JP2002538828A - 広域性病原体に耐性を有するトランスジェニック植物 - Google Patents
広域性病原体に耐性を有するトランスジェニック植物Info
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Abstract
(57)【要約】
デルマセプチンおよび/またはテンポリンのペプチドを発現するトランスジェニック植物を開示する。ある態様では、これらの植物は広域の病原体に対する強い耐性を有し、農作物または園芸作物として有用である。他の態様では、この植物はデルマセプチンおよび/またはテンポリンのペプチドを大量に産生する目的で使用される。
Description
【０００１】 発明の分野 本発明は、テンポリンおよび/またはデルマセプチンのファミリーに属する1種
または複数のペプチドを発現するように遺伝子操作された植物に関する。
または複数のペプチドを発現するように遺伝子操作された植物に関する。
【０００２】 発明の背景 植物は、さまざまな植物病原性の真菌、細菌、ウイルスおよび線虫を原因とす
る数千種に及ぶ伝染病の宿主である。これらの病原体は、成長中の植物への感染
および収穫後の作物の廃棄の両方に起因する全世界における作物の著しい損失の
原因となる。これら病原体による損害を小さくするために最も広く実施されてい
る方法は、多様な化学薬剤の使用を含む。しかしながら、少なくない病原体が化
学薬剤に耐性を示し、一部の病原体（特にウイルス）は、化学的な方法による抑
制に感受性がない。また、使用される化学薬剤の多くは広いスペクトルを持つ毒
素であり、深刻な環境破壊ならびにヒトに対する毒性作用の原因となりうる。
る数千種に及ぶ伝染病の宿主である。これらの病原体は、成長中の植物への感染
および収穫後の作物の廃棄の両方に起因する全世界における作物の著しい損失の
原因となる。これら病原体による損害を小さくするために最も広く実施されてい
る方法は、多様な化学薬剤の使用を含む。しかしながら、少なくない病原体が化
学薬剤に耐性を示し、一部の病原体（特にウイルス）は、化学的な方法による抑
制に感受性がない。また、使用される化学薬剤の多くは広いスペクトルを持つ毒
素であり、深刻な環境破壊ならびにヒトに対する毒性作用の原因となりうる。
【０００３】 植物の育種法、さらに最近では遺伝子工学的手法も、植物に対する病原体に対
峙するために用いられている。いくつかの例では、育種家および分子生物学者が
、ある種の病原体に対する耐性植物の作出に成功している。過去数年間に、植物
から多くの植物R（resistance）遺伝子群が単離されている。R遺伝子を、ある種
の病原体に対して通常は感受性である作物に導入する場合、同遺伝子はある病原
体に対して強い耐性をもたらす。例えば、米国特許第5,571,706号には、タバコ
モザイクウイルスに対する耐性の強化をもたらすタバコN遺伝子の単離について
記載されている。しかしながら、従来の育種法および遺伝子工学的なアプローチ
が、現時点で病原体耐性の強化に成功していると報告されている一方で、通常は
1種の病原体または少数の近縁病原体による問題を対象としているに過ぎない。
その結果、これらのアプローチを用いて作出した作物では、1種の病原体に対す
る防御が強化されるものの、その他の病原体をコ抑制するためには従来の化学薬
剤の使用が未だ必要となる。
峙するために用いられている。いくつかの例では、育種家および分子生物学者が
、ある種の病原体に対する耐性植物の作出に成功している。過去数年間に、植物
から多くの植物R（resistance）遺伝子群が単離されている。R遺伝子を、ある種
の病原体に対して通常は感受性である作物に導入する場合、同遺伝子はある病原
体に対して強い耐性をもたらす。例えば、米国特許第5,571,706号には、タバコ
モザイクウイルスに対する耐性の強化をもたらすタバコN遺伝子の単離について
記載されている。しかしながら、従来の育種法および遺伝子工学的なアプローチ
が、現時点で病原体耐性の強化に成功していると報告されている一方で、通常は
1種の病原体または少数の近縁病原体による問題を対象としているに過ぎない。
その結果、これらのアプローチを用いて作出した作物では、1種の病原体に対す
る防御が強化されるものの、その他の病原体をコ抑制するためには従来の化学薬
剤の使用が未だ必要となる。
【０００４】 細菌および真菌の病原体を含む広域の病原体に対する耐性が強化された植物を
作出することができる場合には、農業分野で極めて有益であると思われる。その
ような植物を本発明では対象とする。
作出することができる場合には、農業分野で極めて有益であると思われる。その
ような植物を本発明では対象とする。
【０００５】 発明の概要 本発明者らは、トランスジェニック植物におけるある種のペプチドの発現が、
真菌および細菌の病原体の両方に対する耐性強化を含む広いスペクトルの病原体
耐性をもたらすことを見出した。このペプチドは、ある種のカエルの皮膚に天然
にみられるテンポリンおよびデルマセプチンのファミリーに属する低分子で、正
に帯電した（陽性の）ペプチドである。本発明で提供するトランスジェニック植
物は、食用作物などの一般的な農業的適用に用いることができる。または、この
植物を収穫・処理することで、発現したテンポリンおよび/またはデルマセプチ
ンのペプチドを抽出し、さらに精製して医学的適用およびその他の適用において
使用することができる。
真菌および細菌の病原体の両方に対する耐性強化を含む広いスペクトルの病原体
耐性をもたらすことを見出した。このペプチドは、ある種のカエルの皮膚に天然
にみられるテンポリンおよびデルマセプチンのファミリーに属する低分子で、正
に帯電した（陽性の）ペプチドである。本発明で提供するトランスジェニック植
物は、食用作物などの一般的な農業的適用に用いることができる。または、この
植物を収穫・処理することで、発現したテンポリンおよび/またはデルマセプチ
ンのペプチドを抽出し、さらに精製して医学的適用およびその他の適用において
使用することができる。
【０００６】 したがって本発明は、少なくとも1種のデルマセプチンまたはテンポリンのペ
プチドを発現するトランスジェニック植物と、そのような植物を作出する方法を
含む。種子、果実、茎、葉および根を含むこのような植物の一部は、食糧供給源
として、またはデルマセプチンまたはテンポリンのペプチド源として従来の方法
で使用することができる。あらゆる植物種は、1種または複数の植物病原体に感
受性があるので、本発明は、任意の植物種に広いスペクトルの耐性を作り上げる
際に有用に応用することができる。したがって本発明は、単子葉植物、双子葉植
物、および裸子植物のいずれにも応用することができる。これらの植物には、ト
ウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、ダイズ、ワタ、一般的なマメ類、セイヨ
ウアブラナ/カノーラ、アルファルファ、アマ、ヒマワリ、ベニバナ、アブラナ
、ラッカセイ、クローバーのほか、レタス、トマト、ウリ、キャッサバ、ジャガ
イモ、ニンジン、ダイコン、エンドウ、ヒラマメ、キャベツ、カリフラワー、ブ
ロッコリー、メキャベツ、コショウなどの野菜類、カンキツ属、リンゴ、ナシ、
モモ、アプリコット、クルミなどの木に実る果物類、および、ラン、カーネーシ
ョン、バラなどの花卉類が含まれるがこれらに限定されない。
プチドを発現するトランスジェニック植物と、そのような植物を作出する方法を
含む。種子、果実、茎、葉および根を含むこのような植物の一部は、食糧供給源
として、またはデルマセプチンまたはテンポリンのペプチド源として従来の方法
で使用することができる。あらゆる植物種は、1種または複数の植物病原体に感
受性があるので、本発明は、任意の植物種に広いスペクトルの耐性を作り上げる
際に有用に応用することができる。したがって本発明は、単子葉植物、双子葉植
物、および裸子植物のいずれにも応用することができる。これらの植物には、ト
ウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、ダイズ、ワタ、一般的なマメ類、セイヨ
ウアブラナ/カノーラ、アルファルファ、アマ、ヒマワリ、ベニバナ、アブラナ
、ラッカセイ、クローバーのほか、レタス、トマト、ウリ、キャッサバ、ジャガ
イモ、ニンジン、ダイコン、エンドウ、ヒラマメ、キャベツ、カリフラワー、ブ
ロッコリー、メキャベツ、コショウなどの野菜類、カンキツ属、リンゴ、ナシ、
モモ、アプリコット、クルミなどの木に実る果物類、および、ラン、カーネーシ
ョン、バラなどの花卉類が含まれるがこれらに限定されない。
【０００７】 最も基本的な形態で本発明は、1種または複数のデルマセプチンおよび/または
テンポリンのペプチドを発現するトランスジェニック植物を提供する。デルマセ
プチンおよびテンポリンのペプチドファミリーに属するペプチド類は、当技術分
野において周知である。本発明で使用するデルマセプチンの例には、モール（Mo
r）ら、Biochemistry、30:8824-8830、1991、Strahilevitz、Biochemistry、33:
10951-10960、1994およびウェクセルベルガー（Wechselberger）、Biochim. Bio
phys. Acta 1388: 279-283、1998に記載されたデルマセプチン群が含まれるが、
これらに限定されない。使用するテンポリンの例には、シマコ（Simmaco）ら、E
ur. J. Biochem.、242:788-92、1996に記載されたテンポリン群が含まれるが、
これらに限定されない。自然界に存在する状態（すなわちカエルの細胞内で発現
する状態）では、デルマセプチンおよびテンポリンのペプチドはいずれも前駆体
として産生され、前駆型は後にタンパク質分解性の切断によるプロセシングを受
けて成熟型のタンパク質となる。成熟型のデルマセプチンは通常約27〜34残基の
アミノ酸であり、成熟型のテンポリンは通常長さが約10〜13残基のアミノ酸であ
る。本発明では、天然の完全長（プロセシング前）の形のペプチドならびに、成
熟型（プロセシング後）のペプチドおよび中間体の両方の使用を考えている。ま
た、合成したペプチドも使用することができる。合成ペプチドには天然には存在
せず、アミノ酸配列が天然のペプチドとは異なるもののデルマセプチンまたはテ
ンポリンの生物学的活性を保持するペプチドを含む任意の形態が含まれる。この
ような配列の異型は、通常少なくとも1種の天然のデルマセプチンまたはテンポ
リンのペプチドと少なくとも40%のアミノ酸配列同一性をもつ。
テンポリンのペプチドを発現するトランスジェニック植物を提供する。デルマセ
プチンおよびテンポリンのペプチドファミリーに属するペプチド類は、当技術分
野において周知である。本発明で使用するデルマセプチンの例には、モール（Mo
r）ら、Biochemistry、30:8824-8830、1991、Strahilevitz、Biochemistry、33:
10951-10960、1994およびウェクセルベルガー（Wechselberger）、Biochim. Bio
phys. Acta 1388: 279-283、1998に記載されたデルマセプチン群が含まれるが、
これらに限定されない。使用するテンポリンの例には、シマコ（Simmaco）ら、E
ur. J. Biochem.、242:788-92、1996に記載されたテンポリン群が含まれるが、
これらに限定されない。自然界に存在する状態（すなわちカエルの細胞内で発現
する状態）では、デルマセプチンおよびテンポリンのペプチドはいずれも前駆体
として産生され、前駆型は後にタンパク質分解性の切断によるプロセシングを受
けて成熟型のタンパク質となる。成熟型のデルマセプチンは通常約27〜34残基の
アミノ酸であり、成熟型のテンポリンは通常長さが約10〜13残基のアミノ酸であ
る。本発明では、天然の完全長（プロセシング前）の形のペプチドならびに、成
熟型（プロセシング後）のペプチドおよび中間体の両方の使用を考えている。ま
た、合成したペプチドも使用することができる。合成ペプチドには天然には存在
せず、アミノ酸配列が天然のペプチドとは異なるもののデルマセプチンまたはテ
ンポリンの生物学的活性を保持するペプチドを含む任意の形態が含まれる。この
ような配列の異型は、通常少なくとも1種の天然のデルマセプチンまたはテンポ
リンのペプチドと少なくとも40%のアミノ酸配列同一性をもつ。
【０００８】 使用するデルマセプチンおよびテンポリンの他の合成型には、N末端にペプチ
ドの延長を有する型を含む。延長ペプチドは、タンパク質のプロセシングの過程
で通常除去されるデルマセプチンまたはテンポリンの前駆型の一部からなってい
てもよく、または合成された配列であってもよい。これらのN末端の延長ペプチ
ドは、タンパク質分解性の切断に対する耐性を強化するように働くことがあり、
また、ペプチドの抗菌活性を強化することもある。一般にN末端の延長は長さが2
〜25残基のアミノ酸であるが、延長部分がさらに長いものを用いてもよい。ある
態様で使用するN末端延長配列の例には、ペプチド配列MAMWKおよびMASRHを含む
。AMWK配列は天然ペプチドにおける延長であり、プロセシングの過程で通常切断
される完全長デルマセプチンbペプチド配列の一部である。ASRHは合成型の延長
配列である。個々の例では、ペプチドの適切な発現を確実なものとするためにN
末端のメチオニンが延長ペプチドに付加されている。
ドの延長を有する型を含む。延長ペプチドは、タンパク質のプロセシングの過程
で通常除去されるデルマセプチンまたはテンポリンの前駆型の一部からなってい
てもよく、または合成された配列であってもよい。これらのN末端の延長ペプチ
ドは、タンパク質分解性の切断に対する耐性を強化するように働くことがあり、
また、ペプチドの抗菌活性を強化することもある。一般にN末端の延長は長さが2
〜25残基のアミノ酸であるが、延長部分がさらに長いものを用いてもよい。ある
態様で使用するN末端延長配列の例には、ペプチド配列MAMWKおよびMASRHを含む
。AMWK配列は天然ペプチドにおける延長であり、プロセシングの過程で通常切断
される完全長デルマセプチンbペプチド配列の一部である。ASRHは合成型の延長
配列である。個々の例では、ペプチドの適切な発現を確実なものとするためにN
末端のメチオニンが延長ペプチドに付加されている。
【０００９】 本発明の基本的局面は、トランスジェニック植物におけるテンポリンおよびデ
ルマセプチンのペプチドの発現に基づくが、他のアミノ酸配列をペプチドに連結
して融合ペプチドを作製することもできる。トランスジェニック植物における融
合ペプチドの発現は、テンポリンまたはデルマセプチンのペプチド単独の発現と
比べて、より有効な広いスペクトルの病原体耐性をもたらしうる、または発現す
るデルマセプチン/テンポリン分子の安定性を高めて発現レベルを増すことで植
物組織からペプチドを精製しやすくできる。したがって、本発明の他の態様では
、以下の組成からなる融合ペプチドを発現するトランスジェニック植物を提供す
る。 （1）デルマセプチンまたはテンポリンである第1ペプチド配列；および、 （2）第1ペプチド配列に使用可能に連結させた第2ペプチド配列。 第2ペプチド配列は、第1ペプチド配列のアミノ（N）末端に通常連結されるが、
必ずしもこの連結様式に限定されない。
ルマセプチンのペプチドの発現に基づくが、他のアミノ酸配列をペプチドに連結
して融合ペプチドを作製することもできる。トランスジェニック植物における融
合ペプチドの発現は、テンポリンまたはデルマセプチンのペプチド単独の発現と
比べて、より有効な広いスペクトルの病原体耐性をもたらしうる、または発現す
るデルマセプチン/テンポリン分子の安定性を高めて発現レベルを増すことで植
物組織からペプチドを精製しやすくできる。したがって、本発明の他の態様では
、以下の組成からなる融合ペプチドを発現するトランスジェニック植物を提供す
る。 （1）デルマセプチンまたはテンポリンである第1ペプチド配列；および、 （2）第1ペプチド配列に使用可能に連結させた第2ペプチド配列。 第2ペプチド配列は、第1ペプチド配列のアミノ（N）末端に通常連結されるが、
必ずしもこの連結様式に限定されない。
【００１０】 ある態様では、第2ペプチド配列は陰イオン性の（負に帯電した）「プロ領域
」のペプチド配列からなる。プロ領域のペプチドは、デルマセプチンまたはテン
ポリンの陽イオン性を中和するように作用することで、細胞内環境における安定
性の強化をもたらす可能性がある。したがってプロ領域は一般に、グルタミン酸
（GluまたはE）およびアスパラギン酸（AspまたはD）などの負に帯電したアミノ
酸を多く含む。適切なプロ領域には、天然の切断前（完全長）のデルマセプチン
およびテンポリンのペプチドに見いだされる領域ならびにヒツジのcatheliｎタ
ンパク質のプロ領域などを初めとする哺乳類起源の領域を含む他のペプチドに由
来する陰イオン性プロ領域が含まれる。このようなプロ領域を含む融合ペプチド
はP-DまたはP-Tと表すことができる。この式でPはプロ領域のペプチドを意味し
、Tはテンポリンペプチド、また、Dはデルマセプチンペプチドを意味する。
」のペプチド配列からなる。プロ領域のペプチドは、デルマセプチンまたはテン
ポリンの陽イオン性を中和するように作用することで、細胞内環境における安定
性の強化をもたらす可能性がある。したがってプロ領域は一般に、グルタミン酸
（GluまたはE）およびアスパラギン酸（AspまたはD）などの負に帯電したアミノ
酸を多く含む。適切なプロ領域には、天然の切断前（完全長）のデルマセプチン
およびテンポリンのペプチドに見いだされる領域ならびにヒツジのcatheliｎタ
ンパク質のプロ領域などを初めとする哺乳類起源の領域を含む他のペプチドに由
来する陰イオン性プロ領域が含まれる。このようなプロ領域を含む融合ペプチド
はP-DまたはP-Tと表すことができる。この式でPはプロ領域のペプチドを意味し
、Tはテンポリンペプチド、また、Dはデルマセプチンペプチドを意味する。
【００１１】 上述のプロ領域ペプチドは、デルマセプチンまたはテンポリンのペプチドのN
末端に直接連結されることがあるが、スペーサーペプチドを用いた2種のペプチ
ドの連結が有用な場合がある。2種のペプチドドメインを連結するためにスペー
サーペプチドを使用することは当技術分野において周知である。このようなスペ
ーサーペプチドは通常長さが2〜25残基のアミノ酸であり、第1ペプチド配列と第
2ペプチドを連結する柔軟なヒンジとなる。2種のペプチド配列を連結する柔軟な
ヒンジとして使用するスペーサー配列には、チョウドリー（Chaudhary）ら、Nat
ure 339: 394-397、1989に記載されているグリシン（4）セリンスペーサー（GGG
GS×3）などがある。または、上述のN末端におけるペプチド延長がスペーサーペ
プチドの機能を果たす場合もある。プロ領域ペプチド、スペーサーペプチド、お
よびデルマセプチンまたはテンポリンのペプチドからなる融合ペプチドは、P-S-
DまたはP-S-Tと表すことができる（Sはスペーサーペプチドを意味する）。
末端に直接連結されることがあるが、スペーサーペプチドを用いた2種のペプチ
ドの連結が有用な場合がある。2種のペプチドドメインを連結するためにスペー
サーペプチドを使用することは当技術分野において周知である。このようなスペ
ーサーペプチドは通常長さが2〜25残基のアミノ酸であり、第1ペプチド配列と第
2ペプチドを連結する柔軟なヒンジとなる。2種のペプチド配列を連結する柔軟な
ヒンジとして使用するスペーサー配列には、チョウドリー（Chaudhary）ら、Nat
ure 339: 394-397、1989に記載されているグリシン（4）セリンスペーサー（GGG
GS×3）などがある。または、上述のN末端におけるペプチド延長がスペーサーペ
プチドの機能を果たす場合もある。プロ領域ペプチド、スペーサーペプチド、お
よびデルマセプチンまたはテンポリンのペプチドからなる融合ペプチドは、P-S-
DまたはP-S-Tと表すことができる（Sはスペーサーペプチドを意味する）。
【００１２】 スペーサー配列には、プロテアーゼで認識・切断されるペプチド配列などの切
断部位も含まれる。そのような部位は、植物組織からの精製後にデルマセプチン
またはテンポリンのペプチドからプロ領域を除去しやすくなる。
断部位も含まれる。そのような部位は、植物組織からの精製後にデルマセプチン
またはテンポリンのペプチドからプロ領域を除去しやすくなる。
【００１３】 本発明の上述の局面とそれ以外の局面は、以下の節でさらに詳述する。
【００１４】 配列表 添付した配列表に記載した核酸およびアミノ酸の配列を、ヌクレオチド塩基に
ついては標準的な略号で、また、アミノ酸については3文字表記法を用いて示す
。個々の核酸配列は一本鎖のみを示すが、表示した鎖に対する任意の参照によっ
て含まれるような相補鎖は、理解される。 配列番号：1は、デルマセプチンbのcDNA配列を示す。 配列番号：2は、前駆体（未プロセシング）デルマセプチンbペプチドのアミノ酸
配列を示す。 配列番号：3は、成熟型デルマセプチンbペプチドの27残基のアミノ酸配列を示す
。 配列番号：4は、成熟型デルマセプチンBペプチドの31残基のアミノ酸配列を示す
。 配列番号：5〜14は、さまざまな成熟型（プロセシング後の）デルマセプチンペ
プチドのアミノ酸配列を示す。 配列番号：15は、テンポリンGをコードするcDNA配列を示す。 配列番号：16は、テンポリンGの前駆体（未プロセシング）のアミノ酸配列を示
す。 配列番号：17は、成熟型テンポリンGの13残基のアミノ酸配列を示す。 配列番号：18〜26は、さまざまな成熟型（プロセシング後の）テンポリンペプチ
ドのアミノ酸配列を示す。 配列番号：27は、MSRA2をコードする核酸配列を示す。 配列番号：28は、MSRA2のアミノ酸配列を示す。 配列番号：29〜32は、MSRA2をコードする核酸配列を作製する際に使用したオリ
ゴを示す。 配列番号：33は、MSRA3をコードする核酸配列を示す。 配列番号：34は、MSRA3のアミノ酸配列を示す。 配列番号：35〜38は、MSRA3をコードする核酸配列を作製する際に使用したオリ
ゴを示す。 配列番号：39〜41は、さまざまなN末端延長配列のアミノ酸配列を示す。
ついては標準的な略号で、また、アミノ酸については3文字表記法を用いて示す
。個々の核酸配列は一本鎖のみを示すが、表示した鎖に対する任意の参照によっ
て含まれるような相補鎖は、理解される。 配列番号：1は、デルマセプチンbのcDNA配列を示す。 配列番号：2は、前駆体（未プロセシング）デルマセプチンbペプチドのアミノ酸
配列を示す。 配列番号：3は、成熟型デルマセプチンbペプチドの27残基のアミノ酸配列を示す
。 配列番号：4は、成熟型デルマセプチンBペプチドの31残基のアミノ酸配列を示す
。 配列番号：5〜14は、さまざまな成熟型（プロセシング後の）デルマセプチンペ
プチドのアミノ酸配列を示す。 配列番号：15は、テンポリンGをコードするcDNA配列を示す。 配列番号：16は、テンポリンGの前駆体（未プロセシング）のアミノ酸配列を示
す。 配列番号：17は、成熟型テンポリンGの13残基のアミノ酸配列を示す。 配列番号：18〜26は、さまざまな成熟型（プロセシング後の）テンポリンペプチ
ドのアミノ酸配列を示す。 配列番号：27は、MSRA2をコードする核酸配列を示す。 配列番号：28は、MSRA2のアミノ酸配列を示す。 配列番号：29〜32は、MSRA2をコードする核酸配列を作製する際に使用したオリ
ゴを示す。 配列番号：33は、MSRA3をコードする核酸配列を示す。 配列番号：34は、MSRA3のアミノ酸配列を示す。 配列番号：35〜38は、MSRA3をコードする核酸配列を作製する際に使用したオリ
ゴを示す。 配列番号：39〜41は、さまざまなN末端延長配列のアミノ酸配列を示す。
【００１５】 I．定義 デルマセプチン：本明細書で用いる「デルマセプチン」という用語は、デルマ
セプチンと呼ばれる天然の陽イオン性ペプチドファミリー（Strahilevitz, Bioc
hemistry, 33:10951-960, 1994）に属する任意のペプチドならびにデルマセプチ
ンの以下に定義される生物学的活性を示す天然のペプチド断片および異型を指す
。
セプチンと呼ばれる天然の陽イオン性ペプチドファミリー（Strahilevitz, Bioc
hemistry, 33:10951-960, 1994）に属する任意のペプチドならびにデルマセプチ
ンの以下に定義される生物学的活性を示す天然のペプチド断片および異型を指す
。
【００１６】 デルマセプチン群は、南米に生息する樹上性カエルであるソバージュネコメガ
エル（Phyllomedusa sauvagii）の皮膚抽出物中で当初同定された（Morら, J. B
iol. Chem., 269:31635-31641, 1994）。デルマセプチン群は、繊維性の真菌な
らびに細菌、酵母、および原虫の増殖を阻害する広スペクトル殺菌ペプチドであ
る（Strahilevitz, Biochemistry, 33:10951-10960, 1994）。最初のデルマセプ
チンであるデルマセプチンSの同定以後、このペプチドファミリーに属する多く
の他のメンバーの特徴が決定され、クローン化が行われている。これらペプチド
は以下を含む：ジャイアントネコメガエル（Phyllomedusa bicolor）の皮膚から
単離されたデルマセプチンb（Morら, J. Biol. Chem., 269: 31635-31641, 1994
）（配列番号：2）；ウェクセルベルガー（Wechselberger）、Biochim. Biophys
. Acta 1388:279-283、1998に記載されたメキシコフトアマガエル（Pachymedusa
dacnicolor）から単離され、クローンPD-3-3およびPD-2-2にコードされた2種の
デルマセプチン（ペプチド配列は配列番号：5〜6にそれぞれ示す）。ウェクセル
ベルガーの論文（Biochim. Biophys. Acta 1388:279-283, 1998）に記載された
アガリクニス アナエ（Agalychnis annae）から単離され、クローンAA-3-6、AA-
3-3、AA-3-1にコードされた3種のデルマセプチン（それらのペプチド配列は配列
番号：7〜9にそれぞれ示す）。モルおよびニコラス（Mor and Nicolas）、Journ
al Biochemical Chemistry、269:1934-1939、1994に記載されているソバージュ
ネコメガエルに由来し、デルマセプチン5、デルマセプチン4、デルマセプチン3
、デルマセプチン2、およびデルマセプチン1と命名された5種のデルマセプチン
ペプチド（それらのペプチド配列は配列番号10〜14にそれぞれ示す）。以上の配
列は、ゲンバンクを始めとする公的データベースから容易に入手することができ
る。
エル（Phyllomedusa sauvagii）の皮膚抽出物中で当初同定された（Morら, J. B
iol. Chem., 269:31635-31641, 1994）。デルマセプチン群は、繊維性の真菌な
らびに細菌、酵母、および原虫の増殖を阻害する広スペクトル殺菌ペプチドであ
る（Strahilevitz, Biochemistry, 33:10951-10960, 1994）。最初のデルマセプ
チンであるデルマセプチンSの同定以後、このペプチドファミリーに属する多く
の他のメンバーの特徴が決定され、クローン化が行われている。これらペプチド
は以下を含む：ジャイアントネコメガエル（Phyllomedusa bicolor）の皮膚から
単離されたデルマセプチンb（Morら, J. Biol. Chem., 269: 31635-31641, 1994
）（配列番号：2）；ウェクセルベルガー（Wechselberger）、Biochim. Biophys
. Acta 1388:279-283、1998に記載されたメキシコフトアマガエル（Pachymedusa
dacnicolor）から単離され、クローンPD-3-3およびPD-2-2にコードされた2種の
デルマセプチン（ペプチド配列は配列番号：5〜6にそれぞれ示す）。ウェクセル
ベルガーの論文（Biochim. Biophys. Acta 1388:279-283, 1998）に記載された
アガリクニス アナエ（Agalychnis annae）から単離され、クローンAA-3-6、AA-
3-3、AA-3-1にコードされた3種のデルマセプチン（それらのペプチド配列は配列
番号：7〜9にそれぞれ示す）。モルおよびニコラス（Mor and Nicolas）、Journ
al Biochemical Chemistry、269:1934-1939、1994に記載されているソバージュ
ネコメガエルに由来し、デルマセプチン5、デルマセプチン4、デルマセプチン3
、デルマセプチン2、およびデルマセプチン1と命名された5種のデルマセプチン
ペプチド（それらのペプチド配列は配列番号10〜14にそれぞれ示す）。以上の配
列は、ゲンバンクを始めとする公的データベースから容易に入手することができ
る。
【００１７】 デルマセプチンペプチドは通常、長さが約60〜80残基のアミノ酸からなる前駆
体として発現した後にプロセシングされ、長さが約27〜34残基のアミノ酸からな
る成熟型ペプチドとなる。例えば、デルマセプチンb（配列番号：1；Amicheら,
J. Biol. Chem. 269:1747-1852, 1994；Chapentierら, Biol. Chem. 273:14690-
14697, 1998；ゲンバンクのヌクレオチド配列データベースのアクセッション番
号X72387に登録）をコードするcDNAは78残基のアミノ酸からなる前駆体ペプチド
をコードする（配列番号：2）。デルマセプチンbの前駆型は、プロセシングされ
デルマセプチンbおよびデルマセプチンBと呼ばれる2種の成熟型ペプチドとなる
（Strahilevitz, Biochemistry, 33:10951-10960, 1994）。デルマセプチンb（
配列番号：3）は、長さが27残基のアミノ酸からなり、前駆型アミノ酸の49〜75
番目の残基を含む。デルマセプチンBは、長さが31残基のアミノ酸のオルタネィ
ティブ切断産物で、4残基のアミノ酸からなるN末端延長（AMWK）を含む（配列番
号：4）。デルマセプチンBは前駆型アミノ酸の45〜75番目の残基を含む。完全長
のデルマセプチンbの前駆型を示す配列番号：1および2を除き、配列表に示すデ
ルマセプチンペプチドはプロセシング後の成熟型ペプチドを示す。
体として発現した後にプロセシングされ、長さが約27〜34残基のアミノ酸からな
る成熟型ペプチドとなる。例えば、デルマセプチンb（配列番号：1；Amicheら,
J. Biol. Chem. 269:1747-1852, 1994；Chapentierら, Biol. Chem. 273:14690-
14697, 1998；ゲンバンクのヌクレオチド配列データベースのアクセッション番
号X72387に登録）をコードするcDNAは78残基のアミノ酸からなる前駆体ペプチド
をコードする（配列番号：2）。デルマセプチンbの前駆型は、プロセシングされ
デルマセプチンbおよびデルマセプチンBと呼ばれる2種の成熟型ペプチドとなる
（Strahilevitz, Biochemistry, 33:10951-10960, 1994）。デルマセプチンb（
配列番号：3）は、長さが27残基のアミノ酸からなり、前駆型アミノ酸の49〜75
番目の残基を含む。デルマセプチンBは、長さが31残基のアミノ酸のオルタネィ
ティブ切断産物で、4残基のアミノ酸からなるN末端延長（AMWK）を含む（配列番
号：4）。デルマセプチンBは前駆型アミノ酸の45〜75番目の残基を含む。完全長
のデルマセプチンbの前駆型を示す配列番号：1および2を除き、配列表に示すデ
ルマセプチンペプチドはプロセシング後の成熟型ペプチドを示す。
【００１８】 広範囲のデルマセプチンペプチドの配列、およびこれらのペプチドをコードす
る核酸配列を使用できる場合、当業者であれば、標準的な分子生物学的手法を用
いてこれらのペプチドおよびそれに対応する核酸配列を容易に合成することがで
きると思われる。
る核酸配列を使用できる場合、当業者であれば、標準的な分子生物学的手法を用
いてこれらのペプチドおよびそれに対応する核酸配列を容易に合成することがで
きると思われる。
【００１９】 上述した天然のデルマセプチンペプチドの使用に加えて、天然のデルマセプチ
ンペプチドとは多少変わるものの、植物で発現させた場合に広スペクトルの病原
体耐性の強化をもたらすペプチドを用いて本発明を実施できることは当業者には
明らかであると思われる。例えば、成熟型デルマセプチンペプチドのN末端にあ
るαへリックスの両親媒性セグメント、特に最初の18残基のアミノ酸が抗菌活性
に重要であることが確認されており（Morら, J. Biol. Chem., 269:31635-31641
, 1994; Mor and Nicolas, Journal Biochemical Chemistry, 269:1934-39, 199
4）、この断片が完全長の成熟型デルマセプチンの代わりに使用されることがあ
る。したがって「デルマセプチン」という用語は、デルマセプチンペプチドの異
型ならびに、特定レベルの配列同一性を天然のデルマセプチンペプチドと共有す
る天然ペプチド断片、または1個もしくは複数のアミノ酸が保存的に置換されて
いる点が天然のデルマセプチンペプチドとは異なる天然ペプチド断片も含む。
ンペプチドとは多少変わるものの、植物で発現させた場合に広スペクトルの病原
体耐性の強化をもたらすペプチドを用いて本発明を実施できることは当業者には
明らかであると思われる。例えば、成熟型デルマセプチンペプチドのN末端にあ
るαへリックスの両親媒性セグメント、特に最初の18残基のアミノ酸が抗菌活性
に重要であることが確認されており（Morら, J. Biol. Chem., 269:31635-31641
, 1994; Mor and Nicolas, Journal Biochemical Chemistry, 269:1934-39, 199
4）、この断片が完全長の成熟型デルマセプチンの代わりに使用されることがあ
る。したがって「デルマセプチン」という用語は、デルマセプチンペプチドの異
型ならびに、特定レベルの配列同一性を天然のデルマセプチンペプチドと共有す
る天然ペプチド断片、または1個もしくは複数のアミノ酸が保存的に置換されて
いる点が天然のデルマセプチンペプチドとは異なる天然ペプチド断片も含む。
【００２０】 このような異型ペプチドおよび断片では、後述の方法でアッセイするデルマセ
プチンの生物学的活性が保たれている。異型デルマセプチンは、後述の方法で決
定する場合に、通常、天然のデルマセプチンペプチドと少なくとも40%のアミノ
酸配列同一性を有する（配列番号：3に示すペプチドなど）。
プチンの生物学的活性が保たれている。異型デルマセプチンは、後述の方法で決
定する場合に、通常、天然のデルマセプチンペプチドと少なくとも40%のアミノ
酸配列同一性を有する（配列番号：3に示すペプチドなど）。
【００２１】 デルマセプチンの生物学的活性：デルマセプチンペプチドのもつ細菌増殖およ
び/または真菌増殖を阻害する能力。デルマセプチンの生物学的活性は、後述す
るプロトコールを用いて容易に確認することができる。
び/または真菌増殖を阻害する能力。デルマセプチンの生物学的活性は、後述す
るプロトコールを用いて容易に確認することができる。
【００２２】 所定のデルマセプチンペプチドの抗菌活性は、エルビニア・カロトボーラ菌（
Erwinia carotovora）や大腸菌（Escherichia coli）DH5αなどのペクチン質分
解性細菌株の増殖阻害能力を決定して評価する。任意のペプチドの活性は、ペプ
チドをLB培地で連続的に希釈し、100 μlを96穴のマイクロタイタープレートの
ウェルに取り分けて決定する。次いで新鮮な細菌培養物（0.3以下 A550）をLuri
a-Bertani（LB）培地（1% w/v トリプトンおよび0.5% w/v 酵母エキストラクト
）上で増殖させ、LB培地で10-2倍に希釈して約104〜105のコロニー形成単位（CF
U）/mlとする。次に10 μlの細菌培養物をペプチドを含むウェルに接種し、試料
を37℃で4時間インキュベートする。ウェル含有物を次にLB培地で希釈してLB寒
天培地にプレーティングし、37℃で一晩インキュベートする。次いで、デルマセ
プチン（およびペプチド非添加の対照）の各希釈液に対応するプレート上のコロ
ニー数を集計し、試験用のペプチドの抗菌活性を対照プレートと比較して決定す
る。
Erwinia carotovora）や大腸菌（Escherichia coli）DH5αなどのペクチン質分
解性細菌株の増殖阻害能力を決定して評価する。任意のペプチドの活性は、ペプ
チドをLB培地で連続的に希釈し、100 μlを96穴のマイクロタイタープレートの
ウェルに取り分けて決定する。次いで新鮮な細菌培養物（0.3以下 A550）をLuri
a-Bertani（LB）培地（1% w/v トリプトンおよび0.5% w/v 酵母エキストラクト
）上で増殖させ、LB培地で10-2倍に希釈して約104〜105のコロニー形成単位（CF
U）/mlとする。次に10 μlの細菌培養物をペプチドを含むウェルに接種し、試料
を37℃で4時間インキュベートする。ウェル含有物を次にLB培地で希釈してLB寒
天培地にプレーティングし、37℃で一晩インキュベートする。次いで、デルマセ
プチン（およびペプチド非添加の対照）の各希釈液に対応するプレート上のコロ
ニー数を集計し、試験用のペプチドの抗菌活性を対照プレートと比較して決定す
る。
【００２３】 デルマセプチンペプチドは、このアッセイ条件下で7 μg/mlの濃度で少なくと
も10%の細菌増殖阻害能力をもつ場合に生物学的活性があると判定する（同濃度
における細菌コロニー数は、対照プレート上の細菌コロニー数の90%にすぎない
）。
も10%の細菌増殖阻害能力をもつ場合に生物学的活性があると判定する（同濃度
における細菌コロニー数は、対照プレート上の細菌コロニー数の90%にすぎない
）。
【００２４】 所定のデルマセプチンペプチドの抗真菌活性は、真菌株フィトフトラ・カクト
ラム（Phytophthora cactorum）および/またはフザリウム・ソラニ（Fusarium s
olani）を用いて評価する。選択した真菌株は、20 g/Lのファイブシリアルベビ
ーフードインスタントフレークおよび8 g/Lの寒天（agar3）を含むファイブシリ
アルアガー（Five Cereal Agar; FCA）（Terrasら, The Plant Cell 7:573-588,
1995）上で増殖させる。5日間室温で増殖させた後、菌糸体プラグを除き、未使
用のFCAプレートの中央に上下逆に置く。次に試験用ペプチドの滅菌済溶液（10
μ1）を、プレートの縁から3 cmの位置にあるウェルと、同じプレート上に設け
た滅菌水を含む対照のウェルに注ぐ。さまざまな濃度の試験用ペプチドを同じプ
レート上で、または別のプレート上で試験することができる。5日間室温でイン
キュベートしたアッセイ用プレートを対象に、各ウェルの周囲に生じた増殖阻害
域を測定する。
ラム（Phytophthora cactorum）および/またはフザリウム・ソラニ（Fusarium s
olani）を用いて評価する。選択した真菌株は、20 g/Lのファイブシリアルベビ
ーフードインスタントフレークおよび8 g/Lの寒天（agar3）を含むファイブシリ
アルアガー（Five Cereal Agar; FCA）（Terrasら, The Plant Cell 7:573-588,
1995）上で増殖させる。5日間室温で増殖させた後、菌糸体プラグを除き、未使
用のFCAプレートの中央に上下逆に置く。次に試験用ペプチドの滅菌済溶液（10
μ1）を、プレートの縁から3 cmの位置にあるウェルと、同じプレート上に設け
た滅菌水を含む対照のウェルに注ぐ。さまざまな濃度の試験用ペプチドを同じプ
レート上で、または別のプレート上で試験することができる。5日間室温でイン
キュベートしたアッセイ用プレートを対象に、各ウェルの周囲に生じた増殖阻害
域を測定する。
【００２５】 デルマセプチンペプチドは、このアッセイ条件下で5 μg/mlの濃度で真菌増殖
阻害能力をもつ場合に生物学的活性があると判定する（すなわち同濃度のペプチ
ドを含むくぼみの周囲に識別可能な阻害域が認められる）。
阻害能力をもつ場合に生物学的活性があると判定する（すなわち同濃度のペプチ
ドを含むくぼみの周囲に識別可能な阻害域が認められる）。
【００２６】 テンポリン：本発明で用いる「テンポリン」という用語は、テンポリンと呼ば
れる天然の陽イオン性ペプチドファミリーに属する任意のメンバー（Simmacoら,
Eur. J. Biochem., 242:788-92. 1996）ならびに、テンポリンの生物学的活性
（以下に定義）を示す天然のペプチドの断片および異型を指す。
れる天然の陽イオン性ペプチドファミリーに属する任意のメンバー（Simmacoら,
Eur. J. Biochem., 242:788-92. 1996）ならびに、テンポリンの生物学的活性
（以下に定義）を示す天然のペプチドの断片および異型を指す。
【００２７】 テンポリン群は、抗菌活性を有する低分子量の陽イオン性ペプチドで、ヨーロ
ッパアカガエル（Rana temporaria）の皮膚から調製されたcDNAライブラリーか
ら当初同定された。テンポリンペプチドは、スズメバチ（Vespa）の毒液から単
離された溶血性ペプチドとある程度類似した配列がみられるが、テンポリンペプ
チドに溶血性はない（Simmacoら, Eur. J. Biochem., 242:788-92, 1996）。
ッパアカガエル（Rana temporaria）の皮膚から調製されたcDNAライブラリーか
ら当初同定された。テンポリンペプチドは、スズメバチ（Vespa）の毒液から単
離された溶血性ペプチドとある程度類似した配列がみられるが、テンポリンペプ
チドに溶血性はない（Simmacoら, Eur. J. Biochem., 242:788-92, 1996）。
【００２８】 テンポリンファミリーの10種のペプチドであるテンポリンA、B、C、D、E、F、
G、H、KおよびLは、シマコ（Simmaco）らの論文（Eur. J. Biochem., 242:788-9
2. 1996）に記載されている。デルマセプチンと同様に、テンポリンは通常、前
駆型として発現し、その後にプロセシングされて成熟型となる。例えば、テンポ
リンGをコードするcDNA分子（配列番号：15、ゲンバンクのヌクレオチドデータ
ベースのアクセッション番号Y09395に登録）は、61残基のアミノ酸からなるテン
ポリンG前駆型をコードする（配列番号：16）。1〜22番目のアミノ酸はシグナル
配列を構成し、23〜46番目のアミノ酸はプロ領域を構成し、また、47〜59番目の
アミノ酸はプロセシング後に成熟型テンポリンGペプチドとなる領域を構成する
（成熟型ペプチドは配列番号：17に示す）。一般に予測される成熟型テンポリン
ペプチドは長さが10〜13残基のアミノ酸からなり、Ｃ末端がアミド化されている
ペプチドがいくつか見出されている（Simmacoら, Eur. J. Biochem., 242:788-9
2. 1996）。成熟型のテンポリンA、B、C、D、E、F、G、H、KおよびLは、それぞ
れ配列番号：18、19、20、21、22、23、17、24、25および26に示す。
G、H、KおよびLは、シマコ（Simmaco）らの論文（Eur. J. Biochem., 242:788-9
2. 1996）に記載されている。デルマセプチンと同様に、テンポリンは通常、前
駆型として発現し、その後にプロセシングされて成熟型となる。例えば、テンポ
リンGをコードするcDNA分子（配列番号：15、ゲンバンクのヌクレオチドデータ
ベースのアクセッション番号Y09395に登録）は、61残基のアミノ酸からなるテン
ポリンG前駆型をコードする（配列番号：16）。1〜22番目のアミノ酸はシグナル
配列を構成し、23〜46番目のアミノ酸はプロ領域を構成し、また、47〜59番目の
アミノ酸はプロセシング後に成熟型テンポリンGペプチドとなる領域を構成する
（成熟型ペプチドは配列番号：17に示す）。一般に予測される成熟型テンポリン
ペプチドは長さが10〜13残基のアミノ酸からなり、Ｃ末端がアミド化されている
ペプチドがいくつか見出されている（Simmacoら, Eur. J. Biochem., 242:788-9
2. 1996）。成熟型のテンポリンA、B、C、D、E、F、G、H、KおよびLは、それぞ
れ配列番号：18、19、20、21、22、23、17、24、25および26に示す。
【００２９】 広範囲のテンポリンペプチドの配列、およびこれらのペプチドをコードする核
酸配列を使用できる場合、当業者であれば、標準的な分子生物学的手法を用いて
これらのペプチドおよびそれらに対応する核酸配列を容易に作製することができ
ると思われる。
酸配列を使用できる場合、当業者であれば、標準的な分子生物学的手法を用いて
これらのペプチドおよびそれらに対応する核酸配列を容易に作製することができ
ると思われる。
【００３０】 上述した天然のテンポリンペプチドの使用に加えて、天然のテンポリンペプチ
ドとは多少変わるものの、植物で発現させた場合に広スペクトルの病原体耐性の
強化をもたらすペプチドを用いて本発明を実施できることは当業者には明らかで
あると思われる。したがって「テンポリン」という用語は、テンポリンペプチド
の異型ならびに、特定レベルの配列同一性を天然のテンポリンペプチドと共有す
る天然ペプチド断片、または1個もしくは複数のアミノ酸が保存的に置換されて
いる点が天然のテンポリンペプチドとは異なる天然ペプチド断片も含む。
ドとは多少変わるものの、植物で発現させた場合に広スペクトルの病原体耐性の
強化をもたらすペプチドを用いて本発明を実施できることは当業者には明らかで
あると思われる。したがって「テンポリン」という用語は、テンポリンペプチド
の異型ならびに、特定レベルの配列同一性を天然のテンポリンペプチドと共有す
る天然ペプチド断片、または1個もしくは複数のアミノ酸が保存的に置換されて
いる点が天然のテンポリンペプチドとは異なる天然ペプチド断片も含む。
【００３１】 このような異型ペプチドおよび断片では、後述の方法でアッセイするテンポリ
ンの生物学的活性が保たれている。異型テンポリンは、後述の方法で決定される
場合、通常、天然のテンポリンペプチドと少なくとも40%のアミノ酸配列同一性
を有する（配列番号：17に示すペプチドなど）。
ンの生物学的活性が保たれている。異型テンポリンは、後述の方法で決定される
場合、通常、天然のテンポリンペプチドと少なくとも40%のアミノ酸配列同一性
を有する（配列番号：17に示すペプチドなど）。
【００３２】 テンポリンの生物学的活性：テンポリンペプチドのもつ細菌増殖阻害能力。
【００３３】 所定のテンポリンペプチドの抗菌活性は、エルビニア・カロトボーラ菌や大腸
菌DH5αなどのペクチン質分解性細菌株の増殖阻害能力を決定して評価する。所
定のペプチドの活性は、ペプチドをLB培地で連続希釈し、100 μlを96穴のマイ
クロタイタープレートのウェルに取り分けて決定する。次いで新鮮な細菌培養物
（0.3以下 A550）をLuria-Bertani（LB）培地（1% w/v トリプトンおよび0.5% w
/v 酵母エキストラクト）上で増殖させ、LB培地で10-2倍に希釈して約104〜105
のコロニー形成単位（CFU）/mlとする。次に10 μlの細菌培養物をペプチドを含
むウェルに接種し、試料を37℃で4時間インキュベートする。ウェル含有物を次
にLB培地で希釈してLB寒天培地にプレーティングし、37℃で一晩インキュベート
する。次いで、テンポリン（およびペプチド非添加の対照）の各希釈液に対応す
るプレート上のコロニー数を集計し、試験されるペプチドの抗菌活性を対照プレ
ートと比較して決定する。
菌DH5αなどのペクチン質分解性細菌株の増殖阻害能力を決定して評価する。所
定のペプチドの活性は、ペプチドをLB培地で連続希釈し、100 μlを96穴のマイ
クロタイタープレートのウェルに取り分けて決定する。次いで新鮮な細菌培養物
（0.3以下 A550）をLuria-Bertani（LB）培地（1% w/v トリプトンおよび0.5% w
/v 酵母エキストラクト）上で増殖させ、LB培地で10-2倍に希釈して約104〜105
のコロニー形成単位（CFU）/mlとする。次に10 μlの細菌培養物をペプチドを含
むウェルに接種し、試料を37℃で4時間インキュベートする。ウェル含有物を次
にLB培地で希釈してLB寒天培地にプレーティングし、37℃で一晩インキュベート
する。次いで、テンポリン（およびペプチド非添加の対照）の各希釈液に対応す
るプレート上のコロニー数を集計し、試験されるペプチドの抗菌活性を対照プレ
ートと比較して決定する。
【００３４】 テンポリンペプチドは、このアッセイ条件下で100 μg/mlの濃度で少なくとも
10%の細菌増殖阻害能力をもつ場合に生物学的活性があると判定する（同濃度に
おける細菌コロニー数は、対照プレート上の細菌コロニー数の90%にすぎない）
。
10%の細菌増殖阻害能力をもつ場合に生物学的活性があると判定する（同濃度に
おける細菌コロニー数は、対照プレート上の細菌コロニー数の90%にすぎない）
。
【００３５】 所定のテンポリンペプチドの抗真菌活性は、真菌株フィトフトラ・カクトラム
および/またはフザリウム・ソラニ（Fusarium solami）を用いて評価する。選択
した真菌株は、20 g/Lのファイブシリアルベビーフードインスタントフレークお
よび8 g/Lの寒天（agar3）を含むファイブシリアルアガー（Terrasら, The Plan
t Cell 7:573-588, 1995）上で増殖させる。5日間室温で増殖させた後、菌糸体
プラグを除き、未使用のFCAプレートの中央に上下逆に置く。次に試験用ペプチ
ドの滅菌済溶液（10 μl）を、プレートの縁から3 cmの位置にあるウェルと、同
じプレート上に設けた滅菌水を含む対照のウェルに注ぐ。さまざまな濃度の試験
用プチドを同じプレート上で、または別のプレート上で試験することができる。
5日間室温でインキュベートしたアッセイ用プレートを対象に、各ウェルの周囲
に生じた増殖阻害域を測定する。
および/またはフザリウム・ソラニ（Fusarium solami）を用いて評価する。選択
した真菌株は、20 g/Lのファイブシリアルベビーフードインスタントフレークお
よび8 g/Lの寒天（agar3）を含むファイブシリアルアガー（Terrasら, The Plan
t Cell 7:573-588, 1995）上で増殖させる。5日間室温で増殖させた後、菌糸体
プラグを除き、未使用のFCAプレートの中央に上下逆に置く。次に試験用ペプチ
ドの滅菌済溶液（10 μl）を、プレートの縁から3 cmの位置にあるウェルと、同
じプレート上に設けた滅菌水を含む対照のウェルに注ぐ。さまざまな濃度の試験
用プチドを同じプレート上で、または別のプレート上で試験することができる。
5日間室温でインキュベートしたアッセイ用プレートを対象に、各ウェルの周囲
に生じた増殖阻害域を測定する。
【００３６】 テンポリンペプチドは、このアッセイの条件下で5 μg/mlの濃度で真菌増殖阻
害能力をもつ場合に生物学的活性があると判定する（すなわち同濃度のペプチド
を含むくぼみの周囲に識別可能な阻害域が認められる）。
害能力をもつ場合に生物学的活性があると判定する（すなわち同濃度のペプチド
を含むくぼみの周囲に識別可能な阻害域が認められる）。
【００３７】 トランスジェニック植物：本明細書で用いるこの用語は、ある野生型の植物に
は通常みられない組換え遺伝物質を含む同植物を指す。したがって、形質転換で
組換えDNAを導入した植物細胞から成長した植物はトランスジェニック植物であ
り、その植物のすべての子孫は、（その作出法が有性生殖的または無性生殖的な
方法であれ）導入された外来遺伝子を含む。
は通常みられない組換え遺伝物質を含む同植物を指す。したがって、形質転換で
組換えDNAを導入した植物細胞から成長した植物はトランスジェニック植物であ
り、その植物のすべての子孫は、（その作出法が有性生殖的または無性生殖的な
方法であれ）導入された外来遺伝子を含む。
【００３８】 配列同一性：2種の核酸配列または2種のアミノ酸配列間の類似性は、配列間で
共有される配列同一性のレベルで表される。配列同一性は同一性のパーセンテー
ジで通常表され、パーセンテージが大きくなればなるほど、2種の配列の類似性
は増す。
共有される配列同一性のレベルで表される。配列同一性は同一性のパーセンテー
ジで通常表され、パーセンテージが大きくなればなるほど、2種の配列の類似性
は増す。
【００３９】 比較目的の配列アライメントの方法は当技術分野において周知である。さまざ
まなプログラムおよびアライメントアルゴリズムが諸文献に記載されている（Sm
ith and Waterman, Adv. Appl. Math, 2:482, 1981；Needleman and Wunsch, J.
Mol. Biol., 48:443, 1970；Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 85:2444, 1988；Higgins & Sharp, GeNe. 73:237-244, 1988；Higgins & Sha
rp, CABIOS, 5:151-153. 1989; Corpetら, Nucleic Acids Research, 16:10881-
10890, 1988；Huang,ら, 「バイオサイエンスにおけるコンピューターの適用（C
omputer Applications in the Biosciences）」, 8:155-165, 1992；およびPear
sonら, Methods in Molecular Biology, 24:307-331, 1994）。アルツチュル（A
ltschul）らは、配列アライメントおよびホモロジー計算についての詳細な考察
を述べている（Nature GeNe 6:119-129, 1994）。
まなプログラムおよびアライメントアルゴリズムが諸文献に記載されている（Sm
ith and Waterman, Adv. Appl. Math, 2:482, 1981；Needleman and Wunsch, J.
Mol. Biol., 48:443, 1970；Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 85:2444, 1988；Higgins & Sharp, GeNe. 73:237-244, 1988；Higgins & Sha
rp, CABIOS, 5:151-153. 1989; Corpetら, Nucleic Acids Research, 16:10881-
10890, 1988；Huang,ら, 「バイオサイエンスにおけるコンピューターの適用（C
omputer Applications in the Biosciences）」, 8:155-165, 1992；およびPear
sonら, Methods in Molecular Biology, 24:307-331, 1994）。アルツチュル（A
ltschul）らは、配列アライメントおよびホモロジー計算についての詳細な考察
を述べている（Nature GeNe 6:119-129, 1994）。
【００４０】 NCBIのBasic Local Alignment Search Tool（BLAST）（Altschulら, J. Mol.
Biol. 215:403-410, 1990）は、National Center for BioTechnology Informati
on（NCBI、メリーランド州ベセスダ）を含む複数の供給源から、また、配列解析
プログラム（blastp、blastn、blastx、tblastnおよびtblastx）に関連する使用
のためにインターネット上から入手することができる。BLASTは、http//www.ncb
i.nlm.nih.gov/BLAST/でアクセスすることができる。このプログラムを用いた配
列同一性の決定法は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.htmlで
解説されている。
Biol. 215:403-410, 1990）は、National Center for BioTechnology Informati
on（NCBI、メリーランド州ベセスダ）を含む複数の供給源から、また、配列解析
プログラム（blastp、blastn、blastx、tblastnおよびtblastx）に関連する使用
のためにインターネット上から入手することができる。BLASTは、http//www.ncb
i.nlm.nih.gov/BLAST/でアクセスすることができる。このプログラムを用いた配
列同一性の決定法は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.htmlで
解説されている。
【００４１】 本発明に有用な天然のデルマセプチンおよびテンポリンの異型ペプチドは通常
、NCBI Blast 2.0.1 （Altschulら, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997に
記載）を用いてアライメントさせた場合に天然のテンポリンペプチドまたはデル
マセプチンペプチドのアミノ酸配列の完全長アライメントに対して少なくとも40
%の配列同一性をもつことを特徴とする。約30アミノ酸を上回る数のアミノ酸配
列の比較では、デフォルトのパラメータ（gap existence costが11、per residu
e gap costが1）を設定したデフォルトのBLOSUM62行列を用いたBlast 2の配列関
数（sequence function）を使用する。短いペプチド（約30アミノ酸残基以下）
をアライメントさせる場合は、デフォルトのパラメータ（open gap 9, extensio
n gap 1 penalties）を設定したPAM30マトリックスを用いたBlast 2配列関数を
使用してアライメントを実施する必要がある。標準配列に対する類似性がさらに
高いタンパク質は、この方法で評価する場合、少なくとも45%、少なくとも50%、
少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なく
とも95%の配列同一性である高い同一性（%）を示すと思われる。
、NCBI Blast 2.0.1 （Altschulら, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997に
記載）を用いてアライメントさせた場合に天然のテンポリンペプチドまたはデル
マセプチンペプチドのアミノ酸配列の完全長アライメントに対して少なくとも40
%の配列同一性をもつことを特徴とする。約30アミノ酸を上回る数のアミノ酸配
列の比較では、デフォルトのパラメータ（gap existence costが11、per residu
e gap costが1）を設定したデフォルトのBLOSUM62行列を用いたBlast 2の配列関
数（sequence function）を使用する。短いペプチド（約30アミノ酸残基以下）
をアライメントさせる場合は、デフォルトのパラメータ（open gap 9, extensio
n gap 1 penalties）を設定したPAM30マトリックスを用いたBlast 2配列関数を
使用してアライメントを実施する必要がある。標準配列に対する類似性がさらに
高いタンパク質は、この方法で評価する場合、少なくとも45%、少なくとも50%、
少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なく
とも95%の配列同一性である高い同一性（%）を示すと思われる。
【００４２】 組換え体：組換え核酸は、天然にはない配列を有する核酸、または2種の通常
は分かれた配列セグメントを人工的に組み合わせすることにより作製される配列
を有する核酸である。人工的な組み合わせは、化学合成、またはより一般的には
、単離された核酸セグメントを人工的に操作することで、例えば遺伝子工学的手
法で行われることが多い。
は分かれた配列セグメントを人工的に組み合わせすることにより作製される配列
を有する核酸である。人工的な組み合わせは、化学合成、またはより一般的には
、単離された核酸セグメントを人工的に操作することで、例えば遺伝子工学的手
法で行われることが多い。
【００４３】 オリゴヌクレオチド（オリゴ）：最長約100ヌクレオチドの塩基からなる直鎖
状のポリヌクレオチド配列。
状のポリヌクレオチド配列。
【００４４】 プローブおよびプライマー：核酸のプローブおよびプライマーは、本発明で提
供されるアミノ酸配列を元に容易に調製することができる。プローブは、検出可
能な標識またはレポーター分子に結合する単独の核酸からなる。標識は一般に、
放射性同位元素、リガンド、化学発光薬剤、および酵素などがを含む。さまざま
な目的に適した標識の選択における標識方法および誘手引きは、例えば、サムブ
ロック（Sambrook）ら、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Clon
ing: A Laboratory Manual」 Cold Spring Harbor、1989およびアウスベル（Aus
ubel）ら、「分子生物における最新のプロコール（Current Protocols in Molec
ular Biology）」、Greene Publishing Associates and Wiley-intersciences、
1987の諸文献に記載されている。
供されるアミノ酸配列を元に容易に調製することができる。プローブは、検出可
能な標識またはレポーター分子に結合する単独の核酸からなる。標識は一般に、
放射性同位元素、リガンド、化学発光薬剤、および酵素などがを含む。さまざま
な目的に適した標識の選択における標識方法および誘手引きは、例えば、サムブ
ロック（Sambrook）ら、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Clon
ing: A Laboratory Manual」 Cold Spring Harbor、1989およびアウスベル（Aus
ubel）ら、「分子生物における最新のプロコール（Current Protocols in Molec
ular Biology）」、Greene Publishing Associates and Wiley-intersciences、
1987の諸文献に記載されている。
【００４５】 プライマーは短い核酸で、好ましくは15ヌクレオチドまたはそれ以上の長さの
DNAオリゴヌクレオチドである。プライマーは、核酸ハイブリダイゼーションに
よりプライマーと標的DNA鎖とのハイブリッドを形成させることで、相補的な標
的DNA鎖にアニーリングさせた後、DNAポリメラーゼ酵素を用いて標的DNA鎖に沿
って伸長させることができる。プライマー対は例えば、当技術分野において周知
であるポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）または他の核酸増幅法による核酸配列の
増幅に使用することができる。
DNAオリゴヌクレオチドである。プライマーは、核酸ハイブリダイゼーションに
よりプライマーと標的DNA鎖とのハイブリッドを形成させることで、相補的な標
的DNA鎖にアニーリングさせた後、DNAポリメラーゼ酵素を用いて標的DNA鎖に沿
って伸長させることができる。プライマー対は例えば、当技術分野において周知
であるポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）または他の核酸増幅法による核酸配列の
増幅に使用することができる。
【００４６】 プローブおよびプライマーの調製・使用方法は、例えば、サムブロック（Samb
rook）ら、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Labor
atory Manual）」、Cold Spring Harbor、1989；Ausubelら、「分子生物学にお
ける最新のプロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、Gree
ne Publishing Associates and Wiley-intersciences、1987；およびイニス（In
nis）ら、「PCRプロトコール（PCR Protocols）」、「方法と適用の手引き（A G
uide to Methods and Applications）」、1990の諸文献に記載されている。PCR
用のプライマー対は、例えば、「Primer」（バージョン0.5, （著作権）1991, W
hitehead institute for Biomedical Research、マサチューセッツ州ケンブリッ
ジ）などのその目的のために指定されたコンピュータプログラムを用いることで
、既知の配列を元に合成することができる。特定のプローブまたはプライマーの
特異性が、それらが長くなるほど増すことを当業者であれば理解すると思われる
。したがって例えば20個の連続したヌクレオチドからなるプライマーは、わずか
15残基のヌクレオチドからなる対応するプライマーより高い特異性で標的とアニ
ーリングする。したがって、特異性を大きくすることを目的として、、20、25、
30、35、40、50またはそれ以上の連続したヌクレオチドからなるプローブおよび
プライマーより選択されることがある。
rook）ら、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Labor
atory Manual）」、Cold Spring Harbor、1989；Ausubelら、「分子生物学にお
ける最新のプロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、Gree
ne Publishing Associates and Wiley-intersciences、1987；およびイニス（In
nis）ら、「PCRプロトコール（PCR Protocols）」、「方法と適用の手引き（A G
uide to Methods and Applications）」、1990の諸文献に記載されている。PCR
用のプライマー対は、例えば、「Primer」（バージョン0.5, （著作権）1991, W
hitehead institute for Biomedical Research、マサチューセッツ州ケンブリッ
ジ）などのその目的のために指定されたコンピュータプログラムを用いることで
、既知の配列を元に合成することができる。特定のプローブまたはプライマーの
特異性が、それらが長くなるほど増すことを当業者であれば理解すると思われる
。したがって例えば20個の連続したヌクレオチドからなるプライマーは、わずか
15残基のヌクレオチドからなる対応するプライマーより高い特異性で標的とアニ
ーリングする。したがって、特異性を大きくすることを目的として、、20、25、
30、35、40、50またはそれ以上の連続したヌクレオチドからなるプローブおよび
プライマーより選択されることがある。
【００４７】 単離された：「単離された」生物学的構成成分（核酸またはタンパク質または
細胞小器官など）は、構成成分が天然に生じる生物体の細胞に含まれる他の生物
学的構成成分（すなわち他の染色体DNAおよび染色体外DNAならびにRNA、タンパ
ク質および細胞小器官）と実質的に分離または精製される。「単離された」核酸
およびタンパク質には、標準的な精製法で精製された核酸およびタンパク質が含
まれる。この用語はまた、宿主細胞内における組換え体発現により調製された核
酸およびタンパク質ならびに化学的に合成された核酸を含む。
細胞小器官など）は、構成成分が天然に生じる生物体の細胞に含まれる他の生物
学的構成成分（すなわち他の染色体DNAおよび染色体外DNAならびにRNA、タンパ
ク質および細胞小器官）と実質的に分離または精製される。「単離された」核酸
およびタンパク質には、標準的な精製法で精製された核酸およびタンパク質が含
まれる。この用語はまた、宿主細胞内における組換え体発現により調製された核
酸およびタンパク質ならびに化学的に合成された核酸を含む。
【００４８】 ベクター：宿主細胞に導入され、それのよって形質転換された宿主細胞を形質
転換する核酸分子。ベクターは、宿主細胞内における複製を可能とする核酸配列
、例えば複製起点などを含むことがある。ベクターはまた、当技術分野において
周知である一つまたは複数のマーカー遺伝子および他の遺伝的エレメントを含む
ことがある。
転換する核酸分子。ベクターは、宿主細胞内における複製を可能とする核酸配列
、例えば複製起点などを含むことがある。ベクターはまた、当技術分野において
周知である一つまたは複数のマーカー遺伝子および他の遺伝的エレメントを含む
ことがある。
【００４９】 使用可能に連結された：第1の核酸配列は、第1の核酸配列と第2の核酸配列が
機能的関係のある配置に置かれた場合に、第2の核酸配列と使用可能に連結され
る。例えばプロモーターは、そのプロモーターがコード配列の転写または発現に
影響する場合にはコード配列と使用可能に連結される。一般に、使用可能に連結
されたDNA配列は隣接し、必要な場合には2種のタンパク質のコード領域は同じ読
み枠になるように連結される。2種のペプチド配列は、通常のペプチド結合を介
して、または他の共有結合によって使用可能に連結されることがある。
機能的関係のある配置に置かれた場合に、第2の核酸配列と使用可能に連結され
る。例えばプロモーターは、そのプロモーターがコード配列の転写または発現に
影響する場合にはコード配列と使用可能に連結される。一般に、使用可能に連結
されたDNA配列は隣接し、必要な場合には2種のタンパク質のコード領域は同じ読
み枠になるように連結される。2種のペプチド配列は、通常のペプチド結合を介
して、または他の共有結合によって使用可能に連結されることがある。
【００５０】 II．デルマセプチンペプチドおよびテンポリンペプチドの選択 a．デルマセプチンペプチド デルマセプチンペプチド群を例示した一覧表は既に記載した。表に示すような
デルマセプチンのポリペプチドをコードする核酸分子は、ペプチド配列に対する
遺伝暗号の単なる適用に由来するか、または天然のcDNAもしくは遺伝子配列が使
用されることがある。例として、デルマセプチンbをコードするcDNA配列を配列
番号：1に挙げる（これはAmicheら, J. Biol. Chem. 269:1747-852, 1994で発表
されている）。通常、成熟型のデルマセプチンペプチドが発現用に選択される。
しかし、完全長のデルマセプチンペプチドの任意の断片は、その断片を病原体耐
性植物の作出に使用する場合には、デルマセプチンの生物学的活性を有する条件
下で選択されることがある。
デルマセプチンのポリペプチドをコードする核酸分子は、ペプチド配列に対する
遺伝暗号の単なる適用に由来するか、または天然のcDNAもしくは遺伝子配列が使
用されることがある。例として、デルマセプチンbをコードするcDNA配列を配列
番号：1に挙げる（これはAmicheら, J. Biol. Chem. 269:1747-852, 1994で発表
されている）。通常、成熟型のデルマセプチンペプチドが発現用に選択される。
しかし、完全長のデルマセプチンペプチドの任意の断片は、その断片を病原体耐
性植物の作出に使用する場合には、デルマセプチンの生物学的活性を有する条件
下で選択されることがある。
【００５１】 様々なデルマセプチンペプチドがさまざまな程度の抗菌活性を有し、一部のペ
プチドはある種の病原体に対して他の病原体よりも効率的に作用することを当業
者であれば理解すると思われる。したがって、耐病性が強化されたトランスジェ
ニック植物作出用のペプチドを選択する際は、特定のデルマセプチンの選択は数
ある因子のなかでも、ペプチドを発現させる植物種、およびその植物種に通常感
染する病原体種に依存すると思われる。
プチドはある種の病原体に対して他の病原体よりも効率的に作用することを当業
者であれば理解すると思われる。したがって、耐病性が強化されたトランスジェ
ニック植物作出用のペプチドを選択する際は、特定のデルマセプチンの選択は数
ある因子のなかでも、ペプチドを発現させる植物種、およびその植物種に通常感
染する病原体種に依存すると思われる。
【００５２】 発現させる所望のデルマセプチンペプチドを選択する際は、該ペプチドをコー
ドする核酸分子は、標準的な分子生物学的手法で作製することができる。デルマ
セプチンペプチドは比較的短いので、核酸分子の極めて単純な合成法は、市販の
オリゴヌクレオチド合成装置を用いて、重複したオリゴヌクレオチドの合成を介
するものである場合が高い。したがってオリゴヌクレオチドは、インビトロで完
全長のコード領域にまとめることができる。このアプローチでは、核酸分子を導
入する植物におけるコドン使用の傾向を反映させることで発現効率を高める、特
定のアミノ酸残基をコードするコドンの選択も可能となる。このアプローチを用
いたコード配列作製の詳細な例は、下記の実施例で説明する。
ドする核酸分子は、標準的な分子生物学的手法で作製することができる。デルマ
セプチンペプチドは比較的短いので、核酸分子の極めて単純な合成法は、市販の
オリゴヌクレオチド合成装置を用いて、重複したオリゴヌクレオチドの合成を介
するものである場合が高い。したがってオリゴヌクレオチドは、インビトロで完
全長のコード領域にまとめることができる。このアプローチでは、核酸分子を導
入する植物におけるコドン使用の傾向を反映させることで発現効率を高める、特
定のアミノ酸残基をコードするコドンの選択も可能となる。このアプローチを用
いたコード配列作製の詳細な例は、下記の実施例で説明する。
【００５３】 b．テンポリンペプチド テンポリンペプチド群を例示した一覧表は上に記載した。表に示すようなテン
ポリンのペプチドをコードする核酸分子は、ペプチド配列に対する遺伝暗号の単
純な適用に由来するか、または、天然のcDNAもしくは遺伝子配列が使用されるこ
とがある。例としてテンポリンGをコードするcDNA配列を配列番号：15に挙げる
。通常、成熟型のテンポリンペプチドが発現用に選択される。しかし、完全長の
テンポリンペプチドの任意の断片は、その断片を病原体耐性植物の作出に使用す
る場合には、デルマセプチンの生物学的活性を有する条件下で選択されることが
ある。
ポリンのペプチドをコードする核酸分子は、ペプチド配列に対する遺伝暗号の単
純な適用に由来するか、または、天然のcDNAもしくは遺伝子配列が使用されるこ
とがある。例としてテンポリンGをコードするcDNA配列を配列番号：15に挙げる
。通常、成熟型のテンポリンペプチドが発現用に選択される。しかし、完全長の
テンポリンペプチドの任意の断片は、その断片を病原体耐性植物の作出に使用す
る場合には、デルマセプチンの生物学的活性を有する条件下で選択されることが
ある。
【００５４】 デルマセプチンペプチドの選択と同様に、さまざまなテンポリンペプチドがさ
まざまな程度の抗菌活性を有し、一部のペプチドがある種の病原体に対して他の
病原体よりも効率的に作用することを当業者であれば理解すると思われる。した
がって、病原体耐性が強化されたトランスジェニック植物作出用のペプチドを選
択する際は、特定のテンポリンの選択は数ある因子のなかでも、ペプチドを発現
させる植物種、および対象植物種に有害な病原体種に依存すると思われる。
まざまな程度の抗菌活性を有し、一部のペプチドがある種の病原体に対して他の
病原体よりも効率的に作用することを当業者であれば理解すると思われる。した
がって、病原体耐性が強化されたトランスジェニック植物作出用のペプチドを選
択する際は、特定のテンポリンの選択は数ある因子のなかでも、ペプチドを発現
させる植物種、および対象植物種に有害な病原体種に依存すると思われる。
【００５５】 上述のデルマセプチンと同様に、重複したオリゴヌクレオチドの合成および集
合が、テンポリンをコードする核酸分子を合成する単純かつ便宜な方法である。
合が、テンポリンをコードする核酸分子を合成する単純かつ便宜な方法である。
【００５６】 ｃ．他のペプチド配列の付加 テンポリンおよびデルマセプチンのタンパク質は、トランスジェニック植物内
で融合タンパク質の形態で発現させることもできる。任意の所望のペプチドを、
植物における発現用に選択されるデルマセプチンまたはテンポリンのタンパク質
と融合することができるが、デルマセプチンまたはテンポリンのアミノ末端に使
用可能に連結させた陰イオン性プロ領域ペプチドからなる融合タンパク質の発現
は特に有用であると予想される。この目的のために、任意の陰イオン性プロ領域
ペプチドを使用することができ、このようなペプチドには、天然の完全長（すな
わち未プロセシング）のデルマセプチンペプチドおよびテンポリンペプチドに存
在する陰イオン性プロ領域が含まれる。例えば、テンポリンGのアミノ酸の23〜4
6番目の残基からなるプロ領域（配列番号：16に示される）は、プロ領域として
使用することができる。プロ領域のペプチドは、デルマセプチンまたはテンポリ
ンの陽イオン性を中和するために働き、この働きにより細胞内環境における安定
性の強化がもたらされうる。したがってプロ領域は一般に、グルタミン酸（Glu
またはE）およびアスパラギン酸（AspまたはD）などの負に帯電したアミノ酸を
多く含む。
で融合タンパク質の形態で発現させることもできる。任意の所望のペプチドを、
植物における発現用に選択されるデルマセプチンまたはテンポリンのタンパク質
と融合することができるが、デルマセプチンまたはテンポリンのアミノ末端に使
用可能に連結させた陰イオン性プロ領域ペプチドからなる融合タンパク質の発現
は特に有用であると予想される。この目的のために、任意の陰イオン性プロ領域
ペプチドを使用することができ、このようなペプチドには、天然の完全長（すな
わち未プロセシング）のデルマセプチンペプチドおよびテンポリンペプチドに存
在する陰イオン性プロ領域が含まれる。例えば、テンポリンGのアミノ酸の23〜4
6番目の残基からなるプロ領域（配列番号：16に示される）は、プロ領域として
使用することができる。プロ領域のペプチドは、デルマセプチンまたはテンポリ
ンの陽イオン性を中和するために働き、この働きにより細胞内環境における安定
性の強化がもたらされうる。したがってプロ領域は一般に、グルタミン酸（Glu
またはE）およびアスパラギン酸（AspまたはD）などの負に帯電したアミノ酸を
多く含む。
【００５７】 当技術分野において周知である他の天然のプロ領域ペプチドの例には、以下に
挙げるタンパク質のプロ領域ペプチドが含まれる：ヒト好中球のデフェンシンタ
ンパク質（Daherら, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 85:7327-7331, 1988）；ウシ
の抗菌性カセリシディン（cathelincidin）タンパク質BMAP28（Skerlavajら, J.
Biol. Chem. 271:28375-381, 1996）；ヒツジの抗菌性カセリン（cathelin）フ
ァミリータンパク質（Mahoneyら, FEBS Lett. 377:519-522, 1995）；ウシのイ
ンドリシディン（indolicidin）（Del Salら, Biochem. Biophys. Res. Commun.
187:467-472, 1992）；ブタの抗菌性ペプチドprophen in-2およびPR-39（Zhao et ad., FEES Lett. 367:130-134, 1995）およびPMAP-3
7（Tossiら, Eur. J. Biochem, 15:941-946, 1995）；ヒトの抗菌性リポ多糖結
合タンパク質CAP18（Larrickら, Infect. Immun. 63:1291-1297, 1995）；およ
び、ネズミのタンパク質E3（Scott and Collins, Blood 88:2517-2530, 1996）
。
挙げるタンパク質のプロ領域ペプチドが含まれる：ヒト好中球のデフェンシンタ
ンパク質（Daherら, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 85:7327-7331, 1988）；ウシ
の抗菌性カセリシディン（cathelincidin）タンパク質BMAP28（Skerlavajら, J.
Biol. Chem. 271:28375-381, 1996）；ヒツジの抗菌性カセリン（cathelin）フ
ァミリータンパク質（Mahoneyら, FEBS Lett. 377:519-522, 1995）；ウシのイ
ンドリシディン（indolicidin）（Del Salら, Biochem. Biophys. Res. Commun.
187:467-472, 1992）；ブタの抗菌性ペプチドprophen in-2およびPR-39（Zhao et ad., FEES Lett. 367:130-134, 1995）およびPMAP-3
7（Tossiら, Eur. J. Biochem, 15:941-946, 1995）；ヒトの抗菌性リポ多糖結
合タンパク質CAP18（Larrickら, Infect. Immun. 63:1291-1297, 1995）；およ
び、ネズミのタンパク質E3（Scott and Collins, Blood 88:2517-2530, 1996）
。
【００５８】 陰イオン性プロ領域ペプチドは、陽イオン性ペプチドのN末端に直接連結する
ことができるが、スペーサーペプチド配列を用いて、プロ領域ペプチドをデルマ
セプチンまたはテンポリンのペプチドと連結する別の態様がある。2種のペプチ
ドドメインを連結するためにスペーサーペプチドを使用することは当技術分野に
おいて周知であり、このようなスペーサーペプチドは通常長さが2〜25残基のア
ミノ酸であり、第1ペプチド配列と第2ペプチドを連結する柔軟なヒンジとなる。
2種のペプチド配列を連結する柔軟なヒンジとして使用されるスペーサー配列に
は、チョウドリー（Chaudhary)らの論文（Nature 339: 394-397, 1989）に記載
されているグリシン（4）セリンスペーサー（GGGGS×3）を含む。または後述す
るN末端のペプチド延長がスペーサーペプチドの機能を果たす場合もある。スペ
ーサー配列ペプチドには、因子Xaなどのプロテアーゼで認識・切断されるペプチ
ド配列などの切断部位も含まれる。切断部位があることで、植物組織からの精製
後にデルマセプチンまたはテンポリンのペプチドからプロ領域を除去しやすくな
る。ある種の陽イオン性ペプチドを微生物系で発現させるために、陰イオン性プ
ロ領域ペプチドおよびスペーサーペプチドを使用することは当技術分野において
周知であり、ハンコック（HaNcock）による米国特許第5,593,866号に記載されて
いる。
ことができるが、スペーサーペプチド配列を用いて、プロ領域ペプチドをデルマ
セプチンまたはテンポリンのペプチドと連結する別の態様がある。2種のペプチ
ドドメインを連結するためにスペーサーペプチドを使用することは当技術分野に
おいて周知であり、このようなスペーサーペプチドは通常長さが2〜25残基のア
ミノ酸であり、第1ペプチド配列と第2ペプチドを連結する柔軟なヒンジとなる。
2種のペプチド配列を連結する柔軟なヒンジとして使用されるスペーサー配列に
は、チョウドリー（Chaudhary)らの論文（Nature 339: 394-397, 1989）に記載
されているグリシン（4）セリンスペーサー（GGGGS×3）を含む。または後述す
るN末端のペプチド延長がスペーサーペプチドの機能を果たす場合もある。スペ
ーサー配列ペプチドには、因子Xaなどのプロテアーゼで認識・切断されるペプチ
ド配列などの切断部位も含まれる。切断部位があることで、植物組織からの精製
後にデルマセプチンまたはテンポリンのペプチドからプロ領域を除去しやすくな
る。ある種の陽イオン性ペプチドを微生物系で発現させるために、陰イオン性プ
ロ領域ペプチドおよびスペーサーペプチドを使用することは当技術分野において
周知であり、ハンコック（HaNcock）による米国特許第5,593,866号に記載されて
いる。
【００５９】 ある態様では、N末端の延長ペプチド配列を、デルマセプチンまたはテンポリ
ンのペプチドに付加することができる。このような延長ペプチドは、タンパク質
のプロセシング過程で通常除去されるデルマセプチンまたはテンポリンの前駆型
の一部からなる場合があるほか、合成された配列の場合がある。N末端の延長ペ
プチドは、タンパク質分解性の切断に対する耐性を強化し、転写レベルを強化し
、またはペプチドの抗菌活性を強化するように働くことがある。一般にN末端の
延長は長さが2〜25残基のアミノ酸であるが、延長部分をさらに長くする場合も
ある。ある態様で使用されるN末端の延長配列の例には、ペプチド配列AMWK、ASR
HおよびALWKなどがある。AMWK（配列番号：39）配列は天然ペプチドにおける延
長であり、プロセシングの過程で通常切断される完全長のデルマセプチンbペプ
チド配列の一部である。（デルマセプチンBを合成するために）デルマセプチンb
のN末端へこの配列を付加すると、該ペプチドのインビトロにおける抗菌活性が
強化されることが報告されている（Strahilevitz, Biochemistry, 33:10951-109
60, 1995）。ASRH（配列番号：41）およびALWK（配列番号：41）のペプチドは合
成型の延長配列である。個々の場合において、ペプチドの適切な発現を確実にす
るためにN末端にメチオニンが付加されている。任意の特定のN末端の延長ペプチ
ドの付加が、産生ペプチド（デルマセプチンまたはテンポリン）の生物学的活性
に及ぼす効果を、上述の生物学的活性アッセイで容易に評価可能であることを当
業者であれば理解すると思われる。
ンのペプチドに付加することができる。このような延長ペプチドは、タンパク質
のプロセシング過程で通常除去されるデルマセプチンまたはテンポリンの前駆型
の一部からなる場合があるほか、合成された配列の場合がある。N末端の延長ペ
プチドは、タンパク質分解性の切断に対する耐性を強化し、転写レベルを強化し
、またはペプチドの抗菌活性を強化するように働くことがある。一般にN末端の
延長は長さが2〜25残基のアミノ酸であるが、延長部分をさらに長くする場合も
ある。ある態様で使用されるN末端の延長配列の例には、ペプチド配列AMWK、ASR
HおよびALWKなどがある。AMWK（配列番号：39）配列は天然ペプチドにおける延
長であり、プロセシングの過程で通常切断される完全長のデルマセプチンbペプ
チド配列の一部である。（デルマセプチンBを合成するために）デルマセプチンb
のN末端へこの配列を付加すると、該ペプチドのインビトロにおける抗菌活性が
強化されることが報告されている（Strahilevitz, Biochemistry, 33:10951-109
60, 1995）。ASRH（配列番号：41）およびALWK（配列番号：41）のペプチドは合
成型の延長配列である。個々の場合において、ペプチドの適切な発現を確実にす
るためにN末端にメチオニンが付加されている。任意の特定のN末端の延長ペプチ
ドの付加が、産生ペプチド（デルマセプチンまたはテンポリン）の生物学的活性
に及ぼす効果を、上述の生物学的活性アッセイで容易に評価可能であることを当
業者であれば理解すると思われる。
【００６０】 d．デルマセプチンおよびテンポリンの異型ペプチド 上述の通り、テンポリンおよびデルマセプチンの天然のペプチドの多くは周知
であり、配列表に示したものによって例示される。天然ペプチドの異型は、アミ
ノ酸の置換の導入、アミノ酸残基の追加、またはアミノ酸残基の欠失により選択
することができる。このような異型ペプチドは、（例えば異型ペプチドが機能的
活性を保つことを確認する目的で）化学的に合成できるほか、生物学的発現系を
用いて作製することができる。後者の場合、対応する天然のペプチドをコードす
る核酸配列を対象として異型ペプチドをコードするように操作することができる
。この際に例えば、部位特異的変異導入またはポリメラーゼ連鎖反応といったさ
まざまな方法を用いることができる。または、これらのペプチドは比較的短い分
子であることから、異型ペプチドのコード領域を単純にデノボで合成して適切な
発現ベクターに導入することができる。
であり、配列表に示したものによって例示される。天然ペプチドの異型は、アミ
ノ酸の置換の導入、アミノ酸残基の追加、またはアミノ酸残基の欠失により選択
することができる。このような異型ペプチドは、（例えば異型ペプチドが機能的
活性を保つことを確認する目的で）化学的に合成できるほか、生物学的発現系を
用いて作製することができる。後者の場合、対応する天然のペプチドをコードす
る核酸配列を対象として異型ペプチドをコードするように操作することができる
。この際に例えば、部位特異的変異導入またはポリメラーゼ連鎖反応といったさ
まざまな方法を用いることができる。または、これらのペプチドは比較的短い分
子であることから、異型ペプチドのコード領域を単純にデノボで合成して適切な
発現ベクターに導入することができる。
【００６１】 アミノ酸配列の最も単純な修飾には、1個または複数のアミノ酸と、類似の生
物学的性質を有するアミノ酸との置換が含まれる。これらのいわゆる保存的置換
は、最終的なタンパク質の活性に及ぼす影響が極めて小さい可能性がある。した
がって天然のテンポリンまたはデルマセプチンのペプチドとは、1か所または複
数の箇所の保存的アミノ酸の置換が異なるペプチドを本発明における天然ペプチ
ドの代わりに使用することができる。表1は、あるタンパク質中の本来のアミノ
酸と置換可能なアミノ酸および、保存的置換とみなされるアミノ酸を示す。
物学的性質を有するアミノ酸との置換が含まれる。これらのいわゆる保存的置換
は、最終的なタンパク質の活性に及ぼす影響が極めて小さい可能性がある。した
がって天然のテンポリンまたはデルマセプチンのペプチドとは、1か所または複
数の箇所の保存的アミノ酸の置換が異なるペプチドを本発明における天然ペプチ
ドの代わりに使用することができる。表1は、あるタンパク質中の本来のアミノ
酸と置換可能なアミノ酸および、保存的置換とみなされるアミノ酸を示す。
【表１】
【００６２】 機能または他の特徴におけるより実質的な変化は、表1に挙げた置換ほど保存
的ではない置換を選択することで、すなわち（a）置換領域におけるポリペプチ
ドバックボーンの構造、例えばシートまたはらせん構造、（b）標的部位にある
分子の電荷または疎水性、または（c）側鎖の大きさの維持に及ぼす作用がさら
に有意に異なる残基を選択することで得られる。タンパク質の性質を極めて大き
く変化させると通常予想される置換には以下のような置換がある：（a）親水性
残基（例えばセリルまたはスレオニル）と疎水性の残基（例えばロイシル、イソ
ロイシル、フェニルアラニル、アラニル）の置換；（b）システインまたはプロ
リンと他の残基との（またはによる）置換；（c）電気的に陽性の側鎖を有する
残基（例えばリシル、アルギニル、またはヒスチジル）と電気的に陰性の残基（
例えばグルタミルまたはアスパルチル）との置換；または（d）大きな側鎖をも
つ残基、例えばフェニルアラニンと側鎖をもたない残基、例えばグリシンとの（
またはによる）置換。上記のようなより実質的な変化を1種または複数有する異
型ペプチドを、テンポリンまたはデルマセプチンの生物学的活性が保たれている
場合に限り本発明で使用することもできる。
的ではない置換を選択することで、すなわち（a）置換領域におけるポリペプチ
ドバックボーンの構造、例えばシートまたはらせん構造、（b）標的部位にある
分子の電荷または疎水性、または（c）側鎖の大きさの維持に及ぼす作用がさら
に有意に異なる残基を選択することで得られる。タンパク質の性質を極めて大き
く変化させると通常予想される置換には以下のような置換がある：（a）親水性
残基（例えばセリルまたはスレオニル）と疎水性の残基（例えばロイシル、イソ
ロイシル、フェニルアラニル、アラニル）の置換；（b）システインまたはプロ
リンと他の残基との（またはによる）置換；（c）電気的に陽性の側鎖を有する
残基（例えばリシル、アルギニル、またはヒスチジル）と電気的に陰性の残基（
例えばグルタミルまたはアスパルチル）との置換；または（d）大きな側鎖をも
つ残基、例えばフェニルアラニンと側鎖をもたない残基、例えばグリシンとの（
またはによる）置換。上記のようなより実質的な変化を1種または複数有する異
型ペプチドを、テンポリンまたはデルマセプチンの生物学的活性が保たれている
場合に限り本発明で使用することもできる。
【００６３】 さらに広範囲なアミノ酸の変化は、異型のデルマセプチンまたはテンポリンの
ペプチドに作り変えることもできる。しかし上述した通り、これらの異型ペプチ
ドは通常、上述のアライメントプログラムを用いたそれら個々の天然配列のアミ
ノ酸配列の完全長アライメントにおいて少なくとも40%の配列が同一であること
を特徴とする。また、このような異型ペプチドは生物学的活性を保つ。
ペプチドに作り変えることもできる。しかし上述した通り、これらの異型ペプチ
ドは通常、上述のアライメントプログラムを用いたそれら個々の天然配列のアミ
ノ酸配列の完全長アライメントにおいて少なくとも40%の配列が同一であること
を特徴とする。また、このような異型ペプチドは生物学的活性を保つ。
【００６４】 デルマセプチンまたはテンポリンのペプチドが生物学的活性をもつことは、上
述のアッセイ系を用いて確認される。ペプチドが所望の活性をもつことが確認さ
れれば、該ペプチドをコードする核酸分子は、標準的な分子生物学的手法を用い
て容易に作製することができる。適当な場合には、読み枠の選択時に、ペプチド
を発現させる植物種のコドン使用の傾向を考慮する。
述のアッセイ系を用いて確認される。ペプチドが所望の活性をもつことが確認さ
れれば、該ペプチドをコードする核酸分子は、標準的な分子生物学的手法を用い
て容易に作製することができる。適当な場合には、読み枠の選択時に、ペプチド
を発現させる植物種のコドン使用の傾向を考慮する。
【００６５】 III．デルマセプチンおよび/またはテンポリンの植物への導入 デルマセプチンおよび/またはテンポリンのペプチドをコードする核酸配列を
合成後は、植物に耐病性を付与するために、標準的な手法を用いてその配列をト
ランスジェニック植物で発現させることができる、。植物細胞中で核酸を発現さ
せる制御配列（例えばプロモーター）に使用可能に連結させるようにした形質転
換用ベクターに核酸をクローニングすることが基本的なアプローチとなる。次に
形質転換用ベクターを、多くの手法（例えばエレクトロポレーション）の一つを
用いて植物細胞に導入し、その細胞から植物体を再生させ、導入した核酸を有す
る子孫植物を選択する。好ましくは形質転換用ベクターのすべてまたは一部は、
植物細胞のゲノムに安定して組み込まれる。植物細胞に組み込まれる形質転換用
ベクターの上記部分、ならびに導入配列および発現を制御する関連配列を含む部
分（導入した「外来遺伝子」）は、組換え用発現カセットと呼ぶことができる。
合成後は、植物に耐病性を付与するために、標準的な手法を用いてその配列をト
ランスジェニック植物で発現させることができる、。植物細胞中で核酸を発現さ
せる制御配列（例えばプロモーター）に使用可能に連結させるようにした形質転
換用ベクターに核酸をクローニングすることが基本的なアプローチとなる。次に
形質転換用ベクターを、多くの手法（例えばエレクトロポレーション）の一つを
用いて植物細胞に導入し、その細胞から植物体を再生させ、導入した核酸を有す
る子孫植物を選択する。好ましくは形質転換用ベクターのすべてまたは一部は、
植物細胞のゲノムに安定して組み込まれる。植物細胞に組み込まれる形質転換用
ベクターの上記部分、ならびに導入配列および発現を制御する関連配列を含む部
分（導入した「外来遺伝子」）は、組換え用発現カセットと呼ぶことができる。
【００６６】 導入した外来遺伝子を含む子孫植物は、表現型の変化を検出することで選択す
ることができる。表現型の変化起因するか、または形質転換用ベクターに組み込
んだ優性選択マーカー遺伝子の封入の結果としての化学薬剤（例えば抗生物質）
に対する耐性強化として表れる可能性がある。
ることができる。表現型の変化起因するか、または形質転換用ベクターに組み込
んだ優性選択マーカー遺伝子の封入の結果としての化学薬剤（例えば抗生物質）
に対する耐性強化として表れる可能性がある。
【００６７】 クローン化した核酸配列を用いた形質転換による植物の特徴の改変が成功した
例は、科学技術論文に十分に記載されている。当技術分野における知見を示す選
択された例は以下を含む。 米国特許第5,571,706号（「植物ウイルス耐性遺伝子および方法」） 米国特許第5,677,175号（「植物病原体の誘導タンパク質」） 米国特許第5,510,471号（「植物形質転換用のキメラ遺伝子」） 米国特許第5,750,386号（「病原体耐性を有するトランスジェニック植物」） 米国特許第5,597,945号（「耐病性を遺伝的に強化した植物」） 米国特許第5,589,615号（「改変型2S貯蔵アルブミンの発現により栄養価を高め
たトランスジェニック植物の作出過程」） 米国特許第5,750,871号（「アブラナ種における形質転換および外来遺伝子の発
現」） 米国特許第5,268,526号（「トランスジェニック植物におけるフィトクロムの過
剰発現」） 米国特許第5,780,708号（「稔性を有する遺伝子導入トウモロコシ植物体」） 米国特許第5,538,880号（「稔性を有する遺伝子導入トウモロコシ植物体の調製
法」） 米国特許第5,773,269号（「稔性を有する遺伝子導入オートムギ植物体」） 米国特許第5,736,369号（「遺伝子導入穀物植物体の作出法」） 米国特許第5,610,042号（「コムギの安定な形質転換法」）
例は、科学技術論文に十分に記載されている。当技術分野における知見を示す選
択された例は以下を含む。 米国特許第5,571,706号（「植物ウイルス耐性遺伝子および方法」） 米国特許第5,677,175号（「植物病原体の誘導タンパク質」） 米国特許第5,510,471号（「植物形質転換用のキメラ遺伝子」） 米国特許第5,750,386号（「病原体耐性を有するトランスジェニック植物」） 米国特許第5,597,945号（「耐病性を遺伝的に強化した植物」） 米国特許第5,589,615号（「改変型2S貯蔵アルブミンの発現により栄養価を高め
たトランスジェニック植物の作出過程」） 米国特許第5,750,871号（「アブラナ種における形質転換および外来遺伝子の発
現」） 米国特許第5,268,526号（「トランスジェニック植物におけるフィトクロムの過
剰発現」） 米国特許第5,780,708号（「稔性を有する遺伝子導入トウモロコシ植物体」） 米国特許第5,538,880号（「稔性を有する遺伝子導入トウモロコシ植物体の調製
法」） 米国特許第5,773,269号（「稔性を有する遺伝子導入オートムギ植物体」） 米国特許第5,736,369号（「遺伝子導入穀物植物体の作出法」） 米国特許第5,610,042号（「コムギの安定な形質転換法」）
【００６８】 これらの例には、形質転換用ベクターの選択、形質転換法、および導入した外
来遺伝子を過剰に発現するように設計したコンストラクトの構築に関する記述が
含まれる。
来遺伝子を過剰に発現するように設計したコンストラクトの構築に関する記述が
含まれる。
【００６９】 a．植物種 多くの病原体によって引き起こされる病気は、多種多様な植物種に影響を及ぼ
す。このような植物は、単子葉植物、双子葉植物または裸子植物の場合がある。
したがって例えば、デルマセプチンおよび/またはテンポリンのペプチドは、ト
ウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、ダイズ、ワタ、一般的なマメ類、セイヨ
ウアブラナ/カノーラ、アルファルファ、アマ、ヒマワリ、ベニバナ、アブラナ
、タバコ、ラッカセイ、クローバー、ササゲ、ブドウのほか、レタス、トマト、
ウリ、キャッサバ、ジャガイモ、ニンジン、ダイコン、エンドウ、ヒラマメ、キ
ャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、メキャベツ、コショウなどの野菜、カン
キツ属、リンゴ、ナシ、モモ、アプリコット、クルミなどの木に実る果物、およ
び、アメリカトガサワラおよびテーダマツなどのモミノキ、および、カーネーシ
ョン、バラなどの花卉を含む植物種に導入することができるがこれらに限定され
ない。
す。このような植物は、単子葉植物、双子葉植物または裸子植物の場合がある。
したがって例えば、デルマセプチンおよび/またはテンポリンのペプチドは、ト
ウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、ダイズ、ワタ、一般的なマメ類、セイヨ
ウアブラナ/カノーラ、アルファルファ、アマ、ヒマワリ、ベニバナ、アブラナ
、タバコ、ラッカセイ、クローバー、ササゲ、ブドウのほか、レタス、トマト、
ウリ、キャッサバ、ジャガイモ、ニンジン、ダイコン、エンドウ、ヒラマメ、キ
ャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、メキャベツ、コショウなどの野菜、カン
キツ属、リンゴ、ナシ、モモ、アプリコット、クルミなどの木に実る果物、およ
び、アメリカトガサワラおよびテーダマツなどのモミノキ、および、カーネーシ
ョン、バラなどの花卉を含む植物種に導入することができるがこれらに限定され
ない。
【００７０】 b．ベクターの構築とプロモーターの選択 植物細胞の安定なトランスフェクションまたは、トランスジェニック植物の確
立に適した多くの組換え用ベクターが、パウエルズ（Pouwels）ら、「クローニ
ングベクター：実験マニュアル（Cloning Vectors: A Laboratory Manual）」、
1985、supp.、1987；Weissbach and Weissbach、Methods for Plant Molecular
Biology、Academic Press. 5:173-184、1989；およびGelvinら、「植物分子生物
学マニュアル（Plant Molecular Biology Manual）」、Kluwer Academic Publis
hers、1990の文献に記載されている。植物の形質転換用ベクターには通常、5’
端および3’端の調節配列の転写制御下にある一つまたは複数のクローン化され
た配列および優性選択マーカーが含まれる。このような植物用形質転換用ベクタ
ーは通常、プロモーター調節領域（例えば誘導可能なもしくは構成的な発現、環
境もしくは発生による調節を受ける発現、または、細胞もしくは組織に特異的な
発現、を制御する調節領域）、転写開始の開始点、リボソーム結合部位、RNAプ
ロセシングのシグナル、転写終結点、および/または、ポリアデニル化シグナル
も含む。外来遺伝子の発現に有用な植物の構成的プロモーターの例は以下を含む
：多くの植物組織で構成的かつ高レベルの発現をもたらすカリフラワーモザイク
ウイルス（CaMV）の35Sプロモーター（例えば、Odelら, Nature, 313:810, 1985
；Dekeyserら, Plant Cell, 2:591, 1990；Terada and Shimamoto, Mol. GeN. G
enet. 220:389, 1990；およびBenfey and Chua, Science, 250:959-966, 1990を
参照）、ノパリン合成酵素プロモーター（Anら, Plant Physiol. 88:547, 1988
）、オクトピン合成酵素プロモーター（Frommら, Plant Cell, 1:977,1989）、
および、翻訳エンハンサー配列をもつ2x CaMV/35Sプロモーター（Kayら, Scienc
e, 236:1299-1302, 1987）。
立に適した多くの組換え用ベクターが、パウエルズ（Pouwels）ら、「クローニ
ングベクター：実験マニュアル（Cloning Vectors: A Laboratory Manual）」、
1985、supp.、1987；Weissbach and Weissbach、Methods for Plant Molecular
Biology、Academic Press. 5:173-184、1989；およびGelvinら、「植物分子生物
学マニュアル（Plant Molecular Biology Manual）」、Kluwer Academic Publis
hers、1990の文献に記載されている。植物の形質転換用ベクターには通常、5’
端および3’端の調節配列の転写制御下にある一つまたは複数のクローン化され
た配列および優性選択マーカーが含まれる。このような植物用形質転換用ベクタ
ーは通常、プロモーター調節領域（例えば誘導可能なもしくは構成的な発現、環
境もしくは発生による調節を受ける発現、または、細胞もしくは組織に特異的な
発現、を制御する調節領域）、転写開始の開始点、リボソーム結合部位、RNAプ
ロセシングのシグナル、転写終結点、および/または、ポリアデニル化シグナル
も含む。外来遺伝子の発現に有用な植物の構成的プロモーターの例は以下を含む
：多くの植物組織で構成的かつ高レベルの発現をもたらすカリフラワーモザイク
ウイルス（CaMV）の35Sプロモーター（例えば、Odelら, Nature, 313:810, 1985
；Dekeyserら, Plant Cell, 2:591, 1990；Terada and Shimamoto, Mol. GeN. G
enet. 220:389, 1990；およびBenfey and Chua, Science, 250:959-966, 1990を
参照）、ノパリン合成酵素プロモーター（Anら, Plant Physiol. 88:547, 1988
）、オクトピン合成酵素プロモーター（Frommら, Plant Cell, 1:977,1989）、
および、翻訳エンハンサー配列をもつ2x CaMV/35Sプロモーター（Kayら, Scienc
e, 236:1299-1302, 1987）。
【００７１】 環境、ホルモン、化学的シグナルおよび/または発生シグナルに応じて調節を
受けるさまざまな植物遺伝子のプロモーターも、植物細胞における外来遺伝子の
発現に使用されることでき、以下によって調節されるプロモーターを含む：（a
）熱（Callisら, Plant Physiol., 88:965,1988；Ainleyら, Plant Mol. Biol.,
22:13-23, 1993；およびGilmartinら, The Plant Cell, 4:839-949, 1992）、
（b）光（例えば、エンドウのrbcS-3Aプロモーター、Kuhlemeierら、Plant Cell
、1:471, 1989、およびトウモロコシのrbcSプロモーター、Schaffher & SheeN,
Plant Cell、3:997、1991、（c）ホルモン、例えばアブシジン酸（Marcotteら,
Plant Cell. 1: 471, 1989）、（d）傷（例えばジャガイモのPinIIプロモーター
（Keilら, Nucl. Acids. Res. 14: 5641-5650, 1986）、アグロバクテリウム(Ag
robacterium)のmasプロモーター（Langridgeら, Bio/Technology 10:305-308, 1
989）、およびブドウのvst1プロモーター（Weiseら, Plant Mol. Biol., 26:667
-677, 1994））、および（e）ジャスモン酸メチルまたはサリチル酸など化学物
質（Gatzら, Plant Mol. Biol. 48:89-108, 1997も参照））。
受けるさまざまな植物遺伝子のプロモーターも、植物細胞における外来遺伝子の
発現に使用されることでき、以下によって調節されるプロモーターを含む：（a
）熱（Callisら, Plant Physiol., 88:965,1988；Ainleyら, Plant Mol. Biol.,
22:13-23, 1993；およびGilmartinら, The Plant Cell, 4:839-949, 1992）、
（b）光（例えば、エンドウのrbcS-3Aプロモーター、Kuhlemeierら、Plant Cell
、1:471, 1989、およびトウモロコシのrbcSプロモーター、Schaffher & SheeN,
Plant Cell、3:997、1991、（c）ホルモン、例えばアブシジン酸（Marcotteら,
Plant Cell. 1: 471, 1989）、（d）傷（例えばジャガイモのPinIIプロモーター
（Keilら, Nucl. Acids. Res. 14: 5641-5650, 1986）、アグロバクテリウム(Ag
robacterium)のmasプロモーター（Langridgeら, Bio/Technology 10:305-308, 1
989）、およびブドウのvst1プロモーター（Weiseら, Plant Mol. Biol., 26:667
-677, 1994））、および（e）ジャスモン酸メチルまたはサリチル酸など化学物
質（Gatzら, Plant Mol. Biol. 48:89-108, 1997も参照））。
【００７２】 または、組織（例えば根、葉、花および種子の）特異的なプロモーター（Carp
enterら, The Plant Cell 4:557-571, 1992；DeNisら, Plant Physiol. 101:129
5-1304, 1993；Oppermsmら, Science 263:221-223, 1993；Stockhauseら, The P
lant Cell 9:479-489, 1997；Roshalら, The EMBO J. 6:1155, 1987；Scherntha
Nerら, EMBO J. 7:1249, 1988；Yamamotoら, Plant Cell 3:371-382, 1990；お
よびBustosら, Plant Cell 1:839, 1989）をコード配列に融合させることで、個
々の器官で特異的に発現させることができる。
enterら, The Plant Cell 4:557-571, 1992；DeNisら, Plant Physiol. 101:129
5-1304, 1993；Oppermsmら, Science 263:221-223, 1993；Stockhauseら, The P
lant Cell 9:479-489, 1997；Roshalら, The EMBO J. 6:1155, 1987；Scherntha
Nerら, EMBO J. 7:1249, 1988；Yamamotoら, Plant Cell 3:371-382, 1990；お
よびBustosら, Plant Cell 1:839, 1989）をコード配列に融合させることで、個
々の器官で特異的に発現させることができる。
【００７３】 植物の形質転換用ベクターには、例えば外来遺伝子のORF配列の上流または下
流に位置するイントロンなどのRNAプロセシングシグナルも含めることができる
。また発現ベクターには、mRNAの安定性を高めるための3’端ターミネーター領
域などの植物遺伝子の3’端の非翻訳領域に由来する付加的な調節配列も含める
ことができる。例として、ジャガイモのPI-IIターミネーター領域、またはオク
トピン合成酵素もしくはノパリン合成酵素（NOS）の3’端ターミネーター領域な
どがある。
流に位置するイントロンなどのRNAプロセシングシグナルも含めることができる
。また発現ベクターには、mRNAの安定性を高めるための3’端ターミネーター領
域などの植物遺伝子の3’端の非翻訳領域に由来する付加的な調節配列も含める
ことができる。例として、ジャガイモのPI-IIターミネーター領域、またはオク
トピン合成酵素もしくはノパリン合成酵素（NOS）の3’端ターミネーター領域な
どがある。
【００７４】 最終的には、また上述したように、植物の形質転換用ベクターには、形質転換
体の速やかな選択を可能とするための優性選択マーカー遺伝子を含めることもで
きる。優性選択マーカー遺伝子には、抗生物質耐性遺伝子（例えばハイグロマイ
シン、カナマイシン、ブレオマイシン、G418、ストレプトマイシンまたはスペク
チノマイシンに対する耐性）をコードする遺伝子、および、除草剤耐性遺伝子（
）例えば、ホスフィノスリシンアセチル基転移酵素）が含まれる。
体の速やかな選択を可能とするための優性選択マーカー遺伝子を含めることもで
きる。優性選択マーカー遺伝子には、抗生物質耐性遺伝子（例えばハイグロマイ
シン、カナマイシン、ブレオマイシン、G418、ストレプトマイシンまたはスペク
チノマイシンに対する耐性）をコードする遺伝子、および、除草剤耐性遺伝子（
）例えば、ホスフィノスリシンアセチル基転移酵素）が含まれる。
【００７５】 c．形質転換法および再生法 単子葉植物および双子葉植物の両細胞の形質転換および再生は、現在では日常
化しており、適切な形質転換法が実施者によって決定されている。方法の選択は
、形質転換対象の植物種によって変わる；任意の植物種のために特定の方法を使
用することが適切であることを当業者であれば認識すると思われる。適切な方法
には、植物プロトプラストへのエレクトロポレーション、リポソームを介した形
質転換法、ポリエチレングリコール（PEG）を用いた形質転換法、ウイルスを用
いた形質転換法、植物細胞へのマイクロインジェクション、植物細胞を対象とし
た微粒子銃法、減圧浸潤法、および、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（
Agrobacterium tumefaciens；AT）を用いた形質転換法などが含まれるが、これ
らに限定されない。植物の形質転換および再生の一般的な手法は、本節の始めに
挙げた特許文書に記載されている。
化しており、適切な形質転換法が実施者によって決定されている。方法の選択は
、形質転換対象の植物種によって変わる；任意の植物種のために特定の方法を使
用することが適切であることを当業者であれば認識すると思われる。適切な方法
には、植物プロトプラストへのエレクトロポレーション、リポソームを介した形
質転換法、ポリエチレングリコール（PEG）を用いた形質転換法、ウイルスを用
いた形質転換法、植物細胞へのマイクロインジェクション、植物細胞を対象とし
た微粒子銃法、減圧浸潤法、および、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（
Agrobacterium tumefaciens；AT）を用いた形質転換法などが含まれるが、これ
らに限定されない。植物の形質転換および再生の一般的な手法は、本節の始めに
挙げた特許文書に記載されている。
【００７６】 d．形質転換植物の選抜 形質転換用ベクターによる植物の形質転換および再生に続いて、形質転換した
植物を、形質転換用ベクターに組み込まれた優性選択マーカーを用いて通常選択
する。一般にこのようなマーカーは、形質転換植物の芽生えに抗生物質耐性をも
たらし、芽生えを適切な濃度の抗生物質に曝すことで形質転換体を選抜すること
ができる。
植物を、形質転換用ベクターに組み込まれた優性選択マーカーを用いて通常選択
する。一般にこのようなマーカーは、形質転換植物の芽生えに抗生物質耐性をも
たらし、芽生えを適切な濃度の抗生物質に曝すことで形質転換体を選抜すること
ができる。
【００７７】 また、外来遺伝子を介して植物にもたらされる病原体耐性を活用することで選
択することもできる。下記の実施例で説明するように、このようなスクリーニン
グ法は、トランスジェニック植物の再生後に行うか、または（使用した形質転換
法に係って）、植物が再生する前の緑色の遺伝子導入カルスを対象に行う場合が
ある。
択することもできる。下記の実施例で説明するように、このようなスクリーニン
グ法は、トランスジェニック植物の再生後に行うか、または（使用した形質転換
法に係って）、植物が再生する前の緑色の遺伝子導入カルスを対象に行う場合が
ある。
【００７８】 IV．複数の陽イオン性ペプチドのコード領域を含む植物 場合によっては、デルマセプチンまたはテンポリンのペプチドをコードする外
来遺伝子の単一コピーによりもたらされる耐性レベルは、1種の陽イオン性ペプ
チド遺伝子の複数のコピーを導入することで、または、多様な陽イオン性ペプチ
ドをコードする複数の遺伝子を導入することで増加することができる。
来遺伝子の単一コピーによりもたらされる耐性レベルは、1種の陽イオン性ペプ
チド遺伝子の複数のコピーを導入することで、または、多様な陽イオン性ペプチ
ドをコードする複数の遺伝子を導入することで増加することができる。
【００７９】 遺伝子工学的手法を用いることで、複数の陽イオン性ペプチドのコード領域を
一つのベクターに導入することが可能となる。通常（必ずしも通常とは限らない
ものの）このようなベクターは、読み枠（ORF）の5’端または3’端には調節配
列を使用可能に連結させた2種またはそれ以上のデルマセプチンおよび/またはテ
ンポリンのORFからなる。このようなベクターを植物に導入した場合、多種多様
な陽イオン性ペプチドを発現させることができる。
一つのベクターに導入することが可能となる。通常（必ずしも通常とは限らない
ものの）このようなベクターは、読み枠（ORF）の5’端または3’端には調節配
列を使用可能に連結させた2種またはそれ以上のデルマセプチンおよび/またはテ
ンポリンのORFからなる。このようなベクターを植物に導入した場合、多種多様
な陽イオン性ペプチドを発現させることができる。
【００８０】 複数の外来遺伝子を含む植物は、標準的な育種法を使用して作出することもで
きる。第1の陽イオン性ペプチドをコードする外来遺伝子を第1の植物に導入でき
、第2の陽イオン性ペプチドをコードする第2の外来遺伝子を第2の植物に導入す
ることができる。得られたトランスジェニック植物を後に交配させることで、両
外来遺伝子をもつ子孫を作出することができる。
きる。第1の陽イオン性ペプチドをコードする外来遺伝子を第1の植物に導入でき
、第2の陽イオン性ペプチドをコードする第2の外来遺伝子を第2の植物に導入す
ることができる。得られたトランスジェニック植物を後に交配させることで、両
外来遺伝子をもつ子孫を作出することができる。
【００８１】 V．デルマセプチンおよびテンポリンの産生および単離 上述の組成物および方法は、広スペクトルの病原体に対する耐性が強化された
植物の作出に使用できるだけでなく、広範囲に及ぶ他の応用を意図したデルマセ
プチンおよびテンポリンの大量生産にも使用できる。例えば、植物で大量に産生
するテンポリンおよびデルマセプチンは、精製して医療的適用において使用する
ことができる。
植物の作出に使用できるだけでなく、広範囲に及ぶ他の応用を意図したデルマセ
プチンおよびテンポリンの大量生産にも使用できる。例えば、植物で大量に産生
するテンポリンおよびデルマセプチンは、精製して医療的適用において使用する
ことができる。
【００８２】 生物学的に活性なペプチドを植物で産生させることは現在では広く行われてお
り、大量発現および精製の方法は周知である。生物学的に活性なタンパク質の植
物における産生を容易にするコンストラクトの諸例は、グッドマン（Goodman）
らによる米国特許第4,956,282号で見いだされる。このようなコンストラクトは
一般に、プロモーター領域および、後の精製過程で使用するアミノ酸配列をコー
ドする付加的な核酸配列を含む。デルマセプチンおよび/またはテンポリンのペ
プチドの単離を容易にするために用いるアミノ酸配列は、後に切断して廃棄する
ことができる。
り、大量発現および精製の方法は周知である。生物学的に活性なタンパク質の植
物における産生を容易にするコンストラクトの諸例は、グッドマン（Goodman）
らによる米国特許第4,956,282号で見いだされる。このようなコンストラクトは
一般に、プロモーター領域および、後の精製過程で使用するアミノ酸配列をコー
ドする付加的な核酸配列を含む。デルマセプチンおよび/またはテンポリンのペ
プチドの単離を容易にするために用いるアミノ酸配列は、後に切断して廃棄する
ことができる。
【００８３】 実施例 1．デルマセプチンおよびテンポリンのペプチドをコードする核酸配列の選択お
よび作製 a．デルマセプチンのコード配列 核酸分子は、5残基のアミノ酸からなるN末端延長配列MAMWKをもつ成熟型デル
マセプチンb（配列番号：3）の27残基のアミノ酸をコードするようにデザインし
た。この核酸コンストラクトはMSRA2と命名し、4種の重複するオリゴヌクレオチ
ドを用いた1回のPCR反応で合成した。使用したオリゴヌクレオチドを表2に示す
。第1の2種のオリゴヌクレオチド（オリゴ1およびオリゴ2）は、ペプチドのN末
端部およびＣ末端をそれぞれコードする核酸配列を含んでいた。これらのオリゴ
ヌクレオチドはPCR反応で20 nMの濃度で使用した。第2の2種のオリゴヌクレオチ
ドは、さまざまな制限酵素により認識される配列を含んでいた。具体的には、オ
リゴ3は制限酵素XbaI、KpnIおよびNcoIの切断部位を含み、オリゴ4は制限酵素Ss
tI、PstIおよびHindIIIの切断部位を含んでいた。これらのオリゴヌクレオチド
はPCR反応で200 nMの濃度で使用した。増幅後の産物は、固有の制限酵素切断部
位を用いて一般的なクローニングベクターにクローニングした。MSRA2のコード
領域の核酸配列を配列番号：27に示し、コードするペプチドを配列番号：28に示
す。オリゴ1〜4は配列番号：29〜32に示す。
よび作製 a．デルマセプチンのコード配列 核酸分子は、5残基のアミノ酸からなるN末端延長配列MAMWKをもつ成熟型デル
マセプチンb（配列番号：3）の27残基のアミノ酸をコードするようにデザインし
た。この核酸コンストラクトはMSRA2と命名し、4種の重複するオリゴヌクレオチ
ドを用いた1回のPCR反応で合成した。使用したオリゴヌクレオチドを表2に示す
。第1の2種のオリゴヌクレオチド（オリゴ1およびオリゴ2）は、ペプチドのN末
端部およびＣ末端をそれぞれコードする核酸配列を含んでいた。これらのオリゴ
ヌクレオチドはPCR反応で20 nMの濃度で使用した。第2の2種のオリゴヌクレオチ
ドは、さまざまな制限酵素により認識される配列を含んでいた。具体的には、オ
リゴ3は制限酵素XbaI、KpnIおよびNcoIの切断部位を含み、オリゴ4は制限酵素Ss
tI、PstIおよびHindIIIの切断部位を含んでいた。これらのオリゴヌクレオチド
はPCR反応で200 nMの濃度で使用した。増幅後の産物は、固有の制限酵素切断部
位を用いて一般的なクローニングベクターにクローニングした。MSRA2のコード
領域の核酸配列を配列番号：27に示し、コードするペプチドを配列番号：28に示
す。オリゴ1〜4は配列番号：29〜32に示す。
【表２】 太字のヌクレオチドは、オリゴ1とオリゴ2間の相補的な領域を表す。オリゴ1の
下線部は、オリゴ3の下線部と同一であり、従ってオリゴ3は、オリゴ1およびオ
リゴ2による初回伸長で得られるPCR産物と結合可能となる。同様にオリゴ4の下
線部は、オリゴ2の下線部と同一である。これによりオリゴ4は、オリゴ1および
オリゴ2による伸張で作製されるPCR産物と結合可能となる。
下線部は、オリゴ3の下線部と同一であり、従ってオリゴ3は、オリゴ1およびオ
リゴ2による初回伸長で得られるPCR産物と結合可能となる。同様にオリゴ4の下
線部は、オリゴ2の下線部と同一である。これによりオリゴ4は、オリゴ1および
オリゴ2による伸張で作製されるPCR産物と結合可能となる。
【００８４】 b．テンポリンのコード配列 核酸分子は、6残基のアミノ酸からなるN末端延長配列MASRHMをもつ成熟型テン
ポリン（配列番号：33）の13残基のアミノ酸をコードするようにデザインした。
この核酸構コンストラクトはMSRA3と命名し、4種の重複するオリゴヌクレオチド
を用いた1回のPCR反応で合成した。使用したオリゴヌクレオチドを表3に示す。
第1の2種のオリゴヌクレオチド（オリゴ1およびオリゴ2）は、原型ペプチドをコ
ードする核酸配列を含んでいた。しかし、デルマセプチンペプチドの原型をコー
ドするのに使用したオリゴヌクレオチドとは異なり、これらのオリゴヌクレオチ
ドは完全に相補的なので、オリゴ3およびオリゴ4との結合に先立って行う初回伸
長サイクルは必要ない。オリゴ1およびオリゴ2はPCR反応で20 nM の濃度で使用
した。第2の2種のオリゴヌクレオチドは、さまざまな制限酵素により認識される
配列を含んでいた。具体的には、オリゴ3は制限酵素XbaI、KpnIおよびNdeIの切
断部位を含み、また、オリゴ4は制限酵素SstIおよびPstIの切断部位を含んでい
た。これらのオリゴヌクレオチドはPCR反応で200 nMの濃度で使用した。
ポリン（配列番号：33）の13残基のアミノ酸をコードするようにデザインした。
この核酸構コンストラクトはMSRA3と命名し、4種の重複するオリゴヌクレオチド
を用いた1回のPCR反応で合成した。使用したオリゴヌクレオチドを表3に示す。
第1の2種のオリゴヌクレオチド（オリゴ1およびオリゴ2）は、原型ペプチドをコ
ードする核酸配列を含んでいた。しかし、デルマセプチンペプチドの原型をコー
ドするのに使用したオリゴヌクレオチドとは異なり、これらのオリゴヌクレオチ
ドは完全に相補的なので、オリゴ3およびオリゴ4との結合に先立って行う初回伸
長サイクルは必要ない。オリゴ1およびオリゴ2はPCR反応で20 nM の濃度で使用
した。第2の2種のオリゴヌクレオチドは、さまざまな制限酵素により認識される
配列を含んでいた。具体的には、オリゴ3は制限酵素XbaI、KpnIおよびNdeIの切
断部位を含み、また、オリゴ4は制限酵素SstIおよびPstIの切断部位を含んでい
た。これらのオリゴヌクレオチドはPCR反応で200 nMの濃度で使用した。
【００８５】 増幅後の産物を、固有の制限酵素切断部位を用いて一般的なクローニングベク
ターにクローニングした。MSRA3のコード領域の核酸配列を配列番号：33に、ま
た、コードするペプチドを配列番号：34に示す。オリゴ1〜4は配列番号：35〜38
に示す。
ターにクローニングした。MSRA3のコード領域の核酸配列を配列番号：33に、ま
た、コードするペプチドを配列番号：34に示す。オリゴ1〜4は配列番号：35〜38
に示す。
【表３】 太字のヌクレオチドは、オリゴ1とオリゴ2間の相補的な領域を表す。図に示す通
り、これらの配列は完全に相補的である。オリゴ2の下線部はオリゴ3の下線部と
相補的であり、オリゴ1の下線部はオリゴ4の下線部と相補的である。
り、これらの配列は完全に相補的である。オリゴ2の下線部はオリゴ3の下線部と
相補的であり、オリゴ1の下線部はオリゴ4の下線部と相補的である。
【００８６】 得られた2本鎖DNAは次に、後述する1種または複数のベクターにクローニング
した。
した。
【００８７】 2．さまざまなプロモーター配列を含むベクター MRSA2配列およびMRSA3をコードする核酸配列は、さまざまな植物形質転換用ベ
クター上にまとめることで、多種多様なプロモーターの転写制御下においた。
クター上にまとめることで、多種多様なプロモーターの転写制御下においた。
【００８８】 MRSA2およびMRSA3配列のこのようなベクターへのクローニングでは、個々の配
列を、CaMV 35Sプロモーターの2つのコピーを含むプロモーターおよび、AMV RNA
4翻訳エンハンサーエレメントの制御下においた（Kayら, Science 236:1299-130
2, 1987）。このベクターに連結して得たクローンには、名称の最初にpDをつけ
た。したがって、pDMSRA2は、2つのCaMV 35SプロモーターとAMV RNA4翻訳エンハ
ンサーの制御下にあるMRSA2コンストラクトを含むベクターを意味する。同様にp
DMSRA3は、2つのCaMV 35SプロモーターとAMV RNA4翻訳エンハンサーの制御下に
あるMRSA3コンストラクト含むベクターを意味する。
列を、CaMV 35Sプロモーターの2つのコピーを含むプロモーターおよび、AMV RNA
4翻訳エンハンサーエレメントの制御下においた（Kayら, Science 236:1299-130
2, 1987）。このベクターに連結して得たクローンには、名称の最初にpDをつけ
た。したがって、pDMSRA2は、2つのCaMV 35SプロモーターとAMV RNA4翻訳エンハ
ンサーの制御下にあるMRSA2コンストラクトを含むベクターを意味する。同様にp
DMSRA3は、2つのCaMV 35SプロモーターとAMV RNA4翻訳エンハンサーの制御下に
あるMRSA3コンストラクト含むベクターを意味する。
【００８９】 別のベクターは、MSRA2コンストラクトが、再構築した「スーパープロモータ
ー」の制御下にあるようにデザインした。このプロモーターは、3量体ocs（オク
トピン合成酵素）上流活性化配列（逆方向）に続けてmas（マンノピン合成酵素
）プロモーター/アクチベーター領域（Langridgeら, Bio/Technology 10:305-30
8, 1989）を含む。このスーパープロモーターは、ニー（Ni）ら、The Plant J.
、 7: 661-676、1995で詳述されている。この特殊なコンストラクトには、MRSA2 のコード領域の上流に位置し、使用可能に連結させる6 x Hisタグのコード領域
も含まれる。したがって6 x Hisタグのアミノ酸配列は、コードされたデルマセ
プチン/MAMWKペプチドに対するN末端の付加物として発現する。このペプチドを
コードするベクターはpRSHMSRA2と命名した。
ー」の制御下にあるようにデザインした。このプロモーターは、3量体ocs（オク
トピン合成酵素）上流活性化配列（逆方向）に続けてmas（マンノピン合成酵素
）プロモーター/アクチベーター領域（Langridgeら, Bio/Technology 10:305-30
8, 1989）を含む。このスーパープロモーターは、ニー（Ni）ら、The Plant J.
、 7: 661-676、1995で詳述されている。この特殊なコンストラクトには、MRSA2 のコード領域の上流に位置し、使用可能に連結させる6 x Hisタグのコード領域
も含まれる。したがって6 x Hisタグのアミノ酸配列は、コードされたデルマセ
プチン/MAMWKペプチドに対するN末端の付加物として発現する。このペプチドを
コードするベクターはpRSHMSRA2と命名した。
【００９０】 3．ジャガイモおよびタバコの形質転換 ジャガイモの品種であるラセット・バーバンク（Russert Burbank）およびデ
ジレ（Desiree）ならびにタバコを、代表的な形質転換用植物種として使用した
。植物の形質転換は、ドゥブロック（DeBlock）、Theoret. Appl. Genet. 76:76
7-774、1988に記載された方法を一部変更して実施した。
ジレ（Desiree）ならびにタバコを、代表的な形質転換用植物種として使用した
。植物の形質転換は、ドゥブロック（DeBlock）、Theoret. Appl. Genet. 76:76
7-774、1988に記載された方法を一部変更して実施した。
【００９１】 手短に説明すると、タバコおよびジャガイモの形質転換は、4週齢のシュート
から葉（5 mm）および茎を分離して行った。これらの葉およびシュートを切断し
て、さらにガラスピペットの先端で引っかいて傷をつけた。傷をつけた葉および
茎を次に、15 mlのS2培地を入れたペトリ皿に上下逆方向に浮かべた。この培地
は、ムラシゲ・スクーグ（Murashige and Skoog）、Physiol. Plant. 15:473-47
9、1962に記載された組成に、30 g/Lのショ糖、0.5 g/LのMES（pH 5.5）、およ
び20 g/Lのマンニトールを添加した培地である。
から葉（5 mm）および茎を分離して行った。これらの葉およびシュートを切断し
て、さらにガラスピペットの先端で引っかいて傷をつけた。傷をつけた葉および
茎を次に、15 mlのS2培地を入れたペトリ皿に上下逆方向に浮かべた。この培地
は、ムラシゲ・スクーグ（Murashige and Skoog）、Physiol. Plant. 15:473-47
9、1962に記載された組成に、30 g/Lのショ糖、0.5 g/LのMES（pH 5.5）、およ
び20 g/Lのマンニトールを添加した培地である。
【００９２】 対数増殖期後期のアグロバクテリウム（対象ベクターで形質転換したもの）を
含む60 μlのLB培地を各ペトリ皿に加え、その皿をアグロバクテリウムの存在下
で低光度（500ルックス）で3日間インキュベートした。次いで植物組織を、1 g/
Lのカルベニシリンを含むS2培地で洗浄し、ろ紙に水分を吸収させて乾燥させ、S
4培地上に上下逆方向に置いた。S4培地は、ムラシゲおよびスクーグ、Physiol.
Plant. 15:473-479、1962に記載された組成からショ糖を除いたものに200 mg/L
のグルタミン、0.5 g/LのMES（pH 5.7）、0.5 g/LのPVP、20 g/Lのマンニトール
、20 g/Lのグルコース、40 mg/Lの硫酸アデニン、0.5%のアガロース、1 mg/Lの
トランスゼアチン、0.1 mg/LのNAA、1 g/Lのカルベニシリンおよび50 μg/mlの
カナマイシン、10 mg/LのAgNO3を添加した培地である。植物組織試料は、3000ル
ックスで室温（RT）に放置してカルスを形成させた。2週間後、葉および茎の傷
をつけた縁に多くの小さいカルスが形成した。小さなカルスを新鮮なS6培地（NA
Aを含まないS4）に移した。2〜3週間後にカルスをS8培地（S6培地に0.1 mg/L GA 3 を添加したもの）に移し、シュートを形成させた。
含む60 μlのLB培地を各ペトリ皿に加え、その皿をアグロバクテリウムの存在下
で低光度（500ルックス）で3日間インキュベートした。次いで植物組織を、1 g/
Lのカルベニシリンを含むS2培地で洗浄し、ろ紙に水分を吸収させて乾燥させ、S
4培地上に上下逆方向に置いた。S4培地は、ムラシゲおよびスクーグ、Physiol.
Plant. 15:473-479、1962に記載された組成からショ糖を除いたものに200 mg/L
のグルタミン、0.5 g/LのMES（pH 5.7）、0.5 g/LのPVP、20 g/Lのマンニトール
、20 g/Lのグルコース、40 mg/Lの硫酸アデニン、0.5%のアガロース、1 mg/Lの
トランスゼアチン、0.1 mg/LのNAA、1 g/Lのカルベニシリンおよび50 μg/mlの
カナマイシン、10 mg/LのAgNO3を添加した培地である。植物組織試料は、3000ル
ックスで室温（RT）に放置してカルスを形成させた。2週間後、葉および茎の傷
をつけた縁に多くの小さいカルスが形成した。小さなカルスを新鮮なS6培地（NA
Aを含まないS4）に移した。2〜3週間後にカルスをS8培地（S6培地に0.1 mg/L GA 3 を添加したもの）に移し、シュートを形成させた。
【００９３】 S8培地上で2週間放置後、第1シュート（0.5 cm）をS1培地に移した。この培地
は、ガンボーグ（Gamborg）ら、Exp. Cell Res. 50:151-158、1968に記載された
成分に、20 g/Lのショ糖、150 mg/Lの塩化カルシウム、0.4%のアガロース（pH 5
.8）、1 g/Lのカルベニシリンおよび50 μg/mlのカナマイシンを添加した培地で
あった。S1培地およびシュートをマジェンタ瓶に入れて根を形成させた。1週間
後にシュートに根が認められた。同一のシュートの選択を避けるために、同一ま
たは近い関係にあるカルス由来のシュートの採取を避けた。
は、ガンボーグ（Gamborg）ら、Exp. Cell Res. 50:151-158、1968に記載された
成分に、20 g/Lのショ糖、150 mg/Lの塩化カルシウム、0.4%のアガロース（pH 5
.8）、1 g/Lのカルベニシリンおよび50 μg/mlのカナマイシンを添加した培地で
あった。S1培地およびシュートをマジェンタ瓶に入れて根を形成させた。1週間
後にシュートに根が認められた。同一のシュートの選択を避けるために、同一ま
たは近い関係にあるカルス由来のシュートの採取を避けた。
【００９４】 再生したトランスジェニック植物と考えられる植物体を、1 g/Lのカルベニシ
リンおよび50 μg/mlのカナマイシンを含むMS培地に移してさらに分析を行った
。
リンおよび50 μg/mlのカナマイシンを含むMS培地に移してさらに分析を行った
。
【００９５】 4．耐病性に関するカルスのスクリーニング 耐病性アッセイの単純な初期検出法を開発した。対照カルスおよびトランスジ
ェニックカルスをS4培地（ショ糖を含まず、200 mg/Lのグルタミン、0.5 g/LのM
ES（pH 5.7）、0.5 g/LのPVP、20 g/Lのマンニトール、20 g/Lのグルコース、40
mg/Lの硫酸アデニン、0.5%のアガロース、1 mg/Lのトランスゼアチン、0.1 mg/
LのNAA、1 g/Lのカルベニシリンおよび50 μg/mlのカナマイシン、10 mg/LのAgN
O3を添加したMS培地）中で成長させた。次に試料を、3000ルックスの光度で室温
に放置してカルスを形成させた。2週間後、葉および茎の傷をつけた縁に多くの
小さなカルスが形成した。小さなカルスを新鮮なS6培地（NAAを含まないS4）に
移した。2〜3週間後にカルスを新鮮な培地に移し、植物病原体であるフザリウム
（Fusarium）またはフィトフトラ（Phytophthora）存在下で成長させた。実験終
了時に、生存していて、かつ明るい緑色のままのカルス数を集計した。対照の試
料に真菌耐性のカルスは認められず、真菌病原体に耐性となったカルスは形質転
換していることが明らかとなった。
ェニックカルスをS4培地（ショ糖を含まず、200 mg/Lのグルタミン、0.5 g/LのM
ES（pH 5.7）、0.5 g/LのPVP、20 g/Lのマンニトール、20 g/Lのグルコース、40
mg/Lの硫酸アデニン、0.5%のアガロース、1 mg/Lのトランスゼアチン、0.1 mg/
LのNAA、1 g/Lのカルベニシリンおよび50 μg/mlのカナマイシン、10 mg/LのAgN
O3を添加したMS培地）中で成長させた。次に試料を、3000ルックスの光度で室温
に放置してカルスを形成させた。2週間後、葉および茎の傷をつけた縁に多くの
小さなカルスが形成した。小さなカルスを新鮮なS6培地（NAAを含まないS4）に
移した。2〜3週間後にカルスを新鮮な培地に移し、植物病原体であるフザリウム
（Fusarium）またはフィトフトラ（Phytophthora）存在下で成長させた。実験終
了時に、生存していて、かつ明るい緑色のままのカルス数を集計した。対照の試
料に真菌耐性のカルスは認められず、真菌病原体に耐性となったカルスは形質転
換していることが明らかとなった。
【００９６】 5．トランスジェニック植物の分子レベルでの特徴 遺伝子導入ジャガイモおよび遺伝子導入タバコから下記の方法でDNAを単離し
た。場合によっては、精製にはさらに厳格なプロトコールを含み、単純な粗抽出
法を行う場合もあった。厳格な抽出法は、10 gの新鮮な葉の組織を集めることか
ら始め、試料は液体窒素中で直ちに凍結した。次に凍結組織を微細な粉末に粉砕
し、20 mlの抽出用緩衝液（50 mM Tris-HCl緩衝液、5 mM EDTA、0.35 Mソルビト
ール、0.1% BSA、0.1% βメルカプトエタノール、10% PEG4000）中に抽出した。
ホモジネートは、多層チーズクロスおよび単層のミラクロスでろ過した。次に、
最終的な精製段階を、ワグナー（Wagner）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
84:2097-5100、1987に係って行った。
た。場合によっては、精製にはさらに厳格なプロトコールを含み、単純な粗抽出
法を行う場合もあった。厳格な抽出法は、10 gの新鮮な葉の組織を集めることか
ら始め、試料は液体窒素中で直ちに凍結した。次に凍結組織を微細な粉末に粉砕
し、20 mlの抽出用緩衝液（50 mM Tris-HCl緩衝液、5 mM EDTA、0.35 Mソルビト
ール、0.1% BSA、0.1% βメルカプトエタノール、10% PEG4000）中に抽出した。
ホモジネートは、多層チーズクロスおよび単層のミラクロスでろ過した。次に、
最終的な精製段階を、ワグナー（Wagner）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
84:2097-5100、1987に係って行った。
【００９７】 PCR分析を目的として単離を行う際は、粗抽出法を主に使用した。この方法で
は約200 mgの新鮮な葉を採取し、液体窒素中で粉砕して粉末にした。この粉末に
100 μlの0.5 N NaOHを添加して（ボルテックスミキサーで）30秒間混合した。
懸濁液を5分間遠心し、5 μlの上清を45 μlの100 mM トリス緩衝液（pH 8.0）
に加えた。このゲノムDNA粗抽出液をPCRによる増幅の鋳型として用いた。
は約200 mgの新鮮な葉を採取し、液体窒素中で粉砕して粉末にした。この粉末に
100 μlの0.5 N NaOHを添加して（ボルテックスミキサーで）30秒間混合した。
懸濁液を5分間遠心し、5 μlの上清を45 μlの100 mM トリス緩衝液（pH 8.0）
に加えた。このゲノムDNA粗抽出液をPCRによる増幅の鋳型として用いた。
【００９８】 MSRA2のコンストラクトの有無は、抽出したゲノムDNAならびに、前掲した表2
のオリゴ3およびオリゴ4を用いたPCR反応を行って検出した。反応から予測され
る産物の大きさは129 bpであった。この方法を採用することで、pDMSRA2コンス
トラクトまたはpRSHMSRA2コンストラクトで形質転換した遺伝子導入タバコおよ
びジャガイモの同定が可能であった。
のオリゴ3およびオリゴ4を用いたPCR反応を行って検出した。反応から予測され
る産物の大きさは129 bpであった。この方法を採用することで、pDMSRA2コンス
トラクトまたはpRSHMSRA2コンストラクトで形質転換した遺伝子導入タバコおよ
びジャガイモの同定が可能であった。
【００９９】 MSRA3のコンストラクトは、前掲した表3のオリゴ3およびオリゴ4を用いて、ま
たは2 x 35S CaMVプロモーターに特異的なプライマーを用いて、前掲した表3の
オリゴ4を組み合わせてPCR反応を行って検出した。pDMSRA3コンストラクトを含
む遺伝子導入タバコの植物体を同定した。
たは2 x 35S CaMVプロモーターに特異的なプライマーを用いて、前掲した表3の
オリゴ4を組み合わせてPCR反応を行って検出した。pDMSRA3コンストラクトを含
む遺伝子導入タバコの植物体を同定した。
【０１００】 対照の植物も、3量体ocs（オクトピン合成酵素）上流活性化配列に続けてmas
（マンノピン合成酵素）のプロモーター/アクチベーター領域を含むスーパープ
ロモーターの制御下にあるGUS遺伝子を含むように遺伝子操作した（Niら, The P
lant J. 7: 661-676, 1995）。この外来遺伝子がタバコ植物体ゲノムへ挿入され
たことは、PCR法で確認した。
（マンノピン合成酵素）のプロモーター/アクチベーター領域を含むスーパープ
ロモーターの制御下にあるGUS遺伝子を含むように遺伝子操作した（Niら, The P
lant J. 7: 661-676, 1995）。この外来遺伝子がタバコ植物体ゲノムへ挿入され
たことは、PCR法で確認した。
【０１０１】 場合によっては、外来遺伝子の活発な発現をノーザンブロット解析で確認した
。この解析実験で使用するRNA基質は、遺伝子導入タバコおよびジャガイモの植
物体から単離・精製した。この単離に用いたプロトコールは、ファーウールト（
Verwoerd）ら、Nucl. Acids Res. 17:2362、 1989に係って実施した。
。この解析実験で使用するRNA基質は、遺伝子導入タバコおよびジャガイモの植
物体から単離・精製した。この単離に用いたプロトコールは、ファーウールト（
Verwoerd）ら、Nucl. Acids Res. 17:2362、 1989に係って実施した。
【０１０２】 6．病原細菌に対する耐性 遺伝子導入ジャガイモおよび遺伝子導入タバコの、病原細菌エルビニア・カロ
トボーラ（Erwiniacarotovora）に対する耐性を検討する目的で、細菌をLB培地
で室温で一晩増殖させた（A600＝2.9）。エルビニアの培養物2 mlを分取してdH2 Oで5倍に希釈し、希釈した培養液1 mlを2 mlのMS液体培地に加えて抗菌アッセイ
に用いた。トランスジェニック植物または対照の植物体から切断したばかりの枝
（〜3.5 cm）を、希釈したエルビニア培養液を含む試験管に挿し、植物体の切断
端の底部を細菌培養液に浸した。この試験管を3000ルックスで室温でインキュベ
ートして断続的に観察した。
トボーラ（Erwiniacarotovora）に対する耐性を検討する目的で、細菌をLB培地
で室温で一晩増殖させた（A600＝2.9）。エルビニアの培養物2 mlを分取してdH2 Oで5倍に希釈し、希釈した培養液1 mlを2 mlのMS液体培地に加えて抗菌アッセイ
に用いた。トランスジェニック植物または対照の植物体から切断したばかりの枝
（〜3.5 cm）を、希釈したエルビニア培養液を含む試験管に挿し、植物体の切断
端の底部を細菌培養液に浸した。この試験管を3000ルックスで室温でインキュベ
ートして断続的に観察した。
【０１０３】 pDMSRA2を含む遺伝子導入ジャガイモおよびpDMSRA2またはpRSHMSRA2を含む遺
伝子導入タバコを対象に、文献に記載の方法で試験を行い、病原体に対して耐性
をもつことを示した：細菌培養液の存在下で成長させた1週間後、トランスジェ
ニック植物には感染が認められず（目視判定）、成長を続けた。これと極めて対
照的に、細菌培養液に浸した対照の植物体は、一週間のインキュベート後に激し
く感染が認められ、成長は阻害され、病原真菌の曝露から2〜3週間後に枯死した
。
伝子導入タバコを対象に、文献に記載の方法で試験を行い、病原体に対して耐性
をもつことを示した：細菌培養液の存在下で成長させた1週間後、トランスジェ
ニック植物には感染が認められず（目視判定）、成長を続けた。これと極めて対
照的に、細菌培養液に浸した対照の植物体は、一週間のインキュベート後に激し
く感染が認められ、成長は阻害され、病原真菌の曝露から2〜3週間後に枯死した
。
【０１０４】 遺伝子導入ジャガイモの塊茎の、病原細菌エルビニア・カロトボーラ（Erwini
acarotovora cv carotovora）に対する耐性を調べるために、小さなくぼみを塊
茎の円盤状切片（直径2 cm、厚み3 cm）上に設けた。100倍希釈して一晩培養し
た細菌培養液20マイクロリットル（約2x107 CFU）を、ピペットでくぼみに注ぎ
、円盤状切片を室温で6日間インキュベートした。次に、腐敗組織を塊茎の円盤
状切片から丁寧に除き、組織の重量減少を測定した。このようなアッセイの結果
から、遺伝子を導入していない対照と比べて、遺伝子導入ジャガイモの組織が軟
腐病に耐性をもつことが判明した（図1）。
acarotovora cv carotovora）に対する耐性を調べるために、小さなくぼみを塊
茎の円盤状切片（直径2 cm、厚み3 cm）上に設けた。100倍希釈して一晩培養し
た細菌培養液20マイクロリットル（約2x107 CFU）を、ピペットでくぼみに注ぎ
、円盤状切片を室温で6日間インキュベートした。次に、腐敗組織を塊茎の円盤
状切片から丁寧に除き、組織の重量減少を測定した。このようなアッセイの結果
から、遺伝子を導入していない対照と比べて、遺伝子導入ジャガイモの組織が軟
腐病に耐性をもつことが判明した（図1）。
【０１０５】 抗菌ペプチド（配列番号：34（MRSA3）および配列番号：28（MRSA2））の殺菌
効果を、大腸菌（図2）およびエルビニア・カロトボーラ（図3）に対して、約1x
105細菌/mlと記載濃度の抗菌ペプチドを含む最終容量220 μlの溶液を対象にマ
イクロタイタープレート上で判定した。細胞培養液は室温で4時間インキュベー
トし、希釈後にLBプレートにプレーティングした。37℃（大腸菌）または28℃（
E.carotovora）で一晩インキュベートした後に、コロニー数を集計して細菌生存
率を評点化した。両アッセイの結果から、ペプチドに有意な抗菌活性があること
が判明した。
効果を、大腸菌（図2）およびエルビニア・カロトボーラ（図3）に対して、約1x
105細菌/mlと記載濃度の抗菌ペプチドを含む最終容量220 μlの溶液を対象にマ
イクロタイタープレート上で判定した。細胞培養液は室温で4時間インキュベー
トし、希釈後にLBプレートにプレーティングした。37℃（大腸菌）または28℃（
E.carotovora）で一晩インキュベートした後に、コロニー数を集計して細菌生存
率を評点化した。両アッセイの結果から、ペプチドに有意な抗菌活性があること
が判明した。
【０１０６】 7．真菌に対する耐性 成熟した植物を対象に、さまざまな真菌に対する耐性について以下のプロトコ
ールを用いて試験した。1 cm2 x 0.5 cmのフザリウムまたはフィトフトラ種を含
む培地の切片を作製し、9 cmのペトリ皿中のV8寒天培地（250 ml/LのV8液、7 g/
Lの寒天）の新しいプレートの中央に配して約1か月間室温で、または真菌の菌糸
がペトリ皿表面を完全に覆うまで室温で成長させた。トランスジェニック植物の
シュート（10 cm以下）を切断し、MS培地に移してさらに増殖させた。さまざま
な処理を行い、シュートから根が出るまで植物体を3日間または2週間成長させた
。次に真菌を含む寒天の1 cm2 x 0.5 cmの薄切り2枚を、植物体を傷つけること
なくシュートの両側に接触させた。次いで、得られた感染の程度を肉眼判定した
。
ールを用いて試験した。1 cm2 x 0.5 cmのフザリウムまたはフィトフトラ種を含
む培地の切片を作製し、9 cmのペトリ皿中のV8寒天培地（250 ml/LのV8液、7 g/
Lの寒天）の新しいプレートの中央に配して約1か月間室温で、または真菌の菌糸
がペトリ皿表面を完全に覆うまで室温で成長させた。トランスジェニック植物の
シュート（10 cm以下）を切断し、MS培地に移してさらに増殖させた。さまざま
な処理を行い、シュートから根が出るまで植物体を3日間または2週間成長させた
。次に真菌を含む寒天の1 cm2 x 0.5 cmの薄切り2枚を、植物体を傷つけること
なくシュートの両側に接触させた。次いで、得られた感染の程度を肉眼判定した
。
【０１０７】 代表的な実験では、pDMSRA2で形質転換した遺伝子導入ジャガイモ、pRSHMRSA2 またはpDMSRA2で形質転換したタバコ植物体、および、対照のジャガイモ植物体
およびタバコ植物体をフィトフトラ・カクトラム（Phytophthora cactorum）に
曝露した。7日後、フィトフトラ・カクトラムは、MS培地表面で増殖しており、
対照植物の根および茎に浸透しており、植物の生育に必要な機能が損なわれてい
た。対照植物の根が激しく損なわれていたことは明らかであった。植物体と真菌
間の相互作用により、腐敗過程を示す黄茶色の色素が分泌された。その後、水分
および葉を失った植物体は形がねじれ、茎の基部が柔らかくなり根は枯れた。一
方でトランスジェニック植物は健康な状態を維持し、真菌の菌糸がMS培地を完全
に覆った状態でも病的症状は認められなかった。
およびタバコ植物体をフィトフトラ・カクトラム（Phytophthora cactorum）に
曝露した。7日後、フィトフトラ・カクトラムは、MS培地表面で増殖しており、
対照植物の根および茎に浸透しており、植物の生育に必要な機能が損なわれてい
た。対照植物の根が激しく損なわれていたことは明らかであった。植物体と真菌
間の相互作用により、腐敗過程を示す黄茶色の色素が分泌された。その後、水分
および葉を失った植物体は形がねじれ、茎の基部が柔らかくなり根は枯れた。一
方でトランスジェニック植物は健康な状態を維持し、真菌の菌糸がMS培地を完全
に覆った状態でも病的症状は認められなかった。
【０１０８】 前掲の実験はまた、トランスジェニック植物のフィトフトラ・インフェスタン
ス（Phytophthora infestans）に対する耐性を試験する際にも用いた。これらの
アッセイで得られた結果から、トランスジェニック植物が、フィトフトラ・イン
フェスタンスにも耐性をもつことが判明した。
ス（Phytophthora infestans）に対する耐性を試験する際にも用いた。これらの
アッセイで得られた結果から、トランスジェニック植物が、フィトフトラ・イン
フェスタンスにも耐性をもつことが判明した。
【０１０９】 pDMSRA2遺伝子導入ジャガイモの植物体についてはフザリウム・ソラニを曝露
させた別の実験を行った。6日後にフザリウムは、MS培地の表面全体に増殖し、
対照植物の根の損傷は激しく、茎の基部にはフザリウムが浸透しており、茎は柔
らかくなり、感染が認められる葉脈は明るい茶色となり壊死を起こしていた。数
日後に対照植物は衰弱し、枯死した。しかしトランスジェニック植物体は、フザ
リウム・ソラニの極端な繁殖にもかかわらず成長を続けた。
させた別の実験を行った。6日後にフザリウムは、MS培地の表面全体に増殖し、
対照植物の根の損傷は激しく、茎の基部にはフザリウムが浸透しており、茎は柔
らかくなり、感染が認められる葉脈は明るい茶色となり壊死を起こしていた。数
日後に対照植物は衰弱し、枯死した。しかしトランスジェニック植物体は、フザ
リウム・ソラニの極端な繁殖にもかかわらず成長を続けた。
【０１１０】 複数の態様および実施例において本発明の原理を図示および説明したが、本発
明がこのような原理から逸脱することなく、その配置および細部を改変可能であ
ることは当業者には明らかと思われる。本発明者らは、添付の特許請求項の精神
および範囲の中に含まれるすべての改変を請求する。 参考文献
明がこのような原理から逸脱することなく、その配置および細部を改変可能であ
ることは当業者には明らかと思われる。本発明者らは、添付の特許請求項の精神
および範囲の中に含まれるすべての改変を請求する。 参考文献
【図１】 遺伝子導入ジャガイモの塊茎がもつ対軟腐病耐性を試験したアッ
セイの結果を示すグラフである。対照であるデジレ（Desiree）の塊茎および、
デルマセプチンB（試料番号D1、D2、D6、D10）またはテンポリンA（試料番号T1
、T2、T3）を発現するトランスジェニック植物の塊茎から調製した円盤状切片（
に、E.カロトボーラ（E.carotovora）を感染させた。室温で6日間放置後に円盤
状切片から腐敗組織を慎重に除去し、E.カロトボーラに対する感受性/耐性を塊
茎組織の重量欠損として表した。
セイの結果を示すグラフである。対照であるデジレ（Desiree）の塊茎および、
デルマセプチンB（試料番号D1、D2、D6、D10）またはテンポリンA（試料番号T1
、T2、T3）を発現するトランスジェニック植物の塊茎から調製した円盤状切片（
に、E.カロトボーラ（E.carotovora）を感染させた。室温で6日間放置後に円盤
状切片から腐敗組織を慎重に除去し、E.カロトボーラに対する感受性/耐性を塊
茎組織の重量欠損として表した。
【図２】 MSRA2（デルマセプチンB）およびMSRA3（テンポリンA）の両ペプ
チドの殺菌効果を示すグラフである。細胞培養物は、記載濃度のデルマセプチン
B（DSB；7 μug/ml、30 μg/ml、および75 μg/ml）、テンポリンA（TA；75 μg
/ml、133 μg/ml、200 μg/ml）およびテンポリンAおよびデルマセプチンBの両
者（133 μg/mlのテンポリンAと30 μg/mlのデルマセプチンB）で4時間室温でイ
ンキュベートし、希釈後にLB培地にプレーティングした。一晩37℃でインキュベ
ートした後、コロニー数を集計して細菌生存率を評点化した。
チドの殺菌効果を示すグラフである。細胞培養物は、記載濃度のデルマセプチン
B（DSB；7 μug/ml、30 μg/ml、および75 μg/ml）、テンポリンA（TA；75 μg
/ml、133 μg/ml、200 μg/ml）およびテンポリンAおよびデルマセプチンBの両
者（133 μg/mlのテンポリンAと30 μg/mlのデルマセプチンB）で4時間室温でイ
ンキュベートし、希釈後にLB培地にプレーティングした。一晩37℃でインキュベ
ートした後、コロニー数を集計して細菌生存率を評点化した。
【図３】 MSRA2（デルマセプチンB）およびMSRA3（テンポリンA）の両ペプ
チドのE.カロトボーラに対する殺菌効果を示すグラフである。細胞培養物は、記
載濃度のデルマセプチンB（DSB；23 μg/ml、45 μg/ml）またはテンポリンA（T
A；67 μg/ml、133 μg/ml）の存在下で室温で4時間インキュベートし、希釈後
にLB培地にプレーティングした。一晩28℃でインキュベートした後、コロニー数
を集計して細菌生存率を評点化した。
チドのE.カロトボーラに対する殺菌効果を示すグラフである。細胞培養物は、記
載濃度のデルマセプチンB（DSB；23 μg/ml、45 μg/ml）またはテンポリンA（T
A；67 μg/ml、133 μg/ml）の存在下で室温で4時間インキュベートし、希釈後
にLB培地にプレーティングした。一晩28℃でインキュベートした後、コロニー数
を集計して細菌生存率を評点化した。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年１２月２７日（２００１．１２．２７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】 遺伝子導入ジャガイモの塊茎がもつ対軟腐病耐性を試験したアッ
セイの結果を示すグラフである。対照であるデジレ（Desiree）の塊茎および、
デルマセプチンB（試料番号D1、D2、D6、D10）またはテンポリンA（試料番号T1
、T2、T3）を発現するトランスジェニック植物の塊茎から調製した円盤状切片に
、E.カロトボーラ（E.carotovora）を感染（黒い四角）、または感染させなかっ た（左側の白い四角） 。室温で6日間放置後に円盤状切片から腐敗組織を慎重に
除去し、E.カロトボーラに対する感受性/耐性を塊茎組織の重量欠損として表し
た。
セイの結果を示すグラフである。対照であるデジレ（Desiree）の塊茎および、
デルマセプチンB（試料番号D1、D2、D6、D10）またはテンポリンA（試料番号T1
、T2、T3）を発現するトランスジェニック植物の塊茎から調製した円盤状切片に
、E.カロトボーラ（E.carotovora）を感染（黒い四角）、または感染させなかっ た（左側の白い四角） 。室温で6日間放置後に円盤状切片から腐敗組織を慎重に
除去し、E.カロトボーラに対する感受性/耐性を塊茎組織の重量欠損として表し
た。
【図２】 MSRA2（デルマセプチンB）およびMSRA3（テンポリンA）の両ペプ
チドの大腸菌に対する殺菌効果を示すグラフである。細胞培養物は、記載濃度の
デルマセプチンB（DSB；7 μug/ml、30 μg/ml、および75 μg/ml）、テンポリ
ンA（TA；75 μg/ml、133 μg/ml、200 μg/ml）およびテンポリンAおよびデル
マセプチンBの両者（133 μg/mlのテンポリンAと30 μg/mlのデルマセプチンB）
で4時間室温でインキュベートし、希釈後にLB培地にプレーティングした。一晩3
7℃でインキュベートした後、コロニー数を集計して細菌生存率を評点化した。
チドの大腸菌に対する殺菌効果を示すグラフである。細胞培養物は、記載濃度の
デルマセプチンB（DSB；7 μug/ml、30 μg/ml、および75 μg/ml）、テンポリ
ンA（TA；75 μg/ml、133 μg/ml、200 μg/ml）およびテンポリンAおよびデル
マセプチンBの両者（133 μg/mlのテンポリンAと30 μg/mlのデルマセプチンB）
で4時間室温でインキュベートし、希釈後にLB培地にプレーティングした。一晩3
7℃でインキュベートした後、コロニー数を集計して細菌生存率を評点化した。
【図３】 MSRA2（デルマセプチンB）およびMSRA3（テンポリンA）の両ペプ
チドのE.カロトボーラに対する殺菌効果を示すグラフである。細胞培養物は、記
載濃度のデルマセプチンB（DSB；23 μg/ml、45 μg/ml）またはテンポリンA（T
A；67 μg/ml、133 μg/ml）の存在下で室温で4時間インキュベートし、希釈後
にLB培地にプレーティングした。一晩28℃でインキュベートした後、コロニー数
を集計して細菌生存率を評点化した。
チドのE.カロトボーラに対する殺菌効果を示すグラフである。細胞培養物は、記
載濃度のデルマセプチンB（DSB；23 μg/ml、45 μg/ml）またはテンポリンA（T
A；67 μg/ml、133 μg/ml）の存在下で室温で4時間インキュベートし、希釈後
にLB培地にプレーティングした。一晩28℃でインキュベートした後、コロニー数
を集計して細菌生存率を評点化した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 カイ ウィリアム ダブリュー． カナダ国 ブリティッシュ コロンビア州 ビクトリア キャドボロ ベイ ロード 3620 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD05 AD08 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD09 CD13 CD17 4B024 AA01 AA08 BA80 CA04 DA01 EA04 GA11 HA01 4B065 AA89X AA99Y AB01 BA02 CA24 CA44 CA53 4H045 AA10 BA10 DA83 DA86 EA20 FA74
Claims (13)
- 【請求項１】 以下からなる群から選択される陽イオン性ペプチドを発現す
るトランスジェニック植物： （a）テンポリン；および （b）デルマセプチン。 - 【請求項２】 組換え核酸分子を含むトランスジェニック植物であって、該
核酸分子が以下からなる群から選択されるペプチドをコードするトランスジェニ
ック植物： （a）テンポリン；および （b）デルマセプチン。 - 【請求項３】 ペプチドが、配列番号：3〜14および17〜26に示されるアミ
ノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項2記載のトラン
スジェニック植物。 - 【請求項４】 ペプチドが、長さが2〜25残基のアミノ酸であるN末端ペプチ
ド延長配列をさらに含む、請求項3記載のトランスジェニック植物。 - 【請求項５】N末端ペプチド延長が、AMWK、ASRHおよびALWKからなる群から
選択される、請求項4記載のトランスジェニック植物。 - 【請求項６】 組換え核酸分子からなるトランスジェニック植物であって、
該核酸分子が以下からなる群から選択される式（式中、Dはデルマセプチンペプ
チドであり、Tはテンポリンペプチドであり、およびPは陰イオン性プロ領域ペプ
チドである）である融合ペプチドをコードするトランスジェニック植物： （a）P-D；および （b）P-T。 - 【請求項７】 組換え核酸分子を含むトランスジェニック植物であって、該
核酸分子が以下からなる群から選択される式（式中、Dはデルマセプチンペプチ
ドであり、Tはテンポリンペプチドであり、Pは陰イオン性プロ領域ペプチドであ
り、およびSはスペーサーペプチドである）を持つ融合ペプチドをコードする、
トランスジェニック植物： （a）P-S-D；および （b）P-S-T。 - 【請求項８】 以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド
をコードする核酸分子を含み、ペプチドがデルマセプチンの生物学的活性を有す
るトランスジェニック植物： （a）配列番号：3〜14およびそれらの断片； （b）（a）で指定したアミノ酸配列とは、1個または複数の保存的アミノ酸置換
が異なるアミノ酸配列；および （c）（a）で指定したアミノ酸配列と少なくとも40%の配列同一性を有するアミ
ノ酸配列。 - 【請求項９】 ペプチドが、そのN末端に使用可能に連結された陰イオン性
プロ領域ペプチドをさらに含む、請求項8記載のトランスジェニック植物。 - 【請求項１０】 以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチ
ドをコードする核酸分子を含み、ペプチドがテンポリンの生物学的活性を有する
トランスジェニック植物： （a）配列番号：17〜26およびそれらの断片； （b）（a）で指定したアミノ酸配列とは、1個または複数の保存的アミノ酸置換
が異なるアミノ酸配列；および （c）（a）で指定したアミノ酸配列と少なくとも50%の配列同一性を有するアミ
ノ酸配列。 - 【請求項１１】 ペプチドがさらに、そのN末端に使用可能に連結された陰
イオン性プロ領域ペプチドをさらに含む、請求項8記載のトランスジェニック植
物。 - 【請求項１２】 配列番号：28および34からなる群から選択されるアミノ酸
配列を含む、ペプチドをコードする組換え核酸分子を含む、トランスジェニック
植物。 - 【請求項１３】 生物学的に活性のある陽イオン性ペプチドを作製する方法
であって、以下の段階を含む方法： 請求項1記載のトランスジェニック植物を提供する段階；および 少なくとも1種の生物学的に活性のある陽イオン性ペプチドを植物から単離する
段階。
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|---|---|---|---|
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