HU220115B - Antipatogén peptidek, ezeket tartalmazó készítmények, eljárás növények védelmére és a peptideket kódoló szekvenciák - Google Patents

Description

A találmány új antipatogén peptidekkel, az ezeket a peptideket kódoló DNS-szekvenciákkal, az ezeket a DNS-szekvenciákat tartalmazó vektorokkal, az említett peptideket kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó transzgenikus peptidekkel, az antipatogén peptideket tartalmazó kompozíciókkal foglalkozik; foglalkozik továbbá az említett peptidek és kompozíciók felhasználásával növénypatogének visszaszorítására. A találmány tárgyai még az eljárások antipatogén peptidek vagy ezeket tartalmazó kompozíciók előállítására, valamint azok a transzgenikus növények, amelyek az említett peptidek antipatogén szempontból hatásos mennyiségét képesek szintetizálni.

A szakterületen már ismeretesek olyan peptidek, amelyek antipatogén, különösen antimikrobiális aktivitást mutatnak. Különös fontosságúak az úgynevezett lítikus peptidek, amelyek közül néhányról ismert, hogy organizmusok széles tartománya ellen aktívak; más lítikus peptidek viszont kicsiny hatást mutatnak vagy egyáltalán nem mutatnak hatást. Több példát is felhozhatunk a lítikus peptidekre állati, növényi, rovar és mikrobiális forrásokból, ilyenek például az emlős defenzinek, cekropinek, tioninok, mellűinek, a rovar defenzinek, magaininek, attacinok, dipterinek, szapecinek, cerulinok, xenopszinek vagy ezek hibridjei. Számos antimikrobiális aktivitású lítikus peptid aminosavszekvenciáját leírták már a WO 89/04 371 számú PCT szabadalmi közrebocsátási iratban. Lehrer és munkatársai (1980) hat antimikrobiális peptidet (a továbbiakban helyenként AMP) írtak le, amelyek nyúlgranulocitákból származnak, és amelyek szerkezetileg homológok a humán neutrofil defenzinekkel. Három nyúl AMP-ről írják le (NP-1, NP-2 és NP-3), hogy hatásosak Candida albicans ellen.

Az antipatogén aktivitású peptidek másik osztályát képviselik a hidrolitikus enzimek, mint például a kitináz és a p-l,3-glukanáz, amelyekről ismert, hogy gátolják a penészgombák növekedését (Schlumbaum és munkatársai, 1986; Manch és munkatársai, 1988).

A jelen találmány peptidek olyan további osztályát ismerteti, amely aktívnak bizonyul növényre ható patogének széles tartománya ellen. A peptidek ezen osztálya magában foglal mind ismert, mind új peptideket. Ezek a peptidek különösen alkalmasak olyan antipatogén kompozíciók alkotórészeként, amelyek növénypatogének visszaszorítására alkalmasak.

A jelen találmány egyik tárgya tehát, hogy olyan antipatogén kompozíciót nyújtson növénypatogének visszaszorítására, amely a mezőgazdasági peptidkiszerelésekben szokásosan alkalmazott megfelelő hordozóval együtt valamely jelen találmány szerinti peptid antipatogén szempontból hatékony mennyiségét tartalmazza.

A jelen találmány egy másik tárgya, hogy eljárást nyújtson növények védelmére növénypatogének támadása, elsősorban patogén növények és/vagy gombák támadása, de főleg patogén baktériumok támadása ellen; az eljárás abban áll, hogy a találmány szerinti peptid vagy az említett peptidet tartalmazó kompozíció antipatogén szempontból hatékony mennyiségét felvisszük a növényre vagy a növénypatogén szervezet természetes előfordulási helyére.

A találmány további tárgya, hogy olyan új antipatogén peptideket szolgáltasson, amelyek aktív alkotórészként alkalmazhatók valamely találmány szerinti kompozícióban.

A találmány további tárgya, hogy eljárást nyújtson valamely találmány szerinti antipatogén peptid és valamely ezt tartalmazó kompozíció előállítására.

A találmány még további tárgya, hogy antipatogén szempontból hatásos transzgenikus növényeket szolgáltasson, amelyekben az aktivitás egy vagy több találmány szerinti peptid kifejezésén alapul a növényi sejtben.

A találmány még további tárgya, hogy olyan transzgenikus növényeket szolgáltasson, amelyek tartalmaznak találmány szerinti peptideket kódoló DNSszekvenciákat.

Azokat a peptideket, amelyek a találmány szerint alkalmazhatók, az jellemzi, hogy N-terminális végüknél egy olyan hidrofób területet tartalmaznak, amely előnyösen az alábbi aminosavszekvenciák valamelyikét foglalja magában.

(a) SEQ ID NO: 1; vagy (b) SEQ ID NO:2; vagy (c) SEQ ID NO:6; vagy (d) valamely olyan N-terminális aminosavszekvencia, amely lényegében homológ a fenti szekvenciák legalább egyikével.

A jelen találmány szerinti peptideket több forrásból is beszerezhetjük, ideértve - de nem csak ezekre korlátozva - a mikrobákat, penészgombákat, növényeket, sőt még magasabbrendű állatokat is. Ezeket kinyerhetjük a sejtfalból, sejtmembránból és a citoszól frakcióból.

Az olyan peptidek között, amelyek N-terminális végüknél a fentebb leírt N-terminális szekvenciákkal lényegében homológ aminosavszekvenciával bírnak, és így a találmány szerint alkalmazhatók, találjuk például a foszfolipid transzfer fehérjéket, így a kukoricából (Tchang és munkatársai, 1988; Sossountzov és munkatársai, 1991), parajból (Bouillon és munkatársai, 1987; Bernhard és munkatársai, 1991), paradicsomból (Torres-Schumann és munkatársai, 1992), növényekből és mikroorganizmusokból (Yamado, 1992), sárgarépából (Sterk és munkatársai, 1991), „ragi”-ból (Compos és a Richardson, 1984) és ricinusból (Takashimo és munkatársai, 1986) származó foszfolipid transzfer fehérjéket. További példa lehet egy olyan kis polipeptid, amelyet árpa és köles sikérsejtjeiből izoláltak; ezekről már korábban megállapították, hogy vélhetően amiláz/proteáz inhibitorok (Mundy és Rogers, 1986; Svensson és munkatársai, 1986; Bemhard és munkatársai, 1989).

A találmány oltalmi körén belül azonban csak a peptidek előnyösek, amelyek célszerűen elhervadt árpanövények leveleiből nyerhetők, és az alábbi vonásokkal jellemezhetők:

(a) látszólagos molekulatömegük az 5 kD és 12 kD közti tartományban van;

(b) HPLC-tisztításban retenciós idejük 96,30, illetve

106,30 perc;

HU 220 115 Β (c) aminosav-összetételük az 1. táblázat szerinti;

(d) hidrofób N-terminális szekvenciával bírnak, amelyek előnyösen az alábbi aminosavszekvenciák egyikét tartalmazzák:

(d,) SEQ ID NO: 1; vagy (d₂) SEQ ID NO: 2; vagy (d₃) SEQIDNO:6;

(e) antimikrobiális aktivitásuk van, különösen Corynebacterium sepedonicum ellen.

Jeleznünk kell azonban, hogy a találmány szerinti peptidek kinyerhetők más forrásokból is, például a citoszól frakcióból is, nemcsak az elhervadt növények leveleiből.

Találmány szerinti peptidekként alkalmazhatók szintetikus peptidek is, amelyek a fenti peptidek valamelyikének funkcionális származékai vagy funkcionális hibridjei lehetnek.

A legelőnyösebb egy olyan peptid, amely a SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 vagy SEQ ID NO:5 aminosavszekvenciával bír.

Meglepő módon arra jöttünk rá, hogy a fentebb leírt peptidek egy gyakorlati célokból nagyon előnyös mikrobicid spektrummal bírnak elsősorban fítopatogén baktériumok és gombák ellen. így például az említett peptideknek nagyon előnyös gyógyító, megelőző és szisztematikus fitoterápiás tulajdonságai vannak, és alkalmazhatók tenyésztett növények védelmére. Ezen peptidek segítségével gátolhatok vagy elpusztíthatok azok a növénypatogének, amelyek a növényeken vagy növényekben, illetve növényrészekben vagy növényrészeken előfordulnak.

Következésképpen a találmány olyan antipatogén kompozíciókra is vonatkozik, amelyek aktív komponensként egy vagy több fentebb leírt peptidet tartalmaznak, ahol ezek a peptidek N-terminális végüknél olyan hidrofób területtel bírnak, amely előnyösen az alábbi aminosavszekvenciák egyikét tartalmazza:

(a) SEQ ID NO: 1; vagy (b) SEQ ID NO:2; vagy (c) SEQ ID NO:6; vagy (d) egy olyan N-terminális aminosavszekvencia, amely lényegében homológ a fenti szekvenciák legalább egyikével;

a kompozíciók az aktív komponenst antipatogén szempontból hatásos mennyiségben tartalmazzák olyan hordozókkal és/vagy adjuvánsokkal együtt, amelyek általában használatosak a mezőgazdaságipeptid-kiszerelésekben.

A legelőnyösebb valamely olyan kompozíció, amely aktív komponensként SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 4 vagy SEQ ID NO: 5 aminosavszekvenciát tartalmazó peptidet foglal magában.

Az aktív komponensen kívül egy találmány szerinti antipatogén kompozíció tartalmaz valamely mezőgazdaságilag elfogadható hordozót és/vagy adjuvánst is; ezzel kapcsolatban utalunk azokra az anyagokra vagy anyagkombinációkra, amelyek a mezőgazdasági kompozíciók szakterületén ismertek; ezek között megemlítjük a szilárd vagy folyékony adjuvánsokat, oldószereket, felületaktív anyagokat és más, a mezőgazdasági szerek kiszerelésénél általánosan alkalmazott egyéb anyagokat; a fentiekből egyet vagy többet is alkalmazhatunk szükség szerint.

A találmány további tárgya olyan antipatogén kompozíció szolgáltatása, amely valamely megfelelő, a mezőgazdaságipeptid-kiszereléseknél alkalmazott szokásos hordozóval együtt valamely aktív alkotórész antipatogén szempontból hatásos mennyiségét tartalmazza, ahol az aktív alkotórész valamely találmány szerinti peptidet és valamely lítikus peptidet tartalmaz. Előnyösek azok a kompozíciók, amelyekben az aktív alkotórész komponensei szinergikusan hatásos mennyiségben vannak jelen.

A találmány további tárgya, hogy olyan antipatogén kompozíciót szolgáltasson, amely valamely megfelelő, a mezőgazdaságipeptid-kiszereléseknél alkalmazott szokásos hordozóval együtt valamely aktív alkotórész antipatogén szempontból hatásos mennyiségét tartalmazza, ahol az aktív alkotórész egy foszfolipo-transzfer fehérjét és valamely lítikus peptidet tartalmaz. Előnyösek azok a kompozíciók, amelyekben az aktív alkotórész komponensei szinergikusan hatásos mennyiségben vannak jelen.

Előnyös lítikus peptid valamely tionin.

Ahogyan a bejelentésben alkalmazzuk, valamely anyag vagy kompozíció „antipatogén szempontból hatásos mennyisége” olyan mennyiséget jelent, amely a célzott növényi patogént elpusztítja vagy növekedését gátolja, amikor a növényre felvisszük, vagy amikor valamely transzgenikus növényben kifejeződik.

A „növényi patogén” kifejezés magában foglalja a gombákat, baktériumokat, nematódákat és rovarokat. A megcélzott patogének elsősorban baktériumok.

Ahogyan ebben a bejelentésben alkalmazzuk, a „lényegi szekvenciahomológia” közeli szerkezeti rokonságot jelent a nukleotid- vagy aminosavszekvenciák között. így például a lényegileg homológ DNS-szekvenciák lehetnek 60%-ban homológok, előnyösen 80%-ban homológok és legelőnyösebben 90 vagy 95%-ban vagy még nagyobb százalékban homológok; a lényegében homológ aminosavszekvenciák lehetnek 35%-ban homológok, előnyösen 50%-ban homológok és legelőnyösebben 50%-nál nagyobb mértékben homológok. A homológia magában foglal olyan kapcsolatot is, ahol egy vagy több nukleotid-, illetve aminosavszekvencia hiányzik, vagy közbe vannak iktatva elszórtan további nukleotidokból, illetve aminosavakból álló alszekvenciák.

A „homológia” kifejezés itt nemcsak a szerkezeti homológiát foglalja magában, hanem a funkcionális homológiát is.

Ahogyan a jelen találmányban alkalmazzuk, a „konstitutív” kifejezés olyan peptidekre vonatkozik, amelyek mindenkor jelen vannak egy növényi sejtben. Az „indukálható” kifejezés olyan pepiidre vonatkozik, amely a növényi sejtben csak akkor van jelen, amikor a növény valamely stresszállapotnak vagy külső behatásnak van kitéve, és a peptid termelése vagy jelenléte ilyen módon van aktiválva vagy fokozva.

Indukálni lehet kémiai eszközökkel; így például több vegyi anyagról ismert, hogy patogénekkel kapcso3

HU 220 115 Β latos fehérjék induktoraiként működnek növényekben; ilyenek például az etilén, benzoesav, szalicilsav, poliakrilsav és ezek származékai. Az indukció bekövetkezhet más, fiziológiai vagy fizikai eszközökkel is, például magas vagy alacsony hőmérsékletek, fizikai sebkialakítás vagy más ismert induktív eszközök alkalmazásával.

A találmány szerinti peptideket előállíthatjuk megfelelő növényi részekből, például elhervadt növények részeiből, elsősorban elhervadt árpanövényből. Abból a célból, hogy a fehérje károsodása vagy vesztesége minél kisebb legyen, ajánlatos alacsony hőmérsékleten, előnyösen 4 °C hőmérsékleten dolgozni, és kerülni a fölösleges kitettséget oxigénnek. Ezen kívül bizonyos kémiai anyagokat is adhatunk a tisztítási munkamenetben alkalmazott különböző pufferekhez. Ezek között megemlíthetjük például a fehérjestabilizálókat, mint a glicerint, a szulfhidrilreagenseket, mint a ditiotreitolt, amelyek a ciszteingyökök oxidálódásának minimálisra szorítására szolgálnak, és a fémkelátképzőket, mint az EDTA-t, amelyek megóvják a fehérjét a nehézfémionok hatásától, amelyek ugyanis inaktiválhatják a fehérjét. Abból a célból, hogy a proteázok lebontó hatásának tulajdonítható fehéijeveszteséget elkerüljük, célszerű valamely proteázinhibitor hozzáadása is.

A találmány szerinti peptidek előállítását elvégezhetjük elkülönítési (szeparációs) eljárásokkal, amelyek a szakterületen jól ismertek. Ilyenek például a kicsapás, fáziselválasztás, kromatográfia, elektroforézis, centrifugálás és ultraszűrés.

A kicsapás lehet például ammónium-szulfátos kicsapás, acetonos kicsapás, polietilénimines (Polymin P) kicsapás és izoelektromos kicsapás.

A fáziselválasztási eljárások közül megemlítjük például a polietilénglikol alkalmazását. Amikor polietilénglikol (PEG), só és víz megfelelő keverékét alakítjuk ki, kétfázisú rendszer képződik. Egy adott fehérje megoszlását a két fázis között befolyásolhatjuk a só koncentrációjával, a polimer koncentrációjával, az alkalmazott hőmérséklettel és az alkalmazott pH-val.

A szakterületen ismert kromatográfiás munkamenetek közül az alábbiak bizonyultak hasznosnak a tisztítási munkamenet tervezésében: ioncserélő kromatográfia, hidrofób kromatográfia, affinitáskromatográfia, immobilizált fémaffinitás-kromatográfia (IMAC), immunaffinitás-kromatográfia, és különösen a nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC), amely lehetővé teszi a fordított fázisú frakcionálást, hidrofóbaffinitáskromatográfiát és gélszűréses kromatográfiát, vagy lehetővé teszi, hogy nagy nyomáson hajtsunk végre ioncserélő kromatográfiát. A tisztítási munkamenethez alkalmazott oszlopokat célszerűen csökkenteni vagy minimalizálni kell gyenge, nem ionos detergensek, mint például NP40 jelenlétével a pufferoldatokban, hogy elkerüljük a fehérjeveszteséget az oszlopanyaghoz való nem fajlagos adszorpció következtében.

A találmány egyik előnyös kiviteli módja szerint hervadt árpanövények szikleveleit vagy szárait összegyűjtjük, és ezeket használjuk fel alapanyagként az ezt követő fehérjekivonáshoz. Az összegyűjtött növényi anyagot először folyékony nitrogén jelenlétében porrá őröljük, majd homogenizáljuk és megfelelő pufferoldattal extraháljuk. Egy vagy több ilyen extrahálás után következik egy további extrakciós lépés nagy sókoncentrációjú oldattal, hogy extraháljuk a sejtfalakat és a membránfehéijéket is. A szilárd részecskéket kicentrifugáljuk, a felülúszót megtartjuk és desztillált vízzel szemben dializáljuk. Egy másik eljárás szerint a felülúszót oszlopkromatográfiával is sómentesíthetjük vagy kicsaphatjuk ammónium-szulfáttal. A végső tisztítást HPLC-vel érjük el.

A találmány szerinti peptidek aminosav-összetételében az aminosavak relatív arányának meghatározását a szakterületen jól ismert eljárásokkal végezhetjük el, például oszlop utáni O-ftáldialdehid-származékképzéssel (Benzon és Hare, 1975), vagy egy másik eljárás szerint teljes hidrolízis után, oszlop előtti fenilizotocianát-származékképzéssel Bidlingmeyer és munkatársai (1984) szerint.

Az N-terminális aminosavszekvencia-elemzést standard eljárásokkal hajthatjuk végre, például Edmanlebontással.

Ezekre a szekvenciainformációkra alapozva könnyen állíthatunk elő oligonukleotid próbákat (vizsgáló mintákat), amelyek a peptidet kódoló megfelelő gén azonosítására és izolálására alkalmazhatók.

Mivel a genetikai kódról ismert, hogy degenerálódhat, az esetek többségében különböző kodonok alkalmazhatók egy és ugyanazon amínosavhoz. Eltekintve néhány kivételes esettől, egy adott aminosavszekvenciát általában egy egész sorozat oligonukleotid kódolhat, amelyek hasonlítanak egymáshoz. Figyelembe kell venni azonban azt, hogy az oligonukleotidok ezen sorozatának csak egy tagja esik ténylegesen egybe a keresett génben levő megfelelő szekvenciával. Abból a célból, hogy a lehetséges oligonukleotidok számát már a kezdetnél korlátozzuk, alkalmazhatjuk azokat a szabályokat, amelyeket Latke és munkatársai (1985) fektettek le; ezek a szerzők számításba vették azt a gyakoriságot, amellyel egy adott kodon ténylegesen előfordul eukarióta sejtekben. Abból a célból, hogy megkönnyítsük a kívánt gén kimutatását, a fentebb leírt DNS-próbát jelezhetjük valamely megfelelően és könnyen kimutatható csoporttal.

A találmány foglalkozik valamely találmány szerinti peptidet, peptidfragmentumot vagy peptidrészt kódoló DNS-szekvenciával is, továbbá foglalkozik olyan vektorokkal, amelyek tartalmazzák az említett DNSszekvenciát. A DNS-szekvencia lehet szintetikus DNSszekvencia is, amelyet a szakterületen jól ismert eljárásokkal lehet előállítani.

Miután a találmány szerinti peptidek valamelyikét kódoló gént izoláltuk valamely megfelelő forrásból, például cDNS- vagy genomikus DNS-könyvtárból, ezek a gének könnyen alkalmazhatók transzgenikus növények előállításához. Ezek a transzgenikus növények, amikor a bevezetett gének kifejeződnek, védve vannak a növénypatogének támadásától.

A találmány foglalkozik azokkal a transzgenikus növényekkel is, amelyek legalább egy találmány szerinti peptidet kódoló DNS-szekvenciákat tartalmaznak.

HU 220 115 Β

A találmány tárgyai közé tartozik egy eljárás olyan transzgenikus növények előállítására, amelyek antipatogén szempontból hatékony mennyiségben szintetizálni képes(ek) egy vagy több peptidet; az eljárás abból áll, hogy

a) előállítunk egy vagy több peptidet kódoló rekombináns DNS-szekvenciákat tartalmazó transzgenikus növényt, vagy

b) előállítunk két vagy több, egy vagy több peptidet kódoló rekombináns DNS-szekvenciát tartalmazó transzgenikus növényt, és az említett növényeket hagyományos nemesítést technikákat alkalmazva keresztezzük.

Az eljárásban előnyösen előállítunk egy első homozigóta transzgenikus növényt, amely egy első peptidet kódoló rekombináns DNS-szekvenciát tartalmaz, előállítunk egy második homozigóta transzgenikus növényt, amely egy második peptidet kódoló rekombináns DNSszekvenciát tartalmaz, előállítunk egy harmadik homozigóta transzgenikus növényt, amely egy harmadik peptidet kódoló rekombináns DNS-szekvenciát tartalmaz, majd hagyományos nemesitől technikákat alkalmazva keresztezzük a három homozigóta növényt.

A transzgenikus növényekben a peptidek szintézise valamely indukálható kifejező rendszer alkalmazásával indukálható, az indukálható rendszerbe beleértve egy indukálható gént és egy indukáló regulátort (szabályozót).

Abból a célból, hogy a növényi sejtben kifejezhetővé váljék, a DNS-szekvenciát előnyösen valamely megfelelő vektorba klónozzuk a növény transzformálásához. Ez a megfelelő vektor tartalmaz egy vagy több promotor vagy regulátor DNS-szekvenciát, amelyek elősegítik a kódoló DNS-szekvencia kifejezését a transzformáit növényi sejtben. Számos növényi kifejező kazetta és vektor ismert a szakterületen. A növényekbe bevezethetők promotor nélküli konstrukciók is.

Megfelelő kontrollszekvenciák azok, amelyek tartalmaznak promotort és 5’ és 3’ nem transzlatált szabályozó területeket, amelyek működőképesek növényekben. Ezek a szekvenciák egymástól függetlenül származhatnak sokféle forrásból, például vírus-, növényi vagy bakteriális génekből. Ezek a promotorok vagy szabályozó szekvenciák lehetnek természetükben konstitutívak, vagy szabályozhatók kifejezési termékeikkel. Az ilyen szabályozás lehet időbeli vagy térbeli, és magában foglalhat fejlődés által szabályozott promotorokat és indukálható promotorokat. A fehéijék kifejeződhetnek a vakuolumokban vagy extracellulárisan a szakterületen jól ismert eljárásokat alkalmazva (EP 462,065).

Az előnyös promotorok között találjuk a karfíolmozaik-vírusból származó promotorokat, köztük a 355 és 195 promotorokat. A karfiolmozaik-vírust (CaMV) Hohn és munkatársai (1982) jellemezték és írták le. Ez a leírás a jelen bejelentésbe referenciaként épül be. Szintén előnyösek a nopalin szintáz, oktopin szintáz és mannopin szintáz promotorok.

A felhasználáshoz alkalmas víruspromotorok és 5’ és 3’ nem transzlatált szekvenciák működőképesek növényekben; az ilyen alkalmas vírusok között találjuk például a növényi vírusokat, mint a karfiolmozaik-vírust.

A CaMV annyiban szokatlan növényi vírus, hogy kettős szálú DNS-t tartalmaz. Legalább két CaMV transzkripciós promotor működőképes növényekben, nevezetesen a 19S promotor, amely a CaMV VI génjének transzkripcióját eredményezi és a 35S promotor. A találmány szempontjából a 19S és 35S promotorok az előnyösen alkalmazható növényivírus-promotorok.

A találmányban való felhasználásra alkalmas növényigén-promotorokra és 5’ és 3’ nem transzlatált területekre példák lehetnek azoknak a géneknek a promotorjai és nem transzlatált területei, amelyek a ribulóz bifoszfát karboxiláz oxigenáz kis alegységét, a foszfoenol piruvát karboxilázt, az aktint, a patogenezissel kapcsolatos fehérjéket és a klorofill a/b kötőfehérjét kódolják. Ezek a növényi génterületek növényi sejtekből izolálhatok olyan módon, amely hasonló a CaMV-ből a megfelelő területek izolálására korábban leírt eljáráshoz (Morelli és munkatársai, 1985).

Baktériumgénekből eredő megfelelő promotorok és 3’ és 5’ nem transzlatált területek lehetnek például azok, amelyek az Agrobacterium-plazmidok T-DNS területében vannak jelen. Néhány példát felsorolunk a megfelelő Agrobacteriumokra: az A. tumefaciens Ti plazmidja és az A. rhizogenes Ri plazmidja. A találmányban hasznosítható Agrobacterium-promotorok és 3’ és 5’ nem transzlatált területek elsősorban azok, amelyek az oktopin, mannopin és nopalin szintázt kódoló génekben vannak jelen. Ezeket a szekvenciákat hasonló eljárásokkal kaphatjuk meg, mint amelyeket korábban már leírtak CaMV, növényi promotorok és nem transzlatált szekvenciák izolálásánál.

Valamely promotoron kívül a találmány szerinti kiméragének előnyösen magukban foglalnak további nem transzlatált szekvenciákat, amelyeket vezető (leader) szekvenciának neveznek. A megfelelő vezető szekvenciák között találjuk azokat a különböző hosszúságú vezető szekvenciákat, amelyeket a 35S CaMVgénből izoláltak (Pierce és munkatársai, 1987). Az előnyös vezető szekvenciák azok, amelyeket a 35S CaMVgénből izoláltak, és hosszúságuk mintegy 50 nukleotid és mintegy 130 nukleotid között van.

A kifejezhető DNS-hez, de különösen a beiktatandó struktúrgénhez az is előnyös, ha olyan szekvenciát tartalmaz, amely a növényi sejtben működőképes N-terminális szignálpeptidet kódol, vagy amely egy ilyen szekvenciához kapcsolódik az 5'-terminális területben. Ez a szignálpeptid transzportszignál, amely az endomembránrendszeren keresztül szállított fehérjék N-terminális végénél található. Ez a szignálszekvencia biztosítja, hogy az említett fehérjék először áthatoljanak az endoplazmatikus retikulumba, ahol a szignálpeptid proteolitikusan lehasad a prekurzor fehérjéről, amint az teljesítette a feladatát. Speciális feladata következtében a szignálpeptid-szekvenciának ez a típusa nagy mértékben megőrződött az evolúció során minden élő sejtben, függetlenül attól, hogy ezek baktériumok, élesztők, állatok vagy növények.

Ezenkívül a DNS-molekula tartalmazhat további szekvenciaszekciókat; ezek olyan peptidfragmentumokat kódolnak, amelyek általában azt a célt szolgálják,

HU 220 115 Β hogy javítsák a készséget a vakuolumokba való bebocsátáshoz; ilyen például a Matsuoka és Nakamura (1991) által felfedezett propeptidfragmentum a spóráinál N-terminális túlnyúlásában.

A pepiidet kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó rekombináns DNS-t a növényi sejtekbe nagyon sokféle módon vezethetjük be, amelyek ismeretesek azok számára, akik a szakterületen jártasak. A növényi sejtek transzformálásának eljárásai között találjuk például az ultrahangos kezelést (Joesbo és Brunstedt, 1990), a mikroinjekciót (Crossway és munkatársai, 1986; Neuhaus, 1987), az elektroporációt (Riggs és munkatársai, 1986), az ép sejtek elektroporációját (Molina és munkatársai, 1992), az Agrobacteriummal közvetített transzformálást (Hinchee és munkatársai, 1988), a szilikon-karbid-rosttal közvetített átszállítást (Kaeppler és munkatársai, 1992), a közvetlen génátvitelt (Paszkowski és munkatársai, 1984), és a ballisztikus részecskegyorsítást például olyan berendezéseket alkalmazva, amelyeket az Agracetus Inc. (Madison, Wisconsin) és a Dupont, Inc. (Wilmington, Delaware) forgalmaz [4,945,05 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; McCabe és munkatársai, 1988; Weissinger és munkatársai, 1988; Sanford és munkatársai, 1987 (hagyma); Christou és munkatársai, 1988 (szója); McCabe és munkatársai, 1988 (szója); Datto és munkatársai, 1990 (rizs); Klein és munkatársai, 1988 (kukorica); Klein és munkatársai, 1988 (kukorica); Klein és munkatársai, 1989 (kukorica); Fromm és munkatársai, 1990; Gordon-Kamm és munkatársai (1990), kukorica].

Az egyik lehetséges eljárás genetikai anyag bevitelére növényi sejtekbe lehet például az, hogy növényi sejteket érintkezésbe hozunk a bevezetendő DNS-t tartalmazó vírusokkal vagy Agrobacteriummal. Ezt úgy érhetjük el, hogy érzékeny növényi sejteket fertőzünk, vagy a növényi sejtekből származó protoplasztokat ezekkel együtt tenyésztjük. A találmány oltalmi körén belül a karfiolmozaik-vírust alkalmazhatjuk vektorként a találmány szerinti, pepiidet kódoló DNS-szekvencia beiktatásához valamely növénybe.

A pepiidet kódoló DNS-szekvencia sejtekbe való beiktatásának másik eljárása lehet a növényi sejtek fertőzése olyan Agrobacterium tumefacienssel és/vagy Agrobacterium rhizogenessel, amelyek előzőleg transzformálva voltak az említett génkonstrukcióval. A transzgenikus növényi sejteket azután megfelelő tenyésztési körülmények (amelyek jól ismertek a szakterületen jártas személyek számára) között tenyésztjük úgy, hogy ezek gyökereket és szárakat képezzenek, és végül teljes növény alakuljon ki.

A növényi anyag transzformálásának egy további lehetséges eljárása a kevert fertőzés mind Agrobacterium rhizogenest, mind Agrobacterium tumefacienst alkalmazva, amint ezt Petit és munkatársai (1986) sárgarépa transzformálásánál leírták.

A találmány szerinti peptidet kódoló DNS-szekvenciát átvihetjük tehát megfelelő növényi sejtekbe, például az Agrobacterium tumefaciens Ti-plazmidja vagy az Agrobacterium rhizogenes Ri-plazmidja segítségével. A Ti-plazmid vagy a Ri-plazmid az Agrobacteriummal végzett fertőzés során átvándorol a növénybe, és stabilan integrálódik a növényi genomba.

Mind a Ti-plazmidnak, mind a Ri-plazmidnak két olyan területe van, amely esszenciális a transzformált sejtek előállításához. Ezen területek egyike, a transzfer DNS (T-DNS) terület átjut a növénybe, és tumorok indukálásához vezet. A másik terület, a virulenciaátadó (vir) terület, csak a tumorok kialakulásához szükséges, fenntartásukhoz nem. A transzfer DNS-terület méretei megnagyobbíthatok a peptidet kódoló DNS-szekvencia beépítésével anélkül, hogy az átvihetőség károsodna. A tumort indukáló géneket eltávolitva és valamely szelektálható markert beépítve a módosított Ti- vagy Riplazmidot alkalmazhatjuk vektorként a találmány szerinti génkonstrukció átszállításához valamely megfelelő növénysejtbe.

A vir terület az Agrobacterium T-DNS területének átvitelét hajtja végre a növényi sejt genomjába, tekintet nélkül arra, hogy vajon a T-DNS terület és a vir terület ugyanazon a vektoron vannak-e jelen vagy más vektorokon vannak jelen azonos Agrobacterium-sejtben. Egy vir terület egy kromoszómán szintén indukálja a T-DNS átvitelét egy vektorból egy növényi sejtbe.

így a peptidet kódoló DNS átviteléhez növényi sejtekbe olyan rendszert használhatunk, amelyben a vir terület és a T-DNS terület különböző vektorokban helyezkedik el. Az ilyen rendszer „binér vektor rendszereként ismeretes, és a T-DNS-t tartalmazó vektort következésképpen „binér vektor”-nak nevezzük.

Bármely T-DNS-t tartalmazó vektor, amelyet átvihetünk növényi sejtekbe, és amely lehetővé teszi a transzformált sejtek szelektálását, alkalmas a találmány oltalmi körén belüli felhasználáshoz; ilyen például egy ingázó vektor, amely tartalmazza a találmány szerinti peptidet kódoló DNS-szekvenciát a bal határszekvencia (RB) közé klónozva, és amely stabil replikációra képes mind E. coliban, mind A. tumefaciensben.

A DNS Agrobacterium segítségével történő bevezetésének valamely növényi sejtbe egyik előnyös eljárása az úgynevezett levéllemez-transzformálás Agrobacterium alkalmazásával (Horsch és munkatársai, 1985). Megfelelő célnövényből származó steril levéllemezeket inkubálunk a találmány szerinti peptidet kódoló DNS-szekvenciák valamelyikét tartalmazó Agrobacteriumsejtekkel, majd a lemezeket átvisszük megfelelő tápközegbe vagy tápközegre. Különösen alkalmasak és ennek megfelelően a találmány szempontjából előnyösek az LS tápközegek, amelyek agar hozzáadásával meg vannak szilárdítva, és dúsítva vannak kereskedelmi forgalomban kapható egy vagy több növénynövekedés-szabályozóval.

Többnapos, előnyösen 2-3 napos, 20-40 °C hőmérsékleten, előnyösen 23-35 °C hőmérsékleten és legelőnyösebben 25 °C hőmérsékleten szórt fényben végzett inkubálás után a levéllemezeket a hajtás indukálásához alkalmas tápközegbe visszük át. A transzformánsok kiválasztásához különösen előnyös az olyan LS tápközeg, amely nem tartalmaz auxint, hanem helyette citokinint tartalmaz, és amelyhez valamely szelektív anyag van hozzáadva az alkalmazott markergéntől fug6

HU 220 115 Β gően. A tenyészeteket fényen tartjuk, és megfelelő időközönként, előnyösen egyhetes időszakonként friss tápközegbe visszük át. A kifejlődő zöld hajtásokat kivágjuk, és tovább tenyésztjük olyan megfelelő tápközegben, amely indukálja a hajtásokat, hogy gyökeret képezzenek. A találmány szempontjából különösen előnyös az olyan LS tápközeg, amely nem tartalmaz auxint vagy citokinint, de amelyhez valamely szelektív anyag van hozzáadva a transzformánsok kiválasztásához.

Az Agrobacteriummal közvetített transzformáláson kívül a találmány szerinti eljárásban alkalmazhatunk közvetlen transzformálási eljárásokat is a találmány szerinti génkonstrukció beiktatásához növényi anyagba.

A genetikai anyag közvetlen átviteléhez növényi sejtbe alkalmas eljárás lehet például a protoplasztok kezelése olyan munkameneteket alkalmazva, amelyek módosítják a plazmamembránt; ilyenek például a polietilénglikolos kezelés, a hősokk-kezelés, az ultrahangos kezelés vagy az elektroporáció, vagy ezeknek a munkameneteknek a kombinálása.

Az elektroporációs technikában a növényi protoplasztokat vagy sejteket a peptidet kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó plazmidokkal együtt nagy térerősségű elektromos impulzusoknak vetjük alá. Ez reverzibilis növekedést idéz elő a biomembránok permeabilitásában, és így lehetővé teszi a plazmidok beiktatását. Az elektroporézisnek alávetett növényi protoplasztok felújítják sejtfalukat, osztódnak, és kalluszszövetet képeznek. A transzformált növényi sejtek szelekciója a fentebb leírt fenotípusos markerek segítségével történhet.

A genetikai anyag növényi sejtekbe való közvetlen bevezetésére szolgáló eljárást ismertetnek Negrutiu és munkatársai (1987), amely teljesen kémiai jellegű munkameneteken alapul, és amely lehetővé teszi, hogy a transzformálás nagyon gyorsan és hatékonyan menjen végbe.

Egy vektorban levő genetikai anyag növényi sejtekbe való közvetlen beiktatására szolgáló további eljárások lehetnek például a mikroinjektálás finoman kihúzott mikropipettákat alkalmazva (Neuhaus és munkatársai, 1987), vagy a sejtek bombázása mikrolövedékekkel, amelyek a transzformáló DNS-sel be vannak vonva [„Microprojectile Bombardment (Wong és munkatársai, 1988)], vagy amelyek egy DNS-tartalmú oldaton keresztül vannak felgyorsítva a transzformálandó sejtek irányában nyomás hatására; itt az oldószer finom köddé porlasztása történik a nyomásváltozás eredményeképpen (434,616 lajstromszámú európai szabadalmi leírás).

A növényi sejtek, szövetek és növények átvizsgálását az adott DNS-szekvenciák jelenlétére Southemelemzéssel végezzük (Southern, 1975). Ennek a munkamenetnek a részleteit Maniatis és munkatársai (1982) adják meg. Ez az átvizsgálás elvégezhető a polimeráz láncreakció (PCR) munkamenetének alkalmazásával is. A PCR munkameneteket részletesen leírják Mullis és munkatársai (1987), valamint Erlich (1989).

A növényi sejtek transzformálása magában foglalja azt az elkülönítési műveletet is, amelyben elválasztjuk a transzformált sejteket azoktól a sejtektől, amelyek nem transzformálódtak. Az ilyen elkülönítéshez vagy szelekcióhoz az egyik kényelmes eljárás az, hogy a transzformált sejtbe beiktatandó anyagba beépítjük egy szelekciós marker génjét. Ennek eredményeként csak azok a sejtek tartalmazzák a marker gént, amelyek sikeresen transzformálódtak. A marker gén transzlációs terméke azután olyan fenotípusos jellemvonást ad át, amely lehetővé teszi a szelekciót. A fenotípusos jellemvonás általában a túlélési képesség valamely kémiai szer, például antibiotikum, mint kanamicin, G418, paromomicin stb. jelenlétében; ezt a kémiai szert a szelekciós tápközegben helyezzük el.

Azok között a gének között, amelyek antibiotikumrezisztenciát adnak át, találjuk például azokat, amelyek neomicinfoszfotranszferázt kódolnak [kanamicinrezisztencia, van den Elzen és munkatársai (1985)], a Tn5-ből származó kanamicinrezisztencia gént (NPTII) [Bevan és munkatársai (1983); McBride és munkatársai (1990)], a PAT gént, amelyet Thompson és munkatársai írnak le (1987), és a klóramfenikol-acetiltranszferázt.

A jól átvizsgálható markerként szövettenyészetben elsődlegesen alkalmazható génre, amely genetikailag manipulált vektorokat tartalmazó növényi sejtek azonosítására jó, példa lehet egy olyan gén, amely valamely kromogén terméket termelő enzimet kódol. Az egyik példa erre a β-glukuronidáz (GUS) termelését kódoló gén. Ezt az enzimet széles körben alkalmazzák; ennek előállítását és alkalmazását Jefferson írja le.

Miután a transzformált növényi sejteket szelekciós tápközegeken tenyésztettük, túlélő sejteket szelektálunk a további tanulmányokhoz és műveletekhez. A szelekciós eljárások és anyagok jól ismertek azok számára, akik a szakterületen járatosak, és lehetővé teszik, hogy a szakértő nagy valószínűséggel kiválassza azokat a túlélő sejteket, amelyek sikeresen transzformálódtak exogén DNS-sel.

A növényi sejtek vagy növények transzformálása után (például Agrobacterium Ti-plazmid alkalmazásával) azokat a növényi sejteket vagy növényeket, amelyek a Ti-plazmiddal transzformálva vannak úgy, hogy az enzim kifejeződik, egy megfelelő fenotípusos marker segítségével kiválaszthatjuk. Ezek között a fenotípusos markerek között találjuk - a korlátozás szándéka nélkül - az antibiotikumrezisztenciát. Más fenotípusos markerek is ismertek a szakterületen, és alkalmazhatók a találmány szerinti eljárásokban.

A pozitív kiónokat a szakterületen ismert eljárásokat követve regeneráljuk. Ezt követően a transzformált növényeket értékeljük a kívánt tulajdonságok jelenlétére és/vagy arra a mértékre, amellyel a kívánt tulajdonságok kifejeződnek. Az első értékelés lehet például a transzformáit növények baktériumellenes/gombaellenes rezisztenciájának szintje, a kívánt tulajdonságok stabil örökölhetősége, a szabadföldi kísérletek stb.

Azok között a növénypatogének között, amelyek a jelen találmány célpontjai lehetnek, találjuk például az alábbi osztályok tagjait: baktériumok (például Corynebacterium, Pseudomonas, Xanthomonas és Erwinia);

HU 220 115 Β gombák, mint Fungi imperfecti (például Botrytis, Fusarium, Septoria), Ascomycetes (például Erysiphe, Móniba), Oomycetes (például Peronospora, Phytophthora, Plasmopara, Colletotrichum és Pythium), Basidiomycetes (például Rhizoctonia és Puccinia), valamint rovarok és nematódák (például Meloidogyne, Caenorhabditis, Globora, Heterodera és Pratylenchus). A gomba eredetű patogének között találjuk például Botrytis cinerea, Colletotrichum lagenarium, Erysiphe graminis, Móniba fructicola, Peronospora tabacina, Phytophthora parasitica, Plasmopara viticola, Pythium ultimum, Rhizoctonia solani és Septoria nodorum fajokat.

A céltermények, amelyeket védeni lehet a jelen találmány szerint, például az alábbi növényfajokba tartozhatnak: kukorica, gabonafélék (például búza, árpa, rozs, zab, rizs, cirok és ezekkel rokon növények), répa (például cukorrépa és takarmányrépa), csonthéjasok, almafélék és puha gyümölcsök (például alma, körte, szilva, őszibarack, mandula, cseresznye, eper, málna és szeder), hüvelyes növények (például bab, lencse, borsó, szója), olajos növények (például repce, mustár, mák, olajfa, napraforgó, kókuszdió, ricinus, kakaóbab, földimogyoró); uborkafélék (például uborka, tök, dinnye), rostos növények (például gyapot, len, kender, juta), citrus növények (például narancs, citrom, grapefruit, mandarin), zöldségek (például paraj, saláta, káposzta, sárgarépa, hagyma, paradicsom, burgonya, paprika), Lauraceae növények (például avokádó, szegfűszeg, kámfor), további növények, mint dohány, dió, kávé, cukornád, tea, szőlő, komló, banán, természetes guminövények, valamint dísznövények.

A találmány tárgya az antipatogén kompozíciók előállítása is, amely abból áll, hogy valamely találmány szerinti peptidet homogénen összekeverünk egy vagy több megfelelő hordozóval és/vagy adjuvánssal, amelyeket általában alkalmaznak a mezőgazdaságipeptidkiszerelésekben. Az aktív komponenst homogénen összekeveijük egy vagy több fentebb felsorolt anyaggal vagy anyagcsoporttal. A találmány foglalkozik a növények növénypatogének támadása elleni védelmére szolgáló eljárással is, amely eljárás abból áll, hogy az aktív komponenst vagy az aktív komponenst tartalmazó antipatogén kompozíciót a növényen vagy a növénypatogén környezetében alkalmazzuk.

Az egyik kiviteli módban a találmány szerinti peptideket megelőzés céljából vagy kezelés céljából kompozíciók formájában alkalmazhatjuk egy vagy több mezőgazdaságilag elfogadható hordozóval együtt, ezt a kompozíciót a termőterületre vagy a kezelendő növényre vihetjük fel együtt vagy egymás után további anyagokkal. Ezek az anyagok lehetnek mind műtrágyák, mind mikorelemdonorok, mind más olyan készítmények, amelyek befolyásolják a növény növekedését. Ezek lehetnek továbbá szelektív herbicidek, inszekticidek, fúngicidek, baktericidek, nematicidek, molluszcicidek vagy a fenti készítményekből néhánynak keverékei, amennyiben szükséges, más hordozókkal, felületaktív anyagokkal vagy az alkalmazást elősegítő adjuvánsokkal együtt, amelyeket szokásosan alkalmaznak az ilyen jellegű kiszereléseknél. A megfelelő hordozók és adjuvánsok lehetnek szilárdak vagy folyékonyak; ezek általában olyan anyagok, amelyeket rendszeresen alkalmaznak a kiszerelési technológiákban, például természetes vagy regenerált ásványi anyagok, oldószerek, diszpergálószerek, nedvesítőszerek, ragasztószerek, kötőanyagok vagy műtrágyák.

A találmány szerinti aktív komponensek vagy agrokémiai kompozíciók, amelyek legalább egy aktív komponenst tartalmaznak, egyik előnyös alkalmazása a levélen történő alkalmazás. Az alkalmazások száma és az alkalmazások gyakorisága függ a megfelelő patogén által előidézett fertőzés intenzitásától. Az aktív komponens azonban behatolhat a növénybe a gyökereken át a talajból is (szisztematikus kezelés) olyan módon, hogy a növény helyét folyékony kompozícióval impregnáljuk, vagy az anyagokat szilárd formában, például szemcsék formájában juttatjuk a talajba (talajkezelés). Az aktív komponenseket alkalmazhatjuk a magokra is (burkolás) olyan módon, hogy a magokat aktív komponenseket tartalmazó folyékony kiszereléssel impregnáljuk vagy szilárd kiszereléssel burkoljuk be. Speciális esetekben lehetségesek az alkalmazás más módjai is, ilyen például a növény szárainak vagy bimbóinak szelektív kezelése.

Az aktív komponenseket alkalmazhatjuk módosítatlan formában, vagy előnyösen a kiszerelésekben általánosan alkalmazott adjuvánsokkal együtt; ennek megfelelően ismert módon kiszerelhetők emulgeálható koncentrátumokká, burkolásra alkalmas krémekké, közvetlenül permetezhető vagy hígítható oldatokká, híg emulziókká, nedvesíthető porokká, oldható porokká, porokká, granulátumokká; kiszerelhetők azonban kapszulázva is, például polimer anyagokba. A kompozíció természetének megfelelően választjuk meg az alkalmazási eljárásokat, például permetezést, porlasztást, porkiszórást, hintést vagy kiöntést, figyelembe véve még a célba vett tárgyak természetét és az uralkodó körülményeket is. Az alkalmazás előnyös aránya normálisan 50 g és 5 kg aktív komponens (a. i.) között van hektáronként (ha); ez előnyösen 100 g és 2 kg a. i/ha között, legelőnyösebben 200 g és 500 g a. i/ha között van.

Az aktív komponenst, és ahol szükséges, valamely szilárd vagy folyékony adjuvánst tartalmazó kiszereléseket, kompozíciókat vagy készítményeket ismert módon állítjuk elő, például homogénre keveréssel és/vagy az aktív komponensek őrlésével adalékanyagokkal, például oldószerekkel, szilárd hordozókkal, és - ha szükséges - felületaktív anyagokkal együtt.

A megfelelő oldószerek között találjuk az aromás szénhidrogéneket, előnyösen a 8-12 szénatomosakat, például a xilolok keverékét vagy a helyettesített naftalinokat, a hálátokat, például a dibutil-ffalátot, az alifás szénhidrogéneket, például a ciklohexánt vagy a paraffinokat, az alkoholokat és glikolokat, valamint ezek étereit és észtereit, például az etanolt, és az etilénglikol monometil- vagy monoetil-étert, a ketonokat, például a ciklohexanont, az erősen poláros oldószereket, például az N-metil-2-pirrolidont, dimetil-szulfoxidot vagy dimetil-formamidot, valamint az epoxidozott étolajokat, például az epoxidozott kókuszdióolajat vagy szójaolajat, továbbá a vizet.

HU 220 115 Β

A szórható és diszpergálható porokhoz alkalmazott szilárd hordozók normálisan természetes ásványi töltőanyagok, például a kaiéit, a talkum, a kaolin, a montmorillonit vagy az attapulgit. A fizikai tulajdonságok javítása céljából adhatók nagymértékben diszpergált adszorbens polimerek is. A megfelelő granulált adszorbens hordozók porózus típusúak, ilyenek például a habkő, a téglaőrlemény, a szepiolit vagy a bentonit; megfelelő nem adszorbens hordozóanyagok, például a kalcit és a homok. Ezeken kívül nagyszámú, szerves és szervetlen eredetű előgranulált anyag is alkalmazható, elsősorban például a dolomit és porított növényi részek.

A kiszerelésben alkalmazandó aktív komponens természetétől függően a megfelelő felületaktív anyag lehet nem ionos, kationos és/vagy anionos felületaktív anyag, amelynek jó emulzióképző, diszpergáló és nedvesítő tulajdonságai vannak. A „felületaktív anyag” kifejezés vonatkozik a felületaktív anyagok keverékeire is.

A megfelelő anionos felületaktív anyagok lehetnek mind vízoldható szappanok, mind vízoldható szintetikus felületaktív anyagok.

A megfelelő szappanok a nagy szénatomszámú (10-22 szénatomos láncú) zsírsavak alkálifémsói, alkáli foldfémsói vagy helyettesített vagy helyettesítetlen ammóniumsói, így például az olajsav vagy sztearinsav vagy természetes zsírsavkeverékek nátrium- vagy káliumsói. Ilyen természetes zsírsavkeverékek előállíthatok kókuszdióolajból vagy faggyúolajokból. Alkalmazhatók a metil-taurin zsírsavsói is.

Leggyakrabban azonban az úgynevezett szintetikus felületaktív anyagokat alkalmazzuk, elsősorban a zsírsav-szulfonátokat, zsírsav-szulfátokat, szulfonált benzimidazol-származékokat vagy alkil-aril-szulfonátokat.

A zsírsav-szulfonátok és -szulfátok általában alkálifémsók, alkáli földfémsók vagy helyettesített vagy helyettesítetlen ammóniumsók formájában vannak, és 8-22 szénatomos alkilgyökkel bírnak, amelyekbe beszámítjuk az alkilgyökök minden alkil-maradékát; ilyenek például a lignoszulfonsav, a dodecilszulfátok vagy természetes zsírsavakból nyerhető zsíralkoholszulfát keverékek nátrium- vagy kalciumsói. Ezek között a vegyületek között találjuk a zsíralkohol/etilénoxid adduktumok kénsavésztereinek és szulfonsavésztereinek sóit is. A szulfonált benzimidazol-származékok előnyösen 2 szulfonsavcsoportot tartalmaznak, továbbá egy zsírsavgyököt 8-22 szénatommal. Az alkil-aril-szulfonátokra példák lehetnek a dodecil-benzolszulfonsav, dibutil-naftalinszulfonsav, vagy egy naftalin-szulfonsav/formaldehid kondenzációs termék nátrium-, kalciumvagy trietilaminsói. Alkalmasak a megfelelő foszfátok is, például egy p-nonil-fenol és 4-14 mól etilén-oxid adduktumának foszforsav-észterei.

A nem ionos felületaktív anyagok előnyösen alifás vagy cikloalifás alkoholok, vagy telített vagy telítetlen zsírsavak és alkilfenolok poliglikol-éter származékai, ahol az említett származékok 3-30 glikoléter csoportot és az (alifás) szénhidrogéngyökökben 8-20 szénatomot és az alkil-fenolok alkilrészében 6-18 szénatomot tartalmaznak.

További alkalmas nem ionos felületaktív anyagok a polietilénoxid vízoldható adduktumai polipropilén glikollal, etilén-diamin-propilénglikollal és alkil-polipropilénglikollal, amely az alkilláncban 1-10 szénatomot tartalmaz. Ezek az adduktumok 20-250 etilénglikolétercsoportot és 10-100 propilénglikol-étercsoportot tartalmaznak. Ezek a vegyületek általában 1-5 etilénglikol-egységet tartalmaznak egy propilénglikol egységre számítva.

A nem ionos felületaktív anyagokra jó példák a nonil-fenol-polietoxietanolok, a ricinusolaj poliglikol éterek, a polipropilén/polietilén-oxid adduktumok, a tributil-fenoxipolietoxietanol, a polietilénglikol és az oktil-fenoxietoxietanol. A polioxietilén-szorbitan zsírsavéterei és a polioxietilén-szorbitan trioleát szintén alkalmas nem ionos felületaktív anyagok.

A kationos felületaktív anyagok előnyösen kvaterner ammónium sók, amelyek - N-szubsztituensként legalább egy 8-22 szénatomos alkilgyökkel és további szubsztituensekként kisebb szénatomszámú helyettesítetlen vagy halogénezett alkil, benzil, vagy kisebb szénatomszámú hidroxi-alkil-gyökökkel bírnak. A sók előnyösen halogenidek, metil-szulfátok vagy etil-szulfátok formájában vannak, ilyenek például a sztearilmetil-ammónium-klorid és a benzil-di(2-klóretil)-etilammónium-bromid.

A kereskedelmi forgalomban levő, általában alkalmazott felületaktív anyagokat leírják például az alábbi irodalmi helyek: „McCutcheon’s Detergents and Emulsifiers Annual” (1979); valamint Sisely és Wood (1980).

Az agrokémiai kompozíciók általában mintegy 0,1% és mintegy 99%, előnyösen mintegy 0,1% és mintegy 95% és legelőnyösebben mintegy 3% és mintegy 90% közti mennyiségben tartalmaznak aktív komponenst; mintegy 1% és mintegy 99,9%, előnyösen mintegy 1% és mintegy 99%, és legelőnyösebben mintegy 5% és mintegy 95% közti mennyiségben tartalmaznak szilárd vagy folyékony adjuvánst; és mintegy 0% és mintegy 25%, előnyösen mintegy 0,1% és mintegy 25%, és legelőnyösebben mintegy 0,1% és mintegy 20% közti mennyiségben tartalmaznak felületaktív anyagot.

A kereskedelmi termékek általában koncentrátumként vannak kiszerelve, a végső felhasználó általában ezt hígított formában alkalmazza.

A találmány foglalkozik továbbá valamely foszfolipid transzfer fehérje alkalmazásával aktív alkotórészként valamely antipatogén szempontból hatékony, találmány szerinti kompozícióban.

A találmány foglalkozik továbbá valamely találmány szerinti peptid alkalmazásával aktív alkotórészként valamely antipatogén szempontból hatékony, találmány szerinti kompozícióban. Előnyös egy N-terminális végénél olyan hidrofób területet tartalmazó peptid alkalmazása, amely előnyösen az alábbi aminosavak valamelyikét tartalmazza:

(a) Alá Ile Thr Cys Gly Gin Val Ser Ser Alá Leu vagy (b) Alá Ile Ser Cys Gly Gin Val Ser Ser Alá Leu Ser

Pro Cys Ile Ser Tyr Alá Arg Gly Asn Asn Alá

HU 220 115 Β (c) Alá Ile Ser Cys Gly Gin Val Ser Ser Alá Leu Ser Pro Cys Ile Ser Tyr Alá Arg Gly Asn Gly Alá (d) N-terminális aminosavszekvencia, amely lényegében homológ a fenti szekvenciák legalább egyikével. Ezt a peptidet aktív alkotórészként alkalmazzuk valamely találmány szerinti, antipatogén szempontból hatékony kompozícióban.

A találmány további tárgya, hogy eljárást nyújtson a növények védelmére növényi patogének, elsősorban patogén baktériumok és/vagy gombák támadása ellen; az eljárás abban áll, hogy valamely találmány szerinti peptid vagy kompozíció antipatogén szempontból hatékony mennyiségét alkalmazzuk a növényre vagy a növénypatogén környezetébe.

A találmány további tárgya, hogy eljárást nyújtson növénypatogének visszaszorítására, az eljárás abban áll, hogy valamely foszfolipid transzfer fehérje antipatogén szempontból hatékony mennyiségét kifejeződésre késztetjük valamely transzgenikus növényben.

A találmány további tárgya, hogy eljárást nyújtson növénypatogének visszaszorítására; az eljárás abban áll, hogy valamely találmány szerinti fehérje antipatogén szempontból hatékony mennyiségét kifejeződésre késztetjük.

A találmány további tárgya, hogy eljárást nyújtson növénypatogének visszaszorítására; az eljárás abban áll, hogy valamely aktív alkotórész antipatogén szempontból hatékony mennyiségét kifejeződésre késztetjük; az aktív komponens valamely foszfolipotranszfer fehérjét és valamely lítikus peptidet tartalmaz.

A találmány további tárgya, hogy eljárást nyújtson növénypatogének visszaszorítására; az eljárás abban áll, hogy valamely aktív alkotórész antipatogén szempontból hatékony mennyiségét kifejeződésre késztetjük; az aktív komponens tartalmazza a találmány szerinti peptidet.

A találmány további tárgya, hogy eljárást nyújtson növénypatogének visszaszorítására; az eljárás az alábbi lépésekből áll:

a) olyan transzgenikus növényt állítunk elő, amely egy vagy több foszfolipid transzfer fehérjét kódoló rekombináns DNS-t tartalmaz;

b) a transzgenikus növényt arra késztetjük, hogy szintetizáljon egy vagy több foszfolipid transzfer fehérjét.

Ide tartozik egy olyan eljárás is növénypatogének visszaszorítására, amely az alábbi lépésekből áll:

a) olyan transzgenikus növényt állítunk elő, amely egy vagy több SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 5 képletekben bemutatott peptidet kódol; ide értve azokat a peptideket is, amelyek ezekhez szekvencia szerint lényegileg homológok;

b) a transzgenikus növényt arra késztetjük, hogy szintetizáljon egy vagy több, SEQ ID NO:3 - SEQ ID NO: 5 képletben bemutatott peptidet, ideértve azokat a peptideket is, amelyek ezekhez szekvencia szerint lényegileg homológok.

Ide tartozik egy olyan eljárás is növénypatogének visszaszorítására, amely az alábbi lépésekből áll:

a) olyan transzgenikus növényt állítunk elő, amely valamely aktív alkotórész antipatogén szempontból hatékony mennyiségét kódoló rekombináns DNS-t tartalmaz, ahol az aktív alkotórész tartalmaz egy olyan peptidet, amely a SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 5 képletekben van bemutatva, ide értve azokat a peptideket is, amelyek ezekhez szekvencia szerint lényegileg homológok, és tartalmaz valamely lítikus peptidet;

b) a transzgenikus növényt arra késztetjük, hogy szintetizálja egy aktív alkotórész antipatogén szempontból hatékony mennyiségét, ahol az aktív alkotórész tartalmaz egy olyan peptidet, amely a SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO:5 képletekben van bemutatva, ideértve azokat a peptideket is, amelyek ezekhez szekvencia szerint lényegileg homológok, és tartalmaz valamely lítikus peptidet.

Ide tartozik egy olyan eljárás is növénypatogének visszaszorítására, amely az alábbi lépésekből áll:

a) olyan transzgenikus növényt állítunk elő, amely egy vagy több foszfolipid transzfer fehérjét kódoló rekombináns DNS-t tartalmaz;

b) a transzgenikus növényt arra késztetjük, hogy szintetizáljon egy vagy több foszfolipid transzfer fehérjét.

Ide tartozik egy eljárás is transzgenikus növények előállítására, amelyek képesek szintetizálni valamely aktív alkotórészt antipatogén szempontból hatékony mennyiségben; az eljárás abban áll, hogy

a) előállítunk egy olyan transzgenikus növényt, amely foszfolipid transzfer fehérjét és kívánt esetben egy lítikus peptidet kódoló rekombináns DNS-szekvenciákat tartalmaz; vagy

b) előállítunk két vagy több transzgenikus növényt, amelyek foszfolipid transzfer fehérjét és kívánt esetben egy lítikus peptidet kódoló rekombináns DNSszekvenciákat tartalmaz, és az említett növényeket keresztezzük hagyományos nemesítési technikákat alkalmazva.

A találmány további tárgyai közé tartozik egy eljárás is transzgenikus növények előállítására, amelyek képesek szintetizálni valamely aktív alkotórészt antipatogén szempontból hatékony mennyiségben; az eljárás abban áll, hogy a) előállítunk egy transzgenikus növényt, amely egy olyan peptidet kódol, amely a SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 5 képletekben van bemutatva, ide értve azokat a peptideket is, amelyek ezekhez szekvencia szerint lényegében homológok, és kívánt esetben egy lítikus peptidet is kódol; vagy b) előállítunk két vagy több transzgenikus növényt, amely egy olyan peptidet kódol, amely a SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5 képletekben van bemutatva, ide értve azokat a peptideket is, amelyek ezekhez szekvencia szerint lényegében homológok, és kívánt esetben egy lítikus peptidet is kódol, és az említett növényeket keresztezzük hagyományos nemesítési technikákat alkalmazva,

A találmány általános leírása után a jobb megértés céljából kiviteli példákat mutatunk be, amelyek kiegészítik a leírást. Ezek célja csak a pontosabb illusztrálás és nem a korlátozás, hacsak ennek ellenkezőjét nem jelezzük.

HU 220 115 Β

Kiviteli példák

1. példa

Arpanövény növesztése

C. v. Betzes és c. v. Bomi árpafajtákat vermikulitba ültetünk lapos tálcákban (15x30x8 cm). A tálcákat steril vízzel nedvesítjük, és zárt szobában sötétben tartjuk 7 napon át. A szikleveleket és/vagy szárakat eltávolítjuk, folyékony nitrogénben azonnal lefagyasztjuk és -70 °C hőmérsékleten tároljuk.

2. példa

Fehérjetisztítás

2.1. Szövetextrahálás

Mintegy 20 g (friss tömeg) levágott sziklevelet és/vagy szárat megőrlünk porrá folyékony nitrogénnel, mozsarat és mozsártörőt alkalmazva. Az őrölt anyagot 4 térfogat (80 ml) pufferoldattal extraháljuk, amely pufferoldat 0,1 mol/1 trisz. HCl-t és 10 mmol/1 EDTA-t (pH 7,5) tartalmaz.

Az egyesített extraktumokat 5000xg-nél 10 percen át centrifugáljuk 4 °C hőmérsékleten. A felülúszót eldobjuk és az üledéket kétszer extraháljuk 80-80 ml desztillált H₂O-val.

2.2. Sejtfalextrahálás

A H₂O-val végzett extrahálást követően az üledéket 50 ml nagy sótartalmú oldattal extraháljuk, amely 1,5 mol/1 vizes Li₂O-nak felel meg. Az extrakciós keveréket 4 °C hőmérsékleten tartjuk 1 órán át. Az extrakciós keveréket azután 5000 χ g-nél centrifugáljuk 10 percen át 4 °C hőmérsékleten.

A felülúszót megtartjuk, és (a) dializáljuk 5 1 desztillált vízzel szemben olyan membránt alkalmazva, amely visszatartja a >3000 kD-os molekulákat Spectra/Por6; MWCO: 3000; SPECTRUM, Medical Industries, Inc. L. A., USA);

(b) sómentesítjük Sephadex G25 oszlopon (Pharmacia) átengedve, vagy (c) kicsapjuk szilárd ammónium-szulfáttal (43,7 g/100 ml felülúszó).

Ha a fenti (a) és (b) lépést alkalmazzuk, a sómentesített felülúszót fagyasztva szárítással koncentráljuk.

2.3. HPLC-frakcionálás

Az extraktumot, amelyet a fentebb leírtak szerint koncentráltunk (fagyasztva szárítás vagy ammóniumszulfátos kicsapás), újra feloldjuk 0,1% (tömeg/térfogat) trifluor-ecetsavat (TFA) tartalmazó H₂O-ban, majd HPLC-frakcionálásnak vetjük alá. Az alkalmazott kromatográfiás rendszer Ultrapore C-4 oszlopból (Beckman), 126-System Gold Beckman szivattyúból és Beckman UV 166-System Gold detektorból áll. Az UV-kimutatást 214 nm hullámhossznál végezzük. A fenti 1 ml-es frakciót a C-4 oszlopba injektáljuk. Kiinduláshoz a mobil fázis 100% desztillált víz, amely 0,1% (tömeg/térfogat) TFA-t tartalmaz. Az átáramlási sebességet 0,5 ml/percre állítjuk be és szobahőmérsékletet alkalmazunk. Ezt követően az oszlopon 0—>30 (térfogat/térfogat) izopropanol lineáris gradienst állítunk be 180 perc alatt (=90 ml), majd 30->50 (térfogat/térfogat) izopropanol gradiens következik 15 perc alatt (=7,5 ml). 3-10 ml-es frakciókat gyűjtünk, és szárazra koncentráljuk vákuumban Savant Speed Vác Concentrator berendezésben. A frakciókat, amelyek mintegy 96,3 perc (CW 18), 104,4 perc (CW 20), 106,3 perc (CW 21) és 111 perc (CW 22) retenciós idő után eluálódnak, összegyűjtjük és további elemzésnek vetjük alá. A fehérjét Folin és Lowry eljárása szerint (Lowry és munkatársai, 1951), vagy BCA protein Assay Reagent (PIERCE, Rockford, Illinois, USA) alkalmazásával határozzuk meg. A CW 18-nak, CW 20nak, CW 21-nek és CW 22-nek megfelelő csúcsokat egyedi frakcióként összegyűjtjük, a csúcsok felfutó és lefutó részeiből az első és utolsó 20 másodpercet elöntve. Az így kapott fehéijefrakciók három típusú elektroforézissel (savas, bázisos és SDS-PAGE) és N-terminális szekvenciaelemzéssel is homogénnek tűnnek.

2.4. Molekulatömeg

A CW 18 és CW 21 peptidek molekulatömege 8,78 kD, illetve 8,66 kD tömegspektrometriásan meghatározva.

2.5. Aminosav-összetétel

A CW 18, CW 21, CW 20 és CW 22 peptidek aminosav-összetételében az aminosavak relatív arányát az oszlop előtti fenil-izocianátos származékképzés alkalmazásával határozzuk meg Bidlingmeyer és munkatársai (1984) szerint, 24 órás teljes hidrolízis után.

Az 1. táblázatban megadott eredményeket úgy kell érteni, mint az egyes megadott aminosavak (mért) %-át az összes, hasonló módon mért aminosavra vonatkoztatva.

7. táblázat:

A CW 18, CW 21, CW 20 és CW 22 peptidek aminosav-összetétele (gyök/100)

AA (aminosav)	CW 18	CW21	CW20	CW22
Cys	6,2	5,6	6,5	5,5
Asx*	3,9	3,9	5,2	5,2
Glx*	5,0	5,1	4,6	5,4
Ser	H,9	12,6	11,6	11,4
Gly	13,3	12,7	13,0	13,3
His	1,3	-	1,1	-
Arg	6,0	4,1	3,4	3,6
Thr	5,5	2,8	3,2	2,5
Alá	15,9	19,3	19,3	18,9
Pro	6,0	7,9	6,7	6,0
Tyr	3,0	2,1	2,0	2,2
Val	6,4	6,3	6,4	6,8
Ile	5,0	7,1	5,9	5,8
Leu	4,9	4,3	4,6	4,6
Lys	5,7	6,2	6,4	7,7

Asx jelentése Asn vagy Asp Glx jelentése Gin vagy Glu

HU 220 115 Β

2.6. Aminosavszekvenciák

Abból a célból, hogy azonosítsuk a találmány szerinti peptidek N-terminális aminosavszekvenciáját, illetve a komplett aminosavszekvenciáját, automatizált Edman-lebontást végzünk Applied Biosystems 470A gázfázisú szekvenciaelemző berendezésen (Applied Biosystems Inc., Foster City, Kalifornia, USA). A PTH aminosavakat Applied Biosystems 120A PTH elemző berendezés alkalmazásával azonosítjuk.

A CW 21 peptid aminosavszekvenciája a SEQ ID NO:4-gyel azonos. A CW 18 peptid aminosavszekvenciája a SEQ ID N0:3-mal (Bomi), illetve a SEQ ID NO: 5-tel (Betzes) azonos. A CW 20 és CW 22 N-terminális aminosavszekvenciái (12 aminosav) a CW 21 Nterminális aminosavszekvenciájával azonosak.

3. példa

Antipatogén szempontból hatásos, folyékony kompozíciók kiszerelése

Az alábbiakban megadjuk a kompozíciók százalékos arányát (tömegszázalékban).

Oldatok	a	b	c	d
Peptid	80%	10%	5%	95%
Etilénglikol monometil éter	20%	-	-	-
Polietilén glikol 400	-	70%	-	-
N-metil-2-pirrolidon	-	20%	-	-
Epoxidizált kókuszdióolaj	-	-	1%	5%
Petróleumdesztillátutn (forráspont: 160 °C-190 °C)	-	-	94%	-

Ezek az oldatok mikrocseppek formájában való alkalmazáshoz használhatók

4. példa

Antibakteriális mérési eljárások (a) Mikrotitráló lemezeket alkalmazunk, hogy megvizsgáljuk a CW 18 és CW 21 peptideket. A vizsgálandó anyagot (5 pg) feloldjuk vízben és hozzáadjuk 1/3-ra koncentrált N-1 tápközeghez (pH 7,2-7,4; Difco Beef Extráét 1,0 g; Difco Yeast Extráét 2,0 g; Difco Bactopepton 5,0 g; NaCl 5,0 g; vízzel kiegészítve 1000 miig), amelyet előzőleg inokuláltunk C. sepedonicum törzs baktériumaival 10⁴ baktérium/ml koncentrációban; a végső térfogat 150 pl. A vizsgálandó anyag végső koncentrációja a tápközegben 10~⁸ mol/1 és 10^-5 mol/1 közti tartományban van (a látszólagos móltömeget mintegy 5 kD-ra becsülve).

A baktériumok növekedését 48 órás, 25 °C hőmérsékleten végzett inkubálás után értékeljük, 492 nm-nél mérve a tápközeg abszorbanciáját.

Kontroll céljára két standardot alkalmazunk a fenti vizsgálatban, mégpedig az α l/β tionint búza endospermiumból és LT26-tionint árpalevelekből.

Az oldható levél tioninokat úgy készítjük el, ahogyan azt Reimann-Philipp és munkatársai leírták (1989), majd tovább tisztítjuk olyan RP-HPLC programot alkalmazva, amelyet fentebb CW 18-ra és CW 21re leírtunk. A homogén LT26 szekvenciaelemzését elvégezzük a 28. aminosavig; úgy találjuk, hogy ez azonos azzal a szekvenciával, amely a D63 klón cDNSéből kikövetkeztethető (Bohlmann és Apel, 1987).

Az endospermium eredetű tioninokat a petroléteres extraktum kicsapásával nyerjük ki, amint ezt Garcia-Olmedo és társai leírták; ezután tovább tisztítjuk RP-HPLC-vel, amint fentebb leírtuk.

Az antibakteriális vizsgálat eredményeit az 1. ábrában adjuk meg.

(b) CW 18-at, CW 21-et, CW 20-at és CW 22-t szükség szerint feloldunk vízben. C. sepedonicumot (ennek szinonim neve Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus) és Pseudomonas solanacearumot egyenként inokulálunk 10⁴ cfú/ml végső koncentrációban (cfú=colony forming unit=telepképző egység) mikrotitráló lemezekbe 150 pl végső koncentrációban [100 pl peptid + 50 pl tápközeg (Oxoid nutrient broth)]. A 28 °C hőmérsékleten végzett inkubálás 16-24 órája után a növekedést mérjük, mégpedig az abszorbancia leolvasásával 492 nm-en ELISA lemezleolvasón.

2. táblázat

CW 18, CW21, CW 20, CW 22 és tionin aktivitása C. sepedonicum és P. solanacearum ellen (EC-50 gátlás+)

	C. sepedonicum	P. solanacearum
Fehérje	ppm	μΜ*	ppm	μΜ*
árpa
CW 18	1	0,1	3	0,3
CW21	3	0,3	5	0,6
CW20	L5	0,2
CW 22	<1	<0,1	3	0,3
Tionin	5	1	5	1

⁺EC-50: az a peptidmennyiség, amely a baktérium növekedésének 50%-os gátlásához szükséges a kontrollal összehasonlítva *a molekulatömeget 9000-nek becsülve (c) A baktériumokat mikrotitráló lemezekben tenyésztjük. A peptideket hozzáadjuk a növesztő tápközeghez. A növekedést, mint az optikai sűrűség emelkedését a 2. és 3. napon mérjük az inokulálástól számítva. A kiindulási inokulum 10^{5 * *} baktérium/ml. A peptidek koncentrációja 100 ppm.

3. táblázat

A Xanthomonas orizae növekedésének gátlása (a kontroll százalékában)

	CW 18	CW 20	CW21	CW 22	Kontroll
2. nap	73	27	40	39	100
3. nap	77	33	29	39	100

HU 220 115 Β

5. példa

Gombaellenes (antifungális) vizsgálat (a) A gombaellenes vizsgálatot analóg módon hajtjuk végre, mint a fentebb leírt antibakteriális vizsgálatot. NI tápközeg helyett borsó tápközeget alkalmazunk, amelyet előzőleg inokuláltunk 104-10⁶ vizsgálandó gombaspórával. A vizsgálandó anyagok végső koncentrációja a tápközegben 2000, illetve 200 és 0,2 ppm közti tartományban van a vizsgálandó organizmustól függően. A lemezeket nedves kamrában, 23 °C hőmérsékleten, rázógépen, sötétben végzett 48 órás inkubálás után értékeljük.

A patogén növekedését a tápközeg 595 nm-nél mért abszorbanciájával határozzuk meg.

A kezeletlen kontrollokat összehasonlítva a CW 18 és a CW 21 erős gombaellenes aktivitást mutat több gombapatogén ellen.

(b) Spórákat gyűjtünk 25 °C hőmérsékleten burgonyaglükóz agar (Difco) lemezen nőtt 8 napos tenyészetekből. A spórákat Broekaert és munkatársai (1990) szerint gyűjtjük, és 20%-os glicerinben tároljuk -20 °C hőmérsékleten. A növekedésgátlási vizsgálatban gombaspóraszuszpenziót (10 000 spóra/ml) növesztünk 25 °C hőmérsékleten, mikrotitráló üregenként 67,5 pl burgonyaglükóz tápközegen, és inkubáljuk a szükség szerint vízben feloldott fehérjékkel (teljes térfogat 75 μΐ). A tenyészet 540 nm-nél mért abszorbanciájának mértéke lineáris korrelációban van a gomba biomasszával széles optikai sűrűség (OD) tartományon belül. A 25 °C hőmérsékleten végzett inkubálás 26-44 órája után a növekedést meghatározzuk, az abszorbanciát 540 nm-nél mérve ELISA mikrotitráló lemezleolvasón. Az eredményeket a 4. és 5. táblázatokban adjuk meg.

4. táblázat

A CW 18, CW 21, CW 20, CW 22 és tionin aktivitása Fusarium solani ellen (EC-50 értékek*)

Fehérje	F. solani
Ppm	μΜ*
CW18	45	5
CW21	30	3
CW 20	200	20
CW 22	100	10
Tionin	10	2

⁺EC-50: az a peptidmennyiség, amely a gomba növekedésének 50%-os gátlásához szükséges, a kontrollal összehasonlítva.

*a molekulatömeget 9000-re becsülve.

5. táblázat

CW 21-et tartalmazó kompozíció és tionin aktivitása Fusarium solani ellen (EC-50+ értékek)

Fehére	ppm	μΜ*
10 ppm CW 21 + tionin	4	0,75
20 ppm CW 21 + tionin	1	0,2

+EC-50: az a peptidmennyiség, amely a gomba növekedésének 50%-os gátlásához szükséges, a kontrollal összehasonlítva *a molekulatömeget 9000-re becsülve

6. példa

Agrobacterium transzformálása

Binér vektort transzformálunk A. tumefaciens LB4404 törzsbe az alábbi eljárással. Az Agrobacterium törzset 30 °C hőmérsékleten egy éjszakán át növesztjük 5 ml LBGM tápközegben [50% L-tápközeg, 50% mannit-glutamát tápközeg (Garfmkel és Nester, 1980)]. Az 5 ml-es tenyészetet hozzáadjuk 250 ml LBGM-hez, és élénken rázatjuk addig, amíg a tenyészet sűrűsége eléri a 0,6 OD (optikai sűrűség) értéket 600 nm hullámhossznál. A sejteket azután centrifugálással összegyűjtjük 8000xg-nél és újra szuszpendáljuk 5 ml LBGMben. 200 μΐ sejtet adunk 0,2-1 pg binér plazmid DNShez LBGM-ben, és a keveréket azonnal lefagyasztjuk száraz jég/etanolos fürdőben. 5 perc múlva a csövet 37 °C hőmérsékletű vízfürdőbe helyezzük 5 percre, majd 2 ml LBGM-et adunk hozzá. A szuszpenziót 30 °C hőmérsékletű vízfürdőben tartjuk 2-3 órán át, majd a sejteket centrifugálással összegyűjtjük. A sejteket újra szuszpendáljuk minimális térfogatú LBGMben, majd szelektív tápközegre szélesztjük (LBGM lemezek 100 pg/ml gentamicinnel). A telepet 30 °C hőmérsékleten 2-3 nap múlva tűnnek fel.

Pozitív telepeket választunk ki, és ezek pozitivitását Southem-folt-elemzéssel igazoljuk. Ezeket alkalmazzuk a további növénytranszformációs kísérletekhez.

7. példa

Stabil transzformálás és transzgenikus növények regenerálása

Növényi szöveteket transzformálunk a fentebb leírt vektorokkal bármely, a szakterületen ismert technikával. Az ilyen, DNS növényi sejtekbe való átviteléhez alkalmazott módszerek között találjuk például a növények, növényrészek vagy sejtek közvetlen fertőzését vagy együtt tenyésztését A. tumefacienssel (Horsch és munkatársai, 1985; Morton, 1984), a protoplasztok kezelését exogén DNS-sel olyan eljárások segítségével, amelyeket Paszkowski és munkatársai (1984); a 164 575 lajstromszámú európai szabadalmi leírás; Shillito és munkatársai (1985); Potrykus és munkatársai (1985); Lörz és munkatársai (1985); Fromm és munkatársai (1987); a 2 140 822 lajstromszámú nagybritanniai szabadalmi leírás; és Negrutiu és munkatársai (1987) ismertetnek; az inkubálást polietilénglikollal (PEG) (Negrutiu és munkatársai, 1987); a mikroinjekciót [Reich és munkatársai (1986 a és b)]; és a mikrolövedékes bombázást (Klein és munkatársai, 1987).

A. Levéllemez-transzformálás dohánynövényen

Agrobacteriumot növesztünk 18-24 órán át glutamátsó tápközegen, amelynek a pH-ját 5,6-ra állítjuk be és kiegészítjük 0,15% mannittal, 50 pg/ml kanamicinnel, 50 pg/ml spektinomicinnel és 1 mg/ml streptomicinnel, majd felhígítjuk 0,2 OD600 értékre azonos, de antibiotikum nélküli tápközeggel. A baktériumokat azután tovább növesztjük 3-5 órán át, majd 0,2-0,4 OD600 értékre hígítjuk a levéllemezek inokulálásához. A levéllemezek 5-7 mm-es lemezek, amelyeket Nicotiana tabacum cv. xanthi leveleiből szűrünk ki; ezeket a levele13

HU 220 115 Β két előzőleg aszeptikusán növesztettük GA7 tartályokban, Horsch és munkatársai eljárását követve (1985) bizonyos módosításokkal.

A levéllemezeket 2 napig 0,7%-os agaron tartjuk fenn, amely Murashige és Skoog féle „nagyobb” és „kisebb” sókat (MS), 1 mg/1 benzil-adenint és 1 mg/ml anaftalin-ecetsavat tartalmaz; ezután ezeket átvisszük azonos tápközegre, amely azonban tartalmaz még 50 pg/ml kanamicint, 100 pg/ml karbenicillint és 100 pg/ml mefaxint is. A hajtásokat, amelyek a lemezeken kialakulnak, szaporítjuk, amíg hat levélkét kapunk a hajtáscsúcsok altenyésztésével GA7 tartályokban olyan tápközegen, amely 50 pg/ml kanamicint is tartalmaz.

A növénykéket olyan tápközegen gyökereztetjük, amely nem tartalmaz hormont, de tartalmaz 50 pg/ml kanamicint; ezután talajra visszük át és fitotronban felerősítjük, majd üvegházba visszük át kémiai szabályozószerekkel végzett indukciós kezeléshez. Az érés után a magokat learatjuk.

B. Transzgenikus dohánykallusz és növények előállítása

Agrobacteriumot alkalmazunk a levéllemezekből (A) képződő kallusz transzformálására. A kanamicint tartalmazó MSBN szelekciós tápközegen képződő kalluszt kalluszt növesztő tápközegen tartjuk fenn, amely MS „nagyobb” és „kisebb” sókat, Fe-EDTA-t (Gibco # 500-1117; 4,3 g/1), MS vitaminokat, 100 mg/1 mioinozitot, 20 g/1 szacharózt, 2 mg/1 naftalin-ecetsavat és 0,3 mg/ml kinetint tartalmaz.

A kalluszt transzgenikus növények regenerálására használhatjuk fel olyan módon, hogy kalluszdarabokat viszünk át MSBN tápközegre és az „A” fejezetben leírt eljárást alkalmazzuk.

C. Sárgarépa transzformálása

Agrobacteriumot növesztünk olyan módon, ahogyan ezt az „A” fejezetben leírtuk. A baktériumokat ezután - 0,2-0,4 OD600 értékre hígítva - felhasználhatjuk felületén sterilezett sárgarépából hasított lemezkék inokulálására.

Abból a célból, hogy a sárgarépákat felületükön sterilezzük, ezeket meghámozzuk, és 20 percre 10%-os Chlorox-oldatban áztatjuk. A sárgarépákat steril vízzel öblítjük, 5 mm-es darabokra szeleteljük, és vizes agarra helyezzük alapoldalával felfelé. A lemezke felső felületére azután 20-50 baktériumot viszünk fel.

D. Napraforgó transzformálása

Agrobacteriumot növesztünk olyan módon, ahogyan ezt az fejezetben leírtuk. A baktériumokat ezután 0,2-0,4 OD600 értékre hígítva - felhasználjuk napraforgó növények szárának inokulálására. A napraforgó növények szárát az alábbiak szerint készítjük elő.

Napraforgómagokat 10 percen át öblítünk 10% Captannal, majd 10 percen át öblítünk 10% Chloroxban, ezután leöblítjük steril vízzel. A magburkolatokat eltávolítjuk, és a magokat csíráztatjuk 0,7%-os vizes agaron sötétben 3 napon át, majd ezeket 23 °C hőmérsékletre beállított laboratóriumi inkubátorba helyezzük 12 óra világos - 12 óra sötét világítási periódus mellett. A növénykéket egy héten át növesztjük, majd a szárakat lefejezzük, és a hasított szárfelületeket a baktériumokkal inokuláljuk.

E. Paradicsom transzformálása

Agrobacteriumot növesztünk, amint ezt az „A” fejezetben leírtuk. A baktériumokat - 0,2-0,4 OD600 értékre hígítva - azután paradicsom növénykék szárainak inokulálására használjuk fel az alábbiak szerint.

Paradicsommagokat áztatunk 20 percig 10%-os Chlorox-ban, és steril vízzel leöblítjük. A magokat 0,7%-os vizes agaron csíráztatjuk sötétben 3 napon át, majd laboratóriumi inkubátorba helyezzük, amely 23 °C hőmérsékletre és 12 óra fény - 12 óra sötétség időritmusra van beállítva. A növénykéket 1 héten át növesztjük, majd lefejezzük, és a hasított szárfelületeket a baktériumokkal inokuláljuk.

F. Gyapot transzformálása

Agrobacteriumot növesztünk, amint ezt az „A” fejezetben leírtuk. A baktériumokat - 0,2-0,4 OD600 értékre hígítva - azután gyapotsziklevelek inokulálására használjuk fel az alábbiak szerint.

A gyapotmagokat 20 percen át áztatjuk 10%-os Chlorox-ban, és steril vízzel leöblítjük. A magokat sötétben csíráztatjuk 0,7%-os vizes agaron. A növénykéket 1 héten át növesztjük, mielőtt a baktériumokat inokulálnánk a sziklevél felszínére.

G. Zea mays elit beltenyésztett Fűnk 2717 vonal speciális kallusztipusának előállítása

Beltenyésztett Fűnk 2717 kukoricavonal növényeit melegházban virágzásig növesztjük, majd önbeporozzuk. 2-2,5 mm hosszúságú embriókat tartalmazó éretlen csöveket távolítunk el a növényről és sterilizáljuk 20 percen át 10%-os Chlorox-oldatban. A magokból az embriókat aszeptikusán kiemeljük, és az embrió tengelyével lefelé 0,24% (tömeg/térfogat) Gelrite-tel szilárdított OMS tápközegre helyezzük, amely 0,1 mg/1 2,4-D-t, 6% (tömeg/térfogat) szacharózt és 25 mmol/1 1-prolint tartalmaz (kiindulási tápközeg). A tenyésztést 2 héten át sötétben végezzük, a scutellumon kifejlődő kalluszt az embrióról eltávolítjuk és B5 tápközegre (Gamborg és munkatársai, 1968) helyezzük, amely tartalmaz még 0,5 mg/1 2,4-D-t, és 0,24% (tömeg/térfogat) Gelrite-vel van szilárdítva. A kalluszt minden második héten újra tenyésztjük friss tápközegen. Összesen nyolc hét után az embriót az iniciációs tápközegre helyezzük, és a speciális típusú kalluszt jellegzetes morfológiája alapján azonosítjuk. Ezt a kalluszt tovább tenyésztjük azonos tápközegen. További 2 hét múlva a kalluszt átvisszük 2 mg/1 2,4-D-t is tartalmazó és Gelrite-vel szilárdított N6 tápközegre, és sorozatban újabb és újabb tenyésztéseket végzünk.

H. Zea mays elit beltenyésztett Fűnk 2717 vonal szuszpenziós tenyészetének előállítása

A „G” fejezetben leírt kalluszt altenyésztjük összesen legalább 6 hónapon át. Az altenyésztéshez kiválasztott kallusz viszonylag nem nyálkás, szemcsés, és nagyon morzsalékos, úgyhogy ez elkülöníthető kis egyedi sejtaggregátumokká folyékony tápközegekre való helyezéshez. Az olyan tenyészeteket, amelyek nagy, kiterjedt sejteket tartalmaznak, nem tartjuk meg. A Zea mays elit beltenyésztett Fűnk 2717 speciális kalluszának mintegy 500 mg-os aliquotját 125 ml-es Delong palackban levő 30 ml N6 tápközegbe visszük át, amely i

HU 220 115 B tartalmaz még 2 mg/12,4-D-t is. 1 hetes, 26 °C hőmérsékleten, forgó rázógépen (130 fordulat/perc; 2,5 cm kitérés), sötétben végzett tenyésztés után a tápközeget friss tápközegre cseréljük. A szuszpenziókat ilyen módon ismét altenyésztjük egy héten át. Ekkor a tenyészeteket átvizsgáljuk, és azokat, amelyek nem mutatnak nagyszámú kiterjedt sejtet, megőrizzük. Azokat a szuszpenziós tenyészeteket, amelyek nagy, kiterjedt sejtekkel bíró aggregátumokat tartalmaznak, eldobjuk. Az előnyös szövet citoplazmásan sűrűn osztódó sejtaggregátumokból áll, amely jellegzetesen lágyabb felülettel bír, mint a szokásos típusú sejtaggregátumok. A megőrzött tenyészetek legalább 50% olyan sejttel bírnak, amelyek ezeket a kisebb aggregátumokat képviselik. Ez a kívánt morfológia. Ezeknek a szuszpenzióknak a növekedési sebességük is gyors, kettőződési idejük kevesebb, mint egy hét. A szuszpenziós tenyészeteket hetenként altenyésztjük, 0,5 ml PCV-t (packed cell volume: állandó sejttérfogat egy pipettában) átvíve 25 ml friss tápközegbe. Az ilyen módon végzett altenyésztés 4-6 hete után a tenyészetek egyhetes altenyésztése 2-3-szoros növekedést idéz elő. Azokat a tenyészeteket, amelyekben a sejtek több mint 75%-a kívánt morfológiájú, további altenyésztésre megtartjuk. A vonalakat úgy tartjuk fenn, hogy altenyésztéshez mindig azokat a lombikokat választjuk ki, amelyek tartalma a legjobb morfológiát mutatja. Bizonyos esetekben időszakonként (kéthetenként) szűrést alkalmazunk 630 pm pórusméretű rozsdamentes acélszűrőn keresztül, hogy növeljük a tenyészetek diszpergáltságát, de ez a lépés nem feltétlenül szükséges.

I. Protoplasztok előállítása Zea mays szuszpenziós tenyészeteiből

A „H” fejezet szerint előállított szuszpenziós tenyészetből 1-1,5 ml PCV-t inkubálunk 10-15 ml, szűréssel sterilezett keverékbe, amely az alábbi alkotórészekből áll: 4%(tömeg/térfogat)cellulázRS 1%(tömeg/térfogat) Rhozymevel KMC sóoldatban (8,65 g/1 KC1, 16,47 g/1 MgCl₂.6H₂O, 12,5 g/1 CaCl₂.H₂O, és 5 g/1 MES; pH 5,6). Emésztést végzünk 30 °C hőmérsékleten lassan forgó táblán, 3-4 órán át. A készítményt fordított fázisú mikroszkóp alatt vizsgáljuk protoplasztkibocsátásra. A kibocsátott protoplasztokat az alábbiak szerint gyűjtjük össze. A készítményt átszűrjük 100 pm lyukméretű szitán, majd 50 pm lyukméretű szitán. A protoplasztokat a szitákon keresztül mossuk olyan térfogatú KMC-oldattal, amely az enzimoldat eredeti térfogatának felel meg. 10 ml protoplasztkészítményt helyezünk minden egyes eldobható műanyag centrifugacsőbe, és 1,5-2 ml 0,6 mol/literes szacharózoldatot [pH 5,6-ra pufferolva 0,1% (tömeg/térfogat) morfolinetán-szulfonsavval (MES és KOH)] rétegzünk alá. A csövet 60-100 χ g-n centrifugáljuk 10 percen át, és a határrétegen csíkot képező protoplasztokat pipetta segítségével összegyűjtjük és friss csőbe helyezzük. A protoplasztkészítményt újra szuszpendáljuk 10 ml friss KMC-sóoldatba, majd 5 percen át centrifugáljuk 60-100xg-n. A felülúszót eltávolítjuk és eldobjuk, és a protoplasztokat gyengéden újra szuszpendáljuk a megmaradó cseppben, majd fokozatosan 10 ml 13/14 erősségű KMC-oldatot adunk hozzá. Miután 5 percig újra centrifugáltuk, a felülúszót ismét eltávolítjuk, és a protoplasztokat újra szuszpendáljuk 6/7 erősségű KMColdatban. A számláláshoz kiveszünk egy aliquotot, és a protoplasztokat ismét ülepítjük centrifúgálással. A protoplasztokat újra szuszpendáljuk 10⁷/ml koncentrációban KM-8p tápközegben vagy 0,5 mol/1 mannitoldatban, amely 6 mmol/1 MgCl₂-t tartalmaz, vagy más megfelelő tápközegben, amely a transzformáláshoz alkalmas.

J. Zea mays protoplasztok transzformálása elektroporációval

a. ) A hősokk kivételével az összes lépést szobahőmérsékleten hajtjuk végre (22-28 °C). Az „I” fejezet utolsó lépésében az újraszuszpendálást 0,5 mol/literes mannitoldatban végezzük, amely 0,1% (tömeg/térfogat) MES-t és 6 mmol/1 MgCl₂-t tartalmaz. Ennek a szuszpenziónak az ellenállását Dialóg Electroporator (DIA-LOG GmbH, D-4000 Düsseldorf 13, Németország) kamrájában mérjük, és 1-1,2 kG-ra állítjuk be 300 mmol/literes MgCl₂-oldat alkalmazásával. A protoplasztokat hősokknak vetjük alá olyan módon, hogy a mintát tartalmazó csövet 45 °C hőmérsékletű vízfürdőbe merítjük 5 percre, majd jégen lehűtjük szobahőmérsékletre. 4 g linearizált plazmidot, amely egy növényekben szelektálható higromicinrezisztencia-gént [például amelyet Rothstein és munkatársai (1987) leírnak], vagy kiméragén-konstrukciókat tartalmaz, és 20 pg borjútimusz-hordozó DNS-t adunk ezen szuszpenzió 0,25 ml-es aliquotjaihoz. A protoplasztokhoz hozzáadunk 0,125 ml 24%-os (tömeg/térfogat) PEG-oldatot (molekulatömeg: 8000), amely 30 mmol MgCl₂-t is tartalmazó 0,5 mol/literes mannitoldatban van. A keveréket alaposan, de gyengéden összekeverjük, és 10 percen át inkubáljuk. A mintát az elektroporátor kamrájába visszük át, és a mintáknak háromszor adunk impulzust 10 másodperces időközökben, a kezdeti feszültség 1500; 1800; 2300 vagy 2800 Vem-*, és egy exponenciális lefutási idő 1 sec.

A protoplasztokat az alábbiak szerint tenyésztjük.

A mintákat 6 cm-es Petri-csészékben szélesztjük szobahőmérsékleten. További 5-15 perc múlva 3 ml KM-8p tápközeget adunk hozzá, amely tartalmaz még 1,2% (tömeg/térfogat) SeaPlaque agarózt és 1 mg/1 2,4-D-t is. Az agarózt és a protoplasztokat összekeverjük, és a tápközeget gélesedni hagyjuk.

b. ) a fenti a.) eljárást ismételjük egyszer vagy többször az alábbi módosításokkal:

(1) A protoplasztkészítmény ellenállását 0,5-0,7 kG-ra állítjuk be.

(2) Az alkalmazott PEG 4000 molekulatömegű PEG.

(3) Nem adunk PEG-et a kísérlethez, vagy csak fél térfogat 12%-os (tömeg/térfogat) PEG-et adunk.

(4) Az impulzusokat 3 másodperces időközökben adjuk.

(5) Az elektroporáció után a protoplasztokat olyan csészékben szélesztjük, amelyek 16 °C hőmérsékletre hűtött lemezre vannak elhelyezve.

(6) Az elektroporációs lépés után a protoplasztokat csövekbe helyezzük, mossuk 10 ml 6/7 erősségű

HU 220 115 Β

KMC-oldattal vagy W5 oldattal (amely 380 mg/1

KCl-t, 18,375 g/1 CaCl₂, 2H₂O-t, 9 g/1 NaCl-ot, és g/1 glükózt tartalmaz; pH 6,0), majd 60 χ g-vel percen át centrifugáljuk, újra szuszpendáljuk

0,3 ml KM tápközegben, majd szélesztjük, mint az „a” eljárásban.

(7) A kísérlethez nem adunk borjútimusz-hordozó

DNS-t.

K. Zea mays-protoplasztok transzformálása PEG-gel végzett kezeléssel.

(a) Az „I” fejezet utolsó lépésében a protoplasztokat újra szuszpendáljuk 0,5 ml mannitoldatban, amely 12-30 mmol/1 MgCl₂-ot is tartalmaz. A hősokkot 45 °C hőmérsékleten 5 percen át végezzük, amint ezt már a „J” fejezetben leírtuk. A protoplasztokat aliquotokra osztjuk szét a transzformáláshoz centrifúgacsövekbe, csövenként 0,3 ml szuszpendált protoplasztot helyezve. A következő 10 perc során az alábbiakat adjuk a csövekhez: DNS (mint a „J” fejezetben), és PEGoldat [6000 molekulatömeg; 40% (tömeg/térfogat); tartalmaz 0,1 mol/1 Ca(No₃)₂-t és 0,4 mol/1 mannitot; pH 8-9, KOH-val beállítva], hogy a végső PEG-koncentráció 20% legyen. Az aliquotokat 30 percig inkubáljuk alkalmanként gyengéden rázatva, majd a protoplasztokat Petri-csészébe helyezzük (0,3 ml eredeti protoplasztszuszpenzió 6 cm átmérőjű lemezenként), és tenyésztjük, mint a „J” fejezetben.

(b) az „a” eljárást megismételjük, és a protoplasztokat mossuk 30 perces inkubálás után, és ötször hozzáadunk 0,3 ml W5 oldatot 2-3 perces időközönként. A protoplasztszuszpenziót centrifugáljuk, a felülúszót eltávolítjuk, és a protoplasztokat a „J” fejezet (a) része szerint tenyésztjük.

(c) Az „a” és „b” eljárást ismételjük meg azzal a módosítással, hogy a PEG végső koncentrációja 13 és 25% (tömeg/térfogat) között van.

L. A kalhtsz regenerálása protoplasztokból

A lemezeket, amelyek a protoplasztokat tartalmazzák agarózban, sötétbe helyezzük 26 °C hőmérsékletre. 14 nap után telepek kezdenek kialakulni a protoplasztokból. A telepeket tartalmazó agarózt átvisszük 9 cm átmérőjű Petri-csésze felületére, amely csésze 30 ml N6 tápközeget tartalmaz 2 mg/1 2,4-D-vel kiegészítve és 0,24% (tömeg/térfogat) Gelrite-tel megszilárdítva. Erre a tápközegre a későbbiekben úgy utalunk, mint 2N6-ra. A kalluszt tovább tenyésztjük sötétben 26 °C hőmérsékleten, és kalluszdarabokat altenyésztünk minden két hétben friss, szilárd 2N6 tápközegben.

M. Zea mays transzformált kalluszának kiválasztása

Az „L” fejezet szerinti eljárást ismételjük azzal a módosítással, hogy 100 mg/1 vagy 200 mg/1 higromicin B-t adunk a 2N6 tápközeghez abból a célból, hogy kiválasszuk a transzformált sejteket.

N. Kukoricanövény regenerálása (a) A kalluszt 2N6 tápközegre helyezzük fenntartáshoz, DN6 tápközegre (N6 tápközeg 2,4-D nélkül) és N61 tápközegre (amely olyan N6 tápközeget tartalmaz, amelyben van még 0,25 mg/12,4-D és 10 mg/1 kinetin) helyezzük a regenerálás beindításához. Az ON6 és N61 tápközegeken növekedő kalluszt fényben növesztjük (16 óra/napfény, 840-8400 lux fehér, fluoreszcens lámpából). Az N61 tápközegen növekvő kalluszt két hét után átvisszük ON6 tápközegre, mivel a megnyújtott idő N61 tápközegen káros. A kalluszt minden két hétben altenyészteni kell, még ha ezt a kalluszt ugyanolyan összetételű tápközegre kell átvinni. A növénykék mintegy 4-8 hét múlva tűnnek fel. Amikor a növénykék elérik a legalább 2 cm-es magasságot, átvisszük GA7 tartályokban levő ON6 tápközegre. A 2-4. hétben gyökerek alakulnak ki, és amikor a gyökerek elég jól kialakultnak látszanak, hogy megtámasszák a növekedő növényt, a növénykéket földbe visszük át, tőzeges cserépbe, és 4-7 napig tompított fényben tartjuk. Gyakran segít, ha egy áttetsző műanyag sapkát helyezünk 2-3 napra a növénykék fölé, hogy segítsük azok megerősödését. Amikor a növények szilárdan állnak, ezeket úgy kezeljük, mint normális kukoricanövényeket, és üvegházban érettségig növesztjük. Abból a célból, hogy utódnövényeket kapjunk, a növényeket önbeporozzuk vagy vad típussal keresztezzük.

(b) Az (a) pont szerinti eljárást ismételjük azzal a különbséggel, hogy 100 mg/1 vagy 200 mg/1 higromicin B-t is adunk a kallusz fenntartásához alkalmazott tápközeghez.

8. példa

Transzgenikus T3 magvonalak kifejlesztése

A transzgenikus növényeknél a genotípus megjelölést a következő konvenció szerint használjuk: a transzformációs eseményből adódó kiindulási növényt, amely a szövettenyészetből nőtt ki, nevezzük TI növénynek. Azokat a növényeket, amelyek a TI növények természetes virágainak önbeporzásából alakulnak ki, T2-nek nevezzük, ez új genotípust szerez a normális meiotikus folyamat során. Hasonlóképpen azokat a magokat, amelyek T2 növények (vagyis T2 magokból kinövő növények) természetes virágainak önbeporzásából alakulnak ki, T3-nak nevezzük stb.

Transzgenikus növényeket (TI) érettségig növesztünk. A virágokat hagyjuk önbeporzódni, és a maghüvelyeket normális kiszáradás után összegyűjtjük. Az egyes egyedi növényekből való magokat összegyűjtjük és külön-külön tároljuk. Az egyes magtételeket genetikai szegregációs elemzéssel vizsgáljuk, hogy meghatározzuk a kanamicinrezisztencia biológiai utat hordozó mendeli lókuszok számát. T2 magokat felületükön sterilezünk olyan módon, hogy többször mossuk 2%-os hipklorit oldattal, amely 0,02% (térfogat/térfogat) Tween 20-at is tartalmaz, majd leöblítjük steril vízzel. Mintegy 150 magot helyezünk 0,2 xMS sókkal (Murashige és Skoog, 1962) telített szűrőpapírra, amely 150 g/ml kanamicint is tartalmaz. A csírázás és a sziklevelek mintegy 5 mm-re kiterjedése után meghatározzuk a normális zöld (kan-r) és az elhalványodott (kan-s) sziklevelek arányát. Csak azokat a T2 magtételeket tartjuk meg további elemzésre, amelyek mintegy 3:1 (kan-r: kan-s) hányadost mutatnak; ez a szegregációs arány egyedül olyan mendeli lókuszt jelez, amely kanamicin marker gént hordoz.

4-10 növényt növesztünk érettségig az egyes T2 magkészletekből (azonos feltételeket alkalmazva,

HU 220 115 Β mint amelyeket fentebb leírtunk) és hagyjuk önbeporzódni. A T3 magösszegyűjtés, magsterilezés és magcsírázás ugyanúgy történik, ahogyan fentebb a T2 magoknál leírtuk. A T3 magtételeket, amelyekben a vizsgált magok 100%-a (n= 150) kan-r fenotípust mutat, homozigótának becsüljük a biológiai út szempontjából (vagyis egy homozigóta T2 szülőnövényből erednek), és fenotípusos analízishez megtartjuk.

Ezután hagyományos nemesítési technikákat alkalmazunk, hogy ugyanabba a növénybe bejuttassunk minden gént.

Irodalmi hivatkozások

Benzon J. R., Hare P. E.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 619-622. (1975)

Bemhard W. R., Somerville C. R.: Arch. Biochem. Biophys. 269, 695-697. (1989)

Bemhard W. R., Thoma S., Botella J., Somerville

C. R.: Plánt Physiol. 95, 164-170. (1991)

Bevan M. W., Flavell R. B., Chilton M.-D.: Natúré 304, 184-187.(1983)

Bidlingmeyer B. A., Cohen S. A., Tarvin T. L.: J. Chrom. 336, 93-104. (1984)

Bohlmann H., Apel K.: Mól. Gén. Génét. 207, 446-454. (1987)

Bouillon P., Drischel C., Vergnolle C„ Duranton H., Káder J-C.: Eur. J. Biochem. 166, 387-391. (1987)

Broekaert W. F., Terras F. R. G., Cammue Β. P. A., Vanderleyden J.: FEMS Microbiol. Lett. 69, 55-60. (1990)

Campos F. A. P., Richardson M.: FEBS Lett. 167, 221-225.(1984)

Christou P., McCabe D. E., Swain W. F.: Plánt Physiol. 87, 671-674. (1988)

Crossway A., Hauptli H., Houck C. M., Irvine J. M., Oakes J. V., Perani L. A.: BioTechniques 4, 320-334. (1986)

Datta S. K., Peterhans A., Datta K., Potrykus I.: Bio/Technology 8, 736-740. (1990) van den Elzen P. J. M., Townsend 1, Lee K. Y., Bedbrook J. R.: Plánt Mól. Bioi. 5, 299-392. (1985)

Erlich H. A. (szerkesztő): PCR Technology, Stockton Press (kiadó), New York (1989)

Fromm M., Callis J., Taylor L. P., Walbot V.: Methods in Enzymology 153, 351-366. (1987)

Fromm Μ. E., Morrish F., Armstrong C., Williams R., Thomas J., Klein T. M.: Bio/Technology 8, 833-839. (1990)

Garcia-Olmedo F. Sotelo I., Garcia-Faure R.: Anales Inst. Nac. Invest. Agro. 17, 433-443. (1968)

Gordon-Kamm W. J„ Spencer T. M., Mangano M.

L., Adams T. R., Daines R. J., Start W. G., O’Brien J. V., Chambers S. A., Adams W. R., Willetts N. G., Rice T. B., Mackey C. J., Krueger R. W., Kausch A. P., Lemaux P. G.: The Plánt Cell 2, 603-618. (1990)

Hinchee M. A. W., Connor-Ward D. V., Newell C. A., McDonnell R. E., Sato S. J., Gasser C. S., Fischhoff

D. A., Re D. B., Fraley R. T., Horsch R. B.: Biotechnology 6, 915-922. (1988)

Hohn T., Richards K., Lebeurier G.: a „Gene cloning in organisms other than E. coli” (Génklónozás

E. colitól eltérő mikroorganizmusokban) című közleményben; Current Topics in Microbiology and Immunology 96, 193-220. (1982)

Horsch R. B., Fry J. E., Hoffmann N. L., Eichholtz

D. , Rogers S. G., Fraley R. T.: Science 227, 1229-1231.(1985)

Jefferson R. A.: Plánt Molecular Biology Reporter 5, 387-405. (1987)

Joersbo M., Brunstedt J.: Plánt Cell Reports 9, 207-210. (1990)

Kaeppler H. F., Gu W., Somers D. A., Rines H. W., Cockbum A. F.: Plánt Cell Reports 9, 415-418. (1990)

Klein T. M., Fromm M., Weissinger A., Tömés D., Schaaf S., Sletten M., Sanford J. C.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4305-4309. (1988)

Klein T. M., Gradziel T., Fromm Μ. E„ Sanford J. C.: Biotechnology 6, 559-563. (1988)

Klein T. M., Kronstein L., Sanford J. C., Fromm M.

E. : Plánt Physiol. 91, 440-444. (1989)

Klein T. M., Wolf E. D., Wu R., Sanford J. C.: Natúré 327, 70-73. (1987)

Lathe R.: J. Mól. Bioi. 183, 1-12. (1985)

Lehrer R. I., Szklarek D., Ganz T., Selsted Μ. E.: Infection and Immunity 52, 902-904. (1986)

Lörz H., Baker B., Schell J.: Mól. Gén. Génét. 199, 178-182. (1985)

Lowry Ο. H., Rosenbrough N. J., Farr A. L., Randall R. J.: J. Bioi. Chem. 193, 265-275. (1951)

Maniatis T., Fritsch E. F., Sambrook J.: Molecular cloning, a laboratory manual (Molekuláris klónozás, laboratóriumi kézikönyv) Cold Spring Harbor Laboratory (kiadó), Cold Spring Harbor (1982)

Marton L.: a „Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants” (Növények sejttenyészete és szomatikus sejtgenetikája) című kiadványban, 1, 514-521. (1984)

Mauch F., Mauch-Mani B., Boller T.: Plánt Phys. 88, 936-942. (1988)

McBride K. E., Summerfelt K. R.: Plánt Mól. Bioi. 14, 269-276. (1990)

McCabe D. E., Swain W. F., Martinell B. J., Christou P.: Bio/Technology 6, 923-926. (1988)

McCutcheon’s Detergents and Emulsifiers Annual (McCutcheon detergens- és emulgeálószer kézikönyve), MC Publishing Corp. (kiadó), Ringwood, New Jersey (1979)

Molina P., Arencibia A., Gutiérrez C., Fuentes A., Menéndez E., Grenidge V., de la Ríva G., Selma-Houssein G.: Advances in Gene Technology: Feeding the World in the 21^st Century (Fejlemények a géntechnológiában: a világ táplálása a 21. században); 60. Miami Winter Symposium (1992)

Morelli G., Nagy F., Fraley R. T., Rogers S. G. ChuaN. H. : Natúré 315, 200-204. (1985)

Mullis K. B., Faloona F. A.: Meth. Enzymol. 155, 335-350. (1987)

Mundy J., Rogers J. C.: Planta 169, 51-63. (1986)

Murashige T., Skoog F.: Physiol. Plánt. 15, 473-497. (1962)

Negrutiu L., Shillito R., Potrykus I., Biasini G., Sala F.: Plánt Mól. Bioi. 8, 363-373. (1987)

HU 220 115 Β

Neuhaus és munkatársai: Theor. Appl. Génét. 75, 30-36. (1987)

Paszkowski I, Shillito R. D., Saul M., Mandak V., Hohn T., Hohn B., Potrykus I.: EMBO J. 3, 2717-2722. (1984)

Petit és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 202, 388. (1986)

Pierce D. A., Mettler I. J., Lachmansigh A. R., Pomeroy L. M., Weck E. A., Mascarenhas D.: „Plánt Gene Systems and their Biology” (Növényi génrendszerek és 10 biológiájuk), 301-310, Alán R. Liss, Inc. (kiadó) (1987)

Potrykus I., Paszkowski J., Saul M. W., Petruska J., Shillito R. D.: Mól. Gén. Génét. 199, 169-177. (1985)

Reich T. J., Iyer V. N., Haffner M., Holdbrook L.

A., Miki B. L.: Can. J. Bot. 64, 1259-1267. (1986)

Reich T. J., Iyer V. N., Miki B. L.: Biotechnology 4, 1001-1004. (1986)

Reimann-Philipp U., Behnke S., Batschauer A., Schafer E., Apel K.: Eur. J. Biochem. 182, 283-289. (1989) 20

Reimann-Philipp U., Schrader G., Martinoia E., Barkholt V., Apel K.: J. Bioi. Chem. 264, 8978-8984. (1989)

Riggs C. D., Bates G. W.: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83, 5602-5606. (1986)

Sanford J. C., Klein T. M., Wolf E. D., Allén N.: Particulate Science and Technology 5, 27-37. (1987)

Schlumbaum A., Mauch F., Vögeli U., Boller T.: Natúré 324, 365-367. (1986)

Shillito R. D., Saul M. W., Paszkowski J., Müller 30 M., Potrykus I.: Biotechnology 3, 1099-1103 (1985)

Sisely és Wood: „Encyclopedia of Surface Active Agents” (A felületaktív anyagok enciklopédiája), Chemical Publishing Co. (kiadó), New York, (1980)

Sossountzov L., Ruiz-Avila L., Vignols F., Jolliot A., Arondel V., Tchang F., Grosbois M., Guerbette F., Migniac E., Delseny M., Puigdomenéch P., Káder J-C.: Plánt Cell 3, 923-933. (1991)

Sterk P., Booij H., Schellekens G. A., van Kammen A., de Vries S. C.: Plánt Cell 3, 907-921. (1991) Southern Ε. M.: J. Mól. Bioi. 98, 503-517. (1975) Svensson B. és munkatársai: Carlsberg Rés Commun 57, 493-500. (1986)

Takishima K., Watanabe S., Yamada M., Mamiya G.: Biochim. Biophys Acta 870, 248-255. (1986)

Tchang F., This P., Stiefel V., Arondel V., Morch M-D,, Pages M., Puigdomenech P., Grellet F., Delseny M., Bouillon P., Huet J-C., Guerbette F., Beau15 vais-Cante F., Duranton H., Pemollet J-C., Káder J-C.: J. Bioi. Chem. 263, 16 849-16 855. (1988)

Thompson C. J., Mowa R. N., Tizard R., Crameri R., Davies J. E., Lauwereys M., Botterman J.: EMBO J. 6, 2519-2523. (1987)

Torres-Schumann S., Godoy J. A., Pintor-Toro J. A.: Plánt Mól. Bioi. 18, 749-757. (1992)

Velten J., Velten L., Hain R., Schell J.: EMBO J. 3, 2723-2730. (1984)

Yamada M.: Plánt Cell Physiol. 33, 1-6. (1992)

Wang Y-C. és munkatársai. Plánt Mól. Bioi. 77, 433-439. (1988)

Weising K., Schell J., Kahl G.: Annual Rév. Génét. 22, 421-477. (1988)

EP 164,575 szabadalmi leírás

EP 434,616 szabadalmi leírás

EP 462,065 szabadalmi leírás

WO 89/04 371 szabadalmi közrebocsátási irat

US 4,945,050 szabadalmi leírás

GB 2,140,822 szabadalmi leírás

Szekvencialista SEQIDNO: 1 Szekvenciatípus: peptid

A szekvencia hosszúsága: 11 aminosav
Alá Ile Thr Cys SEQIDNO: 2 Szekvenciatípus: peptid	Gly	Gin Val	Ser	Ser	Al a	Leu
A szekvencia hosszúsága:	: 23 aminosav
Alá Ile Ser Cys	Gly	Gin Val	Ser	Ser	Al a	Leu	Ser	Pro	Cy s
Ile Ser Tyr Alá SEQIDNO: 3 Szekvenciatípus: peptid	Arg	Gly Asn	Gly	Al a
A szekvencia hosszúsága:	: 90 aminosav
Alá Ile Thr Cys	Gly	Gin Val	Ser	Ser	Al a	Leu	Gly	Pro	Cy s	14
Alá Alá Tyr Alá	Lys	Gly Ser	Gly	Thr	Ser	Pro	Ser	Al a	Gly	28
Cys Cys Ser Gly	Val	Lys Arg	Leu	Al a	Gly	Leu	Alá	Arg	Ser	42
Thr Alá Asp Lys	G1 n	Alá Thr	Cys	Arg	Cys	Leu	Lys	Ser	Val	56
Alá Gly Aly Tyr	Asn	Alá Gly	Arg	Al a	Al a	Gly	Ile	Pro	Ser	70
Arg Cys Gly Val	Ser	Val Pro	Tyr	Thr	Ile	Ser	Al a	Ser	Val	84
Asp Cys Ser Lys SEQ IDNO: 4 Szekvenciatípus: peptid	Ile	Hi s								90
A szekvencia hosszúsága:	: 90 aminosav
Alá Ile Ser Cys	Gly	Gin Val	Ser	Ser	Al a	Leu	Ser	Pro	Cy s	14
Ile Ser Tyr Alá	Arg	Gly Asn	Gly	Al a	Lys	Pro	Pro	Al a	Al a	28

HU 220 115 Β

Cys

Cy s

Ser

Gly

Va 1

Lys

Ar

g

Leu

Al a

Gly

Al a

Al a

Gin

Ser

42

Thr

Al a

Asp

Ly s

Gin

Al a

Al

a

Cy s

Lys

Cys

lle

Lys

Ser

Al a

56

Al a

Gly

Gly

Leu

Asn

Al a

Gl

y

Ly s

Al a

Al a

Gly

lle

Pro

Ser

70

Me t

Cys

Gly

Val

Ser

Val

Pr

0

Tyr

Al a

I le

Ser

Al a

Ser

Val

84

Asp

Cy s

Ser

Lys

lle

Arg

90

SEQIDNO: 5 Szekvenciatípus: peptid

A szekvencia hosszúsága	: 90 aminosav
Alá lle Thr Cys	Gly Gin Val	Ser	Ser	Al a	Leu	Gly	Pro	Cy s	14
Alá Alá Tyr Alá	Lys Gly Alá	Gly	Val	Asn	Pro	Ser	Al a	Gly	28
Cys Cys Ser Gly	Val Lys Arg	Leu	Al a	Gly	Leu	Al a	Arg	Ser	42
Thr Alá Asp Lys	Gin Alá Thr	Cys	Arg	Cys	Leu	Lys	Ser	Val	56
Alá Gly Aly Tyr	Asn Alá Gly	Arg	Alá	Al a	Gly	lle	Pro	Ser	70
Arg Cys Gly Val Asp Cys Ser Lys SEQIDNO: 6 Szekvenciatípus: peptid A szekvencia hosszúsága	Ser Val Pro lle His : 23 aminosav	Tyr	Thr	lle	Se r	Al a	Ser	Val	84 90
Alá lle Ser Cys Alá Arg Gly Asn	Gly Gin Val Asn Alá	Ser	Ser	Alá	Leu	Ser	Pro	Cy s	lle

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (13)

1. Antipatogén peptid, azzal jellemezve, hogy az aláb- 25 bi, SEQ ID NO: 3 aminosavszekvenciát tartalmazza:

Al a lle Thr Cys Gly Gin Val Ser Ser Al a Leu Gly Pro Cy s 14 Al a Al a Tyr Al a Ly s Gly Ser Gly Thr Ser Pro Ser Al a Gly 28 Cys Cys Ser Gly Val Ly s Arg Leu Al a Gly Leu Al a Arg Ser 42 Thr Al a Asp Lys Gin Al a Thr Cy s Arg Cys Leu Ly s Ser Va 1 56 Al a Gly Aly Tyr Asn Al a Gly Arg Al a Al a Gly lle Pro Ser 70 Arg Cy s Gly Val Ser Val Pro Tyr Thr lle Ser Al a Ser Va 1 84 Asp Cy s Ser Lys lle Hi s 90

vagy az alábbi, SEQ ID NO: 5 aminosavszekvenciát tartalmazza:

Al a lle Thr Cys Gly Gin Va 1 Ser Ser Al a Leu Gly Pro Cy s 14 Al a Al a Tyr Al a Ly s Gly Al a Gly Val Asn Pro Ser Al a Gly 28 Cy s Cy s Ser Gly Val Lys Arg Leu Al a Gly Le u Alá Arg Ser 42 Thr Al a Asp Lys Gin Al a Thr Cys Arg Cys Leu Lys Ser Val 56 Al a Gly Aly Tyr Asn Al a Gly Arg Al a Al a Gly lle Pro Ser 70 Arg Cys Gly Val Ser Val Pro Tyr Thr lle Ser Al a Ser Va 1 84 Asp Cys Ser Lys lle Hi s 90

vagy az alábbi, SEQ ID NO: 4 aminosavszekvenciát tartalmazza:

Al a lle Ser Cys Gly Gin Val Ser Ser Al a Leu Ser Pro Cy s 14 lle Ser Tyr Al a Arg Gly Asn Gly Al a Lys Pro Pro Al a Al a 28 Cys Cys Ser Gly Val Lys Arg Leu Alá Gly Al a Al a Gin Ser 42 Thr Al a Asp Lys Gin Al a Al a Cys Lys Cy s lle Lys Ser Alá 56 Al a Gly Gly Leu Asn Al a Gly Ly s Al a Al a Gly lle Pro Ser 70 Me t Cy s Gly Val Ser Val Pro Tyr Al a lle Ser Al a Ser Val 84 Asp Cy s Ser Lys lle Arg 90

2. DNS-szekvencia, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti valamelyik peptidet kódolja.

3. Antipatogén kompozíció, azzal jellemezve, hogy valamely, a mezőgazdaságipeptid-készítményekben általánosan alkalmazott megfelelő hordozóval együtt olyan peptid antipatogén szempontból hatékony mennyiségét tartalmazza, amely N-terminális végén az alábbi aminosavszekvenciák egyikét tartalmazó hidrofób területtel bír:

(a) Alá lle Thr Cys Gly Gin Val Ser Ser Alá Leu vagy (b) Alá lle Ser Cys Gly Gin Val Ser Ser Alá Leu Ser Pro Cys lle Ser Tyr Alá Arg Gly Asn Asn Alá (c) Alá lle Ser Cys Gly Gin Val Ser Ser Alá Leu Ser Pro Cys lle Ser Tyr Alá Arg Gly Asn Gly Alá (d) egy olyan N-terminális szekvencia, amely homológ a fenti szekvenciák legalább egyikével.

HU 220 115 Β

4. A 3. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként egy antipatogén peptidet tartalmaz, amely magában foglalja a SEQ ID NO: 3, vagy a SEQ ID NO. 5 vagy a SEQ ID NO: 4 aminosavszekvenciát.

5. Antipatogén kompozíció, azzal jellemezve, hogy a mezőgazdaságipeptid-kiszereléseknél általánosan alkalmazott megfelelő hordozóval együtt valamely aktív alkotórész antipatogén szempontból hatékony mennyiségét tartalmazza, ahol az aktív alkotórész egy foszfolipotranszfer fehérjét és egy lítikus peptidet tartalmaz.

6. Az 5. igénypont szerinti antipatogén kompozíció, azzal jellemezve, hogy a mezőgazdaságipeptid-kiszereléseknél általánosan alkalmazott megfelelő hordozóval együtt valamely aktív alkotórész antipatogén szempontból hatékony mennyiségét tartalmazza, ahol az aktív alkotórész valamely, az 1. igénypont szerinti fehérjét és egy lítikus peptidet tartalmaz.

7. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy az aktív alkotórész komponensei szinergikusan hatásos mennyiségben vannak jelen.

8. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy a lítikus peptid tionin.

9. Eljárás növények védelmére növénypatogének támadása ellen, azzal jellemezve, hogy egy foszfolipid transzfer fehérje antipatogén szempontból hatékony mennyiségét a növényre vagy a növénypatogén környezetébe juttatjuk.

10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti peptid antipatogén szempontból hatékony mennyiségét a növényre vagy a növénypatogén környezetébe juttatjuk.

11. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 3-8. igénypont szerinti antipatogén kompozíciót a növényre vagy a növénypatogén környezetébe juttatjuk.

12. A 9-11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nevezett növénypatogén valamely patogénbaktérium és/vagy -gomba.

13. A 9-11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antipatogén kompozíciót profilaktikusan vagy gyógyító jelleggel alkalmazzuk.