JPH06510197A - 殺生物性タン白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 殺生物性タン白質 本発明は殺生物性タン白質（ｂｉｏｃｉｄａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、その製造方 法及び使用方法及びこれをコードするＤＮＡ配列に関する。特に本発明はカラシ ナ科、キク科又はマメ科の群の種子の如き種子から単離された抗微生物性タン白 質に関する。

本明細書において、抗微生物性タン白質は次の活性：抗菌活性（これは抗酵母活 性も包含し得る）；抗バクテリア活性の少なくとも１つの活性を有するタン白質 と定義される。活性は部分的抑制又は殺滅の如き広範囲の拮抗作用を包含する。

カラシナ科（Ｂｒａｓｓ　１ｃａｃｅａｅ）は熱帯、亜熱帯及び温帯地域におい て広範囲に生育している草本及び潅木の大きな科（ｆａｍｉｌｙ）である。カラ シナ科は“十字花科“としても知られている。ダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ　５ ａｔｉｖｕｓ）はこのカラシナ科に属し、野菜として広範囲に栽培されている。

ダリャ（Ｄａｈｌｉａ）はキク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）に属し、庭園観賞用 植物として広く栽培されている。ダリャ　メルッキ（Ｄａｈｌｉａ　ｍｅｒｃｋ ｉｉ）又は天竺牡丹（Ｄａｈｌｉａ　ｖａｒｉａｂｌｉｓ）の種類に属している 多数の雑種ダリャが市販されて入手強壮剤及び痛風の治療剤として使用されてい た。

マメ科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）に属する。ハマエンドウ（Ｌａｔｈｙｒｕｓ ）は庭園観賞用植物として広範囲に栽培されてきており、最も広く知られている のはスィートピー植物、エジプト豆（Ｌａｔｈｙｒｕｓ　ｏｄｏｒａｔｕｓ）で ある。クリトリア（Ｃ１ｉｔｏｒｉａ）属はヨーロッパの園芸家には余り良く知 られておらず；クリトリア　テルナテア（Ｃ１ｉｔｏｒｉａ　ｔｅｒｎａｔｅａ ）は１８００年代に東インドから当初は伝えられた。

植物は、通常、菌類生物（ｆｕｎｇａｌ　ｏｒｇａｎｉｓｍ）に著しく富む基体 （ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）上で生長するか、感染した状態になることは希である。

潜在的な侵入物（ｐｏｔｅｎｔｉａｌｉｎｖａｄｅｒ）を排斥するために、植物 はその構成要素として又は誘導可能な形で、広い範囲の抗菌性化合物を産生ずる 。これらの抗菌性化合物の中で最も研究されているものはフィトアレキシン、即 ち、適当な防御関連信号分子（ｄｅｆｅｎｃｅ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｓｉｇｎａｌ 　ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の知覚（ｐｅｒｃｅｐｔ　１ｏｎ）に基ついて特異的に合 成される、広範囲の抗微生物活性を有する二次代謝産物（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　 ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ）である。

フィトアレキシンの産生は、フィトアレキシン生合成経路の酵素をコードする一 連の遺伝子の転写活性化（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ａｃｔｉｖａｔｉ ｏｎ）に基づいている。しかしなから、最近の１０年間に幾つかの植物タン白質 は植物病原性菌類（ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｆｕｎｇｉ）の制御にお いてより直接的な役割を果たし得ることが次第に明らかになった。

現在ては、キチナーゼ、ベーター−１，３−グルカナーゼ。

キチン結合性レクチン（ｃｈｉｔｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ　１ｅｃｔｉｎ）　、ゼ アマチン（ｚｅａｍａｔｉｎ）、チオニン及びリポソームー不活性化タン白質を 包含する、抗菌性を存する種々のタン白質が確認されている。

これらのタン白質はかなりの注目を集めてきており何故ならば生物調節剤（ｂｉ ｏｃｏｎｔｒｏｌ　ａｇｅｎｔ）として潜在的に使用し得たからである。キチナ ーゼ及びベーター−１，３−グルカナーゼはそれ自体弱い活性を有し、組合せて 施用した時に植物病原菌を阻害するに過ぎないＱｌａｕｃｈ等。

１９８８、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　８８．９３６〜９４２）。キチン 結合性レクチンもまたかなり弱い抗菌要素であると分類し得る（Ｂｒｏｅｋａｅ ｒｔ等、１９８９．５ｃｉｅｎｃｅ、　２４５．　１１００−１１０２；　Ｖａ ｎＰａｒｉｊＳ等１９９１．　Ｐｌａｎｔａ、　１８３．　２５８〜２６４）。

ゼアマチンはより強力な抗菌性タン白質であるがその活性は生理濃度でのイオン の存在により大きく低下する（Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＳｅｌｉｔｎｅｒｍｉｋｏｆ ｆ、　１９９０．　Ｇ、Ｇｅｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１３６．２１５０〜２ ＋５５）　、最後に、チオニン（ｔｈｉｏｎｉｎ）及びり♂ソーム不活性化タン 白質はヒトの細胞に対して有毒であることが知られているので潜在的に有害であ る　（Ｃａｒｒａｓｃｏ等。

１９８１、Ｅｕｒ　、ｌＢｉｏｃｈｅｍ、１１６．　１８５〜１８９　；　Ｖｅ ｒｎｏｎ等。

１９８５、Ａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　２３８．　１８〜２ ９：　５ｔｒｉｐｅ及びＢａｒｂｉｅｒｉ、　１９８６．　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ 、　１９５．　１〜８）。

今般本発明者は、植物病原性菌類に対して広範囲の活性を有し且つ若干の抗バク テリア活性とイオンに対する中度の感受性と培養したヒト細胞に対して明らかに 低い毒性とを有する新規な種類の強力な抗微生物性タン白質を精製した。

本発明によると、種子から単離し得る抗微生物性タン白質、特にダイコン（Ｒａ ｐｈａｎｕｓ）、アブラナ（Ｂｒａｓｓ　１ｃａ）。

カラン（Ｓｉｎａｐｉｓ）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ダリ ャ（口ａｈｌｉａ）、　アザミ（Ｃｎｉｃｕｓ）、　ハ？エントウ（Ｌａｔｈｙ ｒｕｓ）又はクリトリア（Ｃ１ｉｔｏｒｉａ）属を含めてカラシナ科、キク科又 はマメ科の群から単離し得る抗微生物性タン白質が提供される。

別の要旨においては、本発明は本発明のタン白質をコードするＤＮＡ配列を含有 するベクターよりなる。ＤＮＡはコード化されたタン白質を発現させ得る生物学 的系にクローン化又は形質転換させ得る。

本発明は、また本発明の抗微生物性タン白質をコードする組換え体ＤＮＡで形質 転換された植物を包含する。

本発明はまた、菌類又はバクテリアを本発明のタン白質に暴露する菌類又はバク テリアを駆除する方法よりなる。

新規な種類の強力な抗微生物性タン白質をカラシナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａ ｅ）、キク科（Ｃｏｍｐｏｓ　ｉ　ｔａｅ）及びマメ科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａ ｅ）の種子から単離した。同様なタン白質は他の植物の科、属及び種で見出され る。この種類は、共通のアミノ酸配列を共有し且つ広範囲の植物病原性菌類に対 して活性を示すタン白質を包含する。

ダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ　５ａｔｉｖｕｓ）の種子から単離した抗微生物性 タン白質はそれぞれ以下においてＲｓ−ＡＦＰＩ　（ダイコン：　Ｒａｐｈａｎ ｕｓ　５ａｔｉｖｕｓ−抗菌性タン白質■）及びＲｓ−ＡＦＰ２　：　（ダイコ ン：　ＲａｐｈａｎｕＳ　５ａｔｉＶｕＳ−抗菌性タン白質２）と呼ぶ２種のタ ン白質要素（ｆａｃｔｏｒｓ）を包含する。両者共、オリゴマー状タン白質であ り、同一の５ｋＤａサブユニツトからなる。両者のタン白質は高度に塩基性であ り、１０以上のｐ１値を有する。同様な抗菌性タンラシナ科から単離した。

ダリャ（Ｄａｈｌｉａ）及びアザミ（Ｃｎｉｃｕｓ）属の種子がら単離した抗微 生物性タン白質は以下においてそれぞれＤｍ−ＡＭＰＩ微生物性タン白質２）と 称する４種のタン白質要素を包から単離し得る。４種のタン白質は全て密接に関 連しており、オリゴマー状の構造体として配置した５　ｋＤａサブユニットから なる。

ハマエンドウ（Ｌａｔｈｙｒｕｓ）及びクリトリア（Ｃ１ｉｔｏｒｉａ）の種子 から単離した抗微生物性タン白質は以下においてそれぞれＬｃ−ＡＦＰ　（−ｒ −ジプト豆；　ｔ、ａｔｈｙｒｕｓ　ｃｉｃｅｒａ−抗菌性タン白質）、　Ｃｔ −ＡＭＰＩ　（クリトリア　テルナテア。

Ｃ１１ｔｏｒｉａ　ｔｅｒｎａｔｅａ−抗微生物性タン白質Ｉ）及びＣｔ−ＡＭ Ｐ２　（クリトリア　テルナテア；　Ｃ１１ｔｏｒｉａ　ｔｅｒｎａｔｅａ−抗 微生物性タン白質２）と称する３種のタン白質要素を包含する。Ｌｃ−ＡＦＰは ハマエンドウ（Ｌａｔｈｙｒｕｓ）属の種子から単離できる。Ｃｔ−ＡＭＰタン 白質゛はクリトリア（Ｃ１ｉｔｏｒｉａ）属の種子から単離てきる。３種のタン 白質は全てオリゴマー状構造体として配置された５　ｋＤａサブユニットよりな りしかも高度に塩基性である。

Ｎ−末端アミノ酸配列の測定が示した所によれば、カラシナ科、キク科及びマメ 科から単離した前記のタン白質は密接に関連しておりしかも単一タン白質の一族 であると分類し得る。種々の植物の科の間では、タン白質配列は大体５０％が同 一である。これらの配列により標準のペプチド合成機を用いて化学合成により該 タン白質を製造し得る。

抗微生物性タン白質はＣｈｉａｎｇ及びＨａｄｗｉｇｅｒ、　１９９１（Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｃｒｏｂｅ　Ｉｎｔｅｒａｃｔ、４．３２４−３３１）によっ て記載さｐ１３９及びｐ１２３０の予期したタン白質生成物と部分的に相同性で ある。この相同性はイシバシ等（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ。

１９９０、１５．　５９〜６４）によって記載される如くササゲ遺伝子の予期し たタン白質生成物と共に共有される。抗微生物性タン白質はＳｔｉｅｋｅｍａ等 、　１９８８（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ。

Ｉｌ、２５５〜２６９）によって記載される如くジャガイモる。ｃＤＮＡが研究 されているに過ぎないので遺伝子ｐ１３９゜ｐ１２３０．　ｐｓＡｓｌｏ又はｐ １３２２にエンコードしたタン白質の生物学的特性については何も知られていな い。然しながら、ρ１３９．　ｐ１２３０及びｐ１３２２遺伝子は病害又は他の 外的条件によって植物にチャレンジした後にスイッチされる。

ｐｓＡｓ１０遺伝子は発芽に伴なうタン白質をコードすると提案されている。本 発明の抗微生物タン白質と配列類似性の故に、ｐ１３９．　ｐ［２３０，ｐｓＡ ｓｌｏ又はｐ１３２２によってエンコードされるタン白質は殺菌剤又は抗生物質 として有用であり得る。

抗微生物性のタン白質配列は禾本科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）の次の一員：コウリ ャン（Ｂｌｏｃｋ及びＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、　１９９１．　ＦＥＢＳＬｅｔｔ 、　２７９　：　１ｏｔ−１０４）、小麦（Ｃａｌｉｔｔａ等、　＋９９０．　 ＦＥＢＳＬｅｔｔ、　２７０　：　１９１−１９４）及び大麦（Ｍｅｎｄｅｚ等 、１９９０゜Ｅｕｒ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９４：　５３３〜５３９）で見出 される一群の小さなα−アミラーゼ阻害剤（インヒビター）の配列と低度の部分 的な相同性を示す。コウリャンからのＳｉα２及び小麦からのγ−１−プロチオ ニンを含めてか＼るタン白質は昆虫のα−アミラーゼを阻害することが知られて おりしかも幼虫に対しては有毒である。これらのα−アミラーゼ阻害剤か何らか の抗菌活性又は別の抗微生物活性を示すかどうかは知られておらず：これら阻害 剤の生物学的活性について別のデータは報告されていない。本発明の抗微生物性 タン白質と配列類似性の故にα−アミラーゼ阻害剤タン白質は殺菌剤として又は 抗生物質として作用てあり得る。

第３の抗菌性タン白質は、以下ではＲ５−ｎ５ＬＴＰ　（ダイコン：　Ｒａｐｈ ａｎｕｓ　５ａｔｉｖｕｓ非特異の脂質転移タン白質）と称するダイコンの種子 から単離されている。このタン白質は二量体状タン白質であり、２個の同一な９ 　ｋＤａサブユニットからなる。アミノ酸配列を測定するとＲ５−ｎ５ＬＴＰの ４３個のＮ−末端残基の存在を確認し、別の植物から単離した非特異の脂質転移 タン白質（Ａｒｏｎｄｅｌ及びＫａｄｅｒ。

１９９０、　Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ、　４６：　５７９〜５８５）と相同性で あるが前述した別の抗微生物性タン白質とは相同性てないことを示した。Ｒ５− ｎ５ＬＴＰ配列により標準ペプチド合成機を用いて化学合成によってタン白質を 製造することが可能である。

これらタン白質の主要構造の理解によって抗微生物性タン白質をコードするＤＮ Ａ構造体を製造することか可能である。ＤＮＡ配列は既知のアミノ酸配列から予 測でき、又はＤＮＡ配列は植物由来のＤＮＡライブラリーから単離てきる。

オリゴヌクレオチド　プローブは既知のアミノ酸配列から誘導できしかも該プロ ーブを用いてタン白質の若干又は全てをコードするｃＤＮＡクローンをｃＤＮＡ ライブラリーから篩別てきる。Ｒｓ−ＡＦＰｓをコードするｃＤＮＡクローンは この仕方で単離され且つ配列された。これらの同じオリゴヌクレオチド　プロー ブ又はｃＤＮＡクローンを用いてゲノムＤＮＡライブラリーを篩別することによ り実際のＡＦＰ。

ＡＭＰ又はＲ３−ｎ５ＬＴＰ遺伝子を単離できる。か＼るゲノムクローンは植物 ゲノム中で作用する制御配列を含有し得る。

即ち、プロモーター配列を単離することもでき、このプロモーター配列を用いて 抗微生物性（又は他の）タン白質の発現を行なうことができる。これらのプロモ ーターは特に環境条件（例えば菌類病原体の存在）に応答性であり得る。

抗微生物性タン白質をコードするＤＮＡ　（これはｃＤＮＡクローン、ゲノムク ローン又は標準の核酸シンセサイザーを用いて製造されたＤＮＡであり得る）は 次いでタン白質の発現を可能とする生物学的系にクローン化し得る。それ故タン 白質を適当な微生物又は培養細胞中で製造し、抽出し単離して使用できる。適当 な微生物としては大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）及び麦酒酵母菌 （Ｓａｃｃｈａｎｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）がある。遺伝子材料はま たウィルス又はバクテリオファージ中にクローン化し得る。適当な細胞としては 培養昆虫細胞及び培養哺乳動物細胞がある。このＤＮＡを用いて既知の方法によ り任意の植物種をまた形質転換させ、こうして抗微生物性タン白質を植物内で発 現させる。

本発明による植物細胞は、本発明による構造体ポレーション、マイクロインジェ クション（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃ−ｔｉｏｎ）　、　マイクロプロジエクテイル ガン（ｍｉｃｒｏｐｒｏ　ｊｅｃ−ｔｉｌｅ　ｇｕｎ）等］により形質転換し得 る。ついで、適当な場合には、形質転換細胞を、新規な核物質かゲノム中に安定 に組込まれている全植物（ｗｈｏｌｅ　ｐｌａｎｔ）として再生させることかで きる。この方法により単子葉及び双子葉植物を得ることかできるが、通常、後者 の方が再生がより容易である。

本発明に従って製造し得る遺伝的に修飾した（ｇｅｎｅｔｉ−ｃａｌｌｙ　ｍｏ ｄｉｆｉｅｄ）植物の例としては次のものが挙げられる：屋外作物、穀類、果実 及び野菜例えばカノラ（ｃａｎｏｌａ）、ヒマワリ、タバコ、テンサイ、綿、大 豆、トウモロコシ、小麦、大麦、米、コウリャン、トマト、マンゴ−、モモ、リ ンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、ジャガイモ、ニンジン、レタス、キャベ ツ、タマネギ。

ＡＦＰ、　ＡＭＰ及びＲ５−ｎ５ＬＴＰタン白質は抗酵母活性を含めて広範囲の 抗菌活性を示し、ＡＭＰｓはまたグラム陽性バクテリアに対しても活性である。

これらのタン白質は殺菌剤又は抗生物質として作用である。植物病原体を抗微生 物性タン白質に暴露することは標準の農業技術（例えば噴霧）を用いてタン白質 を植物体部分に施用することにより達成できる。これらのタン白質は植物体内で 発現させることにより菌類又はバクテリアの病害を駆除するのにも使用できる。

抗微生物性タン白質は全て驚くべき程に高い活性を示す：これらはミクロモル以 下（ｓｕｂｍｉｃｒｏｍｏｌａｒ）の施用量で種々の植物病原菌の生長を抑制す る。ＡＭＰｓの抗菌活性は部分的にはイオン条件に左右されるに過ぎない。ＡＦ Ｐｓの抗菌作用は生理濃度（５０ｍＭ）のに゛イオンによっては影響されない。

Ｒｓ−ＡＦＰ２ではなくてＲｓ−ＡＦＰＩの抗菌作用は生理濃度（Ｉ　ｍＭ）の Ｃａ２″″により拮抗される。Ｒ５−ｎ５ＬＴＰはまた種々の植物病原菌の生長 を抑制するがＡＦＰｓよりも余り強力ではなく且つより塩感作性である。

抗微生物性タン白質は適当な種子から単離、精製でき、あるいはその既知のアミ ノ酸配列から人工的に合成できあるいは組換え体ＤＮＡの発現により適当な微生 物内で製造し得る。このタン白質は形質転換植物内でも発現させ得る。

本発明は図面を参照することにより更に理解されるでてのカチオン交換クロマト グラムとこれに組合せた菌生長抑制率のグラフを示す。

第２Ａ図は精製Ｒｓ−ＡＦＰＩの）ＩＰＬＣプロフィールを示す。

第２Ｂ図は精製Ｒｓ−ＡＦＰ２及びＲ５−ｎ５ＬＴＰのＨＰＬＣプロフィールを 示す。

第３図は精製Ｒｓ−ＡＦＰＩ及びＲｓ−ＡＦＰ２の天然ゲル電気泳動及びバイオ ザイモグラフィーを示す。

第４図は西洋アブラナ（Ｂ　ｎａｐｕｓ）の抗菌性タン白質についてのカチオン 交換クロマトグラムとこれに組合せた菌生長抑制率のグラフを示す。

第５図は、精製した西洋アブラナ（Ｂ　ｎａｐｕｓ）の抗菌性タン白質の）ＩＰ Ｌｃプロフィールを示す。

第６図はアブラナ（足囲）の抗菌性タン白質についてのカチオン交換クロマトグ ラムとこれに組合せた菌生長抑制率のグラフを示す。

第７図は精製したアブラナ（Ｂ　ｒａｐａ）の抗菌性タン白質の）ＩＰＬｃプロ フィールを示す。

第８図はシロカラシ（Ｓ　ａｌｈａ）の抗菌性タン白質についてのカチオン交換 クロマトグラムとこれに組合せた菌生長抑制率のグラフを示す。

第９図は精製したシロカラシ（Ｓ　ａｌｂａ）の抗菌性タン白質のＩ（ＰＬＣプ ロフィールを示す。

第１０図はΔ　ｔｈａｌｉａｎａの抗菌性タン白質についてのカチオン交換クロ マトグラムとこれに組合せた菌生長抑制率のグラフを示す。

第１１図は精製したΔ　ｔｈａｌｉａｎａの抗菌性タン白質のＨＰＬＣプロフィ ールを示す。

第１２図はダリャ　メルツキ（Ｄａｈｌｉａ　ｍｅｒｃｋｉｉ）の塩基性抽出物 についてのカチオン交換クロマトグラムと対応する抗菌活性のグラフを示す。

第１３図は精製したＤｍ−ＡＭＰＩ及びＤｍ−ＡＭＰ２の逆相ＨＰＬＣプロフィ ールを示す。

第１４図はサントリツウ（Ｃｎｉｃｕｓ　ｂｅｎｅｄｉｃｔｕｓ）の塩基性抽出 物についてのカチオン交換クロマトグラムと対応する抗菌活性のグラフを示す。

第１５図は精製したＣｂ−ＡＭＰＩの逆相ＨＰＬＣプロフィールを示す。

第１６図は精製したＣｂ−ＡＭＰ２の逆相ＨＰＬＣプロフィールを示す。

第１７図はハマエンドウ（Ｌａｔｈｙｒｕｓ）の塩基性抽出物についてのカチオ ン交換クロマトグラムと対応する抗菌活性のグラフを示す。

第１８図は精製Ｌｃ−ＡＦＰの逆相ＨＰＬＣプロフィールを示す。

第１９図はクリトリア（Ｃ１ｉｔｏｒｉａ）の塩基性抽出物についてのカチオン 交換クロマトグラムと対応する抗菌活性のグラフを示す。

第２０図は精製Ｃ１−ＡＭＰＩの逆相ＨＰＬＣプロフィールを示す。

第２１図は精製Ｃｌ−ＡＭＰ２の逆相）ＩＰＬＣプロフィールを示す。

第２２図は精製Ｒｓ−ＡＦＰｓの５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。

第２３図は精製Ｒ５−ｎ５ＬＴＰの５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。

第２４図は精製Ｄｍ−ＡＭＰｓの５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。

第２５図は精製Ｃｂ−ＡＭＰｓ　ｃ７）　５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析ヲ示ス。

第２６図ハ憤製Ｌｃ−ＡＦＰ及Ｕ　Ｃｔ−ＡＭＰｓ　ｃ７）　５ＤＳ−ＰＡＧＥ 分析ヲ示す。

第２７図はＲｓ−ＡＰＰＩ、　Ｒｓ−ＡＦＰ２及び関連するカラシナ科（Ｂｒａ ｓｓ　１ｃａｃｅａｅ）タン白質のアミノ酸配列を示す。

第２８図はＤｍ−ＡＭＰｓ及びＣｂ−ＡＭＰｓのアミノ酸配列を示す。

第２９図はしｃ−ＡＦＰ及びＣｔ−ＡＭＰＩのアミノ酸配列を示す。

第３０図はＲｓ−ＡＦＰｌ、　Ｄｍ−ＡＭＰＩ、　Ｃｂ−ＡＭＰｓ、　Ｌｃ−Ａ ＦＰ、　Ｃｔ−ＡＭＰＩ、コウリャンＳ１α２．小麦γｌブロチオニンのアミノ 酸配列の列及びエントウ豆遺伝子ｐ［２３０及びｐ１３９の予測生成物、ササゲ 遺伝子ｐＳＡＳ１０の予測生成物及びジャガイモの遺伝子ｐ３２２の予測生成物 のアミノ酸配列の列を示す。

第３１Ａ図はＤ＋ｎ−ＡＭＰ及びＣｂ−ＡＭＰ遺伝子について予期したＤＮＡ配 列を示す。

第３１Ｂ図はＬｃ−ＡＦＰ及びＣｔ−ＡＭＰＩ遺伝子について予期したＤＮＡ配 列を示す。

第３２図はＲ５−ｎ５ＬＴＰのアミノ酸配列を示す。

第３３図はＲ５−ｎ５ＬＴＰ及び種々の植物の非特異脂質転移タン白質のアミノ 酸配列の列を示す。

第３４図はＲｓ−ＡＦＰ２試験管内活性のグラフを示す。

第３５図はＲｓ−ＡＦＰＩの全長ｃＤＮＡ配列を示す。

第３６図はＲｓ−ＡＦＰ２の切頭ｃＤＮＡ配列を示す。

第３７図はＲｓ、−Ａ　Ｆ　Ｐ　２のＰＣＲで補助される部位指向突然変異誘発 （ムタゲネシス）の全長ＤＮＡ配列を示す。

第３８図は発現ベクターｐＦＲＧ　７を示す。

第３９図は発現ベクターｐＦＲＧ　８を示す。

次の実施例によって本発明を例証する。

実施例１ 抗菌活性及び抗バクテリア活性の検定 抗菌活性は従来の文献（Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ、　１９９０．　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃ ｒｏ−ｂｉｏｌ　Ｌｅｔｔ、　６９．５５−６０）に記載されているごとき顕微 分光分析（ｍｉｃｒｏｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ）により測定した。

試験は、慣用的に、２０μｌの（フィルター−殺菌）試験溶液と、　ｌ／２濃度 の（ｈａｌｆ　ｓｔｒｅｎｇｔｈ）馬鈴薯デキストロース肉汁（１／２ＰＤＢ） 中の菌胞子懸濁液（胞子数２　Ｘ　１０’　／ｍ１）８０μｌを使用して行なっ た。若干の試験は合成増殖培地中の菌糸体フラグメントの懸濁液を用いて行なっ た。合成増殖培地１；！に＊ＨＰＯ４（２，５ｒｎＭ）、　Ｍｇ５Ｏ，（５Ｏａ Ｍ）、　ＣａＣ１ｔ（５ＯａＭ）、　Ｆｅ５Ｏａ（５μＭ）、ＣｏＣ１ｔ（０， １μＭ）、　Ｃｕ５Ｏ４（０，１μＭ）。

Ｎａ！Ｍｏ０ａ（２μＭ）、ＨＪＯｓ（０，５μＭ）、　Ｋｌ（０，１μＭ）、 Ｚｎ５Ｏ４（０，５μＭ）、Ｍｎ５Ｏ４（０，１μＭ）、　グルコース（１０ｇ ／ｌ）、アスパラギン（ｌ　ｇ／Ｉ）、メチオニン（２０ｍｇ／ｌ）、ｍｙｏ− イノシトール（２ｏ＋ｇ／ｌ）、ビオチン（０，２ｍｇ／　ｌ）　、チアミン− ＨＣＩ（１ｍｇ／Ｉ）及びピリドキシン−ＨＣＩ（０，２ｍｇ／Ｉ）からなる。

対照ミクロ培養液（ｃｏｎｔｒｏｌ　ｍ１ｃｒｏｃｕｌｔｕｒｅ）は２０μｍの 殺菌蒸留水と８０μｍの菌胞子懸濁液を含有していた。

特に説明かない限り、供試微生物はフサリウム　クモ／ｌ／　Ｌ　（Ｆｕｓａｒ ｊｕｍ　ｃｕｌｍｏｒｕｍ）　（菌株　ＩＭＩ　１８０４２０）であり、培養は ２５℃で４８時間行なった。生長抑制率（％）は５９５ｎｍにおける対照ミクロ 培養液の修正吸光度、（ｃｏｒｒｅｃｔｅｃｆａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）に対する 、対照ミクロ培養液の修正吸光度から供試ミクロ培養液の修正吸光度を差し引い たものの比の１００倍と定義される。修正吸光度値は４８時間後に測定した培養 液の５９５ｎｍての吸光度から、３０分後に測定した５９５ｎｍでの吸光度を差 し引いた値に等しい。

抗バクテリア活性は顕微分光分析により以下に述べるごとき方法で測定した。軟 質栄養アガロース［トリプトン　１０ｇ／ｌ　；ジ−プラーク（Ｓｅａｐｌａｑ ｕｅ）アガロース（ＦＭＣ）５ｇ／ｌ］に接種することによりバクテリア懸濁液 を調製した。バクテリア懸濁液（１ｍｌ当り、１０５コロニー形成単位）の−分 量（８０μｌ）を平底９６−ウェル（ｗｅｌｌ）マイクロプレート（ｍｉｃｒｏ ｐｌａｔｅ）中のフィルター殺菌試料（２０μｍ）に添加した。２８°Ｃでの培 養を３０分及び２４時間行なった後、マイクロプレートリーダーを使用して、培 養液の５９５ｎｍでの吸光度を測定した。生長抑制率は抗菌活性検定について述 へたごとくして算定した。

実施例２ ダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ　５ａｔｉｖｕｓ）の種子からの塩基性タン白質フ ラクションの抽出 ３０〜７０％の間の相対飽和度（ｒｅｌａｔｉｖｅ　５ａｔｕｒａｔｉｏｎ）で 沈殿するタン白質の硫酸アンモニウム分別を行なった後、熱処理して熱不安定性 タン白質を除去し且つｐＨ９で平衡化したＱ−セファ０−ス（Ｑ−３ｅｐｈａｒ ｏｓｅ）　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）アニオン交換カラム上を通過させること により塩基性タン白質フラクション（ｐｉ＞９）を単離した。詳細な方法は以下 に記載する。

Ｉｋｇのダイコン（Ｒ５ａｔｉｖｕｓ）種子（ベルギー、Ａｖｅｖｅから入手） をコーヒーミル中で粉砕し、得られた粗い粉末を、１０ｍＭのＮａ８２ＰＯ４， １５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４，ｌ００ｍＭのＫＣＩ、　２ｍλ１のＥＤＴＡ、２耐 １のチオ尿素及び１ｍＬｌのＰ　ｋｌ　Ｓ　Ｆを含有する水冷抽出緩衝液（ｅｘ ｔｒａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ）を２１を使用して４゛Ｃて２時間抽出した。

ホモジネート（ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ）をチーズクロス（ｃｈｅｅｓｅｃｌｏｔ ｈ）を通して絞り、遠心分離（７０００Ｘｇで３０分間）により清澄化した。上 澄液に固体硫酸アンモニウムを添加して相対飽和度を３０％とし、室温で一夜放 置後に生成した沈殿を遠心分離（７０００ｘｇで３０分間）により除去した。上 澄液の硫酸アンモニウムの相対飽和度を７０％に調節しついで室温で一夜放置し て生成した沈殿を遠心分離（７０００ｘｇで３０分間）により捕集した。ペレッ トを４００ｍ１の蒸留水に再度溶解させた後、該溶液を１５分間８０°Ｃに加熱 した。凝固した不溶性物質を再度の遠心分離（７０００ｘｇで３０分間）により 除去し、上澄液を１、０００Ｄａの分子量カットオツフ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　 ｗｅｉｇｈｔ　ｃｕｔｏｆｆ）を有するチューブ（ｔｕｂｉｎｇ）（ｓｐｅｃｔ ｒａｌｐｏｒ、　Ｓｐｅｃｔｒｏｍ。

米国）を使用して蒸留水に対して長時間（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ）透析した。

透析後、１０倍に濃縮した緩衝液（ｔｅｎ−ｆｏｌｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ 　ｂｕｆｆｅｒ）を添加することにより溶液を５０ｍ＾（Ｔｒｉｓ−１（ＣＩ　 （ｐＨ９）に調整し、ついで、５０ｍλＩ　ＴｒｉＳ−ＨＣＩ（ｐＨ９）と平衡 なＱ−セファロースファストフロー（Ｑ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌ ｏｗ）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製スエーデン、アップサラ）　（１２ｘ　 ５　ｃｍ）上を通過させた。カラムを通過したタン白質フラクションを蒸留水に 対して長時間透析し、しかも１０倍に濃縮した緩衝液を添加することにより５０ ｍＭ　ナトリウムＮ−モルホリノエタンスルホン酸（Ｎａ−ＭＥＳ）　（ｐＨ６ ）に調整した。

この物質はダイコン（Ｒ５ａｔｉｖｕｓ）Ｆｌ子の熱安定性塩基性タン白質フラ クションを表わす。これについて更に行なったクロマトグラフィーによる精製は 実施例３に記載されている。

実施例３ ダイコン（Ｒ５ａｔｉｖｕｓ）種子からの抗菌性タン白質の精製 ダイコン　（Ｒ５ａｉｉｖｕｓ）抗菌性タン白質の単離のための出発原料は実施 例２に記載のごとくして成熟種子から抽出した塩基性熱安定性タン白質フラクシ ョンであった。

これらのタン白質を第１図に示すごとくカチオン交換クロマトグラフィーにより 更に分離した。

約１５０ｍｇの塩基性熱安定性タン白質フラクションを５０ｍＭのす）・リウム ＭＥＳ　（ｐＨ６）に溶解し、予めナトリウＭＥＳ緩衝液で平衡化したＳ−セフ ァロース高性能（Ｓ−８ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）（ＩＯＸ　１．６ｃｍ）上に供給した。カ ラムを０〜５００ｍＭのＮａＣ１を含有する５０ｍＭのナトリウム＋１ｌＥＳ緩 衝液（ｐＨ６）　ＩＯｏｏｍｌを使用して直線的勾配で２．５ｍｌ／分の速度て 溶離した。

溶出液を２８０ｎｍての吸光度のオンライン測定によりタン白質について監視し くその結果は第１図の下方パネルに示されている）　、１．Ｏｍｌのフラクショ ンずつ回収し、そのうち２０μｌを実施例１て記載したごとき顕微分光分析によ る抗菌活性評価において、合成増殖培地（培地Ａ、結果は第１図の上方パネルに 実線として示した）又は１ｍＭＣａＣ１ｚと５０ｍＭ　ＫＣＩとを補給した同じ 合成増殖培地（培地Ｂ、結果は第１図の上方パネルにダッシュ線として示した） の何れかを用いて試験した。

を表わしている幅広のピークと、それぞれ１００及び２００ｍＭＮａＣｌ付近で 溶離する十分に分離された（ｒｅｓｏｌｖｅｄ）　２個のピーク（ピークｌ及び ピーク２）と、　２５０〜４５０ｍＭ　ＮａＣ１て溶離する５個の未分離ピーク （ピーク３〜７）の一群とを精製した。未境界フラクションには抗菌活性か伴な われず、然るに全ての境界（ｂｏｕｎｄ）ピークフラクションは培地Ａで検定し た時に抗菌活性を示した。然しなから、培地Ｂて行なった試験ではそれぞれピー クｌ及び２に対応するフラクションについて生長抑制を示すに過ぎない。

それ故これらのフラクションの抗菌活性はピーク３〜７のフラクションの抗菌活 性よりも塩依存性が余りないと思われる。

更に、増殖培地Ｂて抗菌活性を示しているフラクション（ピークｌ及び２）を逆 相クロマトグラフィーにより精製した。約１ｍｇの量のピークｌ物質（第２Ａ図 ）とピーク２物質（第２Ｂ図）を、０．１％ＴＦＡで平衡化したＰｅｐ−３（多 孔質シリカＣ２／　Ｃ＋ｓ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）カラム（２５ｘ　Ｏ，９ ３ｃｍ）上に充填した。カラムの溶離は５ｍ１Ｚ分の速度でかつ２００ｍ１の０ ．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）から４０％アセトニトリル１０．１％ＴＦＡ までの直線的勾配で行なった。溶出液は２１４ｎｍでの吸光度をオンライン測定 することによりタン白質について監視した。溶出液のフラクションを５ｍｌずつ 捕集し、真空乾燥し、最後に０、５ｍｌの蒸留水に溶解させた：そのうちｌＯμ ｌを顕微分光分析による抗菌活性評価試験で使用した。

第２Ａ図及び第２Ｂ図に、それぞれ、精製ビークｌ物質とビーク２物質のＨＰＬ Ｃプロフィールが示されている。

下方パネルには２１４ｎｍでの吸光度を測定することによる溶出液のタン白質に ついての監視結果が示されている。

培地Ａ（実線）及び培地Ｂ（ダッシュ線）における顕微分光分析による抗菌活性 評価の結果は上方パネルに示されている。

ビークｌからの物質は、３０％アセトニトリルで溶離されしかも培地Ａと培地Ｂ との両方で抗菌活性を有して共溶能（ｃｏ−ｅｌｕｔ　ｉｎｇ）される単一の主 ピークを生成した。このビークから単離した活性因子をＲｓ−ＡＦＰＩ　（ダイ コン（Ｒａｐｈａｎｕｓ　５ａｔｉｖｕｓ）の抗菌性タン白質ｌ）と称する。

他方ビーク２物質はそれぞれ３０％及び３３％のアセトニトリルで溶離する２個 の主ピークに分離した。３０％アセトニトリルで溶離するビークは培地Ａ及び培 地Ｂの両者で活性であるが、３３％アセトニトリルで溶離するビークは培地Ａで のみ活性である。３０％アセトニトリルビークかリルピークからの活性因子は、 それが他の植物種から単離した非特異脂質転移タン白質と相同性を有する故にＲ ５−ｎ５ＬＴＰ　（ダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ　５ａｔｉｖｕｓ）の非特異脂 質転移タン白質）と呼ぶ（実施例１３参照）。

実施例４ 単離したＲｓ−ＡＦＰｓの純粋 単離した抗菌性タン白質の純粋（ｐｕｒｉｔＹ）は天然のカソードゲル電気泳動 、続いてのタン白質の染色（第３図の左パネル）及びバイオザイモグラフ技術を 用いての抗菌活性のその場での検出（第３図の右パネル）によって証明された。

天然のカソードゲル電気泳動及びバイオザイモグラフィーは、若干の変更を行な いながら前記の如＜　（ＤｅＢｏｌｌｅ等、１９９１．　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏ ｒｅｓｉｓ、１２．　４４２〜４４４）行なった。電気泳動は６０ｍλｌ　Ｔｒ ｉｓ／７０ｍλＩＭＥｓを含有する連続相の１０％アクリルアミドゲル（ｐＨ７ ）上で行なった。

電気泳動の緩衝液は１００ｍ＆Ｉ　Ｌ−ヒスチジン／４１ｍ＾］λＩＢＳ（ｐＨ ６ｙ５）よりなる。電気泳動中はゲルをｌＯｏＣに冷却した。

供試試料は２０％のグリセロールと０．００２５％のメチレンブルーと１０８ｇ の精製Ｒｓ−ＡＦＰＩ又は２０μｇのＲｓ−ＡＦＰ２とを含有した。タン白質は ゲルから製造した拡散プロットの銀染色により検出した（Ｋｏｖａｒｉｋ等、　 １９８７．　ＦｏｌｉａＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、　３３．　２５３〜２５７）。

このゲルを、生育しつるトリコデルマハマタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｈａ ｍａｔｕｍ）胞子を含有する軟質寒天ゲル（Ｄｅ　Ｂｏｌｌｅ等、　１９９１． 　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏ−ｒｅｓｉｓ、　１２．４４２〜４４４）と重ね且つ２ ５°Ｃで３日間培養（インキュベート）した。

第３図（左パネル）が示す所によればＲｓ−ＡＦＰＩ　（レーンｌ）及びＲｓ− ＡＦＰ２　（レーン２）はカソードゲル電気泳動後には単一のタン白質バンドと して移動する。更には、抗菌活性はゲル中のタン白質バンドと共に正しく共移動 した（右パネル）。これらの結果により単離したタン白質因子は高度に純粋であ り、しかも抗菌活性は少量の汚染物には帰因されないことを示している。

実施例５ カラシナ科植物の他の種からのＲｓ−ＡＦＰｓに関連する抗菌性タン白質 実施例３に記載した精製法を用いて、西洋アブラナ（Ｂｒａｓｓ　１ｃａｃｅａ ｅ）からの抗菌性タン白質を単離した。

第４図は西洋アブラナ（Ｂ　ｎａｐｕｓ）から単離した抗菌性タン白質について のカチオン交換クロマトグラム及びこれに組合せた菌類生長抑制率のグラフ（上 方のパネル）を示す。第５図はビーク１　（Ｂｎ−ＡＦＰＩ、左パネル）及びビ ーク２　（Ｂｎ−ＡＦＰ２．右パネル）から単離した精製Ｂ　ｎａｐｕｓ抗菌性 タン白質のＨＰＬＣプロフィールを示す。

第６図はＢ　ｒａｐａから単離した抗菌性タン白質についてのカチオン交換クロ マトグラム及びこれに組合せた菌類生長抑制率のグラフ（上方パネル）を示す。

第７図はビーク１　（Ｂｒ−ＡＦＰｌ、左パネル）及びビーク２　（Ｂｒ−ＡＦ Ｐ２゜右パネル）から単離した精製Ｂ　ｒａｐａ抗菌性タン白質の）ＩＰＬＣプ ロフィールを示す。

第８図はＳ　’ａｌｈａから単離した抗菌性タン白質についてのカチオン交換ク ロマトグラム及びこれに組合せた菌生長抑制率のグラフ（上方パネル）を示す。

第９図はビークｌ　（Ｓａ−ＡＦＰｌ、左パネル）及びビーク２　（Ｓａ−ＡＦ Ｐ２．右パネル）から単離した精製Ｓ　ａｌｈａ抗菌性タン白質のＨＰＬＣプロ フィールを示す。

第１Ｏ図はＡ　ｔｈａｌｉａｎａから単離した抗菌性タン白質についてのカチオ ン交換クロマトグラム及びこれに組合せた菌生長抑制率のグラフ（上方パネル） を示す。第１１図はビーク１（Ａｔ−ＡＦＰｌ）から単離した精製Ａ　ｔｈａｌ ｉａｎａ抗菌性タン白質の１（ＰＬＣプロフィールを示す。

これらの抗菌性タン白質は全てそれらの５ＤＳ−ＰＡＧＥ及び等電点電気泳動パ ターン（実施例５に記載した如く）に関してＲｓ−ＡＦＰＩ及びＲｓ−ＡＦＰ２ と同様に挙動した。

実施例６ ダリヤ　メルツキ（Ｄａｈｌｉａ　ｍｅｒｃｋｉｉ）、サントリツウ（Ｃｎｉｃ ｕｓ　ｂｅｎｅｄｉｅｃｔｕｓ）、エジプト豆（Ｌａｔｈｙｒｕｓンの抽出 購入した）又はしａｔｈｙｒｕｓ　ｃｉｃｅｒａの種子（ポルトガルＩｎ５ｔｉ ｔｕｔｏ　Ｂｏｔａｎｉｃｏ　Ｕ旧ｖｅｒｓｉｔａｄｅ　Ｃｏｉｍｂｒａから入 手）５００ｇずつをコーヒーミル中で粉砕し、得られる粗い粉末を、１０ｍＭ　 ＮａＨ２ＰＯ−、１５ｍＭ　Ｎａｔ）ＩＰＯ４，１００ｍＭ　ＫＣｌ、２ｍＭＥ ＤＴＡ及び１ｍＭベンズアミジンを含有する水冷抽出緩衝液２１で４°Ｃで２時 間抽出した。得られるホモジネートをチーズクロスを通して絞り、遠心分離（７ ，０００ｘｇで３０分間）により清澄化した。上澄み液に固体硫酸アンモニウム を添加して７５％の相対飽和度とし、４°Ｃで一夜放置することにより沈殿を形 成させた。７，０００　ｘｇで３０分間遠心分離したのに続いて、沈殿を最小量 の蒸留水に再溶解させ、ベンゾイル化セルロースチューブ（Ｓｉｇｍａ、セント ルイス、ＭＯ）を用いて蒸留水に対して長時間透析した。

透析後に、１０倍に濃縮した緩衝液を添加することにより溶液を５０ｍＭ　ＮＨ ４ＡＣ（ｐＨ９）に調整し、次いて５０ｍＭ　ＮＨ４ＡＣ（ｐＨ９）に平衡化し たＱ−セファロース　ファーストフロー　（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ 　Ｆｌｏｗ）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製、スエーデン、アップサラ）　（ １２ｘ５ｃｍ）上に通過させた。

カラムを通過したタン白質フラクションは酢酸でｐＨ６に調節した。

この物質は種子の塩基性（ｐｌ＞９）タン白質フラクションを表わす。これらの フラクションは実施例７，８゜９及び１０に記載した如く更に精製した。

実施例７ 菌性タン白質の精製 Ｄ　ｍｅｒｃｋｉｉ抗微生物性タン白質の単離のための原料は実施例６の如く成 熟種子から抽出した塩基性タン白質フラクションであった。これらのタン白質を この抽出液のカチオン交換クロマトグラフィーにより更に精製した。

大体５００ｍ１の塩基性タン白質フラクションを、５０ｍＭＮＨ４ＡＣ，ｐＨ６ で平衡化したＳ−セファロース高性能（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）カラム（ｆｏ ｘ　１．６ｃｍ）に施用した。カラムを３２５分間に亘って５０〜７５０ｍ１の ＮＨ＜Ａｃ、　ｐ）１６．０の直線的勾配で３．０ｍｌ／分の速度て溶離した。

溶出液を２８０ｎｍての吸光度のオンライン測定によりタン白質について監視し くその結果は第１２図の下方パネルに示した）　、１０ｍ１のフラクションずつ 回収した。各々のフラクションからの試料を実施例Ｉに記載した如く抗菌活性に ついて検定した（結果は第１２図の上方パネルに示した）。

クロマトグラフィーに続いて、抽出液は約２５０ｍＭ　ＮＨ４ＡＣて溶離する活 性の幅広ピークを生成した。抗菌活性を示すフラクションをプールし且つ更に逆 相ＨＰＬＣによって精製した。約３ｍｇ量のピーク物質を、０．１％ＴＦＡ　（ ）リフルオロ酢酸）で平衡化したＰＥＰ−３（多孔質シリカＣ２／Ｃ＋ｓ、Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ社製）カラム（２５ｘ　Ｏ，４ｃｍ）上に充填した。カラムは１ ００分間に亘って０．１％ＴＦＡ〜１００％アセトニトリル１０．１％ＴＦＡの 直線的勾配で１　ｍｌ／分で展開した。溶出液は２８０ｎｍでの吸光度のオンラ イン測定によりタン白質について監視した（結果は第１３図の下方パネルに示し た）。１ｍｌのフラクションずつ捕集し、真空乾燥し、０．５ｍｌの蒸留水に溶 解させた。各々のフラクションからのｌＯμＩを抗菌活性について検定した（結 果は第１３図の上方パネルに示した）。ピーク物質は１８％及び２２％アセトニ トリルて溶離する、十分に分離された活性のピーク２個か得られた。これらのピ ークはそれぞれ精製タン白質Ｄｍ−ＡＭＰＩ及びＤｍ−ＡＭＰ２を表わす。

実施例８ サントリツウ　（Ｃｎｉｃｕｓ　ｂｅｎｅｄｉｃｔｕｓ）種子から抗微生物性タ ン白質の精製 Ｃｎ１ｃｕｓ　ｂｅｎｅｄｉｃｔｕｓ種子からの塩基性抽出液を用いて実施例７ に記載した方法に従った。Ｓ−セファロース高性能カラム上でのクロマトグラフ ィーに続いて、Ｃｎ１ｃｕｓ抽出液は大体２５０ｍＭ　（ピークｌ）及び５００ ｍＭ　（ピーク２）ＮＨ４ＡＣて溶離する抗菌活性の２個のピークを生成した（ 結果は第１４図に示した）。

活性フラクションを各々のピークについてプールし、更に実施例７に記載の如く 逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃにより精製した。ピーク１についての結果は第１５図に示し； １８％アセトニトリルて溶離される活性因子を生成しこれはＣｂ−ＭＰＩと称す る。同様にピーク２は活性のある単一ピークとして溶離しこれをＣｂ−ＡＭＰと 称する（結果は第１６図に示した）。

実施例９ エノブト豆（Ｌａｔｈｙｒｕｓ　ｃｉｃｅｒａ）　１１子からの抗菌性タン白質 の精製 エジプト豆（Ｌａｔｈｙｒｕｓ　ｃｉｃｅｒａ）種子からの塩基性抽出液を用い て実施例７に記載した方法に従った。Ｓ−セファロース高性能カラム上のクロマ トグラフィーに続いて、Ｌａｔｈｙｒｕｓ抽出液は約１６０ｍＭ　ＮＨ４ＡＣで 溶離される、抗菌活性の単一ピークを生成した（結果は第１７図に示した）。

活性フラクションをプールし、更に実施例７に記載した如く逆相）ＩＰＬｃによ り精製した。ピークｌについての結果は第１８図に示され２２２％アセトニトリ ルで溶離される活性因子を生成しこれをＬｃ−ＡＦＰと称する。

実施例ＩＯ クリトリア　テルナテア（Ｃ１ｉｔｏｒｉａ　ｔｅｒｎａｔｅａ）種子からの抗 微生物性タン白質の精製 Ｃ１１ｔＯｒｉａ　ｔｅｒｎａｔｅａ種子からの塩基性抽出液を用いて実施例７ に記載の方法に従って行なった。Ｓ−セファロース高速カラム上でのクロマトグ ラフィーに続いて、Ｃ１１ｔｏｒｉａは２６０ｍＭ〜４００ｍＭ　ＮＨａＡｃで 溶離される、抗菌活性のある２個の部分的に分離したピークを生成した（結果は 第１９図に示した）。

活性フラクションを各々のピークについてプールし、更に実施例７に記載の如（ 逆相ＨＰＬＣにより精製した。ピークｌについての結果は第２０図に示され；約 １８％のアセトニトリルで溶離される活性因子を生成しこれをＣｔ−ＡＭＰ　＋ と称する。同様にピーク２は約１８％のアセトニトリルで溶離される活性ピーク を生成しこれをｃｔ−Ａｕｐ２と称する（結果は第２１図に示した）。

実施例１１ 精製抗微生物性タン白質の分子構造 精製抗微生物性タン白質の分子構造を更に分析した。

ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）をフ ァストシステム（Ｐｈａｓｔ　Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｐｈａｒｍａ−ｃｉａ社製）電 気泳動装置を使用して、予備注型された（ｐｒｅｃａｓｔ）市販のゲル［Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ社からのファストゲルハイ　デンシティ（ＰｈａｓｔＧｅｌ　Ｈｉ ｇｈ　Ｄｅｎｓｉｔｙ）］上で行なった。試料緩衝液には２００ｍＭのＴｒｉｓ −ＨＣＩ（１）８８．３）。

１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、ｌ　ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のブロムフェノー ルブルー及び、特に説明のない場合、１％（Ｗ／Ｖ）のジチオエリスリトール（ ＤＴＥ）を含有させた。タン白質は１２．５％のグルタルアルデヒド中での電気 泳動の後に固定しくｆｉｘ）　、Ｈｅｕｋｅｓｈｏｖｅｎ及びＤｅｒｎｉｃｋ（ １９８５，Ｅｌｅｃｔｒｏ−ｐｈｏｒｅｓｉｓ、６　：　１０３−１１２）に従 って銀染色した（ｓｉｌｖｅｒｓｔａｉｎｅｄ）。

Ｒｓ−ＡＦＰｓを５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。β−メルカプトエタノー ルで還元し且つＳ−ピリジルエチル化によりシスティン残基を変性した後に、両 者のＲｓ−ＡＰＰＩ及びＲｓ−ＡＦＰ２は約５　ｋＤａの見掛は分子量を有する 単一のバンドを示す。異なるシスティン誘導化なしに簡単な還元後には、５　ｋ Ｄａバンドは常に種々の収量で１６ｋＤａバンドを伴ない、これは電気泳動中に 抵抗したオリゴマー状の５ｋＤａタン白質を表わし得る。還元されていないＲｓ −ＡＦＰＩ及びＲｓ−ＡＦＰ２はそれぞれ２０ｋＤａ及び１７ｋＤａの単一バン ドとして移行した。これらの結果が示す所によれば天然のＲｓ−ＡＦＰｓは５　 ｋＤａポリペプチドの二量体、二量体又は四量体よりなるオリゴマー状タン白質 である。オリゴマー状構造はジスルフィド結合により安定化されると思われる。

第２２図は精製Ｒｓ−ＡＦＰｓの５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示し；レーンｌは非還 元Ｒｓ−ＡＰＰＩであり、レーン２は還元及びＳ−ピリジルエチル化したＲｓ− ＡＦＰＩであり、レーン３は非還元Ｒｓ−ＡＦＰ２であり、レーン４は還元及び Ｓ−ピリジルエチル化したＲｓ−ＡＦＰ２である。２００ナノグラムのタン白質 がゲル上で分離された。レーンＭは次の大きさ＋　１７ｋＤａ。

１４、５ｋＤａ、　８　ｋＤａ、　６　ｋＤａ及び２．５ｋＤａを存して分子量 マーカー　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）として用いたミオグロビンフラグメント を示す。

ＤＴＥで還元した後のＲ５−ｎ５ＬＴＰを５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析すると単一の９ 　ｋＤａバンドを生成した。非還元Ｒ５−ｎ５ＬＴＰは単一の１８ｋＤａバンド として移行した。それ故Ｒ５−ｎ５ＬＴＰはジスルフィド架橋によって安定化さ れた二量体状タン白質（２ｘ　９　ｋＤａ）であると思われる。

第２３図は精製Ｒ５−ｎ５ＬＴＰの５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示し：レーンＩは非 還元Ｒ５−ｎ５ＬＴＰてあり、レーン２は還元Ｒ５−ｎ５ＬＴＰである。分子量 マーカー（レーンＭ）は第２２図の如くである。

Ｒｓ−ＡＦＰｓの遊離のシスティンチオール基を下記のごとくして定性的に分析 した。１００ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）と１ｍＭのＥＤＴＡを含有 する６Ｍグアニジニウム−ＣＩ（ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍｕ−Ｃ１）中に１００ μｇの量の還元又は非還元タン白質を溶解させた。混合物を５．５′−ジチオニ トロ安息香酸と反応させ、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８９，Ｐｒｏｔｅｉｎｓｔ ｒｕｃｔｕｒｅ、　ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ、　１５５−１ ６７）により記載の如くニトロチオ安息香酸塩の遊離を監視した。タン白質の還 元はＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，６）を１００ｍＭまで、ジチオエリスリトール を３０ｍＭまで添加しついで４５℃で１時間インキュベートすることにより行な った。タン白質はＣｔ／Ｃ＋ｔフシリカカラム上の逆相クロマトグラフィーによ り過剰の反応剤から分離した。

非還元Ｒｓ−ＡＦＰｓは遊離のシスティンチオール基を含有しておらず、これに 対して、還元タン白質は遊離のシスティンチオール基を含有しており、全てのシ スティン残基かジスルフィド結合に関与していることを示した。

Ｒｓ−ＡＦＰＩ及びＲｓ−ＡＦＰ２のｐｉ値を等電点電気泳動により測定し、両 者のタン白質についてｌＯより大きいことが見出された。等電点電気泳動は４． ７〜１０．６ｐｌ範囲の標識タン白質（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて、８ Ｍ尿素中で再水和させた、予備注型インムービリンドライストリップ（［ｍｍｏ ｂｉｌｉｎｅ　Ｄｒｙ　５ｔｒｉｐｓ）　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）上で行な った。

第２４図はＤａｈｌｉａからの２種の精製タン白質の５Ｏ３−ＰＡＧＥ分析を示 し：第２５図は２種の精製Ｃｍ１ｃｕｓタン白質の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す 。分子量マーカーは対照タン白質として走行した（レーンＭ　：　２９ｋＤａ、 　２０．１ｋＤａ、　１３．２ｋＤａ及び５、２ｋＤａ）。ＤＴＴで還元した時 には、４種のタン白質は全て５／６ｋＤａバントして走行した（第２４図、レー ン２及び４：第２５図、レーン２及び４）。これらの非還元形では、精製タン白 質はオリゴマーとして走行した。非還元Ｄｍ−ＡＭＰＩは２４ｋＤａタン白質と して走行しく第２４図、レーン１　）　、Ｄｎ＋−ＡＭＰ２は１７ｋＤａタン白 質として走行する（第２４図、レーン３）。同様に、非還元Ｃｂ−ＡＭＰＩは３ ０ｋＤａの単一バンドとして走行しく第２５図、レーン１　）　、Ｃｂ−ＡＭＰ ２は１８ｋＤａのバンドとして走行する（第２５図、レーン３）。

第２６図はＣ１１ｔｏｒｉａからの２種の精製タン白質の５Ｏ３−ＰＡＧＥ分析 及びＬａｔｈｙｒｕｓからの精製タン白質の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分２析を示す。分 子量マーカーは対照タン白質として走行した（レーンＭ　：　２９ｋＤａ、　２ ０．ＩｋＤａ、　１３．２ｋＤａ及び５．２ｋＤａ）。

ＤＴＴで還元した時には、３種のタン白質は全て５／６バンドとして走行した（ 第２６図、レーン２．　Ｃｔ−ＡＭＰＩ　；レーン４．　Ｃｔ−ＡＭＰ２　、レ ーン６　、　Ｌｅ−ＡＦＰ）　、それらの非還元形では、精製タン白質はオリゴ マーとして走行した。非還元Ｃｔ−ＡＭＰＩ及びＣｔ−ＡＭＰ２は大体１５ｋＤ ａのタン白質として走行した（第２６図、それぞれレーンｌ及び３）、然るに非 還元Ｌｃ−ＡＦＰは大体１２ｋＤａのタン白質として走行した（第２６図、レー ン５）。

実施例１２ Ｒｓ−ＡＦＰｓ及び関連タン白質のアミノ酸配列抗菌性タン白質のシスティン残 基は、Ｆｕｌｌｍｅｒの方法（１９８４，Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｎ＋、　１４ ２．３３６〜３４１）を用いてＳ−ピリジルエチル化によって変性された。反応 剤はＰｅｐ−３（多孔質シリカＣ２／　Ｃｕ　）　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製） カラム（２５ｘ　０．４ｃｍ）上でＨＰＬＣにより除去した。Ｓ−ピリジルエチ ル化タン白質は、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）から０．１％ＴＰＡ含有 アセトニトリルまでの直線的な勾配でカラムを溶離することにより回収した。得 られたタン白質フラクションのアミノ酸配列分析は、４７７Ａタン白質シークエ ンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で、　１２０Ａアナライザ ー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によりフェニルチオヒダントイン アミノ酸誘導体をオンライン検出することにより行なった。タン白質がブロック されることにより必要な場合には、Ｓ−ピリジルエチル化タン白質をピログルタ メートアミノペプチダーゼで処理することか供給者の処方により行なわれた（Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、　Ｍａｎｎｈｅｉｍ。

ＦＲＧ）。

Ｒｓ−ＡＦＰＩ及びＲｓ−ＡＦＰ２のＮ−末端アミノ酸配列は、環状Ｎ−末端グ ルタメート残基を閉袋するピログルタメートアミノペプチダーゼでの処理後に自 動化したエドマン（Ｅｄｍａｎ）分解により測定した。第２７図はＲｓ−ＡＦＰ Ｉの最初の４４Ｎ＝末端アミノ酸の配列とＲｓ−ＡＦＰ２の最初の３５アミノ酸 残基の配列とを示す。Ｒｓ−ＡＦＰＩ及びＲｓ−ＡＦＰ２の配列は最初の３６残 基内で２個所の位置でのみ相違する。Ｒｓ−ＡＦＰ２においてグルタミン酸をグ ルタミン（位置４）て置換し且つアスパラギンをアルギニン（位置２７）で置換 するとＲｓ−ＡＦＰＩに相対的なこのタン白質のより高い正味の正荷電（ｎｅｔ 　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｈａｒｇｅ）と合致し、これはカソードゲル電気泳動（ 第３図）及びカチオン交換クロマトグラフィー（第１図）によって既に立証され た。Ｒｓ−ＡＦＰｌはシスティン及び塩基性アミノ酸に富んでいると思われる（ 最初の４５残基内のそれぞれ５残基及び９残基）。

部分的なアミノ酸配列（４９６４Ｄａ）に基づいて算定したＲｓ−ＡＦＰｌの分 子量は５ＤＳ−ＰＡＧＥによって推定された分子量値（約５０００Ｄａ）にきわ めて近く、これは測定した配列がタン白質の主要部分を配合することを示してい る。然しなからＲｓ−ＡＦＰＩは少なくとも１つ以上のシスティンを含有してい ると予期される。何故ならば遊離チオール基が不在であると尚多数のシスティン の存在を推量するからである。

第２７図はまた実施例５に記載した如く別のカラシナ科から単離したＲｓ−ＡＦ Ｐ様タレタン白質ｎ−ＡＦＰｌ、　Ｂｎ−ＡＦＰ２．８ｒ−ＡＦＰｌ、　Ｂｒ− ＡＦＰ２．５ａ−ＡＦＰｌ、　５ａ−ＡＦＰ２．　Ａｔ−ＡＦＰＩ）の最初の２ ３〜３ＯＮ−末端アミノ酸を示している。全てのタン白質は配列決定前にピログ ルタメートアミノペプチダーゼで処理されるが、システィン残基は変性しなかっ た。従って、システィン残基はエドマン分解によりプラン（ｂｌａｎｋ）として 出現する。Ｒｓ−ＡＦＰｌ中の対応のアミノ酸と同一のアミノ酸は点線により示 される。それ故カラシナ科の他の一員からのＲｓ−ＡＦＰ様タレタン白質ｓ−Ａ ＦＰＩ及びＲｓ−ＡＦＰ２と同−又は殆んど同一であると思われる。Ｂｒ−ＡＦ Ｐ２は位ｆｌｌｌで未同定の異常アミノ酸を含有する。

第２８図はペプチドＤｍ−ＡＭＰＩ、　Ｃｂ−ＡＭＰＩ及びＣｂ−ＡＭＰ２につ いての完全なアミノ酸配列を示ず。Ｄｍ−ＡＭＰ２の最初の２ＯＮ−末端アミノ 酸についての配列も示している。Ｄｍ−ＡＭＰ　１及びＤｍ−ＡＭＰ２について のアミノ酸配列はこれらの最初の２０アミノ酸中で１個所の位置（位置２）のみ で相違する。Ｃｂ−ＡＭＰＩ及びＣｂ−ＡＭＰ２についての配列を比較すると、 ３つの変化かある。Ｃｂ−ＡＭＰ２における中性アスパラギンの代りにＣｂ−Ａ ＭＰＩにおける酸性残基（位置２２でのアスパラギン酸）を用い且つ塩基性リン ノの代りに位置２３でグルタミンを用いると、より高い正味の正荷電と合致する 。同様にＣｂ−ＡＭＰ２はまた２個所の位置でＤｍ−ＡＭＰＩとは異なるが、結 果は２個の正荷電の正味増大（ｎｅｔ　ｇａｉｎ）である。

４種のタン白質は全てカラシナ科の種子から単離したタン白質と顕著な類似性を 示す。Ｒｓ−ＡＦＰＩ　Ｃダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ　５ａｔｉｖｕｓ）−抗 菌性タン白質ｌ〕についてのアミノ配列をＤｍ−ＡＭＰ　ｌについてのアミノ酸 配列と整列比較させるとこれらは大体５０％同一のアミノ酸残基を有することを 示す。

第２９図はベブチＦ’Ｌｃ−ＡＦＰ及びＣｔ−ＡＭＰＩについての完全なアミノ 酸配列を示す。Ｃｔ−ＡＭＰ２はＣｔ−ＡＭＰＩ　と高度に相同性であると予期 される。Ｌｃ−ＡＦＰとＣｔ−ＡＭＰＩ　との両者ともまたキク科及びカランナ 科のタン白質と相同性である。

特にＣｔ−ＡＭＰＩは、その配列中に３５の同一残基を有する点密に関連するタ ン白質のこの群と、菌類フサリウムソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｓｏｌａｎｉ） （Ｃｈｉａｎｇ及びＨａｄｗｉｇｅｒ、　１９９１゜Ｍｏｌ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉ ｃｒｏｂｅ　Ｉｎｔｅｒａｃｔ、４．　３２４〜３３１）によって特異的に誘発 される、エントウ豆（Ｐｉｓｕｍ　ｓａｔｉｖｕｍ）の２種の遺伝子ｐ１３９及 びｐ［２３０によってコードされた生成物Ｂｉｏ１．１１．　２５５〜２６９） のタン白質生成物に対しても相同性が見出される。遺伝子（ジーン）　ｐ１３９ ．　ｐ［２３０又はｐ３２２によってコードされるタン白質の生物学的特性につ いては何も知られていない。更には、Ｒｓ−ＡＦＰ様／ダリャ／アザミ／ハマエ ンドウ／クリトリア（Ｄａｈｌｉａ／　Ｃｎ１ｃｕｓｓｏｎ、　１９９１．　Ｆ ＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　２７９．　１０１−１０４）からの昆虫の腸のα−アミラ ーゼの阻害剤と相同性を示し、且つまた細胞無含有系（Ｍｅｎｄｅｚ等、　１９ ９０．　Ｅｕｒ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１９４゜５３３〜５３９）において試 験管内タン白質合成を抑制するトリチカム　エスチバム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａ ｅｓｔｉｖｕｍ）　（Ｃｏｌｉｌｌａ等、１９９０．　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　 ２７０．　１９１〜１９４）からのγ−プロチオニンと相同性を示す。

第３０図はＲｓ−ＡＦＰｌ、　Ｄｍ−ＡＭＰＩ、　Ｃｂ−ＡＭＰｓ、　Ｌｃ−Ａ ＦＰ、　Ｃｔ−ＡＭＰｌ、コウリャンのα−アミラーゼ阻害剤Ｓｌα２、小麦の γｌブロチオニンのアミノ酸配列の（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）　及びフサリウム（ Ｆｕｓａｒｉｕｍ）−誘発エンドウ豆遺伝子ｐ１２３０及びｐ１３９、ササゲ遺 伝子ｐｓＡｓｌＯ１及びジャガイモ遺伝子ｐ３２２の成熟タン白質生成物の予期 配列を示す。Ｒｓ−ＡＦＰＩと比較した配列の同−性及び保存変化は箱形に囲っ である。保存変化はアミノ酸相同性基（ｈｏｍｏｌｏｇＶ　ｇｒｏｕｐ）ＦＷＹ 。

ＭＩＬＶ、　Ｒ［（Ｋ、　ＥＤＮＱ及びＰＡＧＳＴ内での置換であると考えられ る。最適な配列のために導入されたギャップはダッシュ記号により表わされてい る。

アミノ酸配列の列により、システィンの全て及びグリシンの大部分は保存位置に あると思われ、これらのタン白質の構造及び機能に関してそれらの重要性を示唆 している。また位置１１及び４０にある保存芳香族残基も注目に値する。

第３１Ａ図はＤｍ−ＡＭＰＩ、　Ｄｍ−ＡＭＰ２．　Ｃｂ−ＡＭＰＩ及びＣｂ− ＡＭＰ２をコードする遺伝子の可能なりＮＡ配列の１つを示す。同様に、第３１ Ｂ図はＬｃ−ＡＦＤ及びＣｔ　−ＡＭＰ　１をコードする遺伝子の可能なＩ）Ｎ Ａ配列の１つを示す。これらの遺伝子配列ノ酸配列から予測されている。種子内 の実際の遺伝子配列は遺伝子コードの縮重により相違し得る。

実施例１３ Ｒｓ−ｎｓＬＴＰのアミ／［１ＪＩＪ Ｒｓ−ｎｓＬＴＰのアミノ酸配列決定は実施例１２の記載に応じて行なった。

第３２図はＲ５−ｎ５ＬＴＰの最初の４３Ｎ−末端アミノ酸配列を示し、そのう ちソステイン残基はＳ−ピリジルエチル化により変性されている。第３３図にお いて、Ｒ５−ｎ５ＬＴＰの配列はホウレン草（Ｓｐｉｎａｃｉａ　ｏｌｅｒａｃ ｅａｅ）　（Ｓｏ−ｎｓＬＴＰ：Ｂｅｒｎｈｅｒｄ等、１９９０．　Ｐｌａｎｔ 　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　９５．　１６４〜１７０）、ヒマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃｏ ｍｍｕｎｉｓ）　（Ｒｓ−ｎｓＬＴＰ　：　Ｔａｋｉｓｈｉｍａ等。

１９８６、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ、　８７０．２４８〜 ２５５）、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ　ｃａｒｏｔａ）（Ｄｃ−ｎｓＬＴＰ　：　 ５ｔｅｎｋ等、１９９１．　ＰｌａｎｔＣｅｌｌ、９．　９０７〜９２１）、大 麦（Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ）　（）ｌｖ−ｎｓＬＴＰ　；　Ｂｅｒｎ ｈａｒｄ及び５ｏｎｅｒｖｉｌｌｅ、１９８９．　Ａｒｃｈ　ＢｉｏｃｈｅｍＢ ｉｏｐｈｙｓ、　２６９．６９５〜６９７）及びトウモロコシ（Ｚｅａ　ｍａｙ ｓ）（Ｚｍ−ｎｓＬＴＰ　：　Ｔｃｈａｎｇ等、１９８８．　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃ ｈｅｍ、２６３．　１６８４９〜１６８５５）から単離した非特異脂質転移タン 白質のＮ−末端配列と共に配列しである。アミノ酸配列の最適な配列のために導 入したギャップはダッシュ記号によって示される。６個の配列のうち少なくとも ４個で生起する同一のアミノ酸及び保存置換は枠で囲っである。保存変化は７ミ ／酸相同性基ＰＷＹ、　ＬＩｒＬＶ、　ＲＨＫ、　ＥＤＮＱ及びＰＡＧＳＴ内の 置換であると考えられる。Ｒ５−ｎ５ＬＴＰは他の植物起源からの非特異脂質運 搬タン白質と３８〜５３％の配列同一性を示す。非特異脂質運搬タン白質は２つ の膜システムの間でリン脂質又は別の非極性化合物を転位させ得るタン白質であ る。これらのタン白質は小胞体から細胞膜及び細胞小器官膜へのリン脂質の輸送 に役割を演じると既に考えられている（Ａｒｏｎｄｅ　ｌ及びＫａｄｅｎ、１９ ９０．εｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ、　４６゜５７９〜５８５）。然しなから、最新 の証拠が示す所によれば、ｎ５ＬＴＰｓは細胞外的に配置しており、膜の生合成 におけるそれらの提案された機能をありそうもなくさせる（Ｓｔｅｒｋ等、　１ ９９１．　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１１．　３．　９０７〜９２１）。

実施例１４ タン白質の抗菌活性の安定性 抗菌活性の試験は実施例１に記載の評価方法に従って、フサリウム　クルモルム 胞子を含有する増殖培地で５倍に稀釈した２０μｍの試料を使用して行なつｔこ 。未処理対照試料はｌｏｍλ１燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）中（二５００μ ｇ／ｍｌの供試タン白質を含有していた。熱安定性試験（ま供試タン白質の一分 量ずつを１００℃までの種々の温度で１０分間加熱することにより行なった。ジ スルフィド架橋〕還元Ｉｔ　シｆ　ｔトレイトールを３０ｍｋ１．　Ｔｒｉｓ− ＨＣｌ（ｐＨ８，６）を３００ｍＭ添加することにより行なった。反応剤（よ逆 相クロマトグラフィーにより除去した。消化のため、種々のプロテアーゼを１０ ０μｇ／ｍｌ添加し、３７°Ｃで１６時間インキュベートした。反応剤のみを含 有する対照処理液（よ逆相クロマトグラフィ一工程後に抗菌活性（二つ０て陰性 であると判明した。

試験した全ての精製タン白質の抗菌活性は、　１００°Ｃまでの温度で１０分間 の熱処理に対して耐性であった。し力為しなから、ジチオトレイトールによるそ のジスルフィド結合の還元は抗菌活性を完全に消滅させた。これらのジスルフィ ド結合は生物学的活性には必須である。Ｒｓ−ＡＦＰタン白質をトリプシン、キ モトリプシン、プロテイナーゼＫ又はプロナーゼＥで処理すると抗菌活性を少な くとも１０倍だけ低下させた。

実施例１５ タン白質の抗菌効力（ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ　ｐｏｔｅｎｃｙ）実施例１に記載 の評価方法を使用して、精製タン白質の抗菌効力を種々の植物病原菌（ｐｌａｎ ｔ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｆｕＢｕｓ）について評価した。菌の生長、菌胞子の 捕集と収穫及び菌糸体フラグメントの調製は従来の方法（Ｂｒｏｅ−ｋａｅｒｔ 等、　１９９０．　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｌｅｔｔ、　６９　：　５ ５−６０）シスボラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）　ｆ、　ｓｐ 、ｅ’ｙ　（ｐｉｓｉ）［Ｍ［２３６４４１，フサリウム　オキシスポラム（Ｆ ｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）　ｆ、　ｓｐ、リコペルシシ（ｌｙｃｏｐ ｅｒｓｉｃｉ）　ＭＵＣＬ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ　ｆｉｊｉｅｎｓｉ ｓ）変種フィシエンシス（ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ）　ＩＭＩ　１０５３７８．　ネ クトリア　へマトコッヵ（Ｎｅｃｔｒｉａ　ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ）　Ｃｏ １１ｅｃｔｉｏｎ　Ｖａｎ　Ｅｔｔｅｎ　ｆ６０−２−２．ペニシリウム　ジキ タタム　（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｄｉｇｉｔａｔｕｍ）　（ＫＯ８７９）、　 ホマベタエ（Ｐｈｏｍａｂｅｔａｅ）　ＭＵＣＬ９９１６、ピレノホラ　トリチ シーレベンチス（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ　ｔｒｉｔｉｃｉ−ｒｅｐｅｎｔｉｓ ）　ＭＵＣＬ　３０２１７．　ビリキュラリア　オリザエ　（Ｐｙｒｉｃｕｌａ ｒｉａ　ｏｒｙｚａｅ）　ＭＵＣＬ３０１６６、リゾクトニア　ソラニ　（Ｒｈ ｉｚｏｃｔｏｎｉａ　５ｏｌａｎｉ）ＣＢＳ　２０７−８４．スフレロチニア　 スクレロチアヌム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ　ｓｃｌｅｒｏｔｉａｎｕｍ）　Ｍ ＵＣＬ　３０１６３．セブトリアＭ［ＪＣＬ　１９５２７゜ 糸フラグメントを接種材料として使用した。他の全ての菌は胞子として接種した 。

抗菌性タン白質の逓減希釈物を、増殖培地Ａ又は培地Ｂを用いて菌類に施用した 。生長抑制率（％）は顕微分光分析法により測定した。４８時間培養してから５ ０％の生長抑制率に必要な濃度（ＩＣ５ｏ値）は施用量一応答曲線がら算出され た。生長の遅い菌Ｓ　ノドルム及びＶ　イナエクアリスについて＋ＣＳ。値はそ れぞ培養してがら５日及び１５日後に測定した。

Ｒｓ−ＡＦＰＩ及びＲｓ−ＡＦＰ２についての結果を表１に要約する。

表１ Ｒｓ−ＡＦＰＩ及びＲｓ−ＡＦＰ２の抗菌活性＋ＣＳ。（μｇ／ｍｌ） 菌　類　培地Ａ　培地Ｂ Ｒｓ−ＡＦＰＩ　Ｒｓ−ＡＦＰ２　Ｒｓ−ＡＦＰＩ　Ｒｓ−ＡＦＰ２培地Ａ培地 語中る５０％生長抑制率に必要なＲｓ−ＡＦＰｓの濃度は供試微生物の種類に応 じて０．３μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍ１以上までに変動した。Ｒｓ−ＡＦＰ Ｉの抗菌効力は培地ＡにおいてＲｓ−ＡＦＰ２の抗菌効力よりも一般にわずかに 低い。

Ｒｓ−ＡＦＰＩ　とＲｓ−ＡＦＰ２との間の抗菌効力の差異は培地Ｂで行なった 試験についてより顕著である。Ｒｓ−ＡＦＰＩは１００μｇ／ｍ１以下の濃度で は１７種の菌のうち４種の菌を５０％以上だけ抑制するに過ぎないが、然るにＲ ｓ−ＡＦＰ２はこの濃度で１８種の菌のうち１１種の菌を抑制する。Ｆ　クルモ ルム及び旦　ベチコーラの如き若干の菌については、培地Ａで測定したＲｓ−Ａ ＦＰ２のＩＣ，。値は培地Ｂで得られたそれと匹敵し得る。二　オキシスポラム ｆ、　ｓｐ、ｆ：”ｚの如き別の菌についてはＲｓ−ＡＦＰ２のＩＣ，、値は培 地Ａにおける２μｇ／ｍｌから培地Ｂにおける　１００μｇ／ｍ１以上までに増 大した。

Ｂ　ナブス、Ｂ　ラバ、Ｓ　アルバ及びＡ　タリアナからのＲｓ−ＡＦＰ様タン 白質の抗菌効力を、５種の相異なる供試菌を用いてＲｓ−ＡＦＰＩ及びＲｓ−Ａ ＦＰ２の抗菌効力と比較した。これらの実験の結果を表２に示す。Ｂｒ−ＡＦＰ ２を除いては、全てのタン白質はＲｓ−ＡＦＰｓの特異活性に匹敵し得る特異活 性を育した。Ｂｒ−ＡＦＰ２が関連するタン白質種よりも平均して２０倍活性が 少ないという事実は、Ｂｒ−ＡＦＰ２か位ｆｔ１ｌに異常アミノ酸を有しく第２ ７図参照）然るにＲｓ−ＡＦＰｓ及び関連タン白質が全て位置１１に芳香族残基 を有する（第３０図参照）という所見に関連し得る。培地Ｂで試験した時には、 Ｒｓ−ＡＦＰ２は特に菌Ｆ　クルモルムについて最も強力なタン白質であると思 われる。

Ｒ５−ｎ５ＬＴＰの抗菌効力を表３に示す。大部分の菌に対してＲ５−ｎ５ＬＴ ＰはＲｓ−ＡＦＰ２に関して１０〜２０倍活性が余り強力でない。Ｒ５−ｎ５Ｌ ＴＰはまた高度に塩感作性であると思われる。試験した１３種の菌類の何れも　 １００μｇ／ｍｌ以下の濃度では培地Ｂ中のＲ５−ｎ５ＬＴＰによって抑制され ないものである。

表３ Ｒｓ−ｎｓＬＴＰの抗菌活性 キク科植物タン白質についての結果を表４に要約する。

培地Ａにおける５０％生長抑制率について必要とされる抗微生物性タン白質の濃 度は、供試微生物に応じて０．３μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍ１以上までで変 動した。一般に、タン白質の抗菌効力は次の順番である；　Ｃｂ−Ａ艮ＩＰ２＞ 　Ｃｂ−ＡＡＩＰＩ＞　Ｄｍ−ＡＭＰＩ　＞　Ｄｍ−ＡｌＦ２゜タン白質間の活 性の差異はＣｂ−ＡｌＦ２が最良の塩耐性を示しながら、培地Ｂにおいてより顕 著である。Ｄｍ−ＡＭＰＩ及びＤｍ−ＡｌＦ２は１００μｇ／ｍ１以下の濃度で は１１種の菌の内６種の菌の生長を５０％以上だけ抑制するに過ぎないか、然る に２種のＣｎ１ｃｕｓタン白質は培地Ｂで検定した時に８種の菌の内７種の菌の 生長を抑制する。

表５はマメ科植物の種子から単離した抗微生物性タン白質についての結果を要約 する。

これらのタン白質は活性ではあるが、それらの活性は、特に高い塩濃度の緩衝液 、培地Ｂで検定した時には、Ｒｓ−ＡＦＰｓ及びキク科タン白質の活性よりも幾 分低い。特に、Ｌｃ−ＡＦＰの活性は著しく低く且つＢｒ−ＡＦＰ２の活性と匹 敵し得る。Ｌｃ−ＡＦＰのアミノ酸配列は、また通常トリプトファンである位置 １１での置換を示している（第２７図及び第２９図参照）。

精製タン白質の各六により試験管内で証明された高度の抗菌活性は、該タン白質 が菌微生物による侵入に対して種子又は苗木を保護するのに役割を果たし得るこ とを示唆している。

実施例１６ 抗菌活性に対するイオンの影響 Ｒｓ−ＡＦＰｓ及びＲ５−ｎ５ＬＴＰの抗菌活性に対するイオンの影５種の相異 なる培地で測定した。対照培地は、全部で２．５ｍＫ（の−価カチオン５　０． １ｍＭの二価カチオンとを含有する実施例１に記載した合成増殖培地である。４ 種の別の培地はそれぞれＩＯｍＭ（７）ＫＣｌ、５０ｍＭのＫＣｌ、　ｌ　ｍＭ のＣａＣｌ２又は５ｍＮｉのＣａＣｌ２を補充して含有した。比較の目的で、こ れらの試験は、小麦の種子からの抗菌性タン白質であるβ−プロチオニン（Ｒｅ ｄｍａｎ及びＦｉｓｈｅｒ、　１９６９．　Ｊ　５ｃｉＦｏｏｄ　Ａｇｒｉｃ、 　２０．　４２７〜４３２に記載の如く単離した）及びミラビリス　ジャラバ　 （Ｍｉｒａｂｉｌｉｓ　ｊａｌａｐａ）の種子からの抗菌性タン白質であるλｌ ｊ−ＡＡＩＰ２（Ｃａｍｍｕｅ等、　＋９９２゜Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、　２ ６７、２２２８〜２２２３）と平行して行なった。

表６はに＋及びＣａ”の存在下での抗菌活性検定の結果を示す。

５０　ｍ　Ｍまてのｔ（ＣＩを添加してもＲｓ−ＡＦＰＩ又はＲｓ−ＡＦＰ２の 何れかの抗菌活性も影響を受けなかった。ｌｍＡｌのＣａＣｌ　２はＲｓ−ＡＦ Ｐ２に影響を及はさないか、Ｒｓ−ＡＦＰＩの１ｃｓｏ値を約４倍だけ増大させ た（即ちＣａ２“はＲＳ−ＡＦＰＩの抗菌活性を低下させた）。５ｍ八へのＣａ ＣＩｚはＲｓ−ＡＦＰＩを殆んと完全に対して完全な不活性化までで変動した。

５０ｍＡｌのＫＣＩを添加すると両方の供試歯に対して３０倍以上だけＲ５−ｎ ５ＬＴＰの活性を減少させた。比較すると、β−プロチオニンのＩＣ５ｏ値は５ ｍＭのＣａＣＬの存在下では約７倍だけ増大した。

ｌｔｌ　ｊ　−Ａ　ＩＪ　Ｐ　２は塩が存在すると高度に感作性であると思われ る。何故ならそのｌｃｓ。値はＩｎＪＩのＣａＣｌ２又は５０ｍＡｌのＫＣＩの 何れかの添加によっても約１０倍たけ増大したからである。

これらの結果から、Ｒｓ−ＡＦＰｓは二価のカチオンによって拮抗されることを 示している。Ｒｓ−ＡＦＰＩはＲｓ−ＡＦＰ２よりも二価のカチオンの存在に対 してずっと感作性である。

Ｒ５−ｎ５ＬＴＰはＲｓ−ＡＦＰＩ又はＲｓ−ＡＦＰ２の何れかよりも明らかに 尚更塩−感作性である。カチオンの拮抗作用は供試微生物に応して強く左右され ることは明らかである。

実施例１７ 酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の生長に対する 精製抗微生物性タン白質の効果 精製タン白質を酵母菌５ａｃｃｈａｒｏｒｎｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに 対するそれらの効果について試験した。使用した方法は実施例１に記載した抗菌 検定と同様であるが但し増殖培地は０．５％のジ−プラーク（ｓｅａｐｌａｑｕ ｅ）アガロースと共にＹＰＤ　（１０ｇ／ｌの酵母エキス、２０ｇ／　ｌのバク トペブトン、２０ｇ／Ｉのグルコース）であった。

２５０μｇ／ｍｌの濃度で試験した時には、精製カラシナ科タン白質の何れも酵 母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（菌株５ｐｌ）の 生長に効果はない。同様にＬｃ−ＡＦＰは２００μｇ７ｍ　ｌの濃度で旦　セレ ビシアエ（菌株ＪＲＹＩ８８）の生長を抑制しなかった。

キク科及びクリトリア属のペプチドは５　セレビシアエ（菌株ＪＲＹＩ８８）の 生長に対して活性であった。これらの結果を表７に示す。６［ｒのペプチドの内 、２種の７１ｊトリア属ペプチド、Ｃｌ−ＡＭＰＩ及びＣｔ−ＡλＩＰ２は最高 度の活性を示した。

表　７ 酵母に対するＤｍ−ＡＭＰｓ、　Ｃｂ−ＡλＩＰｓおよびＣｔ−ＡＭＰｓの活性 タン白質　ＩＣｓ。（μｇ／ｍｌ） Ｄｍ−ＡＭＰＩ　５０ Ｄｍ−ＡＭＰ２　５０ Ｃｂ−ＡＭＰＩ　３０ Ｃｂ−ＡＭＰ２　２０ Ｃ１−ＡλＩＰ１　１８ Ｃｔ−Ａへ１Ｐ２９ 実施例１８ バクテリアに対する精製抗微生物性タン白質の効果実施例１に記載した試験法を 用いて、精製タン白質の抗バクテリア効果を次のバクテリア菌株、アゲロバ：／ ２　（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ　ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ）　Ｓｐ７．ノ＜シル ス　ＺガテリウムＧＢａｃｉｌｌｕｓ　ｒｎｅｇａｔｅｒｉｕｍ）　ＡＴＣＣ１ ３６３２，ｘｔｂウィニア　カロトボラ　（εｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏ ｒａ）菌株３９１２、エノエリヒア　コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ ｉ）菌株）（ＢＩＯｌ、プソイドモナス　ソラナセアルム　（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ ｎａｓｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）菌株Ｉり６０及びサルシナ　ルテア（Ｓａｒ ｃｉｎａ　１ｕｔｅａ）ＡＴＣＣ９３４２について評価した。

Ｒｓ−ＡＦＰ２は２００μｇ／ｍｌでＢ　メガテリウムの５０％生長抑制を生起 したが５００μｇ／ｍｌまでの濃度では別のバクテリアには効果を有しなかった 。

キク科のタン白質Ｄｍ−Ａ＾ＩＰ１．　Ｄｍ−Ａ＾［Ｐ２、Ｃｂ−Ａ＾ＩＰ＋及 びＣｂ−ＡλｌＰ２はＢ　メガテリウムに対してのみ活性を示し、その際該タン 白質はそれぞれ１８０．４０．８０及び３２μｇ／ｍ　１の濃度で５０％まで生 長を抑制した。

Ｒｓ−ＡＦＰｌ、　Ｂｍ−ＡＦＰｓ、　Ｂｒ−ＡＦＰ２．　Ｓ’ａ−ＡＦＰｓ、 　Ｃｔ−ＡＭＰｓ及びＬｃ−ＡＦＰは５００μｇ／ｍｌまでの濃度でバクテリア の何れに対しても効果を有しなかった。

一般にこれらのタン白質は弱い抗バクテリア活性のみを有することを結果が示し ている。

実施例１９ 培養ヒト細胞に対する精製抗菌性タン白質の効果ヒト細胞に対する毒性の評価は ９６−ウェル（９６−ｗｅｌｌ）マイクロプレート中で培養した、ヘソ（ｕｍｂ ｉｌｉｃａｌ）静脈内皮細胞（Ａｌｅｓｓｅｉ等、　１９８８．　Ｅｕｒ　Ｊ　 Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１７５．５３１−５４０）又は皮膚筋肉繊維芽細胞（Ｖａｎ 　Ｄａｍｍｅ等、　１９８７．　ＥｕｒＪ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１７．　ｌ−７ ）について行なった。増殖培地ノ代わりに、８０μｌの無血清培地［内皮細胞に ついてはオブチメン（Ｏｐｔｉｍｅｎ）　１．繊維芽細胞についてはイーグルの 最小必須培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｉｎｉｍａｌ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｍｅｄ ｉｕｍ）（ε＾］ε＾＃）両方の培地共ＧＩＢＣＯから入手］を使用し、これに ２０μＩのフィルター殺菌供試溶液を添加した。更に、細胞を５％Ｃ０２雰囲気 及び１００％相対湿度の下で、３７°Ｃで２４時間インキュベートした。細胞の 生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）をトリバンブルー（燐酸緩衝液、ＰＢＳ中、４０ ０ｍｇ／ｌ）で１０分間染色した後、顕微鏡で評価した。別法として、細胞をニ ュウトラルレッド（ｎｅｕｔｒａｌ　ｒｅｄ）　（ＰＢＳ中、５６ｍｇ／ｌ）で ３７゛Ｃで２時間染色した。細胞を酸性エタノール（５０％のエタノールを含有 する１００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ４）中に溶解させ（ｌｙｓｅ）、染料 の遊離（ｒｅｌｅａｓｅ）を５４０ｎｍでの顕微分光光度分析により測定した。

Ｒｓ−ＡＦＰｓ及びＲ５−ｍ５ＬＴＰはこの検定法を用いてそれらの潜在的な毒 性効果について評価した。培養したヒトへそ静脈内皮細胞又は皮膚筋肉繊維芽細 胞に５００μｇ／ｍｌまで添加した場合、Ｒｓ−ＡＦＰＩ、　Ｒｓ−ＡＦＰ２又 はＲ５−ｍ５ＬＴＰはいずれも、２４時間のインキュベートの後に、細胞の生存 率に影響を与えなかった。これに対して、β−プロチオニンは、５０μｇ／ｍｌ 添加した場合、両者の細胞の生存率を９０％以上まで減少させた。

実施例２０ 葉の病害に対するＲｓ−ＡＦＰｓの抗菌活性：生体内試験法の方法を用いてテン サイの葉の病害セルコスボラベチコラ　（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ　ｂｅｔｉｃｏ ｌａ）　（菌株Ｅ８９７）に対してＲｓ−ＡＦＰ２を試験した。

直径４ｃｍの小車植木鉢に入れたジョンインネス鉢植え堆肥（Ｎｏ、　ｌ又は２ ）中でテンサイ植物を栽培した。タン白質製剤は殺菌蒸留水に溶解させ且つ適当 な濃度に希釈することにより使用直前に処方した。処方物は葉への噴霧液として 植物に施用した。噴霧液は個々の小滴の最大保持率まで施用した。植物は病害を 接種する１日前にタン白質で処理し、病害は５００００胞子／ｍｌの濃度で葉へ の噴霧液として施用した。植物は４８時間湿度室に保持し次いで温室に移送した 。病害は更に８日間インキュベーションしたのに続いて評価した。

結果を第３４図に示す。市販されて入手し得る殺菌剤へキサコナゾールを標準品 として使用した。Ｒｓ−ＡＦＰ２は病害の良好な防除を与え、５０％の防除を与 える濃度は大体１５μＭであった。比較として、ヘキサコナゾールは約７μＭで 施用した時には５０％の病害防除を与えた。これによりタン白質は作動な生体内 殺菌剤として作用できしがもその活性はモル基準で化学的標準品と匹敵し得るこ とが確認される。

実施例２１ Ｒｓ−ＡＦＰＩ及びＲｓ−ＡＦＰ２　ｃＤＮＡｓの分子クローニング屋外で成長 させたダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ　５ａｔｉｖｕｓ）植物から、６種の相異な る発現段階の種子を収集し、液体窒素で凍結し、−８０°Ｃて貯蔵した。粉砕後 に、組織ｔｇ当り、６ｍｌの１：２フエノール・　ＲＮＡ抽出緩衝液混合物と２ ｍｌのクロロホルムとを使用する以外は、Ｄｅ　ｖｒｉｅｓ等の方法（１９８８ ，Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｍａｎｕａｌ、　８６゜ １〜１３）を用いて、６種の相異なる発現段階の混合物１５ｇから全ＲＮＡを抽 出した。Ｓｉｌｆｌｏｗ等により文献に記載されたオリゴ（ｄＴ）−セルロース でのアフィニテイクロマトグラフィ−（１９７９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 １８．２７２５−２７３１）によりポリ（Ａ）　”　ｍＲＮＡを精製して、組織 １ｇ当り約１０μｇのポリ（Ａ）　”　ＲＮＡを得た。Ｇｕｂｌｅｒ及びＨｏｆ ｆｍａｎの方法（１９８３，Ｇｅｎｅ、　２５．２６３−２６９）に従って、　 １．５μｇのポリ（Ａ）　”　ＲＮＡから二重鎖ｃＤＮＡｓを調製しついでＰｈ ａｒｍａｃｉａ社からのｃＤＮＡＤＮＡ合成キラ（ｃＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉ ｓ　Ｋｉｔ）を使用してＥｃｏＲＩ　／　Ｎｏｔ　Ｉアダプターに連結した。ｃ ＤＮＡｓを製造業者の取扱説明書に従ってλ２ＡＰ　ｎファージベクター（Ｓｔ ｒａｔａｇｅｎｅ）中にクローンした。

ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのためのＤＮＡプローブを以下の方法で ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により製造した。２個の縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａ ｔｅ）オリゴヌクレオチド。

ＯＷＢ＋５　（５’　ＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＡＲＹＴＮＴＧＹＳＡＲＭＧＮＣＣ ３”）及び０ＷＢＩ７　（５’　ＡＡＡＧＡＡＴＴＣＲＴＧＮＧＣＮＧＧＲＡＡ ＮＡＣＲＴＡＲＴＴＲＣ３’　）を合成した。ＯＷＢ　＋　５はＲｓ−ＡＦＰＩ のアミノ酸２〜７に相当し、センス配向（ｓｅｎｓｅ　ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ ）を有する。ＯＷＢ＋７はＲｓ−ＡＦＰＩのアミノ酸３６〜４３に相当し、アン チセンス配向（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）を有する。両方 のプライマーはそれらの５′末端てＡＡＡＧＡＡＴＴＣ（即ちＡＡＡ続いてＥｃ ｏＲＩ認識配列）配列を有する。ＰＣＲはアンブリマーとしてＯＷＢ＋５及び０ ＷＢ１７を使用し、ターゲットＤＮＡとして２５％ｇのｃＤＮＡを使用してかつ Ｔａｑポリメラーゼを使用して標準的な条件下（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、　１９８ ９．　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂ　Ｐｒｅｓｓ）で行なった。

温度プログラムは９４°Ｃで５分間の初期工程、３０サイクル（９４°Ｃて１分 間、４５°Ｃで２分間；７２°Ｃて３分間）及び７２°Ｃで１０分間の最終工程 から構成した。１４４ｂｐ　ＰＣＲ増幅生成物（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　 ｐｒｏｄｕｃｔ）を３％アガロース（ＮｕＳｉｅｖｅ。

ＦＭＣ）ゲル上で精製した。このＰＣＲ生成物はセンス縮重オリゴヌクレオチド ０ＷＢ１６　（５’　ＡＡＡＧＡＡＴＴＣＧＧＮＡＣＮＴＧＧＷＳＮＧＧＮＧＴ ＮＴＧ　３’　）及び０ＷＢＩ７を用いて部分的に再増幅させた。

０ＷＢ１６はまたその５′末端でＡＡＡＧＡＡＴＴＣ延長部を有する。

この１２３ｂｐ　ＰＣＲ増幅生成物を３％アガロース（ＮｕＳｉｅｖｅ。

ＦＭＣ）ゲル上で再び精製し次いで反応混合物に２００μＭのｄＴＴＰの代りに １３０μＭのｄＴＴＰと７０μＭのジゴキシゲニン−１］　−ｄＵＴＰ（ｄｉｇ ｏｘｉｇｅｎｉｎ−１１−ｄＵＴＰ）を含有させたこと以外、前記と同一の条件 下でＰＣＲにより再増幅させた。ジゴキシゲニン標識した（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎ ｉｎ−１ａｂｅｌｌｅｄ）ＰＣＲ生成物を３％ヌンーブアガロースゲル（ＮｕＳ ｉｅｖｅ　ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌ）上で精製した。約１００．０００プラ一ク 形成単位（ｐｌａｑｕｅｆｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔ）のλＺＡＰ　ＩＩ　ｃＤＮ Ａライブラリーを、ナイロン膜［ハイボンド−Ｎ　（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ）Ａｍｅ ｒｓｈａｍ社製］を使用シゲニン標識ＰＣＲ生成物を使用してスクリーンした。

ナイロン膜を風乾し、ＤＮＡを膜上てＵＶ光線（０，１５Ｊ／ｃｍ２）の下で架 橋させた。ハイブリダイゼーションは５ｘｓｓｃ、１％ブロッキング剤（ｂｌｏ ｃｋｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）、０．１ ％Ｎ−ラウリルサルコシン、１０％ｇ／ｍｌの熱変性（ｈｅａｔ−ｄｅ口ａｔｕ ａｔｅｄ）ノボキシゲニン標識プローブを含有する０、０２％ドデシル硫酸すト リウム中で６４°Ｃで１６時間行ナツタ。２　Ｘ　ＳＳＣ／　０．１％ＳＤＳ中 テ２５℃で５分間、２回及び０．ｌＸ　ＳＳＣ／　０．１％ＳＤＳ中で６０°Ｃ で１５分間、２回洗浄することにより、非特異的に結合した（ｎｏｎ−ｓｐｅｃ ｉｆｉｃａｌｌｙ　ｂｏｕｎｄ）プローブを除去した。プローブの検出（ｄｅｔ ｅｃｔｉｏｎ）はアルカリホスファターゼに結合されたアンチージゴキシゲニン 抗体（ａｎｔｉ−ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎａｎｔｉｂｏｄｙ）　（Ｂｏｅｈｒｉ ｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）及びその基体、５−ブロム−４−クロル−３−イ ンドリルホスフェート（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して その製造業者の使用説明書に従って行なった。正のプラーク（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐｌａｑｕｅ）を同一のプローブを使用してかつ同一の条件下で２回の追加的な スクリーニング工程を行なうことにより精製した。精製プラークからのインサー トを、生体内で、ヘルパーファージＲ４０８を使用して切除して（ｅｘｃｉｔｅ ）、ｐブルースクリプトファージミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｐｈａｇｅｍｉ ｄｅ）型にした。２２個の種々の正のクローンからのインサートをＥｃｏＲＩ消 化により切除し、それらの大きさをアガロースゲル電気泳動により比較した。４ 個のクローンは大体４００ｂｐのインサートを有し、別の１８個の正のクローン は大体２５０〜３００ｂｐの範囲にあるインサートを含有した。４００ｂｐのイ ンサートを有する４個のクローンと、より小さなインサートを有する６個のクロ ーンとをヌクレオチド配列分析にかけた。最大のインサートを有するクローンは 全て、実験的なＮ−末端アミノ酸配列との比較により測定し得た如く、Ｒｓ−Ａ ＦＰＩに対応する８０個のアミノ酸オーブンリーディングフレームを有した（実 施例１２参照）。２４３ｂｐのオーブンリーディングフレームは、（−１，−３ ）ルール（ｖｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ　１９８５．　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、　１８４ ゜９９〜１０５）に従った、推定上の２９アミノ酸シグナル配列が先立っている 成熟Ｒｓ−ＡＦＰＩ　（５０アミノ酸）をコードする。

これらの全長ｃＤＮＡクローンはそれらの５′及び３′末端の非ホン訳領域の長 さにおいて互いに異なるに過ぎない。

最小のインサートを有するクローンの内の５個はそれらが５′末端で切頭されて いる（ｔｒｕｎｃａｔｅ）以外は全長Ｒｓ−ＡＦＰＩ　ｃＤＮＡクローンと部分 的に同一である。残りのクローンは推定した且つ実験的に決定したアミノ酸配列 を比較することにより５′切頭Ｒｓ−ＡＦＰ２　ｃＤＮＡクローンと同定した。

全長Ｒｓ−ＡＦＰＩ　ｃＤＮＡクローンｐＦＲＧｌ　（第３５図）と切頭Ｒｓ− ＡＦＰ２　ｃＤＮＡクローンｐＦＲＧ２　（第３６図）とを比較する時には、コ ドンの使用がわずかに異なっておりしかもＲｓ−ＡＦＰ２　ｃＤＮＡの３′末端 非ホン訳領域はＲｓ−ＡＦＰＩ　ｃＤＮＡのそれよりも長いことが見られる。最 後に、Ｒｓ−ＡＦＰＩ及びＲｓ−ＡＦＰ２　ｃＤＮＡクローンの両方は少なくと も２個のポリアデニル化シグナルを有する。第３５図は全長Ｒｓ−ＡＦＰＩ　ｃ ＤＮＡクローンｐＦＲＧ１のヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列とを示す。推 定シグナル配列にはアンダーラインが引かれており、成熟Ｒｓ−ＡＦＰＩの配列 は四角形で囲まれている。

第３６図は５′切頭Ｒｓ−ＡＦＰ２　ｃＤＮＡクローンｐＦＲＧ２のヌクレオチ ド配列と推定アミノ酸配列とを示す。

全長Ｒｓ−ＡＦＰ２　ｃＤＮＡを得るために、別の試験法に従った：ＰＣＢは、 一方ではＭ１３普遍プライマーと組合せて、他方ではＭ１３逆行プライマーと組 合せてアンチセンスオリゴヌクレオチド０ＷＢ２３ （５’　ＡＴＡＧＡＡＴＴＣＧＡＣＧＴＧＡＧＣＴＴＡＴＣＡＴＣＴＴＡＴＴＡ ＴＣＣＧ　３　”）を用いて標準条件下で行なった。０ＷＶＢ２３の最後の３０ 個のヌクレオチドはｐＦＲＧ２のポリ−Ａ　テイル（ｔａｉ　ｌ）に直接隣接し ている３′非ホン訳領域の一部の反転補完配列を形成する。この配列はヌクレオ チド（ＡＴＡ）が先行するＧＡＡＴＴＣＥｃｏＲＩ認識部位を有する５′末端ま で伸長されている。鋳型として、２μｇの全ｃＤＮＡ又は１０’組換え体ファー ジを使用した。両方の場合に、３回の別個の反応を設定した。増幅前に、９９° Ｃで５分間のＰＣＲ温度プログラムで最初の工程によりファージを溶解させてフ ァージＤＮＡを遊離した。増幅生成物の大きさは３％アガロース（ＮｕＳｉｅｖ ｅ、　ＦＭＣ）ゲル上で電気泳動により測定した。生成物は２８０〜３００ｂｐ のインサートに相当する大きさで得られた。即ち、全長Ｒｓ−ＡＦＰ２　ｃＤＮ ＡクローンはｃＤＮＡライブラリーに存在してるとは思われないと結論し得る。

実施例２２ Ｒｓ−ＡＦＰＩ　ｃＤＮＡのＲｓ−ＡＰＰ２　ＤＮＡ　ヘの突然変異誘発実験的 に決定したＮ−末端配列（実施例１２参照）及びヌクレオチド配列（実施例２１ 参照）から推定し得る如（、Ｒｓ−ＡＦＰＩ及びＲｓ−ＡＦＰ２は実施例１２に 記載した如く２個のアミノ酸でのみ異なる。Ｒｓ−ＡＦＰ２の抗菌効力はＲｓ− ＡＦＰＩの抗菌効力よりも有意な程に高くしかもＲｓ−ＡＦＰ２の全長ｃＤＮＡ クローンは入手し得ないので、Ｅ、Ｍｅｒｉｎｏ等の方法（１９９２，ＢｉｏＴ ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１２．５０８〜５１０）に従ってＰＣＲで助力される部位 指向突然変異誘発によってＲｓ−ＡＦＰＩ　ｃＤＡＮをＲｓ−ＡＦＰ２ヌクレオ チド配列として形質転換させた。次のオリゴヌクレオチドを使用した： ０ＷＢ２８　（５’　ＣＴＴＧＧＣＣＴＴＴＧＧＣＡＣＡＡＣＴＴＣ３’　）。

０ＷＢ２９　（５’　ＧＣＴＴＴＣＴＣＡＡＧＴＣＴＡＡＴＧＣＡＣ３’　）。

ＷＢ３０ （５’　ＡＡＣＴＣＧＡＧＣＴＧＣＡＧＴＧＴＣＧＡＣＣＴＡＴＴＡＡＣＡＡＧ ＧＡＡＡＧＴＡＧＣ３’　）。

ＷＢ３５ （５’　ＧＧＡＡＴＡＧＣＣＧＡＴＣＧＡＧＡＴＣＴＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡ ＴＧＡＣＣＡＴＧ　３’　）。

０ＷＢ３６　（５’　ＧＧＡＡＴＡＧＣＣＧＡＴＣＧＡＧＡＴＣＴＡＧＧＡ　３ ’　）。

最初の突然変異（成熟タン白質の位置５でグルタメートをグルタミンに転換）は 、アンブリマーとして０ＷＢ３５（これは５′タッグ配列を有するＭ１３普遍プ ライマーである）及び０Ｗ８２８　（最初のアンチセンス突然変異誘発ブ（ｓｔ ｒａｔａｇｅｎｅ）と共にＰＣＲを行なうことにより導入した。

ＭｇＣ１ｔを５０ｍＭの最終濃度まで増幅化合物に添加した。温度プログラムは ９４°Ｃで５分間の初期工程と、３０サイクル（９４℃て１分間、４５℃で２分 間、７２°Ｃで３分間）と７２°Ｃで１０分間の最終工程とを包含する。第２の 工程では、このＰＣＲ生成物はメガプライマー（ｍｅｇａｐｒｉｍｅｒ）として 使用ｃＤＮＡを用いてＰｆｕポリメラーゼによって伸長された。温度プログラム は９４°Ｃで５分間の初期工程と続いての５サイクルの延長（９４°Ｃて１分間 、５０°Ｃで１分間、７２°Ｃで１分間）を包含した。次いで０ＷＢ２９　（成 熟タン白質の位置２７てアスパラギンからアルギニンへの第２の突然変異を導入 するアンチセンスプライマー）及び０ＷＢ３６　（これは０ＷＢ３６の５′タッ グ配列と同一である）を添加し、続いて最初の突然変異の導入について記載の如 （Ｐｆｕ−ポリメラーゼによりＰＣＲ増幅を行なった。全長Ｒｓ−ＡＦＰ２ヌク レオチド配列を得るには、オリゴヌクレオチドブライマー　０ＷＢ３６及び０Ｗ Ｂ３０　（これは第２の停止コドン続いてＳａｌ　Ｉ　、Ｐｓｔ　Ｉ及びＸｈｏ 　Ｉ制限部位を導入しかくしてまたＲｓ−ＡＦＰＩ　ｃＤＮＡクローンｐＦＲＧ 　１の３′末端非ホン訳領域を除去する）を用いて第２の工程で概説した方法を 反復した。最終のＰＣＲ生成物はＢａｍＨＩ（ｐブルースクリブトファージミト ｐＦＲＧ　Ｉのポリリンカーで生起する）及び５ａｌＩで切断され、ｐＥＭＢＬ １８＋　（同じ制限酵素で予備消化した）中にサブクローン化し、ヌクレオチド 配列分析にかけた。第３７図はＲｓ−ＡＦＰＩ　ｃＤＮＡクローンｐＦＲＧ１の ＰＣＲ−助力部位指向突然変異誘発により得られた全長Ｒｓ−ＡＦＰ２ＤＮＡク ローンｐＦＲＧ４のヌクレオチド配列及び誘導アミノ酸配列を示す。推定シグナ ル配列にアンダーラインを引き、成熟ＲＳ−ＡＦＰ２の配列を箱で囲った。

実施例２３ 発現ベクターｐＦＲＧ７の構成 ｐＦＲＧ７　（第３８図・ＳＰ＝ソゲナルペプチド、ＭＰ＝成熟タン白質）はＲ ｓ−ＡＦＰ２　ＤＮＡの完全コーディング領域であって、その５′末端に、高い 転写活性を与えるための重複（ｄｕｐｌｉｃａｔｅｄ）エンハンサ−成分（Ｋａ ｙ等、　１９８７．５ｏｃｉｅｎｃｅ。

２３６、１．２９９−１３０２）を存するカリフラワーモザイクウィルスの３５ Ｓ　ＲＮＡ（Ｏｄｅｌｌ等、　１９８５．　Ｎａｔｕｒｅ、　３１３．８１０− ８１２）の強力な構成プロモーターが隣接（ｆｌａｎｋ）　しているものを含有 している。Ｒｓ−ＡＦＰ２　ＤＮＡのコーディング領域は、その３′末端側にカ リフラワーモザイクウィルスの３５ＳＲＮＡのポリアデニレーソヨン配列（Ｃａ λ１Ｖ３５ｓ）か隣接している。このベクターのプラスミド主鎖はファージミド （ｐｈａｇｅｍｉｄ）　ｐｌＪｃ１２０（Ｖｉｅｉｒａ及びｋｌｅｓｓｉｎｇ、 １９８７．　λ！ｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏ１．１５３．３−１１．）である。

ｐＦＲＧ７は次の方法で構築した。

Ｒｓ−ＡＦＰ２　ＤＮＡ　（第３７図）よりなるクローンｐＦＲＧ４は（Ｔｉｍ ｍｅｒｍａｎｓ等、　１９９０．　Ｊ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　１４．　３ ３３〜３４４）の誘導体である。

実施例２４ 植物形質転換ベクターｐＦＲＧ８の構成ｃＤＮＡ発現カセットを含有するフラグ メントをｐＢｉｎ１９Ｒｉの固有の（ｕｎｉｑｕｅ）ＨｉｎｄＩ［部位中にサブ クローンした。ｐＢｉｎ１９Ｒｉは植物形質転換ベクターｐＢｉｎ１９の修飾体 （ｍｏｄｉｆ　１ｅｄｖｅｒｓｉｏｎ）（Ｂｅｖａｎ、　＋９８４．　Ｎｕｃｌ ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１２゜Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｏｃ、　ＵＳＡ、　８７：　３４３５−３４３９）が導入されてい る。新規な植物形質転換ベクターはｐＦＲＧ８　（第３９図）と称する。

実施例２５ 植物形質転換。

［ｐＡＬ４４０４］（Ｈｏｅｋｅｍａ等、　１９８３．　Ｎａｔｕｒｅ、　３０ ３：　１７９−１８０）はＦｒａｍｏｎｄ等の方法（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ、１　：　２６２−９）を使用して、ベクターｐＦＲＧ８により形質転換され た。

タバコの形質転換はＨｏｚｓｃｈ　ＲＢ等の方法（＋９８５゜と共に共培養する ことにより行なった。共培養は１００ｕ　ｇ／ｍｌのカナマイシンの選択圧（ｓ ｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ）下で行なう。トランスジェニック植物（ ｐＦＲＧ８　ｐＡｃ１１２で形質転換）は１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含 有する培地で再生された。これらのトランスジェニック植物は標準ウェスタンブ ロッティング技術を使用して、新規に導入された遺伝子の発現について分析し得 る。導入された遺伝子の構成的発現を行なうことのできる植物を選択し、白花受 粉させて種子を得ることかできる。トランスジェニック植物のＦｌ幼苗は更に分 析し得る。

１：１２Ｎ　Ｗ−−−−−一 溶離時間（分） 溶離時間（分） タン白質　活　性 １］［ｌ！Ｎ　Ｗ−−−−− ＼コ （％）　’ｌ（ｒＩ４　”ニー　＋ｌ＋　Ｌ　−−−−−−−−（ｔｕｕし■乙 ）Ｉ　￥　萄 μ） （”Ｊ［Ｊｔ７Ｔと）暴　γ　番 ）コｅＨＷ　−−−−−− （％）±「１宰巾Ｉ晋Ｔ　（田”０８乙）λ　￥　葡−（％）　’Ｉ／　ｎ　４ 　’：’　４　＋　、Ｌ　−−−−−−−−（ＬＩＪＬｌｔ７Ｔ乙）′ｘＩ　＊ 　ｍ　−１フｅＮ　Ｗ　−−−−−− （％）’Ｉ／ｌ’ｉｎτ−１斗、Ｃ−−−−−−−−Ｃ） １）Ｅ！Ｎ　Ｗ　−−−−−− （％）ｍｉｌｌｉ　（ｔｕｕｏ８乙）Ｊ７；’４．ｉ溶離時間（分） 溶離量 Ｓ−セファロース上のＩＥＣ 溶離時間（分） 溶離量 Ｓ−セファロース上のｌＥＣ ０５和　１５　２０　２５　３０ 溶離時間（分） 溶離時間（分）　。

溶離量 Ｓ−セファロース上のｌＥＣ ０５和　１５　２０　２５　３０ 溶離時間（分） 溶離量 Ｓ−セファロース上のＩＥＣ ０　５　和　１５　２０　２５　３０ 溶離時間（分） 溶離時間（分） ＦＩＧ、　３０　（１／３） ＦＩｏ　、　３０　（２／３１ ＦＩｏ、３０　（３／３） ｔ−＋Ｅ−ｔ？　ｌＳ　ＨＨ？ ＱＥ−４Ｕ　Ｑｆ−４ＣＪ）−１ ←　Ｃ←　、　Ｌ）　ｅ　（り Ｅ−４ｃ！ＩＦ−１ （！ｌ　Ｃり　Ｃ！ｌ　＜０＜ Ｑ＜　Ｑ　＜２） Ｅ−Ｉ　Ｃ）　Ｅ−Ｉ　Ｅ−Ｉ　Ｌ）　←　ＱＯ＜　○　Ｑ　＜　○　く ｏｏ　■　Ｃ５Ｃ！ＩＬＩ（り ｈｏ　Ｅ−Ｉ　Ｉ−１ｏ　←　Ｑ Ｅ−Ｉ　Ｃ！１　Ｅ−Ｉ　Ｆ−１０Ｅ−Ｉ　ＣＤＥ−＋、＜Ｅ−＋Ｈ（Ｅ−＋＜ ０（り　ａ　ｏ（−）　○　０ ＣＬ 匣　ＣＬ　ＣＬ　Ｉ　ＣＬ＝口 く　菖　＜２！：　■　Ｑ 、　Ｎ＋　ＰＣＴ／ＧＢ　９２１０１５７０、、、Ｉｌ、、Ｎ＋ＰＣＴ／Ｇ日９ ２１０１５７０フロントページの続き （５１）　ｒｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号ＡＯＩＮ　６５１００　 Ｚ　９１５９−４ＨＣＯ７Ｋ　７／１０　８３１８−４Ｈ Ｃ１２Ｎ　５／１０ （３１）優先権主張番号　９２１３５２６．８（３２）優先臼　１９９２年６月 ２５日（３３）優先権主張国　イギリス（ＧＢ）（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、 ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ， ＳＮ、　ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ３，Ｆ Ｉ、　ＨＵ。

Ｊ　Ｐ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　Ｎｏ、　ＰＬ、　 Ｒ○、　ＲＵ、　ＳＤ、　ＵＳ （７２）発明者　カムエ、プルノー、フィリップ、アンジエロ ベルギー国、ビイ−１６５２・アルセムベルク、ジエイ、ビイ、ウオターシュト ラート、１０９エイ ＦＩ （７２）発明者　オスポーン、ルパート、ウィリアムイギリス国、ミドルセック ス・テイダブリュ２・６エスダブリユ、ツウイケンハム。

ワーウイツク・ロード、３６ （７２）発明者　リーズ、サラ、ブランウエンイギリス国、バークシャー・アー ルシイ１２・３エツクスエツクス、ブラックネル。

フォーレスト・パーク、マイケルデヴアー・ウェイ、３２ （７２）発明者　テラス、フランキイ、レイモンド、ジエラルド ベルギー国、ビイ−８５７０・アンゼゲム、シャーグシュトラート、９６ （７２）発明者　ヴアンデルレイデン、ジョセフベルギー国、ビイ−３００１・ へヴアーレー。

カスタンイエラーン、１２

Claims (43)

【特許請求の範囲】
1. １．第２７図〜第２９図又は第３２図に示したアミノ酸配列を実質的に有する抗 微生物性タン白質。
2. ２．第２７図〜第２９図又は第３２図に示したアミノ酸配列を実質的に有する少 なくとも１種のポリペプチドを包含し且つオリゴマーである請求の範囲１に記載 のタン白質。
3. ３．植物の種子から単離され得る請求の範囲１又は請求の範囲２記載のタン白質 。
4. ４．カラシナ科の種子又はキク科の種子又はマメ科の種子から単離され得る請求 の範囲３記載のタン白質。
5. ５．ダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ），アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ），カラシ（ Ｓｉｎａｐｉｓ），アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ），ダリヤ（Ｄａ ｈｌｉａ），アザミ（Ｃｎｉｏｕｓ），ハマエンドウ（Ｌａｔｈｙｒｕｓ）及び クリトリア（Ｃｌｉｔｏｒｉａ）属の種子から単離される請求の範囲４記載のタ ン白質。
6. ６．ダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ）の種子から単離され得る純粋なタン白質、Ｒ ｓ−ＡＦＰ１
7. ７．ダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ）の種子から単離され得る純粋なタン白質、Ｒ ｓ−ＡＦＰ２。
8. ８．ダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ）の種子から単離され得る純粋なタン白質、Ｒ ｓ−ｎｓＬＴＰ。
9. ９．アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種子から単離され得る純粋なタン白質、Ｂ ｎ−ＡＦＰ１，Ｂｎ−ＡＦＰ２，Ｂｒ−ＡＦＰ１及びＢｒ−ＡＦＰ２。
10. １０．カラシ（Ｓｉｎａｐｉｓ）の種子から単離され得る純粋なタン白質、Ｓａ −ＡＦＰ１及びＳａ−ＡＦＰ２。
11. １１．アラビドプシス（Ａｒａｂｌｄｏｐｓｌｓ）の種子から単離され得る純粋 なタン白質Ａｔ−ＡＦＰ１。
12. １２．ダリヤ（Ｄａｈｌｉａ）の種子から単離され得る純粋なタン白質、Ｄｍ− ＡＭＰ１。
13. １３．ダリヤ（Ｄａｈｌｉａ）の種子から単離され得る純粋なタン白質、Ｄｍ− ＡＭＰ２。
14. １４．アザミ（Ｃｎｉｃｕｓ）の種子から単離され得る純粋なタン白質、Ｃｂ− ＡＭＰ１。
15. １５．アザミ（Ｃｎｉｃｕｓ）の種子から単離され得る純粋なタン白質、Ｃｂ− ＡＭＰ２。
16. １６．ハマエンドウ（Ｌａｔｈｙｒｕａ）の種子から単利単離され得る純粋なタ ン白質、ＬＣ−ＡＦＰ。
17. １７．クリトリア（Ｃｌｉｔｏｎａ）の種子から単離され得る純粋なタン白質、 Ｃｔ−ＡＭＰ１。
18. １８．クリトリア（Ｃｌｉｔｏｎａ）の種子から単離され得る純粋なタン白質、 Ｃｔ−ＡＭＰ２。
19. １９．合成タン白質である請求の範囲１〜１８の何れかに記載のタン白質。
20. ２０．請求の範囲１〜１９の何れかに記載のタン白質をコードする組換え体ＤＮ Ａ配列。
21. ２１．ｃＤＮＡである請求の範囲２０記載のＤＮＡ配列。
22. ２２．ゲノミックＤＮＡである請求の範囲２０記載のＤＮＡ配列。
23. ２３．植物ゲノムから単離される請求の範囲２２記載のＤＮＡ配列。
24. ２４．プロモーター配列を包含する請求の範囲２３記載のＤＮＡ配列。
25. ２５．請求の範囲１〜１９の何れかに記載のタン白質をコードする遺伝子から得 られるプロモーター配列。
26. ２６．請求の範囲２０に記載されるＤＮＡ配列を含有するベクター。
27. ２７．エンコードされたタン白質を発現するように請求の範囲２０に記載される 組換え体ＤＮＡを含有する生物学的系。
28. ２８．微生物である請求の範囲２７記載の生物学的系。
29. ２９．植物である請求の範囲２７記載の生物学的系。
30. ３０．請求の範囲２０に記載の組換え体ＤＮＡの発現により産生される抗微生物 性タン白質。
31. ３１．請求の範囲２０に記載の組換え体ＤＮＡで形質転換された植物。
32. ３２．組換え体ＤＮＡは次のタン白質；Ｒｓ−ＡＦＰ１，Ｒｓ−ＡＦＰ２，Ｒｓ −ｎｓＬＴＰ，Ｂｎ−ＡＦＰ１，Ｂｎ−ＡＦＰ２，Ｂｒ−ＡＦＰ１，Ｂｒ−ＡＦ Ｐ２，Ｓａ−ＡＦＰ１，Ｓａ−ＡＦＰ２，Ａｔ−ＡＦＰ１，Ｄｍ−ＡＭＰ１，Ｄ ｍ−ＡＭＰ２，Ｃｂ−ＡＭＰ１，Ｃｂ−ＡＭＰ２，Ｌｃ−ＡＦＰ，Ｃｔ−ＡＭＰ １，Ｃｔ−ＡＭＰ２の少なくとも１種をコードする請求の範囲２６記載の植物。
33. ３３．請求の範囲３１又は３２に記載の植物の種子又は子孫。
34. ３４．請求の範囲１〜１９の何れか又は請求の範囲３０に記載のタン白質の少な くとも１種を含有する組成物。
35. ３５．菌類又はバクテリアを請求の範囲１〜１９の何れか、請求の範囲３０又は 請求の範囲３４に記載のタン白質又は組成物に暴露することからなる、菌類又は バクテリアの駆除方法。
36. ３６．菌類又はバクテリアを、エンドウ豆の遺伝子ｐＩ３９、エンドウ豆の遺伝 子ｐＩ２３０、ササゲの遺伝子ｐＳＡＳ１０又はジャガイモの遺伝子ｐＩ３２２ によってエンコードされたタン白質に暴露することからなる、菌類又はバクテリ アの駆除方法。
37. ３７．菌類又はバクテリアを、ＳＩα２、γ−１−プロチオニン又は別のアミラ ーゼ阻害剤タン白質に暴露することからなる、菌類又はバクテリアの駆除方法。
38. ３８．請求の範囲１〜１９の何れか又は請求の範囲３０に記載のタン白質を、こ れを含有する有機材料から製造するための抽出方法であって、有機材料をマセレ ーション及び溶剤抽出にかけることからなる、タン白質を製造するための抽出方 法。
39. ３９．タン白質を引続いて遠心分離、クロマトグラフィー及び透析により精製す る請求の範囲３８に記載の方法。
40. ４０．有機材料がダイコン、アブラナ、カラシ、アラビドプシス、ダリヤ、アザ ミ、ハマエンドウ又はクリトリアの種子からなる請求の範囲３８又は請求の範囲 ３９の何れかに記載の方法。
41. ４１．有機材料が請求の範囲２７に記載の生物学的系からなる請求の範囲３８又 は請求の範囲３９の何れかに記載の方法。
42. ４２．タン白質の化学合成からなる請求の範囲１〜１９の何れかに記載のタン白 質の製造方法。
43. ４３．タン白質をコードする組換え体ＤＮＡ配列を発現させることからなる、請 求の範囲１〜１９の何れかに記載のタン白質の製造方法。