BR112017006583B1 - Peptídeo isolado, polipeptídeo de fusão, composição e métodos de conferir resistência à doença às plantas, de potencializar o crescimento da planta, de aumentar a tolerância e resistência da planta ao estresse biótico ou ao estresse abiótico e de modular a sinalização bioquímica da planta - Google Patents

Peptídeo isolado, polipeptídeo de fusão, composição e métodos de conferir resistência à doença às plantas, de potencializar o crescimento da planta, de aumentar a tolerância e resistência da planta ao estresse biótico ou ao estresse abiótico e de modular a sinalização bioquímica da planta Download PDF

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Abstract

peptídeos elicitores tendo caixa de resposta hipersensível rompida e uso dos mesmos. a presente invenção refere-se - aos peptídeos que induzem uma resposta de planta, porém não uma resposta hipersensível, quando aplicada ao tecido da planta. estes peptídeos da mesma forma preferivelmente exibem solubilidade melhorada, estabilidade, resistência à degradação química, ou uma combinação destas propriedades. o uso destes peptídeos ou polipeptídeos de fusão, ou construções de dna codificando os mesmos, para modular a sinalização bioquímica da planta, conferir resistência à doença às plantas, realçar o crescimento da planta, conferir tolerância ao estresse biótico, conferir tolerância e resistência ao estresse abiótico, conferir resistência à dissecação aos cortes removidos das plantas ornamentais, conferir resistência à doença pós-colheita ou à dissecação pós-colheita a uma fruta ou legume, ou realçar a longevidade da maturação da fruta ou legume é da mesma forma descrito.

Description

[0001] A presente invenção refere-se ao benefício de propriedade do Pedido de Patente Provisório U.S. No. Serial 62/058.535, depositado em 1 de Outubro de 2014, e Pedido de Patente Provisório U.S. No. Serial 62/186.527, depositado em 30 de Junho de 2015, cada dos quais está aqui incorporado por referência em sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0002] A presente invenção refere-se a novos peptídeos desencadeadores tendo caixas de resposta hipersensível rompidas e seu uso para induzir as respostas de planta ativas incluindo, entre outros, aumento do crescimento, resistência a doenças, resistência a pestes ou insetos, e resistência ao estresse.
ANTECEDENTE DA INVENÇÃO
[0003] A identificação e isolamento de proteínas em forma de grampo vieram da pesquisa básica Cornell University tentando entender como as bactérias patogênicas das plantas interagem com as plantas. Uma primeira linha de defesa é a resposta hipersensível (HR), uma morte celular de planta localizada no sítio da infecção. A morte celular cria uma barreira física ao movimento do patógeno e em algumas plantas as células mortas podem liberar compostos tóxicos para o patógeno invasor. A pesquisa indicou que as bactérias patogênicas eram suscetíveis de ter um único fator que foi responsável pelo desencadeamento de HR. Um objetivo básico da pesquisa de Cornell foi identificar uma proteína bacteriana específica responsável pelo desencadeamento de HR. A proteína alvo foi conhecida por ser codificada por um de um grupo de genes de bactérias chamado de grupo de gene de Resposta Hipersensível e Patogenicidade (hrp). O grupo de hrp na bactéria Erwinia amylovora (Ea), que provoca a ferrugem do fogo na pêra e maçã, foi dissecado e uma única proteína foi identificada a qual desencadeou HR em certas plantas. A esta proteína foi dada o nome de grampo (e, tardia, grampoEa) e o gene correspondente designado hrpN. Este foi o primeiro exemplo de uma tal proteína e gene identificados de qualquer espécie bacteriana.
[0004] Várias proteínas em forma de grampo diferentes foram, desde então, identificadas das espécies Erwinia, Pseudomonas, Ralstonia, Xanthomonas, e Pantoea, entre outras. As proteínas em forma de grampo, enquanto diversas no nível de sequência de aminoácido primário, partilham características bioquímicas e biofísicas comuns, bem como funções biológicas. Com base nas suas propriedades únicas, as proteínas em forma de grampo são consideradas na literatura como pertencentes a uma única classe de proteínas.
[0005] Subsequente à sua identificação e isolamento, foi posteriormente descoberto que o grampo poderia desencadear resistência à doença às plantas e aumentar o crescimento das plantas. Uma descoberta precoce importante foi que a aplicação da proteína em forma de grampo tornou uma planta resistente a um ataque subsequente de patógenos e em locais na planta bem afastados do sítio da injeção. Isto significou que as proteínas em forma de grampo podem disparar uma Resistência Adquirida Sistêmica (SAR), um mecanismo de defesa da planta que forneça a resistência a uma variedade de patógenos virais, bacterianos e fúngicos.
[0006] Na proteção das culturas, há uma necessidade contínua de composições que melhoram a saúde das plantas. Plantas mais saudáveis são desejáveis uma vez que resultam em melhores rendimentos e/ou uma melhor qualidade das plantas ou culturas. Plantas mais saudáveis da mesma forma resistem melhor ao estresse biótico e abiótico. Uma alta resistência contra estresses bióticos, por sua vez, permite aos produtores reduzir a quantidade de pesticidas aplicados e, consequentemente, retardar o desenvolvimento de resistências contra os respectivos pesticidas.
[0007] Grampoαβ é uma proteína de fusão que é derivada de vários grampos diferentes. Grampoαβ tem demonstrado suprimir a produção de ovos nematoides, potencializar o crescimento, qualidade e rendimento de uma planta, e aumentar o vigor de uma planta. As suas sequências de aminoácido e nucleotídeo são descritas na Publ. de Pedido U.S. No. 2010/0043095.
[0008] Até a presente data, a produção de grampo e grampoαβ e seu uso em aplicações agrícolas e hortícolas tem sido como um sólido em pó revestido de amido. Isto limita o uso e a versatilidade das proteínas em forma de grampo, porque as suspensões líquidas das proteínas em forma de grampo em pó em água têm uma vida útil efetiva de apenas 48-72 horas antes de ocorrer a degradação significativa e perda de atividade. Outro problema com as soluções em forma de grampo é a solubilidade e estabilidade da proteína.
[0009] Seria desejável identificar os peptídeos em forma de grampo derivados e sintéticos que são facilmente solúveis em solução aquosa, estáveis, resistentes à degradação química, e efetivas na indução de respostas de planta ativas que incluem, entre outros, produção e crescimento de planta realçados, bem como resistência aos estressores abióticos e bióticos.
[0010] A presente invenção está direcionada a superar estas e outras limitações na técnica.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0011] Um primeiro aspecto da invenção refere-se a um peptide isolado compreendendo a sequência de aminoácido de: J-X-X-X-J-J-X-X-X-J-J-X-X-X-J-J (SEQ ID NO: 1) em que
[0012] o peptídeo é livre de cisteína e metionina;
[0013] cada X nas posições 2, 3, 7, 8, 12, e 13 é opcional e, quando presente, é qualquer aminoácido;
[0014] cada X nas posições 4, 9, e 14 é qualquer aminoácido;
[0015] um a três dos resíduos de J nas posições 1, 5, 6, 10, 11, 15, e 16 é um aminoácido não hidrofóbico ou A, e todos os outros dentre os resíduo de J são L, I, V, ou F, e o peptídeo induz uma resposta de planta ativa, porém, não induz uma resposta hipersensível, quando aplicada ao tecido da planta.
[0016] Um segundo aspecto da invenção refere-se a um peptide isolado tendo a sequência de aminoácido de: XXGISEKXXXXXXXXXXXXXXXX (SEQ ID NO: 2, consenso de P1/P4 modificado), em que
[0017] X na posição 1 é opcional e pode ser S, N, D, isoD, G, A ou S;
[0018] X na posição 2 é opcional e pode ser Q, E, g-glutamato, G, A, ou S;
[0019] X na posição 8 é Q, E, g-glutamato, G, A ou S;
[0020] X na posição 9 é M, L, I, F, ou V, ou um aminoácido não hidrofóbico;
[0021] X na posição 10 é opcional e pode ser D ou isoD;
[0022] X na posição 11 é Q, E, g-glutamato, G, A ou S;
[0023] X na posição 12 é M, L, I, ou F, ou um aminoácido não hidrofóbico;
[0024] X na posição 13 é M, L, ou I, ou um aminoácido não hidrofóbico;
[0025] X na posição 14 é opcional e pode ser qualquer aminoácido hidrofílico, preferivelmente S, T, D, isoD, K, ou Q, e opcionalmente A ou C;
[0026] X na posição 15 é Q, E, g-glutamato, G, A, S, K ou I;
[0027] X na posição 16 é M, L, I, V, ou F, ou um aminoácido não hidrofóbico;
[0028] X na posição 17 é M, L, I, A, ou V, ou um aminoácido não hidrofóbico;
[0029] X na posição 18 é Q, E, g-glutamato, G, A, S, M, T ou K;
[0030] X na posição 19 é A, D, isoD, S, V, T, K, R, E, H ou G;
[0031] X na posição 20 é M, L ou I;
[0032] X na posição 21 é M, L, I, V, S, ou F, ou um aminoácido não hidrofóbico exceto serina;
[0033] X na posição 22 é Q, E, g-glutamato, G, A, S;
[0034] X na posição 23 é P, Q, E, g-glutamato, G, A ou S; e
[0035] em que pelo menos um dos resíduos nas posições 9, 12, 13,16, 17, e 20 é um aminoácido não hidrofóbico, ou o resíduo na posição 21 é um aminoácido não hidrofóbico exceto serina; e em que o peptídeo induz uma resposta de planta ativa, porém, não induz uma resposta hipersensível, quando aplicada ao tecido da planta.
[0036] Um terceiro aspecto da invenção refere-se a um peptide isolado tendo a sequência de aminoácido de:SXGISEKXXDXXXXXXXXAXXXP (SEQ ID NO: 3, consenso de P4 modificado),
[0037] em que
[0038] X na posição 2 é Q, E, g-glutamato, G, A ou S;
[0039] X na posição 8 é Q, E, g-glutamato, G, A ou S;
[0040] X na posição 9 é M, S, L, A, I, V, ou F, ou um aminoácido não hidrofóbico exceto serina;
[0041] X na posição 11 é Q, E, g-glutamato, G, A ou S;
[0042] X na posição 12 é L, I, ou F, ou um aminoácido não hidrofóbico;
[0043] X na posição 13 é L, A, I, V, ou F, ou um aminoácido não hidrofóbico;
[0044] X na posição 14 é qualquer aminoácido hidrofílico;
[0045] X na posição 15 é Q, E, g-glutamato, G, A, S, K ou I;
[0046] X na posição 16 é L, A, I, V, M, ou F, ou um aminoácido não hidrofóbico;
[0047] X na posição 17 é M, I, S, ou F, ou um aminoácido não hidrofóbico exceto serina;
[0048] X na posição 18 é Q, E, g-glutamato, G, A ou S;
[0049] X na posição 20 é M, L, I, V, ou F, ou um aminoácido não hidrofóbico;
[0050] X na posição 21 é M, L ou F, ou um aminoácido não hidrofóbico; e
[0051] X na posição 22 é Q, E, g-glutamato, G, A ou S,
[0052] em que um dos resíduos nas posições 9, 12, 13, 16, 20 e 21 é um aminoácido não hidrofóbico ou A, ou o resíduo na posição 17 é um aminoácido não hidrofóbico exceto serina; e em que o peptídeo induz uma resposta de planta ativa, porém, não induz uma resposta hipersensível, quando aplicada ao tecido da planta.
[0053] Um quarto aspecto da invenção refere-se a um peptide isolado tendo a sequência de aminoácido de:XXGISEKXJDXJJTXJJXAJJXX (SEQ ID NO: 4, consenso de P1 modificado), em que
[0054] X na posição 1 é N, D, isoD, G, A ou S;
[0055] X na posição 2 é Q, E, g-glutamato, G, A ou S;
[0056] X na posição 8 é Q, E, g-glutamato, G, A ou S;
[0057] X na posição 11 é Q, E, g-glutamato, G, A ou S;
[0058] X na posição 15 é Q, E, g-glutamato, G, A ou S;
[0059] X na posição 18 é M, T, K, E, g-glutamato, G, A ou S;
[0060] X na posição 22 é Q, E, g-glutamato, G, A ou S;
[0061] X na posição 23 é Q, E, g-glutamato, G, A ou S;
[0062] J nas posições 9, 12, 13, 16, 17, 20, e 21 são aminoácidos hidrofóbicos selecionados dentre L, V, I, e F, exceto que um dos aminoácidos nestas posições é um aminoácido não hidrofóbico ou A; em que o peptídeo induz uma resposta de planta ativa, porém, não induz uma resposta hipersensível, quando aplicada ao tecido da planta.
[0063] Um quinto aspecto da invenção refere-se a um peptide isolado tendo a sequência de aminoácido de:(i) KPXDSXSXJAKJJSXJJXSJJX (SEQ ID NO: 5, consenso de P15b/P20 modificado), em que
[0064] X na posição 3 é N, D ou isoD;
[0065] X na posição 6 é Q, E, g-glutamato, G, A ou S;
[0066] X na posição 8 é N, D ou isoD;
[0067] X na posição 15 é opcional e pode ser qualquer aminoácido;
[0068] X na posição 18 é M, E, g-glutamato, G, A, S, T ou K;
[0069] X na posição 22 é opcional e pode ser Q, E, g-glutamato, G, A ou S; e
[0070] J nas posições 9, 12, 13, 16, 17, 20 e 21 são aminoácidos hidrofóbicos selecionados dentre L, V, I, e F, exceto que pelo menos um dos aminoácidos nestas posições é um aminoácido não hidrofóbico ou A; ou (ii) JAKJJSXJJXSJJX (SEQ ID NO: 6, consenso de P15/20 min modificado), em que
[0071] X na posição 7 é opcional e pode ser qualquer aminoácido;
[0072] X na posição 10 é M, E, g-glutamato, G, A, S, T ou K;
[0073] X na posição 14 é opcional e pode ser Q, E, g-glutamato, G, A ou S; e
[0074] J nas posições 1, 4, 5, 8, 9, 12, e 13 são aminoácidos hidrofóbicos selecionados dentre L, V, I, e F, exceto que pelo menos um dos aminoácidos nestas posições é um aminoácido não hidrofóbico ou A; e
[0075] em que o peptídeo induz uma resposta de planta ativa, porém, não induz uma resposta hipersensível, quando aplicada ao tecido da planta.
[0076] Um sexto aspecto da invenção refere-se a um peptide isolado tendo a sequência de aminoácido de:PSPJTXJJXXJJGXJJXAXN (SEQ ID NO: 7, consenso de P6/6a modificado), em que
[0077] X na posição 6 é Q, E, g-glutamato, G, A ou S;
[0078] X na posição 9 é M, E, g-glutamato, G, A, S, T ou K;
[0079] X na posição 10 é H ou N;
[0080] X na posição 14 é E, g-glutamato, D ou isoD;
[0081] X na posição 17 é Q, E, g-glutamato, G, A ou S;
[0082] X na posição 19 é Q, E, g-glutamato, G, A ou S; e
[0083] J nas posições 4, 7, 8, 11, 12, 15, e 16 são aminoácidos hidrofóbicos selecionados dentre L, V, I, M, e F, exceto que pelo menos um dos aminoácidos nestas posições é um aminoácido não hidrofóbico ou A; em que o peptídeo induz uma resposta de planta ativa, porém, não induz uma resposta hipersensível, quando aplicada ao tecido da planta.
[0084] Um sétimo aspecto da invenção refere-se a um peptide isolado tendo a sequência de aminoácido de:(i) XXXXXXJXXJJXXJJXJJK (SEQ ID NO: 8, consenso de P14d modificado), em que
[0085] X na posição 1 pode ser: Q, N, D, E, g-glutamato, isoD ou S;
[0086] X na posição 2 pode ser: D, E, g-glutamato, isoD;
[0087] X na posição 3 pode ser: P, D, E, isoD ou g-glutamato;
[0088] X na posição 4 pode ser M, A, S, D, E, isoD ou g-glutamato
[0089] X na posição 5 pode ser Q, E ou g-glutamato;
[0090] X na posição 6 pode ser A, E ou g-glutamato;
[0091] X na posição 8 pode ser M, L, E, Q, D, N, G, A, S, isoD ou g- glutamato;
[0092] X na posição 9 pode ser Q, N, E, D, G, A, S, isoD ou g- glutamato;
[0093] X na posição 12 pode ser Q, N, E, D, G, A, S, isoD ou g- glutamato;
[0094] X na posição 13 pode ser Q, N, E, D, G, A, S, isoD ou g- glutamato;
[0095] X na posição 16 pode ser K, Q, N, E, D, R, G, A ou S; e
[0096] J nas posições 7, 10, 11, 14, 15, 17, e 18 são aminoácidos hidrofóbicos selecionados dentre L, V, I, e F, exceto que pelo menos um dos aminoácidos nestas posições é um aminoácido não hidrofóbico ou A; ou (ii) JXXJJXXJJXJJK (SEQ ID NO: 9, consenso de P14d min modificado), em que
[0097] X na posição 2 pode ser M, L, E, Q, D, N, G, A, S, isoD ou g- glutamato;
[0098] X na posição 3 pode ser Q, N, E, D, G, A, S, isoD ou g- glutamato;
[0099] X na posição 6 pode ser Q, N, E, D, G, A, S, isoD ou g- glutamato;
[00100] X na posição 7 pode ser Q, N, E, D, G, A, S, isoD ou g-glutamato;
[00101] X na posição 10 pode ser K, Q, N, E, D, R, G, A ou S; e
[00102] J nas posições 1, 4, 5, 8, 9, 11, e 12 são aminoácidoshidrofóbicos selecionados dentre L, V, I, e F, exceto que pelo menos um dos aminoácidos nestas posições é um aminoácido não hidrofóbico ou A; em que o peptídeo induz uma resposta de planta ativa, porém, não induz uma resposta hipersensível, quando aplicada ao tecido da planta.
[00103] Um oitavo aspecto da invenção refere-se a um peptídeo isolado tendo a sequência de aminoácido de: (i) JXXJJXJJXXJJ (SEQ ID NO: 10, consenso de P25 modificado) em que
[00104] X na posição 2 pode ser Q, N, E, g-glutamato, D, isoD, T, S, A ou G;
[00105] X na posição 3 pode ser K, Q, N, E, g-glutamato, D, isoD, T, S, A ou G;
[00106] X na posição 6 pode ser K, Q, N, E, g-glutamato, D, isoD, T, S, A ou G;
[00107] X na posição 9 pode ser E, g-glutamato, D, isoD, Q, N, T, S, A ou G;
[00108] X na posição 10 pode ser A, G, S, T, E, g-glutamato, D, isoD, Q ou N; e
[00109] J nas posições 1, 4, 5, 7, 8, 10, e 11 são aminoácidos hidrofóbicos selecionados dentre L, V, I, F, e M, exceto que pelo menos um dos aminoácidos nestas posições é um aminoácido não hidrofóbico ou A; ou (ii) JXXJJXXJJXJJXXJJ (SEQ ID NO: 11, consenso de P25 modificado) em que
[00110] X na posição 2 pode ser T, S, A, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q ou N;
[00111] X na posição 3 pode ser G, T, S, A, D, isoD, E, g-glutamato, Q ou N;
[00112] X na posição 6 pode ser Q, N, E, g-glutamato, D, isoD, T, S, A ou G;
[00113] X na posição 7 pode ser K, Q, N, E, g-glutamato, D, isoD, T, S, A ou G;
[00114] X na posição 10 pode ser K, Q, N, E, g-glutamato, D, isoD,T, S, A ou G;
[00115] X na posição 13 pode ser E, g-glutamato, D, isoD, Q, N, T, S, A ou G;
[00116] X na posição 14 pode ser A, G, S, T, E, g-glutamato, D, isoD, Q ou N;
[00117] J nas posições 1, 4, 5, 8, 9, 11, 12, e 15 são aminoácidos hidrofóbicos selecionados dentre L, V, I, F, e M, exceto que pelo menos um dos aminoácidos nestas posições é um aminoácido não hidrofóbico ou A; e J na posição 16 é opcional e um aminoácido hidrofóbico selecionado dentre L, V, I e F; em que o peptídeo induz uma resposta de planta ativa, porém, não induz uma resposta hipersensível, quando aplicada ao tecido da planta.
[00118] Um nono aspecto da invenção refere-se a um peptídeo isolado compreendendo a sequência de aminoácido de:(i) XXXXXXXXXXXJXXJJXXJJXXJJXXX (SEQ ID NO: 12, P17/18 modificado), em que
[00119] X na posição 1 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente Q, S, E, g-glutamato, A, T, G, D, isoD, N, K ou R;
[00120] X na posição 2 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente Q, S, E, g-glutamato, A, T, G, D, isoD, N, K ou R;
[00121] X na posição 3 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente P, Q, S, E, g-glutamato, A, T, G, D, isoD, N, K ou R;
[00122] X na posição 4 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente I, Q, S, E, g-glutamato, A, T, G, D, N, isoD, K ou R;
[00123] X na posição 5 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente D, isoD, S, E, g-glutamato, A, T, G, N, Q, K ou R;
[00124] X na posição 6 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente R, Q, S, E, g-glutamato, A, T, G, D, isoD, N ou K;
[00125] X de posição 7 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente Q, S, E, g-glutamato, A, T, G, D, isoD, N, K ou R;
[00126] X na posição 8 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente T, Q, S, E, g-glutamato, A, G, D, isoD, N, K ou R;
[00127] X na posição 9 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente I, Q, S, E, g-glutamato, A, T, G, D, isoD, N, K ou R;
[00128] X na posição 10 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente E, g-glutamato, Q, S, A, T, G, D, isoD, N, K ou R;
[00129] X na posição 11 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente Q, S, E, g-glutamato, A, T, G, D, isoD, N, K ou R;
[00130] X na posição 13 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N, K ou R;
[00131] X na posição 14 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente Q, A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, N, K ou R;
[00132] X na posição 17 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N, K ou R;
[00133] X na posição 18 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente Q, A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, N, K ou R;
[00134] X na posição 21 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente K, A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N ou R;
[00135] X na posição 22 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente S, A,T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N, K ou R;
[00136] X na posição 25 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente S, A, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N, K ou R;
[00137] X na posição 26 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente P, S, A, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N, K ou R;
[00138] X na posição 27 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente Q, S, A, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, N, K ou R;
[00139] J nas posições 12, 15, 16, 19, 20, 23, e 24 são aminoácidos hidrofóbicos selecionados dentre L, V, I, F, e M, exceto que pelo menos um dos aminoácidos nestas posições é um aminoácido não hidrofóbico ou A; ou (ii) JXXJJXXJJXXJJ (SEQ ID NO: 13, consenso de P17/18 min modificado), em que
[00140] X na posição 2 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N, K ou R;
[00141] X na posição 3 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente Q, A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, N, K ou R;
[00142] X na posição 6 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N, K ou R;
[00143] X na posição 7 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente Q, A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, N, K ou R;
[00144] X na posição 10 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente K, A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N ou R;
[00145] X na posição 11 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente S, A,T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N, K ou R; e
[00146] J nas posições 1, 4, 5, 8, 9, 12, e 13 são aminoácidos hidrofóbicos selecionados dentre L, V, I, F, e M, exceto que pelo menos um dos aminoácidos nestas posições é um aminoácido não hidrofóbico ou A; em que o peptídeo induz uma resposta de planta ativa, porém, não induz uma resposta hipersensível, quando aplicada ao tecido da planta.
[00147] Um décimo aspecto da invenção refere-se a um peptídeo isolado compreendendo a sequência de aminoácido de:XJXXJJXJJXXJJ (SEQ ID NO: 14, consenso de P19 modificado), em que
[00148] X na posição 1 é opcional e pode ser L, I, V, F ou M;
[00149] X na posição 3 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente K, A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N ou R;
[00150] X na posição 4 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N, K ou R;
[00151] X na posição 7 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente K, A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N ou R;
[00152] X na posição 10 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N, K ou R;
[00153] X na posição 11 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente R, A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N ou K; e
[00154] J nas posições 2, 5, 6, 8, 9, 12, e 13 são aminoácidos hidrofóbicos selecionados dentre L, V, I, F e M, exceto que pelo menos um dos aminoácidos nestas posições é um aminoácido não hidrofóbico ou A; em que o peptídeo induz uma resposta de planta ativa, porém, não induz uma resposta hipersensível, quando aplicada ao tecido da planta.
[00155] Um décimo primeiro aspecto da invenção refere-se a um peptídeo isolado que inclui a sequência de aminoácido de:Z1-LLXLFXXIL-Z2 (SEQ ID NO: 126, P3 mínimo) em que
[00156] X na posição 3 é qualquer aminoácido hidrofílico, preferivelmente K, A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N ou R;
[00157] X na posição 6 é qualquer aminoácido hidrofílico,preferivelmente K, A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N ou R;
[00158] X na posição 7 é qualquer aminoácido hidrofílico,preferivelmente K, A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N ou R; e
[00159] em que um dentre Z1 e Z2 está presente, porém, preferivelmente não ambos, com Z1 compreendendo LXX- onde cada X é um aminoácido hidrofílico, preferivelmente K, A, S, T, G, D, isoD, E, g- glutamato, Q, N ou R, e com Z2 compreendendo -XXLF onde cada X é um aminoácido hidrofílico, preferivelmente K, A, S, T, G, D, isoD, E, g- glutamato, Q, N ou R.
[00160] Um décimo segundo aspecto da invenção refere-se a um peptídeo isolado que inclui a sequência de aminoácido de: L-X-X-(L/I)- (L/I)-X-X-(L/I/V)-(L/I/V) (SEQ ID NO: 116), em que o peptídeo é livre de cisteína e metionina; cada X nas posições 2, 3, 6, 7 é qualquer aminoácido; e o peptídeo induz uma resposta de planta ativa, porém, não induz uma resposta hipersensível, quando aplicada ao tecido da planta.
[00161] Um décimo terceiro aspecto da invenção refere-se a uma proteína de fusão que inclui um dos peptídeos do primeiro ao décimo segundo aspectos da invenção juntamente com um ou mais dentre um tag de purificação, um tag de solubilidade, ou um segundo peptídeo de acordo com um do primeiro ao décimo segundo aspectos da invenção.
[00162] Um décimo quarto aspecto da invenção refere-se a um peptídeo isolado selecionado a partir do grupo consistindo em DVGQLIGELIDRGLQ (SEQ ID NO: 15), GDVGQLIGELIDRGLQSVLAG (SEQ ID NO: 16), SSRALQEVIAQLAQELTHN (SEQ ID NO: 17), ou GLEDIKAALDTLIHEKLG (SEQ ID NO: 18). Da mesma forma abrangidos por este aspecto da invenção são as proteínas de fusão que incluem um destes peptídeos juntamente com um ou mais dentre um tag de purificação, um tag de solubilidade, ou um segundo peptídeo de acordo com um do primeiro ao décimo segundo e décimo quarto aspectos da invenção.
[00163] Um décimo quinto aspecto da invenção refere-se a uma composição que inclui um ou mais peptídeos ou proteínas de fusão de acordo com o primeiro, segundo, terceiro, quarto, quinto, sexto, sétimo, oitavo, nono, décimo, décimo primeiro, décimo segundo, décimo terceiro, ou décimo quarto aspectos da invenção, e um veículo.
[00164] Um décimo sexto aspecto da invenção refere-se a um método de conferir resistência à doença às plantas. Este método inclui: aplicar uma quantidade efetiva de um peptídeo isolado ou proteína de fusão de acordo com o primeiro, segundo, terceiro, quarto, quinto, sexto, sétimo, oitavo, nono, décimo, décimo primeiro, décimo segundo, décimo terceiro ou décimo quarto aspecto da invenção ou uma composição de acordo com o décimo quinto aspecto da invenção a uma planta ou semente de planta ou ao local onde a planta está crescendo ou espera- se crescer, em que a referida aplicação é efetiva para conferir resistência à doença.
[00165] Um décimo sétimo aspecto da invenção refere-se a um método de potencializar o crescimento da planta. Este método inclui: aplicar uma quantidade efetiva de um peptídeo isolado ou proteína de fusão de acordo com o primeiro, segundo, terceiro, quarto, quinto, sexto, sétimo, oitavo, nono, décimo, décimo primeiro, décimo segundo, décimo terceiro ou décimo quarto aspecto da invenção ou uma composição de acordo com o décimo quinto aspecto da invenção a uma planta ou semente de planta ou ao local onde a planta está crescendo ou espera- se crescer, em que a referida aplicação é efetiva para potencializar o crescimento da planta.
[00166] Um décimo oitavo aspecto da invenção refere-se a um método de aumentar a tolerância de uma planta e resistência aos estressores bióticos. Este método inclui: aplicar uma quantidade efetiva de um peptídeo isolado ou proteína de fusão de acordo com o primeiro, segundo, terceiro, quarto, quinto, sexto, sétimo, oitavo, nono, décimo, décimo primeiro, décimo segundo, décimo terceiro ou décimo quarto aspecto da invenção ou uma composição de acordo com o décimo quinto aspecto da invenção a uma planta ou semente de planta ou ao local onde a planta está crescendo ou espera-se crescer, em que a referida aplicação é efetiva para aumentar a tolerância da planta e resistência aos fatores de estresse biótico selecionados a partir do grupo consistindo em pestes tais como insetos, aracnídeos, nematódeos, ervas daninhas, e combinações dos mesmos.
[00167] Um décimo nono aspecto da invenção refere-se a um método de aumentar a tolerância de uma planta ao estresse abiótico. Este método inclui: aplicar uma quantidade efetiva de um peptídeo isolado ou proteína de fusão de acordo com o primeiro, segundo, terceiro, quarto, quinto, sexto, sétimo, oitavo, nono, décimo, décimo primeiro, décimo segundo, décimo terceiro ou décimo quarto aspecto da invenção ou uma composição de acordo com o décimo quinto aspecto da invenção a uma planta ou semente de planta ou ao local onde a planta está crescendo ou espera-se crescer, em que a referida aplicação é efetiva para aumentar a tolerância da planta aos fatores de estresse abiótico selecionados a partir do grupo consistindo em estresse por sal, estresse por água (incluindo seca e inundação), estresse por ozônio, estresse por metal pesado, estresse por frio, estresse por calor, estresse nutricional (deficiência de fosfato, potássio, nitrogênio) e combinações dos mesmos.
[00168] Um vigésimo aspecto da invenção refere-se a um método de conferir resistência à dissecação aos cortes removidos das plantas ornamentais. Este método inclui: aplicar um peptídeo isolado ou proteína de fusão de acordo com o primeiro, segundo, terceiro, quarto, quinto, sexto, sétimo, oitavo, nono, décimo, décimo primeiro, décimo segundo, décimo terceiro ou décimo quarto aspecto da invenção ou uma composição de acordo com o décimo quinto aspecto da invenção a uma planta ou ao local onde a planta está crescendo, em que a referida aplicação é efetiva para conferir resistência à dissecação aos cortes removidos da planta ornamental.
[00169] Um vigésimo primeiro aspecto da invenção refere-se a um método de conferir resistência à doença pós-colheita ou à dissecação pós-colheita a uma fruta ou legume. Este método inclui: aplicar uma quantidade efetiva de um peptídeo isolado ou proteína de fusão de acordo com o primeiro, segundo, terceiro, quarto, quinto, sexto, sétimo, oitavo, nono, décimo, décimo primeiro, décimo segundo, décimo terceiro ou décimo quarto aspecto da invenção ou uma composição de acordo com o décimo quinto aspecto da invenção a uma planta contendo uma fruta ou legume ou ao local onde a planta está crescendo; ou aplicar uma quantidade efetiva do peptídeo isolado ou da composição a uma fruta ou legume colhido, em que a referida aplicação é efetiva para conferir resistência à doença pós-colheita ou resistência à dissecação à fruta ou legume.
[00170] Um vigésimo segundo aspecto da invenção refere-se a um método de potencializar a longevidade da maturação da fruta ou legume. Este método inclui: aplicar uma quantidade efetiva de um peptídeo isolado ou proteína de fusão de acordo com o primeiro, segundo, terceiro, quarto, quinto, sexto, sétimo, oitavo, nono, décimo, décimo primeiro, décimo segundo, décimo terceiro ou décimo quarto aspecto da invenção ou uma composição de acordo com o décimo quinto aspecto da invenção a uma planta contendo uma fruta ou legume ou ao local onde a planta está crescendo; ou aplicar uma quantidade efetiva do peptídeo isolado ou da composição a uma fruta ou legume colhido, em que a referida aplicação é efetiva para potencializar a longevidade da maturação da fruta ou legume.
[00171] Um vigésimo terceiro aspecto da invenção refere-se a um método de modular um ou mais processos de sinalização biológicos de uma planta. Este método inclui: aplicar uma quantidade efetiva de um peptídeo isolado de acordo com o primeiro, segundo, terceiro, quarto, quinto, sexto, sétimo, oitavo, nono, décimo, décimo primeiro, décimo segundo, décimo terceiro ou décimo quarto aspecto da invenção ou uma composição de acordo com o décimo quinto aspecto da invenção a uma planta ou ao local onde a planta está crescendo, em que a referida aplicação é efetiva no início de um ou mais processos de sinalização bioquímicos.
[00172] Um vigésimo quarto aspecto da invenção refere-se a uma construção de DNA incluindo uma primeira molécula de ácido nucleico codificando um peptídeo de acordo com o primeiro, segundo, terceiro, quarto, quinto, sexto, sétimo, oitavo, nono, décimo, décimo primeiro, décimo segundo, décimo terceiro ou décimo quarto aspecto da invenção ou um polipeptídeo de fusão contendo a mesma; e uma molécula de ácido nucleico efetiva de promotor acoplada de forma operável à primeira molécula de ácido nucleico. Este aspecto da invenção da mesma forma abrange um vetor de expressão recombinante contendo a construção de DNA, uma célula hospedeira recombinante contendo a construção de DNA, bem como plantas transgênicas ou sementes de planta que incluem uma célula de planta recombinante da invenção (que contém a construção de DNA).
[00173] Um vigésimo quinto aspecto da invenção refere-se a um método de conferir resistência à doença às plantas, potencializar o crescimento da planta, conferir tolerância e resistência aos estressores bióticos, conferir tolerância ao estresse abiótico, ou modular a sinalização bioquímica da planta. Este método inclui fornecer uma planta transgênica transformada com uma construção de DNA de acordo com o vigésimo quarto aspecto da invenção; e cultivar a planta sob condições efetivas para permitir a construção de DNA expressar o peptídeo ou o polipeptídeo de fusão para conferir resistência à doença, potencializar o crescimento da planta, conferir tolerância e resistência aos estressores bióticos, conferir tolerância ao estresse abiótico, ou modular a sinalização bioquímica à planta transgênica.
[00174] Um vigésimo sexto aspecto da invenção refere-se a um método de conferir resistência à dissecação aos cortes removidos de plantas ornamentais, conferir resistência à doença pós-colheita ou à dissecação pós-colheita a uma fruta ou legume, ou potencializar a longevidade da maturação da fruta ou legume. O método inclui fornecer uma planta transgênica transformada com uma construção de DNA de acordo com o vigésimo quarto aspecto da invenção; e cultivar a planta sob condições efetivas para permitir a construção de DNA expressar o peptídeo ou o polipeptídeo de fusão para conferir resistência à dissecação aos cortes removidos de uma planta ornamental transgênica, conferir resistência à doença pós-colheita ou resistência à dissecação a uma fruta ou legume removido da planta transgênica, ou potencializar a longevidade da maturação para uma fruta ou legume removido da planta transgênica.
[00175] Um vigésimo sétimo aspecto da invenção refere-se a um método de conferir resistência à doença às plantas, potencializar o crescimento da planta, conferir tolerância e resistência aos estressores bióticos, conferir tolerância ao estresse abiótico, ou modular a sinalização bioquímica. Este método inclui fornecer uma semente de planta transgênica transformada com uma construção de DNA de acordo com o vigésimo quarto aspecto da invenção; plantar a semente de planta transgênica no solo; e propagar uma planta transgênica da semente de planta transgênica para permitir a construção de DNA expressar o peptídeo ou o polipeptídeo de fusão para conferir resistência à doença, potencializar o crescimento da planta, conferir tolerância ao estresse biótico e resistência aos estressores bióticos, ou conferir tolerância ao estresse abiótico.
[00176] Um vigésimo oitavo aspecto da invenção refere-se a um método de conferir resistência à dissecação aos cortes removidos de plantas ornamentais, conferir resistência à doença pós-colheita ou à dissecação pós-colheita a uma fruta ou legume, ou potencializar a longevidade da maturação da fruta ou legume. O método inclui fornecer uma semente de planta transgênica transformada com uma construção de DNA de acordo com o vigésimo quarto aspecto da invenção; plantar a semente de planta transgênica no solo; e propagar uma planta transgênica da semente de planta transgênica para permitir a construção de DNA expressar o peptídeo ou o polipeptídeo de fusão para conferir resistência à dissecação aos cortes removidos de uma planta ornamental transgênica, conferir resistência à doença pós- colheita ou resistência à dissecação a uma fruta ou legume removido da planta transgênica, ou potencializar a longevidade da maturação para uma fruta ou legume removido da planta transgênica.
[00177] O fornecimento dos peptídeos que não desencadeiam uma resposta hipersensível, porém, desencadeiam outras respostas de planta ativas, incluindo, entre outros, produção de peróxido, realce de crescimento, e resistência ao estresse biótico e abiótico, onde tais peptídeos desejavelmente exibem solubilidade melhorada, estabilidade, resistência à degradação química, ou uma combinação destas propriedades, proporcionará aos cultivadores com maior flexibilidade na preparação, manuseio e liberação às plantas nos seus campos ou estufas quantidades efetivas de composições contendo estes peptídeos HR-negativos. A simplificação do processo de aplicação aos produtores conduzirá a uma maior conformidade e, assim, a melhores resultados no que diz respeito a um ou mais dentre resistência à doença, realce de crescimento, tolerância e resistência aos estressores bióticos, tolerância ao estresse abiótico, resistência à dissecação para cortes removidos de plantas ornamentais, resistência à doença pós-colheita ou resistência à dissecação à fruta ou vegetais colhidos de plantas, e/ou longevidade melhorada da maturação da fruta ou legume para fruta ou vegetais colhidos de plantas. Estes e outros benefícios são descritos aqui.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[00178] Um aspecto da invenção refere-se a novos peptídeos que possuem a capacidade de induzir uma resposta de planta ativa, porém, não uma resposta hipersensível, que proporciona um ou mais dos seguintes atributos: sinalização bioquímica modificada; crescimento realçado; resistência ao patógeno; e/ou resistência ao estresse biótico ou abiótico.
[00179] Quando aqui usado, os aminoácidos de ocorrência natural são identificados ao longo das abreviaturas convencionais de três letras e/ou uma letra, correspondendo ao nome trivial do aminoácido, de acordo com a seguinte lista: Alanina (Ala, A), Arginina (Arg, R), Asparagina (Asn, N), Ácido aspártico (Asp, D), Cisteína (Cys, C), Ácido glutâmico (Glu, E), Glutamina (Gln, Q), Glicina (Gly, G), Histidina (His, H), Isoleucina (Ile, I), Leucina (Leu, L), Lisina (Lys, K), Metionina (Met, M), Fenilalanina (Phe, F), Prolina (Pro, P), Serina (Ser, S), Treonina (Thr, T), Triptofano (Trp, W), Tirosina (Tyr, Y), e Valina (Val, V). As abreviações são aceitas na técnica do peptídeo e são recomendadas pela comissão de IUPAC-IUB na nomenclatura bioquímica. Variações de ocorrência natural de aminoácidos incluem, sem limitação, gama- glutamato (g-Glu) e isoaspartato (iso-Asp ou isoD).
[00180] O termo “aminoácido” também inclui análogos, derivados e congêneres de qualquer aminoácido específico referido aqui, bem como derivados de aminoácido protegidos C-terminal ou N-terminal (por exemplo, modificados com um grupo protetor N-terminal, de cadeia lateral, ou C-terminal, incluindo, porém, não limitado à acetilação, formilação, metilação, amidação, esterificação, PEGuilação, e adição de lipídeos). Aminoácidos de ocorrência não natural são bem conhecidos e podem ser introduzidos nos peptídeos da presente invenção usando a síntese de fase sólida como descrito abaixo. Além disso, o termo “aminoácido” inclui igualmente D- e L-aminoácidos. Consequentemente, um aminoácido que é identificado aqui por seu nome, símbolo de três letras ou uma letra e não é identificado especificamente como tendo a configuração D ou L, entende-se que assume qualquer uma das configurações D ou L. Em uma modalidade, um peptídeo compreende todos os L-aminoácidos.
[00181] Em certas modalidades, peptídeos são identificados para “consistir em” uma sequência referida, caso em que o peptídeo inclui apenas a(s) sequência(s) de aminoácido referida(s) sem quaisquer aminoácidos estranhos nas extremidades N- ou C-terminais dos mesmos. Na medida em que uma sequência referida está na forma de uma sequência de consenso onde um ou mais dos resíduos de X ou Xaa denotados podem ser qualquer dentre um ou mais aminoácidos, em seguida, múltiplas sequências de peptídeo são abrangidas por um peptídeo consistindo em uma tal sequência referida.
[00182] Em certas outras modalidades, os peptídeos são identificados para “consistirem essencialmente em” uma sequência referida, caso em que o peptídeo inclui a(s) sequência(s) de aminoácido referida(s) opcionalmente com um ou mais aminoácidos estranhos nas extremidades N- e/ou C-terminais dos mesmos, cujos aminoácidos estranhos não alteram materialmente uma ou mais das seguintes propriedades: (i) a capacidade do peptídeo induzir uma resposta de planta ativa, (ii) solubilidade do peptídeo em água ou soluções aquosas, (iii) estabilidade do peptídeo dissolvido em água ou solução aquosa a 50°C durante um período de tempo (por exemplo, 3 semanas), (iv) resistência do peptídeo à degradação química na presença de uma solução tamponada aquosa que inclui um agente biocida (por exemplo, Proxel®GXL) a 50°C durante um período de tempo (por exemplo, 3 semanas); e (v) a incapacidade do peptídeo induzir uma resposta hipersensível na infiltração ou aplicação às plantas.
[00183] Brevemente, a estabilidade e resistência à degradação química dos peptídeos podem ser avaliadas como segue usando as amostras de peptídeo tendo uma pureza inicial de pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 98%. Para estabilidade em água, o peptídeo é dissolvido diretamente em água deionizada. Para testes de degradação química, o peptídeo é dissolvido em uma solução aquosa contendo 50 mM de tampão de pH e 0,25% de Proxel GXL. Tampões de pH exemplares incluem, sem limitação: (i) Citrato pH 5,6; (ii) MES pH 6,2; (iii) MOPS pH 6,5; (iv) imidazol pH 7.0; (v) Citrato pH 7,2; (vi) EDDS, pH 7,3; (vii) EDTA pH 8,0; (viii) fosfato sódico pH 8,0; ou (ix) TES pH 8,0. Os peptídeos são primeiro dissolvidos na solução aquosa em uma concentração de 0,5 mg/mL. As amostras são incubadas a 50°C para permitir a degradação acelerada. Uma amostra inicial do peptídeo é removida, diluída 10x com água, e analisada por HPLC de fase reversa. Brevemente, 20 μl da amostra são injetados no fluxo de solvente de um instrumento de HPLC e analisados em uma coluna de HPLC C18 (YMC ProPack C18, YMC, Japan, ou C18 Stablebond, Agilent Technologies, USA) usando um fosfato de trietilamina em gradiente de água/acetonitrila ou um gradiente de TFA a 0,1% em água/TFA a 0,1% em acetonitrila para separar espécies de peptídeo diferentes. Peptídeos de eluição são monitorados por absorvência UV em 218 nm e quantificados com base na área sob o pico. A área sob o pico para a amostra de peptídeo inicial é tratada como o padrão para quantificação relativa em ciclos subsequentes. Em intervalos regulares (por exemplo, 1, 3, 7, 10, 14, 17, e 21 dias), cada amostra de peptídeo é pesquisada e analisada por HPLC como descrito acima. Se necessário observar a degradação (isto é, onde o peptídeo exibe um alto grau de estabilidade química), este protocolo pode ser estendido por várias semanas para observar a degradação. A quantificação dos ciclos de peptídeo subsequentes é expressa como uma porcentagem do resultado de HPLC original (dia 0).
[00184] Um peptídeo que é pelo menos parcialmente solúvel em água ou solução aquosa exibe uma solubilidade maior do que 0,1 mg/mL, preferivelmente pelo menos cerca de 1,0 mg/mL, pelo menos cerca de 2,0 mg/mL, pelo menos cerca de 3,0 mg/mL, ou pelo menos cerca de 4,0 mg/mL. Em certas modalidades, o peptídeo exibe alta solubilidade em água ou solução aquosa, com uma solubilidade de pelo menos cerca de 5,0 mg/mL, pelo menos cerca de 10,0 mg/mL, pelo menos cerca de 15,0 mg/mL, ou pelo menos cerca de 20 mg/mL.
[00185] Um peptídeo que é estável em água ou solução aquosa exibe pelo menos cerca de 66%, pelo menos cerca de 68%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 72 %, pelo menos cerca de 74 %, pelo menos cerca de 76%, pelo menos cerca de 78%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 88%, ou pelo menos cerca de 90% da concentração de peptídeo original durante o período designado de tempo incubado a 50°C. Em certas modalidades, o período designado de tempo é 3 dias, 7 dias, 14 dias, 21 dias, 28 dias, um mês, dois meses, ou três meses.
[00186] Um peptídeo que é resistente à degradação química exibe pelo menos cerca de 66%, pelo menos cerca de 68%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 72 %, pelo menos cerca de 74 %, pelo menos cerca de 76%, pelo menos cerca de 78%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 88%, ou pelo menos cerca de 90% da concentração de peptídeo original durante o período designado de tempo incubado a 50°C. Em certas modalidades, o período designado de tempo é 3 dias, 7 dias, 14 dias, 21 dias, 28 dias, um mês, dois meses, três meses, ou quatro meses. Quatro meses de estabilidade a 50°C é aproximadamente equivalente a 2 anos de estabilidade em temperatura ambiente.
[00187] Uma propriedade de um peptídeo de desencadear uma resposta hipersensível, ou não, na infiltração ou aplicação do peptídeo aos tecidos de planta pode ser medida aplicando-se o peptídeo em forma de pó seco ou na forma de solução a uma planta, particularmente embora não exclusivamente uma folha de planta. As taxas de aplicação incluem 1-500 μg/mL para solução líquida e 0,0001 - 0,5% (p/p para aplicação de pó. A aplicação exemplar do peptídeo em forma de solução é descrita nos Exemplos acompanhantes. As plantas são consideradas HR-positivas (“HR+”) se apresentarem morte celular macroscópica de grande alcance visível a olho nu, acompanhada por murchamento e escurecimento do tecido afetado em 48 horas. As plantas são consideradas HR-negativas (“HR-”) se não apresentarem murchamento discernível ou morte de tecido observável a olho nu. É possível que um peptídeo HR- possa causar a morte de uma proporção pequena de células em tecido tratado que não é observável a olho nu.
[00188] Em certas modalidades, alteração do material da uma ou mais propriedades é pretendida significar que há menos do que 20% de variação, menos do que 15% de variação, menos do que 10% de variação, ou menos do que 5% de variação em uma propriedade referida quando comparando um peptídeo que possui o um ou mais aminoácidos estranhos a um peptídeo de outra maneira idêntico sem um ou mais aminoácidos estranhos. Em certas modalidades, o número de aminoácidos estranhos nas extremidades N- ou C-terminais é até 20 aminoácidos em uma ou ambas extremidades, até 15 aminoácidos em uma ou ambas extremidades, até 10 aminoácidos em uma ou ambas extremidades, até 7 aminoácidos em uma ou ambas extremidades, até 5 aminoácidos em uma ou ambas extremidades, ou até 3 aminoácidos em uma ou ambas extremidades. Além disso, na medida em que uma sequência referida está na forma de uma sequência de consenso onde um ou mais dos resíduos de X ou Xaa denotados podem ser qualquer dentre um ou mais aminoácidos, em seguida múltiplas sequências de peptídeo são abrangidas pelo peptídeo consistindo essencialmente em uma tal sequência referida, sem considerar as variações adicionais de tais sequências que são proporcionadas pela presença de aminoácidos estranhos nas suas extremidades N- e/ou C-terminais.
[00189] Em várias modalidades da invenção, os peptídeos descritos podem incluir uma sequência hidrofílica de aminoácido, por exemplo, na extremidade N-terminal ou C-terminal de uma sequência de peptídeo designada. A sequência de aminoácido hidrofílica é pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, ou pelo menos 10 aminoácidos no comprimento, e inclui resíduos de aminoácido que contribui para uma propriedade hidrofílica da sequência de aminoácido que é adjacente à sequência de aminoácido do peptídeo designado (isto é, o peptídeo que induz uma resposta de planta ativa). Métodos diferentes foram usados na técnica para calcular a hidrofobicidade/hidrofilicidade relativa dos resíduos de aminoácido e proteínas (Kyte et al., “A Simple Method for Displaying the Hydropathic Character of a Protein,” J. Mol. Biol. 157: 105-32 (1982); Eisenberg D, “Three-dimensional Structure of Membrane and Surface Proteins,” Ann. Rev. Biochem. 53: 595-623 (1984); Rose et al.,“Hydrogen Bonding, Hydrophobicity, Packing, and Protein Folding,” Annu. Rev. Biomol. Struct. 22: 381-415 (1993); Kauzmann, “Some Factors in the Interpretation of Protein Denaturation,” Adv. Protein Chem. 14: 1-63 (1959), que estão aqui incorporados por referência em sua totalidade). Qualquer uma destas escalas de hidrofobicidade pode ser usada para os propósitos da presente invenção; entretanto, a escala de hidrofobicidade de Kyte-Doolittle é talvez a escala mais frequentemente referenciada. Estas escalas de hidropatia fornecem uma lista de classificação para a hidrofobicidade relativa de resíduo de aminoácidos. Por exemplo, aminoácidos que contribuem para a hidrofilicidade incluem Arg (R), Lys (K), Asp (D), Glu (E), Gln (Q), Asn (N), e His (H) bem como, embora em menor grau, Ser (S), Thr (T), Gly (G), Pro (P), Tyr (Y), e Trp (W). Por exemplo, sequências de poliglutamato podem ser usadas para potencializar a solubilidade das proteínas e outras moléculas de fármaco (Lilie et al, Biological Chemistry 394(8):995-1004(2013); Li et al., Cancer Research 58: 2404- 2409(1998)), cada dos quais está aqui incorporado por referência em sua totalidade).
[00190] O “índice de hidropatia” de uma proteína ou sequência de aminoácido é um número que representa suas propriedades hidrofílicas ou hidrofóbicas médias. Um índice de hidropatia negativo define a hidrofilicidade da sequência de aminoácido de interesse. O índice de hidropatia é diretamente proporcional à hidrofilicidade da sequência de aminoácido de interesse; desse modo, quanto mais negativo o índice, maior sua hidrofilicidade. Em certas modalidades, a sequência de aminoácido hidrofílica adicionada descrita acima tem um índice de hidropatia com menos do que 0, -0,4, -0,9, -1,3, -1,6, -3,5, -3,9, ou -4,5. Em certas modalidades, o peptídeo inteiro resultante terá um índice de hidropatia com menos do que 0,3, 0,2, 0,1, ou 0,0, preferivelmente menor do que -0,1, -0,2, -0,3, -0,4, mais preferivelmente menos do que -0,5, -0,6, -0,7, -0,8, -0,9, ou -1,0.
[00191] Nos peptídeos da presente invenção, os aminoácidos que contribuem para um índice de hidropatia hidrofílico, para o peptídeo como um todo ou para a sequência de aminoácido hidrofílica adicionada, incluem Arg (R), Lys (K), Asp (D), Glu (E), Gln (Q), Asn (N), His (H), Ser (S), Thr (T), Gly (G), Pro (P), Tyr (Y), e Trp (W). Destes, Asp (D), Glu (E), Gln (Q), Asn (N) ou suas variantes são preferidas. Variantes exemplares incluem g-glutamato para Glu e ácido isoaspártico (ou isoD) para Asp.
[00192] Quando aqui usado, neste e em outros aspectos da invenção, o termo “aminoácido hidrofóbico” é pretendido referir-se a um aminoácido que contribui para o índice de hidropatia de hidrofobicidade de uma sequência designada de aminoácido. Aminoácidos que contribuem para um índice de hidropatia hidrofóbico, para o peptídeo como um todo ou para uma sequência de aminoácido particular do mesmo, incluem Ile (I), Val (V), Leu (L), Phe (F), Cys (C), Met (M), e Ala (A). Em certas modalidades, o termo “aminoácido hidrofóbico” pode referir-se a qualquer um dentre Ile (I), Val (V), Leu (L), Phe (F), Cys (C), Met (M), e Ala (A); ou, alternativamente, a qualquer um dentre Ile (I), Val (V), Leu (L), Phe (F), e Ala (A). Em certas outras modalidades, o termo “aminoácido hidrofóbico” referir-se a um dentre Ile (I), Val (V), Leu (L), e Phe (F).
[00193] Quando aqui usado, o termo “aminoácido não hidrofóbico” é pretendido significar um aminoácido que é hidrofílico (ou não hidrofóbico) em uma das escalas de hidrofobicidade acima identificadas. Este termo geralmente refere-se àqueles aminoácidos que contribuem para um índice de hidropatia hidrofílico para o peptídeo como um todo ou para a sequência de aminoácido hidrofílica adicionada.
[00194] Em um aspecto da invenção, o peptídeo inclui a sequência de aminoácido de: J-X-X-X-J-J-X-X-X-J-J-X-X-X-J-J (SEQ ID NO: 1)
[00195] em que o peptídeo é livre de cisteína e metionina, cada X nas posições 2, 3, 7, 8, 12, e 13 é opcional e, quando presente, é qualquer aminoácido, cada resíduo de X nas posições 4, 9, e 14 é qualquer aminoácido, um a três dos resíduos de J nas posições 1, 5, 6, 10, 11, 15, e 16 é um aminoácido não hidrofóbico ou A (preferivelmente, quando A está presente, está em uma das posições 1, 5, 6, 10, 15, ou 16), e todos os outros dentre os resíduo de J são L, I, V, ou F, (preferivelmente L, I, ou V); e em que o peptídeo induz uma resposta de planta ativa, porém, não induz uma resposta hipersensível, quando aplicada ao tecido da planta.
[00196] Em certas modalidades, o peptídeo não compreende ou consiste na sequência de aminoácido DVGQLIGELIDRGLQ (SEQ ID NO: 15), GDVGQLIGELIDRGLQSVLAG (SEQ ID NO: 16),SSRALQEVIAQLAQELTHN (SEQ ID NO: 17), ou GLEDIKAALDTLIHEKLG (SEQ ID NO: 18). Cada um destes peptídeos é identificado em Haapalainen et al., “Functional Mapping of Harpin HrpZ of Pseudomonas syringae Reveals the Sites Responsible for Protein Oligomerization, Lipid Interactions, and Plant Defence Induction,” Mol. Plant Pathol. 12(2):151-66 (2011), que está aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[00197] Em uma modalidade, um a três dos resíduos de J nas posições 1, 5, 6, 10, 11, 15, e 16 é um aminoácido não hidrofóbico, e todos os outros são preferivelmente L, I, V, ou F. De acordo com uma modalidade particular, não mais do que dois dentre os resíduos de J nas posições 1, 5, 6, 10, 11, 15, e 16 são não hidrofóbicos. Em outra modalidade, não mais do que um dentre os resíduos de J nas posições 1, 5, 6, 10, 11, 15, e 16 é não hidrofóbico.
[00198] Em uma modalidade, não mais do que um dentre os resíduos de J é A, e preferivelmente o resíduo de A está em uma das posições 1, 5, 6, 10, 15, e 16; um ou dois dos resíduos de J restantes é opcionalmente um aminoácido não hidrofóbico, e todos os outros resíduos de J são L, I, V, ou F. Em certas modalidades, não mais do que um dentre os resíduos de J é A, e preferivelmente o resíduo de A está em uma das posições 1, 5, 6, 10, 15, e 16; e todos os outros resíduos de J são L, I, V, ou F.
[00199] Em certas modalidades, o número dos aminoácidos separando os resíduos na posição 1 das posições 5 e 6, das posições 10 e 11, e das posições 15 e 16 pode variar de um a três aminoácidos. Em uma modalidade, um dos resíduos de X nas posições 2 e 3 não está presente, um dos resíduos de X nas posições 7 e 8 não está presente, um dos resíduos de X nas posições 12 e 13 não está presente, ou dois ou mais dos resíduos de X nestas posições não estão presentes. Por exemplo, em uma modalidade, um dos resíduos de X nas posições 2 e 3 e um dos resíduos de X nas posições 7 e 8 não estão presentes. Em outra modalidade, o resíduo de X na posição 12, 13, ou ambos, não está presente. Em outra modalidade, um dos resíduos de X nas posições 2 e 3, um dos resíduos de X nas posições 7 e 8, e um dos resíduos de X nas posições 12 e 13 não estão presentes.
[00200] Em outra modalidade, cada dentre os resíduos de X nas posições 2, 3, 7, e 8 está presente (isto é, o peptídeo inclui três aminoácidos separando o resíduo na posição 1 dos resíduos nas posições 5 e 6, e os resíduos nas posições 5 e 6 das posições de resíduos 10 e 11). Em outra modalidade, o resíduo de X na posição 12 está presente ou os resíduos de X nas posições 12 e 13 estão presentes (isto é, o peptídeo inclui dois ou três aminoácidos separando os resíduos nas posições 10 e 11 dos resíduos nas posições 15 e 16).
[00201] Nos parágrafos precedentes, a numeração de resíduo refere-se à SEQ ID NO: 1, embora porque certos resíduos são opcionais, a posição real dos resíduos de J e resíduos intervenientes podem diferir-se em qualquer peptídeo particular.
[00202] O comprimento do peptídeo nesta modalidade é menor do que 100 aminoácidos, ou alternativamente menor do que 90 aminoácidos, menor do que 80 aminoácidos, menor do que 70 aminoácidos, menor do que 60 aminoácidos, ou menor do que cerca de 50 aminoácidos. Em certas modalidades, o comprimento do peptídeo está entre 12 e cerca de 50 aminoácidos no comprimento.
[00203] Nas modalidades descritas acima, onde os resíduos de X em cada das posições 2, 3, 7, 8, 12, (quando presente) de SEQ ID NO: 1 podem ser qualquer aminoácido, em certas modalidades estes resíduos são independentemente selecionados a partir do grupo de Arg (R), Lys (K), Asp (D), Glu (E), Gln (Q), Asn (N), Ser (S), Thr (T), Gly (G), ácido isoaspártico (isoD), e g-glutamato, e cada resíduo de X nas posições 4, 9, e 13 é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em G, A, S, T, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N, K, e R.
[00204] Nesta modalidade, o peptídeo isolado é preferivelmente estável quando dissolvido em água; resistente à degradação química em condições aquosas na presença de um tampão de pH e um biocida, como descrito acima; e/ou tem uma solubilidade em uma solução aquosa de pelo menos cerca de 1,0 mg/mL.
[00205] Peptídeos exemplares de acordo com o primeiro aspecto da invenção compreendem as sequências de aminoácido identificadas na Tabela 1 abaixo:Tabela 1
[00206] Em certas modalidades, estes peptídeos consistem essencialmente em, ou consistem na sequência de aminoácido de uma ou mais dentre SEQ ID NOS: 19-46.
[00207] Outros peptídeos exemplares de acordo com o primeiro aspecto da invenção compreendem as sequências de aminoácido identificadas na Tabela 2 abaixo:Tabela 2
[00208] Em certas modalidades, estes peptídeos consistem essencialmente em, ou consistem na sequência de aminoácido de uma ou mais dentre SEQ ID NOS: 47-68.
[00209] Outros peptídeos exemplares de acordo com o primeiro aspecto da invenção compreendem as sequências de aminoácido identificadas na Tabela 3 abaixo:Tabela 3
[00210] Na Tabela 3, os peptídeos incluem o tag de solubilidade SEEEEE, indicado por impressão em itálico. Peptídeos compreendendo as sequências mostradas na Tabela 3, porém, faltando este tag de solubilidade específico (ou tendo um tag de solubilidade diferente) são da mesma forma considerados aqui.
[00211] Em certas modalidades, estes peptídeos consistem essencialmente em, ou consistem na sequência de aminoácido de uma ou mais dentre SEQ ID NOS: 69-84.
[00212] Peptídeo do primeiro aspecto da invenção podem da mesma forma compreender as sequências de aminoácido identificadas na Tabela 4 abaixo:Tabela 4
[00213] Na Tabela 4, os peptídeos incluem o tag de solubilidade SEEEEE, indicado por impressão em itálico. Peptídeos compreendendo as sequências mostradas na Tabela 4, porém, faltando este tag de solubilidade específico (ou tendo um tag de solubilidade diferente) são da mesma forma considerados aqui.
[00214] Em certas modalidades, estes peptídeos consistem essencialmente em, ou consistem na sequência de aminoácido de uma ou mais dentre SEQ ID NOS: 85-98.
[00215] Em outra modalidade do primeiro aspecto da invenção, peptídeos compreendem as sequências de aminoácido identificadas na Tabela 5 abaixo:Tabela 5
[00216] Na Tabela 5, os peptídeos incluem o tag de solubilidade SEEEEE, indicado por impressão em itálico. Peptídeos compreendendo as sequências mostradas na Tabela 5, porém, faltando este tag de solubilidade específico (ou tendo um tag de solubilidade diferente) são da mesma forma considerados aqui.
[00217] Em certas modalidades, estes peptídeos consistem essencialmente em, ou consistem na sequência de aminoácido de uma ou mais dentre SEQ ID NOS: 99-112.
[00218] Outro aspecto da invenção refere-se a um peptídeo isolado compreendendo a sequência de aminoácido de uma dentre SEQ ID NOS: 113, 114, 117-123, 127, 133-138, 140-142, 144, 145, 148-150, e 153-155, como mostrado na Tabela 6 abaixo:Tabela 6
[00219] Na Tabela 6, vários peptídeos incluem os tags de solubilidade S-polyE onde o segmento de polyE contém de 3 a 7 resíduos de Glu (E), indicado por impressão em itálico. Peptídeos compreendendo as sequências mostradas na Tabela 6, porém, faltando este tag de solubilidade específico (ou tendo um tag de solubilidade diferente) são da mesma forma considerados aqui.
[00220] Em certas modalidades, estes peptídeos consistem essencialmente em, ou consistem na sequência de aminoácido de uma ou mais dentre SEQ ID NOS: 113, 114, 117-123, 127, 133-138, 140142, 144, 145, 148-150, 153-159.
[00221] Outro aspecto da invenção refere-se a um peptídeo isolado tendo a sequência de aminoácido de:XXGISEKXXXXXXXXXXXXXXXX (SEQ ID NO: 2, consenso de P1/P4 modificado), em que
[00222] X na posição 1 é opcional e pode ser S, N, D, isoD, G, A ou S;
[00223] X na posição 2 é opcional e pode ser Q, E, g-glutamato, G, A ou S;
[00224] X na posição 8 é Q, E, g-glutamato, G, A ou S;
[00225] X na posição 9 é M, L, I, F, ou V, ou um aminoácido não hidrofóbico;
[00226] X na posição 10 é opcional e pode ser D ou isoD;
[00227] X na posição 11 é Q, E, g-glutamato, G, A ou S;
[00228] X na posição 12 é M, L, I, ou F, ou um aminoácido não hidrofóbico;
[00229] X na posição 13 é M, L, ou I, ou um aminoácido não hidrofóbico;
[00230] X na posição 14 é opcional e pode ser qualquer aminoácido hidrofílico, S, T, D, isoD, K, ou Q, e opcionalmente A ou C;
[00231] X na posição 15 é Q, E, g-glutamato, G, A, S, K ou I;
[00232] X na posição 16 é M, L, I, V, ou F, ou um aminoácido não hidrofóbico;
[00233] X na posição 17 é M, L, I, A, ou V, ou um aminoácido não hidrofóbico;
[00234] X na posição 18 é Q, E, g-glutamato, G, A, S, M, T ou K;
[00235] X na posição 19 é A, D, isoD, S, V, T, K, R, E, H ou G;
[00236] X na posição 20 é M, L ou I;
[00237] X na posição 21 é M, L, I, V, S, ou F, ou um aminoácido não hidrofóbico exceto serina;
[00238] X na posição 22 é Q, E, g-glutamato, G, A, S;
[00239] X na posição 23 é P, Q, E, g-glutamato, G, A ou S; e
[00240] em que pelo menos um dos resíduos nas posições 9, 12, 13, 16, 17, e 20 é um aminoácido não hidrofóbico, ou o resíduo na posição 21 é um aminoácido não hidrofóbico exceto serina; e em que o peptídeo induz uma resposta de planta ativa, porém, não induz uma resposta hipersensível, quando aplicada ao tecido da planta.
[00241] Nesta modalidade, o peptídeo isolado é preferivelmente estável quando dissolvido em água; resistente à degradação química em condições aquosas na presença de um tampão de pH e um biocida, como descrito acima; e/ou tem uma solubilidade em uma solução aquosa de pelo menos cerca de 1,0 mg/mL.
[00242] Uma família exemplar de peptídeos de acordo com este aspecto da invenção tem a sequência de aminoácido de:SXGISEKXXDXXXXXXXXAXXXP (SEQ ID NO: 3, consenso de P4 modificado), em que
[00243] X na posição 2 é Q, E, g-glutamato, G, A ou S;
[00244] X na posição 8 é Q, E, g-glutamato, G, A ou S;
[00245] X na posição 9 é M, S, L, A, I, V, ou F, ou um aminoácido não hidrofóbico exceto serina;
[00246] X na posição 11 é Q, E, g-glutamato, G, A ou S;
[00247] X na posição 12 é L, I, ou F, ou um aminoácido não hidrofóbico;
[00248] X na posição 13 é L, A, I, V, ou F, ou um aminoácido não hidrofóbico;
[00249] X na posição 14 é qualquer aminoácido hidrofílico;
[00250] X na posição 15 é Q, E, g-glutamato, G, A, S, K ou I;
[00251] X na posição 16 é L, A, I, V, M, ou F, ou um aminoácido não hidrofóbico;
[00252] X na posição 17 é M, I, S, ou F, ou um aminoácido não hidrofóbico exceto serina;
[00253] X na posição 18 é Q, E, g-glutamato, G, A ou S;
[00254] X na posição 20 é M, L, I, V, ou F, ou um aminoácido não hidrofóbico;
[00255] X na posição 21 é M, L ou F, ou um aminoácido não hidrofóbico; e
[00256] X na posição 22 é Q, E, g-glutamato, G, A ou S;
[00257] em que um dos resíduos nas posições 9, 12, 13, 16, 20, e 21 é um aminoácido não hidrofóbico ou A, ou o resíduo na posição 17 é um aminoácido não hidrofóbico exceto serina; e em que o peptídeo induz uma resposta de planta ativa, porém, não induz uma resposta hipersensível, quando aplicada ao tecido da planta. Preferivelmente, um a quatro, não mais do que três, não mais do que dois, ou exatamente um dos resíduos nas posições 9, 12, 13, 16, 20, e 21 é um aminoácido não hidrofóbico, ou o resíduo na posição 17 é um aminoácido não hidrofóbico exceto serina.
[00258] Em certas modalidades, estes peptídeos de acordo com SEQ ID NO: 2 da mesma forma alcançam os aspectos estruturais na definição dos peptídeos de SEQ ID NO: 1, caso em que os resíduos de metionina e cisteína não estão presentes. Desse modo, nestas modalidades, X na posição 14 pode ser qualquer aminoácido hidrofílico exceto metionina ou cisteína, preferivelmente S ou T.
[00259] Peptídeos exemplares que compartilham a estrutura de consenso com SEQ ID NO: 3, ou são derivados de SEQ ID NO: 3, são identificados na Tabela 7 abaixo:Tabela 7: Variantes de Peptídeo do Peptídeo P4 (SEQ ID NO: 3 de consenso)
[00260] Em certas outras modalidades, o peptídeo isolado consiste essencialmente em, ou consiste na sequência de aminoácido de uma ou mais dentre SEQ ID NOS: 48-56, 58, 59, 61 e 161-163.
[00261] Nesta modalidade, o peptídeo isolado é preferivelmente estável quando dissolvido em água; resistente à degradação química em condições aquosas na presença de um tampão de pH e um biocida, como descrito acima; e/ou tem uma solubilidade em uma solução aquosa de pelo menos cerca de 1,0 mg/mL.
[00262] Outra família exemplar de peptídeos de acordo com este aspecto da invenção tem a sequência de aminoácido de:XXGISEKXJDXJJTXJJXAJJXX (SEQ ID NO: 4, consenso de P1 modificado), em que
[00263] X na posição 1 é N, D, isoD, G, A ou S;
[00264] X na posição 2 é Q, E, g-glutamato, G, A ou S;
[00265] X na posição 8 é Q, E, g-glutamato, G, A ou S;
[00266] X na posição 11 é Q, E, g-glutamato, G, A ou S;
[00267] X na posição 15 é Q, E, g-glutamato, G, A ou S;
[00268] X na posição 18 é M, T, K, E, g-glutamato, G, A ou S;
[00269] X na posição 22 é Q, E, g-glutamato, G, A ou S;
[00270] X na posição 23 é Q, E, g-glutamato, G, A ou S; e
[00271] J nas posições 9, 12, 13, 16, 17, 20, e 21 são aminoácidos hidrofóbicos selecionados dentre L, V, I e F, exceto que um dos aminoácidos nestas posições é um aminoácido não hidrofóbico ou A; em que o peptídeo induz uma resposta de planta ativa, porém, não induz uma resposta hipersensível, quando aplicada ao tecido da planta. Preferivelmente, um a quatro, não mais do que três, não mais do que dois, ou exatamente um dos resíduos nas posições 9, 12, 13, 16, 17, 20, e 21 é um aminoácido não hidrofóbico ou A. Em uma modalidade, não mais do que um dentre os resíduos de J é A, e preferivelmente o resíduo de A está em uma das posições 9, 12, 13, 16, 20 e 21; um ou dois dos resíduos de J restantes é opcionalmente um aminoácido não hidrofóbico, e todos os outros resíduos de J são L, I, V, ou F. Em certas modalidades, não mais do que um dentre os resíduos de J é A, e preferivelmente o resíduo de A está em uma das posições 9, 12, 13, 16, 20, e 21; e todos os outros resíduos de J são L, I, V ou F.
[00272] Em certas modalidades, estes peptídeos de acordo com SEQ ID NO: 4 da mesma forma alcançam os aspectos estruturais na definição dos peptídeos de SEQ ID NO: 1, caso em que os resíduos de metionina e cisteína não estão presentes. Desse modo, naquelas modalidades, X na posição 18 é T, K, E, g-glutamato, G, A ou S.
[00273] Nesta modalidade, o peptídeo isolado é preferivelmente estável quando dissolvido em água; resistente à degradação química em condições aquosas na presença de um tampão de pH e um biocida, como descrito acima; e/ou tem uma solubilidade em uma solução aquosa de pelo menos cerca de 1,0 mg/mL.
[00274] Peptídeos exemplares que compartilham a estrutura de consenso com SEQ ID NO: 4 são identificados na Tabela 8 abaixo: Tabela 8: Variantes de Peptídeo P1 (consensus SEQ ID NO: 4)
[00275] Variantes adicionais destes peptídeos podem incluir a substituição de metionina na posição 18 com T, K, E, g-glutamato, G, A, ou S, como notado acima.
[00276] Em certas outras modalidades, o peptídeo isolado consiste essencialmente em, ou consiste na sequência de aminoácido de uma ou mais dentre SEQ ID NOS: 164, 166-179.
[00277] Nesta modalidade, o peptídeo isolado é preferivelmente estável quando dissolvido em água; resistente à degradação química em condições aquosas na presença de um tampão de pH e um biocida, como descrito acima; e/ou tem uma solubilidade em uma solução aquosa de pelo menos cerca de 1,0 mg/mL.
[00278] Ainda outro aspecto da invenção refere-se a um peptide isolado tendo a sequência de aminoácido de: (i) KPXDSXSXJAKJJSXJJXSJJX (SEQ ID NO: 5, consenso de P15b/P20 modificado), em que
[00279] X na posição 3 é N, D ou isoD;
[00280] X na posição 6 é Q, E, g-glutamato, G, A ou S;
[00281] X na posição 8 é N, D ou isoD;
[00282] X na posição 15 é opcional e pode ser qualquer aminoácido;
[00283] X na posição 18 é M, E, g-glutamato, G, A, S, T ou K;
[00284] X na posição 22 é opcional e pode ser Q, E, g-glutamato, G, A ou S; e
[00285] J nas posições 9, 12, 13, 16, 17, 20, e 21 são aminoácidos hidrofóbicos selecionados dentre L, V, I, F, e A, exceto que pelo menos um dos aminoácidos nestas posições é um aminoácido não hidrofóbico; ou (ii) JAKJJSXJJXSJJX (SEQ ID NO: 6, consenso de P15/20 min modificado), em que
[00286] X na posição 7 é opcional e pode ser qualquer aminoácido;
[00287] X na posição 10 é M, E, g-glutamato, G, A, S, T ou K;
[00288] X na posição 14 é opcional e pode ser Q, E, g-glutamato, G, A ou S; e
[00289] J nas posições 1, 4, 5, 8, 9, 12, e 13 são aminoácidos hidrofóbicos selecionados dentre L, V, I, e F, exceto que pelo menos um dos aminoácidos nestas posições é um aminoácido não hidrofóbico ou A; e
[00290] em que o peptídeo induz uma resposta de planta ativa, porém, não induz uma resposta hipersensível, quando aplicada ao tecido da planta. Preferivelmente, um a quatro, não mais do que três, não mais do que dois, ou exatamente um dos resíduos nas posições 9, 12, 13, 16, 17, 20, e 21 de SEQ ID NO: 5 é um aminoácido não hidrofóbico ou A; e um a quatro, não mais do que três, não mais do que dois, ou exatamente um dos resíduos nas posições 1, 4, 5, 8, 9, 12, e 13 de SEQ ID NO: 6 é um aminoácido não hidrofóbico ou A. Em uma modalidade, não mais do que um dentre os resíduos de J é A, e preferivelmente o resíduo de A está em uma das posições 9, 12, 13, 16, 20, e 21 de SEQ ID NO: 5 ou posições 1, 4, 5, 8, 12, e 13 de SEQ ID NO: 6; um ou dois dos resíduos de J restantes é opcionalmente um aminoácido não hidrofóbico, e todos os outros resíduos de J são L, I, V, ou F. Em certas modalidades, não mais do que um dentre os resíduos de J é A, e preferivelmente o resíduo de A está em uma das posições 9, 12, 13, 16, 20, e 21 de SEQ ID NO: 5 ou posições 1, 4, 5, 8, 12, e 13 de SEQ ID NO: 6; e todos os outros resíduos de J são L, I, V, ou F.
[00291] Peptídeos exemplares que compartilham a estrutura de consenso com SEQ ID NO:5 ou 6 são identificados na Tabela 9 abaixo: Tabela 9: Variantes de Peptídeo P15/20 (SEQ ID NOS: 5 ou 6 de consenso)
[00292] Variantes adicionais destes peptídeos podem incluir a substituição de metionina na posição 18 com E, g-glutamato, G, A, S, T, ou K, como notado acima.
[00293] Em certas outras modalidades, o peptídeo consiste essencialmente em, ou consiste na sequência de aminoácido de uma ou mais dentre SEQ ID NOS: 180-193.
[00294] Nesta modalidade, o peptídeo isolado é preferivelmente estável quando dissolvido em água; resistente à degradação química em condições aquosas na presença de um tampão de pH e um biocida, como descrito acima; e/ou tem uma solubilidade em uma solução aquosa de pelo menos cerca de 1,0 mg/mL.
[00295] Um outro aspecto da invenção refere-se a um peptídeo isolado tendo a sequência de aminoácido de:PSPJTXJJXXJJGXJJXAXN (SEQ ID NO: 7, consenso de P6/6a modificado), em que
[00296] X na posição 6 é Q, E, g-glutamato, G, A ou S;
[00297] X na posição 9 é M, E, g-glutamato, G, A, S, T ou K;
[00298] X na posição 10 é H ou N;
[00299] X na posição 14 é E, g-glutamato, D ou isoD;
[00300] X na posição 17 é Q, E, g-glutamato, G, A ou S;
[00301] X na posição 19 é Q, E, g-glutamato, G, A ou S; e
[00302] J nas posições 4, 7, 8, 11, 12, 15, e 16 são aminoácidos hidrofóbicos selecionados dentre L, V, I, M, e F, exceto que pelo menos um dos aminoácidos nestas posições in um aminoácido não hidrofóbico ou A;
[00303] em que o peptídeo induz uma resposta de planta ativa, porém, não induz uma resposta hipersensível, quando aplicada ao tecido da planta. Preferivelmente, um a quatro, não mais do que três, não mais do que dois, ou exatamente um dos resíduos nas posições 4, 7, 8, 11, 12, 15, e 16 é um aminoácido não hidrofóbico ou A. Em uma modalidade, não mais do que um dentre os resíduos de J é A, e preferivelmente o resíduo de A está em uma das posições 4, 7, 8, 11, 15, e 16 de SEQ ID NO: 7; um ou dois dos resíduos de J restantes é opcionalmente um aminoácido não hidrofóbico, e todos os outros resíduos de J são L, I, V, M, ou F. Em certas modalidades, não mais do que um dentre os resíduos de J é A, e preferivelmente o resíduo de A está em uma das posições 4, 7, 8, 11, 15, e 16 de SEQ ID NO: 7; e todos os outros resíduos de J são L, I, V, M, ou F.
[00304] Peptídeos exemplares que compartilham a estrutura de consenso com SEQ ID NO: 7 são identificados na Tabela 10 abaixo: Tabela 10: Variantes de Peptídeo P6/6a (SEQ ID NO: 7 de consenso)
[00305] Variantes adicionais destes peptídeos podem incluir a substituição de metionina na posição 7 com L, I, V, F, um aminoácido não hidrofóbico, ou A, como notado acima; e substituição de metionina na posição 9 com L, E, g-glutamato, G, A, S, T, ou K, como notado acima.
[00306] Em certas outras modalidades, o peptídeo isolado consiste essencialmente em, ou consiste na sequência de aminoácido de uma ou mais dentre SEQ ID NOS: 194-207.
[00307] Nesta modalidade, o peptídeo isolado é preferivelmente estável quando dissolvido em água; resistente à degradação química em condições aquosas na presença de um tampão de pH e um biocida, como descrito acima; e/ou tem uma solubilidade em uma solução aquosa de pelo menos cerca de 1,0 mg/mL.
[00308] Outro aspecto da invenção refere-se a um peptídeo tendo a sequência de aminoácido de: (i) XXXXXXJXXJJXXJJXJJK (SEQ ID NO: 8, consenso de P14d modificado), em que
[00309] X na posição 1 pode ser: Q, N, D, E, g-glutamato, isoD ou S;
[00310] X na posição 2 pode ser: D, E, g-glutamato, isoD;
[00311] X na posição 3 pode ser: P, D, E, isoD ou g-glutamato;
[00312] X na posição 4 pode ser M, A, S, D, E, isoD ou g-glutamato
[00313] X na posição 5 pode ser Q, E ou g-glutamato;
[00314] X na posição 6 pode ser A, E ou g-glutamato;
[00315] X na posição 8 pode ser M, L, E, Q, D, N, G, A, S, isoD ou g-glutamato;
[00316] X na posição 9 pode ser Q, N, E, D, G, A, S, isoD ou g- glutamato;
[00317] X na posição 12 pode ser Q, N, E, D, G, A, S, isoD ou g- glutamato;
[00318] X na posição 13 pode ser Q, N, E, D, G, A, S, isoD ou g- glutamato;
[00319] X na posição 16 pode ser K, Q, N, E, D, R, G, A ou S; e
[00320] J nas posições 7, 10, 11, 14, 15, 17, e 18 são aminoácidos hidrofóbicos selecionados dentre L, V, I, e F, exceto que pelo menos um de the aminoácidos nestas posições é um aminoácido não hidrofóbico ou A; ou (ii) JXXJJXXJJXJJK (SEQ ID NO: 9, consenso de P14d min modificado), em que
[00321] X na posição 2 pode ser M, L, E, Q, D, N, G, A, S, isoD ou g- glutamato;
[00322] X na posição 3 pode ser Q, N, E, D, G, A, S, isoD ou g- glutamato;
[00323] X na posição 6 pode ser Q, N, E, D, G, A, S, isoD ou g-glutamato;
[00324] X na posição 7 pode ser Q, N, E, D, G, A, S, isoD ou g- glutamato;
[00325] X na posição 10 pode ser K, Q, N, E, D, R, G, A ou S; e
[00326] J nas posições 1, 4, 5, 8, 9, 11, e 12 são aminoácidos hidrofóbicos selecionados dentre L, V, I, e F, exceto que pelo menos um dos aminoácidos nestas posições é um aminoácido não hidrofóbico ou A; em que o peptídeo induz uma resposta de planta ativa, porém, não induz uma resposta hipersensível, quando aplicada ao tecido da planta. Preferivelmente, um a quatro, não mais do que três, não mais do que dois, ou exatamente um dos resíduos nas posições 7, 10, 11, 14, 15, 17, e 18 de SEQ ID NO: 8 é um aminoácido não hidrofóbico ou A; e um a quatro, não mais do que três, não mais do que dois, ou exatamente um dos resíduos nas posições 1, 4, 5, 8, 9, 11, e 12 de SEQ ID NO: 9 é um aminoácido não hidrofóbico ou A. Em uma modalidade, não mais do que um dentre os resíduos de J é A, e preferivelmente o resíduo de A está em uma das posições 7, 10, 11, 14, 17, e 18 de SEQ ID NO: 8 ou posições 1, 4, 5, 8, 11, e 12 de SEQ ID NO: 9; um ou dois dos resíduos de J restantes é opcionalmente um aminoácido não hidrofóbico, e todos os outros resíduos de J são L, I, V, ou F. Em certas modalidades, não mais do que um dentre os resíduos de J é A, e preferivelmente o resíduo de A está em uma das posições 7, 10, 11, 14, 17, e 18 de SEQ ID NO: 8 ou posições 1, 4, 5, 8, 11, e 12 de SEQ ID NO: 9; e todos os outros resíduos de J são L, I, V, ou F.
[00327] Peptídeos exemplares que compartilham a estrutura de consenso com SEQ ID NO: 8 ou 9 são identificados na Tabela 11 abaixo:Tabela 11: Variantes de Peptídeo P14d (SEQ ID NO: 8 ou 9 de consenso)
[00328] Variantes adicionais destes peptídeos podem incluir a substituição de metionina em uma ou ambas as posições 4 e 8 com L, E, Q, D, N, G, A, S, isoD, ou g-glutamato, como notado acima.
[00329] Em certas outras modalidades, o peptídeo isolado consiste essencialmente em, ou consiste na sequência de aminoácido de uma ou mais dentre SEQ ID NOS: 208-221.
[00330] Nesta modalidade, o peptídeo isolado é preferivelmente estável quando dissolvido em água; resistente à degradação química em condições aquosas na presença de um tampão de pH e um biocida, como descrito acima; e/ou tem uma solubilidade em uma solução aquosa de pelo menos cerca de 1,0 mg/mL.
[00331] Um outro aspecto da invenção refere-se a um peptídeo tendo a sequência de aminoácido de: (i) JXXJJXJJXXJJ (SEQ ID NO: 10, consenso de P25 modificado) em que
[00332] X na posição 2 pode ser Q, N, E, g-glutamato, D, isoD, T, S, A ou G;
[00333] X na posição 3 pode ser K, Q, N, E, g-glutamato, D, isoD, T, S, A ou G;
[00334] X na posição 6 pode ser K, Q, N, E, g-glutamato, D, isoD, T, S, A ou G;
[00335] X na posição 9 pode ser E, g-glutamato, D, isoD, Q, N, T, S, A ou G;
[00336] X na posição 10 pode ser A, G, S, T, E, g-glutamato, D, isoD, Q ou N; e
[00337] J nas posições 1, 4, 5, 7, 8, 10, e 11 são aminoácidos hidrofóbicos selecionados dentre L, V, I, F, e M, exceto que pelo menos um dos aminoácidos nestas posições é um aminoácido não hidrofóbico ou A; ou (ii) JXXJJXXJJXJJXXJJ (SEQ ID NO: 11, consenso de P25 modificado) em que
[00338] X na posição 2 pode ser T, S, A, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q ou N;
[00339] X na posição 3 pode ser G, T, S, A, D, isoD, E, g-glutamato, Q ou N;
[00340] X na posição 6 pode ser Q, N, E, g-glutamato, D, isoD, T, S, A ou G;
[00341] X na posição 7 pode ser K, Q, N, E, g-glutamato, D, isoD, T, S, A ou G;
[00342] X na posição 10 pode ser K, Q, N, E, g-glutamato, D, isoD, T, S, A ou G;
[00343] X na posição 13 pode ser E, g-glutamato, D, isoD, Q, N, T, S, A ou G;
[00344] X na posição 14 pode ser A, G, S, T, E, g-glutamato, D, isoD, Q ou N;
[00345] J nas posições 1, 4, 5, 8, 9, 11, 12, e 15 são aminoácidos hidrofóbicos selecionados dentre L, V, I, F e M, exceto que pelo menos um dos aminoácidos nestas posições é um aminoácido não hidrofóbico ou A; e
[00346] J na posição 16 é opcional e um aminoácido hidrofóbico selecionado dentre L, V, I e F;
[00347] em que o peptídeo induz uma resposta de planta ativa, porém, não induz uma resposta hipersensível, quando aplicada ao tecido da planta. Preferivelmente, um a quatro, não mais do que três, não mais do que dois, ou exatamente um dos resíduos nas posições 1, 4, 5, 7, 8, 10, e 11 de SEQ ID NO: 10 é um aminoácido não hidrofóbico, e um a quatro, não mais do que três, não mais do que dois, ou exatamente um dos resíduos nas posições 1, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, e 16 de SEQ ID NO: 11 é um aminoácido não hidrofóbico. Em uma modalidade, não mais do que um dentre os resíduos de J é A, e preferivelmente o resíduo de A está em uma das posições 1, 4, 5, 7, 10, e 11 de SEQ ID NO: 10 ou posições 1, 4, 5, 8, 11, 12, 15, e 16 de SEQ ID NO: 11; um ou dois dos resíduos de J restantes é opcionalmente um aminoácido não hidrofóbico, e todos os outros resíduos de J são L, I, V, ou F. Em certas modalidades, não mais do que um dentre os resíduos de J é A, e preferivelmente o resíduo de A está em uma das posições 1, 4, 5, 7, 10, e 11 de SEQ ID NO: 10 ou posições 1, 4, 5, 8, 11, 12, 15, e 16 de SEQ ID NO: 11; e todos os outros resíduos de J são L, I, V, ou F.
[00348] Peptídeos exemplares que compartilham a estrutura de consenso com SEQ ID NO: 10 ou 11 são identificados na Tabela 12 abaixo:Tabela 12: Variantes de Peptídeo P25 (SEQ ID NO: 10 ou 11 de consenso)
[00349] Variantes adicionais destes peptídeos podem incluir a substituição de metionina na posição 13 com L, V, I, e F, como notado acima.
[00350] Em certas outras modalidades, o peptídeo isolado consiste essencialmente em, ou consiste na sequência de aminoácido de uma ou mais dentre SEQ ID NOS: 222-239.
[00351] Nesta modalidade, o peptídeo isolado é preferivelmente estável quando dissolvido em água; resistente à degradação química em condições aquosas na presença de um tampão de pH e um biocida, como descrito acima; e/ou tem uma solubilidade em uma solução aquosa de pelo menos cerca de 1,0 mg/mL.
[00352] Ainda outro aspecto da invenção refere-se a um peptídeo tendo a sequência de aminoácido: (i) XXXXXXXXXXXJXXJJXXJJXXJJXXX (SEQ ID NO: 12, P17/18 modificado), em que
[00353] X na posição 1 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente Q, S, E, g-glutamato, A, T, G, D, isoD, N, K ou R;
[00354] X na posição 2 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente Q, S, E, g-glutamato, A, T, G, D, isoD, N, K ou R;
[00355] X na posição 3 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente P, Q, S, E, g-glutamato, A, T, G, D, isoD, N, K ou R;
[00356] X na posição 4 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente I, Q, S, E, g-glutamato, A, T, G, D, N, isoD, K ou R;
[00357] X na posição 5 pode ser qualquer aminoácido, porém,preferivelmente D, isoD, S, E, g-glutamato, A, T, G, N, Q, K ou R;
[00358] X na posição 6 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente R, Q, S, E, g-glutamato, A, T, G, D, isoD, N ou K;
[00359] X de posição 7 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente Q, S, E, g-glutamato, A, T, G, D, isoD, N, K ou R;
[00360] X na posição 8 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente T, Q, S, E, g-glutamato, A, G, D, isoD, N, K ou R;
[00361] X na posição 9 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente I, Q, S, E, g-glutamato, A, T, G, D, isoD, N, K ou R;
[00362] X na posição 10 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente E, g-glutamato, Q, S, A, T, G, D, isoD, N, K ou R;
[00363] X na posição 11 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente Q, S, E, g-glutamato, A, T, G, D, isoD, N, K ou R;
[00364] X na posição 13 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N, K ou R;
[00365] X na posição 14 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente Q, A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, N, K ou R;
[00366] X na posição 17 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N, K ou R;
[00367] X na posição 18 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente Q, A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, N, K ou R;
[00368] X na posição 21 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente K, A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N ou R;
[00369] X na posição 22 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente S, A,T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N, K ou R;
[00370] X na posição 25 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente S, A, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N, K ou R;
[00371] X na posição 26 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente P, S, A, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N, K ou R;
[00372] X na posição 27 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente Q, S, A, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, N, K ou R; e
[00373] J nas posições 12, 15, 16, 19, 20, 23, e 24 são aminoácidos hidrofóbicos selecionados dentre L, V, I, F, e M, exceto que pelo menos um dos aminoácidos nestas posições é um aminoácido não hidrofóbico ou A;ou (ii) JXXJJXXJJXXJJ (SEQ ID NO: 13, consenso de P17/18 min modificado), em que
[00374] X na posição 2 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N, K ou R;
[00375] X na posição 3 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente Q, A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, N, K ou R;
[00376] X na posição 6 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N, K ou R;
[00377] X na posição 7 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente Q, A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, N, K ou R;
[00378] X na posição 10 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente K, A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N ou R;
[00379] X na posição 11 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente S, A,T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N, K ou R; e
[00380] J nas posições 1, 4, 5, 8, 9, 12, e 13 são aminoácidos hidrofóbicos selecionados dentre L, V, I, F, e M, exceto que pelo menos um dos aminoácidos nestas posições é um aminoácido não hidrofóbico ou A;
[00381] em que o peptídeo induz uma resposta de planta ativa, porém, não induz uma resposta hipersensível, quando aplicada ao tecido da planta. Preferivelmente, um a quatro, não mais do que três, não mais do que dois, ou exatamente um dos resíduos nas posições 12, 15, 16, 19, 20, 23, e 24 de SEQ ID NO: 12 é um aminoácido não hidrofóbico ou A; e um a quatro, não mais do que três, não mais do que dois, ou exatamente um dos resíduos nas posições 1, 4, 5, 8, 9, 12, e 13 de SEQ ID NO: 13 é um aminoácido não hidrofóbico ou A. Em uma modalidade, não mais do que um dentre os resíduos de J é A, e preferivelmente o resíduo de A está em uma das posições 12, 15, 16, 19, 23, e 24 de SEQ ID NO: 12 ou posições 1, 4, 5, 8, 12, e 13 de SEQ ID NO: 13; um ou dois dos resíduos de J restantes é opcionalmente um aminoácido não hidrofóbico, e todos os outros resíduos de J são L, I, V, F, ou M. Em certas modalidades, não mais do que um dentre os resíduos de J é A, e preferivelmente o resíduo de A está em uma das posições 12, 15, 16, 19, 23, e 24 de SEQ ID NO: 12 ou posições 1, 4, 5, 8, 12, e 13 de SEQ ID NO: 13; e todos os outros resíduos de J são L, I, V, F, ou M.
[00382] Peptídeos exemplares que compartilham a estrutura de consenso com SEQ ID NO: 12 ou 13, ou são derivados de SEQ ID NO: 12 ou 13 e alcançam a estrutura de consenso de SEQ ID NO: 1, são identificados na Tabela 13 abaixo:Tabela 13: Variantes de Peptídeo P17/P18 (SEQ ID NO: 12 ou 13 de consenso)
[00383] Na Tabela 13, peptídeos incluem o tag de solubilidade SEEEEE, indicado por impressão em itálico. Peptídeos compreendendo as sequências mostradas na Tabela 13, porém, faltando este tag de solubilidade específico (ou tendo um tag de solubilidade diferente) são da mesma forma considerados aqui.
[00384] Em certas outras modalidades, o peptídeo isolado consiste essencialmente em, ou consiste na sequência de aminoácido de uma ou mais dentre SEQ ID NOS: 85-98.
[00385] Nesta modalidade, o peptídeo isolado é preferivelmente estável quando dissolvido em água; resistente à degradação química em condições aquosas na presença de um tampão de pH e um biocida, como descrito acima; e/ou tem uma solubilidade em uma solução aquosa de pelo menos cerca de 1,0 mg/mL.
[00386] Ainda outro aspecto da invenção refere-se a um peptídeo tendo a sequência de aminoácido: XJXXJJXJJXXJJ (SEQ ID NO: 14, consenso de P19 modificado), em que
[00387] X na posição 1 é opcional e pode ser L, I, V, F ou M;
[00388] X na posição 3 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente K, A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N ou R;
[00389] X na posição 4 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N, K ou R;
[00390] X na posição 7 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente K, A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N ou R;
[00391] X na posição 10 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N, K ou R;
[00392] X na posição 11 pode ser qualquer aminoácido, porém, preferivelmente R, A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N ou K; e
[00393] J nas posições 2, 5, 6, 8, 9, 12, e 13 são aminoácidos hidrofóbicos selecionados dentre L, V, I, F e M, exceto que pelo menos um dos aminoácidos nestas posições é um aminoácido não hidrofóbico ou A;
[00394] em que o peptídeo induz uma resposta de planta ativa, porém, não induz uma resposta hipersensível, quando aplicada ao tecido da planta. Preferivelmente, um a quatro, não mais do que três, não mais do que dois, ou exatamente um dos resíduos nas posições 2, 5, 6, 8, 9, 12, e 13 é um aminoácido não hidrofóbico. Em uma modalidade, não mais do que um dentre os resíduos de J é A, e preferivelmente o resíduo de A está em uma das posições 2, 5, 6, 8, 12, e 13 de SEQ ID NO: 14; um ou dois dos resíduos de J restantes é opcionalmente um aminoácido não hidrofóbico, e todos os outros resíduos de J são L, I, V, F ou M. Em certas modalidades, não mais do que um dentre os resíduos de J é A, e preferivelmente o resíduo de A está em uma das posições 2, 5, 6, 8, 12 e 13 de SEQ ID NO: 14; e todos os outros resíduos de J são L, I, V, F ou M.
[00395] Peptídeos exemplares que compartilham a estrutura de consenso com uma dentre SEQ ID NO: 14, ou são derivados de uma dentre SEQ ID NO: 14 e alcançam a estrutura de consenso de SEQ ID NO: 1, são identificados na Tabela 14 abaixo:Tabela 14: Variantes de Peptídeo P19 (SEQ ID NO: 14 de consenso)
[00396] Na Tabela 14, peptídeos incluem o tag de solubilidade SEEEEE, indicado por impressão em itálico. Peptídeos compreendendo as sequências mostradas na Tabela 14, porém, faltando este tag de solubilidade específico (ou tendo um tag de solubilidade diferente) são da mesma forma considerados aqui.
[00397] Em certas modalidades, o peptídeo isolado consiste essencialmente em, ou consiste na sequência de aminoácido de SEQ ID NOS: 99-112.
[00398] Nesta modalidade, o peptídeo isolado é preferivelmente estável quando dissolvido em água; resistente à degradação química em condições aquosas na presença de um tampão de pH e um biocida, como descrito acima; e/ou tem uma solubilidade em uma solução aquosa de pelo menos cerca de 1,0 mg/mL.
[00399] Um outro aspecto da invenção refere-se a um peptídeo isolado que inclui a sequência de aminoácido de:Z1-LLXLFXXIL-Z2 (SEQ ID NO: 126, P3 mínimo) em que
[00400] X na posição 3 é qualquer aminoácido hidrofílico, preferivelmente K, A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N ou R;
[00401] X na posição 6 é qualquer aminoácido hidrofílico, preferivelmente K, A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N ou R;
[00402] X na posição 7 é qualquer aminoácido hidrofílico, preferivelmente K, A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N ou R; e
[00403] em que um dentre Z1 e Z2 está presente, porém, preferivelmente não ambos, com Zi compreendendo LXX- onde cada X é um aminoácido hidrofílico, preferivelmente K, A, S, T, G, D, isoD, E, g- glutamato, Q, N ou R, e com Z2 compreendendo -XXLF onde cada X é um aminoácido hidrofílico, preferivelmente K, A, S, T, G, D, isoD, E, g- glutamato, Q, N ou R.
[00404] em que o peptídeo induz uma resposta de planta ativa, porém, não induz uma resposta hipersensível, quando aplicada ao tecido da planta.
[00405] Em uma modalidade, Z1 porém não Z2 está presente. Em uma modalidade alternativa, Z2 porém não Z1 está presente.
[00406] Peptídeos exemplares que compartilham a estrutura de consenso com SEQ ID NO: 126, ou são derivados de SEQ ID NO: 126 e alcançam a estrutura de consenso de SEQ ID NO: 1, são identificados na Tabela 15 abaixo:Tabela 15: Variantes de Peptídeo P3 (SEQ ID NO: 126 de consenso)
[00407] Na Tabela 15, peptídeos incluem o tag de solubilidade SEEE, SEEEE, e SEEEEEE, indicado por impressão em itálico. Peptídeos compreendendo as sequências mostradas na Tabela 15, porém, faltando este tag de solubilidade específico (ou tendo um tag de solubilidade diferente) são da mesma forma considerados aqui.
[00408] Em certas modalidades, o peptídeo isolado consiste essencialmente em, ou consiste na sequência de aminoácido de SEQ ID NOS: 156-159.
[00409] Nesta modalidade, o peptídeo isolado é preferivelmente estável quando dissolvido em água; resistente à degradação química em condições aquosas na presença de um tampão de pH e um biocida, como descrito acima; e/ou tem uma solubilidade em uma solução aquosa de pelo menos cerca de 1,0 mg/mL.
[00410] Outro aspecto da invenção refere-se a um peptídeo isolado que inclui a sequência de aminoácido de:L-X-X-(L/I)-(L/I)-X-X-(L/I/V)-(L/I/V) (SEQ ID NO: 116)
[00411] em que o peptídeo é livre de cisteína e metionina; cada X nas posições 2, 3, 6, 7 é qualquer aminoácido; e o peptídeo induz uma resposta de planta ativa, porém, não induz uma resposta hipersensível, quando aplicada ao tecido da planta.
[00412] Em certas modalidades, X em uma ou mais das posições 2, 3, 6, e 7 é um aminoácido não hidrofóbico, X em duas ou mais das posições 2, 3, 6, e 7 é um aminoácido não hidrofóbico, X em três ou mais das posições 2, 3, 6, e 7 é um aminoácido não hidrofóbico, ou X em cada das posições 2, 3, 6, e 7 é um aminoácido não hidrofóbico. Nesta modalidade, os aminoácidos não hidrofóbicos independentemente podem ser qualquer um dentre G, A, S, T, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N, K, e R.
[00413] Os peptídeos de acordo com este aspecto da invenção são geralmente denotados por uma truncação da sequência da caixa HR, que é descrita no Pedido copendente PCT PCT/US15/53387, intitulado “Hypersensitive Response Desencadeador Peptides and Use Thereof”, depositado em 1 de Outubro de 2015, que está aqui incorporado por referência em sua totalidade. Desse modo, em virtude da truncação da sequência da caixa de HR, por terminação do peptídeo ou substituição de resíduos de aminoácido que forma parte da sequência da caixa de HR, o peptídeo isolado de acordo com este aspecto não compreende a sequência de aminoácido:(L/I/V/F)-X-X-(L/I/V/F)-(L/I)-X-X-(L/I/V)-(L/I)-X-X-(L/I/V/F)-(L/I/V/F) (SEQ ID NO: 125)
[00414] em que cada X nas posições 2, 3, 6, 7, 10, 11 é qualquer aminoácido.
[00415] Peptídeos exemplares que compartilham a estrutura de consenso com SEQ ID NO: 116 são identificados na Tabela 16 abaixo: Tabela 16
[00416] Na Tabela 16, peptídeos incluem os tags de solubilidade SEEEE e SEEEEE, indicados por impressão em itálico. Peptídeos compreendendo as sequências mostradas na Tabela 15, porém, faltando o tag de solubilidade específico (ou tendo um tag de solubilidade diferente) são da mesma forma considerados aqui.
[00417] Em certas modalidades, o peptídeo isolado consiste essencialmente em, ou consiste na sequência de aminoácido de SEQ ID NOS: 115, 124, 128-132, 139, 143, 146, 147, 151, 152, e 160.
[00418] Nesta modalidade, o peptídeo isolado é preferivelmente estável quando dissolvido em água; resistente à degradação química em condições aquosas na presença de um tampão de pH e um biocida, como descrito acima; e/ou tem uma solubilidade em uma solução aquosa de pelo menos cerca de 1,0 mg/mL.
[00419] Os peptídeos isolados da invenção podem da mesma forma ser apresentados na forma de um peptídeo de fusão que inclui, além disso, uma segunda sequência de aminoácido acoplada aos peptídeos inventivos via ligação de peptídeo. A segunda sequência de aminoácido pode ser um tag de purificação, tal como poli-histidina (His6-), uma glutationa-S-transferase (GST-) ou proteína de ligação de maltose (MBP-), que ajuda na purificação, porém, pode ser removido depois, isto é, clivado a partir do peptídeo depois da recuperação. Sítios de clivagem específicos de protease ou sítios de clivagem específicos de substância química (isto é, em uma sequência ligante clivável) podem ser introduzidos entre o tag de purificação e o peptídeo desejado. Sítios de clivagem específicos de protease são bem conhecidos na literatura e incluem, sem limitação, o sítio de clivagem específico de enterocinase (Asp)4-Lys, que é clivado depois da lisina; o sítio de clivagem específico de fator Xa Ile-(Glu ou Asp)-Gly-Arg, que é clivado depois da arginina; o sítio de clivagem específico de tripsina, que cliva depois de Lys e Arg; e o sítio de clivagem específico de Genenase™ I Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tir. Substâncias químicas e seus sítios de clivagem específicos incluem, sem limitação, brometo de cianogênio (CNBr) que cliva em resíduos de metionina (Met); BNPS-skatole que cliva em resíduos de triptofano (Trp); ácido fórmico, que cliva em ligações de peptídeo de ácido aspártico-prolina (Asp-Pro); hidroxilamina que cliva em ligações de peptídeo de asparagina-glicina (Asn-Gly); e ácido 2-nitro-5- tiocianobenzoico (NTCB), que cliva em resíduos de cisteína (Cys) (veja Crimmins et al., “Chemical Cleavage of Proteins in Solution,” Curr. Protocol. Protein Sci., Capítulo 11: Unidade 11.4 (2005), que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade). Para usar um destes métodos de clivagem, pode ser necessário remover sítios de clivagem não desejados de dentro das sequências de peptídeo desejadas por mutação. Por exemplo, P14-22E,26E-R (SEQ ID NO: 23) foi mutada para compatibilidade com tripsina: o resíduo de lisina na posição 9 é mutado para um glutamato e uma arginina C-terminal é adicionada para representar o produto de uma clivagem de tripsina teórica. O produto de peptídeo desejado pode ser purificado também para remover os tags de purificação clivados.
[00420] Os peptídeos isolados da invenção também podem estar presentes na forma de um peptídeo de fusão que inclui sequências de peptídeo múltiplas da presente invenção ligadas juntamente por uma sequência ligante, que pode ou não levar a forma de uma sequência de aminoácido clivável do tipo descrito acima. Tais proteínas de fusão multiméricas podem ou não incluir tags de purificação. Em uma modalidade, cada sequência monomérica pode incluir um tag de purificação ligado a um peptídeo da invenção por uma primeira sequência de peptídeo clivável; e as várias sequências monoméricas podem ser ligadas a sequências monoméricas adjacentes por uma segunda sequência de peptídeo clivável. Por conseguinte, na expressão da proteína de fusão multimérica, isto é, em uma célula hospedeira, a proteína de fusão recuperada pode ser tratada com uma protease ou substância química, que é efetiva para clivar a segunda sequência de peptídeo clivável, desse modo liberando sequências de peptídeo monoméricas individuais que contêm tags de purificação. Na purificação de afinidade, as sequências de peptídeo monoméricas recuperadas podem ser tratadas com uma protease ou substância química que é efetiva para clivar a primeira sequência de peptídeo clivável e desse modo liberar o tag de purificação do peptídeo de interesse. O último também pode ser purificado usando filtração em gel e/ou HPLC como descrito infra.
[00421] Estas proteínas de fusão podem incluir as sequências, identificadas acima como SEQ ID NO: 15-18, que foram previamente identificadas em Haapalainen et al., “Functional Mapping of Harpin HrpZ of Pseudomonas syringae Reveals the Sites Responsible for Protein Oligomerization, Lipid Interactions, and Plant Defence Induction,” Mol. Plant Pathol. 12(2):151-66 (2011), que está aqui incorporada por referência em sua totalidade.
[00422] De acordo com um método, os peptídeos da presente invenção podem ser sintetizados por operações de síntese de peptídeo padrão. Estes incluem igualmente protocolos de síntese de FMOC (9- fluorenilmetilóxi-carbonila) e tBoc (terc-butilóxi-carbonila) que podem ser realizados em instrumentos de síntese de peptídeo de fase sólida automatizados incluindo, sem limitação, os sintetizadores Applied Biosystems 431 A, 433 A e sintetizadores de peptídeo de fase sólida automatizados Peptide Technologies Symphony ou Sonata em grande escala ou CEM Liberty. O uso de instrumentos de síntese de peptídeo alternativos é da mesma forma considerado. Os peptídeos preparados usando a síntese de fase sólida são recuperados em uma forma substancialmente pura.
[00423] Os peptídeos da presente invenção também podem ser preparados usando sistemas de expressão recombinantes seguido por separação e purificação dos peptídeos recombinantemente preparados. Geralmente, isto envolve inserir uma molécula de ácido nucleico de codificação em um sistema de expressão, ao qual a molécula é heteróloga (isto é, não normalmente presente). Uma ou mais moléculas de ácido nucléico desejadas que codificam um peptídeo da invenção podem ser inseridas no vetor. A molécula de ácido nucleico heteróloga é inserida no sistema de expressão ou vetor em orientação de sentido próprio (5'—3') e estrutura de leitura correta em relação ao promotor e quaisquer outras moléculas reguladoras 5' e 3'. Sequências de nucleotídeo representativas para expressão em bactérias e hospedeiros de planta são incluídas na Tabela 17 abaixo:Tabela 17
[00424] Com conhecimento da sequência de aminoácido codificada aqui listada e do organismo transgênico desejado, sequências de DNA otimizadas por códon adicionais e sequências de RNA podem ser geradas com nada mais do que experiência de rotina.
[00425] A expressão (inclusive transcrição e translação) de um peptídeo ou polipeptídeo de fusão da invenção pela construção de DNA pode ser regulada com respeito ao nível de expressão, ao(s) tipo(s) de tecido onde a expressão ocorre e/ou estágio de desenvolvimento de expressão. Várias sequências reguladoras heterólogas (por exemplo, promotores e realçadores) estão disponíveis para controlar a expressão da construção de DNA. Estas incluem promotores constitutivos, induzíveis e reguláveis, bem como promotores e realçadores que controlam a expressão de uma maneira específica de tecido ou temporal. Promotores constitutivos exemplares incluem o promotor E4 de framboesa (Pat. U.S. Nos. 5.783.393 e 5.783.394 cada uma das quais está por este meio incorporada por referência em sua totalidade), o promotor de nopalina sintase (NOS) (Ebert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:5745-5749 (1987), que está por este meio incorporada por referência em sua totalidade), o promotor de octopina sintase (OCS) (que é carregado nos plasmídeos de indução de tumor de Agrobacterium tumefaciens), os promotores de caulimovírus tal como o promotor 19S de vírus em mosaico da couve-flor (CaMV) (Lawton et al., Plant Mol. Biol. 9:315-324 (1987), que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade) e o promotor 35S de CaMV (Odell et al., Nature 313:810-812 (1985), que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade), o promotor 35S vírus em mosaico de escrofulária (Pat. U.S. No. 5.378.619 que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade), o promotor induzível por luz a partir da pequena subunidade de ribulose-1,5-bis-fosfato carboxilase (ssRUBISCO), o promotor de Adh (Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:6624-6628 (1987), que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade), o promotor de sacarose sintase (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 87:4144-4148 (1990), que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade), o promotor de complexo de gene R (Chandler et al., Plant Cell 1:11751183 (1989), que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade), o promotor de gene de proteína de ligação de clorofila a/b, o promotor de CsVMV (Verdaguer et al., Plant Mol Biol., 37:1055-1067 (1998), que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade), e o promotor de actina de melão (PCT Publ. No. WO00/56863 que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade). Promotores específicos de tecido exemplares incluem os promotores E4 e E8 de tomate (Pat. U.S. No. 5.859.330, que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade) e o promotor de gene 2AII de tomate (Van Haaren et al., Plant Mol Bio., 21:625-640 (1993), que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade).
[00426] Em uma modalidade preferida, a expressão da construção de DNA está sob controle de sequências reguladoras de genes cuja expressão está associada com desenvolvimento de semente e/ou embrião precoce. Na verdade, em uma modalidade preferida, o promotor usado é um promotor realçado por semente. Exemplos de tais promotores incluem as regiões reguladoras 5' de tais genes como napina (Kridl et al., Seed Sci. Res. 1:209:219 (1991), que estão por este meio incorporadas por referência em sua totalidade), globulina (Belanger e Kriz, Genet. 129: 863-872 (1991), No. de Acesso GenBank L22295 cada um dos quais está por este meio incorporado por referência em sua totalidade), gama zeína Z 27 (Lopes et al., Mol Gen Genet. 247:603-613 (1995), que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade), promotor L3 oleosina (Pat. U.S. No. 6,433,252 que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade), faseolina (Bustos et al., Plant Cell 1(9):839-853 (1989), que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade), arcelina 5 (Publ. de Pedido U.S. No. 2003/0046727, que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade), um promotor 7S de soja, um promotor 7Sa (Publ. de Pedido U.S. No. 2003/0093828, que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade), o promotor de conglicinina 7Sαβ de soja, um promotor 7Sα (Beachy et al., EMBO J. 4:3047 (1985); Schuler et al., Nucleic Acid Res. 10(24):8225- 8244 (1982), cada um dos quais está por este meio incorporado por referência em sua totalidade), inibidor de tripsina de soja (Riggs et al., Plant Cell 1(6):609-621 (1989), que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade), ACP (Baerson et al., Plant Mol. Biol., 22(2):255-267 (1993), que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade), estearoil-ACP dessaturase (Slocombe et al., Plant Physiol. 104(4):167-176 (1994), que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade), subunidade a' de soja de β-conglicinina (Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83:8560-8564 (1986), que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade), Vicia faba USP (Publ. de Pedido U.S. No. 2003/229918, que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade) e promotor de oleosina L3 Zea mays (Hong et al., Plant Mol. Biol., 34(3):549-555 (1997), que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade).
[00427] Moléculas de ácido nucleico que codificam os peptídeos da presente invenção podem ser preparadas por meio de síntese de fase sólida usando, por exemplo, o método de fosforamidita e blocos de construção de fosforamidita derivados de 2’-desoxinucleosídeos protegidos. Para obter o oligonucleotídeo desejado, os blocos de construção são sequencialmente acoplados à cadeia de oligonucleotídeo crescente na ordem requerida pela sequência do produto. Na conclusão da reunião de cadeia, o produto é liberado da fase sólida para solução, desprotegido, coletado e tipicamente purificado usando HPLC. Os limites de síntese de fase sólida são adequados para preparar oligonucleotídeos até cerca de 200 nt em comprimento que codifica peptídeos na ordem de cerca de 65 aminoácidos ou menos. As extremidades do oligonucleotídeo sintetizado podem ser projetadas para incluir sítio de clivagem de enzima de restrição específico para facilitar a ligação do oligonucleotídeo sintetizado em um vetor de expressão.
[00428] Para peptídeos mais longos, oligonucleotídeos podem ser preparados por meio de síntese de fase sólida e em seguida as sequências de oligonucleotídeo sintéticas ligadas juntamente usando várias técnicas. Técnicas recombinantes para a fabricação de genes sintéticos inteiros são revisadas, por exemplo, em Hughes et al., “Chapter Twelve - Gene Synthesis: Methods and Applications,” Methods in Enzymology 498:277-309 (2011), que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade.
[00429] Uma vez que um vetor de expressão adequado é selecionado, as sequências de ácido nucléico desejadas são clonadas no vetor usando procedimentos de clonagem padrão na técnica, como descrito por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Laboratory, Cold Springs Harbor, N.Y. (1989), ou Pat. U.S. No. 4.237.224 de Cohen e Boyer, que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade. O vetor é em seguida introduzido a um hospedeiro adequado.
[00430] Uma variedade de sistemas de hospedeiro-vetor pode ser utilizada para recombinantemente expressar os peptídeos da presente invenção. Principalmente, o sistema de vetor deve ser compatível com o hospedeiro usado. Sistemas de hospedeiro-vetor incluem, sem limitação, o seguinte: bactérias transformadas com DNA de bacteriófago, DNA de plasmídeo ou DNA de cosmídeo; microrganismos tais como levedura que contém vetores de levedura; sistemas de célula de mamífero infectados com vírus (por exemplo, vírus da vaccínia, adenovírus, etc.); sistemas de célula de inseto infectados com vírus (por exemplo, baculovírus); e células de planta infectadas por Agrobacterium. Os elementos de expressão destes vetores variam em sua resistência e especificidades. Dependendo do sistema de hospedeira-vetor utilizado, qualquer um de vários elementos de transcrição e translação adequados pode ser usado para realizar este e outros aspectos da presente invenção.
[00431] Peptídeos purificados podem ser obtidos através de vários métodos. O peptídeo é preferivelmente produzido na forma purificada (preferivelmente pelo menos cerca de 80 % ou 85 % puro, mais preferivelmente pelo menos cerca de 90 % ou 95 % puro) por técnicas convencionais. Dependendo se a célula hospedeira recombinante é feita para segregar o peptídeo em meio de cultura (veja Pat. U.S. No. 6.596.509 de Bauer et al., que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade), o peptídeo pode ser isolado e purificado por centrifugação (para separar componentes celulares do sobrenadante que contém o peptídeo segregado) seguido por precipitação de sulfato de amônio sequencial do sobrenadante. A fração que contém o peptídeo é submetida à filtração em gel em uma coluna de dextrana ou poliacrilamida de tamanho apropriado para separar os peptídeos de outras proteínas. Se necessário, a fração de peptídeo também pode ser purificada por HPLC.
[00432] Alternativamente, se o peptídeo de interesse de interesse não é segregado, pode ser isolado das células recombinantes usando esquemas de isolamento e purificação padrão. Isto inclui romper as células (por exemplo, por sonicação, congelamento, prensa de French, etc.) e em seguida recuperar o peptídeo dos resíduos celulares. A purificação pode ser obtida usando os procedimentos de centrifugação, precipitação e purificação descritos acima. O uso de tags de purificação, descrito acima, pode simplificar este processo.
[00433] Em certas modalidades, não é requerida purificação. Onde a purificação não é realizada, lisados sem célula podem ser recuperados depois da centrifugação para remoção de resíduos celulares. O lisado sem célula resultante pode ser tratado com aquecimento durante uma quantidade suficiente de tempo para desativar quaisquer proteases nativas na fração recuperada, por exemplo, 10 min a 100°C. Se desejado, um ou mais dos agentes biocidas, inibidores de protease e tensoativos não iônicos podem ser introduzidos a uma tal preparação sem célula (veja Publ. de Pedido U.S. No. 20100043095 de Wei, que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade).
[00434] Uma vez que os peptídeos da presente invenção são recuperados, eles podem ser usados para preparar uma composição que inclui um veículo, e uma ou mais aditivos selecionados a partir do grupo que consiste em um agente bactericida ou biocida, um inibidor de protease, um tensoativo não iônico, um fertilizante, um herbicida, um inseticida, um fungicida, um nematicida, inoculantes biológicos, reguladores de planta, e misturas dos mesmos.
[00435] Em certas modalidades, as composições incluem mais do que cerca de 1 nM do peptídeo, mais do que cerca de 10 nM do peptídeo, mais do que cerca de 20 nM do peptídeo, mais do que cerca de 30 nM do peptídeo, mais do que cerca de 40 nM do peptídeo, mais do que cerca de 50 nM do peptídeo, mais do que cerca de 60 nM do peptídeo, mais do que cerca de 70 nM do peptídeo, mais do que cerca de 80 nM do peptídeo, mais do que cerca de 90 nM do peptídeo, mais do que cerca de 100 nM do peptídeo, mais do que cerca de 150 nM do peptídeo, mais do que cerca de 200 nM do peptídeo, ou mais do que cerca de 250 nM do peptídeo. Em certas modalidades, as composições incluem menos de cerca de 1 nM do peptídeo. Por exemplo, certos peptídeos podem estar presentes a uma concentração de menos do que cerca de 2 ng/mL, menos do que cerca de 1,75 ng/mL, menos do que cerca de 1,5 ng/mL, menos do que cerca de 1,25 ng/mL, menos do que cerca de 1,0 ng/mL, menos do que cerca de 0,75 ng/mL, menos do que cerca de 0,5 ng/mL, menos do que cerca de 0,25 ng/mL, ou até mesmo menos do que cerca de 0,1 ng/mL.
[00436] Veículos adequados incluem água, soluções aquosas opcionalmente contendo um ou mais cossolventes, suspensões e partículas de veículo sólidas. Veículos sólidos exemplares incluem terras minerais tais como silicatos, sílicas gel, talco, caulins, pedra calcária, cal, giz, argila (bole), loess, argilas, dolomita, terra diatomácea, sulfato de cálcio, sulfato de magnésio, óxido de magnésio, materiais sintéticos moídos, e produtos de origem vegetal, tais como farinha de cereal, farinha de casca de árvore, farinha de madeira e farinha de casca de noz, pós de celulose, amidos e derivados de amido, bem como outros mono-, di- e polissacarídeos.
[00437] Fertilizantes adequados incluem, sem limitação, sulfato de amônio, fosfato de amônio, nitrato de amônio, ureias, e combinações dos mesmos.
[00438] Inseticidas adequados incluem, sem limitação, membros da classe neonicotinoide tais como imidicloprida, clotianidina, e tiametoxam; os membros da classe organofosfato tais como clorpirifos e malationa; os membros da classe piretroide tais como permetrina; outros inseticidas naturais tais como nicotina, nornicotina, e piretrinas; os membros da classe carbamato tais como aldicarbe, carbofurano, e carbarila; os membros da classe lactona macrocíclica tais como vários produtos de abamectina, avermectina e ivermectina; os membros da classe diamida tais como clorantraniliprol, ciantraniliprol e flubendiamida; inibidores de síntese de quitina, particularmente aqueles da classe benzoilureia tais como lufenurona e diflubenzurona; e qualquer combinação dos mesmos, inclusive combinações de dois ou mais, três ou mais, ou quatro ou mais, inseticidas. Inseticidas adicionais são listados no “Compendium of Pesticide Common Names”, que é a base de dados operada por Alan Wood e disponível em formulário eletrônico no site da internet alanwood.net.
[00439] Fungicidas adequados incluem, sem limitação, membros da estrobilurina classe tais como azoxistrobina, piraclostrobina, trifloxistrobina, picoxistrobina e fluoxastrobina; os membros da classe triazol tais como ipconazol, metconazol, tebuconazol, triticonazol, tetraconazol, difenoconazol, flutriafol, propiconazol e protioconazol; os membros da classe sucinato desidrogenase tais como carboxina, fluxapiroxade, boscalide e sedaxano: os membros da classe fenilamida tais como metalaxil, mefenoxam, benalaxil e oxadiixil; os membros da classe fenilpirrol tal como fludioxonila; os membros da classe ftalimida tal como captana; os membros da classe ditiocarbamato tais como mancozebe e tiram; os membros da classe benzimidazol tal como tiabendazol; e qualquer combinação do mesmo, inclusive combinações de dois ou mais, três ou mais, ou quatro ou mais fungicidas. Fungicidas adicionais são listados no Compendium of Pesticide Common Names, que é uma base de dados operada por Alan Wood e disponível em formulário eletrônico no site da internet alanwood.net.
[00440] Nematicidas adequados incluem, sem limitação, substâncias químicas da classe carbamato tais como aldicarbe, aldoxicarbe, oxamila, carbofurano e cleotocarbe; e substâncias químicas da classe organofosfato tais como tionazina, etoprofos, fenamifos, fensulfotiona, terbufos, isazofos e ebufos. Nematicidas adicionais são listados no Compendium of Pesticide Common Names, que é uma base de dados operada por Alan Wood e disponível em formulário eletrônico no site da internet alanwood.net.
[00441] Bactericidas adequados incluem, sem limitação, aqueles com base n diclorofene e álcool benzílico hemi formal (Proxel® de ICI ou Acticide® RS de Thor Chemie e Katon® MK de Rohm & Haas) e derivados de isotiazolinona tais como alquilisotiazolinonas e benzisotiazolinonas (Acticide® MBS de Thor Chemie; Proxel® GXL de ICI). Bactericidas adicionais são listados no Compendium of Pesticide Common Names, que é uma base de dados operada por Alan Wood e disponível em formulário eletrônico no site da internet alanwood.net.
[00442] Inoculantes adequados incluem, sem limitação, Bradyrhizobium spp., particularmente Bradyrhizobium japonicum (produtos de BASF Vault®), Bacillus subtilis, Bacillus firmus, Bacillus pumilis, Streptomyces lydicus, Trichoderma spp., Pasteuria spp., outras culturas de células rizobiais (BASF Nodulator® e Rhizo-Flo®), e qualquer combinação dos mesmos, inclusive combinações de dois ou mais, três ou mais, ou quatro ou mais inoculantes.
[00443] Reguladores de planta são substâncias químicas, naturais ou sintéticas, que estimulam ou inibem a sinalização bioquímica da planta. Estes normalmente são, porém não exclusivamente, reconhecidos por receptores na superfície da célula, causando uma cascata de reações na célula. Reguladores de planta adequados incluem, sem limitação, etefona; etileno; ácido salicílico; ácido acetilsalicílico; ácido jasmônico; jasmonato de metila; diidrojasmonato de metila; quitina; quitosana; ácido abscísico; qualquer composto ou inibidor de auxina, incluindo porém não limitado a ácido (4- clorofenóxi)acético, ácido (2,4-diclorofenóxi)acético e ácido 2,3,5- triiodobenzoico; qualquer citocinina, incluindo porém não limitado à cinetina e zeatina; giberelinas; brassinolida; e qualquer combinação dos mesmos, inclusive combinações de dois ou mais, três ou mais, ou quatro ou mais reguladores.
[00444] Outros aditivos adequados incluem agentes de tamponamento, agentes umectantes, agentes de revestimento e agentes abrasivos. Estes materiais podem ser usados para facilitar a aplicação das composições de acordo com a presente invenção. Além disso, as composições podem ser aplicadas a sementes de planta com outra formulação de semente convencional e materiais de tratamento, inclusive argilas e polissacarídeos.
[00445] Composições ou sistemas usados para tratamento de semente de planta incluem: um ou mais dos peptídeos da presente invenção, preferivelmente, entretanto não exclusivamente, um ou mais dentre os peptídeos p4-14s-9a (SEQ ID NO: 57), p4-14s-12d (SEQ ID NO: 59), p14 (SEQ ID NO: 113), p14a (SEQ ID NO: 114), p14-22E,26E (SEQ ID NO: 23), p1-29 (SEQ ID NO: 130) e p4-14S-16S (SEQ ID NO: 55) em combinação com um ou mais inseticidas, nematicidas, fungicidas, outros inoculantes, ou outros reguladores de planta, inclusive combinações de inseticidas múltiplos, ou nematicidas múltiplos, fungicidas múltiplos, outros inoculantes múltiplos, ou reguladores de planta múltiplos. Inseticidas adequados, nematicidas, fungicidas, inoculantes e reguladores de planta para estes tratamentos de combinação incluem aqueles identificados acima. Estas composições são apresentadas na forma de uma composição simples na hora de tratamento de semente. Em contraste, um sistema usado para tratamento de semente pode envolver tratamentos múltiplos, por exemplo, uma composição que contém os peptídeos é usada em um tratamento e uma composição que contêm os um ou mais inseticidas, nematicidas, fungicidas, reguladores de planta e/ou bactericidas, é usada em um tratamento separado. Na modalidade posterior, ambos estes tratamentos são realizados aproximadamente ao mesmo tempo, isto é, antes do plantio ou aproximadamente no momento do plantio.
[00446] Um tal exemplo inclui um ou mais de peptídeos da presente invenção, incluindo (sem limitação) um ou mais dentre os peptídeos p4- 14s-9a (SEQ ID NO: 57), p4-14s-12d (SEQ ID NO: 59), p14 (SEQ ID NO: 113), p14a (SEQ ID NO: 114), p14-22E,26E (SEQ ID NO: 23), p129 (SEQ ID NO: 130) e p4-14S-16S (SEQ ID NO: 55), em combinação com Poncho™ (clotianidina) disponibilizado por Bayer Crop Science, Poncho™ VOTiVO (clotianidina e nematicida biológico de Bacillus firmus) disponibilizado por Bayer Crop Science, e Gaucho™ (imidiclopride) disponibilizado por Bayer Crop Science.
[00447] Outro exemplo inclui um ou mais de peptídeos da presente invenção, incluindo (sem limitação) um ou mais dentre os peptídeos p4- 14s-9a (SEQ ID NO: 57), p4-14s-12d (SEQ ID NO: 59), p14 (SEQ ID NO: 113), p14a (SEQ ID NO: 114), p14-22E,26E (SEQ ID NO: 23), p1-29 (SEQ ID NO: 130) e p4-14S-16S (SEQ ID NO: 55), em combinação com Cruiser™ (tiametoxam) disponibilizado por Syngenta, CruiserMaxx™ (tiametoxam, mefenoxam e fludioxinila) disponibilizado por Syngenta, Cruiser Extreme™ (tiametoxam, mefenoxam, fludioxinila e azoxistrobina) disponibilizado por Syngenta, Avicta™ (tiametoxam e abamectina) disponibilizado por Syngenta, e Avicta™ Complete (tiametoxam, abamectina, e Clariva Complete™, que contêm o inoculante biológico de Pasteuria nishizawae-Pn1) disponibilizado por Syngenta, e Avicta Complete™ Corn (tiametoxam, mefenoxam, fludioxinila, azoxistrobina, tiabendazol e abamectina) disponibilizado por Syngenta.
[00448] Outro exemplo inclui um ou mais de peptídeos da presente invenção, incluindo (sem limitação) um ou mais dentre os peptídeos p4- 14s-9a (SEQ ID NO: 57), p4-14s-12d (SEQ ID NO: 59), p14 (SEQ ID NO: 113), p14a (SEQ ID NO: 114), p14-22E,26E (SEQ ID NO: 23), p129 (SEQ ID NO: 130) e p4-14S-16S (SEQ ID NO: 55), em combinação com Vault Liquid plus Integral (espécies de Bradyrhizobium e inoculantes MBI 600 de cepa de Bacillus subtilis) disponibilizado por BASF, Vault NP (inoculante de Bradyrhizobium japonicum) disponibilizado por BASF, e Subtilex NG (inoculante biológico de Bacillus subtilis) disponibilizado por BASF.
[00449] A presente invenção também se refere a métodos de conferir resistência à doença às plantas, potencializar o crescimento da planta, realizar o controle de peste, conferir tolerância ao estresse biótico ou abiótico às plantas e/ou modular a sinalização bioquímica da planta. Estes métodos envolvem aplicar uma quantidade efetiva de um peptídeo isolado da invenção, ou uma composição da invenção a uma planta ou semente de planta ou o local onde a planta está crescendo ou é esperado que cresça. Como consequência de tal aplicação, o peptídeo contata células da planta ou semente de planta, e induz na planta ou uma planta crescida a partir da semente de planta, resistência à doença, realce do crescimento, tolerância ao estresse biótico, tolerância ao estresse abiótico ou sinalização bioquímica alterada. Alternativamente, o peptídeo ou composição da invenção pode ser aplicado às plantas, tal que sementes recuperadas a partir dessas próprias plantas podem conferir resistência à doença em plantas, potencializar o crescimento da planta, afetar o controle de inseto, conferir tolerância ao estresse biótico ou abiótico e/ou modular a sinalização bioquímica.
[00450] Nestas modalidades, é da mesma forma possível selecionar plantas ou sementes de planta ou o local ao qual o peptídeo isolado ou composição da invenção é aplicado. Por exemplo, para campos conhecidos por conter um alto teor de nematódeo, as plantas ou sementes de planta a serem cultivadas em tais campos, ou os campos (local), podem ser seletivamente tratadas aplicando o peptídeo isolado ou composição da invenção como aqui descrito; considerando que nenhum tal tratamento pode ser necessário para plantas ou sementes de planta cultivadas em campos que contêm baixo teor de nematódeo. Similarmente, para campos que têm irrigação reduzida, as plantas ou sementes de planta a serem cultivadas em tais campos, ou os campos (local), podem ser seletivamente tratadas aplicando o peptídeo isolado ou composição da invenção como aqui descrito; considerando que nenhum tal tratamento pode ser necessário para plantas ou sementes de planta cultivadas em campos que têm irrigação adequada. Igualmente, para campos propensos a inundar, as plantas ou sementes de planta a serem cultivadas em tais campos, ou os campos (local), podem ser seletivamente tratadas aplicando o peptídeo isolado ou composição da invenção como aqui descrito; considerando que nenhum tal tratamento pode ser necessário para plantas ou sementes de planta cultivadas em campos que não são propensos a inundar. Como ainda outro exemplo de tal seleção, para campos propensos ao ataque de inseto em certos momentos da estação de cultivo, as plantas ou sementes de planta a serem cultivadas em tais campos, ou os campos (local), podem ser seletivamente tratadas aplicando o peptídeo isolado ou composição da invenção como aqui descrito; considerando que o mesmo campo pode não ser tratado em momentos ineficazes da estação de cultivo ou outros campos que não são propensos a tal ataque podem não ser tratados. Tais etapas de seleção podem ser realizadas ao praticar cada um dos métodos de uso aqui descritos, isto é, conferir resistência à doença às plantas, potencializar o crescimento da planta, realizar o controle de peste (inclusive insetos e nematódeos), conferir tolerância ao estresse biótico ou abiótico às plantas e/ou modular a sinalização bioquímica da planta.
[00451] Como uma alternativa para aplicar um peptídeo isolado ou uma composição que contém o mesmo às plantas ou sementes de planta para conferir resistência à doença em plantas, realizar o cultivo da planta, controlar insetos, conferir resistência ao estresse e/ou sinalização bioquímica modulada às plantas ou plantas cultivadas a partir das sementes, podem ser utilizadas plantas transgênicas ou sementes de planta. Ao utilizar plantas transgênicas, isto envolve fornecer uma planta transgênica transformada com uma molécula de DNA que codifica um peptídeo da invenção e cultivar a planta sob condições efetivas para permitir que a molécula de DNA confira resistência à doença às plantas, realce o crescimento da planta, controle os insetos, confira tolerância ao estresse biótico ou abiótico e/ou module a sinalização bioquímica. Alternativamente, uma semente de planta transgênica transformada com uma molécula de DNA que codifica um peptídeo da invenção pode ser fornecida e plantada no solo. Uma planta é em seguida propagada a partir da semente plantada sob condições efetivas para permitir que a molécula de DNA expresse o peptídeo e desse modo confira resistência à doença à planta transgênica, realce o crescimento da planta, controle os insetos e/ou confira tolerância ao estresse biótico ou abiótico.
[00452] Nestas modalidades, é da mesma forma possível selecionar plantas transgênicas ou sementes de planta para realizar a presente invenção. Por exemplo, para campos conhecidos por conter um alto teor de nematódeo, as plantas transgênicas ou sementes de planta podem ser seletivamente cultivadas em tais campos; considerando que plantas não transgênicas ou sementes de planta podem ser cultivadas em campos que contêm baixo teor de nematódeo. Similarmente, para campos que têm irrigação reduzida, as plantas transgênicas ou sementes de planta podem ser seletivamente cultivadas em tais campos; considerando que plantas não transgênicas ou sementes de planta podem ser cultivadas em campos que têm irrigação adequada. Igualmente, para campos propensos a inundar, as plantas transgênicas ou sementes de planta podem ser cultivadas em tais campos; considerando que plantas não transgênicas ou sementes de planta podem ser cultivadas em campos que não são propensos a inundar. Como ainda outro exemplo de tal seleção, para campos propensos ao ataque de inseto em certos momentos da estação de cultivo, as plantas transgênicas ou sementes de planta podem ser seletivamente cultivadas em tais campos; considerando que plantas não transgênicas ou sementes de planta podem ser cultivadas em campos que não são propensos a tal ataque de inseto. Tais etapas de seleção podem ser realizadas ao praticar cada um dos métodos de uso aqui descritos, isto é, conferir resistência à doença às plantas, potencializar o crescimento da planta, realizar o controle de peste (inclusive insetos e nematódeos), conferir tolerância ao estresse biótico ou abiótico às plantas e/ou modular a sinalização bioquímica da planta.
[00453] A presente invenção também -refere-se à métodos de melhorar a resistência à dessecação para cortes removidos a partir de plantas ornamentais, resistência à doença pós-colheita ou resistência à dessecação à fruta ou legumes colhidos das plantas e/ou longevidade melhorada da maturação da fruta ou legume para fruta ou legumes colhidos das plantas. Estes métodos envolvem aplicar uma quantidade efetiva de um peptídeo isolado da presente invenção ou uma composição de acordo com a presente invenção a uma planta ou ao local onde a planta está crescendo. Como consequência de tal aplicação, o peptídeo contata células da planta ou semente de planta, e induz resistência à dessecação para cortes removidos a partir de plantas ornamentais, resistência à doença pós-colheita ou resistência à dessecação à fruta ou legumes colhidos das plantas e/ou longevidade melhorada da maturação da fruta ou legume para fruta ou legumes colhidos das plantas. Alternativamente, uma quantidade efetiva de um peptídeo isolado da presente invenção ou uma composição de acordo com a presente invenção pode ser aplicada a uma fruta colhida ou legume. Como consequência de tal aplicação, o peptídeo contata células da fruta colhida ou legume, e induz resistência à doença pós- colheita ou resistência à dessecação à fruta tratada ou legumes e/ou longevidade melhorada da maturação da fruta ou legume pela fruta tratada ou legumes.
[00454] Nestas modalidades, é da mesma forma possível selecionar plantas, cortes, frutas, legumes ou o local ao qual o peptídeo isolado ou composição da invenção é aplicado. Por exemplo, para cortes colhidos ou fruta ou legumes que estão sendo transportados por grandes distâncias ou armazenados durante longos períodos de tempo, em seguida, estes podem ser seletivamente tratados aplicando o peptídeo isolado ou composição da invenção como aqui descrito; considerando que os cortes colhidos ou frutas ou legumes que estão sendo transportados localmente e pretendidos ser consumidos sem substancialmente períodos de armazenamento, podem ser excluídos de tal tratamento.
[00455] Como uma alternativa para aplicar um peptídeo isolado ou uma composição que contém o mesmo às plantas ou sementes de planta para induzir resistência à dessecação aos cortes removidos de plantas ornamentais, resistência à doença pós-colheita ou resistência à dessecação à fruta ou legumes colhidos das plantas e/ou longevidade melhorada da maturação da fruta ou legume para fruta ou legumes colhidos das plantas, podem ser utilizadas plantas transgênicas ou sementes de planta. Ao utilizar plantas transgênicas, isto envolve fornecer uma planta transgênica transformada com uma molécula de DNA que codifica um peptídeo da invenção e cultivar a planta sob condições efetivas para permitir que a molécula de DNA induza resistência à dessecação para cortes removidos de plantas ornamentais, resistência à doença pós-colheita ou resistência à dessecação à fruta ou legumes colhidos a partir das plantas transgênicas e/ou longevidade melhorada da maturação da fruta ou legume para fruta ou legumes colhidos a partir das plantas transgênicas. Alternativamente, uma semente de planta transgênica transformada com uma molécula de DNA que codifica um peptídeo da invenção pode ser fornecida e pode ser plantada no solo. Uma planta é em seguida propagada a partir da semente plantada sob condições efetivas para permitir que a molécula de DNA expresse o peptídeo e desse modo induza resistência à dessecação para cortes removidos de plantas ornamentais, resistência à doença pós-colheita ou resistência à dessecação à fruta ou legumes colhidos a partir das plantas transgênicas e/ou longevidade melhorada da maturação da fruta ou legume para fruta ou legumes colhidos a partir das plantas transgênicas.
[00456] Nestas modalidades, é da mesma forma possível selecionar plantas transgênicas ou sementes de planta para realizar a presente invenção. Por exemplo, podem ser selecionadas plantas transgênicas ou sementes de planta para o cultivo, quando sabe-se que os cortes colhidos ou fruta ou legumes destinam-se a ser transportados por grandes distâncias ou armazenados durante longos períodos de tempo pós-colheita; considerando que plantas não transgênicas ou sementes de planta podem ser selecionadas para o cultivo, quando sabe-se que os cortes colhidos ou fruta ou legumes destinam-se a ser transportados localmente e/ou consumidos sem substancialmente períodos de armazenamento.
[00457] Plantas adequadas incluem dicotiledôneas e monocotilédones, incluindo plantas agrícolas, silviculturais, ornamentais e hortícolas, se em uma forma natural ou geneticamente modificada. Plantas exemplares incluem, sem limitação, alfafa, maçã, abricó, aspargos, abacates, bananas, cevada, feijões, faia (Fagus spec.), begônia, vidoeiro, amora-preta, mirtilo, repolho, cânfora, óleo de colza, cenoura, planta de óleo de rícino, cereja, canela, cítrico, semente de cacau, café, milho, algodão, pepino, cucúrbita, eucalipto, abeto, linho, beterraba forrageira, fúcsia, alho, gerânio, uvas, amendoim, cânhamo, lúpulo, juneberry, juncea (Brassica juncea), juta, lentilha, alface, linhaça, melão, mostarda, nectarina, carvalho, aveias, dendezeiro, colza de semente oleaginosa, azeitona, cebola, páprica, ervilha, pêssego, pêra, pelargônio, pimentas, petúnia, pinho (Pinus spec.), ameixa, álamo (Populus spec.), pomóideas, batata, colza, framboesa, arroz, seringueira, centeio, sorgo, soja, espinafre, abeto vermelho, abóbora, morango, beterraba, cana-de-açúcar, girassol, chá, teca, tabaco, tomate, triticale, relva, melancia, trigo e salgueiro (Salix spec.), Arabidopsis thaliana, Saintpaulia, poinsettia, crisântemo, cravo e zínia.
[00458] Com respeito à sinalização bioquímica modificada, isto inclui igualmente realce de certas séries de reação bioquímicas de planta e diminuição de certas outras séries de reação bioquímicas de planta. Séries de reação de sinalização bioquímica que podem ser alteradas de acordo com a presente invenção incluem expressão de gene e produção de proteína, produção de metabólitos, e produção de moléculas de sinalização/metabólitos secundários. Séries de reação de sinalização bioquímica exemplares e suas modificações incluem, sem limitação, indução de produção de óxido nítrico, produção de peróxido, e outros metabólitos secundários; agonista da série de reação de sinalização de etileno e indução de expressão de gene responsivo ao etileno (veja Dong et al., Plant Phys. 136:3628-3638 (2004); Li et al., Planta 239:83146 (2014); Chang et al., PLoS One 10,e0125498 (2015), cada um dos quais está por este meio incorporado por referência em sua totalidade); agonista da série de reação de sinalização de ácido salicílico e indução de expressão de gene responsivo ao ácido salicílico (veja Dong et al., Plant J. 20:207-215 (1999), que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade); agonista da série de reação de ácido abscísico e indução de expressão de gene responsivo ao ácido abscísico (veja Dong et al., Planta 221: 313-327 (2005), que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade); agonista da série de reação de sinalização de giberelina e indução de expressão de gene responsivo à giberelina (veja Li et al., Planta 239:831-46 (2014), que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade); antagonista de sinalização de ácido jasmônico e inibição da expressão de genes responsivos ao ácido jasmônico (veja Dong et al., Plant Phys. 136:3628-3638 (2004), que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade); indução da expressão de inibidor de protease (veja Laluk e Mengiste, Plant J. 68:480-494 (2011); Xia et al., Chin. Sci. Bull 56: 2351-2358 (2011), cada um do qual está por este meio incorporado por referência em sua totalidade); indução da produção de espécie de oxigênio reativo em tecidos de planta; indução da produção de peptídeo antimicrobiano e imunorrelacionados, tais como, sem limitação, peroxidase, superóxido dismutase, quitinase, e β- 1,3-glicanase (Wang et al., J. Agric. Food Chem. 59:12527-12533 (2011), que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade); e indução da expressão de gene de expansina e produção (veja Li et al., Planta 239:831-46 (2014), que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade).
[00459] Com respeito à resistência à doença, a imunidade absoluta contra infecção pode não ser conferida, porém a severidade da doença é reduzida e o desenvolvimento do sintoma é retardado. Número de lesão, tamanho de lesão, e extensão de esporulação de patógenos fúngicos são todos diminuídos. Este método de conferir resistência à doença tem o potencial para tratar doenças previamente intratáveis, tratar doenças sistemicamente que poderia não ser tratadas separadamente devido ao custo, e evitar o uso de agentes infecciosos ou materiais ambientalmente prejudiciais.
[00460] O método de conferir resistência ao patógeno às plantas de acordo com a presente invenção é útil na conferência de resistência a uma ampla variedade de patógenos inclusive vírus, bactérias e fungos. Resistência, inter alia, aos seguintes vírus pode ser obtida pelo método da presente invenção: vírus em mosaico do Tabaco e vírus em mosaico do Tomate. Resistência, inter alia, às seguintes bactérias pode da mesma forma ser conferida às plantas de acordo com a presente invenção: Pseudomonas spp. patogênica, Erwinia spp. patogênica, Xanthomonas spp. patogênica e Ralstonia spp. Patogênica. As plantas podem ser tornadas resistentes, inter alia, aos seguintes fungos por uso do método da presente invenção: Fusarium spp. e Phytophthora spp.
[00461] Com respeito ao uso dos peptídeos ou composições da presente invenção para potencializar o crescimento da planta, várias formas de promoção ou realce do crescimento da planta podem ser obtidas. Isto pode ocorrer tão cedo quanto o crescimento da planta começa a partir de sementes ou depois na vida de uma planta. Por exemplo, o crescimento da planta de acordo com a presente invenção abrange maior rendimento, vigor de planta aumentado, vigor aumentado de mudas (isto é, pós-germinação), peso da planta aumentado, biomassa aumentada, número aumentado de flores por planta, rendimento de grão e/ou fruta mais alto, quantidade aumentada de sementes produzidas, porcentagem aumentada de sementes germinadas, velocidade aumentada de germinação, tamanho de planta aumentado, altura de planta diminuída (para o trigo), maior biomassa, mais e maior fruta, coloração de fruta mais precoce, broto mais precoce, maturação de fruta e planta, mais forquilhas ou brotos laterais, folhas maiores, senescência de folha retardada, crescimento de broto aumentado, crescimento de raiz aumentado, alocação de raiz/broto alterada, teor de proteína aumentado, teor de óleo aumentado, teor de carboidrato aumentado, teor de pigmento aumentado, teor de clorofila aumentado, fotossíntese total aumentada, eficiência de fotossíntese aumentada, respiração reduzida (uso de O2 mais baixo), compensação para tratamentos de redução de rendimento, durabilidade aumentada de talos (e resistência à hospedagem de talo), durabilidade aumentada de raízes (e resistência à hospedagem de raiz), melhor crescimento da planta em condições de baixa luz, e combinações dos mesmos. Como resultado, a presente invenção fornece benefício econômico significante a cultivadores. Por exemplo, germinação precoce e maturação precoce permite que as culturas sejam cultivadas em áreas onde estações de cultivo curtas de outro modo impediriam seu crescimento naquele local. A porcentagem aumentada de resultados de germinação de semente em postos de cultura melhorados e uso de semente eficiente mais. Maior rendimento, tamanho aumentado, e produção de biomassa realçada permitem maior geração de renda a partir de um determinado lote de terreno.
[00462] Com respeito ao uso dos peptídeos ou composições da presente invenção para controlar pestes (incluindo porém não limitados aos insetos e nematódeos, que são estressores bióticos), tal controle de peste abrange impedir as pestes de contatar plantas às quais o peptídeo ou composição da invenção foi aplicada, impedir o dano direto às plantas por lesão alimentar, fazendo com que as pestes se afastem de tais plantas, exterminar as pestes próximas a tais plantas, interferir com a alimentação larval do inseto em tais plantas, impedir as pestes de colonizar as plantas hospedeiras, impedir a colonização insetos a partir de liberação de fitotoxinas, interferir com deposição de ovos nas plantas hospedeiras, etc. A presente invenção da mesma forma impede o dano da doença subsequente às plantas que é o resultado de infecção por peste.
[00463] A presente invenção é efetiva contra uma ampla variedade de insetos (estressores bióticos). Broca do milho Europeia é uma peste principal do milho (milho dentado e doce) porém da mesma forma se alimenta em mais de 200 espécies de planta inclusive, feijões verdes, de cera e de lima e sojas comestíveis, pimentas, batata e tomate mais muitas espécies de erva daninha. Pestes de alimentação larvais de inseto adicionais que danificam uma ampla variedade de culturas vegetais incluem o seguinte: lagarta de beterraba, larva de repolho, lagarta da espiga de milho, lagarta de outono, traça das crucíferas, larva da raiz do repolho, larva da cebola, larva da semente de milho, lagarta (pickleworm) (lagarta) (melonworm), larva de pimenta, e lagarta (pinworm) do tomate. Coletivamente, este grupo de pestes de inseto representa o grupo economicamente mais importante de pestes para produção vegetal. A presente invenção também é efetiva contra nematódeos, outra classe de estressores bióticos economicamente importantes. Nematódeo de Cisto de Soja (Heterodera glycines) é uma peste principal de sojas. Nematódeo Reniforme (Rotylenchulus reniformis) é uma peste principal de algodão visto que pode parasitar espécies de cultura adicionais, notavelmente soja e milho. Pestes de nematódeo adicionais incluem os nematódeos de nó de raiz do gênero Meloidogyne (particularmente em algodão, trigo e cevada), nematódeos de cisto de cereal do gênero Heterodera (particularmente em soja, trigo e cevada), nematódeos de lesão de raiz do gênero Pratylenchus, nematódeos de galhas em semente do gênero Anguina (particularmente em trigo, cevada e centeio), e nematódeos de talo do gênero Ditylenchus. Outros estressores bióticos incluem aracnídeos, ervas daninhas, e combinações dos mesmos.
[00464] Com respeito ao uso dos peptídeos ou composições da presente invenção para conferir resistência ao estresse abiótico às plantas, tal estresse abiótico abrange qualquer fator ambiental que tem um efeito adverso em fisiologia e desenvolvimento da planta. Exemplos de tal estresse ambiental incluem estresse relacionado ao clima (por exemplo, seca, inundação, geada, temperatura fria, temperatura alta, luz excessiva e luz insuficiente), estresse por poluição do ar (por exemplo, dióxido de carbono, monóxido de carbono, dióxido de enxofre, NOx, hidrocarbonetos, ozônio, radiação ultravioleta, chuva ácida), substância química (por exemplo, inseticidas, fungicidas, herbicidas, metais pesados), estresse nutricional (por exemplo, super ou subabundância de fertilizante, micronutrientes, macronutrientes, particularmente potássio, derivados de nitrogênio, e derivados de fósforo), e resposta curativa melhorada ao ferimento. O uso de peptídeos da presente invenção conferi resistência às plantas contra tais formas de estresse ambiental.
[00465] Um aspecto adicional da presente invenção refere-se ao uso dos peptídeos da presente invenção como um protetor em combinação com um ou mais dos agentes ativos (isto é, em uma composição ou em composições separadas) para o controle de ervas daninhas aquáticas em um corpo de água como descrito na Publ. U.S. No. 20150218099 de Mann, que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade.
[00466] Ainda outro aspecto da presente invenção refere-se ao uso dos peptídeos da presente invenção como um reforçador de planta em uma composição para aplicação às plantas cultivadas sob condições de irrigação de água reduzida, cuja composição da mesma forma inclui pelo menos um antioxidante e pelo menos um administrador de radiação, e opcionalmente pelo menos um regulador de crescimento da planta, como descrito na Publ. U.S. No. 20130116119 de Rees et al., que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade.
[00467] Os métodos da presente invenção que envolve aplicação do peptídeo ou composição podem ser realizados por uma variedade de procedimentos, quando toda ou parte da planta é tratada, inclusive folhas, talos, raízes, propágulos (por exemplo, cortes), fruta, etc. Isto pode (porém não necessário) envolver a infiltração do peptídeo na planta. Métodos de aplicação adequados incluem pulverização de alta ou baixa pressão, injeção e abrasão de folha próxima a quando a aplicação de peptídeo ocorrer. Ao tratar sementes de planta, de acordo com a modalidade de aplicação da presente invenção, o polipeptídeo ou proteína desencadeadora de resposta hipersensível pode ser aplicado por pulverização de baixa ou alta pressão, revestimento, imersão (por exemplo, embebimento), ou injeção. Outros procedimentos de aplicação adequados podem ser considerados por aqueles versados na técnica, desde que eles possam realizar o contato da proteína ou polipeptídeo desencadeador de resposta hipersensível com células da planta ou semente de planta. Uma vez tratada com os peptídeos ou composições da presente invenção, as sementes podem ser plantadas no solo natural ou artificial e cultivadas usando procedimentos convencionais para produzir plantas. Depois que as plantas foram propagadas das sementes tratadas de acordo com a presente invenção, as plantas podem ser tratadas com uma ou mais aplicações dos peptídeos ou composições da invenção para conferir resistência à doença às plantas, potencializar o crescimento da planta, controlar insetos nas plantas, conferir tolerância ao estresse biótico ou abiótico, melhorar a resistência à dessecação de cortes removidos, conferir resistência à doença pós-colheita ou resistência à dessecação a fruta ou legumes colhidos e/ou longevidade melhorada da maturação da fruta ou legume para fruta ou legumes colhidos.
[00468] Os peptídeos ou composições da invenção podem ser aplicados às plantas ou sementes de planta de acordo com a presente invenção sozinhos ou em uma mistura com outros materiais. Alternativamente, os peptídeos ou composições podem ser aplicados separadamente às plantas com outros materiais que são aplicados em momentos diferentes.
[00469] Na modalidade alternativa da presente invenção que envolve o uso de plantas transgênicas e sementes transgênicas, um peptídeo da invenção não necessita ser aplicado topicamente às plantas ou sementes. Ao contrário, plantas transgênicas transformadas com uma molécula de DNA que codifica um peptídeo da invenção são produzidas de acordo com procedimentos conhecidos na técnica.
[00470] Um vetor adequado para expressão em plantas (isto é, contendo sequências de controle de translação e transcrição operáveis em plantas) pode ser diretamente microinjetado em células de planta por uso de micropipetas para transferir mecanicamente o DNA recombinante. Crossway, Mol. Gen. Genetics, 202:179-85 (1985), que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade. O material genético também pode ser transferido na célula de planta usando polietileno glicol. Krens, et al., Nature, 296:72-74 (1982), que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade.
[00471] Outro método para transformar células de planta com um gene que codifica o peptídeo da invenção é bombardeio de partícula (também conhecido como transformação biolística) da célula hospedeira. Isto pode ser realizado em um dentre vários modos. O primeiro envolve propelir partículas inertes ou biologicamente ativas em células. Esta técnica é descrita na Patente U.S. Nos. 4.945.050, 5.036.006 e 5.100.792, todas de Sanford et al., que está por este meio incorporado por referência. Geralmente, este procedimento envolve propelir partículas inertes ou biologicamente ativas nas células sob condições efetivas para penetrar a superfície externa da célula e ser incorporadas dentro do interior da mesma. Quando são utilizadas partículas inertes, o vetor pode ser introduzido na célula revestindo as partículas com o vetor que contém o DNA heterólogo. Alternativamente, a célula alvo pode ser cercada pelo vetor de forma que o vetor seja transportado na célula pelo curso da partícula. Partículas biologicamente ativas (por exemplo, células bacterianas secadas que contêm o vetor e DNA heterólogo) também podem ser propelidas em células de planta.
[00472] Ainda outro método de introdução é fusão de protoplastos com outras entidades, quaisquer minicélulas, células, lisossomas ou outros corpos com superfície de lipídeo fusíveis. Fraley, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:1859-63 (1982), que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade.
[00473] A molécula de DNA também pode ser introduzida nas células de planta por eletroporação. Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:5824 (1985), que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade. Nesta técnica, protoplastos de planta são eletroporados na presença de plasmídeos que contém o cassete de expressão. Impulsos elétricos de alta resistência de campo reversivelmente permeabiliza as biomembranas, permitindo a introdução dos plasmídeos. Protoplastos de planta eletroporados reformam a parede celular, dividem e regeneram.
[00474] Outro método de introduzir a molécula de DNA em células de planta é infectar uma célula de planta com Agrobacterium tumefaciens ou A. rhizogenes previamente transformada com o gene. Sob condições apropriadas conhecidas na técnica, as células de planta transformadas são cultivadas para formar brotos ou raízes, e também se desenvolvem nas plantas. Geralmente, este procedimento envolve inocular o tecido de planta com uma suspensão de bactérias e incubar o tecido durante 48 a 72 horas em meio de regeneração sem antibióticos a 25-28°C. Agrobacterium é um gênero representativo da familiar gram- negativa Rhizobiaceae. Suas espécies são responsáveis pela doença galha da copa (A. tumefaciens) e raiz pilosa (A. rhizogenes). As células de planta em tumores de galha da copa e raízes pilosas são induzidas para produzir derivados de aminoácido conhecidos como opinas, que são catabolizados apenas pelas bactérias. Os genes bacterianos responsáveis para expressão de opinas são uma fonte conveniente de elementos de controle para cassetes de expressão quiméricos. Além disso, o ensaio quanto à presença de opinas pode ser usado para identificar tecido transformado. As sequências genéticas heterólogas podem ser introduzidas em células de planta apropriadas, por meio do plasmídeo Ti de A. tumefaciens ou o plasmídeo Ri de A. rhizogenes. O plasmídeo de Ti ou Ri é transmitido às células de planta em infecção por Agrobacterium e é estavelmente integrado no genoma de planta. J. Schell, Science, 237:1176-83 (1987), que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade.
[00475] Depois da transformação, as células de planta transformadas devem ser regeneradas. A regeneração da planta a partir de protoplastos cultivados é descrita em Evans et al., Handbook of Plant Cell Cultures, Vol. 1: (MacMillan Publishing Co., New York, 1983); e Nasil I.R. (ed.), Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Acad. Press, Orlando, Vol. 1, 1984, e Vol. III (1986), que estão por este meio incorporados por referência em sua totalidade.
[00476] Sabe-se que praticamente todas as plantas podem ser regeneradas a partir de células cultivadas ou tecidos. Meios para regeneração variam de espécies para espécies de plantas, porém geralmente uma suspensão de protoplastos transformados ou uma placa de petri contendo explantes transformados é fornecida primeiro. Tecido de calo é formado e os brotos podem ser induzidos a partir do calo e subsequentemente enraizados. Alternativamente, a formação de embrião pode ser induzida no tecido de calo. Estes embriões germinam como embriões naturais para formar plantas. Os meios de cultura geralmente conterão vários aminoácidos e hormônios, tais como auxina e citocininas. Também é vantajoso adicionar ácido glutâmico e prolina ao meio, especialmente para tais espécies como milho e alfafa. A regeneração eficiente dependerá do meio, do genótipo e da história da cultura. Se estas três variáveis são controladas, por conseguinte a regeneração normalmente é reproduzível e repetível.
[00477] Depois que o cassete de expressão for estavelmente incorporado em plantas transgênicas, pode ser transferido a outras plantas através de cruzamento sexual. Quaisquer das várias técnicas de reprodução padrão podem ser usadas, dependendo das espécies a ser cruzadas.
[00478] Uma vez que as plantas transgênicas deste tipo são produzidas, as próprias plantas podem ser cultivadas de acordo com procedimento convencional com a presença do gene que codifica o desencadeador de resposta hipersensível que resulta em resistência à doença, crescimento da planta realçado, controle de insetos na planta, tolerância ao estresse abiótico ou biótico, resistência à dessecação melhorada de cortes removidos, resistência à doença pós-colheita ou resistência à dessecação em fruta ou legumes colhidos e/ou longevidade melhorada da maturação da fruta ou legume para fruta ou legumes colhidos.
[00479] Alternativamente, as sementes transgênicas são recuperadas das plantas transgênicas. Estas sementes podem em seguida ser plantadas no solo e cultivadas usando procedimentos convencionais para produzir plantas transgênicas. As plantas transgênicas são propagadas a partir das sementes transgênicas plantadas sob condições efetivas para conferir resistência à doença às plantas, potencializar o crescimento da planta, controlar insetos, conferir tolerância ao estresse abiótico ou biótico, melhorar a resistência à dessecação de cortes removidos, conferir resistência à doença pós- colheita ou resistência à dessecação em fruta ou legumes colhidos e/ou conferir longevidade melhorada da maturação da fruta ou legume para fruta ou legumes colhidos.
[00480] Quando as sementes de planta e plantas transgênicas são usadas de acordo com a presente invenção, elas podem ser tratadas adicionalmente com os mesmos materiais, visto que são usados para tratar as plantas e sementes, as quais um peptídeo da invenção ou composição da invenção é aplicado. Estes outros materiais, inclusive peptídeos ou composição da invenção, podem ser aplicados às sementes de planta e plantas transgênicas pelos procedimentos acima mencionados, incluindo pulverização de alta ou baixa pressão, injeção, revestimento e imersão. Similarmente, depois que as plantas foram propagadas a partir das sementes de planta transgênica, as plantas podem ser tratadas com uma ou mais aplicações dos peptídeos ou composições da invenção para conferir resistência à doença, potencializar o crescimento, controlar os insetos, tolerância ao estresse abiótico ou biótico, resistência à dessecação de cortes removidos, resistência à doença pós-colheita ou resistência à dessecação em fruta ou legumes colhidos e/ou longevidade melhorada da maturação da fruta ou legume para fruta ou legumes colhidos.
[00481] Tais plantas transgênicas também podem ser tratados com agentes de tratamento de planta convencionais, por exemplo, agentes bactericidas ou biocidas, inibidores de protease, tensoativos não iônicos, fertilizantes, herbicidas, inseticidas, fungicidas, nematicidas, inoculantes biológicos, reguladores de planta, e misturas dos mesmos, como descrito acima.
EXEMPLOS
[00482] Os exemplos seguintes são fornecidos para ilustrar modalidades da presente invenção, porém não pretendem, de forma alguma, limitar seu escopo.
Exemplo 1 - Análise de Resposta Hipersensível
[00483] HR em tabaco foi testada como descrito em Wei, Science 257:85-88 (1992), que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade. Resumidamente, os peptídeos foram dissolvidos a uma concentração de 500 μg/mL em solução aquosa. Foram realizadas quatro diluições seriais com um volume igual de água, produzindo amostras de peptídeo a 500, 250, 125, 62,5, 31,25 (g/mL de soluções de peptídeo. Plantas de xanthi de cultivar de Nicotiana tabacum foram usadas a 5-7 semanas de idade (pré-florescência). As folhas foram ligeiramente perfuradas com um palito em um painel de folha mediano. As soluções de peptídeo foram em seguida infusas por seringa sem agulha na ferida, enchendo o painel. Cada amostra de peptídeo foi infusa em uma folha de 2 plantas diferentes. As folhas foram observadas e classificadas durante as próximas 48 horas quanto ao murchamento e escurecimento, lesões típicas da morte celular programada.
[00484] O teste de Resposta Hipersensível foi realizado em muitos peptídeos e determinado ser negativo. Alguns peptídeos têm que ser ainda testados, designado como “a ser determinado” ou “TBD” na Tabela 18 abaixo, porém espera-se que sejam HR-negativos com base nos resultados para peptídeos intimamente relacionados.Tabela 18: Sumário de Resultados de Resposta HipersensívelTabela 18: Sumário de Resultados de Resposta Hipersensível
Exemplo 2 - Análise de Resposta de Peróxido
[00485] O ensaio de complexo de laranja de xilenol férrico para peróxido de hidrogênio (Gay et al., Analytical Biochemistry 273:149-55 (1999), que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade) foi usado para determinar a produção de peróxido através de tecido de folha de planta. Resumidamente, o reagente A foi preparado misturando 10 mg de sulfato de amônio ferroso com 133 μL de ácido sulfúrico em um volume total de 1 mL com água. O Reagente B foi preparado misturando 2 g de sorbitol com 9,34 mg de laranja de xilenol em 80 mL de água. Ácido clorídrico a 1M foi adicionado lentamente, até que a solução tenha se tornado amarela. A solução foi em seguida diluída com água a um volume total de 100 mL, e armazenada em um frasco escuro a 4°C.
[00486] As folhas de quaisquer plantas de tabaco (plantas cultivadas até a 6 folhas definitivas) ou plantas de soja (plantas cultivadas até a 6 folhas definitivas) foram usadas para o ensaio. A folha foi primeiro removida da planta e colocada em uma toalha de papel. Círculos de tecido de folha de 0,5 cm foram em seguida removidos da folha usando uma ferramenta de perfuração de couro. Estes discos foram em seguida colocados nas cavidades de uma placa de 96 cavidades. 250 mL de água foram adicionados a cada disco. A placa foi coberta com parafilme e descansada durante 12 horas no escuro. A água em excesso foi em seguida removida, e as cavidades lavadas com um adicional de 250 μL de água. As lavagens foram em seguida removidas das cavidades e substituídas com 105 μL de uma solução de 0,5ug/mL de peptídeo em água ou blank de água, geralmente em quadruplicado. Onde a solubilidade de peptídeo foi um problema, o tampão de pH foi adicionado igualmente às amostras de peptídeo e blank. Os discos de folha foram incubados com os peptídeos durante uma hora sob iluminação fluorescente. 50 μL da solução de cada amostra de folha foram removidos para uma nova cavidade para análise química.
[00487] Só antes da análise, os reagentes A e B foram recém- misturados em uma relação de 1:100 para produzir o reagente de ensaio. 200 μL desta mistura foram adicionados a cada cavidade contendo 50 μL de solução tratada de folha. A placa foi incubada no escuro por 20 minutos, e a absorvência a 595 nm foi detectada. Os resultados foram analisados usando o teste T de Student de duas caudas. Os resultados foram divididos em várias classes de resposta. XR++ indicou uma resposta positiva com absorvência > 0,05 unidades acima do controle negativo, e um teste T de Student p < 0,05. XR+ indicou uma absorbância < 0,05 unidades acima do blank, e um teste T de Student p < 0,05. XR fraca indicou uma resposta > 0,02 unidade acima do controle negativo com um valor de p que não foi significante. XR- indicou uma absorvência dentro de 0,02 unidade do controle negativo. Deveria ser notado que pode haver variabilidade biológica significante na resposta de peróxido devido à idade da planta, localização do disco dentro da folha, e outros fatores. Como resultado, os valores de p do teste T são um guia e não um critério de inclusão absoluto.
[00488] Os resultados destes estudos são resumidos na Tabela 19 abaixo: Tabela 19: Sumário de Resposta de PeróxidoTabela 19: Sumário de Resposta de PeróxidoTabela 19: Sumário de Resposta de Peróxido
[00489] Em geral, a vasta maioria dos peptídeos testaram XR+ em Soja. Entretanto, o tabaco foi mais discriminador. A maioria dos peptídeos que foram uma mutação simples de uma sequência de HR+ foi XR+ em tabaco. Até mesmo uma segunda mutação frequentemente ainda resultou em fenótipo de XR+. Entretanto, testes em variantes de p14 mostraram a mutação de três resíduos de leucina para alanina geralmente resultada em uma perda de desencadeamento de XR. Igualmente, variantes truncadas C-terminais de p15 (p15-62 e p15-63) foram XR- em tabaco.
Exemplo 3 - Análise de Crescimento de Raiz & Broto
[00490] Os peptídeos foram testados quanto aos efeitos biológicos na distribuição de recursos de crescimento para o broto (acima do solo) e raiz (abaixo do solo). Os peptídeos foram dissolvidos a 0,2, 2, ou 5 μg/mL em um volume total de 100 mL de água deionizada. Sementes de milho ou soja foram em seguida embebidas durante uma hora na solução de peptídeo. As plantas de controle não tratadas (UTC) foram embebidas em água deionizada. Xícaras de bebida de 300 mL de plásticos claras (Solo®, Dart Container Corporation) foram preparadas para o plantio marcando-se a base com uma cruz, dividindo a base em quatro quadrantes iguais. As xícaras foram, em seguida, preenchidas com solo Sunshine Mix #1 (SunGro Horticulture) peneirado para %”. 100 mL de água foram adicionados ao solo. As sementes tratadas foram, em seguida, plantadas pressionando-se a semente ligeiramente no topo do solo. As sementes foram, em seguida, cobertas com um adicional de 50 mL de solo solto. As sementes foram permitidas germinar e crescer durante 12-14 dias.
[00491] O comprimento do broto foi medido como a distância a partir do solo para a ponta ligeiramente esticada da folha mais alta para cada planta. As plantas que não germinaram ou exibiram crescimento atrofiado foram removidas da experiência. A atrofia foi definida como a falta de uma folha definitiva completamente expandida no momento da coleta de dados ou tendo uma folha definitiva expandida julgada pelo olho a ser < ^ da área da folha média do grupo de tratamento. Geralmente, 30 sementes foram plantadas por grupo de tratamento e 15-25 plantas foram usadas para coleta de dados.
[00492] O crescimento da raiz foi calculado contando-se o número de vezes que uma raiz primária cruza as marcas de quadrante da base da xícara. Estas foram observadas frequentemente ao longo da circunferência da base da xícara, embora algumas tenham sido visíveis ao longo do lado do recipiente e foram contadas como se cruzando uma extensão vertical da linha do quadrante. Este número foi dividido por 4 para produzir um índice de crescimento de raiz. Este índice foi encontrado para correlatar ~90 % com comprimento de raiz primária total medido (soma dos comprimentos de todas as raízes primárias depois de enxaguar o solo das raízes e medição direta).
[00493] Os resultados destes estudos são resumidos na Tabela 20 abaixo. Cada número indica o aumento em porcentagem acima dos valores de controle não tratados. Um asterisco indica que a diferença foi estatisticamente significante com p < 0,05 como determinado pelo teste T de Student.Tabela 20: Sumário de Crescimento Raiz & Broto
[00494] O crescimento de raiz aumentado (mostrado em p4-14s-16s, p14 e p14a) aumenta a capacidade de coleta de água da planta e aumentará a resistência à seca e inundação. Reciprocamente, o crescimento de broto aumentado (como em p4-14s-9a, p4-14s-20s, e soja de p14a a 0,2 μg/mL) aumenta a coleta de luz e conversão de energia. É notável que p14a ou pode causar aumento no crescimento de raiz ou broto dependendo da dosagem. P4-14s-16s causa uma forte troca em alocação de recurso para o crescimento de raiz.
Exemplo 4 - Testes de Crescimento
[00495] Sementes de soja (ou sementes de milho, como indicado) foram plantadas nos pavimentos com 2 sementes por célula dentro do pavimento em uma estufa. As sementes foram permitidas germinar, e a planta menor é selecionada, deixando uma planta por célula. Uma vez as primeiras folhas definitivas são completamente ampliadas, e as segundas folhas estão começando a se expandir, as plantas foram inicialmente medidas quanto à altura. Isto foi realizado esticando a folha mais alta para cima e medindo a distância até o solo. Os peptídeos foram dissolvidos em água nas concentrações indicadas (Tabela 21 abaixo). As plantas foram em seguida tratadas com um spray foliar usando frascos de spray amplamente disponíveis até que o líquido fosse gotejando a partir das folhas. Seis pavimentos de 14 plantas foram cada qual tratados por condição (peptídeo ou controle). As plantas de controle não tratadas designadas foram pulverizadas com água. As plantas foram permitidas crescer durante 14 dias. A altura das plantas foi novamente medida e comparada à altura original para quantificar o crescimento. Finalmente, as plantas foram colhidas removendo os brotos (todo o material do solo acima). Para algumas experiências, isto foi pesado ao colher para determinar a massa fresca (inclusive o peso da água). Os brotos foram em seguida secados a 70°C durante 72 horas, e novamente pesados para determinar a biomassa seca. Embora este método use uma medida similar (crescimento) como no Exemplo 3 acima, o método de tratamento é diferente (embebimento de semente vs. spray foliar). Como resultado, os resultados experimentais podem divergir.Tabela 21: Sumário de Medidas de CrescimentoTabela 21: Sumário de Medidas de Crescimento
[00496] Vários dos peptídeos estudados causam aumentos no crescimento e biomassa seca (p4-14s-9a, p14, p14a, e p14-32). Além disso, vários peptídeos causaram conservação aumentada de água em comparação com plantas UTC que sofreram estresse pela seca na conclusão da experiência. O teor de água conservado foi indicado por >10 % de aumento na massa fresca, tal como constatado em plantas tratadas com p14a - e p14-32. O efeito de crescimento não foi limitado à soja; milho também exibiu um modesto benefício de crescimento no tratamento de peptídeo com p1-29.
[00497] Notavelmente, P14-dc4, que incorpora um C-terminal truncado, parece perder o crescimento significante, biomassa seca e benefícios de massa fresca observados para p14. Através de comparação, a remoção da sequência N-terminal de P14 (amostras de P14a) ainda resulta em aumentos para todas as 3 medidas.
Exemplo 5 - Indução de Resistência para Vírus em Mosaico do Tabaco
[00498] Os peptídeos foram testados quanto à indução de resistência ao vírus em mosaico do tabaco (TMV) em tabaco. Resumidamente, três plantas de tabaco em 6-8 semanas de idade foram selecionadas por grupo (amostras e controles). A folha mais inferior da planta foi coberta, e a planta foi pulverizada com uma solução de água (controle negativo), peptídeo ou Proact (controle positivo). O spray foi aplicado até que as folhas sejam completamente umedecidas, indicado por gotejamento de líquido das folhas. As plantas foram em seguida, permitidas secar e a cobertura da folha foi removida.
[00499] Três dias pós-tratamento, a folha previamente coberta e uma folha no lado oposto da planta foram, em seguida, ligeiramente polvilhadas com terra diatomácea e 20 μL de uma solução de 1,7 μg/mL de vírus em mosaico de tabaco purificado foram aplicados. A solução de TMV foi em seguida espalhada pela superfície da folha esfregando- se ligeiramente a solução e a terra diatomácea pela superfície das folhas. Dois minutos depois da inoculação, a terra diatomácea foi enxaguada fora as folhas com água. 3 Dias depois da inoculação de TMV, as folhas foram marcadas com base no número de lesões de TMV observadas. A folha foi da mesma forma marcada quanto aos sinais da resposta hipersensível, incluindo o amarelamento e murchamento das folhas afetadas.
[00500] A efetividade descrita na Tabela 22 refere-se ao % de declínio em lesões de TMV em plantas tratadas vs UTC. Uma redução do TMV nas folhas cobertas indica uma resposta imune sistêmica na planta, ao mesmo tempo que a redução sobre as folhas não cobertas indica uma resposta local. Asteriscos indicam que o valor P derivado de um teste T foi < 0,05.Tabela 22: Sumário da Resistência do TMV Tabela 22: Sumário da Resistência do TMV Tabela 22: Sumário da Resistência do TMVTabela 22: Sumário da Resistência do TMV
[00501] Vários peptídeos HR-negativos causam respostas locais e sistêmicas significantes: P4-14S-9A, P4-14S-17A, P4-14S-12D, e P4- 14S-16V produziram os melhores resultados. Em geral, a maioria dos peptídeos exibiu alguma atividade anti-TMV. Entretanto, peptídeos com uma truncação C-terminal maior em comparação com uma caixa de HR intata (veja o Pedido PCT PCT/US15/53387, intitulado “Hypersensitive Response Desencadeador Peptides and Use Thereof”, depositado em 1 de outubro de 2015, que está por este meio incorporado por referência em sua totalidade) (por exemplo, p4-116, P14-dc4), exibem efetividade reduzida contra infecção por TMV. Uma truncação C-terminal mais curta geralmente desencadeou resistência ao TMV a uma taxa ligeiramente mais fraca (50-75 % de controle). O maior rompimento do espaçamento de resíduo em P4-d10,14,18, da mesma forma exibiu uma redução moderada na efetividade contra infecção por TMV. Da mesma forma, a mutação de algumas posições de leucina parecia associada com as respostas de TMV mais fracas: P19min-13S, P18min-7D, P18min-11S, P14d-18D, P4-14S-20V, P4-14S-20S, P4-14s-16A. Notavelmente, embora contenha várias sequências hidrofóbicas, P25-14 exibe controle mais fraco de infecção por TMV. Uma investigação sistemática de mutação dos resíduos de leucina e isoleucina importantes sobre várias sequências de desencadeamento de HR revelou que as mutações nos vários locais podem causar uma redução na resposta imune. A mutação do primeiro resíduo hidrofóbico (em p14d-7S, p18min-7D, e p25-9D) pode causar eficácia reduzida em folhas cobertas, indicando uma redução na resposta imune sistêmica. P15b-12S da mesma forma exibe uma redução similar nas respostas sistêmicas na folha coberta. P19min- 13S exibe ativação imune pobre. Alguém pode remover o último dubleto hidrofóbico, que ainda permitiu a atividade anti-TMV (por exemplo em P1-31 e P1-111). Entretanto, uma outra sequência hidrofóbica encurtado está associada com uma redução na atividade contra TMV, como demonstrado por P4-116 e P14-dc4.
[00502] Tendo desse modo descrito o conceito básico da invenção, ficará bastante evidente para aqueles versados na técnica que pretende-se que a descrição detalhada precedente seja apresentada apenas por meio de exemplo, e não ser limitante. Várias alterações, melhorias e modificações ocorrerão e são pretendidas por aqueles versados na técnica, entretanto não expressamente declaradas aqui. Pretendem que estas alterações, melhorias e modificações sejam sugeridas aqui, e estejam dentro do espírito e escopo da invenção. Adicionalmente, a ordem especificada dos elementos de processamento ou sequências, ou o uso de números, letras ou outras designações, portanto, não pretende limitar os processos reivindicados a qualquer ordem, exceto como pode ser especificado nas reivindicações. Consequentemente, a invenção é limitada apenas pelas seguintes reivindicações e equivalentes a ela.

Claims (28)

1. Peptídeo isolado, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácido de: L-X-X-(L/I)-(L/I)-X-X-(L/I/V)-(L/I/V) (SEQ ID NO: 116), em que o peptídeo é livre de cisteína e metionina; cada X nas posições 2, 3, 6 e 7 é independentemente selecionado do grupo consistindo em G, A, S, T, D, isoD, E, g-glutamato, Q e N; o peptídeo compreende até 24 aminoácidos na extremidade N-terminal da SEQ ID NO: 116, até 10 aminoácidos na extremidade C- terminal da SEQ ID NO: 116, ou ambos, exceto que a sequência de aminoácidos do peptídeo não compreende a sequência de aminoácidos (L/I/V/F) -XX- (L/I/V/F) - (L/I) -XX- (L/I/V) - (L/I) -XX- (L/I/V/F) - (L/I/V/F) (SEQ ID NO: 125) em que cada X nas posições 2, 3, 6, 7, 10, 11 é qualquer aminoácido; e o peptídeo induz uma resposta de planta ativa, porém, não induz uma resposta hipersensível, quando aplicada ao tecido da planta mecanicamente rompido.
2. Peptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que não contém resíduos de K ou R, exceto na extremidade C-terminal do mesmo.
3. Peptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos de uma das SEQ ID NOs: 124, 129-132, 139, 143 e 160.
4. Peptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que consiste essencialmente na sequência de aminoácido de uma das SEQ ID NOs: 124, 129-132, 139, 143 e 160.
5. Peptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende até 20 aminoácidos na extremidade N-terminal da SEQ ID NO: 116, até 7 aminoácidos na extremidade C-terminal da SEQ ID NO: 116, ou ambos.
6. Peptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos de uma das SEQ ID NOs: 124, 129, 130 e 132, exceto que (i) quaisquer resíduos de lisina ou arginina são alterados para glutamato e (ii) um resíduo de arginina é introduzido na extremidade C-terminal do peptídeo.
7. Peptídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de é determinado por um ou mais de: (i) estável quando dissolvido em água ou solução aquosa, (ii) resistente à degradação química quando dissolvido em uma solução de tamponamento aquosa contendo um biocida, (iii) solubilidade maior do que cerca de 0,1% em água ou solução aquosa.
8. Peptídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a resposta de planta ativa induzida pelo peptídeo é selecionada a partir do grupo consistindo em indução de peróxido, crescimento realçado, resistência ao patógeno, resistência ao estresse biótico ou abiótico, e sinalização bioquímica modificada.
9. Peptídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 5 a 8, caracterizado pelo fato de que é um polipeptídeo de fusão compreendendo uma segunda sequência de aminoácido acoplada por ligação peptídica à sequência de aminoácido.
10. Peptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a segunda sequência de aminoácido inclui um tag de purificação, ou uma sequência de aminoácido N- terminal ou C-terminal hidrofílica.
11. Peptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a segunda sequência de aminoácido também inclui uma sequência ligadora clivável entre o tag de purificação e a sequência de aminoácido.
12. Peptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que é um polipeptídeo de fusão compreendendo uma primeira sequência de aminoácido para o referido peptídeo ligado a uma segunda sequência de aminoácido para o referido peptídeo.
13. Polipeptídeo de fusão, caracterizado pelo fato de que compreende uma pluralidade de sequências de aminoácido ligadas juntamente em série, cada dentre a pluralidade de sequências de aminoácido compreendendo um peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 5 a 8.
14. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais peptídeos como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 ou um polipeptídeo de fusão como definido na reivindicação 13, e um veículo.
15. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um aditivo selecionado a partir do grupo consistindo em fertilizante, herbicida, inseticida, fungicida, nematicida, um agente bactericida, um inoculante biológico, um regulador de plantas e misturas dos mesmos.
16. Composição, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o veículo é um veículo aquoso ou um veículo sólido em forma de particulado.
17. Composição, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o veículo é um veículo aquoso e que ainda compreende um ou mais de um agente biocida, um inibidor de protease, um tensoativo não iônico, ou uma combinação dos mesmos.
18. Composição, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o veículo é um veículo sólido e é um pó seco.
19. Método de conferir resistência à doença às plantas, potencializando o crescimento da planta ou aumentando a tolerância da planta ao estresse biótico ou abiótico, caracterizado pelo fato de que compreende:aplicar uma quantidade efetiva de um peptídeo isolado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, um polipeptídeo de fusão como definido na reivindicação 13, ou uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 14 a 18 a uma planta ou semente de planta ou ao local onde a planta está crescendo ou espera- se crescer, em que a referida aplicação é efetiva para conferir resistência à doença, potencializar o crescimento da planta, ou aumentar a tolerância da planta ao estresse biótico ou abiótico, em que o estresse biótico é selecionado a partir do grupo consistindo em insetos, aracnídeos, nematoides, ervas-daninhas, e combinação dos mesmos, ou em que o estresse abiótico é selecionado a partir do grupo consistindo em estresse por sal, estresse por água, estresse por ozônio, estresse por metal pesado, estresse pelo frio, estresse pelo calor, estresse nutricional, e combinações dos mesmos.
20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que confere resistência à doença e a doença é uma doença viral, uma doença bacteriana, ou uma doença fúngica.
21. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que potencializa o crescimento de plantas e o crescimento potencializado compreende vigor da planta melhorado, peso da planta aumentado, biomassa aumentada, número aumentado de flores por planta, produção de grão e/ou fruta superior, mais rebentos ou brotos laterais, folhas maiores, crescimento do broto aumentado, teor de proteína aumentado, teor de óleo aumentado, teor de amido aumentado, teor de pigmento aumentado, teor de clorofila aumentado, e combinações dos mesmos.
22. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a referida aplicação é realizada com uma planta.
23. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a referida aplicação é realizada com uma semente de planta, o referido método ainda compreendendo plantar a semente tratada com o peptídeo ou composição em solo natural ou artificial, e propagar uma planta da semente plantada no solo.
24. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a referida aplicação é realizada no local onde a planta está crescendo ou espera-se crescer.
25. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a planta é selecionada a partir de plantas agrícolas, silviculturais, ornamentais e hortícolas cada qual em sua forma natural ou geneticamente modificada.
26. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a planta a ser tratada é selecionada a partir do grupo consistindo em alfafa, maçã, abricó, espargo, abacates, bananas, cevada, feijão, faia (Fagus spec.), begônia, bétula, amora, mirtilo, couve, cânfora, canola, cenoura, planta de óleo de rícino, cereja, canela, cítricos, semente de cacau, café, milho, algodão, pepino, cucúrbita, eucalipto, abeto, linho, beterraba forrageira, fúcsia, alho, gerânio, uvas, amendoim, cânhamo, lúpulo, juneberry, juncea (Brassica juncea), juta, lentilha, alface, linhaça, melão, mostarda, carvalho, aveia, dendezeiro, colza de semente oleaginosa, azeite, cebola, páprica, ervilha, pêssego, pêra, pelargônio, pimentas, petúnia, pinho (Pinus spec.), álamo (Populus spec.), pomóideas, batata, colza, framboesa, arroz, seringueira, centeio, sorgo, soja, espinafre, abeto vermelho, abóbora, morango, beterraba, cana-de-açúcar, girassol, chá, teca, tabaco, tomate, triticale, relva, melancia, trigo e salgueiro (Salix spec.).
27. Método de modular a sinalização bioquímica da planta, caracterizado pelo fato de que compreende:aplicar uma quantidade efetiva de um peptídeo isolado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, um polipeptídeo de fusão como definido na reivindicação 13, ou uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 14 a 18 a uma planta ou semente de planta ou ao local onde a planta está crescendo ou espera- se crescer, em que a referida aplicação é efetiva para modular a sinalização bioquímica da planta.
28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a sinalização bioquímica da planta é selecionada a partir do grupo consistindo na indução de produção de óxido nítrico, produção de peróxido, ou um metabólito secundário; modulação agonística da série de reação de sinalização de etileno e indução da expressão de gene responsivo ao etileno; modulação agonística da série de reação de sinalização de ácido salicílico e indução da expressão de gene responsivo ao ácido salicílico; modulação agonística da série de reação do ácido abscísico e indução da expressão de gene responsivo ao ácido abscísico; modulação agonística da série de reação de sinalização de giberelina e indução da expressão de gene responsivo à giberelina; modulação antagonística da sinalização de ácido jasmônico e inibição da expressão de genes responsivos ao ácido jasmônico; indução da expressão do inibidor de protease; indução da produção de espécie de oxigênio reativo em tecidos de planta; indução da produção de peptídeo antimicrobiano e imunorrelacionado; e indução da expressão de gene de expansina e produção.
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