DE69823225T2

DE69823225T2 - Fusionsproteine, bestehend aus proteinaseinhibitoren

Info

Publication number: DE69823225T2
Application number: DE69823225T
Authority: DE
Inventors: John Howard Stainforth ATKINSON; John Michael Thornhill MCPHERSON; Edward Peter Bramley URWIN
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 1997-12-03
Filing date: 1998-12-01
Publication date: 2004-09-02
Anticipated expiration: 2018-12-02
Also published as: BR9814707A; AR017190A1; HUP0004509A2; DE69823225D1; WO1999028484A1; ES2215333T3; GB9725556D0; CA2312050A1; HUP0004509A3; US6784337B1; UA71901C2; DK1036185T3; RU2230787C2; ATE264396T1; TR200001572T2; CN1280627A; PL340924A1; EP1036185B1; HK1032073A1; CN1195063C

Description

Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren zur Verbesserung der Pathogenresistenz oder -verträglichkeit einer Pflanze, indem die Pflanze mit einem Transgen transformiert wird, das ein Fusionsprotein aus zwei oder mehr Proteinen oder Proteindomänen codiert, die die Pathogenresistenz oder -verträglichkeit bei ihrer eigenen Expression verbessern können. Die Erfindung wird durch gleichzeitige Übertragung von zwei unterschiedlichen Proteinaseinhibitoren als Fusionsprotein auf Arabidopsis thaliana beispielhaft erläutert, was zur verbesserten Resistenz oder Verträglichkeit gegenüber pflanzenparasitischen Nematoden führt. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird anerkannt, daß transgene Pflanzen, die erfindungsgemäß erhalten werden, tolerant oder verträglich nicht nur gegenüber Nematoden, sondern ebenfalls gegenüber Viren, Pilzen, Bakterien, Insekten, Milben und dergleichen sein können.
Nematoden sind die hauptsächlichen tierischen Parasiten von Pflanzen, die globale Verluste in der Landwirtschaft verursachen, die jedes Jahr auf > 100 Milliarden $ geschätzt werden. Eine verbesserte Pflanzenresistenz gegen parasitische Nematoden ist höchst erwünscht, um die Notwendigkeit für Nematizide zu reduzieren, von denen einige zu den am höchsten inakzeptablen Pestiziden gehören, die in der Landwirtschaft verwendet werden. Es gibt verschiedene mögliche Ansätze für die Entwicklung transgener Pflanzen mit verbesserter Nematodenresistenz, die Befall- und Migrationsabwehrstrategien, Futterzellverhinderung und Anti-Nematoden-Futterstrategien einschließen (Atkinson et al., Tibtech 13: 369–374, 1995). Dieser letztere Ansatz kann Proteinaseinhibitoren (PIs) verwenden, die ein wichtiges Element der natürlichen Pflanzenverteidigungsstrategien sind (Ryan, Annu. Rev. Pythopathol. 28: 425–49, 1990). Es gibt zehn PI-Gruppen, die für Pflanzen charakterisiert sind und alle vier Klassen von Proteinasen abdecken, und zwar Cystein-, Serin-, Metallo- und Aspartylproteinasen (Richardson, Methods in Plant Biochemistry 5: 259–305, 1991). EP-A-502 730 offenbart, daß wirksame transgene Verteidigungen auf PI-Basis für Nematoden verwirklicht werden können. Eines der bevorzugten Merkmale von PIs in der Nematodenbekämpfung ist ihre geringe Größe. Das Potential von PIs für den transgenen Pflanzen schutz wird durch das Fehlen von schädlichen Wirkungen von vielen PIs gesteigert, wenn sie von Menschen verzehrt werden.
cDNAs, die Cystein- und Serin-Verdauungsproteinasen eines Cystennematoden codieren, wurden kloniert, ihre hauptsächliche proteolytische Aktivität wurde im Darm lokalisiert, und es wurde gezeigt, daß die PIs CpTI und Oryzacystatin (Oc-I) wirksam gegen diese Proteinasen sind. Ortsspezifische Mutagenese führte zu einem verbesserten Ki von Oc-I im Anschluß an die Deletion einer Aminosäure. Dieses modifizierte Cystatin (Oc-IΔD86) hat eine gesteigerte Wirksamkeit als Transgen gegen Kartoffel-Cystennematoden (Urwin et al., Plant J. 8: 121–131, 1995). Bei Expression in Arabidopsis beschränkt es das Wachstum sowohl des Cystennematoden Heterodera schachtii als auch des Wurzelknotennematoden Meloidogyne incognita.
Die Abkömmlinge einer Kreuzung aus transgenem Tabak, der CpTI bzw. Erbsenlectin exprimiert, zeigten eine additive Wirksamkeit gegen die Baumwolleule (Boulter et al., Crop Protection 9: 351–354, 1990). Tandem-Promotor/Gen-Konstrukte könnten ein ähnliches Ergebnis ohne die Notwendigkeit zur Kreuzung von Pflanzen erreichen. Die Natur legt wenigstens zwei weitere alternative Wege zum Erreichen der Expression von mehr als einem Inhibitor nahe, und zwar bifunktionelle Inhibitoren (Wen et al., Plant Mol. Biol. 18: 813–814, 1992) und Multidomänen-PIs (Waldron et al., Plant Mol. Biol. 23: 801–812, 1993).
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren zur Verbesserung der Pathogenresistenz oder -verträglichkeit durch Übertragung von mehr als einem Resistenz- oder Verträglichkeits-Effektorprotein bereitzustellen. Für den Zweck der vorliegenden Erfindung beschreibt Resistenz die Wirkung eines eingeführten Transgens zur Beschränkung oder Verhinderung der Pathogenvermehrung in oder auf der transgenen Pflanze. Verträglichkeit betrifft die Fähigkeit der transgenen Pflanze, den schädigenden Wirkungen eines Pathogenangriffs zu widerstehen oder sich davon zu erholen und einen guten Ertrag abzuwerfen. Sowohl Resistenz gegen als auch Verträglichkeit für ein Pathogen führen zu einer Reduzierung der Schädigung der Nutzpflanze, die durch das Pathogen verursacht wird.
Die Erfindung stellt somit bereit:
Ein Verfahren zur Verbesserung der Pathogenresistenz oder -verträglichkeit in einer Pflanze und ihren Nachkommen, umfassend das Integrieren, in das Genom der Pflanze, eines Gens, das ein Fusionsprotein codiert, das folgendes umfaßt:

(a) ein erstes Protein oder eine erste Proteindomäne mit antipathogener Aktivität;
(b) ein Linker-Peptid; und
(c) ein zweites Protein oder eine zweite Proteindomäne mit antipathogener Aktivität.

Insbesondere stellt die Erfindung Verfahren, Gene und Proteine wie zuvor genannt bereit, worin

– weitere Proteine oder Proteindomänen mit antipathogener Aktivität mit dem Fusionsprotein durch Linker-Peptide fusioniert sind,
– wenigstens eine s) der Proteine oder Proteindomänen mit antipathogener Aktivität Proteinase-Inhibitoraktivität besitzt,
– wenigstens eine s) der Proteine oder Proteindomänen mit antipathogener Aktivität der Proteinaseinhibitor Oc-IΔD86 ist,
– wenigstens eine s) der Proteine oder Proteindomänen mit antipathogener Aktivität der Proteinaseinhibitor CpTI ist,
– das Gen funktionell an eine Promotorsequenz gebunden ist, die die Expression vorzugsweise in Pflanzenwurzeln antreibt,
– das Linker-Peptid eine Aminosäuresequenz umfaßt, die proteolytisch durch die Pflanze gespalten wird,
– das Linker-Peptid eine Aminosäuresequenz umfaßt, die proteolytisch in der Pflanze stabil ist,
– das Linker-Peptid dadurch gekennzeichnet ist, daß es die Aminosäuresequenz QASSYTAPQPQ umfaßt,
– das Linker-Peptid dadurch gekennzeichnet ist, daß es die Aminosäuresequenz VILGVGPAKIQFEG umfaßt,
– das Linker-Peptid dadurch gekennzeichnet ist, daß es die Aminosäuresequenz QASIEGRYTAPQPQ umfaßt,
– die Nematodenresistenz oder -verträglichkeit verbessert ist.

Die Erfindung stellt ferner transgene Pflanzen bereit, die durch das zuvor genannte Verfahren erhältlich sind. Insbesondere stellt die Erfindung bereit:

– eine Pflanze, die ein Fusionsprotein exprimiert, das durch ein DNA-Molekül gemäß der Erfindung codiert wird.

Zusätzlich erlaubt die Erfindung die Verwendung der beschriebenen DNA-Moleküle zur Verbesserung der Pathogenresistenz oder -verträglichkeit einer Pflanze und ihrer Nachkommen.
Zur Unterstützung des Verständnisses der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend häufig verwendete Begriffe in größerem Detail erläutert:
Eine Pflanze bezeichnet jede Pflanze, insbesondere Samenpflanzen. Die strukturelle und physiologische Einheit von Pflanzen sind Pflanzenzellen, die einen Protoplasten und eine Zellwand umfassen. Der Begriff "Pflanzenzelle" bezeichnet jede Zelle, die entweder Teil einer Pflanze ist oder daraus stammt. Beispiele für Zellen schließen differenzierte Zellen ein, die Teil einer lebenden Pflanze sind; differenzierte Zellen in Kultur; undifferenzierte Zellen in Kultur; die Zellen von undifferenziertem Gewebe, wie Kallus oder Tumore; differenzierte Zellen von Samen, Embryos, Fortpflanzungseinheiten oder Pollen. Insbesondere kann die Pflanzenzelle in Form einer isolierten einzelnen Zelle oder einer kultivierten Zelle oder als Teil einer höheren organisierten Einheit sein, wie z. B. ein Pflanzengewebe oder ein Pflanzenorgan.
Eine Gruppe von Pflanzenzellen kann in eine strukturelle und funktionelle Einheit gegliedert werden, die Pflanzengewebe genannt wird. Dieser Begriff schließt ein, aber ist nicht beschränkt auf Pflanzenorgane, Pflanzensamen, Gewebekultur und jede Gruppe von Pflanzenzellen, die in strukturelle und/oder funktionelle Einheiten gegliedert sind.
Pflanzenmaterial bezeichnet Blätter, Stengel, Wurzeln, Blüten oder Blütenteile, Früchte, Pollen, Pollenschläuche, Samenanlagen, Embryosäcke, Eizellen, Zygoten, Embryos, Samen, Stecklinge, Zell- oder Gewebekulturen oder jeden anderen Teil oder jedes andere Produkt einer Pflanze.
Eine Pflanze oder Zelle mit stabil in ihrem Genom eingebauter rekombinanter DNA wird als transgene Pflanze oder Zelle bezeichnet werden.
Transformation bezeichnet die Einführung einer Nukleinsäure in eine Zelle, insbesondere die stabile Integration eines DNA-Moleküls in das Genom eines interessierenden Organismus.
Die rekombinante DNA bezeichnet ein oder mehrere DNA-Moleküle, die durch Verbinden von DNA-Segmenten aus unterschiedlichen Quellen gebildet und unter Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie erhalten werden, wie z. B. beschrieben von Sambrook et al. in "Molecular Cloning – A Laboratory Manual", 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1989). Rekombinante DNA-Technik erzeugt rekombinante DNA in vitro und überführt sie in Zellen, in denen sie exprimiert oder vermehrt werden kann (siehe "Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology", Hrsg. Juo, CRC Press, Boca Raton (1996)), zum Beispiel Übertragung von DNA in (einen) Protoplasten oder (eine) Zelle(n) in verschiedenen Formen, einschließlich zum Beispiel (1) nackte DNA in ringförmigen, linearen oder supergeknäulten Formen, (2) DNA, die in Nukleosomen oder Chromosomen oder Kernen oder Teilen daraus enthalten ist, (3) DNA, die mit anderen Molekülen komplexiert oder assoziiert ist, (4) DNA, die in Liposomen, Sphäroplasten, Zellen oder Protoplasten eingeschlossen ist, oder (5) DNA, die aus anderen Organismen als dem Wirtsorganismus übertragen wird (z. B. Agrobacterium tumefaciens). Diese und andere verschiedene Verfahren der Einführung der rekombinanten DNA in Zellen sind fachbekannt und können verwendet werden, um die transgenen Zellen oder transgenen Pflanzen der vorliegenden Erfindung zu erzeugen. Die ursprüngliche Insertion der rekombinanten DNA in das Genom einer R⁰-Pflanze wird nicht durch herkömmliche Pflanzenzuchtverfahren erreicht, sondern durch die technischen Verfahren wie hier beschrieben. Im Anschluß an die ursprüngliche Insertion können die transgenen Nachkommen unter Verwendung von im wesentlichen herkömmlichen Zuchtverfahren vermehrt werden.
Ein Gen wird als Beschreibung einer diskreten chromosomalen Region betrachtet, die ein regulatorische DNA-Sequenz umfaßt, die für die Kontrolle der Expression einer codierenden Sequenz verantwortlich ist, die transkribiert und translatiert wird, um ein spezifisches Polypeptid oder Protein zu ergeben. Insbesondere bezeichnet ein Gen eine codierende Sequenz und assoziierte Regulationssequenzen, worin die codierende Sequenz zu RNA transkribiert wird, wie mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, sense-RNA oder antisense-RNA. Beispiele für Regulationssequenzen sind Promotorsequenzen, 5'- und 3'-untranslatierte Sequenzen und Terminationssequenzen. Weitere Elemente, die vorliegen können, sind z. B. Introns.
Eine codierende Sequenz wird als Beschreibung der Sequenz eines DNA-Moleküls betrachtet, die bei Transkription und Translation zur Bildung eines Polypeptids oder Proteins führt.
Expression bezeichnet die Transkription und/oder Translation eines endogenen Gens oder eines Transgens in Pflanzen. Im Falle von antisense-Konstrukten kann Expression zum Beispiel die Transkription allein der antisense-DNA bezeichnen.
Ein DNA-Molekül, das wenigstens zwei heterologe Teile enthält, z. B. Teile, die aus vorher bestehenden DNA-Sequenzen stammen, die in ihren vorher bestehenden Zuständen nicht assoziiert sind, wird manchmal als chimäres Gen bezeichnet. Diese Moleküle werden bevorzugt unter Verwendung von rekombinanter DNA-Technik erzeugt.
Insbesondere bezeichnet heterolog, wie es hier verwendet wird, "von unterschiedlichem natürlichen oder von synthetischem Ursprung". Falls zum Beispiele eine Wirtszelle mit einer Nukleinsäuresequenz transformiert wird, die nicht in der untransformierten Wirtszelle auftritt, sagt man, daß die Nukleinsäuresequenz heterolog in Bezug auf die Wirtszelle ist. Die transformierende Nukleinsäure kann einen heterologen Promotor, eine heterologe codierende Sequenz oder eine heterologe Terminationssequenz umfassen. Alternativ kann die transformierende Nukleinsäure vollständig heterolog sein oder kann jede mögliche Kombination aus heterologen und endogenen Nukleinsäuresequenzen umfassen.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der Konstruktion von Genen, die eine Fusion aus Effektorproteinen oder Proteindomänen codieren, und wird in Bezug auf die Nematodenbekämpfung durch Konstrukte beispielhaft erläutert, die die PIs CpTi und Oc-IΔD86 fusionieren. Diese PIs werden gewählt, weil sie unterschiedliche inhibitorische Eigenschaften zeigen, die zu unterscheidbaren Wirkungen gegen Cystennematoden führen. So beeinflußt CpTI das geschlechtliche Schicksal, und Oc-IΔD86 unterdrückt das Wachstum, insbesondere von sich entwickelnden weiblichen Nematoden. Die transgene Expression der Fusionsproteine führt zur Reduktion der eindringenden Pathogenpopulation über eine einzelne Generation, wie für Nematoden durch neue Eibildung bestimmt, um wenigstens 25% und bevorzugt 50%. In Abwesenheit eines meßbaren Verlusts des Fortpflanzungserfolgs kann der durch ein Pathogen verursachte Ertragsverlust zumindest um 25%, bevorzugt 50% reduziert werden.
Das Prinzip des Ansatzes richtet sich auf die Verwendung von Peptid-Linkern, das es beiden PIs erlaubt, als Fusionsprotein translatiert zu werden. Die Eigenschaften des Linkers bestimmen den Übertragungsmodus, d. h. als Fusionsprotein oder getrennt aufgrund proteolytischer Spaltung. Solche Linker-Strategien besitzen ein breites Potential, das sich über die Nematodenbekämpfung hinweg erstreckt. Sie bieten eine neue Grundlage für die Anhäufung von Verteidigungsgenen zur Steigerung der Wirksamkeit und Beständigkeit von transgenen Resistenz- oder Verträglichkeitsansätzen.
Zur Verbesserung der Pathogenresistenz oder -verträglichkeit umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren das Integrieren, in das Genom einer Pflanze, eines Gens, das ein Fusionsprotein codiert, das folgendes umfaßt:

(a) ein erstes Protein oder eine erste Proteindomäne mit antipathogener Aktivität;
(b) ein Linker-Peptid;
(c) ein zweites Protein oder eine zweite Proteindomäne mit antipathogener Aktivität; und
(d) gegebenenfalls ein e) oder mehrere Proteine oder Proteindomänen mit antipathogener Aktivität, die daran durch ein oder mehrere Peptid-Linker fusioniert sind.

Bevorzugte Proteine oder Proteindomänen mit antipathogener Aktivität sind PIs, Bacillus thuringiensis-Toxine, Pathogenese-bezogene Proteine, Chitinasen, Glucanasen, Peptide, die Lysepeptide einschließen, Thionine, Collagenasen, Lipasen, Lectine, ribosomale inaktivierende Proteine, Pectinaseinhibitoren, Lipaseinhibitoren, α-Amylaseinhibitoren, Polygalacturonidase-Inhibitorprotein, Patatin, Permatin, Lysozym, Cholesterinoxidase, virales Hüllprotein, Antikörper, einkettige Antikörper, die Produkte von Avirulenzgenen und Resistenzgenen und andere Proteine, die den Fortpflanzungserfolg von Insekten, Nematoden, Viren, Bakterien oder Pilzen oder die dadurch verursachte Schädigung reduzieren. Es ist nicht bekannt, daß die fusionierten Proteine oder Proteindomänen als Fusionsproteine in der Natur auftreten. Ihre entsprechenden Gensequenzen stammen bevorzugt aus dem Genom von mehr als einem Organismus und erfordern die rekombinante DNA-Technik, um sie zusammenzubringen. Verglichen mit Mehrfachen der gleichen Effektordomäne, die eine tatsächliche Zunahme der Effektorkonzentration erreicht, erlauben unterschiedliche Domänen von zwei oder mehr Effektorproteinen die Möglichkeit synergistischer oder additiver Wirkungen. Falls eine (s) oder mehrere der Proteine oder Proteindomänen einer Domäne entsprechen, die durch eine spezifische genomische Region der zu transformierenden Pflanze codiert wird, wird die Integration des Fusionskonstrukts gemäß der vorliegenden Erfindung sicherlich innerhalb einer unterschiedlichen genomischen Region auftreten. Besonders bevorzugt sind Proteine oder Proteindomänen mit antipathogener Aktivität gegen mehr als ein Pathogen einer Nutzpflanze oder antipathogene Proteine, die Krankheitsassoziationen entgegenwirken, wie denjenigen zwischen Fusarium und Meloidogyne.
Bestimmte Nematoden induzieren Freßstellen, die eine Pflanzenzellmodifikation und das Fressen an einer Stelle für mehrere Stunden oder beträchtlich mehr beinhalten. Sie schließen Arten der Gattungen Meloidogyne, Globodera, Heterodera, Rotylenchulus, Tylenchulus, Naccobus, Xiphinema, Longidorus, Paralongidorus, Cryphodera, Trophotylenchulus, Hemicycliophora, Criconemella, Verutus und Heliocotylenchus ein. Gattungen, von denen angenommen wird, daß sie für einen beschränkteren Zeitraum an einer Stelle fressen, schließen ein: Pratylenchus, Radopholus, Hirschmanniella, Trichodorus, Paratrichodorus, Ditylenchus, Aphelenchoides, Scutellonema und Belonolaimus. In Bezug auf die Bekämpfung der Arten der obigen Gattungen und anderer, sich von Pflanzen ernährender Gattungen von Dorylaimid- und Tylenchid-Nematoden sind PIs, Collagenasen, Pectinaseinhibitoren, Lectine, Patatin und Cholesterinoxidase von besonderem Interesse. Viele PIs sind Samenspeicherproteine, die sich während der Entwicklung des Samen anreichern, und können als eines der am häufigsten vorkommenden Proteine in reifen Samen auftreten. Inhibitoren von Cystein- oder Serin-Verdauungsproteinasen, die sich im Darm von Nematoden befinden, können bevorzugt zur Verwendung in der Erfindung sein. Cysteinproteinasen sind von besonderem Interesse, da sie keine Säugetier-Verdauungsenzyme sind. Besonders wirksam ist Oryzacystatin (Oc-I). Ortsspezifische Mutagenese von Oc-I führte zu einem verbesserten Ki im Anschluß an die Deletion einer Aminosäure. Dieses modifizierte Cystatin (Oc-IΔD86) hat eine gesteigerte Wirksamkeit als Transgen gegen Kartoffel-Cystennematoden (Urwin et al., Plant J. 8: 121–131, 1995). Bei Expression in Arabidopsis beschränkt es das Wachstum von sowohl Heterodera schachtii, einem Cystennematoden, als auch von Meloidogyne incognita, einem Wurzelknotennematoden. Die Wirkung eines einzelnen PI auf Mitglieder der zwei Hauptgruppen von ökonomisch bedeutenden Nematoden erlaubt eine breite Resistenzstrategie zur Bekämpfung sehr unterschiedlicher Nematodenschädlinge einer Zielnutzpflanze. Dies steht dem beschränkten Bereich von Zielarten gegenüber, die mit vielen natürlichen Resistenzgenen verbunden sind. Zum Beispiel liefert die in Sorten wie Maris Piper vorhandene H1-Resistenz eine qualitative Resistenz gegen einen Kartoffel-Cystennematoden (Globodera rostochiensis), aber keinen Schutz gegen eine zweite, eng verwandte Art (G. pallida).
Die Funktion des Linker-Peptids besteht in der Verbindung der antipathogenen Proteine oder Proteindomänen ohne Störung ihrer Funktion. Natürliche Linker haben allgemein eine Länge von ca. 3 bis 15 Aminosäuren. Pentapeptide mit nur Gly, Ser und Thr treten am häufigsten in natürlichen Linkern auf und bilden die besten allgemeinen Linker. Glycin liefert Flexibilität, und die anderen zwei sind polar, so daß sie mit Lösungsmittel oder einer Wasserstoffbindung an ihren Hauptketten-Stickstoff wechselwirken. Dies führt zu einer gewissen Konformations- und energetischen Stabilität. Sie wechselwirken unwahrscheinlich mit einem anderen Teil der verbundenen Proteine oder Proteindomänen und sind wenig wahrscheinlich anfällig für die Spaltung durch Wirtsproteasen. Ebenfalls als vorteilhaft werden Ala, Pro, Asp, Lys, Gln und Asn betrachtet. Hydrophobe Reste wie Arg und Glu, die größten der basischen bzw. sauren Reste, werden vermieden. Linker, die für Spaltung durch weit verbreitete Proteasen anfällig sind, besitzen häufig einen oder mehrere der unvorteilhaften Bestandteile. Zum Beispiel kann Gly-Gly-X, worin X häufig ein Aminosäurerest mit einer hydrophoben Seitenkette ist, ein proteolytischer Prozessierungsort sein. Diese Angelegenheiten und eine Liste potentiell nützlicher Linker werden beschrieben in P. Argos, J. Mol. Biol. 211, 943–958, 1990. Der Wert eines spaltbaren Linkers wird nicht berücksichtigt.
Linker werden in einem weiten Bereich von Gebieten verwendet. Die sachdienlichste für diese Erfindung ist die Verwendung von Linkern zur Expression funktioneller Antikörpermoleküle, wie einkettiger Antikörper in Pflanzen. Sowohl vollständige als auch konstruierte Antikörper wurden in Pflanzen exprimiert. Einkettige Fv-Fragmente (ScFv) von Antikörpern können durch Verbinden der Domänen der variablen schweren Kette (V_H) und der variablen leichten Kette (V_L) eines Antikörpergens (V) konstruiert werden. Ein Ansatz, um dies zu erreichen, besteht in der Verwendung eines Peptid-Linkers. Eine Anzahl von Peptiden wurden unter Verwendung eines computergestützten Programms und einer Recherche von Bibliotheken mit dreidimensionalen Peptidsequenzen konstruiert. Ein erfolgreicher Linker ist ein natürlicher Immunglobulin-Linker mit benachbarten Resten mit der Aminosäuresequenz KESGSVSSEQLAQFRSLD (Bird et al., Science 242, 423–427; 1988; SEQ ID NO: 12). Ein anderes Peptid mit der Aminosäuresequenz EGKSSGSGSESKP (Bird et al., Science 242, 423–427; 1988; SEQ ID NO: 13) wird durch Gly, Ser und Thr dominiert. Es wurde erfolgreich verwendet, um ein ScFv in Pflanzen zu exprimieren (Owen et al., Biotechnology 10, 790–794, 1992). Ein Linker mit der Aminosäuresequenz GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 14) wurde für ScFv-Antikörper auf der Basis der Bestimmung des euklidischen Abstandes zwischen dem C-Terminus der V_H-Domäne und dem N-Terminus der V_L-Domäne empfohlen (Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 5879–5883, 1988). Dieser Linker besitzt Flexibilität und behält dennoch Stabilität und Konformation in Lösung bei (P. Argos, J. Mol. Biol. 211, 943–958, 1990).
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die codierenden Regionen der PIs Oc-IΔD86 und CpTI im Tandem angeordnet und im Raster durch eine Peptid-Linkersequenz verbunden, die konstruiert ist, um empfänglich für Proteolyse zu sein. Die verwendete Peptid-Linkersequenz entspricht 14 Aminosäuren (VILGVGPAKIQFEG; SEQ ID NO: 1) der zentralen "Spacer"-Region des Metallothionein-artigen Proteins PsMTa der Erbse (Evans et al., FEBS 262: 29–32, 1990). Diese "Spacer"-Region ist als Proteinase-empfindlich bekannt (Kille et al., FEBS 295: 171–175, 1991 und Tommey et al., FEBS 292: 48–52, 1991). Sowohl CpTI als auch Oc-IΔD86 waren vorwiegend als sepa rate Proteine vorhanden, wenn sie in transgenem Arabidopsis exprimiert wurden. Es wurde berichtet, daß viele andere Proteine proteolytisch empfindlich sind, und verschiedene Erkennungssequenzen wurden charakterisiert (Uhlen et al., Meth. Enzymol. 185: 129–143, 1990 und Foresberg et al., J. Prot. Chem. 11: 201–211, 1992).
Ein natürlicher Präzedenzfall für die Verwendung eines proteolytisch empfindlichen Linkers ist das Kartoffel-Multicystatin, PML, das acht Tandem-Cystatindomänen umfaßt, die durch für proteolytische Spaltung empfängliche Sequenzen verbunden sind (Waldron et al., Plant Mol. Biol. 23: 801–812, 1993). Jedoch ist PML nicht für die Fragmentierung in der Pflanze bekannt, sondern wird als inaktive Kristalle in der Subphellogenschicht der Knollen gelagert. Es wird angenommen, daß es Aktivität nach Fragmentierung im Darm bestimmter Insekten erlangt. Es ist nicht zur Verwendung gegen Nematoden geeignet, die nur unwahrscheinlich dieses Protein mit 86,8 kDa aufnehmen.
Die Narbe des Ziertabaks Nicotiana alata enthält ein ungewöhnliches PI (NA-PI-II). Es wird als ein Vorläuferprotein mit vorhergesagten 41,6 kDa exprimiert, das an sechs Stellen unter Erzeugung von sieben Peptiden gespalten wird. Alle außer Peptid 1 besitzen die gleiche Größe und teilen eine N-terminale Sequenz, aber Peptid 7 hat vielleicht keine funktionelle inhibitorische Stelle für die Chymotrypsin- oder Trypsin-Inhibierung. Die Reifungsorte, die zur Freisetzung von funktionellen PIs führen, wurden nicht bestimmt.
Moleküle, die eine ähnliche Reifung erfahren, existieren auch in Tiersystemen, wobei ein Beispiel Profilaggrin ist, das an der terminalen Differenzierung der Säugetierepidermis beteiligt ist.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die codierenden Regionen der PIs Oc-IΔD86 und CpTI im Tandem angeordnet und im Raster durch eine Peptid-Linkersequenz verbunden, die konstruiert ist, um beständig gegen Proteolyse zu sein. Das verwendete Linker-Peptid entspricht einem Abschnitt mit 11 Aminosäuren (QASSYTAPQPQ; SEQ ID NO: 2) des Pilzenzyms Galactoseoxidase, der die ersten zwei Domänen des Enzyms verbindet. Diese Region ist als strukturell steif bekannt (Ito et al., Nature 350: 87–91, 1991), und es gibt keinen Hinweis für eine proteolytische Spaltung, was nahelegt, daß der Linker nicht für eine schnelle Proteolyse empfänglich ist. In Arabidopsis lenkt das Konstrukt die Expression eines Fusionsproteins aus Oc-IΔD86 und CpTI, das hauptsächlich als ein 23 kDA Protein intakt bleibt. Von anderen halbsteifen Linkern wurde berichtet, wie von Glucoamylase 1 (Kramer et al., J. Chem. Soc. Farad. Trans. 89: 2595–2602, 1993), die zur Durchführung der gleichen Funktion verwendet werden kann. Die Sequenz des Galactoseoxidase-Linkers kann modifiziert werden, um empfänglich für proteolytische Spaltung zu werden. So wird die modifizierte Linkersequenz QASIEGRYTAPQPQ (SEQ ID NO: 11) proteolytisch in einem Pilz-Expressionssystem gespalten.
Die codierende Sequenz eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins ist funktionsfähig mit einem in der Pflanze exprimierbaren Promotor verbunden. Bevorzugte Promotoren schließen konstitutive, induzierbare, temporär regulierte, entwicklungsgemäß regulierte, chemisch regulierte, gewebebevorzugte und/oder gewebespezifische Promotoren ein.
Bevorzugte konstitutive Promotoren schließen die CaMV 35S- und 19S-Promotoren ein (Fraley et al., US-PS 5,352,605 ). Ein zusätzlich bevorzugter Promotor stammt aus einem beliebigen der verschiedenen Actin-Gene, die für die Expression in den meisten Zelltypen bekannt sind. Die von McElroy et al. beschriebenen Promotor-Expressionskassetten (Mol. Gen. Genet. 231: 150–160, 1991) können leicht zur Expression der codierenden Sequenz modifiziert werden und sind besonders geeignet zur Verwendung in einkeimblättrigen Wirten.
Noch ein anderer bevorzugter konstitutiver Promotor stammt aus Ubiquitin, das ein anderes, zur Anreicherung in vielen Zelltypen bekanntes Genprodukt ist. Der Ubiquitinpromotor wurde aus verschiedenen Arten zur Verwendung in transgenen Pflanzen kloniert (z. B. Sonnenblume – Binet et al., Plant Science 79: 87–94, 1991; Mais – Christensen et al., Plant Molec. Biol. 12: 619–32, 1989). Der Mais-Ubiquitinpromotor wurde in transgenen einkeimblättrigen Systemen entwickelt, und seine Sequenz und Vektoren, konstruiert für die einkeimblättrige Transformation, werden in Christiansen et al., EP-A-342 926, offenbart.
Gewebespezifische oder gewebebevorzugte Promotoren, die zur Expression der codierenden Sequenz in Pflanzen, insbesondere Mais und Zuckerrübe, nützlich sind, sind diejenigen, die die Expression in Wurzel, Mark, Blatt oder Pollen lenken. Beispiele sind der TUB1-Promotor aus Arabidopsis thaliana-b1-Tubulin-Gen (Snustad et al., Plant Cell 4: 549, 1992), die PsMT_A-Promotorregion aus dem Metallothionein-artigen Gen von Pisum sativum (Evans et al., FEBS Letters 262: 29, 1990), die RPL16A- und ARSK1-Promotoren aus Arabidopsis thaliana und weitere, in WO 97/20057 und WO 93/07278 offenbarte Promotoren. Ein weiterer nützlicher Promotor ist das wun1-Promotorfragment aus Kartoffel (Siebertz et al., Plant Cell 1: 961–968, 1989), das in Geweben induziert wird, die Wundstellen umgeben. Ferner sind chemisch induzierbare Promotoren zur Lenkung der Expression nützlich und sind auch bevorzugt (siehe WO 95/19443).
Zusätzlich zu Promotoren kann eine Vielzahl von Transkriptionsterminatoren in chimären Genen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Transkriptionsterminatoren sind verantwortlich für die Termination der Transkription hinter Transgen und für seine korrekte Polyadenylierung. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die codierende Sequenz funktionsfähig mit ihrer natürlich auftretenden Polyadenylierungssignalsequenz verbunden. Geeignete Transkriptionsterminatoren und diejenigen, die als in Pflanzen funktionierend bekannt sind, schließen den CaMV 35S-Terminator, den tm1-Terminator, den Erbse rbcS E9-Terminator und andere fachbekannte ein. Zweckmäßige Terminationsregionen sind ebenfalls aus dem Ti-Plasmid von A. tumefaciens erhältlich, wie die Octopinsynthase- und Nopalinsynthase-Terminationsregionen. Siehe ebenfalls Rosenberg et al., Gene 56: 125, 1987; Guerineau et al., Mol. Gen. Genet. 262: 141–144, 1991; Proudfoot, Cell 64: 671–674, 1991; Sanfacon et al., Genes Dev. 5: 141–149; Mogen et al., Plant Cell 2: 1261–1272, 1990; Munroe et al., Gene 91: 151–158, 1990; Ballas et al., Nucleic Acids Res. 17: 7891–7903, 1989; Joshi et al., Nucleic Acid Res. 15: 9627–9639, 1987.
Es wurde festgestellt, daß zahlreiche Sequenzen die Genexpression innerhalb der Transkriptionseinheit steigern, und diese Sequenzen können in Verbindung mit einer codierenden Sequenz verwendet werden, um die Expression in transgenen Pflanzen zu erhöhen. Es wurde gezeigt, daß verschiedene Intronsequenzen die Expression steigern, insbesondere in einkeimblättrigen Zellen. Zum Beispiel wurde festgestellt, daß die Introns des Mais Adh1-Gens signifikant die Expression des Gens vom Wildtyp unter seinem erkennenden Promotor steigern, wenn sie in Maiszellen eingeführt werden (Callis et al., Genes Develop. 1: 1183–1200, 1987). Intronsequenzen werden routinemäßig in Pflanzentransformationsvektoren eingeführt, typischerweise innerhalb der nicht-translatierten Leitsequenz.
Die Konstrukte können ebenfalls einen Regulator, wie ein nukleäres Lokalisierungssignal (Kalderon et al., Cell 39: 499–509, 1984; und Lassner et al., Plant Molecular Biology 17: 229–234, 1991), eine Pflanzentranslations-consensus-Sequenz (C. P. Joshi, Nucleic Acids Research 15: 6643–6653, 1987), ein Intron (Luehrsen und Walbot, Mol. Gen. Genet. 225: 81–93, 1991) und dergleichen einschließen, funktionsfähig verbunden mit der entsprechenden Nukleotidsequenz.
Bevorzugt ist die 5'-Leitsequenz im Expressionskassettenkonstrukt eingeschlossen. Solche Leitsequenzen können zur Steigerung der Translation agieren. Translationsleitsequenzen sind fachbekannt und schließen ein: Picornavirus-Leader, z. B. EMCV-Leader (Encephalomyocarditis 5'-nicht-codierende Region) (O. Elroy-Stein, T. R. Fuerst und Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6126–6130, 1989); Potyvirus-Leader, z. B. TEV-Leader (Tobacco Etch Virus) (Allison et al., MDMV-Leader (Maize Dwarf Mosaic Virus)"; Virology 154: 9–20, 1986) und menschliches Immunglobulin schwere Kette bindendes Protein (BiP) (D. G. Macejak und P. Samow, Nature 353: 90–94, 1991); untranslatierte Leitsequenz aus der Hüllprotein-mRNA des Luzerne-Mosaikvirus (AMV RNA 4) (S. A. Jobling und L. Gebrke, Nature 325: 622–625, 1987); Tabakmosaikvirus-Leader (TMV) (D. R. Gallie et al., Molecular Biology of RNA, 237–256, 1989); und Maize Chlorotic Mottle Virus-Leader (MCMV) (S. A. Lommel et al., Virology 91: 382–385, 1991). Siehe ebenfalls Della-Cioppa et al., Plant Physiology 84: 965–968, 1987.
Gene, die Fusionsproteine wie oben beschrieben codieren, können in Pflanzenzellen auf eine Anzahl von fachbekannten Weisen eingeführt werden. Die Fachleute werden einsehen, daß die Wahl des Verfahrens vom Typ der zur Transformation ausgewählten Pflanze abhängen könnte. Geeignete Verfahren zur Transformation von Pflanzenzellen schließen Mikroinjektion (Crossway et al., BioTechniques 4: 320–34, 1986), Elektroporation (Riggs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5602–5606, 1986), Agrobacterium-vermittelte Transformation (Hinchee et al., Biotechnology 6: 915–921, 1988; siehe auch Ishida et al., Nature Biotechnology 14: 745–750 (Juni 1996) für die Mais-Transformation), direkter Gentransfer (Paszkowski et al., EMBO J. 3: 2717–2722, 1984; Hayashimoto et al., Plant Physiol. 93: 857–863, 1990) (Reis) und ballistische Teilchenbeschleunigung unter Verwendung von Vorrichtungen, die erhältlich sind von Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin, und Dupont, Inc., Wilmington, Delaware (siehe z. B. Sanford et al., US-PS 4,945,050 ; und McCabe et al., Biotechnology 6: 923–926, 1988). Siehe ebenfalls Weissinger et al., Annual Rev. Genet. 22: 421–477, 1988; Sanford et al., Particulate Science and Technology 5: 27–37, 1987 (Zwiebel); Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8526–8530, 1990 (Tabak-Chloroplast); Christou et al., Plant Physiol. 87: 671–674, 1988 (Sojabohne); McCabe et al., Bio/Technology 6: 923–926, 1988 (Sojabohne); Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4305–4309, 1988 (Mais); Klein et al., Bio/Technology 6: 559–563, 1988 (Mais); Klein et al., Plant Physiol. 91: 440–444, 1988 (Mais); Fromm et al., Bio/Technology 8: 833–839, 1990; und Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603– 618, 1990 (Mais); Koziel et al., Biotechnology 11: 194–299, 1993 (Mais); Shimamoto et al., Nature 338: 274–277, 1989 (Reis); Christou et al., Biotechnology 9: 957–62, 1991 (Reis); Datta et al., Bio/Technology 8: 736–740, 1990 (Reis); europäische Patentanmeldung EP-A-332 581 (Knaulgras) und andere Pooideae); Vasil et al., Biotechnology 11: 1553–1558, 1993 (Weizen); Weeks et al., Plant Physiol. 102: 1077–1084, 1993 (Weizen); Wan et al., Plant Physiol. 104: 37–48, 1994 (Gerste); Jahne et al., Theor. Appl. Genet. 89: 525–533, 1994 (Gerste); Umbeck et al., Bio/Technology 5: 263–266, 1987 (Baumwolle); Casas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11212–11216 (Dez. 1993) (Hirse); Somers et al., Bio/Technology 10: 1589–1594 (Dez. 1992) (Hafer); Torbert et al., Plant Cell Reports 14: 635–640, 1995 (Hafer); Weeks et al., Plant Physiol. 102: 1077–1084, 1993 (Weizen); Chang et al., WO 94/13882 (Weizen) und Nehra et al., The Plant Journal 5: 285–297, 1994 (Weizen).
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform zur Einführung von rekombinanten DNA-Molekülen in Zuckerrübe durch Agrobacterium-vermittelte Transformation kann gefunden werden in Konwar, J. Plant Biochem. & Biotech. 3: 37–41, 1994.
Verfahren unter Verwendung einer beliebigen Form aus direktem Gentransfer, Technik mit Teilchenkanone oder Agrobacterium-vermitteltem Transfer machen sich gewöhnlich, aber nicht notwendigerweise, einen selektierbaren oder durchmusterungsfähigen Marker zu Nutze, der Resistenz gegen ein Antibiotikum (z. B. Kanamycin, Hygromycin oder Methotrexat) oder ein Herbizid (z. B. Phosphinothricin) bereitstellt. Die Wahl des selektierbaren oder durchmusterungsfähigen Markers zur Pflanzentransformation ist jedoch nicht kritisch für die Erfindung. Beispiele sind das nptII-Gen, das Resistenz gegen Kanamycin und verwandte Antibiotika verleiht (Vieira & Messing, Gene 19: 259–68, 1982; Bevan et al., Nature 304: 184–187, 1983), das bar-Gen, das Resistenz gegen das Herbizid Phosphinothricin verleiht (White et al., Nucl. Acids Res. 18: 1062, 1990; Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79: 625–631, 1990), das hph-Gen, das Resistenz gegen das Antibiotikum Hygromycin verleiht (Blochlinger & Diggelmann, Mol. Cell. Biol. 4: 2929–2931), und das dhfr-Gen, das Resistenz gegen Methotrexat verleiht (Bourouis und Jarry, EMBO J. 2: 1099–1104, 1983). Die Transformation kann mit einer einzelnen DNA-Art oder mehrfachen DNA-Arten (d. h. Cotransformation) durchgeführt werden, und diese beiden Techniken sind geeignet zur Verwendung mit zum Beispiel PI-codierenden Sequenzen.
Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind das oben beschriebenen Fusionsprotein, das folgendes umfaßt:

(a) ein erstes Protein oder eine erste Proteindomäne mit antipathogener Aktivität;
(b) ein Linker-Peptid;
(c) ein zweites Protein oder eine zweite Proteindomäne mit antipathogener Aktivität; und
(d) gegebenenfalls ein e) oder mehrere weitere Proteine oder Proteindomänen mit antipathogener Aktivität, die daran durch ein oder mehrere Peptid-Linker fusioniert sind,

Pathogene wie Nematoden verursachen einen wirtschaftlichen Verlust für die meisten der Nutzpflanzen der Welt. Diese schließen für die Landwirtschaft der gemäßigten Zonen ein: Kartoffeln, Zuckerrübe, Gemüsepflanzen (einschließlich Tomate, Gurke, Kohl, Blumenkohl, Sellerie, Salat, Karotte, Rüben, Pastinak Rettich, Kichererbse und Linse), Ölsaaten, Hülsenfrüchte, Mais, Weizen, Gerste, Hafer, Roggen und andere Getreidearten, Weideland- und Grünfutterpflanzen (einschließlich einer Reihe von Gräsern, roter und weißer Klee und Luzerne), Waldbäume, Laub- und Nußbäume, Beerenobst und Reben, einschließlich Weinstöcken, Zier- und Zwiebelpflanzen, Knoblauch, Zwiebeln und Gewächshauspflanzen.
Diese schließen ebenfalls subtropische und tropische Nutzpflanzen ein, wie Reis, andere Getreidearten (einschließlich Weizen, Gerste, Mais, Hafer, Sorghum und Hirse), Hackfrüchte und Knollenfrüchte (einschließlich Kartoffel, Süßkartoffel, Maniok, Yamswurzel, Wasserbrotwurzel), Nahrungshülsenfrüchte, Gemüse (einschließlich Tomate, Gurke, Gewürzgurke, Hönigmelonen und andere Melonen, Wassermelone, Kohl, Blumenkohl, spanischer Pfeffer, Aubergine, Knoblauch, Zwiebeln, Sellerie, Kürbis, "Sashes" und Kalebassen, Salat, Kichererbse und Linse), Erdnuß, Zitrusgewächse, subtropische und tropische Obstbäume, Kokos- und andere Palmen, Kaffee, Kakao, Tea, Bananen, Wegerich und Manilahanf, Zuckerrohr, Tabak, Ananas, Baumwolle und andere tropische Faserpflanzen und ebenfalls eine Reihe von Gewürzen.
Die zweikeimblättrigen oder einkeimblättrigen Pflanzen, die transgenisch die erfindungsgemäßen Fusionsproteine exprimieren, stellen eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar, ebenso wie die Abkömmlinge der Pflanzen und ihre Samen. Außerdem umfaßt wird eine gewerbliche Tüte, die Samen der Pflanzen umfaßt. Bevorzugt ist eine gewerbliche Tüte zusammen mit Etikettanweisungen zur Verwendung der darin enthaltenen Samen. Die genetischen Eigenschaften, die gentechnisch in die oben beschriebenen Pflanzen eingeführt sind, werden durch geschlechtliche Fortpflanzung oder vegetatives Wachstum weitergegeben und können somit in Abkömmlingen aufrechterhalten und verbreitet werden. Allgemein macht die Aufrechterhaltung und Verbreitung Gebrauch von bekannten landwirtschaftlichen Verfahren, die zur Anpassung an die spezifischen Zwecke entwickelt wurden, wie Bodenbearbeitung, Sähen oder Ernten. Spezialisierte Prozesse, wie Hydrokultur oder Gewächshaustechik, können ebenfalls eingesetzt werden. Da die wachsende Nutzpflanze gefährdet für Angriff und Beschädigungen ist, die durch Insekten oder Infektionen verursacht werden, sowie für Konkurrenz durch Unkrautpflanzen, werden Maßnahmen ergriffen, um Unkräuter, Pflanzenkrankheiten, Insekten, Nematoden und andere nachteilige Bedingungen zur Verbesserung der Ernte zu kontrollieren. Diese schließen mechanische Maßnahmen, wie die Bodenbearbeitung oder Entfernung von Unkräutern und infizierten Pflanzen, sowie die Ausbringung von Agrochemikalien ein, wie von Herbiziden, Fungiziden, Gametoziden, Nematiziden, Wachstumsregulatoren, Reifungsmitteln und Insektiziden.
Gebrauch von den vorteilhaften genetischen Eigenschaften der transgenen Pflanzen und Samen gemäß der Erfindung kann ferner in der Pflanzenzucht gemacht werden, die auf die Entwicklung von Pflanzen mit verbesserten Eigenschaften gerichtet ist, wie Verträglichkeit von Schädlingen, Herbiziden oder Streß, ein verbesserter Nährwert, eine erhöhte Ausbeute oder eine verbesserte Struktur, die weniger Verlust durch Umlegen oder Zerschlagung verursacht. Die verschiedenen Züchtungsschritte sind durch einen wohl definierten menschlichen Eingriff gekennzeichnet, wie Auswahl der zu kreuzenden Linien, Ausrichten der Bestäubung der Elternlinien oder Auswahl geeigneter Abkömmlinge. Abhängig von den gewünschten Eigenschaften werden unterschiedliche Zuchtmaßnahmen ergriffen. Die relevanten Techniken sind allgemein fachbekannt und schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf Hybridisierung, Inzucht, Rückkreuzung, Viellinienzüchtung, Sortenmischung, interspezifische Hybridisierung, Aneuploid-Techniken etc.. Hybridisierungstechniken schließen ebenfalls die Sterilisation von Pflanzen ein, um männliche oder weibliche sterile Pflanzen zu liefern, durch mechanische, chemische oder biochemische Mittel. Die Fremdbestäubung einer männlichen steri len Pflanze mit Pollen einer unterschiedlichen Linie stellt sicher, daß das Genom der männlich sterilen, aber weiblich fruchtbaren Pflanze gleichförmig Eigenschaften beider Elternlinien erhalten wird. So können die transgenen Samen und Pflanzen gemäß der Erfindung verwendet werden, um verbesserte Pflanzenlinien zu züchten, die zum Beispiel die Wirksamkeit herkömmlicher Verfahren, wie die Herbizid- oder Pestizidbehandlung, erhöhen oder das Abgehen von solchen Verfahren aufgrund ihrer modifizierten genetischen Eigenschaften erlauben. Alternativ können neue Nutzpflanzen mit verbesserter Streßtoleranz erhalten werden, die aufgrund ihrer optimierten genetischen "Ausrüstung" Ernteprodukt mit besserer Qualität als solche Produkte liefern, die nicht vergleichbare nachteilige Entwicklungsbedingungen ertragen konnten.
In der Saatgutproduktion sind die Keimungsqualität und Gleichförmigkeit des Saatguts wesentliche Produkteigenschaften, wohingegen die Keimungsqualität und Gleichförmigkeit von Saatgut, das durch den Landwirt geerntet und verkauft wird, nicht wichtig sind. Da es schwierig ist, eine Nutzpflanze frei von anderen Nutzpflanzen- und Unkrautsamen zu halten, saatgutbürtige Krankheiten zu kontrollieren und Saatgut mit guter Keimung zu erzeugen, wurden relativ kostspielige und wohldefinierte Saatgutproduktionspraktiken durch die Saatguthersteller entwickelt, die Erfahrung auf dem Gebiet der Züchtung, Konditionierung und Vermarktung von reinen Samen besitzen. So ist es übliche Praxis für den Landwirt, zertifiziertes Saatgut zu kaufen, das spezifische Qualitätsstandards erfüllt, anstelle Saatgut zu verwenden, das von seinen eigenen Nutzpflanzen geerntet wurde. Das als Saatgut zu verwendende Fortpflanzungsmaterial wird herkömmlich mit einem Schutzüberzug behandelt, der Herbizide, Insektizide, Fungizide, Bakterizide, Nematizide, Molluskizide oder Mischungen daraus umfaßt. Herkömmlich verwendete Schutzüberzüge umfassen Verbindungen wie Captan, Carboxin, Thiram (TMTD), Methalaxyl (Apron) und Pirimiphos-methyl (Actellic). Falls gewünscht, werden diese Verbindungen zusammen mit weiteren Trägern, Tensiden oder ausbringungsfördernden Hilfsstoffen formuliert, die herkömmlich auf dem Gebiet der Formulierung eingesetzt werden, um Schutz gegen Beschädigung bereitzustellen, die durch bakterielle, pilzliche oder tierische Schädlinge verursacht wird. Die Schutzüberzüge können durch Tränken des Fortpflanzungsmaterials mit einer flüssigen Formulierung oder durch Beschichten mit einer kombinierten nassen oder trockenen Formulierung aufgebracht werden. Andere Methoden der Aufbringung sind ebenfalls möglich, wie die auf die Knospen oder die Frucht gerichtete Behandlung.
Es ist ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung, neue landwirtschaftliche Verfahren bereitzustellen, wie die oben exemplarisch aufgeführten, die durch die Verwendung von transgenen Pflanzen, transgenem Pflanzenmaterial oder transgenem Saatgut gemäß der vorliegenden Erfindung gekennzeichnet sind, was in größerem Detail in den folgenden, nicht-beschränkenden Beispielen beschrieben wird. In diesen Beispielen werden Verfahren zur Herstellung, Manipulation und Analyse von Nukleinsäuren durch Standardverfahren durchgeführt, wie beschrieben von Sambrook et al. in "Molecular Cloning – A Laboratory Manual", 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1989).
Beispiele
Beispiel 1: Erzeugung dualer Inhibitor-Expressionskassetten
Fusionsproteine, die sowohl die Oc-IΔD86- als auch CpTI-codierenden Regionen enthalten, getrennt durch eine Linkersequenz, werden durch ein zweistufiges PCR-Verfahren erzeugt. Die Oc-IΔD86-codierende Region wird aus einem bereits bestehenden Konstrukt (Urwin et al., Plant J. 8: 121–131, 1995) unter Verwendung des Oligonukleotid-Primers P1 (5'-ATGTCGAGCGACGGACGGCCGGTGCTTGGC-3'; SEQ ID NO: 3), entsprechend dem 5'-Ende der codierenden Region, und eines zweiten Primers P2 (5'-GATCTTCGCCGGACCGACGCCAAGAATCACGGCATTTGCACTGGCATC-3'; SEQ ID NO: 4) PCR-amplifiziert, komplementär zum 3'-Ende der Oc-IΔD86-codierenden Region und zum 5'-Teil der unterstrichenen Protease-spaltbaren Linkersequenz, die aus der pflanzlichen Metallothionein-artigen PsMTa-Gensequenz erhältlich ist (Evans et al., FEBS 262: 29–32, 1990). In ähnlicher Weise wird das CpTI-Gen des binären Vektors pROK/CpTI+5, der die CpTI-cDNA enthält, unter der Kontrolle des CaMV 35S-Promotors (Hilder at al., Nature 330: 160–163, 1987), mit dem Primer P3 amplifiziert (5'-GTCGGTCCGGCGAAGATCCAGTTTGAAGGTAGTARTCATCATGATGAC-3'; SEQ ID NO: 5), der konstruiert ist, um den 3'-Teil der unterstrichenen Protease-spaltbaren PsMTa-Linkersequenz und das 5'-Ende der CpTI-codierenden Region zu codieren, zusammen mit P4 (5'-TTCTTACTCATCATCTTCATCCCTGGACTTGC-3'; SEQ ID NO: 6), komplementär zum 3'-Ende der CpTI-codierenden Region. Die amplifizierten Oc-IΔD86- und CpTI-Sequenzen enthalten eine 18 by komplementäre Region an ihren 3'- bzw. 5'-Enden und werden durch die PCR-Technik des "SOEing" (Ho et al., Gene 77: 51–59, 1989 und Horton et al., Gene 77: 61–68, 1989) unter Verwendung der Primer P1 und P4 verbunden. Dies führt dazu, daß Oc-IΔD86 und CpTI durch den spaltbaren Linker mit der Aminosäuresequenz
getrennt sind, wobei die Pfeile mutmaßliche Spaltstellen anzeigen (Oc-IΔD86/PsMTa/CpTI-Fusionsprotein).
Ein ähnliches Verfahren wird verwendet, um ein DNA-Fragment zu erzeugen, das Oc-IΔD86 und CpTI mit einem dazwischenliegenden nicht-spaltbaren Linker codiert (Oc-IΔD86/go/CpTI-Fusionsprotein), erhalten aus der Galactoseoxidase-Gensequenz (McPherson et al., 1992), unter Verwendung einerseits eines Primer-Paares, das aus dem obigen P1 und P5 (5'-CTGGGGGGCTGTGTAAGAACTAGCTTGGGCATTTGCACTGGCATC-3'; SEQ ID NO: 7) besteht, und andererseits eines Primer-Paares, das aus P6 (5'-AGTTCTTACACAGCCCCCCAGCCTGGTAGTAATCATCATGATGAC-3'; SEQ ID NO: 8) und dem obigen P4 besteht (die den Linker codierende Sequenz ist unterstrichen). Diese nicht-spaltbare Linkersequenz codiert ein Peptid mit der Sequenz QASSYTAPQPQ.
Die amplifizierten Fusionskonstrukte werden zunächst in den Vektor PCRII kloniert (Invitrogen, Leek, Niederlande) und daraus in die SmaI-Stelle des pQE32-Expressionsvektors (Qiagen) für Sequenzierungs- und Expressionsuntersuchungen kloniert. Anschließend werden sie aus pQE32 als PstI (T4-Polymase-abgestumpft)/BamH2-Fragmente übertragen, um das GUS-Gen von pBI121 (Clonetech Laboratories Inc.) nach Verdauung mit SstI (T4-Polymerase-abgestumpft)/BamHI zu ersetzen. Die Fusionssequenzen stehen unter der Kontrolle des CaMV35S-Promotors von pBI121.
Beispiel 2: Erzeugung einzelner Inhibitor-Expressionskassetten
Die Sequenz, die den reifen Augenbohnen-Trypsininhibitor (CpTI) codiert, wird aus dem Plasmid pUSSR (Hilder et al., Nature 220: 160–163, 1987) durch die Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von Oligonukleotidprimern amplifiziert, die aus der veröffentlichten Sequenz, aber mit addierten Restriktionsenzymstellen (unterstrichen) zur Unterstützung der Klonierung in den Expressionsvektor konstruiert werden. Die zwei Primer sind 5'-ACTATGGATCCAGTAATCATCATGATGACTC-3' (SEQ ID NO: 9) und 5'-ATATTAAGCTTTTCTTACTCATCATCTTC-3' (SEQ ID NO: 10). Das 246 bp-Produkt wird direkt in den Expressionsvektor pQ30 ("QIAexpression"-System, Qiagen) unter Verwendung der in die Primer eingeführten BamHI- und HindIII-Stellen kloniert.
Die Sequenz, die Oc-I codiert, wird aus genomischer DNA von Oryza sativa L. japonica durch die Polymerasekettenreaktion unter Verwendung der Primer P7 (5'-ACATGTCGAATTCTTAGGCATTTGCACTGGC-3'; SEQ ID NO: 15) und P8 (5'-GAGGAGCCCGGGTCGAGCGACGGA-3'; SEQ ID NO: 16) amplifiziert. Das Intron wird durch die PCT-Technik des Gen-SOEing (Ho et al., supra) entfernt, worin die Primer-Paare P7/P9 (5'-CTCGAACTCTAGAAGAGAATTGGCCTTGTTGTG-3'; SEQ ID NO: 17) und P8/P10 (5'-AATTCTCTTCTAGAGTTC-3', SEQ ID NO: 18) zur Amplifizierung der zwei Exons verwendet werden. Diese Produkte werden dann durch SOE zusammengeführt, indem mit den Primern P7 und P8 amplifiziert wird, und das Produkt wird in Smal/EcoRI-verdautes Bluecript kloniert. Anschließend wird das konstruierte Oc-I-Gen in den Typ IV pQE-Expressionsvektor (Qiagen) unter Verwendung der BamHI/HindIII-Stellen kloniert.
Die "Unique Site Elimination"-Strategie (Pharmacia) wird verwendet, um eine einzelne Kodonenveränderung innerhalb des OC-I-Gens unter Verwendung des Primers P11 (5'-AAACCATGGATGTTCAAGGAGCTC-3'; SEQ ID NO: 19) zu erzeugen.
Beispiel 3: Pflanzentransformation
Die pBI-abgeleiteten Plasmide werden in kompetentes Agrobacterium tumefaciens LBA4404 durch Elektroporation eingeführt, wie beschrieben von Shen und Forde, Nucleic Acids Res. 17: 83–85, 1989. Anschließend werden sie in Arabidopsis thaliana Ökotypus C24 durch A. tumefaciens-vermittelte Transformation von Wurzeln eingeführt, wie beschrieben von Clarke et al., Plant Mol. Biol. Rep. 10: 178–189, 1992. T1-Saatgut wird aus individuellen Pflanzen unter Verwendung von Aracons von Beta-Tech, Gent, Belgien, gesammelt, um Selbstbefruchtung sicherzustellen. Arabidopsis, das 35S/Oc-IΔD86 beinhaltet (Urwin et al., The Plant Journal 12, 455–461, 1997), wurde ebenfalls in dieser Untersuchung verwendet.
Beispiel 4: E. coli-Expression
Die Expression aus sowohl dem einzelnen als auch dem dualen Effektorkonstrukt wird wie von Urwin et al. beschrieben durchgeführt, Plant J. 8: 121-131, 1995. Die Proteine werden als Fusionsproteine exprimiert, die einen 6 × His-N-Terminus enthalten, wie durch den pQ30- bzw. pQE32-Vektor codiert, und unter Verwendung von Nickelharz gereinigt, mit der Ausnahme von CpTI, das aus dem Oc-IΔD86/PsMTa/CpTI-Fusionsprotein freigesetzt wird. Im letzteren Fall wird ein rohes Homogenat nach der Entfernung von Oc-IΔD86 unter Verwendung des 6-His-Tag getestet. Inhibierungswerte des rohen Homogenats aus untransformiertem E. coli werden von diesen CpTI-Proben abgezogen. Oc-IΔD86 wird mit dem von Urwin et al. beschriebenen polyklonalen Antikörper nachgewiesen (Urwin et al., 1995, supra) und CpTI mit einem monoklonalen Antikörper, der gemäß Liddell und Cryer erzeugt wird, "A practial guide to monoclonal antibodies", John Wiley and Sons, New York, USA, S. 188, 1991.
Papain und Trypsin werden in den Cystein- bzw. Serinproteinase-Inhibierungstests verwendet, im wesentlichen wie beschrieben von Abrahamson et al., J. Biol. Chem. 262: 9688–9694, 1987, unter Verwendung des Substrats N-Cbz-Phe-Arg-7-Amido-4-methylcumarin. Fluoreszenz wird mit einem Perkin Elmer SL50B Spektrofluorimeter mit einer Plattenleseergänzung gemessen.
Beispiel 5: Detektion der Expression und Aufnahme durch Nematoden
In E. coli exprimierte Proteine werden unter Verwendung des QIAexpress-Systems (Qiagen, Hilden, Deutschland) wie von Urwin et al. beschrieben gereinigt, Urwin et al., Plant J. 8: 121–131, 1995.
Gesammelte Proteinfraktionen aus Arabidopsis, die zur SDS-PAGE-Analyse geeignet sind, werden durch Homogenisieren von Wurzelmaterial mit einem Mörser und Pistill vor dem Aufnehmen in 0,15 M NaCl, 10 mM HEPES und 10 mM EDTA pH 7,4 erhalten. Proteinproben werden durch Kochen in SDS PAGE-Beladungspuffer (15% β-Mercaptoethanol, 15% SDS, 1,5% Bromphenolblau, 50% Glycerin) vor der Elektrophorese solubilisiert. Die PI-Expression wird durch Western-Blot-Analyse wie von Urwin et al. beschrieben (The Plant Journal 12: 455–61, 1997) unter Verwendung eines Meerrettichperoxidasekonjugierten Antikörpers analysiert, um die Verwendung des Meerettichperoxidase-Chemolumineszenz-(HRPL)-Systems zu erleichtern, das gemäß den Herstelleranweisungen verwendet wird (National Diagnostics, Atlanta, Georgia). Die lösliche Proteinfraktion wird durch Extrahieren von gemahlenem Pflanzenmaterial in Puffer (0,15 M NaCl, 10 mM HEPES, 10 mM EDTA pH 7,4) gesammelt. Unlösliches Material wird mit 75.000 U/min für 15 min pelletisiert (Beckman Optima-Zentrifuge unter Verwendung eines TLA100.2-Rotors), um lösliches (Cytosol) und unlösliches Material zu trennen. Das Pellet wird kräftig in 100 mM Natriumcarbonat pH 11 resuspendiert, wie oben zentrifugiert und der Überstand, der die membrangebundenen Proteine enthält, gesammelt. Das Pellet wird in dem Carbonatpuffer gewaschen und in SDS-PAGE-Beladungspuffer resuspendiert. Alle Proben wurden in SDS-PAGE-Beladungspuffer vor der Elektrophorese gekocht.
Western-Blot-Analyse wird ebenfalls verwendet, um die Aufnahme von Inhibitoren durch Nematoden aus transgenen Pflanzen zu zeigen. Fressende weibliche Tiere werden durch manuelles Ablesen von Arabidopsis-Wurzeln gesammelt, wodurch die Abwesenheit von kontaminierendem Pflanzenmaterial sichergestellt wird. Ca. 70 Nematoden werden von Pflanzen gesammelt, die einzelne oder duale PIs exprimieren. Nematoden werden in einem Microfuge-Röhrchen gemahlen und in 0,15 M NaCl, 10 mM HEPES, 10 mM EDTA pH 7,4, das eine Mischung handelsüblicher Proteaseinhibitoren enthält (Boehringer Mannheim, Lewes, UK), resuspendiert. Die Proben werden mit SDS-PAGE-Beladungspuffer gekocht, und die Western-Blot-Analyse wird wie oben beschrieben durchgeführt.
Gegen CpTI und Oc-IΔD86 gerichtete Antikörper reagieren mit Proteinbanden des korrekten M_r in den Homogenaten von Arabidopsis, das einzelne PI-Konstrukte exprimiert. Kein Antikörper kreuzreagiert in einem nachweisbaren Ausmaß mit entweder dem nicht-erkennenden PI in Pflanzenhomogenaten oder mit anderen, in der Probe vorhandenen Proteinen. Sowohl in den E. coli- als auch in den Arabidopsis-Wurzelhomogenaten liefert das Oc-IΔD86/go/CpTI-Konstrukt ein Hauptprodukt mit c23 kDa, das durch beide Antikörper erkannt wird und somit beide PIs enthält. Ein schwächeres Signal, das dem individuellen PI mit niedrigerem Molekulargewicht entspricht, wurde mit jedem Antikörper nachgewiesen, was ein geringes Maß an Dissoziation des Fusionsproteins anzeigt. Das Oc-IΔD86/PsMTa/CpTI-Konstrukt liefert ein umgekehrtes Western-Blot-Muster, das eine höhere Reaktivität mit den Produkten mit niedrigerem M_r als mit höherem M_r zeigt. Dies legt nahe, daß in diesem Fall gespaltete PIs vorherrschen. Relative Inhibierungstests werden an den Produkten von Oc-IΔD86/PsMTa/CpTI und Oc-IΔD86/go/CpTI durchgeführt, die in E. coli erzeugt wurden. Beide liefern eine 95%ige Inhibierung der Papain- und Trypsinaktivität, was nahelegt, daß das Tandem-PI-Molekül beide Proteinasen inhibiert, und daß die zwei PIs noch wirksam nach Spaltung des PsMTa-abgeleiteten Linkers sind.
Eine Western-Blot-Analyse wird an Wurzelhomogenaten einer Reihe von transformierten Linien durchgeführt. Für jedes der vier Konstrukte wird eine Linie zur weiteren Untersuchung ausgewählt. Jede ausgewählte Linie exprimiert das (die) Ziel-PI(s) mit 0,4% Gesamtprotein. Die Analyse der Inhibitoraufnahme durch Nematoden mit beiden Antikörpers zeigt, daß weibliche Tiere von M. incognita Oc-IΔD86 oder CpTI aufnehmen, wenn sie an Pflanzen parasitieren, die einzelne PI-Konstrukte exprimieren. Ebenfalls wird intaktes Fusionsprotein Oc-IΔD86/go/CpTI durch beide Antikörper nachgewiesen. Gleichzeitig weist jeder Antikörper ein kleineres Produkt nach, daß einzelnen PIs entspricht. Überraschend werden keine Produkte der erwarteten Größe in Nematoden nachgewiesen, die Oc-IΔD86/PsMTa/CpTI-Konstrukt exprimieren. Die Ergebnisse für H. schachtii sind ähnlich denjenigen für M. incognita mit der Ausnahme, daß das nicht-gespaltene Produkt von Oc-IΔD86/go/CpTI nicht innerhalb der Nematoden nachgewiesen werden kann. Das Versagen des Nachweises von Produkten aus Oc-IΔD86/PsMTa/CpTI in Nematoden ist unerwartet vor dem Hintergrund, daß beide Inhibitoren in der Wirtspflanze vorhanden sind. Die Western-Blot-Analyse differentiell fraktionierten Pflanzenmaterials zeigt, daß beide Produkte von Oc-IΔD86/PsMTa/CpTI membrangebunden sind, aber keine integralen Membranproteine sind.
Beispiel 6: Nematodeninfektion, -gewinnung und -messung
Populationen von H. schachtii werden auf Kohlpflanzen gehalten. Vier Wochen alte Kohlpflanzen werden durch Umpflanzen der Pflanzen in eine Sand/Lehm-Mischung infiziert, die H. schachtii-Eier mit einer Dichte von 30 Eiern/g enthält. Die Kohlpflanzen werden bei 22°C bei normaler Tageslänge gezüchtet. Der infizierte Boden, der zur Züchtung dieser Pflanzen verwendet wird, wird gewonnen, und die Anzahl von Eiern/g wird gezählt. Eine dreifache Reihenverdünnung mit 50% Lehm/Sand-Mischung wird unter Verwendung eines Bodenteilers durchgeführt, und dies wird dann verwendet, um Arabidopsis vom Wildtyp C24 zu züchten. In vorläufigen Experimenten wurde festgestellt, daß eine Eizahl von 9 Eiern/g die höchste, fünffache Zunahme ergibt. Jedoch wurden in anschließenden Infektionen nur 5 Eier/g verwendet, um eine gute Infektion ohne Überbeanspruchung der Pflanzen sicherzustellen.
Populationen von M. incognita werden auf Tomatenpflanzen gehalten, die mit einem 16-stündigen Tag bei 24°C gezüchtet werden. Ganze Wurzelballen infizierter Pflanzen werden in kleine Stücke gehackt und verwendet, um eine Reihenverdünnung in 50% Lehm/Sand-Mischung herzustellen. Teilmengen der Reihenverdünnungen werden verwendet, um eine optimale Infektionsrate einzurichten, wobei die Masse der "Erde" auf 10°C gehalten wird.
Reines infiziertes Wurzelmaterial und Cysten werden gesammelt, indem die Pflanzen in einer 50% Sand/Lehm-Mischung gezüchtet werden. Manuelles Sammeln der Nematoden zu frühen Zeitpunkten wird erleichtert, indem die Wurzeln mit saurem Fuchsin angefärbt werden, wie beschrieben von Urwin et al. (Urwin et al., The Plant Journal 12: 455–461, 1997), mit der Ausnahme, daß die dünnen Arabidopsis-Wurzeln keinen Säuberungsschritt erfordern. Das Sammeln der Cysten wird unter Verwendung eines Seinhorst-Elutriators (Seinhorst 1964) durchgeführt. Weibliche Fruchtbarkeit wird durch manuelles Zählen der Anzahl von Eiern aller Individuen bestimmt, die von einer Gruppe von Pflanzen gesammelt werden.
Infizierte Arabidopsis-Pflanzen werden mit einer 16-stündigen Tageslänge bei einer Bestrahlung von 6 mmol Photonen m^–2s^–1 bei 22°C in Sanyo MLR3500 Wachstumskammern gezogen. Pflanzentöpfe, die Arabidopsis vom Wildtyp C24 enthalten, und diejenigen, die Pflanzen enthalten, die Inhibitoren exprimieren, werden in zufällige Gitter gestellt.
Beispiel 7: Modifikation des Galactoseoxidase-Linkers
Die Aminosäuresequenz der Linkerregion zwischen Domäne 1 und Domäne 2 von Galactoseoxidase wird durch Austausch der drei Aminosäurekodonen AGT TCT TAC, die die Aminosäuresquenz SSY codieren, gegen die Sequenz TCT ATC GAA GGT CGC (SEQ ID NO: 20), die die Aminosäuresequenz SIEGR (SEQ ID NO: 21) codiert, modifiziert. Das erste Kodon ersetzt einfach das bestehende Ser-Kodon, während die verbleibenden vier Kodonen eine proteolytische Faktor Xa-Spaltstelle codieren. Das verwendete Mutageneseverfahren auf PCR-Basis wird in Baron et al. beschrieben, J. Biol. Chem. 269: 25095–25105, 1994. Das modifizierte Galactoseoxidase-Gen wird in Aspergillus nidulans exprimiert. Überraschend werden zwei Proteinbanden auf einem SDS-PAGE-Gel gefunden, die den Größen von Domäne 1 (ca. 16 kDa) und Domänen 2 + 3 (ca. 52 kDa) entsprechen. Kein Protein wird in einer Position nachgewiesen, die der Galactoseoxidase voller Länge entspricht. Die Ergebnisse zeigen, daß der modifizierte Galactoseoxidase-Linker empfänglich für Spaltung durch pilzliche Proteinase ist. Die Verwendung dieses Linkers oder weitere Modifikationen davon sollten es Pflanzenproteinasen erlauben, multimere Moleküle in der Pflanze zu verarbeiten.
Während die vorhergehende Erfindung in einem gewissen Detail für die Zwecke der Klarheit und des Verständnisses beschrieben wurde, wird ein Fachmann aus dem Lesen dieser Offenbarung einsehen, daß verschiedene Veränderungen in Form und Detail vorgenommen werden können, ohne vom wahren Umfang der Erfindung und den folgenden Ansprüchen abzuweichen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Verbesserung der Nematodenresistenz oder -verträglichkeit in einer Pflanze und ihren Nachkommen, umfassend das Integrieren, in das Genom der Pflanze, eines Gens, das ein Fusionsprotein codiert, das folgendes umfaßt: (a) ein erstes Protein oder eine erste Proteindomäne mit antipathogener Aktivität; (b) ein Linker-Peptid; und (c) ein zweites Protein oder eine zweite Proteindomäne mit antipathogener Aktivität, worin wenigstens eine (s) der Proteine oder Proteindomänen mit antipathogener Aktivität Proteinase-Inhibitoraktivität besitzt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin weitere Proteine oder Proteindomänen mit antipathogener Aktivität an das Fusionsprotein durch Linker-Peptide fusioniert sind.
Verfahren gemäß Anspruch 2, worin wenigstens eine (s) der Proteine oder Proteindomänen mit antipathogener Aktivität der Proteinaseinhibitor Oc-IΔD86 ist.
Verfahren gemäß Anspruch 3, worin wenigstens eine (s) der Proteine oder Proteindomänen mit antipathogener Aktivität der Proteinaseinhibitor CpTI ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Gen funktionell an eine Promotorsequenz gebunden ist, die die Expression vorzugsweise in Pflanzenwurzeln antreibt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Linker-Peptid eine Aminosäuresequenz umfaßt, die proteolytisch durch die Pflanze gespalten wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Linker-Peptid eine Aminosäuresequenz umfaßt, die in der Pflanze proteolytisch stabil ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Linker-Peptid dadurch gekennzeichnet ist, daß es die Aminosäuresequenz QASSYTAPQPQ umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 6, worin das Linker-Peptid dadurch gekennzeichnet ist, daß es die Aminosäuresequenz VILGVGPAKIQFEG umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 6, worin das Linker-Peptid dadurch gekennzeichnet ist, daß es die Aminosäuresequenz QASIEGRYTAPQPQ umfaßt.
DNA-Molekül, das ein Fusionsprotein codieren kann, das folgendes umfaßt: (a) ein erstes Protein oder eine erste Proteindomäne mit antipathogener Aktivität; (b) ein Linker-Peptid; und (c) ein zweites Protein oder eine zweite Proteindomäne mit antipathogener Aktivität, worin wenigstens eine s) der Proteine oder Proteindomänen mit antipathogener Aktivität Proteinase-Inhibitoraktivität besitzt, und worin das Linker-Peptid eine Aminosäuresequenz umfaßt, die in der Pflanze proteolytisch stabil ist.
DNA-Molekül gemäß Anspruch 11, worin das codierte Fusionsprotein weitere Proteine oder Proteindomänen mit antipathogener Aktivität umfaßt, die daran durch Linker-Peptide fusioniert sind.
Fusionsprotein, das durch das DNA-Molekül gemäß Anspruch 11 codiert wird.
Pflanze, die das durch das DNA-Molekül gemäß Anspruch 11 codierte Fusionsprotein exprimiert.
Verwendung des DNA-Moleküls gemäß Anspruch 11 zur Verbesserung der Nematodenresistenz oder -verträglichkeit einer Pflanze und ihrer Nachkommen.