica, O, O-dietil [2-(dipropilamino)-2-oxoetil]-etilfosforamidotioato, O- metil S-fenil fenilpropilfosforamidotioato, S-metil 1,2,3-benzotiadiazol-7- carbotioato e espiro[2H]-1-benzopirano-2,1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-ona, N- triclorometil)tio-4- ciclo-hexano-1,2-dicarboximida, tetrametiltioperoxidicarbônico diamida, metil N-(2,6-dimetilfenil)-N-(metoxiacetil)-DL-alaninato, 4-(2,2-difluoro- 1,3-benzodioxol-4-il)-1-H-pirrol-3-carbonitrila ou uma combinação dos mesmos.
[1703] Onde o agroquímico compreende um inoculante de fungos, o inoculante de fungos pode compreender um inoculante de fungos da família Glomeraceae, um inoculante de fungos da família Claroidoglomeraceae, um inoculante de fungos da família Gigasporaceae, um inoculante de fungos da família Acaulosporaceae, um inoculante de fungos da família Sacculosporaceae, um inoculante fúngico da família Entrophosporaceae, um inoculante fúngico da família Pacidsporaceae, um inoculante fúngico da família Diversisporaceae, um inoculante fúngico da família Paraglomeraceae, um inoculante fúngico da família Archaeosporaceae, um inoculante fúngico da família Geosiphonaceae, um inoculante de fungos da família Ambisporaceae, um inoculante de fungos da família Scutellosporaceae, um inoculante de fungos da família Dentiscultataceae, um inoculante de fungos da família Racocetraceae, um inoculante de fungos do filo Basidiomycota, um inoculante de fungos do filo Ascomyc inoculante fúngico do filo Zygomycota ou uma combinação dos mesmos.
[1704] Onde o agroquímico compreende um inoculante bacteriano, o inoculante bacteriano pode compreender um inoculante bacteriano do gênero Rhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Bradyrhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Mesorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Azorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Allorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Sinorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Kluyvera, um inoculante bacteriano do gênero Azotobacter, um inoculante bacteriano do gênero Pseudomonas, um inoculante bacteriano do gênero Azospirillium, um inoculante bacteriano do gênero Bacillus, um inoculante bacteriano do gênero Streptomyces, um inoculante bacteriano do gênero Paenibacillus, um inoculante bacteriano do gênero Paracoccus, um inoculante bacteriano do gênero Enterobacter, um inoculante bacteriano do gênero Alcaligenes, um inoculante bacteriano do gênero Mycobacterium, um inoculante bacteriano do gênero Trichoderma, um inoc bacteriano do gênero Gliocladium, um inoculante bacteriano do gênero Glomus, um inoculante bacteriano do gênero Klebsiella ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.
[1705] Onde o agroquímico compreende um inoculante bacteriano e o inoculante bacteriano compreende um inoculante bacteriano do gênero Bacillus, o inoculante bacteriano do gênero Bacillus pode compreender Bacillus argri, Bacillus aizawai, Bacillus albolactis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus coagularas Bacillus endorhythmos, Bacillus kurstaki, Bacillus lacticola, Bacillus lactimorbus, Bacillus lactis, Bacillus laterosporus, Bacillus lentimorbus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus medusa, Bacillus metiens, Bacillus popto, Bacillus nigrificus, Bacillus nigrificus, Bacillus spp., Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus unifagellatu ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.
[1706] Onde o agroquímico compreende um hormônio vegetal, o hormônio vegetal pode compreender uma giberelina, uma auxina, uma cinetina ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.
[1707] Qualquer uma das formulações descritas aqui pode compreender um fertilizante, um bioestimulante ou uma combinação dos mesmos.
[1708] Da mesma forma, qualquer um dos métodos aqui descritos pode ainda compreender a aplicação de um fertilizante, um bioestimulante ou uma combinação dos mesmos ao meio de crescimento da planta, à planta, à semente da planta ou à área circundante à planta ou à semente da planta.
[1709] O fertilizante pode compreender nitrogênio, fosfato (por exemplo, fosfato de monoamônio, fosfato diamônico, ortofosfato, ortopolifosfato ou uma combinação de qualquer um dos mesmos), potássio (por exemplo, acetato de potássio), zinco, ferro, selênio, boro, cobre ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.
[1710] Por exemplo, o fertilizante pode compreender 12% de nitrogênio amoniacal e 58% de fosfato disponível.
[1711] O bioestimulante pode compreender um ácido giberélico, um ácido indol-3-butírico, uma cinetina, uma auxina, um homólogo ou derivado de auxina ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.
[1712] Onde a formulação compreende um fertilizante, um bioestimulante ou uma combinação dos mesmos, a proteína de fusão compreende adequadamente uma fosfatase ácida, uma fosfolipase, uma mananase, uma glucanase ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.
[1713] Da mesma forma, onde o método compreende ainda aplicar um fertilizante, um bioestimulante ou uma combinação dos mesmos ao meio de crescimento da planta, à planta, à semente da planta ou à área circundante à planta ou à semente da planta, a proteína de fusão compreende adequadamente uma fosfatase ácida, uma fosfolipase, uma mananase, uma glucanase ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.
X. ENZIMAS LIVRES
[1714] Qualquer uma das enzimas descritas neste documento também pode ser usada como enzima livre ou como enzima expressa em microrganismos recombinantes em qualquer um dos métodos, formulações, composições e sementes de plantas, descritas na Publicação do Pedido de Patente nº US 2017/0356002, cujo conteúdo da mesma está incorporado ao presente documento por referência na sua totalidade. XI. PLANTAS
[1715] Em qualquer dos métodos acima referidas para as plantas, a planta pode ser uma dicotiledônea, uma monocotiledônea ou uma gimnosperma.
[1716] Da mesma forma, para qualquer uma das sementes aqui descritas, a semente pode ser uma semente de uma dicotiledônea, uma monocotiledônea ou uma gimnosperma.
[1717] Por exemplo, onde a planta é um dicotiledôneo ou a semente é uma semente de um dicotiledôneo, o dicotiledôneo pode ser selecionado do grupo que consiste em feijão, ervilha, tomate, pimenta, abóbora, alfafa, amêndoa, anis, maçã, damasco, arracha, alcachofra, abacate, amendoim bambara, beterraba, bergamota, pimenta preta, acácia negra, amora, mirtilo, laranja amarga, bok-choi, castanha do Brasil, fruta-pão, brócolis, feijão, couve de Bruxelas, trigo sarraceno, couve, camelina Repolho chinês, cacau, melão, sementes de cominho, cardo, alfarroba, cenoura, castanha de caju, mandioca, mamona, couve-flor, aipo-rábano, aipo, cereja, castanha, grão de bico, chicória, pimenta, crisântemo, canela, cidra, clementina, cravo, trevo, café, noz de cola, colza, milho, algodão, semente de algodão, feijão-caupi, amora, amora, agrião, pepino, groselha, pinha, árvore de baqueta, ervilha, berinjela, berinjela, endívia, erva-doce, feno-grego, figo, avelã, linho, gerânio, groselha, cabaça, uva, toranja, goiaba, cânhamo, cânhamo, ele saltar, feijão de cavalo, rábano, índigo, jasmim, alcachofra de Jerusalém, juta, couve, kapok, kenaf, couve-rábano, kumquat, lavanda, limão, lentilha, lespedeza, alface, limão, alcaçuz, lichia, nêspera, tremoço, macadâmia maça, tangerina, mangel, manga, nêspera, melão, hortelã,
amoreira, mostarda, nectarina, semente de niger, noz-moscada, quiabo, oliva, azeitona, ópio, laranja, mamão, pastinaga, ervilha, pêssego, amendoim, pera, noz-pecã, caqui ervilha de pombo, porca de pistache, banana, ameixa, romã, pomelo, semente de papoula, batata, batata doce, ameixa, abóbora, quebracho, marmelo, árvores do gênero Cinchona, quinoa, rabanete, rami, colza, framboesa, ema, ruibarbo rosa, borracha, rutabaga, cártamo, sainfoin, salsify, sapodilla, Satsuma, scorzonera, gergelim, árvore de karité, soja, espinafre, abóbora, morango, beterraba sacarina, cana de açúcar, girassol, sueco, pimentão, tangerina, chá, teff, tabaco, tomate, trevo, árvore tung, nabo, ervilhaca, noz, melancia, erva-mate, agrião de inverno, agrião de inverno, bolsa de pastor, agrião de jardim, mastruço, agrião, pennycress, anis estrelado, louro, louro, cássia, jamun, endro, tamarindo, hortelã-pimenta, orégano, alecrim, sálvia, graviola, Thlaspi, puna, bálsamo de pera, noz de kukui, castanha do Taiti, manjericão, huckleberry, hibiscus maracujá, maçã estrelada, sassafrás, cacto, erva de São João, loosestrife, espinheiro, coentro, planta de curry, kiwi, tomilho, abobrinha, ulluco, jicama, folha de água, laranja de macaco espinhoso, mombin amarelo, carambola, amaranto, wasabi, japonês pimenta, ameixa amarela, mashua, toon chinês, espinafre da Nova Zelândia, espinafre bower, ugu, tansy, morrião dos passarinhos, jocote, maçã malaia, jambu, leitugas, batata chinesa, salsa de cavalo, mostarda de hedge, campion, ágata, cassodeiro, cardo, burnet, groselha estrela, erva salgada, glasswort, azeda, samambaia de prata, verduras, prímula, prímula, beldroegas, grama-de-nó, terebinto, alface, betel selvagem, pimenta da África Ocidental, yerba santa, estragão, salsa, cerefólio, agrião, saxifrage burnet, favo de mel, petasita, shiso, pimenta em água, perila, feijão amargo, oca, kampong, aipo chinês, manjericão limão, manjericão tailandês, mimosa da água, cicely, repolho, moringa, mauka, samambaia de avestruz, erva de arroz em casca, erva de arroz, alface de serra amarela, amor, grama de pimenta, maca, garrafa cabaça, feijão jacinto, espinafre aquático, peixe-gato, erva-doce, espinafre de Okinawa, lúpulo doce de lótus, soldado galante, culantro, rúcula, cardo, caigua, mitsuba, chipilin, samphire, mampat, ebolo, cabaça de hera, cardo de repolho, couve marinha, chaya, huauzontle, mostarda etíope,
magenta spreen, bom rei henry, epazol, quartos de cordeiro, centella em crista de galho, alcaparra, rapini, couve napa, mizuna, savoy chinês, kai-lan, mostarda, espinafre de Malabar, acelga, marshmallow, acácia-escalada, China juta, páprica, sementes de urucum, hortelã, salgados, manjerona, cominho, camomila, erva-cidreira, pimenta da Jamaica, mirtilo, cherimólia, amora, amora, amora, amora, amora, amora, feijoa, jaca, jambul, jujuba, physalis, mangostão roxo, rambutan, groselha, groselha, baga salal, satsuma, fruta de ugli, feijão azuki, feijão preto, ervilha de olhos pretos, feijão borlotti, feijão comum, feijão verde, feijão, feijão de lima, feijão mungo, feijão da marinha, feijão pinto, feijão de corredor, mangetout, ervilha, brócolis, calabresa, urtiga, pimentão, raddichio, daikon, rabanete branco, skirret, tat soi, brócolis, rabanete preto, raiz de bardana, feijão fava, brócolis raab, lablab, tremoço, sterculia, feijão aveludado, feijão alado, feijão inhame, mulga, erva daninha, guarda-chuva arbusto, tjuntjula, wakalpulka, arbusto de bruxa, acácia, chia, noz de faia, candlenut, colocynth, mamoncillo, noz de Maya, mongongo, noz de ogbono, noz do paraíso e cempedak.
[1718] Onde a planta é um monocotiledônea ou a semente é uma semente de um monocotiledôneo, o monocotiledôneo pode ser selecionado do grupo que consiste em milho, trigo, aveia, arroz, cevada, milho, banana, cebola, alho, aspargos, azevém, milho, fonio, raishan, grama de nipa, açafrão, galanga, cebolinha, cardamomo, tamareira, abacaxi, chalota, alho-poró, cebolinha, castanha de água, rampa, Lágrimas de trabalho, bambu, ragi, farinha de água impecável, orelha de elefante de folhas de flecha, espinafre do Taiti abaca, areca, bajra, noz de betel, painço de vassoura, sorgo de vassoura, citronela, coco, coco, milho, dasheen, durra, trigo duro, edo, fique, formio, gengibre, grama de pomar, grama de esparto, grama do Sudão, milho da Guiné Cânhamo de Manila, henequen, milho híbrido, jowar, capim-limão, maguey, milho junco, milho de dedo, milho foxtail, milho japonês, milho proso, linho da Nova Zelândia, aveia, óleo de palma, palma palmira, sagu, redtop, sisal, sorgo, trigo soletrado, milho doce, sorgo doce, taro, teff, capim timothy, triticale, baunilha, trigo e inhame.
[1719] Onde a planta é um gimnosperma ou a semente é uma semente de um gimnosperma, o gimnosperma pode pertencer a uma família selecionada do grupo que consiste em Araucariaceae, Boweniaceae, Brassicaceae, Cephalotaxaceae, Cupressaceae, Cycadaceae, Ephedraceae, Ginkgoaceae, Gnetaceae, Pinaceae, Podocarpeae, Taxaceae, Taxodiaceae, Welwitschiaceae e Zamiaceae.
[1720] Quando a planta é da família Brassicaceae, a planta pode compreender uma planta do gênero Brassica. Por exemplo, a planta da família Brassicaceae pode compreender Brassica napus, Brassica rapa, Brassica juncea, Brassica hirta, Brassica oleracea, Raphanus sativus, Sinapus alba ou Lepidium sativum.
[1721] As plantas e sementes aqui descritas podem incluir plantas transgênicas ou sementes de plantas, como cereais transgênicos (trigo, arroz), milho, soja, batata, algodão, tabaco, colza e plantas frutíferas (frutas de maçãs, peras, frutas cítricas e uvas. As plantas transgênicas preferidas incluem milho, soja, batata, algodão, tabaco e colza.
[1722] Plantas e sementes transgênicas adequadas podem ser caracterizadas pela formação de toxinas da planta, especialmente a partir do material genético Bacillus thuringiensis (por exemplo, pelo gene CryIA (a), CryIA (b), CryIA (c), CryIIA, CryIIΙΑ, CryIIΙΒ2, Cry9c, Cry2Ab, Cry3Bb, CryIF ou uma combinação dos mesmos). A formação de toxinas nas plantas aumenta a resistência da planta a insetos, aracnídeos, nematoides, lesmas e caracóis (doravante denominados "plantas Bt"). As plantas Bt, por exemplo, estão disponíveis comercialmente sob o nome comercial YIELD GARD ® (por exemplo, milho, algodão, soja), Knock0ut ® (por exemplo, milho), StarLink ® (por exemplo, milho), StarLink ® (por exemplo, milho), Bollgard ® (algodão), Nucotn ® (algodão) e NewLeaf ® (batata), variedades de milho, algodão, soja e batata. As plantas de tolerância a herbicidas incluem plantas com os nomes comerciais Roundup Ready ® (uma tolerância ao glifosato, como milho, algodão, soja), Clearfield ® (por exemplo, milho), Liberty Link ® (tolerância com glufosinato, por exemplo, colza), IMI ® (com tolerância à imidazolinona) e STS ® (tolerância a uma sulfonilureia, como o milho).
[1723] As sementes de plantas, conforme descrito aqui, podem ser geneticamente modificadas (por exemplo, qualquer semente que resulte em uma planta ou parte de planta geneticamente modificada que expresse tolerância a herbicidas, tolerância a fatores ambientais como estresse hídrico, seca, vírus e produção de nitrogênio ou resistência a bactérias, fungos ou toxinas de insetos). Sementes geneticamente modificadas adequadas incluem as de cole, legumes, frutas, árvores, fibras, oleaginosas, tubérculos, café, flores, leguminosas, cereais, bem como outras plantas das espécies monocotiledôneas e dicotiledôneas. De preferência, as sementes geneticamente modificadas incluem amendoim, tabaco, gramíneas, trigo, cevada, centeio, sorgo, arroz, colza, beterraba, girassol, tomate, pimenta, feijão, alface, batata e cenoura. Mais preferencialmente, as sementes geneticamente modificadas incluem algodão, soja e milho (doce, campo, semente ou pipoca).
[1724] Plantas transgênicas particularmente úteis que podem ser tratadas de acordo com a invenção são plantas que contêm eventos de transformação, ou uma combinação de eventos de transformação, listados, por exemplo, nas bases de dados de várias agências reguladoras nacionais ou regionais (ver, por exemplo, http: // gmoinfo. jrc.it/gmp_browse.aspx e http://www.agbios.com/dbase.php).
[1725] Tendo descrito a invenção em detalhes, será aparente que modificações e variações são possíveis sem se afastar do escopo da invenção definido nas reivindicações anexas.
EXEMPLOS
[1726] Os seguintes exemplos não limitativos são fornecidos para ilustrar ainda mais a presente invenção. Exemplos adicionais, demonstrando a capacidade de várias enzimas, conforme descrito aqui, de estimular o crescimento das plantas e/ou promover a saúde das plantas quando aplicadas às plantas como enzimas livres, estão incluídas na publicação do pedido de patente nº US 2017/0356002, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência em sua totalidade. EXEMPLO 1: USO DE VÁRIAS SEQUÊNCIAS DE
ALVEJAMENTO PARA EXPRESSAR LIPASE NA SUPERFÍCIE DE BACILLUS THURINGIENSIS.
[1727] Uma grande variedade de sequências de alvejamento que possuem um alto grau de homologia com os aminoácidos 20- 35 de BclA (aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1) pode ser usada para exibir enzimas, proteínas e peptídeos na superfície de membros da família Bacillus cereus. Várias sequências de alvejamento foram comparadas produzindo proteínas de fusão contendo as sequências de alvejamento ligadas à lipase de Bacillus subtilis (o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 324, diretamente ligada à lipase da SEQ ID NO: 263). As construções de fusão foram sintetizadas usando os promotores nativos da sequência de alvejamento, clonadas no plasmídeo replicador pMK4 e introduzidas em Bacillus thuringiensis BT013A. Bacillus thuringiensis BT013A foi depositado no Serviço de Pesquisa Agrícola (ARS) do Departamento de Agricultura dos EUA (USDA), com o endereço 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 EUA, em 10 de março de 2014, e atribuído o número de depósito NRRL B-50924. Bacillus thuringiensis BT013A também é conhecido como Bacillus thuringiensis 4T7.
[1728] As cepas foram submetidas à esporulação por incubação a 30°C em placas de ágar nutriente contendo cloranfenicol 10 μg/ml por 3 dias. Os esporos foram coletados, lavados e ressuspensos em PBS a uma taxa de 1x108/ml. 1 X 105 esporos para cada construto de fus foram suspensos em 400 μl de dH2O. As reações foram aquecidas com os componentes da reação até a temperatura de reação desejada (40 °C). 200 μl de tampão de trabalho foram adicionados (Solução A:Solução B de 9:1). A solução A foi Tris 50 mM pH 10 e 13,6 mM de ácido desoxicólico e a Solução B foi 3 mg/ml de palmitato de p-nitrofenila em isopropanol. A reação foi incubada a 40 °C por 10 minutos e colocada em gelo, centrifugada para remover esporos e a absorvância a 420 nm foi registrada. Os resultados são mostrados na Tabela 22 abaixo. A atividade foi normalizada para uma proteína de fusão de controle compreendendo os aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1 fundidos à lipase de Bacillus subtilis.
TABELA 22. Cepa Sequência de Enzima Atividade relativa alvejamento B. thuringiensis BT013A Aminoácidos 1–35 Lipase 100% da SEQ ID NO: 1 B. thuringiensis BT013A Aminoácidos 1–27 Lipase 92,5% da SEQ ID NO: 3 B. thuringiensis BT013A Aminoácidos 1–28 Lipase 13,5% da SEQ ID NO: 7 B. thuringiensis BT013A Aminoácido 1-24 Lipase 24,8% da SEQ ID NO: 9 B. thuringiensis BT013A Aminoácido 1–33 Lipase 98,5% da SEQ ID NO: 13 B. thuringiensis BT013A Aminoácido 1-33 Lipase 107,8% da SEQ ID NO: 21 B. thuringiensis BT013A SEQ ID NO: 96 Lipase 137,1% B. thuringiensis BT013A SEQ ID NO: 98 Lipase 146,3% B. thuringiensis BT013A SEQ ID NO: 100 Lipase 115,7% B. thuringiensis BT013A SEQ ID NO: 104 Lipase 81,5%
[1729] Várias sequências de alvejamento ligadas à lipase resultam em níveis de expressão mais altos e atividade da enzima na superfície dos esporos. Em particular, SEQ ID NOs. 96, 98 e 100, cada um contendo uma sequência de alvejamento mais curta, resultou em uma expressão de fusão aprimorada na superfície dos esporos de BEMD. Todas as proteínas de fusão contendo as sequências de alvejamento testadas resultaram na exibição de lipase na superfície. EXEMPLO 2: USO DE VÁRIAS SEQUÊNCIAS DE
EXOSPORIUM PARA EXPRESSAR LIPASE NA SUPERFÍCIE DE BACILLUS THURINGIENSIS E DEMONSTRAÇÃO DA LOCALIZAÇÃO DA PROTEÍNA DE FUSÃO NA SUPERFÍCIE DO EXOSPORIUM.
[1730] Uma grande variedade de proteínas exosporium pode ser usada para exibir enzimas, proteínas e peptídeos na superfície dos membros da família Bacillus cereus. Várias proteínas exosporium diferentes foram comparadas produzindo proteínas de fusão contendo as proteínas exosporium ligadas à lipase Bacillus subtilis, como descrito no Exemplo 1. As construções de fusão foram sintetizadas usando o promotor nativo da proteína do exosporium indicada na Tabela 23 abaixo, clonadas no plasmídeo replicador pMK4 e introduzidas em Bacillus thuringiensis BT013A. Os esporos que exibem as várias fusões de lipase da proteína do exosporium - Bacillus subtilis 168 foram feitos através do crescimento das bactérias transformadas no caldo de infusão cerebral do coração com pressão seletiva de 10 μg/ml de cloranfenicol, plaqueando em placas de ágar nutritivo e incubando a 30 °C por 3 dias. Após 3 dias, os esporos foram lavados fora das placas, purificado por centrifugação e ressuspenso em PBS a 1 X 108 UFC/ml.
[1731] 1 X 105 esporos para cada construto de fusão foram suspensos em 400 μl de dH2O. As reações foram aquecidas com os componentes da reação até a temperatura de reação desejada (40 °C). Foram adicionados 200 μl de tampão de trabalho (Solução A: Solução B de 9:1). A solução A foi Tris 50 mM pH 10 e 13,6 mM de ácido desoxicólico e a Solução B foi 3 mg/ml de palmitato de p-nitrofenila em isopropanol. A reação foi incubada a 40 °C por 10 minutos e colocada em gelo, centrifugada para remover esporos e a absorvância a 420 nm foi registrada. Os resultados são mostrados na Tabela 23 abaixo. A atividade foi normalizada para a SEQ ID NO: 109 ligada à lipase. TABELA 23. Cepa Proteína do Enzima Atividade exosporium relativa B. thuringiensis BT013A SEQ ID NO: 109 Lipase 100% B. thuringiensis BT013A SEQ ID NO: 110 Lipase 134,5% B. thuringiensis BT013A SEQ ID NO: 113 Lipase 17,8% B. thuringiensis BT013A SEQ ID NO: 117 Lipase 19,8% B. thuringiensis BT013A SEQ ID NO: 118 Lipase 8,2%
[1732] Utilização das proteínas exosporium das SEQ ID NOs. 109 e 110 resultaram na maior atividade enzimática no esporo. Todas as proteínas de fusão contendo proteínas exosporium resultaram na exibição superficial da lipase ativa de Bacillus subtilis 168, embora em níveis diferentes.
[1733] Foi demonstrado que proteínas exosporium adicionais resultam no alvejamento de proteínas de fusão ao exosporium usando o repórter fluorescente mCherry. Criaram-se construtos de fusão que continham as proteínas exosporium das SEQ ID NOs. 111, 120 e 110 ligadas ao repórter mCherry. Os esporos foram cultivados por 1,5 dia, coletados e ressuspensos como descrito acima. 7 ml de esporos fluorescentes foram colocados sob um microscópio Nikon E1000 e fotografados durante a esporulação tardia. A localização circular em um anel é indicativa da localização da camada externa de esporos, e a aparência corresponde à de uma proteína do exosporium. Os resultados da microscopia fluorescente são mostrados na Figura 2. Os painéis A, B e C da Figura 2 são imagens microscópicas fluorescentes de esporos que expressam proteínas de fusão compreendendo as proteínas exosporium das SEQ ID NOs. 111, 120 e 110, respectivamente, e o repórter mCherry. Todas as três fusões demonstraram altos níveis de fluorescência e localização do exosporium, demonstrando sua utilidade potencial para a expressão de proteínas estranhas na superfície do exosporium. EXEMPLO 3: USO DE VÁRIAS SEQUÊNCIAS DE
ALVEJAMENTO E PROTEÍNAS EXOSPORIUM PARA EXPRESSAR A FOSFATASE NOS ESPOROS DE BACILLUS THURINGIENSIS E EFEITOS DOS ESPOROS QUE EXPRESSAM A FOSFATASE NA SOJA.
[1734] Os esporos de BEMD que expressam a fosfatase A4 de Bacillus subtilis EE148 (PhoA4) foram criados por síntese gênica dos genes que codificam para várias sequências de alvejamento e proteínas exosporium sob o controle de seus promotores nativos ligados ao PhoA4. Os genes sintetizados foram clonados em pMK4 e introduzidos em Bacillus thuringiensis BT013A. Os esporos que exibiam as várias fusões de proteína do exosporium - Bacillus subtilis EE148 PhoA4 foram feitos cultivando as bactérias transformadas no caldo de infusão de coração cerebral com pressão seletiva de 10 μg/ml de cloranfenicol, plaqueando em placas de ágar nutritivo e incubando a 30 °C por três dias. Após três dias, os esporos foram lavados fora das placas, purificado por centrifugação e ressuspenso em PBS a 1 x 108 UFC/ml.
[1735] A soja foi plantada com 2,54 cm de profundidade em vasos de 10 cm de profundidade, preenchidos com solo superficial de barro. Esporos BEMD expressam PhoA4 foram diluídos para uma concentração de 1 x 104/ml em 50 ml de água e aplicado a cada planta no plantio. Um controle somente de água também foi incluído. Adicionou-se polifosfato aos vasos em líquido a uma taxa de 0,5 mg/vaso. As plantas foram cultivadas sob luz ideal usando lâmpadas T5, 54 watts e expostas a 13 horas de luz por dia sob condições de temperatura controlada entre 15,5 e 25,5 °C. As plantas foram regadas até a saturação a cada três dias durante o teste de duas semanas. No final de duas semanas, a altura de cada planta foi medida e as medidas foram normalizadas para controlar plantas somente com água.
[1736] Os resultados são mostrados na Tabela 24 abaixo. A soja cultivada na presença de esporos de BEMD que expressam proteínas de fusão contendo PhoA4 ligadas a várias sequências de alvejamento e proteínas exosporium com diferentes parceiros de fusão com PhoA4 exibiram crescimento aumentado, mas a extensão do efeito variou dependendo da sequência de alvejamento ou proteína do exosporium usada. TABELA 24. Espécies de Bacillus Sequência de alvejamento Altura em 2 ou proteína do exosporium semanas, ligada a PhoA4 Normalizada H2O (sem bactérias) N/D 100% Bacillus thuringiensis BT013A Aminoácidos 1–35 da SEQ ID 100% NO: 1 Bacillus thuringiensis BT013A Aminoácidos 1–28 da SEQ ID 117,4% NO: 3 Bacillus thuringiensis BT013A Aminoácidos 1–33 da SEQ ID 107,3% NO: 21 Bacillus thuringiensis BT013A SEQ ID NO: 96 123,3% Bacillus thuringiensis BT013A SEQ ID NO: 98 124,1% Bacillus thuringiensis BT013A SEQ ID NO: 109 131,7% Bacillus thuringiensis BT013A SEQ ID NO: 110 104,8% EXEMPLO 4: USO DE VÁRIAS SEQUÊNCIAS DE
ALVEJAMENTO PARA EXPRESSAR ENDOGLUCANASE NA SUPERFÍCIE DE ESPOROS DE MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS.
[1737] O plasmídeo pSUPER foi gerado atravésfusão do plasmídeo pUC57 (que contém uma cassete de resistência à ampicilina) com o plasmídeo de Bacillus pBC16-1 (contendo uma resistência à tetraciclina). Este plasmídeo de 5,5 kpb pode replicar-se em E. coli e Bacillus spp.
O plasmídeo pSUPER foi modificado pela clonagem de um fragmento gerado por PCR através de recombinação homóloga que fundiu o promotor BclA, o códon de início e os aminoácidos 20-35 de BclA (aminoácidos 20-35 de SEQ ID NO: 1) na estrutura com endoglucanase de Bacillus subtilis 168 (o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 334, diretamente ligada à β-1,4-endoglucanase da SEQ ID NO: 293; pSUPER- BclA 20-35-Endo). Geraram-se fragmentos de PCR que continham o promotor BclA (SEQ ID NO: 149), o códon de início e os aminoácidos 20-35 do BclA fundidos na estrutura à endoglucanase de Bacillus subtilis 168. Esses fragmentos de PCR foram digeridos com XhoI e ligados ao local SalI do plasmídeo pSUPER para gerar o plasmídeo pSUPER-BclA 20-35- endoglucanase.
Este plasmídeo foi então sujeito a PCR inverso para amplificar todo o esqueleto plasmídico inteiro, mas deixando de fora a sequência correspondente aos aminoácidos 20–35 de BclA.
Este produto de PCR inverso foi combinado com um produto de PCR que amplificou a região equivalente de cada uma das SEQ ID NOs. 5, 15, 25, 81, 85, 87 ou aminoácidos 20–33 da SEQ ID NO: 1. Assim, foram criados construtos que continham cada uma das seguintes sequências de alvejamento fundidas na estrutura com a endoglucanase de Bacillus subtilis 168: (1) aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1; (2) aminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 5; (3) aminoácidos 28-43 da SEQ ID NO: 15; (4) aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 25; (5) aminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 81; (6) aminoácidos 13-28 da SEQ ID NO: 85; (7) aminoácidos 13-28 da SEQ ID NO: 87; e (8) aminoácidos 20-33 da SEQ ID NO: 1. Cada construto continha o promotor de BclA de tipo selvagem e uma metionina no códon de início, seguido pela sequência de alvejamento fundida na estrutura ao gene da endoglucanase de Bacillus subtilis.
Cada um desses construtos foi transformado em E. coli e semeados para obter colônias únicas em placas Luria mais ampicilina (100 µg/ml). Os plasmídeos de cada única colônia foram crescidos em culturas durante a noite em caldo Luria mais ampicilina e purificados usando um kit miniprep WIZARD SV, e as sequências foram verificadas por sequenciação de Sanger.
O DNA também foi quantificado por espectrofotometria e o DNA foi introduzido no Bacillus thuringiensis BT013A. Além disso, o construto Endo pSUPER-BclA-20–35 foi introduzido no Bacillus thuringiensis BT013A, que teve a proteína BclA nativa removida de seu genoma por meio de recombinação homóloga (knockout BclA, "BclA KO"). As colônias corretas foram rastreadas por placas em caldo nutriente contendo antibiótico (tetraciclina a 10 µg/ml). Cada colônia positiva foi criada em caldo de infusão de coração cerebral a 30 °C durante a noite a 300 rpm, com antibiótico, e o DNA genômico foi purificado e sequenciado novamente para verificar a pureza genética. As colônias verificadas foram cultivadas durante a noite em caldo de infusão de coração cerebral com 10 µg/ml de tetraciclina e induzidas a esporular por esporulação em um meio à base de extrato de levedura.
[1738] Cada uma das execuções de produção no meio à base de extrato de levedura foi coletada 48 horas após a produção de esporos e sujeita a comparação enzimática dos esporos resultantes. O ensaio para a atividade da endoglucanase foi realizado através da determinação da atividade da celulase usando um substrato de carboximetilcelulose (CMC) e um ácido dinitrosalicílico (reagente DNS). Uma fonte comercial de enzima celulase foi usada para preparar padrões em tampão de citrato 50 mM, pH 4,8. CMC a 1% (sal de carboximetilcelulose de sódio) foi preparado em tampão de citrato 50 mM, pH 4,8, para servir como substrato para a reação. 250 μl de preparação de esporos foram sedimentados e os esporos foram ressuspensos em 150 μl de tampão de citrato 50 mM, pH 4,8. A reação foi executada com um reagente composto de 1% de DNS, NaOH a 1%, 0,05% de Na2SO4, 0,2% de fenol e 18,2% de sais de Rochelle. 150 μl da amostra foram misturados com 250 μl do substrato CMC a 1% e incubados em banho-maria a 50 °C por 15 minutos. Foram adicionados 300 μl de reagente DNS e as amostras foram fervidas a 100C por 10 minutos e depois resfriadas em gelo. A solução foi centrifugada por 5 minutos a 14.000 x g para remover os esporos da leitura de absorvância. A absorvância foi determinada a 540 nm usando um nanospectrofotometer IMPLEN modelo P330. As amostras foram realizadas em triplicado com um espaço em branco para cada reação. Os resultados das leituras de enzimas são mostrados na Tabela 25.
[1739] Para o milho, 1 µl de cada caldo inteiro para cada um dos construtos foi colocado em cada semente. Para a abóbora, 2 µl de caldo inteiro para cada construto foram colocados em cada semente. Para conseguir isso, 50 sementes foram colocadas em um tubo de polipropileno de fundo cônico de 50 ml e submetidas a vórtice levemente usando um misturador de vórtice. Para esse turbilhão de sementes, 50 µl (para milho) ou 100 µl (para abóbora) de caldo contendo os esporos recombinantes foram lentamente pipetados para dentro do tubo, e a ação de vórtice revestiu as sementes com um revestimento uniforme de todo o caldo celular de cada construir. Essas sementes foram então plantadas a 1” de profundidade no solo nativo, usando um vaso de 39,6 cm 3 (15,6 pol3), com duas sementes por vaso. Os vasos foram regados até a saturação, e as plantas foram autorizadas a germinar. As plantas foram cultivadas em uma sala de crescimento controlado, fixada em 70°F (21°C) durante o dia e 60°F (15,5°C) durante a noite, com um período de luz de 14 horas/dia, sob condições de luz artificial, por 14 dias. Após 14 dias, as plantas foram medidas quanto à altura e os resultados foram normalizados para um grupo controle que recebeu apenas água como tratamento nas sementes.
TABELA 25. NÍVEIS DE ENZIMAS E FENÓTIPOS DE CRESCIMENTO DAS PLANTAS.
[1740] AA = aminoácidos
[1741] ND = não determinado
[1742] Os dados acima mostram que cada uma dessas construções foi capaz de estimular o crescimento das plantas e mostram que o uso de diferentes sequências de alvejamento permite o controle do nível de expressão da enzima na parte externa do esporo.
[1743] O uso dos aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1 ou AA 13-28 da SEQ ID NO: 85 como a sequência de alvejamento resultou nos níveis mais altos de produção enzimática. Isso é surpreendente, considerando o baixo grau de identidade entre essas sequências de alvejamento (43,8% de identidade em todo o comprimento da sequência de alvejamento). O uso dos aminoácidos 28-43 da SEQ ID NO: 15 ou dos aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 25 resultou na maior resposta das plantas nos dois tipos de plantas. A expressão da proteína de fusão contendo os aminoácidos 20–25 da SEQ ID NO: 1 como a sequência de alvejamento no hospedeiro BT013A BclA KO levou a um aumento muito grande (263,8%) na quantidade de atividade enzimática na superfície dos esporos em comparação expressão da mesma proteína de fusão na cepa de tipo selvagem. EXEMPLO 5: USO DE VÁRIAS SEQUÊNCIAS DE
ALVEJAMENTO E PROTEÍNAS EXOSPORIUM PARA EXPRESSAR FOSFOLIPASE, LIPASE E ENDOGLUCANASE NA SUPERFÍCIE DE ESPOROS DE MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS.
[1744] O plasmídeo pSUPER foi modificado pela clonagem de um fragmento gerado por PCR (digestão e ligação com XhoI) que fundiu o promotor BclA, o códon de início e os aminoácidos 20-35 de BclA (aminoácidos 20-35 de SEQ ID NO: 1), seguidos por uma sequência de seis ligantes de alanina em estrutura com a fosfolipase C específica para a fosfatidilcolina de Bacillus thuringiensis gene (PC-PLC) (peptídeo sinal da SEQ ID NO: 317, diretamente ligado ao PLC da SEQ ID NO: 250; pSUPER-BclA 20- 35-PL) ou lipase de Bacillus subtilis LipA (o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 324, diretamente ligado à lipase da SEQ ID NO: 263; pSUPER-BclA-20-35-Lipase) ou Bacillus subtilis endoglucanase eglS (o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 334, diretamente ligado à β-1,4-endoglucanase da SEQ ID NO: 293; pSUPER-BclA- 20-35-Endo) como descrito acima no Exemplo 4. Esses plasmídeos foram então submetidos a PCR inverso para amplificar todo o esqueleto plasmídico inteiro, mas sem a sequência correspondente aos aminoácidos 20–35 de BclA. Este produto de PCR inverso foi combinado com um produto de PCR que amplificou a região equivalente de cada uma das SEQ ID NOs. 5 (isto é, aminoácidos 23- 38 da SEQ ID NO: 5), 15 (isto é, aminoácidos 28-43 da SEQ ID NO: 15) e 25
(isto é, aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 25); as proteínas exosporium de comprimento total de SEQ ID NOs. 120, 111, 121, 108 e 114; ou aminoácidos 20-33, 20-31, 21-33, 23-33 ou 23-31 da SEQ ID NO: 1. Cada uma dessas construções continha o promotor BclA do tipo selvagem, uma metionina no códon de início, seguido pela sequência de alvejamento ou proteína do exosporium fundida na estrutura à fosfolipase C específica para a fosfatidilcolina, Bacillus cereus, Bacillus subtilis 168 Lipase LipA ou gene Bacillus subtilis 168 endoglucanase eglS. Cada uma destas construções foi pesquisada quanto aos transformantes corretos, como descrito no Exemplo 4 acima.
[1745] Cada uma das execuções de produção no meio à base de extrato de levedura foi coletada 48 horas após a produção de esporos e sujeita a comparação enzimática dos esporos resultantes. A determinação dos dados de enzimas para a endoglucanase foi realizada como descrito acima no Exemplo 4. Para o ensaio da enzima fosfolipase C, 1 ml de esporos recombinantes foi sedimentado a 10.000 × g por 3 minutos e o sobrenadante removido e descartado. O sedimento de esporos foi então ressuspenso em 500 µl de tampão de reação (Tris-HCL 0,25 mM, glicerol a 60%, o-nitrofenil fosforilcolina 20 mM, pH 7,2). Um controle negativo para ensaios enzimáticos continha esporos BT013A sem expressão enzimática. Cada amostra foi incubada a 37 °C por 18 horas, centrifugada novamente para remover os esporos, diluída 1: 1 em água e o Abs540 lido usando um espectrofotômetro. Isto foi comparado com uma curva padrão em relação aos controles de fosfolipase e lipase comprados comercialmente para estabelecer os U/ml de atividade. Os resultados das leituras de enzimas são mostrados nas Tabelas 26 e 27.
TABELA 26. NÍVEIS DE ENZIMAS DA
ENDOGLUCANASE Sequência de alvejamento, Níveis de endoglucanase (mU/ml) experiência #1 (H2O) Controle 0 mU/ml AA 20–35 SEQ ID NO: 1 38,2
SEQ ID NO: 120 25,7 SEQ ID NO: 111 29,7 SEQ ID NO: 121 24,4 SEQ ID NO: 108 24,0 SEQ ID NO: 114 11,0 AA 20–33 da SEQ ID NO: 1 30,5 Sequência de alvejamento, Níveis de endoglucanase (mU/ml) experiência #2 AA 20–31 da SEQ ID NO: 1 48,22 AA 21-33 da SEQ ID NO: 1 60,86 AA 23-33 da SEQ ID NO: 1 19,93 AA 23–31 da SEQ ID NO: 1 45,31 AA 20–35 da SEQ ID NO: 1 54,1 AA = aminoácidos
[1746] Muitas das sequências alvo e proteínas exosporium foram capazes de exibir uma grande quantidade de enzimas ativas na superfície dos esporos, incluindo SEQ ID NOs. 108, 111, 114, 120 e 121. Os aminoácidos 20-31, 21-33 e 23-31 da SEQ ID NO: 1 forneceram níveis de expressão enzimática semelhantes aos aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, indicando que fragmentos menores são adequados para a exibição de enzimas na a superfície dos esporos. Somente os aminoácidos 23-33 da SEQ ID NO: 1 exibiram um nível de exibição de enzima diminuído nos esporos.
TABELA 27. NÍVEIS DE ENZIMA FOSFOLIPASE Sequência de Níveis de enzima PC- Níveis de enzimas alvejamento PLC lipase (em relação ao controle (em relação ao de H2O) controle de H2O) (H2O) Controle 0,0 0,0 AA 20–35 SEQ ID NO: 1 0,787 0,436 AA 23-38 da SEQ ID NO: 5 0,688 0,602
AA 28-43 da SEQ ID NO: 0,372 0,228 15 AA 9–24 da SEQ ID NO: 25 0,247 0,359 SEQ ID NO: 114 0,446 0,798 SEQ ID NO: 120 3,612 0,753 SEQ ID NO: 111 0,738 0,329 AA = Aminoácidos
[1747] Semelhante aos resultados mostrados acima na Tabela 26, os níveis mais altos de fosfolipase ou lipase na superfície dos esporos foram observados quando os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, os aminoácidos 23 a 38 da SEQ ID NO: 5 ou o foi utilizada a sequência de proteína do exosporium da SEQ ID NO: 120.
[1748] Os efeitos dos esporos que expressam o construto BclA 20-35-PL na nodulação na soja são mostrados abaixo na Tabela 28. TABELA 28. RESPOSTAS DA PLANTA FOSFOLIPASE Sequência de alvejamento Nodulação por Planta (Soja) (H2O) Controle 9,8 Controle de Deformação (Bacillus 8,2 thuringiensis BT013A) Bacillus thuringiensis BT013A que expressa 14,0 uma proteína de fusão de AA 20–35 da SEQ ID NO: 1 e fosfolipase
[1749] Os esporos que expressam o construto 20-35-PL e os esporos não transformados foram aplicados às sementes de soja usando volumes de 1 μl de preparações de esporos e uma concentração de esporos de 1,8 a 1,9 x 108 esporos por ml (de culturas que resultaram em aproximadamente 99% de esporulação). As sementes foram tratadas antes do plantio pipetando 1 μl da preparação de esporos diretamente em cada semente e permitindo a secagem. A nodulação foi examinada após cerca de três semanas, no estágio V3 do desenvolvimento. As plantas foram cuidadosamente removidas, a sujeira lavada suavemente das raízes e os nódulos contados para cada planta. Como mostrado na Tabela 28, a adição de esporos exibindo fosfolipase nas sementes de soja permite um número acelerado de nódulos nas plantas, o que é uma indicação positiva para o crescimento inicial e para eventuais aumentos no rendimento da soja. EXEMPLO 6: EXPRESSÃO APRIMORADA DE
CONSTRUTOS DE FUSÃO NO SISTEMA BEMD PELO USO DE ELEMENTOS PROMOTORES APRIMORADOS OU ALTERNATIVOS.
[1750] O sistema BEMD pode exibir uma ampla gama de proteínas, peptídeos e enzimas usando uma ou mais das sequências de alvejamento descritas aqui. Algumas dessas sequências de alvejamento têm uma alta afinidade pelo exosporium, o que seria benéfico para a expressão da proteína de fusão, mas seu baixo nível de expressão da proteína de fusão limita seu uso no sistema BEMD. Para tais proteínas e sequências de fusão, podem ser utilizados promotores alternativos de esporulação de alta expressão em vez dos promotores nativos.
[1751] Por exemplo, a SEQ ID NO: 13 (aminoácidos 1–39 do gene KBAB4 de B. weihenstephensis 3572) fornece uma sequência N- terminal muito eficaz para a entrega de proteínas ao exosporium dos membros da família Bacillus cereus, como mostrado na Tabela 29 abaixo. Todos os genes foram sintetizados na sua forma completa (incluindo regiões promotoras e regiões que codificam para proteínas de fusão) como aqui descrito. Quando os elementos promotores nativos do gene KBAB4 de B. weihenstephensis 3572 (SEQ ID NO: 177) foram usados para expressar uma proteína de fusão compreendendo a sequência de alvejamento de SEQ ID NO: 13 fundida com uma enzima β-galactosidase (de E. coli), um baixo nível de proteína de fusão foi expresso, levando a uma redução na atividade enzimática na superfície do esporo. A atividade enzimática foi medida pela conversão de o- nitrofenilgalactósido 0,5M em solução por 10 minutos. A conversão enzimática foi medida com um espectrofotômetro no ABS540. A substituição dos elementos promotores nativos do gene KBAB4 B. weihenstephensis 3572 pelos promotores das SEQ ID NO de alta expressão: 157 (B. anthracis beta/BAS3290) ou SEQ ID NO: 178 (B. weihenstephensis KBAB4 YVTN β-proteína da hélice) levou a um aumento drástico na atividade enzimática dos esporos. Por outro lado, a substituição dos elementos promotores nativos do gene KBAB4 de B. weihenstephensis 3572 pelo promotor nativo de B. anthracis Sterne BAS1882 (SEQ ID NO: 176) levou a uma diminuição da atividade enzimática dos esporos. O nível de expressão da sequência de alvejamento da SEQ ID NO: 13 fundida à - galactosidase foi muito menor (0,38X) quando acionado pelo promotor de BAS1882 (SEQ ID NO: 176) e foi bastante aprimorado quando acionado a partir do promotor BetA (SEQ ID NO: 197) ou promotor de proteína YVTN (SEQ ID NO: 178). TABELA 29. Promotor Proteína de Atividade da β- Mudança de Fusão galactosidase no dobra sistema BEMD, normalizada SEQ ID NO: 177 SEQ ID NO: 13- 100% β-galactosidase SEQ ID NO: 157 SEQ ID NO: 13- 213,4% 2,13X β-galactosidase SEQ ID NO: 178 SEQ ID NO: 13- 220,7% 2,21X β-galactosidase SEQ NO: ID 176 SEQ ID NO: 13- 38,1% 0,38X β-galactosidase EXEMPLO 7: NÍVEIS DE EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO USANDO VÁRIOS PROMOTORES CONTENDO SIGMA-K.
[1752] Como mostrado no Exemplo 6 acima, a substituição do promotor nativo de uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium pode afetar significativamente o nível de proteína de fusão expressa no exosporium de um esporo da família Bacillus cereus. Por exemplo, a substituição do promotor BclA nativo pelo promotor BclB reduz bastante o nível de proteína de fusão na superfície dos esporos dos membros da família Bacillus cereus. Alternativamente, a substituição do promotor BclB nativo pelo promotor BclA aumenta dramaticamente os níveis de proteína de fusão no exosporium.
[1753] Níveis de expressão relativa do promotor para várias proteínas exosporium sob o controle de seus promotores de esporulação nativos foram obtidos a partir de dados de microarranjo de Bergman et al., Transcriptional profiling of the Bacillus anthracis life cycle in vitro and an implied model for regulation of spore formation, J. Bacteriol. 188 (17): 6092–6100 (2006). Os níveis de expressão relativa foram determinados durante o tempo de esporulação tardia (300 minutos após o início do experimento), quando os promotores de sigma K são mais ativos. Os promotores Sigma K são importantes promotores para expressão de genes localizados no exosporium e proteínas associadas. Expressão relativa é o aumento no nível de expressão de um gene quando comparado à média de todos os outros genes do cromossomo em todos os momentos. A tabela 30 abaixo mostra os níveis de expressão relativa de uma variedade de genes controlados por sigma K em membros da família Bacillus cereus.
TABELA 30. Proteína (Promotor SEQ ID NO.) Expressão relativa (Aumento de dobra no mRNA) CotO (SEQ ID NO: 186) 79,21 Ramnose (SEQ ID NO: 185) 75,69 BclC (SEQ ID NO: 139) 14,44 Sigma K (SEQ ID NO: 187) 64 Promotor 1 de US Glicosil transferase adjacente a 72,25 BclA (SEQ ID NO: 189) Promotor 2 de DS Glicosil transferase adjacente a 73,96 BclA (SEQ ID NO: 190) BclA (SEQ ID NO: 175) 77,44 ExsY (SEQ ID NO: 180) 32,49
YjcA (SEQ ID NO: 182) 64 YjcB (SEQ ID NO: 183) 70,56 BxpB/ExsFA (SEQ ID NO: 184) 30,25 InhA (SEQ ID NO: 188) 34,25 EXEMPLO 8: PREPARAÇÃO DE FRAGMENTOS DE
EXOSPORIUM A PARTIR DE MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS RECOMBINANTE COMPREENDENDO UM KNOCKOUT DO GENE COTE.
[1754] O plasmídeo pUCpE foi construído que continha o esqueleto pUC19, que é capaz de se replicar em E. coli, bem como a origem da cassete de resistência à eritromicina de replicação de pE194. Esse construto é capaz de se replicar em E. coli e Bacillus spp. Uma região de DNA de 1 kb correspondente à região a montante do gene CotE e uma região de 1 kb correspondente à região a jusante do gene CotE foram amplificadas por PCR a partir de Bacillus anthracis ΔSterne. As duas regiões de 1 kb foram então unidas em conjunto usando união por extensão sobreposta através de saliências homólogas de 15 pb que correspondiam aos amplicões de PCR opostos. Este fragmento de 2 kb foi digerido com XhoI (em iniciadores externos) e ligado ao local SalI de pUCpE. Esse construto plasmídico foi verificado por digestão e sequenciação de DNA. Um gene de resistência a ômega-canamicina Gram- positivo foi digerido com BamHI e colocado entre as duas regiões de 1 kb. O construto final foi novamente verificado por PCR e sequenciado, e o plasmídeo final foi introduzido em Bacillus anthracis Sterne. Os clones corretos foram pesquisados procurando resistência à eritromicina e resistência à canamicina.
[1755] Os clones foram passados sob alta temperatura (40 °C) no caldo de infusão cerebral do coração na presença de canamicina (25 μg/ml) e foram rotineiramente atingidos para isolamento em placas de ágar LB contendo canamicina e cultivadas a 30 °C. Colônias individuais foram picadas em placas de ágar LB contendo eritromicina 5 μg/ml e cultivadas a 30 °C. Os clones que mantiveram a resistência à canamicina, mas perderam a resistência à eritromicina (significando perda do plasmídeo, mas recombinação e remoção do gene CotE) foram crescidos em caldo de infusão de coração cerebral mais canamicina, e o DNA cromossômico foi isolado usando um kit de isolamento de DNA cromossômico Qiagen. A deleção adequada do gene CotE foi determinada por amplificação por PCR da região do gene CotE e perda de CotE, e ganho do cassete de resistência à canamicina.
[1756] Foi gerado um construto (pHP13-AcpC-eGFP) que codificava a proteína do exosporium AcpC (fosfatase ácida) fundida na estrutura à proteína repórter fluorescente eGFP (proteína verde fluorescente aprimorada). O construto pHP13-AcpC-eGFP incluiu o promotor AcpC nativo, o local de ligação ribossômica e a sequência de codificação para AcpC (de B. anthracis tern Sterne), fundido na estrutura a eGFP (de pGFPuv). Esse construto foi gerado por amplificação por PCR dos genes individuais de AcpC e eGFP com iniciadores correspondentes que continham uma região de sobreposição de 15 pb correspondente aos amplicons alternativos. Os dois amplicons de PCR foram então purificados e combinados em uma segunda reação de PCR usando iniciadores externos que continham locais XhoI. Os dois amplicons se preparam com suas extremidades compatíveis e criam amplicons de PCR de fusão. Os amplicons de PCR de fusão foram purificados e digeridos com XhoI por 1 hora a 37 °C. O produto de PCR emendado foi clonado no local SalI de pHP13, e os clones corretos foram verificados em sequência e transformados em SCS110 E. coli. O DNA do plasmídeo foi posteriormente isolado da E. coli e introduzido em B. anthracis Sterne CotE :: Kan, gerado como descrito acima, que foi cultivado em caldo de infusão de coração cerebral contendo 10 μg/ml de cloranfenicol durante a noite a 30 °C. Um mililitro desta cultura foi inoculado em caldo nutritivo (50 ml) em um balão defletor e cultivado a 30 °C por 3 dias. Os esporos foram coletados por centrifugação a 10.000 X g por 5 minutos e o sobrenadante (contendo os fragmentos de exosporium quebrados) foi filtrado através de um filtro de membrana de 100.000 Da para obter fragmentos de exosporium purificados contendo as proteínas de fusão.
[1757] Uma micrografia eletrônica de transmissão mostrando os esporos de knockout CotE é fornecida na Figura 3. As setas fechadas indicam fragmentos de exosporium que foram separados dos esporos e a seta aberta indica um esporo do qual o exosporium foi removido.
[1758] A purificação dos fragmentos de exosporium foi realizada da seguinte forma: Os esporos de CotE :: kan foram cultivados em caldo de infusão de coração cerebral durante a noite a 30 °C e esfregados em placas de ágar nutritivo e crescidos a 30 °C por 3 dias. Após 3 dias, os esporos foram coletados esfregando as placas com cotonetes umedecidos com PBS e ressuspensos em 1 ml de PBS em um tubo de microcentrífuga. Os esporos foram separados da cultura por centrifugação e o sobrenadante contendo os fragmentos de exosporium foi filtrado através de um filtro de 0,22 μM para remover quaisquer esporos residuais. O filtrado foi então filtrado através de um filtro de 100 kDa para coletar fragmentos de exosporium, mas permitir que proteínas livres passassem através do filtro. O filtro de 100 kDa foi lavado e os fragmentos de exosporium coletados fervidos em tampão SDS por 5 minutos e separados por eletroforese em SDS-PAGE. A Figura 4 fornece uma fotografia de um gel SDS-PAGE mostrando os fragmentos de exosporium purificados (faixa 2) e um padrão marcador de proteína (faixa 1). Os fragmentos de exosporium mostrados na pista 2 representam as proteínas individuais que constituem os fragmentos de exosporium. Apenas um subconjunto de bandas que normalmente seria visto em toda a preparação de SDS-PAGE de esporos é aparente.
[1759] Dez microlitros da preparação do fragmento de exosporium contendo a proteína de fusão AcpC-eGFP foram testados quanto à atividade em um ensaio de fosfatase contra pNPP (polifosfato de p-nitrofenil). A atividade da fosfatase ácida foi detectada por espectrofotometria com base na liberação de p-nitrofenol do fosfato através da atividade da fosfatase. Resumidamente, 1 ml de pNPP 10 mM em tampão fosfato a pH 6,0 foi incubado com fragmentos de exosporium em um tubo de microcentrífuga de 1 ml e deixado incubar a 37 °C por 10 minutos. Após 10 minutos, o tubo foi centrifugado por 1 minuto para remover o excesso de esporos, e o sobrenadante foi lido em um espectrofotômetro a 420 nm para obter p-nitrofenol livre. Verificou-se que os fragmentos de exosporium purificados foram capazes de liberar efetivamente os grupos fosfato de pNPP, demonstrando que o AcpC estava presente nos fragmentos de exosporium. Os resultados deste ensaio são mostrados na Figura
5. Na Figura 5, "Esporos de controle de CotE" refere-se apenas aos esporos de knockout do CotE (que não expressam a proteína de fusão AcpC-eGFP), "CotE Acp-eGFP" refere-se aos esporos de knockout do CotE que expressam a proteína de fusão AcpC-eGFP, e "Fragmentos de CotE AcpC-eGFP" refere-se aos fragmentos de exosporium obtidos como descrito acima a partir dos esporos de knockout de CotE que expressam a proteína de fusão AcpC-eGFP.
[1760] Esses resultados demonstram que mutações que perturbam o exosporium, como uma mutação knock-out no gene CotE, podem ser usadas para gerar fragmentos de exosporium substancialmente livres de esporos e demonstram que esses fragmentos de exosporium contêm proteínas de fusão que são alvejadas ao exosporium. EXEMPLO 9: GERAÇÃO DE MEMBROS DA FAMÍLIA
BACILLUS CEREUS RECOMBINANTE EXIBINDO OVALBUMINA OU O ANTÍGENO PROTETOR DE BACILLUS ANTHRACIS.
[1761] O gene da ovalbumina de Gallus gallus do clone OGa28271C de GenScript ORF e o gene do antígeno protetor de Bacillus anthracis (pagA) foram amplificados via reação em cadeia da polimerase (PCR) usando os iniciadores mostrados abaixo na Tabela 31. As sequências de aminoácidos codificadas pelo gene da ovalbumina e pelos genes pagA são fornecidas na Tabela 32 abaixo. TABELA 31. SEQUÊNCIAS DE INICIADORES. OvaL PagA Direta SEQ ID NO: 362 SEQ ID NO: 364 Reversa SEQ ID NO: 363 SEQ ID NO: 365 TABELA 32. SEQUÊNCIAS DE OVALBUMINA E PAGA Proteína SEQ ID NO. Ovalbumina, Gallus gallus 366 pagA, Bacillus anthracis 367
[1762] Os fragmentos de PCR resultantes foram clonados em um dos três plasmídeos de expressão (pSUPER-BclA-FL, pSUPER-BclA 20– 35 ou pSUPER-AcpC) usando a técnica de splicing by overlapping extension (SOE). O plasmídeo pSUPER-BclA-FL foi gerado através da fusão de um fragmento PCR que continha o promotor BclA (SEQ ID NO: 149), códon de início e sequência de codificação para BclA de comprimento total (FL) fundido na estrutura no pSUPER plasmídeo. O plasmídeo pSUPER-BclA-20-35 foi gerado através da fusão de um fragmento de PCR que continha o promotor BclA (SEQ ID NO: 149), cod de iniciao, e uma sequcia que codifica para os aminoidos 20- 35 de BclA (aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1) fundidos na estrutura no plasmídeo pSUPER. O plasmídeo pSUPER-AcpC foi gerado através da fusão de um fragmento de PCR com o promotor AcpC nativo (SEQ ID NO: 141), local de ligação ribossômica e sequência de codificação para AcpC (de B. thuringiensis BT013A; SEQ ID NO: 120), fundido na estrutura no plasmídeo pSUPER. O plasmídeo foi gerado por meio de pSUPER fusão do plasmídeo pUC57 (que contém uma cassete de resistência à ampicilina) com o plasmídeo de Bacillus pBC16-1 (contendo uma resistência à tetraciclina). Este plasmídeo de 5,5 kpb pode replicar-se em E. coli e Bacillus spp.
[1763] O construto pSUPER-BclA-FL-OVAL gerado usando esses métodos codifica uma proteína de fusão que compreende BclA e ovalbumina de comprimento total, e o pSUPER-BclA-FL-PAG codifica uma proteína de fusão que compreende BclA de comprimento total e o antígeno protetor de B. anthracis. Esses construtos foram transformados e propagados em cepas de E. coli. As sequências dos plasmídeos foram verificadas por sequenciação de DNA.
[1764] A fim de remover as porções derivadas de E. coli dos plasmídeos pSUPER e criar plasmídeos menores para expressão em Bacillus, os construtos pSUPER verificados por sequência foram amplificados com iniciadores que amplificam o segmento derivado de Bacillus da estrutura principal do plasmídeo. Os produtos de PCR resultantes foram auto-ligado para gerar os plasmídeos PBC (pBC-BclA-FL-OVAL plasmídeo e pBC-BclA-FL-PAG)
que foram usados para transformar várias cepas de Bacillus no Exemplo 10 abaixo. EXEMPLO 10: PREPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE FRAGMENTOS DE EXOSPORIUM.
[1765] Mutantes Knockout (Ko): Para produzir cepas mutantes exsY e cotE knockout (KO) de Bacillus thuringiensis BT013A, foi construído o vetor de transporte e integração do plasmídeo pKOKI que continha o esqueleto pUC57, capaz de se replicar em E. coli, como a origem do cassete de resistência à replicação de eritromicina de pE194. Esse construto é capaz de se replicar em E. coli e Bacillus spp. Uma região de DNA de 1 kb que correspondia à região a montante do gene cotE e uma região de 1 kb que correspondia à região a jusante do gene cotE foram amplificadas por PCR a partir de Bacillus thuringiensis BT013A. Foi feito um segundo construto que continha a região de DNA de 1 kb que correspondia à região a montante do gene exsY e uma região de 1 kb que correspondia à região a jusante do gene exsY, ambas amplificadas por PCR a partir de Bacillus thuringiensis BT013A. Para cada construto, as duas regiões de 1 kb foram então unidas usando recombinação homóloga com regiões sobrepostas com o plasmídeo pKOKI. Os construtos plasmídicos foram verificados por digestão e sequenciação de DNA. Os clones foram rastreados procurando resistência à eritromicina.
[1766] Os clones foram passados sob alta temperatura (40 °C) em caldo de infusão de coração cerebral (BHI). Colônias individuais foram picadas em placas de ágar LB contendo eritromicina 5μg/ml, cultivadas a 30 °C, e rastreadas quanto à presença do plasmídeo pKOKI como um plasmídeo livre por PCR de colônia. As colônias que tinham um evento de integração foi prosseguida através passaging a tela para colónias únicas que perderam resistência à eritromicina (significando a perda do plasmídeo, mas a recombinação e a remoção do gene exsY ou Cote). As deleções verificadas foram confirmadas por amplificação por PCR e sequenciamento da região-alvo do cromossomo. O plasmídeo pBC-BclA-FL-OVAL foi transformado no mutante knockout exsY e o plasmídeo pBC-BclA-FL-PAG foi transformado no mutante cotE KO. Os plasmídeos pBC-BclA-FL-OVAL e pBC-BclA-FL-PAG estão descritos acima no Exemplo 9.
[1767] Criação de fragmentos de exosporium: Para cada um dos dois mutantes KO, as culturas durante a noite foram cultivadas em meio BHI a 30 °C, 300 rpm, em frascos defletores com seleção de antibióticos. Um mililitro desta cultura durante a noite foi inoculado em um meio à base de extrato de levedura (50 ml) em um frasco defletor e cultivado a 30 °C por 3 dias. Uma alíquota de esporos foi removida, 1% de Tween foi adicionado e os esporos foram agitados por vórtice por um minuto. Os esporos foram coletados por centrifugação a 10.000 X g por 5 minutos, e o sobrenadante contendo os fragmentos de exosporium foi filtrado através de um filtro de 0,22 μM para remover quaisquer esporos residuais. O sobrenadante (contendo os fragmentos de exosporium) foi filtrada através de um filtro de membrana 100.000 Da a obter fragmentos de exosporium purificada contendo as proteínas de fusão. As proteínas de menor peso molecular foram removidas passando pelo filtro de 100 kDa. Nenhum esporo foi encontrado no filtrado ou retentado do sobrenadante.
[1768] Micrografias eletrônicas de transmissão são fornecidas na Figura 6, mostrando esporos intactos de Bacillus thuringiensis BT013A (painel A) cercados por exosporium anexado, esporos do mutante eliminador de ExsY (painel B) do Bacillus thuringiensis BT013A (painel B) do qual o exosporium se desprendeu e esporos de o mutante eliminador de Bacillus thuringiensis BT013A CotE (painel C) do qual o exosporium se destacou. A seta no painel A da Figura 6 indica as camadas de exosporium de esporos intactos de BT013A, enquanto as setas nos painéis B e C da Figura 6 indicam exosporium que foi destacado dos esporos nos mutantes CotE e ExsY. As imagens foram tiradas em um microscópio eletrônico de transmissão JEOL JEM 1400. Não foram observados fragmentos de exosporium visíveis quando os esporos de controle que expressam uma proteína de fusão (Bacillus thuringiensis BT013A sem o knockout CotE, expressando a proteína de fusão BclA-FL-OVAL, dados não mostrados) foram submetidos aos mesmos procedimentos de centrifugação e filtragem descritos acima.
[1769] Presença de antígeno de proteção BclA-FL- OVAL ou BclA-FL-PAG em fragmentos de exosporium coletados dos mutantes de knockout CotE e ExsY: Fragmentos de exosporium foram criados e purificados como descrito acima a partir de esporos que continham o plasmídeo pBC-BclA-FL-OVAL ou plasmídeo pBC-BclA-FL-PAG. Esses esporos criam um exosporium que contém proteínas de fusão compreendendo BclA de comprimento total e ovalbumina ou antígeno protetor A. Os fragmentos de exosporium contendo essas construções foram criados a partir dos esporos mutantes knockout de cotE e dos esporos mutantes knockout exsY. A concentração de ovalbumina ou proteína protetora do antígeno A foi determinada por transferência de pontos. A Tabela 33 abaixo resume os resultados de transferência de pontos em comparação com a proteína purificada. Resumidamente, uma fração enriquecida de fragmento de exosporium gerada como descrito acima, caldo de células inteiras ou ovalbumina purificada ou antígeno protetor foi transferida para nitrocelulose e, em seguida, sondada com anticorpos policlonais de coelho disponíveis comercialmente contra a ovalbumina completa ou o antígeno protetor Bacillus anthracis. O caldo de células inteiras foi retirado das culturas durante a noite como descrito acima e não foi submetido a nenhuma etapa de vórtice, filtração ou centrifugação. As transferências foram então desenvolvidas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano silvestre (HRP). A ovalbumina e os anticorpos antígenos protetores foram verificados por Western blot quanto ao tamanho e especificidade. As transferências Western foram realizadas utilizando ovalbumina purificada e proteínas antigênicas protetoras. A ovalbumina e os anticorpos antígenos protetores reconheceram bandas do tamanho correto e não reagiram de maneira cruzada com caldo de células inteiras não transformadas de Bacillus thuringiensis BT013A.
[1770] Os resultados de manchas são mostrados abaixo na Tabela 33. Os resultados mostram que a proteína de interesse (OVAL ou PAG) estava presente nas frações enriquecidas em caldo de células inteiras e em fragmentos de exosporium. A maior parte da proteína de interesse foi retida nas frações enriquecidas com fragmentos de exosporium, demonstrando que as proteínas de interesse estavam presentes nos fragmentos de exosporium.
TABELA 33. EXPRESSÃO DE PAG E OVAL DETECTADA
POR ANTICORPOS POLICLONAIS Hospedeiro Construto Fração coletada Proteína detectada em relação à curva padrão da proteína purificada sobre o fundo exsY KO BclA-FL- Enriquecida com Aumento de 1,66 vez OVAL fragmentos de exosporium exsY KO BclA-FL- Caldo de Células Aumento de 1,85 vez OVAL Inteiras cotE KO BclA-FL- Enriquecida com Aumento de 1,12 vez PAG fragmentos de exosporium cotE KO BclA-FL- Caldo de Células Aumento de 1,03 vez PAG Inteiras EXEMPLO 11: PRESENÇA DE BCLA 20-35-
ENDOGLUCANASE EM FRAGMENTOS DE EXOSPORIUM RECOLHIDOS A PARTIR DO KNOCKOUT DE COTE E EXSY E MUTANTES NEGATIVOS DOMINANTES EM COTO.
[1771] Para fornecer uma demonstração adicional de que fragmentos de exosporium contendo proteínas de fusão podem ser gerados usando as cepas de knockout CotE e ExsY, e para demonstrar que os fragmentos de exosporium podem ser gerados usando cepas negativas dominantes em CotO, foram gerados fragmentos de PCR que continham o promotor BclA (SEQ ID NO: 149), codão de início e aminoácidos 20–35 do BclA fundidos na estrutura da endoglucanase de Bacillus subtilis 168 (o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 334, diretamente ligado à β-1,4-endoglucanase da SEQ ID NO : 293). Esses fragmentos de PCR foram digeridos com XhoI e ligados ao local SalI do plasmídeo pSUPER para gerar o plasmídeo pSUPER-BclA 20-35- endoglucanase.
[1772] Os mutantes de knockout CotE e ExsY foram gerados como descrito acima no Exemplo 10.
[1773] Mutantes negativos dominantes: Para criar mutantes negativos dominantes, a amplificação por PCR foi realizada na metade do terminal N e na metade do terminal C de CotO (SEQ ID NO: 199), contendo os aminoácidos 1–81 e 81–199, respectivamente. Estes fragmentos foram clonados no vetor de traansporte pHP13 E coli/Bacillus usando recombinação homóloga. Os clones corretos foram verificados pelo sequenciamento de Sanger. Cada um dos dois mutantes negativos dominantes em CotO foi introduzido no Bacillus thuringiensis BT013A.
[1774] Presença da endoglucanase BclA 20-35 na coleção de fragmentos de exosporium dos mutantes negativos dominantes em CotE e Knockout ExsY e CotO: Os fragmentos de exosporium foram criados e purificados como descrito no Exemplo 10 a partir de esporos que continham o plasmídeo pSUPER BclA 20-35-Endo. Esses esporos criam um exosporium que exibe proteínas de fusão compreendendo BclA de comprimento total ligado à endoglucanase. Os fragmentos de exosporium contendo esse construto foram criados a partir dos esporos mutantes de knockout cotE, esporos de knockout exsY, esporos mutantes negativos dominantes de N-terminal em CotO ou esporos mutantes negativos dominantes de C-terminal em CotO. Em cada uma dessas experiências, a quantidade de atividade da endoglucanase nos fragmentos de exosporium foi quantificada como uma porcentagem dos níveis totais de enzimas. Esses resultados foram comparados com os resultados gerados usando Bacillus thuringiensis BT013A de tipo selvagem que não continha nenhuma mutação, mas continha o plasmídeo pSUPER BclA 20-35- Endo. Os resultados são mostrados na Tabela 34 abaixo.
[1775] Efeitos dos fragmentos de exosporium no crescimento das plantas: Esses fragmentos de exosporium foram entregues como tratamento de sementes em sementes de soja (como descrito no Exemplo 5 acima). Um controle do tipo selvagem (B. thuringiensis BT013A que expressa a construto BclA 20-35 Endo) também foi revestido em sementes de soja. Para cada experimento, 1 μl de fragmentos de exosporium de cada construto, ou uma diluição de 1: 2, 1: 4 ou 1: 8 dos fragmentos foi aplicada a cada semente. Os resultados são mostrados na Tabela 34 abaixo. TABELA 34: ATIVIDADE DA ENZIMA DO FRAGMENTO
DE EXOSPORIUM E RESPOSTA AO CRESCIMENTO DA PLANTA
[1776] Estes resultados demonstram que as mutações que rompem o exosporium, tal como uma mutação knockout na Cote ou gene exsY, ou uma mutação dominante negativa na proteína Coto, pode ser utilizada para gerar fragmentos de exosporium que são substancialmente livres de esporos, e demonstra que esses fragmentos de exosporium contêm proteínas de fusão alvejadas ao exosporium. Havia uma pequena quantidade de atividade endoglucanase de fundo na preparação do fragmento de exosporium da cepa BT013 sem mutações e expressando o construto BclA 20-25 Endo (BT013A BclA
20-35 Endo). Isso foi inesperado e pode representar um baixo nível de exosporium instável que está sendo liberado dos esporos e capturado durante o processo de coleta de fragmentos de exosporium. As cepas CotE e ExsY KO continham a maior quantidade de enzima na fração do fragmento de exosporium. Os mutantes negativos dominantes do CotO que expressam uma proteína de fusão também têm um nível elevado de enzima na fração do fragmento de exosporium.
[1777] Os fragmentos de exosporium dos mutantes CotE e ExsY (que não expressam BclA 20-35 Endo) aplicados diretamente às plantas tiveram um efeito negativo no crescimento e foram removidos deste experimento. Quando os fragmentos de exosporium de BT013A BclA 20-35 Endo foram aplicados à soja, houve um fenótipo de crescimento negativo. Quando fragmentos de exosporium dos mutantes CotE ou ExsY que expressam a proteína de fusão BclA 20-35 Endo foram adicionados à soja, ocorreu um aumento substancial na taxa de crescimento (+ 28,3% e + 14,8% sobre os fragmentos BT013A BclA 20-35 Endo). Os fragmentos de exosporium mutantes CotE ainda estavam ativos na diluição de 1: 4, mas os fragmentos de exosporium ExsY não estavam mais dando um benefício de crescimento para a soja nessa diluição. Os mutantes negativos dominantes do CotO que expressam a proteína de fusão BclA 20-35 Endo deram um pequeno aumento no crescimento da soja em comparação com os fragmentos do BT013A BclA 20-35 Endo, resultando em aumentos de + 6,5% e + 2,7% no crescimento, respectivamente. EXEMPLO 12: ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE CEPAS BACTERIANAS PROMOTORAS DE CRESCIMENTO DE PLANTAS.
[1778] Amostras de solo das rizosferas das batatas mais saudáveis e resistentes (Solanum tuberosum), abóbora amarela (Cucurbita pepo), tomate (Solanum lycopersicum) e feijão (Phaseolus coccineus) foram colhidas, diluídas em água estéril e espalhadas em nutrientes placas de ágar. Isolados bacterianos que demonstraram altas taxas de crescimento e puderam ser passados e propagados foram selecionados para estudos posteriores. As cepas selecionadas foram cultivadas em meio mínimo (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl 0,50 g, MgSO4 7H2O 0,15 g, CaCl2 2H2O 0,013 g e glicose 1 g, por l de peso seco). Culturas durante a noite (30 °C) de cepas selecionadas foram centrifugadas, decantadas e ressuspensas em uma quantidade igual de água destilada.
Foram plantadas dez sementes de alface de manteiga por tratamento, a uma profundidade de 1 cm em solo argiloso (Columbia, MO) que foi peneirado para remover grandes detritos.
As sementes foram inoculadas a plantação em vasos com 4 cm de altura, com 0,5 ul de bactérias ressuspensas em água misturados em 10 ml de H2O.
Dez ml de H2O foi suficiente para entregar as bactérias na 3 pol3 (49,16 cm3) do solo, bem como saturar o solo para a germinação adequada de sementes.
As plantas foram cultivadas a temperaturas entre 65 e 75 °F (18 a 24 °C) com 11 horas de luz/dia e 5 ml de rega a cada 3 dias.
Após uma semana, foram coletadas as alturas e os diâmetros das folhas, bem como a saúde geral das plantas.
A triagem inicial dos isolados da rizosfera resultou na obtenção de mais de 200 espécies distintas de bactérias e fungos da rizosfera das quatro plantas.
Algumas das espécies bacterianas estão descritas na Tabela 35 abaixo.
As cepas identificadas são indicadas pelas suas identificações bacterianas adequadas.
Outras cepas são indicadas por seu número de identificação desconhecido.
Inoculantes com resultados próximos ao controle (+/– 2%) não foram incluídos na tabela.
TABELA 35. Inoculante bacteriano Altura Média (cm) Comparação SEM Não inoculado 1,8 Controle 0,07 Paracoccus kondratiavae NC35 2 111,1% 0,05 B. aryabhattai CAP53 3,65 202,8% 0,45 B. flexus BT054 2,45 136,1% 0,11 Cepa Bacillus mycoides BT155 2,17 120,4% 0,21 B. aryabhattai CAP56 2,1 116,7% 0,20 B. nealsonii BOBA57 2,8 155,6% 0,03 E. cloacae CAP12 2,4 133,3% 0,41 Desconhecido 8 1,77 77,8% 0,65 Desconhecido 122 1,9 105,6% 0,11 Desconhecido 15 1,4 77,8% 0,41 Desconhecido 39 1,8 100,0% 0,20 Desconhecido 401 2 111,1% 0,21 Desconhecido 402 1,53 85,2% 0,27
Desconhecido 41 1,45 80,6% 0,31 Desconhecido 42 1,4 77,8% 0,15 Desconhecido 44 2,2 133,3% 0,08 Desconhecido 51 1,83 102,9% 0,21
[1779] As cepas bacterianas que produziram o maior efeito sobre a saúde geral das plantas e a altura das plantas no teste inicial de alface foram submetidas a uma identificação mais aprofundada. As cepas bacterianas foram cultivadas durante a noite em caldo Luria Bertani a 37C, e as culturas durante a noite foram centrifugadas em uma centrífuga. O meio foi decantado e o sedimento bacteriano restante foi submetido ao isolamento de DNA cromossômico usando o kit de isolamento de DNA cromossômico bacteriano Qiagen. O DNA cromossômico foi submetido à amplificação por PCR das regiões codificadoras do rRNA 16S usando os iniciadores E338F 5'-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AGT-3 '(SEQ ID NO: 368), E1099R A 5'-GGG TTG CGC TCG TTG C- 3 '(SEQ ID NO: 369) e E1099R B 5'-GGG TTG CGC TCG TTA C-3' (SEQ ID NO: 370). Os amplicons de PCR foram purificados usando um kit de purificação Promega PCR, e os amplicons resultantes foram diluídos e enviados para o DNA Core da Universidade de Missouri para sequenciamento de DNA. As sequências de DNA foram comparadas ao banco de dados NCBI BLAST de isolados bacterianos, e o gênero e a espécie foram identificados por comparação direta com cepas conhecidas. As principais espécies identificadas estão indicadas na Tabela 35 acima. Em muitos casos, as sequências de DNA de 16S rRNA foram capazes de delinear apenas o gênero da cepa bacteriana selecionada. Nos casos em que a identificação direta não foi realizada, análises bioquímicas adicionais, usando métodos padrão no campo, foram realizadas para diferenciar as cepas nas espécies e nos níveis de cepas, e estão listadas na Tabela 36 abaixo.
TABELA 36. Teste P. kondratiavae NC35 B. aryabhattai CAP53 B. aryabhattai CAP56 B. nealsonii BOBA57 B. mycoides BT155 E. cloacae CAP12 B. flexus BT054 Urease – – - - - – + Catalase + + + + + + + Oxidase – + + + – - - Nitrato + + - + + - + Crescimento, 5% NaCl + - + + - + + Crescimento, 7,5% NaCl - – + + – + – Crescimento, 42 °C + + + + + + + Crescimento, 50 °C – – + + – + – Crescimento, pH 5 + – + + – + – Crescimento, pH 9 + + + + + + + Ácido, Celobiose + - + + + + – Ácido, lactose + – + + + – + Ácido, Amido – – – + – + - EXEMPLO 13: ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE
CEPAS BACTERIANAS PROMOTORAS DE CRESCIMENTO DE PLANTAS ADICIONAIS.
[1780] Amostras de solo de campos agrícolas próximos a Gas, Kansas foram coletadas, diluídas em água estéril e espalhadas em placas de ágar de nutrientes. Isolados bacterianos que demonstraram altas taxas de crescimento e puderam ser passados e propagados foram selecionados para estudos posteriores. As cepas selecionadas foram cultivadas em meio mínimo (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl 0,50 g, MgSO4 7H2O 0,15 g, CaCl2 2H2O 0,013 g e glicose 1 g, por l de peso seco). Culturas durante a noite (30 °C) de cepas selecionadas foram centrifugadas, decantadas e ressuspensas em uma quantidade igual de água destilada. As sementes de milho foram revestidas com polímero de semente comercial misturado apenas com água (1,6 µl por total de sementes) ou polímero de semente comercial contendo cepas bacterianas selecionadas (1,6 µl por total de sementes). As sementes revestidas foram plantadas em vasos de 3 polegadas (7,62 cm) de diâmetro a uma profundidade de 2,5 cm (1 polegada) em solo com argila (Columbia, MO) que foi peneirada para remover detritos grandes. As plantas foram cultivadas em temperaturas entre 18 e 24 °C (65 a 75 °F) com 11 horas de luz/dia e 50 ml de rega no plantio e a cada 3 dias. Após duas semanas, foram coletadas as alturas e os diâmetros das folhas, bem como a saúde geral das plantas. Para ensaios de germinação e determinação do comprimento da raiz de 3 dias, as sementes foram revestidas como indicado acima e dispersas uniformemente a 10 sementes por toalha de papel. As toalhas de papel foram umedecidas com 10 ml de água, enroladas, colocadas em um pequeno saco plástico e incubadas a 30 °C ou colocadas em um tapete de calor de germinação em 27 a 30 °C (80 a 85 °F). As medidas das raízes foram registradas após 3 dias. A triagem inicial dos isolados da rizosfera resultou na obtenção de mais de 100 espécies distintas de bactérias e fungos da rizosfera. Algumas das espécies bacterianas estão descritas na Tabela 37 abaixo. As cepas identificadas são indicadas pelas suas identificações bacterianas adequadas.
TABELA 37.
Altura Média Comprimento (2 semanas), Médio da raiz normalizada (3 dias), para controle normalizado de polímero para controle de Inoculante bacteriano (%) polímero (%) Controle de polímero 100 100 B. mycoides EE118 111,1 189,1 B. subtilis EE148 99,4 172,8 Alcaligenes faecalis EE107 111,5 129,2 B. mycoides EE141 109,2 143,5 B. mycoides BT46-3 105,6 141,3 Membro da família B. cereus EE128 105,6 - B. thuringiensis BT013A 101,8 103,8 Paenibacillus massiliensis BT23 104,2 139,4 Membro da família B. cereus EE349 105,2 – B. subtilis EE218 106,6 - B. megaterium EE281 107,8 –
[1781] As cepas bacterianas que produziram o maior efeito na saúde das plantas são descritas na Tabela 37 acima. As cepas bacterianas foram cultivadas durante a noite em caldo Luria Bertani a 37C, e as culturas durante a noite foram centrifugadas em uma centrífuga. O meio foi decantado e o sedimento bacteriano restante foi submetido ao isolamento de DNA cromossômico usando o kit de isolamento de DNA cromossômico bacteriano Qiagen. O DNA cromossômico foi submetido à amplificação por PCR das regiões codificadoras do rRNA 16S usando os iniciadores E338F 5'-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AGT-3 '(SEQ ID NO: 368), E1099R A 5'-GGG TTG CGC TCG TTG C- 3 '(SEQ ID NO: 369) e E1099R B 5'-GGG TTG CGC TCG TTA C-3' (SEQ ID NO: 370). Os amplicons de PCR foram purificados usando um kit de purificação Promega PCR, e os amplicons resultantes foram diluídos e enviados para o DNA Core da Universidade de Missouri para sequenciamento de DNA. As sequências de DNA foram comparadas ao banco de dados NCBI BLAST de isolados bacterianos, e o gênero e a espécie foram identificados por comparação direta com cepas conhecidas. As principais espécies identificadas estão indicadas na Tabela 37 acima. Em muitos casos, as sequências de DNA de 16S rRNA foram capazes de delinear apenas o gênero da cepa bacteriana selecionada. Nos casos em que uma identificação direta não foi realizada, análises bioquímicas adicionais, utilizando métodos padrão no campo, foram realizadas para diferenciar cepas nas espécies e níveis de cepa, e as cepas diferenciadas estão listadas na Tabela 38 abaixo. TABELA 38.
Alcaligenes faecalis EE107 Paenibacillus massiliensis Teste B. megaterium EE281 Membro da família B. B. mycoides BT46-3 B. mycoides EE118 B. mycoides EE141 B. subtilis EE148 B. subtilis EE218 B. cereus EE349 B. thuringiensis cereus EE128 Membro da da família BT013A Motilidade + + + + + BT23 + – + – – - Colônia – – – – – + + – + – + rizóide Catalase + + + + + + + + + + + Oxidase + – – – – – – + – – – Nitrato + + wk – – – + + + + + Crescimento, + wk – + + – + + - + - 5% NaCl Crescimento, wk - - + + - - - - - - 7,5% NaCl Crescimento, - + + + + + + + - + - 42 °C Crescimento, - - - - – - - - - - - 50 °C Crescimento, wk - + + + - wk + - + - pH 5 Crescimento, + + - + + - wk + + + - pH 9 Ácido, - - wk + - + + wk + - wk Celobiose Ácido, - + + + + - + + - + wk lactose Ácido, Amido - + - + + - + wk + + – wk = crescimento fraco ou baixo crescimento EXEMPLO 14: TESTE DE CEPAS BACTERIANAS PROMOTORAS DE CRESCIMENTO DE PLANTAS EM ALFAFA.
[1782] As cepas selecionadas foram cultivadas em meio mínimo (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl 0,50 g, MgSO4 7H2O 0,15 g, CaCl2 2H2O 0,013 g e glicose 1 g, por l de peso seco). As culturas durante a noite (30 °C) das cepas selecionadas foram centrifugadas, os meios decantados e as bactérias ressuspensas em uma quantidade igual de água destilada. Dez sementes de alfafa revestidas com ZEBA foram plantadas para cada tratamento a uma profundidade de 0,6 cm em solo argiloso (Columbia, MO) que foi peneirado para remover grandes detritos. O ZEBA é um polímero à base de amido de milho superabsorvente usado como revestimento de sementes de retenção de umidade. As sementes foram inoculadas a plantação, com 0,5 ul de bactérias ressuspensas em água misturados em 10 ml de H 2 O. Dez ml de H2O foi suficiente para entregar as bactérias na 3 pol3 (49,16 cm3) do solo, bem como saturar o solo para a germinação adequada de sementes. As plantas foram cultivadas a temperaturas entre 65 e 75 °F (18 a 24 °C) com 11 horas de luz/dia e 5 ml de rega a cada 3 dias. A alfafa foi autorizada a crescer por 1 wk para analisar a emergência e o crescimento inicial das plantas nas condições descritas. As cepas identificadas indicadas pelas respectivas identificações bacterianas e dados finais da altura estão listados na Tabela 39 abaixo. TABELA 39. Inoculante bacteriano Altura Média (cm) Comparação SEM Não inoculado 4,82 – 0,008 B. aryabhattai CAP56 4,85 101,20% 0,016 B. nealsonii BOBA57 4,86 101,70% 0,021 E. cloacae CAP12 5,6 116,23% 0,020 EXEMPLO 15: TESTE DE CEPAS BACTERIANAS PROMOTORAS DE CRESCIMENTO DE PLANTAS EM PEPINOS.
[1783] As cepas selecionadas foram cultivadas em meio mínimo (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl 0,50 g, MgSO4 7H2O 0,15 g, CaCl2 2H2O 0,013 g e glicose 1 g, por l de peso seco). As culturas durante a noite (30 °C) das cepas selecionadas foram centrifugadas, os meios decantados e ressuspensos em igual quantidade de água destilada. Foram plantadas dez sementes de pepino para cada tratamento, a uma profundidade de 1 cm, em solo argiloso (Columbia, MO), que foi peneirado para remover grandes detritos. As sementes foram inoculadas a plantação, com 0,5 ul de bactérias ressuspensas em água misturados em 10 ml de H 2 O. Dez ml de H2O foi suficiente para entregar as bactérias na 3 pol3 (49,16 cm3) do solo, bem como saturar o solo para a germinação adequada de sementes. As plantas foram cultivadas a temperaturas entre 65 e 75 °F (18 a 24 °C) com 11 horas de luz/dia e 5 ml de rega a cada 3 dias. Deixou-se o pepino crescer por 2 wks para analisar a emergência e o crescimento inicial das plantas nas condições descritas. As cepas identificadas indicadas pelas respectivas identificações bacterianas e dados finais da altura estão listados na Tabela 40 abaixo. TABELA 40. Inoculante Altura Média Comparação SEM bacteriano (cm) Não inoculado 11,23 – 0,067 B. aryabhattai CAP53 11,5 102,00% 0,023 B. aryabhattai CAP56 11,35 101,20% 0,035 B. nealsonii BOBA57 11,33 101,10% 0,014 EXEMPLO 16: TESTE DE CEPAS BACTERIANAS PROMOTORAS DE CRESCIMENTO DE PLANTAS EM ABÓBORA.
[1784] As cepas selecionadas foram cultivadas em meio mínimo (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl 0,50 g, MgSO4 7H2O 0,15 g, CaCl2 2H2O 0,013 g e glicose 1 g, por l de peso seco). Culturas durante a noite (30 °C) de cepas selecionadas foram centrifugadas, decantadas e ressuspensas em uma quantidade igual de água destilada. Dez sementes de abóbora amarela foram plantadas para cada tratamento a uma profundidade de 1 cm em solo argiloso (Columbia, MO) que foi peneirado para remover grandes detritos. As sementes foram inoculadas a plantação, com 0,5 ul de bactérias ressuspensas em água misturados em 10 ml de H 2 O. Dez ml de H2O foi suficiente para entregar as bactérias na 3 pol3 (49,16 cm3) do solo, bem como saturar o solo para a germinação adequada de sementes. As plantas foram cultivadas a temperaturas entre 65 e 75 °F (18 a 24 °C) com 11 horas de luz/dia e 5 ml de rega a cada 3 dias. A abóbora foi deixada crescer por 2 wks para analisar a emergência e o crescimento inicial das plantas nas condições descritas. As cepas identificadas indicadas por suas identificações bacterianas apropriadas,
dados finais de altura e diâmetro final das folhas (por extensão das duas folhas) estão listadas na Tabela 41 abaixo. TABELA 41. Inoculante Altura Média Compara SEM Diâmetro da Comparação bacteriano (cm) ção folha (cm) Não inoculado 10,16 – 0,028 5,08 – B. aryabhattai 11,75 115,60% 0,055 7,25 142,60% CAP53 B. flexus BT054 11,88 116,90% 0,017 6,36 125,20% Bacillus mycoides 11,92 117,20% 0,051 6,33 124,60% BT155 B. aryabhattai 11,95 117,60% 0,027 6,33 124,60% CAP56 B. nealsonii 11,89 117,00% 0,118 6,42 126,40% BOBA57 E. cloacae CAP12 11,42 112,30% 0,039 6,83 134,40% EXEMPLO 17: TESTE DE CEPAS BACTERIANAS PROMOTORAS DE CRESCIMENTO DE PLANTAS EM AZEVÉM.
[1785] As cepas selecionadas foram cultivadas em meio mínimo (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl 0,50 g, MgSO4 7H2O 0,15 g, CaCl2 2H2O 0,013 g e glicose 1 g, por l de peso seco). Culturas durante a noite (30 °C) de cepas selecionadas foram centrifugadas, decantadas e ressuspensas em uma quantidade igual de água destilada. Trinta sementes de azevém foram plantadas para cada tratamento a uma profundidade de 0,3 cm em solo argiloso (Columbia, MO) que foi peneirado para remover grandes detritos. As sementes foram inoculadas a plantação, com 0,5 ul de bactérias ressuspensas em água misturados em 10 ml de H 2 O. Dez ml de H2O foi suficiente para entregar as bactérias na 3 pol3 (49,16 cm3) do solo, bem como saturar o solo para a germinação adequada de sementes. As plantas foram cultivadas a temperaturas entre 65 e 75 °F (18 a 24 °C) com 11 horas de luz/dia e 5 ml de rega a cada 3 dias. Deixou-se o Ryegrass crescer por 1,5 wks para analisar a emergência e o crescimento inicial de plantas nas condições descritas. As cepas identificadas indicadas pelas respectivas identificações bacterianas e dados de altura estão listadas na Tabela 42 abaixo. TABELA 42.
Inoculante bacteriano Altura Média (cm) Comparação SEM Não inoculado 1,61 – 0,023 B. aryabhattai CAP53 2,01 124,70% 0,012 B. flexus BT054 2,21 137,30% 0,034 Bacillus mycoides BT155 2,29 142,20% 0,049 B. aryabhattai CAP56 2,19 136,00% 0,009 B. nealsonii BOBA57 2,29 142,40% 0,045 E. cloacae CAP12 1,98 122,50% 0,015 EXEMPLO 18: TESTE DE CEPAS BACTERIANAS PROMOTORAS DE CRESCIMENTO DE PLANTAS EM MILHO.
[1786] As cepas selecionadas foram cultivadas em meio mínimo (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl 0,50 g, MgSO4 7H2O 0,15 g, CaCl2 2H2O 0,013 g e glicose 1 g, por l de peso seco). Culturas durante a noite (30 °C) de cepas selecionadas foram centrifugadas, decantadas e ressuspensas em uma quantidade igual de água destilada. Foram plantadas dez sementes de milho para cada tratamento, a uma profundidade de 2,5 cm, em solo argiloso (Columbia, MO), que foi peneirado para remover grandes detritos. As sementes foram inoculadas a plantação, com 0,5 ul de bactérias ressuspensas em água misturados em 10 ml de H 2 O. Dez ml de H2O foi suficiente para entregar as bactérias na 3 pol3 (49,16 cm3) do solo, bem como saturar o solo para a germinação adequada de sementes. As plantas foram cultivadas a temperaturas entre 65 e 75 °F (18 a 24 °C) com 11 horas de luz/dia e 5 ml de rega a cada 3 dias. Deixou-se crescer o milho por 2 wks para analisar a emergência e o crescimento inicial das plantas nas condições descritas. As cepas identificadas indicadas pelas respectivas identificações bacterianas e dados finais de altura estão listados na Tabela 43 abaixo. TABELA 43. Inoculante bacteriano Altura Média (cm) Comparação SEM Não inoculado 8,9 – 0,039 B. aryabhattai CAP53 11,01 123,60% 0,081 B. flexus BT054 9,96 112,00% 0,095 Cepa Bacillus mycoides BT155 9,6 107,90% 0,041 B. aryabhattai CAP56 9,54 107,10% 0,088 B. nealsonii BOBA57 9,23 103,70% 0,077
EXEMPLO 19: TESTE DE CEPAS BACTERIANAS PROMOTORAS DE CRESCIMENTO DE PLANTAS EM SOJA.
[1787] As cepas selecionadas foram cultivadas em meio mínimo (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl 0,50 g, MgSO4 7H2O 0,15 g, CaCl2 2H2O 0,013 g e glicose 1 g, por l de peso seco, ou para Bradyrhizobium ou Rhizobium em meios de levedura manitol). As culturas durante a noite (30 °C) das cepas selecionadas foram centrifugadas, os meios decantados e ressuspensos em igual quantidade de água destilada. Dez sementes de soja foram plantadas para cada tratamento a uma profundidade de 2,5 cm no solo argiloso (Columbia, MO), que foi peneirado para remover grandes detritos. As sementes foram inoculadas a plantação, com 0,5 ul de bactérias ressuspensas em água misturados em 10 ml de H 2 O. Ao testar duas cepas bacterianas, 0,5 ul de cada bactérias ressuspensas foram misturados em 10 ml de H 2 O. Dez ml de H2O foi suficiente para entregar as bactérias na 3 pol3 (49,16 cm3) do solo, bem como saturar o solo para a germinação adequada de sementes. As plantas foram cultivadas a temperaturas entre 65 e 75 °F (18 a 24 °C) com 11 horas de luz/dia e 5 ml de rega a cada 3 dias. A soja foi autorizada a crescer por 2 wks para analisar a emergência e o crescimento inicial das plantas nas condições descritas. As cepas identificadas indicadas pelas respectivas identificações bacterianas e dados finais da altura estão listados na Tabela 44 abaixo. A coinoculação de cepas de bactérias na presente invenção com membros do Bradyrhizobium sp. ou Rhizobium sp. levar a um aumento no crescimento das plantas em comparação com qualquer inoculante sozinho. TABELA 44. Inoculante bacteriano Altura Comparação SEM Média (cm) Não inoculado 13,94 – 0,089 B. aryabhattai CAP53 16,32 117,1% 0,146 B. flexus BT054 17,85 128,0% 0,177 Cepa Bacillus mycoides BT155 18,93 135,8% 0,117 B. aryabhattai CAP56 17,23 123,6% 0,133 B. aryabhattai CAP53 16,32 117,1% 0,077
B. aryabhattai CAP53 e Bradyrhizobium sp. 16,72 119,9% 0,182 B. aryabhattai CAP53 e Rhizobium sp. 17,32 124,2% 0,086 Bradyrhizobium sp. 14,25 102,2% [1 Rhizobium sp. 14,75 105,8% [1 EXEMPLO 20: MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS
CEREUS COM ATRIBUTOS QUE PROMOVEM O CRESCIMENTO DAS PLANTAS.
[1790] Bacillus mycoides cepa BT155, Bacillus mycoides cepa EE118, Bacillus mycoides cepa EE141, Bacillus mycoides cepa BT46-3, Bacillus cereus membro da família cepa EE349, Bacillus thuringiensis cepa BT013A, e Bacillus megaterium cepa EE281 foram cultivadas em meio Luria Bertani a 37 °C e as culturas durante a noite foram centrifugadas, os meios decantados e ressuspensos em igual quantidade de água destilada. Vinte sementes de milho foram plantadas para cada tratamento a uma profundidade de 2,5 cm em solo argiloso (Columbia, MO) que foi peneirado para remover detritos grandes. As sementes foram inoculadas a plantação, com 0,5 ul de bactérias ressuspensas em água misturados em 50 ml de H 2 O. Cinquenta ml de H2O foi suficiente para entregar as bactérias para o 29 pol 3 (475,22 centímetros) do solo, bem como saturar o solo para a germinação adequada de sementes. As plantas foram cultivadas em temperaturas entre 65-72 °F (18,3- 22,2 °C) com 13 horas de luz/dia e 5 ml de rega a cada 3 dias. As mudas foram deixadas crescer por 2 wks para analisar a emergência e o crescimento inicial das plantas nas condições descritas. As cepas identificadas indicadas pelas respectivas identificações bacterianas e dados finais da altura estão listados na Tabela 45 abaixo. TABELA 45. Inoculante bacteriano Altura Percentagem SEM Média, cm, Milho Controle H2O 11,41 100% 0,123 B. mycoides EE118 12,43 108,9% 0,207 B. mycoides EE141 12,84 112,5% 0,231
B. mycoides BT46-3 11,81 103,5% 0,089 Bacillus thuringiensis BT013A 12,05 105,6% 0,148 Membro da família Bacillus cereus EE128 13,12 114,9% 0,159 Bacillus mycoides BT155 12,85 112,6% 0,163 Bacillus megaterium EE281 11,99 105,1% 0,098
[1791] Todas as bactérias promotoras de crescimento de plantas testadas tiveram um efeito benéfico na altura do milho em duas wks nas condições descritas. A cepa EE128, membro da família Bacillus cereus, teve o maior efeito neste ensaio, dando um aumento superior a 14% na altura do milho. EXEMPLO 21: SELEÇÃO APRIMORADA DE MEMBROS
DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS PARA RASTREAR ATIVIDADES PROMOTORAS DE CRESCIMENTO DE PLANTAS E OUTRAS ATIVIDADES BENÉFICAS COMO HOSPEDEIRO DE EXPRESSÃO DE BEMD.
[1792] O sistema BEMD pode ser usado para exibir uma ampla gama de proteínas, peptídeos e enzimas usando qualquer uma das sequências de alvejamento descritas aqui para fornecer efeitos agrícolas benéficos. Efeitos benéficos adicionais podem ser obtidos selecionando um hospedeiro de expressão (um membro da família Bacillus cereus) com atributos benéficos inerentes. Muitas linhagens de membros da família Bacillus cereus têm benefícios que promovem o crescimento das plantas. Além disso, muitas cepas de membros da família Bacillus cereus fornecem efeitos protetores, por meio de atividades fungicidas, inseticidas, nematocidas ou outras atividades protetoras diretas. Ao usar tais cepas, como o hospedeiro de expressão do sistema BEMD, o produto final dos esporos teria uma combinação de benefícios positivos na agricultura.
[1793] A Tabela 46 abaixo fornece resultados para uma experiência em que uma proteína de fusão foi expressa em várias cepas de membros da família Bacillus cereus. Todas as cepas expressaram uma proteína de fusão compreendendo os aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1 e a fosfatase PhoA4 de Bacillus subtilis, uma enzima benéfica para aumentar a captação de fosfato no milho. O gene foi sintetizado, clonado no vetor pMK4 e introduzido em cada um dos Bacillus spp. indicado na Tabela 46 abaixo. As cepas foram submetidas à esporulação por incubação a 30 °C em placas de ágar nutriente contendo cloranfenicol 10 μg/ml por três dias. Os esporos foram recolhidos, lavados, e aplicado ao milho a plantação, a uma taxa de 1x10 5 UFC/ml em 50 ml de água por vaso 7,62 centímetro de diâmetro, com 5 mg de polifosfato por vaso. O milho foi cultivado em solo argiloso por duas wks. As plantas foram cultivadas sob luz ideal usando lâmpadas T5, 54 watts e expostas a 13 horas de luz por dia sob condições de temperatura controlada entre 15,5 e 25,5 °C. As plantas foram regadas até a saturação a cada três dias, durante um teste de duas wks. No final de duas wks, a altura de cada planta foi medida e as medidas foram normalizadas para controlar os esporos de Bacillus thuringiensis. A expressão dos aminoácidos 1–35 da SEQ ID NO: 1 - proteína de fusão fosfatase levou a um aumento na altura do milho em 2 wks, independentemente da cepa hospedeira de expressão selecionada. Conforme mostrado na Tabela 46, o uso de um membro da família Bacillus cereus que promove o crescimento da planta aumentou ainda mais a altura do milho.
TABELA 46. Espécie de Cepa Proteína de Fusão Altura em 2 Bacillus semanas, Normalizada B. thuringiensis Cepa BT013A Nenhuma 100% B. thuringiensis Cepa BT013A SEQ ID NO: 1- 117,4% Fosfatase B. mycoides Cepa EE141 Nenhuma 107,3% B. mycoides Cepa EE141 SEQ ID NO: 1- 123,3% Fosfatase Membro da família Cepa EE128 Nenhuma 124,1% B. cereus Membro da família Cepa EE128 SEQ ID NO: 1- 131,7% B. cereus Fosfatase B. mycoides Cepa BT155 Nenhuma 104,8% B. mycoides Cepa BT155 SEQ ID NO: 1- 121,9% Fosfatase
EXEMPLO 22: EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO
EM UMA CEPA DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS ENDOFÍTICA
[1794] Verificou-se que o membro da família Bacillus cereus EE349 tem a capacidade de crescer endofiticamente e ser capaz de servir como uma cepa hospedeira para o sistema BEMD. Para demonstrar a capacidade do membro da família Bacillus cereus EE349 de crescer endofiticamente e de servir como uma cepa hospedeira para o sistema BEMD, o membro da família Bacillus cereus EE349 foi transformado com o plasmídeo pSUPER-BclA 20-35-endoglucanase (descrito acima no Exemplo 4). As bactérias transformadas foram em seguida, induzidas a esporular limpando as bactérias em placas de ágar nutriente e incubação das placas a 30 °C durante 72 horas. Após 72 horas, os esporos bacterianos foram recolhidas a partir da placa, por raspagem em estéril tampão fosfato salino (PBS), e foram purificados por centrifugação de densidade de três vezes.
[1795] Estes esporos foram diluídos para uma concentração de 1x105 esporos/50 ml de água, e 50 ml de água foi então adicionada a sementes de milho híbrido comercial em solo de envasamento em plantio. As sementes de milho foram revestidas com fungicida e inoculante biológico. A variedade híbrida de milho foi o BECK 5475RR, que contém o gene de resistência ao glifosato ROUNDUP READY e o gene de resistência à seca AQUAMAX. As plantas foram cultivadas sob luz artificial durante 14 horas por dia e foi determinado o crescimento das plantas ao longo de um período de dez dias. As plantas foram regadas a cada três dias ao longo do experimento. Após dez dias, as plantas foram medidas quanto à altura e normalizadas em relação à altura de plantas de milho não tratadas. Os resultados dessas experiências são mostrados na Tabela 47 abaixo. TABELA 47. EFEITOS DE UM MEMBRO DA FAMÍLIA
BACILLUS CEREUS ENDOFÍTICA QUE EXPRESSA A PROTEÍNA DE FUSÃO BCLA 20-35-ENDOGLUCANASE NO CRESCIMENTO DE MUDAS DE MILHO Plasmídeo Cepa de expressão Crescimento de Milho (Normalizado) Nenhum (controle) Nenhuma 100%
Nenhuma Membro da família Bacillus 104,1% cereus EE349 pSUPER-BclA 20– Membro da família Bacillus 111,5% 35-endoglucanase cereus EE349
[1796] Como pode ser observado nos dados mostrados na Tabela 47, a expressão da pSUPER-BclA 20-35-endoglucanase na cepa endofítica membro da família Bacillus cereus EE349 resultou em aumento do crescimento de milho em comparação com plantas não tratadas ou plantas tratadas com a família Bacillus cereus membro EE349 sozinho.
[1797] O membro da família Bacillus cereus EE349, que expressa a endoglucanase BclA 20-35, foi isolado do interior das plantas de milho. As plantas com dez dias de idade foram extraídas do solo e lavadas para remover o excesso de detritos. As plantas foram então invertidas, expostas a alvejante a 5% por dez minutos, lavadas em água, expostas a peróxido de hidrogênio (10%) por dez minutos, lavadas novamente em água e os caules foram divididos com uma lâmina de barbear estéril. As metades divididas dos caules foram colocadas com a face voltada para baixo em placas de ágar nutritivo por duas horas. Após duas horas, os caules foram removidos e as placas de ágar incubadas a 30 °C por 48 horas. Após 48 horas, as placas foram examinadas quanto à morfologia das colônias e as colônias de membros da família Bacillus cereus encontradas internas à planta foram picadas com dentes em placas de ágar nutriente e ágar nutritivo mais tetraciclina (para selecionar bactérias que contêm o plasmídeo pSUPER-20–35 BclA-endoglucanase). O aumento resultante no número de colônias EE349 de membros da família Bacillus cereus é indicado na Tabela 48 abaixo. Estes resultados demonstram a capacidade do sistema BEMD de ser introduzido na planta alvo por expressão em uma cepa endofítica da família Bacillus cereus. TABELA 48. ENSAIO ENDOFÍTICO NO MEMBRO DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS EE349 Tratamento Bactérias Bactérias da Membros da Endofíticas família família Bacillus (Total) Bacillus cereus resistentes à tetraciclina cereus (todas as cepas) H2O (Controle) 156 31 0 Membro da família 221 64 21 Bacillus cereus EE349 transformado com pSUPER-20-35 BclA- endoglucanase
[1798] Os clones de Bacillus resistentes à tetraciclina foram cultivados durante a noite a 30 °C em caldo de infusão de coração cerebral mais tetraciclina e centrifugados a 10.000 X g por 5 minutos. O sobrenadante foi removido e o sedimento foi congelado durante a noite a –20 °C. O DNA cromossômico foi então extraído de cada clone e a presença do plasmídeo pSUPER-20–35 BclA-endoglucanase determinada por transformação do DNA cromossômico (contendo o plasmídeo) em células E. coli DH5α e plaqueamento em placas LB mais ampicilina. Os clones corretos foram submetidos a análise de sequência de DNA, que verificou que o membro da família Bacillus cereus EE349 era interno à planta (endofítica) e continha o plasmídeo.
[1799] Muitas bactérias endofíticas foram encontradas nas mudas de milho, com várias cepas e espécies diferentes dentro da família Bacillus cereus encontradas tanto nas plantas de controle quanto nas plantas tratadas com EE349. Os membros da família Bacillus cereus resistentes à tetraciclina (indicando a presença do plasmídeo pSUPER-20–35 BclA- endoglucanase) foram encontrados apenas nas mudas de milho tratadas e todos tinham a mesma morfologia de colônia do hospedeiro de expressão original, membros da família Bacillus cereus EE349. A presença do plasmídeo pSUPER 20-35 BclA-endoglucanase foi verificada por amplificação por PCR usando iniciadores exclusivos. EXEMPLO 23: ISOLAMENTO, IDENTIFICAÇÃO E
CARACTERIZAÇÃO DE CEPAS BACTERIANAS ENDOFÍTICAS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS
[1800] Além da cepa endofítica membro da família Bacillus cereus EE349 discutida acima no exemplo imediatamente anterior, vários outros membros da família Bacillus cereus que têm a capacidade de crescer endofiticamente também foram identificados: membro da família Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444, Bacillus thuringiensis EE319, Bacillus thuringiensis EE-B00184, Bacillus mycoides EE- B00363, Bacillus pseudomycoides EE-B00366 e membro da família Bacillus cereus EE-B00377.
[1801] Para obter esses membros adicionais da família Bacillus cereus, sementes de milho híbridas comerciais foram plantadas em vasos e deixadas crescer. As sementes de milho foram revestidas com fungicida e inoculante biológico. As plantas foram cultivadas sob luz artificial durante 14 horas por dia e o crescimento das plantas ao longo de um período de 14 dias foi determinado. As plantas foram regadas a cada três dias ao longo do experimento. Após 14 dias, as plantas foram extraídas do solo e lavadas para remover o excesso de detritos. As plantas foram então invertidas, expostas a alvejante a 5% por dez minutos, lavadas em água, expostas a peróxido de hidrogênio (10%) por dez minutos, lavadas novamente em água e os caules foram divididos com uma lâmina de barbear estéril. As metades divididas dos caules foram colocadas com a face voltada para baixo em placas de ágar nutritivo por duas horas. Após duas horas, os caules foram removidos e as placas de ágar incubadas a 30 °C por 48 horas. Após 48 horas, as placas foram examinadas quanto à morfologia das colônias e as colônias de membros da família Bacillus cereus encontradas internas à planta foram picadas no ágar nutriente. Estes foram então cultivados durante a noite a 30 °C em caldo de infusão cerebral do coração e centrifugados a 10.000 X g por 5 minutos. O sobrenadante foi removido e o sedimento foi congelado durante a noite a –20 °C. O DNA cromossômico foi então extraído de cada clone, a identidade de cada colônia foi verificada por PCR usando os iniciadores 16S rRNA e os amplicons foram enviados para sequenciamento e identificação do DNA. As sequências 16S rRNA para essas cepas são fornecidas acima na Tabela 18.
EXEMPLO 24: ISOLAMENTO, IDENTIFICAÇÃO E
CARACTERIZAÇÃO DE CEPAS BACTERIANAS ENDOFÍTICAS ADICIONAIS (MEMBROS DA FAMÍLIA NÃO BACILLUS CEREUS)
[1802] As cepas bacterianas endofíticas Bacillus megaterium EE385, Bacillus sp. EE387, Bacillus circulans EE388, Bacillus subtilis EE405, Lysinibacillus fusiformis EE442, Lysinibacillus spp. EE443 e Bacillus pumilus EE-B00143 foram isolados de mudas de milho. Mudas de milho com duas wks de idade foram primeiro esterilizadas. As plantas foram extraídas do solo e lavadas para remover o excesso de detritos. As plantas foram então invertidas, expostas a alvejante a 5% por dez minutos, lavadas em água, expostas a peróxido de hidrogênio (10%) por dez minutos e lavadas novamente em água. Os talos foram então divididos com uma lâmina de barbear estéril. As metades divididas dos caules foram colocadas com a face voltada para baixo em placas de ágar nutritivo por duas horas. Após duas horas, as hastes da planta foram removidas das placas e as placas foram então incubadas a 30 °C por 48 horas. Colônias de bacilos endofíticas foram selecionadas para análise posterior. Estas cepas foram crescidas em caldo de infusão de coração cerebral durante a noite a 30 °C, e as culturas submetidas à extração de DNA utilizando um Kit de DNA Cromossômico da Qiagen. O DNA foi amplificado por PCR para obter o gene 16S rRNA, que foi enviado para o seqüenciamento do DNA. As sequências resultantes que o BLAST pesquisou usando os bancos de dados NCBI para estabelecer a identidade das espécies de Bacilli. As sequências 16S rRNA são fornecidas acima na Tabela 21. EXEMPLO 25: DEMONSTRAÇÃO ADICIONAL DA
UTILIDADE DOS MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS ENDOFÍTICA PARA FORNECER PEPTÍDEOS, PROTEÍNAS E ENZIMAS ENDOFITICAMENTE ÀS PLANTAS
[1803] Verificou-se que Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus thuringiensis EE-B00184 e Bacillus cereus EE439 têm a capacidade de crescer endofiticamente (ver Exemplos 23 e 24 acima) e de ser capaz de servir como cepas hospedeiras para o sistema BEMD. Para demonstrar a capacidade desses bacilos de crescer endofiticamente e de servir como uma cepa hospedeira para o sistema BEMD, cada uma dessas cepas foi transformada com o plasmídeo pMK4-BclA 20-35-eGFP, que codifica uma proteína de fusão que compreende os aminoácidos 20- 35 de BclA (aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1) fundidos na estrutura ao eGFP. As bactérias transformadas foram em seguida, induzidas a esporular limpando as bactérias em placas de ágar nutriente e incubação das placas a 30°C durante 72 horas. Após 72 horas, os esporos bacterianos foram recolhidas a partir da placa, por raspagem em estéril tampão fosfato salino (PBS), e foram purificados por centrifugação de densidade de três vezes.
[1804] Estes esporos foram diluídos para uma concentração de 1x108/ml, e 1 μl de caldo de células inteiras foi então adicionado às sementes de milho híbridas comerciais no envasamento do solo no plantio. As sementes de milho foram revestidas com fungicida e inoculante biológico. A variedade de híbrido de milho foi BECK 6175YE, que contém o gene de resistência ao glifosato ROUNDUP READY e o gene de resistência à seca AQUAMAX. As plantas foram cultivadas sob luz artificial durante 14 horas por dia e foi determinado o crescimento das plantas ao longo de um período de dez dias. As plantas foram regadas a cada três dias ao longo do experimento.
[1805] Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus thuringiensis EE-B00184 e Bacillus cereus EE439 expressando a proteína de fusão BclA 20- 35-eGFP foram então isolados do interior das plantas de milho. As plantas com dez dias de idade foram extraídas do solo e lavadas para remover o excesso de detritos. As plantas foram então invertidas, lavadas em água, expostas a alvejante a 5% por dez minutos, lavadas em água, expostas a etanol a 70% por dez minutos, lavadas novamente em água e os caules foram divididos com uma lâmina de barbear estéril. As metades divididas dos caules foram colocadas com a face voltada para baixo em placas de ágar nutritivo por duas horas a 30 °C. Após duas horas, os caules foram removidos e as placas de ágar incubadas a 30 °C por 48 horas. Após 48 horas, as placas foram examinadas quanto à morfologia das colônias, e as colônias de Bacillus encontradas internas à planta foram selecionadas com palitos de dente em placas de ágar nutriente e ágar nutriente mais cloranfenicol (para selecionar bactérias que contêm o plasmídeo pMK4-20-35 BclA-eGFP). Os resultados são mostrados na Tabela 49 abaixo. Estes resultados demonstram a capacidade do sistema BEMD de ser introduzido na planta alvo por expressão em uma cepa endofítica da família Bacillus cereus.
[1806] A Figura 7 também demonstra a capacidade de Bacillus thuringiensis EE-B00184 de expressar eGFP nos esporos, como evidenciado por microscopia fluorescente. Na Figura 7, as setas indicam esporos únicos. Para gerar a imagem mostrada na Figura 7, Bacillus thuringiensis EE- B00184 foi transformado com pSUPER BclA 20-35 eGFP e deixado esporular como descrito acima. Os esporos foram sedimentados, lavados e submetidos a microscopia de fluorescência para demonstrar a superfície do esporo carregada de proteínas eGFP na Figura 7.
[1807] A Figura 8 demonstra a capacidade das colônias bacterianas isoladas das plantas em fluorescência verde, demonstrando que elas realmente entregam a proteína de interesse (aqui eGFP) dentro das plantas. A Figura 8 mostra a fluorescência de colônias de bactérias endofíticas isoladas de plantas de milho em placas, iluminadas com uma lâmpada filtrada por GFP. TABELA 49. ENTREGA ENDOFÍTICA DE PROTEÍNAS DE "CARGA" Cepa Endofítica "Carga" % de % de colônias de colônias de Bacillus + Bacillus + para para eGFP plasmídeo Bacillus Sim BclA 20–35 29,8% 29,8% thuringiensis eGFP EE417 Bacillus Sim BclA 20–35 38,9% 38,9% thuringiensis eGFP EE-B00184 Bacillus Sim BclA 20–35 23,9% 23,9% cereus EE439 eGFP
[1808] Para demonstrar ainda mais a capacidade da cepa endofítica Bacillus thuringiensis EE-B00184 de expressar proteínas na superfície dos esporos, a construto pSUPER BclA-20-35-Endo descrita acima no Exemplo 4 também foi introduzida no Bacillus thuringiensis EE-B00184. As células transformadas foram rastreadas por PCR e sequenciamento de Sanger. Os esporos foram produzidos pelo crescimento de uma cultura noturna em BHI mais seleção (cloranfenicol), e 500 μl de cada cultura foram esfregados em placas de ágar com caldo nutritivo e deixados incubar a 30 °C por 3 dias. Após 3 dias, os esporos foram removidos com swab em PBS, diluídos para uma concentração de 1x108/ml e centrifugados para recuperar os esporos. A medição enzimática dos esporos foi realizada como descrito acima no Exemplo 4 e calculada como mU/ml para cada construto. Os resultados são mostrados na Tabela 50 abaixo. TABELA 50. CEPA ENDOFÍTICA BACILLUS THURINGIENSIS EE-B00184 (EE-B00184) QUE EXPRESSA PROTEÍNAS DE
FUSÃO Parceiro de fusão da Cepa Endofítica do Atividade da proteína do exosporium Hospedeiro endoglucanase (mU/ml) ou da sequência de alvejamento AA 20–35 da SEQ ID NO: EE-B00184 95,8 1
[1809] As cepas endofíticas podem ser administradas à planta através da adição ao meio de crescimento da planta, incluindo formulações de solo, irrigação e granular. As cepas endofíticas também podem entrar na planta alvo através das porções aéreas das plantas. Essas cepas criam um mecanismo de entrega exclusivo e eficaz para a entrega de proteínas e peptídeos de interesse na planta. EXEMPLO 26: PADRONIZAÇÃO DA ENZIMA ACC
DESAMINASE EM PREPARAÇÕES DE ESPOROS DE BACILLUS
[1810] Dois aminoácidos do tipo selvagem D-cisteína desulfhydrase de SEQ ID NO: 245 (a partir de Bacillus thuringiensis; CÓDIGO ID: E195) foram mutados para criar SEQ ID NO: 249 (CÓDIGO ID: D406). Estas mutações são mostradas em texto sublinhado e negrito na SEQ ID NO: 249 na Tabela 3 acima. Embora a D-cisteína dessulfidrase do tipo selvagem da SEQ ID NO: 245 possua ampla atividade inerente de 1-aminociclopropano-1-carboxilato- desaminase (ACC desaminase/ACCD), para os fins do presente Exemplo e
Exemplos 27 e 28 abaixo, a D-cisteína dessulfidrase do tipo selvagem da SEQ ID NO: 245 é referida como uma “D-cisteína dessulfidrase” e a enzima que contém as mutações (SEQ ID NO: 249) será denominada “ACC desaminase”.
[1811] As enzimas do tipo selvagem (SEQ ID NO: 245) e mutantes (SEQ ID NO: 249) foram clonadas no plasmídeo pSUPER-BclA20-35 usando a técnica de emenda por extensão de sobreposição (SOE). O plasmídeo pSUPER-BclA20-35 contém um fragmento de PCR que inclui o promotor BclA (SEQ ID NO: 149), um códon de início e uma sequência de codificação para os aminoácidos 20-35 de BclA (aminoácidos 20-35 de SEQ ID NO : 1, a sequência de alvejamento), fundida em trama no plasmídeo pSUPER. Assim, os seguintes construtos foram gerados: pSUPER-BclA20-35-SEQ ID NO: 245 e pSUPER- BclA20-35-SEQ ID NO: 249. Um ligante de seis alaninas também foi incluído entre a sequência de alvejamento (aminoácidos 20-35 de BclA) e a região de codificação da D-cisteína dessulfidrase ou ACC desaminase.
[1812] A fim de remover as porções derivadas de E. Coli de plasmídeos pSUPER e criar plasmídeos menores para expressão em Bacillus, os construtos pSUPER verificados por sequência foram amplificados com iniciadores que amplificam o segmento derivado de Bacillusda estrutura do plasmideo. Os produtos resultantes de PCR foram autoligados para gerar os plasmídeos PBC (-BclA20-35-SEQ ID NO: 245 e pBC-BclA20-35-SEQ ID NO: 249) que foram utilizados para transformar a cepa mutante knockout exsY de Bacillus thuringiensis BT013A descrita acima no Exemplo 10. Os transformantes foram cultivados em caldo durante a noite com seleção de tetraciclina e o DNA total foi coletado usando procedimentos padrão. O DNA foi então submetido ao sequenciamento de Sanger para verificar se cada transformante continha o construto desejado.
[1813] Os esporos knockout exsY de Bacillus thuringiensis BT013A não transformados e os esporos knockout exsY de Bacillus thuringiensis BT013 transformados com cada um dos construtos pBC-BclA20- 35-SEQ ID NO: 245 e pBC-BclA20-35-SEQ ID NO: 249 construtos eram cultivados a 30° a 1,8-1,9 x 108 esporos por ml em meio de levedura meios à base de extratos durante 64 horas. Essas culturas de esporulação resultaram em aproximadamente 99% de esporulação.
[1814] A fim de padronizar (garantir uma atividade enzimática aproximadamente igual para ambos os construtos), as atividades enzimáticas daD-cysteína desulfidrase (SEQ ID NOs. 245; CÓDIGO ID: E195) e a ACC desaminase (SEQ ID NO: 249; CÓDIGO ID: D406) para uso nos estudos de plantas descritos nos Exemplos 27 e 28 abaixo, a atividade de ACC desaminase em preparações de esporos de Bacillus foi medida utilizando um ensaio de hidrazina de dinitrofenol espectrofotométrico (Li et al., A colorimetric assay of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) based on ninhydrin reaction for rapid screening of bacteria containing ACC deaminase, LETT APPL. MICROBIOL. 53 (2): 178–85 (2011). Especificamente, a atividade da ACC desaminase foi medida com base na formação de um derivado de cetobutirato formado por meio de uma reação em duas etapas. Na primeira etapa da reação, o 1- aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) é desaminado para formar α- cetobutirato (α-KB) e amônia:
[1815] Na segunda etapa da reação, α-KB é combinado com 2,4-dinitrofenil (DNP) hidrazina para formar ácido α-cetobutírico (2,4-dinitrofenil) hidrazona:
[1816] Esta hidrazona foi então quantificada espectrofotometricamente medindo sua absorção a 540 nm. A conversão de quantidades de α-KB em atividade enzimática foi alcançada por quantificação usando uma curva padrão de α-KB (ver Figura 9).
[1817] 100 ul de cada amostra de esporos (caldo de célula total) foi misturado com 100 ul de 0,1 M de Tris-HCl, pH 8,5. Uma série de diluições de padrões α-KB (50, 100, 500, 1.000 e 2.000 nM) foi também preparado a partir de uma solução 10 mM de a-KB em Tris-HCl 0,1 M (pH 8,5). O α-KB foi adquirido junto à Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
[1818] Amostras de esporos, espaços em branco e padrões de KB foram então submetidos ao ensaio de atividade ACCD de duas etapas descrito acima. Para a primeira reação, 20 μl de água purificada de 500 mM de ACC ou milliQ foram adicionados a cada amostra de esporos ou padrão de α-KB, respectivamente. Os tubos de reação foram agitados no vórtex e incubados a 30 °C em bloco térmico por 1 hora. A reação foi parada pela adição de 1 ml de HCl 0,56 M (ácido clorídrico) aos tubos de reação, seguido de vórtex e centrifugação à velocidade máxima por 5 minutos.
[1819] A segunda reação foi iniciada pela transferência de volumes de 1 ml das primeiras misturas de reação para volumes de 800 ml de 0,56 M HCl em novos tubos cônicos de 15 ml. Um volume de 300 µl de DNP hidrazina a 0,2% (p/v) em HCl 2,0 M foi adicionado a cada um dos tubos de reação e os tubos foram agitados no vórtex e incubados a 30 °C em uma incubadora estática por 30 min. Após a incubação, 1,0 ml de NaOH a 2 M foi adicionado a cada um dos tubos e os tubos foram novamente agitados em vórtex. As reações foram deixadas estabilizar por 10 a 20 segundos para garantir que a reação colorimétrica estivesse completa. Um volume de 1 ml de cada uma das reações foi transferido para uma cubeta de poliestireno e lido em um espectrofotômetro no comprimento de onda de 540 nm. A leitura da absorvância de um verdadeiro "branco" (tampão Tris 0,1 M, pH 8,5) foi subtraída de cada amostra de reação para gerar a absorvância final usada na análise dos dados.
[1820] Uma curva padrão foi gerada a partir da leitura de absorbância dos padrões α-KB e é mostrada na Figura 9. Na Figura 9, a linha sólida é uma linha artificial de melhor ajuste. Cada ponto de dados usado para criar a linha de melhor ajuste representou uma absorvância média (A540 nm) para duas repetições para cada uma das amostras de reação na série de diluição de α-KB plotada contra a concentração inicial de α-KB. A atividade enzimática de ACCD foi calculada como 1 unidade de atividade do ACCD equivalente a 1 µmol de α-KB liberado por 1 hora a 30 °C a pH 8,5.
[1821] A atividade enzimática para os esporos não transformados (fundo, controle de esporos) e para os esporos transformados com os construtos de D-cisteína dessulfidrase (E195; SEQ ID NO: 245) e ACC desaminase (D406; SEQ ID NO: 249) foi medida usando o ensaio de atividade de ACCD. Os resultados são mostrados na Figura 10. Sem estar vinculado a nenhuma teoria em particular, acredita-se que a atividade ligeiramente mais alta da D-cisteína dessulfidrase E195 em comparação com a ACC desaminase D406 observada neste ensaio possa ter sido devido a uma diferença na UFC/ml para cada enzima (a UFC/ml para a ACC desaminase D406 foi de 1,54 × 10 8 UFC/ml, enquanto que para a D-cisteína dessulfididase E195 foi de 2,18 × 108 UFC/ml) e/ou o fato de que a D-cisteína dessulfidrase E195 é menos ativa que a ACC- desaminase D406 a pH 8,5, o pH no qual o ensaio foi realizado.
[1822] As barras de erro na Figura 10 representam o erro padrão com base em um intervalo de confiança de 95%. As atividades das enzimas E195 e D406 foram padronizadas com base no ensaio de atividade ACCD para fornecer atividades semelhantes antes da aplicação foliar ao milho, como descrito no Exemplo 28 abaixo. EXEMPLO 27: TRATAMENTO FOLIAR DE MILHO COM
ACC DESAMINASE
[1823] Os esporos não transformados e esporos transformados com o construtode ACC desaminase BC pBC-BclA20-35-SEQ ID NO: 249 (D406) foram preparados como descrito acima no Exemplo 26. Estes esporos foram aplicados como tratamentos foliares para plantas de milho de idade de duas wks (híbrido de milho de Beck 5828 YH) no estágio V2 a V3 de desenvolvimento. As plantas de milho foram cultivadas a partir de sementes em uma sala de crescimento ambientalmente controlada. As sementes foram plantadas diretamente em vasos de 39,7 cm3 contendo o solo Timberline n° 13, a uma profundidade de 2,54 cm, com 2 sementes por vaso. Após o plantio, 50 ml de água em temperatura ambiente foram adicionados a cada vaso para permitir a germinação. Os vasos foram mantidos em uma sala de crescimento artificial, recebendo aproximadamente 300 µmol m-2 s-1 (fótons leves) por um ciclo de 12/12 luz/dia e uma faixa de temperatura noturna de 21 °C dia/15 °C. As plantas receberam os mesmos regimes de rega e fertilizantes.
[1824] Em duas wks, as preparações de esporos contendo 1,8-1,9 x 108 esporos totais em 1 ml de água com tensoativo não iônico a 0,5% (ALLIGARE SURFACE, Alligare LLC) foram aplicadas por aspersão foliar. O tensoativo da SUPERFÍCIE tensoativo ALLIGARE contém uma mistura de alkylpolyoxethylene, derivados de glicol, umectante e auxiliares de formulação. As plantas foram tratadas com volumes iguais de esporos não transformados (solução de controle BEMD) ou esporos que expressam a ACC desaminase D406. Após o tratamento, as plantas foram colocadas nas mesmas condições de crescimento ambiental e permitidas crescer mais duas wks antes da mensuração dos parâmetros de crescimento (massa da parte aérea, massa da raiz e comprimento da raiz). A Tabela 51 abaixo resume os resultados e mostra a massa e comprimento radiculares médios da raiz e da raiz normalizados para controles tratados com água por dois ensaios (18 plantas por ensaio). A ACC desaminase (D406) aplicada como tratamento foliar aumentou modestamente a massa da parte aérea (+ 2%) e aumentou substancialmente a massa da raiz (+ 10%) e o comprimento da raiz (+ 11%). TABELA 51. EFEITOS DA ACC DESAMINASE NO CRESCIMENTO DE MILHO, APLICAÇÃO FOLIAR. Tratamento Percentagem Massa percentual Comprimento Foliar média da massa média da raiz (g), percentual médio da Milho bruta (g), normalizada para raiz (cm), normalizada controle normalizado para para controle controle ACC 98% 106% 114% desaminase D406 Ensaio 1 ACC 105% 113% 108% desaminase D406 Ensaio 2 ACC 102% 110% 111% desaminase D406
Ensaio Médio 1 e 2 EXEMPLO 28: TRATAMENTO FOLIAR DE MILHO COM D-CISTEÍNA DESSULFIDRASE E ACC DESAMINASE: COMPARAÇÃO DE
ESPOROS INTACTOS E FRAGMENTOS DE EXOSPORIUM
[1825] Os esporos não transformadas, bem como os esporos que expressam o construto de ACC desaminase pBC-BclA20-35-SEQ ID NO: 249 (D406) ou o construto deD-cisteína dessulfidrase pBC-BclA20-35- SEQ ID NO: 245 (E195) foram preparados e cultivados como descrito acima no Exemplo 26. Uma alíquota de cada cultura de esporos foi coletada e retirada (referida neste Exemplo como "esporos intactos"). O restante de cada cultura resultante de esporos foi centrifugado por 5 minutos a 10.000 × g para remover os esporos do meio. O sobrenadante restante, que contém os fragmentos de exosporium, foi então filtrado através de um filtro de seringa de 0,22 μM para remover quaisquer esporos remanescentes. O sobrenadante contendo os fragmentos de exosporium foi confirmado como livre de células por meio de placas em ágar nutriente por 48 horas a 30 °C.
[1826] Plantas de milho (híbrido de milho de Beck 5828 YH) foram cultivadas como descrito no Exemplo 27 e foram tratadas em duas wks (no estágio de desenvolvimento V2 a V3) por aspersão foliar com fragmentos de exosporium derivados de esporos não transformados, fragmentos de exosporium derivados de esporos expressar a D-cisteína dessulfidrase (SEQ ID NO: 245; CÓDIGO ID: E195), fragmentos de exosporium derivados de esporos que expressam a ACC desaminase (SEQ ID NO: 249; CÓDIGO ID D406) ou esporos intactos que expressam a ACC desaminase (SEQ ID NO: 249; CÓDIGO ID D406). Atividades equivalentes das enzimas D-cisteína dessulfidrase e ACC desaminase foram entregues a cada planta, preparando soluções de esporos contendo 1,8-1,9 x 108 esporos/ml antes da criação de fragmentos de exosporium. Os esporos ou fragmentos de exosporium foram então diluídos em 10 ml de água com tensoativo não iônico a 0,1% (ALLIGARE
SURFACE, Alligare LLC). 1 ml dos esporos diluídos ou fragmentos de exosporium foi então aplicado foliarmente a cada planta.
[1827] Em quatro wks, os parâmetros de crescimento (massa e comprimento das raízes) foram medidos e comparados com plantas de controle tratadas com fragmentos de exosporium derivados de esporos não transformados. A Tabela 52 abaixo resume o comprimento normalizado da parte aérea, a massa radicular e o comprimento médio em duas tentativas. Os dados são normalizados para resultados de plantas tratadas com fragmentos de exosporium derivados de esporos não transformados. As aplicações foliares de fragmentos de exosporium contendo D -cisteína dessulfidrase E195 ou ACC desaminase D406 (fragmentos de exosporium ou esporos intactos) conduziu a aumentos em massa de raiz e o comprimento da raiz. O tratamento utilizando fragmentos de exosporium foliares contendo D-cisteína dessulfidrase E195, resultou em um aumento + 9% em massa da raiz e um aumento de + 14% no comprimento da raiz. Os tratamentos foliares utilizando fragmentos de exosporium ou esporos intactos contendo ACC desaminase (D406) resultaram em aumentos semelhantes na massa e no comprimento das raízes. TABELA 52. EFEITOS DA D-CISTEÍNA DESSULFIDRASE
E DA ACC DESAMINASE ENTREGUES USANDO ESPOROS INTACTOS OU FRAGMENTOS DE EXOSPORIUM NO CRESCIMENTO DO MILHO,
APLICAÇÃO FOLIAR Tratamento Foliar Massa percentual média Comprimento médio de Milho da raiz (g) normalizado percentual da raiz (cm), para controle normalizado para controle D-cisteína 109% 114% dessulfidrase E195 (fragmentos de exosporium) ACC desaminase 107% 113% D406 (fragmentos de exosporium)
ACC desaminase 110% 111% D406 (esporos intactos) EXEMPLO 29: ENSAIOS DE BIOATIVIDADE PARA
OTIMIZAÇÃO DE ENZIMAS EM PREPARAÇÕES DE ESPOROS DE BACILLUS
[1828] Os exemplos fornecidos a seguir descrevem o uso do sistema BEMD para fornecer várias enzimas às plantas por meio de tratamento com sementes, sulco ou foliar. As atividades enzimáticas podem ser determinadas usando bioensaios espectrofotométricos específicos de substrato. Dentro de cada classe de enzimas, as atividades enzimáticas podem ser padronizadas para que aproximadamente a mesma atividade seja aplicada às sementes, plantas ou solo ao redor das plantas. Ensaios ilustrativos de atividade enzimática que podem ser utilizados para esse fim são descritos abaixo.
[1829] β-1,3-endoglucanase
[1830] A atividade da β-1,3-endoglucanase pode ser avaliada medindo a clivagem hidrolítica do carboximetil-curdlan solúvel derivado do β-1,3-glucano (CM-Curdlan). A clivagem das ligações β-1,3 libera a extremidade redutora de um dos dois monômeros de açúcar originalmente envolvidos na ligação. As extremidades redutoras liberadas são subsequentemente quantificadas pela redução do ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) para o ácido 3-amino-5-nitrosalicílico, que pode ser quantificado espectrofotometricamente medindo sua absorção a 540 nm. A conversão das quantidades de extremidades redutoras liberadas em atividade enzimática é alcançada por quantificação e comparação com uma curva padrão de glicose que é gerada usando uma preparação pré-quantificada de endoglucanase disponível comercialmente como padrão.
[1831] β-1,4-endoglucanase
[1832] A atividade da β-1,4-endoglucanase pode ser avaliada medindo a clivagem hidrolítica da carboximetil celulose (CMC) derivada do β-1,4-glucano solúvel. A clivagem das ligações β-1,4 libera a extremidade redutora de um dos dois monômeros de açúcar originalmente envolvidos na ligação. As extremidades redutoras liberadas são subsequentemente quantificadas pela redução do ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) para o ácido 3- amino-5-nitrosalicílico, que pode ser quantificado espectrofotometricamente medindo sua absorção a 540 nm. A conversão das quantidades de extremidades redutoras liberadas em atividade enzimática é alcançada por quantificação e comparação com uma curva padrão de glicose que é gerada usando uma preparação pré-quantificada de endoglucanase disponível comercialmente como padrão.
QUITOSANASE
[1833] A atividade da quitosanase pode ser avaliada medindo a clivagem hidrolítica da quitosana. A clivagem das ligações β-1,4 libera a extremidade redutora de um dos dois monômeros de glucosamina originalmente envolvidos na ligação. As extremidades redutoras liberadas são subsequentemente quantificadas pela redução do ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) para o ácido 3-amino-5-nitrosalicílico, que pode ser quantificado espectrofotometricamente medindo sua absorção a 540 nm. A conversão das quantidades de extremidades redutoras liberadas em atividade enzimática é alcançada por quantificação e comparação com uma curva padrão de glicose gerada usando como padrão uma preparação de quitosanase pré-quantificada e comercialmente disponível.
MANANASE
[1834] A atividade da mananase pode ser avaliada medindo-se a clivagem hidrolítica do galactomanano da alfarroba (alfarroba), que possui uma relação 22:78 de galactose: manose, com os resíduos de manose possuindo ligações β-1,4 e α-1,6 galactose ligada a cada terceiro manose (no meio da subunidade). A clivagem das ligações β-1,4 libera a extremidade redutora de um dos resíduos de manose originalmente envolvidos na ligação. As extremidades redutoras liberadas são subsequentemente quantificadas pela redução do ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) para o ácido 3- amino-5-nitrosalicílico, que pode ser quantificado espectrofotometricamente medindo-se sua absorção a 540 nm. A conversão de quantidades de extremidades redutoras liberadas em atividade enzimática é alcançada por quantificação e comparação com uma curva padrão de manose gerada usando uma enzima mananase pré-quantificada disponível comercialmente.
FOSFATASE ÁCIDA
[1835] A atividade da fosfatase ácida pode ser avaliada medindo-se a liberação de p-nitrofenol (pNP) a partir de bis (4-nitrofenil) fosfato [bNPP]. A clivagem das ligações fosfato libera duas moléculas de pNP do fosfato. O composto de bNPP é incolor, enquanto o pNP é amarelo brilhante e pode ser quantificado espectrofotometricamente medindo sua absorção a 405 nm em condições básicas. Para otimizar a detecção colorimétrica, o hidróxido pode ser adicionado no final da reação enzimática em todos os padrões de enzimas, padrões de produtos e amostras. A conversão da absorvância em atividade enzimática é alcançada por quantificação e comparação com uma curva padrão de pNP gerada usando uma preparação de fosfatase ácida pré-quantificada e disponível comercialmente como padrão.
FOSFOLIPASE C
[1836] A atividade da fosfolipase C pode ser avaliada medindo a liberação de p- nitrofenol (pNP) da p- nitrofenilfosforilcolina (NPPC). A clivagem da ligação fosfato libera pNP da fosforilcolina. O composto NPPC é incolor, enquanto o pNP é um verde-amarelo brilhante que pode ser quantificado espectrofotometricamente medindo sua absorção a 405-410 nm. A conversão de quantidades de pNP em atividade enzimática é alcançada por quantificação e comparação com uma curva padrão de pNP gerada usando uma preparação pré-quantificada e comercialmente disponível de fosfolipase C como padrão.
LIPASE
[1837] A atividade da lipase pode ser avaliada medindo- se usando ésteres de p- nitrofenilacil (por exemplo, palmitato de p- nitrofenil) como análogos do substrato cromogênico para fornecer um ensaio espectrofotométrico contínuo. A lipólise dos ésteres de p- nitrofenil (lauratos, palmitatos, oleatos) dá origem ao p- nitrofenol de cor amarela, que pode ser quantificado espectrofotometricamente medindo sua absorvância de 405-410 nm. Este ensaio fornece uma medição rápida e sensível para determinar a atividade da lipase (mU ml-1) medindo o cromogênio amarelo (p- nitrofenol) resultante da hidrólise do substrato.
XILOGLUCANASE
[1838] A atividade da xiloglucanase pode ser avaliada medindo-se a clivagem ou a endo-hidrólise do xiloglucano (tamarindo). As extremidades redutoras liberadas são subsequentemente quantificadas pela redução do ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) para o ácido 3-amino-5- nitrosalicílico, que pode ser quantificado espectrofotometricamente medindo sua absorção a 540 nm. A conversão das quantidades de extremidades redutoras liberadas em atividade enzimática é alcançada por quantificação e comparação com uma curva padrão de glicose gerada usando uma preparação pré- quantificada e comercialmente disponível de xiloglucanase (Paenibacillus, GH5) como padrão.
[1839] Outros métodos também podem ser usados para determinar a atividade da xiloglucanase usando ensaios específicos de substrato. Por exemplo, como descrito em Ariza et al. (Structure and activity of Paenibacillus polymyxa xyloglucanase from glycoside hydrolase Family 44, J. Biol. Chem. 286 (39): 33890-33900, 2011), a atividade da xiloglucanase pode ser medida usando o xiloglucano reticulado com azurina do substrato cromogênico. A absorvância do substrato reagido por enzima é medida a 650 nm para quantificar a atividade da enzima. Outros ensaios específicos de substrato da atividade da xiloglucanase usam xiloglucano de tamarindo, carboximetilcelulose, glucana de cevada, arabinoxilano de trigo ou galactomanano de alfarroba como substrato, com medições de absorvância dos substratos reativos à enzima, tomados a 650 nm para quantificar a atividade da xiloglucanase. EXEMPLO 30: TRATAMENTO DE β-1,4- ENDOGLUCANASE DE MILHO.
[1840] Construtos que codificam proteínas de fusão contendo β-1,4-endoglucanases foram preparados usando os mesmos métodos descritos acima no Exemplo 26. Cada um dos construtos continha o promotor BclA (SEQ ID NO: 149), um códon de início, uma sequência de codificação para os aminoácidos 20-35 de BclA (aminoácidos 20-35 de SEQ ID NO: 1) e uma sequência de codificação para uma p-1,4-endoglucanase. As β-1,4- endoglucanases utilizadas foram as seguintes:
[1841] 1. O peptídeo sinal da SEQ ID NO: 334, diretamente ligado à β-1,4-endoglucanase da SEQ ID NO: 293 (CÓDIGO ID E94);
[1842] 2. A β-1,4-endoglucanase da SEQ ID NO: 293, sem qualquer peptídeo sinal (CÓDIGO ID: E112); e
[1843] 3. O peptídeo sinal da SEQ ID NO: 334, diretamente ligado à β-1,4-endoglucanase da SEQ ID NO: 294 (CÓDIGO ID E113).
[1844] A β-1,4-endoglucanase da SEQ ID NO: 294 é uma versão truncada da β-1,4-endoglucanase da SEQ ID NO: 293, em que o domínio de ligação a carboidratos foi removido truncando os últimos 167 aminoácidos de a proteína. Em cada um dessos construtos, também foi incluído um ligante de cinco alanina entre a sequência de alvejamento (aminoácidos 20-35 de BclA) e a β-1,4-endoglucanase.
[1845] O construto contendo o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 334 diretamente ligada à β-1,4-endoglucanase da SEQ ID NO: 293 foi clonado em um plasmídeo que confere resistência à tetraciclina. Este plasmídeo (pBCm-BclA20-35) foi derivado do plasmídeo pBC16 Bacillus cereus e contém a origem do gene de replicação e resistência à tet do pBC16. O plasmídeo resultante e a cepa hospedeira que expressa o plasmídeo receberam o código identificação E94.
[1846] O construto contendo a β-1,4-endoglucanase da SEQ ID NO: 293, sem nenhum peptídeo sinal, foi clonado no plasmídeo pBCm- BclA20-35 à resistência à tetraciclina. O plasmídeo resultante e a cepa hospedeira que expressa o plasmídeo receberam o código identificação E112.
[1847] O construto contendo o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 334, diretamente ligada à β-1,4-endoglucanase da SEQ ID NO: 294, foi clonado no plasmídeo pBCm-BclA20-35 que confere resistência à tetraciclina. O plasmídeo resultante e a cepa hospedeira que expressa o plasmídeo receberam o código identificação E113.
[1848] Cada um dos construtos no plasmídeo pBCm- BclA20-35 à resistência à tetraciclina foi transformado em Bacillus thuringiensis BT013A de tipo selvagem e os esporos foram gerados como descrito acima no Exemplo 26.
[1849] Os esporos que expressam cada um dos construtos foram aplicados aos tratamentos de sulco de milho (híbrido de milho de Beck 5828 NR) usando volumes de 1 μl de preparações de esporos e uma concentração de esporos de 1,8 a 1,9 x 108 esporos por ml (de culturas que resultaram em aproximadamente 99% de esporulação). Para o tratamento no sulco, 1 μl da preparação de esporos foi diluído em 1 ml de água, que foi aplicada ao solo ao redor da semente no momento do plantio.
[1850] As plantas foram cultivadas em uma sala de crescimento ambientalmente controlada sob as mesmas condições descritas acima no Exemplo 27. A altura da planta foi medida em duas wks e normalizada para controlar plantas tratadas apenas com água. Os resultados são fornecidos na Tabela 53 abaixo, conforme a altura da planta normalizada para controlar a média em três ensaios (18 plantas por ensaio).
TABELA 53. EFEITOS DO EFEITO DA Β-1,4- ENDOGLUCANASE NA ALTURA DA PLANTA PARA MILHO, TRATAMENTO
DE SULCOS Tratamento de Milho Porcentagem média da altura da planta (cm), normalizada para controle (No sulco) β-1,4-endoglucanase E94 111% β-1,4-endoglucanase E112 120% β-1,4-endoglucanase E113 119%
[1851] O tratamento no sulco com as enzimas β-1,4- endoglucanase (E94, E112 e E113) aumentou a altura da planta sobre o controle, em + 11%, + 20% e + 19%, respectivamente (Tabela 53). EXEMPLO 31: TRATAMENTO DE SEMENTES DE MILHO
COM LIQUENASE
[1852] Um construto que codifica uma proteína de fusão contendo uma liquenase foi preparado usando os mesmos métodos descritos acima no Exemplo 26. O construto continha o promotor BclA (SEQ ID NO: 149), um códon de início, uma sequência de codificação para os aminoácidos 20-35 de BclA (aminoácidos 20-35 de SEQ ID NO: 1) e uma sequência de codificação para uma liquenase. A liquenase continha o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 335, diretamente ligada à liquenase da SEQ ID NO: 295. Esse construto foi clonado no plasmídeo pBCm-BclA20-35 de resistência à tetraciclina descrito acima no Exemplo 30 e com o código de identificação E111. Este plasmídeo foi transformado em Bacillus thuringiensis BT013A de tipo selvagem e os esporos foram gerados como descrito acima no Exemplo 26.
[1853] Em duas experiências separadas, as sementes de milho (híbrido de milho de Beck 5828 NR) foram tratadas com 1 µl de esporos expressando a enzima liquenase E111 ou β-1,4-endoglucanase E94 (Experiência 1) ou apenas com esporos expressando a liquenase E111 (Experiência 2). Os construtos de β-1,4-endoglucanase E94 são descritos acima no Exemplo 30. O tratamento de sementes foi conduzido como descrito acima no Exemplo 30.
[1854] As plantas foram cultivadas em um ambiente de crescimento controlado nas mesmas condições descritas acima no Exemplo 27. A altura da planta foi medida em duas wks. Os resultados são mostrados nas Tabelas 54 e 55 abaixo como a altura média da planta normalizada para um controle somente de água para cada teste em cada experimento. Cada experimento envolveu dois ensaios replicados usando 18 plantas por ensaio.
[1855] A enzima liquenase aplicada como tratamento de sementes aumentou a altura da planta em 5 a 6% em ambos os experimentos, em comparação com as plantas de controle (tratadas com água) (Tabelas 54 e 55). TABELA 54. TRATAMENTO DE SEMENTES COM LIQUENASE, EFEITO NA ALTURA DAS PLANTAS DE MILHO Tratamento de sementes Porcentagem Porcentagem Porcentagem Milho média da média da média da altura da altura da altura da planta (cm) planta (cm) planta (cm) normalizada normalizada normalizada para controle para controle para controle Ensaio 1 Ensaio 2 Ensaios 1 e 2 β-1,4-endoglucanase E94 102,4% 101,4% 101,9% Liquenase E111 108,4% 102,4% 105,4% TABELA 55. TRATAMENTO DE SEMENTES COM LIQUENASE, EFEITO NA ALTURA DAS PLANTAS DE MILHO Tratamento de Porcentagem Porcentagem Porcentagem sementes de média da altura média da altura média da altura milho da planta (cm) da planta (cm) da planta (cm) normalizada normalizada normalizada para controle para controle para controle Ensaio 1 Ensaio 2 Ensaios 1 e 2 Liquenase E111 112,2% 100,3% 106,3% EXEMPLO 32: TRATAMENTO DE SULCO DE MILHO
COM LIQUENASE
[1856] Os esporos que expressam a liquenase E111 descrita acima no Exemplo 31 ou a β-1,4-endoglucanase E94 descrita acima no
Exemplo 30 foram aplicados no sulco ao milho (híbrido de milho de Beck 5828 NR). Um microlitro de cada preparação de esporos foi diluído em 1 ml de água. Os esporos diluídos foram então aplicados no solo ao redor das sementes no momento do plantio. As plantas foram cultivadas em uma sala de crescimento ambientalmente controlada sob as mesmas condições descritas acima no Exemplo 27. Após duas wks de crescimento, a altura da planta foi medida e comparada aos controles tratados com água. Os resultados são fornecidos na Tabela 56 abaixo, conforme a altura da planta normalizada para controlar a média em três ensaios (18 plantas por ensaio).
[1857] Os tratamentos de sulco utilizando liquenase (E111) e β-1,4-endoglucanase (E94) aumentaram o crescimento das plantas. A aplicação de liquenase no sulco (E111) aumentou a altura da planta em + 13%, enquanto a β-1,4-endoglucanase E94 aumentou a altura da planta em + 11% em comparação aos controles tratados com água. TABELA 56. A APLICAÇÃO DE LIQUENASE NO SULCO
AUMENTA A ALTURA DA PLANTA DO MILHO Tratamento no sulco, milho Porcentagem média da altura da planta (cm), normalizada para controle β-1,4-endoglucanase E94 111% Liquenase E111 113% EXEMPLO 33: TRATAMENTO DE SEMENTES DE MILHO
COM XILOGLUCANASE
[1858] Construtos que codificam proteínas de fusão contendo xiloglucanases foram preparados como descrito acima no Exemplo 26. Cada um dos construtos continha o promotor BclA (SEQ ID NO: 149), um códon de início, uma sequência de codificação para os aminoácidos 20-35 de BclA (aminoácidos 20-35 de SEQ ID NO: 1) e uma sequência de codificação para uma xiloglucanase. A xiloglucanase utilizada foi a seguinte:
[1859] 1. A xiloglucanase da SEQ ID NO: 300, sem qualquer peptídeo sinal (xiloglucanase XG12, Bacillus licheniformis CÓDIGO ID: E149); e
[1860] 2. A xiloglucanase da SEQ ID NO: 299, sem qualquer peptídeo sinal (xiloglucanase XG5, Paenibacillus pabuli; CÓDIGO ID: D381).
[1861] Esses construtos foram clonados no plasmídeo pBCm-BclA20-35 de resistência à tetraciclina descrito acima no Exemplo 30. Esses plasmídeos foram então transformados em Bacillus thuringiensis BT013A de tipo selvagem e os esporos foram gerados como descrito acima no Exemplo
26.
[1862] As sementes de milho (híbrido de milho de Beck 5828 NR) foram tratadas com 1 µl das preparações de esporos usando o método descrito acima no Exemplo 30. As sementes foram plantadas e as plantas foram cultivadas em uma sala de crescimento ambientalmente controlada nas mesmas condições descritas acima no Exemplo 27. A altura da planta foi medida em duas wks e comparada aos controles tratados com água. Os resultados estão resumidos na Tabela 57 abaixo, conforme a altura da planta normalizada para controlar a média em três ensaios (18 plantas por ensaio). Ambas as enzimas xiloglucanase aumentaram a altura da planta, em + 5% para E149 e + 3% para D381, em comparação ao controle (Tabela 57). TABELA 57. O TRATAMENTO DE SEMENTES COM
XILOGLUCANASE AUMENTA A ALTURA DA PLANTA NO MILHO Tratamento de Porcentagem média da altura da planta (cm), sementes de milho normalizada para controle Xiloglucanase E149 105% Xiloglucanase D381 103% EXEMPLO 34: TRATAMENTO DE SEMENTES DE MILHO
COM XILANASE
[1863] Construtos que codificam proteínas de fusão contendo xilanases foram preparados como descrito acima no Exemplo 26. Cada um dos construtos continha o promotor BclA (SEQ ID NO: 149), um códon de início, uma sequência de codificação para os aminoácidos 20-35 de BclA
(aminoácidos 20-35 de SEQ ID NO: 1) e uma sequência de codificação para uma xilanase. As xilanases utilizadas foram as seguintes:
[1864] 1. O peptídeo sinal da SEQ ID NO: 328, diretamente ligado à xilanase da SEQ ID NO: 268 (CÓDIGO ID: E100); e
[1865] 2. A xilanase da SEQ ID NO: 268, sem qualquer peptídeo sinal (CÓDIGO ID: E146).
[1866] Esses construtos foram clonados no plasmídeo pBCm-BclA20-35 de resistência à tetraciclina descrito acima no Exemplo 30. Esses plasmídeos foram então transformados em Bacillus thuringiensis BT013A de tipo selvagem e os esporos foram gerados como descrito acima no Exemplo
26.
[1867] As sementes de milho (híbrido de milho 5828 NR de Beck) foram tratadas como descrito no Exemplo 30 usando 1 µl de cada uma das preparações de esporos. As sementes foram plantadas e as plantas foram cultivadas em uma sala de crescimento ambientalmente controlada nas mesmas condições descritas acima no Exemplo 27. A altura da planta foi medida em duas wks e comparada aos controles tratados com água. Os resultados estão resumidos na Tabela 58 abaixo como a altura normalizada da planta em média em três tentativas (18 plantas por tentativa). O tratamento de sementes com as duas enzimas xilanase (XynA) resultou em diferentes efeitos no crescimento das plantas. A Xilanase E100 apresentou um aumento de + 7% na altura da planta em relação às plantas de milho controle. TABELA 58. EFEITOS DO TRATAMENTO DE
SEMENTES COM XILANASE NA ALTURA DAS PLANTAS DE MILHO Tratamento de Porcentagem média da altura da planta (cm) sementes de milho normalizada para controle Xilanase E100 107% Xilanase E146 97% EXEMPLO 35: TRATAMENTO DE SEMENTES DE SOJA
COM XILOSIDASE
[1868] Construtos que codificam proteínas de fusão contendo xilosidases foram preparados como descrito acima no Exemplo 26. Cada um dos construtos continha o promotor BclA (SEQ ID NO: 149), um códon de início, uma sequência de codificação para os aminoácidos 20-35 de BclA (aminoácidos 20-35 de SEQ ID NO: 1) e uma sequência de codificação para uma xilosidase. As xilosidases utilizadas foram as seguintes:
[1869] 1. A xilosidase de SEQ ID NO: 276 (CÓDIGO ID: E175); e
[1870] 2. A xilosidase de SEQ ID NO: 275 (CÓDIGO ID E194).
[1871] Esses construtos foram clonados no plasmídeo pBCm-BclA20-35 de resistência à tetraciclina descrito acima no Exemplo 30. Esses plasmídeos foram então transformados em Bacillus thuringiensis BT013A de tipo selvagem e os esporos foram gerados como descrito acima no Exemplo
26.
[1872] Esses construtos de xilosidase e o construto de E- 1,4-endoglucanase E94 descrita acima no Exemplo 30 foram testados quanto aos seus efeitos como tratamentos de sementes em soja. As sementes de soja (MorSoyXtra 38X52) foram tratadas com 1 µl de cada uma das preparações de esporos, pipetando 1 μl da preparação de esporos diretamente em cada semente e deixando secar. As sementes tratadas foram então cultivadas em uma sala ambientalmente controlada. As sementes foram plantadas diretamente em vasos de 39,7 cm3 contendo solo Timberline n° 13, a uma profundidade de 2,54 cm, com 2 sementes por vaso. Após o plantio, 50 ml de água em temperatura ambiente foram adicionados a cada vaso para permitir a germinação. Os vasos foram mantidos em uma sala de crescimento artificial iluminada, recebendo aproximadamente 300 µmol m-2 s-1 (fótons leves) por um ciclo de 12/12 luz/dia e uma faixa de temperatura noturna de 21 °C dia/15 °C. As plantas receberam os mesmos regimes de rega e fertilizantes. Após 4-5 wks, as plantas foram medidas quanto a alterações nos parâmetros de biomassa seca (peso total e peso acima do solo). Os resultados da biomassa estão resumidos na Tabela 59 como normalizados para controlar plantas cultivadas a partir de sementes tratadas com água, em média em dois ensaios (18 plantas por ensaio).
[1873] Quando comparada às plantas de controle, a enzima β-1,4-endoglucanase (E94) aumentou o peso seco total médio em + 45% e a biomassa de soja seca acima do solo em + 66%. A xilosidase (E175), em média, aumentou a biomassa seca total em + 15% e a biomassa seca acima do solo em + 23%. TABELA 59. EFEITOS DO TRATAMENTO DE
SEMENTES COM XILOSIDASE NA BIOMASSA DA SOJA Tratamento de sementes Porcentagem média Média percentual Soja, Peso Seco do peso total (g), acima do peso do normalizada para solo (g), controle normalizada para controle β-1,4-endoglucanase E94 145% 166% Xilosidase E175 115% 123% Xilosidase E194 92% 94% EXEMPLO 36: EFEITO DA XILOSIDASE NA COBERTURA FRACIONADA DA COPA VERDE DA SOJA (FGCC)
[1874] Os construtos de xilosidase descritos acima no Exemplo 35 também foram testados quanto aos seus efeitos na cobertura fracionada da copa verde (FGCC) em soja. O FGCC é uma medida-chave de análise de imagem diagnóstica usada para estimar o desenvolvimento da copa e fornece um meio para prever a interceptação de luz e evapotranspiração das superfícies das folhas das plantas. O aplicativo móvel Canopeo FGCC fornece uma comparação das proporções de cores vermelho para verde (R/G) e azul para verde (B/C) e fornece uma medida não destrutiva da cobertura da copa verde. O resultado da análise é uma imagem binária em que pixels brancos correspondem aos pixels que atendem aos critérios de seleção (copa verde) e pixels pretos correspondem aos pixels que não corresponderam aos critérios (copa não verde). A copa verde fracionada (faixa verde ~500–570 nm) abrange faixas de 0 (sem copa verde) a 1 (100% de cobertura de copa verde) (Patrignani
A. et al., Canopeo: A powerful new tool for measuring fractional green canopy cover, BIOMETRY, MODELING AND STATISTICS 107: 2312–2320, 2015).
[1875] As sementes de soja (MorSoyXtra 38X52) foram tratadas como descrito no Exemplo 35 com 1 µl de cada preparação de esporos de xilosidase ou com a preparação de esporos de β-1,4-endoglucanase E94 descrita acima no Exemplo 30. As plantas foram cultivadas em uma sala de crescimento ambientalmente controlada sob as mesmas condições descritas acima no Exemplo 35. No estágio da folha trifoliada, o FGCC foi medido para quantificar o tamanho da copa e o “verdor” geral. Os resultados estão resumidos na Tabela 60. A Tabela 60 fornece os parâmetros do FGCC e as respostas normalizadas em comparação com os controles tratados com água, em média em dois ensaios (18 plantas por ensaio). O tratamento de sementes com xilosidase (E175) aumentou o verdor em comparação com os controles tratados com água. O tratamento de sementes com xilosidase (E175) resultou em aumentos de + 13% (Estudo 1) e + 7% (Estudo 2) do parâmetro calculado pelo FGCC. Assim, a xilosidase (E175) pode ter impactos positivos para aumentar o fenótipo de "ficar verde" na soja, especialmente durante os estágios de desenvolvimento de grãos e vagens, permitindo maior assimilação e transferência de carboidratos durante esses dois estágios para aumentar o rendimento geral.
TABELA 60. EFEITOS DO TRATAMENTO DE
SEMENTES COM XILOSIDASE NA COBERTURA FRACIONADA DA COPA VERDE (FGCC) EM SOJA Tratamento Cobertura Variação Cobertura Variação de sementes média da média média da média Soja copa do percentual copa do percentual FGCC no FGCC por FGCC no FGCC por Ensaio 1 planta Ensaio 2 planta normalizada normalizada para controle para controle Ensaio 1 Ensaio 2 Controle 0,844 – 0,912 – (Água)
Xilosidase 0,951 113% 0,973 107% E175 Xilosidase 0,622 74% 0,673 74% E194 EXEMPLO 37: EFEITOS DO TRATAMENTO DE
SEMENTES COM XILOSIDASE NA NODULAÇÃO NA SOJA
[1876] Os construtos de xilosidase descritos acima no Exemplo 35 e a β-1,4-endoglucanase E94 descrita acima no Exemplo 30 também foram testados quanto aos seus efeitos sobre a nodulação na soja. As sementes de soja (MorSoyXtra 38X52) foram tratadas como descrito no Exemplo 35 com 1 µl de cada uma das preparações de esporos de xilosidase ou com a preparação de esporos de β-1,4-endoglucanase E94. Em 4-5 wks, os nódulos foram contados e normalizados para resultados de plantas controle cultivadas a partir de sementes tratadas com água. Os resultados estão resumidos na Tabela 61 abaixo como a contagem normal de nódulos em média em dois ensaios (18 plantas por ensaio). O tratamento de sementes com xilosidase (E175) ou β-1,4- endoglucanase (E94) aumentou o número de nódulos por planta em + 5% e + 9%, respectivamente, em comparação às plantas controle.
TABELA 61. EFEITOS DO TRATAMENTO DE
SEMENTES COM XILOSIDASE NA NODULAÇÃO PRECOCE DA SOJA Tratamento de sementes de soja Nódulos médios percentuais por planta, normalizados para controle β-1,4-endoglucanase E94 109% Xilosidase E175 105% Xilosidase E194 99% EXEMPLO 38: TRATAMENTO DE SEMENTES DE MILHO
COM MANANASE
[1877] Construtos que codificam proteínas de fusão contendo mananases foram preparados como descrito acima no Exemplo 26. Cada um dos construtos continha o promotor BclA (SEQ ID NO: 149), um códon de início, uma sequência de codificação para os aminoácidos 20-35 de BclA (aminoácidos 20-35 de SEQ ID NO: 1) e uma sequência de codificação para um mananases. As mananases utilizadas foram as seguintes:
[1878] 1. A mananase da SEQ ID NO: 308, sem qualquer peptídeo sinal (CÓDIGO ID: E177); e
[1879] 2. A mananase da SEQ ID NO: 307, sem qualquer peptídeo sinal (CÓDIGO ID: E196).
[1880] Esses construtos foram clonados no plasmídeo pBCm-BclA20-35 de resistência à tetraciclina descrito acima no Exemplo 30. Esses plasmídeos foram então transformados em Bacillus thuringiensis BT013A de tipo selvagem e os esporos foram gerados como descrito acima no Exemplo
26.
[1881] As sementes de milho (híbrido de Beck 5828 YH) foram tratadas como descrito no Exemplo 30 com 1 µl de cada uma das preparações de esporos de mananase. As sementes foram plantadas e as plantas foram cultivadas em uma sala de crescimento ambientalmente controlada nas mesmas condições descritas acima no Exemplo 27. A altura das plantas foi medida em duas wks e comparou as plantas cultivadas a sementes de controle tratadas com água. Os resultados estão resumidos na Tabela 62 como a altura normalizada da planta, em média, em dois ensaios (18 plantas por ensaio).
[1882] O tratamento de sementes com as enzimas mananase E177 e E196 promoveu o crescimento da planta, medido pela altura da planta. A mananase E177 resultou em um aumento de + 14% e a mananase E196 resultou em um aumento de + 5% na altura da planta em comparação com o controle. TABELA 62. A APLICAÇÃO DE MANANASE NO
TRATAMENTO DE SEMENTES AUMENTA A ALTURA DA PLANTA DO MILHO
Tratamento de sementes Porcentagem média da altura da planta (cm) de milho normalizada para controle Mananase E177 114% Mananase E196 105% EXEMPLO 39: TRATAMENTO DE SEMENTES DE SOJA
COM MANANASE
[1883] Os construtos de mananase descritas acima no Exemplo 38 e o construto de β-1,4-endoglucanase E94 descrita no Exemplo 30 acima também foram testados quanto aos seus efeitos no crescimento das plantas em soja quando aplicadas como tratamentos de sementes.
[1884] As sementes de soja (MorSoyXtra 38X52) foram tratadas como descrito no Exemplo 35 com 1 µl de cada uma das preparações de esporos de mananase ou com a preparação de esporos de β-1,4- endoglucanase E94. As sementes foram plantadas e as plantas foram cultivadas em uma sala de crescimento ambientalmente controlada sob as mesmas condições descritas acima no Exemplo 35. As medidas de crescimento (biomassa seca e nodulação) foram realizadas em 4-5 wks e normalizadas para controlar plantas cultivadas a partir de sementes tratadas com água. As tabelas 63 e 64 abaixo resumem os resultados normalizados, em média, de dois ensaios (12 plantas por ensaio) TABELA 63. EFEITOS DO TRATAMENTO DE
SEMENTES COM EFEITO DA MANANASE NO PESO SECO DA SOJA Tratamento de sementes Porcentagem média Média percentual Soja, Peso Seco do peso total (g), acima do peso do normalizada para solo (g), controle normalizada para controle β-1,4-endoglucanase E94 145% 166% Mananase E177 110% 113% Mananase E196 121% 130%
[1885] Como mostrado na Tabela 63, o tratamento de sementes com a enzima β-1,4-endoglucanase (E94) aumentou o peso seco total em + 45% e a biomassa de soja seca acima do solo em + 66% em comparação com o tratamento controle. A mananase (E177) aumentou a biomassa seca total em + 10% e aumentou a biomassa seca acima do solo em + 13% em comparação com as plantas de controle. A mananase (E196) aumentou a biomassa seca total em + 21% e a biomassa seca acima do solo em + 30% em comparação com os controles. TABELA 64. EFEITOS DO TRATAMENTO DE
SEMENTES COM MANANASE NA NODULAÇÃO PRECOCE DA SOJA Tratamento de sementes de soja Percentual médio de nódulos por Nodulação precoce planta normalizado para controle β-1,4-endoglucanase E94 109% Mananase E177 109% Mananase E196 106%
[1886] Conforme mostrado na Tabela 64, o tratamento de sementes com mananase E177 resultou em um aumento de + 9% na contagem de nódulos por planta e o tratamento com mananase E196 resultou em um aumento de + 6% na contagem de nódulos por planta, em comparação com o controle negativo. A mananase E177 resultou em aumentos equivalentes na contagem de nódulos por planta em relação à β-1,4-endoglucanase E94. EXEMPLO 40: TRATAMENTO DE SEMENTES DE MILHO
COM ENZIMAS DEGRADADORAS DE PECTINA
[1887] Construtos que codificam proteínas de fusão contendo enzimas degradadoras de pectina foram preparados como descrito acima no Exemplo 26. Cada um dos construtos continha o promotor BclA (SEQ ID NO: 149), um códon de início, uma sequência de codificação para os aminoácidos 20-35 de BclA (aminoácidos 20-35 de SEQ ID NO: 1) e uma sequência de codificação para uma enzima degradadora de pectina. A enzima degradadora de pectina utilizada foi a seguinte:
[1888] 1. A pectina-liase de SEQ ID NO: 310 (CÓDIGO ID: E176); e
[1889] 2. O peptídeo sinal da SEQ ID NO: 346, diretamente ligado à endopoligalacturonase da SEQ ID NO: 309 (CÓDIGO ID: D405).
[1890] Esses construtos foram clonados no plasmídeo pBCm-BclA20-35 de resistência à tetraciclina descrito acima no Exemplo 30. Esses plasmídeos foram então transformados em Bacillus thuringiensis BT013A de tipo selvagem e os esporos foram gerados como descrito acima no Exemplo
26.
[1891] As sementes de milho (híbrido de Beck 5828 YH) foram tratadas como descrito no Exemplo 30 com 1 ml de cada uma das preparações de esporos da enzima degradadora de pectina. As sementes foram plantadas e as plantas foram cultivadas em uma sala de crescimento ambientalmente controlada nas mesmas condições descritas acima no Exemplo
27. Em duas wks, a altura das plantas foi medida e normalizada para controlar as plantas cultivadas a partir de sementes tratadas com água. Os resultados estão resumidos na Tabela 65 como a altura média da planta normalizada para controle em dois ensaios (18 plantas por ensaio). Ambas as enzimas degradadoras de pectina, E176 e D405, apresentaram efeitos semelhantes aos tratamentos de sementes no milho, resultando em um aumento de + 1% na altura da planta em comparação ao tratamento controle. TABELA 65. EFEITOS DO TRATAMENTO DE
SEMENTES COM ENZIMAS DEGRADADORAS DE PECTINA NA ALTURA
DAS PLANTAS DE MILHO Tratamento de sementes de milho Porcentagem média da altura da planta (cm) normalizada para controle Pectina-liase E176 101% Endopoligalacturonase D405 101% EXEMPLO 41: TRATAMENTO DE SEMENTES DE SOJA
COM ENZIMAS QUE DEGRADAM A PECTINA
[1892] Os construtos contendo as enzimas que degradam a pectina também foram testados quanto a seus efeitos na soja quando aplicadas como tratamento de sementes. As sementes de soja (MorSoy Xtra 38X52) foram tratadas como descrito no Exemplo 35 com 1 μl de cada uma das preparações de esporos de enzimas degradadoras de pectina ou com a preparação de esporos de β-1,4-endoglucanase E94 descrita acima no Exemplo 30. As sementes foram plantadas e as plantas foram cultivadas em uma sala de crescimento ambientalmente controlada sob as mesmas condições descritas acima no Exemplo 35. Em 4-5 wks, foram obtidas medidas de biomassa seca e nodulação e comparadas com plantas de controle cultivadas a partir de sementes tratadas com água. As Tabelas 66 e 67 resumem as medições normalizadas de biomassa e nodulação em média em três tentativas (18 plantas por tentativa).
[1893] As diferenças de peso seco para peso seco total e peso seco acima do solo ou biomassa (gramas) foram aumentadas durante o tratamento controle para ambas as enzimas degradadoras de pectina (E176 e D405). A pectina-liase (E176) aumentou a biomassa seca total em + 16% e a biomassa seca total acima do solo em + 25%, enquanto a endopoligalacturonase (D405) resultou em aumentos médios de + 25% para a biomassa seca total e um aumento de + 42% para biomassa seca total acima do solo em comparação com o tratamento controle (Tabela 66). A enzima β-1,4-endoglucanase (E94) aplicada como tratamento de sementes à soja resultou em um aumento positivo na biomassa seca total (+ 45%) e também na biomassa de soja seca acima do solo (+ 66%) em comparação com o tratamento de controle. TABELA 66. EFEITOS DO TRATAMENTO DE
SEMENTES COM ENZIMAS DEGRADADORAS DE PECTINA NO PESO SECO DA SOJA. Tratamento de sementes Porcentagem Média percentual Soja, Peso Seco média do peso acima do peso do solo total (g), (g), normalizada para normalizada para controle controle β-1,4-endoglucanase E94 145% 166% Pectina-liase E176 116% 125%
Endopoligalacturonase D405 125% 142%
[1894] As plantas de soja cultivadas a partir de sementes tratadas com β-1,4-endoglucanase E94 tiveram, em média, um aumento de + 9% nos nódulos por planta em comparação com as plantas controle cultivadas a partir de sementes tratadas com água (Tabela 67). O tratamento de sementes com a pectina-liase E176 resultou em um aumento médio de + 2% nos nódulos por planta em comparação com as plantas controle. TABELA 67. EFEITOS DO TRATAMENTO DE
SEMENTES COM ENZIMAS DEGRADADORAS DE PECTINA NA
NODULAÇÃO PRECOCE DA SOJA Tratamento de sementes Nódulos médios percentuais por planta, Nodulação precoce da soja normalizados para controle β-1,4-endoglucanase E94 109% Pectina-liase E176 102% Endopoligalacturonase D405 95% EXEMPLO 42: ATIVIDADE DA FOSFOLIPASE C EM ESPOROS.
[1895] Construtos que codificam proteínas de fusão contendo enzimas fosfolipase C (PLC) foram preparados como descrito acima no Exemplo 26. Cada um dos construtos continha o promotor BclA (SEQ ID NO: 149), um códon de início, uma sequência de codificação para os aminoácidos 20-35 de BclA (aminoácidos 20-35 de SEQ ID NO: 1) e uma sequência de codificação para um PLC. As enzimas PLC utilizadas foram as seguintes:
[1896] O peptídeo sinal da SEQ ID NO: 317, diretamente ligado à fosfolipase C da SEQ ID NO: 250 (CÓDIGOS ID: E95 e E62);
[1897] 1. A fosfolipase C da SEQ ID NO: 250, sem nenhum peptídeo sinal; e
[1898] 2. A fosfolipase C da SEQ ID NO: 251, sem nenhum peptídeo sinal.
[1899] 3. A SEQ ID NO: 251 não possui o propeptídeo que está presente na SEQ ID NO: 250 e, portanto, compreende apenas o domínio catalítico do PLC.
[1900] A Tabela 68 abaixo mostra os domínios incluídos nesses construtos e a Tabela 69 fornece uma representação da disposição dos domínios dentro de cada construto.
TABELA 68. DESIGNAÇÕES DE DOMÍNIO DE
ELEMENTO PARA CONSTRUTOS DE PLC Domínios de elemento de construto Abreviação de elemento promotor bclA (SEQ ID NO: 149) bclAP sequência de alvejamento bclA aa20–35 bclAt (aminoácidos 20–35 da SEQ ID NO: 1) peptídeo sinal plc (SEQ ID NO: 317) plc-sp propeptídeo plc (SEQ ID NO: 261) plc-pp domínio catalítico plc (SEQ ID NO: 251) plc-cc TABELA 69. CONSTRUTOS USADOS PARA
EXPRESSAR A FOSFOLIPASE C Tratamentos de fosfolipase C Descrições de construto Fosfolipase C E62 [bclAP::bclAt::plc-sp::plc-pp::plc-cc] Fosfolipase C E95 [bclAP::bclAt::plc-sp::plc-pp::plc-cc] Fosfolipase C E143 [bclAP::bclAt::plc-pp::plc-cc] Fosfolipase C E144 [bclAP::bclAt::plc-cc]
[1901] Os construtos E95, E143 e E144 foram clonados no plasmídeo pBCm-BclA20-35 de resistência à tetraciclina descrito acima no Exemplo 30. O construto E62 foi clonado no plasmídeo pBC-BclA20-35, que contém um pedaço adicional de 200 pb de DNA que é removido no pBCm e não agrega nenhum valor ao plasmídeo. Os plasmídeos resultantes foram então transformados em Bacillus thuringiensis BT013A e os esporos foram gerados como descrito acima no Exemplo 26.
[1902] A atividade das enzimas PLC sobre a superfície dos esporos foi então avaliada por medição da libertação de p-nitrofenol (PNP) a partir de um substrato p -nitrofenilfosforilcolina (NPPC) (Carbosynth, código do produto n° EN26341). O composto NPPC é incolor, enquanto o pNP é um verde- amarelo brilhante e pode ser quantificado espectrofotometricamente medindo sua absorção a 405-410 nm. A produção de um mol de pNP em um minuto é equivalente a 1 unidade de atividade de PLC.
[1903] Uma curva padrão foi gerada primeiro usando pNP disponível comercialmente (Acros Organics, código do produto n° 157050050). Para gerar a curva padrão, foram preparadas soluções contendo concentrações variáveis de pNP variando de 0,025 mM a 0,50 mM em tampão HEPES 100 mM, pH 7,0. A absorção de cada amostra a 405 nm foi então medida usando um espectrofotômetro. A curva padrão é mostrada na Figura 11. Na Figura 11, a linha pontilhada é uma linha artificial de melhor ajuste. Cada ponto de dados usado para criar a linha de melhor ajuste representa uma absorvância média (A405 nm) para três repetições de cada uma das soluções de amostra plotadas contra a concentração ajustada de pNP comercial.
[1904] Os esporos que expressam cada um dos construtos do PLC foram então incubados com 2,8 µmol do substrato NPPC em HEPES 100 mM, pH 7,0 por 180 minutos a 37 °C. Cada preparação de esporos continha, aproximadamente, 2 x 108 esporos. O substrato NPPC sozinho foi usado como controle negativo. A reação foi então parada pela adição de 200 µl de bicarbonato de sódio 0,1 M. A absorção de cada amostra a 405 nm foi então medida usando um espectrofotômetro. Os resultados são mostrados nas Figuras
12 e 13. A Figura 12 mostra a atividade dos construtos das enzimas E62, E143 e E144 em comparação com o controle negativo isolado de NPPC. A Figura 13 mostra a atividade do construto da enzima E143, medida em dois ensaios diferentes, em comparação com o controle negativo isolado de NPPC. EXEMPLO 43: TRATAMENTO DE SEMENTES DE SOJA COM FOSFOLIPASE C.
[1905] Os construtos de PLC descritos no Exemplo 42 acima também foram avaliados quanto aos seus efeitos na soja quando aplicadas como tratamento de sementes. As sementes de soja (híbrido de soja 297NR de Beck) foram tratadas como descrito acima no Exemplo 35, exceto que um volume de 0,5 ml de cada uma das preparações de esporos E62, E143 e E144 foi usado. As preparações de esporos continham 1,8-1,9 x 108 esporos por ml (a partir de culturas que resultaram em aproximadamente 99% de esporulação). As sementes de controle foram tratadas com esporos de Bacillus não transformados sem enzimas (E0) ou apenas com água. As sementes foram plantadas e as plantas foram cultivadas em uma sala de crescimento ambientalmente controlada. As sementes foram plantadas diretamente em vasos de 39,7 cm3 contendo o solo Timberline n° 13 combinado com o solo de envasamento MIRACLE-GRO na proporção de 1:4 e plantados a uma profundidade de 2,54 cm, com 2 sementes por vaso. Após o plantio, 50 ml de água em temperatura ambiente foram adicionados a cada vaso para permitir a germinação. Os vasos foram mantidos em uma sala de crescimento artificial iluminada, recebendo aproximadamente 300 µmol m -2 s-1 (fótons leves) por um ciclo de 12/12 luz/dia e uma faixa de temperatura noturna de 21 °C dia/15 °C. As plantas receberam os mesmos regimes de rega e fertilizantes.
[1906] A altura da planta foi medida em 4-5 wks. O crescimento da soja a partir de sementes que receberam a fosfolipase C (E62, E143, E144) foi comparado com o crescimento a partir de sementes tratadas apenas com esporos de Bacillus (E0). Os resultados estão resumidos na Tabela 70 como a altura média da planta normalizada para controlar plantas cultivadas a partir de sementes tratadas apenas com água. Todos os tratamentos, incluindo o tratamento de esporos sem enzima (E0), são relatados como normalizados para plantas que receberam o tratamento de sementes com controle de água isolado. Plantas de soja cultivadas a partir de sementes tratadas com as enzimas fosfolipase C (E62, E143, E144) ou apenas com esporos de Bacillus tiveram aumentos substanciais na altura das plantas em comparação com as plantas controle cultivadas a partir das sementes tratadas com água. O tratamento com fosfolipase C E143 teve o maior efeito, mostrando um aumento de + 88% na altura da planta em relação ao controle somente de água (Tabela 70).
TABELA 70. EFEITOS DO TRATAMENTO DE
SEMENTES COM PLC NA ALTURA DA PLANTA EM SOJA Tratamento de sementes de soja Porcentagem média da altura da planta (cm) normalizado para controle Esporos de Bacillus (sem enzima 126,2% EO) Fosfolipase C E62 131,8% Fosfolipase C E143 187,6% Fosfolipase C E144 160,6% EXEMPLO 44: TRATAMENTO DE FOSFOLIPASE D DE
MILHO E SOJA
[1907] Um construto que codifica uma proteína de fusão contendo uma enzima fosfolipase D (PLD) foi preparado como descrito acima no Exemplo 26. O construto continha o promotor BclA (SEQ ID NO: 149), um códon de início, uma sequência de codificação para os aminoácidos 20-35 de BclA (aminoácidos 20-35 de SEQ ID NO: 1) e uma sequência de codificação para um PLD (SEQ ID NO: 256; CÓDIGO ID: D409). O construto foi clonado no plasmídeo pBCm-BclA20-35 de resistência à tetraciclina descrito acima no Exemplo 30. Este plasmídeo foi então transformado em Bacillus thuringiensis BT013A de tipo selvagem e os esporos foram gerados como descrito acima no Exemplo 26.
[1908] Sementes de milho (híbrido 5828 YH) e sementes de soja (híbrido MorSoyXtra 38X52) foram tratadas como descrito acima nos Exemplos 30 e 35 usando 1 µl (aplicação padrão 1X) ou 2 µl (aplicação padrão
2X) da preparação de esporos. Como nos exemplos anteriores, as preparações de esporos continham 1,8-1,9 x 108 esporos/ml (a partir de culturas que resultam em cerca de 99% de esporulação). As sementes foram tratadas como descrito nos Exemplos 27 e 35. As sementes foram plantadas e cultivadas como descrito anteriormente no Exemplo 27 (para milho) ou Exemplo 35 (para soja) e as medidas de crescimento (altura da planta, biomassa seca, nodulação) foram realizadas em 2 wks (em milho) ou em 4-5 wks (soja). Dois ou três ensaios replicados foram realizados usando, em média, 18 plantas por ensaio e os resultados estão resumidos nas Tabelas 71–74. Os resultados foram normalizados para controles tratados com água. TABELA 71. EFEITOS DO TRATAMENTO DE
SEMENTES COM PLD NA ALTURA DAS PLANTAS DE MILHO Tratamento de sementes de Porcentagem média da altura da milho planta (cm), normalizada para controle (média de dois ensaios) Fosfolipase D409 (1 µl) 103% Fosfolipase D409 (2 µl) 99%
[1909] A fosfolipase D409 aplicada a uma taxa de uso de 1X nas sementes de milho proporcionou um aumento no crescimento do milho, medido por um aumento de + 3% na altura da planta em relação às plantas de controle cultivadas a partir de sementes tratadas com água (Tabela 71). TABELA 72. EFEITOS DO TRATAMENTO DE SEMENTES COM PLD NO PESO FRESCO DA SOJA (MÉDIA DE DOIS ENSAIOS) Tratamento de Peso médio Percentagem do Percentagem sementes total fresco em peso médio média acima Soja porcentagem (g) fresco da raiz (g) do solo, peso normalizado normalizado para fresco (g) para controle controle normalizado para controle Fosfolipase D 101% 94% 109% D409 1X (1 µl/semente) Fosfolipase D 108% 101% 117% D409 2X (2 µl/semente)
[1910] A fosfolipase D409 aplicada à taxa de uso 2X mais alta (2 µl/semente) nas sementes de soja resultou em um aumento incremental no peso fresco total, peso fresco da raiz e peso fresco acima do solo, em comparação com a semente tratada com o controle da água. Os maiores efeitos foram observados com o peso fresco acima do solo (um aumento de 17% sobre o controle) (Tabela 72). TABELA 73. EFEITOS DO TRATAMENTO DE
SEMENTES COM PLD NA ALTURA DA PLANTA EM SOJA Tratamento de sementes Porcentagem média da altura da planta Soja (cm), normalizada para controle (média de três tentativas) Fosfolipase D409, 1X 116% (1 µl/semente) Fosfolipase D409, 2X 117% (2 µl/semente)
[1911] A fosfolipase D (D409) aplicada às sementes de soja nas taxas de uso de 1X e 2X resultou em aumentos gerais semelhantes na altura da planta (+ 16% ou + 17%, respectivamente) em comparação com as sementes tratadas com o controle da água. Os dados mostrados são uma média de três tentativas (Tabela 73).
TABELA 74. EFEITOS DO TRATAMENTO DE
SEMENTES COM PLD NA NODULAÇÃO PRECOCE DA SOJA Tratamento de sementes Nódulos médios percentuais por planta, Soja, Nodulação Precoce normalizados para controle Fosfolipase D409, 1X 123% (1 µl por semente) Fosfolipase D409, 2X 118% (2 µl por semente)
[1912] Alterações na nodulação precoce, medidas por nódulos médios por planta de soja, foram comparadas usando tratamentos com fosfolipase D (D409) nas taxas de uso de 1X (1 µl/semente) e 2X (2 µl/semente).
Os nódulos foram contados em 12 plantas separadas por ensaio, em 4-5 wks. Plantas cultivadas a partir de sementes tratadas com fosfolipase D (D409) em qualquer taxa de uso mostraram um aumento nos nódulos por planta em comparação ao controle. Em média, as taxas de uso de 1X e 2X resultaram em um aumento de + 23% e + 18% na nodulação, respectivamente, sobre as plantas de controle (Tabela 74).
EXEMPLO 45: TRATAMENTO DE SEMENTES DE SOJA
E MILHO COM MÚLTIPLAS CLASSES DE ENZIMAS
[1913] As preparações de esporos, conforme descrito nos exemplos acima, contendo as enzimas descritas abaixo, foram aplicadas à soja (híbrido MorSoyXtra 38X52) (Tabelas 75-77) ou milho (híbridos de milho de Beck 5828 YH) (Tabelas 78-80). Os esporos foram tratados com 1 µl das preparações de esporos. Todas as sementes foram tratadas como descrito no Exemplo 30 (para milho) ou 35 (para soja). Todas as plantas foram cultivadas como descrito no Exemplo 27 (para milho) ou 35 (para soja). A altura das plantas de milho foi medida em duas wks (Tabelas 78–80). As medições de crescimento (biomassa, altura, nodulação) foram realizadas em 4-5 wks para a soja (Tabelas 75-77). Todas as medições são relatadas nas Tabelas 75–80 como médias ou como normalizadas para controlar plantas cultivadas a partir de sementes tratadas com água. Dois ou três ensaios replicados foram realizados usando, em média, 18 plantas por ensaio. TABELA 75. EFEITOS DO TRATAMENTO DE
SEMENTES COM VÁRIAS ENZIMAS NA NODULAÇÃO DA SOJA Tratamento de Número médio de Alteração percentual sementes de soja nódulos por planta nos nódulos conforme (DESVPAD) normalizada para controle Controle (Água) 9,8 (4,1) – β-1,4-endoglucanase E94 10,8 (5,13) + 10% Xilosidase E175 9,9 (3,83) + 1% Xilosidase E194 8,6 (5,98) –12% Mananase E177 10,6 (5,58) + 8% Mananase E196 10,4 (3,52) + 6%
Endopoligalacturonase 9,8 (4,56) – D405
[1914] A Tabela 75 resume o número médio de nódulos por planta registrados em 4-5 wks em plantas de soja cultivadas a partir de sementes tratadas com β-1,4-endoglucanase E94, xilosidase E175, xilosidase E194, mananase E177, mananase E196 ou endopoligalacturonase D405. A tabela calcula a média dos dados obtidos em 3 tentativas separadas com 16 plantas replicadas por tentativa, num total de 48 plantas. O tratamento de sementes utilizando as enzimas β-1,4-endoglucanase (E94) e mananase (E177 e E196) aumentou a contagem de nódulos por planta em + 10%, + 8% e + 6%, respectivamente, em comparação com as plantas controle cultivadas a partir de sementes tratadas com água.
TABELA 76. EFEITOS DO TRATAMENTO DE
SEMENTES COM VÁRIAS ENZIMAS NA BIOMASSA DE PESO SECO DA
SOJA Tratamento de sementes Peso Peso Peso Relação Soja Seco seco médio da entre o Médio médio raiz seca peso da acima (gramas) seco Planta do solo por planta acima do Total (gramas) solo e o (gramas) por peso por planta seco da planta raiz Controle (Água) 2,8 2,0 0,8 2,5 β-1,4-endoglucanase E94 4,0 3,4 0,6 5,6 Xilosidase E175 3,6 2,8 0,8 3,5 Xilosidase E194 2,5 1,9 0,6 3,2 Mananase E177 3,6 2,8 0,8 3,5 Mananase E196 3,1 2,4 0,7 3,4 Endopoligalacturonase D405 3,9 3,3 0,6 5,5
[1915] A Tabela 76 resume o peso seco total, o peso seco acima do solo e o peso seco das raízes de plantas de soja (híbrida MorSoyXtra 38X52) cultivadas a partir de sementes tratadas com β-1,4-endoglucanase E94, xilosidase E175, xilosidase E194, mananase E177, mananase E196 ou endopoligalacturonase D405. Os dados na Tabela 76 são médias dos dados registrados em 2 ensaios separados, com 16 plantas replicadas por ensaio, em um total de 32 plantas. Todas as enzimas testadas apresentaram melhorias na biomassa acima do solo (peso) em comparação com as plantas de controle. Além disso, a razão entre o peso seco acima do solo e o peso seco da raiz foi determinada para investigar mudanças na biomassa acima do solo e na biomassa radicular em resposta a tratamentos individuais. Essa proporção para as plantas que receberam o tratamento de controle de água é equivalente a 2,5. Todas as enzimas da Tabela 76 (E94, E175, E194, E196 e D405) resultaram em uma razão aumentada de peso seco acima do solo para peso seco da raiz em comparação com os controles tratados com água. Os maiores efeitos foram observados com o tratamento com β-1,4-endoglucanase E94 e endopoligalacturonase D405, que apresentaram proporções de 5,6 e 5,5 respectivamente, mais de duas vezes mais do que os controles (2,5).
TABELA 77. EFEITOS DO TRATAMENTO DE
SEMENTES COM VÁRIAS ENZIMAS NO PESO SECO TOTAL E NA
BIOMASSA SECA GLOBAL ACIMA DO SOLO DA SOJA Tratamento de sementes de soja Porcentagem Porcentagem Média de peso Média acima do seco da planta peso seco do solo Total (gramas) (gramas) por por planta planta Controle (Água) 100% 100% β-1,4-endoglucanase E94 168% 198% Xilosidase E175 132% 145% Xilosidase E194 110% 116% Mananase E177 136% 148% Mananase E196 124% 136% Endopoligalacturonase D405 151% 178%
[1916] A Tabela 77 resume o peso seco total e o peso seco acima do solo normalizado para controles para plantas de soja (híbrida MorSoyXtra 38X52) cultivadas a partir de sementes tratadas com β-1,4- endoglucanase E94, xilosidase E175, xilosidase E194, mananase E177,
mananase E196 ou endopoligalacturonase D405. Diferenças na quantidade de peso seco total da planta e peso seco acima do solo são relatadas em 2 ensaios com 18 plantas replicadas por ensaio. Os maiores aumentos comparativos entre as classes de enzimas foram observados na β-1,4-endoglucanase E94 e na endopoligalacturonase D405. Esses resultados apóiam ainda mais os aumentos da razão descritos acima na Tabela 76. TABELA 78. EFEITOS DO TRATAMENTO DE
SEMENTES COM VÁRIAS ENZIMAS NO CRESCIMENTO DE PLANTAS DE
MILHO Tratamento de Sementes, Milho Porcentagem média da altura da planta (cm), normalizada para controle β-1,4-endoglucanase E94 106% Xilosidase E175 106% Mananase E177 126% Mananase E196 115%
[1917] A Tabela 78 resume a altura média da planta registrada em duas wks para plantas de milho (híbrido de Beck 5828 YH) cultivadas a partir de sementes tratadas com β-1,4-endoglucanase E94, xilosidase E175, xilosidase E194, mananase E177, mananase E196. Os dados na tabela são médias de 2 tentativas com 18 plantas replicadas por tentativa. O tratamento das sementes de milho com as enzimas mananase E177 e E196 resultou em aumentos substanciais na altura das plantas, + 26% e + 15%, respectivamente, em comparação com as plantas de milho cultivadas a partir das sementes tratadas com água.
TABELA 79. A APLICAÇÃO DE ENZIMAS NO
TRATAMENTO DE SEMENTES AUMENTA A ALTURA DAS PLANTAS PARA
O MILHO Tratamento de Porcentagem média da altura da planta (cm) Sementes, Milho normalizada para controle Xilosidase E175 106% Mananase E177 126% Mananase E196 115%
[1918] A Tabela 79 resume outro estudo comparando a altura da planta em duas wks para plantas de milho (híbrido de Beck 5828) cultivadas a partir de sementes tratadas com xilosidase E175 e mananases E177 e E196. A tabela mostra a altura média da planta normalizada para controles tratados com água de 3 ensaios com 18 plantas replicadas por ensaio. O tratamento de sementes de milho para todas as enzimas testadas resultou em aumento da altura das plantas em comparação ao controle. Os tratamentos de sementes com as classes de mananase das enzimas E177 e E196 apresentaram os maiores efeitos, com aumentos respectivos de + 26% e + 15% na altura das plantas, em comparação com as plantas controle cultivadas a partir de sementes tratadas com água. EXEMPLO 46: EXPERIÊNCIAS DE RENDIMENTO
[1919] O efeito do tratamento de sementes, aplicação foliar ou tratamento de sulco no rendimento de milho e soja no campo será testado. Os canteiros de sementes de campo em uma variedade de locais no meio-oeste dos EUA serão preparados usando métodos convencionais ou de conservação para plantios de milho e soja. O fertilizante será aplicado conforme recomendado pelas práticas agrícolas convencionais e permanecerá consistente entre os locais do Centro-Oeste dos EUA. Os herbicidas serão aplicados no controle de plantas daninhas e suplementados com cultivo quando necessário.
[1920] Os híbridos de milho e soja serão tratados como sementes, em sulco ou por pulverização foliar com preparações de esporos preparadas conforme descrito nos Exemplos acima e contendo fosfolipase, β- 1,4-endoglucanase, ACC desaminase, liquenase, xiloglucanase, xilanase, xilosidase, mananase ou enzima degradadora de pectina.
[1921] O tratamento de sementes será realizado com um WINTERSTEIGER HEGE 11 (Wintersteiger AG, Áustria). A capacidade desta máquina de tratamento de sementes pode acomodar um grande número de diferentes tipos, tamanhos e quantidades de sementes (20–3.000 gramas). As sementes serão carregadas em tigelas do maquinário do tratador de sementes. A seleção da tigela depende da quantidade de sementes de tratamento necessária e do tamanho da tigela selecionada: tigela grande de 14,5 l (500–
3.000 g de sementes por revestimento); tigela média de 7 l (80-800 g de sementes por revestimento); e tigela pequena de 1 l (20–100 g de sementes por revestimento). Durante a operação, as sementes serão distribuídas em direção às periferias radiais das tigelas rotativas por meio de uma aplicação de força centrífuga com o dispositivo de revestimento centrífugo. O disco giratório localizado no fundo da tigela distribuirá o tratamento de sementes uniformemente sobre a semente. Nesse ponto, o ciclo de centrifugação começará, o que fará com que as sementes giram em torno do centro da tigela em um círculo para revestir uniformemente as sementes. O processo de semente que fornece um tratamento, revestimento ou curativo será iniciado após a dispersão uniforme da semente ao redor do espalhador. O material da amostra para tratamento de sementes (como um pó, semilíquido, líquido ou uma pasta) pode ser aplicado no disco rotativo, à medida que os discos estão girando dentro das tigelas rotativas usadas para distribuir o tratamento de sementes uniformemente para fornecer uma camada uniforme e vestir o superfície da semente.
[1922] Uma quantidade equivalente de cada preparação de esporos de aproximadamente 1 µl (aplicação padrão) será aplicada por cada semente. Um fluxo de ar constante será fornecido usando ar comprimido (2 a 6 barras) durante o revestimento das sementes para ajudar no revestimento uniforme das sementes na tigela. A quantidade de tempo para o revestimento da semente depende da quantidade da semente, da viscosidade do tratamento da semente e do tipo de semente usada no tratamento. Uma calculadora de tratamento de sementes será usada para ajustar todos os volumes, para a maioria das culturas principais e comercialmente cultivadas, e o tipo de tratamento de sementes que está sendo aplicado. Após o tratamento e a secagem das sementes, elas serão distribuídas em um(ns) recipiente(s) maior(es) de armazenamento. As sementes serão secas ao ar ou secas com uma corrente de ar contínua que passa sobre as sementes. As sementes serão transferidas para um recipiente ou saco separado para transporte, transferência ou armazenamento.
[1923] Após o tratamento, as sementes de milho e soja serão plantadas em campos devidamente preparados. As sementes de milho serão plantadas de 4 a 5 cm de profundidade para garantir o desenvolvimento normal das raízes. As sementes de milho serão plantadas de 28.000 a 32.000 plantas por acre com larguras de linha de 30 polegadas (76,2 cm) com espaçamento de aproximadamente 1,6 a 1,8 sementes por pé. As sementes de soja serão plantadas de 1,5 a 2 polegadas (3,81 a 5,08 cm) de profundidade para garantir o desenvolvimento normal das raízes. A semente de soja será plantada em aproximadamente 140.000 plantas por acre, com larguras de linhas de 30 polegadas (76,2 cm) com espaçamento de aproximadamente 7 a 8 sementes por pé (por 30,5 cm). Parcelas de duas linhas, 25 pés (7,62 m) de comprimento, serão plantadas em todos os locais (10 a 20). Cada híbrido será cultivado em pelo menos três parcelas separadas (réplicas) em cada local para contabilizar a variabilidade do campo.
[1924] Experimentos paralelos tratarão plantas com aplicação foliar ou tratamento no sulco usando as mesmas preparações de esporos. O rendimento (Bu/Ac) de cada cultura tratada com as enzimas promotoras de crescimento entregues como tratamentos de sementes, tratamentos foliares ou sulcos será relatado em cada local e em toda a localização. O rendimento será relatado como normalizado para as plantas de controle não tratadas e mostrado como um aumento ou uma diminuição no Bu/Ac em comparação com as plantas de controle que não receberam tratamento com uma enzima. EXEMPLO 47: USO DE VÁRIAS SEQUÊNCIAS DE
ALVEJAMENTO PARA EXPRESSAR ENDOGLUCANASE NA SUPERFÍCIE DE ESPOROS DE MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS.
[1925] O plasmídeo pSUPER foi gerado através da fusão do plasmídeo pUC57 (contendo uma cassete de resistência à ampicilina e uma origem de replicação ColE1) com o plasmídeo pBC16-1 de Bacillus cereus (contendo um gene de resistência à tetraciclina, gene de replicação repU e origem de replicação oriU). Este plasmídeo de 5,8 kb pode replicar-se em E. coli e Bacillus spp. e pode ser selecionado conferindo resistência aos antibióticos β- lactâmicos em E. coli e resistência à tetraciclina em Bacillus spp.
O plasmídeo pSUPER foi modificado pela inserção de um fragmento gerado por PCR que fundiu o promotor BclA (SEQ ID NO: 149), um códon de início, aminoácidos 20- 35 de BclA (aminoácidos 20-35 de SEQ ID NO: 1) e uma sequência ligante de polialanina (AAAAADLE; SEQ ID NO: 386) em estrutura com Bacillus subtilis 168 β-1,4-endoglucanase (o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 334, diretamente ligada à β-1,4-endoglucanase de SEQ ID NO: 293) resultando em um plasmídeo denominado pSUPER-BclA 20-35-Endo.
Para a substituição da sequência de alvejamento, o plasmídeo pSUPER-BclA 20-35-Endo foi submetido a PCR inverso para amplificar todo o esqueleto inteiro do plasmídeo, mas deixando de fora a sequência correspondente aos aminoácidos 20-35 do BclA.
Este produto de PCR inverso foi combinado com um produto de PCR contendo a região equivalente de cada uma das SEQ ID NOs: 5, 15, 25, 81, 85, 87 ou aminoácidos 20–33 da SEQ ID NO: 1. Assim, foram criados construtos que continham cada uma das seguintes sequências de alvejamento fundidas na estrutura com endoglucanase de Bacillus subtilis 168: (1) aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1; (2) SEQ ID NO: 381; (3) SEQ ID NO: 383; ou (4) SEQ ID NO: 382. Cada um desses construtos foi transformado em E. coli e plaqueado em placas de Petri de caldo Lysogeny mais ampicilina (100 µg/ml) para obter colônias únicas.
Colônias individuais foram usadas para inocular o caldo de Lisogenia mais ampicilina e incubadas durante a noite a 37 °C, 300 rpm.
Os plasmídeos das culturas resultantes foram extraídos usando o Sistema de Purificação de DNA Wizard Plus SV Minipreps (Promega Corporation). As concentrações de DNA desses extratos plasmídicos foram determinadas por espectrofotometria e os plasmídeos obtidos foram submetidos a digestões analíticas com combinações apropriadas de enzimas de restrição e depois visualizados por eletroforese em gel de agarose para investigar o tamanho do plasmídeo e a presença de características plasmáticas distintas.
Seções relevantes, tais como a cassete de expressão da β-1,4-endoglucanase, dos derivados pSUPER purificados foram posteriormente investigadas por sequenciação de Sanger.
Os plasmídeos pSUPER verificados foram introduzidos por eletroporação no Bacillus thuringiensis BT013A ou um derivado BT013A no qual o gene bclA nativo (knockout BclA, "BclA KO") foi removido do genoma por recombinação homóloga. As colônias transformadas únicas foram isoladas através de placas em placas de Petri com caldo nutritivo contendo tetraciclina (10 µg/ml). Colônias positivas individuais foram usadas para inocular caldo de infusão cerebral do coração contendo tetraciclina (10 µg/ml) e incubadas durante a noite a 30 °C, 300 rpm. O DNA genômico das culturas resultantes foi purificado e seções do plasmídeo pSUPER foram sequenciadas novamente para verificar a pureza genética das sequências fechadas. As colônias verificadas foram cultivadas durante a noite em caldo de infusão de coração cerebral com 10 µg/ml de tetraciclina e induzidas a esporular através da incubação em um meio mínimo à base de extrato de levedura. EXEMPLO 48: USO DE UMA CASSETE DE EXPRESSÃO À BASE DE TETRACICLINA PARA EXPRESSAR ENZIMAS (POR EXEMPLO, XILANASES) NA SUPERFÍCIE DOS ESPOROS DE MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS.
[1926] O plasmídeo pSUPER-BclA 20-35-Endo foi sujeito a PCR inverso para amplificar o esqueleto inteiro do plasmídeo, mas deixando de fora as sequências correspondentes ao peptídeo sinal e ao quadro de leitura aberto da β-1,4-endoglucanase. Este produto de PCR inverso foi combinado com um produto de PCR contendo uma sequência de nucleotídeos que codifica para uma das seguintes xilanases SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 273 (E232) ou uma fusão do peptídeo sinal de SEQ ID NO: 328 diretamente ligado à xilanase de SEQ ID NO: 268 (E100). Assim, foram criados construtos que continham quadros de leitura abertos para as seguintes sequências de aminoácidos fundidas no quadro com um códon de início, aminoácidos 20-35 de BclA (SEQ ID NO: 1), um ligante de polialanina (AAAAADLE; SEQ ID NO: 386) sequência e (1) SEQ ID NO: 268 (pSUPER-BclA 20-35-XynA_nosec); (2) SEQ ID NO: 273 (pSUPER-BclA 20-35-XynC); ou (3) SEQ ID NO: 328 diretamente ligada à SEQ ID NO: 268 (pSUPER-BclA 20-35-XynA) sob controle transcricional do promotor BclA. Esses construtos foram transformados em E. coli e plaqueados em placas de petri de caldo Lysogeny mais ampicilina (100 µg/ml) para obter colônias únicas. Colônias individuais foram usadas para inocular o caldo de Lisogenia mais ampicilina e incubadas durante a noite a 37 °C, 300 rpm. Os plasmídeos das culturas resultantes foram extraídos usando o Sistema de Purificação de DNA Wizard Plus SV Minipreps (Promega Corporation). As concentrações de DNA desses extratos plasmídicos foram determinadas por espectrofotometria. Os plasmídeos foram então submetidos a digestões analíticas com combinações apropriadas de enzimas de restrição e visualizados por eletroforese em gel de agarose para investigar o tamanho do plasmídeo e a presença de características plasmáticas distintas. Seções relevantes, tais como a cassete de expressão da xilanase, dos derivados pSUPER purificados foram ainda verificadas por sequenciação de Sanger. Os fragmentos de pBC (seção de pSUPER derivada de pBC16-1, incluindo o cassete de expressão BclA/xilanase) dos plasmídeos pSUPER criados foram amplificados por PCR e subsequentemente circularizados por ligação da extremidade cega. As ligações de pBC resultantes foram introduzidas por eletroporação em Bacillus thuringiensis BT013A. As colônias transformadas únicas foram isoladas através de placas em placas de Petri com caldo nutritivo contendo tetraciclina (10 µg/ml). Colônias positivas individuais foram usadas para inocular caldo de infusão cerebral do coração contendo tetraciclina (10 µg/ml) e incubadas durante a noite a 30 °C, 300 rpm. O DNA genômico das culturas resultantes foi purificado e o plasmídeo pBC foi sequenciado novamente para verificar a pureza genética das sequências clonadas. As colônias verificadas foram cultivadas durante a noite em caldo de infusão de coração cerebral com 10 µg/ml de tetraciclina e induzidas a esporular através da incubação em um meio mínimo à base de extrato de levedura. EXEMPLO 49: USO DE UM CASSETE DE EXPRESSÃO
COMPREENDENDO UM MARCADOR NÃO ANTIBIÓTICO SELECIONÁVEL PARA EXPRESSAR A FOSFOLIPASE C (PLC) NA SUPERFÍCIE DOS ESPOROS DE MEMBROS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS.
[1927] O plasmídeo pSUPER-BclA 20-35-Endo (ver acima) foi submetido a PCR inverso para amplificar todo o esqueleto plasmídico inteiro, mas deixando de fora a sequência do gene de resistência à tetraciclina.
Este produto de PCR inverso foi combinado com um produto de PCR contendo uma cassete de expressão de marcador selecionável não antibiótico.
O plasmídeo resultante foi sujeito a outro PCR inverso ajustado para amplificar todo o esqueleto do plasmídeo, mas deixando de fora as sequências correspondentes ao peptídeo sinal e ao quadro de leitura aberto da β-1,4-endoglucanase.
Este produto de PCR inverso foi combinado com um produto de PCR contendo uma sequência de nucleotídeos que codifica para uma fusão de SEQ ID NO: 317 e SEQ ID NO: 250 (designada como CÓDIGO ID: E80 quando expressa com o sistema de marcador selecionável não antibiótico). Assim, foi criado um construto que continha um códon de início, aminoácidos 20-35 de BclA (SEQ ID NO: 1), um ligante de alanina (AAAAAALE (SEQ ID NO: 387), conforme descrito na Tabela 80 abaixo), sequência fundida no tabela com fosfolipase C de Bacillus thuringiensis (o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 317, diretamente ligada à fosfolipase C da SEQ ID NO: 250) sob controle transcricional do promotor BclA.
Esse construto foi transformado em E. coli e plaqueado em placas de petri de caldo Lysogeny mais ampicilina (100 µg/ml) para obter colônias únicas.
Colônias individuais foram usadas para inocular o caldo de Lisogenia mais ampicilina e incubadas durante a noite a 37 °C, 300 rpm.
Os plasmídeos das culturas resultantes foram extraídos usando o Sistema de Purificação de DNA Wizard Plus SV Minipreps (Promega Corporation). As concentrações de DNA desses extratos plasmídicos foram determinadas por espectrofotometria.
Os plasmídeos foram então submetidos a digestões analíticas com combinações apropriadas de enzimas de restrição e visualizados por eletroforese em gel de agarose para investigar o tamanho do plasmídeo e a presença de características plasmáticas distintas.
Secções relevantes, tais como a cassete de expressão da fosfolipase, dos derivados pSUPER purificados foram ainda verificadas por sequenciação de Sanger.
O fragmento pBC (seção derivada de pBC16-1 de pSUPER incluindo cassete de expressão de BclA/fosfolipase) do plasmídeo pSUPER criado foi amplificado por PCR e subsequentemente circularizado por ligação da extremidade cega. A ligação de pBC resultante foi introduzida usando eletroporação em uma cepa derivada de Bacillus thuringiensis BT013A que havia sido modificada para apoiar o uso do marcador selecionável não antibiótico. Colônias únicas de transformações foram obtidas por placas em placas de petri com caldo mínimo. Colônias individuais foram usadas para inocular um caldo mínimo e incubadas durante a noite a 30 °C, 300 rpm. O DNA genômico das culturas resultantes foi purificado e o plasmídeo pBC foi sequenciado novamente para verificar a pureza genética. As colônias verificadas foram cultivadas durante a noite em um meio mínimo e induzidas a esporular através da incubação em um meio mínimo à base de extrato de levedura.
[1928] O nível de atividade dos membros da família Bacillus cereus recombinante que expressam proteínas de fusão contendo endoglucanases produzidas no Exemplo 47, a xilanase E100 produzida no Exemplo 48 ou a fosfolipase E80 produzida no presente exemplo (Exemplo 49) foram medidos e comparados com o nível de atividade dos membros da família recombinante Bacillus cereus expressando proteínas de fusão contendo liquenases; mananases; xiloglucanases; as enzimas E143, D473, D474, D475 e E258 fosfolipase C; enzimas fosfolipase D; xilosidases; pectolases; fosfatase ácida; fitase; e lactonase (todas preparadas usando o mesmo sistema de expressão descrito no Exemplo 48 e as sequências de ligação listadas na Tabela 80 abaixo); e uma ACC desaminase preparada como fragmentos de exosporium como descrito no Exemplo 26 e usando a sequência de ligação listada na Tabela 80 abaixo. Os ensaios de atividade para cada um desses tipos de enzimas foram descritos nos exemplos acima (por exemplo, Exemplo 29), exceto para medir a atividade da fosfolipase, xilanase, liquenase, xilosidase, enzimas pécticas, fitase, lactonase ou ACC desaminase descritas abaixo.
FOSFOLIPASE
[1929] A atividade da fosfolipase C (PLC) foi avaliada quantificando a liberação de p-nitrofenol usando p-nitrofenilfosforilcolina (NPPC; CAS n° 21064-69-7, Carbosynth EN26341) como substrato. Alíquotas (1 ml) das produções de esporos foram centrifugadas 5 min a 16.100 × g em uma microcentrífuga de mesa para granular os esporos. Os grânulos de esporos foram ressuspensos em 30 µl de água desionizada e transferidos para uma placa de PCR de 300 µl/poço e 96 poços. Trinta microlitros de tampão de reação (NPPC 20 mM, HEPES 200 mM, pH 7,0, D-sorbitol a 60% p/v) foram adicionados a cada poço e as reações foram incubadas a 37 °C em um termociclador de PCR por 45 min. Subsequentemente, 60 µl de tampão de bicarbonato de sódio 0,5 M contendo EDTA 25 mM foram adicionados para interromper as reações e desenvolver a cor. A placa de PCR foi centrifugada 5 min. a 2.272 × g em uma centrífuga de placa para granular os esporos. Os sobrenadantes foram transferidos para uma microplaca de 350 µl/poço de 96 poços de fundo plano e a absorbância a 405 nm foi medida usando um leitor de microplaca Synergy HTX (BioTek). A atividade de PLC foi quantificada por comparação com uma curva padrão de p- nitrofenol (CAS n° 100-02-7, Acros Organics 157050050), considerando o tempo de incubação. As amostras foram analisadas em triplicado.
XILANASE
[1930] A atividade da xilanase foi quantificada por um ensaio de redução de açúcar usando 4-O-metil-D-glucurono-D-xilano (MGX; CAS n° 9062-57-1, Sigma M5144) como substrato. Alíquotas (0,5-1 ml) das produções de esporos foram centrifugadas por 5 minutos a 16.100 × g em uma microcentrífuga de mesa para granular os esporos. Os grânulos de esporos foram ressuspensos em 60 µl de tampão de citrato 50 mM, pH 5,0 e transferidos para uma placa de PCR de 300 µl/poço de 96 poços. Oitenta microlitros de 0,5% de MGX em p/v (em água) foram adicionados a cada poço e as reações foram incubadas a 50 °C em um termociclador de PCR por 40 min. A placa foi colocada em gelo e 120 uL de reagente DNS (1% de ácido 3,5-dintrosalicílico em p/v, NaOH a 1%, 0,05% de Na2SO4, 0,2% de fenol, 18,2% de sal de Rochelle) foi adicionado. As reações foram subsequentemente incubadas a 100 °C por 10 min. em um termociclador de PCR. A placa de PCR foi centrifugada 5 min. a
2.272 × g em uma centrífuga de placa para granular os esporos. Os sobrenadantes foram transferidos para uma microplaca de 350 µl/poço de 96 poços de fundo plano e a absorbância a 540 nm foi medida usando um leitor de microplaca Synergy HTX (BioTek). A atividade da xilanase foi quantificada por comparação com uma curva padrão de glicose, considerando o tempo de incubação. As amostras foram analisadas em triplicado.
LIQUENASE
[1931] A atividade da liquenase foi quantificada por um ensaio de redução de açúcar usando β-D-glucano de cevada (CAS n° 9041-22- 9, Sigma G6513) como substrato. Alíquotas (1 ml) das produções de esporos foram centrifugadas por 5 minutos. a 16.100 × g em uma microcentrífuga de mesa para granular os esporos. Os grânulos de esporos foram ressuspensos em 60 µl de tampão HEPES 50 mM, pH 7,0 e transferidos para uma placa de PCR de 300 µl/poço de 96 poços. Oitenta microlitros de 0,5% de β-D-glucano em p/v (em água) foram adicionados a cada poço e as reações foram incubadas a 50 °C em um termociclador de PCR por 25 min. A placa foi colocada em gelo e 120 uL de reagente DNS (1% de ácido 3,5-dintrosalicílico em p/v, NaOH a 1%, 0,05% de Na2SO4, 0,2% de fenol, 18,2% de sal de Rochelle) foi adicionado. As reações foram subsequentemente incubadas a 100 °C por 10 min em um termociclador de PCR. A placa de PCR foi centrifugada por 5 min a 2.272 × g em uma centrífuga de placa para granular os esporos. Os sobrenadantes foram transferidos para uma microplaca de 350 µl/poço de 96 poços de fundo plano e a absorbância a 540 nm foi medida usando um leitor de microplaca Synergy HTX (BioTek). A atividade da liquenase foi quantificada por comparação com uma curva padrão de glicose, considerando o tempo de incubação. As amostras foram analisadas em triplicado.
XILOSIDASE
[1932] A atividade da xilosidase foi ensaiada através da quantificação de p-nitrofenol libertar usando p-nitrofenil-β-D-xilopiranosido (PNPX; CAS n° 2001-96-9, Sigma N2132) como um substrato. Alíquotas (50– 200 µl) das produções de esporos foram centrifugadas por 5 minutos a 16.100 × g em uma microcentrífuga de mesa para granular os esporos. Os grânulos de esporos foram ressuspensos em 50 µl de tampão de citrato 100 mM, pH 6,2 e transferidos para uma placa de PCR de 300 µl/poço de 96 poços. Cinquenta microlitros de 5 mM de PNPX (em água) foram adicionados a cada poço e as reações foram incubadas a 37 °C em um termociclador de PCR por 20 min. A atividade enzimática foi interrompida pela adição de 100 µl de etanol a 95%. Posteriormente, 50 µl de bicarbonato de sódio 0,5 M foram adicionados para o desenvolvimento da cor. A placa de PCR foi centrifugada por 5 min a 2.272 × g em uma centrífuga de placa para granular os esporos. Os sobrenadantes foram transferidos para uma microplaca de 350 µl/poço de 96 poços de fundo plano e a absorvância a 405 nm foi medida usando um leitor de microplacas Synergy HTX (BioTek). A atividade da xilosidase foi determinada por comparação com uma curva padrão de p- nitrofenol (CAS n° 100-02-7, Acros Organics 157050050), considerando o tempo de incubação. As amostras foram analisadas em triplicado.
ENZIMAS PÉCTICAS
[1933] A atividade de pectolase/poligalacturonase foi quantificada por um ensaio de redução de açúcar usando pectina de casca de citros (CAS n° 9000-69-5, Sigma P9135) como substrato. Alíquotas (0,5-1 ml) das produções de esporos foram centrifugadas por 5 minutos a 16.100 × g em uma microcentrífuga de mesa para granular os esporos. Os grânulos de esporos foram ressuspensos em 70 µl de tampão CHES 50 mM, pH 10,0 e transferidos para uma placa de PCR de 300 µl/poço e 96 poços. Trinta microlitros de água desionizada e 40 µl de pectina a 1% em p/v (em água) foram adicionados a cada poço e as reações foram incubadas a 50 °C em um termociclador de PCR por 45 min. A placa foi colocada em gelo e 120 uL de reagente DNS (1% de ácido 3,5-dintrosalicílico em p/v, NaOH a 1%, 0,05% de Na2SO4, 0,2% de fenol, 18,2% de sal de Rochelle) foi adicionado. As reações foram subsequentemente incubadas a 75 °C por 10 min. em um termociclador de PCR. A placa de PCR foi centrifugada por 5 min a 2.272 × g em uma centrífuga de placa para granular os esporos. Os sobrenadantes foram transferidos para uma microplaca de 350 µl/poço de 96 poços de fundo plano e a absorbância a 540 nm foi medida usando um leitor de microplaca Synergy HTX (BioTek). A atividade de pectolase/poligalacturonase foi quantificada por comparação com uma curva padrão de glicose, considerando o tempo de incubação. As amostras foram analisadas em triplicado.
FITASE
[1934] A atividade da fitase foi testada quantificando a liberação de p- nitrofenol usando fosfato de p- nitrofenil (pNPP; CAS n° 4264-83- 9, Sigma 487600-M) como substrato. As reações foram preparadas em gelo em tubos de 1,7 ml, cada reação continha 100 µl de produções completas de esporos, 100 µl de tampão Na-Acetato 200 mM (pH 5) e 30 µl de pNPP 30 mM (em água). Em seguida, as reações foram incubadas a 37 °C com agitação (800 rpm) por 30 min. Posteriormente, as reações foram colocadas no gelo e 100 µl de NaOH 1 M foram adicionados para desenvolver a cor amarela que o p- nitrofenol possui um pH alcalino. Os tubos foram então centrifugados 5 min a
16.100 × g em uma microcentrífuga de mesa para esporos de sedimentos, e 200 µl de sobrenadantes foram transferidos para uma microplaca de 350 µl/poço de 96 poços de fundo plano e a absorbância a 400 nm foi medida usando um Synergy HTX (BioTek) leitor de microplacas. A atividade da fitase foi determinada pela lei de Beer-Lambert e coeficiente de extinção a 400 nm de 18.000 M-1 cm-1. As amostras foram analisadas pelo menos em duplicado.
LACTONASE
[1935] Lactonase a atividade foi medida usando um bioensaio de pigmentação usando a cepa CV026 de Chromobacterium violaceum, um mutante que produz apenas o violaceína de pigmento púrpura em resposta à lactona exógena de homoserina (HSL). O HSL reagiu com amostras da enzima lactonase (H51), juntamente com o tratamento de controle BT013A E0 (cepa de fundo sem enzima) por 2 horas a 37 °C. As amostras foram congeladas a -80 °C para interromper a reação. As placas de petri de ágar LB- canamicina foram inoculadas uniformemente com uma cultura de CV026 que havia crescido em cultura líquida de LB-canamicina durante a noite. Um volume de 300 µl da cultura líquida contendo a produção da enzima e o controle BT013A foi espalhado sobre as placas de Petri de reação. Depois que o meio secou em placas de Petri, um volume de 1 µl dos produtos de reação descongelados foi aplicado em pontos pré-marcados nas placas de Petri. Os tratamentos foram aplicados em triplicado. Após a incubação durante a noite a 30 °C, foram tiradas imagens das placas de petri e a área de pigmentação roxa produzida por CV026 foi quantificada usando o ImageJ Software (Instituto Nacional de Saúde). Uma redução na pigmentação indicou que o HSL em uma dada reação havia sido degradado.
ACC DESAMINASE
[1936] A atividade da ACC desaminase foi avaliada medindo-se a quantidade de NADH (CAS n° 606-68-8, Sigma N8129) usada pela lactato desidrogenase (número CE 1.1.1.27, Sigma 10127230001) ao usar a- cetobutirato, produzido pela ACC desaminase após uma reação com ACC (CAS n° 22059-21-8, Sigma 149101-M) como substrato. Alíquotas de 0,9-1 ml de produção de esporos foram centrifugadas por 5 minutos a 14.000 rpm em uma microcentrífuga de mesa para granular os esporos. As pastilhas de esporos foram ressuspensas em 1 ml de tampão TRIS 100 mM, pH 8,0, e depois novamente centrifugadas a 14.000 rpm por 5 minutos para granular esporos. O sedimento de esporos foi então ressuspenso em 600 µl de tampão TRIS 100 mM, pH 8,0, 10 mM de ACC e 0,132 mM de NADH e 200 µl foram transferidos para 3 poços em uma placa de PCR de 300 µl/poço e 96 poços. Foram adicionados 5 U de lactato desidrogenase a cada poço e a mistura foi transferida para uma microplaca de 350 µl/poço de 96 poços de fundo plano e deixada reagir a 37 °C em um leitor de microplacas Synergy HTX (BioTek), fazendo leituras a 340 nm a cada 2 minutos por 1 hora. A atividade da ACC desaminase foi medida subtraindo as leituras de fundo, usando a lei de Beer-Lambert e o coeficiente de extinção NADH. As amostras foram analisadas em triplicado.
[1937] A Tabela 80 lista a atividade enzimática medida em cada lote de produção para essas séries de enzimas. TABELA 80. ENZIMAS CLONADAS E EXPRESSAS USANDO VÁRIAS ESTRUTURAS DE EXPRESSÃO PLASMÍDICA;
MARCADOR SELECIONÁVEL À BASE DE TETRACICLINA (PSUPER E PBC TETL) E NÃO ANTIBIÓTICO (PBC NASM) Enzima Nomenclatura Atividade Sequência Espinha Código ID: enzimática medida de dorsal do SEQ ID NO: Número CE do lote de alvejamento plasmídeo produção , proteína do de (mU/ml) exosporium expressão ou /cepa fragmento de proteína do exosporium (Ligador de alanina) β-1,4- EC 3.2.1.4 499,49 BclA20-35 pBC tetL endoglucanase mU/ml (aminoácidos /BT103A E94* 20-35 da Bacillus subtilis SEQ ID NO: estirpe 168 1) (SEQ ID NO: 334 (AAAAADLE; diretamente ligada SEQ ID NO: à SEQ ID NO: 386) 293) β-1,4- EC 3.2.1.4 260,09 BclA1-166 PBC tetL endoglucanase mU/ml (SEQ ID NO: /T103A E107* 383) Bacillus subtilis (AAAAADLE; estirpe 168 SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 334 386) diretamente ligada à SEQ ID NO: 293) β-1,4- EC 3.2.1.4 84,01 BclA1-296 pBC tetL endoglucanase mU/ml (SEQ ID NO: /BT103A E108 * 382) Bacillus subtilis (AAAAADLE; estirpe 168 SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 334 386) diretamente ligada à SEQ ID NO: 293) β-1,4- EC 3.2.1.4 98,05 CotY (SEQ pBC tetL endoglucanase mU/ml ID NO: 381) /BT103A E110 * (AAAAADLE; Bacillus subtilis SEQ ID NO: estirpe 168 386)
(SEQ ID NO: 334 diretamente ligada à SEQ ID NO: 293) Xiloglucanase EC 3.2.1.151 2,328 BclA20-35 pBC tetL E149 mU/ml (aminoácidos /BT103A Bacillus 20-35 da licheniformis SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 300) 1) (AAAAADLE; SEQ ID NO: 386) Xiloglucanase EC 3.2.1.151 245,387 BclA20-35 pBC tetL D381 mU/ml (aminoácidos /BT103A Paenibacillus 20-35 da pabuli SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 299) 1) (AAAAADLE; SEQ ID NO: 386) Mananase EC 3.2.1.78 27,203 BclA20-35 pBC tetL E177 mU/ml (aminoácidos /BT103A Bacillus subtilis 20-35 da estirpe 168 SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 308) 1) (AAAAADLE; SEQ ID NO: 386) Mananase EC 3.2.1.78 115,589 BclA20-35 pBC tetL E196 mU/ml (aminoácidos /BT103A Bacillus circulans 20-35 da (SEQ ID NO: 307) SEQ ID NO: 1) (AAAAADLE; SEQ ID NO: 386) Fosfolipase C EC 3.1.4.11 0,113 BclA20-35 pBC E80 mU/ml (aminoácidos NASM/Der (com sinal 20-35 da ivado secretor e SEQ ID NO: BT103A propeptídeo) 1) Bacillus (AAAAAALE; thuringiensis SEQ ID NO: (peptídeo sinal da 387) SEQ ID NO: 317 diretamente ligado à SEQ ID NO: 250) Fosfolipase C EC 3.1.4.11 0,203 BclA20-35 pBC tetL E143 mU/ml (aminoácidos BT103A (sem sinal 20-35 da secretório, com SEQ ID NO: propeptídeo) 1) Bacillus (AAAAAALE; thuringiensis SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 250) 387) Fosfolipase C EC 3.1.4.11 38,986 BclA20-35 pBC tetL D473 µU/ml (aminoácidos BT103A Listeria 20-35 da monocytogenes SEQ ID NO: (peptídeo sinal da 1) SEQ ID NO: 376 (AAAAADLE; diretamente ligado SEQ ID NO: à SEQ ID NO: 386) 373) Fosfolipase C EC 3.1.4.11 55,461 BclA20-35 pBC tetL D474 µU/ml (aminoácidos BT103A (propeptídeo + 20-35 da enzima) SEQ ID NO: Listeria 1) monocytogenes (AAAAADLE; (SEQ ID NO: 373) SEQ ID NO: 386) Fosfolipase C EC 3.1.4.11 116,582 BclA20-35 pBC tetL D475 µU/ml (aminoácidos BT103A (apenas domínio 20-35 da enzimático SEQ ID NO: Listeria 1) monocytogenes (AAAAADLE; (SEQ ID NO: 374) SEQ ID NO: 386) Fosfatidilinositol EC 3.1.4.11 Ativo BclA20-35 pBC tetL Fosfolipase C (aminoácidos BT103A E258 20-35 da Bacillus cereus SEQ ID NO: (peptídeo sinal da 1) SEQ ID NO: 377 (AAAAADLE; diretamente ligado SEQ ID NO: à SEQ ID NO: 386) 375) Fosfolipase D EC 3.1.4.4 Ativo BclA20-35 pBC tetL E229 (aminoácidos BT103A
Bacillus 20-35 da licheniformis SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 260) 1) (AAAAADLE; SEQ ID NO: 386) Fosfolipase D EC 3.1.4.4 Ativo BclA20-35 pBC tetL D409 (aminoácidos BT103A Streptomyces 20-35 da chromofuscus SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 256) 1) (AAAAADLE; SEQ ID NO: 386) Xilanase EC 3.2.1.8 0,974 BclA20-35 pBC tetL E100 mU/ml (aminoácidos BT103A Bacillus subtilis 20-35 da estirpe 168 SEQ ID NO: (peptídeo sinal da 1) SEQ ID NO: 328 (AAAAADLE; diretamente ligado SEQ ID NO: à xilanase da SEQ 386) ID NO: 268) Xilanase EC 3.2.1.8 1,932 BclA20-35 pBC tetL E146 mU/ml (aminoácidos BT103A Bacillus subtilis 20-35 da estirpe 168 SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 268, 1) sem peptídeo (AAAAADLE; sinal) SEQ ID NO: 386) Xilanase EC 3.2.1.8 5,412 BclA20-35 pBC tetL E232 mU/ml (aminoácidos BT103A Bacillus subtilis 20-35 da estirpe 168 SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 273) 1) (AAAAADLE; SEQ ID NO: 386) Liquenase EC 3.2.1.73 6,922 BclA20-35 pBC tetL E111 mU/ml (aminoácidos BT103A Bacillus subtilis 20-35 da estirpe 168 SEQ ID NO: (peptídeo sinal da 1) SEQ ID NO: 335 diretamente ligado à SEQ ID NO: (AAAAADLE; 295) SEQ ID NO: 386) Licenase (β-1,3- EC 3.2.1.73 5,334 BclA20-35 pBC tetL 1,4- mU/ml (aminoácidos BT103A endoglucanase) 20-35 da licB D436 SEQ ID NO: Clostridium 1) thermocellum (AAAAADLE; ATCC 27405 SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 296) 386) Xilosidase EC 3.2.1.37 14,265 BclA20-35 pBC tetL E175 mU/ml (aminoácidos BT103A Bacillus subtilis 20-35 da estirpe 168 SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 276) 1) (AAAAADLE; SEQ ID NO: 386) Xilosidase EC 3.2.1.37 6,564 BclA20-35 pBC tetL E194 mU/ml (aminoácidos BT103A Bacillus pumilis 20-35 da (SEQ ID NO: 275) SEQ ID NO: 1) (AAAAADLE; SEQ ID NO: 386) Pectina-liase EC 4.2.2.10 2,744 BclA20-35 pBC tetL E176 mU/ml (aminoácidos BT103A (SEQ ID NO: 310) 20-35 da SEQ ID NO: 1) (AAAAADLE; SEQ ID NO: 386) Endopoligalacturo EC 3.2.1.15 1,203 BclA20-35 pBC tetL nase mU/ml (aminoácidos BT103A D405 20-35 da Aspergillus niger SEQ ID NO: cepa SC323 1) (peptídeo sinal da (AAAAADLE; SEQ ID NO: 346 SEQ ID NO: diretamente ligado 386) à SEQ ID NO: 309)
Fitase EC 3.1.3.8 19 U/BclA20-35 pBC tetL E246 ml(aminoácidos BT103A Bacillus subtilis 20-35 da estirpe 168 SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 380) 1) (AAAAADLE; SEQ ID NO: 386) Lactonase EC 3.1.1.81 Ativo BclA20-35 pBC tetL H51 (aminoácidos BT103A Bacillus 20-35 da thuringiensis cepa SEQ ID NO: B184 1) (SEQ ID NO: 277) (AAAAADLE; SEQ ID NO: 386) ACC desaminase EC 3.5.99.7 0,92 BclA20-35 pBC tetL D406 mU/ml (aminoácidos BT013A (SEQ ID NO: 249) 20-35 da knockout Bacillus SEQ ID NO: ExsY thuringiensis 1) (AAAAADLE; SEQ ID NO: 386) Fosfatase ácida EC 3.1.3.2 0,75 BclA20-35 pBC tetL E252 mU/ml (aminoácidos BT103A Bacillus 20-35 da thuringiensis SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 378) 1) (AAAAADLE; SEQ ID NO: 386) * As β-1,4-endoglucanases designadas como E94, E107, E108 e E110 contêm o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 334 diretamente ligado à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 293, mas diferem em relação à sequência de alvejamento, proteína do exosporium, ou fragmento de proteína do exosporium usado para alvejar a endoglucanase para o exosporium da seguinte forma: E94 contém BclA20-35 (aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1); E107 contém BclA1- 166 (SEQ ID NO: 383); E108 contém BclA1-296 de comprimento total (SEQ ID NO: 382); E110 contém CotY (SEQ ID NO: 381).
EXEMPLO 50: EFEITOS DOS TRATAMENTOS
ENZIMÁTICOS FORNECIDOS COMO TRATAMENTO DE SEMENTES NA RESPOSTA DO CRESCIMENTO DAS PLANTAS NO MILHO
[1938] Os membros da família Bacillus cereus recombinante que expressam proteínas de fusão contendo uma xiloglucanase, uma mananase, uma xilanase ou uma xilosidase foram preparados usando os métodos descritos acima no Exemplo 48 e foram entregues como tratamentos de sementes em sementes de milho (híbrido de milho de Beck 5828 YH) usando o volumes (µl) aplicados às camadas externas de cada semente como tratamento de sementes e indicados na Tabela 81-84. Cada enzima foi preparada em caldo de células inteiras que foi coletada e utilizada nas experiências. Um controle de tipo selvagem (cepa hospedeira não transformada de B. thuringiensis BT013A (E0; controle sem enzimas) também foi aplicado às sementes usando um volume de 1 µl por semente e usado como comparação de controle para os tratamentos enzimáticos Semente de milho que recebeu a semente os tratamentos com xiloglucanase, mananase, xilanase, xilosidase e os tratamentos de controle E0 foram então plantados em vasos de 4 x 4 cm preenchidos com solo Timberline 18 com duas sementes cada plantadas por vaso e inicialmente regadas com 50 ml de água para promover a germinação. Duas réplicas usando 18 sementes por cada tratamento por réplica foram colocadas em uma sala de crescimento ambientalmente controlada e randomizadas usando um delineamento em blocos ao acaso. As plantas foram cultivadas sob níveis de luz de aproximadamente 300 µmol m -2 s-1 e um fotoperíodo de 13 horas (ciclo de 13/11 dia/noite). As plantas foram mantidas a 23,9 °C durante as horas de luz e a 18,3 °C durante as horas de escuridão. A altura da planta (um indicador da taxa de crescimento da planta) foi medida 15 dias após o plantio (DAP) ou aproximadamente no estágio de crescimento do desenvolvimento V3 para capturar o vigor inicial da planta. Uma altura média da planta por cada tratamento enzimático foi normalizada para plantas cultivadas a partir de sementes que receberam e o controle E0 foi fornecido à semente usando um volume de 1 µl. Os resultados dos tratamentos com sementes das enzimas xiloglucanase, mananase, xilanase e xilosidase na taxa de crescimento do milho, conforme indicado pelas mudanças na altura da planta, são comparados ao controle E0 (sem enzima) mostrado na Tabela 81-84.
[1939] As xiloglucanases D381 e E149 aplicadas como tratamento de sementes no milho resultaram em um aumento nas taxas de crescimento durante os estágios iniciais do desenvolvimento do milho, conforme indicado por uma porcentagem aumentada da altura média da planta normalizada para plantas cultivadas a partir de sementes que receberam tratamento de controle de água (Tabela 81). Em geral, a altura da planta aumentou com o aumento dos volumes das enzimas xiloglucanase aplicadas de 1 µl a 3 µl à semente antes do plantio. Os tratamentos com sementes que receberam os 3 µl das enzimas xiloglucanase (D381 ou E149) resultaram nos maiores aumentos na altura das plantas conforme normalizado para o controle da água e comparado ao controle E0, que geralmente era comparável ao controle da água nas duas repetições utilizadas nos ensaios. O tratamento de sementes de milho usando a xiloglucanase D381 (SEQ ID NO: 299) aplicado usando o volume de tratamento de 3 µl por semente exibiu aumentos ligeiramente maiores na altura da planta em V3 (15 DAP) em comparação com a xiloglucanase E149 (SEQ ID NO: 300), um aumento de 2,4%. TABELA 81. TRATAMENTO DE SEMENTES COM XILOGLUCANASE, EFEITO NA ALTURA DAS PLANTAS PARA MILHO* Tratamento de sementes Volume Porcentagem Porcentagem Porcentagem de milho Altura média Altura média Média da da planta da planta (cm) altura da (cm) Normalizada planta (cm) Normalizada para controle Normalizada para controle Réplica 2 para Réplica 1 controlar a média experimental Controle E0 1 µl 98,9% 103,2% 101,1% (B. thuringiensis BT013A) Xiloglucanase D381 1 µl 102,2% 101,9% 102,1% (SEQ ID NO: 299) 2 µl 104,2% 105,0% 104,6% 3 µl 104,6% 110,9% 107,8% Xiloglucanase E149 1 µl 103,8% 101,9% 102,9%
(SEQ ID NO: 300) 2 µl 102,2% 108,2% 105,2% 3 µl 102,3% 108,5% 105,4% * Normalizado para plantas cultivadas a partir de sementes que receberam o tratamento de controle de água (1 µl por semente).
[1940] O tratamento de sementes de milho usando mananases (E196 e E177) resultou em aumento das taxas de crescimento, conforme indicado pelo aumento da altura das plantas quando comparado às plantas cultivadas a partir de sementes que receberam o tratamento de controle de água ou o controle BT013A E0 (sem enzima), conforme mostrado na Tabela
82. As plantas que foram cultivadas a partir de sementes tratadas com o controle E0 não apresentaram diferenças substanciais na altura da planta (cm) em comparação com as cultivadas a partir de sementes que receberam o controle da água para os dois tratamentos repetidos no ensaio. O tratamento de sementes com mananase E196 (SEQ ID NO: 307) resultou em plantas com aumento da altura das plantas observadas com o aumento da dose da enzima de 1 µl para 3 µl com o volume de 3 µl aplicado como tratamento de sementes, que produziu o maior aumento de altura, um aumento de + 7% sobre as plantas de controle (cultivadas a partir de sementes tratadas com água). A mananase E177 (SEQ ID NO: 308) aplicada como tratamento de sementes também resultou em plantas de milho com uma taxa de crescimento ou altura de plantas aumentada em comparação com as plantas de controle (cultivadas a partir de sementes tratadas com água). Os maiores aumentos globais na altura das plantas foram de sementes tratadas com mananase E177 (1 µl de enzima aplicada à semente), um aumento de + 8% em relação às plantas de controle.
TABELA 82. TRATAMENTO DE SEMENTES COM MANANASE, EFEITO NA ALTURA DAS PLANTAS PARA MILHO * Porcentagem Porcentagem Porcentagem Altura média da Altura média da Média da altura Tratamento de planta (cm) planta (cm) da planta (cm) Volume sementes de Normalizada Normalizada para Normalizada milho para controle para controlar a Controle Réplica 2 média Réplica 1 experimental Controle E0 (B. thuringiensis 1 µl 102,3% 98,6% 100,6% BT013A) Mananase E196 1 µl 107,1% 101,3% 104,1% (SEQ ID NO: 2 µl 104,7% 105,5% 105,1% 307) 3 µl 111,1% 102,8% 107,0% Mananase E177 1 µl 111,6% 104,6% 108,1% (SEQ ID NO: 2 µl 108,6% 101,4% 105,0% 308) 3 µl 106,5% 103,7% 105,1%
[1941] Normalizado para plantas cultivadas a partir de sementes que receberam tratamento de controle de água (1 µl)
[1942] Os tratamentos de sementes aplicados às sementes de milho usando as enzimas xilanase (E100, E146 e E232) também resultaram em plantas de milho com altura de planta aumentada em comparação ou normalizadas com as plantas cultivadas a partir de sementes que o controle E0 (1 µl) e avaliadas usando duas repetições do mesmo julgamento (Tabela 83). Geralmente, os volumes de enzimas aplicados à semente usando 1 µl ou 2 µl resultaram em aumentos semelhantes na altura da planta. As sementes que receberam a xilanase E232 (SEQ ID NO: 273) resultaram em maior altura de planta aumentada, + 4% (1 µl) e + 5% (2 µl) aumentaram ou normalizaram as plantas cultivadas a partir da semente tratada com E0.
TABELA 83. TRATAMENTO DE SEMENTES COM XILANASE, EFEITO NA ALTURA DAS PLANTAS PARA MILHO* Tratamento de Volume Porcentagem Porcentagem Porcentagem sementes de milho Altura média Altura média Altura média da planta (cm) da planta (cm) da planta (cm) Normalizada Normalizada Normalizada para controle para E0 para controle Réplica 1 Controle E0 Réplica 2 Média do teste Controle E0 1 µl 100,0% 100,0% 100,0% (B. thuringiensis BT013A) Xilanase E100 1 µl 99,3% 104,7% 102,0% (peptídeo sinal da 2 µl 96,8% 108,2% 102,5% SEQ ID NO: 328 diretamente ligado à SEQ ID NO: 268) Xilanase E146 1 µl 101,4% 105,3% 103,4% (SEQ ID NO: 268) 2 µl 101,9% 102,7% 102,3% Xilanase E232 1 µl 104,0% 104,3% 104,2% (SEQ ID NO: 273) 2 µl 105,2% 104,8% 105,0% * Normalizado para plantas cultivadas a partir de sementes tratadas com o controle E0 (1 µl)
[1943] Em um experimento separado, utilizando a xilosidase como tratamento de sementes no milho (híbrido de milho 5828 YX de Beck), uma abordagem semelhante foi seguida em relação às condições de crescimento e à randomização dos tratamentos nos ensaios, conforme descrito anteriormente. Neste experimento, sementes de milho que receberam o tratamento de sementes com xilosidase e o correspondente tratamento de controle E0 foram então plantadas em vasos de 4 x 4 cm preenchidos com uma mistura 2: 1 Timberline 20 de solo para lixar para simular os efeitos iniciais do crescimento das plantas de milho cultivado em um solo do tipo argamassa arenosa. Um ensaio de três réplicas usando 18 plantas por cada tratamento por réplica foi cultivado sob condições ambientais de controle, como descrito acima. A altura da planta (um indicador da taxa de crescimento da planta) foi medida 15 dias após o plantio (DAP) para capturar o vigor precoce da planta. Uma altura média da planta (cm) foi calculada para cada tratamento enzimático e normalizada para um controle de água (fornecido usando um volume de 1 µl). Os resultados dos tratamentos com sementes da enzima xilosidase e o controle E0 nas taxas de crescimento do milho são representados como a alteração média na altura da planta em comparação com o controle da água em média para as três repetições e mostrado na Tabela 84. TABELA 84. TRATAMENTO DE SEMENTES COM XILOSIDASE, EFEITO NA ALTURA DAS PLANTAS DE MILHO Porcentagem média da Tratamento de sementes de milho Volume altura da planta (cm) normalizada para Controle* Controle E0 (B. thuringiensis BT013A) 1 µl 101,9% 1 µl 104,9% Xilosidase E194 (SEQ ID NO: 275) 2 µl 103,2% 3 µl 103,1% 1 µl 103,3% Xilosidase E175 (SEQ ID NO: 276) 2 µl 102,5% 3 µl 106,1% * Média de 3 repetições; 18 sementes por replicado; Normalizado para plantas cultivadas a partir de sementes tratadas com um controle de água (1 µl)
[1944] Os tratamentos de sementes de milho utilizando as enzimas xilosidase (E194 e E175) aplicadas usando volumes variados de 1 µl a 3 µl resultaram em benefícios positivos de crescimento para plantas de milho V3 (15 DAP). O tratamento de sementes com xilosidase E194 resultou em plantas com alturas aumentadas em comparação com as plantas cultivadas a partir de sementes que receberam os tratamentos de controle de água ou E0, no entanto, alterar o volume da enzima usada como tratamento de sementes não teve um efeito geral no aumento da altura em o estágio V3 de desenvolvimento. No entanto, o tratamento de sementes com xilosidase E175 resultou em plantas com altura aumentada com o tratamento enzimático de maior volume de 3 µl e resultou em um aumento de + 6% na altura da planta em relação às plantas de controle de água em comparação com as três repetições no ensaio. EXEMPLO 51: TRATAMENTO NO SULCO, EFEITO NO
CRESCIMENTO DO MILHO
[1945] Os membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressam proteínas de fusão contendo enzimas (xiloglucanase D381 (SEQ ID NO: 299)) e fosfolipase C E143 (SEQ ID NO: 250) foram preparados como descrito acima nos Exemplos 48 e Tabela 80 e foram entregues como tratamento de sulco na área circundante às sementes de milho (híbrido de milho de Beck 5828 YH). As sementes de milho foram plantadas em vasos de 4 x 4 cm preenchidos com solo superficial 2: 1 Timberline 20 para lixar com duas sementes cada uma plantada por vaso. Os tratamentos enzimáticos, conforme descrito nas Tabelas 85-89, foram aplicados usando 1X (3,5 µl de enzima em 1 ml de água); 2X (7,0 µl de enzima em 2 ml de água); ou 3X (10,5 µl de enzima em 3 ml de água) e comparado ao controle de tipo selvagem (B. thuringiensis BT013A (E0; sem enzima) aplicado usando um tratamento 1X. Duas a três repetições em um ensaio experimental, conforme indicado, foram realizadas para cada ensaio em sulco, com 18 plantas replicadas por replicado. As sementes foram colocadas em uma sala de crescimento ambientalmente controlada. Os tratamentos foram distribuídos aleatoriamente no local, utilizando um delineamento em blocos casualizados. Todos os tratamentos foram aplicados na área do solo diretamente ao redor de cada semente após o plantio, mas antes de cobrir a semente com o solo. Cada vaso foi inicialmente regado com 50 ml de água para promover a germinação. Após a germinação, as plantas foram regadas usando regimes consistentes para todos os tratamentos em sulco. As plantas foram cultivadas sob níveis de luz de aproximadamente 300 µmol m -2 s -1 (fótons leves) e um fotoperíodo de 13 horas (13/11 dia/noite). As plantas foram mantidas a 23,9 °C durante as horas de luz e a 18,3 °C durante as horas de escuridão. A altura da planta (um indicador da taxa de crescimento da planta) foi medida aproximadamente 10 dias após o plantio (DAP) ou no estágio V2 do desenvolvimento para capturar o vigor precoce da planta. Uma altura média da planta por cada tratamento enzimático foi normalizada para as plantas cultivadas a partir de sementes que receberam um tratamento de aplicação 1X com água. Os efeitos dos vários tratamentos enzimáticos em sulco na taxa de crescimento do milho ou na altura da planta (cm) são mostrados para as combinações individuais de enzimas e enzimas nas Tabelas 85-89.
[1946] As diferenças de altura das plantas para os tratamentos em sulco usando as enzimas xiloglucanase (E149 e D381) e uma enzima fosfolipase C (E143) são relatadas nas Tabelas 85 e 86. Volumes de tratamentos de aplicação de 1X, 2X e 3X das enzimas de produção foram aplicados na área do solo diretamente ao redor de cada semente. As medidas de crescimento e altura das plantas (cm) foram comparadas para os tratamentos em sulco, utilizando as enzimas xiloglucanase e fosfolipase C ou combinações das duas enzimas aplicadas em conjunto. As diferenças de altura das plantas para os tratamentos enzimáticos foram comparadas às plantas cultivadas a partir de sementes que receberam tratamento usando a cepa hospedeira não transformada de controle do tipo selvagem (B. thuringiensis BT013A; E0).
[1947] A xiloglucanase (D381) e a fosfolipase C (E143) foram aplicadas individualmente e em tratamentos combinados (Tabela 85). As aplicações em sulco de xiloglucanase e fosfolipase C aplicadas como combinação resultaram em maiores aumentos no crescimento inicial das plantas, medidos pela mudança na altura da planta (cm) em comparação com o controle do tipo selvagem (B. thuringiensis BT013A; E0); (normalizado para 100%). Aumentar a concentração de xiloglucanase aplicada em combinação com fosfolipase C de 1X para 3X resultou em um aumento de quase + 7% na altura das plantas em relação às plantas que foram cultivadas a partir de sementes tratadas com o controle E0. Da mesma forma, aumentar a concentração de fosfolipase C aplicada no sulco (2X e 3X) usada em combinação com a xiloglucanase (1X) resultou em aumentos na taxa de crescimento ou altura da planta em comparação com as aplicações 1X usando as duas enzimas aplicadas separadamente como tratamentos no sulco ou plantas cultivadas a partir de sementes de controle E0 (mostradas na Tabela 85). TABELA 85. EFEITOS DA XILOGLUCANASE (D381)
USADA EM COMBINAÇÃO COM O EFEITO DA FOSFOLIPASE C NA ALTURA DA PLANTA PARA MILHO, TRATAMENTO NO SULCO Porcentagem Média da altura da planta (cm), Tratamento de Milho Normalizada para controle EO (sulco)* Xiloglucanase D381 (SEQ ID NO: 299) (1X) 103,2% Fosfolipase C E143 (SEQ ID NO: 250) (1X) 102,1% Xiloglucanase D381 (SEQ ID NO: 299) (1X) + Fosfolipase C E143 (SEQ ID NO: 250) 102,7% (1X) Xiloglucanase D381 (SEQ ID NO: 299) (2X) + Fosfolipase C E143 (SEQ ID NO: 250) 103,7% (1X) Xiloglucanase D381 (SEQ ID NO: 299) (3X) + Fosfolipase C E143 (SEQ ID NO: 250) 106,8% (1X) Xiloglucanase D381 (SEQ ID NO: 299) (1X) + Fosfolipase C E143 (SEQ ID NO: 250) 105,8% (2X) Xiloglucanase D381 (SEQ ID NO: 299) (1X) + Fosfolipase C E143 (SEQ ID NO: 250) 103,0% (3X) * Média de duas repetições; 18 plantas por replicado
[1948] Em outro experimento, tratamentos com xiloglucanase (E149) e fosfolipase C (E143) foram aplicados como tratamentos de sulco ao milho e comparados ao controle do tipo selvagem (B. thuringiensis BT013A (E0) (normalizado a 100%). Os resultados estão representados na Tabela 86. As aplicações das enzimas xiloglucanase e fosfolipase C, quando aplicadas individualmente, resultaram em aumento das taxas de crescimento inicial das plantas ou no aumento da altura das plantas, em comparação com as plantas cultivadas a partir de sementes que receberam o tratamento de sulco com o controle E0. Além disso, as aplicações selecionadas no sulco usando os tratamentos combinados de xiloglucanase e fosfolipase C (1X E149: 1X E143; 3X E149: 1X E143; 1X E149: 2X E143) resultaram em aumento da taxa média de crescimento das plantas em relação a qualquer um dos tratamentos enzimáticos aplicados individualmente e comparado ao crescimento de plantas cultivadas a partir de sementes que receberam o tratamento E0 em sulco (1X). O maior aumento na altura da planta resultou em milho que recebeu o tratamento combinado de sulco da xiloglucanase E149 (1X) e fosfolipase C E143 (2X), um aumento de + 6% em relação às plantas cultivadas a partir da semente tratada com controle E0. TABELA 86. EFEITOS DA XILOGLUCANASE (E149)
USADA EM COMBINAÇÃO COM O EFEITO DA FOSFOLIPASE C NA ALTURA DA PLANTA PARA MILHO, TRATAMENTO NO SULCO Tratamento de Milho Porcentagem média da Altura da planta (cm), normalizada para controle (sulco)* Xiloglucanase E149 (SEQ ID NO: 300) (1X) 104,2% Fosfolipase C E143 (SEQ ID NO: 250) (1X) 103,7% Xiloglucanase E149 (SEQ ID NO: 300) (1X) 105,2% + Fosfolipase C E143 (SEQ ID NO: 250) (1X) Xiloglucanase E149 (SEQ ID NO: 300) (2X) 102,8% + Fosfolipase C E143 (SEQ ID NO: 250) (1X) Xiloglucanase E149 (SEQ ID NO: 300) (3X) 104,6% + Fosfolipase C E143 (SEQ ID NO: 250) (1X) Xiloglucanase E149 (SEQ ID NO: 300) (1X) 106,0% + Fosfolipase C E143 (SEQ ID NO: 250) (2X) * Média de duas repetições; 18 plantas por replicado
[1949] A mananase E177 (SEQ ID NO: 308) (preparada como descrito no Exemplo 48) aplicada como um tratamento em sulco resultou em maior crescimento no início da estação, caracterizado por um aumento na altura da planta no estágio V3 do desenvolvimento do milho. As enzimas mananase E177 e fosfolipase C E143 aplicadas como um tratamento enzimático individual (1X) ou em combinações com diferentes tratamentos de aplicação resultaram em maiores benefícios na taxa de crescimento precoce em comparação com plantas cultivadas a partir de sementes tratadas com o controle E0. As mananases E177 (Tabela 87) e E196 (Tabela 88) e fosfolipase C foram aplicadas individualmente como tratamentos enzimáticos e como tratamentos combinados usando mananase e fosfolipase C em aplicações de sulco no milho.
A mananase E196 (também preparada conforme descrito no Exemplo 48) aplicada como tratamento em sulco resultou em um aumento médio de + 5% na altura da planta quando testada em um ensaio de 3 repetições e normalizada para as plantas cultivadas a partir de sementes que receberam o controle E0 tratamento.
O tratamento com fosfolipase C em sulco também resultou em plantas com altura de planta aumentada (+ 2,3%) sobre as plantas controle (controle E0). No entanto, o tratamento combinado de sulco da mananase E196, aplicado com uma dose alta (3X) e fosfolipase C (1X), resultou em um efeito sinérgico no crescimento inicial da estação, com um aumento da altura da planta de mais de + 9% sobre as plantas cultivadas a partir de plantas. semente que recebeu um tratamento de sulco com o controle E0. TABELA 87. EFEITOS DE UMA MANANASE (E177) USADA EM COMBINAÇÃO COM O EFEITO DA FOSFOLIPASE C (E143) NA ALTURA DA PLANTA PARA MILHO, TRATAMENTO EM SULCO Tratamento de Milho Porcentagem Altura média da planta (cm), normalizada para controle E0 (sulco) * Mananase E177 (SEQ ID NO: 308) (1X) 103,5% Fosfolipase C E143 (SEQ ID NO: 250) (1X) 102,8% Mananase E177 (SEQ ID NO: 308) (1X) 103,6% + Fosfolipase C E143 (SEQ ID NO: 250) (1X) Mananase E177 (SEQ ID NO: 308) (2X) 103,3% + Fosfolipase C E143 (SEQ ID NO: 250) (1X) Mananase E177 (SEQ ID NO: 308) (3X) + Fosfolipase C E143 (SEQ ID NO: 250) (1X) 103,9% Mananase E177 (SEQ ID NO: 308) (1X) 103,8% + Fosfolipase C E143 (SEQ ID NO: 250) (2X) Mananase E177 (SEQ ID NO: 308) (1X) 104,6% + Fosfolipase C E143 (SEQ ID NO: 250) (3X) * Normalizado para plantas cultivadas a partir de sementes tratadas com o controle E0 como tratamento no sulco; Média de 3 repetições; 18 plantas por replicado.
TABELA 88. EFEITOS DE UMA MANANASE (E196) USADA EM COMBINAÇÃO COM O EFEITO DA FOSFOLIPASE C (E143) NA ALTURA DA PLANTA PARA MILHO, TRATAMENTO EM SULCO Porcentagem média da Altura da Tratamento de Milho planta (cm), normalizada para controle (sulco)* Mananase E196 (SEQ ID NO: 307) (1X) 105,3%
Fosfolipase C E143 (SEQ ID NO: 250) (1X) 102,3% Mananase E196 (SEQ ID NO: 307) (1X) + Fosfolipase C E143 (SEQ ID NO: 250) 101,2% (1X) Mananase E196 (SEQ ID NO: 307) (2X) + Fosfolipase C E143 (SEQ ID NO: 250) 103,7% (1X) Mananase E196 (SEQ ID NO: 307) (3X) + Fosfolipase C E143 (SEQ ID NO: 250) 109,4% (1X) Mananase E196 (SEQ ID NO: 307) (1X) + Fosfolipase C E143 (SEQ ID NO: 250) 102,9% (2X) Mananase E196 (SEQ ID NO: 307) (1X) + Fosfolipase C E143 (SEQ ID NO: 250) 104,5% (3X) * Normalizado para plantas cultivadas a partir de sementes tratadas com o controle E0 como tratamento no sulco; Média de 3 repetições; 18 plantas por replicado.
[1950] Fosfatidilinositol fosfolipase C E258 e Fosfolipase C E80 (preparadas conforme descrito nos Exemplos 48 e 49, respectivamente), ambas capazes de hidrolisar fosfolipídios na membrana celular e fitase E246, que funciona como uma fosfatase para mobilizar fósforo do solo, criando assim uma utilizável O formulário para plantas foi testado em ensaios replicados em sulco. Ambas as enzimas fosfolipase C (E80 e E258) foram fornecidas como tratamento em sulco usando uma aplicação 1X e resultaram em plantas que tiveram um aumento aproximado de + 6% e + 7% na altura da planta quando comparadas às plantas cultivadas a partir de sementes que recebeu o tratamento E0 no sulco no momento do plantio. O tratamento em sulco com fitase E246 (1X; 2X e 3X) testado nas mesmas três repetições por teste que a fosfolipase C também resultou em aumentos substanciais no vigor e crescimento iniciais das mudas, medidos por alterações na altura da planta com aumentos respectivos de aproximadamente + 7%, + 5% e + 9% em comparação com o tratamento em sulco usando o controle E0 (Tabela 89). TABELA 89. EFEITOS DA FOSFOLIPASE C (E80), FOSFATIDILINOSITOL FOSFOLIPASE C (E258) E FITASE (E246)
APLICADOS USANDO CONCENTRAÇÕES VARIADAS, EFEITO NA ALTURA DA PLANTA PARA MILHO, TRATAMENTO NO SULCO Tratamento de Milho Concentração Alteração percentual (X) na altura média da planta (cm), normalizada para controle E0 (Sulco)* Fosfolipase C E80 1X 105,9% (peptídeo sinal da SEQ ID NO: 317 diretamente ligado à SEQ ID NO: 250) Fosfatidilinositol Fosfolipase C E258 1X 106,8% (peptídeo sinal da SEQ ID NO: 377 2X 102,4% diretamente ligado à SEQ ID NO: 375) 3X 101,3% Fitase E246 1X 107,0% (SEQ ID NO: 380) 2X 104,7% 3X 108,7% * Média de três repetições; 18 plantas por replicado
[1951] As sementes de milho (híbrido de Beck 5828 YH) que continham tratamentos com pesticidas sistêmicos neonicotinóides, clothianidina e imidaclopride foram testados quanto à compatibilidade em ensaios em sulcos testados usando duas versões das enzimas fosfolipase C. Ambas as enzimas fosfolipase C (E80 e E143) têm a mesma sequência nuclear de fosfolipase C (SEQ ID NO: 250). No entanto, a fosfolipase C E80 também contém um sinal secretor adicional (SEQ ID NO: 317). Além disso, a clonagem e expressão do lote de produção de enzima fosfolipase C E143 foi produzida como descrito anteriormente no Exemplo 48 e o lote de produção de enzima fosfolipase C E80 foi produzido como descrito no Exemplo 49. O crescimento inicial da planta (altura da planta) foi medido usando comparações no sulco das enzimas fosfolipase C E80 e E143, cultivadas a partir de sementes tratadas com PONCHO 600 (clothianidin) e GAUCHO 600 (imidaclopride), inseticidas neonicotinóides antes da aplicação do sulco tratamentos de aplicação. O crescimento das plantas usando os tratamentos com fosfolipase C foi comparado com as plantas que foram cultivadas a partir de sementes que receberam apenas os tratamentos com sementes dos inseticidas PONCHO 600 (clothianidin) e GAUCHO 600 (imidaclopride) (sem tratamento no sulco).
[1952] Ambas as enzimas fosfolipase C (E143 e E80) aplicadas como tratamentos em sulco forneceram uma vantagem de crescimento para plantas cultivadas a partir de sementes que tiveram os tratamentos com sementes neonicotinóides PONCHO 600 (clothianidin) ou GAUCHO 600 (imidaclopride). As plantas cultivadas a partir de sementes que continham tratamento com sementes exibiram uma taxa de crescimento aumentada ou altura total da planta em comparação com as plantas cultivadas com sementes tratadas com água (1X), um + 4,3% (PONCHO 600) e um + 7,2% (GAUCHO 600) aumentam em comparação com as plantas cultivadas a partir de sementes que receberam um controle de água.
O tratamento em sulco com fosfolipase C (E143) e fosfolipase C (E80) proporcionou um benefício de crescimento além do que foi observado apenas com os tratamentos com sementes neonicotinóides em ambas as combinações com os tratamentos com sementes PONCHO 600 ou GAUCHO 600 (Tabela 90). TABELA 90. EFEITO DAS ENZIMAS FOSFOLIPASE C (E80 E E143) APLICADAS A SEMENTES DE MILHO CONTENDO TRATAMENTOS COM SEMENTES NEONICOTINÓIDES, EFEITO NA ALTURA DAS PLANTAS PARA MILHO, TRATAMENTO EM SULCO Tratamento de sulco de milho Porcentagem média da Altura da planta (cm), normalizada para controle (sulco)* Tratamento de sementes de Clotianidina (PONCHO 600) 104,3% Tratamento de sementes de imidacloprida (GAUCHO 600) 107,2% Fosfolipase C E143 (SEQ ID NO: 250) (1X) + 105,3% Clotianidina (PONCHO 600) Fosfolipase C E143 (SEQ ID NO: 250) (1X) + 107,8% Imidacloprida (GAUCHO 600) Fosfolipase C E80 106,5% (peptídeo sinal da SEQ ID NO: 317 diretamente ligado à SEQ ID NO: 250) (1X) + Clotianidina (PONCHO 600) Fosfolipase C E80 108,3% (peptídeo sinal da SEQ ID NO: 317 diretamente ligado à SEQ ID NO: 250) (1X) + Imidacloprida (GAUCHO 600)
* Média de 2 repetições, 18 plantas por replicação.
[1953] Em outro experimento, membros da família Bacillus cereus recombinante que expressam proteínas de fusão contendo enzimas fosfolipase C ou fosfolipase D foram preparados, conforme descrito no Exemplo 48, e entregues como tratamento em sulco na área circundante às sementes de milho (híbrido de milho de Beck 5828 YH) em um ambiente que modula as condições de campo. As sementes de milho foram plantadas em vasos de 4 x 4 cm, preenchidos com solo e areia 2:1 Timberline 23 com duas sementes cada plantada por vaso. Os tratamentos enzimáticos, conforme descrito nas Tabelas 90-92, foram aplicados usando os tratamentos 1X (enzima 3,5 µl em 1 ml de água) e 2X (enzima 7,0 µl em 2 ml de água), conforme indicado nas Tabelas 91-93 e comparados ao controle de tipo selvagem (B. thuringiensis BT013A; E0) aplicado utilizando um tratamento 1X. Foram realizadas duas a três repetições em um ensaio, conforme indicado, para cada tratamento em sulco, com 18 plantas por tratamento de repetição. Cada tratamento foi aleatoriamente designado para o local usando um desenho de blocos aleatórios completo. As plantas foram cultivadas em um pátio elevado com exposição a condições externas luz solar completa (junho de 2018) com um ciclo dia/noite aproximado de 14/10. Todos os tratamentos foram aplicados na área do solo diretamente ao redor de cada semente após o plantio, mas antes de cobrir a semente com o solo. Cada vaso foi inicialmente regado com 50 ml de água para promover a germinação. Após a germinação, as plantas foram regadas usando regimes consistentes para todos os tratamentos. A altura das plantas (um indicador da taxa de crescimento das plantas) foi medida aproximadamente 10 dias após o plantio (DAP) ou a transição do estágio de desenvolvimento V2 a V3 para determinar o efeito no surgimento muito precoce e no vigor das mudas. Uma altura média da planta por cada tratamento com enzima fosfolipase foi normalizada para plantas cultivadas a partir de sementes que receberam um tratamento de sulco com o controle BT013A E0 fornecido usando o aplicativo 1X conforme descrito (Tabelas 91-93). Os efeitos das enzimas fosfolipase C e fosfolipase D aplicados usando uma aplicação de sulco na taxa de crescimento do milho (altura da planta) são mostrados nas Tabelas 91-93.
[1954] As enzimas fosfolipase D (D409 e E229) foram comparadas com os tratamentos com fosfolipase C (E143) aplicados no sulco ao milho em ensaios de crescimento de plantas cultivadas em condições externas, como descrito acima, para avaliar seu efeito no vigor e crescimento muito precoce das mudas (Tabela 91). Os tratamentos de fosfolipase no sulco foram normalizados para plantas cultivadas a partir de sementes que receberam um tratamento no sulco com o controle E0 (1X). A fosfolipase D (D409 e E229) aplicada como tratamento de sulco nas sementes de milho diretamente após o plantio resultou em maiores taxas de crescimento observadas nas aplicações de tratamento de sulco 1X e 2X. O tratamento 1X em sulco com a fosfolipase D D409 e a fosfolipase D E229 resultou em um aumento ligeiramente da altura da planta em comparação com os tratamentos 2X com qualquer uma das enzimas. Ambos os tratamentos com 1X de fosfolipase D em sulco resultaram em ligeiros aumentos na altura das plantas de milho em relação ao tratamento em sulco com fosfolipase C E143, que apresentaram um aumento de + 5% em comparação com as plantas cultivadas a partir de sementes que receberam o tratamento de controle E0 em sulco. TABELA 91. ENZIMAS FOSFOLIPASE C E FOSFOLIPASE D, EFEITO NA ALTURA DAS PLANTAS PARA MILHO,
TRATAMENTO EM SULCO Tratamento de sulco de milho Porcentagem média da Altura da planta (cm), normalizada para controle (sulco) Fosfolipase C E143 (1X) (SEQ ID NO: 250) 105,0% Fosfolipase D D409 (1X) (SEQ ID NO: 256) 108,5% Fosfolipase D D409 (2X) (SEQ ID NO: 256) 106,5% Fosfolipase D E229 (1X) (SEQ ID NO: 260) 106,6% Fosfolipase D E229 (2X) (SEQ ID NO: 260) 105,8% * Média de três tentativas; 18 plantas por ensaio; medidas em 7 DAP
[1955] Enzimas da fosfolipase C de Listeria monocytogenes (Lm. D473, D474 e D475) foram comparados com uma fosfolipase C de Bacillus thuringiensis (E80) que demonstrou ter efeitos promotores de crescimento de plantas. Os tratamentos em sulco foram aplicados a sementes de milho que foram plantadas em dois ensaios ao ar livre, como descrito anteriormente, usando diferentes aplicações nas concentrações 1X e 2X. As enzimas fosfolipase C contêm todas a mesma sequência central (SEQ ID NO: 374), mas diferem em relação às sequências sinal secretora e propeptídica. D473 contém o sinal secretório (SEQ ID NO: 376) diretamente ligado à SEQ ID NO: 373 (que contém uma sequência de propeptídeo). D474 é apenas a SEQ ID NO: 373 sem o sinal secretório. D475 (SEQ ID NO: 374) não possui a sequência secretora do sinal e a sequência do propeptídeo.
[1956] A fosfolipase C (E80) usada como tratamento de sulco 1X em sementes de milho resultou em plantas que tiveram um aumento de + 12% na altura da planta em relação às plantas cultivadas a partir de sementes tratadas com o controle E0. Os tratamentos com sulcos utilizando Lm fosfolipase C (D473, D474 e D475) aplicados nas concentrações 1X ou 2X resultaram em plantas com altura de planta aumentada em relação às plantas cultivadas a partir de sementes que receberam o tratamento controle E0. Esses tratamentos em sulco com fosfolipase C de Lm (D473, D474 e D475) também resultaram em plantas com leve aumento da altura das plantas em comparação com o tratamento em sulco usando fosfolipase C E80. Todos os tratamentos 1X em sulco com fosfolipase Lm (D473, D474 e D475) resultaram em plantas com altura de planta aumentada em comparação com os tratamentos 2X em sulco com as mesmas enzimas fosfolipase C. O tratamento 1X no sulco usando a enzima fosfolipase C D475 Lm resultou em plantas de milho com aumento da altura das plantas, um aumento superior a + 20% em comparação com as plantas cultivadas a partir de sementes que receberam o tratamento no sulco usando o controle E0. TABELA 92. ENZIMAS DE FOSFOLIPASE C, EFEITO NA ALTURA DAS PLANTAS PARA MILHO, TRATAMENTO
EM SULCO
Porcentagem média da Altura da planta Tratamento de sulco de milho (cm), normalizada para controle (sulco)* Fosfolipase C E80 (1X) 112,1% (peptídeo sinal da SEQ ID NO: 317 diretamente ligado à SEQ ID NO: 250) Fosfolipase C D473 Lm (1X) 114,0% (o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 376 diretamente ligado à SEQ ID NO: 373) Fosfolipase C D473 Lm (2X) 112,5% (o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 376 diretamente ligado à SEQ ID NO: 373) Fosfolipase C D474 Lm (1X) 115,2% (SEQ ID NO: 373) Fosfolipase C D474 Lm (2X) 112,7% (SEQ ID NO: 373) Fosfolipase C D475 Lm (1X) 120,6% (SEQ ID NO: 374) Fosfolipase C D475 Lm (2X) 113,6% (SEQ ID NO: 374) *Média de duas repetições; 18 plantas por replicado; medido em 10 DAP
[1957] Os membros da família Bacillus cereus recombinante que expressam proteínas de fusão contendo enzimas pectolase (D405 e D176), preparados como descrito no Exemplo 48, foram aplicados diretamente no sulco após o plantio das sementes, resultando em aumentos substanciais na altura da planta e comparados às plantas cultivadas a partir de sementes que receberam tratamentos de sulco usando o controle E0. As pectolases (endopoligalacturonase (D405) e pectina-liase (E176)) aplicadas como tratamentos de sulco nas concentrações 1X e 2X resultaram em aumentos semelhantes na altura média das plantas, em média nos três ensaios, uma média de + 12% (D405) e +8 % (E176) em comparação com plantas cultivadas a partir de sementes que receberam o tratamento de controle E0 em sulco. A fosfolipase C de Bacillus thuringiensis (E80), que demonstrou ter efeitos promotores do crescimento das plantas, também resultou em aumentos positivos na altura da planta, um aumento de + 5% em comparação às plantas de controle E0 (Tabela 93).
TABELA 93. ENZIMAS DA PECTOLASE, EFEITO NA ALTURA DA PLANTA PARA MILHO, TRATAMENTO NO SULCO Tratamento de sulco de milho Porcentagem média da Altura da planta (cm), normalizada para controle (sulco) Fosfolipase C E80 (1X) 105,2% (peptídeo sinal da SEQ ID NO: 317 diretamente ligado à SEQ ID NO: 250) Endopoligalacturonase D405 (1X) 111,2% (peptídeo sinal da SEQ ID NO: 346 diretamente ligado à SEQ ID NO: 309) Endopoligalacturonase D405 (2X) 112,0% (peptídeo sinal da SEQ ID NO: 346 diretamente ligado à SEQ ID NO: 309) Pectina-liase E176 (1X) (SEQ ID NO: 310) 108,2% Pectina-liase E176 (2X) (SEQ ID NO: 310) 107,5% * Média de três ensaios replicados; 18 plantas por tentativa; medido em 10 DAP EXEMPLO 52: TRATAMENTO DE SEMENTES COM
ENZIMAS RESULTA EM AUMENTO DA COBERTURA DA COPA VERDE EM SOJA
[1958] A cobertura fracionária da copa verde (FGCC) é uma ferramenta de análise de diagnóstico (Canopeo) usada para estimar a área da copa verde. O Canopeo (Matlab, Mathworks, Inc., Natick, MA) fornece uma ferramenta de medição com base nos critérios de seleção para a área verde da copa que é determinada usando proporções de cores de vermelho para verde (R/G) e azul para verde (B/G) que compensa o excesso de índice verde ou fundo. A cobertura do FGCC varia de 0 (0% de cobertura verde da copa) a 1 (100% de cobertura verde da copa). A classificação da copa verde é baseada nos seguintes critérios: R/G < P1 e B/G < P2 e 2G-R-B > P3
[1959] Onde P1 e P2 são parâmetros que possuem um valor próximo de 1 para classificar os pixels que estão na faixa da faixa de comprimento de onda verde (500-570 nm) e P3 é um parâmetro que define o excesso de vegetação verde mínima e permite o fundo subtração. Os valores dos parâmetros predefinidos para Canopeo são P1 = 0,95, P2 = 0,95, P3 e = 20.
[1960] Plantas de soja (variedade 424L4) foram cultivadas a partir de sementes que receberam tratamentos com enzimas: xiloglucanase, mananase,-1,4-endoglucanase, xilanase, fosfolipase, pectolase e liquenase. Os membros da família Bacillus cereus recombinante que expressam proteínas de fusão contendo várias enzimas foram preparados como descrito acima no Exemplo 48 (xiloglucanase, mananase, xilanase, pectolase, liquenase e fosfolipase) ou no Exemplo 47 (endoglucanase) e foram entregues como tratamento de sementes em sementes de soja usando os volumes (µl) aplicados às camadas externas de cada semente como tratamento de sementes e indicado na Tabela 94–97. Um controle de tipo selvagem (B. thuringiensis; E0 sem enzima) também foi aplicado às sementes usando um volume de 1 µl por semente e usado como uma comparação de controle para os tratamentos enzimáticos Sementes de soja que receberam os tratamentos com as enzimas como descrito e os tratamentos de controle E0 foram deixados secar e depois plantados em vasos de 4 x 4 cm semeados em uma mistura de solo e areia Timberline Top 2: 1 com duas sementes cada plantadas por vaso e inicialmente regadas com 50 ml de água para promover a germinação. Cada tratamento enzimático e um tratamento de controle de água (sem tratamento de sementes) foram semeados em 3 bandejas que representavam réplicas separadas por tratamento enzimático e cultivadas em instalações externas. Dentro de cada experimento, o mesmo número de bandejas replicadas e o total de plantas por tratamento foi mantido consistente entre os tratamentos. Cada bandeja suportava 18 plantas por tratamento. As bandejas foram distribuídas aleatoriamente entre os tratamentos. As plantas cultivadas em uma instalação ao ar livre foram expostas a parâmetros ambientais semelhantes que simulavam um plantio em campo (maio de 2018). As plantas de soja foram cultivadas por aproximadamente 12 a 14 dias até o estágio foliar unificado ou por 20 dias até o estágio foliar trifólio. Em ambos os estágios, as folhas foram totalmente expandidas. O FGCC foi determinado usando a ferramenta de medição Canopeo e as imagens foram coletadas 50 cm acima do fundo das bandejas da planta, usando um parâmetro de seleção com resolução de 0,91. Vinte imagens representativas foram coletadas por cada tratamento e analisadas para classificar todos os pixels em cada imagem. Uma classificação de pixel representativa atribuída às 20 imagens por tratamento por bandeja. O FGCC foi então calculado para as plantas de soja em cada bandeja ou replicação de tratamento e depois calculado ainda mais por planta para cada bandeja (teste). Os resultados são mostrados para os diferentes tratamentos com sementes enzimáticas nas Tabelas 94–98. As diferenças no FGCC foram relatadas como uma porcentagem da copa verde e normalizadas para as plantas de soja cultivadas a partir de sementes que receberam apenas um tratamento de controle de água nas Tabelas 94-96. As diferenças no FGCC foram relatadas como uma porcentagem da copa verde e normalizadas para plantas de soja cultivadas a partir de sementes que receberam o controle de tratamento E0 nas Tabelas 97-98.
XILOGLUCANASE E MANANASE
[1961] O controle do tipo selvagem (B. thuringiensis BT013A E0, controle não enzimático) resultou em plantas com maior área verde da copa normalizada para as plantas de soja cultivadas a partir de sementes que receberam apenas o tratamento com água. A xiloglucanase (SEQ ID NO: 299) e a mananase (SEQ ID NO: 307) proporcionaram como tratamentos de sementes o aumento da área verde da copa em soja, medida em 14 DAP (estágio foliar unificado). A quantidade da aplicação de tratamento de sementes (1 µl a 3 µl por semente) variou quanto ao efeito no FGCC. Toda a xiloglucanase D381 (SEQ ID NO: 299) fornecida como tratamento de sementes aplicado a 1 µl, 2 µl ou 3 µl por semente resultou em resultados positivos de um aumento na área verde do=a copa (FGCC) com um respectivo + 18,1% (1 µl), + 23,3% (2 µl) e + 14,7% (3 µl) aumentam no FGCC em relação às plantas cultivadas a partir de sementes que receberam o controle da água (Tabela 94). A mananase E196 (SEQ ID NO: 307) fornecida como tratamento de sementes de soja também apresentou aumento do FGCC, mas apenas com as doses de aplicação de 1 µl e 3 µl,
aumentos respectivos de 17,4% e + 12,4% em comparação com plantas cultivadas a partir de sementes que receberam a controle de água (Tabela 94).
TABELA 94. O TRATAMENTO DE SEMENTES
UTILIZANDO AS ENZIMAS XILOGLUCANASE E MANANASE AUMENTOU A ÁREA VERDE DA COPA DA SOJA (FOLHAS UNIFOLIADAS). Tratamento Volume Teste de folha de estágio uniforme = 3 bandejas replicadas Percentual de FGCC por planta normalizada para controle* Controle E0 (B. thuringiensis 1 μL 105,9% BT013A) 1 µl 118,1% Xiloglucanase D381 (SEQ ID NO: 2 µl 123,3% 299) 3 µl 114,7% 1 µl 117,4% Mananase E196 (SEQ ID NO: 307) 2 µl 99,3% 3 µl 112,4% * Normalizado para tratamento de sementes de controle de água (1 µl)
PECTOLASE E LIQUENASE
[1962] Enzimas de pectolase compreendendo pectina-liase E176 (SEQ ID NO: 310) e endopoligalacturonase D405 (peptídeo sinal de SEQ ID NO: 346 diretamente ligado à SEQ ID NO: 309) foram avaliadas como tratamentos de sementes nos mesmos ensaios, usando 3 bandejas replicadas por ensaio para efeitos sobre o FGCC no estágio da folha trifoliada (20 DAP). A liquenase D436 (SEQ ID NO: 296) também foi avaliada como um tratamento de sementes de soja para efeito no FGCC no estágio da folha trifoliada (20 DAP). Cada uma das 3 bandejas por enzima e tratamentos de controle E0 continha 18 plantas, com a bandeja inteira consistindo em um tratamento enzimático. Os cálculos para a área verde da copa ou FGCC foram normalizados para plantas cultivadas a partir de sementes tratadas com controle de água. As enzimas de tratamento de sementes (pectina-liase E176, endopoligalacturonase D405 e liquenase) usaram volumes de tratamento de sementes que são descritos na Tabela 95 abaixo. O controle da base E0 foi aplicado usando um volume de 1 µl por semente. TABELA 95. O TRATAMENTO DE SEMENTES
UTILIZANDO AS ENZIMAS PECTOLASE E LIQUENASE AUMENTOU A ÁREA VERDE DA COPA DA SOJA (FOLHAS UNIFOLIADAS E TRIFOLIADAS). Folha Trifoliada Avaliação = 3 bandejas replicadas por Tratamento Volume tratamento Percentual de FGCC por planta normalizada para controle * Controle E0 (B. thuringiensis BT013A) 1 µl 123,5% 1 µl 121,9% Pectina-liase E176 (SEQ ID NO: 310) 2 µl 114,7% 3 µl 129,0% Endopoligalacturonase D405 1 µl 114,9% (peptídeo sinal da SEQ ID NO: 346 2 µl 172,9% diretamente ligado à SEQ ID NO: 309) 3 µl 124,6% 1 µl 114,2% Licenase (β-1,3-1,4-endoglucanase) licB D436 0,5 µl 112,7% (SEQ ID NO: 296) 0,25 µl 114,3% * Normalizado para tratamento de sementes de controle de água
[1963] A pectina-liase E176 (SEQ ID NO: 310) aplicada como tratamento de sementes usando volumes de 1-3 µl por semente resultou em plantas que apresentaram os maiores valores de FGCC quando comparadas às calças cultivadas a partir de sementes que receberam controle de água (Tabela 95). Os valores mais altos de FGCC foram obtidos para plantas que receberam o aumento médio de 3 µLand a + 29% (trifoliado) para FGCC ao longo das 3 bandejas replicadas (área de copa normalizada para verde para plantas cultivadas a partir de sementes tratadas apenas com água). O tratamento da endopoligalaturonase D405 também resultou em plantas com FGCC aumentado, o que foi maior nos volumes de 2 µl e 3 µl do lote de produção aplicado à semente. As folhas trifoliadas de plantas de soja cultivadas a partir de sementes tratadas com 2 µl de endopoligalacturonase D405 por semente tiveram um aumento substancial do FGCC, um aumento de quase + 73% nas plantas cultivadas no estágio de folhas trifoliadas (20 DAP) em comparação ou normalizadas para as mesmas plantas da idade cultivada a partir das sementes tratadas com controle de água. A liquenase D436 foi aplicada utilizando volumes mais baixos como tratamento de sementes na soja (volumes de 0,25 µl, 0,5 µl e 1 µl). A menor aplicação da liquenase D436 (0,25 L) resultou em um aumento maior do FGCC nas plantas no estágio foliar dos trifoliados (20 DAP). Um aumento de FGCC de aproximadamente + 14% (trifoliado) é mostrado como a média das 3 bandejas e comparado às plantas do tratamento de controle de água.
FOSFOLIPASE C
[1964] A fosfolipase C (PLC) originalmente derivada de Listeria monocytogenes foi clonada usando versões diferentes com uma sequência secretora ou um propeptídeo ou ambos ligados à sequência central de PLC para examinar se essas sequências acessórias contribuíram para aumentos no FGCC em plantas de soja que receberam tratamentos de sementes usando PLC. As fosfolipases D473, D474 e D475 Lm foram descritas no Exemplo 51, acima. Cada um dos tratamentos PLC de Lm. Tratamentos PLC foram aplicados usando 2 µl de enzima de produção, que foi aplicada diretamente a cada semente de soja antes do plantio e comparada com o FGCC de plantas cultivadas a partir de sementes que receberam água (1 µl por semente). Os valores de FGCC para o Lm. PLC D475 que possuía apenas a sequência central do PLC (2 µl) resultaram em um FGCC médio mais alto, um aumento de +22,3% conforme medido para as folhas trifoliadas em comparação com Lm. PLC D473 ou Lm. Tratamentos PLC D473 (2 µL). No entanto, todos os três Lm. Todos PLC (D473, D474 e D475) apresentaram maior área de copa verde aumentada ou FGCC no estágio de folhas trifoliadas quando normalizados para plantas no mesmo estágio que foram cultivadas a partir das sementes tratadas com controle de água.
TABELA 96. O TRATAMENTO DE SEMENTES COM
ENZIMAS FOSFOLIPASE C AUMENTOU A ÁREA VERDE DA COPA DA SOJA (FOLHAS TRIFOLIADAS). Avaliação trifoliada = 3 bandejas replicadas Tratamento Volume Percentual de FGCC por planta normalizada para controle * Fosfolipase C D473 (sequência secretora + 2 µl 104,7% propeptídeo) Listeria monocytogenes (o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 376 diretamente ligado à SEQ ID NO: 373) Fosfolipase C D474 (+ propeptídeo) 2 µl 112,2% Listeria monocytogenes (SEQ ID NO: 373) Fosfolipase C D475 (sem sequência 2 µl 122,3% secretora ou propeptídeo) Listeria monocytogenes (SEQ ID NO: 374) * Normalizado para plantas cultivadas a partir de sementes tratadas com controle de água.
XILANASE E ENDOGLUCANASE
[1965] A xilanase E100 (sequência de sinal da SEQ ID NO: 328 diretamente ligada à SEQ ID NO: 268) e a xilanase E232 (SEQ ID NO: 273) foram comparadas entre si como tratamentos de sementes para efetuar mudanças na área verde da copa em plantas de soja cultivadas para o estágio foliar unificado (14 DAP). Os tratamentos com xilanase também foram comparados com as plantas cultivadas a partir de sementes de soja tratadas com a enzima β-1,4-endoglucanase E94 (sequência de sinal da SEQ ID NO: 334 diretamente ligada à SEQ ID NO: 293). Os valores de FGCC para todas as sementes tratadas com enzima são relatados como normalizados para plantas cultivadas a partir de B. thuringiensis BT013A; E0, controle sem enzimas) na Tabela 97. As plantas de soja apresentaram valores comparáveis de FGCC de plantas cultivadas a partir de sementes que receberam um tratamento de sementes com xilanase E100 fornecida a 1 µl e β-1,4-endoglucanase E94. Ambos resultaram em plantas que tiveram um aumento de mais de + 4% na área verde da copa quando normalizadas para plantas cultivadas a partir de sementes que receberam o controle E0. A xilanase E232 usada como tratamento de sementes também forneceu um volume de 1 µl da enzima do lote de produção por semente, resultando em um aumento de quase + 7% nos valores de FGCC nas plantas (14 DAP) quando comparado às plantas cultivadas a partir da semente tratada com controle E0. TABELA 97. O TRATAMENTO DE SEMENTES
UTILIZANDO AS ENZIMAS ENDOGLUCANASE E XILANASE AUMENTOU A ÁREA VERDE DA COPA DA SOJA (FOLHAS UNIFOLIADAS). Tratamento Teste de estágio de folha uniforme = 3 porcentagem de bandejas replicadas FGCC por planta normalizada para controle * β-1,4-endoglucanase E94 104,6% (sequência de sinal da SEQ ID NO: 334 diretamente ligada à SEQ ID NO: 293) Xilanase E100 104,3% (sequência de sinal da SEQ ID NO: 328 diretamente ligada à SEQ ID NO: 268) 1 µl Xilanase E232 106,7% (SEQ ID NO: 273) 1 µl * Normalizado para plantas cultivadas a partir de B. thuringiensis BT013A; E0, controle sem enzimas) sementes tratadas
OUTRAS FOSFOLIPASES
[1966] A fosfolipase D D409 (SEQ ID NO: 256) e a fosfolipase E229 (SEQ ID NO: 260) foram comparadas com a fosfolipase C E143 (SEQ ID NO: 250) depois que as plantas cultivadas a partir da semente tratada com enzima foram normalizadas para B. thuringiensis BT013A (Controle E0). As duas enzimas fosfolipase D aplicadas como tratamentos de sementes usando um volume de 1 µl ou 2 µl dos lotes de produção por semente diferiram em relação aos valores de FGCC em comparação com as plantas cultivadas a partir de sementes que receberam o tratamento de controle E0, como mostrado na Tabela 97. Todas as plantas cultivadas a partir de sementes que receberam os tratamentos com fosfolipase D (D409 e E229) resultaram em um aumento médio geral do FGCC em comparação com as plantas de sementes que receberam o tratamento com fosfolipase C (E143) aplicado no mesmo volume (1 µl). Um aumento no FGCC de + 5% para a fosfolipase D D409 e de + 19% para a fosfolipase D E229 em relação às plantas que foram cultivadas a partir de sementes que receberam o tratamento de sementes com fosfolipase C E143. No entanto, todos os tratamentos de sementes com fosfolipase produziram plantas com valores mais altos de FGCC em comparação com ou normalizadas com plantas cultivadas a partir de B. thuringiensis BT013A; E0, controle sem enzimas) sementes tratadas. TABELA 98. O TRATAMENTO DE SEMENTES COM
ENZIMAS FOSFOLIPASE AUMENTOU A ÁREA VERDE DA COPA DA SOJA (FOLHAS UNIFOLIADAS). Tratamento Volume Estágio de folha uniforme Avaliações = 3 bandejas replicadas Percentual de FGCC por planta normalizada para controle * Fosfolipase C E143 1 µl 112,2% (SEQ ID NO: 250) Fosfolipase D D409 1 µl 117,4% (SEQ ID NO: 256) 2 µl 121,8% Fosfolipase D E229 1 µl 131,2% (SEQ ID NO: 260) 2 µl 121,4% * Normalizado para plantas cultivadas a partir de B. thuringiensis BT013A; E0, controle sem enzimas) sementes tratadas EXEMPLO 53: TRATAMENTO DE SEMENTES COM
ENZIMAS RESULTA EM MAIOR PRODUTIVIDADE NA SOJA
[1967] Testes de campo replicados foram conduzidos usando duas variedades de soja (Beck's 297R4 e 312R4) em locais no meio- oeste dos EUA. As variedades de soja foram cultivadas em três locais distintos, a variedade Beck's 297R4 (OH, WI & IA) e Beck's 312R4 (IN, IL, IA) para ensaios de rendimento conduzidos usando as enzimas nicenase e mananase e em 3 locais separados em Illinois para Beck 297R4 e 38X52N de Beck para ensaios de rendimento conduzidos usando enzimas ACC desaminase e lactonase. As sementes das variedades de soja continham um tratamento básico de sementes contendo EverGol Energy (65 ml por 100 kg de semente), GAUCHO 600 (0,12 mg de ingrediente ativo/por semente) e ILeVO (0,15 mg de ingrediente ativo fluopyram (48,4%) por semente). Os membros da família Bacillus cereus recombinante (preparados como descrito acima) foram aplicados como tratamentos de sementes, usando as taxas de uso equivalente de onça fluida, conforme descrito nas Tabelas 99-102 e aplicadas no topo do tratamento de sementes de base. As enzimas aplicadas como tratamento de sementes foram deixadas secar na superfície externa da semente antes do plantio.
[1968] A semente de soja foi plantada a uma profundidade de 1,5 a 2 polegadas (3,8 a 5,1 cm) para garantir o desenvolvimento normal das raízes. A semente de soja foi plantada em aproximadamente 150.000 plantas por acre, com larguras de linhas de 30 polegadas (76,2 cm) com espaçamento de sementes de aproximadamente 7 a 8 sementes por pé (0,3 metro). Os canteiros de campo em cada local foram preparados usando métodos convencionais de preparo do solo ou de conservação para os plantios. O fertilizante foi aplicado conforme recomendado pelas práticas agrícolas convencionais e permaneceu consistente entre os locais do meio-oeste dos EUA. Os herbicidas foram aplicados no controle de plantas daninhas e suplementados com cultivo quando necessário.
[1969] O rendimento (Bu/Ac) de plantas de soja que foram cultivadas a partir de sementes que receberam tratamentos de sementes com liquenase (E111) foi comparado com plantas cultivadas a partir de sementes que receberam o tratamento básico de sementes (controle; sem enzima). O rendimento médio e a mudança no rendimento das plantas de controle são relatados individualmente para as duas variedades de soja nos três locais colhidos na Tabela 99.
TABELA 99. RENDIMENTO: LIQUENASE COMO
TRATAMENTO DE SEMENTES AUMENTOU O RENDIMENTO NA SOJA Tratamento Rendimento médio Rendimento médio (Bu/Ac) (Bu/Ac) Variedade: Beck's Variedade: Beck's 297R4 312R4 (Mudança no (Mudança no rendimento rendimento comparado ao comparado ao controle) controle) Controle de Tratamento- 58,89 63,33 Base de Sementes (-) (-) Liquenase E111 62,33 64,78 (peptídeo sinal da SEQ ID (+3,34) (+1,45) NO: 335 diretamente ligado à SEQ ID NO: 295) 2,5 Fl. oz taxa de uso equivalente
[1970] A soja cultivada a partir de sementes que receberam liquenase como tratamento de sementes teve maiores rendimentos em comparação com as plantas de soja que foram cultivadas a partir de sementes que receberam o tratamento básico de sementes (controle) para as variedades 297R4 de Beck e 312R4 de Beck. O rendimento médio (Bu/Ac) aumenta nos três locais diferidos entre as variedades, mas ambos tiveram aumentos positivos no rendimento em comparação com o rendimento das plantas de controle. A variedade 297R4 de Beck teve, em média, um aumento de +3,34 Bu/Ac (224,6 kg/Ha), enquanto o 312R4 de Beck teve um aumento de +1,45 Bu/Ac (97,5 kg/Ha) em comparação com o rendimento colhido nas plantas de controle.
[1971] Em outro ensaio de campo replicado, o rendimento (Bu/Ac) foi coletado de plantas de soja que foram cultivadas a partir de sementes que receberam tratamentos com mananase (E177) e comparadas a plantas cultivadas a partir de sementes que receberam o tratamento básico de sementes (controle; sem enzima). O rendimento médio e a mudança no rendimento sobre as plantas de controle são relatados na Tabela 100 para os 3 locais colhidos.
TABELA 100. RENDIMENTO: MANANASE COMO
TRATAMENTO DE SEMENTES AUMENTOU O RENDIMENTO NA SOJA Tratamento Rendimento médio (Bu/Ac): Variedade: Beck's 297R4 (Maior rendimento sobre o controle) Controle de Tratamento-Base de 58,89 Sementes (-) Mananase E177 61,00 (SEQ ID NO: 308) (+2,11) 2,5 Fl. oz taxa de uso equivalente
[1972] A soja (variedade 297R4 de Beck) que recebeu o tratamento de sementes com a enzima mananase (E177) aumentou o rendimento em comparação com as plantas de soja cultivadas a partir de sementes que receberam apenas o controle básico do tratamento de sementes. Plantas de soja cultivadas a partir de sementes tratadas com mananase tiveram um aumento médio de produção de +2,11 Bu/Ac (142 kg/Ha) nos 3 locais, em comparação com o rendimento das plantas controle.
[1973] O rendimento (Bu/Ac) de plantas de soja que foram cultivadas a partir de sementes que receberam tratamentos com ACC desaminase foi comparado com plantas cultivadas a partir de sementes que receberam o tratamento básico de sementes (controle; sem enzima). O rendimento médio e a mudança no rendimento das plantas de controle são relatados na Tabela 101 individualmente para as duas variedades de soja (297R4 de Beck e 38X52N de Beck) para os 3 locais colhidos.
TABELA 101. ACC DESAMINASE COMO TRATAMENTO
DE SEMENTES AUMENTOU O RENDIMENTO EM SOJA Tratamento Rendimento médio Rendimento médio (Bu/Ac) (Bu/Ac) Variedade: Beck's Variedade: Beck's 297R4 38X52N (Maior rendimento (Maior rendimento sobre o controle) sobre o controle)
Controle de Tratamento- 66,23 61,57 Base de Sementes (-) (-) ACC Desaminase D406 67,14 62,28 (SEQ ID NO: 249) (+0,91) (+0,71) 2 Fl. oz taxa de uso equivalente
[1974] A soja que recebeu o tratamento de sementes com a enzima ACC desaminase (D406) teve um rendimento aumentado em comparação com as plantas de soja cultivadas a partir de sementes que receberam apenas o controle básico do tratamento de sementes. As plantas de soja (variedade Beck 2974R4) cultivadas a partir de sementes tratadas com ACC desaminase tiveram um aumento médio de produção de +0,91 Bu/Ac (61,2 kg/Ha) enquanto que (variedade Beck 38X52N) tiveram um aumento médio de produção de +0,71 Bu/Ac (47,7 kg/Ha) nos 3 locais em comparação com o rendimento das plantas de controle.
[1975] Em outro ensaio de produção de campo replicado realizado em três localidades do Centro-Oeste dos EUA (IL), o rendimento (Bu/Ac) é relatado em plantas de soja que foram cultivadas a partir de sementes que receberam tratamentos com a enzima lactonase (H51) e comparadas a plantas cultivadas a partir de sementes que recebeu o tratamento básico de sementes (controle; sem enzima). O rendimento médio e a mudança no rendimento das plantas de controle são relatados na Tabela 102 individualmente para as duas variedades de soja (Beck's 297R4 e Beck's 38X52N) colhidas. TABELA 102. LACTONASE COMO TRATAMENTO DE
SEMENTES AUMENTOU O RENDIMENTO NA SOJA Tratamento Rendimento médio Rendimento médio (Bu/Ac) (Bu/Ac) Variedade: Beck's Variedade: Beck's 297R4 38X52N (Maior rendimento (Maior rendimento sobre o controle) sobre o controle) Controle de Tratamento- 66,23 61,57 Base de Sementes (-) (-)
Lactonase H51 67,03 65,36 (SEQ ID NO: 277) (+0,80) (+3,79) 2 Fl. oz taxa de uso equivalente * O aumento do rendimento das plantas de soja cultivadas a partir de sementes que receberam tratamento com a enzima lactonase (H51) diferiu entre as 2 variedades de soja (Beck's 297R4 e Beck's 38X52) cultivadas nos 3 locais (IL). As plantas de soja (Beck's 38X52N) tiveram um aumento de +3,79 Bu/Ac (254,9 kg/Ha) em relação à soja cultivada a partir de sementes que receberam o tratamento básico de sementes (sem enzima). As plantas de soja (Beck's 297R4) tiveram um leve aumento de +0,80 Bu/Ac (53,8 kg/Ha) sobre as plantas de controle. EXEMPLO 54: ENSAIO DE SUCO DIGESTIVO
GÁSTRICO PARA CONFIRMAR ENZIMAS ATIVAS PARA USO COMO ADITIVOS EM ALIMENTOS PARA ANIMAIS AGRÍCOLAS
[1976] As enzimas, expressas no exosporium dos membros da família Bacillus cereus recombinante, conforme descrito aqui, que são úteis como aditivos para a alimentação animal, foram caracterizadas quanto à atividade utilizando um sistema de teste in vitro que simula condições gastrointestinais para avaliar a acessibilidade dessas enzimas à medida que elas entram e passam pelo meio. sucos digestivos encontrados no intestino e na trilha gastrointestinal de um mamífero, como uma espécie bovina. O modelo de mamífero foi adaptado de Kaufman et. al., 2007 (Kaufman et al., “Lead bioaccessibility in food web intermediates and the influence on ecological risk characterization”, Environmental Science and Technology 2007; 41: 5902-5907).
[1977] Foi realizado um teste de extração fisiologicamente baseado em mamíferos (PBET) usando os sucos digestivo e intestinal adquiridos de bovinos e amostrados em tempos separados, incluindo uma amostragem de tempo zero (T0) para simular o estado da atividade enzimática durante o consumo de ração. Foram realizadas duas etapas do processo de digestão durante a digestão bovina usando quantidades conhecidas de cada uma das enzimas geradas usando métodos de fermentação de produção em lote, como descrito anteriormente (Tabela 80) para atingir os níveis de atividade desejados. O processo de digestão do primeiro estágio (estágio 1) utilizou um processo de coleta em duas etapas para simular os sucos gástricos de um animal alimentado recentemente (T0) e os sucos durante o processo de digestão em "estado estacionário" (T1). O processo de digestão do segundo estágio (estágio 2) utilizou um processo de coleta em duas etapas para simular a passagem pelo intestino e monitorar a atividade das enzimas alimentares em dois momentos; passagem intestinal lenta (T3) e imediatamente antes do final da passagem intestinal (T4).
[1978] Para a Fase 1: O ensaio PBET foi realizado usando um suco digestivo gástrico contendo: pepsina (1,25 g/L), ácido málico (0,5 g/L), ácido cítrico (0,5 g/L), ácido lático (420 µl/L), ácido acético (500 µl/L) em água desionizada e ajustado para pH 4,0 para simular um animal recém- alimentado e pH 2,5 para simular condições de estado estacionário durante a digestão dos alimentos. As reações PBET iniciais (Fase 1) usaram 4 ml do suco digestivo gástrico combinado com a enzima de “aditivo” em um tubo de centrífuga de 15 ml colocado a 37 °C durante 10 min. Após os 10 minutos de tempo de incubação, os tubos foram mantidos a 37 °C, mas agitados a 250 rpm em um ângulo de 45 °C por 1 hora. Pontos de tempo foram tomados durante a reação para simular o consumo de alimentos no estômago. Várias amostras em cada momento foram coletadas durante a hora de incubação T0 (apenas alimentada); e intervalos de tempo T1 (digestão começaram a atingir níveis estáveis). Em cada ponto de coleta, o agitador foi parado e uma alíquota de 100 µl de suco gástrico contendo a enzima “aditivo alimentar” foi coletada de cada tubo. As amostras de suco gástrico foram então transferidas separadamente para um tubo de microcentrífuga selado de 1,5 ml e imediatamente centrifugadas por 10 min. a 11.000 x g. O sobrenadante de cada amostra foi decantado para um tubo fresco e a fração do sobrenadante foi coletada e armazenada a -20 °C até o tempo para o início dos ensaios de atividade específica da enzima.
[1979] Uma vez que a estimulação digestivo Fase 1 foi completada, o suco digestivo em cada reacção de simulação foi ajustado para pH 7,0 usando 300 ml de solução de NaHCO3. Para o Estágio 2: Após o ajuste do pH, uma solução concentrada de 10x que simulava um suco digestivo encontrado no intestino bovino foi adicionada às misturas de reação de cada amostra que continha extrato biliar (26 mg/ml) e pancreatina (7,5 mg/ml para atingir as concentrações finais desejadas de 1X (extrato biliar = 2,6 mg/ml e pancreatina = 0,75 mg/ml). Essa solução intestinal foi adicionada a cada amostra de repetição antes de voltar para os tubos de amostra para o agitador a 37 °C, ângulo de 45° e agitação a 100 a 150 rpm para imitar a passagem intestinal lenta das enzimas de “aditivo para ração”. Uma alíquota de 100 µl da solução intestinal foi retirada de cada tubo após um intervalo de incubação de 1 hora para o intervalo de tempo T3 (passagem intestinal lenta). Os tubos foram então retornados ao agitador e incubados por um tempo total de 3,5 horas (passagem quase completa através do intestino: final da simulação intestinal) coletados para o intervalo de tempo T4. As amostras foram então transferidas para um tubo de microcentrífuga selado de 1,5 ml e imediatamente centrifugadas por 10 min. a
11.000 x g. O sobrenadante foi decantado para um tubo fresco e o sobrenadante foi armazenado a -20 °C até ser testado novamente usando ensaios específicos de enzimas.
[1980] As enzimas selecionadas para uso como aditivos alimentares foram comparadas com enzimas altamente purificadas (livres) comercialmente disponíveis com níveis de atividade conhecidos; os controles positivos (enzima livre) de cada classe de enzimas, conforme descrito na Tabela 103. As enzimas para "aditivo para ração" e as enzimas comerciais foram testadas com as enzimas digestivas para confirmar que os ensaios específicos da enzima eram funcionais e poderiam ser usados como comparações das enzimas para "aditivo para ração" para garantir que eles mantivessem uma atividade funcional à medida que passassem. através da via digestiva do mamífero, como um mamífero bovino. TABELA 103. ENZIMAS COMERCIALMENTE
DISPONÍVEIS USADAS COMO COMPARAÇÕES DE CONTROLE POSITIVO COM ENZIMAS DESCONTÍNUAS DE PRODUÇÃO USADAS EM UM ENSAIO
DE DIGESTÃO GÁSTRICA EM MAMÍFEROS SIMULADO Controle Positivo de No EC: No de catálogo (CAS) Atividade Enzimas específica (U/mg) Xiloglucanase (GH74) 3.2.1.155 Megazyme E-XGP74 45 Paenibacillus sp. (1000598-79-7/76901- 10-5) Liquenase 3.2.1.73 Megazyme E-LICHN 230 (endo-1,3,1,4-β-glucanase) (37288-51-0) Bacillus subtilis Mananase 3.2.1.78 Megazyme E-BMABS 50 (endo-1,4 β-mananase) (37288-54-3) Bacillus sp. Xilanase 3.2.1.8 Megazyme E-XYLNP 1000 - (endo-1,4-β-xilanase) (9025-57-4) 1500 Neocallimastix patriciarum Endoglucanase 3.2.1.4 Sigma-Aldrich E2164 2 (endo-1,4--D-Glucanase) (9012-54-8) Acidothermus cellulolyticus
[1981] Ensaios de atividade enzimática específica de enzima foram realizados em cada alíquota de 100 µl, conforme coletados para os ensaios digestivos do estágio 1 (digestão através do estômago; T0 e T1) e estágio 2 (movimento pelo intestino; T3 e T4). Uma curva padrão representativo para enzimas na Tabela 104 foi obtido utilizando-se glicose como substrato e clivável detectável e resultou na seguinte equação: y = 12.511x 3 - 398.76x 2 +
448.51x + 40,714 (R2 = 0,9994). O valor de R2 de 0,9994 para a curva padr foi altamente correlacionada positivamente com as atividades específicas individuais enzima e foi utilizado para determinar o ponto de partida e que terminam atividades para cada uma das enzimas de aditivos alimentares nas Fases 1 e 2 dos ensaios de digestão.
[1982] A liquenase E111, as mananases E177 e E196, as xilanases E232, E146 e E100 e as xiloglucanases E149 e D381 (todas preparadas conforme descrito acima no Exemplo 48) foram testadas como enzimas aditivas em alimentos e foram comparadas com a atividade de fundo do controle E0 (Bacillus thuringiensis BT013A, a mesma cepa usada para expressar as enzimas recombinantes). Além disso, foi testada a eficácia da mananase como enzima livre para atuar como aditivo alimentar e permanecer ativo durante a digestão. As mananases D448 e D449 foram preparadas como enzimas livres usando o vetor pFEe4B (que contém os genes de resistência à ampicilina e à tetraciclina) em Bacillus subtilis. O vetor pFe4B possui segmentos que permitem replicação e seleção em Bacillus e E. coli. A seção de E. coli (pUC57) contém a origem de replicação e bla de ColE1, enquanto a seção de Bacillus (pBC16) abriga repU, oriU e tetL. Neste estudo, a seção de pBC foi ainda aumentada com cassetes de expressão para mananase (D448 ou D449) e lacl. O cassete de lacl é accionado por um promotor de penicilase de Bacillus paralicheniformis e resulta na expressão constitutiva de E. coli LacI necessária para suprimir a expressão da carga de interesse antes da indução. O cassete de expressão para as mananases continha um promotor de operão groE de Bacillus subtilis modificado fundido com o local de ligação para LacI. A mananase foi ainda fundida ao sinal de secreção amyQ de Bacillus amyloliquefaciens para garantir sua secreção fora da célula produtora. Os derivados de pFEe4B portando mananase foram transformados em Bacillus subtilis e a expressão foi induzida pela adição de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). O caldo celular total foi filtrado e o sobrenadante (filtrado) usado como produto final neste exemplo. Observa-se que todo o caldo de célula, centrifugado ou filtrado pode ser usado como descrito aqui.
[1983] Todos os quatro tipos de enzimas produzidos na cepa BT013A com uma sequência de alvejamento BclA20-35 (aminoácidos 20–35 da SEQ ID NO: 1) tiveram atividade no início da simulação digestiva e foram capazes de manter alguma atividade durante a simulação (Tabela 104). Isso sugere que, durante todo o processo, o animal teria acesso a carboidratos e açúcares mais livres para se converter em energia. As enzimas livres (D448 e D449), no entanto, mostraram uma queda na atividade ao longo do tempo durante o ensaio. Assim, esses dados demonstram a estabilidade das enzimas esporuladas neste ensaio, apoiando sua capacidade de permanecer com a ração durante todo o processo e não serem prontamente absorvidas pelo epitélio, o que reduziria sua capacidade de continuar digerindo substratos-alvo em todo o estômago e intestinos à medida que as condições se tornam mais favoráveis à atividade enzimática.
TABELA 104. ENZIMAS COMO ADITIVOS
ALIMENTARES RETÊM ATIVIDADE EM UM ENSAIO DE DIGESTÃO
GÁSTRICA DE MAMÍFEROS SIMULADO Tratamento Ensaio de atividade (mU/ml) Com enzimas digestivas (% normalizada para T0) Intervalos de tempo T0 T1 T3 T4 Liquenase 28.769,01 30.160,20 - - Controle positivo (100%) (104,8%) Liquenase E111 51,71 47.11 31,64 36,25 (peptídeo sinal da (100%) (91,1%) (61,2%) (70,1%) SEQ ID NO: 335 diretamente ligado à SEQ ID NO: 295) Mananase 11.694,45 11.659,79 12.804,54 11.798,45 Controle positivo (100%) (99,7%) (109,5%) (100,9%) Mananase E177 79,76 84,21 89,49 89,93 (SEQ ID NO: 308) (100%) (105,6%) (112,2%) (112,7%) Mananase E196 77,97 80,21 83,77 83,32 (SEQ ID NO: 307) (100%) (102,9%) (107,4%) (106,9%) Mananase D448 23.038,02 29.411,29 18.546,06 10.238,15 (SEQ ID NO: 308)* (100%) (127,7%) (80,5%) (44,4%)
Mananase D449 32.685,35 39.757,90 7.671,66 4.429,49 (SEQ ID NO: 307)* (100%) (121,6%) (23,5%) (13,5%) Xilanase 354,92 426,59 451,56 492,94 Controle positivo (100%) (120,2%) (127,2%) (138,9%) Xilanase E232 30,85 31,54 29,73 35,02 (SEQ ID NO: 273) (100%) (102,2%) (96,4%) (113,5%) Xilanase E146 26,88 26,98 27,05 37,98 (SEQ ID NO: 268) (100%) (100,4%) (100,6%) (141,3%) Xilanase E100 24,59 24,49 31,24 29,51 (peptídeo sinal da (100%) (99,6%) (127,0%) (120,0%) SEQ ID NO: 328 diretamente ligado à SEQ ID NO: 268) Xiloglucanase 407,42 329,65 416,05 360,98 Controle positivo (100%) (80,9%) (102,1%) (88,6%) Xiloglucanase E149 21,27 21,27 24,90 23,87 (SEQ ID NO: 300) (100%) (100%) (117,1%) (112,2%) Xiloglucanase D381 151,59 37,71 24,78 27,83 (SEQ ID NO: 299) (100%) (24,9%) (16,3%) (18,4%)
[1984] As mananases E177/E196 compartilham a mesma sequência que as mananases D448 e D449, mas os sistemas de expressão eram diferentes. As mananases E177 e E196 foram expressas como descrito no Exemplo 48 e exibidas no exosporium de Bacillus thuringiensis BT013A; as mananases D448 e D449 foram expressas como enzimas livres utilizando o vetor pFEe4B em Bacillus subtilis.
[1985] Foram realizados ensaios de atividade enzimática específica de enzima para endoglucanases em cada alíquota de 100 µl, coletados para os ensaios digestivos do estágio 1 (digestão através do estômago; T0 e T1) e do estágio 2 (movimento pelo intestino; T3 e T4). Uma curva padrão representativa para enzimas na Tabela 105 foi obtida usando glicose como substrato clivável e detectável e resultou na seguinte equação: y = 152,57x3 - 266,97x 2 + 426,35x + 42,75 (R2 = 0,9994). O valor de R2 de 0,9994 para a curva padr foi altamente correlacionada positivamente com as atividades específicas individuais enzima e foi utilizado para determinar o ponto de partida e que terminam atividades para cada uma das enzimas de aditivos alimentares nas Fases 1 e 2 dos ensaios de digestão. Os dados para endoglucanases estão resumidos na Tabela 105.
TABELA 105. ENDOGLUCANASE USADA COMO
ADITIVO EM ALIMENTOS PARA ANIMAIS MANTÉM A ATIVIDADE EM UM
ENSAIO SIMULADO DE DIGESTÃO GÁSTRICA EM MAMÍFEROS Ensaio de atividade (mU/ml) Tratamento Com enzimas digestivas (% normalizada para T0) Intervalos de tempo T0 T1 T3 T4 Controle Positivo da 1.193,75 1.334,39 2.011,33 2.536,09 Endoglucanase (100%) (111,8%) (168,5%) (212,4%) Endoglucanase E94* 499,49 98,00 41,03 40,22 (100%) (19,6%) (8,2%) (8,0%) Endoglucanase E107* 260,09 574,22 61,90 46,86 (100%) (220,8%) (23,8%) (18,0%) Endoglucanase E108 * 84,01 39,00 43,04 39,41 (100%) (46,4%) (51,2%) (46,9%) Endoglucanase E110* 38,05 31,28 48,56 37,51 (100%) (82,2%) (127,6%) (98,6%) * As β-1,4-endoglucanases designadas como E94, E107, E108 e E110 contêm o peptídeo sinal da SEQ ID NO: 334 diretamente ligado à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 293, mas diferem em relação à sequência de alvejamento, proteína do exosporium, ou fragmento de proteína do exosporium usado para alvejar a endoglucanase para o exosporium da seguinte forma: E94 contém BclA20-35 (aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1); E107 contém BclA1-
166 (SEQ ID NO: 383); E108 contém BclA1-296 de comprimento total (SEQ ID NO: 382); E110 contém CotY (SEQ ID NO: 381).
[1986] As atividades das enzimas de "aditivo para ração", conforme descrito na Tabela 105, com diferentes sequências de alvejamento e comprimentos de sequência de alvejamento foram comparadas com a atividade de fundo do E0 sem controle enzimático ou da cepa hospedeira não transformada ou da (Bacillus thuringiensis BT013A) que era a mesma cepa utilizada para expressar as enzimas recombinantes. As atividades das enzimas de “aditivo para ração” também foram comparadas com a endoglucanase comercialmente disponível (endo-1,4--D-glucanase) de Acidothermus cellulolyticus e descrita na Tabela 105. O nível inicial da atividade da endoglucanase foi mais alto para a sequência de alvejamento BclA 20-35 curta (E94), seguido pela sequência de alvejamento BclA sem o domínio globular (E107) e mais baixo para a sequência de alvejamento BclA de comprimento total (E108). As atividades de endoglucanase foram maiores para cada uma das sequências de alvejamento baseadas em BclA do que a de CotY. Curiosamente, a sequência de alvejamento BclA 1-166 sem domínio globular perdeu menos atividade à medida que passava pelo sistema digestivo do que a sequência de alvejamento mais curta e mais ativa e, de fato, a atividade da endoglucanase foi aprimorada no ambiente proteolítico de baixo pH, sugerindo que há um melhoria para a alimentação ter uma sequência de alvejamento que permita mais proteção contra o ambiente ácido do intestino permitido pela sequência de alvejamento mais longa de BclA ou CotY.
[1987] Em outros ensaios, outro modelo pode ser usado para caracterizar a atividade das presentes enzimas de "aditivo para ração" da presente invenção usando um modelo de pista digestiva aviária que geralmente fornece um ensaio de digestão de moela adequado para a indústria avícola. Semelhante ao ensaio PBET em mamíferos, as enzimas de "aditivo para ração" podem ser avaliadas usando um ensaio Avian PBET, que fornece um modelo de simulação intestinal para capturar a complexidade da via digestiva aviária usando um sistema dinâmico de moela-intestino aviário contendo areia (Martinez-Haro et al., “Avian digestive tract simulation to study the effect of grit geochemistry and food on Pb shot bioaccessibility”, Environmental Science and Technology 2009; 43: 9480-9486).
[1988] Tendo em vista o acima exposto, será visto que os vários objetos da invenção são alcançados e outros resultados vantajosos são alcançados.
[1989] Como várias alterações podem ser feitas nos produtos, formulações e métodos acima, sem se afastar do escopo da invenção, pretende-se que toda a matéria contida na descrição acima e mostrada nos desenhos anexos seja interpretada como ilustrativa e não de maneira sentido limitante.
MODALIDADES
[1990] Para ilustração adicional, modalidades adicionais não limitativas da presente divulgação são estabelecidas abaixo.
[1991] A modalidade 1 é uma proteína de fusão que compreende:
[1992] uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro recombinante da família de Bacillus cereus; e
[1993] uma enzima com atividade de 1- aminociclopropano-1-carboxilato desaminase (ACC desaminase), em que a enzima com atividade de ACC de desaminase compreende:
[1994] uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos uma substituição de aminoácidos em relação à sequência de uma enzima D-cisteína dessulfidrase do tipo selvagem ou ACC desaminase de uma bactéria do gênero Bacillus, em que a substituição de aminoácidos resulta em atividade aumentada de ACC desaminase em comparação com a atividade de ACC desaminase da enzima D-cisteína dessulfidrase do tipo selvagem ou ACC desaminase nas mesmas condições;
[1995] uma enzima Bacillus;
[1996] uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 242-245;
[1997] ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.
[1998] A modalidade 2 é uma proteína de fusão da modalidade 1, em que a sequência de aminoácidos da enzima compreende duas substituições de aminoácidos em relação à sequência da enzima de D-cisteína dessulfidrase do tipo selvagem ou ACC desaminase, em que as substituições de aminoácidos resultam em atividade de ACC desaminase aumentada em comparação com a atividade da enzima ACC desaminase do tipo selvagem sob as mesmas condições.
[1999] A modalidade 3 é uma proteína de fusão da modalidade 1 ou 2, em que a enzima com atividade de ACC desaminase compreende uma enzima de Bacillus thuringiensisou uma enzima de Bacillus pseudomycoides.
[2000] A modalidade 4 é uma proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 1 a 3, em que a sequência de aminoácidos da enzima compreende:
[2001] uma substituição do resíduo de treonina na posição 290 da SEQ ID NO: 242 por um resíduo de ácido glutâmico e uma substituição do resíduo de serina na posição 317 da SEQ ID NO: 242 por um resíduo de leucina;
[2002] uma substituição do resíduo de treonina na posição 290 da SEQ ID NO: 243 por um resíduo de ácido glutâmico e uma substituição do resíduo de serina na posição 317 da SEQ ID NO: 243 por um resíduo de leucina;
[2003] uma substituição do resíduo de treonina na posição 290 da SEQ ID NO: 244 por um resíduo de ácido glutâmico e uma substituição do resíduo de serina na posição 317 da SEQ ID NO: 244 por um resíduo de leucina; ou
[2004] uma substituição do resíduo de treonina na posição 290 da SEQ ID NO: 245 por um resíduo de ácido glutâmico e uma substituição do resíduo de serina na posição 317 da SEQ ID NO: 245 por um resíduo de leucina.
[2005] A modalidade 5 é uma proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 1 a 4, em que a enzima compreende ou consiste na SEQ ID NO: 246, 247, 248 ou 249.
[2006] A modalidade 6 é uma proteína de fusão da modalidade 5, em que a enzima compreende ou consiste na SEQ ID NO: 249.
[2007] A modalidade 7 é uma proteína de fusão da modalidade 1, em que a enzima compreende uma sequência de aminoácidos tendo 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 242-
245.
[2008] A modalidade 8 é uma proteína de fusão da modalidade 7, em que a enzima compreende ou consiste na SEQ ID NO: 245.
[2009] A modalidade 9 é uma proteína de fusão que compreende:
[2010] uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro recombinante da família de Bacillus cereus; e
[2011] uma fosfolipase, a fosfolipase:
[2012] compreendendo uma fosfolipase B;
[2013] compreendendo uma fosfolipase C, a fosfolipase C compreendendo uma fosfolipase C beta 1, uma fosfolipase C beta 2, uma fosfolipase C beta 3, uma fosfolipase C beta 4, uma fosfolipase C delta 1, uma fosfolipase C delta 3, uma fosfolipase C delta 4, uma fosfolipase C épsilon 1, uma fosfolipase C gama 1, uma fosfolipase C gama 2, uma fosfolipase C eta
1, uma fosfolipase C eta 2, uma fosfolipase C zeta 1 ou uma combinação de qualquer uma das mesmas;
[2014] compreendendo uma fosfolipase D, a fosfolipase D compreendendo uma fosfolipase D1, uma fosfolipase D2, um membro 3 da fosfolipase D, um membro 4 da fosfolipase D, um membro 5 da fosfolipase D, um membro 6 da fosfolipase D, ou uma combinação de qualquer um dos mesmos;
[2015] compreendendo uma fosfolipase A2, a fosfolipase A2 compreendendo um grupo IIA fosfolipase A2, um grupo IIC fosfolipase A2, um grupo IID fosfolipase A2, um grupo IIE fosfolipase A2, um grupo IIE fosfolipase A2, um grupo IIF fosfolipase A2, um grupo III fosfolipase A2, um grupo IVA fosfolipase A2, um grupo IVB fosfolipase A2, um grupo IV fosfolipase A2, um grupo IVD fosfolipase A2, um grupo IVE fosfolipase A2, um grupo VIF fosfolipase A2, um grupo VIF fosfolipase A2, um grupo V fosfolipase A2, um grupo V fosfolipase A2, um grupo V fosfolipase A2, um grupo VI fosfolipase A2, um grupo IV fosfolipase A2, um grupo X fosfolipase A2, grupo XIIA fosfolipase A2, grupo XIIB fosfolipase A2, grupo XV fosfolipase A2, grupo XV fosfolipase A2 ou grupo XVI fosfolipase A2 ou uma combinação de qualquer um dos mesmos;
[2016] compreendendo uma 1-alquil-2- acetilglicerofosfocololina esterase;
[2017] compreendendo uma fosfatidilinositol desacilase;
[2018] compreendendo uma fosfolipase C específica para fosfatidilinoslitol;
[2019] compreendendo uma fosfodiesterase de esfingomielina;
[2020] compreendendo uma fosfodiesterase D de esfingomielina;
[2021] compreendendo uma fosfodiesterase de alquilglicerofosfoetanolamina;
[2022] compreendendo uma fosfolipase C de glicoproteína de superfície variante;
[2023] compreendendo uma glicosilfosfatidilinositol fosfolipase D;
[2024] compreendendo uma fosfolipase D de N- acetilfosfatidiletanolamina hidrolisante;
[2025] compreendendo uma fosfatidilinositol diacilglicerol-liase;
[2026] compreendendo uma glicosilfosfatidilinositol diacilglicerol-liase;
[2027] compreendendo um domínio fosfolipase do tipo patatina contendo proteína 2 (PNPLA2);
[2028] compreendendo um domínio fosfolipase do tipo patatina contendo proteína 3 (PNPLA3);
[2029] compreendendo uma fosfolipase de Streptomyces;
[2030] compreendendo uma fosfolipase de Clostridium;
[2031] compreendendo uma fosfolipase de Acidovorax;
[2032] compreendendo fosfolipase de Listeria;
[2033] compreendendo uma fosfolipase de Bacillus cereus;
[2034] compreendendo uma fosfolipase de Bacillus licheniformis;
[2035] compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 252- 260 e 373-375;
[2036] consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250 ou 251;
[2037] ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.
[2038] A modalidade 10 é uma proteína de fusão da modalidade 9, em que a fosfolipase compreende uma fosfolipase B, a fosfolipase B compreendendo uma fosfolipase B1.
[2039] A modalidade 11 é uma proteína de fusão da modalidade 9, em que a fosfolipase compreende uma fosfolipase de Streptomyces, uma Streptomyces de Streptomyces compreendendo uma fosfolipase de Streptomyces chromofuscus; em que a fosfolipase compreende uma fosfolipase de Clostridium, a fosfolipase de Clostridium compreendendo uma fosfolipase de Clostridium perfringens; ou em que a fosfolipase compreende uma fosfolipase de Listeria, a fosfolipase de Listeria compreendendo uma fosfolipase de Listeria monocytogenes.
[2040] A modalidade 12 é uma proteína de fusão da modalidade 11, em que a fosfolipase de Streptomyces chromofuscus compreende fosfolipase D de Streptomyces chromofuscus, em que a fosfolipase de Clostridium perfringens commpreende a fosfolipase C de Clostridium perfringens; ou em que a fosfolipase de Listeria monocytogenes compreende uma fosfolipase C de Listeria monocytogenes.
[2041] A modalidade 13 é uma proteína de fusão da modalidade 9, em que a fosfolipase compreende uma fosfolipase de Bacillus cereus, em que a fosfolipase de Bacillus cereus compreende fosfolipase C de Bacillus cereus ou uma fosfolipase C específica para fosfatidilinositol de Bacillus cereus.
[2042] A modalidade 14 é uma proteína de fusão da modalidade 9, em que a fosfolipase consiste em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 250.
[2043] A modalidade 15 é uma proteína de fusão da modalidade 9, em que a fosfolipase consiste em uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 251.
[2044] A modalidade 16 é uma proteína de fusão da modalidade 9, em que a fosfolipase compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, em pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256 ou 260.
[2045] A modalidade 17 é uma proteína de fusão da modalidade 16, em que a fosfolipase compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, em pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256.
[2046] A modalidade 18 é uma proteína de fusão da modalidade 9, em que a fosfolipase compreende fosfolipase C específica para fosfatidilinoslitol e a fosfolipase C específica para fosfatidilinoslitol compreende uma fosfolipase C específica para fosfatidilinoslitol de Bacillus thuringiensis.
[2047] A modalidade 19 é uma proteína de fusão da modalidade 9, em que a fosfolipase compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, em pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 373-375.
[2048] A modalidade 20 é uma proteína de fusão que compreende:
[2049] uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante; e
[2050] uma lipase, em que a lipase compreende:
[2051] uma lipase de éster carboxílico;
[2052] uma diacilglicerol lipase alfa;
[2053] uma diacilglicerol lipase beta;
[2054] uma lipase A;
[2055] uma lipase hepática;
[2056] uma lipase sensível a hormônios;
[2057] uma lipase gástrica;
[2058] uma lipase endotelial;
[2059] um membro da lipase H;
[2060] um membro da família lipase I;
[2061] um membro da família lipase J;
[2062] um membro da família lipase K;
[2063] um membro da família lipase M;
[2064] um membro da família lipase N;
[2065] uma lipase lipoproteica;
[2066] uma lipase monoglicerídica;
[2067] uma proteína 2 relacionada à lipase pancreática;
[2068] uma proteína 3 relacionada à lipase pancreática;
[2069] uma lipase de acilglicerol;
[2070] uma galactolipase;
[2071] uma lipase lipoproteica;
[2072] uma lipase de Burkholderia cepacia;
[2073] uma lipase de Burkholderia stearothermophilus;
[2074] uma lipase de Pseudomonas;
[2075] uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 262-266;
[2076] ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.
[2077] A modalidade 21 é uma proteína de fusão que compreende:
[2078] uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante; e
[2079] uma xilanase, em que a xilanase compreende:
[2080] uma beta-xilanase;
[2081] uma xilanase de Caldicellulosiruptor;
[2082] uma xilanase de Bacillus;
[2083] uma xilanase de Neocallimastix;
[2084] uma xilanase de Thermomyces;
[2085] uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 267-273;
[2086] ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.
[2087] A modalidade 22 é uma proteína de fusão da modalidade 21, em que a xilanase compreende uma beta-xilanase, a beta- xilanase compreendendo uma glucuronoarabinoxilana endo-1,4-beta-xilanase, uma exo-1,4-beta-xilanase, uma endo- 1,4-beta-xilanase, ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.
[2088] A modalidade 23 é uma proteína de fusão da modalidade 21 ou 22, em que a xilanase compreende uma xilanase de
Caldicellulosiruptor, em que a xilanase de Caldicellulosiruptor compreende uma xilanase de Caldicellulosiruptor saccharolyticus; em que a xilanase compreende uma xilanase de Bacillus, a xilanase de Bacillus compreendendo uma xilanase de Bacillus subtilis ou de Bacillus stearothermophilus; em que a xilanase compreende uma xilanase de Neocallimastix, em que a xilanase de Neocallimastix compreende uma xilanase de Neocallimastix patriciarum; ou em que a xilanase compreende uma xilanase de Thermomyces, a xilanase de Thermomyces compreendendo uma xilanase de Thermomyces lanuginosus.
[2089] A modalidade 24 é uma proteína de fusão da modalidade 21, em que a xilanase compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, em pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 268 ou 273.
[2090] A modalidade 25 é uma proteína de fusão da modalidade24, em que a xilanase compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 268.
[2091] A modalidade 26 é uma proteína de fusão que compreende:
[2092] uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante; e
[2093] uma xilosidase, em que a xilosidase compreende:
[2094] uma xilosidade de Caldicellulosiruptor saccharolyticus;
[2095] uma xilosidase de Bacillus pumilus;
[2096] uma xilosidase de Bacillus subtilis;
[2097] uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 274-276;
[2098] ou uma combinação das mesmas.
[2099] A modalidade 27 é uma proteína de fusão da modalidade 26, em que a xilosidase compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, em pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 275.
[2100] A modalidade 28 é uma proteína de fusão da modalidade 26, em que a xilosidase compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, em pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 276.
[2101] A modalidade 29 é uma proteína de fusão que compreende:
[2102] uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante; e
[2103] uma lactonase, a lactonase compreendendo:
[2104] uma lactonase de Bacillus;
[2105] uma lactonase de Agrobacterium;
[2106] uma lactonase de Rhodococcus;
[2107] uma lactonase de Streptomyces;
[2108] uma lactonase de Arthrobacter;
[2109] uma lactonase de Sphingomonas;
[2110] uma lactonase de Pseudomonas;
[2111] uma lactonase de Klebsiella;
[2112] uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 277 ou 278;
[2113] ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.
[2114] A modalidade 30 é uma proteína de fusão da modalidade 29, em que a lactonase compreende uma lactonase de Agrobacterium, uma lactonase de Rhodococcus, uma lactonase de Streptomyces, uma lactonase de Arthrobacte, uma lactonase de Sphingomonas, uma lctonase de Pseudomonas, uma lactonase de Klebsiella ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.
[2115] A modalidade 31 é uma proteína de fusão da modalidade 29, em que a lactonase compreende uma lactonase de Bacillus, uma lactonase de Bacillus compreendendo uma lactonase de Bacillus thuringiensi, uma lactonase de Bacillus pseudomycoides ou uma combinação das mesmas.
[2116] A modalidade 32 é uma proteína de fusão da modalidade 31, em que a lactonase compreende uma lactonase AiiA.
[2117] A modalidade 33 é uma proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 29 a 32, em que a lactonase é específica para uma molécula de sinalização homoserina lactona bacteriana.
[2118] A modalidade 34 é uma proteína de fusão que compreende:
[2119] uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante; e
[2120] uma quitosanase, a quitosanase:
[2121] compreendendo uma exo-1,4-beta-D- glucosaminidase;
[2122] compreendendo uma endo-1,4-beta-d- glucosaminidase;
[2123] compreendendo uma quitosanase de Streptomyces;
[2124] compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 280;
[2125] consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100 % de identidade em relação à SEQ ID NO: 279;
[2126] ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.
[2127] A modalidade 35 é uma proteína de fusão da modalidade 34, em que a quitosanase consiste em uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 279.
[2128] A modalidade 36 é uma proteína de fusão da modalidade 34, em que a quitosanase compreende uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 280.
[2129] A modalidade 37 é uma proteína de fusão que compreende:
[2130] uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante; e
[2131] uma protease, a protease compreendendo:
[2132] uma protease de asparagina;
[2133] uma protease de Bacillus;
[2134] uma protease de Aspergillus;
[2135] uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 303-306;
[2136] ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.
[2137] A modalidade 38 é uma proteína de fusão da modalidade 37, em que a protease não consiste em uma metionina aminopeptidase.
[2138] A modalidade 39 é uma proteína de fusão da modalidade 37 ou 38, em que a protease não compreende uma metionina aminopeptidase.
[2139] A modalidade 40 é uma proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 37 a 39, em que a protease compreende uma protease de Aspergillus.
[2140] A modalidade 41 é uma proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 37 a 39, em que a protease compreende uma protease de Bacillus, em que a protease de Bacillus compreend uma protease de Bacillus subtilis.
[2141] A modalidade 42 é uma proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 37 a 39, em que a protease compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, em identidade de pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% da SEQ ID NO: 305 ou 306.
[2142] A modalidade 43 é uma proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 37 a 39, em que a protease compreende uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade em relação à SEQ ID NO:
304.
[2143] A modalidade 44 é uma proteína de fusão que compreende:
[2144] uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante; e
[2145] uma glucanase, a glucanase:
[2146] compreendendo uma alfa-1,6-glucanase;
[2147] compreendendo uma beta 1,3/1,4 glucanase;
[2148] compreendendo um xiloglucano:xiloglucosil transferase;
[2149] compreendendo uma ciclo-heptaglucanase;
[2150] compreendendo uma beta-glicosidase oligoxiloglucano;
[2151] compreendendo uma ciclo-hexaglucanase;
[2152] compreendendo uma xiloglucanase;
[2153] compreendendo uma 1,4-beta-celobiosidase de celulose;
[2154] compreendendo uma endo-1,3-beta-D- glucosidase de glucano;
[2155] compreendendo uma ciclomaltodextrinase;
[2156] compreendendo uma 1,3-beta-glucosidase de glucano;
[2157] compreendendo uma endo-1,3-alfa- glucosidase de glucano;
[2158] compreendendo uma endo-1,3(4)-beta- glucanase;
[2159] compreendendouma lichenase;
[2160] compreendendo uma laminarinase;
[2161] compreendendo uma 1,4-beta-glucosidase de glucano;
[2162] compreendendo uma endo-1,6-beta- glucosidase de glucano;
[2163] compreendendo uma 1,3-alfa-glucosidase de glucano;
[2164] compreendendo uma amilopectinase;
[2165] compreendendo uma amiloglucanase;
[2166] compreendendo uma amiloglucosidase;
[2167] compreendendo uma glucanase de Acidothermus;
[2168] compreendendo uma glucanase de Aspergillus;
[2169] compreendendo uma glucanase de Paenibacillus;
[2170] compreendendo uma glucanase de Helix;
[2171] compreendendo uma glucanase de Bacillus circulans;
[2172] compreendendo uma glucanase de Bacillus lichenformis;
[2173] compreendendo uma glucanase de Clostridium;
[2174] compreendendo uma beta-1,4-endoglucanase de Trichoderma reesei;
[2175] compreendendo uma amilase de Bacillus subtilis;
[2176] compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 281– 292 e 295–302;
[2177] consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 293 ou 294;
[2178] ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.
[2179] A modalidade 45 é uma proteína de fusão da modalidade 44, em que a glucanase compreende uma glucanase de Acidothermus, uma glucanse de Aspergillus, uma glucanase de Paenibacillus, uma glucanase de Helix, uma glucanase de Bacillus lichenformis, uma glucanase de Bacillus lichenformis, uma glucanase de Clostridium, uma beta-1,4- endoglucanase de Trostroderma reesei, uma amilase de Bacillus subtilis ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.
[2180] A modalidade 46 é uma proteína de fusão da modalidade 44 ou 45, em que a glucanase compreende uma glucanase de Helix, uma glucanase de Helix compreendendo uma glucanase de Helix pomatia; em que a glucanase compreende uma glucanase de Acidothermus, uma glucanase de Acidothermus compreende uma glucanase de Acidothermus cellulolyticus; em que a glucanase compreende uma glucanase de Clostridium, em que a glucanase de Clostridium compreende uma glucanase de Clostridium thermocellum; ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.
[2181] A modalidade 47 é uma proteína de fusão da modalidade 46, em que a glucanase de Helix pomatia compreende uma beta- 1,3-endoglucanase de Helix pomatia; ou em que a glucanase de Acidothermus compreende uma beta-1,4 endoglucanase de Acidothermus cellulolyticus.
[2182] A modalidade 48 é uma proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 44 a 46, em que a glucanase compreende uma xiloglucanase.
[2183] A modalidade 49 é uma proteína de fusão da modalidade 48, em que a xiloglucanase compreende uma endo-beta-1,4- glucanase específica para xiloglucano, uma exo-beta-1,4-glucanase específica para xiloglucano ou uma combinação das mesmas.
[2184] A modalidade 50 é uma proteína de fusão da modalidade 48 ou 49, em que a xiloglucanase compreende uma xiloglucanase de Paenibacillus ou uma xiloglucanase de Bacillus.
[2185] A modalidade 51 é uma proteína de fusão da modalidade 50, em que a xiloglucanase de Bacillus compreende uma xiloglucanase de Bacillus lichenformis.
[2186] A modalidade 52 é uma proteína de fusão da modalidade 50, em que a xiloglucanase de Paenibacillus compreende uma xiloglucanase de Paenibacillus pabuli.
[2187] A modalidade 53 é uma proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 44 a 46, em que a glucanase compreende uma liquenase.
[2188] A modalidade 54 é uma proteína de fusão da modalidade 53, em que a liquenase compreende uma liquenase de Bacillus subtilis ou uma liquenase de Clostridium thermocellum.
[2189] A modalidade 55 é uma proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 44 a 46, em que a glucanase compreende a amilase de Bacillus subtilis.
[2190] A modalidade 56 é uma proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 44 a 55, em que a glucanase compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, em pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 281–292, 295–296 e 298–302.
[2191] A modalidade 57 é uma proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 44 a 55, em que a glucanase compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, em identidade de pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% da SEQ ID NO: 299 ou 300.
[2192] A modalidade 58 é uma proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 44 a 55, em que a glucanase consiste em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 293 ou 294.
[2193] A modalidade 59 é uma proteína de fusão que compreende:
[2194] uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante; e
[2195] uma proteína expansina, a proteína expansina compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 316.
[2196] A modalidade 60 é uma proteína de fusão que compreende:
[2197] uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante; e
[2198] uma fitase, a fitase compreendendo:
[2199] uma fitase de Triticum;
[2200] uma fitase de Bacillus;
[2201] uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 313-315 e 380;
[2202] ou uma combinação das mesmas.
[2203] A modalidade 61 é uma proteína de fusão da modalidade 60, em que a fitase compreende uma fitase de Triticum, a fitase de Triticum compreendendo uma fitase de fitase de Triticum aestivum; ou em que a fitase compreende uma fitase de Bacillus, a fitase de Bacillus compreendendo uma fitase de Bacillus thuringiensis.
[2204] A modalidade 62 é uma proteína de fusão da modalidade 60 ou 61, em que a fitase compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 380.
[2205] A modalidade 63 é uma proteína de fusão que compreende:
[2206] uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante; e
[2207] uma fosfatase ácida, a fosfatase ácida compreendendo:
[2208] uma fosfatase ácida de Triticum;
[2209] uma fosfatase ácida de Bacillus;
[2210] uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs, 311, 312 e 378;
[2211] ou uma combinação das mesmas.
[2212] A modalidade 64 é uma proteína de fusão da modalidade 63, em que a fosfatase ácida compreende uma fosfatase ácida de Triticum, a fosfatase ácida de Triticum compreendendo uma fosfatase ácida de Triticum aestivum; ou em que a fosfatase ácida compreende uma fosfatase ácida de Bacillus, a fosfatase ácida de Bacillus compreendendo uma fosfatase ácida de Bacillus thuringiensis.
[2213] A modalidade 65 é uma proteína de fusão da modalidade 63 ou 64, em que a fosfatase ácida compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95 %, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311.
[2214] A modalidade 66 é uma proteína de fusão da modalidade 63 ou 64, em que a fosfatase ácida compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95 %, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 312.
[2215] A modalidade 67 é uma proteína de fusão da modalidade 63 ou 64, em que a fosfatase ácida compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 378.
[2216] A modalidade 68 é uma proteína de fusão que compreende:
[2217] uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante; e
[2218] uma pectinase, a pectinase compreendendo uma pectolase.
[2219] A modalidade 69 é uma proteína de fusão da modalidade 68, em que a pectolase compreende uma pectolase de Aspergillus ou uma pectolase de Bacillus.
[2220] A modalidade 70 é uma proteína de fusão da modalidade 68 ou 69, em que a pectolase compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 309 ou 310.
[2221] A modalidade 71 é uma proteína de fusão que compreende:
[2222] uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante; e
[2223] uma mananase.
[2224] A modalidade 72é uma proteína de fusão da modalidade 71, em que a proteína de fusão compreende uma mananase de Bacillus.
[2225] A modalidade 73 é uma proteína de fusão da modalidade 71 ou 72, em que a mananase compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307 ou 308.
[2226] A modalidade 74 é um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 1 a 73.
[2227] A modalidade 75 são fragmentos de exosporium derivados de um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 74.
[2228] A modalidade 76 é uma formulação compreendendo um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 74 e um veículo agricolamente aceitável.
[2229] A modalidade 77 é uma formulação que compreende fragmentos de exosporium da modalidade 75 e um veículo agricolamente aceitável.
[2230] A modalidade 78 é uma formulação da modalidade 76 ou 77, em que a proteína de fusão compreende uma fosfolipase C específica para a fosfatidilcolina de Bacillus cereus e a formulação compreende ainda uma mananase ou uma xiloglucanase.
[2231] A modalidade 79 é uma formulação da modalidade 76 ou 77, em que a proteína de fusão compreende uma mananase e a formulação compreende ainda uma fosfolipase C específica de fosfatidilcolina de Bacillus cereus.
[2232] A modalidade 80 é uma formulação da modalidade 76 ou 77, em que a proteína de fusão compreende uma xiloglucanase e a formulação compreende ainda uma fosfolipase C específica de fosfatidilcolina de Bacillus cereus.
[2233] A modalidade 81 é uma formulação da modalidade 76 ou 77, em que a proteína de fusão compreende uma xiloglucanase e a formulação compreende ainda uma mananase.
[2234] A modalidade 82 é uma formulação da modalidade 76 ou 77, em que a proteína de fusão compreende uma mananase e a formulação compreende ainda uma xiloglucanase.
[2235] A modalidade 83 é uma formulação da modalidade 76 ou 77, em que a proteína de fusão compreende uma fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 311, e em que a formulação compreende ainda uma fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 312.
[2236] A modalidade 84 é uma formulação da modalidade 76 ou 77, em que a proteína de fusão compreende uma fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 312, e em que a formulação compreende ainda uma fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 311.
[2237] A modalidade 85 é uma formulação que compreende um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão ou fragmentos de exosporium derivados de um membro da família Bacillus cereus que expressa uma proteína de fusão, em que a proteína de fusão compreende:
[2238] uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante; e
[2239] uma fosfatase ácida;
[2240] e em que a formulação compreende ainda uma segunda enzima.
[2241] A modalidade 86 é uma formulação que compreende um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão ou fragmentos de exosporium derivados de um membro da família Bacillus cereus que expressa uma proteína de fusão, em que a proteína de fusão compreende:
[2242] uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante; e
[2243] uma fosfolipase C;
[2244] e em que a formulação compreende ainda uma segunda enzima.
[2245] A modalidade 87 é uma formulação de qualquer uma das modalidades 76 a 86, em que a formulação compreende ainda agroquímicos.
[2246] A modalidade 88 é uma formulação de qualquer uma das modalidades 76 a 87, em que a formulação compreende ainda um fertilizante, um bioestimulante ou uma combinação dos mesmos.
[2247] A modalidade 89 é uma semente de planta tratada com um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade
74.
[2248] A modalidade 90 é uma semente de planta tratada com fragmentos de exosporium da modalidade 75.
[2249] A modalidade 91 é uma semente de planta tratada com uma formulação de qualquer uma das modalidades 76 a 88.
[2250] A modalidade 92 é uma semente de planta de qualquer uma das modalidades 89 a 91, em que a semente da planta é revestida com o membro da família Bacillus cereus recombinante, os fragmentos de exosporium ou a formulação.
[2251] A modalidade 93 é um aditivo para ração animal compreendendo um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 74.
[2252] A modalidade 94 é um aditivo para ração animal que compreende fragmentos de exosporium da modalidade 75.
[2253] A modalidade 95 é uma composição de ração animal que compreende ração animal e um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 74.
[2254] A modalidade 96 é uma composição de ração animal que compreende ração animal e fragmentos de exosporium da modalidade 75.
[2255] A modalidade 97 é um aditivo para ração animal da modalidade 93 ou 94 ou uma composição para ração animal da modalidade 95 ou 96, em que o aditivo ou composição compreende ainda um veículo adequado para a ingestão por um animal de gado ou animal doméstico.
[2256] A modalidade 98 é um aditivo para ração animal ou composição para raçã animal da modalidade 97, em que o transportador compreende amido, álcool polivinílico, uma dextrina, calcário, sacarose, talco, celulose ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.
[2257] A modalidade 99 é um aditivo para ração animal ou composição para ração animal da modalidade 98, em que a dextrina compreende maltodextrina, ciclodextrina ou uma combinação dos mesmos.
[2258] A modalidade 100 é um aditivo para ração animal ou composição de ração animal da modalidade 98 ou 99, em que o transportador compreende álcool polivinílico e celulose.
[2259] A modalidade 101 é uma composição de ração animal de qualquer uma das modalidades 95 a 100, em que a ração animal compreende forragem.
[2260] A modalidade 102 é uma composição de ração animal da modalidade 101, em que a forragem compreende feno, palha, silagem, uma ração comprimida, uma ração peletizada, um óleo, um grão, um grão germinado, uma leguminosa, uma fração insolúvel de um cultivo, cultura resíduo ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.
[2261] A modalidade 103 é uma composição de ração animal da modalidade 102, em que a leguminosa compreende soja.
[2262] A modalidade 104 é uma composição de ração animal da modalidade 102, em que a fração insolúvel de um cultivo para ração compreende talos de milho.
[2263] A modalidade 105 é uma composição de ração animal de qualquer uma das modalidades 95 a 104, em que a ração animal compreende um cereal.
[2264] A modalidade 106 é uma composição de ração animal da modalidade 105, em que o cereal compreende cevada, trigo, centeio, aveia, milho, arroz, milheto, sorgo ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.
[2265] A modalidade 107 é um método para estimular o crescimento da planta e/ou promoção da saúde da planta, compreendendo a aplicação de um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 74, fragmentos de exosporium da modalidade 75, ou uma formulação de qualquer uma das modalidades 76a 88 para um meio de crescimento vegetal, uma planta, uma semente de planta ou área em torno de uma planta ou semente de planta.
[2266] A modalidade 108 é um método da modalidade 107, em que o método compreende a aplicação de um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 74.
[2267] A modalidade 109 é um método da modalidade 107, em que o método compreende a aplicação de fragmentos de exosporium da modalidade 75.
[2268] A modalidade 110 é um método da modalidade 107, em que o método compreende a aplicação de uma formulação de qualquer uma das modalidades 76 a 88.
[2269] A modalidade 111 é um método de qualquer uma das modalidades 107 a 110, em que a proteína de fusão compreende uma fosfolipase C específica para fosfatidilcolina de Bacillus cereus e o método compreende ainda a aplicação de uma mananase ou uma xiloglucanase ao meio de crescimento vegetal, planta, semente de planta ou área circundante à planta ou à semente da planta.
[2270] A modalidade 112 é um método de qualquer uma das modalidades 107 a 110, em que a proteína de fusão compreende uma mananase e o método compreende ainda a aplicação de uma fosfolipase C específica para a fosfatidilcolina de Bacillus cereus ao meio de crescimento vegetal, planta, semente de planta ou área circundante à planta ou a semente da planta.
[2271] A modalidade 113 é um método de qualquer uma das modalidades 107 a 110, em que a proteína de fusão compreende uma xiloglucanase e o método compreende ainda a aplicação de uma fosfolipase C específica para a fosfatidilcolina de Bacillus cereus ao meio de crescimento vegetal, planta, semente de planta ou área circundante à planta ou a semente da planta.
[2272] A modalidade 114 é uma formulação de qualquer uma das modalidades 78, 79, 87 e 88, uma semente da modalidade 84 ou 85, ou um método da modalidade 111 ou 112, em que a fosfolipase C e a mananase estão presentes em quantidades sinergicamente eficazes.
[2273] A modalidade 115 é uma formulação de qualquer uma das modalidades 78, 80, 87 e 88, uma semente da modalidade 91 ou 92, ou um método da modalidade 111 ou 113, em que a fosfolipase C e a xiloglucanase estão presentes em quantidades sinergisticamente eficazes.
[2274] A modalidade 116 é um método de qualquer uma das modalidades 107 a 110, em que a proteína de fusão compreende uma xiloglucanase e o método compreende ainda a aplicação de uma mananase ao meio de crescimento da planta, planta, semente de planta ou área ao redor da planta ou semente de planta.
[2275] A modalidade 117 é um método de qualquer uma das modalidades 107 a 110, em que a proteína de fusão compreende uma mananase e o método compreende ainda a aplicação de uma xiloglucanase ao meio de crescimento da planta, planta, semente de planta ou área ao redor da planta ou semente de planta.
[2276] A modalidade 118 é uma formulação de qualquer uma das modalidades 81, 82, 87 e 88, uma semente da modalidade 91 ou 92, ou um método da modalidade 116 ou 117, em que a xiloglucanase e a mananase estão presentes em quantidades sinergicamente eficazes.
[2277] A modalidade 119 é um método de qualquer uma das modalidades 107 a 110, em que a proteína de fusão compreende uma fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 311 e em que o método compreende ainda a aplicação de uma fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 312 ao meio de crescimento vegetal, planta, semente de planta ou área circundante à planta ou à semente da planta.
[2278] A modalidade 120 é um método de qualquer uma das modalidades 107 a 110, em que a proteína de fusão compreende uma fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 312 e em que o método compreende ainda a aplicação de uma fosfatase ácida compreendendo SEQ ID NO: 311 ao meio de crescimento vegetal, planta, semente de planta ou área circundante à planta ou à semente da planta.
[2279] A modalidade 121 é um método para estimular o crescimento da planta e/ou promover a saúde da planta, compreendendo a aplicação de um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão a um meio de crescimento da planta, uma planta, uma semente de planta ou uma área ao redor de uma planta ou planta semente, em que a proteína de fusão compreende:
[2280] uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante; e
[2281] uma xilosidase, uma histidina protease, uma fosfatase ácida ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.
[2282] A modalidade 122 é um método para estimular o crescimento das plantas e/ou promoção da saúde da planta, compreendendo a aplicação de fragmentos de exosporium derivados a partir de esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressam uma proteína de fusão para um meio de crescimento da planta, uma planta, uma semente de planta ou uma área em torno de uma planta ou semente de planta, em que a proteína de fusão compreende:
[2283] uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante; e
[2284] uma xilosidase, uma histidina protease, uma fosfatase ácida ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.
[2285] A modalidade 123 é um método da modalidade 121 ou 122, em que a proteína de fusão compreende uma xilosidase.
[2286] A modalidade 124 é um método da modalidade 123, em que a xilosidase compreende uma xilosidase de Caldicellulosiruptor saccharolyticus, uma xilosidase de Bacillus pumilus, xilosidase de Bacillus subtilis, ou uma combinação dos mesmos.
[2287] A modalidade 125 é um método da modalidade 123 ou 124, em que a xilosidase compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, em pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 274-276.
[2288] A modalidade 126 é um método da modalidade 121 ou 122, em que a proteína de fusão compreende uma protease de histidina.
[2289] A modalidade 127 é um método da modalidade 121 ou 122, em que a proteína de fusão compreende uma fosfatase ácida.
[2290] A modalidade 128 é um método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a saúde das plantas, compreendendo a aplicação de um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão a um meio de crescimento vegetal, uma planta, uma semente de planta ou uma área ao redor de uma planta ou planta semente, em que a proteína de fusão compreende:
[2291] uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante; e
[2292] uma fosfatase ácida;
[2293] e em que o método compreende ainda a aplicação de uma segunda enzima ao meio de crescimento da planta, à planta, à semente da planta ou à área circundante à planta ou à semente da planta.
[2294] A modalidade 129 é um método para estimular o crescimento das plantas e/ou promoção da saúde da planta, compreendendo a aplicação de fragmentos de exosporium derivados a partir de esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressam uma proteína de fusão para um meio de crescimento da planta, uma planta, uma semente de planta ou uma área em torno de uma planta ou semente de planta, em que a proteína de fusão compreende:
[2295] uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante; e
[2296] uma fosfatase ácida;
[2297] e em que o método compreende ainda a aplicação de uma segunda enzima ao meio de crescimento da planta, à planta, à semente da planta ou à área circundante à planta ou à semente da planta.
[2298] A modalidade 130 é uma formulação de qualquer uma das modalidades 85-88, uma semente de qualquer uma das modalidades 89 a 92, ou um método da modalidade 128 ou 129, em que a segunda enzima compreende uma lipase, uma fosfolipase, uma glucanase, uma xilanase, uma pectinase, uma mananase, uma liquenase ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.
[2299] A modalidade 131 é uma formulação de qualquer uma das modalidades 85 a 88 e 130, uma semente de qualquer uma das modalidades 89 a92 e 130, ou um método de qualquer uma das modalidades 121, 122 e 127-130, em que a fosfatase ácida compreende uma fosfatase ácida de Triticum aestivum.
[2300] A modalidade 132 é uma formulação de qualquer uma das modalidades 85 a 88, 130 e 131, uma semente de qualquer uma das modalidades 89 a 92, 130 e 131, ou um método de qualquer uma das modalidades 121, 122 e 127 a 131, em que a fosfatase ácida compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311 ou 312.
[2301] A modalidade 133 é um método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a saúde das plantas, compreendendo a aplicação de um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão a um meio de crescimento vegetal, uma planta, uma semente de planta ou uma área ao redor de uma planta ou planta semente, em que a proteína de fusão compreende:
[2302] uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante; e
[2303] uma fosfolipase C;
[2304] e em que o método compreende ainda a aplicação de uma segunda enzima ao meio de crescimento da planta, à planta, à semente da planta ou à área circundante à planta ou à semente da planta.
[2305] A modalidade 134 é um método para estimular o crescimento das plantas e/ou promoção da saúde da planta, compreendendo a aplicação de fragmentos de exosporium derivados a partir de esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressam uma proteína de fusão para um meio de crescimento da planta, uma planta, uma semente de planta ou uma área em torno de uma planta ou semente de planta, em que a proteína de fusão compreende:
[2306] uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro da família Bacillus cereus recombinante; e
[2307] uma fosfolipase C;
[2308] e em que o método compreende ainda a aplicação de uma segunda enzima ao meio de crescimento da planta, à planta, à semente da planta ou à área circundante à planta ou à semente da planta.
[2309] A modalidade 135 é uma formulação das modalidades 86 a 88 ou um método da modalidade 133 ou 134, em que a fosfolipase C compreende uma fosfolipase C de Bacillus thuringiensis.
[2310] A modalidade 136 é uma formulação das modalidades 86 a 88 ou 135 ou um método de qualquer uma das modalidades 133 a 135, em que a fosfolipase C restringe uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, em identidade de pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% da SEQ ID NO: 250 ou SEQ ID NO: 251.
[2311] A modalidade 137 é uma formulação ou método da modalidade 136, em que a fosfolipase C consiste essencialmente em ou consiste em SEQ ID NO: 250 ou SEQ ID NO: 251.
[2312] A modalidade 138 é uma formulação de qualquer uma das modalidades 86 a 88 e 135 a 137 ou um método de qualquer uma das modalidades 133 a 137, em que a segunda enzima compreende uma xiloglucanase ou uma mananase.
[2313] A modalidade 139 é uma formulação ou método da modalidade 138, em que a segunda enzima compreende uma xiloglucanase e a xiloglucanase compreende uma xiloglucanase de Paenibacillus pabuli ou uma xiloglucanase de Bacillus licheniformis.
[2314] A modalidade 140 é uma formulação ou método da modalidade 138 ou 139, em que a segunda enzima compreende uma xiloglucanase e a xiloglucanase compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299 ou 300.
[2315] A modalidade 141 é uma formulação ou método da modalidade 140, em que a fosfolipase C compreende a SEQ ID NO: 250 e a xiloglucanase compreende a SEQ ID NO: 299.
[2316] A modalidade 142 é uma formulação ou método da modalidade 140, em que a fosfolipase C compreende a SEQ ID NO: 250 e a xiloglucanase compreende a SEQ ID NO: 300.
[2317] A modalidade 143 é uma formulação ou método de qualquer uma das modalidades 138 a 142 ou uma semente da modalidade 91 ou 92, em que a fosfolipase C e a xiloglucanase estão presentes em quantidades sinergisticamente eficazes.
[2318] A modalidade 144 é uma formulação ou método da modalidade 138, em que a segunda enzima compreende uma mananase e a mananase compreende uma mananase de Bacillus circulans ou uma mananase de Bacillus subtilis.
[2319] A nodalidade 145 é uma formulação ou método da modalidade 138 ou 144, em que a segunda enzima compreende uma mananase e a mananase compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307 ou 308.
[2320] A modalidade 146 é uma formulação ou método da modalidade 145, em que a fosfolipase C compreende a SEQ ID NO: 250 e a mananase compreende a SEQ ID NO: 308.
[2321] A modalidade 147 é uma formulação ou método da modalidade 145, em que a fosfolipase C compreende a SEQ ID NO: 250 e a mananase compreende a SEQ ID NO: 307.
[2322] A modalidade 148 é uma formulação ou método de qualquer uma das modalidades 144 a 147 ou uma semente da modalidade 91 ou 92, em que a fosfolipase C e a mananase estão presentes em quantidades sinergisticamente eficazes.
[2323] A modalidade 149 é um método de qualquer uma das modalidades 107 a 132, em que o método compreende a aplicação do membro da família Bacillus cereus recombinante, os fragmentos de exosporium ou a formulação no meio de crescimento da planta.
[2324] A modalidade 150 é um método da modalidade 149, em que o meio de crescimento da planta compreende um fertilizante.
[2325] A modalidade 151 é um método da modalidade 149, em que o meio de crescimento da planta consiste essencialmente em um fertilizante.
[2326] A modalidade 152 é um método de qualquer uma das modalidades 107 a 151, em que o método compreende ainda suplementar o meio de crescimento da planta com um substrato para uma enzima.
[2327] A modalidade 153 é um método da modalidade 152, em que o substrato compreende triptofano, um adenosina monofosfato, um adenosina difosfato, um adenosina trifosfato (por exemplo, adenosina-3-trifosfato), um polifosfato, uma refeição proteica, um trimetafosfato,
uma celulose, um metilcelulose, quitina, quitosana, derivado de celulose, fosfato, gordura, cera, fosfolipídeo, ácido fítico ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.
[2328] A modalidade 154 é um método de qualquer uma das modalidades 107 a 153, em que o método compreende a aplicação do membro da família Bacillus cereus recombinante, os fragmentos de exosporium ou a formulação na planta.
[2329] A modalidade 155 é um método da modalidade 154, em que o método compreende a aplicação do membro da família Bacillus cereus recombinante, os fragmentos de exosporium ou a formulação nas raízes da planta.
[2330] A modalidade 156 é um método da modalidade 154 ou 155, em que o método compreende a aplicação do membro da família Bacillus cereus recombinante, os fragmentos de exosporium ou a formulação foliarmente.
[2331] A modalidade 157 é um método de qualquer uma das modalidades 107 a 156, em que o método compreende a aplicação do membro da família Bacillus cereus recombinante, os fragmentos de exosporium ou a formulação à semente da planta.
[2332] A modalidade 158 é um método da modalidade 157, em que a aplicação do membro da família Bacillus cereus recombinante, os fragmentos de exosporium ou a formulação à semente da planta compreende:
[2333] (a) aplicação de membro da família Bacillus cereus recombinante, fragmentos de exosporium ou formulação à semente da planta no momento do plantio; ou
[2334] (b) revestimento da semente da planta com o membro da família recombinante Bacillus cereus, os fragmentos de exosporium ou a formulação.
[2335] A modalidade 159 é um método de qualquer uma das modalidades 107 a 158, em que o método compreende ainda a aplicação de um agroquímico no meio de crescimento da planta, na planta, na semente da planta ou na área ao redor da planta ou na semente da planta.
[2336] A modalidade 160 é um método de qualquer uma das modalidades 107 a 159, em que o método compreende ainda aplicar um fertilizante, um bioestimulante ou uma combinação dos mesmos ao meio de crescimento da planta, à planta, à semente da planta ou à área ao redor da planta ou a semente da planta.
[2337] A modalidade 161 é um método de qualquer uma das modalidades 107 a 160, em que as plantas cultivadas na presença do membro da família Bacillus cereus recombinante, os fragmentos de exosporium ou a formulação exibem crescimento aumentado em comparação com as plantas cultivadas na ausência da enzima, a proteína expansina, ou o microorganismo, nas mesmas condições.
[2338] A modalidade 162 é um método de qualquer uma das modalidades 107 a 161, em que as sementes às quais o membro da família Bacillus cereus recombinante, os fragmentos de exosporium ou a formulação foram aplicadas exibem taxas de germinação aumentadas em comparação com as sementes às quais a enzima ou microorganismo não foi aplicado, nas mesmas condições.
[2339] A modalidade 163 é um método de qualquer uma das modalidades 107 a 162, em que as plantas cultivadas na presença do membro da família Bacillus cereus recombinante, os fragmentos de exosporium ou a formulação exibem aumento da captação de nutrientes em comparação com as plantas cultivadas na ausência da enzima, a proteína expansina, ou o microorganismo, nas mesmas condições.
[2340] A modalidade 164 é um método de qualquer uma das modalidades 107 a 163, em que as plantas cultivadas na presença do membro da família Bacillus cereus recombinante, os fragmentos de exosporium ou a formulação exibem suscetibilidade reduzida a um patógeno em comparação com as plantas cultivadas na ausência de a enzima ou o microrganismo, nas mesmas condições.
[2341] A modalidade 165 é um método de qualquer uma das modalidades 107 a 164, em que as plantas cultivadas na presença do membro da família Bacillus cereus recombinante, os fragmentos de exosporium ou a formulação exibem suscetibilidade reduzida a um estresse ambiental em comparação com as plantas cultivadas na ausência da enzima ou do microrganismo, nas mesmas condições.
[2342] A modalidade 166 é um método da modalidade 165, em que o estresse ambiental compreende seca, inundação, calor, congelamento, sal, metais pesados, pH baixo, pH alto ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.
[2343] A modalidade 167 é um método de qualquer uma das modalidades 107 a 166, em que as plantas cultivadas na presença do membro da família Bacillus cereus recombinante, os fragmentos de exosporium ou a formulação exibem conteúdo aumentado de nutrientes em comparação com as plantas cultivadas na ausência da enzima, a proteína expansina, ou o micro- organismo, nas mesmas condições.
[2344] A modalidade 168 é um método da modalidade 167, em que o nutriente compreende um polissacarídeo, uma proteína, ácido fítico, um fosfato, um fosfolípido ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.
[2345] A modalidade 169 é um método de qualquer uma das modalidades 107 a 168, em que as plantas cultivadas na presença do membro da família Bacillus cereus recombinante, os fragmentos de exosporium ou a formulação exibem aumento da nodulação da raiz em comparação com as plantas cultivadas na ausência da enzima ou o microorganismo, nas mesmas condições.
[2346] A modalidade 170 é um método de qualquer uma das modalidades 107 a 169, em que as plantas cultivadas na presença do membro da família Bacillus cereus recombinante, os fragmentos de exosporium ou a formulação exibem amadurecimento mais lento dos frutos quando comparados às plantas cultivadas na ausência da enzima ou o microrganismo, nas mesmas condições.
[2347] A modalidade 171 é um método de qualquer uma das modalidades 107 a 170, em que as plantas cultivadas na presença do membro da família Bacillus cereus recombinante, os fragmentos de exosporium ou a formulação exibem maior rendimento de colheita em comparação com as plantas cultivadas na ausência da enzima, a proteína expansina, ou o microorganismo, nas mesmas condições.
[2348] A modalidade 172 é um método de qualquer uma das modalidades 107 a 171, em que as plantas cultivadas na presença do membro da família Bacillus cereus recombinante, os fragmentos de exosporium ou a formulação exibem senescência foliar alterada em comparação com as plantas cultivadas na ausência da enzima ou o microrganismo, nas mesmas condições.
[2349] A modalidade 173 é um método para entregar uma enzima a um animal, compreendendo alimentar o animal com um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 74, fragmentos de exosporium da modalidade 75 ou uma combinação dos mesmos.
[2350] A modalidade 174 é um método da modalidade 173, em que o membro da família recombinante Bacillus cereus ou os fragmentos de exosporium estão em um aditivo para ração animal ou em uma composição para ração animal.
[2351] A modalidade 175 é um método da modalidade 174, em que o aditivo para ração animal compreende um aditivo para ração animal de qualquer uma das modalidades 93, 94 e 97 a 100 ou em que a composição para ração animal compreende uma composição para ração animal de qualquer uma das modalidades 95 a 106.
[2352] A modalidade 176 é um método de qualquer uma das modalidades 173 a 175, em que o método compreende a aplicação do membro da família Bacillus cereus recombinante ou dos fragmentos de exosporium a uma planta, a uma semente de planta ou para cultivar resíduos e alimentar a planta, semente de planta, ou resíduo de colheita para o animal.
[2353] A modalidade 177 é um método da modalidade 176, em que o método compreende aplicar o membro da família Bacillus cereus recombinante ou os fragmentos de exosporium à planta ou semente da planta antes da colheita.
[2354] A modalidade 178 é um método da modalidade 177, em que o método compreende aplicar o membro da família Bacillus cereus recombinante ou os fragmentos de exosporium à planta ou semente da planta após a colheita.
[2355] A modalidade 179 é um método de qualquer uma das modalidades 176 a 178, em que a semente da planta ou planta compreende soja, cevada, trigo, centeio, aveia, arroz, milho, sorgo, grama ou planta de alfafa ou semente da planta, ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.
[2356] A modalidade 180 é um método de qualquer uma das modalidades 173 a 179, em que o animal compreende um animal de gado ou um animal doméstico.
[2357] A modalidade 181 é um método da modalidade 180, em que o animal compreende aves, suínos, gado, um cavalo, uma cabra, uma ovelha, um cachorro, um gato, um peixe, um coelho ou um roedor.
[2358] A modalidade 182 é uma proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 1 a 73, um membro da família Bacillus cereus recombinante da modalidade 74, fragmentos de exosporium da modalidade 75, uma formulação de qualquer uma das modalidades 76-88, 114, 115, 118, 130- 132 e 135 a 148, uma semente de qualquer uma das modalidades 89 a 92, 114, 115, 118, 130-132, 143 e 148, um aditivo para ração animal de qualquer uma das modalidades 93, 94 e 97 a 100, uma composição de ração animal de qualquer uma das modalidades 95 a 106, ou um método de qualquer uma das modalidades 107 a 181, em que a enzima com atividade de ACC desaminase, a fosfolipase, a lipase, a xilanase, a xilosidase, a lactonase, a quitosanase, a protease, a glucanase, a proteína expansina, a fitase, a fosfatase ácida, a pectinase ou a mananase compreendem ainda um peptídeo sinal.
[2359] A modalidade 183 é uma proteína de fusão, membro da família Bacillus cereus recombinante, fragmentos de exosporium, formulação, semente, aditivo para ração animal, composição de ração animal ou método da modalidade 182, em que o peptídeo sinal está presente no terminal amino da enzima que possui atividade de ACC desaminase, a fosfolipase, a lipase, a xilanase, a xilosidase, a lactonase, a quitosanase, a protease, a glucanase, a proteína expansina, a fitase, a fitase, a fosfatase ácida, a pectinase ou a mananase.
[2360] A modalidade 184 é uma proteína de fusão, membro da família Bacillus cereus recombinante, fragmentos de exosporium, formulação, semente, aditivo para ração animal, composição de ração animal ou método da modalidade 182 ou 183, em que o peptídeo sinal compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 317-360 e 376-379.
[2361] A modalidade 185 é uma proteína de fusão, membro da família Bacillus cereus recombinante, fragmentos de exosporium, formulação, semente, aditivo para ração animal, composição de ração animal ou método de qualquer uma das modalidades 182 a 184, em que:
[2362] a proteína de fusão compreende uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 252 e em que a fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 317 no seu terminal amino;
[2363] a proteína de fusão compreende uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos
70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 253, e em que a fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 318 no seu terminal amino;
[2364] a proteína de fusão compreende uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 254 e em que a fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 319 no seu terminal amino;
[2365] a proteína de fusão compreende uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 255 e em que a fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 320 no seu terminal amino;
[2366] a proteína de fusão compreende uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256 e em que a fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 321 no seu terminal amino;
[2367] a proteína de fusão compreende uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 256, e em que a fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 322 no seu terminal amino;
[2368] a proteína de fusão compreende uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%,
pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 257, e em que a fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 323 no seu terminal amino;
[2369] a proteína de fusão compreende uma lipase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 263, e em que a lipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 324 no seu terminal amino;
[2370] a proteína de fusão compreende uma lipase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 264, e em que a lipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 325 no seu terminal amino;
[2371] a proteína de fusão compreende uma lipase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 265 e em que a lipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 326 no seu terminal amino;
[2372] a proteína de fusão compreende uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 267, e em que a xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 327 no seu terminal amino;
[2373] a proteína de fusão compreende uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade em relação à
SEQ ID NO: 268 e em que a xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 328 no seu terminal amino;
[2374] a proteína de fusão compreende uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 269, e em que a xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 329 no seu terminal amino;
[2375] a proteína de fusão compreende uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 270, e em que a xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 330 no seu terminal amino;
[2376] a proteína de fusão compreende uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 273, e em que a xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 331 no seu terminal amino;
[2377] a proteína de fusão compreende uma quitosanase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, em pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 279 e em que a quitosanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 332 no seu terminal amino;
[2378] a proteína de fusão compreende uma quitosanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 280, e em que a quitosanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 333 no seu terminal amino;
[2379] a proteína de fusão compreende uma glucanase consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, em pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 294, e em que a glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 334 no seu terminal amino;
[2380] a proteína de fusão compreende uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 295 e em que a glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 335 no seu terminal amino;
[2381] a proteína de fusão compreende uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 296, e em que a glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 336 no seu terminal amino;
[2382] a proteína de fusão compreende uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 297 e em que a glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 337 no seu terminal amino;
[2383] a proteína de fusão compreende uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 298, e em que a glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 338 no seu terminal amino;
[2384] a proteína de fusão compreende uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299, e em que a glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 339 no seu terminal amino;
[2385] a proteína de fusão compreende uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 300 e em que a glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 340 no seu terminal amino;
[2386] a proteína de fusão compreende uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 302 e em que a glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 341 no seu terminal amino;
[2387] a proteína de fusão compreende uma protease compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 304 e em que a protease compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 342 no seu terminal amino;
[2388] a proteína de fusão compreende uma protease compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade em relação à
SEQ ID NO: 306, e em que a protease compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 343 no seu terminal amino;
[2389] a proteína de fusão compreende uma mananase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307, e em que a mananase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 344 no seu terminal amino;
[2390] a proteína de fusão compreende uma mananase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 308, e em que a mananase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 345 no seu terminal amino;
[2391] a proteína de fusão compreende uma pectolase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 309 e em que a pectolase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 346 no seu terminal amino;
[2392] a proteína de fusão compreende uma pectolase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 310 e em que a pectolase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 347 no seu terminal amino;
[2393] a proteína de fusão compreende uma fosfatase ácida compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 311, e em que a fosfatase ácida compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 348 no seu terminal amino;
[2394] a proteína de fusão compreende uma fosfatase ácida compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 312, e em que a fosfatase ácida compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 349 no seu terminal amino;
[2395] a proteína de fusão compreende uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 313 e em que a fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 350 no seu terminal amino;
[2396] a proteína de fusão compreende uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 314 e em que a fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 350 no seu terminal amino;
[2397] a proteína de fusão compreende uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 315, e em que a fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 351 no seu terminal amino;
[2398] a proteína de fusão compreende uma proteína de expansina compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 316, e em que a proteína expansina compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 352 no seu terminal amino;
[2399] a proteína de fusão compreende uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 373 e em que a fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 376 no seu terminal amino;
[2400] a proteína de fusão compreende uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 375, e em que a fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 377 no seu terminal amino;
[2401] a proteína de fusão compreende uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99 % ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 380, e em que a fitase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 354 no seu terminal amino; ou
[2402] a proteína de fusão compreende uma fosfatase ácida compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 378, e em que a fosfatase ácida compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 379 no seu terminal amino.
[2403] A modalidade 186 é uma proteína de fusão, membro da família Bacillus cereus recombinante, fragmentos de exosporium, formulação, semente, aditivo para ração animal, composição de ração animal ou método da modalidade 185, em que a proteína de fusão compreende uma glucanase que consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 294, e em que a glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 334 no seu terminal amino.
[2404] A modalidade 187 é uma proteína de fusão, membro da família Bacillus cereus recombinante, fragmentos de exosporium, formulação, semente, aditivo para ração animal, composição de ração animal ou método da modalidade 185, em que a proteína de fusão compreende uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 295, e em que a glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 335 no seu terminal amino.
[2405] A modalidade 188 é uma proteína de fusão, membro da família Bacillus cereus recombinante, fragmentos de exosporium, formulação, semente, aditivo para ração animal, composição de ração animal ou método da modalidade 185, em que a proteína de fusão compreende uma xilanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70 %, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 268, e em que a xilanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 328 no seu terminal amino.
[2406] A modalidade 189 é uma proteína de fusão, membro da família Bacillus cereus recombinante, fragmentos de exosporium, formulação, semente, aditivo para ração animal, composição de ração animal ou método da modalidade 185, em que a proteína de fusão compreende uma pectolase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70 %, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 309, e em que a pectolase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 346 no seu terminal amino.
[2407] A modalidade 190 é uma proteína de fusão, membro da família Bacillus cereus recombinante, fragmentos de exosporium, formulação, semente, aditivo para ração animal, composição de ração animal ou método da modalidade 185, em que a proteína de fusão compreende uma fosfolipase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70 %, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 373, e em que a fosfolipase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo SEQ ID NO: 376 no seu terminal amino.
[2408] A modalidade 191 é um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 74 e 182 a 190, fragmentos de exosporium de qualquer uma das modalidades 75 e 182 a 190, uma formulação de qualquer uma das modalidades 76 a 88, 114, 115, 118, 130 a 132, 135 a 148 e 182 a 190, uma semente de qualquer uma das modalidades 89 a 92, 114, 115, 118, 130 a 132, 143, 148 e 182 a 190, um aditivo para ração animal de qualquer um das modalidades 93, 94, 97 a 100 e 182 a 190, uma composição de ração animal de qualquer uma das modalidades 95 a 106 e 182 a 190 ou um método de qualquer uma das modalidades 107 a 181, em que o membro da família Bacillus cereus recombinante é sob a forma de um esporo.
[2409] A modalidade 192 é um membro da família Bacillus cereus recombinante, fragmentos de exosporium, formulação, aditivo para ração animal, composição de ração animal, semente ou método da modalidade 191, em que o esporo é inativado.
[2410] A modalidade 193 é um método de qualquer uma das modalidades 107 a 121, 123 a 128 e 130 a 190, em que o método compreende ainda a inativação do membro da família Bacillus cereus recombinante antes da aplicação do membro da família Bacillus cereus recombinante ao meio de crescimento vegetal, a planta, a semente da planta ou a área circundante à planta ou a semente da planta ou antes de alimentar o membro da família recombinante Bacillus cereus recombinante ao animal.
[2411] A modalidade 194 é um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 74 e 182 a 192, fragmentos de exosporium de qualquer uma das modalidades 75 e 182-192, uma formulação de qualquer uma das modalidades 76 a 88, 114, 115, 118, 130 a 132, 135 a 148 e 182 a 192, uma semente de qualquer uma das modalidades 89 a 92, 114, 115, 118, 130 a 132, 143, 148 e 182 a 192, um aditivo para ração animal de qualquer uma das modalidades 93. 94, 97–100 e 182–192, uma composição de ração animal de qualquer uma das modalidades 95 a 106 e 182 a 192 ou um método de qualquer uma das modalidades 107 a 193, em que o membro da família Bacillus cereus recombinante compreende Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus samanii, Bacillus gaemokensis, Bacillus weihenstephensis, Bacillus toyoiensis, ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.
[2412] A modalidade 195 é um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 74, 182-192 e 194, fragmentos de exosporium de qualquer uma das modalidades 75, 182-192 e 194, uma formulação de qualquer uma das modalidades 76 a 88, 114, 115, 118, 130–132, 135–148, 182–192 e 194, uma semente de qualquer uma das modalidades 89–92, 114, 115, 118, 130–132, 143, 148, 182–192 e 194, um aditivo para ração animal de qualquer uma das modalidades 93. 94, 97–100, 182–192 e 194, uma composição de ração animal de qualquer uma das modalidades 95–106, 182–192 e 194, ou um método de qualquer uma das modalidades 107–194, em que o membro da família Bacillus cereus recombinante compreende uma cepa de bactérias promotoras de crescimento de plantas, uma cepa endofítica de bactérias ou uma cepa de bactérias que é tanto promotora de crescimento de plantas quanto endofítica.
[2413] A modalidade 196 é um membro da família Bacillus cereus recombinante, fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição de ração animal ou método da modalidade 195, em que a cepa de bactérias produz uma toxina inseticida, produz um composto fungicida, produz um composto nematicida, produz um composto bacteriocida, é resistente a um ou mais antibióticos, compreende um ou mais plasmídeos de replicação livre, liga-se a raízes de plantas, coloniza raízes de plantas, forma biofilmes, solubiliza nutrientes, segrega ácidos orgânicos ou uma combinação de qualquer disso.
[2414] A modalidade 197 é um membro da família Bacillus cereus recombinante, fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição para ração animal ou método da modalidade 196, em que a toxina inseticida compreende uma toxina Cry; em que o composto fungicida compreende uma β-1,3-glucanase, uma quitosanase, uma lyticase ou uma combinação de qualquer uma das mesmas; ou em que o composto nematicida compreende uma toxina Cry.
[2415] A modalidade 198 é um membro da família Bacillus cereus recombinante, fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição de ração animal ou método de qualquer uma das modalidades 194-197, em que o membro da família recombinante Bacillus cereus compreende Bacillus mycoides BT155 (NRRL No. B-50921), Bacillus mycoides EE118 (NRRL No. B-50918), Bacillus mycoides EE141 (NRRL No. B-50916), Bacillus mycoides BT46-3 (NRRL Nº B-50922), Bacillus cereus EE128 membro da família (NRRL No. B-50917), Bacillus thuringiensis BT013A (NRRL B-No. 50924), Bacillus cereus membro da família EE349 (NRRL Nº B-50928); membro da família Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119); Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120); Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121); Membro da família Bacillus cereus EE439 (NRRL B-50979); Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50974); Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977); Bacillus thuringiensis EE319 (NRRL B- 50983); Bacillus mycoides EE116 (NRRL Nº B-50919); ou Bacillus thuringiensis EE-B00184 (NRRL B-67122).
[2416] A modalidade 199 é um membro da família Bacillus cereus recombinante, fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição de ração animal ou método da modalidade 198, em que o membro da família recombinante Bacillus cereus compreende Bacillus thuringiensis BT013A (NRRL No. B-50924).
[2417] A modalidade 200é um membro da família Bacillus cereus recombinante, fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo de ração de animal, uma composição de ração animal, ou o método da modalidade 198, em que o elemento da família Bacillus cereus recombinante compreende o membro da família Bacillus cereus EE349 (NRRL No. B-50928).
[2418] A modalidade 201 são fragmentos de exosporium de qualquer uma das modalidades 75, 182–192 e 194–200, uma formulação de qualquer uma das modalidades 76–88, 114, 115, 118, 130–132, 135–148, 182–192 e 194–200, uma semente de qualquer uma das modalidades 89–92, 114, 115, 118, 130–132, 143, 148, 182–192 e 194–200, um aditivo para ração animal de qualquer uma das modalidades 93. 94, 97–100, 182–192 e 194– 200, uma composição de ração animal de qualquer uma das modalidades 96– 106, 182–192 e 194 e 147–153, ou um método de qualquer uma das modalidades 107–200, em que os fragmentos de exosporium são derivados de esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa a proteína de fusão, em que o membro da família Bacillus cereus recombinante também compreende uma mutação ou expressa uma proteína, em que a expressão da proteína é aumentada em comparação com a expressão da proteína em um membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem sob as mesmas condições e em que a mutação ou a expressão aumentada da proteína resulta em esporos do membro da família Bacillus cereus com um exosporium que é mais fácil de remover do esporo em comparação com o exosporium de um esporo do tipo selvagem.
[2419] A modalidade 202 são fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição para ração animal ou um método da modalidade 201, em que o membro da família Bacillus cereus recombinante:
[2420] (i) compreende uma mutação no gene CotE;
[2421] (ii) expressa uma proteína ExsY, em que a expressão da proteína ExsY é aumentada em comparação com a expressão da proteína ExsY em um membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem sob as mesmas condições e em que a proteína ExsY compreende um terminal carboxi etiqueta compreendendo uma proteína globular;
[2422] (iii) expressa uma proteína BclB, em que a expressão da proteína BclB é aumentada em comparação com a expressão da proteína BclB em um membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem sob as mesmas condições;
[2423] (iv) expressa uma proteína YjcB, em que a expressão da proteína YjcB é aumentada em comparação com a expressão da proteína YjcB em um membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem sob as mesmas condições;
[2424] (v) compreende uma mutação no gene ExsY;
[2425] (vi) compreende uma mutação no gene CotY;
[2426] (vii) compreende uma mutação no gene ExsA; ou
[2427] (viii) compreende uma mutação no gene CotO.
[2428] A modalidade 203 são fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição para ração animal ou um método da modalidade 201 ou 202, em que o membro da família Bacillus cereus recombinante compreende uma mutação no gene CotE.
[2429] A modalidade 204 são fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição de ração para animais ou um método da modalidade 203, em que a mutação no gene CotE inibe parcial ou completamente a capacidade de CotE de anexar o exosporium ao esporo.
[2430] A modalidade 205 são fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição para ração animal ou um método da modalidade 203 ou 204, em que a mutação no gene CotE compreende um knockout no gene CotE ou uma forma negativa dominante do gene CotE.
[2431] A modalidade 206 são fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição para ração animal ou um método de qualquer uma das modalidades 201 a 205, em que o membro da família recombinante Bacillus cereus expressa uma proteína ExsY, em que a expressão de a proteína ExsY é aumentada em comparação com a expressão da proteína ExsY em um membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem sob as mesmas condições e em que a proteína ExsY compreende uma etiqueta do terminal carboxi compreendendo uma proteína globular.
[2432] A modalidade 207 são fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição para ração animal ou um método da modalidade 206, em que a proteína globular tem um peso molecular entre 25 kDa e 100 kDa.
[2433] A modalidade 208 são fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição de alimentação animal ou um método da modalidade 206 ou 207, em que a proteína globular compreende uma proteína fluorescente verde (GFP) ou uma variante da mesma.
[2434] A modalidade 209 são fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição para ração animal ou um método de qualquer uma das modalidades 206-208, em que a expressão da proteína ExsY compreendendo a etiqueta do terminal carboxi compreendendo um globular A proteína inibe a ligação da proteína ExsY aos seus alvos no exosporium.
[2435] A modalidade 210 são fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição para ração animal ou um método de qualquer uma das modalidades 201 a 209, em que o membro da família recombinante Bacillus cereus expressa uma proteína BclB, em que a expressão de a proteína BclB é aumentada em comparação com a expressão da proteína BclB em um membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem nas mesmas condições.
[2436] A modalidade 211 são fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição de ração animal ou um método da modalidade 210, em que a expressão da proteína BclB resulta na formação de um exosporium frágil.
[2437] A modalidade 212 são fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição para ração animal ou um método de qualquer uma das modalidades 201-211, em que o membro da família recombinante Bacillus cereus expressa uma proteína YjcB, em que a expressão de a proteína YjcB é aumentada em comparação com a expressão da proteína YjcB em um membro da família Bacillus cereus de tipo selvagem sob as mesmas condições.
[2438] A modalidade 213 são fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição de ração animal ou um método da modalidade 212, em que a expressão da proteína YjcB faz com que o exosporium se forme em pedaços em vez de em uma estrutura completa.
[2439] A modalidade 214 são fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição para ração animal ou um método de qualquer uma das modalidades 201-213, em que o membro da família recombinante Bacillus cereus compreende uma mutação no gene ExsY.
[2440] A modalidade 215 são fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição para ração animal ou um método da modalidade 214, em que a mutação no gene ExsY inibe parcial ou completamente a capacidade de ExsY de concluir a formação do exosporium ou anexar o exosporium ao esporo.
[2441] A modalidade 216 são fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição para ração animal ou um método da modalidade 214 ou 215, em que a mutação no gene ExsY compreende um knockout no gene ExsY.
[2442] A modalidade 217 são fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição para ração animal ou um método de qualquer uma das modalidades 201-216, em que o membro da família Bacillus cereus recombinante compreende uma mutação no gene CotY.
[2443] A modalidade 218 são fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição para ração animal ou um método da modalidade 217, em que a mutação no gene CotY compreende um knockout no gene CotY.
[2444] A modalidade 219 são fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição de ração animal ou um método da modalidade 217 ou 218, em que a mutação no gene CotY resulta na formação de um exosporium frágil.
[2445] A modalidade 220 são fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição para ração animal ou um método de qualquer uma das modalidades 201-219, em que o membro da família recombinante Bacillus cereus compreende uma mutação no gene ExsA.
[2446] A modalidade 221 são fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição para ração animal ou um método da modalidade 220, em que a mutação no gene ExsA compreende um knockout no gene ExsA.
[2447] A modalidade 222 são fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição de ração animal ou um método da modalidade 220 ou 221, em que a mutação no gene ExsA resulta na formação de um exosporium frágil.
[2448] A modalidade 223 são fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição para ração animal ou um método de qualquer uma das modalidades
201 a 222, em que o membro da família Bacillus cereus recombinante compreende uma mutação no gene CotO.
[2449] A modalidade 224 são fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição para ração animal ou um método da modalidade 223, em que a mutação no gene CotO compreende um knockout no gene CotO ou uma forma negativa dominante do gene CotO.
[2450] A modalidade 225 são fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição de ração animal ou um método da modalidade 223 ou 224, em que a mutação no gene CotO faz com que o exosporium se forme em tiras.
[2451] A modalidade 226 é uma proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 1–73 e 182–190, um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 74, 182–192 e 194–200, fragmentos de exosporium de qualquer uma das modalidades 75, 182–192 e 194–225, uma formulação de qualquer uma das modalidades 76–88, 114, 115, 118, 130–132, 135–148, 182–192 e 194–225, uma semente de qualquer uma das modalidades 89–92, 114, 115, 118, 130–132, 143, 148, 182–192 e 194–225, um aditivo para ração animal de qualquer uma das modalidades 93, 94, 97–100 e 182–225, um composição de ração animal de qualquer uma das modalidades 95 a 106 e 182 a 225, ou um método de qualquer uma das modalidades 107 a 225, em que a sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium compreende:
[2452] (1) uma sequência de direcionamento compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 43% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 54%;
[2453] (2) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1;
[2454] (3) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1;
[2455] (4) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 1;
[2456] (5) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 2;
[2457] (6) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 1;
[2458] (7) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-35 da SEQ ID NO: 1;
[2459] (8) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-35 da SEQ ID NO: 1;
[2460] (9) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10 a 35 da SEQ ID NO: 1;
[2461] (10) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 1;
[2462] (11) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 3;
[2463] (12) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 3;
[2464] (13) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 3;
[2465] (14) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 4;
[2466] (15) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 3;
[2467] (16) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 3;
[2468] (17) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 3;
[2469] (18) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 3;
[2470] (19) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-38 da SEQ ID NO: 5;
[2471] (20) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 5;
[2472] (21) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 5;
[2473] (22) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 6;
[2474] (23) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 5;
[2475] (24) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 5;
[2476] (25) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-38 da SEQ ID NO: 5;
[2477] (26) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 5;
[2478] (27) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 5;
[2479] (28) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 20-38 da SEQ ID NO: 5;
[2480] (29) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-28 da SEQ ID NO: 7;
[2481] (30) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 13-28 da SEQ ID NO: 7;
[2482] (31) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 7;
[2483] (32) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 8;
[2484] (33) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 7;
[2485] (34) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 7;
[2486] (35) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-28 da SEQ ID NO: 7;
[2487] (36) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 7;
[2488] (37) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 9;
[2489] (38) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 9;
[2490] (39) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 9;
[2491] (40) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 10;
[2492] (41) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 9;
[2493] (42) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 9;
[2494] (43) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 9;
[2495] (44) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 11;
[2496] (45) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 11;
[2497] (46) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 11;
[2498] (47) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 12;
[2499] (48) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 11;
[2500] (49) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 11;
[2501] (50) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 11;
[2502] (51) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 11;
[2503] (52) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 11;
[2504] (53) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 13;
[2505] (54) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 13;
[2506] (55) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 13;
[2507] (56) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 14;
[2508] (57) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 13;
[2509] (58) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 13;
[2510] (59) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 13;
[2511] (60) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 13;
[2512] (61) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 13;
[2513] (62) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-43 da SEQ ID NO: 15;
[2514] (63) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 28-43 da SEQ ID NO: 15;
[2515] (64) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 15;
[2516] (65) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 16;
[2517] (66) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 15;
[2518] (67) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 15;
[2519] (68) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 15;
[2520] (69) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 15;
[2521] (70) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 15;
[2522] (71) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 15;
[2523] (72) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 15;
[2524] (73) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 17;
[2525] (74) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 17;
[2526] (75) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 17;
[2527] (76) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 18;
[2528] (77) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 17;
[2529] (78) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 17;
[2530] (79) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-27 da SEQ ID NO: 17;
[2531] (80) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 17;
[2532] (81) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 19;
[2533] (82) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 19;
[2534] (83) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 19;
[2535] (84) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 20;
[2536] (85) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 19;
[2537] (86) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 19;
[2538] (87) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 19;
[2539] (88) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 19;
[2540] (89) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 19;
[2541] (90) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 21;
[2542] (91) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 21;
[2543] (92) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 21;
[2544] (93) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 22;
[2545] (94) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 21;
[2546] (95) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 21;
[2547] (96) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 21;
[2548] (97) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 21;
[2549] (98) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 21;
[2550] (99) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 23;
[2551] (100) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 23;
[2552] (101) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 23;
[2553] (102) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 24;
[2554] (103) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 23;
[2555] (104) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 23;
[2556] (105) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 23;
[2557] (106) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 25;
[2558] (107) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 25;
[2559] (108) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 25;
[2560] (109) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 26;
[2561] (110) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 25;
[2562] (111) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 25;
[2563] (112) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 25;
[2564] (113) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 27;
[2565] (114) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-30 da SEQ ID NO: 27;
[2566] (115) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 27;
[2567] (116) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 28;
[2568] (117) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 27;
[2569] (118) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-30 da SEQ ID NO: 27;
[2570] (119) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 27;
[2571] (120) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 27;
[2572] (121) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 29;
[2573] (122) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 29;
[2574] (123) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 29;
[2575] (124) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 30;
[2576] (125) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 29;
[2577] (126) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 29;
[2578] (127) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 29;
[2579] (128) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 29;
[2580] (129) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 29;
[2581] (130) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 31;
[2582] (131) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 31;
[2583] (132) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 31;
[2584] (133) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 32;
[2585] (134) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 31;
[2586] (135) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 31;
[2587] (136) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-24 da SEQ ID NO: 31;
[2588] (137) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 33;
[2589] (138) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 33;
[2590] (139) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 34;
[2591] (140) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-16 da SEQ ID NO: 35;
[2592] (141) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 35;
[2593] (142) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 36;
[2594] (143) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-29 da SEQ ID NO: 43;
[2595] (144) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 14-29 da SEQ ID NO: 43;
[2596] (145) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 43;
[2597] (146) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 44;
[2598] (147) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-29 da SEQ ID NO: 43;
[2599] (148) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-29 da SEQ ID NO: 43;
[2600] (149) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-29 da SEQ ID NO: 43;
[2601] (150) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-29 da SEQ ID NO: 43;
[2602] (151) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 45;
[2603] (152) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 45;
[2604] (153) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 45;
[2605] (154) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 46;
[2606] (155) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 45;
[2607] (156) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5 a 35 da SEQ ID NO: 45;
[2608] (157) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8 a 35 da SEQ ID NO: 45;
[2609] (158) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10 a 35 da SEQ ID NO: 45;
[2610] (159) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 45;
[2611] (160) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-43 da SEQ ID NO: 47;
[2612] (161) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 28-43 da SEQ ID NO: 47;
[2613] (162) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 47;
[2614] (163) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 48;
[2615] (164) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-43 da SEQ ID NO: 47;
[2616] (165) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-43 da SEQ ID NO: 47;
[2617] (166) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-43 da SEQ ID NO: 47;
[2618] (167) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-43 da SEQ ID NO: 47;
[2619] (168) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-43 da SEQ ID NO: 47;
[2620] (169) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 20-43 da SEQ ID NO: 47;
[2621] (170) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 25-43 da SEQ ID NO: 47;
[2622] (171) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-32 da SEQ ID NO: 49;
[2623] (172) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 17-32 da SEQ ID NO: 49;
[2624] (173) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 49;
[2625] (174) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 50;
[2626] (175) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-32 da SEQ ID NO: 49;
[2627] (176) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5 a 32 da SEQ ID NO: 49;
[2628] (177) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-32 da SEQ ID NO: 49;
[2629] (178) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10 a 32 da SEQ ID NO: 49;
[2630] (179) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-32 da SEQ ID NO: 49;
[2631] (180) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 51;
[2632] (181) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 51;
[2633] (182) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 51;
[2634] (183) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 52;
[2635] (184) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 51;
[2636] (185) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 51;
[2637] (186) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 51;
[2638] (187) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 51;
[2639] (188) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 51;
[2640] (189) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 53;
[2641] (190) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 53;
[2642] (191) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 53;
[2643] (192) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 54;
[2644] (193) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 53;
[2645] (194) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 53;
[2646] (195) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-33 da SEQ ID NO: 53;
[2647] (196) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 53;
[2648] (197) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 53;
[2649] (198) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 55;
[2650] (199) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-30 da SEQ ID NO: 55;
[2651] (200) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 55;
[2652] (201) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 56;
[2653] (202) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 55;
[2654] (203) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5 a 30 da SEQ ID NO: 55;
[2655] (204) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8-30 da SEQ ID NO: 55;
[2656] (205) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-30 da SEQ ID NO: 55;
[2657] (206) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-130 da SEQ ID NO: 57;
[2658] (207) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 115-130 da SEQ ID NO: 57;
[2659] (208) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 57;
[2660] (209) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 58;
[2661] (210) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-130 da SEQ ID NO: 57;
[2662] (211) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-130 da SEQ ID NO: 57;
[2663] (212) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-130 da SEQ ID NO: 57;
[2664] (213) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 20-130 da SEQ ID NO: 57;
[2665] (214) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 30-130 da SEQ ID NO: 57;
[2666] (215) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 40-130 da SEQ ID NO: 57;
[2667] (216) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 50-130 da SEQ ID NO: 57;
[2668] (217) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 60-130 da SEQ ID NO: 57;
[2669] (218) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 70-130 da SEQ ID NO: 57;
[2670] (219) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 80-130 da SEQ ID NO: 57;
[2671] (220) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 90-130 da SEQ ID NO: 57;
[2672] (221) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 100-130 da SEQ ID NO: 57;
[2673] (222) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 110-130 da SEQ ID NO: 57;
[2674] (223) um fragmento de proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 95;
[2675] (224) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 96;
[2676] (225) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 97;
[2677] (226) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 98;
[2678] (227) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 99;
[2679] (228) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 100;
[2680] (229) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 101;
[2681] (230) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 102;
[2682] (231) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 103;
[2683] (232) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 104;
[2684] (233) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 105;
[2685] (234) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 106;
[2686] (235) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 108;
[2687] (236) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 109;
[2688] (237) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 110;
[2689] (238) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 111;
[2690] (239) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 112;
[2691] (240) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 113;
[2692] (241) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 114;
[2693] (242) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 115;
[2694] (243) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 116;
[2695] (244) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 117;
[2696] (245) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 118;
[2697] (246) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 119;
[2698] (247) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 120;
[2699] (248) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 121;
[2700] (249) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 22-31 da SEQ ID NO: 1;
[2701] (250) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 22-33 da SEQ ID NO: 1;
[2702] (251) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 20-31 da SEQ ID NO: 1;
[2703] (252) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 14-23 da SEQ ID NO: 3;
[2704] (253) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 14-25 da SEQ ID NO: 3;
[2705] (254) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 12-23 da SEQ ID NO: 3;
[2706] (255) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 59;
[2707] (256) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 59;
[2708] (257) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 60;
[2709] (258) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-30 da SEQ ID NO: 59;
[2710] (259) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 4-30 da SEQ ID NO: 59;
[2711] (260) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 6-30 da SEQ ID NO: 59;
[2712] (261) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 61;
[2713] (262) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 61;
[2714] (263) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 61;
[2715] (264) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 62;
[2716] (265) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-33 da SEQ ID NO: 61;
[2717] (266) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-33 da SEQ ID NO: 61;
[2718] (267) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-33 da SEQ ID NO: 61;
[2719] (268) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-33 da SEQ ID NO: 61;
[2720] (269) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 63;
[2721] (270) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 63;
[2722] (271) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 64;
[2723] (272) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-35 da SEQ ID NO: 63;
[2724] (273) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5 a 35 da SEQ ID NO: 63;
[2725] (274) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 8 a 35 da SEQ ID NO: 63;
[2726] (275) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-35 da SEQ ID NO: 63;
[2727] (276) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-35 da SEQ ID NO: 63;
[2728] (277) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 65;
[2729] (278) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 65;
[2730] (279) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 65;
[2731] (280) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 66;
[2732] (281) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 107;
[2733] (282) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 65;
[2734] (283) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 65;
[2735] (284) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 67;
[2736] (285) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 67;
[2737] (286) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 67;
[2738] (287) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 68;
[2739] (288) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-27 da SEQ ID NO: 67;
[2740] (289) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-27 da SEQ ID NO: 67;
[2741] (290) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-27 da SEQ ID NO: 67;
[2742] (291) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-38 da SEQ ID NO: 69;
[2743] (292) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 69;
[2744] (293) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 69;
[2745] (294) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 70;
[2746] (295) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 69;
[2747] (296) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 69;
[2748] (297) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 69;
[2749] (298) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 69;
[2750] (299) uma proteína do exosporium compreendendo SEQ ID NO: 72;
[2751] (300) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 73;
[2752] (301) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade em relação à SEQ ID NO: 74;
[2753] (302) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-42 da SEQ ID NO: 75;
[2754] (303) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 27-42 da SEQ ID NO: 75;
[2755] (304) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 75;
[2756] (305) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 76;
[2757] (306) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-42 da SEQ ID NO: 75;
[2758] (307) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-42 da SEQ ID NO: 75;
[2759] (308) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-42 da SEQ ID NO: 75;
[2760] (309) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-42 da SEQ ID NO: 75;
[2761] (310) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 20-42 da SEQ ID NO: 75;
[2762] (311) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 25-42 da SEQ ID NO: 75;
[2763] (312) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 77;
[2764] (313) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 77;
[2765] (314) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 77;
[2766] (315) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 78;
[2767] (316) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-24 da SEQ ID NO: 77;
[2768] (317) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-24 da SEQ ID NO: 77;
[2769] (318) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 80;
[2770] (319) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-38 da SEQ ID NO: 81;
[2771] (320) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 81;
[2772] (321) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 81;
[2773] (322) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 82;
[2774] (323) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-38 da SEQ ID NO: 81;
[2775] (324) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-38 da SEQ ID NO: 81;
[2776] (325) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-38 da SEQ ID NO: 81;
[2777] (326) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-38 da SEQ ID NO: 81;
[2778] (327) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 20-38 da SEQ ID NO: 81;
[2779] (328) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-34 da SEQ ID NO: 83;
[2780] (329) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 83;
[2781] (330) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 84;
[2782] (331) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 86;
[2783] (332) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-28 da SEQ ID NO: 87;
[2784] (333) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 13-28 da SEQ ID NO: 87;
[2785] (334) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 87;
[2786] (335) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 88;
[2787] (336) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 87;
[2788] (337) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 87;
[2789] (338) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 87;
[2790] (339) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-28 da SEQ ID NO: 89;
[2791] (340) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 89;
[2792] (341) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 90;
[2793] (342) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-28 da SEQ ID NO: 89;
[2794] (343) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 5-28 da SEQ ID NO: 89;
[2795] (344) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-28 da SEQ ID NO: 89;
[2796] (345) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-93 da SEQ ID NO: 91;
[2797] (346) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 91;
[2798] (347) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 92;
[2799] (348) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-93 da SEQ ID NO: 91;
[2800] (349) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-93 da SEQ ID NO: 91;
[2801] (350) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 20-93 da SEQ ID NO: 91;
[2802] (351) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 30-93 da SEQ ID NO: 91;
[2803] (352) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 40-93 da SEQ ID NO: 91;
[2804] (353) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 50-93 da SEQ ID NO: 91;
[2805] (354) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 60-93 da SEQ ID NO: 91;
[2806] (355) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-130 da SEQ ID NO: 93;
[2807] (356) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 93;
[2808] (357) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 94;
[2809] (358) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 2-130 da SEQ ID NO: 93;
[2810] (359) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-130 da SEQ ID NO: 93;
[2811] (360) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 20-130 da SEQ ID NO: 93;
[2812] (361) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 30-130 da SEQ ID NO: 93;
[2813] (362) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 122;
[2814] (363) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 20-33 da SEQ ID NO: 1;
[2815] (364) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 21-33 da SEQ ID NO: 1;
[2816] (365) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 23-31 da SEQ ID NO: 1;
[2817] (366) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 96;
[2818] (367) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 96;
[2819] (368) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 12-25 da SEQ ID NO: 3;
[2820] (369) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 13-25 da SEQ ID NO: 3;
[2821] (370) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 15-23 da SEQ ID NO: 3;
[2822] (371) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 97;
[2823] (372) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 98;
[2824] (373) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 23-36 da SEQ ID NO: 5;
[2825] (374) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 23-34 da SEQ ID NO: 5;
[2826] (375) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 24-36 da SEQ ID NO: 5;
[2827] (376) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 26-34 da SEQ ID NO: 5;
[2828] (377) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 13-26 da SEQ ID NO: 7;
[2829] (378) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 13-24 da SEQ ID NO: 7;
[2830] (379) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 14-26 da SEQ ID NO: 7;
[2831] (380) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 16-24 da SEQ ID NO: 7;
[2832] (381) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 9;
[2833] (382) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 9;
[2834] (383) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 9;
[2835] (384) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 12-20 da SEQ ID NO: 9;
[2836] (385) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 105;
[2837] (386) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 105;
[2838] (387) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 11;
[2839] (388) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 11;
[2840] (389) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 11;
[2841] (390) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 98;
[2842] (391) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 98;
[2843] (392) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 13;
[2844] (393) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 13;
[2845] (394) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 13;
[2846] (395) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 21-29 da SEQ ID NO: 13;
[2847] (396) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 99;
[2848] (397) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 99;
[2849] (398) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 28-41 da SEQ ID NO: 15;
[2850] (399) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 28-39 da SEQ ID NO: 15;
[2851] (400) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 29-41 da SEQ ID NO: 15;
[2852] (401) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 31-39 da SEQ ID NO: 15;
[2853] (402) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 12-25 da SEQ ID NO: 17;
[2854] (403) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 13-25 da SEQ ID NO: 17;
[2855] (404) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 100;
[2856] (405) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 19;
[2857] (406) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 19;
[2858] (407) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 19;
[2859] (408) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 21-29 da SEQ ID NO: 19;
[2860] (409) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 21;
[2861] (410) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 21;
[2862] (411) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 21;
[2863] (412) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 21-29 da SEQ ID NO: 21;
[2864] (413) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 101;
[2865] (414) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 101;
[2866] (415) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 23;
[2867] (416) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 23;
[2868] (417) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 23;
[2869] (418) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 12-20 da SEQ ID NO: 23;
[2870] (419) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 102;
[2871] (420) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 102;
[2872] (421) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 25;
[2873] (422) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 25;
[2874] (423) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 25;
[2875] (424) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 12-20 da SEQ ID NO: 25;
[2876] (425) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 103;
[2877] (426) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 103;
[2878] (427) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 15-28 da SEQ ID NO: 27;
[2879] (428) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 15-26 da SEQ ID NO: 27;
[2880] (429) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 16-28 da SEQ ID NO: 27;
[2881] (430) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 18-26 da SEQ ID NO: 27;
[2882] (431) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 104;
[2883] (432) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 104;
[2884] (433) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 33;
[2885] (434) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 1-11 da SEQ ID NO: 33;
[2886] (435) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 3-11 da SEQ ID NO: 33;
[2887] (436) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 1-14 da SEQ ID NO: 35;
[2888] (437) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 1-12 da SEQ ID NO: 35;
[2889] (438) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 2-14 da SEQ ID NO: 35;
[2890] (439) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 14-27 da SEQ ID NO: 43;
[2891] (440) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 14-25 da SEQ ID NO: 43;
[2892] (441) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 15-27 da SEQ ID NO: 43;
[2893] (442) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 20-33 da SEQ ID NO: 45;
[2894] (443) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 20-31 da SEQ ID NO: 45;
[2895] (444) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 21-33 da SEQ ID NO: 45;
[2896] (445) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 106;
[2897] (446) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 106;
[2898] (447) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 28-41 da SEQ ID NO: 47;
[2899] (448) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 28-39 da SEQ ID NO: 47;
[2900] (449) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 53;
[2901] (450) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 53;
[2902] (451) uma sequência de direcionamento consistindo nos aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 53;
[2903] (452) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 18-31 da SEQ ID NO: 61;
[2904] (453) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 18-29 da SEQ ID NO: 61;
[2905] (454) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 19-31 da SEQ ID NO: 61;
[2906] (455) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 65;
[2907] (456) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 65;
[2908] (457) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 65;
[2909] (458) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 107;
[2910] (459) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 1-13 da SEQ ID NO: 107;
[2911] (460) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 12-25 da SEQ ID NO: 67;
[2912] (461) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 12-23 da SEQ ID NO: 67;
[2913] (462) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 13-25 da SEQ ID NO: 67;
[2914] (463) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 15-23 da SEQ ID NO: 67;
[2915] (464) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 23-36 da SEQ ID NO: 69;
[2916] (465) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 23-34 da SEQ ID NO: 69;
[2917] (466) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 24-36 da SEQ ID NO: 69;
[2918] (467) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 26-34 da SEQ ID NO: 69;
[2919] (468) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 27-40 da SEQ ID NO: 75;
[2920] (469) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 27-38 da SEQ ID NO: 75;
[2921] (470) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 9-22 da SEQ ID NO: 77;
[2922] (471) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 9-20 da SEQ ID NO: 77;
[2923] (472) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 10-22 da SEQ ID NO: 77;
[2924] (473) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 12-20 da SEQ ID NO: 77;
[2925] (474) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 23-36 da SEQ ID NO: 81;
[2926] (475) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 23-34 da SEQ ID NO: 81;
[2927] (476) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 24-36 da SEQ ID NO: 81;
[2928] (477) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 26-34 da SEQ ID NO: 81;
[2929] (478) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 13-26 da SEQ ID NO: 87;
[2930] (479) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 13-24 da SEQ ID NO: 87;
[2931] (480) uma sequência de direcionamento compreendendo os aminoácidos 14-26 da SEQ ID NO: 87;
[2932] (481) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 371;
[2933] (482) uma sequência de direcionamento compreendendo a SEQ ID NO: 372
[2934] (483) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 381;
[2935] (484) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 382;
[2936] (485) um fragmento de proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 383;
[2937] (486) uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 384; ou (487) um fragmento de proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à SEQ ID NO: 385.
[2938] A modalidade 227 é uma proteína de fusão, um membro da família Bacillus cereus recombinante, fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição de ração animal ou um método da modalidade 226, em que a sequência de alvejamento compreende:
[2939] uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 50% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos cerca de 63%;
[2940] uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 50% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos cerca de 72%;
[2941] uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 56% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos cerca de 63%;
[2942] uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 62% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 72%;
[2943] uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 68% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos cerca de 81%;
[2944] uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 75% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos cerca de 72%;
[2945] uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 75% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 81%;
[2946] uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 81% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos cerca de 81%; ou
[2947] uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 81% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos cerca de 90%.
[2948] A modalidade 228 é uma proteína de fusão, um membro da família Bacillus cereus recombinante, fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição para ração animal ou um método da modalidade 227, em que a sequência de alvejamento consiste na sequência de aminoácidos.
[2949] A modalidade 229 é uma proteína de fusão, um membro da família Bacillus cereus recombinante, fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição para ração animal ou um método da modalidade 226, em que a sequência de alvejamento consiste em:
[2950] (a) uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e com pelo menos cerca de 43% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é de pelo menos cerca de 54%;
[2951] (b) aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1;
[2952] (c) aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1;
[2953] (d) SEQ ID NO: 1;
[2954] (e) SEQ ID NO: 96; ou
[2955] (f) SEQ ID NO: 120.
[2956] A modalidade 230 é uma proteína de fusão, um membro da família Bacillus cereus recombinante, fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição de ração animal ou um método da modalidade 226, em que a proteína de fusão compreende uma proteína do exosporium ou uma fragmento de proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120 e 121.
[2957] A modalidade 231 é uma proteína de fusão, um membro da família Bacillus cereus recombinante, fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição de ração animal ou um método da modalidade 226, em que a proteína de fusão compreende uma proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 60, 62, 64, 66, 68, 70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 ou 122.
[2958] A modalidade 232 é uma proteína de fusão, um membro da família Bacillus cereus recombinante, fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição de ração animal ou um método da modalidade 226, em que a proteína de fusão compreende uma proteína do exosporium ou uma fragmento de proteína do exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 381-385.
[2959] A modalidade 233 é uma proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 1–73, 182–190 e 225–232, um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 74, 182– 192, 194–200 e 225–232, fragmentos de exosporium de qualquer uma das modalidades 75, 182-192 e 194-232, uma formulação de qualquer uma das modalidades 76-88, 114, 115, 118, 130-132, 135-148, 182-192 e 194- 232, uma semente de qualquer uma das modalidades 89-92, 114, 115, 118, 130-132, 143, 148, 182-192 e 194-232, um aditivo para ração animal de qualquer uma das modalidades 93, 94, 97 –100 e 182–232, uma composição de ração animal de qualquer uma das modalidades 95-106 e 182–232, ou um método de qualquer uma das modalidades 107–232, em que a sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium compreende a sequência de aminoácidos GXT no seu terminal carbóxi, em que X é qualquer aminoácido.
[2960] A modalidade 234 é uma proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 1–73, 182-190 e 225–233, um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 74, 182–192, 194–200 e 225–233, fragmentos de exosporium de qualquer uma das modalidades 75, 182-192 e 194-233, uma formulação de qualquer uma das modalidades 76-88, 114, 115, 118, 130-132, 135-148, 182-192 e 194- 233, uma semente de qualquer uma das modalidades 89-92, 114, 115, 118, 130-132, 143, 148, 182-192 e 194-233, um aditivo para ração animal de qualquer uma das modalidades 93, 94, 97 –100 e 182–233, uma composição de ração animal de qualquer uma das modalidades 95-106 e 182–233, ou um método de qualquer uma das modalidades 107–233, em que a sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium compreende um resíduo de alanina na posição da sequência de alvejamento que corresponde ao aminoácido 20 da SEQ ID NO: 1.
[2961] A modalidade 235 é uma proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 1–73, 182–190 e 225–234, um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 74, 182– 192, 194–200 e 225–234, fragmentos de exosporium de qualquer uma das modalidades 75, 182–192 e 194–234, uma formulação de qualquer uma das modalidades 76–88, 114, 115, 118, 130–132, 135–148, 182–192 e 194– 234, uma semente de qualquer uma das modalidades 89-92, 114, 115, 118, 130-132, 143, 148, 182-192 e 194-234, um aditivo para ração animal de qualquer uma das modalidades 93, 94, 97 –100 e 182–234, uma composição de ração animal de qualquer uma das modalidades 95-106 e 182–234, ou um método de qualquer uma das modalidades 107–234, em que a sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium ainda compreende um resíduo de metionina, serina ou treonina na posição de aminoácido imediatamente anterior ao primeiro aminoácido da sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium ou na posição da sequência de alvejamento que corresponde ao aminoácido 20 da SEQ ID NO:
1.
[2962] A modalidade 236 é uma proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 1–73, 182-190 e 225–235, um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 74, 182–192, 194–200 e 225–235, fragmentos de exosporium de qualquer uma das modalidades 75, 182-192 e 194-235, uma formulação de qualquer uma das modalidades 76-88, 114, 115, 118, 130-132, 135-148, 182-192 e 194- 235, uma semente de qualquer uma das modalidades 89-92, 114, 115, 118, 130-132, 143, 148, 182-192 e 194-235, um aditivo para ração animal de qualquer uma das modalidades 95-106 e 182 –235, uma composição de ração animal de qualquer uma das modalidades 95-106 e 182–235, ou um método de qualquer uma das modalidades 107–235, em que a proteína de fusão compreende ainda um ligador de aminoácidos entre a sequência de alvejamento, a proteína do exosporium, ou o fragmento de proteína do exosporium e a enzima possuindo atividade de ACC desaminase, a fosfolipase, a lipase, a xilanase, o xilosidase, o lactonase, os chitosanas e, a protease, a glucanase, a proteína expansina, a fitase, a fosfatase ácida, a pectinase ou a mananase.
[2963] A modalidade 237 é uma proteína de fusão, um membro da família Bacillus cereus recombinante, fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição para ração animal ou um método da modalidade 236, em que o ligante compreende um ligante de polialanina, uma poliglicina ligante, ou um ligante compreendendo uma mistura de resíduos de alanina e glicina.
[2964] A modalidade 238 é uma proteína de fusão, um membro da família Bacillus cereus recombinante, fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição para ração animal ou um método da modalidade 236 ou 237, em que o ligante compreende um local de reconhecimento de protease.
[2965] A modalidade 239 é um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 74, 182–192, 194–200 e 225–238, fragmentos de exosporium de qualquer uma das modalidades 75, 182–192 e 194–238, uma formulação de qualquer uma das modalidades 76–88, 114, 115, 118, 130–132, 135–148, 182–192 e 194–238, uma semente de qualquer uma das modalidades 89–92, 114, 115, 118, 130– 132, 143, 148, 182–192 e 194–238, um aditivo para ração animal de qualquer uma das modalidades 95-106 e 182–238, uma composição de ração animal para qualquer uma das modalidades 95–106 e 182–238, ou um método de qualquer uma das modalidades 107 a 238, em que a proteína de fusão é expressa sob o controle de um promotor de esporulação nativo da sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium da proteína de fusão ou uma porção dela.
[2966] A modalidade 240 é um membro da família Bacillus cereus recombinante de qualquer uma das modalidades 74, 182–192, 194–200 e 225–238, fragmentos de exosporium de qualquer uma das modalidades 75, 182–192 e 194–238, uma formulação de qualquer uma das modalidades 76–88, 114, 115, 118, 130–132, 135–148, 182–192 e 194–238, uma semente de qualquer uma das modalidades 89–92, 114, 115, 118, 130– 132, 143, 148, 182–192 e 194–238, um aditivo para ração animal de qualquer uma das modalidades 95-106 e 182–238, uma composição de ração animal para qualquer uma das modalidades 95–106 e 182–238, ou um método de qualquer uma das modalidades 107-238, em que a proteína de fusão é expressa sob o controle de um promotor de esporulação de alta expressão.
[2967] A modalidade 241 é um membro da família Bacillus cereus recombinante, fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição de ração animal ou um método da modalidade 240, em que o promotor de esporulação de alta expressão compreende uma esporulação sigma-K sequência promotora específica da polimerase.
[2968] A modalidade 242 é um membro da família Bacillus cereus recombinante, fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição de ração animal ou um método de qualquer uma das modalidades 239-241, em que o promotor de esporulação compreende uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NOs: 37-42 e 123-191.
[2969] A modalidade 243 é um membro da família Bacillus cereus recombinante, fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição para ração animal ou um método de qualquer uma das modalidades 239-241, em que o promotor compreende uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 37, 38, 41, 42, 149, 150, 175, 180, 181, 185, 189 ou 190.
[2970] A modalidade 244 é um membro da família Bacillus cereus recombinante, fragmentos de exosporium, uma formulação, uma semente, um aditivo para ração animal, uma composição para ração animal ou um método de 242 ou 243, em que a sequência ou sequências promotoras da polimerase específicas da esporulação do sigma-K têm 100% de identidade com os nucleotídeos correspondentes de qualquer uma das SEQ ID NOs: 37-42 e 123-191.
[2971] A modalidade 245 é uma formulação de qualquer uma das modalidades 88, 114, 115, 118, 130–132, 135–148, 182–200 e 194–244, uma semente de qualquer uma das modalidades 91, 92, 114, 115,118, 130 -132, 143, 148, 182-200, e 194-244, ou um método de qualquer uma das modalidades 107-120, 149-172 e 182-244, em que o fertilizante compreende nitrogênio, fosfato, potássio, zinco, ferro, selênio, boro, cobre ou uma combinação deles.
[2972] A modalidade 246 é uma formulação, semente, ou o método da modalidade 245, em que o fosfato compreende fosfato de monoamônio, fosfato de diamónio, ortofosfato, ortopolifosfato, ou uma combinação de quaquer um dos mesmos; ou em que o potássio compreende acetato de potássio.
[2973] A modalidade 247é uma formulação, semente, ou o método da modalidade 245, em que o adubo compreende 12% de nitrogênio amoniacal e 58% de fosfato disponível.
[2974] A modalidade 248 é uma formulação de qualquer uma das modalidades 88, 114, 115,118, 130-132, 135-148, 182-200, e 194-247, uma semente de qualquer uma das formas de realizao 91, 92, 114, 115,118, 130–132, 143, 148, 182–200 e 194–247, ou um método de qualquer uma das modalidades 107–120, 149–172 e 182–247, em que o bioestimulante compreende um ácido giberélico, um ácido indole-3-butírico, uma cinetina, uma auxina, um homólogo ou derivado de auxina, ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.
[2975] A modalidade 249 é uma formulação de qualquer uma das modalidades 88, 114, 115,118, 130–132, 135–148, 182–200 e 194–248, uma semente de qualquer uma das modalidades 91, 92, 114, 115,118, 130– 132, 143, 148, 182–200 e 194–248, ou um método de qualquer uma das modalidades 107–120, 149–172 e 182–248, em que a formulação compreende um fertilizante, um bioestimulante ou uma combinação destes ou em que o método compreende ainda aplicar um fertilizante, um bioestimulante ou uma combinação dos mesmos ao meio de crescimento da planta, à planta, à semente da planta ou à área circundante à planta ou à semente da planta, e em que a proteína de fusão compreende uma fosfatase ácida, uma fosfolipase, uma mananase, uma glucanase ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.
[2976] A modalidade 250 é uma formulação de qualquer uma das modalidades 76-88, 114, 115,118, 130–132, 135-148, 182–
200 e 194–249, uma semente de qualquer uma das 91, 92, 114, 115,118, 130– 132, 143, 148, 182–200 e 194–249, ou um método de qualquer uma das modalidades 107–120, 149–172 e 182–249, em que o veículo agricolamente aceitável compreende um dispersante, um tensoativo, um aditivo, água, um espessante, um agente antiaglomerante, um produto de decomposição de resíduos, uma formulação de compostagem, uma aplicação granular, terra de diatomáceas, um óleo, um agente corante, um estabilizador, um conservante, um polímero, um revestimento ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.
[2977] A modalidade 251 é uma formulação, semente ou método da modalidade 250, em que o veículo agricolamente aceitável compreende um aditivo, e o aditivo compreende um óleo, uma goma, uma resina, uma argila, um polioxietileno glicol, um terpeno, um orgânico viscoso, um éster de ácido graxo, um álcool sulfatado, um alquilsulfonato, um sulfonato de petróleo, um sulfato de álcool, um diamato de alquilbutano sódico, um poliéster de dioato de tiobutano sódico, um derivado de benzeno acetonitrila, um material proteico ou uma combinação de qualquer um dos mesmos; o veículo agricolamente aceitável compreende um espessante, e o espessante compreende um alquilsulfonato de cadeia longa de polietileno glicol, um oleato de polioxietileno ou uma combinação de qualquer um dos mesmos; o transportador aceitável em agricultura compreende um tensoativo, e o tensoativo compreende um óleo de petróleo pesado, um destilado de petróleo pesado, um éster de ácido graxo poliol, um éster de ácido graxo polietoxilado, um arilalquil polioxietileno glicol, um acetato de alquilamina, um alquil aril sulfonato, um álcool poli-hídrico, um fosfato de alquila ou uma combinação de qualquer um dos mesmos; ou o veículo agricolamente aceitável compreende um agente antiaglomerante e o agente antiaglomerante compreende um sal de sódio, um carbonato de cálcio, terra de diatomáceas ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.
[2978] A modalidade 252 é uma formulação, semente ou método da modalidade 250, em que o tensoativo compreende um tensoativo não iônico.
[2979] A modalidade 253 é uma formulação, semente ou método da modalidade 251, em que o aditivo compreende um material proteico e o material proteico compreende um produto lácteo, farinha de trigo, farelo de soja, sangue, albumina, gelatina, farelo de alfafa, extrato de levedura ou uma combinação de qualquer um dos mesmos; ou o agente antiaglomerante compreende um sal de sódio, e o sal de sódio compreende um sal de sódio de monometil naftaleno sulfonato, um sal de sódio de dimetil naftaleno sulfonato, um sulfito de sódio, um sulfato de sódio ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.
[2980] A modalidade 254 é uma formulação de qualquer uma das modalidades 76-88, 114, 115,118, 130–132, 135-148, 182- 200 e 194-253, uma semente de qualquer uma das modalidades 91, 92, 114, 115,118, 130–132, 143, 148, 182–200 e 194–253, ou um método de qualquer uma das modalidades 107–120, 149–172 e 182–253, em que o veículo agricolamente aceitável compreende vermiculita, carvão, açúcar lama de prensa de carbonatação de fábrica, casca de arroz, carboximetilcelulose, turfa, perlita, areia fina, carbonato de cálcio, farinha, alume, amido, talco, polivinilpirrolidona ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.
[2981] A modalidade 255 é uma formulação de qualquer uma das modalidades 76-88, 114, 115,118, 130–132, 135-148, 182– 200 e 194–254, uma semente de qualquer uma das modalidades 91, 92, 114, 115,118, 130–132, 143, 148, 182–200 e 194–254, ou um método de qualquer uma das modalidades 107–120, 149–172 e 182–254, em que a formulação compreende uma formulação de revestimento de sementes, um líquido formulação para aplicação em plantas ou meio de crescimento vegetal, ou formulação sólida para aplicação em plantas ou meio de crescimento vegetal.
[2982] A modalidade 256 é uma formulação, semente ou método da modalidade 255, em que a formulação de revestimento de sementes compreende uma solução aquosa ou à base de óleo para aplicação em sementes ou uma formulação em pó ou granular para aplicação em sementes.
[2983] A modalidade 257 é uma formulação, semente ou método da modalidade 255, em que a formulação líquida para aplicação em plantas ou em um meio de crescimento de plantas compreende uma formulação concentrada ou uma formulação pronta para uso.
[2984] A modalidade 258 é uma formulação, semente ou método da modalidade 255, em que a formulação sólida para aplicação em plantas ou em um meio de crescimento de plantas compreende uma formulação granular ou um agente em pó.
[2985] A modalidade 259 é uma formulação de qualquer uma das modalidades 76-88, 114, 115,118, 130–132, 135-148, 182– 200 e 194–258, uma semente de qualquer uma das modalidades 91, 92, 114, 115,118, 130–132, 143, 148, 182–200 e 194–258, ou um método de qualquer uma das modalidades 107–120, 149–172 e 182–258, em que o agroquímico compreende um fertilizante, um material fertilizante de micronutrientes, um inseticida, um nematicida, um herbicida, uma alteração no crescimento das plantas, um fungicida, um inseticida, um moluscicida, um algicida, um inoculante bacteriano, um inoculante fúngico, um hormônio vegetal ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.
[2986] A modalidade 260 é uma formulação, semente ou método da modalidade 259, em que o inoculante bacteriano compreende uma cepa de bactérias promotoras de crescimento de plantas, uma cepa endofítica de bactérias ou uma cepa de bactérias que é tanto promotora de crescimento de plantas quanto endofítica.
[2987] A modalidade 261 é uma formulação, semente ou método da modalidade 260, em que a cepa de bactérias produz uma toxina inseticida, produz um composto fungicida, produz um composto nematicida, produz um composto bacteriocida, é resistente a um ou mais antibióticos, compreende um ou plasmídeos que se reproduzem mais livremente, se ligam às raízes das plantas, colonizam as raízes das plantas, formam biofilmes, solubilizam nutrientes, secretam ácidos orgânicos ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.
[2988] A modalidade 262 é uma formulação, semente ou método da modalidade 261, em que a toxina inseticida compreende uma toxina Cry; em que o composto fungicida compreende uma β-1,3-glucanase, uma quitosanase, uma lyticase ou uma combinação de qualquer uma das mesmas; ou em que o composto nematicida compreende uma toxina Cry.
[2989] A modalidade 263 é uma formulação, semente ou método de qualquer uma das modalidades 260 a 262, em que a cepa compreende Bacillus aryabhattai CAP53 (NRRL Nº B-50819), Bacillus aryabhattai CAP56 (NRRL Nº B-50817), Bacillus flexus BT054 (NRRL Nº B- 50816), Paracoccus kondratievae NC35 (NRRL Nº B-50820), Bacillus mycoides BT155 (NRRL Nº B-50921), Enterobacter cloacae CAP12 (NRRL Nº B-50822), Bacillus nealsonii BOBA57 (NRRL Nº NRRL B-50821), Bacillus mycoides EE118 (NRRL B-N ° 50918), Bacillus subtilis EE148 (NRRL Nº B-50927), Alcaligenes faecalis EE107 (NRRL Nº B- 50920), Bacillus mycoides EE141 (NRRL Nº B- 50916), Bacillus mycoides BT46-3 (NRRL No.B-50922), Bacillus cereus membro da família EE128 (NRRL Nº B-50917), Paenibacillus massiliensis BT23 (NRRL B-N ° 50923), Bacillus cereus membro da família EE349 (NRRL B-No. 50928), Bacillus subtilis EE218 (NRRL B-No. 50926), Bacillus megaterium EE281 (NRRL No. B-50925), membro da família Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B -67119); Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120), Bacillus mycoides EE- B00363 (NRRL B-67121), Bacillus pumilus EE-B00143 (NRRL B-67123), Bacillus thuringiensis EE-B00184 (NRRL B-67122), Bacillus mycoides EE116 (NRRL B-50919), membro da família Bacillus cereus EE417 (NRRL B-50974), Lysinibacillus fusiformis EE442 (NRRL B-50975), Lysinibcaillus sphaericus EE443 (NRRL B-50976), Bacillus cereus membro da família EE444 (NRRL Nº B- 50977), Bacillus subtilis EE405 (NRRL Nº B-50978), membro da família Bacillus cereus EE439 (NRRL No. B-50979), Bacillus megaterium EE385 (NRRL Nº B- 50980), Bacillus espécies EE387 (NRRL Nº B-50981), Bacillus circulans EE388 (NRRL Nº B-50982), Bacillus thuringiensis EE319 (NRRL No. B-50983), Bacillus thuringiensis BT013A (NRRL No. B-50924), ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.
[2990] A modalidade 264 é uma formulação, semente ou método de qualquer uma das modalidades 259-263, em que o agroquímico compreende um fertilizante e o fertilizante compreende um fertilizante líquido ou seco; em que o agroquímico compreende um material fertilizante de micronutrientes e o material fertilizante de micronutrientes compreende ácido bórico, um borato, uma frita de boro, sulfato de cobre, uma frita de cobre, um quelato de cobre, um decahidrato de tetraborato de sódio, um sulfato de ferro, um óxido de ferro, amônio e ferro sulfato, uma frita de ferro, um quelato de ferro, um sulfato de manganês, um óxido de manganês, um quelato de manganês, um cloreto de manganês, uma frita de manganês, um molibdato de sódio, ácido molibdânico, um sulfato de zinco, um óxido de zinco, um carbonato de zinco, um frita de zinco, fosfato de zinco, um quelato de zinco ou uma combinação de qualquer um dos mesmos; em que o agroquímico compreende um inseticida, e o inseticida compreende um organofosfato, um carbamato, um piretróide, um acaricida, um alquil ftalato, ácido bórico, um borato, um fluoreto, enxofre, uma uréia substituída haloaromática, um éster de hidrocarboneto, um biologicamente- inseticida de base ou uma combinação de qualquer um dos mesmos; em que o agroquímico compreende um herbicida, e o herbicida compreende um composto clorofenoxi, um composto nitrofenólico, um composto nitrocresólico, um composto dipiridil, uma acetamida, um ácido alifático, um anilida, uma benzamida, um ácido benzóico, um derivado do ácido benzóico, anísico ácido, um derivado do ácido anísico, um benzonitrila, dióxido de benzotiadiazinona, um tiocarbamato, um carbamato, um carbanilato, cloropiridinil, um derivado de ciclohexenona, um derivado de dinitroaminobenzeno, um composto de fluorodinitrotoluidina, isoxazolidinona, isotazilopamina, fosfato, um ftalato, um composto de ácido picolínico, uma triazina, um triazol, um uracil, um derivado de ureia, endothall, clorato de sódio ou uma combinação de qualquer um dos mesmos; em que o agroquímico compreende um fungicida e o fungicida compreende um benzeno substituído, um tiocarbamato, um bis ditiocarbamato de etileno, uma tioftalidamida, um composto de cobre, um composto de organomercúrio, um composto de organotina, um composto de cádmio,
anilazina, benomil, ciclo-hexamida, dodino, etridiazol, iprodiona, metlaxil, tiamimefon, triforina ou uma combinação de qualquer um dos mesmos; em que o agroquímico compreende um inoculante de fungos e o inoculante de fungos compreende um inoculante de fungos da família Glomeraceae, um inoculante de fungos da família Claroidoglomeraceae, um inoculante de fungos da família Gigasporaceae, um inoculante de fungos da família Acaulosporaceae, um inoculante de fungos da família Sacculosporaceae, um inoculante fúngico da família Entrophosporaceae, um inoculante fúngico da família Pacidsporaceae, um inoculante fúngico da família Diversisporaceae, um inoculante fúngico da família Paraglomeraceae, um inoculante fúngico da família Archaeosporaceae, um inoculante fúngico da família Geosiphonacea um inoculante de fungos da família Ambisporaceae, um inoculante de fungos da família Scutellosporaceae, um inoculante de fungos da família Dentiscultataceae, um inoculante de fungos da família Racocetraceae, um inoculante de fungos do filo Basidiomycota, um inoculante de fungos do filo Ascomyc inoculante do filo Zygomycota ou uma combinação de y disso; ou em que o agroquímico compreende um inoculante bacteriano e o inoculante bacteriano compreende um inoculante bacteriano do gênero Rhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Bradyrhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Mesorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Azorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Allorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Sinorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Kluyvera, um inoculante bacteriano do gênero Azotobacter, um inoculante bacteriano do gênero Pseudomonas, um inoculante bacteriano do gênero Azospirillium, um inoculante bacteriano do gênero Bacillus, um inoculante bacteriano do gênero Streptomyces, um inoculante bacteriano do gênero Paenibacillus, um inoculante bacteriano do gênero Paracoccus, um inoculante bacteriano do gênero Enterobacter, um inoculante bacteriano do gênero Alcaligenes, um inoculante bacteriano do gênero Mycobacterium, um inoculante bacteriano do gênero Trichoderma, um agente bacteriano inoculante do gênero Gliocladium, um inoculante bacteriano do gênero Glomus, um inoculante bacteriano do gênero Klebsiella ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.
[2991] A modalidade 265 é uma formulação, semente ou método de qualquer uma das modalidades 259 a 264, em que o agroquímico compreende um fungicida, o fungicida pode compreender aldimorfe, ampropilfos, potássio de ampropilfos, andoprim, anilazina, azaconazol, azoxistrobina, benalaxil, benodanil, benomil, benzamacril, benzamacril-isobutila, bialafos, binapacril, bifenila, bitertanol, blasticidina-S, boscalide, bromuconazol, bupirimato, butiobato, polissulfeto de cálcio, capsimicina, captafol, captan, carbendazim, carvon, quinometionato, clobentiazona, clorfenazol, cloroneb, cloropicrina, clorotalonil, clozolinato, clozilacon, cufraneb, cimoxanil, ciproconazol, ciprodinil, ciprofuramol, debacarb, diclorofeno, diclobutrazol, dicloflolorodimodazina, diclodinodazol, dicloforazina, diclodinodazol, dicloforazina, dinocap, difenilamina, dipirithiona, ditalimfos, ditianona, dodemorfe, dodino, drazoxolona, edifenfos, epoxiconazol, etaconazol, etirimol, etridiazol, famoxadona, fenapanil, fenarimol, fenbucinodinoxin, feno-fenidin, feno-fenidin, fenodimidina ferbam, ferimzona, fluazinam, flumetover, fluoromida, fluquinconazol, flurprimidol, flusilazol, flusulfamida, flutolanil, flutriafol, folpet, fospetil-alumínio, fosetil-sódio, ftalida, fuberidazol, furalaxil, furametpir, furcarazaz, furconet, furcarazaz guazatina, hexaclorobenzeno, hexaconazol, himexazol, imazalil, imibenconazol, iminoctadina, albesilato de iminoctadina, triacetato de iminoctadina, iodocarbe, iprobenfos (IBP), iprodiona, irumamicina, isoprotiolano, isovalediona, kasugamicina, kresoxim-metil, preparações de cobre, como: hidróxido de cobre, óxido de cobre, sulfato de cobre, naften de cobre mistura de oxina-cobre e Bordeaux, mancopper, mancozeb, maneb, meferimzona, mepanipirim, mepronil, metconazol, metassulfocarbe, metfuroxam, metiram, metomeclam, metsulfovax, mildiomicin, miclobutanil, miclozolin, níquel dimopilditiocarbama, oxamocarbe, ácido oxolínico, oxicarboxim, oxifentinina, paclobutrazol, pefurazoato, penconazol, pencicuron, fosdifeno, pimaricina, piperalina, polioxina, polioxorim, probenazol, procloraz, procimidona, propamocarb, propanosina-pirazina, propiconazina-piroxazina,,
piroquilon, piroxifur, quinconazol, quintozeno (PCNB), preparações de enxofre e enxofre, tebuconazol, tecloftal am, tecnazeno, tetciclase, tetraconazol, tiabendazol, tiofen, tifluzamida, tiofanato-metil, tioximida, tolclofos-metil, tolilfluanida, triadimefona, triadimenol, triazbutil, triazoxida, triclamifaz, triclaziflazina, triclaziflazina, vinclozolina, viniconazol, zarilamida, zineb, ziram e também Dagger G, OK-8705, OK-8801, a-(1,1-dimetiletil)-(3-(2-fenoxietil)-1H- 1,2,4-triazol-1-etanol, a-(2,4-diclorofenil)-[3-fluoro-3-propil-1 H--1,2,4-triazol-1- etanol, a-(2,4-diclorofenil)-[3-metoxi-a-metil-1 H-1,2,4-triazol e-1 -etanol, a-(5- metil -1,3-dioxan-5-il)-[3-[[4-(trifluorometil) -fenil]-metileno]-1 H-1,2,4-triazol-1 - etanol, (5RS,6RS)-6-hidroxi-2,2,7,7-tetrametil-5-(1 H-1,2,4-triazol-1-il)-3- octanona, (E)-a-(metoxiimino)-N-metil-2-fenoxi-fenilacetamida, carbamato de 1- isopropil{2-metil-1-[[[1-(4-metilfenil)-etil]-amino]-carbonil]-propil}, 1-(2,4- diclorofenil)-2-(1 H-1,2,4-triazol-1-il)-etanona-O-(fenil metil)-oxima, 1-(2-metil-1- naftalenil)-1 H-pirrol-2,5-diona, 1-(3,5-diclorofenil)-3-(2-propenil)-2,5- pirrolidindiona, 1-[(diiodometil)-sulfonil]-4-metil-benzeno, 1-[[2-(2,4-diclorofenil)- 1, 3-dioxolan-2-il]-metil]-1 H-imidazol, 1-[[2-(4-clorofenil)-3-feniloxiranil]-metil]-1 H-1,2,4-triazol, 1-[1-[2-[(2,4-diclorofenil)-metoxi]-fenil]-ethenil]-1 H-imidazol, 1- metil -5-nonil-2-(fenilmetil)-3-pirroIidinol, 2',6'-dibromo-2-metil-4'-trifluorometoxi- 4'-trifluoro-metil-1, 3-tiazol -carboxanilida, 2,2-dicloro-N-[1-(4-clorofenil)-etil]-1- etil-3-metil-ciclopropanecarboxamida, 2,6-dicloro-5-(metiltio)-4-pirimidinil- tiocianato, 2,6-dicloro-N-(4-trifluorometilbenzil)-benzamida, 2,6-dicloro-N-[[4- (trifluorometil)-fenil]-metil]-benzamida, 2-(2,3,3-triiodo-2-propenil)-2H-tetrazol, 2- [(1-metiletil)-sulfonil]-5-(triclorometil)-1,3,4-tiadiazol, 2-[[6-deoxi-4-O-(4-O-metil- (3-D-glicopiranosil)-a-D-glucopiranosil]-amino]-4-metoxi-1 H-pirrolo [2,3- d]pirimidina-5-carbonitrila, 2-aminobutano, 2-bromo-2-(bromometil)- pentanodinitrila, 2-cloro-N-(2,3-di-hidro-1,1,3-trimetil-1 H-inden-4-il)-3- piridinacarboxamida, 2-cloro-N-(2,6-dimetilfenil)-N-(isotiocianatometil)- acetamida, 2-fenilfenol (OPP), 3,4-dicloro-1-[4-(difluorometoxi)-fenil]-pirrol-2,5- diona, 3,5-dicloro-N-[ciano[(1-metil-2-propinil)-oxi]-metil]-benzamida, 3-(1,1- dimetilpropil-1-oxo-1H-indeno-2-carbonitrila, 3-[2-(4-clorofenil)-5-etoxi-3- isoxazolidinil]-piridina, 4-cloro-2-ciano-N,N-dimetil-5-(4-metilfenil)-1H-imidazol-l-
sulfonamida, 4-metil-tetrazolo[1,5-a]quinazolin-5(4H)-ona, sulfato de 8-(1,1- dimetiletil)-N-etil-N-propil-1,4-dioxaspiro[4, 5]decano-2-metanamina, 8- hidroxiquinolina, hidrazida de 9H-xanteno-2-[(fenilamino)-carbonil]-9-carboxílico, bis-(1-metiletil)-3-metil-4-[(3-metilbenzoil)-oxi]-2,5-tiofenodicarboxilato, cis-1-(4- clorofenil)-2-(1 H-1,2,4-triazol-1-il)-ciclo-heptanol, cloridrato de cis-4-[3-[4-(1,1- dimetilpropil)-fenil-2-metilpropil]-2,6-dimetil-morfeolina, acetato de etil [(4- clorofenil)-azo]-ciano, bicarbonato de potássio, sal de metanotetratiol-sódico, metil 1-(2,3-di-hidro-2,2-dimetil-inden-1-il)-1 H-imidazol-5-carboxilato, metil N- (2,6-dimetilfenil)-N-(5-isoxazolilcarbonil)-DL-alaninato, metil N-(cloroacetil)-N- (2,6-dimetilfenil)-DL-alaninato, N-(2,3-dicloro-4-hidroxifenil)-1-metil-ciclo- hexanocarboxamida, N-(2,6-dimetil fenil)-2-metoxi-N-(tetra-hidro-2-oxo-3- furanil)-acetamida, N-(2,6-dimetil fenil)-2-metoxi-N-(tetra-hidro-2-oxo-3-tienil)- acetamida, N-(2-cloro-4-nitrofenil)-4-metil-3-nitro-benzenosulfonamida, N-(4- ciclohexilfenil)-1,4,5,6-tetra-hidro-2-pirimidinamina, N-(4-hexilfenil)-1,4,5,6-tetra- hidro-2-pirimidinamina, N-(5-cloro-2-metilfenil)-2-metoxi-N-(2-oxo-3- oxazolidinil)-acetamida, N-(6-metoxi)-3-piridinil)-ciclopropanocarboxamida, N- [2,2,2-tricloro-1-[(cloroacetil)-amino]-etil]-benzamida, N-[3-cloro-4,5-bis(2- propiniloxi)-fenil]-N'-metoxi-metanimidamida, sal de N-formil-N-hidroxi-DL- alanina sódica, O, O-dietil [2-(dipropilamino)-2-oxoetil]-etilfosforamidotioato, O- metil S-fenil fenilpropilfosforamidotioato, S-metil 1,2,3-benzotiadiazol-7- carbotioato e espiro[2H]-1-benzopirano-2,1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-ona, N- triclorometil)tio-4- ciclo-hexano-1,2-dicarboximida, tetrametiltioperoxidicarbônico diamida, metil N-(2,6-dimetilfenil)-N-(metoxiacetil)-DL-alaninato, 4-(2,2-difluoro- 1,3-benzodioxol-4-il)-1-H-pirrol-3-carbonitrila ou uma combinação dos mesmos.
[2992] A modalidade 266 é uma formulação, semente ou método de qualquer uma das modalidades 259–265, em que o agroquímico compreende um inoculante bacteriano do gênero Bacillus e o inoculante bacteriano do gênero Bacillus compreende Bacillus argri, Bacillus aizawai, Bacillus albolactis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus coagulans, Bacillus endoparasiticus, Bacillus endorhythmos, Bacillus kurstaki, Bacillus lacticola, Bacillus lactimorbus, Bacillus lactis, Bacillus laterosporus,
Bacillus lentimorbus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus medusa, Bacillus metiens, Bacillus natto, Bacillus nigrificans, Bacillus popillae, Bacillus pumilus, Bacillus siamensis, Bacillus sphearicus, Bacillus spp., Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus unifagellatu ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.
[2993] A modalidade 267 é uma formulação, semente ou método de qualquer uma das modalidades 259-266, em que o agroquímico compreende um herbicida e o herbicida compreende 2,4-D, 2,4-DB, acetoclor, acifluorfeno, alacloro, ametrina, atrazina, aminopiralid, benefício, bensulfuron, bensulida, bentazon, bromacil, bromoxinil, butilato, carfentrazona, clorimuron, clorsulfuron, clethodim, clomazona, clomazona cloransulam, cicloato, DCPA, desmedifame, dicamba, diclobenil, diclofop, diclosulam, diflufenzopyr, dimetenamida, diquat, diuron, DSMA, endothall, EPTC, etalfluralina, etofumesato, fenoxaprop, fluazifam-P, flazifaz-P, flazifaz-P, flazifaz-P, flazifaz-P, flazifaz-P, flazifaz-P, flazazamida Fluometurão, fluroxipir, fomesafena, foramsulfurão, glufosinato, glifosato, halossulfurão, hexazinona, imazamethabenz, imazamox, imazapic, imazaquin, imazethapyr, isoxabeno, isoxaflutol, lactofeno, lactofeno, linuron, mesaclor, MSMA, napropamida, naptalam, nicossulfurão, norflurazon, orazalin, oxadiazon, oxifluorfena, paraquat, ácido pelargônico, pendimetalina, fenmedifame, picloram, primisulfurão, prodiamina, prometrina, pronamida, propanil, prosulfurão, pirazon, piritiobac, quinclorac, quizalofop, rimsulfuron, sethoxydim, siduron, simazina, sulfentrazona, sulfometuron, sulfossulfuron, tebuthiuron, terbacil, tiazopyr, tifensluron, triobencortifluorodazina ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.
[2994] A modalidade 268 é uma formulação, semente ou método de qualquer uma das modalidades 259-267, em que o agroquímico compreende um fertilizante e o fertilizante compreende sulfato de amônio, nitrato de amônio, nitrato de sulfato de amônio, cloreto de amônio, bissulfato de amônio, polissulfeto de amônio, tiossulfato de amônio, amônia aquosa, amônia anidra, polifosfato de amônio, sulfato de alumínio, nitrato de cálcio, nitrato de cálcio e amônio, sulfato de cálcio, magnesita calcinada, calcário calcítico, óxido de cálcio, nitrato de cálcio, calcário dolomítico, cal hidratada, carbonato de cálcio, fosfato de diamônio, fosfato monoamônico, nitrato de magnésio, sulfato de magnésio, nitrato de potássio, cloreto de potássio, sulfato de magnésio e potássio, sulfato de potássio, nitratos de sódio, calcário magnésio, magnésia, ureia, ureia- formaldeídos, nitrato de ureia e amônio, ureia revestida com enxofre, ureia revestida com polímero, isobutililideno diuréia, K 2 SO 4 –2MgSO 4, cainita, silvinita, cieserita, sais de Epsom, enxofre elementar, marga, moída conchas de ostras, farinha de peixe, bolos de óleo, esterco de peixe, farinha de sangue, fosfato de rocha, super fosfatos, escória, farinha de ossos, cinzas de madeira, estrume, guano de morcego, musgo de turfa, composto, areia verde, farinha de semente de algodão, farinha de penas, refeição de caranguejo, emulsão de peixe, ácido húmico ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.
[2995] A modalidade 269 é uma formulação, semente ou método de qualquer uma das modalidades 259-268, em que o hormônio vegetal compreende uma giberelina, uma auxina, uma cinetina ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.
[2996] A modalidade 270 é uma semente de qualquer uma das modalidades 89–92, 114, 115, 118, 130–132, 143, 148, 182-192 e 194– 269, em que a semente compreende uma semente de uma planta da família Brassicaceae.
[2997] A modalidade 271 é um método de qualquer uma das modalidades 107–172 e 182–269, em que a planta compreende uma planta da família Brassicaceae.
[2998] A modalidade 272 é uma semente da modalidade 270 ou um método da modalidade 271, em que a planta da família Brassicaceae compreende uma planta do gênero Brassica.
[2999] A modalidade 273 é uma semente da modalidade 270 ou um método da modalidade 271, em que a planta da família Brassicaceae compreende Brassica napus, Brassica rapa, Brassica juncea,
Brassica hirta, Brassica oleracea, Raphanus sativus, Sinapus alba ou Lepidium sativum.

Claims (27)

REIVINDICAÇÕES
1. PROTEÍNA DE FUSÃO caracterizada pelo fato de que compreende: uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro recombinante da família Bacillus cereus; e uma enzima com atividade de 1-aminociclopropano-1- carboxilato desaminase (ACC desaminase), em que a enzima com atividade de ACC desaminase compreende: uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos uma substituição de aminoácidos em relação à sequência de uma enzima D-cisteína desulfidrase do tipo selvagem ou ACC desaminase de uma bactéria do gênero Bacillus, em que a substituição de aminoácidos resulta em atividade aumentada de ACC desaminase em comparação com a atividade de ACC- desaminase da enzima D-cisteína-desulfidrase do tipo selvagem ou ACC- desaminase nas mesmas condições; uma enzima de Bacillus; uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 242-245; ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.
2. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácidos da enzima compreende duas substituições de aminoácidos em relação à sequência da enzima D-cisteína desulfididrase ou ACC desaminase do tipo selvagem, em que as substituições de aminoácidos irão resultar na atividade aumentada da ACC desaminase em comparação com a atividade da enzima ACC desaminase do tipo selvagem sob as mesmas condições.
3. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a enzima com atividade de ACC desaminase compreende uma enzima de Bacillus thuringiensis ou uma enzima de Bacillus pseudomycoides.
4. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácidos da enzima compreende: uma substituição do resíduo de treonina na posição 290 da SEQ ID NO: 245 por um resíduo de ácido glutâmico e uma substituição do resíduo de serina na posição 317 da SEQ ID NO: 245 por um resíduo de leucina; uma substituição do resíduo de treonina na posição 290 da SEQ ID NO: 242 por um resíduo de ácido glutâmico e uma substituição do resíduo de serina na posição 317 da SEQ ID NO: 242 por um resíduo de leucina; uma substituição do resíduo de treonina na posição 290 da SEQ ID NO: 243 por um resíduo de ácido glutâmico e uma substituição do resíduo de serina na posição 317 da SEQ ID NO: 243 por um resíduo de leucina; ou uma substituição do resíduo de treonina na posição 290 da SEQ ID NO: 244 por um resíduo de ácido glutâmico e uma substituição do resíduo de serina na posição 317 da SEQ ID NO: 244 por um resíduo de leucina.
5. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a enzima compreende ou consiste em SEQ ID NO: 249, 246, 247 ou 248.
6. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a enzima compreende ou consiste em SEQ ID NO: 249.
7. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a enzima compreende uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 245, 242, 243 e 244.
8. PROTEÍNA DE FUSÃO caracterizada pelo fato de que compreende: uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro recombinante da família Bacillus cereus; e uma glucanase, a glucanase: compreendendo uma xiloglucanase; compreendendo uma alfa-1,6-glucanase; compreendendo uma beta 1,3/1,4 glucanase; compreendendo um xiloglucano: xiloglucosil transferase; compreendendo uma ciclo-heptaglucanase; compreendendo uma beta-glicosidase de oligoxiloglucano; compreendendo uma ciclo-hexaglucanase; compreendendo uma 1,4-beta-celobiosidase de celulose; compreendendo uma endo-1,3-beta-D-glucosidase de glucano; compreendendo uma ciclomaltodextrinase; compreendendo uma 1,3-beta-glucosidase de glucano; compreendendo uma endo-1,3-alfa-glucosidase de glucano; compreendendo uma endo-1,3(4)-beta-glucanase; compreendendo uma liquenase; compreendendo uma laminarinase; compreendendo uma 1,4-beta-glucosidase de glucano; compreendendo uma endo-1,6-beta-glucosidase de glucano; compreendendo uma 1,3-alfa-glucosidase de glucano; compreendendo uma amilopectinase;
compreendendo uma amiloglucanase; compreendendo uma amiloglucosidase; compreendendo uma glucanase de Acidothermus; compreendendo uma glucanase de Aspergillus; compreendendo uma glucanase de Paenibacillus; compreendendo uma glucanase de Helix; compreendendo uma glucanase de Bacillus circulans; compreendendo uma glucanase de Bacillus lichenformis; compreendendo uma glucanase de Clostridium; compreendendo uma beta-1,4-endoglucanase de Trichoderma reesei; compreendendo uma amilase de Bacillus subtilis; compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs. 300, 299, 281 a 292, 295 a 298, 301 e 302; consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 293 ou 294; ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.
9. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a glucanase compreende uma xiloglucanase.
10. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a xiloglucanase compreende uma endo-beta- 1,4-glucanase específica para xiloglucano, uma exo-beta-1,4-glucanase específica para xiloglucano ou uma combinação das mesmas.
11. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a xiloglucanase compreende uma xiloglucanase de Bacillus ou uma xiloglucanase de Paenibacillus.
12. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a xiloglucanase de Bacillus compreende uma xiloglucanase de Bacillus lichenformis ou em que a xiloglucanase de Paenibacillus compreende uma xiloglucanase de Paenibacillus pabuli.
13. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a glucanase compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, em pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 300 ou 299.
14. PROTEÍNA DE FUSÃO caracterizada pelo fato de que compreende: uma sequência de alvejamento, proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium que alveja a proteína de fusão para o exosporium de um membro recombinante da família Bacillus cereus; e uma mananase.
15. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a mananase compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307 ou 308.
16. MEMBRO DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS recombinante caracterizado pelo fato de que expressa uma proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15.
17. FRAGMENTOS DE EXOSPORIUM caracterizados pelo fato de que são derivados de um membro da família Bacillus cereus recombinante, de acordo com a reivindicação 16.
18. FORMULAÇÃO caracterizada pelo fato de que compreende um membro da família Bacillus cereus recombinante, de acordo com a reivindicação 16, e um veículo agricolamente aceitável.
19. FORMULAÇÃO caracterizada pelo fato de que compreende fragmentos de exosporium, de acordo com a reivindicação 17, e um veículo agricolamente aceitável.
20. SEMENTE DE PLANTA caracterizada pelo fato de que é tratada com um membro da família Bacillus cereus recombinante, de acordo com a reivindicação 16.
21. SEMENTE DE PLANTA caracterizada pelo fato de que é tratada com fragmentos de exosporium, de acordo com a reivindicação 17.
22. MÉTODO PARA ESTIMULAR O CRESCIMENTO DE PLANTAS e/ou promover a saúde de plantas caracterizado pelo fato de que compreende a aplicação de um membro da família Bacillus cereus recombinante, de acordo com a reivindicação 16, a um meio de crescimento de plantas, uma planta, uma semente de planta ou uma área circundante a uma planta ou uma semente de planta.
23. MÉTODO PARA ESTIMULAR O CRESCIMENTO DE PLANTAS e/ou promover a saúde de plantas caracterizado pelo fato de que compreende a aplicação de fragmentos de exosporium, de acordo com a reivindicação 17, a um meio de crescimento de plantas, uma planta, uma semente de planta ou uma área circundante a uma planta ou uma semente de planta.
24. MÉTODO PARA ENTREGAR UMA ENZIMA a um animal caracterizado pelo fato de que compreende alimentar o animal com um membro da família Bacillus cereus recombinante, de acordo com a reivindicação 16, fragmentos de exosporium derivados de um membro da família Bacillus cereus recombinante, de acordo com a reivindicação 16, ou uma combinação dos mesmos.
25. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que a enzima que tem atividade de ACC desaminase, da glucanase ou da mananase compreende ainda um peptídeo sinal.
26. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que o peptídeo sinal está presente no terminal amino da enzima que possui atividade ACC desaminase, glucanase ou mananase.
27. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que: a proteína de fusão compreende uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 300, e em que a glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 340 no seu terminal amino; a proteína de fusão compreende uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 299, e em que a glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 339 no seu terminal amino; a proteína de fusão compreende uma glucanase que consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 294, e em que a glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 334 no seu terminal amino; a proteína de fusão compreende uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 295, e em que a glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 335 no seu terminal amino; a proteína de fusão compreende uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 296, e em que a glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 336 no seu terminal amino; a proteína de fusão compreende uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 297, e em que a glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 337 no seu terminal amino; a proteína de fusão compreende uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 298, e em que a glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 338 no seu terminal amino; a proteína de fusão compreende uma glucanase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 302, e em que a glucanase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 341 no seu terminal amino; a proteína de fusão compreende uma mananase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 307, e em que a mananase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 344 no seu terminal amino; ou a proteína de fusão compreende uma mananase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade em relação à SEQ ID NO: 308, e em que a mananase compreende ainda um peptídeo sinal compreendendo a SEQ ID NO: 345 no seu terminal amino.
FIG. IA SEQ 20-35 25-35 ID % de identidade % de identidade NO. MSNNNYSNG LNPDESLSASAFDPNLVGPTLPPIPPFTLPTG 1 100% 100% MSEKY11LHGTALEPNLIGPTLPPIPPFTFPNG 3 81,3% ' 90.9% ' Petição 870200038064, de 23/03/2020, pág. 1040/1168 MVKVVEGNGGKSKIKS PLNSNFKILSDLVGPTFPPVPTGMTGIT 5 50, 0% 72.7% ' MKQNDKLWLDKGIIGPENIGPTFPVLPPIHIPTG 7 43.8% ' 54 ',5% MDEFLSSAALNPGSVGPTLPPMQPFOFRTG 9 62,5% ' 72, 7% MFDKNEIQKINGILQANALNPNLIGPTLPPIPPFTLPTG 11 81,3% ' 90 ,9% MFDKNEMKKTNEVLQANALDPNIIGPTLPPIPPFTLPTG 13 81,' 3% 8 1 ,'8 % MSRKCKFNRSRMSRKDR7NSPKIKSEISISPDLVGPTFPPIPSFTLPTG 15 62,5% ' 8 1 ,' 8 % MNEEYSILHGPALEPNLIGPTLPSIPPFTFPTG 17 75,0% 8 1 ', 8 % MKNRDNNRKQNSLSSNFRIPPELIGPTFPPVPTGPTGIG 19 50.' 0% 63.6% MSDKHQMKKISEVLQAHALDPNLIGPPLPPITPFTFPTG 21 75,' 0% 72 ,7% 1/14 MDEFLSFAALNPGSIGPTLPPVPPFQFPTG 23 62,5% 72,' 7% MDEFLS5TAI.NPCSIGPTLPPMQPFQFPTG 25 56,2% 63,' 6% MKERDRQNSLNSNFRISPNLIGPTFPPVPTGFTGIG 27 56.' 2% 63,' 6% V FDKN EIOKINGILQANALNPNLIGPTLPPIPPFTL PTG 29 81,' 3% 90,' 9% MDEFLYFAALNPGSIGPTLPPVQPFQFPTG 31 56,2% 63,6% MDSKNIGPTFPPLP3INFPTG 33 43.8% 54 .5% MIGPENIGPTFPILPPIYIPTG 35 43,8% 54 ,5% MSNNNIPSPFFFNNFNPELIGPTFPPIPPLTLPTG 43 68,8% 8 1 ,' 8 % MFSEKKRKDLIPDNFLSAPALDPNLIGPTFPPIPSFTLPTG 45 75,0% 72 ,7% MTRKCKFNBSRISRRDRFNSPKIKSEILISPDLVGPTFPPIPSFTLPTG 47 62. 5% 81,8% MSRKDRFNSPKIKSEISISPDLVGPTFPPIPSFTLPTG 49 62, 5% 81,8% MKERDNKGKQHSLNSNFRIPPELIGPTFPPVPTGFTGIG 51 50,0% 63, 5% MRERDNKRQQH SLN PN FRISPELIGPTFPPVPTGFTGIG 53 50,0% 63, 3% MKNRDTJKGKQQSN FRI PPELIGPTFPPVPTGFTGIG 55 50.0% 63, 6% MKFSKKSTVDSSIVGKRVVSKVNILRFYDARSCQDKDVDGFVDVGELFTIFRKLNMEGSVQFKAI1NSI 57 81,3% 90. 9%
GKTYYITINEVYVFVTVLLQYSTLIGGSYVFDKNEIQKINGILQANALNPNLIGPTLPPIPPFTLPTG
FIG. IB SEQ 20-35 25-35 ID % de identidade % de identidade NO.
Petição 870200038064, de 23/03/2020, pág. 1041/1168 MSNNNYSNGLNPDESLSASAFDPNLVGPTLPPIPPFTLPTG 1 100% 100% MKE RDKQNS LN S N FRIS PNLIGPTFPPVPTG FTGIG 59 56,2% 63,• 6% MMENKKGSKHNEFLSAKAFNPNLVGPTLPPVPSFTLPTG 61 81,3% i 81,8% i MSNNNYSDGLNPDEFLSASAFDPNLVGPTLPPIPPFTLPTG 63 100% 100% MDEFLSSAAINPNLVGPTLPPVPPFTLPTG 65 81,3% 90, 9% MFDKNKILQANAFNSNLIGPTLPPIPPFTLPTG 67 81,3% 9 0 ,i 9 % MSDENEKKYSNELAQADFISAAAFDPSLVGPTLPPTPPFTLPTG 69 87,5% 90,9% MSRKDRFNSPKIKSEISISPDLVGPTFPPIPSFTLPTG 71 62, 5% 81, 8% MDEFLSSAALNPGSVGPTLPPMQPFQFSTG 73 2/14 6 2 ,i 5 % 7 2 ,• 7 % MFLGGGYMERKNKWYGLNSNVNLSASSFDPNLVGPTLPPISPISVPTG 75 87,5% 9 0 ,• 9 % MDELLSSTLINPDLLGPTLPAIPPFTLPTG 77 6 2 ,• 5 % 8 1 , 8% MKNRDNNRKCNSLSSNFRIPPELIGPTFPPVPTGFTGIG 79 50,0% 6 3 , 6% MVKVVEGNSGKSKIKSSLNSNFKLSSGLVGPTFPPVPTGMTGIT 81 50, 0% 72, 7% MEGNGGKSKIKSPLNSNF-KILSDLVGPTFPPVPTGMTGIT 83 50, 0% 72, 7% MKQNDKLWLDKGIIGPENIGPTFPVLPPIHIPTG 85 43.8% 54 •, 5% MNSNEKLSLNKGMVRPENIGPTFPVLPPIYIPTG 87 43,8% 54,5% i MKRNDNLSLNKGMIGPENIGPTFPILPPIYIPTG 89 43,8% 54 ,5% MDSFVDVGEIFTIFRKLNMEGSLQFKVHNS 91 81, 3% 90,9%
MGKTYYITINEVYVYVTVLLQYSTLIGGSYVFDKNEIQKIMGILQANALNPNLIGPTLPPIPPFTLPTG MKFSKKSTVDSSIVGKRWSKVNILRFYDARSWQDKDVDGFVDVGELFTIFRKLNMEGSVQFKAHNSI 93 8 1 ,> 3 % 90 , 9%
GKTYYITINEVYVFVTVLLQYSTLIGGSYVFDKNEIQKINGILQANALNPNLIGPTLPPIPPFTLPTG
CJ
CO r\l <
LL
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