UA71901C2 - Compact proteins as proteinase inhibitors - Google Patents

Description

Опис винаходу

У даному винаході описано спосіб поліпшення резистентності або толерантності рослин до патогенів, згідно 2 з'яким рослину перетворюють трансгеном, що кодує злитий протеїн з двох або. кількох протеїнів або доменів протеїнів, здатних поліпшувати резистентність або толерантність до патогенів при самостійній експресії.

Винахід підкріплюється прикладами спільного введення двох окремих інгібіторів протеїнази як злитого протеїну в Агарідорзіз (пайапа, що веде до поліпшення резистентності або толерантності рослин до паразитичних нематод. З точки зору даного винаходу визнано, що трансгенні рослини, отримані згідно з даним винаходом, 710 можуть бути толерантними або резистентними не тільки до нематод, але й до вірусів, грибків, бактерій, комах, кліщів тощо.

Нематоди є основними тваринними паразитами рослин, що спричинюють великомасштабні втрати для сільського господарства, які оцінюються у 5100 млрд. щороку. Поліпшена резистентність рослин до паразитичних нематод є дуже потрібною для зменшення потреби у нематицидах, деякі з яких належать до 12 найбільш неприйнятних пестицидів, які застосовують у сільському господарстві. Існує кілька можливих підходів до удосконалення трансгенних рослин з поліпшеною резистентністю до нематод, які включають антиінвазійні та міграційні стратегії, стратегії виснаження живильних клітин та антинематодного живлення (АгкКіпзоп еї аї,

Тіббесп 13:369-374, 1995). Останній підхід пов'язаний з використанням інгібіторів протеїнази (РІ), які є важливим елементом стратегії природного захисту рослин (Куап, Аппи Кем Рпуораїйо! 28:425-49, 1990). Існує 20 десять РІ груп, які відрізняються від рослин, що охоплюють усі чотири класи протеїназ, а саме: цистеїн-, серин-, метало- та аспартилпротеїназ (Кіспагазоп, Меїпоаз іп Ріапі Віоспетівігу 5:259-305, 1991). В ЕР-А-502 730 описано, що може бути досягнутий ефективний трансгенний захист від нематод на основі РІ. Однією з переваг РІ у боротьбі з нематодами є їхній малий розмір. Потенціал РІ для захисту трансгенних культур збільшується відсутністю шкідливого впливу багатьох РІ при споживанні людьми. с 25 Клонували кДНК, що кодують цистеїн та серинову травну протеїназу цистної нематоди, їхню основну (3 протеолітичну активність локалізували на кишечник, і РІ СртіІ та оризацистатин (Ос-І) виявляли ефективність проти цих протеїназ. Спрямований на сайт мутагенез давав поліпшений К; Ос-І після видалення однієї амінокислоти. Цей змінений цистатин (Ос-ІДО8б) збільшував свою ефективність як трансген проти цистної нематоди картоплі (Огпміп еї аї, Ріапі 9 8:121-131,1995). При експресії в Агарідорзіз він обмежує розвиток як - 30 цистної нематоди Неїйегодега зспасніїй, так і нематоди кореневих наростів Меїіоідодупе іпсодпіга. ав!

Потомство гібридів трансгенного тютюну, що експресує СртТІ та лектин гороху, відповідно, демонструє додаткову ефективність проти совки (ВоцМег ей ам. Стор Ргоїесіп, 9:351-354, 1990). Серійні послідовності б промотор/ген можуть досягати подібного результату без необхідності гібридизації рослин. У природі існують «- принаймні два інші альтернативні способи досягнення експресії більш ніж одного інгібітора, а саме --

Зо біфункціональні інгібітори (УУеп еї аї, Ріапі Мо! Віо!ї 18:813-814, 1992) та багатодоменні РІ (Умаїдгоп еї аї.. т

Ріапі Мо! Віої 23:801-812, 1993). Задача даного винаходу полягає у забезпеченні способів поліпшення резистентності або толерантності до патогенів шляхом введення більш ніж одного протеїну -- ефектора резистентності або толерантності. З точки зору даного винаходу як резистентність описано вплив введеного «б трансгена на обмеження або уникнення розмноження патогена у трансгенних рослинах або на них. З

Толерантність стосується здатності трансгенної рослини до витримування або відновлення після шкідливого с впливу нападів патогенів і давати добрий врожай. І резистентність, і толерантність до патогена дає зниження "з шкоди для культур, викликаних патогеном.

Таким чином, винахід пропонує: - Спосіб поліпшення резистентності або толерантності до патогенів у рослинах та їх потомства, включаючи 75 об'єднання з геномом вищезгаданої рослини гена, що кодує злитий протеїн, включаючи - (а) перший протеїн або домен протеїну з антипатогенною активністю; - (б) пептид-лінкер; і (в) другий протеїн або домен протеїну з антипатогенною активністю. Зокрема, винахід пропонує способи, ї-о гени та протеїни, згадані вище, де («в 50 - інші протеїни або домени протеїнів з антипатогенною активністю зливають у злитий протеїн за допомогою га пептидів-лінкерів - принаймні один з протеїнів або доменів протеїнів з антипатогенною активністю має активність інгібітора протеїнази - принаймні один з протеїнів або доменів протеїнів з антипатогенною активністю є інгібітором протеїнази 955 Ос-ІдОВО

ГФ) - принаймні один з протеїнів або доменів протеїнів з антипатогенною 7 активністю є інгібітором протеїнази СртТіІ - ген функціонально є з'єднаним з послідовністю промотора, що стимулює експресію, в оптимальному варіанті -- у корінні рослин бо - пептид-лінкер включає амінокислотну послідовність, яка протеолітично розщеплюється рослиною - пептид-лінкер включає амінокислотну послідовність, яка є протеолітично стабільною у рослині - пептид-лінкер характеризується включенням амінокислотної послідовності ОАЗЗУТАРОРО - пептид-лінкер характеризується включенням амінокислотної послідовності МІ ЄМОРАКІОРЕО - пептид-лінкер характеризується включенням амінокислотної послідовності ОАБІЕСКУТАРОРО 65 - резистентність або толерантність до нематоди є поліпшеною.

Винахід також пропонує трансгенні рослини, які одержують способом, описаним вище. Зокрема, винахід пропонує: - рослину, що експресує злитий протеїн, який кодується молекулою ДНК згідно з винаходом.

До того ж, винахід дозволяє застосовувати молекули ДНК, описані як такі, що поліпшують резистентність або толерантність до патогенів рослин та їх потомства. Для більшої зрозумілості даного винаходу нижче більш детально пояснюються часто вживані терміни:

Рослина стосується будь-якої рослини, зокрема, насінної рослини. Структурною й фізіологічною одиницею рослини є рослинні клітини, включаючи протопласт та стінки клітин. Термін "рослинна клітина" стосується 70 будь-якої клітини, яка або є частиною рослини, або походить від неї. Приклади клітин включають диференційовані клітини, які являють собою частину живої рослини; диференційовані клітини у культурі; недиференційовані клітини у культурі; клітини недиференційованих тканин, таких як калюс або пухлини; диференційовані клітини насіння, ембріонів, паростків або пилку. Зокрема, рослинна клітина може мати форму ізольованої окремої клітини чи культивованої клітини, або бути частиною більш організованої одиниці, /5 наприклад, рослинної тканини або органу рослини.

Група рослинних клітин може бути організована у структурну й функціональну одиницю, яку називають рослинною тканиною. Цей термін включає, крім іншого, органи рослин, насіння рослин, культури тканин і будь-які групи рослинних клітин, організовані у структурні та/або функціональні одиниці.

Рослинний матеріал стосується листя, стебла, коріння, квітки або частини квіток, плодів, пилку, пилкових труб, насінних зачатків, зародкових клітин, яйцеклітин, зигот, ембріонів, насіння, черешків, клітин чи культур тканин або будь-якої іншої частини чи продукту рослини.

Рослина або клітина, яка має стабільно включену в її геном рекомбінантну ДНК, має назву трансгенної рослини або клітини.

Трансформація стосується введення нуклеїнової кислоти у клітину, зокрема, стабільного об'єднання сч об Молекули ДНК з геномом даного організму. Вищезгадана рекомбінантна ДНК стосується однієї або кількох молекул ДНК, утворених шляхом приєднання сегментів ДНК з різних джерел і отриманих з застосуванням і) технології рекомбінантних ДНК як описано, наприклад, у роботі ЗатбргооК еї аї.,, "МоІесшаг Сіопіпд-А

І арогаюгу Мапиа!", 2па еайоп, Со бргіпд Нагрог іІарогайогу Ргез5, МУ, ИОБА (1989). Технології рекомбінантних ДНК дозволяють одержати рекомбінантну ДНК іп міо і переносити її у клітини, девона може - де зо бути експресована або розмножена (Див. Сопсізе Оісіопагу ої Віотедісіле та Моіесшіаг Віоіоду, Ед. дио, СКС

Ргезв, Воса Каїоп (1996)), наприклад, перенесення ДНК у протопласт(и) або клітину(и) у різних формах, о включаючи, наприклад, (1) депротеїнізованої ДНК у кільцевій, лінійній або надспіральній формах, (2) ДНК, що ду міститься у нуклеосомах або хромосомах чи ядрах або їх частинах, (3) ДНК, з'єднаної або асоційованої з іншими молекулами, (4) ДНК, що міститься у ліпосомах, сферопластах, клітинах чи протопластах або (5) ДНК, -- перенесеної з інших організмів, крім організму-хазяїна (наприклад, Адгорасіегішт (Штегасіепв). Ці та інші ї- різні способи введення рекомбінантних ДНК у клітини є відомими спеціалістам і можуть застосовуватися для одержання трансгенних клітин або трансгенних рослин згідно з даним винаходом. Початкова інсерція рекомбінантних ДНК у геном КО рослини супроводжується не традиційними способами розведення рослин, а « описаними авторами технічними способами. Після початкової інсерції трансгенне потомство може 70 розмножуватися з застосуванням традиційних способів розведення. - с Ген має описувати окрему хромосомну ділянку, включаючи регуляторну ДНК послідовність, що відповідає за й контроль над експресією кодуючої послідовності, яка транскрибується й транслюється для забезпечення "» окремого поліпептиду або протеїну. Зокрема, ген стосується кодуючої послідовності та асоційованих регуляторних послідовностей, у яких кодуюча послідовність транскрибується у РНК, таку як мРНК, рРНК, тРНК,

СНРНК, смислову РНК або антисмислову РНК. Прикладами регуляторних послідовностей є послідовності -І промотора, 5 та 3' нетрансльовані послідовності та термінальні послідовності. з Іншими елементами, які можуть бути присутні, є, наприклад, інтрони.

Кодуюча послідовність має описувати послідовність молекули ДНК, яка при транскрипції та трансляції веде (Се) до утворення поліпептиду або протеїну.

Експресія стосується транскрипції та/або трансляції ендогенного гена або трансгена у рослині. У разі о антисмислових послідовностей, наприклад, експресія може стосуватися лише транскрипції антисмислової ДНК. - Молекулу ДНК, що містить принаймні дві гетерологічні частини, наприклад, частини, що походять від попередньо існуючих ДНК послідовностей, які не є асоційованими у їхніх попередніх станах, часом називають химерним геном. Вищезгадані молекули в оптимальному варіанті одержують з застосуванням технології рекомбінантних ДНК.

Зокрема, застосований авторами термін "гетерологічний" означає "різного природного або синтетичного іФ) походження". Наприклад, якщо клітину-хазяїна перетворюють за допомогою послідовності нуклеїнової кислоти, ко яка не зустрічається у нетрансформованій клітині-хазяїні, то про цю послідовність нуклеїнової кислоти кажуть, що вона є гетерологічною по відношенню до клітини-хазяїна. Трансформація нуклеїнової кислоти може включати бо гетерологічний промотор, гетерологічну кодуючу послідовність або гетерологічну термінальну послідовність. В альтернативному варіанті трансформуюча нуклеїнова кислота може бути повністю гетерологічною або може включати будь-яку можливу комбінацію послідовностей гетерологічної та ендогенної нуклеїнової кислоти.

Спосіб згідно з даним винаходом базується на побудові генів, що кодують злиття протеїнів-ефекторів або доменів протеїнів, Її наводиться прикладом відносно боротьби з нематодами за допомогою послідовностей зі 65 злиттям РІ СртТІ та Ос-І лО86б. Вищезгадані РІ вибирають тому, що вони виявляють різні інгібіторні характеристики, що дає помітний ефект проти цистних нематод. Таким чином, СртТ! впливає на майбутню статеву активність, а Ос-ІДО86 пригнічує розвиток, особливо недозрілих жіночих нематод. Трансгенна експресія вищезгаданих злитих протеїнів веде до зниження популяції патогена за одне покоління, як було визначено для нематод через утворення нових яйцеклітин на принаймні 2595, в оптимальному варіанті --5095. За відсутності Вимірюваних втрат успіхи репродуктивності втрати врожайності, викликані патогеном, можуть бути знижені принаймні на 2595, краще -- на 50965.

Основа підходу зосереджується на застосуванні пептидних лінкерів, що дозволяють обом РІ транслюватися як злитий протеїн. Властивості лінкера визначають спосіб введення, тобто як злитий протеїн чи окремо, завдяки протеолітичному розщепленню. Такі лінкерні стратегії мають широкий потенціал, який виходить за межі боротьби 7/0 з нематодами. Вони пропонують нову основу для стекінгу захисних генів для підвищення ефективності та тривалості трансгенної резистентності або толерантності.

Для поліпшення резистентності або толерантності до патогенів спосіб згідно з даним винаходом включає включення у геном рослини гена, що кодує злитий протеїн, включаючи (а) перший протеїн або домен протеїну з антипатогенною активністю; (б) пептид-лінкер; (в) другий протеїн або домен протеїну з антипатогенною активністю; і (г) необов'язково один або кілька протеїнів чи доменів протеїнів з антипатогенною активністю, злиті за допомогою одного або кількох пептиднихлінкерів.

Оптимальними протеїнами або доменами протеїнів з антипатогенною активністю є РІ, токсини Васіїйи5 їВигіпдіепзіз, пов'язані з патогенезом протеїни, хітінази, глюканази, пептиди, включаючи літичні пептиди, тіоніни, колагенази, ліпази, лектини, рибосомальні інактивуючі протеїни, інгібітори пектинази, інгібітори ліпази, інгібітори А-амілази, протеїн (-- інгібітор полігалактуронідази, пататин, перматин, лізозим, холестеролоксидазу, протеїн оболонки вірусів, антитіла, одноланцюгові антитіла, продукти генів авірулентності та генів резистентності та інші протеїни, що знижують успіх репродуктивності або шкоду, якої завдають комахи, с нематоди, віруси, бактерії або грибки. Злиті протеїни або домени протеїнів у природі як злиті протеїни досі не траплялися, їхні відповідні генні послідовності в оптимальному варіанті походять від генома більш ніж і) одного організму і для з'єднання вимагають технології рекомбінантних ДНК. Порівняно з великою кількістю однакового домена-ефектора, завдяки якому досягають фактичного збільшення концентрації ефектора, окремі домени двох або кількох протеїнів-ефекторів допускають можливість синергетичного або додаткового ефекту. -"пе

Якщо один або кілька з протеїнів або доменів протеїнів відповідають доменові, що кодується конкретною геномною ділянкою рослини, яку піддають перетворенню, об'єднання злитої послідовності згідно з даним о винаходом неодмінно відбувається в іншій геномній ділянці. Зокрема, оптимальними є протеїни або домени Ф протеїнів з антипатогенною активністю проти більш ніж одного патогенна культури або антипатогенних протеїнів, які протистоять асоціаціям захворювань, як це трапляється між Гизайит та Меїісідодупе. -

Деякі нематоди викликають утворення живильних сайтів, беручи участь у модифікації рослинних клітин, і ї- живляться в одному сайті протягом кількох годин або значно довшого часу. Вони включають види таких родів, як

Меїсідодупе /СіІородега, Нейегодега, Коїїуіепспшив, Туїепспціи5, Массорив, Хірпіпета, Ї опдідогив,

Рагаіопдідогив, Стурподега, Тгорпоїуіепспціив5, Нептісусіюрпога, СтісопетейМйа, Мегшив та Неїосоїуіепспив.

Роди, які живляться протягом більш обмеженого періоду в одному сайті, включають Ргаїіепспив, Кадорпо|сшзв, « НігвсптаппієМа, Тісподогиз, Рагафсподогиз, Ойуепспиз, АрПеїІепспоїдез, ЗсціеПйопета, та Веїіопоїаітив. шщ с Відносно боротьби з видами вищезгаданих родів та родів інших фітофагів торилаіїмідних та тиленхоїдних й нематод РІ особливий інтерес являють колагенази, інгібітори пектинази, лектини, пататин та «» холестеролоксидаза. Багато РІ є протеїнами, що зберігаються у насінні, які накопичуються під час розвитку насіння і можуть траплятися як один з найбільш численних протеїнів у зрілому насінні. Інгібітори цистеїнової або серинової травних протеїназ, локалізовані у кишечнику нематод, можуть бути оптимальними для -і застосування у винаході. Цистеїнові протеїнази являють особливий інтерес, оскільки вони не є травними ферментами ссавців. Особливо ефективним є оризацистатин (Ос-І). Спрямований на сайт мутагенез Ос-! - забезпечував поліпшення К, після видалення однієї амінокислоти. Цей модифікований цистатин (Ос-ІДО86) має (Се) підвищену ефективність як трансген проти цистної нематоди картоплі (Огміп еї аї., Ріапі У 8:121-131,1995).

При експресії в Агарідорзіз він обмежує розвиток і Нейегодега зспаснійї, цистної нематоди, і Меїіоідодупе о іпсодпі(а, нематоди кореневих наростів. Вплив одного РІ на членів двох основних груп економічних нематод - дозволяє здійснювати широку стратегію резистентності для боротьби з дуже різними нематодами -- шкідниками культур. У цьому полягає відміна від обмеженого ряду видів, пов'язаних з багатьма генами природної резистентності. Наприклад, НІ резистентність, присутня у культиварах, таких як Магіз Рірег, забезпечує якісну резистентність проти однієї цистної нематоди картоплі (Сіородега говіоспіепзіз) але не захищає від інших близько споріднених видів (0. раїїаа). о Функція пептиду-лінкера полягає у приєднанні до антипатогенних протеїнів або доменів протеїнів, не ко завдаючи шкоди їхній функції. Природні лінкери, як правило, мають довжину приблизно від З до 15 амінокислот.

Пентапептиди лише з Су, Зег та Тиг трапляються найчастіше у природних лінкерах і складають найкращі бо загальні лінкери. Гліцин забезпечує гнучкість, а інші два є полярними для взаємодії з розчинником або воднем, що зв'язують з їхнім основним ланцюгом азот. Так досягають певної конформаційної й енергетичної стабільності.

Вони навряд чи можуть взаємодіяти з якоюсь іншою частиною з'єднаних протеїнів або доменів протеїнів і навряд чи є сприйнятливими до розщеплення протеазами хазяїна. Сприятливими також вважають Аа, Рго, Азр, І ув, біп та Азп. Уникають гідрофобних залишків, таких як Агд та сій, найбільших з основних та кислотних залишків 65 Відповідно. Лінкери, сприйнятливі до розщеплення широко поширеними протеазами, часто мають один або кілька з вищезгаданих несприятливих складових. Наприклад, с1іу-с1у-Х, де Х часто є амінокислотним залишком з гідрофобним боковим ланцюгом, може бути сайтом протеолітичної обробки. Ці речовини та перелік потенціально корисних лінкерів описані у роботі Агдо5, Р, 9. Мо! Віої. 211, 943-958,1990. Цінність наявності розщеплюваного лінкера не розглядається. Лінкери застосовували у широкому діапазоні галузей. Найбільш буттєвим для цього винаходу є застосування лінкерів для експресії молекул функціональних антитіл, таких як одноланцюгові антитіла у рослинах. У рослинах експресували і повні, і піддані інженерії антитіла.

Одноланцюгові Ем фрагменти (ЗсЕу) антитіл можуть бути піддані інженерії шляхом зв'язування доменів змінного важкого ланцюга (Ми) та змінного легкого ланцюга (Мі) гена антитіла (М). Один з підходів до досягнення цього полягає у застосуванні пептидного лінкера. Було сконструйовано певну кількість пептидів з застосуванням 7/0 Комп'ютерної програми та пошуку У бібліотеках тривимірних пептидних послідовностей. Успішним лінкером є природний імуноглобуліновий лінкер з сусідніми залишками, що має амінокислотну послідовність

КЕБЗБОБЗМУМЗ5ЕОЇ АОРКБІО (Віга еї аї, Зсіепсе 242423-427,1988; ЗЕО ІО МО: 12). В іншому пептиді, що має амінокислотну послідовність ЕОКЗЗОБОЗЕЗКР (Віга еї аї, Зсіепсе 242 423-427, 1988; 5ЕО ІЮО МО: 13), домінують

Су, Зег та Тиг. Його було успішно застосовано для експресії ЗсЕм у рослинах (Омеп еї аї, Віоїесппоіоду 10, 75 790-794; 1992). Лінкер з амінокислотною послідовністю СОС (ЗЕО ІЮ МО: 14) рекомендували для ЗсЕм антитіл на основі визначення евклідової кодової відстані між С-кінцем М н домена та М-кінцем М, домена (Низіоп еї аїЇ, Ргос. Май Асай Зсі 85, 5879-5883; 1988). Цей лінкер має гнучкість і водночас зберігає стабільність та конформацію у розчині (Агоов, Р, у. Мо). Віої. 211, 943-958,1990).

В одному варіанті втілення даного винаходу кодуючі ділянки РІ Ос-ІАЮО86 та СртіІ розташовані серійно й З'єднані у рамку послідовністю пептидного лінкера, який має бути сприйнятливим до протеолізу. Послідовність застосованого пептидного лінкера відповідає 14 амінокислотам (МІ СЗЄМОРАКІОРЕС; ЗЕО ІО МО: 1) центральної "спейсерної ділянки металотіонеїноподібного протеїну гороху РзаМтТа (Емапз еї аі., РЕВ5 262: 29-32,1990).

Відомо, що ця "спейсерна ділянка є чутливою до протеїнази (Кійе еї аІ., РЕВ5 295:171-175,1991 та Тоттеу еї аІ,, РЕВЗ 292: 48-52,1991). І СрТіІ, ії Ос-ІДО86 були присутні головним чином як окремі протеїни при експресії в сч

Трансгенній рослині Агабрідорзіз. Повідомлялося про багато інших протеїнів, які є протеолітично чутливими, й характеризувалися кілька послідовностей розпізнавання (Ойіеп еї а), Мей Еплуто! 185:129-143,1990 та о

Еогезбего еї аї, У Ргої Спет 11:201-211,1992).

Природним попередником для застосування протеолітично чутливого лінкера є мультицистатин картоплі,

РМІ, який включає вісім серійних цистатинових доменів, зв'язаних послідовностями, сприйнятливими до «-- протеолітичного розщеплення (УМаїдгоп еї аї, Ріапі Мої Віо! 23: 801-812,1993). Однак РМІ. ніколи не виявляв здатності до фрагментації іп ріапіа, але зберігається у вигляді неактивних кристалів у підфелогеновому шарі - бульб. Вважають, що він набуває активності активність після фрагментації у кишечнику певних видів комах. Він ду не є придатним для застосування проти нематоди, яка навряд чи може проковтнути цей протеїн у 86,8кДа.

Приймочки декоративного тютюну Місойапа аїайїа містять незвичний РІ (МА-РІ-ІЇ). Він експресується як -

Зз5 попередній протеїн з передбаченими 41,бкДа, який розщеплюється у шістьох сайтах для утворення сімох ї- пептидів. Усі, крім пептиду 1, мають однаковий розмір і спільну М-кінцеву послідовність, але пептид 7 може не мати функціонального інгібіторного сайта для інгібування хімотрипсину або трипсину. Сайти процесингу, що ведуть до вивільнення функціональних РІ, виявлені не були. Молекули, які зазнають подібного процесингу, існують також у тваринних системах, і одним з прикладів є профілагрин, який бере участь у термінальній « 20 диференціації епідермісу ссавців. шщ с В іншому варіанті втілення даного винаходу кодуючі ділянки РІ Ос-І лО86 та СртіІ розташовані серійно й ц з'єднані у рамку послідовністю пептидного лінкера, який має бути несприйнятливим до протеолізу. Застосований "» пептидний лінкер відповідає відрізкові з 11 амінокислот (ЗА55УТАРОРО; 5ЕО ІЮ МО: 2) грибкового ферменту галактозооксидази, зв'язаної з першими двома доменами ферменту. Відомо, що ця ділянка є структурно стійкою (По еї аї, Майшге 350:87-91, 1991), і не існує ознак протеолітичного розщеплення, що вказує на те, що лінкер -І є несприйнятливим до швидкого протеолізу. У рослині Агарідорзіз ця послідовність спрямовує експресію злитого -3з протеїну Ос-ІДОв86 та СртІ, який залишається попередньо інтактним як 23кДа протеїн. Про інші, напівстійкі лінкери відомо, що вони є лінкерами глюкоамілази 1 (Кгатег еї аї, У Спет бос Рагай Тгапз 89: 2595-2602,1993), (Се) які застосовують для виконання тієї самої функції. Послідовність лінкера галактозооксидази може бути о 50 Модифікована для сприйнятливості до протеолітичного розщеплення. Таким чином, модифікована лінкерна послідовність ОАБІЕСКУТАРОРО (5ЕБЕО ІЮО МО: 11) протеолітично розщеплюється у грибковій експресійній - системі.

Кодуюча послідовність злитого протеїну згідно з даним винаходом є функціонально з'єднаною з рослинним експресибельним промотором. Оптимальні промотори включають складені, індуковані, тимчасово регульовані, регульовані у процесі розвитку, хімічно регульовані, тканинно-оптимальні та/або тканинно-специфічні промотори. Оптимальні складені промотори включають Саму 358 та 198 промотори (Егаїеу еї а/., 0.8. Райепі Мо. і) 5,352,605). Ще більш оптимальний промотор походить від будь-якого одного з кількох актинних генів, про які іме) відомо, що вони експресуються у більшості типів клітин. Промоторні експресійні касети, описані у роботі

МесЕїгоу еї аЇ., МоЇ Сеп. Сепеї 231: 150-160 (1991), можуть бути легко модифіковані для експресії кодуючої бо послідовності і є особливо придатними для застосування в однодольних хазяях.

Ще один оптимальний складений промотор походить від убіквітину, який є іншим генним продуктом, про який відомо, що він накопичуються у багатьох типах клітин. Убіквітиновий промотор клонували з кількох видів для застосування у трансгенних рослинах (наприклад, соняшнику-Віпеї еї аі. Рослин 8сіепсе 79: 87-94 (1991), кукурудзі-Спгізіепзеп ей а. Ріапі Моїес. ВіоЇї. 12: 619-632 (1989)). Убіквітиновий промотор кукурудзи 65 розвивали у трансгенних однодольних системах, і його послідовність та вектори, побудовані для трансформації однодольних, описано у роботі СпНгізіапзеп еї аіІ., ЕР-А-342 926.

Тканинно-специфічними або тканинно-преференційними промоторами, корисними для експресії кодуючої послідовності у рослинах, зокрема, кукурудзі та цукровому буряку, є промотори, які спрямовують експресію у корінні, серцевині, листі або пилку. Прикладами є ТОВІ1 промотор з Б1-тубулінового гена Агабрідорвзіз (Паїїапа (Зпизіай еї а), Ріапі Сеї! 4: 549,1992), РзМТА промоторна ділянка з металотіонеїноподібного гена Різит забймит (Емапз еї а), РЕВЗ І еЦеге 262: 29,1990), КРІ 16А та АКЗК1 промотори з Агабрідорвзіз (Ппаїапа та інші промотори, описані у М/097/20057 та МУО93/07278. Іншим корисним промотором є фрагмент умшп1 промотора картоплі (Зіерегі еї аї, Ріапі СеїІ 1: 961-968,1989), який індукується у тканинах, що оточують місця поранень. Крім того, хімічно індуковані промотори є корисними для спрямування експресії і також є оптимальними (див. 7/0. УМО95/19443).

Крім промоторів, у химерних генах згідно з даним винаходом застосовують різні транскрипційні термінатори.

Транскрипційні термінатори відповідають за термінацію транскрипції за межами трансгена та її правильне поліаденілювання. В одному з оптимальних варіантів втілення кодуюча послідовність є функціонально з'єднаною з природною сигнальною послідовністю поліаденілювання. Відповідні транскрипційні термінатори та 7/5 термінатори, про які відомо, що вони функціонують у рослинах, включають Самм з55 термінатор, їті термінатор, гроз Е9 термінатор гороху та інші відомі спеціалістам термінатори. Зручні термінуючі ділянки також можна отримати з Ті-плазміди А. Штегїасіепз, наприклад, термінуючі ділянки октопінсинтази та нопалінсинтази. Див. також Козепрего еї аЇ., Сепе, 56:125 (1987); Сцегіпеаи еї а), МоЇ Сеп. Сепеї, 262:141-144 (1991); Ргоцаїсої,

СеїІ, 64:671-674 (1991); бапіасоп еї аЇ, Сепез Юеум., 5:141-1449; Модеп еї аї., Ріапі СеїЇ, 2:1261-1272 (1990); Мипгое еї аїЇ., Сепе, 97:151-158 (1990); Вайавз ей аї., Мисівіс Асій Кев. 77:7891-7903 (1989);

Чозпіеа|., Мисієвїс Асіа Кезв., 75:9627-9639 (1987)).

Було виявлено, що багато послідовностей посилюють експресію генів зсередини одиниці транскрипції, і ці послідовності застосовують у зв'язку з кодуючою послідовністю для посилення експресії у трансгенних рослинах.

Різні інтронні послідовності виявляють посилення експресії, зокрема, у клітинах однодольних. Наприклад, було сч ов Виявлено, що інтрони Аант гена кукурудзи значною мірою посилюють експресію природного гена зі спорідненим з ним за жіночою лінією промотором при введенні у клітини кукурудзи (Саїїз е(аі,, Сепез Юемеіор. 1:1183-1200 і) (1987)). Інтронні послідовності зазвичай є включеними у вектори трансформації рослин, як правило, у нетрансльованій лідерній послідовності.

Ці послідовності також можуть включати регулятор, такий як сигнал ядерної локалізації (Каїдегоп еї аї. «- зо Се! 39:499-509 (1984); та І аззпег еї а), Ріапі Моіесшіаг Віоюду 77:229-234 (1991)), узгоджена послідовність трансляції у рослинах (довзпі, СР., МисіІеіс Асіаз Кевзеагсп 75:6643-6653 (1987)), інтрон (І пейгзеп та Умаїрої, о

Мої. Сеп. Сепеї. 225:81-93 (1991)) та інші подібні послідовності, функціонально з'єднані з відповідною Ге! нуклеотидною послідовністю. В оптимальному варіанті в експресійну касету включено 54 лідерну послідовність. Такі лідерні послідовності можуть діяти для посилення трансляції. Лідерні послідовності - трансляції відомі спеціалістам і включають: пікорнавірусні лідерні послідовності, наприклад, ЕМСМ лідерна - послідовність (некодуюча ділянка енцефаломіокардиту 5) (ЕіІгоу-5іеіп, О., ЕРцегві, Т.К., та Мовв, Ргос. Маїй).

Асай. Зсі. ОБА 86:6126-6130 (1989)); лідерні послідовності потивірусу, наприклад, ТЕМ лідерна послідовність (вірус гравіровки тютюну) (Аївоп еї а, МОММ лідерна послідовність (вірус карликової мозаїки кукурудзи); «

Мігоіоду, 754:9-20 (1986)) та важколанцюговий зв'язувальний протеїн імуноглобуліну людини (ВІР), (Масе|ак, 70 0.0, та Затому, Р., Маїшге 353:90-94 (1991); нетрансльована лідерна послідовність з протеїну оболонки мРНК 8 с вірусу мозаїки люцерни (АММ РНК 4)(добіїпо, 5.А., та Сергке, |, Маїшге, 325:622-625 (1987)); лідерна ц послідовність вірусу мозаїки тютюну (ТММ)(Саїйе, О.К. еї аІ., МоІесшаг Віооду ої КМА, радез 237-256(1989)) "» та лідерна послідовність вірусу хпоротичної мозаїки кукурудзи (МСМУМ) (Готтеї, 5.А. еї аї., Мігіоду 97:382-385 (1991)). Див. також ЮОепа-Сіорра ейа!. Ріапі Рпузіоіїоду 84:965-968 (1987).

Гени, що кодують злиті протеїни, як описано вище, можуть бути введені у рослинні клітини багатьма -І визнаними спеціалістами способами. Спеціалістам буде зрозуміло, що вибір способу може залежати від типу з рослини, призначеної для трансформації. Підходящі способи трансформації рослинних клітин включають мікроін'єкцію (Стозвмулау еї аї., ВіоТесппідцез 4:320-334 (1986)), електропорацію (Кідд5з еї аїЇ.,, Ргос. Маї). (Се) Асай. 5сі. ОБА 83:5602-5606 (1986), опосередковану Адгорасіегішт трансформацію (Ніпснее еї аї., Віотесппоіоду 56:915-921 (1988); Див. також Ізпіда еї аіЇ., Маїшге Віогесппоіоду 74:745-750 (дипе 1996) для трансформації о кукурудзи), пряме перенесення генів (Раз2КомувКкі еї а, ЕМВОУ). 3.2717-2722 (1984); Науазпітоїйо еї аї., Ріапі - М РПпузіо!ї 93:857-863 (1990) (рис)) та балістичне прискорення частинок з застосуванням пристроїв від фірм

Аргасейив5, Іпс., Мадізоп, МУізсопвіп та Юиропі Іпс., ММітіпдіоп, ЮОеїаумлаге (див., наприклад, бЗапіога еї аї.,

О.5. Раїепі 4,945,050; та МсСаре еї аї., Віоїесппоіоду 6:923-926 (1988)) Див. також УУеїззіпдег еї аї., Аппра! Кем Сепеї 22:421-477 (1988); Заптога еї аїЇ., Рапісціаї Зсієпсе апа Тесппоїрду 5:27-37 91987(иуїбупя); Змар еї аЇ.,, Ргос. Май. Асад. сі. ОБА 87:8526-8530 (1990) (хлоропласти тютюну); СпПгівіои

Ф, еї аї,, Ріапі РПузіої. 87:671-674 (1988)(соя); МсСабре еї аї!., Віо/Тесппоіоду 6:923-926 (1988) (соя); Ківїп еї ко аі., Ргос. Май). Асад. Зсі. ОБА, 85:4305-4309 (1988) (кукурудза); Кіеіп еї аї, Віо/Гесппоіїоду 6:559-563 (1988) (кукурудза); Кіеїп еїа), Ріапі Рузіої. 91:440-444 (1988) (кукурудза); Еготт еї аї, Віо/Гесппоіоду 6о 8:833-839 (1990); і Согдоп-Катт еї аї., Ріапі СеїЇ 2:603-618 (1990) (кукурудза); Колієї еї аї, ВіоФесппоіоду 11:194-200 (1993) (кукурудза); ЗПпітатої еї а). Майте 338:274-277 (1989) (рис); Співи еї аї,

Віоїесппоіоду 9:957-962 (1991) (рис); ЮОана еї аї, Віо/Гесппоіїсду 8:736-740 (1990) (рис); Європейська патентна заявка ЕР-А-332 581 (грястиця та інші Рооідеаеє); МавіїЇ еї аі.. ВіоїСесппоїоду 11:1553-1558 (1993) (пшениця); УУеекв еї аї., Ріапі Рпузіої. 102:1077-1084 (1993) (пшениця); У/ап еї аї., Ріапі РНузіоїЇ. 704:37-48 65 (1994) (ячмінь); Уайпе еї аї., Треог. Аррі. Сепеї. 89:525-533 (1994) (ячмінь); Стреск еї аї., Віо/ТесппоЇоду 5:263-266 (1987) (бавовна); Сазаз еї аЇ, Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА 90:11212-11216 (Оес. 1993) (сорго);

Зотегв еї аї., Віо/Гесппоїоду 70:1589-1594 (ЮОес. 1992)(овес); Тогрегі еї аїЇ., Ріапі СеїЇ Керогів 74:635-640 (1995) (овес); М/еекз еї аї., Ріапі Рпузіо!ї 702:1077-1084 (1993) (пшениця); Спапао еї аї., М/О94/13822 (пшениця) та Менга еї аі., Те Ріапі доигпа! 5:285-297 (1994) (пшениця).

Один з найбільш оптимальних варіантів втілення для введення рекомбінантних молекул ДНК у цукровий буряк шляхом опосередкованої Адгорасіегічт трансформації можна знайти у роботі Копулаг, 9. Ріапі Віосйет 8

Віоїесі З: 37-41, 1994.

Способи застосуванням форм або прямого перенесення генів, або технологій бомбардування мікрочастинками, або опосередкованого Адгорасіегіцт перенесення зазвичай, але не обов'язково мають 7/0 перевагу селектованого або сортованого маркера, що забезпечує резистентність до антибіотика (наприклад, канаміцину, гігроміцину або метотрексату) або гербіциду (наприклад, фосфінотрицину). Однак вибір селектованого або сортованого маркера для трансформації рослин не є ключовим для винаходу. Прикладами є прій ген, який забезпечує резистентність до канаміцину та близьких до нього антибіотиків (Мівіга 5 Мезвзіпд, Сепе 79:259-268 (1982); Вемап еї аїЇ., Маїшге 304:184-187 (1983)), раг ген, який забезпечує резистентність до гербіциду фосфінотрицину (МУпіе еї аї, Мисі Асіайз Кев. 18:1062 (1990), Зрепсег еї аі, Тйеоп Аррі Сепеї. 79:625-631(1990)), прі ген, який забезпечує резистентність до антибіотика гігроміцину (Віоспіїпдег 5 ОіддеІтапп,

Мої. СеїІ. ВіоїЇ. 4:2929-2931) та ані ген, який забезпечує резистентність до метотрексату (Вошигоців та дагту,

ЕМВО .). 2:1099-1104 (1983)). Трансформацію можуть здійснювати за допомогою одного виду ДНК багатьох видів

ДНК (тобто, котрансформацію), і обидва ці способи є придатними для застосування, наприклад, з РІ кодуючими 2о послідовностями.

Іншим варіантом втілення даного винаходу є вищеописаний злитий протеїн, який включає (а) перший протеїн або домен протеїну з антипатогенною активністю; (б) пептид-лінкер; (в) другий протеїн або домен протеїну з антипатогенною активністю; і сч (г) необов'язково один або кілька інших протеїнів або доменів протеїнів з антипатогенною активністю, злиті одним або кількома пептидними лінкерами, (8) та ДНК послідовності, що кодують вищезгадані протеїни, які застосовують для поліпшення резистентності або толерантності до патогенів рослини та похідних від неї рослин, які визначаються як наступні покоління рослин, що походять від неї статевим або безстатевим шляхом, включаючи, крім інших, потомство рослини. «- зо Патогени, такі як нематоди, спричинюють економічні збитки стосовно більшості світових культур. Вони включають сільськогосподарські культури помірного клімату: цукровий буряк, овочеві культури (включаючи о томати, огірки, капусту, цвітну капусту, селеру, салат, моркву, буряк, пастернак, турецький горох та б сочевицю), олійні культури, бобові культури, кукурудзу, пшеницю, ячмінь, овес, жито та інші злаки, сінокосні та фуражні культури (включаючи низку трав, червону та білу конюшину та люцерну), лісові дерева, листяні та -ї7 з5 Горіхові дерева, соковиті плоди та виноград, декоративні та цибулинні культури, часник, цибулю та тепличні ча культури. Вони також включають субтропічні та тропічні культури, такі як рис, інші злаки (включаючи пшеницю, ячмінь, кукурудзу, овес, сорго та просо), коренеплодові та бульбові культури (включаючи картоплю, батат, маніоку, ямс, таро), харчові бобові, овочі (включаючи томати, огірки, корнішони, канталупи та інші дині, кавуни, капусту, цвітну капусту, чилі, баклажани, часник, цибулю селеру, гарбузи, салат, турецький горох та « сочевицю), арахіс, цитрусові, субтропічні та тропічні плодові дерева, кокоси та інші пальми, кавове дерево, тв) с какао, чай, банани, плодові банани та абаку, цукрову тростину, тютюн, ананас, бавовну та інші тропічні волокнисті культури, а також низку прянощів. з Вищезгадані дводольні або однодольні трансгенні рослини, що експресують злиті протеїни згідно з даним винаходом, складають іще один оптимальний варіанті втілення даного винаходу, так само, як і потомство вищезгаданих рослин та їхнє насіння. Сюди належать також комерційні упаковки, включаючи насіння -І вищезгаданих рослин. Перевагу віддають комерційній упаковці разом з інструкціями на етикетках щодо застосування насіння, що у них міститься. Надані рослинам шляхом інженерії вищеописані генетичні властивості - передаються шляхом статевого відтворення або вегетативного росту і, таким чином, можуть зберігатися й со поширюватися у потомстві рослин. Як правило, для вищезгаданого збереження й поширення користуються

Відомими сільськогосподарськими способами, розробленими для відповідності конкретним цілям, таким як о оранка, сівба або збирання врожаю. Можуть застосовуватися також спеціалізовані процеси, такі як гідропоніка

Кк або вирощування у теплиці. Оскільки культури, що розвиваються, є уразливими до нападів та шкоди, якої завдають комахи та інфекції, а також до бур'янів, проводять заходи щодо боротьби з бур'янами, хворобами рослин, комахами, нематодами та іншими несприятливими умовами для поліпшення врожайності. Вони ов Включають механічні заходи такі як обробка грунту або видалення бур'янів та заражених рослин, а також застосування агрохімікатів, таких як гербіциди, фунгіциди, гаметоциди, нематициди, регулятори росту, агенти, (Ф, що сприяють визріванню, та інсектициди. ка Використовувати вигідні генетичні властивості трансгенних рослин та насіння згідно з винаходом можна також у розведенні рослин, яке має за мету розвиток рослин з поліпшеними властивостями, такими як бо толерантність до паразитів, гербіцидів або несприятливих умов, поліпшена поживна цінність, підвищена врожайність або поліпшена структура, що веде до зменшення втрат від вилягання або ламання. Різні етапи розведення характеризуються чітко визначеним втручанням людини, наприклад, відбором ліній для схрещування, спрямуванням запилення батьківських ліній або відбором відповідного потомства. Залежно від потрібних властивостей проводять різні заходи з розведення. Подібні технології є добре відомими спеціалістам 65 і включають, крім іншого, гібридизацію, інбридинг, зворотне схрещування, багаторазове розмноження, змішування сортів, міжвидову гібридизацію, анеуплоїдні технології і т. ін. Технології гібридизації також включають стерилізацію рослин для одержання чоловічих або жіночих стерильних рослин механічними, хімічними або біохімічними засобами. Перехресне запилення чоловічих стерильних рослин пилком інших ліній гарантує, що геном стерильних чоловічих, але плідних жіночих рослин рівномірно набуде властивостей обох батьківських ліній. Таким чином, трансгенне насіння та рослини згідно з винаходом застосовують для розведення поліпшених ліній рослин, які, наприклад, підвищують ефективність традиційних способів, таких як гербіцидна або пестицидна обробка, або ж вони дозволяють обійтися без вищезгаданих способів завдяки їхнім модифікованим генетичним властивостям. В альтернативному варіанті можуть бути отримані нові культури з поліпшеною толерантністю до несприятливих умов, які, завдяки їхньому оптимізованому генетичному 7/0 "оснащенню", дають врожай продукту кращої якості порівняно з продуктами, які були не спроможні протистояти таким самим несприятливим умовам розвитку.

У виробництві насіння якість проростання та однорідність насіння є суттєвими характеристиками продукту, тоді як якість проростання та однорідність насіння, яке збирає й продає фермер, не є важливими. Оскільки важко утримувати культуру чистою від насіння інших культур та бур'янів, боротися з хворобами насіння та /5 забезпечувати насіння з добрим проростанням, виробниками насіння, які мають досвід у галузі вирощування, зберігання та продажу чистого насіння, було розроблено широку й чітко визначену практику виробництва насіння. Таким чином, загальною практикою для фермерів є купівля сертифікованого насіння, що відповідає конкретним стандартам якості, а не використання насіння, зібраного з власного врожаю. Матеріал, який застосовують як насіння, зазвичай обробляють захисним покриттям, включаючи гербіциди, інсектициди, 2о фунгіциди, бактерициди, нематициди, молюскоциди або їхні суміші. Традиційно застосовувані захисні покриття включають такі сполуки, як каптан, карбоксин, тирам (ТМТО), металаксил (Аргоп) та піриміфос-метил (АсіегіІїс).

Якщо потрібно, ці сполуки формулюють разом з іншими носіями, поверхнево-активними речовинами або сприяючими нанесенню ад'ювантами, традиційно застосовуваними у справі формулювання для забезпечення захисту від шкоди, викликаної бактеріальними, грибковими або тваринними шкідниками. Захисні покриття можуть сч г Застосовуватися шляхом просочування насінного матеріалу рідкою композицією або покриття комбінованою вологою або сухою композицією. і)

Можливі також інші способи застосування, такі як обробка, спрямована на бутони або плоди.

Інший аспект даного винаходу полягає у забезпеченні нових сільськогосподарських способів, таких як способи, наведені вище, які характеризуються застосуванням трансгенних рослини, трансгенного рослинного «- зо матеріалу або трансгенного насіння згідно з даним винаходом, описаним більш детально на представлених нижче окремих прикладах. У цих прикладах процедури утворення, маніпулювання та аналізу нуклеїнових кислот о здійснюються шляхом стандартних процедур, як описано у роботі Затрьгоок еї а! " МоіІесціаг Сіопіпд-А І арогагу Ге!

Мапцааї!", 2па еайіоп, Соїд Зргіпд Нагбог І арогаїгу Ргезв, МУ, ОА (1989).

ПРИКЛАДИ --

Приклад 1: Утворення подвійних експресійних касет інгібітора ї-

Злиті протеїни, що містять ОС-І ЛЮО8б та СртТІ кодуючі ділянки, відокремлені лінкерною послідовністю, утворюють шляхом двоетапної полімеразної ланцюгової реакції. Ос-ІАО86 кодуючу ділянку ампліфікують шляхом полімеразної ланцюгової реакції з попередньо існуючої послідовності (Опгміп еї аїЇ, Ріапі .) 8:121-131,1995) з « застосуванням олігонуклеотидного праймера РІ (У-АТОТСОАОСОАСОобАСооСсСоотТОостТтоос-3; 5ЕО І 40. МО: З), що відповідає 5-кінцеві кодуючої ділянки, та другого праймера Р2 - с (Б ЗАТСТТСОССОСАССОАСОССААСААТСАС. СОСАТТТОСАСТОССАТО-3; ЗЕО ІЮ МО: 4), комплементарного и З кінцеві Ос-ІДОВ8б кодуючої ділянки та 5 частині підкресленої розщеплюваної протеазою лінкерної ,» послідовності, яку одержують з рослинної металотіонеїноподібної послідовності РеМтТа гена (Емапз еї аі, РЕВ5 262: 29-32,1990). Так само СртТіІ ген бінарного вектора РКОК/СртіІн5, що містить СрТІ кКДНК під контролем Самм 355 промотора (Ніїдег ег а, Майшге 330:160-163,1987) ампліфікують праймером РЗ - (5-СТСОСТССООСОААСАТССАСТТТОААОСТ АСТААТСАТСАТОАТОАС-3; ЗЕО ІЮО МО: 5), призначеним для - кодування 3' частини підкресленої розщеплюваної протеазою РеМтТа лінкерної послідовності та 5' кінець СртТІ кодуючої ділянки разом з Рі (5-ПСТТАСТСАТСАТСТІСАТСССТОСАСТТОС-3; БО ІЮ МО: 6), се) комплементарною 3'-кінцеві СртІ кодуючої ділянки. Ампліфіковані ОС-ІДОЗ86 та СртіІ послідовності містять 18 п. о 20 нн. комплементарну ділянку на їхніх 3 та 5' кінцях відповідно і є з'єднаними докупи шляхом полімеразної ланцюгової реакції 50 Е (Но еї аїЇ, Сепе 77: 51-59,1989, та Нопоп еї аЇ, Сепе 77: 61-68,1989) з застосуванням ть праймерів РІ та РА. В результаті це дає відокремлення Ос-ІДОв86 та СртІ за допомогою розщеплюваного лінкера з амінокислотною послідовністю МІ ТЗМОРАТКІОТЕЕС, де стрілки показують передбачувані сайти розщеплення (Ос-ІДОВОРЗМ Тазсрті злитий протеїн). 59 Подібну процедуру застосовують для утворення ДНК фрагмента, що кодує Ос-І ДО86 та СртіІ з проміжним (Ф) нерозщеплюваним лінкером (Ос-ІДОВ8б/до/Срт!І озлитий протеїн), отриманим з генної послідовності ко галактозооксидази (МеРПегзоп еї а). 1992), з одного боку з застосуванням пари праймерів, що складається з вищезгаданого Р1 та РБ5 (5-СТОСООСООСТОТОТААСААСТАОСТТО СОСАТТТОСАСТОССАТО-3; ЗЕО ІЮ МО: во 7), а з іншого боку - пари праймерів, що складаються з Рб (5-АСТТСТТАСАСАОССССССАОССТОСТ АСТААТСАТСАТОАТОАС-3; 5ЕБЕО ІО МО: 8) та вищезгаданого Р4 (послідовність, що кодує лінкер, підкреслено). Ця нерозщеплювана лінкерна послідовність кодує пептид з послідовністю ОАБЗУТАРОРО).

Ампліфіковані злиті послідовності спочатку клонують у вектор полімеразної ланцюгової реакції РСКІЇ в5 (Іпийгодеп, Їеек, Нідерланди), а звідти у Зта | сайт ОЕЗ32 вектора експресії (СОіадеп) для вивчення секвенування та експресії. Потім їх переносять з РОЕЗ2 як Ра І (дефосфорилований Т4 полімеразою) / Вагп НІ фрагменти для заміщення 55 гена рВІ121 (Сіопебесй І арогайгієз Іпс.) після розщеплення за допомогою 581 |і (дефосфорилованого Т4 полімеразою)/Вагп НІ. Злиті послідовності контролюються Самму355 промотором рВІ121.

Приклад 2: Утворення одиничних експресійних касет інгібітора

Послідовність, що кодує інгібітор трипсину достиглого коров'ячого гороху (СрТІ) ампліфікують з плазміди рек (Ніїдег е( аї, Маїйшге 220:160-163,1987) шляхом полімеразної ланцюгової реакції з застосуванням олігонуклеотидних праймерів, створених з опублікованої послідовності, але з додаванням рестрикційних сайтів ферментів (підкреслені) для сприяння клонуванню у вектор експресії Цими двома праймерами є 7/0 З-АСТАТОБАТССАСТААТСАТСАТОАТОАСТО-3 (ЗЕО ІО МО: 9) та 5-АТАТТААОСТТ ТТСТТАСТСАТСАТСТТО-3 (5ЕО ІО МО: 10). Продукт з 246 п. н. клонують безпосередньо у вектор експресії рОозЗо (система "ОіІАехргезвіоп", Оіадеп) з застосуванням Ватні та НіпаїїІЇ сайтів, включених у праймери. Послідовність, що кодує Ос-І, ампліфікують з геномної ДНК Огуга заїїма | |аропіса шляхом полімеразної ланцюгової реакції з застосуванням праймерів Р7 у75 (5-АСАТОТСОААТТСТТАООСАТТТОСАСТОСО-3; ЗЕ ІО МО: 15) та Рв (У-САССАоСсССОООТСОАОСОАСОСА-3; 5ЕО ІЮ МО: 16). Інтрон видаляють шляхом полімеразної ланцюгової реакції за технологією ЗОЕ гена (див. вище Но еї а), причому пари праймерів Р7/Р9 (Б-СТССААСТСТАСААСАСААТТООСССТТОТТОТО-5; ЗЕ ІО МО: 17) та РВ/Р1О (5У-ААТТСТСТТСТАСАСТТО-5; ЗЕО ІЮ МО: 18) застосовують для ампліфікації двох екзонів. Ці продукти після цього з'єднують за допомогою ЗОЕ шляхом ампліфікації з праймерами Р7 та РВ і продуктом, клонованим у розщеплений Зтаї/ЕсокіІ Вішезсгірі. Потім підданий інженерії Ос-І ген клонують у вектор експресії типу ІМ РОЕ (Оіадеп) з застосуванням ВатнНі/Ніпай сайтів.

Для зміни єдиного кодону у Ос- гені з застосуванням праймера Р11 (5-АААССАТОСАТОТТСААДОСАОСТО-57; 5ЕО ІЮ МО: 19) застосовують стратегію "видалення унікального сайта" с (Рпагтасіа).

Приклад 3: Трансформація рослин і)

Похідні від рВІ плазміди вводять у компетентний І ВА4404 Адгобасієегічт (штегасіепз шляхом електропорації, як описано у роботі Зпеп та Рогде, Мисієіїс Асій Кез 17: 83-85, 1989. Потім їх вводять в екотип С24

Агарідорзіз (Наїйапа шляхом опосередкованої А. (Шшптегїасіепз трансформації коріння, як описано у роботі Сіагке «- зо еїаї, РіапЕ Мої Віо! Кер 10:178-189, 1992. Т1 насіння збирають з окремих рослин з застосуванням Агасопз від

Вейа-Тесп, Гент, Бельгія, для забезпечення самозапліднення. У цьому дослідженні також застосовували о

Агарідорзіз, що має 355/ОсІлОв86 (Огпміп еї аї, Тне Ріапі доигпаї! 12, 455-461, 1997). Ге!

Приклад 4: Експресія Е.соїї

Експресію з послідовностей як одиничних, так і подвійних ефекторів здійснюють, як описано у роботі Огміп - з5 Фе аї, Ріапі У 8:121-131,1995. Протеїни експресують як злиті протеїни, що містять бхНів М-кінець як кодований ї- рОЗО та рОЕЗ32 вектором, відповідно, Ї очищений з застосуванням нікельної смоли, за винятком СрТІіІ, вивільненого зі злитого протеїну Ос-ІДОВОРзМтТах СртІ. В останньому разі неочищений гомогенат піддають аналізові після видалення Ос-І ДО86 з застосуванням мітки 6-Нів. Рівень інгібування неочищеного гомогенату з « нетрансформованої Е.соїї віднімають від цих СртТІ зразків. ОС-ІДО86Є виявляють поліклональним антитілом, описаним вище у роботі Опміп еї аї, 1995, а СртІ -- моноклональним антитілом, утвореним згідно з роботою - с Цааеї! та Стгуег, "А ргасіїса! дціде (о топосіопаї! апіїродіев", допп УМіеу апа Бопв, Мем Хогк, ОА, раде 188,1991. и Папаїн та трипсин застосовують в аналізах інгібування цистеїнової та серинової протеїнази відповідно, "» практично так, як описано у роботі Абгапатзоп еї аїЇ, ) Віої Спет 262: 9688-9694,1987, з застосуванням субстрату М-СЬ2-РНпе-Аго-7-амідо-4-метилкумарину. Флуоресцентність вимірюють спектрофториметром Регкіп

ЕІтег 5І 508, що має пристрій для зчитування планшетів. - і Приклад 5: Виявлення експресії та поглинання нематодами - Протеїни, експресовані в Е.соїї, очищають з застосуванням системи ОіАехргезз (Оіадеп, Гільден,

Німеччина), як описано у роботах Огміп ейа!, 1995, Огміп ейаї, Ріапі у 8:121-131,1995. се) Фракції загального протеїну Агарідорзіз, придатні для 505 РАСЕ аналізу, отримують шляхом гомогенізації о 50 коренеплодового матеріалу у ступці з пестиком перед тим, як помістити у 0,15М Масі, 10ММ НЕРЕЗ та 10ММ

ЕОТА, рН 74. Зразки протеїну перед електрофорезом солюбілізують шляхом кип'ятіння у буфері ЗО5 РАСЕ -. (1595 (З-меркаптоетанолу, 15956 5О5, 1,596 бромфенолового блакитного, 5095 гліцерину). РІ експресію аналізують шляхом вестерн-блотингу, як описано у роботі Огплміп еї а! (Те Ріапі доцгпа! 12, 455-461, 1997) з застосуванням кон'югованого пероксидазою хрону антитіла для полегшення застосування хемілюмінесцентної системи пероксидази хрону (НКРІ), яку застосовують згідно з інструкціями виробника (Маїйопа! Оіадповіїсв, о Атланта, Джорджія. Розчинну фракцію протеїну збирають шляхом екстрагування перемеленого рослинного матеріалу у буфері (0,015М Масі, 10мМ Нерез, 10ММ ЕОТА, рН 7,4). Нерозчинний матеріал гранулюють при їмо) 75000боб/хв протягом 15хв (центрифуга Весктап Оріїта, з застосуванням ротора ТІ А100.2) для відокремлення розчинного (цитозолю) та нерозчинного матеріалів. Гранули енергійно ресуспендують у 100мММ карбонату бо натрію, рН 11, центрифугують, як описано вище, і збирають супернатант, що містить асоційовані з мембраною протеїни. Гранули промивають у вищезгаданому карбонатному буфері й ресуспендують у 5О0О5-РАСЕ буфері. Усі зразки перед електрофорезом кип'ятять у ЗОЗ-РАСЕ буфері.

Вестерн-блотинг також застосовують для демонстрації поглинання інгібіторів нематодами з трансгенних рослин. Самиць, що живляться, збирають, знімаючи рукам з коріння Агабрідорзіз, забезпечуючи, таким чином, 65 відсутність домішків рослинного матеріалу. Приблизно 70 нематод збирають з рослин, що експресують одиничні або подвійні РІ. Нематод перемелюють у мікроцентрифузі й ресуспендують у 0,15М Масі, 10мМ Нерез, 10мММ

ЕОТА, рН 7,4, що містить суміш інгібіторів протеази серійного виробництва (Воейгіпдег Мапппеїт, Льюїс,

Сполучене Королівство). Зразки кип'ятять з ЗОЗ РАСЕ буфером і здійснюють аналіз шляхом вестерн-блотингу, як описано вище.

Антитіла проти СрТІ та ОсідО8б реагують з протеїновими смугами з правильним М, у гомогенатах

Агарідорзіз, що експресують одиничні РІ послідовності. Жодне з антитіл не вступає у помітну перехресну реакцію ні з неспорідненим за жіночою лінією РІ у рослинних гомогенатах, ні з іншими протеїнами, присутніми у зразку. У гомогенатах коріння як Е.соїї, так і Агарідорзіз, послідовність Ос-І ДО8б/до/СртІ дає один основний продукт у с 23кДа, який розпізнається обома антитілами і, таким чином, містить обидва РІ. Слабший сигнал, що 70 Відповідає окремому РІ меншої молекулярної маси, виявляли з кожним антитілом, що вказує на нижчий рівень дисоціації злитого протеїну. Послідовність Ос-ІДО86/ РеМтТа/СртІ забезпечує зворотний характер вестерн-блотингу, що показує більш високу реактивність з М,, нижчим, ніж продукти з вищим Мг. Це свідчить про те, що у цьому випадку переважають розщеплені РІ. Проводять аналізи відносного інгібування на продуктах

Ос-ІДОВЕРзМ Тасорії та Ос-ІДОВ8б/до/СртІ, що виробляються в Е.соїї. Обидва забезпечують 9595 інгібування 75 активності папаїну та трипсину, що свідчить про те, що серійна РІ молекула інгібує обидві протеїнази, і що два РІ зберігають ефективність після розщеплення похідного від РазМтТа лінкера.

Вестерн-блотинг здійснюють на гомогенатах коріння кількох трансформованих ліній. Для кожної з чотирьох послідовностей вибирають одну лінію для подальших дослідів. Кожна відібрана лінія експресує потрібний(і) РІ при 0,495 загального протеїну. Аналіз поглинання інгібітора нематодами з обома антитілами показує, що самиці

М. іпсодпіа поглинають Ос-ІДО8б або СртТІ, коли паразитують на рослинах, що експресують одиничні Рі послідовності. Обома антитілами виявляється також інтактний злитий протеїн Ос-ІАО86/до/СртіІ. Одночасно кожне антитіло виявляє менший продукт, що відповідає одиничному РІ. Несподівано було виявлено, що жоден продукт очікуваного розміру не виявляє себе у нематод, взятих з рослин, що експресують послідовність

Ос-ІДО86/РзМтТа/СртіІ. Результати для Н. зспаснпййї є подібними до результатів для М. іпсодпіа за винятком с того, що нерозщеплений продукт Ос-ІДОВ86в/до/СртіІ не може бути виявлений у нематодах. Неможливість виявити Ге) продукти з Ос-ІДО8б/РзМТа/СртІ у нематодах є несподіваною, якщо враховувати те, що обидва інгібітори є присутніми у рослинах-хазяях. Вестерн-блотинг диференційовано фракціонованого рослинного матеріалу показує, що обидва продукти Ос-ІДО86/РзМтТа/СртІ є асоційовані з мембраною, але не є протеїнами, що є складовою частиною мембрани. --

Приклад 6: Зараження нематодами, відновлення та вимірювання (ав)

Популяції Н. зспаснйї тримають на рослинах, капусти. Рослини капусти чотиритижневого віку заражають, б» висаджуючи рослини у суміш піску/суглинку, що містить яйця Н. зспаспій при густині 30 яєць на г 7. Рослини капусти вирощують при 22"С за нормальної тривалості дня. Заражений грунт, який застосовують для -- зв5 Вирощування цих рослин, відновлюють і підраховують кількість яєць на г 7. Здійснюють З-разове серійне ї- розведення грунту 5095 сумішшю суглинку/піску з застосуванням відокремлювана, а потім його застосовують для вирощування дикого С24 Агарідорвіз. У попередніх експериментах кількість яєць у 9 штук на г! виявилася найвищою, з 5-разовим збільшенням. Однак при наступних зараженнях застосовували лише 5 яєць на г 7 для « забезпечення доброго зараження без надмірного навантаження на рослини.

Популяцію М іпсодпі(а тримають на рослинах томатів, які вирощували при 16б-годинному дні при 247С. Цілі - с бульби заражених рослин різали на дрібні шматочки і використовували їх для серійних розведень у 5095 суміші а суглинку/піску. Аліквотні проби серійних розведень застосовують для встановлення оптимальної норми "» зараження при температурі основної маси грунту 10"7С.

Чистий заражений кореневий матеріал та цисти збирають шляхом вирощування рослин у 5095 суміші піску/сугллинку. Ручне збирання нематод у перші моменти полегшується фарбуванням коріння кислотним -| фуксином, як описано у роботі Опміп еї аїЇ, (Опміп ек аії, Те Ріапі дошигпа! 12, 455-461,1997), за винятком - того, що тонке коріння Агарідорзіз не вимагає етапу очищення. Збирання цист здійснюють з застосуванням апарату для відмулювання Зеїіппогві (Зеїіппогві 1964). Плідність жіночих особин виявляють шляхом ручного се) підрахунку числа яєць усіх особин, зібраних з групи рослин. о 20 Заражені рослини Агарідорвіз вирощують при тривалості дня 16бгод, при освітленні б ммоль фотонів м'2 с" при 22"С у камерах для вирощування Запуо МІ КЗ3500. Горщики для рослин, що містять природний С24 "6 Агарідорзів, та ті, що містять рослини, що експресують інгібітори, поміщують на решітки випадкової вібірки.

Приклад 7: Модифікація галактозооксидазного лінкера

Амінокислотну послідовність лінкерної ділянки між доменом 1 та доменом 2 галактозооксидази модифікують 22 шляхом заміщення трьох амінокислотних кодонів АСТ ТСТ ТАС, що кодують амінокислотну послідовність ЗУ, о послідовністю ТСТ АТС САА ОТ СОС (5ЕО ІЮО МО: 20), що кодує амінокислотну послідовність ЗІЄОК (ЗЕО ІЮ

МО: 21). Перший кодон просто заміщує існуючий Зег кодон, тоді як інші чотири кодони кодують сайт де протеолітичного розщеплення Фактор Ха. Застосовану процедуру мутагенезу на основі полімеразної ланцюгової реакції описано у роботі Вагоп ей а), У Віоїї Спет 269, 25095-25105, 1994. Модифікований ген 60 галактозооксидази експресується у Азрегаоїїиз підшапв. Несподівано було виявлено, що два протеїнові ланцюги виявляють себе на БО5-РАСЕ деї, що відповідає за розмірами доменові 1 (приблизно 16бкДа) та доменам 23 (приблизно 52 кДа).

Жодного протеїну не виявлено у позиції, що відповідає галактозооксидазі повної довжини. Результат показує, що модифікований галактозооксидазний лінкер є сприйнятливим до розщеплення грибковою 65 протеїназою. Застосування цього лінкера або подальших його модифікацій дозволяє рослинним протеїназам обробляти мультимерні молекули іп ріапіа.

Хоча даний винахід було описано у деяких деталях з метою пояснення та полегшення розуміння, спеціалістам з опису буде зрозуміло, що можуть бути зроблені різні зміни у формі та деталях без відхилення від обсягу винаходу та нижчеподаної формули.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

(1) ЗАГАЛЬНА ІНФОРМАЦІЯ: () ПОДАВЕЦЬ: (А) НАЗВА: МОМАКТІЗ ДО (Б) ВУЛИЦЯ: Зспмуаггмаїдавее 215 70 (В) МІСТО: Базель (Г) КРАЇНА: Швейцарія (Д) ПОШТОВИЙ ІНДЕКС (21Р): 4058 (Е) ТЕЛЕФОН: 41613241111 (Є) ТЕЛЕФАКС: 141613227532 (ї) НАЗВА ВИНАХОДУ: Продукт злиття (ії) КІЛЬКІСТЬ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ: 21 (м) ФОРМА КОМП'ЮТЕРНОГО ЗЧИТУВАННЯ: (А) ТИП НОСІЯ: Дискета (Б) КОМП'ЮТЕР: ІВМ РС (В) ОПЕРАЦІЙНА СИСТЕМА: РО-БО5/М5-0О05 (Г) ПРОГРАМА: Раїепіїп Кеїеазе Я1.0, Мегвіоп 41.25 (ЕРО) (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО 5ЕО ІЮО МО: 1: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 14 амінокислот сч (Б) ТИП: амінокислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична і) (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: пептид (ії) ППОТЕТИЧНІ ВАРІАНТИ: немає «- зо (ії) АНТИСМИСЛОВІ ПОСЛІДОВНОСТІ: немає (М) ТИП ФРАГМЕНТА: внутрішній о (м) ДЖЕРЕЛО ПОХОДЖЕННЯ: б (А) ОРГАНІЗМ: РзМтТа Лінкер (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ЕС ІЮ МО: 1: -- з5 мае йеч бу Ма! су Рго Аа Гуз Пе біп Рпе См Су ч- 1 5 70 (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО 5ЕО ІЮО МО: 2: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: « (А) ДОВЖИНА: 11 амінокислот з с (Б) ТИП: амінокислота . (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична а (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: пептид (ії) ППОТЕТИЧНІ ВАРІАНТИ: немає -І (ії) АНТИСМИСЛОВІ ПОСЛІДОВНОСТІ: нема (М) ТИП ФРАГМЕНТА: внутрішній - (м) ДЖЕРЕЛО ПОХОДЖЕННЯ:

Ге) (А) ОРГАНІЗМ: лінкер галактозооксидази (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ЕС ІЮО МО: 2: о Сіп Аіа бег Зег Туг ТПиг Аа Рго СіІп Рго Сп - 1 5 10 (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО 5ЕО ІО МО: 3: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ:

ГФ) (А) ДОВЖИНА: 30 пар нуклеотидів (Б) ТИП: нуклеїнова кислота де (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна 6о (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (ії) ППОТЕТИЧНІ ВАРІАНТИ: немає (ії) АНТИСМИСЛОВІ ПОСЛІДОВНОСТІ: немає (м) ДЖЕРЕЛО ПОХОДЖЕННЯ: (А) ОРГАНІЗМ: оліго Р1 б5 (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ЕС ІО МО: 3:

АТОТССАСОС АСобАСоОоСо вОтОоСсттоос (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО 5ЕО ІО МО: 4: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 48 пар нуклеотидів (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (ії) ППОТЕТИЧНІ ВАРІАНТИ: немає (ії) АНТИСМИСЛОВІ ПОСЛІДОВНОСТІ: немає (м) ДЖЕРЕЛО ПОХОДЖЕННЯ: (А) ОРГАНІЗМ: оліго Р2 (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ЕС ІЮ МО: 4: 7 5 САТСТТСОСС ОБАССОАОСС СААСДАТСАС СОСАТІТОСА СТОССАТС (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО 5ЕО ІЮО МО: 5: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 48 пар нуклеотидів (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (ії) ППОТЕТИЧНІ ВАРІАНТИ: немає (ії) АНТИСМИСЛОВІ ПОСЛІДОВНОСТІ: немає с (м) ДЖЕРЕЛО ПОХОДЖЕННЯ: о (А) ОРГАНІЗМ: оліго РЗ (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ЕС ІЮО МО: 5:

ОТСООТОСОО СОААСАТССА ОТТТОААОСТ АСТААТСАТО АТОАТОАС

(2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО 5ЕО ІЮО МО: 6: «- () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 32 пар нуклеотидів о (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (о) (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична - (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) ї- (ії) ППОТЕТИЧНІ ВАРІАНТИ: немає (ії) АНТИСМИСЛОВІ ПОСЛІДОВНОСТІ: немає (м) ДЖЕРЕЛО ПОХОДЖЕННЯ: « (А) ОРГАНІЗМ: оліго РА (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ЕС ІЮ МО: 6: - с ТТСТТАСТСА ТСАТСТТСАТ СССТОбАСТТ ОС :з» (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО 5ЕО ІЮО МО: 7: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 45 пар нуклеотидів - 15 (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична -й (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна со (її) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (ії) ППОТЕТИЧНІ ВАРІАНТИ: немає («в) 20 (ії) АНТИСМИСЛОВІ ПОСЛІДОВНОСТІ: немає щк (м) ДЖЕРЕЛО ПОХОДЖЕННЯ: (А) ОРГАНІЗМ: оліго Р5 (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ЕС ІЮ МО: 7:

СсТобОобООсСтТ СТОТААСААС ТАССТТОбОС АТТТОСАСТО САТ (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО 5ЕО ІО МО: 8:

Ф! () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 45 пар нуклеотидів де (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична 60 (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (ії) ППОТЕТИЧНІ ВАРІАНТИ: немає (ії) АНТИСМИСЛОВІ ПОСЛІДОВНОСТІ: немає (м) ДЖЕРЕЛО ПОХОДЖЕННЯ: б5 (А) ОРГАНІЗМ: оліго Рб

(хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ЕС ІО МО: 8: (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО ЗЕО ІО МО: 9: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 31 пара нуклеотидів (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (ії) ППОТЕТИЧНІ ВАРІАНТИ: немає (ії) АНТИСМИСЛОВІ ПОСЛІДОВНОСТІ: немає (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ЕС ІЮ МО: 9:

АСТАТОСАТС САСТААТСАТ САТСАТОАСТ С

(2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО 5ЕО ІЮО МО: 10: 19 () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 29 пар нуклеотидів (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (ії) ППОТЕТИЧНІ ВАРІАНТИ: немає (ії) АНТИСМИСЛОВІ ПОСЛІДОВНОСТІ: немає (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ЗЕО ІЮ МО: 10:

АТАТТААОСТ ТТТСТТАСТС АТСАТСТТС с (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО 5ЕО ІЮО МО: 11: о () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 14 амінокислот (Б) ТИП: амінокислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична -- (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна о (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: пептид (ії) ППОТЕТИЧНІ ВАРІАНТИ: немає Ме (ії) АНТИСМИСЛОВІ ПОСЛІДОВНОСТІ: немає «- (М) ТИП ФРАГМЕНТА: внутрішній 3о (м) ДЖЕРЕЛО ПОХОДЖЕННЯ: - (А) ОРГАНІЗМ: модифікований лінкер галактозооксидази (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ЗЕО ІЮ МО: 11:

Сіп Аа бег Пе Сім Су Аго Туг Тпг Ага Рго Сіп Рго Сіп « 30 1 5 10 з с (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО 5ЕО ІЮО МО: 12: а () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: "» (А) ДОВЖИНА: 18 амінокислот (Б) ТИП: амінокислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична -і (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна - (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: пептид (Ні) ГІПОТЕТИЧНІ ВАРІАНТИ: немає се) (ії) АНТИСМИСЛОВІ ПОСЛІДОВНОСТІ: немає о 50 (М) ТИП ФРАГМЕНТА: внутрішній (м) ДЖЕРЕЛО ПОХОДЖЕННЯ: -. й (А) ОРГАНІЗМ: лінкер природного імуноглобуліну (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ЗЕО ІЮ МО: 12:

Гуз Сім Зег Су 5ег Ма! Зег Зег СІЧ Сп Геи Аа Сіп Рпе Аго 5ег Гей Азр 1 5 10 15 (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО 5ЕО ІЮО МО: 13: о () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: іме) (А) ДОВЖИНА: 13 амінокислот (Б) ТИП: амінокислота 60 (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: пептид (ії) ППОТЕТИЧНІ ВАРІАНТИ: немає (ії) АНТИСМИСЛОВІ ПОСЛІДОВНОСТІ: немає 65 (М) ТИП ФРАГМЕНТА: внутрішній (м) ДЖЕРЕЛО ПОХОДЖЕННЯ:

(А) ОРГАНІЗМ: пептид-лінкер (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ЗЕО ІО МО: 13:

Сім Сіу СГуз бег бег Сіу бег Су Зег Ом 5ег І уз Рго а 5 10 (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО 5ЕО ІЮО МО: 14: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 15 амінокислот (Б) ТИП: амінокислота то (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: пептид (ії) ППОТЕТИЧНІ ВАРІАНТИ: немає (ії) АНТИСМИСЛОВІ ПОСЛІДОВНОСТІ: немає т (М) ТИП ФРАГМЕНТА: внутрішній (м) ДЖЕРЕЛО ПОХОДЖЕННЯ: (А) ОРГАНІЗМ: пептид-лінкер (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ЗЕО ІЮ МО: 14:

Су Сім бу Су Зег бу Су Су Су бег Су Су Сім Су Зег 1 5 10 15 (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО 5ЕО ІЮО МО: 15: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 31 пара нуклеотидів с (Б) ТИП: нуклеїнова кислота о (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (ії) ППОТЕТИЧНІ ВАРІАНТИ: немає - (ії) АНТИСМИСЛОВІ ПОСЛІДОВНОСТІ: немає о (м) ДЖЕРЕЛО ПОХОДЖЕННЯ: (А) ОРГАНІЗМ: оліго Р7 Ме (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ЗЕО ІО МО: 15: «-

АСАТОТОСАА ТТСТТАСОСА ТТТОСАСТОС С

(2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО 5ЕО ІО МО: 16: - () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 24 пари нуклеотидів (Б) ТИП: нуклеїнова кислота « дю (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична з (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна с (її) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) :з» (ії) ППОТЕТИЧНІ ВАРІАНТИ: немає (ії) АНТИСМИСЛОВІ ПОСЛІДОВНОСТІ: немає (м) ДЖЕРЕЛО ПОХОДЖЕННЯ: - 15 (А) ОРГАНІЗМ: оліго Р8 (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ЗЕО ІЮ МО: 16: - БАСбАОоСоССОо ООТСОАОССА СОСА се) (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО 5ЕО ІЮО МО: 17: о 50 () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 33 пари нуклеотидів -. й (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (ії) ППОТЕТИЧНІ ВАРІАНТИ: немає о (ії) АНТИСМИСЛОВІ ПОСЛІДОВНОСТІ: немає іме) (м) ДЖЕРЕЛО ПОХОДЖЕННЯ: (А) ОРГАНІЗМ: оліго РО 60 (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ЗЕО ІЮ МО: 17:

СТООААСТСТ АСААСАСААТ ТОСССТТОТТ сто (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО 5ЕО ІЮО МО: 18: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 18 пар нуклеотидів 65 (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична

(Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (ії) ППОТЕТИЧНІ ВАРІАНТИ: немає (ії) АНТИСМИСЛОВІ ПОСЛІДОВНОСТІ: немає (м) ДЖЕРЕЛО ПОХОДЖЕННЯ: (А) ОРГАНІЗМ: оліго Р1О (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ЗЕО ІО МО: 18:

ААТТСТСТТС ТАСАСТТСо (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО 5ЕО ІЮО МО: 19: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 24 пари нуклеотидів (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична 19 (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (ії) ППОТЕТИЧНІ ВАРІАНТИ: немає (ії) АНТИСМИСЛОВІ ПОСЛІДОВНОСТІ: немає (м) ДЖЕРЕЛО ПОХОДЖЕННЯ: (А) ОРГАНІЗМ: оліго Р11 (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ЗЕО ІО МО: 19:

АААССАТОСА ТОТТСААОСА СТО

(2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО 5ЕО ІЮО МО: 20: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: с (А) ДОВЖИНА: 15 пар нуклеотидів о (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) -- (ії) ГІПОТЕТИЧНІ ВАРІАНТИ: немає (ії) АНТИСМИСЛОВІ ПОСЛІДОВНОСТІ: немає о (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ЗЕО ІЮ МО: 20: (22)

ТСТАТОСААС СТСОС «- (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО 5ЕО ІЮО МО: 21: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: ге (А) ДОВЖИНА: 5 амінокислот (Б) ТИП: амінокислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична « дю (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна -о (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: пептид с (ії) ППОТЕТИЧНІ ВАРІАНТИ: немає :з» (ії) АНТИСМИСЛОВІ ПОСЛІДОВНОСТІ: немає (М) ТИП ФРАГМЕНТА: внутрішній (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ; ЗЕО ІЮ МО: 21: - 5ег Пе Сім Су Агд шк 1 Й 5. се) о 50

Claims (14)

1. Формула винаходу "з 1. Спосіб поліпшення резистентності або толерантності до нематод у рослини та її потомства, який включає включення у геном вищезгаданої рослини гена, що кодує злитий протеїн, який включає: перший протеїн або домен протеїну з антипатогенною активністю, 99 пептид-лінкер та ГФ) другий протеїн або домен протеїну з антипатогенною активністю, у котрого щонайменше один з протеїнів або юю доменів протеїнів з антипатогенною активністю має здатність інгібувати протеїнази.
2. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що інші протеїни або домени протеїнів з антипатогенною активністю зливають зі злитим протеїном за допомогою пептидів-лінкерів. 60 З.
3. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що принаймні один з протеїнів або доменів протеїнів з антипатогенною активністю є інгібітором протеїнази Ос - ІДЮО86.
4. 4. Спосіб за п. З, який відрізняється тим, що принаймні один з протеїнів або доменів протеїнів з антипатогенною активністю є інгібітором протеїнази СртТІі.
5. 5. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що ген є функціонально з'єднаним з послідовністю промотора, що бо забезпечує експресію переважно у корінні рослин.
6. 6. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що пептид-лінкер включає амінокислотну послідовність, яка протеолітично розщеплюється рослиною.
7. 7. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що пептид-лінкер включає амінокислотну послідовність, яка є протеолітично стабільною у рослині.
8. 8. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що пептид-лінкер включає амінокислотну послідовність ОАБЗУТАРОРО.
9. 9. Спосіб за п. б, який відрізняється тим, що пептид-лінкер включає амінокислотну послідовність МІ/ОМОРАКІОРЕО. 70
10. 10. Спосіб за п. б, який відрізняється тим, що пептид-лінкер включає амінокислотну послідовність ОАБІЕСКУТАРОРО.
11. 11. Молекула ДНК, здатна кодувати злитий протеїн, яка включає перший протеїн або домен протеїну з антипатогенною активністю, пептид-лінкер та другий протеїн або домен протеїну з антипатогенною активністю, у котрого щонайменше один з протеїнів або доменів з антипатогенною активністю здатен інгібувати протеїназу і де пептид-лінкер включає амінокислотну послідовність, яка є протеолітично стабільною у рослині.
12. 12. Молекула ДНК за п. 11, яка відрізняється тим, що злитий протеїн, який кодується вказаною молекулою, включає інші протеїни або домени протеїнів з антипатогенною активністю, злиті з ним за допомогою пептидів-лінкерів.
13. 13. Злитий протеїн, що кодується молекулою ДНК за п.11.
14. 14. Рослина, що експресує злитий протеїн, який кодується молекулою ДНК за п. 11. Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних сч мікросхем", 2005, М 1, 15.01.2005. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і щі ї 6) науки України. «- (ав) Ге) «- -

    - . а - і - (се) (ав) -М ко бо б5