DE69233032T2

DE69233032T2 - Biozide proteine

Info

Publication number: DE69233032T2
Application number: DE69233032T
Authority: DE
Inventors: Frans Broekaert; Philippe Cammue; William Osborn; Bronwen Rees; Raymond Terras; Jozef Vanderleyden
Original assignee: Syngenta Ltd
Current assignee: Syngenta Ltd
Priority date: 1991-08-29
Filing date: 1992-08-27
Publication date: 2003-11-27
Anticipated expiration: 2012-08-28
Also published as: AU667825B2; BR9206420A; CA2116541A1; AU2480892A; WO1993005153A1; NZ244091A; DK0603216T3; EP0603216B1; EP0603216A1; JPH06510197A; JP3375130B2; ATE239080T1; DE69233032D1; ES2193135T3

Description

Diese Erfindung betrifft biozide Proteine, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung und für sie codierende DNA-Sequenzen. Insbesondere betrifft sie antimikrobielle Proteine, die aus Samen wie jenen der Mitglieder der Brassicaceae-, Compositae- oder Leguminosae-Familien isoliert werden.
In diesem Zusammenhang werden antimikrobielle Proteine als Proteine definiert, die wenigstens eine der folgenden Aktivitäten besitzen: Antipilzaktivität (die Antihefeaktivität einschließen kann); antibakterielle Aktivität. Aktivität schließt eine Reihe von antagonistischen Effekten ein, wie partielle Hemmung oder Tod.
Die Brassicaceae ist eine große Familie von Kräutern und Sträuchern, die weitverbreitet in tropischen, subtropischen und gemäßigten Gebieten wachsen. Die Familie Brassicaceae ist ebenfalls als "Cruciferae" bekannt. Raphanus sativus (Rettich) gehört zu dieser Familie und wird weitverbreitet als Gemüse kultiviert.
Dahlia gehört zu den Compositae und wird ausgedehnt als Ziergartenpflanze kultiviert. Eine Anzahl von Hybriden sind gewerblich erhältlich, die zu den Arten Dahlia merckii oder Dahlia variablis gehören. Cnicus benedictus, eine andere Composite, ist eine einheimische Pflanze der Mittelmeerregionen und wurde früher als Stärkungsmittel und Heilmittel für Gicht verwendet.
Lathyrus und Clitoria gehören zur Leguminosae-Familie. Lathyrus wird ausgedehnt als Ziergartenpflanze kultiviert, wobei die am weitesten bekannte die Wicke ist, Lathyrus odoratus. Die Gattung Clitoria ist den europäischen Gärtnern weniger gut bekannt; Clitoria ternatea wurde ursprünglich aus den Ostindischen Inseln im 19. Jahrhundert eingeführt.
Obwohl Pflanzen normalerweise auf Substraten wachsen, die äußerst reich an Pilzorganismen sind, bleibt eine Infektion ein seltenes Ereignis. Um potentielle Eindringlinge auszuschließen, erzeugen Pflanzen ein breites Spektrum von Antipilzverbindungen, entweder in einer konstitutiven oder induzierbaren Weise. Die von diesen am besten untersuchten sind die Phytoalexine, die sekundäre Metaboliten mit einem breiten antimikrobiellen Wirkungsspektrum sind, die spezifisch bei Wahrnehmung von entsprechenden verteidigungsbezogenen Signalmolekülen synthetisiert werden. Die Erzeugung von Phytoalexinen hängt von der Transkriptionsaktivierung einer Reihe von Genen ab, die Enzyme für den Phytoalexin-Biosyntheseweg codieren. Während des letzten Jahrzehnts wurde es jedoch zunehmend ersichtlich, daß einige Pflanzenproteine eine direktere Rolle in der Bekämpfung von phytopathogenen Pilzen spielen können. Verschiedene Klassen von Proteinen mit Antipilzeigenschaften sind identifiziert worden, einschließlich Chitinasen, beta- 1,3-Glucanasen, Chitin-bindenden Lectinen, Zeamatinen, Thioninen und Ribosom-inaktivierenden Proteinen.
Diese Proteine haben eine beträchtliche Aufmerksamkeit erlangt, da sie potentiell als Biobekämpfungsmittel verwendet werden könnten. Die Chitinasen und beta-1,3-Glucanasen besitzen schwache Aktivitäten als solche und sind nur hemmend für Pflanzenpathogene, wenn sie in Kombination eingesetzt werden (Mauch et al., 1988, Plant Physiol, 88, 936-942). Die Chitinbindenden Lectine können ebenfalls als relativ schwache Antipilzfaktoren klassifiziert werden (Broekaert et al., 1989, Science, 245, 1100-1102; von Parijs et al., 1991, Planta, 183, 258-264). Zeamatin ist ein wirksameres Antipilzprotein, aber seine Aktivität wird stark durch die Gegenwart von Ionen in physiologischen Konzentrationen reduziert (Roberts und Selitnermikoff, 1990, G Gen Microbiol, 136, 2150-2155). Schließlich sind Thionine und Ribosom-inaktivierende Proteine potentiell gefährlich, da sie als toxisch für menschliche Zellen bekannt sind (Carrasco et al., 1981, Eur J Biochem, 116, 185-189; Vernon et al., 1985, Arch Biochem Biophys, 238, 18-29; Stirpe and Barbieri, 1986, FEBS Lett, 195, 1-8).
Wir haben jetzt eine neue Klasse von wirksamen antimikrobiellen Proteinen mit breitem Wirkungsspektrum gegen pflanzenpathogene Pilze und mit einer gewissen antibakteriellen Aktivität, moderater Empfindlichkeit gegenüber Ionen und offensichtlich geringer Toxizität für kultivierte menschliche Zellen gereinigt.
Erfindungsgemäß wird ein antimikrobielles Protein mit einer Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe wie in den Fig. 27 bis 29 gezeigt ausgewählt ist, oder mit einer Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe aus den in Fig. 30 gezeigten Sequenzen ausgewählt ist, wobei die Gruppe aus Rs-AFP1, Dm-AMP1, Cb-AMP1, Cb-AMP2, Lc-AFP und Ct-AMP1 besteht, oder mit einer Aminosäuresequenz wie in Fig. 37 für reifes Rs-AFP2 gezeigt oder Varianten davon bereitgestellt, wobei die Varianten eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 85% Ähnlichkeit aufweisen, wenn sie mit einer beliebigen der Sequenzen ausgerichtet werden, und worin bei Ausrichtung mit der Sequenz alle Cystein-Reste konserviert sind und es einen aromatischen Rest in den Positionen gibt, die zu den Positionen 11 und 40 der in Fig. 30 gezeigten Rs-AFP1-Sequenz äquivalent sind.
In weiteren Aspekten umfaßt diese Erfindung einen Vektor, der eine für ein erfindungsgemäßes Protein codierende DNA-Sequenz enthält. Die DNA kann in ein biologisches System kloniert oder transformiert werden, was die Expression des codierten Proteins erlaubt.
Die Erfindung umfaßt ebenfalls Pflanzen, die mit rekombinanter DNA transformiert sind, die ein erfindungsgemäßen antimikrobielles Protein codiert.
Die Erfindung umfaßt ebenfalls ein Verfahren zur Bekämpfung von Pilzen oder Bakterien, wobei sie den erfindungsgemäßen Proteinen ausgesetzt werden.
Eine neue Klasse von wirksamen antimikrobiellen Proteinen wurde aus Samen der Brassicaceae, der Compositae und der Leguminosae isoliert. Ähnliche Proteine können in anderen Pflanzenfamilien, -gattungen und -arten gefunden werden. Die Klasse schließt Proteine ein, die eine gemeinsame Aminosäuresequenz teilen, und die eine Aktivität gegen eine Reihe von pflanzenpathogenen Pilzen zeigen.
Die aus Samen von Raphanus sativus (Rettich) isolierten antimikrobiellen Proteine schließen zwei Proteinfaktoren ein, die nachfolgend als Rs-AFP1 (Raphanus sativus - Antipilzprotein 1) bzw. Rs-AFP2 (Raphanus sativus - Antipilzprotein 2) bezeichnet werden. Beide sind oligomere Proteine, die aus identischen 5 kDa-Untereinheiten zusammengesetzt sind. Beide Proteine sind hoch basisch und haben pI-Werte von mehr als 10. Ähnliche Antipilz-Proteine wurden aus anderen Brassicaceae isoliert, einschließlich Brassica napus (Bn-AFPs), Brassica rapa (Br-AFPs), Sinapis alba (Sa-AFPs) und Arabidopsis thaliana (At-AFP1).
Die aus Samen von Dahlia und Cnicus isolierten antimikrobiellen Proteine schließen vier Proteinfaktoren ein, die nachfolgend als Dm-AMP1 (Dahlia merckii - antimikrobielles Protein 1), Dm-AMP2 (Dahlia merckii - antimikrobielles Protein 2), Cb-AMP1 (Cnicus benedictus - antimikrobielles Protein 1) bzw. Cb-AMP2 (Cnicus benedictus - antimikrobielles Protein 2) bezeichnet werden. Die Dm-AMP-Proteine können aus Samen der Dahlia-Gattung isoliert werden. Die Cb-AMP-Proteine können aus Samen der Cnicus-Gattung isoliert werden. Alle vier Proteine sind eng verwandt und sind aus 5 kDa- Untereinheiten zusammengesetzt, die als oligomere Strukturen angeordnet sind. Alle vier Proteine sind hoch basisch.
Die aus Samen von Lathyrus und Clitoria isolierten antimikrobiellen Proteine schließen drei Proteinfaktoren ein, die nachfolgend als Lc-AFP (Lathyrus cicera - Antipilzprotein), Ct-AMP1 (Clitoria ternatea - antimikrobielles Protein 1) bzw. Ct-AMP2 (Clitoria ternatea - antimikrobielles Protein 2) bezeichnet werden. Lc-AFP kann aus Samen der Lathyrus-Gattung isoliert werden. Die Ct-AMP-Proteine können aus Samen der Clitoria-Gattung isoliert werden. Alle drei Proteine sind aus 5 kDA-Untereinheiten zusammengesetzt, die als oligomere Strukturen angeordnet sind, und sind hoch basisch.
Die N-terminale Aminosäuresequenz-Bestimmung hat gezeigt, daß die aus den Brassicaceae, Compositae und Leguminosae isolierten obigen Proteine eng verwandt sind und als eine einzelne Proteinfamilie klassifiziert werden können. Zwischen den unterschiedlichen Pflanzenfamilien sind die Proteinsequenzen zu etwa 50% identisch. Diese Sequenzen ermöglichen die Herstellung der Proteine durch chemische Synthese unter Verwendung eines standardmäßigen Peptid-Synthesegenerators.
Die antimikrobiellen Proteine sind partiell homolog zu den vorhergesagten Proteinprodukten der Fusarium-induzierten Gene pI39 und pI230 in der Erbse (Pisum sativum - ein Mitglied der Leguminosae-Familie), wie von Chiang und Hadwiger beschrieben, 1991 (Mol Plant Microbe Interact, 4, 324- 331). Diese Homologie wird mit dem vorhergesagten Proteinprodukt des pSAS10-Gens aus der Augenbohne (Vigna unguiculata - eine andere Leguminose) geteilt, wie von Ishibashi et al. beschrieben (Plant Mol Biol, 1990, 15, 59-64). Die antimikrobiellen Proteine sind ebenfalls partiell homolog mit dem vorhergesagten Proteinprodukt von Gen pI322 in der Kartoffel (Solanum tuberosum - ein Mitglied der Solanaceae-Familie), wie von Stiekema et al. beschrieben, 1988 (Plant Mol Biol, 11, 255-269). Nichts ist über die biologischen Eigenschaften der Proteine bekannt, die durch die Gene pI39, pI230, pSAS10 oder pI322 codiert werden, dann nur die cDNA untersucht wurde. Jedoch werden die pI39-, pI230- und pI322-Gene nach Exposition der Pflanze mit einer Krankheit oder andern Streß eingeschaltet. Es wurde vorgeschlagen, daß das pSAS10-Gen ein an der Keimung beteiligtes Protein codiert. Aufgrund ihrer Sequenzähnlichkeit mit den antimikrobiellen Proteinen der Erfindung können die durch die pI39-, pI230-, pSAS10- oder pI322-Gene codierten Proteine als Fungizide oder als Antibiotika nützlich sein.
Die antimikrobiellen Proteinsequenzen zeigen einen geringeren Grad an partieller Homologie mit den Sequenzen einer Gruppe von kleinen α-Amylase- Hemmern, die in den folgenden Mitgliedern der Gramineae gefunden werden: Sorghum (Bloch und Richardson, 1991, FEBS Lett, 279: 101-104), Weizen (Colitta et al., 1990, FEBS Lett, 270: 191-194) und Gerste (Mendez et al., 1990, Eur J Biochem, 194: 533-539). Solche Proteine, einschließlich SIα2 aus Sorghum und γ-1-Purothionin aus Weizen, sind für die Hemmung von Insektenα-Amylase bekannt und sind toxisch für Insektenlarven. Es ist nicht bekannt, ob diese α-Amylase-Hemmer eine Antipilz- oder andere antimikrobielle Aktivität zeigen: keine anderen Daten über ihre biologische Aktivität wurden angegeben. Aufgrund ihrer Sequenzähnlichkeit mit den antimikrobiellen Proteinen der Erfindung können die α-Amylase-Inhibitorproteine nützlich als Fungizide oder als Antibiotika sein.
Ein drittes Antipilzprotein wurde aus Rettichsamen isoliert, nachfolgend als Rs-nsLTP bezeichnet (Raphanus sativus, nicht-spezifisches Lipidtransferprotein). Es ist ein dimeres Protein, das aus zwei identischen 9 kDa-Untereinheiten zusammengesetzt ist. Aminosäuresequenzbestimmung hat die 43 N-terminalen Reste von Rs-nsLTP identifiziert und hat gezeigt, daß es homolog mit nicht-spezifischen Lipidtransferproteinen ist, die aus anderen Pflanzen isoliert werden (Arondel und Kader, 1990, Experientia, 46: 579-585), aber nicht mit den anderen, oben erörterten antimikrobiellen Proteinen. Die Rs-nsLTP-Sequenz ermöglicht die Herstellung des Proteins durch chemische Synthese unter Verwendung eines standardmäßigen Peptid- Synthesegenerators.
Das Wissen um ihre Primärstruktur ermöglicht die Herstellung von DNA- Konstrukten, die die antimikrobiellen Proteine codieren. Die DNA-Sequenz kann aus der bekannten Aminosäuresequenz vorhergesagt werden, oder die Sequenz kann aus DNA-Banken, die aus Pflanzen stammen, isoliert werden.
Oligonukleotid-Sonden können aus der bekannten Aminosäuresequenz abgeleitet und zur Durchmusterung einer cDNA-Bank auf cDNA-Klone verwendet werden, die etwas oder das gesamte Protein codieren. cDNA-Klone, die die Rs-AFPs codieren, wurden auf diese Weise isoliert und sequenziert. Diese gleichen Oligonukleotid-Sonden oder cDNA-Klone können verwendet werden, um das (die) tatsächliche(n) AFP-, AMP- oder Rs-nsLTP-Gen(e) durch Durchmusterung genomischer DNA-Banken zu isolieren. Solche genomischen Klone können Kontrollsequenzen einschließen, die im Pflanzengenom arbeiten. Somit ist es ebenfalls möglich, Promotorsequenzen zu isolieren, die zum Antreiben der Expression der antimikrobiellen (oder anderen) Proteine verwendet werden können. Diese Promotoren können besonders reagierend auf Umweltbedingungen sein (wie die Gegenwart eines Pilzpathogens).
DNA, die die antimikrobiellen Proteine codiert (die ein cDNA-Klon, ein genomischer DNA-Klon oder unter Verwendung eines standardmäßigen Nukleinsäure-Synthesegenerators hergestellte DNA sein kann), kann dann in ein biologisches System kloniert werden, das die Expression der Proteine erlaubt. Daher können die Proteine in einem geeignetem Mikroorganismus oder einer Zellkultur erzeugt, extrahiert und zur Verwendung isoliert werden. Geeignete Mikroorganismen schließen Escherichia coli und Saccharomyces cerevisiae ein. Das genetische Material kann ebenfalls in ein Virus oder einen Bacteriophagen kloniert werden. Geeignete Zellen schließen kultivierte Insektenzellen und kultivierte Säugetierzellen ein. Die DNA kann ebenfalls durch bekannte Verfahren in jede Pflanzenart transformiert werden, so daß die antimikrobiellen Proteine innerhalb der Pflanze exprimiert werden.
Erfindungsgemäße Pflanzenzellen können mit Konstrukten der Erfindung gemäß einer Vielzahl bekannter Verfahren (Agrobacterium Ti-Plasmide, Elektroporation, Mikroinjektion, Mikroprojektilkanone, etc.) transformiert werden. Die transformierten Zellen können dann in geeigneten Fällen zu ganzen Pflanzen regeneriert werden, in denen das neue Kernmaterial stabil im Genom eingebaut ist. Sowohl transformierte einkeimblättrige als auch zweikeimblättrige Pflanzen können auf diese Weise erhalten werden, obwohl letztere gewöhnlich leichter zu regenerieren sind.
Beispiele für genetisch modifizierte Pflanzen, die hergestellt werden können, schließen Feldfrüchte, Getreide, Früchte und Gemüse ein wie: Raps, Sonnenblume, Tabak, Zuckerrübe, Baumwolle, Soja, Mais, Weizen, Gerste, Reis, Sorghum, Tomaten, Mangos, Pfirsiche, Äpfel, Birnen, Erdbeeren, Bananen, Melonen, Kartoffeln, Karotte, Salat, Kohl, Zwiebel.
Die AFP-, AMP- und Rs-nsLTP-Proteine zeigen ein weites Spektrum von Antipilzaktivität, einschließlich Antihefeaktivität, und die AMPs sind ebenfalls wirksam gegen Gram-positive Bakterien. Die Proteine sind nützlich als Fungizide oder Antibiotika. Kontakt eines Pflanzenpathogens mit einem antimikrobiellen Protein kann durch Ausbringung des Proteins auf Pflanzenteile unter Verwendung von standardmäßigen landwirtschaftlichen Techniken (z. B. Sprühen) erreicht werden. Die Proteine können ebenfalls zur Bekämpfung von pilzlicher oder bakterieller Krankheit durch Expression innerhalb der Pflanzenkörper verwendet werden.
Alle antimikrobiellen Proteine zeigen eine überraschend hohe Aktivität: sie hemmen das Wachstum einer Vielzahl von pflanzenpathogenen Pilzen in submikromolaren Dosen. Die Antipilzaktivität der AMPs ist nur teilweise abhängig von den ionischen Bedingungen. Die Antipilzwirkung der AFPs wird nicht durch K&spplus;-Ionen in physiologischen Konzentrationen (50 mM) beeinträchtigt. Der Antipilzwirkung von Rs-AFP1, aber nicht Rs-AFP2, wirkt Ca²&spplus; in physiologischen Konzentrationen (1 mM) entgegen. Rs-nsLTP hemmt ebenfalls das Wachstum einer Vielzahl von pflanzenpathogenen Pilzen, aber ist weniger wirksam und salzempfindlicher als die AFPs.
Die antimikrobiellen Proteine können aus entsprechenden Samen isoliert und gereinigt, künstlich aus ihrer bekannten Aminosäuresequenz synthetisiert oder innerhalb eines geeigneten Mikroorganismus durch Expression rekombinanter DNA erzeugt werden. Die Proteine können ebenfalls innerhalb einer transgenen Pflanze exprimiert werden.
Die Erfindung kann ferner unter Verweis auf die Zeichnungen verstanden werden, in denen gilt:
Fig. 1 zeigt das Kationen-Austauscherchromatogramm für die Raphanus- Antipilzproteine und das verbundene Diagramm der Pilzwachstumshemmung.
Fig. 2A zeigt das HPLC-Profil von gereinigtem Rs-AFP1.
Fig. 2B zeigt das HPLC-Profil von gereinigtem Rs-AFP2 und Rs-nsLTP.
Fig. 3 zeigt native Gel-Elektrophorese und Biozymographie der gereinigten Rs-AFP1 und Rs-AFP2.
Fig. 4 zeigt das Kationen-Austauscherchromatogramm für die B. napus- Antipilzproteine und das verbundene Diagramm der Pilzwachstumhemmung.
Fig. 5 zeigt das HPLC-Profil der gereinigten B. napus Antipilzproteine.
Fig. 6 zeigt das Kationen-Austauscherchromatogramm für B. rapa- Antipilzproteine und das verbundene Diagramm der Pilzwachstumshemmung.
Fig. 7 zeigt das HPLC-Profil von gereinigten B. rapa-Antipilzproteinen.
Fig. 8 zeigt das Kationen-Austauscherchromatogramm für S. alba- Antipilzproteine und das verbundene Diagramm der Pilzwachstumshemmung.
Fig. 9 zeigt das HPLC-Profil von gereinigten S. alba-Antipilzproteinen.
Fig. 10 zeigt das Kationen-Austauscherchromatogramm für A. thaliana- Antipilzprotein und das verbundene Diagramm der Pilzwachstumshemmung.
Fig. 11 zeigt das HPLC-Profil von gereinigten A. thaliana-Antipilzproteinen.
Fig. 12 zeigt das Kationen-Austauscherchromatogramm für den basischen Extrakt von Dahlia merckii und das entsprechende Diagramm der Antipilzaktivität.
Fig. 13 zeigt des Umkehrphasen-HPLC-Profil von gereinigtem Dm-AMP1 und Dm-AMP2.
Fig. 14 zeigt das Kationen-Austauscherchromatogramm für den basischen Extrakt von Cnicus benedictus und das entsprechende Diagramm der Antipilzaktivität.
Fig. 15 zeigt das Umkehrphasen-HPLC-Profil von gereinigtem Cb-AMP1.
Fig. 16 das Umkehrphasen-HPLC-Profil von gereinigtem Cb-AMP2.
Fig. 17 zeigt das Kationen-Austauscherchromatogramm für den basischen Extrakt von Lathyrus und das entsprechende Diagramm der Antipilzaktivität.
Fig. 18 zeigt das Umkehrphasen-HPLC-Profil von gereinigtem Lc-AFP.
Fig. 19 zeigt das Kationen-Austauscherchromatogramm für den basischen Extrakt von Clitoria und das entsprechende Diagramm der Antipilzaktivität.
Fig. 20 zeigt das Umkehrphasen-HPLC-Profil von gereinigtem Ct-AMP1.
Fig. 21 zeigt das Umkehrphasen-HPLC-Profil von gereinigtem Ct-AMP2.
Fig. 22 zeigt die SDS-PAGE-Analyse der gereinigten Rs-AFPs.
Fig. 23 zeigt die SDS-PAGE-Analyse des gereinigten Rs-nsLTP.
Fig. 24 zeigt die SDS-PAGE-Analyse der gereinigten Dm-AMPs.
Fig. 25 zeigt die SDS-PAGE-Analyse der gereinigten Cb-AMPs.
Fig. 26 zeigt die SDS-PAGE-Analyse des gereinigten Lc-AFP und der gereinigten Ct-AMPs.
Fig. 27 zeigt die Aminosäuresequenzen von Rs-AFP1, Rs-AFP2 und den verwandten Brassicaceae-Proteinen.
Fig. 28 zeigt die Aminosäuresequenzen der Dm-AMPs und der Cb-AMPs.
Fig. 29 zeigt die Aminosäuresequenzen von Lc-AFT und Ct-AMP1.
Fig. 30 zeigt die Ausrichtungen der Aminosäuresequenzen von Rs-AFP1, Dm-AMP1, der Cb-AMPs, von Lc-AFP, Ct-AMP1, Sorghum-Siα2, Weizen-γ1-Purothionin und der vorhergesagten Produkte der Erbsen-Gene pI230 und pI39, des Augenbohnen-Gens pSAS10 und des Kartoffel-Gens p322.
Fig. 31A zeigt vorhergesagte DNA-Sequenzen für die Dm-AMP- und Cb-AMP-Gene.
Fig. 31B zeigt vorhergesagte DNA-Sequenzen für die LC-AFP- und Ct-AMP1-Gene.
Fig. 32 zeigt die Aminosäuresequenz von Rs-nsLTP.
Fig. 33 zeigt die Ausrichtung der Aminosäuresequenzen von Rs-nsLTP und verschiedenen pflanzlichen nicht-spezifischen Lipid-Transferproteinen.
Fig. 34 ist ein Diagramm der Rs-AFP2-Aktivität in vivo.
Fig. 35 zeigt die cDNA-Sequenz voller Länge von Rs-AFP1.
Fig. 36 zeigt die gekürzte cDNA-Sequenz von Rs-AFP2.
Fig. 37 zeigt die DNA-Sequenz voller Länge aus PCR-gestützter ortsspezifischer Mutagenese von Rs-AFP2.
Fig. 38 zeigt den Expressionsvektor pFRG7.
Fig. 39 zeigt den Expressionsvektor pFRG8.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Antipilz- und antibakterielle Aktivitätstests

Die Antipilzaktivität wurde durch Mikrospektrophotometrie wie zuvor beschrieben gemessen (Broekaert, 1990, FEMS Microbiol Lett, 69: 55-60). Routinemäßig wurden Untersuchungen mit 20 ul einer (filtersterilisierten) Testlösung und 80 ul einer Suspension von Pilzsporen (2 · 10&sup4; Sporen/ml) in halbkonzentrierter Kartoffeldextrose-Bouillon (1/2 PDB) durchgeführt. Einige Untersuchungen wurden unter Verwendung einer Suspension aus Myzel-Fragmenten in einem synthetischen Wachstumsmedium durchgeführt. Das synthetische Wachstumsmedium bestand aus K&sub2;HPO&sub4; (2,5 mM), MgSO&sub4; (50 uM), CaCl&sub2; (50 uM), FeSO&sub4; (5 uM), CoCl&sub2; (0,1 uM), CuSO&sub4; (0,1 uM), Na&sub2;MoO&sub4; (2 uM), H&sub3;BO&sub3; (0,5 uM), KI (0,1 uM), ZnSO&sub4; (0,5 uM), MnSO&sub4; (0,1 uM), Glucose (10 g/l), Asparagin (1 g/l), Methionin (20 mg/l), Myoinosit (2 mg/l), Biotin (0,2 mg/l), Thiamin-HCl (1 mg/l) und Pyridoxin-HCl (0,2 mg/l). Kontroll- Mikrokulturen enthielten 20 ul steriles destilliertes Wasser und 80 ul der Pilzsuspension.
Wenn nichts anderes angegeben ist, war der Testorganismus Fusarium culmorum (Stamm IMI 180420), und die Inkubation erfolgte bei 25ºC für 48 Stunden. Die prozentuale Wachstumshemmung wird als das 100-fache des Verhältnisses der korrigierten Extinktion der Kontrollmikrokultur abzüglich der korrigierten Extinktion der Testmikrokultur gegenüber der korrigierten Extinktion bei 595 nm der Kontrollmikrokultur definiert. Die korrigierten Extinktionswerte sind, gleich der Extinktion bei 595 nm der Kultur, gemessen nach 48 Stunden, abzüglich der Extinktion bei 595 nm, gemessen nach 30 min.
Die antibakterielle Aktivität wurde mikrospektrophotometrisch wie folgt gemessen. Eine bakterielle Suspension wurde hergestellt, indem weiche Nähragarose (Trypton, 10 g/l; Seaplaque-Agarose (FMC), 5 g/l) geimpft wurde. Teilmengen (80 ul) der bakteriellen Suspension (10&sup5; koloniebildende Einheiten pro ml) wurden zu filtersterilisierten Proben (20 ul) in flachbödigen Mikroplatten mit 96 Vertiefungen gegeben. Die Extinktion bei 595 nm der Kultur wurde mit Hilfe eines Mikroplattenlesers nach 30 Minuten und 24 Stunden Inkubation bei 28ºC gemessen. Die prozentuale Wachstumshemmung wurde wie oben für den Antipilz-Aktivitätstest beschrieben berechet.

Beispiel 2

Extraktion der basischen Proteinfraktion aus Raphanus sativus-Samen

Der Ammoniumsulfat-Fraktionierung von Proteinen, die im Intervall von 30 bis 70% relativer Sättigung ausfielen, schloß sich eine Wärmebehandlung zur Entfernung wärmelabiler Proteine und eine Isolierung der basischen Proteinfraktion (pI > 9) durch Leiten über eine Anionen-Austauschersäule mit Q- Sepharose (Pharmacia) an, die bei pH 9 äquilibriert war. Die ausführlichen Methoden werden nachfolgend beschrieben.
1 kg R. sativus-Samen (erhalten von Aveve, Belien) wurde in einer Kaffeemühle gemahlen, und das resultierende Mehl wurde für 2 Stunden bei 4ºC mit 2 l eines eiskalten Extraktionspuffers extrahiert, der 10 mM NaH&sub2;PO&sub4;, 15 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 100 mM KCl, 2 mM EDTA, 2 mM Thioharnstoff und 1 mM PMSF enthielt. Das Homogenat wurde durch ein Seituch gedrückt und durch Zentrifugieren geklärt (30 min bei 7 000 · g). Festes Ammoniumsulfat wurde zum Überstand hinzugegeben, um eine 30%ige relative Sättigung zu erhalten, und der nach Stehenlassen über Nacht bei Raumtemperatur gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren entfernt (30 min bei 7 000 · g). Der Überstand wurde auf 70%ige relative Ammoniumsulfatsättigung eingestellt und der über Nacht bei Raumtemperatur gebildete Niederschlag durch Zentrifugieren aufgefangen (30 min bei 7 000 · g). Nach erneutem Auflösen des Pellets in 400 ml destilliertem Wasser wurde die Lösung für 15 Minuten auf 80ºC erwärmt. Das koagulierte unlösliche Material wurde durch Zentrifugieren entfernt (30 min bei 7000 · g), und der Überstand wurde sorgfältig gegen destilliertes Wasser unter Verwendung von Schlauchmaterial (SpectralPor, Spectrum, USA) mit einer Molekulargewichtsabgrenzung von 1 000 Da dialysiert. Nach der Dialyse wurde die Lösung auf 50 mM Tris-HCl (pH 9) durch Zugabe des 10-fach konzentrierten Puffers eingestellt und anschließend über eine Säule (12 · 5 cm) Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia, Uppsala, Schweden) im Gleichgewicht mit 50 mM Tris-HCl (pH 9) geleitet. Die durch die Säule geleitete Proteinfraktion wurde sorgfältig gegen destilliertes Wasser dialysiert und auf 50 mM Natrium-n-morpholinoethansulfonsäure (Na-MES), pH6, durch Zugabe des 10-fach konzentrierten Puffers eingestellt.
Dieses Material stellt die basische wärmestabile Proteinfraktion von R. sativus-Samen dar. Seine weitere chromatographische Reinigung wird in Beispiel 3 beschrieben.

Beispiel 3

Reinigung von Antipilzproteinen aus R. sativus-Samen

Das Ausgangsmaterial für die Isolierung der R. sativus-Antipilzproteine war die aus den reifen Samen wie in Beispiel 2 extrahierte basische wärmestabile Proteinfraktion. Diese Proteine wurden ferner durch Kationen- Austauscherchromatographie wie in Fig. 1 gezeigt getrennt.
Ca. 150 mg der in 50 mM Natrium-MES (pH 6) gelösten basischen wärmestabilen Proteinfraktion wurden auf eine Säule (10 · 1,6 cm) S-Sepharose High Performance (Pharmacia) aufgetragen, die zuvor mit dem Natrium-MES- Puffer äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 2,5 ml/min mit einem linearen Gradienten von 1000 ml von 0 nach 500 mM NaCl in 50 mM Natrium- MES-Puffer (pH 6) eluiert. Das Eluat wurde auf Protein durch Direktmessung der Extinktion bei 280 nm überwacht (Ergebnisse in der unteren Tafel der Fig. 1 gezeigt) und in 10 ml-Fraktionen aufgefangen. Von diesen Fraktionen wurden 20 ul im in Beispiel 1 beschriebenen mikrospektrophotometrischen Antipilz-Aktivitätstest unter Verwendung entweder des synthetischen Wachstumsmediums oder des gleichen Mediums, ergänzt mit 1 mM CaCl&sub2; und 50 mM KCl, untersucht.
Bei Fraktionierung lieferte die Mischung einen breiten Peak, der die ungebundene Fraktion darstellt, zwei gutaufgelöste Peaks (Peak 1 und Peak 2), die um 100 bzw. 200 mM NaCl eluieren, und eine Gruppe von fünf nicht- aufgelösten Peaks (Peaks 3 bis 7), die zwischen 250 und 450 mM NaCl eluieren. Keine Antipilz-Aktivität war mit der ungebundenen Fraktion verbunden, wohingegen alle gebundenen Peak-Fraktionen eine Antipilzaktivität bei Untersuchung in Medium A aufzeigten. Jedoch zeigten die in Medium B durchgeführten Untersuchungen nur eine Wachstumshemmung für die den Peaks 1 bzw. 2 entsprechenden Fraktionen. Es erscheint daher, daß die Antipilzaktivität dieser Fraktionen weniger salzabhängig als jene der Fraktionen aus den Peaks 3 bis 7 ist.
Die Fraktionen, die eine Antipilzaktivität im Wachstumsmedium B zeigten (Peaks 1 und 2), wurden weiter durch Umkehrphasen-Chromatographie gereinigt. Ca. 1 mg-Mengen von Peak 1-Material (Fig. 2A) und Peak 2- Material (Fig. 2B) wurden auf eine Säule (25 · 0,93 cm) Pep-S (poröse Kieselerde C&sub2;/C&sub1;&sub8;, Pharmacia) im Gleichgewicht mit 0,1% TFA aufgetragen. Die Säule wurde bei 5 ml/min mit einem linearen Gradienten von 200 ml von 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) nach 40% Acetonitril/0,1% TFA eluiert. Das Eluat wurde auf Protein durch Direktmessung der Extinktion bei 214 nm überwacht. 5 ml-Fraktionen des Eluats wurden aufgefangen, vakuumgetrocknet und schließlich in 0,5 ml destilliertem Wasser gelöst, von dem 10 ul in einem mikrospektrophotometrischen Antipilz-Aktivitätstest verwendet wurden.
Fig. 2A und Fig. 2B zeigen die HPLC-Profile von gereinigtem Peak 1- bzw. peak 2-Material. Die unteren Tafeln zeigen die Überwachung des Eluats auf Protein durch Messung der Extinktion bei 214 nm. Die Ergebnisse des mikrospektrophotometrischen Antipilz-Aktivitätstests in Medium A und Medium B sind in den oberen Tafeln gezeigt.
Das Material aus Peak 1 lieferte einen einzelnen Hauptpeak, der bei 30% Acetonitril eluierte und mit der Antipilzaktivität sowohl in Medium A als auch in Medium B co-eluierte. Der aus diesem Peak isolierte aktive Faktor wird als Rs-AFP1 bezeichnet (Raphanus sativus-Antipilzprotein 1). Das Peak 2-Material löste sich andererseits in zwei Hauptpeaks auf, die bei 30 bzw. 33% Acetonitril eluierten. Der bei 30% Acetonitrile eluierende Peak war sowohl in Medium A als auch in Medium B aktiv, wohingegen der bei 33% eluierende Peak nur in Medium A aktiv war. Der aus dem 30% Acetonitril-Peak gereinigte aktive Faktor wird als Rs-AFP2 (Raphanus sativus- Antipilzprotein 2) bezeichnet, und jener aus dem 33% Acetonitril-Peak wird als Rs-nsLTP (Raphanus sativus nicht-spezifisches Lipid-Transferprotein) wegen seiner Homologie mit den aus anderen Pflanzenarten isolierten nicht- spezifischen Lipid-Transferproteinen bezeichnet (siehe Beispiel 13).

Beispiel 4

Reinheit der isolierten Rs-AFPs

Die Reinheit der isolierten Antipilzproteine wurde durch native kathodische Gel-Elektrophorese, gefolgt von Proteinanfärbung (Fig. 3, linke Tafel) und in-situ-Nachweis der Antipilzaktivität unter Verwendung einer biozymographischen Technik (Fig. 3, rechte Tafel) verifiziert.
Native kathodische Gel-Elektrophorese und Biozymographie wurden wie zuvor beschrieben (De Bolle et al., 1991, Electrophoresis, 12, 442-444) mit einigen Modifikationen durchgeführt. Elektrophorese wurden an kontinuierlichen 10% Acrylamid-Gelen durchgeführt, die 60 mM Tris/70 mM MES (pH 7) enthielten. Der Elektrophoresepuffer bestand aus 100 mM L-Histidin/41 mM MES (pH 6,5). Gele wurden auf 10ºC während der Elektrophorese gekühlt. Die Proben enthielten 20% Glycerin, 0,0025% Methylenblau und 10 ug gereinigtes Rs-AFP1 oder 20 ug Rs-AFP2. Proteine wurden durch Silberanfärbung eines aus dem Gel hergestellten Diffusionsblots nachgewiesen (Kovarik et al., 1987, Folia Biological, 33, 253-257). Das Gel wurde mit einem weichen Agargel überschichtet (De Bolle et al., 1991, Electrophoresis, 12, 442- 444), das lebensfähige Trichoderma hamatum-Sporen enthielt, und bei 25ºC für 3 Tage inkubiert.
Fig. 3 (linke Tafel) zeigt, daß Rs-AFP1 (Spur 1) und Rs-AFP2 (Spur 2) als einzelne Proteinbanden nach kathodischer Gel-Elektrophorese wandern. Außerdem wanderte die Antipilzaktivität genau mit den Proteinbanden im Gel mit (rechte Tafel). Diese Ergebnisse zeigen, daß die isolierten Faktoren hoch rein sind, und daß die Antipilzaktivität nicht Nebenverunreinigungen zuweisbar ist.

Beispiel 5

Antipilzproteine, die mit Rs-AFPs aus anderen Brassicaceae-Arten verwandt sind

Unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Reinigungsverfahrens haben wir Antipilzproteine aus anderen Brassicaceae isoliert, einschließlich Brassica napus, Brassica rapa, Sinapis alba und Arabidopsis thaliana.
Fig. 4 zeigt das Kationen-Austauscherchromatogramm für aus B. napus isoliertes Antipilzprotein und das damit verbundene Diagramm der Pilzwachstumshemmung (obere Tafel). Fig. 5 zeigt das HPLC-Profil der gereinigten B. napus-Antipilzproteine, isoliert aus Peak 1 (Bn-AFP1, linke Tafel) und Peak 2 (Bn-AFP2, rechte Tafel).
Fig. 6 zeigt das Kationen-Austauscherchromatogramm für aus B. rapa isoliertes Antipilzprotein und das verbundene Diagramm der Pilzwachstumshemmung (obere Tafel). Fig. 7 zeigt das HPLC-Profil der gereinigten B. rapa Antipilzproteine, isoliert aus Peak 1 (Br-AFP1, linke Tafel) und Peak 2 (Br-AFP2, rechte Tafel).
Fig. 8 zeigt das Kationen-Austauscherchromatogramm für aus S. alba isoliertes Antipilzprotein und das verbundene Diagramm der Pilzwachstumshemmung (obere Tafel). Fig. 9 zeigt das HPLC-Profil der gereinigten S. alba-Antipilzproteine, isoliert aus Peak 1 (Sa-AFP1, linke Tafel) und Peak 2 (Sa-AFP2, rechte Tafel).
Fig. 10 zeigt das Kationen-Austauscherchromatogramm für aus A. thaliana isoliertes Antipilzprotein und das verbundene Diagramm der Pilzwachstumshemmung (obere Tafel). Fig. 11 zeigt das HPLC-Profil der gereinigten A. thaliana-Antipilzproteine, isoliert aus Peak 1 (At-AFP1).
Alle diese Antipilzproteine verhalten sich ähnlich, wie Rs-AFP1 und Rs-AFP2 bezüglich ihrer SDS-PAGE- und isoelektrischen Fokusierungsmuster (wie in Beispiel 5 beschrieben).

Beispiel 6

Extraktion der basischen Protein-Fraktion aus Dahlia merckii-, Cnicus benedictus-, Lathyrus cicera- und Clitoria ternatea-Samen.

500 g D. merckii- oder C. benedictus- oder Clitoria ternatea-Samen (erworben von Chiltern Seeds, Cumbria, UK) oder Lathyrus cicera-Samen (von Instituto Botanico Universitade Coimbra, Portugal) wurden in einer Kaffeemühle gemahlen, und das resultierende Mehl wurde für 2 Stunden bei 4ºC mit 2 l eines eiskalten Extraktionspuffers extrahiert, der 10 mM NaH&sub2;PO&sub4;, 15 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 100 mM KCl, 2 mM EDTA und 1 mM Benzamidin enthielt. Das resultierende Homogenat wurde durch ein Seituch gedrückt und durch Zentrifugieren geklärt (30 min mit 7 000 · g). Festes Ammoniumsulfat wurde zum Überstand hinzugegeben, um eine 75%ige relative Sättigung zu erhalten, und der Niederschlag durch Stehenlassen über Nacht über 4ºC sich bilden lassen. Im Anschluß an Zentrifugieren mit 7 000 · g für 30 Minuten wurde der Niederschlag in einem minimalen Volumen destilliertem Wasser erneut gelöst und sorgfältig gegen destilliertes Wasser unter Verwendung von benzoyliertem Celluloseschlauchmaterial (Sigma, St. Louis, MO) dialysiert. Nach der Dialyse wurde die Lösung durch Zugabe des 10-fach konzentrierten Puffers auf 50 mM NH&sub4;Ac (pH 9) eingestellt und über eine Säule (12 · 5 cm) Q- Sepharose Fast Flow (Pharmacia, Uppsala, Schweden) geleitet, die in 50 mM NH&sub4;Ac (pH 9) äqulibriert worden war. Die Proteinfraktion, die durch die Säule gelangte, wurde mit Essigsäure auf pH 6 eingestellt.
Dieses Material stellt die basische (pI > 9) Proteinfraktion der Samen dar. Die Fraktionen wurden weiter wie in Beispielen 7, 8, 9 und 10 beschrieben gereinigt.

Beispiel 7

Reinigung von antimikrobiellen Proteinen aus Dahlia merckii-Samen.

Das Ausgangsmaterial für die Isolierung der antimikrobiellen Proteine aus D. merkii war die aus den reifen Samen wie in Beispiel 6 extrahierte basische Proteinfraktion. Proteine wurden weiter durch Kationen-Austauscherchromatographie dieses Extrakts gereinigt.
Ca. 500 ml der basischen Proteinfraktion wurden auf eine Säule (10 · 1,6 cm) S-Sepharose High Performance (Pharmacia) aufgetragen, die in 50 mM NH&sub4;Ac, pH 6,0, äquilibriert worden war. Die Säule wurde bei 3,0 ml/min mit einem linearen Gradienten von 50-750 ml NH&sub4;Ac, pH 6,0, über 325 Minuten eluiert. Das Eluat wurde auf Protein durch Direktmessung der Extinktion bei 280 nm überwacht (Ergebnisse in der unteren Tafel der Fig. 12 gezeigt) und in 10 ml-Fraktionen aufgefangen. Proben aus jeder Fraktion wurden auf Antipilzaktivität wie in Beispiel 1 beschrieben untersucht (Ergebnisse in der oberen Tafel der Fig. 12 gezeigt).
Im Anschluß an Chromatographie lieferte der Extrakt einen breiten Aktivitätspeak, der bei ca. 250 mM NH&sub4;Ac eluierte. Die Antipilzaktivität zeigenden Fraktionen wurden vereinigt und weiter durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Ca. 3 mg-Mengen des Peaks wurden auf eine Säule (25 · 0,4 cm) PEP-S (poröse Kieselerde C&sub2;/C&sub1;&sub8;, Pharmacia) aufgetragen, die mit 0,1% TFA (Trifluoressigsäure) äquilibriert worden war. Die Säule wurde bei 1 ml/min mit einem linearen Gradienten von 0,1% TFA nach 100% Acetonitril/0,1% TFA über 100 Minuten entwickelt. Das Eluat wurde auf Protein durch Direktmessung der Extinktion bei 280 nm überwacht (Ergebnisse in der unteren Tafel der Fig. 13 gezeigt). 1 m-Fraktionen wurden aufgefangen, vakuumgetrocknet und in 0,5 ml destilliertem Wasser gelöst. 10 ul aus jeder Fraktion wurden auf Antipilzaktivität untersucht (Ergebnisse in der oberen Tafel der Fig. 13 gezeigt). Das Material lieferte zwei gut aufgelöste Aktivitätspeaks, die bei 18 bzw. 22% Acetonitril eluierten. Diese stellen die gereinigten Proteine Dm-AMP1 bzw. Dm-AMP2 dar.

Beispiel 8

Reinigung antimikrobieller Proteine aus Cnicus benedictus-Samen

Das in Beispiel 7 beschriebene Verfahren wurde unter Verwendung des basischen Extraktes aus Cnicus benedictus-Samen wiederholt. Im Anschluß an Chromatographie an der S-Sepharose High Performance-Säule lieferte der Cnicus-Extrakt zwei Peaks mit Antipilzaktivität, die bei ca. 250 mM (Peak 1) bzw. 500 mM (Peak 2) NH&sub4;Ac eluierten (Ergebnisse in Fig. 14 gezeigt).
Aktive Fraktionen wurden für jeden Peak vereinigt und weiter durch Umkehrphasen-HPLC wie in Beispiel 7 beschrieben gereinigt. Ergebnisse für Peak 1 sind in Fig. 15 gezeigt: er lieferte einen aktiven Faktor, der bei 18% Acetonitril eluierte und als Cb-AMP1 bezeichnet wird. Ähnlich eluierte Peak 2 zu einem einzelnen Aktivitätspeak, der als Cb-AMP2 bezeichnet wird (Ergebnisse in Fig. 16 gezeigt).

Beispiel 9

Reinigung von Antipilzprotein aus Lathyrus cicera-Samen

Das in Beispiel 7 beschriebene Verfahren wurde unter Verwendung des basischen Extrakts aus Lathyrus cicera-Samen befolgt. Im Anschluß an Chromatographie an der S-Sepharose High Performance-Säule lieferte der Lathyrus-Extrakt einen einzelnen Peak mit Antipilzaktivität, der bei ca. 160 mM NH&sub4;Ac eluierte (Ergebnisse in Fig. 17 gezeigt).
Aktive Fraktionen wurden vereinigt und weiter durch Umkehrphasen-HPLC wie in Beispiel 7 beschrieben gereinigt. Ergebnisse für Peak 1 sind in Fig. 18 gezeigt: er lieferte einen aktiven Faktor, der bei 22% Acetonitril eluierte und als Lc-AFP bezeichnet wird.

Beispiel 10

Reinigung antimikrobieller Proteine aus Clitoria ternatea-Samen.

Das in Beispiel 7 beschriebene Verfahren wurde unter Verwendung des basischen Extrakts aus Clitoria ternatea-Samen befolgt. Im Anschluß an Chromatographie an der S-Sepharose High Performance-Säule lieferte der Clitoria-Extrakt zwei teilweise aufgelöste Peaks mit Antipilzaktivität, die zwischen 260 mM und 400 mM NH&sub4;Ac eluierten (Ergebnisse in Fig. 19 gezeigt).
Aktive Fraktionen wurden für jeden Peak gesammelt und weiter durch Umkehrphasen-HPLC wie in Beispiel 7 beschrieben gereinigt. Ergebnisse für Peak 1 sind in Fig. 20 gezeigt: er lieferte einen aktiven Faktor, der bei · ca. 18% Acetonitril eluierte und als Ct-AMP1 bezeichnet wird. Ähnlich lieferte Peak 2 einen aktiven Faktor, der bei ca. 18% Acetonitril eluierte und als Ct-AMP2 bezeichnet wird (Ergebnisse in Fig. 21 gezeigt).

Beispiel 11

Molekulare Struktur der gereinigten antimikrobiellen Proteine

Die molekulare Struktur der gereinigten antimikrobiellen Proteine wurde weiter analysiert. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) wurde an vorgegossenen gewerblichen Gelen (PhastGel High Density von Pharmacia) unter Verwendung einer Elektrophorese-Vorrichtung PhastSystem (Pharmacia) durchgeführt. Der Probenpuffer enthielt 200 mM Tric-HCl (pH 8,3), 1% (G/V) SDS, 1 mM EDTA, 0,005% Bromphenolblau und, wenn nichts anderes angegeben wird, 1% (G/V) Dithioerythrit (DTE). Proteine wurden nach Elektrophorese in 12,5% Glutaraldehyd fixiert und gemäß Heukeshoven und Dernick (1985, Electrophoresis, 6, 103-112) mit Silber angefärbt.
Die Rs-AFPs wurden durch SDS-PAGE analysiert. Nach Reduzierung mit β- Mercaptoethanol und Modifizierung der Cystein-Reste durch S-Pyridylethylierung zeigen sowohl Rs-AFP1 als auch Rs-AFP2 einzelne Banden mit einem scheinbaren Molekulargewicht von ca. 5 kDa. Nach einfacher Reduzierung ohne weitere Cystein-Derivatisierung wird die 5 kDa-Bande immer von einer 16 kDa-Bande bei unterschiedlichen Ausbeuten begleitet, was eine oligomere Form des 5 kDa-Proteins, das sich während der Elektrophorese widersetzte, darstellen kann. Unreduziertes Rs-AFP1 und Rs-AFP2 wandern als einzelne Banden mit 20 kDA bzw. 17 kDa. Diese Ergebnisse zeigen, daß die nativen Rs- AFPs oliomere Proteine sind, die aus Dimeren, Trimeren oder Tetrameren des 5 kDa-Polypeptids bestehen. Die oligomere Struktur scheint durch Disulfid- Bindungen stabilisiert zu sein.
Fig. 22 zeigt die SDS-PAGE-Analyse der gereinigten Rs-AFPs: Spur 1 ist unreduziertes Rs-AFP1, Spur ist reduziertes und S-pyridylethyliertes Rs-AFP1, Spur 3 ist unreduziertes Rs-AFP2, Spur 4 ist ist reduziertes und S-pyridylethyliertes Rs-AFP2. 200 ng der Proteine wurden an den Gelen getrennt. Spur M zeigt Myoglobin-Fragmente, die als Molekulargewichtsmarker (Pharmacia) mit den folgenden Größen verwendet wurden: 17 kDa, 14,5 kDa, 8 kDa, 6kDa und 2,5 kDa.
SDS-PAGE-Analyse von Rs-nsLTP nach Reduktion mit DTE lieferte eine einzelne 9 kDa-Bande. Das unreduzierte Rs-nsLTP wanderte als einzelne 18 kDa-Bande. Es erscheint daher, daß Rs-nsLTP ein dimeres Protein (2 · 9 kDa) ist, das durch Disulfidbrücken stabilisiert ist.
Fig. 23 zeigt die SDS-PAGE-Analyse des gereinigten Rs-nsLTP: Spur 1 ist unreduziertes Rs-NsLTP, Spur 2 ist reduziertes Rs-nsLTP. Molekulargewichtsmarker (Spur M) sind wie in Fig. 22.
Freie Cysteinthiol-Gruppen der Rs-AFPs wurden qualitativ wie folgt beurteilt. 100 ug-Mengen der reduzierten oder unreduzierten Proteine wurden in 6 M Guanidium-Cl gelöst, das 100 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7) und 1 mM EDTA enthielt. Die Mischungen ließ man mit 5,5'-Dithionitrobenzoesäure reagieren und überwachte sie auf Freisetzung von Nitrothiobenzoat wie von Creighton beschrieben (1989, Protein structure, a practical approach, 155- 167). Reduzierung der Proteine erfolgte durch Zugabe von Tris-HCl (pH 8,6) auf 100 mM und Dithioerythrit auf 30 mM, gefolgt durch Inkubation bei 45ºC für 1 Stunde. Die Proteine wurden von den überschüssigen Reagenzien durch Umkehrphasen-Chromatographie an einer C&sub2;/C&sub1;&sub8;-Kieselerdesäure getrennt.
Die unreduzierten Rs-AFPs enthielten keine freien Cysteinthiol- Gruppen, wohigegen die reduzierten Proteine solche enthielten, was zeigt, daß alle Cystein-Reste an Disulfid-Bindungen teilnehmen.
Die pI-Werte von Rs-AFP1 und Rs-AFP2 wurden durch isoelektrische Fokussierung bestimmt und als höher als 10 für beide Proteine aufgefunden. Isoelektrische Fokussierung wurde an vorgegossenen Immobilin Dry Strips (Pharmacia) durchgeführt, die in 8 M Harnstoff unter Verwendung von Markerproteinen im pI-Bereich von 4,7 bis 10,6 (Pharmacia) rehydratisiert worden waren.
Fig. 24 zeigt die SDS-PAGE-Analyse der zwei gereinigten Proteine aus Dahlia; Fig. 25 zeigt die SDS-PAGE-Analyse der zwei gereinigten Cnicus- Proteine. Molekulargewichtsmarker wurden als Referenzproteine laufen gelassen (Spur M: 29 kDa, 20,1 kDa, 13,2 kDa und 5,2 kDa). Bei Reduzierung mit DTT laufen alle vier Proteine als 5/6 kDa-Banden (Fig. 24, Spuren 2 und 4; Fig. 25; Spuren 2 und 4). In ihrer unreduzierten Form laufen die gereinigten Proteine als Oligomere. Unreduziertes Dm-AMP1 läuft als 24 kDa- Protein (Fig. 24, Spur 1) und Dm-AMP2 als 17 kDa-Protein (Fig. 24, Spur 3). Ähnlich läuft unreduziertes Cb-AMP1 als einzelne Bande von 30 kDa (Fig. 25, Spur 1) und Cb-AMP2 als Bande von 18 kDa (Fig. 25, Spur 3).
Fig. 26 zeigt die SDS-PAGE-Analyse der zwei gereinigten Proteine aus Clitoria und der gereinigtem Proteine aus Lathyrus. Molekulargewichtsmarker wurden als Referenzproteine laufen gelassen (Spur M: 29 kDa, 20,1 kDa, 13,2 kDa und 5,2 kDa). Bei Reduktion mit DTT laufen alle drei Proteine als 5/6 kDa-Banden (Fig. 26: Spur 2, Ct-AMP1; Spur 4, Ct-AMP2; Spur 6, Lc- AFP). In ihrer unreduzierten Form laufen die gereinigten Proteine als Oligomere. Unreduziertes Ct-AMP1 und Ct-AMP2 laufen als Proteine von ca. 15 kDa (Fig. 26, Spuren 1 bzw. 3), wohingegen unreduziertes Lc-AFP als ein ca. 12 kDa-Protein läuft (Fig. 26, Spur 5).

Beispiel 12

Aminosäuresequenzierung der Rs-AFPs und verwandter Proteine

Cystein-Reste der Antipilzproteine wurden durch S-Pyridylethylierung unter Verwendung des Verfahrens von Fullmer modifiziert (1984, Anal Biochem, 142, 336-341). Reagenzien wurden durch HPLC an einer Säule (25 · 0,4 cm) Pep-S (poröse Kieselerde C&sub2;/C&sub1;&sub8;) (Pharmacia) entfernt. Die S-pyridylethylierten Proteine wurden durch Eluieren der Säule mit einem linearen Gradienten von 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) nach Acetonitril, das 0,1% TFA enthielt, gewonnen die resultierenden Proteinfraktionen wurden einer Aminosäuresequenzanalyse in einem 477A Protein-Sequencer (Applied Biosystems) mit Direktnachweis der Phenylthiohydantoinaminosäure- Derivate in einem 120A Analyser (Applied Biosystems) unterworfen. Je nach Notwendigkeit aufgrund blockierter Proteine erfolgte die Behandlung der S-pyridylethylierten Proteine mit Pyroglutamataminopeptidase gemäß Herstelleranweisungen (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland).
Die N-terminale Aminosäuresequenz von Rs-AFP1 und Rs-AFP2 wurde durch automatisierten Edman-Abbau nach Behandlung mit Pyroglutamataminopeptidase, die cyclische N-terminale Glutamat-Reste abspaltet, bestimmt. Fig. 27 zeigt die Sequenz der ersten 44 N-terminalen Aminosäuren von Rs-AFP1 und der ersten 35 Reste von Rs-AFP2. Die Sequenzen von Rs-AFP1 und Rs-AFP2 unterscheiden sich in nur 2 Positionen innerhalb der ersten 36 Reste. Der Austausch einer Glutaminsäure durch ein Glutamin (Position 4) und eines Asparagins durch ein Arginin (Position 27) in Rs-AFP2 sind übereinstimmend mit der höheren positiven Nettoladung dieses Proteins relativ zu Rs-AFP1, das zuvor durch kathodische Gel-Elektrophorese (Fig. 3)und Kationen- Austauscherchromatographie (Fig. 1) nachgewiesen wurde. Rs-AFP1 scheint reich an Cystein und basischen Aminosäuren zu sein (5 bzw. 9 innerhalb der ersten 45 Reste). Das Molekulargewicht von Rs-AFP1, berechnet auf der Basis der partiellen Aminosäuresequenz (4964 Da), ist sehr ähnlich zum Wert, der durch SDS-PAGE abgeschätzt wird (ca. 5000 Da), was anzeigt, daß die festgestellte Sequenz den Hauptteil des Proteins umfaßt. Es wird jedoch erwartet, daß Rs-AFP1 wenigstens ein weiteres Cystein enthält, da die Abwesenheit freier Thiol-Gruppen eine gerade Anzahl von Cysteinen vermuten läßt.
Fig. 27 zeigt ebenfalls die ersten 23 bis 30 N-terminalen Aminosäuren der Rs-AFP-artigen Proteine, die aus anderen Brassicaceae wie in Beispiel 5 beschrieben isoliert wurden (Bn-AFP1, Bn-AFP2, Br-AFP1, Br-AFP2, Sa-AFP1, Sa-AFP2, At-AFP1). Alle Proteine wurden mit Pyroglutamataminopeptidase vor der Sequenzierung behandelt, aber die Cystein-Reste wurden nicht modifiziert. Entsprechend erscheinen Cystein-Reste als Leerstellen beim Edman-Abbau. Aminosäuren, die identisch mit den entsprechenden Aminosäuren in Rs-AFP1 sind, sind durch Punkte angegeben. Es erscheint daher, daß die Rs-AFP-artigen Proteine aus anderen Mitgliedern der Brassicaceae-Familie identisch oder fast identisch mit Rs-AFP1 und Rs-AFP2 sind. Br-AFP2 enthält eine nicht identifizierte ungewöhnliche Aminosäure in Position 11.
Fig. 28 zeigt die vollständige Aminosäuresequenz für die Peptide Dm- AMP1, Cb-AMP1 und Cb-AMP2. Ebenfalls gezeigt wird die Sequenz für die ersten 20 N-terminalen Aminosäuren aus Dm-AMP2. Die Sequenzen für Dm-AMP1 und Dm-AMP2 unterscheiden sich in nur einer Position (Position 2) in diesen ersten 20 Aminosäuren. Beim Vergleich der Sequenzen für Cb-AMP1 und Cb-AMP2 gibt es drei Veränderungen. Die Substitution eines sauren Restes (Asparaginsäure in Position 22) in Cb-AMP1 gegen ein neutrales Asparagin in Cb- AMP2 und die Substitution von Glutamin in Position 23 gegen ein basisches Lysin sind übereinstimmend mit der höheren positiven Nettoladung. Ähnlich unterscheidet sich Cb-AMP2 auch von Dm-AMP1 in zwei Positionen, obwohl das Ergebnis der Nettogewinn von zwei positiven Ladungen ist.
Alle vier. Proteine zeigen eine verblüffende Ähnlichkeit mit den Proteinen, die aus Samen der Brassicaceae-Familie isoliert wurden. Ausrichtung der Aminosäuresequenz für Rs-AFP1 (Raphanus sativus-Antipilzprotein 1) mit der Sequenz für Dm-AMP1 zeigt, daß sie ca. 50% identische Reste aufweisen.
Fig. 29 zeigt die vollständige Aminosäuresequenz für die Peptide Lc- AFP und Ct-AMP1. Von Ct-AMP2 wird erwartet, daß es hoch homolog mit Ct-AMP1 ist. Sowohl Lc-AFP als auch Ct-AMP1 sind ebenfalls homolog mit den Compositae- und Brassicaceae-Proteinen. Insbesondere ist Ct-AMP1 sehr homolog zum Dahlia-Peptid Dm-AMP1 mit 35 identischen Resten in seiner Sequenz.
Homologien können zwischen diesen Gruppen der eng verwandten Proteine und den durch die zwei Erbsen-(Pisum sativum)-Gene, pI39 und pI230, gefunden werden, die spezifisch durch den Pilz Fusarium solani induziert werden (Chiang und Hadwiger, 1991, Mol Plant Microbe Interact, 4, 324-331), und gegenüber dem Protein-Produkt des Kartoffel-(Solanum tuberosum)-Gens p322 (Stiekema et al., 1988, Plant Mol Biol, 11, 255-269). Nichts ist bekannt über die biologischen Eigenschaften der durch die Gene pI39, pI230 oder p322 codierten Proteine. Zusätzlich zeigt die Klasse Rs-AFP-artige/Dahlia/Cnicus/Lathyrus/Clitoria der antimikrobiellen Proteine eine Homologie mit Inhibitoren von Insektendarm-α-Amylasen aus Sorghum bicolor (Bloch und Richardson, 1991, FEBS Lett, 279, 101-104) und auch mit γ-Purothioninen aus Triticum aestivum (Colilla et al., 1990, FEBS Lett, 270, 191-194), die die in-vitro-Proteinsynthese in zellfreien Systemen hemmen (Mendez et al., 1990, Eur J Biochem, 194, 533-539).
Fig. 30 zeigt die Ausrichtung der Aminosäuresequenzen von Rs-AFP1, Dm-AMP1, den Cb-AMPs, Lc-AFP, Ct-AMP1, dem Sorghum-α-Amylase-Hemmer SIα2, Weizen-γ1-Purothionin und den vorhergesagten Sequenzen der reifen Proteinprodukte der Fusarium-induzierten Erbsen-Gene pI230 und pI39, des Augenbohnen-Gens pSAS10 und des Kartoffel-Gens p322. Sequenzidentitäten und konservierte Austausche im Vergleich zu Rs-AFP1 sind umrandet. Konservierte Austausche werden als Substitutionen innerhalb der Aminosäuresequenz- Homologiegruppen FWY, MILV, RHK, EDNQ und PAGST betrachtet. Zur optimalen Ausrichtung eingeführte Lücken werden durch Bindestriche dargestellt.
Nach der Ausrichtung der Sequenzen erscheinen alle Cysteine und die meisten der Glycine an konservierten Positionen, was ihre Bedeutung hinsichtlich Struktur und Funktion dieser Proteine vermuten läßt. Ebenfalls bemerkenswert sind die konservierten aromatischen Reste in den Positionen 11 und 14.
Fig. 31A zeigt eine der möglichen DNA-Sequenzen der Gene, die Dm- AMP1, Dm-AMP2, Cb-AMP1 und Cb-AMP2 codieren. Ähnlich zeigt Fig. 31B eine der möglichen DNA-Sequenzen der Gene, die Lc-AFP und Ct-AMP1 codieren.
Diese Gensequenzen wurden aus den bekannten Aminosäuresequenzen unter Verwendung von Codonen vorhergesagt, die üblicherweise in zweikeimblättrigen Pflanzen auftreten. Die tatsächlichen Gensequenzen innerhalb des Samens können aufgrund der Degenerierung des genetischen Codes abweichen.

Beispiel 13

Aminosäuresequenzierung von Rs-nsLTP.

Die Aminosäuresequenzierung des Rs-nsLTP-Proteins wurde gemäß der Beschreibung in Beispiel 12 durchgeführt.
Fig. 32 zeigt die ersten 43 N-terminalen Aminosäuren von Rs-nsLTP, worin die Cystein-Reste durch S-Pyridylethylierung modifiziert wurden. In Fig. 33 ist die Sequenz von Rs-nsLTP mit den N-terminalen Sequenzen nicht- spezifischer Lipidtransferproteine ausgerichtet, die aus Proteinen von Spinacia oleracea (So-nsLTP, Bernhard et al. 1990, Plant Physiol, 95, 164- 170), Ricinus communis (Rc-nsLTP; Takishima et al., 1986, Biochim Biophys Acta, 870, 248-255), Daucus carota (Dc-nsLTP; Stenk et al., 1991, Plant Cell, 9, 907-921), Hordeum vorgare (Hv-nsLTP; Bernhard und Somerville, 1989, Arch Biochem Biophys, 269, 695-697), und Zea mays (Zm-nsLTP; Tchang et al., 1988, J Biol chem, 263, 16849-16855) isoliert wurden. Zur optimalen Ausrichtung der Sequenzen eingeführte Lücken sind durch Bindestriche angegeben. Identische Aminosäuren und konservierte Substitutionen, die in wenigstens 4 der 6 Sequenzen auftreten, sind umrahmt. Konservierte Austausche werden als Substitutionen innerhalb der Aminosäure-Homologiegruppen FWY, MILV, RHK, EDNQ und PAGST betrachtet. Rs-nsLTP zeigt 38 bis 53% Sequenzidentität mit den nicht-spezifischen Lipidtransportproteinen aus anderen Pflanzenquellen. Nicht-spezifische Lipidtransportproteine sind Proteine, die Phospholipide oder andere apolare Verbindungen zwischen zwei Membransystemen translozieren können. Von diesen Proteinen wurden zuvor angenommen, daß sie eine Rolle im Transport von Phospholipiden aus dem endoplasmatischen Retikulum in Zell- und Organellmembranen spielen (Arondel und Kaden, 1990, Experientia, 46, 579-585). Jedoch zeigen neuere Beweise, daß sich nsLTPs extrazellulär aufhalten, was ihre vorgeschlagene Funktion in der Membranbiogenese unwahrscheinlich macht (Sterk et al., 1991, Plant Cell, 3, 907-921).

Beispiel 14

Stabilität der Antipilzaktivität der Proteine

Untersuchungen der Antipilzaktivität wurden mit 20 ul-Proben, die 5- fach mit Fusarium culmorum-Sporen enthaltendem Wachstumsmedium verdünnt wurden, gemäß dem in Beispiel 1 angegebenen Testverfahren durchgeführt.
Unbehandelte Kontrollproben bestanden aus den Testproteinen mit 500 ug/ml in 10 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7). Wärmestabilitätsuntersuchungen wurden durch Erwärmen von Teilmengen der Testproteine für 10 Minuten auf unterschiedliche Temperaturen bis zu 100ºC durchgeführt. Die Reduktion von Disulfidbrücken erfolgte durch Zugabe von Dithiothreit mit 30 mM und Tris- HCl (pH 8,6) mit 300 mM. Die Reagenzien wurden durch Umkehrphasen-Chromatographie entfernt. Für Digestionen wurden verschiedene Proteasen mit 100 ug/ml hinzugegeben und bei 37ºC für 16 Stunden inkubiert. Die Kontrollbehandlung, die nur die Reagenzien enthielt, erwies sich als negativ für die Antipilzaktivität nach dem Umkehrphasen-Chromatographieschritt.
Die Antipilzaktivität aller untersuchten gereinigten Proteine war resistent gegen Wärmebehandlungen bei bis 100ºC für 10 Minuten. Reduktion ihrer Disulfid-Bindungen durch Dithiothreit vernichtete jedoch die Antipilzaktivität vollständig. Diese Disulfidbindungen sind wesentlich für die biologische Aktivität. Behandlung der Rs-AFP-Proteine mit Trypsin, Chymotrypsin, Proteinase K oder Pronase E reduzierte die Antipilzaktivität wenigstens 10-fach.

Beispiel 15

Antipilzwirksamkeit der Proteine

Die Antipilzwirksamkeit der gereinigten Proteine wurde an unterschiedlichen pflanzenpathogenen Pilzen unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Tests untersucht. Wachstum von Pilzen, Auffangen und Ernten von Pilzsporen und Zubereitung von Myzel-Fragmenten erfolgten wie zuvor beschrieben (Broekaert et al., 1990, FEMS Microbiol Lett, 69: 55-60). Die folgenden Pilzstämme wurden verwendet: Alternaria brassicola MUCL 20297, Ascochyta pisi MUCL 30164, Botrytis cinerea MUCL 30158, Cercospora beticola Stamm K897, Cladosporium sphaerosperum (K0791), Colletotrichum lindemuthianum MDCL 9577, Fusarium culmorum IMI 180420, Fusarium oxysporum f. sp. pisi IMI 236441, Fusarium oxysporum f, sp. lycopersici MUCL 909, Mycosphaerella fijiensis var fijiensis IMI 105378, Nectria haematococca Sammlung Van Etten 160-2-2, Penicillium digitatum (K0879), Phoma betae MUCL 9916, Pyrenophora tritici-repentis MUCL 30217, Pyricularia oryzae MUCL 30166, Rhizoctonia solani CBS 207-84, Sclerotinia sclerotianum MUCL 30163, Septoria nodorum MUCL 30111, Septoria tritici (K1097D), Trichoderma hamatum MUCL 29736, Trichoderma viride (K1127), Verticillium albo-atrum (K0937), Verticillium dahliae MUCL 19210, Venturia inaequalis MUCL 15927.
Für C. beticola, R, solani, S. sclerotianum, S. nodorum und M. fijiensis wurden Myzelfragmente als Inokulum verwendet, wohingegen alle anderen Pilze als Sporen geimpft wurden.
Reihenverdünnungen der Antipilzproteine wurden auf die Pilze entweder unter Verwendung von Wachstumsmedium A oder -medium B aufgetragen. Die prozentuale Wachstumshemmung wurde durch Mikrospektrophotometrie gemessen. Die für eine 50%ige Wachstumshemmung nach 48 Stunden Inkubation erforderliche Konzentration (IC&sub5;&sub0;-Wert) wurde aus den Dosis-Reaktions-Kurven berechnet. Die IC&sub5;&sub0;-Werte für die langsam wachsenden Pilze S. nodorum und V. inaequalis wurden nach 5 bzw. 15 Tagen Inkubation gemessen.
Die Ergebnisse für Rs-AFP1 und Rs-AFP2 sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Tabelle 1 Antipilzaktivität von Rs-AFP1 und Rs-AFP2
NB = nicht bestimmt
Die für eine 50%ige Wachstumshemmung in Medium A erforderliche Konzentration von Rs-AFPs variierte von 0,3 ug/ml bis über 100 ug/ml, abhängig vom Testorganismus. Die Antipilzwirksamkeit von Rs-AFP1 ist allgemein geringfügig geringer als diejenige von Rs-AFP2 in Medium A. Der Unterschied in der Antipilzwirksamkeit zwischen Rs-AFP1 und Rs-AFP2 ist stärker betont für die in Medium B durchgeführten Untersuchungen. Rs-AFP1 hemmt nur 4 von 17 Pilzen um mehr als 50% in Konzentrationen von unter 100 ug/ml, wohingegen Rs-AFP2 hemmend für 11 von 18 Pilzen bei dieser Konzentration ist. Für einige Pilze wie F. culmorum und C. beticola ist der in Medium A gemessene IC&sub5;&sub0;-Wert von Rs-AFP2 vergleichbar mit dem in Medium B erhaltenen. Auf anderen Pilzen, wie F. oxysporum f.sp. pisi, wird der IC&sub5;&sub0;-Wert von Rs-AFP2 von 2 ug/ml in Medium A auf über 100 ug/ml in Medium erhöht.
Die Antipilzwirksamkeit der Rs-AFP-artigen Proteine aus B. napus, B. rapa, S. alba und A. thaliana wurde mit derjenigen von Rs-AFP1 und Rs-AFP2 unter Verwendung von unterschiedlicher Testpilze verglichen. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Tabelle 2 gezeigt. Mit der Ausnahme von Br-AFP2 besaßen alle Proteine spezifische Aktivitäten, die vergleich mit denjenigen der Rs-AFPs sind. Die Tatsache, daß Br-AFP im Durchschnitt 20-fach weniger aktiv als die verwandten Arten ist, kann mit der Beobachtung verbunden sein, daß Br-AFP2 eine ungewöhnliche Aminosäure in Position 11 aufweist (siehe Fig. 27), wohingegen die Rs-AFPs und verwandten Proteine alle einen aromatischen Rest in dieser Position aufweisen (siehe Fig. 30). Bei Untersuchung in Medium B scheint Rs-AFP2 das am stärksten wirksame Protein zu sein, speziell auf dem Pilz F. culmorum. Tabelle 2 Antipilzaktivität von Rs-AFP-artigen Proteinen aus Brassica rapa, Brassica napus, Sinapis alba und Arabidopsis thaliana IC&sub5;&sub0; (ug/Ml) in Medium A Tabelle 2 (Fortsetzung) IC&sub5;&sub0; (ug/ml) in Medium B
Die Antipilzwirksamkeit von Rs-nsLTP ist in Tabelle 3 gezeigt. Auf den meisten Pilzen ist Rs-nsLTP 10- bis 20-fach weniger wirksam relativ zu Rs-AFP2. Rs-nsLTP scheint ebenfalls stärker salzempfindlich zu sein. Keiner der 13 untersuchten Pilze wird durch Rs-nsLTP in Medium B bei Konzentrationen unterhalb 100 ug/ml gehemmt. Tabelle 3 Antipilzaktivität von Rs-nsLTP
Die Ergebnisse für die Compositae-Proteine sind in Tabelle 4 zusammengefaßt.
Die für eine 50%ige Wachstumshemmung in Medium A erforderliche Konzentration antimikrobieller Proteine variierte von 0,3 ug/ml bis über 100 ug/ml, abhängig vom Testorganismus. Allgemein war die Antipilzwirksamkeit der Proteine in der Reihenfolge: Cb-AMP2 > Cb-AMP1 > Dm-AMP1 > Dm-AMP2. Die Unterschiede in der Aktivität zwischen den Proteinen ist stärker betont in Medium B, wobei Cb-AMP2 die beste Salztoleranz zeigt. Dm-AMP1 und Dm-AMP2 hemmen nur das Wachstum von 6 von 11 Pilzen um mehr als 50% bei Konzentrationen unterhalb 100 ug/ml, wohingegen die zwei Cnicus-Proteine das Wachstum von 7 von 8 Pilzen bei Untersuchung im Medium B hemmen.
Tabelle 5 faßt die Ergebnisse für die aus Legumisae-Samen isolierten antimikrobiellen Proteine zusammen.
Diese Proteine sind aktiv, obwohl ihre Aktivität etwas geringer als diejenige der Rs-AFPs und Compositae-Proteine ist, speziell bei Untersuchung in einem Puffer mit viel Salz, Medium B. Insbesondere ist die Aktivität von Lc-AFP deutlich niedriger und vergleichbar mit der Aktivität von Br-AFP2. Die Aminosäuresequenz von Lc-AFP zeigt ebenfalls eine Substitution in Position 11, die normalerweise Tryptophan ist (Fig. 27 und 29).
Die hohen Grade der in vitro durch jedes der gereinigten Proteine gezeigten Antipilzaktivitäten lassen vermuten, daß sie eine Rolle in der Verteidigung von Samen oder Keimlingen gegen Pilzangriff spielen können. Tabelle 4 Antipilzaktivität der Dm-AMPs und der Cb-AMPs
NB = nicht bestimmt Tabelle 5 Antipilzaktivität der Ct-AMPs und von Lc-AFP

Beispiel 16

Wirkung von Ionen auf die Antipilzaktivität

Die Wirkung von Ionen auf die Antipilzaktivität der Rs-AFPs und von Rs-nsLTP wurde in größerem Detail untersucht. Die IC&sub5;&sub0;-Werte von Rs-AFP1, Rs-AFP2 und Rs-nsLTP auf F. culmorum und T. hamatum wurden in fünf unterschiedlichen Medien gemessen. Das Referenzmedium was das in Beispiel 1 beschriebene synthetische Wachstumsmedium, das insgesamt 2,5 mM einwertige Kationen und 0,1 mM zweiwertige Kationen enthält. Die vier anderen Medien enthielten 10 mM KCl, 50 mM KCl, 1 mM CaCl&sub2; bzw. 5 mM CaCl&sub2; als Ergänzung. Für den Zweck des Vergleichs wurden diese Untersuchungen parallel mit β-Purothionin, einem Antipilzprotein aus Weizensamen (isoliert wie beschrieben in Redman und Fischer, 1969, J Sci Food Agric, 20, 427-432), und Mj-AMP2 durchgeführt, einem Antipilzprotein aus Mirabilis jalapa-Samen (Cammue et al., 1992, J Biol Chem, 267, 2228-2233).
Tabelle 6 zeigt die Ergebnisse der Antipilzaktivitätsuntersuchungen in Gegenwart von K&spplus; und Ca²&spplus;.
Zusatz von KCl mit bis zu 50 mM beeinflußte nicht die Antipilzaktivität von Rs-AFP1 oder Rs-AFP2. CaCl&sub2; mit 1 mM hatte keine Wirkung auf Rs- AFP2, aber erhöhte den IC&sub5;&sub0;-Wert von Rs-AFP1 um das ca. 4-fache (d. h. Ca²&spplus; reduzierte die Antipilzaktivität von Rs-AFP1). CaCl&sub2; mit 5 mM inaktivierte beinahe vollständig Rs-AFP1, während seine Wirkung auf Rs-AFP2 von einer geringen Erhöhung des IC&sub5;&sub0;-Wertes für F. culmorum bis zur vollständigen Inaktivierung für T. hamatum variierte. Addition von KCl mit 50 mM verringert die Aktivität von Rs-nsLTP um mehr als das 30-fache mit beiden Testpilzen. Im Vergleich erhöhte sich der IC&sub5;&sub0;-Wert von β-Purothionin um das ca. 7-fache in Gegenwart von 5 mM CaCl&sub2;. Mj-AMP2 schien höher empfindlich auf die Gegenwart von Salzen zu sein, da sich seine IC&sub5;&sub0;-Werte um das ca. 10-fache bei Zugabe von etweder 1 mM CaCl&sub2; oder 50 mM KCl erhöhten.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Rs-AFPs durch zweiwertige Kationen antagonistisch beeinflußt werden. Rs-AFP1 ist viel empfindlicher auf die Gegenwart zweiwertiger Kationen als Rs-AFP2. Rs-nsLTP ist deutlich salzempfindlicher als Rs-AFP1 oder Rs-AFP2. Die antagonistische Wirkung von Kationen scheint stark vom Testorganismus abhängig zu sein. Tabelle 6 Variationen der Antipilzaktivität in Gegenwart von K&spplus; und Ca²&spplus;

Beispiel 17

Wirkung der gereinigten antimikrobiellen Proteine auf das Wachstum der Hefe, Saccharomyces cerevisiae

Die gereinigten Proteine wurden auf ihre Wirkung auf Saccharomyces cerevisiae untersucht. Das verwendete Verfahren war ähnlich dem in Beispiel 1 beschriebenen Antipilztest, außer daß das Wachstumsmedium YPD (10 g/l Hefeextrakt, 20 g/l Bactopepton, 20 g/l Glucose) mit 0,5% Seaplaque- Agarose war.
Bei Untersuchung in Mengen von 250 ug/ml hatte keines der gereinigten Brassicaceae-Proteine eine Wirkung auf das Wachstum von Saccharomyces cerevisiae (Stamm Sp1). Ähnlich hemmte Lc-AFP nicht das Wachstum von S. cerevisiae (Stamm JRY188) bei einer Konzentration von 200 ug/ml).
Die Compositae- und Clitoria-Peptide waren aktiv gegen das Wachstum von S. cerevisiae (Stamm JRY188). Diese Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt. Von den sechs Peptiden zeigten die zwei Clitoria-Peptide, Ct-AMP1 und Ct-AMP2, den höchsten Aktivitätsgrad.

Tabelle 7

Aktivität von Dm-AMPs, Cb-AMPs und Ct-AMPs auf Hefe

Protein IC&sub5;&sub0; (ug/ml)
Dm-AMP1 50
Dm-AMP2 50
Cb-AMP1 18
Cb-AMP2 20
Ct-AMP1 18
Ct-AMP2 9

Beispiel 18

Wirkung der gereinigten antimikrobiellen Proteine auf Bakterien

Die antibakterielle Wirkung der gereinigten Proteine wurde an Agrobacterium tumefaciens C58, Alcaligens eutrophus, Azospirillum brasilense Sp7, Bacillus megaterium ATCC 13632, Erwinia carotovora Stamm 3912, Escherichia coli Stamm HB101, Pseudomonas solanacearum Stamm K60 und Sarcina lutea ATCC 9342 unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Tests gemessen.
Rs-AFP2 verursachte eine 50%ige Hemmung in B. megaterium mit 200 ug/ml, aber hatte keine Wirkung auf die anderen Bakterien in Konzentrationen von bis zu 500 ug/ml.
Die Compositae-Peptide Dm-AMP1, Dm-AMP2, Cb-AMP1 und Cb-AMP2 zeigten eine Aktivität nur auf B. megaterium, wo sie das Wachstum auf 50% bei Konzentrationen von 180, 40, 80 bzw. 32 ug/ml hemmten.
Rs-AFP1, Bn-AFPs, Br-AFP2, Sa-AFPs, Ct-AMPs und Lc-AFP hatten keine Wirkung auf irgendeines der Bakterien in Konzentrationn von bis zu 500 ug/ml.
Die Ergebnisse zeigen, daß diese Proteine allgemein nur eine schwache antibakterielle Aktivität besitzen.

Beispiel 19

Wirkung der gereinigten Antipilzproteine auf kultivierte menschliche Zellen

Menschliche Zelltoxizitäts-Tests wurden entweder an Endothelzellen der Nabelvene (Alessi et al., 1988, Eur J Biochem, 175, 531-540) oder Hautmuskel-Fibroblasten (Van Damme et al., 1987, Eur J Immunol, 17, 1-7), kultiviert in Mikroplatten mit 96 Vertiefungen, durchgeführt. Das Wachstumsmedium wurde durch 80 ul serumfreies Medium ersetzt (Optimem 1 für Endothelzellen oder essentielles Eagle-Minimalmedium (EMEM) für Fibroblasten, beide von GIBCO), dem 20 ul einer filtersterilisierten Testlösung hinzugefügt wurden. Die Zellen wurden weiter für 24 Stunden bei 37ºC unter einer 5%igen CO&sub2;-Atmosphäre mit 100% relativer Feuchtigkeit inkubiert. Die Lebensfähigkeit der. Zellen wurde mikroskopisch nach Anfärben mit Trypanblau (400 mg/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, PBS) für 10 Minuten untersucht. Alternativ wurden Zellen mit Neutralrot (56 mg/l in PBS) für 2 Stunden bei 37ºC angefärbt. Die Zellen wurden in saurem Ethanol (100 mM Natriumcitrat, pH 4, enthaltend 50% Ethanol) lysiert und auf Freisetzung des Farbstoffs durch Mikrospektrophotometrie bei 540 nm bewertet.
Die Rs-AFPs und Rs-snLTP wurden auf ihre potentiellen toxischen Wirkungen unter Verwendung dieses Tests ausgewertet. Bei Zugabe mit bis zu 500 ug/ml zu entweder kultivierten Endothelzellen der menschlichen Nabelvene oder menschlichen Hautmuskel-Fibroblasten beeinflußten weder Rs-AFP1, Rs-AFP2 noch Rs-nsLTP die Zellebensfähigkeit nach 24 Stunden Inkubation. Im Gegensatz verringerte mit 50 ug/ml verabreichtes β-Porothionin die Lebensfähigkeit beider Zelltypen um mehr als 90%.

Beispiel 20

Antipilzaktivität der Rs-AFPs gegen Blattkrankheit: in vivo-Test

Rs-AFP2 wurde gegen die Zuckerrüben-Blattkrankheit Cercospora beticola (Stamm E897) unter Verwendung des folgenden Verfahrens untersucht.
Zuckerrübenpflanzen wurden in John-Innes-Pflanzkompost (Nr. 1 oder 2) in Minitöpfen mit 4 cm Durchmesser herangezogen. Die Proteinzubereitung wurde direkt vor der Verwendung durch Auflösen in sterilem destilliertem Wasser und Verdünnen auf die entsprechende Konzentration formuliert. Die Formulierung wurde auf die Pflanzen als Blattspray aufgetragen. Das Spray wurde bis zur maximalen diskreten Tröpfchenretention aufgetragen. Die Pflanzen wurden mit dem Protein einen Tag vor der Impfung mit der Krankheit behandelt, die als Blattspray mit einer Konzentration von 50 000 Sporen/ml aufgetragen wurde. Die Pflanzen wurden in einer Feuchtigkeitskammer für 48 Stunden gehalten und dann in das Gewächshaus überführt. Die Erkrankung wurde im Anschluß an eine weitere Inkubation von 8 Tagen beurteilt.
Die Ergebnisse sind in Fig. 34 gezeigt. Das handelsübliche Fungizid Hexaconazol wurde als Standard verwendet. Rs-AFP2 ergab eine gute Bekämpfung der Krankheit, und die Konzentration, die 50% der Kontrolle ergab, betrug ca. 15 uM. Im Vergleich ergab Hexaconazol eine 50%ige Krankheitsbekämpfung bei Anwendung mit ca. 7 uM. Dies bestätigt, daß das Protein als wirksames Fungizid in vivo wirken kann, und daß seine Aktivität auf einer molaren Basis vergleichbar mit dem chemischen Standard ist.

Beispiel 21

Molekulare Klonierung von Rs-AFP1- und Rs-AFP2-cDNAs

Von im Freien gezüchteten Raphanus sativus-Pflanzen wurden Samen in sechs unterschiedlichen Entwicklungsstufen gesammelt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80ºC gelagert. Nach Pulverisieren wurde die gesamte RNA aus 15 g einer Mischung der sechs unterschiedlichen Entwicklungsstufen unter Verwendung des Verfahrens von De Vries et al. (1988, Plant Molecular Biology Manual, B6, 1-13) extrahiert, mit der Ausnahme, daß 6 ml einer 1 : 2 Phenol : RNA-Extraktionspuffermischung und 2 ml Chloroform pro Gramm Gewebe verwendet wurden. Poly(A)&spplus;-mRNA wurde durch Affinitätschromatographie an Oligo(dT)-cellulose gereinigt, wie beschrieben von Siflow et al. (1979, Biochemistry 18, 2725-2731), was ca. 10 ug Poly(A)&spplus;-RNA pro Gramm Gewebe lieferte. Doppelsträngige cDNAs wurden aus 1,5 ug Poly(A)&spplus;-RNA gemäß Gubler und Hoffman (1983, Gene 25, 263-269) hergestellt und an EcoRI/NotI-Adaptoren unter Verwendung des cDNA-Synthese-Kits von Pharmacia ligiert. Die cDNAs wurden in den lamda-ZAPII-Phagenvektor (Stratagene) gemäß Herstelleranweisungen kloniert. Eine DNA-Sonde zur Durchmusterung der cDNA-Bank wurde durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wie folgt erzeugt. Zwei degenerierte Oligonukleotide wurden synthetisiert:
OWB15 entspricht den Aminosäuren 2 bis 7 von Rs-AFP1 und hat eine sense-Orientierung. OWB17 entspricht den Aminosäuren 36 bis 43 von Rs-AFP1 und hat eine antisense-Orientierung. Beide Primer besitzen die AAAGAATTC- Sequenz (d. h. AAA gefolgt von der EcoRI-Erkennungssequenz) an ihren 5'- Enden. PCR wurde mit Taq-Polymerase unter Standardbedingungen durchgeführt (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press), wobei OWB15 und OWB17 als Amplimere und 25 ng cDNA als Ziel-DNA verwendet wurden. Das Temperaturprogramm schloß einen Startschritt bei 94ºC für 5 min. 30 Zyklen (94ºC für 1 min. 45ºC für 2 min. 72ºC für 3 min) und einen Endschritt bei 72ºC für 10 min ein. Das PCR-Amplifikationsprodukt mit 144 bp wurde an einem 3%igen Agarosegel (NuSieve, FMC) gereinigt. Dieses PCR-Produkt wurde teilweise unter Verwendung des degenerierten sense- Oligonukleotids OWB16 (5'AAAGAATTCGGNACNTGGWSNGGNGTNTG 3') und OWB17 reamplifiziert. OWB16 weist ebenfalls die AAAGAATTC-Extension an seinem 5'- Ende auf. Dieses PCR-Amplifikationsprodukt mit 123 bp wurde erneut an einem 3%igen Agarosegel (NuSieve, FMC) gereinigt und durch PCR unter den gleichen Bedingungen reamplifiziert, außer daß die Reaktionsmischung 130 uM dTTP und 17 uM Digoxigenin-11-dUTP anstelle von 200 uM dTTP enthielt. Das Digoxigenin-markierte PCR-Produkt wurde an einem 3%igen NuSieve-Agarosegel gereinigt.
Ca. 10 000 Plaque-bildende Einheiten der lambda-ZAPII-cDNA-Bank wurden mit dem Digoxigenin-markierten PCR-Produkt durch in-situ-Plaque- Hybridisierung unter Verwendung von Nylonmembranen (Hybond-N, Amersham) durchmustert. Membranen wurden luftgetrocknet, und DNA wurde mit den Membranen unter UV-Licht (0,15 J/cm²) vernetzt. Die Hybridisierung wurde für 16 h bei 64ºC in 5 · SSC, 1% Blockierungsmittel (Boehringer Mannheim), 0,1% N-Lauroylsarcosin, 0,02% Natriumdodecylsulfat, enthaltend 10 ng/ml der hitzedenaturierten Digoxigenin-markierten Sonde, durchgeführt. Nicht- spezifisch gebundene Sonde wurde durch zweimaliges Spülen für 5 min in 2 · SSC/0,1% SDS bei 25ºC und zweimaliges Spülen für 15 min in 0,1 · SSC/0,1% SDS bei 60ºC entfernt. Nachweis der Sonde erfolgte unter Verwendung von an alkalische Phosphatase gebundenen Antidgoxigenin-Antikörpern (Boehringer Mannheim) und seinem Substrat 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (Boehringer Mannheim) gemäß Herstelleranweisungen. Positive Plaques wurden durch zwei zusätzliche Durchmusterungsrunden mit der gleichen Sonde unter den gleichen Bedingungen gereinigt. Inserts aus gereinigten Plaques wurden in vivo in die pBluescript-Phagemid-Form mit Hilfe des Helferphagen R408 ausgeschnitten. Die Inserte aus 22 unterschiedlichen positiven Klonen wurden durch EcoRI-Digestion ausgeschnitten und ihre Größe durch Agarosegel-Elektrophorese verglichen. 4 Klone hätten ein Insert mit ca. 400 bp, die anderen 18 positiven Klone enthielten Inserts im Bereich zwischen ca. 250 und 300 bp. Die 4 Klone mit den 400 bp-Inserts und 6 Klone mit den kleineren Inserts wurden der Nukleotidsequenzanalyse unterzogen. Die Klone mit dem größten Insert hatten alle ein offenes Leseraster von 80 Aminosäuren entsprechend Rs-AFP1, wie durch Vergleich mit den experimentellen N-terminalen Aminosäuresequenzen bestimmt werden konnte (siehe Beispiel 12). Die offenen Leseraster mit 243 bp codieren für das reife Rs-AFP1 (50 Aminosäuren), vorangegangen von einer mutmaßlichen Signalsequenz mit 29 Aminosäuren, die der (-1, -3)-Regel gehorcht (von Hijne 1985, Mol. Biol. 184, 99-105). Diese cDNA-Klone voller Länge unterschieden sich nur voneinander in der Länge ihrer untranslatierten 5'- und 3'-Endregionen. Fünf der Klone mit dem kleinsten Insert waren teilweise identisch mit den Rs-AFP1-cDNA-Klonen voller Länge, außer daß sie an ihren 5'-Enden verkürzt waren. Der verbleibende Klon wurde als 5'-verkürzter Rs-AFP2-cDNA-Klon durch Vergleich der abgeleiteten und der experimentell bestimmten Aminosäuresequenzen identifiziert. Beim Vergleich des Rs-AFP1-cDNA-Klons vollder Länge pFRG1 (Fig. 35) und des verkürzten Rs-AFP2-cDNA-Klons pFRG2 (Fig. 36) ist ersichtlich, daß die Codon-Verwendung geringfügig unterschiedlich ist, und daß die untranslatierte 3'-Endregion der Rs-AFP2-cDNA länger als diejenige der Rs- AFP1-cDNA ist. Schließlich weisen sowohl die Rs-AFP1- als auch die Rs-AFP2- cDNA-Klone wenigstens zwei Polyadenylierungssignale auf. Fig. 35 zeigt die Nukleotidsequenz und die abgleitete Aminosäuresequenz des Rs-AFP1-cDNA- Klons voller Länge pFRG1. die mutmaßliche Signalsequenz ist unterstrichen, und die Sequenz des reifen Rs-AFP1 ist umrandet. Fig. 36 zeigt die Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz des. 5'-verkürzten Rs- AFP2-cDNA-Klons pFRG2.
Zum Erhalt einer Rs-AFP2-cDNA voller Länge wurde ein anderer Ansatz verfolgt: PCR wurde unter Standardbedingungen unter Verwendung des antisense-Oligonukleotids OWB23 (5'ATAGAATTCGACGTGAGCTTATCATCTTATTATCCG 3') in Kombination mit dem M13-Universalprimer einerseits und dem M13-Umkehrprimer andererseits durchgeführt. Die letzten 30 Nukleotide von OWB23 bilden die invertierte Komplementärsequenz des Teils der 3'-untranslatierten Region, die unmittelbar das Poly-A-Ende von pFRG2 flankiert (siehe Fig. 36). Diese Sequenz wird zum 5'-Ende mit der GAATTC-EcoRI-Erkennungsstelle erweitert, vorangegangen von den Nukleotiden 'ATA'. Als Schablone wurden entweder 2 ug vollständige cDNA oder 105 rekombinante Phagen verwendet. In beiden Fällen wurden 3 separate Reaktionen angestellt. Vor der Amplifikation wurden die Phagen durch einen Startschritt im PCR-Temperaturprogramm von 5 min bei 99ºC lysiert, um die Phagen-DNA freizusetzen. Die Größe der Amplifikationsprodukte wurde durch Elektrophorese an einem 3%igen Agarosegel (NuSieve, FMC) bestimmt. Die Produkte wurden mit Größen erhalten, die Inserten von 280 bis 300 bp entsprachen. Daraus kann geschlossen werden, daß keine Rs- AFP2-cDNA-Klone voller Länge in der cDNA-Bank vorhanden zusein scheinen.

Beispiel 22

Mutagenese von Rs-AFP1-cDNA zu Rs-AFP2-DNA

Wie aus den experimentell bestimmten N-terminalen Sequenzen (siehe Beispiel 12) und den Nukleotidsequenzen (siehe Beispiel 21) abgeleitet werden kann, unterscheiden sich Rs-AFP1 und Rs-AFP2 nur in zwei Aminosäuren, wie in Beispiel 12 angegeben. Da die Antipilzwirksamkeit von Rs-AFP2 signifikant höher als diejenige von Rs-AFP1 ist (siehe Tabelle 1) und ein cDNA-Klon voller Länge des Rs-AFP2 nicht verfügbar ist, wurde die Rs-AFP1- cDNA in die Rs-AFP2-Nukleotidsequenz durch PCR-gestützte ortsspezifische Mutagenese gemäß dem Verfahren von E. Merino et al. tranformiert (1992, BioTechniques 12, 508-510). Die folgenden Oligonukleotide wurden verwendet:
Die erste Mutation (Glutamat zu Glutamin in Position 5 des reifen Proteins) wurd durch Durchführung von PCR mit der Pfu-Polymerase (Stratagene) unter Verwendung von OWB35 (dies ist der M13-Universalprimer mit einer 5'-tag-Sequehz) und OWB28 (der erste antisense-Mutageneseprimer) als Amplimere und 100 ng der KpnI-digerierten pFRG1-cDNA als Ziel-DNA eingeführt. MgCl&sub2; wurde zur Amplfikationsmischung auf eine Endkonzentration von 50 mM zugegeben. Das Temperaturprogramm schloß einen Startschritt bei 94ºC für 5 min. 30 Zyklen (94ºC für 1 min. 45ºC für 2 min, 72ºC für 3 min) und einen Endschritt bei 72ºC für 10 min ein. In einem zweiten Schritt wurde dieses PCR-Produkt als Megaprimer verwendet und durch Pfu-Polymerase unter Verwendung von 50 ng der KpnI-digerierten pFRG1-cDNA als Ziel-DNA verlängert. Das Temperaturprogramm schloß einen Startschritt bei 94ºC für 5 min ein, gefolgt von einer 5-Zyklen-Verlängerung (94ºC für 1 min. 50ºC für 1 min. 72ºC für 1 min). Dann wurden OWB29 (der antisense-Primer, der die zweite Mutation von Asparagin zu Arginin in Position 27 des reifen Proteins einführt) und OWB36 (das identisch zur 5'-tag-Sequenz von OWB35 ist) hinzugegeben, gefolgt von PCR-Amplifikation durch die Pfu-Polymerase wie für die Einführung der ersten Mutation beschrieben. Zum Erhalt einer Rs-AFP2- Nukleotidsequenz voller Länge wurde das im zweiten Schritt umrissene Verfahren wiederholt, obwohl die Oligonukleotidprimer OWB36 und OWB30 verwendet wurden (was ein zweites Stopp-Codon einführt, gefolgt von den SalI-, PstI- und XhoI-Restriktionsstellen, wodurch auch die untranslatierte 3'-Endregion des Rs-AFP1-cDNA-Klons pFRG1 eliminiert wird). Das PCR- Endprodukt wurde mit BamHI (das im Polylinker des pBluescript-Phagemid pFRG1 auftritt) und SalI geschnitten, in pEMBL18+ (vordigeriert mit den gleichen Restriktionsenzymen) subkloniert und der Nukleotidsequenzanalyse unterworfen. Fig. 37 zeigt die Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz des Rs-AFP2-DNA-Klons voller Länge pFRG4, erhalten durch PCRgestützte ortsspezifische Mutagenese des Rs-AFP1-cDNA-Klons pFRG1. Die mutmaßliche Signalsequenz ist unterstrichen, und die Sequenz des reifen Rs- AFP2 ist umrandet.

Beispiel 23

Konstruktion des Expressionsvektors pFRG7

Der Expressionsvektor PFRG7 (Fig. 38; SP = Signalpeptid, MP = reifes Protein) enthält die vollständige codierende Region der Rs-AFP2-DNA, flankiert an ihrem 5'-Ende vom stark konstitutiven Promotor der. 35S-RNA des Blumenkohl-Mosaikvirus (Odell et al., 1985, Nature 313, 810-812), mit einem duplizierten Verstärkerelement für eine hohe Transkriptionsaktivität (Kay et al., 1987, Science 236, 1299-1302). Die codierende Region der Rs-AFP2- DNA wird an ihrer 3'-Endseite durch die Polyadenylierungssequenz von 35S- RNA des Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV35S) flankiert. Die Plasmid-Hauptkette diese Vektors ist das Phagemid pUC120 (Vieira und Messing 1987, Methods Enzymol. 153, 3-11). pFRG7 wurde wie folgt konstruiert: Klon pFRG4, der aus der Rs-AFP2-DNA bestand (Fig. 37), wurde in die BamHI/SalI-Stellen von pEMBL18+ (Boehringer) kloniert. Das 298 bp BamHI/SalI-Fragment wurde in den Expressionsvektor pFAJ3002 subkloniert, der mit BamHI und SalI vordigeriert worden war. pFAJ3002 ist ein Derivat des Expressionsvektors pFF19 (Timmermans et al., 1990, J. Biotechnol. 14, 333-344), dessen besondere EcoRI- Stelle durch eine HindIII-Stelle ersetzt ist.

Beispiel 24

Konstruktion des Pflanzentransformationsvektors pFRG8

Der Expressionsvektor pFRG7 wurde mit HindIII digeriert, und das Fragment, das die Rs-AFP2-DNA-Expressionskassette enthielt, wurde in die besondere HindIII-Stelle von pBin19Ri kloniert. pBin19Ri ist eine modifizierte Version des Pflanzentransformationsvektors pBin19 (Bevan 1984, Nucleic Acids Research 12, 8711-8721), in dem die besonderen EcoRI- und HindIII-Stellen ausgetauscht sind und die Defekte nptII-Expressionskassette (Yenofsky et al. 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3465-3439) eingeführt ist. Der neue Pflanzentransformationsvektor wird als pFRG8 bezeichnet (Fig. 39).

Beispiel 25

Pflanzentransformation

Der unschädlich gemachte Agrobacterium tumefaciens-Stamm LBA4404 (pAL4404) (Hoekema et al., 1983, Nature 303, 179-180) wurde mit dem Vektor pFRG8 unter Verwendung des Verfahrens von de Framond et al. transformiert (BioTechnology 1, 262-269).
Tabaktransformation wurde unter Verwendung von Blattscheiben von Nicotiana tabacum Samsun auf Basis des Verfahrens von Horsch et al. (1985, Science 227, 1229-1231) und durch Co-kultivieren mit pFRG8 enthaltendenden Agrobacterium-Stämmen durchgeführt. Die Co-Kultivierung wurde unter Selektionsdruck von 100 ug/ml Kanamycin durchgeführt. Transgene Pflanzen (transformiert mit pFRG8) wurden auf Medien regeneriert, die 100 ug/ml Kanamycin enthielten. Diese transgenen Pflanzen wurden zur Expression der neu eingeführten Gene unter Verwendung von standardmäßigen Western-Blotting-Techniken analysiert. Pflanzen, die zur konstitutiven Expression der eingeführten Gene fähig sind, können ausgewählt und selbstbestäubt werden, um Samen zu ergeben. F1-Keimlinge der transgenen Pflanzen können weiter analysiert werden.

Claims

1. Isoliertes antimikrobielles Protein mit einer Aminosäuresequenz, die aus der wie in Fig. 27 bis 29 gezeigten Gruppe ausgewählt ist, oder mit einer Aminosäuresequenz, die aus der in Fig. 30 gezeigten Gruppe von Sequenzen ausgewählt ist, wobei die Gruppe aus Rs-AFP1, Dm-AMP1, Cb-AMP1, Cb-AMP2, Lc-AFP und Ct-AMP1 besteht, oder mit einer Aminosäuresequenz wie in Fig. 37 für reifes Rs-AFP2 gezeigt.

2. Antimikrobielles Protein gemäß Anspruch 1, worin das Protein eine Aminosäuresequenz hat, die aus der in Fig. 30 gezeigten Gruppe von Sequenzen ausgewählt ist, wobei die Gruppe aus Rs-AFP1, Dm-AMP1, Cb-AMP1, Cb- AMP2, Lc-AFP und Ct-AMP1 besteht.

3. Antimikrobielles Protein gemäß Anspruch 2, worin das Protein Rs- AFP1 wie in Fig. 30 gezeigt ist.

4. Antimikrobielles Protein gemäß Anspruch 2, worin das Protein Dm- AMP1 wie in Fig. 30 gezeigt ist.

5. Antimikrobielles Protein gemäß Anspruch 2, worin das Protein reifes Rs-AFP2 wie in Fig. 37 gezeigt ist.

6. Protein gemäß Anspruch 1, das ein Oligomer ist und das wenigstens ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die aus der in Fig. 27 bis 29 gezeigten Gruppe von Sequenzen ausgewählt ist, oder mit einer Aminosäuresequenz, die aus der wie in Fig. 30 gezeigten Gruppe ausgewählt ist, wobei die Gruppe aus Rs-AFP1, Dm-AMP1, Cb-AMP1, Cb-AMP2, Lc-AFP und Ct-AMP1 besteht, oder mit einer Aminosäuresequenz wie in Fig. 37 für reifes Rs- AFP2 gezeigt umfaßt.

7. Protein gemäß Ansprüchen 1 bis 6, das aus einem Pflanzensamen isoliert werden kann.

8. Protein gemäß Anspruch 7, das aus einem Samen der Familie Brassicaceae oder der Familie Compositae oder der Familie Leguminosae isoliert werden kann.

9. Protein gemäß Anspruch 8, erhältlich aus Raphanus, Brassica, Sinapis, Arabidopsis, Dahlia, Cnicus, Lathyrus oder Clitoria.

10. Isoliertes reines Protein Rs-AFP1, das aus Raphanus-Samen isoliert werden kann, wobei das Protein die in Fig. 27 gezeigte Aminosäuresequenz umfaßt.

11. Reines Protein Rs-AFP1 gemäß Anspruch 10, das die in Fig. 30 gezeigte Aminosäuresequenz umfaßt.

12. Isoliertes reines Protein Rs-AFP2, das aus Raphanus-Samen isoliert werden kann, wobei das Protein die in Fig. 27 gezeigte Aminosäuresequenz umfaßt.

13. Reines Protein Rs-AFP2 gemäß Anspruch 12, das die Aminosäuresequenz des reifen Proteins wie in Fig. 37 gezeigt umfaßt.

14. Isoliertes reines Protein Rs-nsLTP, das aus Raphanus-Samen isoliert werden kann, wobei das Protein die in Fig. 32 gezeigte Aminosäuresequenz umfaßt.

15. Isolierte reine Proteine Bn-AFP1, Bn-AFP2, Br-AFP1 und Br-AFP2, die aus Brassica-Samen isoliert werden können und die in Fig. 27 gezeigte Aminosäuresequenz umfassen.

16. Isolierte reine Proteine Sa-AFP1 und Sa-AFP2, die aus Sinapis- Samen isoliert werden können und die in Fig. 27 gezeigte Aminosäuresequenz umfassen.

17. Isoliertes reines Protein At-AFP1, das aus Arabidopsis-Samen isoliert werden kann, wobei das Protein die in Fig. 27 gezeigte Aminosäuresequenz umfaßt.

18. Isoliertes reines Protein Dm-AMP1, das aus Dahlia-Samen isoliert werden kann, wobei das Protein die in Fig. 28 gezeigte Aminosäuresequenz umfaßt.

19. Isoliertes reines Protein Dm-AMP2, das aus Dahlia-Samen isoliert werden kann, wobei das Protein die in Fig. 28 gezeigte Aminosäuresequenz umfaßt.

20. Isoliertes reines Protein Cb-AMP1, das aus Cnicus-Samen isoliert werden kann, wobei das Protein die in Fig. 28 gezeigte Aminosäuresequenz umfaßt.

21. Isoliertes reines Protein Cb-AMP2, das aus Cnicus-Samen isoliert werden kann, wobei das Protein die in Fig. 28 gezeigte Aminosäuresequenz umfaßt.

22. Isoliertes reines Protein Lc-AFP, das aus Lathyrus-Samen isoliert werden kann, wobei das Protein die in Fig. 29 gezeigte Aminosäuresequenz umfaßt.

23. Isoliertes reines Protein Ct-AMP1, das die in Fig. 29 gezeigte Aminosäuresequenz umfaßt.

24. Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23, das synthetisch ist.

25. Rekombinante DNA-Sequenz, die ein Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 24 codiert.

26. DNA-Sequenz gemäß Anspruch 25, die eine cDNA ist.

27. Isolierte DNA-Sequenz gemäß Anspruch 25, die genomische DNA ist.

28. DNA-Sequenz gemäß Anspruch 27, die aus einem Pflanzengenom isoliert ist.

29. DNA-Sequenz gemäß Anspruch 28, die die Promotorsequenz eines Polynukleotids einschließt, das ein Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 24 codiert.

30. Vektor, der eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 25 enthält.

31. Nichtmenschliches biologisches System, das einen Vektor gemäß Anspruch 30 einschließt.

32. Biologisches System gemäß Anspruch 31, das ein Mikroorganismus ist.

33. Biologisches System gemäß Anspruch 31, das eine Pflanze ist.

34. Pflanze, die mit einem Vektor gemäß Anspruch 30 transformiert ist.

35. Pflanze gemäß Anspruch 34, in der die rekombinante DNA wenigstens eines der folgenden Proteine codiert: Rs-AFP1, Rs-AFP2, Rs-nsLTP, Bn-AFP1, Bn-AFP2, Br-AFP1, Br-AFP2, Sa-AFP1, Sa-AFP2, At-AFP1, Dm-AMP1, Dm-AMP2, Cb-AMP1, Cb-AMP2, Lc-AFP, Ct-AMP1.

36. Samen und Nachkommen einer Pflanze gemäß Anspruch 34 oder 35, umfassend eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 25.

37. Zusammensetzung, die wenigstens eines der Proteine gemäß einem der Ansprüche 1 bis 24 enthält.

38. Verfahren zur Bekämpfung von Pilzen oder Bakterien, welches den Kontakt mit einem Protein oder einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 24 oder 37 umfaßt.

39. Extraktionsverfahren zur Erzeugung eines Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 24 aus organischem Material, das es enthält, welches das Unterwerfen des organischen Materials der Mazeration und Lösungsmittelsextraktion umfaßt.

40. Extraktionsverfahren gemäß Anspruch 39, worin das Protein anschließend durch Zentrifugieren, Chromatographie und Dialyse gereinigt wird.

41. Extraktionsverfahren gemäß Anspruch 39 oder 40, worin das organische Material Samen von Raphanus, Brassica, Sinapis, Arabidopsis, Dahlia, Cnicus, Lathyrus oder Clitoria umfaßt.

42. Extraktionsverfahren gemäß Anspruch 39 oder 40, worin das organische Material ein biologisches System gemäß Anspruch 31 umfaßt.

43. Verfahren zur Erzeugung eines Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 24, welches die chemische Synthese des Proteins umfaßt.

44. Verfahren zur Erzeugung eines Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 24, welches die Expression einer rekombinanten DNA-Sequenz umfaßt, die das Protein codiert.