DE69122100T2 - Verfahren zur auslösung pflanzenschützender mechanismen - Google Patents

Verfahren zur auslösung pflanzenschützender mechanismen

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Description

    Anwendungsgebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung bezieht sich auf Verfahren zum Induzieren von Pflanzen-Abwehr-Mechanismen. Diese Erfindung bezieht sich insbesondere auf Verfahren zum Induzieren der Bildung von Pflanzen-Abwehr-Proteinen, beispielsweise Proteinase-Inhibitoren, und auf Verfahren zur Förderung der Resistenz von Pflanzen gegen Insekten, Pathogene oder Viren durch Induzieren der Expression von Pflanzen-Abwehr- Genen.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Schäden an Kulturpflanzen (Ernteschäden) durch Insekten und andere Pathogene einschließlich Viren haben zu beträchtlichen wirtschaftlichen Verlusten und zu einer Abnahme der jährlichen landwirtschaftlichen Produktion geführt. Der Mensch hat daher einen breiten Bereich von Pestizid-, Fungizid-, Bakterizid- und Antiviren-Chemikalien geschaffen und angewendet, um die Schäden durch diesen biologischen Streß an Lebensmitteln und anderen Pflanzenfrüchten zu vermindern. Obgleich sich einige Chemikalien als hochwirksam in bezug auf die Verminderung der Insektenschäden an wertvollen landwirtschaftlichen Ernteerträgen erwiesen haben, bleiben doch viele Probleme bei der weit verbreiteten Anwendung vieler Chemikalien, die ihre praktische Anwendbarkeit beschränken. So verbleibt beispielsweise der Chemikalien-Auftrag in der Regel nur einen vorübergehenden Schutz und muß mit variierender Häufigkeit wiederholt werden in Abhängigkeit von Faktoren, wie der Auftragszeit während der Wachstumssaison, der Lebenszyklus-Stufe der behandelten Organismen, den Witterungsbedingungen und dem Geschick, den Kenntnissen und den Fachkenntnissen der Person, welche die Chemikalien-Behandlung, durchführt. Beim Ausbringen werden in der Regel alle Organismen in dem Bereich den chemischen Schutzmitteln ausgesetzt, wodurch sowohl vorteilhafte als auch schädliche Organismen geschädigt werden. Außerdem sind viele Chemikalien für Mensch und Tier toxisch und ihre weit verbreitete Anwendung hat einen nachteiligen Einfluß auf die Umwelt.
  • Andere Versuche, biologische Streß-Schäden an Kulturpflanzen zu vermindern, waren z.B. die selektive Züchtung von Pflanzen, um eine genetische Expression oder Amplifikation der natürlichen Resistenz-Eigenschaften zu erzielen. Die Gesamtheit der erwünschten Merkmale kann jedoch unter der Kontrolle vieler Gene stehen und es kann schwierig sein, sie von unerwünschten Merkmalen zu unterscheiden. Ein typisches unerwünschtes Ergebnis einer erwünschten Merkmals-Expression oder -Amplifikation durch Pflanzenzüchtungsverfahren ist die Ausbeuteabnahme, ein wirtschaftlich unerwünschter Nebeneffekt. Daher besteht eine starke Nachfrage nach neuen und verbesserten Verfahren zur Erzielung einer Expression von natürlichen Resistenz-Eigenschaften in Kulturpflanzen.
  • Signale, die von angreifenden Organismen abgegeben werden, beispielsweise Pflanzen- und Fungi-Zellwand-Fragmente, sogenannte Oligouronide (pflanzlichen Ursprungs) und und β-Glucane und Chitosane (die aus Fungi stammen) lösen die Aktivierung eines Spektrums von Abwehr-Genen aus, die Proteinase-Inhibitor-Proteine umfassen. Es ist die kombinierte Expression mehrerer dieser Gene (in Abhängigkeit von der Pflanze) auf einmal, die Resistenz gegenüber dem Angriff von Insekten, Mikroorganismen und/oder Viren verleiht. Die Erforschung der direkten Effekte der Proteinase-Inhibitoren in der Pflanzen-Abwehr gegen Insekten ist viel schneller fortgeschritten als die Erforschung der anderen Abwehr-Chemikalien und die Regulierung und Expression der Proteinase-Inhibitor-Gene hat zu einem Modell für die Untersuchung der Expression aller Gene, die für die Abwehr-Chemikalien codieren, geführt.
  • Proteinase-Inhibitor-Proteine sind bei allen Lebensformen zu finden und sie umfassen eine der häufigsten Klassen von Proteinen in der Welt. Das Blut höherer Tiere enthält beispielsweise kumulativ mehr als 200 mg verschiedener Proteinase-Inhibitor-Proteine pro 100 ml Serum (M. Laskowski Jr. und I. Kato, "Protein Inhibitors of Proteinases" in "Ann. Rev. Biochem." 49:593-626, 1980). In dem Pflanzenreich enthalten die meisten Speicherorgane wie Samen und Wurzelknollen 1 bis 10 % ihrer Proteine als Inhibitoren verschiedener Typen von proteolytische Enzymen (C.A. Ryan, "Proteinase Inhibitors" in "The Biochemistry of Plants, A Comprehensive Treatise" (P.K. Stumpf und E.E. Conn, eds), Band 6, S. 351-371, Academic Press, New York, 1981) und einige Früchte enthalten bis zu 50 % ihrer Proteine als Inhibitoren von Serin-Endoproteinasen (G. Pearce, D. Liljegren und C.A. Ryan, "Proteinase Inhibitors in Wild Tomato Species" in "Tomato Biotechnology" (D.J. Nevins und R.A. Jones, eds), S. 139-144, R. Alan Liss, Inc., New York, 1987). Proteinase-Inhibitoren wurden für alle vier Klassen von Proteasen (Serin-, Cystein-, Metall- und Asparagyl-Proteinasen) identifiziert und im Falle der Serin-Proteinase-Inhibitoren wurden mehrere nicht-homologe Familien isoliert und charakterisiert (M. Laskowski Jr., I. Kato, W.J. Kohr, J.S. Park, M. Tashiro und H.E. Whatley, "Positive Darwinian Selection of Protein Inhibitors of Serine Proteinases" in "Cold Spring Harbor Symposium in Quantitative Biology", im Druck).
  • Die Funktionen der Inhibitoren scheinen in der Natur zweifach zu sein: (1) die Verhinderung einer unkontrollierten Proteolyse innerhalb der Zellen, Organellen oder Flüssigkeiten (Fluids), wo eine begrenzte Proteolyse wichtig ist für biochemische oder physiologische Prozesse, oder (2) der Schutz von Proteinen von Zellen, Flüssigkeiten (Fluids) oder Geweben gegen fremde proteolytische Enzyme. Die spezifischen Rollen der meisten bekannten Proteinase-Inhibitoren sind jedoch noch nicht ausreichend geklärt. Daraus resultiert ein Mangel an Detailkenntnissen darüber, wie die Proteolyse in vielen, wenn nicht in den meisten, Verfahren in der Natur reguliert wird. Die Säugetier-Protein-Digestion und die Blutgerinnung gehören zu den am meisten untersuchten und am besten verstandenen proteolytischen Systemen (H. Neurath, "Evolution of Proteolytic Enzymes" in "Science" 224: 350-363, 1984). Die Enzyme wurden über Jahre hinweg in bezug auf die strukturellen und mechanistischen Prozesse und erst neuerdings in bezug auf die Gen-Regulierung untersucht. Eine solche umfangreiche Detail-Information in bezug auf die Struktur, die Funktion und die Regulierung der meisten anderen komplexen proteolytischen Systeme, beispielsweise der posttranslatorischen Modifikation, der Protein-Verarbeitung, des Protein-Umsatzes, des Protein-Umbaus und dgl., sind noch nicht verfügbar (J. Bond und P.E. Butler, "Intracellular Proteases" in "Ann. Rev. Biochem." 56: 336- 364, 1987). Vor kurzem gewonnene interessante neue Einsichten in den intrazellulären Protein-Umsatz in prokaryontischen und eukaryontischen Zellen haben die Rollen von ATP, Ubiquitin und Calmodulin und Calcium bei der Regulierung des Protein-Abbaus aufgezeigt. Es wurden Beziehungen gefunden zwischen den Strukturen von Proteinen und ihren Halbwertszeiten in Zellen, Organellen und Flüssigkeiten (Fluids) (Bond, supra; M. Rechsteiner, S. Rogers und K. Rote, "Protein Structure and Intracellular Stability" in "TIBS" 12: 390-394, 1987; J.F. Dice, "Molecular Determinants of Protein Half-lives in Eukaryotic Cells" in "FASEB J.", 349-357, 1987).
  • Die Rollen der Proteinase-Inhibitoren in den meisten dieser Prozesse, wenn sie überhaupt eine spielen, sind kaum bekannt.
  • Neurath, supra, hat vorgeschlagen, daß in primitiven Organismen die Kontrolle (Steuerung) der Proteolyse wahrscheinlich mit Proteinase-Inhibitoren erzielt wird. Später, als komplexere biochemische und physiologische Systeme entwickelt wurden, wurden komplexere Mechanismen zur Kontrolle der proteolytischen Aktivität gefunden, beispielsweise die Zymogen-Aktivierung und die Abschnitt - Bildung (compartmentation) sowie feinere Kontrollen durch Proteinase-Inhibitoren. Pflanzen scheinen Reste der primitiven Kontroll-Mechanismen für die Proteolyse beibehalten zu haben. Es werden verhältnismäßig hohe Gehalte an Proteinase-Inhibitoren synthetisiert und in Pflanzengeweben gespeichert, in denen sie mit Pflanzen-Schädlingen oder - Pathogenen in Wechselwirkung treten können, die versuchen, sie aufzuzehren (Ryan, supra). Die Effekte der Proteinase- Inhibitoren auf die Insektenverdauungs-Enzyme wurde zuerst untersucht von Birk et al in den frühen Sechziger Jahren (Ryan, supra). Aus diesen und anderen Forschungsarbeiten in vielen Laboratorien innerhalb der nächsten 20 Jahre wurde klar, daß die Abwehrrolle von Proteinase-Inhibitoren nur ein Teil einer komplexen Wechselwirkung war zwischen den vielen Abwehr-Chemikalien, die in Pflanzen vorhanden sind oder induziert werden, und den Predatoren und Pathogenen, welche die Pflanzen angreifen. Pflanzen befinden sich seit hunderten von Millionen Jahren mit ihren Predatoren im Kriegszustand und sie haben verschiedene und manchmal komplexe chemische Abwehr-Waffen entwickelt. Dieses Arsenal umfaßt Inhibitoren der digestiven proteolytischen Enzyme der angreifenden Schädlinge (D.F. Rhoades "Evolution of Plant Chemical Defense against Herbivores" in "Herbivores: Their Interaction with Secondary Plant Metabolites" (G. Rosenthal und D.H. Janzen eds) S. 4-55, Academic Press, Inc., New York, 1979).
  • Die Verdauungs-Prozesse höherer Tiere, Insekten und Mikroorganismen können beträchtlich variieren sowohl in bezug auf die Klassen der für die Protein-Digestion verwendeten Enzyme als auch in bezug auf ihre Spezifitäten.
  • So müssen bei der Berücksichtigung der Fähigkeiten irgendeines Proteinase-Inhibitors in einem Pflanzengewebe, eine Fremd-Protease zu inhibieren, die entweder von einem Mikroorganismus sekretiert oder in den Verdauungstrakt eines Herbivors freigesetzt wird, die mechanistische Klasse und die Peptidbindungs-Spezifität der Proteinase sowie strukturelle Aspekte des inhibitors berücksichtigt werden, die seine Fähigkeit, mit dem Enzym spezifisch in Wechselwirkung zu treten, bestimmen (Laskowski, 1980, supra; M. Laskowski Jr., I. Kato, W. Ardelt, J. Cook, A. Denton, M.W. Empie, W.J. Kohr, J.S. Park, K. Parks, B.L. Schartzley, O.L. Schoenberger, M. Tashiro, G. Bichot, H.E. Whatley, A. Wieczorek und M. Wieczorek, "Ovomucoid Third Domain from 100 Avian Species: Isolation, Sequences, and Hypervariability of Enzyme-Inhibitor Contact Residues" in "Biochem." 26: 202-221, 1987). Die Assoziationskonstante der Wechselwirkung muß eine ausreichende Größenordnung haben, um das Enzym wirksam zu inhibieren. Die Assoziationskonstanten der meisten Protease-Inhibitor-Wechselwirkungen betragen 10&sup6;M bis 10¹&sup0;M und sie sind manchmal höher (Laskowski, 1980, supra).
  • Inhibitoren von Serin-Proteasen haben ein weit höheres Interesse gefunden als die anderen Klassen von Proteinase-Inhibitoren. Die Natur hat offensichtlich Serin- Endopeptidase-Inhibitoren mehrmals erfunden, was zu mindestens 13 Familien führte, wie sie in der folgenden Tabelle 1 angegeben sind. Tabelle 1 Familien der Protein-Inhibitoren der Serin-Proteinase
  • Keine der in der Tabelle 1 angegebenen Familien zeigt eine Homologie mit irgendeiner anderen Familie. Alle Inhibitoren von Serin-Proteinasen verwenden den gleichen konkurrierenden Inhibierungs-Mechanismus. Forscher in vielen Laboratorien haben innerhalb der vergangenen 20 Jahre zur Aufklärung der Struktur, der Chemie und des Mechanismus der Wirkung der Serin-Proteinase-Inhibitoren beigetragen (Laskowski, 1980, supra; Laskowski, im Druck, supra). Kurz zusammengefaßt bestimmt die Seitenkette der P&sub1;-Reste der reaktiven Zentren der Inhibitoren ihre Spezifitäten. Es ist dieser der Rest, der das Enzym als potentielles Substrat erkennt. Die P&sub1;-Reste der reaktiven Zentren einiger repräsentativer Serin-Proteinase-Inhibitoren sind in der folgenden Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2 Reaktive Zentren von Proteinase-Inhibitoren, codiert durch verschiedene Inhibitor-Gene oder -cDNAs
  • Wenn die Seitenkette des P&sub1;-Restes in die Spezifitäts Tasche des Enzyms eintritt, treten an der Grenzfläche etwa 200 nicht-kovalente Van der Waals- und Wasserstoff- Bindungs-Kontakte auf, die nur einige wenige Aminosäuren umfassen. Die kumulative Energie der Wechselwirkungen friert die beiden Proteine praktisch zu einem stabilen Komplex ein, in dem das Enzym die Hydrolyse der Peptid-Bindung nicht vervollständigen kann und der Komplex kann auch nicht leicht dissoziieren.
  • Die Anwesenheit eines geringen Prozentsatzes an Gesamt-Nahrungsmittel-Proteinen wie Serin-Proteinase- Inhibitoren, kann starke Auswirkungen auf die Verdauungs- Physiologie von Tieren einschließlich Insekten haben. In Labortieren können Trypsin-Inhibitoren die wirksame Konzentration an Trypsin, die dem Tier für die Digestion (Verdauung) zur Verfügung steht, herabsetzen. Dadurch wird seinerseits die Wirksamkeit von Trypsin in bezug auf die Aktivierung anderer Proenzyme, die von dem Pankreas sekretiert werden, herabgesetzt. Außerdem können die Trypsin- Inhibitor-Komplexe Feed-Back-Mechanismen auslösen, die den Pankreas dazu anregen, eine Überproduktion von Verdauungsenzymen zu erzeugen, während sie dem Magen und dem Gehirn signalisieren, den Freßtrieb des Tieres zu vermindern. Ein länger anhaltendes Zuführen der Inhibitoren kann dazu führen, daß es unmöglich ist, Aminosäuren aus dem Nahrungsmittel abzuleiten und daß es unmöglich ist, essentielle Aminosäuren, die in den sekretierten Verdauungsenzymen vorhanden sind, zu recyclisieren.
  • Untersuchungen über die Effekte der Lebensmittel- Proteinase-Inhibitoren auf das Wachstum und die Entwicklung von Insekten, seien sie nun künstlich in definierte Nahrungsmittel eingeführt oder in Pflanzengeweben bereits vorhanden, haben gezeigt, daß die nativen Inhibitoren für das Wachstum und die Entwicklung von Insekten nachteilig sind für eine Vielzahl von Genera wie Heliothis, Spodoptera, Diabiotica und Tribolium (Ryan, supra; Broadway, supra; Rechsteiner, supra). Diese Antinährstoff-Eigenschaft wird wahrscheinlich verstärkt durch oder verstärkt selbst andere Antinährstoffe oder toxische Chemikalien, die Teil der Gruppe von Abwehr-Chemikalien der Pflanzen sind. Die Proteinase-Inhibitoren ergeben daher, obgleich sie selbst keine hohe Toxizität aufweisen, einen Satz von Genen, mit denen Pflanzen transformiert werden können zur Untersuchung sowohl fundamentaler als auch angewandter Aspekte der Pflanzenabwehr gegen Herbivoren und Pathogene.
  • Die große Anzahl von bekannten, in der Natur vorkommende Proteinase-Inhibitoren umfaßt einen breiten Bereich von Inhibitor-Spezifitäten. Umfangreiche Untersuchungen hinsichtlich der Beziehungen zwischen den Strukturen an den reaktiven Zentren von Vogel-Ovomucoiden (Serin- Proteinase-Inhibitoren) von 100 Species haben gezeigt, daß 8 der 11 Aminosäuren, die an den Kontakten zwischen Serin- Proteinasen und ihren Inhibitoren beteiligt sind, hypervariabel sind (Laskowski, 1987, supra), d.h. daß diese Aminosäuren schneller mutieren als der Rest der Aminosäuren der Inhibitoren. In den Enzymen liegt die entgegengesetzte Situation vor. Die aktiven Zentren-Reste mutieren nicht so schnell wie die Reste, die nicht an der Enzym-Wirkung beteiligt sind. Dies zeigt, daß einige Umwelt-Belastungen diese Hypervariabilität lenken (Laskowski, 1987, supra). Eine Möglichkeit für dieses Phänomen kann darin bestehen, daß eine natürliche Selektion der Proteinase-Inhibitor- Spezifitäten stattgefunden hat als Antwort auf ein sich änderndes Spektrum von Proteinasen, von angreifenden Predatoren und Pathogenen.
  • Neben in der Natur vorkommenden Proteinase-Inhibitoren sind vor kurzem mehrere Serin-Proteinase-Inhibitor- Gene und/oder cDNAs isoliert und zur Transformation von Pflanzen mit Fremd-Proteinase-Inhibitor-Genen verwendet worden, um ihnen Abwehr-Kräfte zu verleihen. So sind beispielsweise in der europäischen Patentanmeldungs- Publikation Nr. 0272144 und in dem Artikel von V.A. Hilder et al., "A Novel Mechanism of Insect Resistance Engineered into Tobacco" in "Nature", 330:160-163 (1967), eine cDNA, die für einen Cowpea-Trypsin-Inhibitor (CpTI), der mit einem konstitutiven CaMV-Promotor und einem Nopalin- Synthase-Terminator fusioniert ist, codierent, und die Verwendung des Konstrukts zur Transformation von Tabak- Pflanzen beschrieben. Der CpTI-Trypsin-Inhibitor wurde konstitutiv in den Blättern von transformierten Pflanzen exprimiert. Darin ist angegeben, daß die transformierten Pflanzen eine Resistenz gegenüber Heliothis virescens, dem Tabakknospen-Wurm, aufweisen, bei dem es sich um einen Insektenschädling handelt, der normalerweise auf Tabakpflanzen wächst. J.J. Sanchez-Serrano et al beschreiben in "Wound-Induced Expression of a Potato Inhibitor II Gene in Transgenic Plants" in "EMBO J." 6:303-306 (1987), die Transformation von Tabakpflanzen mit einem durch eine Wunde (Verletzung) induzierbaren Kartoffel-Inhibitor II-Gen.
  • Die Aktivierung von Abwehr-Genen in Pflanzen durch Pathogen- und Herbivoren-Angriffe oder durch eine andere mechanische Verwundung (Verletzung) kann resultieren aus der Wirkung einer Vielzahl von Signalgeber-Molekülen, die in komplexen Zeit-Mustern nach der anfänglichen Invasion der Gewebe freigesetzt werden (vgl. A.G. Darvill und P. Albersheim, "Ann. Rev. Plant Physiol." 35:243-275, 1984; M.A. Lawton und C.J. Lamb, "Mol. Cell. Biol.", 7: 335-341, 1987; und C.A. Ryan, "Ann. Rev. Cell Biol.", 3: 295-317, 1987). Der Transport dieser Signale wird lokal vermittelt durch interzelluläre und intrazelluläre Flüssigkeiten (Fluids), welche in die Wunde (Verletzung) oder in die Infektions-Stellen eindringen (T.R. Green und C.A. Ryan, "Science" 175:776-777, 1972) oder die systemisch durch das Vasculärsystem der Pflanzen wandern (J. Kuc und C. Presisig, "Mycologia" 76:767-784, 1984; M. Kopp et al., "Plant Physiol." 90:208-216, 1990; und K.E. Hammond-Kosack, et al., "Physiol. Mol. Plant Path.", 35:495-506, 1989). Ein begrenzter indirekter Nachweis hat gezeigt, daß die Signalgebung auch erfolgen kann durch die Atmosphäre (I.T. Baldwin und J.C. Schultz, "Science" 221:277-279, 1983); D.F. Rhoades in "Plant Resistance to Insects", P. Hedin, ed., American Chemical Society, Washington, D.C., 1983; und H.J. Zeringue, "Phytochemistry", 26:1357-1360, 1987). Während mehrere Chemikalien einschließlich Ethylen als Kandidat identifiziert worden sind, der intrezellulär Moleküle aussendet für induzierbare Abwehr-Gene, wurde bis her kein direkter biochemischer Nachweis in dem Stand der Technik vorgelegt, der irgendwelche flüchtigen Chemikalien neben Ethylen als Signale umfaßt, die Pflanzenabwehr-Gene aktivieren können. Ethylen ist hochselektiv bei der Aktivierung von Abwehr-Genen und aktiviert nur die Chitinase- Synthese. Ethylen aktiviert nicht Synthesen von anderen Abwehr-Chemikalien, wie in der Tabelle 1 angegeben, und ist daher nicht Teil des generellen Mechanismus zur Aktivierung von Abwehr-Genen in Pflanzen.
  • Die chemische Struktur der Jasmonsäure ist ähnlich derjenigen der Prostaglandine, wichtigen Signal-Molekülen bei Tieren (B. Samuelson et al., "Ann. Rev. Biochem.", 47: 997-1029, 1978). Jasmonsäure wird offenbar synthetisiert aus Linolensäure, einer Fettsäure, die überall in Pflanzen vorkommt (B.A. Vick und D.C. Zimmerman, "Plant Physiol.", 75:458-461, 1984; und J.M. Anderson in "Second Messengers in Plant Growth and Development", R. Alan Liss, Inc., S. 181-212, 1989). Die Freisetzung von Linolensäure oder 3,6,9,12-Octadecatetraensäure, ausgelöst durch die Aktivierung spezifischer Lipasen als Antwort auf Schädlingsoder Pathogen-Angriffe, könnte schnell zur Bildung von Jasmonsäure oder Methyljasmonat unter der Einwirkung von Enzymen, wie sie in Pflanzen vorhanden sind, führen. Jasmonsäure kann dann als zweites Messenger-Molekül in den Signalübermittlungs-Wegen dienen, die zu einer Abwehr-Gen- Expression führen.
  • Frühere Untersuchungen haben gezeigt, daß Methyljasmonat oder Jasmonsäure, wenn es (sie) direkt auf Pflanzen aufgebracht wird, eine Vielzahl von Antworten (Reaktionen) induzieren kann einschließlich der Wachstumshemmung (W. Dalther et al., "Planta" 153:530-535, 1981); und J. Yamane et al., "Plant and Cell Physiol." 22:689-697, 1981), die Seneszenz (das Altern) und/oder Abszission fördern kann (I. Ueda et al., "Plant Physiol.", 66:246-249, 1980; und R. Curtis, "Plant Growth Regulators", 2:157-168, 1984) sowie spezifische Blatt-Proteine in Monocotyledonen und Dicotyledonen induzieren kann (J. Mueller-Uri et al., "Plant" 176:241-247, 1988; J.M. Anderson et al., "Plant Science", 62:45-52, 1989; und P.E. Staswick, "The Plant Cell", 2:1-6, 1990).
  • Es wurde in dem Stand der Technik bisher jedoch nicht vorgeschlagen, daß Jasmonat-Derivate an den Pflanzen- Predator-Abwehr-Mechanismen beteiligt sein könnten.
  • In Kartoffel- und Tomaten-Blättern wurden zwei kleine durch eine Verletzung (Wunde) induzierbare Gen-Familien von Serin-Proteinase-Inhibitoren identifiziert (J.S. Lee et al., "Proc. Natl. Acad. Sci.", USA 83:7277-7281, 1986; und T.E. Cleveland et al., "Plant Mol. Biol.", 8: 199-208, 1987). Aus durch eine Wunde (Verletzung) induzierbaren mRNAs, die für die beiden Inhibitor-Familien codieren, wurden cDNAs isoliert (J. Graham et al., "J. Biol. Chem.", 260:6555-6560, 1985; und J. Graham et al., "J. Biol. Chem.", 260:6560-6564, 1985) und als Sonden zum Idenfizieren der durch eine Wunde (Verletzung) induzierbaren Gene in Kartoffel- und Tomaten-Gen-Bibliotheken verwendet (Lee at al., supra. und Cleveland et al., supra). 5'-Flankierungs-Sequenzen wurden an das durch eine Wunde (Verletzung) induzierbare Kartoffel-Inhibitor IIK-Gen operativ gebunden zur Erzielung einer durch eine Wunde (Verletzung) induzierbaren Expression von Chloramphenicol- Acetyltransferase (CAT) in transgenen Tabak-Pflanzen (Thornburg et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 84:744- 748, 1987).
  • Aus "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 86, 9851-9855 (1989), ist es auch bereits bekannt, daß die Anwendung von Abscisinsäure auf Kartoffel-, Tomaten- oder transgene Tabak-Pflanzen Proteinase-Inhibitor II-Gene induziert.
  • In "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 86, 1539-1542 (1989), ist angegeben, daß Polygalacturonid, das aus Tomatenblättern extrahiert worden ist, die Proteinase- Inhibitor-Synthese in Tomatenpflanzen induziert.
  • In DD 241 821 ist angegeben, daß Jasmonsäurederivate das Wachstum, die Entwicklung und die Stoffwechselprozesse in Pflanzen beeinflussen im Hinblick insbesondere auf ein verbessertes Wachstum und eine verbesserte Pflanzenstengel-Stabilität.
  • In EP 0 332 104 sind chemische Regulatoren für die Genexpression in Chimären-Genen beschrieben im Hinblick auf die Kontrolle (Steuerung) der Expression von Proteinase-Inhibitoren.
  • In WO-A-89/12230 und "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 84, 5202-5206 (1987), ist die Verwendung von exogenen Lockmitteln (Elizitoren) wie Glutathion und Ethylen zur Aktivierung von Pflanzengenen beschrieben.
  • Es wurde in dem Stand der Technik bisher jedoch nirgends vorgeschlagen, daß Jasmonatderivate zur Induktion der Expression eines Fremdgens verwendet werden könnten, das operativ verbunden ist mit einer solchen, durch eine Wunde (Verletzung) induzierbaren 5'-Regulator-Sequenz.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Es wurde nun gefunden, daß die Expression von Pflanzen-Predator-Abwehr-Proteinen und Fremdgenen, die operativ an eine durch eine Wunde (Verletzung) induzierbare 5'- Regulator-Sequenz gebunden sind, in einem Pflanzengewebe induziert wird durch Inkontaktbringen der zu behandelnden Pflanzen mit einem ein Abwehr-Protein induzierenden Agens. Das induzierende Agens, das Jasmonsäure, niedere Alkylester der Jasmonsäure oder jasmonsäureartige Derivat- Verbindungen sein kann, induziert die Expression von Genen in den Pflanzen, die zur Bildung von Abwehr-Proteinen führt, z.B. von Proteinase-Inhibitoren, Thioninen, Chitinasen und B-Glucanasen.
  • Gemäß einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Pflanzen, die eine ein Pro tein codierende Nucleotidsequenz aufweisen, die operativ gebunden ist an eine durch eine Wunde (Verletzung) induzierbare 5'-Regulator-Nucleotidsequenz, das umfaßt das Inkontaktbringen der Pflanzen mit einer zur Induktion der Bildung des Proteins durch die Pflanzen wirksamen Menge eines Induktionsmittels der Formel:
  • worin R&sub1; für H, niederes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder einen Trägerliganden steht; R&sub2; und R&sub3; unabhängig voneinander ausgewählt werden aus H, -OH, =O oder niederem Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen; und wobei das Agens gegebenenfalls durch eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung an die C&sub2;:C&sub3;-, C&sub3;:C&sub4;-, C&sub3;:C&sub7;-, C&sub4;:C&sub5;-, C&sub5;:C&sub6;-, C&sub6;:C&sub7;- oder C&sub9;:C&sub1;&sub0;-Bindungen gebunden ist.
  • Pflanzen können mit dem Induktionsmittel in Kontakt gebracht werden durch direktes Aufbringen auf das Pflanzengewebe oder durch Übertragung des Induktionsmittels durch die Luft. Es wurde gefunden, daß schon extrem geringe Mengen des Induktionsmittels wirksam sind in bezug auf die Induktion der Abwehr-Protein-Expression und daher wirksam sind in bezug auf die Reduktion des biologischen Stresses des Predator-Angriffs bei behandelten Kulturpflanzen.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Fig. 1 zeigt eine graphische Darstellung der Induktion von Proteinase-Inhibitor I- und -II-Proteinen in den Blättern von Tomatenpflanzen als Antwort (Reaktion) auf variierende Konzentrationen von in der Luft schwebendem Methyljasmonat.
  • Fig. 2 ist eine graphische Darstellung des zeitlichen Verlaufs der Induktion von Proteinase-Inhibitor I- und -II-Proteinen in den Blättern von Tomatenpflanzen als Antwort (Reaktion) auf in der Luft schwebendes Methyljasmonat.
  • Fig. 3 ist eine graphische Darstellung der Induktion von Proteinase-Inhibitor I- und -II-Proteinen in Tomatenpflanzen als Antwort (Reaktion) auf variierende Zeiten der Einwirkung von in der Luft schwebendem Methyljasmonat.
  • Fig. 4 zeigt das Massenspektrum von Methyljasmonat, das aus Artemisia tridentata ssp. tridentata isoliert wurde, im Vergleich mit einer Probe von authentischem Methyljasmonat.
  • Fig. 5 ist eine graphische Darstellung der Restriktions-Karte des Kartoffel-Protease-Inhibitor IIK-Gens.
  • Fig. 6 zeigt die Nucleotid-Sequenz (SEQ ID Nr. 1) des durch eine Wunde (Verletzung) induzierbaren Kartoffel- Protease-Inhibitor IIK-Gens, die auch die Sequenz in den 5'-Flankierungsregionen zeigt, welche die 5'- Regulator- Nucleotid-Sequenz-Elemente, z.B. den Promotor, enthalten.
  • Fig. 7 ist eine graphische Darstellung eines Vektors, der das Fremd-Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT)-Gen enthält, das an die durch eine Wunde (Verletzung) induzierbare Kartoffel-Protease-Inhibitor IIK-Gen 5'-Regulator-Nucleotid-Sequenz ligiert ist.
  • Fig. 8 zeigt die Ergebnisse von Versuchen, bei denen Methyljasmonat verwendet wurde zur Induktion der Expression eines Fremdgens in einer transgenen Tabak-Pflanze, die mit dem CAT-Gen behandelt worden ist, das an die durch eine Wunde (Verletzung) induzierbare 5'-Regulator-Nucleotid- Sequenzen eines Abwehr-Protein-Gens ligiert ist.
    • Detaillierte Beschreibung repräsentativer Ausführungsformen der Erfindung
  • Erfindungsgemäß werden Pflanzen, die Predator-Abwehr- Proteine bilden können, behandelt, indem man die Pflanzen mit einer Menge eines ein Abwehr-Protein induzierenden Agens in Kontakt bringt, die ausreicht, um die Bildung von Abwehr-Proteinen durch die Pflanzen zu induzieren. Das Verfahren ist auch anwendbar zur Induktion der Bildung eines Fremdproteins durch eine transgene Pflanze mit einem Genom, das eine 5'-Regulator-Nucleotid-Sequenz aufweist, die induzierbar ist durch ein ein Abwehr-Protein induzierendes Agens, das mit einem Fremd-Gen oparativ verbunden ist.
  • Unter dem hier verwendeten Ausdruck "Protein, das eine Nucleotid-Sequenz codiert" sind Nucleotid-Sequenzen in DNA oder RNA zu verstehen, die durch Transkription bzw. Translation in der Lage sind, eine Aminosäuresequenz zu ergeben, deren Länge größer ist als drei Aminosäuren, z.B. Predator-Abwehr-Proteine, Abwehr-Proteine oder ein Fremd- Gen.
  • Unter dem hier verwendeten Ausdruck "ein Abwehr- Protein induzierendes Agens" sind Agentien zu verstehen, welche die Expression von Predator-Abwehr-Proteinen und durch eine Wunde (Verletzung) induzierbare Proteine, wie Methyljasmonat, induzieren.
  • Unter dem hier verwendeten Ausdruck "Fremd-Gen" sind Gene zu verstehen, die üblicherweise in der Natur in dem Genom der speziellen Pflanzenzelle, die transformiert werden soll, nicht zu finden sind und die umfassen eukaryontische und prokaryontische Gene und ihre Derivate, die durch rekombinante Verfahren hergestellt worden sind.
  • Unter dem hier verwendeten Ausdruck "durch eine Wunde (Verletzung) induzierbare 5'-Regulator-Nucleotid-Sequenz, "5'-Regulator-Nucleotid-Sequenz", "5'-Regulator-Region", "Abwehr-Gen-Regulator-Sequenzen", "5'-Regulator-Sequenzen" und "5'-Flankierungs(Regulator)-Region", die synonym verwendet werden, sind die Nucleotid-Sequenzen zu verstehen, die in der 5'-Stellung an einem Abwehr-Protein-Gen vorliegen, und die in der Lage sind, die Expression der stromabwärts gelegenen Nucleotid-Sequenzen zu induzieren, wenn die Pflanze einem ein Abwehr-Protein induzierenden Agens wie Methyljasmonat ausgesetzt wird.
  • Unter dem hier verwendeten Ausdruck "operativ gebunden (verbunden)" ist zu verstehen die Bindung einer Nucleotid-Sequenz an eine andere, so daß der gewünschte Effekt erzielt wird, beispielsweise das Binden in dem richtigen Leseraster an einen offenen Leseraster (ORF); oder das Binden einer nicht-translatierten Region an einen ORF oder eine andere nicht-translatierte Region in der Weise, daß der gewünschte Regulations-Effekt (positive Aufwärts-Regulierung oder negative Abwärts-Regulierung) erzielt wird als Antwort (Reaktion) auf das ein Abwehr Protein induzierende Agens.
  • Die hier verwendeten Ausdrücke "Predator-Abwehr- Proteine" und "Abwehr-Proteine", die synonym verwendet werden, umfassen Proteine, die den Angriff oder die Ingestion von Pflanzengewebe durch Predatoren, beispielsweise Insekten, Fungi, Bakterien oder Viren, verhindern und dadurch die Resistenz der Pflanzen gegenüber dem Predator Angriff erhöhen. Die Abwehr-Proteine können direkt wirken unter Verhinderung des Angriffs oder der Ingestion des Pflanzengewebes oder sie können indirekt wirken, beispielsweise als Enzyme, die andere Abwehr-Verbindungen aus Vorläufer-Materialien bilden, als Enzyme, die Teil eines biologischen Syntheseweges sind, der zur Synthese von Abwehr-Verbindungen aus Vorläufer-Materialien führt, oder als Proteine, die ein Enzym oder Enzyme regulieren, das (die) zur Synthese von Abwehr-Verbindungen führt (führen). Zu repräsentativen Beispielen für Abwehr-Proteine, die direkt wirken, gehören Proteinase-Inhibitoren, Thionine, Chitinasen und β-Glucanasen. Zu repräsentativen Enzymen, die zur Synthese von Abwehr-Verbindungen führen, gehören beispielsweise Casben-Synthase. Zu repräsentativen Enzymen, die Teil eines Biosyntheseweges sind, der zur Bildung von Abwehr-Verbindungen führt, gehören beispielsweise die Enzyme in den Phenylpropenoid- und Terpenoid-Synthesewegen, die zur Synthese von Phytoalexin-Antibiotika, Alkaloiden und anderen toxischen Chemikalien führen. Weitere Typen von Predator-Abwehr-Proteinen, die erfindungsgemäß verwendbar sind, sind für den Fachmann auf diesem Gebiet natürlich ohne weiteres ersichtlich. Zu besonders geeigneten Predator-Abwehr-Proteinen gehören Inhibitoren der proteolytischen Verdauungs-Enzyme des angreifenden Predators, wie Proteinase-Inhibitoren, und andere Proteine, die Abwehr-Eigenschaften gegenüber Insekten, Fungi, Bakterien oder Viren aufweisen. Zu repräsentativen Proteinase- Inhibitor-Abwehr-Proteinen, die erfindungsgemäß induzierbar sind, gehören beispielsweise die Trypsin-Inhibitoren der Kunitz-Familie, die Proteinase-Inhibitoren der Bowman Birk-Familie, die Proteinase-Inhibitoren der Inhibitor I- Familie, die Proteinase-Inhibitoren der Inhibitor II- Familie, die Trypsin-Inhibitoren der Gersten-Famihe und die Proteinase-Inhibitoren der Kürbis-Familie. Pflanzen, die erfindungsgemäß behandelt werden sollen, können entweder in der Lage sein, in natürlicher Weise Predator- Abwehr-Proteine zu exprimieren als Antwort (Reaktion) auf den Predator-Angriff (d.h. eine Verletzung bzw. Verwendung des Gewebes) oder sie können genetisch so verändert werden, daß sie unter der Kontrolle eines geeigneten induzierbaren Promotors Abwehr-Proteine exprimieren, wie für den Fachmann auf diesem Gebiet ohne weiteres ersichtlich.
  • Zu bei der praktischen Durchführung der Erfindung verwendbaren, ein Abwehr-Protein induzierenden Agentien gehören Verbindungen oder Zusammensetzungen, die beim Kontakt mit Pflanzengewebe die Expression einer ein Protein codierenden Nucleotid-Sequenz, beispielsweise von Predator-Abwehr-Proteinen oder Fremd-Genen, die operativ an eine Abwehr-Protein-5'-Regulator-Region gebunden sind, induzieren können. Zu geeigneten, ein Abwehr-Protein induzierenden Agentien gehören Agentien, die eine Verbindung der Formel umfassen:
  • worin R&sub1; für H, niederes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder einen Trägerliganden steht; R&sub2; und R&sub3; unabhängig voneinander ausgewählt werden aus H, -OH, =O oder niederem Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen; und wobei das Agens gegebenenfalls durch eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung an eine oder mehrere der C&sub2;:C&sub3;-, C&sub3;:C&sub4;-, C&sub3;:C&sub7;-, C&sub4;:C&sub5;-, C&sub5;:C&sub6;-, C&sub6;:C&sub7;- oder C&sub9;:C&sub1;&sub0;-Bindungen gebunden ist. Zu geeigneten Trägerliganden gehören Reste (Moleküle), die in der Lage sind, das induzierende Agens Pflanzenzellen zuzuführen, ohne die induzierende Aktivität des Agens zu stören, beispielsweise Mono- oder Polysaccharide, Aminosäuren, Polypeptide mit 1 bis 500 Aminosäureresten oder mehr und dgl. Vorzugsweise können die Trägerliganden von dem Rest des induzierenden Agens durch die natürliche biologische Aktivität der Pflanzenzelle abgeschnitten (abgespalten) werden. Zu repräsentativen Beispielen für ein Abwehr-Protein induzierenden Agentien gehören Jasmonsäure, 7-iso-Jasmonsäure, 9,10-Dihydrojasmonsäure, 2,3- Didehydrojasmonsäure, 3,4-Didehydrojasmonsäure, 3,7-Didehydrojasmonsäure, 4,5-Didehydrojasmonsäure, 5,6-Didehydrojasmonsäure, 6,7-Didehydrojasmonsäure, 7,8-Didehydrojasmonsäure und die niederen Alkylester, die Träger-Liganden- Konjugate und die Stereoisomeren davon. Die derzeit bevorzugten, ein Abwehr-Protein induzierenden Ageentien sind Jasmonsäure und Methyljasmonat.
  • Die Mengen des induzierenden Agens, die wirksam sind, um die Expression einer ein Protein codierenden Nucleotid- Sequenz (z.B. von Abwehr-Proteinen, wie Proteinase- Inhibitoren oder Fremd-Genen, die operativ verbunden sind mit Abwehr-Gen-Regulator-Sequenzen) in den behandelten Pflanzen zu induzieren, hängen von vielen Faktoren ab, beispielsweise der Art, der Umgebung und dem Zustand der zu behandelnden Pflanzen, dem Verfahren des Kontaktierens des induzierenden Agens mit dem zu behandelnden Pflanzengewebe und anderen Faktoren. So kann beispielsweise ein Pflanzengewebe erfindungsgemäß behandelt werden durch Kontaktieren des Gewebes mit einer das induzierende Agens enthaltenden Lösung. Alternativ kann das Pflanzengewebe behandelt werden, indem man eine flüchtige Quelle für das induzierende Agens in die Nähe des Pflanzengewebes bringt und das Agens über die Atmosphäre in das Pflanzengewebe diffundieren läßt.
  • Bei der Verwendung in Form einer Lösung kann das zu behandelnde Pflanzengewebe mit einer Lösung in Kontakt gebracht werden, die eine Menge des Induktionsmittels (induzierenden Agens) enthält, welche die Expression von Abwehr-Proteinen durch die behandelte Pflanze wirksam induziert. Bei einer Ausführungsform kann die Lösung eine wäßrige Lösung sein, die etwa 1 pg/ml bis etwa 100 mg/ml des Induktionsmittels, vorzugsweise etwa 1 ng/ml bis etwa mg/ml des Induktionsmittels und besonders bevorzugt etwa 1 µg/ml bis etwa 1 mg/ml des Induktionsmittels enthält. Alternativ kann die Lösung ein organisches Lösungsmittel wie Glycerin enthalten. Die Lösung kann direkt auf das zu behandelnde Pflanzengewebe aufgebracht werden, beispielsweise durch Aufsprühen der Lösung auf das Pflanzengewebe oder durch Imprägnieren (Einweichen) oder anderes Kontaktieren des Pflanzengewebes mit der Lösung.
  • Wenn das Pflanzengewebe durch Übertragung des Induktionsmittels, das in der Luft schwebt, behandelt werden soll, wird eine flüchtige Quelle für das Induktionsmittel in die Nähe des Pflanzengewebes gebracht und das Agens wird durch die Atmosphäre diffundieren oder dispergieren gelassen, um mit dem Pflanzengewebe in Kontakt zu kommen. Bei dieser Ausführungsform kann die flüchtige Quelle beispielsweise sein Pflanzenmaterialien, die in natürlicher Weise das Induktionsmittel bilden (produzieren) oder eine flüchtige Lösung des Agens, beispielsweise eine Lösung, die ein flüchtiges organisches Lösungsmittel und das Induktionsmittel enthält. Zu geeigneten organischen Lösungsmitteln für diesen Zweck gehören Methanol, Ethanol und andere flüchtige organische Lösungsmittel. Das Lösungsmittel kann auch Wasser sein. Die Art, in der die flüchtige Quelle für das Induktionsmittel in die Nähe des zu behandelnden Pflanzengeweges gebracht wird, ist für die praktische Durchführung der Erfindung nicht kritisch. So kann beispielsweise das Induktionsmittel in einem offenen Behälter in der Nähe des Pflanzengewebes auf einen Matrix-Träger, beispielsweise einer Faser-Matrix, in der Nähe des Pflanzengewebes angeordnet werden oder es kann direkt auf den Erdboden in der Nähe des Pflanzengewebes aufgebracht werden.
  • Es ist bekannt, daß induzierbare Abwehr-Antworten (- Reaktionen) in Pflanzen sowohl lokal als auch systemisch aktiviert werden durch Signal-Moleküle, die an den Stellen der Pathogen- oder Insekten-Angriffe gebildet werden, es ist jedoch nur eine Signal-Chemikalie, Ethylen, bekannt, die durch die Atmosphäre wandert unter Aktivierung von Pflanzen-Abwehr-Genen. In Verbindung mit den nachfolgenden Beispielen wird jedoch näher erläutert, daß Abwehr-Proteine induzierende Agentien, wie sie hier beschrieben werden, beim Aufbringen auf die Oberfläche von Pflanzen die Synthese eines Proteins, beispielsweise von Abwehr- Proteinen in den behandelten Pflanzen (und in den benachbarten Pflanzen) oder von Fremd-Proteinen, die mit Abwehr- Protein-5'-Regulator-Sequenzen operativ verbunden sind (z.B. eine Promotor-Region), induzieren. Die Anwesenheit des Induktionsmittels in der Atmosphäre der die Pflanzen enthaltenden Kammern kann auch zur Anreicherung von Abwehr-Proteinen (oder Fremd-Proteinen) in den Blättern der Pflanzen führen. Außerdem wird dann, wenn Sagebrush (amerik. Beifuß), eine Pflanze, von der bekannt ist, daß sie Methyljasmonat in den Blattoberflächenstrukturen aufweist, in Kammern mit Pflanzen inkubiert, eine Abwehr- Protein-Anreicherung in den Blättern der Pflanzen induziert wird, was zeigt, daß eine Kommunikation zwischen den Pflanzen von den Blättern einer Pflanzen-Spezies zu den Blättern einer anderen Spezies stattfindet, wodurch die Expression von Abwehr-Genen aktiviert wird.
  • Die vorstehenden Ausführungen sind besser verständlich in Verbindung mit den folgenden repräsentativen Beispielen, die jedoch lediglich der Erluterung der derzeit bevorzugten Ausführungsform der Erfindung dienen.
    • Beispiel 1 Anreicherung von Proteinase-Inhibitor I in Tomaten- Blättern, der durch Methyljasmonat induziert wird
  • Eine Lösung von Methyljasmonat (10&supmin;³ M in Wasser, enthaltend 0,125 Vol./Vol.%) Triton X-100) wurde auf die oberen Blätter von intakten, 14 Tage alten Tomaten- Pflanzen aufgesprüht Kontrollpflanzen wurden mit einer 0,125 gew./gew.%igem wäßrigen Lösung von Triton X-100, die kein Methyljasmonat enthielt, besprüht. Die behandelten Pflanzen und die Kontrollpflanzen wurden im Freien 30 min lang bei Raumtemperatur trocknen gelassen und dann in versiegelte Plexiglas-Kästen (Fassungsvermögen 11,34 1) gestellt und unter konstanter Beleuchtung (300 µEm&supmin;² s&supmin;¹) 24 h lang inkubiert. Die Kammer A enthielt sowohl die mit Methyljasmonat besprühten Pflanzen als auch die Kontrollpflanzen. Die Kammer B enthielt die Kontrollpflanzen zusammen mit Pflanzen, die einmal entlang ihrer unteren Blätter mit einem Hämostaten verletzt (verwundet) worden waren, während die Pflanzen gleichzeitig besprüht wurden. Die Proteinase-Inhibitor I-Gehalte wurden bestimmt durch radiale Immunodiffusions-Assays nach dem Verfahren von C. Ryan, "Anal. Biochem.", 19:434-429, 1967, und R. Trautman et al., "Immunochemistry", 8:901-916, 1971. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3
  • * Die Werte sind angegeben zusammen mit der Standardabweichung
  • Wie aus der Tabelle 3 ersichtlich, induziert eine wäßrige Lösung von Methyljasmonat, wenn sie auf die Blätter von Tomatenpflanzen aufgesprüht wird, stark die Synthese und die Anreicherung von Proteinase-Inhibitor I- Protein. Die Chemikalie induzierte eine Anreicherung von Inhibitor I, die signifikant höher war als sie durch die Verletzung (Verwundung) induziert werden konnte. Weiterhin zeigt die Tabelle 3, daß die Kontrollpflanzen, die nicht mit Methyljasmonat besprüht worden waren, jedoch in der gleichen Kammer wie die besprühten Pflanzen inkubiert worden waren, geringe Gehalte an Proteinase-Inhibitor I- Protein anreicherten. Die in einer getrennten Kammer inkubierten Kontrollpflanzen reicherten überhaupt keinen Inhibitor I an. Diese Ergebnisse zeigen, daß flüchtiges Methyljasmonat die Synthese von Proteinase-Inhibitoren in den unbehandelten Kontrollpflanzen induzierte.
    • Beispiel 2 Induktions der Proteinase-Inhibitoren I und II in Tomaten durch Methyljasmonat
  • Tomantenpflanzen wurden in luftdichte Kammern gestellt zusammen mit Holzdübeln mit Baumwoll-Spitzen, wobei verschiedene Verdünnungen von Methyljasmonat in Ethanol auf die Baumwolle aufgebracht worden waren. Die Dübel wurden so angeordnet, daß keine Wechselwirkung zwischen dem Methyljasmonat und den Pflanzen außer über die Atmosphäre möglich war. Nach dem Inkubieren der Pflanzen in Licht für 24 h nach dem Einführen von Methyljasmonat in die Kammern wurde der Saft aus den Blättern der Pflanzen untersucht zur Bestimmung der Inhibitor I- und II-Protein-Gehalte durch Immunoradial-Diffusion wie in Beispiel 1. Wie in der Fig. 1 dargestellt, in der die leeren Kreise den Inhibitor I repräsentieren und die ausgefüllten Kreise den Inhibitor II repräsentieren, führte die Anwesenheit von flüchtigem Methyljasmonat in den Kammern zur Synthese und Anreicherung beider Proteinase-Inhibitoren I und II in einer dosisabhängigen Weise. Die halbe maximale Anreicherung beider Inhibitoren wurde beobachtet, wenn 1 bis 2 nL (Nanoliter) Methyljasmonat auf den Baumwolldochten in den Kammern vorhanden waren. Die Dosisabhängigkeit der Anreicherung der Inhibitoren zeigt, daß die Blätter das verflüchtigte Methyljasmonat schnell absorbieren müssen. Unterhalb etwa 10 nL Methyljasmonat pro Kammer wurden die Blätter nicht maximal induziert. Dies läßt vermuten, daß diese niedrigeren Konzentrationen an flüchtigen Methyljasmonat-Gehalten beschränkend waren und daß die Blätter nicht in der Lage waren, die Moleküle ausreichend zu assimilieren, um die Signal-Antworten zu maximieren. Oberhalb 10 nL pro Kammer schienen die Konzentrationen an flüchtigem Methyljasmonat in den Kammern hoch genug zu sein, um in Werten assimiliert zu werden, welche die Inhibitoren maximal induzieren können.
    • Beispiel 3 Induktion der Inhibitoren I und II in Tomantenpflanzen
  • Die Induktion von Proteinase-Inhibitor I- und -II- Proteinen in den Blättern von intakten Tomatenpflanzen nach dem Einwirkenlassen von durch die Luft übertragenem Methyljasmonat wurde außerdem wie folgt bewertet. Zwei Wochen alte Tomatenpflanzen wurden in luftdichte 1250 ml- Glaskammern gestellt zusammen mit Holzdübeln mit Baumwolldochten, auf welche 1 µl von Verdünnungen von (+/-)- Methyljasmonat in Ethanol aufgebracht worden war. Die Baumwollspitze wurde etwa 4-6 cm von den Pflanzenblättern entfernt angeordnet. Die Behälter wurden bei konstanter Beleuchtung wie in Beispiel 1 24 h lang bei 28ºC inkubiert. Der Saft aus den Blättern wurde analysiert zur Bestimmung der Proteinase-Inhibitoren I und II. Die Ergebnisse sind in der Fig. 2 dargestellt, in der die Stäbe die Standardabweichung (n = 4) anzeigen.
  • Wie in der Fig. 2 dargestellt, begannen die Tomantenpflanzen dann, wenn Methyljasmonat in den Kammern bei Sättigungsgehalten(100 nL/Kammer) vorhanden war, die Proteinase-Inhibitoren I (leere Kreise) und II (ausgefüllte Kreise) etwa 5 h nach Beginn der Einwirkung der flüchtigen Verbindung anzureichern und die Anreicherung der Proteine in linearen Raten für nahezu 20 h setzte sich fort. Nach etwa 20 h nahm die Anreicherungsrate der beiden Inhibitoren jedoch ab. Die Gründe dafür sind derzeit nicht bekannt. Nach der Verletzung (Verwundung) nahmen die Raten der Anreicherung der Proteinase-Inhibitoren, wie gezeigt wurde, nach etwa 10 h ab, die Verletzungs-Induktion konnte jedoch durch eine Verletzung verstärkt werden, die etwa 12 h nach der anfänglichen Verletzung angebracht worden war (J.S. Graham, G. Hall, G. Pearce und C.A. Ryan, "Planta" 169:399-405, 1986. Die konstante Anwesenheit des Methyljasmonat-Dampfes kann das System einfach ermüdet haben oder die Blätter können einfach das gesamte Methyljasmonat absorbiert und es in ein nicht-aktives Produkt umgewandelt haben.
  • Die Gehalte an beiden Proteinase-Inhibitoren I und II, die sich entsprechend dem Methyljasmonat anreichern, sind höher als diejenigen, die in Tomatenblättern als Antwort auf die jeweilige Verletzung (Graham et al., supra) oder mit Oligouronid-Elecitoren (M. Walker-Simmons, L. Hadwiger und C.A. Ryan, "Biochem. Biophys. Res. Comm." 110:194-199, 1983) gefunden wurden. Dies läßt vermuten, daß das Methyljasmonat in das Signalübertragungs-Netzwerk sehr wirksam eindringen kann und einige biochemische Beschränkungen umgeht, welche die durch Verletzung induzierbare Induktion der Proteinase-Inhibitoren begrenzen.
    • Beispiel 4 Induktion des Proteinase-Inhibitors I in Tomaten durch Methyljasmonat
  • Die Synthese des Proteinase-Inhibitor I-Proteins entsprechend der Erhöhung der Zeiten der Einwirkung von durch die Luft übertragenem Methyljasmonat auf Tomatenpflanzen wurde bestimmt durch Inkubieren von Tomatenpflanzen in luftdichten 1250 ml-Glaskammern in Gegenwart von flüchtigem Methyljasmonat (100 nL, gelöst in 1 ml Ethanol), das auf Baumwoll-Tampons pipettiert wurde. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Einwirkenlassen der Methyljasmonatdämpfe wurden die Pflanzen in Kammern überführt, die frei von Methyljasmonat waren, und sie wurden weitere 24 h lang nach der anfänglichen Einwirkung inkubiert, wobei der Saft der Blätter zur Bestimmung des Proteinase-Inhibitor I- Gehaltes entsprechend dem Verfahren des Beispiels 1 untersucht wurde. Die Ergebnisse sind in der Fig. 3 dargestellt, in der die Stäbe die Standardabweichung (n = 4) anzeigen.
  • Wie aus der Fig. 3 ersichtlich, war eine Einwirkungszeit von nur 30 min für das flüchtige Methyljasmonat, das aus 100 nL der Chemikalie pro Kammer stammte, auf die Tomatenpflanzen ausreichend, um einen mäßigen Gehalt an Anreicherung von Proteinase-Inhibitor-Protein zu induzieren. Durch Erhöhung des Einwirkenlassens des flüchtigen Methyljasmonats konnte die Anreicherung von Inhibitor-Protein erhöht werden und innerhalb von etwa 8 h wurde ein Maximum erreicht.
    • Beispiel 5 Induktion von TTI und ATI in Tabak- und Alfalfa-Pflanzen
  • Um zu bestimmen, ob Methyljasmonat Proteinase- Inhibitoren auch in anderen Pflanzengenera, die zu einer anderen Pflanzenfamilie gehören, aktivieren kann, wurden kleine Tabak-Pflanzen (Xanthi) und kleine Alfalfa-Pflanzen (cultivar RA3) flüchtigem Methyljasmonat (100 nL Methyljasmonat pro Kammer) ausgesetzt und der Saft der Blätter wurde untersucht zur Bestimmung der Anwesenheit des Tabak- Trypsin-Inhibitors (TTI) und des Alfalfa-Trypsin- Inhibitors (ATI) (W. Brown und C.A. Ryan, "Biochemistry", 23:3418-3422, 1984) durch radiale Immundiffusion, wie in Beispiel 1 beschrieben. In Gegenwart von Methyljasmonat, wurden die TTI-Gehalte von 7 +/-3 µg/g Gewebe (n = 4) in den Blättern von Kontrollpflanzen erhöht auf 116 +/-37 µg/g Gewebe (n = 4) in Blättern von Pflanzen, die Methyljasmonat ausgesetzt worden waren. Die ATI-Gehalte wurden erhöht von 33 +/-7,3 µg/g Gewebe (n = 4) in Kontrollpflanzen auf 385 +/-26,5 µg/g Gewebe (n = 4) in den dem Methyl jasmonat ausgesetztem Pflanzen. Das duch die Luft übertragene Methyljasmonat induziert somit die Expression von mehreren Proteinase-Inhibitor-Genen, die drei Inhibitor- Familien in den Blättern von Pflanzen sowohl der Solanaceae- als auch der Fabaceae-Familien repräsentieren.
    • Beispiel 6 Induktion der Inhibitoren I und II in Tomaten durch Kohabitation mit Sagebrush (amerikan. Beifuß)
  • Um zu demonstrieren, daß eine Pflanzen-Spezies, die Methyljasmonat in ihren Blättern enthält, die Expression von Proteinase-Inhibitor-Genen in benachbarten Pflanzen induzieren kann, wurden 15-Tage alte Tomaten-Pflanzen (mit einer Höhe von etwa 5 cm, die drei expandierende Blätter enthielten) in luftdichte 1250 ml-Glaskammern gestellt zusammen mit Proben des Sagebrush Artemisia tridentata Nutt. subsp. tridentata (etwa 10 cm-Zweige mit mehreren Dutzend Blättern; die Zweige hatten ein Durchschnittsgewicht von 4,5 +1- 0,5 g). Die Pflanzen wurden so angeordnet, daß kein physikalischer Kontakt zwischen den Sagebrush-Blättern und den Tomatenblättern möglich war. Die Kammern wurden versiegelt und 2 Tage lang unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen inkubiert. Kontroll-Tomatenpflanzen wurden in getrennte Kammern in Abwesenheit von Sagebrush gestellt und unter identischen Bedingungen inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Blätter der Tomatenpflanzen untersucht zur Bestimmung der Proteinase Inhibitor-I- und -II-Proteine durch radiale Immunodiffusion, wie in Beispiel 1 beschrieben.
  • Die Pflanzen für den Versuch 1 wurden gesammelt auf einer Meile des East of Desert Aire, WA (Location 1). Die Pflanzen für die Versuche 2 und 3 wurden gesammelt von Lyons Ferry, WA (Location 2). Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 4 angegeben. Tabelle 4
  • Wie in der Tabelle 4 angegeben, wiesen die Blätter der Tomatenpflanzen innerhalb von 2 Tagen erhöhte Gehalte an beiden Proteinase-Inhibitoren I und II auf.
  • Baumwoll-Tampons wurden über die Blattoberflächen von A. tridentata-Blättern gestrichen und in Glaskammern zusammen mit Tomatenpflanzen angeordnet, ähnlich den Versuchen, wie sie weiter oben in Verbindung mit Methyljasmonat beschrieben wurden. Eine flüchtige Komponente induzierte die Anreicherung von Proteinase-Inhibitoren in den Blättern (Daten nicht angegeben). Um zu bestimmen, ob Methyljasmonat tatsächlich in den Blattoberflächen-Trichomen von A. tridentata vorhanden war, wurde eine Ethanolfraktion aus der Blattoberfläche gewonnen und in seine Komponenten fraktioniert durch Silicagel-Kolonnenchromatographie, Dünnschicht-Chromatographie und Umkehrphasen-HPLC, wie nachstehend angegeben.
  • Die letzten 15 cm von A. tridentata-Zweigen wurden aus einer natürlichen Population gesammelt, die in Lyons Ferry, W.A., wuchs. Die Zweige (1 kg), die mehrere 100 kleine Blätter enthielten, wurden 10 s lang in Ethanol (1 L) gerührt. Die resultierende Mischung wurde zu einem braunen öl (2,4 ml) eingeengt, das in Pentan (75 ml) extrahiert wurde. Das Pentan wurde durch Rotationsverdampfung entfernt und das resultierende gelbe Öl (1,2 ml) wurde auf einer Silicagel (Silicar, Mallinckrodt, 60A)- Kolonne (1,2 x 20 cm) fraktioniert. Die Kolonne wurde zuerst mit Pentan gewaschen. Der Ethylacetatgehalt des Pentans wurde in 5 % Vol./Vol.% Stufen auf 10 Vol.Vol .% erhöht, dann wurde er in 10 % Stufen auf 100 % Ethylacetat erhöht. In 30 Vol./Vol.%igem Ethylacetat wurde eine Fraktion eluiert, die eine den flüchtigen Proteinase-Inhibitor induzierende Aktivität aufwies. Diese Fraktion wurde durch präparative Dünnschicht-Chromatographie an Silicagel weiter aufgetrennt. Die Platte wurde in Benzol/Ethylacetat (Volumenverhältnis 10:1) entwickelt. Die Verbindungen, die mit einem Rf von 0,38 wanderten, wiesen eine Proteinase Inhibitor induzierende Aktivität auf, wenn sie jungen Tomantenpflanzen ausgesetzt wurden. Dieses aktive Material wurde weiter chromatographiert auf einer analytischen Silicagel-Dünnschicht (Kodak)-Platte, die vorher mit 5 Gew./Vol.% Silbernitrat in 75 Vol./Vol.% Methanol imprägniert worden war. Vor der Chromatographie wurde die Platte 20 h lang bei 28ºC trocknen gelassen. Die Platte wurde in 30 Vol./Vol.%igem Ethylacetat in Hexanen chromatographiert. Die Proteinase-Inhibitor induzierende Aktivität stand, wie gefunden wurde, in Verbindung mit Komponenten, die mit einem Rf-Wert von 0,17 wanderten. Dieses Material wurde durch Umkehrphasen-HPLC auf einer Beckman Ultraphase C18-Ionenpaar-Kolonne (4,6 mm x 250 mm, 5 mm) in 50 % Acetonitril: 0,1 % Trifluoressigsäure in Wasser weiter aufgetrennt. Die Kolonne wurde isokratisch entwickelt. Ein teilweise aufgetrennter Doppelpeak wurde so aufgetrennt, daß er die Proteinase-Inhibitor-Aktivität aufwies. Es wurde eine Gaschromatographie/Massenspektroskopie der Verbindungen unter Verwendung eines Hewlett Packard 5985 GC/MS-Systems durchgeführt. Die Kolonne war ein Superox FA (Alltech, 30 m x 0,25 mm) mit He-Trägergas bei 1,4 kg.cm&supmin;². Die Kolonnentemperatur betrug 5 min lang 45ºC, dann wurde sie mit einer Geschwindigkeit von 10ºC/min auf 200ºC erhöht, die 10 min lang aufrechterhalten wurde. In allen biologisch aktiven Fraktionen wurden zwei Verbindungen mit identischen GC-Retentionszeiten und ähnlichen Massenspektren wie Methyljasmonat gefunden. Das Massenspektrum einer dieser Verbindungen wurde mit demjenigen von authentischein Methyljasmonat verglichen, wie in Fig. 4 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, daß das durch die Luft übertragene Chemikalien-Signal von A. tridentata-Blättern, das die Expression der Proteinase-Inhibitor-Gene induziert, Methyljasmonat ist.
  • Die Fähigkeit von Methyljasmonat, mindestens vier durch einen Elizitor und eine Verletzung (Wunde) induzierbare Gene aus zwei Pflanzen-Familien zu aktivieren, zeigt, daß diese Verbindung die generelle Eigenschaft hat, ein breites Spektrum von Pflanzen-Abwehr-Genen zu aktivieren. Methyljasmonat-Moleküle können über Stomata in das vasculäre System eindringen und die Proteinase-Inhibitor-Gene über einen Rezeptor-vermittelteten Signal-Übertragungsweg aktivieren. Alternativ kann Methyljasmonat in das Blatt zellen-Zytoplasma diffundieren, in dem es durch intracelluläre Esterasen zu Jasmonsäure hydrolysiert wird. Die freie Säure kann ihrerseits ein integraler Teil eines generellen Signalübertragungssystems sein, das die induzierbaren Abwehr-Gene in Pflanzen steuert (regelt). Die Daten hier zeigen, daß ein hochempfindlicher Mechanismus in den Pflanzen vorliegt, der Abwehr-Protein-Gene als Antwort (Reaktion) auf die Abwehr-Protein induzierenden Agentien aktivieren kann. Der Mechanismus liegt, wie angenommen wird, allgemein in der Natur vor. Es wurde hier ferner gezeigt, daß ein Interpflanzen-Abwehr-Signal auftreten kann zwischen zwei entfernt miteinander verwandten Pflanzen- Familien mit einem repräsentativen induzierenden Agens, flüchtigem Methyljasmonat, als Signal-Molekül.
    • Beispiel 7
  • Um zu bestimmen, ob Methyljasmonat die Expression eines Fremdgens induzieren kann, wurde eine transgenetische Pflanze mit einer 5'-Regulator-Region aus einem Abwehr- Protein-Gen, das operativ mit einem Fremd-Chloramphenicol- Acetyltransferase (CAT)-Gen verbunden war, rekonstruiert. Das Kartoffel-Inhibitor II-Gen wurde geklont, die Nucleotid-Sequenz des Gens und seine 5'-flankierenden (Regulator)-Sequenzen wurden bestimmt und es wurden die Vektoren konstruiert, in denen die Regulator-Sequenzen die Expression von CAT steuern (kontrollieren). Tabak-Zellen wurden mit diesen Vektor-Gen-Sequenzen umgewandelt und die resultierenden transgenetischen Pflanzenblätter wurden getestet in bezug auf die Methyljasmonat-Induktion der CAT-Gen- Expression.
    • Screening (Reihenuntersuchung) einer Bibliothek von Kartoffel-Genen auf Inhibitor II-Gene
  • Um das Inhibitor II-Gen zu klonieren, wurden etwa 3,5 x 10&sup5; Plaques in einer Russet-Burbank-Kartoffel-Genom- Bibliothek (die ein Geschenk von David Anderson, Phytogen, Pasadena, CA, war) einem Screening (einer Reihenuntersuchung) unterworfen unter Verwendung von Nicktranslatierter Tomaten-Inhibitor II-cDNA als Sonde. Als Wirt wurde ein Escherichia coli-Stamm K802 (hsr&supmin;, hsm&spplus;, lac&supmin;, gal&supmin;, met&supmin;) verwendet. Nitrocellulose-Plaque-Lifts der Bibliothek wurden bei 55ºC in einer Lösung vorhybridisiert, die 5X Denhardt-Lösung, 5X SSPE, 0,1 % NaDodSO&sub4;, denaturierte Lachssperma-DNA (100 µg/ml) und Poly(A) &spplus;RNA (1 µg/ml) enthielt (Maniatis et al. in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratoy, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982). Zur Durchführung der Hybridisierungsstufe wurden 0,1 µg eines gekochten Nicktranslatierten Inhibitor II-cDNA zu der Mischung zugegeben und 10 h lang bei 55ºC inkubiert. Die Verfahren zum Waschen, Trocknen und die Autoradiographie der Plots wurden wie beschrieben durchgeführt (Maniatis et al., supra). 29 Plaques, die DNA enthielten, die mit der Sonde stark hybridisiert waren, wurden selektioniert, amplifiziert und dreimal einem Screening (Reihentest) unterzogen, um die Reinheit des Klons zu gewährleisten. Die DNA wurde aus den amplifizierten Klonen isoliert für die Restriktions- Nucleasedigestion, die Southern-Analyse und die Subklonierung von Restriktions-Fragmenten.
  • Ein als Inhibitor IIK bezeichneter Klon, der ein 8- kbp EcoRI-Insert enthielt, hybridisierte am stärksten mit der durch eine Verletzung (Wunde) induzierten cDNA-Sonde und wurde isoliert und charakterisiert mit Restriktions- Enzymen. Ein 2,6-kbp Taq 1-Fragment wurde einer weiteren Restriktions-Analyse und Sequenzierung unterworfen. Die Fig. 5 zeigt eine Restriktionskarte eines 2,6-kbp- Fragments (pRT8), welches das Inhibitor IIK-Gen enthielt, das aus einem 8-kbp-Insert aus einer Kartoffel-Genom- Bibliothek in einem Phagen erhalten wurde. Die Sequenzierungs-Strategie für das Struktur-Gen und seine Flankierungs-Regionen ist nachstehend angegeben (d.h. durch die Pfeile in der Fig. 5). Zur Sequenzierung wurden in den M13 Vektoren Subklone hergestellt und die Pfeile in der Fig. 5 zeigen die Richtung und den Umfang der Sequenzierung an; und in der Fig. 5 werden die folgenden Abkürzungen verwendet: E = EcoRI; P = Pst I, B = BamIII; Hd = HindIII; A = Acc I; T = Taq I; R = Rsa I; S = Sau3A; Bc = Bd I; Sc = Sca I; M = Msp I; Sp = Sph I; H = Hae III.
    • DNA-Sequenz-Bestimmung
  • Zur Bestimmung der Nucleotid-Sequenz des Gens und seiner 5'-flankierenden Regulator-Sequenzen wurden ausgewählte Restriktions-Fragmente aus einem 2,6-kbp-Taq I- Insert erhalten und in verschiedene Stellen innerhalb eines M13-Bacteriophagen geklont. Die Bedingungen zum Klonen, Transformieren, Vermehren von M13, zur Isolierung sowohl der replikativen Form als auch der Einzelstrang-DNA und der Dideoxy-Sequenzierung waren wie in den publizierten Verfahren angegeben (J. Messing et al., "Nucl. Acids Res." 9:309-311, 1981; und J. Vieira et al. "Gene", 19:259-268, 1982).
  • Analysen der Restriktions-Fragmente wurden nach der Southern-Methode durchgeführt (E. Southern, "J. Mol. Biol.", 98:503-517, 1975). Nach der Restriktions- Endonuclease-Digestion wurden DNA-Proben auf Agarose-Gelen abgetrennt, mit Ethidiumbromid angefärbt, denaturiert, neutralisiert und auf Genescreen-Membranen übertragen. Die Vorhybridisierungslösung enthielt 10 % Dextransulfat, 50 % entionisiertes Formamid, 1 % NaDodSO&sub4; und 1 M NaCl. Die Hybridisierung wurde in der gleichen Lösung 16 h lang nach der Zugabe von erhitzer Nick-translatierter Inhibitoren II-cDNA (J. Graham et al., supra) und 100 µl Lachsspermien-Träger-DNA (10 mg/ml) durchgeführt. Die Membranen wurden zweimal in 2xSSC bei Raumtemperatur, dann in 2 x SSC/1 % NaDodDSO&sub4; 30 min lang bei 55ºC gewaschen. Die Autoradiographie wurde zu verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt unter Verwendung eines Calciumwolframat-Verstärkerschirms. Die Nucleotidsequenz des Kartoffel-Inhibitor IIK-Gen und sein codiertes Protein sind in der Fig. 6 angegeben (Thornburg et al., supra). Das Gen ähnelt einem Inhibitoren II-Gen, das aus der Diploid-Kartoffel-Linie HH80 12017 isoliert wurde (M. Keil et al., "Nucleic Acids Res." 14:5641-5650, 1986).
  • In der 5'-Region des Gens ist die putative Regulator- Sequenz TATAA 72 bp stromaufwärts von dem Initiierungs- Kodon und 24 bp stromaufwärts von dem Transkriptions-Start angeordnet, was angenommen wird durch Vergleich mit der Tomaten-Inhibitor II-Abschluß-Stelle (J. Lee et al., supra), die durch Primer-Extensions-Experimente bestimmt wurde, bei dem Nucleotid 258 (dicker Pfeil, Fig. 6). Die Fig. 6 zeigt die Nucleotidsequenz eines 1,24 kbp-Fragments des Inhibitor IIK-Gens und der flankierenden Sequenzen. Die TATA-Box und das Polyadenylierungs-Signal AATAAG sind unterstrichen. Die großen Pfeile zeigen die Stelle des Transkriptions-Beginns an; die kleinen Pfeile zeigen die Stelle der Polyadenylierung in den homologen Tomaten- Inhibitor II cDNA-Sequenzen an. Die Numerierung der Aminosäuren beginnt an dem NH&sub2;-Ende der Übergangs-Sequenz. Das naszierende Protein wird, wie angenommen wird, während oder nach der Synthese zwischen den Aminosäureresten 30 und 31 behandelt zur Bildung des reifen Inhibitors.
    • Vektor-Konstruktionen
  • Die Isolierung und Charakterisierung des Proteinase- Inhibitor IIK-Gens aus Kartoffeln schuf die Gelegenheit, die potentiellen Regulator-Regionen dieses scheinbar durch eine Verletzung induzierbaren Gens mit dem offenen Leseraster des CAT-Gens zu fusionieren, um die Fähigkeiten des Promotors und des Terminators zu testen, CAT unter durch eine Verletzung induzierbarer Kontrolle zu exprimieren. Eine SCA I-Stelle in dem Inhibitor II-Gen (Fig. 5) 18 Basen stromaufwärts von dem Translations-Initiierungskodon und 30 Basen stromabwärts von der putativen Transkriptions-Start-Stelle wurde verwendet, um ein 1000-bp-Fragment der 5'-flankierenden Bereiche des Gens für das Vektor- Konstrukt zu erhalten. Eine Rsa I-Stelle (Frequenz) 11 bp stromaufwärts von dem Terminations-Kodon des Inhibitor IIk-Gens ergab ein 3'-Fragment von 1000 bp, das auch für die Konstruktion des fusionierten Gens verwendet werden konnte. Die resultierende Konstruktion, als pRT45 bezeichnet (Thornburg et al., supra.), eliminierte fast den gesamten offenen Leseraster des Inhibitor IIK-Gens aus der potentiellen Translation einschließlich der Signal- oder Übergangs-Sequenz und der dazwischenliegenden 117-bp- Sequenz. Die wesentlichen Komponenten des mit dem Inhibitor IIK-CAT-fusionierten Gens und dessen Position in dem Transformationsvektor pRT45 sind in der Fig. 7 angegeben.
  • Die Strategie für die Konstruktion war folgende: das 2,6-kbp Taq I-Fragment eines Plasmids pRT8 (Fig. 5), welches das gesamte Inhibitor IIK-Gen mit den obengenannten 3'- und 5'-Sequenzen enthielt, wurde aus einer niedrigschmelzenden Agarose gereinigt, dann mit Msp I digestiert und das 1.35-kbp Taq I/Msp I-Fragment, welches das 5'-Ende des Inhibitors IIK enthielt, wurde zurückgewonnen und an die Acc I-Stelle von pUC13 ligiert. Das Insert wurde mit Pst I (in dem Multilinker) und Sca I entfernt und in eine Pst I/HindII-Stelle von pUC13 ligiert unter Bildung des Plasmids pRT24. Die Sequenzierung beider Enden zeigte, daß dieser Klon das 5'-Ende des Inhibitor IIK-Gens enthielt, das 18 bp stromaufwärts von dem ATG-Start-Kodon endete. Ein 782-bp BglII/BamHI-Fragment, welches die gesamte Codierungs-Region des CAT-Gens enthielt, wurde aus pGA425 isoliert (Maniatis et al, supra) und in die einzelne Bam- HI-Stelle in dem Plasmid pRT24 an dem stromabwärts gelegenen Ende des Inhibitor IIK-Promotors inseriert. Ein 1000- bp Rsa I-Fragment, welches die 3'-flankierende Region des Inhibitor IIK-Gens und 11 bp des offenen Leserasters mit einem TAA-Stopp-Signal enthielt, wurde an dem 3'-Ende des CAT-Gens inseriert unter Bildung von pRT41. pRT41 wurde in die HindIII-Stelle von pGA482 (G. An, "Plant Physiol.", 81:86-91, 1986) und in einen binären Ti-Plasmid-Vektor kloniert unter Bildung von pRT45, um den Pflanzen das Chimären-Gen zuzuführen.
  • Die Sequenz des Chimären-Gens bei der 5'-Fusion (Daten nicht angegeben) zeigte, daß der offene Inhibitor IIK-Leseraster + 18 bp der nicht-translatierten 5'-Region durch die CAT-Codierungsregion und 42 bp ihres eigenen nicht-translatierten 5'-Region ersetzt worden waren. Diese Konstruktion brachte den Translations-Initiierungscodon des CAT-Gens in eine Position 80 bp stromabwärts von der Transkriptions-Initiierungsstelle im Vergleich zu 47 bp in dem intakten Inhibitor IIK-Gen. Die Anwesenheit der Terminierungs-Region des Inhibitor II-Gens in pRT41 wurde durch Southern-Hybridisierung nachgewiesen.
  • Eine zweite Konstruktion war identisch mit dem pRT45, jedoch mit der Ausnahme, daß die 3'-Region des Inhibitor 11-Gens in dem Konstrukt durch die Terminator-Sequenz des 6b-Gens von ptia6 ersetzt wurde. In diesem Konstrukt wurde das Plasmid pRT24, welches die 5'-Region des Inhibitors II enthielt, in pGA492 inseriert (G. An, supra.), bei dem es sich um einen binären Transformationsvektor handelt, der die offene Lesecodierungs-Region von CAT mit dem 6b- Terminator ab dem Ti-Plasmid enthält. Dieser Vektor weist eine Polylinker-Stelle an dem 5'-Ende der CAT- Codierungsregion auf zum Klonieren in ausgewählten Promotor-Sequenzen. Die 1000-bp-Inhibitor II-5'-Region wurde in eine Bgl 11-Stelle von PGA492 kloniert, um die identische Fusion zwischen dem Inhibitor II-Promotor und dem CAT-Gen, wie es in pRT45 gefunden wurde, zu erzeugen. Deshalb war der einzige Unterschied in den Gen-Fusionen zwischen pRT45 und pRT50 die Terminator-Region.
  • Die beiden Konstrukte pRT45 und pRT50 (Fig. 7) schufen die Gelegenheit, die Effekte der beiden Terminatoren auf die Expressions-Werte des CAT, die durch die Inhibitor IIK-5'-Region reguliert (gesteuert) wurde, direkt mitein ander zu vergleichen. Die Fig. 7 (oben) zeigt die Konstrukte in dem binären Ti-Vektor, der 1000 bp der Inhibitor 11K (INH II)-5'-Region, beginnend 18 bp stromaufwärts von dem Translations-Initiierungscodon, und 1000 bp des Inhibitors IIK-3', beginnend 11 bp stromaufwärts von dem Translations-Terminierungscodon, fusioniert mit dem offenen Leseraster des CAT-Gens (pRT45), und ein ähnliches Konstrukt, das die 5'-Region des Inhibitor IIK-Gens und den offenen CAT-Leseraster, jedoch mit dem 6b-Terminator des Ti-Plasmids A6 anstelle des Inhibitor IIK-Terminators (pRK50), enthielt. Die Fig. 7 (unten) zeigt eine kreisförmige Karte pRT45. Die schraffierten Regionen sind solche des Inhibitor IIK-Gens und die ausgefüllte Region ist aus pUC13 und die folgenden Abkürzungen werden in der Fig. 7 verwendet: BL = T-DNA am linken Rand; BR = T-DNA am rechten Rand; nos-npt = eine chimäre nos-npt-Fusion für einen Pflanzen-selektierbaren Marker; bla = β-Lactamase-Gen; TcR = Tetracyclin-resistent; TINH II = Inhibitor IIK- Terminator; PINH II' = Inhibitor IIK-Promotor.
    • Transformation von Tabak-Geweben
  • Zur Herstellung von transgenetischen Pflanzen, in denen das Fremd-CAT-Gen, das operativ an die Inhibitor II Regulator-Region gebunden war, getestet werden konnte, wurden Plasmide, die in E. coli konstruiert worden waren, in Agrobacterium tumefaciens PC2760 überführt, welches das Helfer-Ti-Plasmid AL4404 enthielt (A. Hoekema at al., "Nature" 303:179-181, 1983) nach der triparentalen Paarungsmethode (G. Ditta et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 77:7347-7351,1980). Die Struktur der übertragenen Plasmide wurde nach der Rückpaarung zu E. coli analysiert. Agrobacterium-Zellen, die sowohl das Helfer-Ti-Plasmid als auch den binären Vektor, der die Inhibitor IIK-CAT-Fusion enthielt, trugen, wurden gemeinsam 2 Tage lang mit Blatt- Stücken von sterilen Tabak-Pflanzen kultiviert (G. An et al., "Plant Physiol.", 81:301-305, 1986). Die Bakterienzellen wurden abgewaschen und es wurden transformierte Tabak-Kalli in einem Murashige-Skoog-Agarmedium, das 3% Saccharose, Kanamycin (200 mg/l), Cefotaxim (250 mg/l) und eine geeignete Menge Pflanzenhormon (Naphthalinsäure in einer Menge von 2 mg/l und Benzyladenin in einer Menge von 0,5 mg/l für die Kallus-Induktion; Benzyladenin in einer Menge von 0,5 mg/l für die Sproß(Trieb)-Induktion) enthielt, selektioniert. Die gemeinsam kultivierten Pflanzenzellen wurden bei 28ºC unter Belichtung (3000 lux) 12 h/Tag inkubiert. Die transformierten Tabak-Gewebe wurden innerhalb von 3 bis 4 Wochen nach der gemeinsamen Kultivierung sichtbar gemacht. Die Gewebe wurden auf ein anderes Medium übertragen, das genau die gleichen Bestandteile enthielt, und sie wurden wie oben beschrieben weiter inkubiert. Es wurden Pflanzen regeneriert auf dem Murashige-Skoog-Agarmedium, das die gleiche Konzentration an Saccharose und Antibiotika enthielt, dem jedoch die Pflanzenhormone fehlten. Die regenerierten Pflanzen wurden in Töpfe überführt und in einem Gewächshaus unter natürlichem Licht, ergänzt durch künstliches Licht, wachsen gelassen. Versuche zur Bestimmung der Induzierbarkeit des CAT-Gens in transpenetischen Pflanzen.
  • Zur Bestimmung der Methyljasmonat-induzierten Expression der CAT-Aktivität wurden transformierte Tabak- Pflanzen (Größe 20 bis 30 cm) verwendet (C.M Gorman et al., "Mol. Cell. Biol.", 2:1044-1051, 1982). Jede Pflanze wurde in einen versiegelten 1250 ml-Kolben mit einem Baumwoll-Tampon gestellt, der entweder 1 ml 10 % (Vol./Vol.) Methyljasmonat in Ethanol oder 1 µl Ethanol als Kontrolle enthielt. Nach 20-stündiger Inkubation bei 28ºC unter konstanter Belichtung (300 µEm&supmin;²s&supmin;¹) wurden zwei Blätter jeder Pflanze in bezug auf die CAT-Aktivität untersucht unter Verwendung von 100 µg Blatt-Protein und einer Versuchsdauer von 60 min bei 37ºC. Es wurden Extrakte von den Tabak-Blättern hergestellt durch Mahlen der Blätter mit einem kleinen Mörser und Pistill und Auspressen des Saftes aus den Bruchstücken durch Auspressen desselben mit dem Pistill. Der Saft wurde 2 min lang mit 10 000 x g zentrifugiert und die klare überstehende Flüssigkeit wurde abgetrennt für die Proteinanalyse nach der Bradford-Methode (M. Bradford, "Anal. Biochem.", 72:248-254, 1976). Eine Menge aus jedem Extrakt, der 100 µg Protein enthielt, wurde in bezug auf die CAT-Aktivität wie beschrieben untersucht unter Anwendung einer Versuchsdauer von 60 min bei 37ºC mit Chloramphenicol als Substrat (C.M. Gorman et al., supra.). Die in der Fig. 8 dargestellten Ergebnisse zeigen die CAT-Aktivität in Doppel-Proben (d.h. in zwei Blättern) aus jeder von vier (d.h. 1, 2, 3, 4) Kontroll- oder Methyljasmonat-Transgen-Pflanzen. Die Methyljasmonat induzierte Expression des Fremd-CAT-Gens wurde an die Inhibitor II-5'-Flankierungs-Regulator-Sequenz in allen vier Pflanzen gekuppelt; in den Kontrollen wurde keine CAT- Aktivität festgestellt. Diese Ergebnisse zeigen, daß Methyljasmonat die Expression eines Fremd-Gens, das mit einer Abwehr-Protein-5'-Regulator-Region (beispielsweise der präsumptiven Inhibitoren IIK-Gen-5'-Promotor-Region) operativ verbunden war, induzierte.
  • Die Erfindung wurde zwar vorstehend in Verbindung mit repräsentativen Ausführungsformen und Beispielen näher beschrieben, für den Fachmann auf diesem Gebiet sind jedoch aus der vorstehenden Beschreibung verschiedene Modifikationen und Äquivalente ohne weiteres ersichtlich.

Claims (12)

1. Verfahren zur Behandlung von Pflanzen, die eine Protein-codierende Nucleotidsequenz aufweisen, die operativ mit einer eine Wunde(Angriff)-induzierenden 5'-regulatorischen Nucleotidsequenz verbunden sind, das umfaßt das Inkontaktbringen der Pflanzen mit einer zur Induktion der Bildung des Proteins durch die Pflanzen wirksamen Menge eines Induktionsmittels der Formel
worin R&sub1; für H, niederes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder einen Trägerliganden steht; R&sub2; und R&sub3; unabhängig voneinander ausgewählt werden aus H, -OH, =O oder niederem Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen;
wobei das Induktionsmittel gegebenenfalls durch eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung an den C&sub2;:C&sub3;-, C&sub3;:C&sub4;-, C&sub3;:C&sub7;-, C&sub4;:C&sub5;-, C&sub5;:C&sub6;-, C&sub6;:C&sub7;- oder C&sub9;:C&sub1;&sub0;-Bindungen gebunden ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Protein-codierende Nucleotidsequenz Predator-Abwehr-Proteine codiert.
3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Protein-codierende Nucleotidsequenz ein Fremdgen ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, worin das ein Abwehr-Protein induzierende Agens ausgewählt wird aus der Gruppe, die besteht aus Jasmonsäure, 7-iso-Jasmonsäure, 9,10-Dihydrojasmonsäure, 2, 3-Didehydrojasmonsäure, 3,4-Didehydrojasmonsäure, 3,7-Didehydrojasmonsäure, 4,5-Didehydrojasmonsäure, 5,6-Didehydrojasmonsäure, 6,7-Didehydrojasmonsäure, 7,8-Didehydrojasmonsäure und den niederen Alkylestern, den Trägerliganden-Konjugaten und Stereoisomeren davon.
5. Verfahren nach Anspruch 1, worin das ein Abwehr-Protein induzierende Agens Jasmonsäure oder Methyljasmonat ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Pflanzen mit dem ein Abwehr-Protein induzierenden Agens in Kontakt gebracht werden, indem man die Pflanzen mit einer Lösung des Agens behandelt.
7. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Pflanzen mit dem ein Abwehr-Protein induzierenden Agens in Kontakt gebracht werden, indem man eine flüchtige Quelle des Agens in der Nähe der Pflanzen anordnet und das Agens sich durch die umgebende Atmosphäre in den Pflanzen verteilen läßt.
8. Verfahren nach Anspruch 2, worin die Abwehrproteine ausgewählt werden aus der Gruppe, die besteht aus Proteinase-Inhibitoren, Thioninen, Chitinasen, β-Glucanasen, Casben-Synthase, Enzymen des Phenylpropenoid-Durchgangs, Enzyme des Terpenoid-Durchgangs und Enzymen der Alkaloid- Synthese.
9. Verfahren nach Anspruch 2, worin die Abwehr-Proteine Proteinase-Inhibitoren sind.
10. Verfahren nach Anspruch 2, worin die Abwehr-Proteine durch die Expression von endogenen Genen in den Pflanzen gebildet werden.
11. Verfahren nach Anspruch 2, worin die Abwehr-Proteine durch die Expression von transgenetisch induzierten Genen gebildet werden.
12. Verwendung eines Agens der Formel
worin R&sub1; für H, niederes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder einen Trägerliganden steht; R&sub2; und R&sub3; unabhängig voneinander ausgewhhlt werden aus H, -OH, =O oder niederem Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen;
wobei das Induktionsmittel gegebenenfalls durch eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung an den C&sub2;:C&sub3;-, C&sub3;:C&sub4;-, C&sub3;:C&sub7;-, C&sub4;:C&sub5;-, C&sub5;:C&sub6;-, C&sub6;:C&sub7;- oder C&sub9;:C&sub1;&sub0;-Bindungen gebunden ist,
zum Induzieren der Bildung eines Proteins durch eine Protein-codierende Nucleotidsequenz, die operativ mit einer eine Wunde(Angriff) induzierenden 5'-regulatorischen Nucleotidsequenz in der Pflanze verbunden ist.
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