CN1454989A - 表达hrp基因的酵母基因工程菌株及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
表达hrp基因的酵母基因工程菌株及其构建方法，本发明涉及生物工程。该菌株名称为Saccharomycescerevisiae hrpZ，编号CCTCC NO：M203004。该菌株的构建方法，包括假单胞菌Pseudomonas syringae基因组DNA的提取；以基因组DNA为模板PCR引物对hrp Z重组酵母基因工程菌株的构建；含hrpZ基因的酵母转化和诱导。用该菌株生产的基因工程harpin蛋白，该蛋白具有诱导植物超敏感反应，激活植物体内自我防御机制，促进植物生长。田间药效实验表明其对植物病虫害防治有良好的效果。通过酵母基因工程菌株发酵，大量生产具有生物活性的harpin蛋白，作为植物抗菌抑菌剂的活性成分应用于植物保护和促进植物生长，从而提高作物的产量和质量。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程，具体地说是一种表达hrp基因的酵母基因工程菌株及其构建方法。
背景技术
hrp基因簇存在于多种植物致病性细菌中，它编码的Harpin蛋白是细菌致病性必需的一种蛋白，但对非寄主植物，它可引起植物的超敏感反应(Hypersensitive response)，其表现为受侵染组织的快速、局部的萎缩和死亡，这就限制病原菌进一步扩散的可能性。超敏感反应是植物自身具有的一种保护反应，类似于高等动物所具有的广谱抗病菌虫害的免疫反应。Harpin蛋白本身对细菌、病毒、真菌、线虫、昆虫无杀灭或抑制作用，而是通过与植物受体结合后产生某种信号，刺激或诱导植物自身的免疫机制来保护植物。因此用Harpin蛋白作为抗菌抑菌剂具有不污染环境、不产生抗性等优点，具有很大的市场潜力。
对于Harpin蛋白广谱抗菌的分子机理正处于研究阶段，现已知Harpin蛋白至少激活了3种植物信号转导途径，包括水杨酸依赖途径，乙烯/茉莉酮酸依赖途径和一种典型的抗细菌途径。通过这些途径诱导表达的与植物防御有关的基因包括PR1、PR2(水杨酸依赖途径控制)和PDF1.2、Thi2.1(乙烯/茉莉酮酸依赖途径控制)等。
Harpin蛋白必须首先与植物表面的受体结合才能激活植物自身的防御功能。这种受体首先在植物Arabidopsis中发现，命名为HrBP1，它全长284个氨基酸，分子量30kD，其后在其它12种单子叶和双子叶植物中发现了类似于HrBP1的蛋白，其氨基酸序列具有较高的保守性。国外现在对Erwinia amylovora，Pseudomonas syringae，Ralstoniasolanacearum，国内对Xanthomonas oryzae pv.oryzae中的hrp基因中的结构和功能进行了研究。
Harpin蛋白还具有促进植物生长和发育的功能。研究表明Harpin蛋白可以增强植物的光合作用，利于营养物质的摄取，因此可以促进种子萌发和植株发育，提高作物的产量和质量，增大植株个体，利于植物的早熟和结实。此外还有研究发现Harpin蛋白可以提高蔬菜、水果抗腐烂、霉变能力，延长贮藏时间。对这一现象的机制研究还不透彻，可能与细胞壁修饰基因，生长时相调节基因有关。
Harpin蛋白可以作为抗菌抑菌剂的活性成份广泛的应用于作物保护，特别是单子叶植物和双子叶植物，包括主要的农作物和经济作物、蔬菜等。比如大米、小麦、大麦、黑麦、棉花、玉米、花生、甘薯、大豆、豌豆、莴苣、大蒜、甘蓝、甜菜、萝卜、菠菜、 洋葱、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、南瓜、黄瓜、苹果、梨子、柑橘、草莓、葡萄、菠萝、烟草、番茄、高粱、甘蔗等；还包括一些装饰性植物如非洲堇、矮牵牛花、天竺葵、猩猩木、菊花、康乃馨、百日菊等。
Harpin蛋白应用于作物保护，具有不污染环境、对人畜安全，不产生抗药性等特点。能抑制或杀灭由细菌、病毒、真菌、线虫、昆虫导致的对植物产生的侵染和侵害，是一种新型的抗菌抑菌剂。可用于防治假单胞菌属、欧文氏菌属、黄单胞菌属等引起的细菌类疾病；镰孢属、疫霉属等引起的真菌类疾病；烟草花叶病毒和番茄花叶病毒等植物病毒类疾病。还可以增强植物的光合作用，利于营养物质的摄取，具有促进植物生长和发育的功能。此外，对于农作物、蔬菜害虫如棉铃虫、甜菜夜蛾、菜青虫等也有一定的趋避和控制作用。
目前Harpin蛋白的获得可以有两种方法，一是从植物致病性细菌培养物中提取该蛋白，但工艺复杂，收获量小，价格高，远远不能满足市场需要；二是用基因工程的方法，即通过基因工程菌株发酵，大量生产具有生物活性的Harpin蛋白，作为植物抗菌抑菌剂的活性成分应用于作物保护。现在国内外报道的生产Harpin蛋白都以大肠杆菌为最终表达载体，需要用IPTG为诱导物促进目标蛋白的表达，该诱导物价格较贵，工业化生产成本较高。生产Harpin蛋白以酵母为最终表达载体的未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表达hrp基因的酵母基因工程菌株及其构建方法。本发明涉及的是一种新型的hrp基因表达载体的构建，能够高效的，稳定的，低成本的表达出hrp基因蛋白，用于增强植物的抗逆能力，提高作物的产量和质量，有效防治病虫害。
一种表达hrp基因编码蛋白的酵母基因工程菌株，其特征是该菌株为一种酿酒酵母，名称为Saccharomyces cerevisiae hrpZ，简称hrpZ，已保藏在中国典型培养物保藏中心，编号CCTCC NO：M203004。
基因工程菌株hrpZ的构建方法
一、基因组DNA的提取及hrpZ基因的分离和克隆
1.基因组DNA的提取
从土壤中分离鉴定一株假单胞菌Pseudomonas syringae，按照QIAGEN公司基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA。
2.hrpZ基因分离
以假单胞菌Pseudomonas syringae基因组DNA为模板，用聚合酶链反应(PCR)扩增分离hrpZ基因，PCR引物序列如下：
正向：5’-ATGCAGAGTCTCAGTCTTAACAGCA-3’
反向：5’-AGTTCTCCGTCAGGCGGTTGTC-3’
PCR反应条件：
预变性：92℃-95℃，1-2分钟
变性： 90℃-95℃，30-60秒
复性： 65℃-72℃，30-60秒
延伸： 65℃-72℃，1-3分钟
循环： 30-50个
终止延伸：64℃-69℃ 15-30分钟
PCR产物通过1％琼脂糖电泳检测，回收片断大小约为1.5kb的PCR产物用于克隆表达；
3.hrpZ基因的克隆
通过低熔点琼脂糖回收片段大小适当的PCR产物，克隆至大肠杆菌E.coli表达载体pCRT7/NT-TOPO MCS(INVITROGEN公司)中，克隆方法参见载体说明书。通过限制性内切酶Nde I、Hind III酶切鉴定构建的重组质粒。
感受态大肠杆菌细胞的制备和转化方法如下
从35℃-38℃培养16-20hr的新鲜LB平板中取E.coli BL21单菌落，置3ml LB液体培养基试管中，37℃，200rpm培养过夜，再将菌液按1∶50-150比例接种于适量LB培养基中，37℃剧烈振荡培养约3hr(OD600＝0.3-0.5)，将菌液转入1.5ml无菌离心管，置冰上10min，待培养物预冷至4℃-7℃时，4,000rpm离10min，收集菌体，倒出培养液以0.5ml冰冷的0.1mol/LCaCl2重悬细胞，置冰上半小时后，4,000rpm离心10min，倒出上清，加入100μl冰冷0.1mol/L CaCl2重悬细胞。所制感受态细胞置4℃冰箱，并在12-24hr内使用。
在100μl E.coli BL21菌株感受态细胞中加入8μl待转化的连接产物DNA(DNA≤50ng)，轻旋以混匀内容物，置冰上30min，于42℃冰浴中热休克90s后，迅速移至冰浴中，待细胞冷却1-2min后，每管加入90μl SOC培养液(蛋白胨20g，酵母粉5g，NaCl 0.5g，250mMKCl10ml，5M Na0H调pH值至7.0，15磅20分钟高压灭菌。临用前加5ml已灭菌的2MMgCl2，20ml已灭菌的1M葡萄糖溶液)，置37℃，150rpm培养12-16小时后观察转化结果。
4.序列测定
将hrpZ基因定向克隆至质粒pHP10中，使用INVITROGEN公司提供的正向和反向引物进行序列测定分析，hrpZ基因的核苷酸序列为：
ATGCGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGGGATCTGTACGACGATGACGAIAAGGATCCAACCCTTATGCAGAGTCTCAGTCTTAACAGCATGAGTTCGTTGCAAACCTCTGCATCATTGTTCCCCGTGTCGCTCAACAGCGATGTGAGCGCCAACACCAGCACTTCCAGCAAAGAGCTCAAGGCTGTGATCGATCAGCTGGTTCAGGCGCTGACCCAAAGTGGGCAGCTCGATGAAACCTCACCGCTCGGCAAAATGCTCGCCAAGGCCATGGCTGCGGATGGCAAGTCGGCTAACAGCATCGATGACATCACTGCATCGCTCGACAAGCTGATCCACGAAAAGCTCGGCAACAATTTCGGTGCCTCTGCCGGCATCGGCGCGGGTGGCGGTGGCGGTGGCATTGGCGGGGCGGGTTCTGGTTCGGGTGTCGGTGGCGGTCTGAGCAGCGACGCGGGTGCCGGGCAATCCGATCTGATGAGCCAGGTCCTGAACGGCCTCGGCAAAGCCGTGCTGGACGATCTGCTGACACCGAGTGGTGAAGGCGGAACAACCTTTTCCAGTGATGACATGCCGACCCTGGAAAAAGTCGCCCGGTTCATGGACGACAACAAGGCCCAGTTCCCTACTCGGGACGGCGGCTCGTGGATGAACGAGCTGAAGGAAGACAATGGCCTGTATGCACAGGAAACCGCTCAGTTTCGTTCGGCTCTCGACGTCATTGGTCAACAGCTCGGCCAGCAACAAGGTGATGCCAGTGGCGTTACCAGTGGCGGCGGTCTGGGTTCGCCCGTGAGTGACAGCTCCCTGGGTAATCCTGCAATCGATGCCAACACAGGTCCCGCGGCCAATGGCAATGCCAGCGTCGACGTAGGTCAACTGATCGGTCAACTCATCGACCGTGGTTTGCAGTCGGTTTCGTCGGGTGGCGGTCTGGGTACACCGGTCGACAATTCCACGCAGCCGACAGGTGGCACGCCAGCGGCTAACCCGACGGGCAACGTGTCCAATCAGGACCTGGGTCAACTGCTGAACGGCTTGCTGCAACGCGGGCTGGAAGCGACGCTTCAGGATGCTGGCAACACCGGCGCCGACCTGCAATCGAGCGCTGCGCAAGTGGCAGCTCAGCTGATCAATGCGCTGTTGCAAGGCACCAATAACCAGACTAACCAGGCTGTGGCCTGA
hrpZ基因编码的氨基酸序列为：
MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDPTLMQSLSLNSMSSLQTSASLFPVSLNSDVSANTSTSSKELKAVIDQLVQALTQSGQLDETSPLGKMLAKAMAADGKSANSIDDITASLDKLIHEKLGNNFGASAGIGAGGGGGGIGGAGSGSGVGGGLSSDAGAGQSDLMSQVLNGLGKAVLDDLLTPSGEGGTTFSSDDMPTLEKVARFMDDNKAQFPTRDGGSWMNELKEDNGLYAQETAQFRSALDVIGQQLGQQQGDASGVTSGGGLGSPVSDSSLGNPAIDANTGPAANGNASVDVGQLIGQLIDRGLQSVSSGGGLGTPVDNSTQPTGGTPAANPTGNVSNQDLGQLLNGLLQRGLEATLQDAGNTGADLQSSAAQVAAQLINALLQGTNNQTNQAVA
二、hrpZ重组酵母基因工程质粒的构建
1、基因来源
用于构建酵母表达系统的hrpZ基因来自pHP 10
2、从pHP10中分离hrpZ基因
用PCR的方法从pHP10中分离hrpZ基因，PCR引物如下：
正向：5’CGTCTAGAACACCTTATGCAGAGTC 3’
反向：5’CGCGGCGCACCTCAGCTTCCTTT 3’
PCR反应参数：
预变性：92℃-95℃ 1-2分钟
变性： 92℃-94℃ 1-2分钟
复性： 52℃-55℃ 1-2分钟
延伸： 70℃-75℃ 1-2分钟
循环： 30-50个
终止延伸：70℃-75℃ 5分钟
3、重组质粒的构建
将琼脂糖电泳回收的PCR产物直接克隆至毕赤酵母表达载体pYES2.1/V5-His-TOPO(INVITROGEN公司)，转化大肠杆菌JM109，方法参见载体说明书。
4、包含hrpZ基因的重组质粒的验证
通过内切酶Xba I酶切重组质粒，包含hrpZ基因的重组质粒将被切为hrpZ基因和载体两条带，大小分别为1.5kb和5.9kb，证明该重组质粒构建正确。
三、含hrpZ基因的酵母的转化和诱导
1、酵母菌株
研究用酵母为Saccharomyces cerevisiae。
2、酵母转化
酵母转化过程如下：
(1)YPD培养基过夜培养酵母菌Saccharomyces cerevisiae，接种至新鲜的培养基中，培养至OD600值为0.5-0.7。
(2)离心收集细胞，用20ml缓冲液洗涤(9-11mM甘氨酸pH8.35，1M山梨醇，3％乙醇)。
(3)重悬细胞至2ml缓冲液中，分装。
(4)-80℃冻存。
(5)取200μl解冻的细胞加入1μg重组质粒DNA及50μg鲑鱼精子DNA载体。
(6)细胞解冻后应立即加入1ml转化缓冲液(18-22mM pH8.35甘氨酸，40％PEG1000)。
(7)30℃温浴1小时。
(8)离心收集细胞，沉淀用800μl细胞重悬缓冲液洗涤(10mMpH8.35甘氨酸，150mM NaCl)。
(9)离心收集细胞，沉淀重悬于300μl缓冲液中并涂布选择性培养基(尿嘧啶缺陷型酵母YPD培养基，依照INVITROGEN公司提供方法配制)。
3、酵母诱导
(1)接种15ml含有1.5％-3％棉子糖或1.5％-3％葡萄糖的选择性培养基。
(2)过夜培养
(3)沉淀菌体，洗涤2次。
(4)重悬菌体至含有1.5％-3％半乳糖的诱导性培养基中，菌体OD600值0.4。
(5)在第4、8、12、24小时取样检测hrpZ基因在酵母中的表达情况。
四、hrp基因工程蛋白的提取
参见Sambrook等在《分子克隆实验室手册》，(冷泉港，1989)中的说明进行：
(1)培养并离心收集酵母菌细胞；
以下所有步骤均在2℃-6℃进行。
(2)用1-2体积的玻璃珠破菌缓冲液重悬细胞。
(3)用2-4体积的玻璃珠破菌缓冲液与细胞混合，加4体积冰冷的酸洗玻璃珠。
(4)将细胞悬液转移到合适大小的玻璃珠搅拌容器中，并加玻璃珠破菌缓冲液至容器的边缘，但加到容器中的缓冲液不超过1个细胞悬液的体积。装好搅拌杆和螺盖，确保将容器中所有空气排尽，高速搅拌60s，冰上放置1-2min，重复3-5次。
(5)沉淀玻璃珠，轻轻倒出上清。加入2-4体积的玻璃珠破菌缓冲液，颠倒管5-10次，待玻璃珠沉淀后轻轻倒出上清，合并上清液。
(6)合并的上清液于4℃，12000g离心60min，收集上清即为抽提液。长期贮存时，将其分成小份于液氮中快速冷冻，-80℃贮存。
SDS-PAGE电泳分析hrpZ基因的表达情况
(1)凝胶的灌制
参见Sambrook等《分子克隆实验室手册》，(冷泉港，1989)的方法，配制8％的分离胶溶液15ml，依次混合各成分后加入催化剂TEMED(N，N，N’，N’四甲基乙二胺)，立即混匀开灌胶，封一层0.1％SDS(二烷基硫酸钠)覆盖液面，37℃下聚合30min。聚合完全后排净凝胶上的液体，以同样方法灌浓缩胶，插入梳子，避免产生气泡。
(2)上样及电泳
在酵母诱导发酵液中加等体积2倍SDS凝胶加样缓冲液，于100℃加热3-5min变性，按顺序加样，最后在所有不用的加样孔中加上等体积的加样缓冲液，以100V电泳至溴酚蓝进分离胶，提高电压至150V，当溴酚蓝到达底部前约1cm处结束电泳(约需4hr)。
(3)固定、染色和脱色
剥胶后以5倍体积染液固定并染色过夜(至少4小时以上)，将凝胶浸泡于脱色液中平缓摇动4hr以上，其间更换脱色液3次，脱色完全后即可进行观察和照相。
(4)电泳结果
如图2所示的hrpZ基因在酵母表达载体中的表达情况。
五、基因工程蛋白的活性测定
室内采用叶片穿刺接种法检测基因工程Harpin蛋白的生物活性，即引发植物超敏感反应的能力。
材料和方法
1供试烟草植株 武汉大学生科院基因工程药物及昆虫病毒分子生物学研究室盆栽苗，营养生殖期：6-8真叶。
2.测定方法——点样测活法：
用不锈钢毫针，经75％酒精消毒后，酒精灯外焰灼烧、冷却，于选定的烟草真叶的叶尖区，用毫针垂直刺穿叶片，孔径1mm，每孔间隔2.0cm左右，依次刺上4-6个小孔。用10-100μl的移液器，移取待测样品各40μl，分别点加在烟草真叶已刺小孔上，画图依次标明各孔处理项目，重复2次，将点样的烟草植株置25℃的恒温室，管理、观察。
3.观察供试烟草点样叶片的超敏感反应
每隔2小时对加样供试的烟草植株进行观察，观察加样部位有无萎缩、塌陷、枯死等现象反应。记录超敏感反应现象表现出的时间及程度。
本发明的有益效果是：
活性实验的结果表明，用该菌株生产的基因工程Harpin蛋白超敏感反应现象表现时间短，反应强烈，活性测定结果高于大肠杆菌表达载体表达的同类蛋白。这表明用酵母表达的该工程蛋白具有很强的生物活性。
在田间试验中，基因工程Harpin蛋白防治黄瓜细菌性角斑病防治效果达83.1％，对照化学农药为48.1％；对黄瓜花叶病毒病，基因工程Harpin蛋白的防治效果达100％，远远高于化学农药；对辣椒花叶病毒病和青枯病，基因工程Harpin蛋白的防治效果分别为95.7％、87.7％，均明显高于化学农药；防治茄子绵疫病，基因工程Harpin蛋白防效可达80.2％，明显优于化学农药的55.9％。
酵母表达过程中不需要价格较贵的诱导物。酵母工业化生产的技术路线成熟，适于工业化大生产。
附图说明
图1 重组hrpZ酵母基因工程菌株构建流程图。
图2 hrpZ基因在酵母中的表达情况。
具体实施方式
实施例1
基因工程菌株HrpZ的构建方法
一.基因组DNA的提取及hrpZ基因的分离和克隆
1.基因组DNA的提取
从土壤中分离鉴定一株假单胞菌Pseudomonas syringae，按照QIAGEN公司基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA。
2.hrpZ基因分离
以假单胞菌Pseudomonas syringae基因组DNA为模板PCR扩增分离hrpZ基因，PCR引物序列如下：
正向：5’-ATGCAGAGTCTCAGTCTTAACAGCA-3’
反向：5’-AGTTCTCCGTCAGGCGGTTGTC-3’
PCR反应条件：
预变性：94℃ 1分钟
变性： 92℃ 45秒
复性： 66℃ 45秒
延伸： 68℃ 2分钟
循环： 30个
终止延伸：68℃ 20分钟
PCR产物通过1％琼脂糖电泳检测，回收片断大小约为1.5kb的PCR产物用于克隆表达。
3.hrpZ基因的克隆
通过低熔点琼脂糖回收片段大小适当的PCR产物，克隆至大肠杆菌表达载体pCRT7/NT-TOPO MCS(INVITROGEN公司，如图1)中，克隆方法参见载体说明书。通过限制性内切酶Nde I、Hind III酶切鉴定构建的重组质粒。
感受态大肠杆菌细胞的制备和转化方法如下
从37℃培养16-20hr的新鲜LB平板中取E.coli BL21单菌落，置3ml LB液体培养基试管中，37℃，200rpm培养过夜，再将菌液按1∶100比例接种于适量LB培养基中，37℃剧烈振荡培养约3hr(OD600＝0.3-0.4)，将菌液转入1.5ml无菌离心管，置冰上10min，待培养物预冷至5℃时，4,000rpm离10min，收集菌体，倒出培养液以0.5ml冰冷的0.1mo l/LCaCl2重悬细胞，置冰上半小时后，4,000rpm离心10min，倒出上清，加入100μl冰冷0.1 mol/L CaCl2重悬细胞。所制感受态细胞置4℃保藏，并在12-24hr内使用。
在100μl E.coli BL21菌株感受态细胞中加入8μl待转化的连接产物DNA(DNA≤50ng)，轻旋以混匀内容物，置冰上30min，于42℃冰浴中热休克90s后，迅速移至冰浴中，待细胞冷却1-2min后，每管加入90μl SOC培养液(蛋白胨20g，酵母粉5g，NaCl0.5g，250mMKCl10ml，5M NaOH调pH值至7.0，15磅20分钟高压灭菌。临用前加5ml已灭菌的2MMgCl2，20ml已灭菌的1M葡萄糖溶液)，置37℃，150rpm培养12-16小时后观察转化结果。
4.序列测定
将hrpZ基因定向克隆至质粒pHP10中，使用INVITROGEN公司提供的正向和反向引物进行序列测定分析，hrpZ基因的序列测定结果如上所述。
二hrpZ重组酵母基因工程菌株的构建
基因来源
用于构建酵母表达系统的hrpZ基因来自包含该基因的质粒pHP10。
1、从pHP10中分离hrpZ基因
用PCR的方法从pHP10中分离hrpZ基因，PCR引物如下：
正向：5’CGTCTAGAACACCTTATGCAGAGTC 3’
反向：5’CGCGGCGCACCTCAGCTTCCTTT 3’
PCR反应参数：
预变性：94℃ 1分钟
变性： 94℃ 1分钟
复性： 55℃ 1分钟
延伸： 72℃ 1分钟
循环： 30个
终止延伸：72℃ 5分钟
2、重组质粒的构建
将琼脂糖电泳回收的PCR产物直接克隆至毕赤酵母表达载体pYES2.1/V5-His-TOPO(INVITROGEN公司)，方法参见载体说明书。
3、包含hrpZ基因的重组质粒的验证
通过内切酶XbaI酶切重组质粒，包含hrpZ基因的重组质粒将被切为hrpZ基因和载体两条带，大小分别为1.5kb和5.9kb，证明该重组质粒构建正确。
三酵母转化和诱导
a酵母菌株
研究用酵母为Saccharomyces cerevisiae。
b酵母转化
酵母转化过程如下：
1、YPD培养基过夜培养酵母菌Saccharomyces cerevisiae，接种至新鲜的培养基中，培养至OD600值为0.6。
2、离心收集细胞，用20ml缓冲液洗涤(10mM甘氨酸pH8.35，1M山梨醇，3％乙醇)。
3重悬细胞至2ml缓冲液中，分装。
4、-80℃冻存。
5、取200μl解冻的细胞加入1μg重组质粒DNA及50μg鲑鱼精子DNA载体。
6细胞解冻后应立即加入1ml转化缓冲液(20mM pH8.35甘氨酸，40％PEG1000)。
7、30℃温浴1小时。
8、离心收集细胞，沉淀用800μl细胞重悬缓冲液洗涤(10mMpH8.35甘氨酸，150mM NaCl)。
9、离心收集细胞，沉淀重悬于300μl缓冲液中并涂布选择性培养基(尿嘧啶缺陷型酵母YPD培养基，依照INVITROGEN公司提供方法配制)。
c酵母诱导
①接种15ml含有2％棉子糖或2％葡萄糖的选择性培养基。
②过夜培养
③沉淀菌体，洗涤2次。
④重悬菌体至含有2％半乳糖的诱导性培养基中，菌体OD600值0.4。
⑤在第4、8、12、24小时取样检测hrpZ基因在酵母中的表达情况。
d基因工程蛋白的提取
参见Sambrook等在《分子克隆实验室手册》，(冷泉港，1989)中的说明进行：
(1)培养并离心收集酵母菌细胞；
以下所有步骤均在4℃进行。
(2)用1体积的玻璃珠破菌缓冲液重悬细胞。
(3)用2体积的玻璃珠破菌缓冲液与细胞混合，加4体积冰冷的酸洗玻璃珠。
(4)将细胞悬液转移到合适大小的玻璃珠搅拌容器中，并加玻璃珠破菌缓冲液至容器的边缘，但加到容器中的缓冲液不超过1个细胞悬液的体积。装好搅拌杆和螺盖，确保将容器中所有空气排尽，高速搅拌60s，冰上放置1-2min，重复3-5次。
(5)沉淀玻璃珠，轻轻倒出上清，加入2-4体积的玻璃珠破菌缓冲液，颠倒管5-10次，待玻璃珠沉淀后轻轻倒出上清，合并上清液。
(6)合并的上清液于4℃，12000g离心60min，收集上清即为抽提液。长期贮存时，将其分成小份于液氮中快速冷冻，-80℃贮存。
SDS-PAGE电泳分析hrp基因的表达情况
(1)凝胶的灌制
参见Sambrook等《分子克隆实验室手册》，(冷泉港，1989)的方法，配制8％的分离胶溶液15ml，依次混合各成分后加入催化剂TEMED(N，N，N’，N’四甲基乙二胺)，立即混匀开灌胶，封一层0.1％SDS(二烷基硫酸钠)覆盖液面，37℃下聚合30min。聚合完全后排净凝胶上的液体，以同样方法灌浓缩胶，插入梳子，避免产生气泡。
(2)上样及电泳
在酵母诱导发酵液中加等体积2×SDS凝胶加样缓冲液，于100℃加热3-5min变性，按顺序加样，最后在所有不用的加样孔中加上等体积的加样缓冲液，以100V电泳至溴酚蓝进分离胶，提高电压至150V，当溴酚蓝到达底部前约1cm处结束电泳(约需4hr)。
(3)固定、染色和脱色
剥胶后以5倍体积染液固定并染色过夜(至少4小时以上)，将凝胶浸泡于脱色液中平缓摇动4hr以上，其间更换脱色液3次，脱色完全后即可进行观察和照相。
(4)电泳结果
如图2所示的hrpZ基因在酵母表达载体中的表达情况。
Claims (9)
1、一种表达hrp基因编码蛋白的酵母基因工程菌株，其特征是该菌株为一种酿酒酵母，名称为Saccharomyces cerevisiae hrpZ，已保藏在中国典型培养物保藏中心，编号CCTCC NO：M203004。
2、根据权利要求1所述的菌株，其特征是hrpZ基因的核苷酸序列为：
ATGCGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGGGATCTGTACGACGATGACGATAAGGATCCAACCCTTATGCAGAGTCTCAGTCTTAACAGCATGAGTTCGTTGCAAACCTCTGCATCATTGTTCCCCGTGTCGCTCAACAGCGATGTGAGCGCCAACACCAGCACTTCCAGCAAAGAGCTCAAGGCTGTGATCGATCAGCTGGTTCAGGCGCTGACCCAAAGTGGGCAGCTCGATGAAACCTCACCGCTCGGCAAAATGCTCGCCAAGGCCATGGCTGCGGATGGCAAGTCGGCTAACAGCATCGATGACATCACTGCATCGCTCGACAAGCTGATCCACGAAAAGCTCGGCAACAATTTCGGTGCCTCTGCCGGCATCGGCGCGGGTGGCGGTGGCGGTGGCATTGGCGGGGCGGGTTCTGGTTCGGGTGTCGGTGGCGGTCTGAGCAGCGACGCGGGTGCCGGGCAATCCGATCTGATGAGCCAGGTCCTGAACGGCCTCGGCAAAGCCGTGCTGGACGATCTGCTGACACCGAGTGGTGAAGGCGGAACAACCTTTTCCAGTGATGACATGCCGACCCTGGAAAAAGTCGCCCGGTTCATGGACGACAACAAGGCCCAGTTCCCTACTCGGGACGGCGGCTCGTGGATGAACGAGCTGAAGGAAGACAATGGCCTGTATGCACAGGAAACCGCTCAGTTTCGTTCGGCTCTCGACGTCATTGGTCAACAGCTCGGCCAGCAACAAGGTGATGCCAGTGGCGTTACCAGTGGCGGCGGTCTGGGTTCGCCCGTGAGTGACAGCTCCCTGGGTAATCCTGCAATCGATGCCAACACAGGTCCCGCGGCCAATGGCAATGCCAGCGTCGACGTAGGTCAACTGATCGGTCAACTCATCGACCGTGGTTTGCAGTCGGTTTCGTCGGGTGGCGGTCTGGGTACACCGGTCGACAATTCCACGCAGCCGACAGGTGGCACGCCAGCGGCTAACCCGACGGGCAACGTGTCCAATCAGGACCTGGGTCAACTGCTGAACGGCTTGCTGCAACGCGGGCTGGAAGCGACGCTTCAGGATGCTGGCAACACCGGCGCCGACCTGCAATCGAGCGCTGCGCAAGTGGCAGCTCAGCTGATCAATGCGCTGTTGCAAGGCACCAATAACCAGACTAACCAGGCTGTGGCCTGA
hrpZ基因编码的氨基酸序列为：
MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDPTLMQSLSLNSMSSLQTSASLFPVSLNSDVSANTSTSSKELKAVIDQLVQALTQSGQLDETSPLGKMLAKAMAADGKSANSIDDIFASLDKLIHEKLGNNFGASAGIGAGGGGGGIGGAGSGSGVGGGLSSDAGAGQSDLMSQVLNGLGKAVLDDLLTPSGEGGTTFSSDDMPTLEKVARFMDDNKAQFPTRDGGSWMNELKEDNGLYAQETAQFRSALDVIGQQLGQQQGDASGVTSGGGLGSPVSDSSLGNPAIDANTGPAANGNASVDVGQLIGQLIDRGLQSVSSGGGLGTFPVDNSTQPTGGTPAANPTGNVSNQDLGQLLNGLLQRGLEATLQDAGNTGADLQSSAAQVAAQLINALLQGTNNQTNQAVA
3、一种表达hrp基因编码蛋白的酵母基因工程菌株的构建方法，其特征包括：一、基因组DNA的提取和hrpZ基因的分离与克隆；二、hrpZ重组酵母基因工程菌株的构建；三、含hrpZ基因的酵母的转化和诱导；
一、基因组DNA的提取和hrpZ基因的分离与克隆
假单胞菌Pseudomonas syringae基因组DNA的提取，以假单胞菌Pseudomonas syringae基因组DNA为模板PCR扩增分离hrpZ基因；PCR扩增分离的hrpZ基因使用的载体为大肠杆菌载体pCRT7/NT-TOPO MCS，hrpZ基因克隆至质粒pHP 10中进行序列测定；
二、hrpZ重组酵母基因工程菌株的构建
用于构建酵母表达系统的hrpZ基因来自质粒pHP 10；用PCR的方法从pHP 10中分离hrpZ基因；使用直接克隆至毕赤酵母表达载体pYES2.1/V5-his-TOPO；
三、含hrpZ基因的酵母的转化和诱导。
4、根据权利要求3所述的构建方法，hrpZ基因的分离和克隆，其特征是：hrpZ基因分离，以假单胞菌Pseudomonas syringae基因组DNA为模板PCR扩增分离hrpZ基因，PCR引物序列如下：
正向：5’-ATGCAGAGTCTCAGTCTTAACAGCA-3’
反向：5’-AGTTCTCCGTCAGGCGGTTGTC-3’
PCR反应条件：
预变性：92℃-95℃，1-2分钟
变性： 90℃-95℃，30-60秒
复性： 65℃-72℃，30-60秒
延伸： 65℃-72℃，1-3分钟
循环： 30-50个
终止延伸：64℃-69℃ 15-30分钟
PCR产物通过1％琼脂糖电泳检测，回收片断大小约为1.5kb的PCR产物用于克隆表达；
hrpZ基因的克隆，通过低熔点琼脂糖回收片段大小适当的PCR产物，克隆至大肠杆菌表达载体pCRT7/NT-TOPO MCS中，通过限制性内切酶Nde I、Hind III酶切鉴定构建的重组质粒。
5、根据权利要求4所述的构建方法，hrpZ基因的克隆，其特征是感受态大肠杆菌细胞的制备和转化方法如下：
从35℃～38℃培养16～20hr的新鲜LB平板中取E.coli BL21单菌落，置3ml LB液体培养基试管中，37℃，200rpm培养过夜，再将菌液按1∶50-150比例接种于适量LB培养基中，37℃剧烈振荡培养约3hr，OD600＝0.3-0.5，将菌液转入1.5ml无菌离心管，置冰上10min，待培养物预冷至4℃-7℃时，4,000rpm离心10min，收集菌体，倒出培养液以0.5ml冰冷的0.1mol/LCaCl2重悬细胞，置冰上半小时后，4,000rpm离心10min，倒出上清，加入100μl冰冷0.1mol/L CaCl2重悬细胞；所制感受态细胞置4℃冰箱，并在12-24hr内使用；
在100μl E.coli BL21菌株感受态细胞中加入8μl待转化的连接产物DNA，DNA≤50ng，轻旋以混匀内容物，置冰上30min，于42℃冰浴中热休克90s后，迅速移至冰浴中，待细胞冷却1-2min后，每管加入90μl SOC培养液，培养液组成为蛋白胨20g，酵母粉5g，NaCl 0.5g，250mMKCl 10ml，5M NaOH调pH值至7.0，15磅20分钟高压灭菌；临用前加5ml已灭菌的2MMgCl2，20ml已灭菌的1M葡萄糖溶液；置37℃，150rpm培养12-16小时后观察转化结果。
6、根据权利要求3所述的构建方法，hrpZ重组酵母基因工程菌株的构建，其特征是：
基因来源
用于构建酵母表达系统的hrpZ基因来自pHP 10；
从pHP 10中分离hrpZ基因
用PCR的方法从pHP 10中分离hrpZ基因，PCR引物如下：
正向：5’CGTCTAGAACACCTTATGCAGAGTC 3’
反向：5’CGCGGCGCACCTCAGCTTCCTTT 3’
PCR反应参数：
预变性：92℃-95℃ 1-2分钟
变性： 92℃-94℃ 1-2分钟
复性： 52℃-55℃ 1-2分钟
延伸： 70℃-75℃ 1-2分钟
循环： 30-50个
终止延伸：70℃-75℃ 5分钟
重组质粒的构建
将琼脂糖电泳回收的PCR产物直接克隆至毕赤酵母，所用表达载体为pYES2.1/V5-His-TOPO；
包含hrpZ基因的重组质粒的验证
通过内切酶Xba I酶切重组质粒，包含hrpZ基因的重组质粒将被切为hrpZ基因和载体两条带，大小分别为1.5kb和5.9kb。
7、根据权利要求3所述的构建方法，含hrpZ基因的酵母的转化和诱导，其特征是：
酵母菌株
研究用酵母为Saccharomyces cerevisiae，
一、酵母转化
酵母转化过程如下：
(1)、YPD培养基过夜培养酵母菌Saccharomyces cerevisiae，接种至新鲜的培养基中，培养至OD600值为0.5-0.7；
(2)、离心收集细胞，用20ml缓冲液洗涤，缓冲液组成为：9-11mM甘氨酸pH8.35，1M山梨醇，3％乙醇；
(3)、重悬细胞至2ml缓冲液中，分装；
(4)、-80℃冻存；
(5)、取200μl解冻的细胞加入1μg重组质粒DNA及50μg鲑鱼精子DNA载体；
(6)、细胞解冻后应立即加入1ml转化缓冲液，缓冲液组成为18-22mM pH8.35甘氨酸，40％PEG1000；
(7)、30℃温浴1小时；
(8)、离心收集细胞，沉淀用800μl细胞重悬缓冲液洗涤，缓冲液组成为10mM pH8.35甘氨酸，150mM NaCl；
(9)、离心收集细胞，沉淀重悬于300μl缓冲液中并涂布选择性培养基，培养基为尿嘧啶缺陷型酵母YPD培养基；
二、酵母诱导
(1)、接种15ml含有1.5％-3％棉子糖或1.5％-3％葡萄糖的选择性培养基；
(2)、过夜培养；
(3)、沉淀菌体，洗涤2次；
(4)、重悬菌体至含有1.5％-3％半乳糖的诱导性培养基中，菌体OD600值0.4；
(5)、在第4、8、12、24小时取样检测hrpZ基因在酵母中的表达情况。
8、一种hrp基因工程蛋白的提取方法，其特征是：
(1)培养并离心收集酵母菌细胞；
以下所有步骤均在2℃-6℃进行；
(2)用1-2体积的玻璃珠破菌缓冲液重悬细胞；
(3)用2-4体积的玻璃珠破菌缓冲液与细胞混合，加4体积冰冷的酸洗玻璃珠；
(4)将细胞悬液转移到合适大小的玻璃珠搅拌容器中，并加玻璃珠破菌缓冲液至容器的边缘，但加到容器中的缓冲液不超过1个细胞悬液的体积；装好搅拌杆和螺盖，确保将容器中所有空气排尽，高速搅拌60s，冰上放置1-2min，重复3-5次；
(5)沉淀玻璃珠，轻轻倒出上清，加入2-4体积的玻璃珠破菌缓冲液，颠倒管5-10次，待玻璃珠沉淀后轻轻倒出上清，合并上清液；
(6)合并的上清液于4℃，12000g离心60min，收集上清即为抽提液；长期贮存时，将其分成小份于液氮中快速冷冻，-80℃贮存；
SDS-PAGE电泳分析hrpZ基因的表达情况：
(1)凝胶的灌制
配制8％的分离胶溶液15ml，依次混合各成分后加入催化剂N，N，N’，N’四甲基乙二胺，立即混匀并灌胶，封一层0.1％的二烷基硫酸钠覆盖液面，37℃下聚合30min，聚合完全后排净凝胶上的液体，以同样方法灌浓缩胶，插入梳子，避免产生气泡；
(2)上样及电泳
在酵母诱导发酵液中加等体积2倍的二烷基硫酸钠凝胶加样缓冲液，于100℃加热3-5min变性，按顺序加样，最后在所有不用的加样孔中加上等体积的加样缓冲液，以100V电泳至溴酚蓝进分离胶，提高电压至150V，当溴酚蓝到达底部前约1cm处结束电泳；
(3)固定、染色和脱色
剥胶后以5倍体积染液固定并染色过夜，将凝胶浸泡于脱色液中平缓摇动4hr以上，其间更换脱色液3次，脱色完全后即可进行观察和照相；
(4)电泳结果
得到hrpZ基因在酵母表达载体中的表达情况。
9、根据权利要求8所述的方法，提取的hrp基因工程蛋白的活性测定，其特征是：
基因工程蛋白的活性测定
室内采用叶片穿刺接种法检测基因工程Harpin蛋白的生物活性，即引发植物超敏感反应的能力；
材料和方法
(1).供试烟草植株 武汉大学生科院基因工程药物及昆虫病毒分子生物学研究室盆栽苗，营养生殖期：6-8真叶；
(2).测定方法——点样测活法：
用不锈钢毫针，经75％酒精消毒后，酒精灯外焰灼烧、冷却，于选定的烟草真叶的叶尖区，用毫针垂直刺穿叶片，孔径1mm，每孔间隔2.0cm左右，依次刺上4-6个小孔，用10-100μl的移液器，移取待测样品各40μl，分别点加在烟草真叶已刺小孔上，画图依次标明各孔处理项目，重复2次，将点样的烟草植株置25℃的恒温室，管理、观察；
(3).观察供试烟草点样叶片的超敏感反应
每隔2小时对加样供试的烟草植株进行观察，观察加样部位有无萎缩、塌陷、枯死等现象反应，记录超敏感反应现象表现出的时间及程度。
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