JP2001512020A

JP2001512020A - 植物における抗微生物ペプチド遺伝子の発現、および複数の植物病原体に対する耐性を創製するためのその使用

Info

Publication number: JP2001512020A
Application number: JP2000505305A
Authority: JP
Inventors: フランツィーヌスミス、; アランディー．ブローワーズ、; エック、ジョイスヴァン; ジョンサンフォード、
Original assignee: サンフォードサイエンティフィックインコーポレイテッド
Priority date: 1997-07-31
Filing date: 1998-07-31
Publication date: 2001-08-21
Also published as: AU739960B2; WO1999006564A1; EP0990033A1; US6235973B1; CA2299615A1; AU8682098A

Abstract

(57)【要約】本発明は、抗微生物ペプチド、それらをコード化する核酸構築物、植物細胞を形質転換させる方法、および抗微生物ペプチドの遺伝子を発現するトランスジェニック植物組織を提供し、それにより植物病原体に対する耐性の亢進を示すものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、植物において発現した抗微生物ペプチドの遺伝子、特にマガイニン
（Ｍａｇａｉｎｉｎ）およびＰＧＬクラスのペプチドの遺伝子により、植物病原
体に対して驚くほど向上した耐性を有するトランスジェニック植物に関する。

【０００２】（背景技術）近年、植物を含む多くの有機体は、ペプチドをその宿主の防御戦略の成分とし
て利用することが広く認識されてきている（ＨａｎｃｏｃｋおよびＬｅｈｒｅｒ
、ＴｒｅｎｄｓＩｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１６：８２−８８（１９
８８）またはＢｒｏｅｋａｅｒｔら、ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎ
ＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅｓ１６：２９７−３２３（１９９７）参照）。
これらの広域抗生物質ペプチドは、グラム陰性およびグラム陽性細菌、真菌およ
び原生動物に対して活性であることが示されている。抗微生物活性を有する植物
由来および非植物由来（例えば両生類および昆虫）抗微生物ペプチド双方のトラ
ンスジェニック植物における過剰発現は、穀物植物においてペスト耐性を付与す
る手段として、ある人々により勧められてきた。しかし、抗微生物ペプチドを発
現するトランスジェニックタバコ植物について記載された、刊行された報告では
、概して失望する結果が示された（Ｆｌｏｒａｋら、ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＲ
ｅｓ．４：１３２−１４１（１９９５））。数例において、急速なペプチド分解
が観察され、抗微生物ペプチドは、植物細胞内に有意量まで蓄積できなかった。
この理由から、およびまた植物での発現時に抗微生物ペプチドにより奏効される
潜在的な植物毒性効果に関する重大な懸念から、植物科学者はこの技術を積極的
に遂行しなかった。

【０００３】抗微生物ペプチドは、その構造（例えば直鎖対環状）、そのサイズ（２０−４
５アミノ酸）およびその起源（例えば、昆虫、両生類、植物）に基づき、多くの
カテゴリーに分類できる。しかし、その見かけの多様性にもかかわらず、数多く
の防御関連ペプチドが、非常に塩基性で且つ両親媒性の構造を形成できるという
共通の特徴を有する。これらの統一された特徴により、ほとんどのペプチドは、
病原体細胞膜の直接的な溶解により作用すると考えられることが示唆される。そ
の塩基性構造により、細胞膜との相互作用が容易になり、その両親媒性の性質に
より、それらが膜内に取り込まれ、最終的にはその構造を破壊することができる
。

【０００４】アフリカツメガエル、Ｘｅｎｏｐｕｓｌａｅｖｉｓのカエル皮膚分泌物は、
特に豊富な抗生物質ペプチド源であることが発見された（ＢｅｖｉｎｓおよびＺ
ａｓｌｏｆｆＡｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：３９５−４１４（１９
９０））。公知のペプチドは、マガイニン、ＰＧＬ^ａ、キセノプシン（ｘｅｎｏ
ｐｓｉｎ）およびセルレインを含む。マガイニン１および２は、非常に密接に関
連しており、各々の長さは２３残基であって、システインを全く含まず、両親媒
性αヘリックスを形成する。ＰＧＬ^ａは、より大きい前駆体からプロセス化され
た小ペプチドであり、性質はカチオン性および両親媒性の両方である（Ａｎｄｒ
ｅｕら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４９：５３１−５３５（１９８５））
。それは、期待されたカルボキシル基ではなく、ＣＯＯＨ−末端アミド基を含む
という、幾分まれな特徴を有する。さらに、マガイニン２（しかし、マガイニン
１ではない）およびＰＧＬ^ａは、互いに相乗的に相互作用し、抗細菌活性レベル
を亢進することができることが報告されている（米国特許第５，２５４，５３７
号）。マガイニン／ＰＧＬペプチドは、カエルにおいて共進化し、これは相乗作
用を説明し得る。ＭａｌｏｙおよびＫａｒｉ、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ３７、
１０５−１２２（１９９５）は、とりわけ、マガイニンおよびＰＧＬクラスのペ
プチドを記載する。

【０００５】昆虫はまた、種々の防御関連ペプチドを保持することが実証されている（Ｂｏ
ｍａｎおよびＨｕｌｔｍａｒｋ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１：１０
３−１２６（１９８７））。ガおよびハエのセクロピン（ｃｅｃｒｏｐｉｎ）は
、カエル由来ペプチドよりも僅かに大きく（３１−３９残基）、複数のアルギニ
ンおよびリジン残基の存在のために塩基性であり、ゆえに、陰性荷電脂質二重層
と強く相互作用する。これらのペプチド研究により、それらはヒンジ領域により
Ｃ−末端α−ヘリックスドメインに接続されたＮ−末端α−ヘリックス領域を形
成することが示された。

【０００６】デフェンシン（Ｂｒｏｅｋａｅｒｔら、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１０８：１３５３−１３５８（１９９５）参照）と呼ばれる、他の抗微生物ペプチドが
、ダイコン（Ｔｅｒｒａｓら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ．７：５７３−５８８（１
９９５））およびオオムギ（Ｍｅｎｄｅｎｅｚら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．１９４：５３３−５３９（１９９０））から単離され、これは、より複雑な３
次元構造を特徴とし、システインで安定化された３重の逆平行βシートをα−ヘ
リックスと共に含む。Ｔｅｒｒａｓら（１９９５）は、ダイコンＡＦＰ２タンパ
ク質を過剰発現するトランスジェニックタバコにおいて、アルテルナリア（Ａｌ
ｔｅｒｎａｒｉａ）による感染に対し非常に良好なレベルで保護されたことを報
告した。しかし、有意レベルの疾病耐性の検出には、トランスジェニック植物に
おけるＡＦＰ２ペプチドの域値レベル（これは容易に得られなかった）が必要と
された。

【０００７】天然に存在するペプチドに加えて、欠失、置換および可変の鎖長誘導体を示す
広範な一連の合成類似体が、構造／活性相関研究のために製造された。予期した
通り、多くのこれらの合成変異体は、細菌および真菌に対して抗微生物活性の増
加を示した。さらに、場合によっては、微生物に対する合成抗微生物ペプチドの
効力が劇的に増加しただけでなく、抗微生物活性のスペクトルもまた広がった。

【０００８】トランスジェニック植物における抗微生物ペプチドの発現に関する報告はかな
り限られており、到達した結論は一致していない。Ｍｏｎｔａｎｅｌｌｉおよび
Ｎａｓｃａｒｉ，Ｊ．ＧｅｎｅｔｉｃＢｒｅｅｄ．４５：３０７−３１６（１
９９１）は、セクロピン遺伝子をジャガイモに導入し、新鮮な組織から調製した
抽出物に関連した抗細菌活性を示したが、全植物の耐性は実証されなかった。Ｈ
ｉｇｈｔｏｗｅｒら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔ１３：２９５−２
９９（１９９４）は、セクロピン遺伝子をタバコに導入した後の細菌性病原体に
ついて、類似の失望する結果を報告した。対照的に、Ｃａｒｍｏｎａら、Ｐｌａ
ｎｔＪ．３：４５７−４６２（１９９３）およびＪａｙｎｅｓら、Ｐｌａｎｔ
Ｓｃｉ．８９：４３−５３（１９９３）は、α−チオニンおよびシバ（Ｓｈｉ
ｖａ）−１（修飾セクロピン）を発現するトランスジェニックタバコ植物は、細
菌性病原体による感染に対してより耐性であることを観察した。発現された抗微
生物ペプチドの遺伝子により植物病原体に対して向上した耐性を有するトランス
ジェニック植物が、明らかに必要とされている。特に、マガイニンおよびＰＧＬ ^ａクラスに属するペプチドを、この点に関して試験する必要がある。

【０００９】（発明の開示）本発明は、抗微生物ペプチド、特にマガイニンおよびＰＧＬクラスのペプチド
、およびペプチドをコード化する遺伝子および他の核酸構築物を提供する。特に
、本発明に係るペプチドは、細菌、真菌および植物原形質を含む、植物病原微生
物に対して効果的である。本発明はまた、植物組織を、かかるペプチドをコード
化する核酸構築物で形質転換させることにより、植物組織植物に抗微生物耐性を
付与する方法を提供する。さらに、本発明により、広範囲の微生物に対して耐性
を有するトランスジェニック植物組織が提供される。本質的に、本発明の抗微生
物ペプチドの１以上を発現するように形質転換された任意の植物は、広範囲の微
生物、特に細菌および真菌に対して耐性を顕現する。

【００１０】本発明の以前には、マガイニンおよびＰＧＬクラスの抗微生物ペプチドが、植
物において、真菌性病原体並びに細菌性病原体に対して耐性を付与するか否かが
不確かであった。本明細書で示されるように、このクラスのペプチドは、高いと
いえるほどの抗真菌特性をもたない。本発明により提供される重要な利点は、マ
ガイニンおよびＰＧＬクラスのペプチドはカエルから誘導され、脊椎動物および
哺乳動物毒性の低いことが知られており、そしてマガイニンクラスペプチドは医
薬的使用の歴史を有する、というこれらの事実から生じる。

【００１１】本発明の代表的な、しかしこれに制限されない発見は、以下のものを含む。

【００１２】１）抗−植物病原性細菌活性に加えて、強力な抗−植物病原性真菌活性を保持
する抗微生物ペプチド（特に、マガイニンおよびＰＧＬクラスのペプチドマガイ
ニン２、ＭＳＩ−９９、ＭＳＩ−５５およびＰＧＬ、そしてまたＤ５−Ｃ）；２）特定の病原体に対して特に効果的な抗微生物ペプチド（例えば、ＭＳＩ−
９９およびＤ５−Ｃは、真菌、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａに対して特に活性であ
る）；３）強力なプロモーター（例えば、Ｅ３５Ｓ、ＵＢＱ３およびＵＢＱ１０）に
融合でき、トランスジェニック植物において高いペプチド蓄積レベルをもたらす
、抗微生物ペプチドおよび特にマガイニンおよびＰＧＬクラスのペプチドをコー
ド化する合成遺伝子；４）花弁組織に非常に高度に導入遺伝子産物を発現する、ＵＢＱ３プロモータ
ー；５）抗微生物ペプチドを、細胞から外におよび細胞内空間へと効果的に標的化
する、エンドウビシリンシグナルペプチド配列；６）高レベルの抗微生物ペプチド（特にマガイニンおよびＰＧＬクラスのペプ
チド）を発現し、真菌および細菌（Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓお
よびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓなどの種々の細菌、およびＢｏｔｒｙｔｉｓ、Ｐｈ
ｙｔｏｐｈｔｈｏｒａおよびウドンコ病菌などの種々の真菌）の両方を含む広範
な植物病原体に対し、有意なレベルの耐性を示すトランスジェニック植物；７）本発明のペプチドは、現在までに調査された全トランスジェニック植物種
において非常に類似した作用を示し（例えば、ペチュニア、フクロソウ、ポイン
セチア、およびリシアンサス（ｌｉｓｉａｎｔｈｕｓ））、類似の広域耐性を与
える；８）高レベルで発現された時に、植物原形質による感染に耐性、すなわち以前
には決して得られなかったクラスの耐性を付与する本ペプチド；９）本ペプチドは、より強力で広範なレベルの耐性を得るために組合せて使用
できる；１０）２つの特異的なペプチドであるマガイニン２およびＰＧＬは、インビト
ロにおいて広範な植物病原体に対し相乗的に作用し、前もって共発現させた場合
にも、植物病原体（特に真菌）に対して相乗作用を顕現し、疾病耐性レベルを亢
進させる；１１）この相乗作用により、より少ない全量ペプチドを含むが同一またはより
高いレベルの疾病耐性を有する、トランスジェニック植物の回収が可能となり、
従って、耐性系を同定するために、これら２つのペプチドを共発現する、より少
ない数のトランスジェニック植物のスクリーニングが可能となる（単一の抗微生
物ペプチドのみを発現する植物と比較した場合）；１２）各ペプチドを、亜植物毒性レベルで異なる細胞画分において発現させる
ことにより（例えば、あるペプチドは細胞質ゾルに局在し、その他は細胞外また
は植物色素体に発現する）、上記の相乗作用を最大限に利用する方法；もし病原
体攻撃の間に細胞膜がその完全性を失うならば、次いで画分化したペプチドは自
由に相互作用（相乗作用的に）でき、侵入病原体を殺滅する；１３）本ペプチドを使用して、線虫およびウイルスなどの他の植物害虫を標的
化できる；１４）本抗微生物ペプチドの遺伝子は、植物色素体において発現できるか、ま
たはペプチドはシグナルペプチドを利用してそこに運ばれうる；１５）抗微生物ペプチド発現遺伝子は、他の疾病耐性遺伝子と協力して、より
強力で、より広範で、より持続的な耐性を達成するために使用できる；１６）抗微生物ペプチド活性が、病原体の制御に十分なほど高いが依然として
植物上での副作用が全くないほど低いように、「発現の窓」を植物内で達成でき
る。

【００１３】前記は、単に本発明のある態様を要約したものであり、本発明をこれに制限す
る意図はなく、またそのように解釈すべきではない。本明細書で列挙した全ての
特許、特許出願および他の刊行物は、その全体を引用することによりここに援用
される。

【００１４】（発明を実施するための最良の形態）第一の態様において、本発明は、植物病原性真菌および植物病原性細菌の両方
に対して活性である、一連の優れた抗微生物ペプチド（あるいはまた「溶解」ペ
プチドとしても知られている）を提供する。本発明に係る好ましい抗微生物ペプ
チドは、マガイニンおよびＰＧＬクラスのペプチドである。これらのペプチドは
特に、インビトロで活性である。本発明者らは、本明細書において、宿主植物組
織には明らかな植物毒性効果をもたらすことなく、トランスジェニック植物組織
において疾病制御に効果的なペプチドレベルが達成されることを実証する。ペプ
チドは、種々の植物で発現された場合、細胞質ゾルまたは細胞内空間のいずれか
に高レベルで蓄積する。本発明に係るペプチドは、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ、Ｐｈｙｔ
ｏｐｈｔｈｏｒａおよびウドンコ病菌などの種々の真菌や、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓなどの種々の細菌を含む広
域植物病原体に対する、並びに植物原形質に対する感染への増加した耐性、すな
わち以前には決して達成されなかったクラスの耐性、を植物に付与する。

【００１５】本発明のマガイニンおよびＰＧＬクラスのペプチドは、ＭａｇａｉｎｉｎＰ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（ｍａｇａｉｎｉｎｓおよびＰＧＬ^ａ）により提供されるマガイニンおよびＰＧＬ^ａペプチドから誘導された。これら
を、広範囲の細菌および真菌植物病原体に対する抗微生物活性について評価した
。ペプチドの一次アミノ酸配列は、配列表で示される。我々は、Ｄｅｍｅｔｅｒ
ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより提供されたペプチド由来の１つのセク
ロピンクラスのペプチドと、マガイニンおよびＰＧＬクラスの抗微生物ペプチド
とを比較した。

【００１６】本発明のインビボで発現されたマガイニン／ＰＧＬ型ペプチドは、天然に見ら
れるペプチドと異なる。それらはその天然対と、すなわち、Ｎ末端Ｍｅｔ残基を
有することにより異なる。さらに、ＰＧＬは、インビボ合成の結果として生じた
特徴的な−ＣＯＯＨ基をそのＣ末端に含み、一方、天然に存在するＰＧＬ^ａは、
前駆体タンパク質からのプロセシングの結果生じたＣ末端アミドを有する。マガ
イニンペプチドそれ自体が小さいため、これらの差異は、一見、比較的小さいよ
うに見えるが、かかる小さな変化はペプチド特性に深遠な影響を及ぼすことがで
きる。したがって、もし存在した場合、かかる変化（この結果、ペプチドの荷電
が変化する）がペプチドの抗微生物特性にどのような影響を与えるのかを、合理
的に予測することができない恐れがある。

【００１７】ＭＳＩ−９９およびＭＳＩ−５５は、それぞれ、マガイニン２およびＰＧＬの
置換誘導体である。マガイニン２とＭＳＩ−９９の間のアミノ酸差異としては、
ＭＳＩ−９９において８位（配列表に示した番号を使用）のＬｙｓのＨｉｓによ
る置換、および１９位のＬｙｓのＧｌｙによる置換、およびマガイニン２におい
て２２位のＭｅｔの代わりに存在するＭＳＩ−９９のＬｅｕ残基、が見られる。
ＰＧＬおよびＭＳＩ−５５の一次アミノ酸配列は有意に異なるが、推定される両
親媒性αヘリックス構造は非常に類似している。ペプチドは化学的に合成され、
均一になるまで精製された。

【００１８】Ｄ５−Ｃは、セクロピンＢの合成誘導体である。本明細書で実証したように、
Ｎ末端メチオニンが付加されたＤ５−Ｃペプチドは、植物疾病耐性の工学操作に
使用される、例外的に効果的なセクロピンペプチドである。これは、我々の知る
最善のセクロピンクラスのペプチドである。

【００１９】重要なことには、我々は、マガイニンクラスのペプチドは、植物疾病耐性の亢
進において同等またはより良好であることを示す。マガイニン２ペプチド（Ｎ末
端にメチオニンが付加）はＤ５−Ｃと同じく効果的であり、ＭＳＩ−９９は多く
の有機体において、より良好である。同様に、我々は、Ｎ末端にメチオニンが付
加し、Ｃ末端にアミド基がないＰＧＬクラスペプチドは、特に効果的であること
を示す（すなわち、ＭＳＩ−５５）。最後に、我々は、既に公知のインビトロの
マガイニン２およびＰＧＬの相乗作用は、Ｎ末端にメチオネインが付加されＣ末
端にアミド基がなくても、非常に効果的であることを示した。この強力な相乗作
用を明確に活用して、より高いレベルの疾病耐性を達成することができる。

【００２０】第一の態様による本発明は、細胞質ゾルに局在するように設計されたペプチド
、並びに、植物組織の細胞外空間に分泌および局在するように設計されたペプチ
ドを提供する。好ましい実施形態において、本発明に係るペプチドは、マガイニ
ン２（「Ｍａｇ２」）、ＰＧＬ、ＭＳＩ−５５およびＭＳＩ−９９により表され
例示される、マガイニンおよびＰＧＬクラスのペプチドである。好ましい細胞質
ゾル局在ペプチドは、配列番号２、６、１０および１４のものである。本発明の
細胞外局在ペプチド（細胞質ゾル局在対応物の名称に「*Ｓ」を添えることにより示される、例えばＭＳＩ−９９*Ｓ）は、細胞からの抗微生物ペプチドの分泌を容易にするシグナルペプチドをさらに含む。好ましいシグナルペプチドは、エ
ンドウビシリンシグナルペプチドである。好ましい細胞外局在ペプチドは、配列
番号４、８、１２、１６および１８のものである。

【００２１】本明細書で記載し実証したように、本発明のこの態様のペプチドは、抗微生物
性である。それらは、ペプチドを発現する植物組織上に微生物耐性を付与するに
有用である。本明細書で使用したように、簡潔化のために、「植物組織」は個々
の植物細胞および多細胞植物組織（全植物を含む）を意味する。このインビボ用
途の他に、このペプチドはまた、植物細胞の微生物感染に関与する生物学的プロ
セスの研究における研究手段として、インビトロにおいても有用である。

【００２２】本発明に係るペプチドは、固相合成法並びに（および好ましくは）ペプチドを
コード化する核酸構築物で形質転換されたトランスジェニック細胞（例えば植物
細胞）による発現を含む、当該分野で認められた技術を用いて任意の至便な方法
で製造できる。トランスジェニック発現の例は、下記に示す。所望であれば、ペ
プチドの精製もまた、当分野で認められた方法で行いうる。

【００２３】第二の態様において、本発明は、本発明のペプチドをコード化および発現でき
る遺伝子およびその他の核酸構築物を提供する。ペプチドの遺伝子の構築に従っ
た通則は、以下を含んでいる。（ｉ）転写物の最適な翻訳効率を得るための、イ
ニシエーターコドン付近における翻訳開始の共通配列の取り込み；（ｉｉ）好ま
しい双子葉植物コドンの利用；および（ｉｉｉ）ＲＮＡ転写物を不安定化できる
、または偶発的にポリＡ付加またはイントロンスプライシング事象をシグナル可
能な、ＡおよびＴ残基の長い伸長の回避。従って、配列番号１、５、９および１
３が、細胞質ゾル局在ペプチドの発現に好ましく、配列番号３、７、１１、１５
および１７が、細胞外局在ペプチドの発現に好ましい。エンドウビシリンシグナ
ルペプチド以外のシグナルペプチドを所望であれば、適当なコード配列を、配列
番号１、５、９または１３のうちの１つに添加し、細胞外局在抗微生物ペプチド
を発現可能な構築物を産生できる。しかし、一般的に、任意の前記の核酸配列か
ら１以上の変性ヌクレオチド置換により誘導された任意の核酸は、親核酸に対し
て少なくとも７０％の相同性が維持される限りにおいて、活性抗微生物ペプチド
をインビボにおいて発現できる。本発明はまた、かかる遺伝子も包含する。

【００２４】本発明のこの態様の核酸構築物は、植物細胞に挿入した場合に、核が本発明の
第一の態様のペプチドを発現するものである。かかる核酸構築物の発現は、植物
細胞核ゲノムへの組換え後、または、核ゲノムに再結合しないコード配列を含む
構築物（例えばプラスミド）から達成できる。

【００２５】下記に実証した通り、マガイニン２およびＰＧＬの組合せの抗真菌効果は驚く
べきことに相乗的である。従って、本発明のこの態様の別の好ましい実施形態に
おいて、両方共独立して、細胞外分泌を促進するシグナルペプチド（好ましくは
エンドウビシリンシグナルペプチド）を含むかまたは含まない、マガイニン２お
よびＰＧＬペプチドの両方をコード化する核酸構築物が提供される。この実施形
態は有利には、他のペプチドの非存在下では微生物耐性を付与するには不十分で
ある、有効量の各ペプチドの発現を可能とする。

【００２６】好ましい実施形態において、核酸構築物は、前記のコード配列の１つに加えさ
らに１以上の調節因子を含む。調節因子の中で好ましいのは、植物プロモーター
である。任意の植物プロモーターを使用できる。好ましい植物プロモーターは、
Ｅ３５Ｓ、ＵＢＱ３、ＵＢＱ１０、ＵＢＱ１１およびＵＢＱ１４プロモーターを
含む。

【００２７】本発明のこの態様の核酸は、当分野で認められた技術により、下記の実施例で
例示したようにして製造できる。本明細書で記載および実証したように、本発明
のこの態様の核酸は、本発明の第一の態様に記載の抗微生物ペプチドの発現に有
用である。

【００２８】第三の態様において、本発明は、真菌、細菌および植物原形質を含むがこれら
に限定されない種々の微生物に対して、植物組織に耐性を付与する方法を提供す
る。この方法は、本発明の第二の態様の核酸構築物を用いて植物組織を形質転換
させることを含み、この形質転換された組織はその結果、本発明の第一の態様の
１以上の抗微生物ペプチドを、細胞に微生物耐性を付与するに十分なレベルで発
現できるようになる。本発明のこの態様の方法は、有利には、植物細胞に他の影
響を及ぼすことなく、植物病原性微生物に対する耐性を提供するに十分なレベル
の発現を可能とする。

【００２９】好ましい実施形態において、この方法は、１以上の核酸構築物で植物組織を形
質転換し、その結果、植物組織は本発明に係る２以上の抗微生物ペプチドを発現
することを含む。２つのペプチドは、好ましくは、別々に分画されている（すな
わち、１つのペプチドは色素体、細胞質ゾルまたは細胞外空間に存在し、別のペ
プチドは別の色素体、細胞質ゾルまたは細胞外空間に存在する）。

【００３０】より好ましい実施形態において、この方法は、１以上の核酸で植物組織を形質
転換して、組織にマガイニン２およびＰＧＬペプチドの両方を発現させることを
含む。ここで、両ペプチドは独立して、細胞外分泌を促進するシグナルペプチド
（好ましくはエンドウビシリンペプチド）を含むかまたは含まないものである。
この実施形態におけるマガイニン２およびＰＧＬペプチドは、同一画分または別
々の画分に存在しうる。

【００３１】形質転換は、植物細胞の形質転換のための任意の公知技術により達成できる。
好ましい実施形態において、形質転換は、微粒子銃法（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）で
達成される。形質転換植物組織の選択は、選択マーカー遺伝子との共形質転換な
どの、当分野で公知の技術により達成できる。

【００３２】形質転換は、核または色素体のいずれかにおいて、これは核酸構築物の標的領
域により決定されるが、達成できる。色素体形質転換の詳細は、例えば、共に出
願中の、１９９８年７月２３日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／****（ＷＯ９
９／*****）、名称「亢進した高等植物の色素体形質転換および除草剤耐性トランスジェニック植物の産生」、および、１９９７年７月２３日出願の米国出願番
号０８／８９９，０６１、に見ることができる。

【００３３】第四の態様において、本発明は、１以上の抗微生物ペプチド、特にマガイニン
およびＰＧＬクラスのペプチドをコード化する遺伝子または遺伝子群で形質転換
および発現する、微生物耐性トランスジェニック植物組織を提供する。トランス
ジェニック植物組織は、本発明の第三の態様に従って製造する。全トランスジェ
ニック植物は、当分野で公知の技術に従って、トランスジェニック植物細胞また
は組織を成育することにより得ることができる。

【００３４】本発明はさらに、以下の実施例により記載および説明され、これらは単に説明
の目的のために提供されるのであって、これらに制限する意図はなく、またその
ように解釈すべきではない。当業者は、以下の実施例の変更および修飾を、本発
明の精神または範囲を越えることなく施すことができる。

【００３５】（実施例）［実施例１］マガイニンおよびＰＧＬクラスの抗微生物ペプチドに対する植物
病原体のインビトロ感受性既知量の病原体を、９６ウエルのマイクロタイタープレートの個々のウエル中
の、０〜２５６μｇ／ｍｌの範囲のペプチドの連続希釈液に添加した。等量の増
殖培地（細菌用ルリア・ベルタニ（ＬＢ）ブロスおよび真菌用ジャガイモデキス
トロースブロス（ＰＤＢ））を、各ウエルに添加し、一晩２５℃で穏やかに振り
ながらプレートをインキュベートした。翌日、増殖の有無についてウエルを評定
し、全増殖を阻害した最小ペプチド濃度を、最小阻害濃度（ＭＩＣ）値として記
録した。アッセイに用いた植物病原性細菌は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒ
ｉｎｇａｅおよびＥｒｗｉｎｉａｃａｒｏｔｏｖｏｒａを含んでいた。植物病
原性真菌は、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｐａｒａｓｔｉｃａの２つの単離物（
ペチュニアおよびビンカ由来）、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉ、Ｆｕｓａｒ
ｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓｂａｓｉｃｏ
ｌａ、ＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａおよびＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏ
ｌａｎｉを含んでいた。

【００３６】表１に示されるように、抗微生物ペプチド類似体であるＭＳＩ−９９およびＤ
５−Ｃの作用に対して、細菌は非常に感受性であった（ＭＩＣ＜２μｇ／ｍｌ）
。対照的に、天然ペプチドのマガイニン２およびＰＧＬのみでは、ｌｏｇ相増殖
ＰｓｅｕｄｏｍｏｍａｓおよびＥｒｗｉｎｉａに対し、有意により低い活性が示
された。しかし、等モル量で合わせた場合、マガイニン２／ＰＧＬの組合せは、
ペプチド誘導体よりもさらにより強力であった（ＭＩＣ＝０．５μｇ／ｍｌ）。

【００３７】真菌に関しては、２週間目の培養物に０．０１％のＴｗｅｅｎ２０溶液を大量
に注いで、表面をこすることにより、ジャガイモデキストロース寒天（ＰＤＡ）
プレートから、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍ
ｉｎｅａｒｕｍ、ＴｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓｂａｓｉｃｏｌａおよびＢｏｔ
ｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａの分生胞子を回収した。得られた胞子懸濁液をガラ
スウールを通して濾過し、菌糸体フラグメントを除去した。次いで、血球計数器
で胞子濃度を決定した。発芽前胞子を使用した場合は、胞子懸濁液を使用数時間
前に調製した（胚管の長さが胞子の長さと等しい場合）。Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉ
ａｓｏｌａｎｉでは、胞子の代わりに菌糸体フラグメントを使用した。Ｒｈｉ
ｚｏｃｔｏｎｉａの２週間目のＰＤＢ培養物を、ブレンダーで切断し、ほぼ４つ
の細胞長の菌糸体フラグメントを産生した。次いで、血球計測器を用いてフラグ
メント濃度を決定した。Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｐａｒａｓｔｉｃａでは、
液体培養物で生じた遊走子をアッセイに使用した。

【００３８】アッセイした各真菌は、少なくとも１つの単一の抗微生物ペプチドの作用に対
して感受性であった（表１）。例えば、両方のＦｕｓａｒｉｕｍ種は、４つの単
一の抗微生物ペプチドでの処理に非常に感受性であった。対照的に、２つのＰｈ
ｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ単離物は、天然抗微生物ペプチドに対して比較的に耐性で
あり、ペプチド類似体ＭＳＩ−９９およびＤ５−Ｃが最も優れた抗−Ｐｈｙｔｏ
ｐｈｔｈｏｒａ活性を示した。Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓｂａｓｉｃｏｌａ
、ＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａおよびＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａ
ｎｉは、種々の単一のペプチドに対して中低度レベルの感受性を示した。発芽お
よび非発芽胞子の抗微生物ペプチド処理により、実質的に同一の結果が得られた
。ＭＳＩ−５５はまた、インビトロで強力な抗−細菌および抗−真菌活性を示し
た。

【００３９】

【表１】全体として、最も強力な抗微生物ペプチド処理は、マガイニン２／ＰＧＬの組
合せであった。Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａを除く全真菌は、この組合せに対して
非常に感受性であった。例えば、この組合せを用いた場合のＲｈｉｚｏｃｔｏｎ
ｉａｓｏｌａｎｉのＭＩＣ値は２〜４μｇ／ｍｌであり、マガイニン２または
ＰＧＬ単独の場合に必要とされる１６〜３２μｇ／ｍｌよりもほぼ一桁小さかっ
た。類似しているがそれほど劇的ではない変化がまた、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒ
ａ、ＢｏｔｒｙｔｉｓおよびＦｕｓａｒｉｕｍで観察された。これらを合わせて
考えると、これらの結果は明らかに、このグループの抗微生物ペプチドにより、
広域の抗微生物活性が集合的に示されたことを実証する。結果として、基本的に
全ての植物病原性真菌および細菌が、マガイニンおよびＰＧＬクラスのペプチド
に対して感受性を顕現することが期待される。

【００４０】［実施例２］抗微生物ペプチドの遺伝子の構築これらの小さい遺伝子を組み立てる一般的な方策は、２つの部分的に重複する
一本鎖オリゴヌクレオチドを化学的に合成し、相同領域をハイブリダイズさせ、
次いで、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いた伸長により両方向に二本鎖を完成さ
せることであった。各遺伝子のオリゴヌクレオチド対は、遺伝子の各端に位置す
る特異的な制限部位（それぞれ、５′および３′端のＢａｍＨＩおよびＳｓｔＩ
）を用いて設計し、制限消化後に植物発現ベクターへ示向クローニングさせるよ
うにした。遺伝子構築で従った通則は、以下を含んでいる。（ｉ）転写物の最適
な翻訳効率を得るための、イニシエーターコドン付近での翻訳開始用の共通配列
の取り込み；（ｉｉ）好ましい双子葉植物コドンの利用；および（ｉｉｉ）ＲＮ
Ａ転写物を不安定化でき、または偶発的にポリＡ付加またはイントロンスプライ
シング事象をシグナル可能な、ＡおよびＴ残基の長い伸長の回避。全クローンを
ＤＮＡ配列解析にかけ、期待した遺伝子配列の真正を確認した。これらの抗微生
物ペプチド遺伝子のヌクレオチド配列および対応するペプチド配列は、下記の配
列表に、配列番号１、２、５、６、９、１０、１３および１４で示す。

【００４１】導入遺伝子を用いた、以前の穀物保護研究により、疾病耐性レベルは、防御タ
ンパク質の細胞位置により影響を受け得ることが実証された。例えば、Ｍｅｌｃ
ｈｅｒｓら、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１：５８３−５９３（１９９３
）により、Ｆｕｓａｒｉｕｍによる感染に対する最適耐性レベルは、トランスジ
ェニックトマト植物の細胞内空間にキチナーゼおよびβ−１，３−グルカナーゼ
を分泌することにより達成されることが実証された。これらの結果は、驚くべき
ことではない。なぜなら、病原体攻撃後に誘導されたＰＲ−タンパク質（または
病原関連タンパク質；キチナーゼまたはグルカナーゼはこのメンバーである）が
、細胞質ゾルおよび空胞を含む数多くの細胞分画、並びに細胞外に認められるか
らである。

【００４２】上記の最初に構築された抗微生物ペプチドの遺伝子は、細胞質ゾル内で翻訳お
よび蓄積されるように設計された。しかし、植物の細胞内空間に抗微生物ペプチ
ドを分泌することにより、侵入した病原体に対するより良好な保護を得ることが
可能である。植物細胞から抗微生物ペプチドを運搬するために、エンドウビシリ
ンタンパク質のシグナルペプチドを、抗微生物ペプチドのＮ末端にインフレーム
融合（翻訳的に）させた。先に、エンドウビシリンタンパク質の１５−アミノ酸
シグナルペプチドが、全トランスジェニックタバコ植物の細胞内空間または形質
転換タバコＮＴＩ懸濁細胞の液体培地へのβ−グルクロニダーゼの効果的分泌を
指示することが実証されている（Ｐａｎｇら、Ｇｅｎｅ、１１２：２２９−２３
４（１９９２））。ビシリンシグナルペプチドは、タンパク質輸送の指示に非常
に効率的であった。なぜなら、β−グルクロニダーゼは、ほとんど細胞質に蓄積
せず、またはほとんど小胞体に捕獲されないためである。タンパク質分泌の誤経
路は、修飾ＧＵＳ酵素の細胞外輸送経路であると仮定された。

【００４３】エンドウビシリンシグナルペプチドをコード化するオリゴヌクレオチドをＰＣ
Ｒに使用し、細胞内空間に指向した抗微生物ペプチドを創製した。抗微生物ペプ
チド遺伝子のヌクレオチド配列および分泌用に設計された対応するペプチドは、
配列表に、配列番号３、４、７、８、１１、１２、１５、１６、１７および１８
として提示される。シグナルペプチドは、分泌プロセスの間に開裂するので、成
熟抗微生物ペプチドの最終構造は、この修飾を欠失するペプチドの構造と実質的
に全く異ならない。

【００４４】次いで、完成した抗微生物ペプチド遺伝子を、４つのプロモーターのうちの１
つの転写制御下に置いた。充分に特徴づけられた天然および亢進した型のＣａＭ
Ｖ３５Ｓプロモーターを用いた（Ｏｄｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ、３１３：８１０
−８１２（１９８５）およびＫａｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３６：１２９９−１
３０２（１９８７））。また、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａのポ
リユビキチン遺伝子ファミリーのメンバーであるＵＢＱ３およびＵＢＱ１０遺伝
子のプロモーターを用いた（Ｎｏｒｒｉｓら、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１：８９９５−８９０６（１９９３））。我々は、ＵＢＱ３およびＵＢＱ１０
プロモーターが、トランスジェニック・ペチュニアにおいて、高レベルの遺伝子
発現を指示することを観察した。全抗微生物ペプチド遺伝子は、３′端で、転写
物へのポリＡ付加のシグナルを含むｎｏｓ３′配列によりフランキングさせた。
表２および３は、種々の種への導入用に創製した適切な抗微生物ペプチド発現カ
セットを列挙する。全抗微生物ペプチド発現カセットは、ｐＵＣ−由来クローニ
ングベクターで構築した。

【００４５】

【表２】

【表３】マガイニン２およびＰＧＬの両方を発現するベクターの構築のために、全部で
４つのプラスミドを集めた。プラスミドｐＳＡＮ３１８およびｐＳＡＮ３１９を
構築するために、ＵＢＱ３：：マガイニン２およびＵＢＱ１０：：ＰＧＬカセッ
トを、２方向（それぞれ、ｐＳＡＮ３１８およびｐＳＡＮ３１９の転写の逆およ
び同方向）で単一のプラスミドに結合させた。同様に、ＵＢＱ３：：ＰＧＬおよ
びＵＢＱ１０：：マガイニン２カセットを２方向（それぞれ、ｐＳＡＮ３２０お
よびｐＳＡＮ３２１の転写の逆および同方向）で単一のプラスミドに配置し、プ
ラスミドｐＳＡＮ３２０およびｐＳＡＮ３２１を作成した。

【００４６】［実施例３］植物細胞形質転換本明細書で報告した全ての形質転換は、形質転換させる細胞をＤＮＡ被覆微粒
子で照射することを含む微粒子銃技術（Ｓａｎｆｏｒｄら、ＭｅｔｈｏｄｓＥ
ｎｚｙｍｏｌ．２１７、４８３（１９９２）参照）を用いた。そのパラメーター
は、以下に記す。

【００４７】ペチュニアインビトロでムラシゲおよびＳｋｏｏｇ基本培地（ＭＳ３Ｓ）上で維持された
Ｖ２６または「１６２７」植物から、葉を採取した。茎頂および節切り枝を毎月
とり、新鮮なＭＳ３Ｓに置いた。幼若から中低度の年令の葉を５〜６週の植物か
ら採取した。葉を微粒子銃の日に採取し（Ｋｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ３２７：７０−７３（１９８７））、ＢａｌｌＦｌｏｒａＰｌａｎｔ（ＢＦＰ）（
ＷｅｓｔＣｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）から得られた約２５ｍｌのペチュニア再生培
地を含む１００×１５ｍｍのペトリ皿に置いた。それらは、向軸性表面を上に向
けられた。１枚の葉をプレートの中央に置き、次いで、８枚の葉をこの葉の周囲
に配置した。照射後、葉を裏返し、向軸性表面を培地と接触させた。照射５日後
、葉を約０．５ｃｍ^２断片に切断し、Ｖ２６では１００ｍｇ／ｌカナマイシンを
、また「１６２７」では４ｍｇ／ヒグロマイシンと２５０ｍｇ／ｌのカルベニシ
リンを含む再生培地に移した。

【００４８】再生物の高さが約０．５ｃｍとなった時に外植片から切断し、根付かせるため
にＭＳ３Ｓに移した。ＭＳ３Ｓ培地上で茎頂を培養して、１か月に１回継代培養
した。全培養物は、２５℃で、光の下で光時間１６時間で維持した。

【００４９】ポインセチア品種アンゼリカおよびフリーダムからの胚軸断片を、カルス誘導培地上で培養
した。４週間後、カルスを除去し、胚誘導培地に移した。この時点で、カルスを
照射した。照射の１週間後、カルスを、１０ｍｇ／ｌのヒグロマイシンを含む胚
誘導培地に移した。２週間後、カルスを選択して発育培地に移した。カルスは、
２週間この培地に置かれ、次いで、成熟培地に移し、そこで６週間置かれた。こ
のとき、体細胞胚をセレクションから発芽培地に移した。発芽の約２週間後、小
植物をＭＳ３Ｓ培地に移した。全培養物を光の下１６時間の光時間で２５℃に維
持した。１９９７年７月３１日出願の米国出願番号０８／９０３，９４４は、使
用した培地を記載する。

【００５０】フクロソウフクロソウデザイナースカーレット（ＤｅｓｉｇｎｅｒＳｃａｒｌｅｔ）の
ストック植物を、インビトロで、１ｍｇ／ｌのＩＡＡが補われたＭＳ３Ｓ上で維
持した。葉柄断片を採取し、カルス誘導培地上で培養した。４週間後、カルスを
フクロソウ懸濁培地に置き、回転撹拌器で維持した。懸濁液を数週間毎に継代培
養した。数か月後、約１．５ｍｌの懸濁液を無菌濾紙上に分配し、次いで、ＢＦ
Ｐ（ＷｅｓｔＣｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）により提供されたフクロソウ懸濁再生（
ＧＳＲ）培地に移した。培養物を、プレーティング３日後に照射した。照射２日
後、培養物を、１０ｍｇ／ｌヒグロマイシンを含むＧＳＲ培地に移した。セレク
ション上で１か月後、培養物をセレクションから移した。

【００５１】照射から４〜６週間後、形質転換したと推定される小さいカルスが発達し、直
径が約３ｍｍとなった時にＧＳＲに移した。小さく、緑色の組織化された構造が
形成された時に、０．０５ｍｇ／ｌのＴＤＺ培地を含むＧＳＲ培地に移した。構
造がより組織化された時に、それらを０．０１ｍｇ／ＴＤＺを有するが、ＮＡＡ
は含まない修飾ＧＳＲ培地に移した。それらがよりシュート（新芽）様となった
時に、それらをＢＦＰにより提供される中間培地（Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ
Ｍｅｄｉｕｍ）に移し、そこでそれらを１〜２週間置き、ＢＦＰにより提供され
るメリステム（Ｍｅｒｉｓｔｅｍ）Ｃ培地に移し、そこで１〜２週間置いた。次
いで、小さいシュートを、１ｍｇ／ｌのＩＡＡを含むＭＳ３Ｓ培地に移し、１週
間後にこの培地からＭＳ３Ｓ培地に移した。全培養物は２５℃で光の下、光時間
１６時間で維持された。

【００５２】Ｌｉｓｉａｎｔｈｕｓ選択した同系培養物のインビトロストック植物を、２ｍｇ／ｌＩＡＡを含む発
根培地上で維持した。照射の日に、幼若から中程度の年令の葉を１か月の植物か
ら採取した。それらを、約２５ｍｌのＬｉｓｉａｎｔｈｕｓ再生培地を含む１０
０×１５ｍｍペトリ皿に置き、上向きの向軸表面で指向させた。１枚の葉をプレ
ートの中央に置き、８枚の葉をその周囲に配置した。照射後、葉を裏返し、向軸
性表面を培地と接触させた。照射５日後、葉を約０．５ｃｍ^２の断片に切断し、
１０ｍｇ／ｌヒグロマイシンを含むＬｉｓｉａｎｔｈｕｓ再生培地に移した。全
培養物を、２５℃で光の下、光時間１６時間で維持した。

【００５３】照射パラメーター：抗微生物ペプチド発現カセットを有するプラスミドを、植
物選択マーカーカセットを含むプラスミドＤＮＡと共に、植物組織に共照射した
。全照射において、Ｍ１０タングステン粒子を用いた。Ｖ２６ペチュニアでは、
葉を１または２回、１２００プサイの圧力およびレベル６に設定したプレート距
離（１２ｃｍ）で照射した。「１６２７」では、葉を１回、１２００プサイの圧
力および１２ｃｍのプレート距離で照射した。各プレートを２０ｎｇのＤＮＡ（
抗微生物ペプチドの遺伝子を含むプラスミド１０ｎｇおよび選択マーカー遺伝子
を含むプラスミド１０ｎｇ）で照射した。

【００５４】ポインセチアカルスを、１回１２００プサイの圧力およびレベル５に設定した
プレート距離（９ｃｍ）で照射した。各プレートを、１００ｎｇのＤＮＡ（抗微
生物ペプチドの遺伝子を含むプラスミド５０ｎｇおよび選択マーカー遺伝子を含
むプラスミド５０ｎｇ）で照射した。

【００５５】フクロソウ懸濁培養物を、１回１０００プサイの圧力およびレベル６に設定し
たプレート距離（１２ｃｍ）で照射した。各プレートを、２０ｎｇのＤＮＡ（抗
微生物ペプチドの遺伝子を含むプラスミド１０ｎｇおよび選択マーカー遺伝子を
含むプラスミド１０ｎｇ）で照射した。

【００５６】Ｌｉｓｉａｎｔｈｕｓ葉を１または２回、１２００プサイの圧力およびレベル
６に設定したプレート距離（１２ｃｍ）で照射した。各プレートを、２０ｎｇの
ＤＮＡ（抗微生物ペプチドの遺伝子を含むプラスミド１０ｎｇおよび選択マーカ
ー遺伝子を含むプラスミド１０ｎｇ）で照射した。

【００５７】［実施例４］トランスジェニック植物におけるマガイニンおよびＰＧＬクラス
の抗微生物ペプチド発現抗−細菌バイオアッセイ：トランスジェニック植物における抗微生物ペプチド
活性を検出するための、効率的かつ信頼性のあるインビトロの抗−細菌バイオア
ッセイが開発された。従って、本発明者は、４つの観賞種であるペチュニア、ポ
インセチア、フクロソウおよびＬｉｓｉａｎｔｈｕｓのトランスジェニック植物
において、抗微生物ペプチド活性を検出するためにこのバイオアッセイを利用し
た。手短かに言えば、細胞非含有抽出物を、２５ｍＭＫＰＯ4、ｐＨ５．５緩衝液中で（フクロソウは例外で、これは０．１％ＰＶＰ−１０を補った５０ｍＭＫ
ＰＯ4、ｐＨ６．５緩衝液を使用）、組織培養維持葉組織から調製した。次に、ＬＢブロス（５μｌ）中の１０^３〜１０^４のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉ
ｎｇａｅ（ポインセチアおよびフクロソウに対し）またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓｃｉｃｈｏｒｉｉ（ペチュニアおよびＬｉｓｉａｎｔｈｕｓに対し）細菌を
、全容量５０μｌ中の１００μｇの葉タンパク質に添加した。ペプチドが細菌と
相互作用できるように、室温で２〜２．５時間インキュベートした後、１ｍｌの
ＬＢブロスをタンパク質／細菌混合物に添加し、一晩２８℃でインキュベートし
た。次の日、細菌増殖についてチューブを評定した。ここで、増殖しないことは
、細菌細胞が抗微生物ペプチドの作用により死滅したことを示唆する。全実験に
おいて、非形質転換植物から調製された抽出物および既知量の精製抗微生物ペプ
チドを加えた同抽出物が、それぞれ、陰性および陽性対照として含まれた。典型
的には、各形質転換体を４回このバイオアッセイにかけた（別々の日に調製した
２つの抽出物を、各日に二重にアッセイした）。４つのバイオアッセイ中３つに
おいて、抗微生物ペプチドを介して抗細菌活性を示したトランスジェニック系を
、次の実験用に選択した。いくつかの場合で、我々は、バイオアッセイで測定し
た植物中の抗微生物ペプチドの量を確認するために、免疫検出法を使用した。ア
ッセイの非常に有用な特徴は、チューブに添加する細菌数を操作することにより
検出感度を調節できることである。表４に見るように、典型的には、バイオアッ
セイにかけた２０〜５０％のマガイニンおよびＰＧＬクラスのペプチドのトラン
スジェニック系を試験すると、抗微生物ペプチド活性は陽性であった。実際のパ
ーセントは、発現された抗微生物ペプチドのクラスおよび抗微生物ペプチド発現
カセット（すなわちプロモーターの考慮）の双方に大きく依存している。

【００５８】

【表４】抗−Ｂｏｔｒｙｔｉｓリーフ（葉）ディスクバイオアッセイ：抗−細菌バイオ
アッセイ後、ペチュニア、リシアンサスおよびポインセチアのトランスジェニッ
ク系候補を、インビトロ抗−真菌バイオアッセイを用いて、さらなる解析用に選
択した（インビトロ植物増殖は遅すぎるため、フクロソウはこのリーフディスク
アッセイを用いてスクリーニングしなかった）。手短かに言えば、各組織培養維
持形質転換系（および非形質転換対照）からの１２のリーフ（葉）ディスク（直
径８ｍｍ）を、コルク穴開器を用いて穴を開け、無菌プラスチックバイオアッセ
イ皿内の加湿ホワットマン３Ｍ濾紙上に置いた。次いで、新しく調製したＢｏｔ
ｒｙｔｉｓ胞子懸濁液（２．５μｌ中１０^３胞子）を葉ディスク表面にピペッテ
ィングした。増湿チャンバーに封をし、葉ディスクを２０℃で放置し、疾病が発
達できるようにした。次の３〜１４日間（タイムラインは種により異なる）、疾
病進行をモニターし、感染した葉ディスクのパーセントとして記録した。表５は
、このバイオアッセイから得られた代表的な結果を示す。ここにみるように、疾
病発生率の有意な減少が、種々の抗微生物ペプチドを発現するトランスジェニッ
クペチュニア、ポインセチアおよびリシアンサス系で観察された。Ｂｏｔｒｙｔ
ｉｓ感染レベルはしばしば、多くのトランスジェニック系において３〜４倍も減
少した。リシアンサスの場合、いくつかのトランスジェニック系の感染は、１桁
またはそれ以上減少した。このアッセイは、ペプチドを分泌するトランスジェニ
ック系とその細胞質ゾル内でペプチドを保持する系との間における有意な差は検
出しなかったようである。各穀物の全体の結果は、表４に示す。

【００５９】

【表５】［実施例５］マガイニンおよびＰＧＬクラスの抗微生物ペプチドはペチュニア
においてウドンコ病に対する耐性を付与する。

【００６０】偏性真菌病原体ウドンコ病菌（Ｏｉｄｉｕｍ属）に対し、全ペチュニア植物を
試みた。この試験において、ウドンコ病菌胞子の新しく調製した懸濁液を、温室
で成育したペチュニアの葉にピペッティングした。植物を疾病発達に好ましい条
件下で維持し、その疾病耐性特性についてランクをつけた。感染発生（感染した
接種葉のパーセント）および疾病の重度（コロニー面積）を記録した。

【００６１】表６にみるように、多くのトランスジェニックＶ２６系が疾病の発生率の減少
を示した。例えば、３つのｐＳＡＮ１４７発現系（１４７−６、１４７−８およ
び１４７−１１）は全て、疾病発生率の３〜４倍の減少を示した。これらの系は
、分泌形のＭＳＩ−９９の遺伝子を含んだ。非形質転換対照と比較して、トラン
スジェニック形においてコロニーサイズが５〜５０倍減少したので、疾病重度の
一層劇的な減少が観察された。これらの双方より、疾病発生率および重度の両方
共、時には極めて劇的に、トランスジェニック抗微生物ぺプチド発現ペチュニア
系において減少する。

【００６２】

【表６】［実施例６］マガイニンおよびＰＧＬクラスの抗微生物ペプチドは、ポインセ
チアにおいて、偏性真菌病原体であるウドンコ病菌に対する耐性を付与する。

【００６３】ペチュニアと同様に、全ポインセチア植物を、ポインセチアウドンコ病菌病原
体（Ｏｉｄｉｕｍ属）に対する耐性についてスクリーニングした。単一の抗微生
物ペプチドまたはマガイニン２およびＰＧＬの組合せを発現する２６個のトラン
スジェニックアンゼリカ系を、２つの異なる実験で試験した。さらに、単一の抗
微生物ペプチドまたはマガイニン２およびＰＧＬの組合せを発現する１９個のト
ランスジェニックフリーダム系を、２つの異なる実験で試験した。

【００６４】第一の実験において、１５個のトランスジェニックアンゼリカ系および非トラ
ンスジェニック対照を、それらを重度に感染した起源植物に極めて接近させて配
置することにより接種した。接種源植物は７日後に取り除いた。１５日目に、ウ
ドンコ病菌コロニーを、切開顕微鏡および葉の側面照明を用いて、特定の葉面積
上で定量した。鎖状形の鎖（ｃａｔｅｎｕｌａｔｅｃｈａｉｎ）当たりに観察
された分生子の最大数もまた、コロニー年令および生産性の指標として記録した
。開始から２０日後、再度コロニーを、拡大器を用いずに特定の葉面積上で定量
した。２２日目に、各植物系からの分生子穀物を採取し定量した。

【００６５】コロニーは、開始から２週間後には、拡大せずにはっきりと目で見ることがで
きた。ウドンコ病菌コロニーの密度は、いくつかのトランスジェニック系におい
て対照レベルから有意に且つ大きく減少した。最も顕著なのは、１４８−１５（
Ｄ５−Ｃ*Ｓ）、１６８−７（ＭＳＩ−９９*Ｓ）、１４６−６（Ｍａｇ２*Ｓ）、１６７−３（Ｍａｇ２*Ｓ）、１６７−２（Ｍａｇ２*Ｓ）および１６８−２４
（ＭＳＩ−９９*Ｓ）であった（表７）。鎖あたりの分生子により間接的に測定した潜伏期の長さ（世代時間）は、全トランスジェニック系において、対照レベ
ルを超えて有意に増加した（表７）。２０日目に植物を再度調査した時には、ウ
ドンコ病菌に対する耐性は、コロニー化の密度減少として現れ続けていた（表８
）。疾病の最大の減少は、１６８−７（ＭＳＩ−９９^＊Ｓ）、１６７−２（Ｍａ
ｇ２^＊Ｓ）および１４６−６（Ｍａｇ２^＊Ｓ）系に認められた。

【００６６】

【表７】

【表８】胞子形成ウドンコ病菌コロニーの全バイオマスを、全植物の風下の空気伝送分
生子をサンプリングすることにより推定した。１４６−６（Ｍａｇ２^＊Ｓ）、１
６７−３（Ｍａｇ２^＊Ｓ）、１６７−２（Ｍａｇ２^＊Ｓ）および１６８−２４（
ＭＳＩ−９９^＊Ｓ）の風下には、ほとんど分生子は捕獲されなかった（表８）。
２０日目にウドンコ病菌コロニー数が最も低かったトランスジェニック系１６８
−７（ＭＳＩ−９９^＊Ｓ）は、胞子形成の減少において７番目にランクしたが（
表８）、胞子形成は依然として対照からほぼ８０％減少した。

【００６７】第二の実験において、１２のトランスジェニックアンゼリカ系および非−トラ
ンスジェニック対照を、接種源植物を２４時間後にのみ取り出すこと以外は、上
記と同じように接種した。開始から１３日後、各植物において最もひどく感染し
た葉のコロニー数を記録した。２つのトランスジェニック系、３１９−１０（Ｍ
ａｇ２^＊Ｓ／ＰＧＬの組合せ）および１４５−１５（ＭＳＩ−５５^＊Ｓ）は、ウ
ドンコ病菌コロニー密度の減少を示し、これは非形質転換対照よりも有意に低か
った（表９）。

【００６８】

【表９】２つの追加実験において、１９個のトランスジェニックフリーダム系および非
形質転換対照に対し、重度に感染した起源植物からの植物を通して分生胞子を送
風することにより接種した。単一の温室床箱（ベンチ）上のランダムな完全ブロ
ック設計により、植物を配置した。植物は、各反復ブロック内で毎日回転させ、
ブロックは床箱上で毎日回転させた。各植物におけるウドンコ病菌コロニー数は
、接種から３および４、１７および２１日目に記録した。これらの実験で評価し
た１９個のトランスジェニック系中、３個（１６８−３８、１６８−３０、１６
８−１４）が、植物あたり接種対照よりも有意に低いコロニーを産生した。

【００６９】全体として、ウドンコ病菌に対する有意な耐性は、試験した２６個のトランス
ジェニックアンゼリカ系中１２個、および試験した１９個のトランスジェニック
フリーダム系中３個により示された。耐性は、（ｉ）コロニー数の減少、（ｉｉ
）潜伏期間の増加、および（ｉｉｉ）感染植物の風下の空気伝送胞子数の減少、
として表された。

【００７０】全穀物の全ウドンコ病菌は類似の感染プロセスを有するという事実から、本明
細書で示された結果は、これらの抗微生物ペプチドは、全ての他の型のウドンコ
病菌に対し、実質的に全穀物において効果的であることを示す。

【００７１】［実施例７］抗微生物ペプチドは、フクロソウにおいて、偏性真菌病原体であ
るさび病菌に対する耐性を付与する。

【００７２】全フクロソウ植物を、フクロソウサビ病菌病原体であるＰｕｃｃｉｎｉａｐ
ｅｌａｒｇｏｎｉｉ−ｚｏｎａｌｉｓに対する耐性についてスクリーニングした
。種々の溶解ペプチドの遺伝子および遺伝子組合せを発現する品種デザイナース
カーレットの１５個のトランスジェニック系を、非−トランスジェニック対照と
比較して、サビ病菌病原体に対する耐性に関する２つの実験において試験した。
手短かに言えば、植物に夏胞子懸濁液を噴霧し、高湿度下で感染プロセスの間、
インキュベートした。接種３週間後、１０葉あたりのサビ病菌病巣数および植物
あたりの感染した葉の数を記録した。試験したいくつかのトランスジェニック系
は、サビ病菌感染に対する耐性を表し、非−トランスジェニック対照系と比較し
て、病巣／葉の数が２〜３倍減少した。

【００７３】［実施例８］マガイニンおよびＰＧＬクラスの抗微生物ペプチドは、ペチュニ
アにおいて、真菌病原体であるＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｐａｒａｓｉｔｉｃ
ａに対する耐性を付与する。

【００７４】１２個のトランスジェニックペチュニアＶ２６系を、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒ
ａｐａｒａｓｉｔｉｃａによる感染に対する耐性についてスクリーニングした
。植物系は、温室でクローン的に増殖させ、約６インチの高さの複数分枝した植
物に成育させた。１０個のＰ．ｐａｒａｓｉｔｉｃａの遊走子（液体培養で産生
）を、植物あたり３つの幹上の各々２つの葉に接種した。接種後、植物を加湿チ
ャンバー中２８℃で７日間インキュベートし、次いで、各接種した幹の疾病重度
を記録した。疾病重度に使用した等級システムは、以下の通りである。０＝健康
、１＝接種した葉は褐色化、２＝接種した葉はしおれる、３＝幹が感染およびし
おれる、４＝幹が崩壊。

【００７５】トランスジェニック系の疾病重度は、対照とは異ならず幹が７日目に崩壊する
３つのトランスジェニック系、および接種した葉のみ兆候を見せるが疾病はシュ
ートまで進行しない５つのトランスジェニック系に及んだ。残りの４つのトラン
スジェニック系において、兆候は対照系に比べて遅延するが、次第に接種したシ
ュートは崩壊した。

【００７６】多くの植物は、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ属により引き起こされる疾病を有す
る。マガイニンおよびＰＧＬクラスのペプチドの遺伝子で形質転換した他の植物
種もまた、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａに対して耐性である。

【００７７】［実施例９］抗微生物ペプチドは、フクロソウ花弁上で、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ
ｃｉｎｅｒｅａによる感染に対して耐性を付与する。

【００７８】トランスジェニック抗微生物ペプチド発現フクロソウを、２カ月間温室に順化
させた。類似の年令の小花を、トランスジェニック系および非形質転換対照系か
ら採取し、小花柄の端を水を含むマイクロヒュージチューブに入れた。Ｂｏｔｒ
ｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａの胞子懸濁液を上記のように調製し、希釈して５０胞
子／ｍｌを含ませた。トランスジェニック系あたり１０個の小花に、胞子懸濁液
を、液滴が表面に形成されるまで噴霧した。接種した小花を、加湿チャンバー中
室温でインキュベートし、接種から２、３および４日後の小花当たりの感染した
花弁パーセントおよび感染面積が５０％を超えた花弁のパーセントを記録した。

【００７９】試験した４６個のトランスジェニック系の中で、１３個が対照と比較してＢｏ
ｔｒｙｔｉｓ感染重度の有意な減少を示した（表１０）。いくつかのトランスジ
ェニック系における感染の遅延は、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ感染がわずかな感染であっ
ても小花は老化したことを意味した。非−トランスジェニック対照植物の小花の
感染は、病巣が癒着したため、通常、各花弁の＞５０％であった。

【００８０】

【表１０】［実施例１０］マガイニンおよびＰＧＬクラスの抗微生物ペプチドは、ポイン
セチアシュートにおいて、Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａによる感染に対す
る耐性を付与する。

【００８１】インビトロ抗−細菌アッセイおよび抗−Ｂｏｔｒｙｔｉｓリーフディスクアッ
セイの両方において、抗微生物ペプチド活性の陽性なトランスジェニックポイン
セチア系を、次段階の疾病スクリーニングに進めた。第２の抗−Ｂｏｔｒｙｔｉ
ｓアッセイを展開し、接種したポインセチア切り枝における疾病耐性を評価した
。手短かに言えば、温室で成育したトランスジェニック植物からシュートを採取
し、５分間１０％クロロックス（Ｃｌｏｒｏｘ）溶液中で消毒し、水ですすぎ、
次いで胞子懸濁液（５×１０^５胞子／ｍｌ）に浸した。接種したシュートは、プ
ラスチックバッグ中２日間インキュベートし、次いで、噴霧床条件下で湿潤オア
シスプラグに置き、市販の発根プラクティスをシミュレートした。疾病発生率（
感染した切り枝のパーセント）を規則的に記録し、接種した非形質転換対照シュ
ートと比較した。

【００８２】表１１にみるように、非形質転換対照シュートは、Ｂｏｔｒｙｔｉｓによる感
染に対して感受性であり、素早く重度に感染した（疾病等級３〜４）。対照的に
、抗微生物ペプチド発現系の数は、接種後に大きな減少兆候を示した。Ｄ５−Ｃ ^＊Ｓを発現する１６９−４０系は、３つのバイオアッセイにおいて一貫して疾病
等級１まで、またはそれ以下を示した。Ｂｏｔｒｙｔｉｓ感染の有意な減少レベ
ルを示した（全ての疾病等級≦２）他のトランスジェニック系は、１６３−１１
（Ｍａｇ２）、１６７−３（Ｍａｇ２^＊Ｓ）および１６８−７および１６８−２
４（ＭＳＩ−９９^＊Ｓ）を含んだ。これらの結果は、ポインセチアシュートにお
けるＢｏｔｒｙｔｉｓ感染に対する有意な耐性レベルは、抗微生物ペプチドによ
り付与される、という結論を強く支持する。

【００８３】

【表１１】［実施例１１］マガイニンおよびＰＧＬクラスの抗微生物ペプチドは、ポイン
セチアシュートにおいて、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉによる感染に
対する耐性を付与する。

【００８４】Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａに対する耐性に関するポインセチア切り枝
のスクリーニングに加えて、我々はまた、真菌病原体Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ
ｓｏｌａｎｉに対する耐性についてもスクリーニングした。１５個のシュートを
、温室で成育した、５個のトランスジェニック系および非−トランスジェニック
対照のストック植物から採取した。真菌の１週間培養物から切断した寒天プラグ
をオアシスの穴に置くことにより切り枝に接種し、そこでポインセチア切り枝を
、典型的には根付かせた。各切り枝を、菌糸体のプラグを含むアオシス内の穴に
押し込んだ。接種した切り枝を、５個の切り枝の３個の同型（ｒｅｐｌｉｃａｔ
ｅ）上に配列させ、噴霧下、温室内でインキュベートした。感染により腐敗した
切り枝の数を毎日記録した。

【００８５】表１２にみるように、非−形質転換対照の疾病発生は、３つの別々の実験にお
いて５０％〜６７％の範囲であった。分泌形の抗微生物ペプチドＭＳＩ−９９の
遺伝子を発現する１つのトランスジェニック系の１６８−７により、対照に比較
して一貫した疾病発生率の減少が実証された。この同じトランスジェニック系（
１６８−７）もまた、Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ（表１１参照）並びに
ウドンコ病菌（表７および８参照）に対する耐性を実証した。

【００８６】

【表１２】［実施例１２］マガイニンおよびＰＧＬクラスの抗微生物ペプチドは、ポイン
セチアシュートにおいて、Ｅｒｗｉｎｉａｃａｒｏｔｏｖｏｒａｓｓｃａ
ｒｏｔｏｖｏｒａによる感染に対する耐性を付与する。

【００８７】細菌性病原体による感染に対する耐性レベルの増加は、抗微生物ペプチドによ
り付与されたものであるか否かを評定するために、Ｅｒｗｉｎｉａｃａｒｏｔ
ｏｖｏｒａｓｓｃａｒｏｔｏｖｏｒａをポインセチアシュートに接種した。
温室で成育したトランスジェニック植物の１２個のシュートを、３インチの長さ
に整え、３枚の葉以外は全てを取り除いた。滅菌つまようじで、幹先端から１イ
ンチの高さの幹に創傷を施した。次いで創傷部位に、対数期のＥｒｗｉｎｉａ
ｃａｒｏｔｏｖｏｒａの１×１０^４コロニー形成単位（ｃｆｕ′ｓ）の２μｌの
液滴を入れたピペットの先端で接種した。接種されたシュートを、湿潤オアシス
プラグに突き刺し、次いで温室の噴霧下でインキュベートした。疾病発生率（腐
敗した切り枝の数）を、接種後１週間、毎日記録した。

【００８８】試験した全トランスジェニック系は、Ｅｒｗｉｎｉａｃａｒｏｔｏｖｏｒａ
ｓｓｃａｒｏｔｏｖｏｒａによる感染に対する耐性をある程度示した（図参
照）。図に示した実験において、２つのトランスジェニック系１６７−３（Ｍａ
ｇ２^＊Ｓ）および１６９−４０（Ｄ５−Ｃ^＊Ｓ）は、Ｅｒｗｉｎｉａ軟腐敗の兆
候を示さなかった。他の８個のトランスジェニック系は、実験の経過とともに、
疾病発生率の減少および疾病発生の遅延を示した。２つの系、１６７−２（Ｍａ
ｇ２^＊Ｓ）および１６５−２（Ｄ５−Ｃ）は、接種５日後まで軟腐敗を発生しな
かったが、一方対照系は、３日目に１８％のシュートが感染し、５日目に７５％
のシュートが感染した。

【００８９】マガイニンおよびＰＧＬクラスのペプチドは、細菌性病原体Ｅｃｃに対する耐
性を付与する。抗微生物ペプチドは、真核生物よりも原核生物に対してより活性
であるため、我々はいくつかの植物種におけるいくつかの真菌病原体に対する耐
性を実証したが、全植物種において種々の細菌性病原体に対する耐性を期待でき
る。

【００９０】［実施例１３］マガイニンおよびＰＧＬクラスの抗微生物ペプチドは、野外で
成育した植物のペチュニア花弁において、Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａに
よる感染に対する耐性を付与する。

【００９１】トランスジェニックペチュニア「Ｖ２６」をＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅ
ａ感染に対する耐性について評価する野外実地試験を実施した。Ｂｏｔｒｙｔｉ
ｓｃｉｎｅｒｅａは、高湿度条件下でペチュニア花の灰色カビ病を引き起こす
。非分泌または分泌形でＭＳＩ−９９を発現する２つのトランスジェニック系の
根付きの切り枝を、この試験に含めた。各植物系は、同型あたり６個の植物の４
つの同型により示された。ペチュニアは、１フィート離した２列に離され、２列
の間には４フィートの間隔が置かれた。各植物系は、二重植物の４列の各々に表
された。各二列内の植物の順序はランダムであった。

【００９２】発生率（感染した花のパーセント）およびＢｏｔｒｙｔｉｓ感染の重度は、季
節を通じて毎週記録した。１０個の花を各植物においてランダムに選択し、感染
した花の数、並びに各花の感染の重度を記録した。重度はクラスＩ（感染した花
０〜１０％）、クラスＩＩ（感染した花１１％〜９０％）、クラスＩＩＩ（感染
した花＞９０％）と等級付けた。フィールドには、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ感染を促す
ためにしばしば上から水を注いだ。細胞外空間にペプチドを分泌する系の１つで
ある１４７−８は、一貫して、非形質転換Ｖ２６系との比較において、クラスＩ
ＩＩ花を、あるとしてもほとんど示さなかった。同様に、１４７−８系もまた、
試験期間の大半を通じて、クラスＩＩ花数の減少を示した。他の抗微生物ペプチ
ド発現系は、非形質転換対照に比較して、明らかなＢｏｔｒｙｔｉｓ耐性特徴を
示さなかった。

【００９３】我々は、フクロソウ花（実施例９）、ポインセチアシュート（実施例１０）お
よびペチュニア花（実施例１３）において、マガイニンおよびＰＧＬクラスの抗
微生物ペプチドにより付与されるＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａに対する耐
性を実証した。結果として、Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａに対する類似の
耐性が、これらのペプチドを発現する他の植物種においても観察されることが期
待される。

【００９４】［実施例１４］ポインセチア植物原形質における抗微生物ペプチドの効果Ｌｅｅら、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１５：１７８−１８
２（１９９７）は、現在導管系の篩管細胞内に指定されているように、近年、市
販のポインセチアにおける自由に分枝した表現型は、マイコプラズマ様有機体（
ＭＬＯ）または植物原形質の存在により引き起こされることを実証した。ＭＬＯ
は原核細胞様微生物であるので、植物原形質の抗微生物ペプチドを介する殺滅の
可能性が存在した。この可能性を確かめるために、トランスジェニックポインセ
チア系を市販の分枝アンゼリカ根ストックに移植した。組織培養条件はポインセ
チア組織からの植物原形質を根絶してしまうことから、移植が必要とされた。抗
微生物ペプチドは植物原形質に、従って分枝特性に影響を及ぼすかを決定するた
めに、分泌または非分泌単一抗微生物ペプチドを含む１５個のトランスジェニッ
クアンゼリカ系を移植した。６８日の移植期間後、トランスジェニック（および
非トランスジェニック対照）系の切り枝を根付かせ、鉢植えにし、３週間成育さ
せ、９個の節に摘み取った。摘み取ってから６週間後、各節の側生枝長を測定し
た。

【００９５】表１３にみるように、分枝および非分枝表現型の両方が観察された。細胞外空
間にペプチドを分泌している９個の系の中、９個中わずか２個（２２％）が非分
枝であることが判明した。対照的に、細胞質ゾル中にペプチドを保持する系の５
０％（３／６）が、非分枝表現型を与えることが観察された。植物原形質は細胞
の細胞質ゾルに存すると考えられているので、細胞質ゾル中にペプチドを蓄積さ
せる系における非分枝表現型のより高い比率は、植物原形質を抗微生物ペプチド
にさらすことは致死的な結果をもたらすであろうという考察と一致する。植物原
形質は植物外では維持できないので、ペプチドに対する植物原形質の感受性に関
する先験的なインビトロデータは存在しない。しかし、これらの結果は、他の植
物における抗微生物ペプチドの発現は、感染性ＭＬＯ剤により引き起こされる疾
病を制御する効果的な方法であろうことが強く示唆される。分枝表現型は、抗微
生物ペプチド発現系と同一の形質転換法にかけた後に回収したポインセチア系（
抗微生物ペプチドの遺伝子で形質転換されていない）の１００％において観察さ
れたことに注意すべきである。これは、試験した抗微生物ペプチド発現系の３３
％（５／１５）において観察された非分枝表現型に、組織培養条件のみが関与し
ているわけではないことを強く示唆する。

【００９６】

【表１３】我々は、マガイニンおよびＰＧＬクラスのペプチドが、４つの主要な真菌病原
体（ウドンコ病菌、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ、ＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａおよびＰｈｙｔ
ｏｐｈｔｈｏｒａ）、１つの細菌性病原体（Ｅｒｗｉｎｉａ）および３つの植物
種（ペチュニア、ポインセチアおよびフクロソウ）の植物原形質に対する耐性を
付与することを実証した。さらに、我々は、トランスジェニックリシアンサスに
おける抗微生物ペプチド活性を示した。我々はまた、マガイニンおよびＰＧＬク
ラスの抗微生物ペプチドは、インビトロにおいて、細菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
および真菌病原体ＦｕｓａｒｉｕｍおよびＴｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓに対して
活性であることを示した。ゆえに、我々は、マガイニンおよびＰＧＬクラスのペ
プチドが任意の植物種において産生される場合、それらは広範な真菌、細菌およ
び／または植物原形質病原体に対する耐性を付与することを期待する。

【００９７】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

図面は、接種したポインセチア切り枝のＥｒｗｉｎｉａｃａｒｏｔｏｖｏｖ
ａｓｓｃａｒｏｔｏｖｏｖａ感染の発生率を、グラフで示したものである。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年１月２６日（２０００．１．２６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ブローワーズ、アランディー. アメリカ合衆国 60105 イリノイ州セントチャールズアローヘッドドライブ 589 ４エヌ (72)発明者ヴァンエック、ジョイスアメリカ合衆国 14850 ニューヨーク州イサカロートストリート 205 (72)発明者サンフォード、ジョンアメリカ合衆国 14456 ニューヨーク州ジェネヴァサンセットドライブ 43 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD05 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD09 CD13 CD17 4B024 AA08 BA80 CA02 DA01 EA04 FA02 FA18 GA11 GA17 HA01 4B065 AA88X AA89X AA90Y AB01 AC14 AC15 BA01 CA24 CA53 4H045 AA10 BA17 BA18 BA19 CA53 EA05 FA72 FA74 HA03

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】本質的にマガイニンおよびＰＧＬクラスのペプチドから選択
されたペプチドからなる抗微生物ペプチドであって、前記ペプチドがＮ−末端メ
チオニンを有するものである抗微生物ペプチド。
【請求項２】本質的に配列番号２からなる抗微生物ペプチド。
【請求項３】本質的に配列番号４からなる抗微生物ペプチド。
【請求項４】本質的に配列番号６からなる抗微生物ペプチド。
【請求項５】本質的に配列番号８からなる抗微生物ペプチド。
【請求項６】本質的に配列番号１０からなる抗微生物ペプチド。
【請求項７】本質的に配列番号１２からなる抗微生物ペプチド。
【請求項８】本質的に配列番号１４からなる抗微生物ペプチド。
【請求項９】本質的に配列番号１６からなる抗微生物ペプチド。
【請求項１０】本質的に配列番号１８からなる抗微生物ペプチド。
【請求項１１】マガイニンおよびＰＧＬクラスのペプチドから選択された
ペプチドをコード化する遺伝子を含む核酸であって、前記ペプチドがＮ−末端メ
チオニンを有するか、または有さないものである核酸。
【請求項１２】配列番号１を含む核酸。
【請求項１３】配列番号３を含む核酸。
【請求項１４】配列番号５を含む核酸。
【請求項１５】配列番号７を含む核酸。
【請求項１６】配列番号９を含む核酸。
【請求項１７】配列番号１１を含む核酸。
【請求項１８】配列番号１３を含む核酸。
【請求項１９】配列番号１５を含む核酸。
【請求項２０】配列番号１７を含む核酸。
【請求項２１】１以上の変性ヌクレオチド置換を作成することにより得ら
れる核酸を含む核酸であって、前記核酸が請求項１２〜２０のいずれか一に記載
の核酸で少なくとも７０％の相同性を保持するものである核酸。
【請求項２２】配列番号１７との組合せで配列番号５または配列番号７を
含む核酸であって、植物細胞において発現させた場合に核がペプチド配列番号６
または配列番号８および配列番号１８を発現する核酸。
【請求項２３】さらに植物プロモーターを含む、請求項１２から２２のい
ずれか一に記載の核酸。
【請求項２４】前記植物プロモーターが、Ｅ３５Ｓ、ＵＢＱ３、ＵＢＱ１
０、ＵＢＱ１１およびＵＢＱ１４プロモーターからなる群から選択されるもので
ある請求項２３に記載の核酸。
【請求項２５】請求項１２〜２２のいずれか一に記載の核酸で植物細胞を
形質転換させることを含む、植物細胞に微生物耐性を付与する方法。
【請求項２６】請求項１２〜２２のいずれか一に記載の核酸で植物細胞を
形質転換させることを含む、植物細胞に植物原形質に対する耐性を付与する方法
。
【請求項２７】請求項１２〜２２のいずれか一に記載の核酸で植物細胞を
形質転換させることを含む、植物細胞にウドンコ病菌に対する耐性を付与する方
法。
【請求項２８】前記植物細胞がポインセチア植物細胞である、請求項２７
に記載の方法。
【請求項２９】前記植物細胞がペチュニア植物細胞である、請求項２７に
記載の方法。
【請求項３０】請求項２３に記載の核酸で植物細胞を形質転換させること
を含む、植物細胞に微生物耐性を付与する方法。
【請求項３１】請求項２３に記載の核酸で植物細胞を形質転換させること
を含む、植物細胞に植物原形質に対する耐性を付与する方法。
【請求項３２】請求項２３に記載の核酸で植物細胞を形質転換させること
を含む、植物細胞にウドンコ病菌に対する耐性を付与する方法。
【請求項３３】前記植物細胞がポインセチア植物細胞である、請求項３２
に記載の方法。
【請求項３４】前記植物細胞がペチュニア植物細胞である、請求項３２に
記載の方法。
【請求項３５】植物細胞に微生物耐性を付与する方法であって、配列番号
５または配列番号７を含む核酸と配列番号１７を含む核酸とで細胞を共形質転換
させることを含む方法。
【請求項３６】前記核酸の１以上がさらに、Ｅ３５Ｓ、ＵＢＱ３およびＵ
ＢＱ１０から選択されたプロモーターを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】植物細胞に微生物耐性を付与する方法であって、細胞を形
質転換させてマガイニンおよびＰＧＬクラスから選択した２つのペプチドを発現
させることを含み、前記ペプチドが別々に画分されている方法。
【請求項３８】請求項１２〜２２のいずれか一に記載の核酸により形質転
換されてこれを発現する植物組織。
【請求項３９】ポインセチア植物組織である請求項３８に記載の植物組織
。
【請求項４０】ペチュニア植物組織である請求項３８に記載の植物組織。
【請求項４１】請求項２３に記載の核酸により形質転換されてこれを発現
する植物組織。
【請求項４２】ポインセチア植物組織である請求項４１に記載の植物組織
。
【請求項４３】ペチュニア植物組織である請求項４１に記載の植物組織。
【請求項４４】請求項２４に記載の核酸により形質転換されてこれを発現
する植物組織。
【請求項４５】ポインセチア植物組織である請求項４４に記載の植物組織
。
【請求項４６】ペチュニア植物組織である請求項４４に記載の植物組織。