CN101063090A

CN101063090A - 人苍白杆菌zjb－061及其应用

Info

Publication number: CN101063090A
Application number: CN 200610050592
Authority: CN
Inventors: 郑裕国; 徐亚蓉; 柳志强; 沈寅初
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2006-04-29
Filing date: 2006-04-29
Publication date: 2007-10-31

Abstract

本发明提供了一种从土壤中筛选到的微生物菌株人苍白杆菌ZJB－061(Ochrobactrum anthropi ZJB－061)，及其在催化β－氨基丙腈制备β－氨基丙酸中的应用。所述人苍白杆菌ZJB－061保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No：M 206039，保藏日期2006年4月14日。将人苍白杆菌ZJB－061菌种接种到适用于人苍白杆菌的发酵培养基中、并在所述的发酵培养基中添加少量的β－氨基丙腈，进行发酵培养，然后对发酵液进行离心，得到菌体，将菌体细胞或处理过的菌体细胞添加到含有β－氨基丙腈溶液中进行水解反应，最后对转化液进行分离，即得所述的β－氨基丙酸。本发明通过筛选得到一株新的菌株来生物法合成β－氨基丙酸，代替化学合成的方法。具有转化率高，环境友好，过程绿色等优点。

Description

人苍白杆菌ZJB-061及其应用

(一)技术领域

本发明涉及从土壤中筛选到的微生物新菌株人苍白杆菌ZJB-061(Ochrobactrum anthropi ZJB-061)，及其在催化β-氨基丙腈制备β-氨基丙酸中的应用。

(二)背景技术

β-氨基丙酸是制备泛酸钙的重要中间体，维生素B₃(泛酸)由泛解酸和β-氨基丙酸组成，存在于一切组织之中，它是辅酶A的成分，是体内能量代谢中不可缺少的成分。泛酸参与碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢，特别是对脂肪的合成与代谢起十分重要的作用。泛酸还是形成乙酰胆碱所必需的物质。缺乏泛酸可使动物生长速度下降，皮肤受损，神经系统紊乱，抗体形成受阻。

β-氨基丙酸还是合成肌肽、帕米磷酸钠、巴柳氮的前体。β-氨基丙酸还被应用于电镀，也用于微生物和生物化学等研究，它本身也可用于铅中毒解毒剂，还可用于合成甜味剂等。

生产β-氨基丙酸的方法有多种，目前研究较多的是化学法生产，主要有三种[徐克勋，精细有机化工原料及中间体手册，北京，化学工业出版社，2002，1998，445-446]：

1、丙烯腈法：

2、β-氨基丙腈法：

2NH₂CH₂CH₂CN+Ba(OH)₂→(NH₂CH₂CH₂COO)₂Ba+N₂

3、琥珀酰亚胺降解法(霍氏反应)：

以上三种方法均需强碱或强酸等参与反应，试剂损耗大，对环境不友好，而且收率不高。

由于此法存在着一系列化学法生产的缺点，因此利用生物技术法来来代替化学法是一种趋势。人们一直试图寻求一种生物技术的方法来生产β-氨基丙酸。

日本人及川等在土壤中分离到两株能将β-氨基丙腈分解为β-氨基丙酸的菌株产碱菌(Alcaligenes sp.)OMT-MY14和(aminobacter aminobrance)ATCC23314(公开特许公报：10-42885)。

(三)发明内容

本发明的目的是为了提供一株可将β-氨基丙腈水解为β-氨基丙酸的新的微生物菌株；其次是提供一种利用该微生物催化水解β-氨基丙腈生产β-氨基丙酸的方法。

为达到发明目的本发明采用的技术方案是：

人苍白杆菌ZJB-061(Ochrobactrum anthropi ZJB-061)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No：M206039，保藏日期2006年4月14日，提议的分类命名为人苍白杆菌ZJB-061。

所述人苍白杆菌ZJB-061由如下方法筛选得到：

以β-氨基丙腈为唯一氮源，甘油为唯一碳源，加入基本的无机离子，从土样(采自杭州各个地方)中筛选具有水解β-氨基丙腈生产β-氨基丙酸的腈水解酶类活力的微生物菌株。

筛选培养基：甘油4g/L，MgCl₂ 0.4g/L，Na₂HPO₄ 2g/L，KH₂PO₄ 1g/L，灭菌后添加3mL/L的β-氨基丙腈。

(1)初筛

从浙江各个地区采集土壤样品，称取1.0g土壤，装入含50mL水的250mL三角瓶中，用玻璃珠打散，吸取1mL接入筛选培养基(250mL三角瓶，装液量50mL)，摇床培养(150rpm，30℃，96h)。

(2)复筛

在筛选培养基上长出菌体的培养液稀释不同的梯度，进行平板涂布，挑取不同的单菌落接种到筛选培养基中进行培养72h，离心得到菌体，取0.5g离心得到的菌体，加入10mL磷酸缓冲液，震荡混匀于50mL带塞子的三角瓶中，添加30μL β-氨基丙腈，30℃水浴转化4h。离心，上清用薄板层析法快速定性检测是否含有β-氨基丙酸。具有转化能力的菌种即为我们目标要筛选的微生物菌株，从150个土样中我们筛选到一个具有转化活力的微生物苍白杆菌ZJB-061。

用于筛选微生物的土样来自各种可分离到微生物的样品，如果园、农田、污水处理站等。

所述的人苍白杆菌ZJB-061细胞形态为杆状，长度2～4μm，宽度0.8～1.2μm，无鞭毛、革兰氏染色阳性；所述的人苍白杆菌ZJB-061的生理生化特征的详细科学描述见表1：

表1：人苍白杆菌ZJB-061菌株生理生化特征科学描述

细胞形态

杆状

长度	2～4μm
长度	2～4μm	宽度	0.8～1.2μm
鞭毛	无	宽度	0.8～1.2μm
鞭毛	无	革兰氏染色	阳性
孢子	芽孢	革兰氏染色	阳性
孢子	芽孢	明胶水解	+
酯酶(Tween80)	-	明胶水解	+
酯酶(Tween80)	-	酪氨酸水解	+
淀粉水解	+	酪氨酸水解	+
淀粉水解	+	运动性	-
卵磷酯酶	+	运动性	-
卵磷酯酶	+	酪素水解	+
硝酸盐还原	+	酪素水解	+
硝酸盐还原	+	反硝化实验	-
甲基红实验	+	反硝化实验	-
甲基红实验	+	脱氢酶	-
H₂O₂酶	+	脱氢酶	-
H₂O₂酶	+	柠檬酸盐利用	+
V-P试验	-	柠檬酸盐利用	+
V-P试验	-	ONPG试验	-
苯丙氨酸脱氨酶	-	ONPG试验	-
苯丙氨酸脱氨酶	-	亚硝酸还原	-
牛奶分解	还原	亚硝酸还原	-
牛奶分解	还原	3-酮基乳糖	-
脲酶试验	-	3-酮基乳糖	-
脲酶试验	-	吲哚试验	-
鸟氨酸脱羧酶	-	吲哚试验	-
鸟氨酸脱羧酶	-	赖氨酸脱羧酶	-
精氨酸脱羧酶	+	赖氨酸脱羧酶	-
精氨酸脱羧酶	+	产H₂S试验	+
丙二酸盐试验	-	产H₂S试验	+

注：表中+表示阳性，-表示阴性

以提取到的细胞总DNA为模板，利用引物p16S-8：5′-aga gttt gat cct ggctca g-3′和p16S-1541：5′-aag gag gtg atc cag ccg ca-3′扩增菌株的16S rDNA基因，将PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，经PCR扩增成功获得了一长约为1.5kb的片段，经测序确认该片段实际长度为1422bp，其序列如下：

GGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGCCCCGCAAGGGGAGCGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAACGTACCTTTTGCTACGGAATAACTCAGGGAAACTTGTGCTAATACCGTATGTGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATCGGCAAAGGATCGGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCACCGGTGAAGATAATGACGGTAACCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGACTTTTAAGTCAGGGGTGAAATCCCGGGGCTCAACCCCGGAACTGCCTTTGATACTGGAAGTCTTGAGTATGGTAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGACCATTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGTTAGCCGTTGGGGAGTTTACTCTTCGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAACATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCCCTTGACATACCGGTCGCGGACACAGAGATGTGTCTTTCAGTTCGGCTGGACCGGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGGGACTGCCGGTGATAAGCCGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGCAGCGAGCACGCGAGTGTGAGCTAATCTCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTTTTACCCGAAGGCGCTGTGCTAACCGCAAGGAGGCAGGCGACCACGGTAGGGTCAGCGACTGGGGTGAAGTCGTAA。

将该序列(已提交GenBank，GenBank登记号为No.DQ468351)与GenBank中相关数据进行相似性分析发现，与人苍白杆菌的同源性最高(homology，100％/1422 bps，based on 16S rDNA)。同已知的细菌16S rDNA序列进行比对，利用Phylips(version 3.572)软件构建进化树，确定菌株的进化地位，生理生化鉴定结合分子鉴定，可确认该菌株为人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)，拟命名为Ochrobactrum anthropi ZJB-061。

由β-氨基丙腈通过水解作用制备β-氨基丙酸主要反应为：

所述的人苍白杆菌ZJB-061主要用于制备β-氨基丙酸。所述的方法是将人苍白杆菌ZJB-061菌种接种到适用于人苍白杆菌的发酵培养基中、并在所述的发酵培养基中添加终浓度为10～60mmol/L的β-氨基丙腈，进行发酵培养，然后对发酵液进行离心，得到菌体，将菌体细胞或处理过的菌体细胞添加到含有β-氨基丙腈溶液中进行水解反应，最后对转化液进行分离，即得所述的β-氨基丙酸。所述处理过的菌体细胞是指经处理后得到的粗酶、固定化细胞、固定化酶。

用于本发明培养菌种的培养基是一些含有可以被上述菌株利用营养物质，通常所用的培养基含有：碳源(例如葡萄糖，甘油，麦芽糖)，有机营养物质(如酵母膏，蛋白胨，牛肉膏，玉米浆)，无机营养成分(如磷酸盐，镁，钾、铁)等，另外还要加入少量的β-氨基丙腈作为诱导剂，诱导微生物在培养的过程中产生水解腈到酸的腈水解酶。优选的，所述发酵培养基组成为：葡萄糖5～12％，MgCl₂ 0.01～1.0％，Na₂HPO₄ 0.1～0.5％，KH₂PO₄ 0.05～0.2％，酵母膏0.2～0.6％，余量为去离子水，将发酵培养基分装、灭菌，接入斜面人苍白杆菌ZJB-061菌种，并添加终浓度10～60mmol/L的β-氨基丙腈；培养条件为：pH6～8、温度28～32℃下培养3～4天。本发明中培养基组成以重量/体积百分比计算，某物质浓度为1％表示100mL溶液中含有1g该物质。

按照上述方法培养3～4天，然后通过离心等方法分离出细胞。再将细胞或处理过的细胞(粗酶、固定化细胞、固定化酶等)悬浮在缓冲液中，然后加入底物β-氨基丙腈，进行水解反应。

上述加入底物β-氨基丙腈的方式有多种，可以一次性加入，也可以逐渐地，以可控制的方式连续加入腈化合物，底物浓度最大可以达到150mmol/L。

β-氨基丙腈在细胞或处理过的细胞的生物催化作用下转化为β-氨基丙酸，反应液中大约含有3％～5％(湿重)的细胞和大约50～150mmol/L的β-氨基丙腈。

所述水解反应的反应条件为：反应温度30～40℃，反应pH 5～9，反应3～10小时。优选的，所述水解反应在磷酸盐缓冲液(0.2N，pH6.0)转化体系中，最佳转化温度为30-35℃，β-氨基丙腈转化为β-氨基丙酸的转化率达到92％以上。

本发明中作为生物催化剂的微生物细胞或处理过的细胞(粗酶、固定化细胞、固定化酶等)可以重复利用。

所述转化液分离方法为：将转化液离心分离，上清首先调pH至4-5，通过柱I(WA-2树脂，用氨水洗脱)去除大部分的无机离子，然后蒸掉大部分氨水，通过柱II(D201-FC树脂，用盐酸洗脱)去除β-氨基丙腈以及一些无机阳离子；最后通过柱III(WA-2树脂，用氨水洗脱)，去除前一洗脱液中的盐酸等杂质，收集β-氨基丙酸，浓缩结晶，得到的β-氨基丙酸纯度达到95％以上。

具体的，所述β-氨基丙酸制备方法如下：

(1)发酵培养：发酵培养基组成葡萄糖10％，MgCl₂ 0.4％，Na₂HPO₄ 2％，KH₂PO₄ 1％，酵母膏3％，用去离子水配制，pH自然；将发酵培养基分装、灭菌，接入斜面人苍白杆菌ZJB-061菌种，并添加终浓度10～60mmol/L的β-氨基丙腈，摇床转速150r/min，pH6.5-7.5，温度28-32℃条件下培养3.5天；

(2)催化水解：发酵液离心收集菌体，加于0.2N、pH6.0的磷酸盐缓冲液中，添加终浓度为50～150mmol/L的β-氨基丙腈，pH7.0、30℃水浴中转化3～10小时；

(3)产物分离：上清首先调pH至4-5，通过柱I(WA-2树脂，用氨水洗脱)去除大部分的无机离子，然后蒸掉大部分氨水，通过柱II(D201-FC树脂，用盐酸洗脱)去除β-氨基丙腈以及一些无机阳离子；最后通过柱III(WA-2树脂，用氨水洗脱)，浓缩结晶，得所述的β-氨基丙酸。

本发明中所用到的分析方法：

(1)薄板层析法定性检测：薄板层析法：展开剂为乙醇∶蒸馏水＝85∶15；点样体积2μL；展开时间40min；以0.2％的茚三酮溶液为显色剂。β-氨基丙酸R_f＝0.2133，β-氨基丙腈R_f＝0.4067。

(2)高效液相色谱法：β-氨基丙酸和β-氨基丙腈的衍生化方法：取0.2mL样品，再依次加入1mL 0.5mol/L的NaHCO₃溶液、0.8mL蒸馏水和0.5mL的衍生化试剂(二硝基氟苯，浓度为3％，用乙腈配置)，在60℃下水浴避光反应30min后，取出并加入7.5mL的pH为7.0的磷酸盐缓冲液(NaH₂PO₄和Na₂HPO₄浓度都是0.2mol/L，前者与后者混合的体积比是39∶61，未有特殊说明下同)，就可以进样了。以甲醇：0.05mol/L的乙酸和乙酸钠溶液(55∶45)为流动相；C18色谱柱(250nm×4.6nm)；流速：1.0mL/min；柱温：30℃。可以对转化液中β-氨基丙酸和β-氨基丙腈进行定量检测。

本发明的有益效果主要体现在：通过筛选得到新的菌株来生物法合成β-氨基丙酸，代替化学合成方法。具有转化率高，环境友好，过程绿色等优点。

(四)附图说明

图1为人苍白杆菌ZJB-061同相关菌株的进化树。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

从斜面将人苍白杆菌ZJB-061接种至100mL灭菌后的发酵培养基中：葡萄糖10g/L，MgCl₂ 0.4g/L，Na₂HPO₄ 2g/L，KH₂PO₄ 1g/L，酵母膏3g/L。再添加终浓度为44.7mmol/L的β-氨基丙腈，培养4天后发酵液冷冻离心(4℃，13000rpm，10min)，去上清，磷酸盐缓冲液洗涤，同样方法离心。取0.5g离心得到的湿菌体，加入10mL磷酸盐缓冲液，震荡混匀于50mL带塞子的三角瓶中，添加0.447mmol(即30μL)β-氨基丙腈，30℃水浴转化2.5h。离心，上清通过柱前衍生高效液相色谱法进行检测。转化率达98％。

将转化液离心分离，上清首先调pH至4，通过柱I：WA-2树脂(购自安徽烷东化工厂)，用氨水洗脱，去除大部分的无机离子，然后蒸掉大部分氨水，通过柱II：D201-FC树脂(购自漂莱特(中国)有限公司)，用盐酸洗脱，去除β-氨基丙腈以及一些无机阳离子；最后通过柱III：WA-2树脂(购自安徽烷东化工厂)，用氨水洗脱，去除前一洗脱液中的盐酸等杂质，收集β-氨基丙酸，浓缩结晶，得到β-氨基丙酸，纯度达到95％。

实施例2：

从斜面将人苍白杆菌ZJB-061接种至100mL发酵灭菌后的培养基中：甘油4g/L，MgCl₂ 0.4g/L，Na₂HPO₄ 2g/L，KH₂PO₄ 1g/L，酵母膏3g/L。再添加终浓度为44.7mmol/L的β-氨基丙腈，培养5天后发酵液冷冻离心(4℃，13000rpm，10min)，去上清，磷酸盐缓冲液洗涤，同样方法离心。取0.5g离心得到的湿菌体，加入10mL磷酸盐缓冲液，震荡混匀于50mL带塞子的三角瓶中，添加0.746mmol(即50μL)β-氨基丙腈，30℃水浴转化6h。离心，上清通过柱前衍生高效液相色谱法进行检测。转化率达92％。

实施例3：

从斜面将人苍白杆菌ZJB-061接种至100mL发酵灭菌后的培养基中：葡萄糖8g/L，MgCl₂ 0.3g/L，Na₂HPO₄ 1.5g/L，KH₂PO₄ 1.5g/L，再添加终浓度为44.7mmol/L的β-氨基丙腈，培养4天后发酵液冷冻离心(4℃，13000rpm，10min)，去上清，磷酸盐缓冲液洗涤，同样方法离心。取0.5g离心得到的湿菌体，加入10mL磷酸盐缓冲液，震荡混匀于50mL带塞子的三角瓶中，添加0.447mmol(即30μL)β-氨基丙腈，30℃水浴转化2.5h。离心，通过高效液相色谱法进行检测。转化率达91.2％。

实施例4：

从斜面将人苍白杆菌ZJB-061接种至100mL发酵灭菌后的培养基中：葡萄糖10g/L，MgCl₂ 0.4g/L，Na₂HPO₄ 2g/L，KH₂PO₄ 1g/L，酵母膏5g/L，再添加终浓度为59.6mmol/L的β-氨基丙腈，培养3.5天后发酵液冷冻离心(4℃，13000rpm，10min)，去上清，磷酸盐缓冲液洗涤，同样方法离心。取0.5g离心得到的湿菌体，加入10mL磷酸盐缓冲液，震荡混匀于50mL带塞子的三角瓶中，添加1.04mmol(即70μL)β-氨基丙腈，30℃水浴转化10h。离心，上清通过柱前衍生高效液相色谱法进行检测。转化率达88％。

实施例5：

从斜面将人苍白杆菌ZJB-061接种至100mL灭菌后的发酵培养基中：葡萄糖8g/L，MgCl₂ 0.3g/L，Na₂HPO₄ 2g/L，KH₂PO₄ 1.5g/L，酵母膏5g/L，再添加终浓度为44.7mmol/L的β-氨基丙腈，培养5天后发酵液冷冻离心(4℃，13000rpm，10min)，去上清，磷酸盐缓冲液洗涤，同样方法离心。取0.3g离心得到的湿菌体，加入10mL磷酸盐缓冲液，震荡混匀于50mL带塞子的三角瓶中，添加0.447mmol(即30μL)β-氨基丙腈，30℃水浴转化3h。离心，上清通过柱前衍生高效液相色谱法进行检测。转化率达89％。

实施例6：

从斜面将人苍白杆菌ZJB-061接种至100mL灭菌后的发酵培养基中：葡萄糖8g/L，MgCl₂ 0.3g/L，Na₂HPO₄ 2g/L，KH₂PO₄ 1.5g/L，酵母膏5g/L，再添加终浓度为44.7mmol/L的β-氨基丙腈，培养5天后发酵液离心(13000rpm，10min)，去上清，蒸馏水洗涤，同样方法离心。取0.3g离心得到的湿菌体，加入蒸馏水中，震荡混匀于50mL带塞子的三角瓶中，添加0.447mmol(即30μL)β-氨基丙腈，30℃水浴转化3h。离心，上清通过柱前衍生高效液相色谱法进行检测。转化率达85％。

序列表.WorkFile

Application Project

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<120>Title：人苍白杆菌ZJB-061及其应用

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<213>OrganismName：

<400>PreSequenceString：

gggctcagaa cgaacgctgg cggcaggctt aacacatgca agtcgagcgc cccgcaaggg

60

gagcggcaga cgggtgagta acgcgtggga acgtaccttt tgctacggaa taactcaggg

120

aaacttgtgc taataccgta tgtgcccttc gggggaaaga tttatcggca aaggatcggc

180

ccgcgttggat tagctagtt ggtgaggtaa aggctcacca aggcgacgat ccatagctgg

240

tctgagagga tgatcagcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca

300

gcagtgggga atattggaca atgggcgcaa gcctgatcca gccatgccgc gtgagtgatg

360

aaggccctag ggttgtaaag ctctttcacc ggtgaagata atgacggtaa ccggagaaga

420

agccccggct aacttcgtgc cagcagccgc ggtaatacga agggggctag cgttgttcgg

480

atttactggg cgtaaagcgc acgtaggcgg acttttaagt caggggtgaa atcccggggc

540

tcaaccccgg aactgccttt gatactggaa gtcttgagta tggtagaggt gagtggaatt

600

ccgagtgtag aggtgaaatt cgtagatatt cggaggaaca ccagtggcga aggcggctca

660

ctggaccatt actgacgctg aggtgcgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct

720

ggtagtccac gccgtaaacg atgaatgtta gccgttgggg agtttactct tcggtggcgc

780

agctaacgca ttaaacattc cgcctgggga gtacggtcgc aagattaaaa ctcaaaggaa

840

ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgcagaac

900

cttaccagcc cttgacatac cggtcgcgga cacagagatg tgtctttcag ttcggctgga

960

ccggatacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc

1020

cgcaacgagc gcaaccctcg cccttagttg ccagcattta gttgggcact ctaaggggac

1080

tgccggtgat aagccgagag gaaggtgggg atgacgtcaa gtcctcatgg cccttacggg

序列表.WorkFile

1140

ctgggctaca cacgtgctac aatggtggtg acagtgggca gcgagcacgc gagtgtgagc

1200

taatctccaa aagccatctc agttcggatt gcactctgca actcgagtgc atgaagttgg

1260

aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca

1320

ccgcccgtca caccatggga gttggtttta cccgaaggcg ctgtgctaac cgcaaggagg

1380

caggcgacca cggtagggtc agcgactggg gtgaagtcgt aa

1422

<212>Type：DNA

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SequenceName：ZJB-061菌株的16s rDNA序列

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agagtttgat cctggctcag

20

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SequenceName：引物p16S-8

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aaggaggtga tccagccgca

20

<212>Type：DNA

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SequenceName：引物p16S-1541

SequenceDescription：

Claims

1.人苍白杆菌ZJB-061(Ochrobactrum anthropi ZJB-061)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No：M 206039，保藏日期2006年4月14日。

2.如权利要求1所述的人苍白杆菌ZJB-061，其特征在于：所述的人苍白杆菌ZJB-061细胞形态为杆状，长2～4μm、宽0.8～1.2μm，无鞭毛、有芽孢，革兰氏染色阳性；所述的人苍白杆菌ZJB-061生化实验明胶水解阳性，酪氨酸水解阳性，淀粉水解阳性，酪素水解阳性，硝酸盐还原阳性，反硝化实验阴性，甲基红实验阳性，脱氢酶阴性，过氧化酶阳性。

3.如权利要求1所述的人苍白杆菌ZJB-061，其特征在于：所述的人苍白杆菌ZJB-061的16S rDNA序列如下：

GGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACACATGCAA

GTCGAGCGCCCCGCAAGGGGAGCGGCAGACGGGTGAGTAA

CGCGTGGGAACGTACCTTTTGCTACGGAATAACTCAGGGAAA

CTTGTGCTAATACCGTATGTGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATC

GGCAAAGGATCGGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGAGGT

AAAGGCTCACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGG

ATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCT

ACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAG

CCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGT

TGTAAAGCTCTTTCACCGGTGAAGATAATGACGGTAACCGGA

GAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT

ACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGATTTACTGGGCGTAAAGC

GCACGTAGGCGGACTTTTAAGTCAGGGGTGAAATCCCGGGG

CTCAACCCCGGAACTGCCTTTGATACTGGAAGTCTTGAGTAT

GGTAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGT

AGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGG

ACCATTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAAC

AGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATG

TTAGCCGTTGGGGAGTTTACTCTTCGGTGGCGCAGCTAACGC

ATTAAACATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAAC

TCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATG

TGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCCCTTG

ACATACCGGTCGCGGACACAGAGATGTGTCTTTCAGTTCGGC

TGGACCGGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGT

CGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTC

GCCCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGGGACT

GCCGGTGATAAGCCGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGT

CCTCATGGCCCTTACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATG

GTGGTGACAGTGGGCAGCGAGCACGCGAGTGTGAGCTAATC

TCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGAG

TGCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCC

GCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAC

ACCATGGGAGTTGGTTTTACCCGAAGGCGCTGTGCTAACCGC

AAGGAGGCAGGCGACCACGGTAGGGTCAGCGACTGGGGTG

AAGTCGTAA。

4.如权利要求1～3之一所述的人苍白杆菌ZJB-061在制备β-氨基丙酸中的应用。

5.如权利要求4所述的人苍白杆菌ZJB-061在制备β-氨基丙酸中的应用，其特征在于：所述的应用是将人苍白杆菌ZJB-061菌种接种到适用于人苍白杆菌的发酵培养基中、并在所述的发酵培养基中添加终浓度为10～60mmol/L β-氨基丙腈，进行发酵培养，然后对发酵液进行离心，得到菌体，将菌体细胞或处理过的菌体细胞添加到含有β-氨基丙腈的溶液中进行水解反应，最后对转化液进行分离，即得所述的β-氨基丙酸。

6.如权利要求5所述的人苍白杆菌ZJB-061在制备β-氨基丙酸中的应用，其特征在于：所述发酵培养基组成为：葡萄糖5～12％，MgCl₂0.01～1.0％，Na₂HPO₄0.1～0.5％，KH₂PO₄0.05～0.2％，酵母膏0.2～0.6％，余量为去离子水；发酵培养条件为：pH6～8、温度28～32℃下培养3～4天。

7.如权利要求5所述的枯草杆菌ZJB-061在微生物水解制备β-氨基丙酸中的应用，其特征在于所述水解反应的反应条件为：反应温度30～40℃，反应pH 5～9，反应3～10小时。

8.如权利要求5所述的枯草杆菌ZJB-061在微生物水解制备β-氨基丙酸中的应用，其特征在于所述水解反应在0.2N、pH6.0的磷酸盐缓冲液转化体系中进行。

9.如权利要求5所述的人苍白杆菌ZJB-061在微生物水解制备β-氨基丙酸中的应用，其特征在于所述转化液的分离方法为：将转化液离心分离，上清调pH至4-5，通过柱I：WA-2树脂、用氨水洗脱，收集洗脱液蒸掉大部分氨水，再通过柱II：D201-FC树脂、用盐酸洗脱，最后通过柱III：WA-2树脂、用氨水洗脱，浓缩结晶，得所述的β-氨基丙酸。

10.如权利要求5所述的人苍白杆菌ZJB-061在微生物水解制备β-氨基丙酸中的应用，其特征在于所述β-氨基丙酸制备方法如下：(1)发酵培养：发酵培养基组成：葡萄糖10％，MgCl₂0.4％，Na₂HPO₄2％，KH₂PO₄1％，酵母膏3％，用去离子水配制，pH自然；将发酵培养基分装、灭菌，接入斜面人苍白杆菌ZJB-061菌种，并添加终浓度10～60mmol/L的β-氨基丙腈，摇床转速150r/min，pH6.5-7.5，温度28-32℃条件下培养3.5天；

(3)产物分离：将转化液离心分离，上清调pH至4-5，通过柱I：WA-2树脂、用氨水洗脱，收集洗脱液蒸掉大部分氨水，接着通过柱II：D201-FC树脂、用盐酸洗脱，洗脱液再通过柱III：WA-2树脂、用氨水洗脱，浓缩结晶，得所述的β-氨基丙酸。