JPH06508033A - 植物を保護するための殺昆虫蛋白質および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 植物を保護するための殺昆虫蛋白質および方法本発明は、遺伝子工学および植物 農業の分野に関するものである。より詳細には、本発明は、農業または園芸で昆 虫を制御または駆除する方法および化合物を提供する。

数多（の野菜および作物が昆虫有害生物の攻撃を受けている。大部分の植物は特 定の昆虫に対しである程度の耐性を示し、この耐性は物理的または化学的であり 得る。例えば、数多くの植物が有する葉の上の毛は、小型の昆虫がその表面を吸 うに充分な程近付かないようにし得る。他の場合として、植物は、それらの組織 に引き寄せないようにするか或は毒性を示すようにする範囲の複雑な二次的化学 品を用いている。このような草食性昆虫の制御は、古典的には部分的に、培養お よび品種改良方法がめて来たものであった。このような損失を低くするに有効な 方法は、有害生物に耐性を示す遺伝子を有する作物品種を用いることである（Ｐ ａｉｎｔｅｒ著［作物植物における昆虫耐性Ｊ　（Ｉｎｓｅｃｔ　Ｒｅ５ｉｓｔ ａｎｃｅ　ｉｎ　Ｃｒｏｐ　Ｐｌａｎｔｓ）　、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ：　Ｎｅｗ 　Ｙｏｒｋ　（１９５１）参照）。植物の品種改良を行っている人達は、通常の 品種改良プログラムを通してそれらの変種の中に昆虫耐性遺伝子を組み込むこと によって、昆虫の攻撃が原因となる損失を低（する試みを行ってきた。

宿主植物の耐性に対する古典的なアプローチは、ある場合には際だった成功を示 してはいるが、むしろ経験的である。耐性に関する「特性」を一度発見すると、 彼らは、選択操作を用いて農業経営的に許容される路線に入ろうとする。古典的 なアプローチが有する１つの限界は、１つの植物からもう１つの植物への耐性遺 伝子の移動が、相互品種改良（４ｎｔｅｒｂｒｅｄ）され得る種に限定されてい る点である。追加的に、このような種類の耐性は、多くの遺伝子の制御下にある 可能性があり、そのため、植物の品種改良を行っている人がそれを充分に利用す るのは困難である。

しばしば、耐性を示す変種は収率低下を示すことで、これを経済的に実行するこ とは不可能であった。更に、もし種の中か或は関係した種の範囲内で耐性を同定 することができない場合、古典的な品種改良を用いたのでは、昆虫有害生物に対 する耐性を改良することは不可能である。

昆虫の制御では、化学的殺昆虫剤に重く頼ってきた。これらの薬剤は、典型的に 、土壌の上に投与するか或はその中に結合させるか、或は植物の葉か或は餌場の 中に投与されている。幅広い範囲の化学的有害生物防除剤が利用できるにも拘ら ず、草食性昆虫に関する問題は重大なままである。多くの化学的有害生物防除剤 は、繰り返し投与する必要があると言った欠点を有している。数多くの有害生物 防除剤を用いることに関する主要な問題は、その投与された薬剤に対して昆虫が 耐性を示すようになり得ることである。このような現象は、この薬剤を繰り返し て投与している間に、その昆虫集団の中で最も高い耐性を示す一員が選択される ことを通して生じる。従って、新規な昆虫制御剤、詳細には通常の殺昆虫剤とは 異なる様式の作用を示す薬剤に対する必要性が存在している。

合成化合物の代替物として、天然に存在している特定の薬剤が単離され、そして 有害生物防除剤として開発されてきた。これらには、植物および微生物の二次代 謝物および蛋白質、並びに天然の捕食動物または昆虫の病原体（他の昆虫、菌・ カビ、細菌およびウィルスを含む）が含まれる。更に、組換えＤＮＡ技術が発展 するにつれて、供与有機体からの遺伝子を受容有機体に転移させる結果として、 この受容体の中に新規な表現型を生じさせることができる。形質転換した植物の 場合、もしこの導入した遺伝子がポリペプチドをコード化するとしたならば、こ の表現型は昆虫損傷に耐性を示すことができ、この作用が、その有害生物に有害 な影響をもたらす。その結果として、このような効果を示すポリペプチド類を見 付は出すことに関して多大な興味が持たれており、そしてそれは多大な有効性を 示す。このようなポリペプチドのための遺伝子を用いて、有機体、特に植物およ び微生物を修飾し、その結果として、これらが昆虫有害生物の発育および発生に 悪影響を与えるようにすることができる。記述されているこのようなポリペプチ ド類の数は非常に限定されており、例えばバチルス・ツリンギエンシス（Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）由来のポリペプチド類、種々の蛋白 質様プロテアーゼおよびアミラーゼ阻害剤、種々の植物レクチン類などである。

特定の阻害剤による崩壊に敏感であることが知られている、昆虫が有する１つの 生理学的システムは、消化プロテアーゼの作用である。これらの消化プロテアー ゼは、ペプチド結合を開裂させることによって、摂取された蛋白質およびポリペ プチド類を加水分解する。この語「プロテアーゼ」は、具体的には、下記の４種 の主要な触媒的分類：セリンプロテアーゼ類、システィンプロテアーゼ類、カル ボキシルプロテアーゼ類およびメタロプロテアーゼ類の、エンドペプチダーゼ類 およびエキソペプチダーゼ類が含まれる（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ他、＾ｎｎ、　Ｒ ｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、４９：５９３−６２６　（１９８３）参照）。特定 のプロテアーゼが属している種類は、それが活性を示すｐＨ範囲、それが特定の 蛋白質を加水分解する能力、充分に特徴付けされた他のプロテアーゼに対する類 似性、並びに種々の阻害剤に対してそれが示す感受性によって決定され得る。

多様な種類の、昆虫の消化酵素が、餌の蛋白質からペプチド類およびアミノ酸類 を放出させる。１つの種類の消化酵素は、システインプロテイカーゼ類である。

この言葉「システィンプロテアーゼ」は、この酵素が有する触媒部位にシスティ ン残基の高い反応性を示すチオール基を有するプロテアーゼを記述することを意 図したものである。数多くの草食性昆虫は、少なくとも部分的に、蛋白質の消化 に関して、牛腸のシスティンプロテアーゼに頼っていると言った証拠が存在して いる。これらには、半し目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）　、特にカメムシ（＾ｎａｓ ａ　ｔｒｉｓｔｉｓ）　；　シヨうし目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）　、特にコー ンルートワーム（ｃｏｒｎ　ｒｏｏｔｗｏｒｍ）　（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ　５ ｐＩ）、）　：メキンカンビーンビートル（Ｍｅｘｉｃａｎ　ｂｅａｎ　ｂｅｅ ｔｌｅ）（Ｅｐｉｌａｃｈｎａ　ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓ）　：レッドフラワービ ートル（ｒｅｄ　ｆｌｏｕｒ　ｂｅｅｔｌｅ）　（Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ　ｃａｓ ｔａｎｅｕ＋ｎ）　；コンヒューズドフラワービートル（ｃａｎｆｕｓｅｄ　ｆ ｌｏｕｒ　ｂｅｅｔｌｅ）　（Ｔｒｉｂａｌ　ｕｍ　ｃｏｎｆｕｓｕｍ）　；フ ジマメのぞうむしくＣａ１ｌｏｓｏｂｒｕｃｈｕｓ　ｍａｃｕｌａｔｕｓ）　： わたのぞうむしく＾ｎｔｈｏｎｏｍｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓ）；コロラドじゃがい もはむしくＬｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ　ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔｅ）　；スリー ラインドボテドビートル（ｔｈｒｅｅ−１ｉｎｅｄ　ｐｏｔａｔｏ　ｂｅｅｔｌ ｅ）　（！、ｅｍａ　ｔｒｉｌｉｎｅａｔａ）　；米のぞうむしく５ｉｔｏｈｉ ｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）　；とうもろこしのぞうむしく５ｉｔｏｐｈｉｌｕｓ　 ｚｅａｍａｉｓ）　；穀倉のぞうむしく５ｉｔｏｈｉｌｕｓ　ｇｒａｎａｒｉｕ ｓ）　；レソサーダレインボアラ（ｌｅｓｓｅｒ　ｇｒａｉｎ　ｂｏｒｅｒ）　 （Ｒｈｙｚｏｐｅｒｔｈａ　ｄｏＩＩｌｉｎｉｃａ）　Ｈのみとびよろいむしく Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ　ｓｐｐ、、Ｈａｌｔｉｃａ　ｓｐｐ、およびＥｐｉｔ ｒｉｘ　ｓｐｐ、　）　；エジプトアルファルファのぞうむしくＨｙｐｅｒａ　 ｐｏｓｔｉｃａ）　；豆のぞうむしく＾ｃａｎｔｈｏｓｃｅｌｉｄｅｓ　ｏｂｔ ｅｅｔｕｓ）　；イエローミールワーム（ｙｅｌｌｏｗ　ｍｅａｌｗｏｒｍ）　 （Ｔｅｎｅｂｒｉｏ　ｍｏｌｉｔｏｒ）　；およびアスパラガスビートル（ａｓ ｐａｒａｇｕｓ　ｂｅｅｔｌｅ）　（Ｃｒｉｏｃｅｒｉｓ　ａｓｐａｒａｇｉ） などが含まれる。

プロテアーゼと複合体を形成してそれらの蛋白分解活性を阻害する化合物が現実 に普及している。種々の「低分子量」プロティナーゼ阻害剤が知られており、こ れらは主に非天然の合成源のものである。天然に存在している数多くの低分子量 阻害剤が細菌および菌・カビ源から単離されて特徴付けされており、この群には 、Ｅ−６４（Ｎ−（Ｌ−３−トランス−カルボキシオキシラン−２２−カルボニ ル）−Ｌ−ロイシル）−アミド−４−グアニド）ブタン）、ロイペプチン類、ア ンチペイン類およびペプスタチン類の如き阻害剤が含まれる。

いくつかの蛋白質様プロテイナーゼ阻害剤が植物種から単離されており、これら は、昆虫および病原体の攻撃に応答して発生的に調節されると共に誘発される、 植物組織内の防御化学品の中に入る。セリン−、システィン−、アスパラギン酸 −およびメタローブロテイカーゼ類の阻害剤が植物の中、特に貯蔵器官、例えば 塊茎および種子の中に見いだされている。最も通常に幅広く研究されている植物 プロテアーゼ阻害剤群は、トリプシンおよびキモトリプシンを含む動物のセリン プロテアーゼを阻害する阻害剤である（Ｒｙａｎ、＾ｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｐｈ ｙｔｏｐａｔｎｏｌ、　２８：４２５−４４９　（１９９０）参照）。

蛋白質様システィンプロテアーゼ阻害剤は、システィンプロテアーゼの触媒活性 を低下させるか或はなくさせるものである。システインプロテイナーゼ類の最適 ｐＨは通常５−７の範囲であり、これは、システインプロテイナーゼ類を用いて いる昆虫の牛腸管腔内のｐＨ範囲である（上記Ｒｙａｎ　（１９９０）参照）。

シスタチン類（ｃｙｓｔａｔｉｎｓ）は、天然に存在している蛋白質様システィ ンプロテアーゼ阻害剤である（Ｂａｒｒｅｔｔ、　Ｔｒｅｎｄｓ、　Ｂｉｏｌ、 　Ｓｅｔ、、１２：１９３−１９６　（１９８７）参照）。シスタチン類は、分 子量、ジスルフィド結合の数、細胞下位置および主要な構造特徴に関して３つの 科に分類されている（上記Ｂａｒｒｅｔｔ　（１９８７）参照）。この分類分は システムは、主に、を椎シスタチン類に関する情報が基になっている。

１つの科は、ジスルフィド結合または炭水化物基を有していない、約１００個の アミノ酸残基（Ｍ、１１，０００）を有する単一ドメインから成っている分子を 有する１型シスタチン類（時にはステフィン類と呼ばれる）で構成されている。

いくらか複雑なものは２型のシスタチン類であり、これらは、約１１５個のアミ ノ酸残基（Ｍ、１３，０００）から成る単一ドメインを有する分子であり、その カルボキシル末端近くにジスルフィドループを２本含んでいる。ニワトリのシス タチンは、ヒトのシスタチンＣおよびＳ、ウシの初乳由来のシスタチン、および ヘビの毒液由来のシスタチンと同様、この種類のものである。最も複雑なシスタ チン分子は、３型のシスタチン、即ちキニノーゲン類の分子である。

これらの各々は４つのドメインを含んでおり、ここで、ドメイン４はキニン（こ れはシスティンプロテアーゼの阻害剤でない）であり、そしてドメイン１−３は 、明らかに遺伝材料の２つの複製から得られるシスタチン様ドメインであるが、 しかしながら、ドメイン１はシスティンプロテアーゼの阻害剤でないが、ドメイ ン２と３は阻害剤である。

阻害活性の原因となるシスタチンの領域は、下記の如く要約され得る、即ち、こ のシスタチン超科の一員内の配列相同性は、２つのよく保存された性質を表し、 その１つはアミノ末端Ｇ１ｙ残基であり、もう１つは配列Ｇｉｎ−Ｖａ　Ｉ−Ｖ ａ　１−Ａｌａ−Ｇｌｙであるか或はそれの類似Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｘｘｘ−Ｖａ　］ −Ｘｘｘ−Ｇ　ｌ　ｙである。このような高度に保存された領域が他の保存され たセグメントとの「結合端（ｂｉｎｄｉｎｇ　ｅｄｇｅ）」を構成して、それの 活性部位裂溝の所でシスティンプロテアーゼと相互作用していると考えられてい る。

システインプロテイカーゼ類を利用している種々のしようし目の制御で、動物の シスタチン類（例えばめん鳥の卵白シスタチンおよびキニノーゲン類など）およ び低分子量の非ペプチドであるシスティンプロテアーゼ阻害剤（例えばＥ−６４ 、アンチパインおよびロイペプチン）が有効であり得ることが教示されている（ オーストラリア特許出願番号３６５６８７８９号参照）。

植物のシスティンプロテアーゼ阻害剤に関してはほとんど知られていない。パイ ナツプル（Ｒｅｄｄｙ他、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、２５０：１７４１− １７５０　（１９７５）参照）、ジャガイモ（これは通常ジャガ芋パパイン阻害 剤（ＰＰＩ）と呼ばれている）　（ＲｏｄｉｓおよびＨｏｆｆ、　Ｐｌａｎｔ　 Ｐｈｙｓｉｏｌ、、７４：９０７−９１１　（１９８４）参照）、トウモロコシ （Ａｂｅ他、＾ｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、５２：１５８３−１５８ ４　（１９８８）参照）、米（＾ｂｅ他、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２６ ２：１６７９３−１６７９７　（１９８７）参照）、フジマメ（Ｒｅｌｅ他、＾ ｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、、２０４：１１７−１２８　（ １９８０）参照）、マングビーン（ｍｕｎｇ　ｂｅａｎ）　（Ｂａｕｍｇａｒｔ ｎｅｒ他、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、５８：１−６　（１９７６）参照） 、トマト（＾ｋｅｒｓ他、Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｂｏｔ、、　５８：１０００−１０ ０３　（１９８０）参照）、小麦、大麦およびライ麦（Ｆｏｓｓｏｍ、＾ｃｔａ 　Ｐａｔｈｏｌ。

Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ、　５ｃａｎｄ、　Ｓｅｃ　Ｂ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ、、７ ８ニア４１−７５４　（１９７０）参照）、キビ（ＴａｓｈｉｒｏおよびＭａｋ ｉ、＾ｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、、５０：２９５５−２９５７　 （１９８６）参照）、カポチー？　（Ｖａｌｖｅｓｋｉ他、円ａｎｔ　５ｃｉｅ ｎｃｅ、７４：１７９−１８４　（１９９１）参照）、スコツトランド松（Ｓａ ｌｍｉａＳＰｈｙｓｉｏｌ、　Ｐｌａｎｔ、、４８：２６６−２７０　（１９８ ０）参照）およびエンテロロビウム・コントルチシリクウム（Ｅｎｔｅｒｏｌｏ ｂｉｕｍ　ｃｏｎｔｒｏｒｔｉｓｉｌｉｑｕｕｍ）豆（Ｏ１ｉｖａ他、Ｂｉｏｌ 、　Ｃｈｅｗ、　Ｈｏｐｐｅ−３ｅｙｌｅｒ、３６９：２２９−２３２（１９８ ８）参照）を含む種々の植物組織由来のシスティンプロテアーゼ阻害剤が報告さ れている。

米由来のオリサシスタチン類（ｏｒｙｚａｃｙｓｔａｔｉｎｓ）　ＩおよびＩＩ がシスタチン類として同定された。このアミノ酸配列は他のシスタチン類が有す るアミノ酸配列と類似していることから、オリザシスタチンは動物由来のシスタ チン題材の一員に相同性を示すことが確認され、そしてこのことは、この植物シ スタチンと動物のシスタチン類とは、同族体先祖由来の遺伝子から進化したもの であることを示唆している（上記＾ｂｅ他（１９８８）参照）。

ライステリア・フロリブンダ（Ｗｉｓｔｅｒｉａ　ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ）の種 （Ｈｉｒａｓｈｉｋｉ他、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１０８：６０４−６０８　 （１９９０））および大豆（Ｂｒｚｉｎ他、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、　Ｈｏｐｐｅ−３ｅｖｌｅｒ、　３７１：１６７−１７０　（１９９ ０））から精製されたシスティンプロテアーゼ阻害剤から得られた部分的アミノ 酸配列データもまた、これらが単一のシスタチンドメインを有するシスタチン題 材の一員であることを示している。

蛋白質の結晶がジャガ芋の塊茎内に天然に存在していることは長い間知られてい た。これらの結晶は、主に、サブフエロゲン（ｓｕｂｐｈｅｌｌｏｇｅｎ）層の 中に存在しているが、時には塊茎全体に渡って見いだされる。ジャガ芋塊茎の外 側皮質から単離された、構造的損傷を受けていない立方体結晶は、有意量で核酸 、脂質または炭水化物を含んでいない蛋白質である（Ｈｏｆｆ他、Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍ＋ｏｕｎ、、　４９：１５２５−１ ５２９　（１９７２）参Ｉ！ｉｌり。この結晶の大きさは５がら２５μｍで変化 し、そして通常立方体形状を有しているが、これらは時には、双子結晶および類 似角柱形状を有する結晶として存在し得る（上記ＲｏｄｉｓおよびＨｏｆｆ　（ １９８４）参照）。

このジャガ芋の結晶性蛋白質は、スルフヒドリルブロティナーゼ類であるパパイ ン、キモパパインおよびフィシンに対してプロテイナーゼ阻害活性を示す（上記 ＲｏｄｉｓおよびＨｏｆｆ　（１９８４）参照）。このポリペプチドもまた、ア ルカリ性ｐＨおよびホスフェートの存在下で容易に結晶化する点でユニークであ り（上記ＲｏｄｉｓおよびＨｏｆｆ　（１９８４）参照）、そしてこれは、ジャ ガ芋植物の塊茎最外層および葉の中で多量に作られる。

例えば、若いトマトの小葉の中に見いだされた結晶（キモパパイン阻害活性が検 出された）の大きさおよび外観は、ジャガ芋の塊茎で観察されたそれと同じであ る（ＡｋｅｒｓおよびＨｏｆｆ、　Ｃａｎ、　Ｊ、Ｂａｔ、、５８：　ｔｏｏｏ −ｔｏ。

３　（１９８０）参照）。細胞質の結晶もまた、２０時間の誘導期間後、トマト の葉組織の電子顕微鏡写真の中で示された。

植物のシスティンプロテアーゼ阻害剤の機能は、生理学的機能の意味では充分に 理解されていない。トリプシン阻害剤とは対照的に、システィンプロテアーゼ阻 害剤に関して見いだされた低い一定したレベルは、それらが種子に関する代謝事 象に参加していることを示唆している。これらの阻害剤は、恐らくは生理学的に 重要であり、そしていくつかの阻害剤は、栄養上の重要さを有している可能性が ある（Ｖａｌｅｖｓｋ４他、Ｐｌａｎｔ　５ｃｉｅｎｃｅ、　７４：１７９−１ ８４　（１９９１）参照）。昆虫および／または病原体に対する保護役割は実証 されていない。

Ｒｙａｎは、システィン機構を示す（ｃｙｓｔｅｉｎｅ　ｎ＋ｅｃｈａｎｉｓｔ ｉｃ）種類の酵素を阻害する、同定した動物および植物蛋白質を数多く挙げてい るが、彼はまた、現実に利用できる阻害剤遺伝子の大部分に関して、それらが起 こし得る植物内の防御役割を研究しそして試験する必要があると述べている（Ｒ ｙａｎ、　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ、、２８：４２５− ４９　（１９９０）参照）。従って、システィンプロテアーゼ阻害剤、特に動物 のシスタチンが昆虫の発育および発生に対して有害な影響を示すことに関する直 接的な証拠はほとんど存在していない。言い換えれば、システィンプロテアーゼ 阻害剤はシスティンプロテアーゼのインビトロアッセイにおいてシスティンプロ テアーゼを阻害すると期待されてはいるが、出版されているデータでは、単に、 選択した昆虫の腸環境内のシスティンプロテアーゼ阻害剤が昆虫有害生物の発育 および発生を制御する機能を果すか否かを予測するには不充分である。例えば、 選択したフジマメ種子内のパパイン阻害剤のレベルと、主に牛腸内にシスティン プロテアーゼを有する昆虫であるカロソブルクス−７クラツス（Ｃａｌｌｏｓｏ ｂｒｕｃｈｕｓ、　ｍａｃｕｌａｔｕｓ）に対する耐性との間には全く相関関係 が存在していない（Ｘａｖｉｅｒ−Ｆｉｌｈｏ他、Ｊ、＾ｇｒｉｃ、Ｆｏｏｄ　 Ｃｈｅｍ、　３７：１１３９−１１４３　（１９８９）参照）。

実際、Ｒｙａｎは、特定的に、いくつかの昆虫の幼虫が有する牛腸に関するアッ セイを教示しティる文献（Ｍｕｒｄｏｃｋ他、Ｃｏｍｐ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　 Ｐｈｙｓｉｏｌ。

Ｂ、　８７：７８３−８７　（１９８７））を引用している。１つのしようし目 昆虫であるＴ、カスタネラム（Ｔ、　ｃａｓｔａｎｅｕＩｌｌ）は、アルキル化 剤ｐＣＭＢで高度に阻害されるンステイン腸プロテアーゼを有していることが示 されている。

実際、Ｌｉａｎｇ他（ＦＥＢＳ、　２７８（２）＋１３９−１４２　（１９９１ ））およびＣｈｅｗ他（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｕ ｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、　３：４１−４９　（１９９２））は、インビトロアッ セイにおいて、オリザシスタチンがＴ、カスタネラムの中編プロテアーゼの可能 な阻害剤であることを示している。しかしながら、Ｃｈｅｗ他（上記、１９９２ ）は、オリザシスタチンを極めて高いレベル（１０重量％／重量）で食餌の中に 入れた時、オリザシスタチンが昆虫の発育阻害を生じさせるのは最低限（２４日 後３５％）であることを示している。この食餌内１０％のオリザシスタチンが示 す効果は、非蛋白質様システィンプロテアーゼ阻害剤Ｅ−６４が示す効果よりも かなり低い。

本発明の１つの目的は、消化システィンプロテアーゼ類を有する昆虫による昆虫 の外寄生から植物またはそれの一部を保護する方法を提供することにある。

本発明の更に一層の目的は、昆虫の外寄生に敏感な植物またはそれの一部を、消 化システィンプロテアーゼ類を有する昆虫による攻撃から保護し得る新規な組成 物を提供することにある。

本発明の更に一層の目的は、消化システィンプロテアーゼ類を有する昆虫によっ て摂取された時それらに対して有害な影響を生じ得る蛋白質をコード化する遺伝 子を用いて、宿主細胞の形質転換を行うことを含む、遺伝的に形質転換された宿 主細胞を作り出す方法を提供することにある。

本発明の他の目的および利点は、以下に与える本発明の記述から明らかになるで あろう。

従って、１つの態様において本発明は、消化システィンプロテアーゼ類を有する 昆虫による昆虫の外寄生を制御する方法に関する。これは特に、上記昆虫による 外寄生に感受性の植物組織の中か、上か或はその近くに、中腸有効性を示す植物 シスタチンを与えることによって、その植物組織が示す上記昆虫に対する耐性を 改良することに関係している。

２番目の態様において本発明は、消化システィンプロテアーゼ類を有する１種以 上の昆虫による昆虫の外寄生に感受性の植物組織の耐性を改良し得る、中腸有効 性を示す植物シスタチンを含んでいる殺昆虫組成物に関する。

３番目の態様において本発明は、植物細胞内で中腸有効性を示す植物シスタチン をコード化しそして発現し得るベクター類に関する。

４番目の態様において本発明は、消化システィンプロテアーゼ類を有する１種以 上の昆虫による昆虫の外寄生に感受性の植物組織を保護し得る、牛腸有効性を示 す植物シスタチンをコード化する遺伝子を有する細胞の形質転換細胞および細胞 培養物に関する。

５番目の態様において本発明は、消化システィンプロテアーゼ類を有する１種以 上の昆虫による昆虫の外寄生に感受性の植物組織の耐性を改良し得る、牛腸有効 性を示す植物シスタチンの殺昆虫組成物を調製する方法に関する。

本発明が有する数多くの態様を添付図で具体的に説明する。

図１は、引き出されたジャガ芋パパイン阻害剤のアミノ酸配列を示している。

図２は、ファージＢＺ２内のＰＰＩ遺伝子のヌクレオチド配列を示している。

図３は、トリプシンでＰＰＩを消化させることによって得られるポリペプチド類 のＮ−末端アミノ酸配列を示している。

図４は、ＰＰｌ−５とオリザシスタチン−１とめん鳥の卵シスタチンとのアミノ 酸配列の比較を示している。

図５は、第二令ウェスタン・コーン・ルートワーム（ｌｌｌｅｓｔｅｒｎ　Ｃｏ ｒｎ　Ｒｏｏｔｗｏｒｍ）およびササン・コーン・ルートワーム（Ｓｏｕｔｈｅ ｒｎ　Ｃｏｒｎ　Ｒｏｏｔｗｏｒｍ）の発育に対するＰＰＩの効果を示している 。

図６は、新生ササン・コーン・ルートワーム（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｃｏｒｎ　Ｒ ｏｏｔｗ。

ｒ＋ｎ）の発育に対するＰＰＩの効果を示している。

図７は、ｐＤＡＢ２１９Δのプラスミド地図を示している。

図８は、ｐＨ７０７−Ｎｏｔのプラスミド地図を示している。

本明細書で引用する文献全ての教示事項全体が、引用することによって組み入れ られる。

前に考察したように、消化アッセイに関するインビトロアッセイでプロテアーゼ 阻害剤が阻害性を示すことの単なる事実は、これがインビボで有効であることを 必ずしも意味していない。このことは特にＰｕｒｃｅｌｌ他の研究（Ｉｎｓｅｃ ｔ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、、２２：４１−４７　（１９ ９２））で示されている、と言うのは、トリプシン阻害剤はインビトロで牛腸蛋 白分解活性の良好な阻害剤であるにも拘らず（６０−７０％阻害）、これらの蛋 白質を高レベルで与えることと、わたのぞうむしまたはタバコバドワーム幼虫の 発育阻害とは全く関係がなかったからである。選択した昆虫の発育および発生に 対して特定のシスタチンが有害な効果を示すか否かに関する実験的証拠はほとん ど存在していない。入手可能な証拠が示唆しているのは、以前に特徴付けされた シスタチン類が選択された昆虫の発育および発生を制御する効果は比較的低いと 言うことである（上記ｃｈｅｎ他（１９９２））。

本発明は、消化システィンプロテアーゼを有する昆虫による外寄生を制御する能 力を有する、牛腸有効性を示す植物シスタチン類を、昆虫制御量で用いることを 意図したものである。特に感受性の昆虫には、コーンルートワーム、メキシカン ビーンビートル、レッドフラワービートル、コンヒューズドフラワービートル、 フジマメのぞうむし、わたのぞうむし、コロラドじゃがいもはむし、スリーライ ンドボテドビートル、米のぞうむし、とうもろこしのぞうむし、穀倉のぞうむし 、レッサーダレインボアラ、のみとびよろいむし、エジプトアルファルファのぞ うむし、豆のそうむし、イエローミールワーム、アスパラガスビートルおよびか めむしなどの１種以上の昆虫（幼虫を含む）が含まれる。

「昆虫制御量」は、昆虫の正常な生命過程を有害に崩壊させるに充分な量の、牛 腸有効性を示す植物シスタチンである［即ち、致死（毒性）または致死量以下（ 損傷、または発育もしくは発生の阻害、または忌避）の量］。

上で考察したように、インビトロで蛋白分解酵素を阻害する能力は、この阻害剤 が昆虫の発育を制御するに有効であることを必ずしも意味するものではない。シ スティンプロテアーゼ類を有する特定の昆虫はまた、摂取したシスティンプロテ アーゼ阻害剤を不活性化し得る他の消化プロテアーゼも有している。理論で範囲 を限定することを意図するものではないが、単一ドメインのシスタチン類は、与 えられた標的有害生物が有する標的システィンプロテアーゼと結合してそれを阻 害するに先立って、その中編環境の中で不活性化されると考えられる。

従って、本発明は、牛腸有効性を示す植物シスタチンを意図したものである。「 牛腸有効性を示す植物シスタチン」は、消化システィンプロテアーゼの不活性化 を可能にするに充分な時間、標的有害生物の牛腸内における不活性化に耐性を示 すシスタチンを意味している。本発明の目的で、「標的昆虫」は、消化酵素とし てンステインブロテアーゼを有している昆虫である。「耐性を示す」は、標的昆 虫有害生物を制御するに先立ってこの標的昆虫の牛腸における本質的な不活性化 に感受性を示さない、牛腸有効性を示す植物シスタチンを意味している。

好適な具体例において、本発明は、ジャガ芋パパイン阻害剤とも呼ばれている、 ジャガ芋由来の結晶性シスタチン類を意図したものである。

本発明の目的で「ジャガ芋パパイン阻害剤」は、図１に挙げる配列を有する遺伝 子によってコード化される蛋白質またはそれの機能誘導体を包含することを意図 している。図１で分かるように、ジャガ芋塊茎並びにジャガ芋の葉から誘導され る結晶の蛋白質成分は、８つのドメインで構成されており、これらは、理論によ って範囲を限定することを意図するものではないが、遺伝材料の複製から生じた ものであると見られる。これらの８つのドメインは８７ｋＤのポリペプチドを含 んでいる。各々のドメインは、ジスルフィド結合を有していないアミノ酸を約９ ５個含んでいる。これらのドメインの配列を基にすると、この蛋白質は、繰り返 すシスタチン単位を含んでいるシスタチン紐材の一員であるのは明らかである。

具体的には、これらのドメイン配列は、ＱＸＶＸＧ配列の高い保存を示しており 、そして各々のドメインのアミノ末端領域は、保存されたＧｌｙを含んでいる。

その８７ｋＤのジャガ芋パパイン阻害剤ポリペプチドの隣接ドメインは、トリプ シンの作用によって、１．２または３個のシスタチンドメインを含んでいる個々 の単位に開裂し得る。他のプロテアーゼ類、例えばキモトリプシン、サブチリシ ンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、サーモリシン（ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ）およびプロテ アーゼにもまた、ＰＰＩを開裂させて個々の活性シスタチン単位を生じさせる。

これらのドメインは約１０ｋＤのＭｒを有している。試験したドメインの各々は 、システィンプロテアーゼ阻害活性を示す。いくつかのドメインを直接アミノ酸 配列決定し、そしてこのＤＮＡ配列から予測したアミノ酸配列から、ドメイン間 には同一でないにしても近い類似性が存在している。

本分野の技術者は、このような他のマルチドメインのシスタチン類も本発明の範 囲内に包含されることを理解している。

ジャガ芋の塊茎以外の供給源からもマルチドメインシスタチン単位を含んでいる 蛋白質を単離することができる。例えば、トマトの小葉の如き種々の植物源から 、天然に存在しているマルチドメインシスタチン類を単離することができる。塊 茎ＰＰＩに対するポリクローナル抗血清と強力に反応する、ジャガ芋塊茎由来の ＰＰＩと同じ大きさく８７ｋＤ）を有するポリペプチド類もまたジャガ芋の葉の 中で見いだされた。この葉のＰＰＩレベルの上昇は、これらの葉が損傷を受ける ことによって誘発され、そしてこの葉の可溶蛋白質全体の２％に及ぶレベルが達 成され得る。このポリペプチドはまた、塊茎由来のＰＰＩに対して上昇するポリ クローナル抗血清によって認識されることから、トマトの葉の中でも同様な効果 が注目される。本発明は、特定の具体例において、種々のシスタチンドメインの １種以上を含んでいる、牛腸有効性を示す植物シスタチンを用いることを意図し たものであることは明らかであろう。単一ドメインのシスタチン類を繰り返した 組み合わせか、或は異なる単一ドメインシスタチン類を用いてマルチドメインシ スタチン類を合成することも可能である。例えば、本発明はまた、該ジャガ芋パ パイン阻害剤が有する阻害性を示すフラグメントも包含している。これらのフラ グメントには、該ジャガ芋パパイン阻害剤が有する８種の個々のドメインのいず れかおよび全ての組み合わせが含まれる。

１種以上のシスタチンサブユニットを有するマルチドメインシスタチン類は、い ずれか１つのシスタチンサブユニットによる不活性化に耐性を示す昆虫を制御す る能力を有している可能性がある。これらの阻害剤を再配列して、マルチドメイ ンのシスタチン類を含む新規な蛋白質形態を生じさせることができる。ドメイン の多重度を維持することで、モル当量レベルにおいて、より有効なシスティンプ ロテアーゼ阻害特性を有するシスタチンが得られることも明らかであろう。また 、異なる活性部位配列を有するドメインを多数有する阻害剤を用いることで、有 害生物が耐性を迅速に獲得する可能性を低くすることができる。

その牛腸有効性を示す植物シスタチンが昆虫有害生物の発育を阻害するに有効性 を示し得る（または増大した能力を有する）ように、標的昆虫の牛腸内でシスタ チンが劣化するのを低くするか或は抑制する態様のいずれも、本発明の範囲内で ある。本発明の例となる態様には、マルチドメインのシスタチンを用いること、 そして／または摂取されたシスタチンの不活性化を抑制する２番目の阻害剤を共 投与することが含まれる。

マルチドメインのシスタチン類は、その標的有害生物を本質的に制御するに充分 な期間に渡ってその蛋白質がそれの活性を維持するに充分な程大きいサイズを有 するものであってもよいか、或はそのように調製されていてもよい。

更に本発明に包含されるものは、天然に存在しているマルチドメインシスタチン 類の阻害性フラグメントであり、これらもまた、その標的有害生物を本質的に制 御するに充分な期間に渡ってその活性を維持するに充分な程大きいサイズを有す るものである。

実施例項で分かるように、ジアブロチカ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ）幼虫によって 摂取されたとき、このマルチドメインのジャガ芋パパイン阻害剤は、その８７ｋ Ｄのポリペプチドから成る単一ドメインよりも、中編の不活性化に対して高い耐 性を示す。従って、本発明の教示を得た技術者は、ここに、該システィンプロテ アーゼ阻害剤の脇下活性化の様式を測定することか可能であり、そしてそのシス タチンの不活性化を生じさせる酵素（類）を不活性化する化合物の有効量を相乗 剤として含有させることができるであろう。例えば、ジアブロチカ幼虫によって 食された場合、ジャガ芋由来のカルボキシペプチダーゼ阻害剤（Ｒｙａｎ、　Ｊ 、　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ。

２４９：５４９５　（１９７４））は、これらの昆虫が示す消化生理または発育 に対して如何なる有害な影響も与えなかった。しかしながら、ジャガ芋のカルボ キシペプチダーゼ阻害剤と、マルチドメインのジャガ芋パパイン阻害剤かう誘導 される単一シスタチンドメインを共投与すると、相乗効果が得られ、その結果と してジアブロチ力幼虫の発育阻害が生じた。他の植物種から得られるカルボキシ ペプチダーゼ類（例えばＬｅａｒｙ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１ｇ（１１ ）：２２５２−２２５６　（１９７９））もまた、ＰＰＩとの相乗剤として働い てジアブロチ力幼虫を制御すると期待される。

牛腸有効性を示す植物シスタチンの阻害活性を監視する生化学アッセイを用いる ことで、技術者は、システィンプロテアーゼを阻害する能力を有する蛋白質に関 して、常規様式によりインビトロアッセイで植物を検査することができる。標的 昆虫の餌にそのシスティンプロテアーゼ阻害剤を投与する２番目のスクリーニン グを用いることができる。この昆虫に１−２時間摂取させた後、その中編を取り 出し、そして分光光度計測定、好適には高感度の蛍光測定または放射測定アッセ イを用いて、その腸内のシスティン蛋白分解活性量を分析する。その牛腸内の消 化システィンプロテアーゼ活性量を有意に低下させるところの、牛腸有効性を示 す植物シスタチン類は、その昆虫の発育に対して有害な影響を与える可能性があ る。この阻害剤をその昆虫の餌の中に組み込むか或はその上に投与した後、体重 上昇および死亡率を測定することでその昆虫の発育および発生を監視することに よる、３番目のスクリーニングを用いて、上記を確かめることができる。

適当な活性が測定されたならば、Ｎ末端の配列決定と共に蛋白分解で誘導される オリゴペプチド類の配列決定を用いて、その牛腸有効性を示す植物シスタチンの アミノ酸配列または少なくともそれの一部を測定してもよい。加うるに、その牛 腸有効性を示す植物シスタチンを特異的に認識する抗血清を調製することもでき る。

本発明の教示を得た人は、天然に存在している牛腸有効性を示す植物シスタチン 類の本質的に純粋な機能誘導体を合成するか或は単離することができると理解さ れるべきである。この牛腸有効性を示す植物シスタチンの「機能誘導体」は、そ の牛腸有効性を示す植物シスタチンが示す生物学的活性に本質的に類似している 生物学的活性を示す化合物である。

この言葉機能誘導体は、「フラグメント」、「有効な相同性を示す変種」または 「類似物」を包含することを意図したものである。

分子の「フラグメント」は、牛腸有効性を示す植物シスタチン分子の阻害性ポリ ペプチドの部分集合いずれをも表すことを意味している。

その牛腸有効性を示す植物シスタチンの如き分子の「有効な相同性を示す変種ｊ は、配列および機能の点でその分子全体か或はそれのフラグメントに本質的に類 似している分子を表すことを意味している。本発明の目的で、１つのアミノ酸配 列の構成が、このアミノ酸配列の活性を示す部分の少なくとも７０％、好適には 少なくとも８０％、最も好適には少なくとも９０％同じであるか等しい場合、２ 番目のアミノ酸配列に有効な相同性を示している。一般に、この有効な相同性を 示す配列は、その天然に存在しているアミノ末端Ｇ１ｙ残基および保存されてい る配列Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｘｘｘ−Ｖａ　ｌ　−Ｘｘｘ−Ｇ　ｌ　ｙの位置に高い保存 度を維持しているべきである。可能的に同等であるアミノ酸の一般的分類を以下 に示すが、ここで、１つのグループ内のアミノ酸は、そのグループ内の他のアミ ノ酸で置換されていてもよいが、そのグループは、（１）グルタミン酸およびア スパラギン酸；　（２）リジン、アルギニンおよびヒスチジン：　（３）アラニ ン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン：　（４）アスパラギンおよびグルタ ミン：　（５）　ｌ−レオニンおよびセリン；　（６）フェニルアラニン、チロ シンおよびトリプトファン、および（７）グリシンおよびアラニンである。この 定義にとってより重要で決定的なことは、２番目のアミノ酸が、消化システィン プロテアーゼの触媒活性を低下させるか或はなくさせる能力を有する三次構造に 適合している場合、この２番目のアミノ酸配列の機能はもう１つのアミノ酸配列 に対して有効な相同性を示していることである。

この中腸有効性を示す植物シスタチンの如き分子の「類似物」は、機能の点でそ の分子全体か或はそれのフラグメントに本質的に類似している分子を表すことを 意味している。従って、２種の分子が同様な活性を有している場合これらは類似 物であると見なされる、と言うのは、もしこれらの分子の１つが有する構造が他 の分子の中に見い出されないか、或はもしこれらのアミノ酸残基の配列が同じで ない場合でも、ここでは、その言葉を用いるからである。

ここで用いる語「本質的に純粋な」は、１種以上の純度もしくは均一特質によっ て等質性を示す、その中腸有効性を示す植物シスタチンを記述することを意味す るものである。例えば、本質的に純粋な、中腸有効性を示す植物シスタチンは、 分子量、クロマトグラフィー挙動などのパラメーターに関して、標準的実験変動 内で一定および再現性のある特質を示す。しかしながら、この語は、この中腸有 効性を示す植物シスタチンと他の化合物との人工もしくは合成混合物を排除する ことを意味するものではない。この言葉はまた、その中腸有効性を示す植物シス タチンの生物学的活性を邪魔しない、例えば精製が不完全なことで生じ得る不純 物が少量存在していることを排除することを意味するものではない。

本質的に純粋な、中腸有効性を示す植物シスタチンは、それが天然に存在してい る給源から、適当な蛋白質精製技術のいずれかで単離され得る。例となる技術に は、クロマトグラフィー技術、例えばゲル濾過液クロ、イオン交換クロマトグラ フィー、高性能液クロ、逆相クロマトグラフィーなどか、或は抗シスタチン抗体 を用いた免疫学的試薬の使用が含まれる。

構成成分であるアミノ酸類から中腸有効性を示す植物シスタチンをインビトロで 合成することも可能である（ＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄＳＪ、＾ｍｅｒｉ、　Ｃｈｅ ｍ。

Ｓｏｃ、、８５：２１４９−２１５４　（１９６３）および「固相ペプチド合成 Ｊ　（Ｓｏｌｉｄ　ＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）　、Ｓｔ ｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ編集　（１９６９）参照）。このようにして製造し たペプチド類は、本分野でよく知られている操作を用いることで単離および精製 され得る（「分子生物学における最近のプロトコルＪ　（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒ ｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　、＾ｕｓｅｂ ｅｌ他編集（１９８９）およびＳａｍｂｒｏｏｋ他、「分子クローニング・実験 室マニュアル」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ　Ｍａｎｕａｌ）　（１９８９）参照）。

この中腸有効性を示す植物シスタチンのアミノ酸配列全体を測定して合成するこ とも可能であるが、この中腸有効性を示す植物シスタチン遺伝子の配列全体を単 離するのが好適である。よく知られている技術を用い、染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡ または合成源のＤＮＡから、中腸有効性を示す植物シスタチンをコード化するＤ ＮＡを調製することができる。

標準技術を用いて、中腸有効性を示す植物シスタチンをコード化するゲノムＤＮ Ａを単離することも可能である（上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）　）。

本発明の一部として特に包含されるものは、その中腸有効性を示す植物シスタチ ン遺伝子並びにそれの５゛および３°フランキング領域の対立変異体形態をコー ド化するゲノムＤＮＡ配列である。プライマーを用い、そしてポリメラーゼ連鎖 反応（ＰＣＲ）により、配列に特異的なオリゴヌクレオチド類を用いてＤＮＡを インビトロで指数増幅させることも可能である（Ｍｕｌｌｉｓ他、Ｍｅｔｈ、　 Ｅｎｚ、、　１５５：３３５−３５０　（１９８７）；　）ｌｏｒｔｏｎ他、Ｇ ｅｎｅ、　７７：６１　（１９８９）　；およびｒＰｃＲ技術：　ＤＮＡ増幅の 原理および応用」（ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａ ｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ ｎ）　、Ｅｒｌｉｃｈ編集（１９８９）参照）。

植物の非特異的脂質であるアシルヒドロラーゼをコード化するＤＮＡ単離物もま た、相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）ライブラリーから入手可能である。ｃＤＮＡ調 合物を組換え型ベクターに結合させることで、遺伝子ライブラリーを生じさせる 。また、これらのｃＤＮＡをλｇｔｌｌの如きベクター内で発現させた後、その 中腸有効性を示す植物シスタチンに対する抗体を用いてこのライブラリーのスク リーニングを行ってもよい。

当該技術分野でよく知られている技術により、適切なオリゴヌクレオチドか或は １組のオリゴヌクレオチド類を用いて、そのゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブ ラリーをスクリーニングすることができる。所望配列の検出を容易にする目的で 、このオリゴヌクレオチドプローブを、検出可能な物理的もしくは化学的特性を 有する何らかの材料で標識してもよい。これらの所望配列を単離し、精製した後 、配列決定する一般的操作は、当該技術分野でよく知られている（上記［分子生 物学における最近のプロトコルＪ　（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉ ｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　（１９８９）および上記Ｓａｍｂ ｒｏｏｋ他（１９８９）参照）。

中腸有効性を示す植物シスタチンをコード化し得る遺伝配列を得る代替方法は、 興味の持たれている遺伝配列を決定した後、オリゴヌクレオチド合成でそれを製 造する方法である（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ著ｒＤＮＡおよびＲＮＡの方法論ｊ　（ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ＤＮＡ　ａｎｄ　ＲＮＡ）　、Ｗｅｉｓｓｍａ ｎ編集（１９８３）；　Ｂ６Ｂｕｃａｇｅ他、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔ ｔｅｒｓ、　２２：１８５９−１９６２　（１９８１）参照）。１組のオリゴヌ クレオチド類を合成することで、１組のオーバーラツプしたフラグメントを生じ させ、これをアニールして結合させると、この遺伝子の両方のストランドが得ら れる。次に、これらのフラグメントを、よく知られている技術を用いてアニール して一緒に結合させる（上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８２）参照）。また、標 的ＤＮＡとハイブリッド形成しないいわゆる「ワッギングテール（ｗａｇｇｉｎ ｇ　ｔａｉｌ）　Ｊを有するプライマーを合成することによってその遺伝子を生 じさせた後、これらのゲノム配列を増幅させ、そしてオーバーラツプエクステン ション（ｏｖｅｒｌａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）で互いにスプライスする（）Ｉ ｏｒｔｏｎ他、Ｇｅｎｅ、　？７：６１−６８　（１９８９））。

その得られる予測した大きさを有するＤＮＡフラグメントを電気泳動で単離した 後、増幅および更に一層の操作に適切なりローニング用ベクターの中に結合させ る（上記Ｍｕｌｌｉｓ他（１９８７）　；および上記ｒＰＣＲ技術：ＤＮＡ増幅 の原理および応用」参照）。

勿論、その単離した配列の中に修飾物を組み込むことも可能であり、これらには 、種々の限定された数のヌクレオチド類の付加、欠失または非保存置換か、或は 数多（のヌクレオチド類の保存置換が含まれるが、但し適当な読み枠が保持され ることを条件とする。翻訳の停止および開始シグナルを適当な地点に加え、そし て便利なりローニング部位を作り出す配列をその末端に加える。オリゴヌクレオ チド配列を修飾する例となる技術には、ポリヌクレオチドを仲介させた部位特異 的変異誘発が含まれる（Ｚｏ１１ｅｒ他、ＤＮＡ、３：４７９−４８８　（１９ ８４）；　Ｉ’ｌｉｇｕｃｈｉ他、Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓＲｅｓ、、１６：７３ ５１−７３６７　（１９８８）；上記Ｈｏ他、Ｇｅｎｅ　（１９８９）；上記Ｈ ｏｒｔｏｎ他（１９８９）　；およびｒＰＣＲ技術：ＤＮＡ増幅の原理および応 用Ｊ　、Ｅｒｌｉｃｈ編集、（１９８９）参照）。

上記遺伝配列の更に一層の特徴付けを行うためには、その配列を適切な宿主の中 に導入して、これらの配列がコード化する蛋白質を発現させ、そしてそれらが中 腸有効性を示す植物シスタチンの特質を有していることを確認するのが望ましい 。上記操作に関する技術は本分野でよく知られており、そして上記Ｓａ＋ｎｂｒ ｏｏｋ他（１９８９）によって開示された。

ウィルス類、原核細胞および真核細胞の形質転換を行うためのベクター類は入手 可能であるか、或は容易に調製され得る。一般に、プラスミドまたはウィルスの ベクター類は、与えられた宿主の中で非相同ＤＮＡ配列を維持しそして発現する に必要とされるＤＮＡ制御配列の全てを含んでいるべきである。上記制御配列に は、一般に、プロモーター配列、転写の開始もしくはリーダー配列、翻訳開始− シグナルコドンの遺伝情報を指定するＤＮＡ配列、翻訳ターミネータ−コドン、 並びにＤＮＡ合成および／またはメツセンジャーＲＮＡ修飾の終了を制御するシ グナルを含んでいる３°非翻訳領域の遺伝情報を指定するＤＮＡ配列が含まれる 。最後に、これらのベクター類は、望ましくは、このベクターを含んでいる宿主 細胞の同定を可能にする表現型特性を与え得るマーカー遺伝子と、５′非翻訳領 域内のイントロン、例えばｍＲＮＡを一定した状態レベルで増強するトウモロコ シのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来のイントロン１などを有しているべ きである。

例となる宿主細胞には原核生物株と真核生物株が含まれる。選択した宿主細胞を 形質転換するに適当な操作は、用いる宿主細胞に従って選択され得る。今日まで の経験を基にすると、形質転換方法それ自身に帰すべき遺伝子発現における差は 、細胞の中に挿入された時点ではほとんどないと見られる。

宿主細胞の中に生物学的材料を導入するに通常な技術には、エレクトロポレーシ ョン［ＳｈｉｇｅｋａｗａおよびＤｏｗｅｒ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、 　６：７４２（１９８８）；Ｍｉｌｌｅｒ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８５：８５６−８６０　（１９８８）；およびＰｏｗ ｅｌｌ他、＾ｐｐ１．　Ｅｎｖｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、５４：６５ ５−６６０　（１９８８）参照］　：直接ＤＮＡ吸収メカニズム［Ｍａｎｄｅｌ およびＨｉｇａｌＪ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、５３　：１５９−１６２　（１ ９７２）；　Ｄｉｔｙａｔｋｉｎ他、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈ ｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ、　２８１：３１９−３２３　（１９７２）　：　ｆｉｇ ｌｅｒ他、Ｃｅ１ｌ、１６：７７　（１９７９）：およびＵｃｈｉｍｉｙａ他、 Ｐｒ。

ｃ、　５ｔｈ　Ｉｎｔｌ、　Ｃｏｎｇ、　Ｐｌａｎｔ　Ｔｉ５ｓｕｅ　ａｎｄ　 Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　（１９８２）　、Ａ　Ｆｕｊｉｗａｒａｍ集、　Ｊ ａｐ　八５ｓｏｃ、ｆｏｒ　Ｐｌａｎｔ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、Ｔｏ ｋｙｏ、　５０７−５０８頁参照］　：融合メカニズム［Ｕ（ｈｉｄａｚ他［生 存可能哺乳動物細胞への巨大分子の導入Ｊ　（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ 　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　Ｉｎｔｏ　Ｖｉａｂｌｅ　Ｍａｎｎａｌｉａ ｎ　Ｃｅ１ｌｓＳＣ，Ｂａｓｅｒｇａ、　Ｇ、　ＣｒｏｓｅおよびＧ、　Ｒｏｖ ｅｒａ編集、Ｗｉｓｔａｒ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　５ｅｒｉｅｓ、　１巻、＾、 　Ｒ，Ｌｉ５ｓ　Ｉｎｃ、、ＮＹ、　１６９−１８５頁（１９８０）参照］；感 染剤［Ｆｒａｌｅｙ他、ＣＲＣＣｒ１ｔ、　Ｒｅｖ、　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ、、 ４：１−４６　（１９８６）；および＾ｎｄｅｒｓｏｎ、　５ｃｉｅｎｃｅ、２ ２６：４０１−４０９　（１９８４）参照］　；ミクロインジェクションメカニ ズム［Ｃｒｏｓｓｗａｙ他、Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、、２０２：１７ ９−１８５　（１９８６）参照］　；および高速発射メカニズム［ＥＰＯＯ４０ ５６９６参照］が含まれる。

通常、修飾されていない有機体に対して所望の有機体を選択することを可能にす る選択技術を用い、通常の方法に従って、形質転換細胞を単離する。一般に、形 質転換を行った後の宿主細胞を、マーカー遺伝子の発現を可能にする約４８時間 に渡って増殖させる。次に、これらの細胞を、選択性を示しモして／またはスク リーニング可能な培地の中に入れ、ここで、死滅か或は生化学特性を用いて、形 質転換した細胞から形質転換していない細胞を区別する。免疫プロット分析、酵 素連結免疫吸収剤アッセイ、ラジオイムノアッセイ、または蛍光活性化細胞ソー ター分析、イムノヒストケミストリーなどのアッセイ分析技術を用いて、その選 択した細胞を、中腸有効性を示す植物シスタチンの発現に関してスクリーニング することができる。次に、この形質転換した組織を、昆虫制御活性に関して試験 する。

宿主細胞を形質転換することで１つの給源を得ることが可能であり、これを用い て、興味の持たれている遺伝子を含んでいるベクターを有意量で単離した１麦、 これを次に、所望の宿主細胞の中に導入するか、或はそれに関する蛋白質を有意 量で発現させて単離することができる。例となる組換え型宿主細胞には、単細胞 の原核生物株と真核生物株が含まれる。宿主として用いられ得る原核微生物には 、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ。

１ｉ）および他の腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）　、バ チルス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）および種々のンユードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ ｎａｓ）が含まれる。通常の真核微生物には、ビール酵母菌（Ｓａｃｃｈｒｏｍ ｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピチア・バストリス（Ｐｉｃｈｉａ　 ｐａｓｔｏｒｉｓ）が含まれる。通常の高等真核宿主細胞には、５ｐ２１０また はＣＨＯ細胞が含まれる。他の好適な宿主は、昆虫の細胞、例えばドロソフィラ （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）幼虫であり、ここで、このベクターは、ドロソフィラ のアルコールデヒドロゲナーゼプロモーターを含んでいる。二者択一的に、バキ ュロウィルスベクター、例えばオートグラフ７”カリホルニヵ（Ａｕｔｏｇｒａ ｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）の核ポリへドロシス（ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓ ｉｓ）ウィルス（Ｍｉｌｌｅｒ他、５ｃｉｅｎｃｅ、　２１９ニア１５−７２１ 　（１９８３）参照）を工学処理して、培養した昆虫細胞の中でその中腸有効性 を示す植物シスタチンを多量に発現させることも可能である（Ａｎｄｒｅｖｓ他 、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ、２５２：１９９−２０６　（１９８８）参照）。

本発明は、消化システィンプロテアーゼ類を有する昆虫による外寄生に感受性を 示す植物またはそれらの一部に投与するための農学組成物を提供するものであり 、上記農学組成物は、中腸有効性を示す植物シスタチンを含んでいる。しばしば 、この農学組成物は、農学的に許容される担体を含んでいる。この言葉「農学的 に許容される担体」は、活性化合物の有効性を悪化させることな（その組成物の 中にこの化合物を溶解させるか、分散させるか或は拡散させる目的で用いられ得 るものであると共に、それら自身、土壌、装置、作物または農業経営環境に悪影 響を示さない物質を意味している。

この農学組成物は、粉末、結晶、警濁液、粉、ペレット、顆粒、カプセル封じ、 ミクロカプセル封じ、エーロゾル、溶液、ゲルまたは他の分散液を含む幅広い種 類の形態で用いられ得る。適当な液状もしくは固体状担体に加えて、乳化剤、湿 潤剤、展着剤、分散剤、粘着剤、或は通常の農学実施に従って昆虫の食餌を刺激 する薬剤の如きアジュバントを組酸物の中に含有させてもよい。殺昆虫剤を調合 するためのアジュバントは本分野の技術者によ（知られている。

牛腸有効性を示す植物シスタチンの濃度は、その特別な組成の性質、詳細にはそ れが濃縮されているか或はそれを直接用いるかに応じて、幅広く変化し得る。こ の牛腸有効性を示す植物シスタチンは、一般に少なくとも１重量％の量で存在し ており、そしてこれは１００重量％に及んでもよい。

この農学組成物の提示は、植物または植物の一部に直接か或はそれの近くに外部 投与することによって達成され得る。これらの農学組成物は、噴霧、粉付け、ス プリンクラ−の使用などによって、この昆虫有害生物（類）の環境、例えば植物 、土壌または水に投与され得る。

本発明は更に、その牛腸有効性を示す植物シスタチンをコード化する遺伝子で形 質転換した組換え型宿主（例えば微生物宿主および昆虫のウィルス）を用い、こ れらを、標的昆虫による攻撃に敏感な選択された植物または植物の一部の上か或 はその近くに投与することを意図している。

昆虫の外寄生に感受性を示す植物組織にコロニー形成し得るが或はその牛腸有効 性を示す植物シスタチンを含んでいる死滅しているが或は生存能力のない細胞と して投与され得る、宿主を選択する。特に興味の持たれる微生物宿主は、原核生 物および下等な真核生物、例えば菌・カビである。

牛腸有効性を示す植物シスタチンをカプセル封じする微生物宿主の特質には、こ の蛋白質を保護する性質、例えば細胞壁が厚いこと、染色されること、並びに封 入体の細胞内包装または生成１葉への親和性；哺乳動物毒性がないこと、有害生 物に摂取させる誘引性、この牛腸有効性を示す植物シスタチンに損傷を与えるこ となく殺して固定するのが容易なこと；並びにこの牛腸有効性を示す植物シスタ チンが示す活性を長引かせるように処理され得ること；などが含まれる。植物に コロニー形成する微生物宿主の特質には、植物毒性がないこと：牛腸有効性を示 す植物シスタチンをコード化する遺伝配列を導入することが容易なこと；発現系 が利用できること；発現の効力、並びにこの殺昆虫剤が宿主の中で安定なことが 含まれる。

グラム陰性およびグラム陽性両方の説明的原核生物には、腸内細菌科、例えばエ シェリキア科（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ）　；バチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａ ｅ）　；リゾポス科（Ｒｈｉｚｏｂｏｃｅａｅ）　、例えばリゾビウム（Ｒｈｉ ｚｏｂｉｕｍ）およびリゾバクター（Ｒｈｉｚｏｂａｃｔｅｒ）　；螺旋画材（ Ｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ）　（例えば発光菌属（ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕ ｍ）　）　、ジモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）　、セラチア属（Ｓｅｒｒａ ｔｉａ）　、アエロモナス属（＾ｅｒｏｍｏｎａｓ）　、ビブリオ属（Ｖｉｂｒ ｉｏ）、デスルホビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）　、スピリルム属 （Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）など：乳酸かん菊科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａ ｅ）　；シュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍ。

ｎａｄａｃｅａｅ）　（例えばシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）お よびアセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）　）　；アゾトバクタ−科（ Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）およびニトロバクタ−科（Ｎｉｔｒｏｂａ ｃｔｅｒａｃｅａｅ）などが含まれる。真核生物の中には、菌・カビ（例えば藻 菌類（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）および子のう囲網（＾ｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ ）があり、これらには酵母菌（例えばサツカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ ｃｅｓ）およびシゾサツカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｓ）および担子画調（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）の酵母菌（例えばロドト ルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）　、アウレオバシジウム（＾ｕｒｅｏｂａｓｉ ｄｉｕｍ）　、スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）　）などが 含まれる。

本発明はまた、牛腸有効性を示す植物シスタチンをコード化する遺伝子を含んで いるバキュロウィルスの使用も意図している。ヘリオチス・ビレセンス（１’１ ｅｌｉｏｔｈｉｓ　ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）　（わたのみむし）、オルギラ・シュ ードラガタ（Ｏｒｇｙｌａ　ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ）　（アメリカ松の毒 蛾）、リマントリア・ジスバー（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ　ｄｉｓｐａｒ）　（まい まい蛾）、オートグラフイカ・カリホルニカ（＾ｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ　ｃａ ｉｉｆｏｒｎｉｃａ）　（アルファルファの尺とり虫）、ネオジプリオン・セル チフ７−　（Ｎｅｏｄｉｐｒｉｏｎ　５ｅｒｔｉｆｅｒ）　（ヨーロッパ松蝿） およびラスペイレシア・ポモネラ（Ｌａｓｐｅｙｒｅｓｊａ　ｐｏｍｏｎｅｌｌ ａ）　（心食い蛾）などに感染するものを含むバキュロウィルス類が登録されて おり、そして有害生物防除剤として用いられている（ｔｌｓ　４．７４５゜０５ １およびＥＰ　１７５８５２参照）。

この組換え型宿主は種々の方法で調合され得る。これは、湿潤可能粉剤、粒剤ま たは粉伺は剤の中で用いられ得るか、或は種々の不活性材料、例えば無機鉱物（ 葉状ケイ酸塩、炭酸塩、硫酸塩、燐酸塩など）、または植物材料（粉末にしたト ウモロコシの穂軸、米の外被、くるみの殻など）と混合することで用いられ得る 。この調合物は、展着−増粘アジュバント、安定剤、他の殺昆虫添加剤、界面活 性剤、並びに細菌細胞の増殖を増強するか或は安定化する細菌栄養素および他の 薬剤を含んでいてもよい。液状調合物は、水を基にしているか或は非水系であっ てもよく、そして泡状物、ゲル、懸濁液、乳化可能濃縮物などとして用いられ得 る。

これらの材料は、流動剤、界面活性剤、乳化剤、分散剤またはポリマーを含んで いてもよい。

また、この牛腸有効性を示す植物シスタチンは、植物への感染過程を通して昆虫 がその選択した牛腸有効性を示す植物シスタチンを昆虫制御量で消費するように 、感受性を示す植物の組織の中に組み込まれ得る。

これを行う１つの方法は、その感受性を示す植物に全身投与するに適合した、植 物毒性を示さない賦形剤の中に、この牛腸有効性を示す植物シスタチンを組み込 むことである。しかしながら、牛腸有効性を示す植物シスタチンの遺伝情報を指 定する遺伝子を単離することが可能なことから、本発明は、好適な具体例におい て、牛腸有効性を示す植物シスタチンを生物学的に合成して、昆虫による攻撃に 対して新規または追加的保護メカニズムをこれらの植物に与える能力を有する、 形質転換した植物を意図している。

本発明は、（ａ）感受性を示す分類群からの少なくとも１種の植物から得られる 細胞または組織を培養し、（ｂ）この細胞または組織培養物の細胞の中に、該牛 腸有効性を示す植物シスタチン遺伝子を該細胞中で発現させる植物調節配列に実 施可能様式で連結させた、牛腸有効性を示す植物シスタチンをコード化する構造 遺伝子を導入し、そして（ｃ）この細胞または組織培養物から、昆虫に耐性を示 す全体植物を再生させる、ことを含む、消化システィンプロテアーゼ類を有する 昆虫による昆虫の外寄生に対する耐性を上記分類群の植物に与える方法を提供す る。

明らかに、牛腸有効性を示す植物シスタチン類が特異的に高い量で発現すること は、その植物それ自身にとって有害であり得る。選択された小器官の中に分泌さ せるか或は隔離させるシグナル配列を用いることにより、この蛋白質が昆虫病原 体の腸環境内に放出されるまで、これを代謝的に不活性な所に位置させることが 可能になる。更に、ある種の蛋白質は、シトシルの中に貯蔵されるよりはむしろ 細胞から分泌される時、形質転換した植物の中により高いレベルで蓄積する（Ｈ ｉａｔｔ他、Ｎａｔｕｒｅ。

３４２ニア６−７８　（１９８９）　）。

このＤＮＡ配列は、一般に、標的有機体のそれとは異なる種の植物由来の、中腸 有効性を示す植物シスタチンを基とするものであるか、或はそれに相同性を示す 実質的配列を有するものである。しかしながら、このＤＮＡ配列が、標的植物の それと同じ種の植物を基とするものであるか、或はそれを基とする中腸有効性を 示す植物シスタチンに相同性を示す実質的配列を有する場合、上記配列は有意に 多い量で発現され得る。

上記システムの転写および翻訳効率を最適にする目的で、コドンの使用頻度を試 験しそしてとのコドンが、本質的に、その植物の中に通常存在している転写およ び翻訳システム内で好適であるかを決定することも可能である。このような好適 使用コドンを用いることで、蛋白質コーディング配列を構築することも可能であ り、これにより、その供与植物の未修飾形態の中に直接そのコーディング配列を 入れることによって達成されるレベルに比較して、その中腸有効性を示す植物シ スタチン遺伝子の転写および關訳効率のレベルが有意に増強され得る。

一般に、形質転換技術のいずれかを用いた非相同性遺伝子の挿入はランダムにな ると見られるが、しかしながら、ＤＮＡを部位特異的に組換えて植物細胞の中に 入れた植物を作り出す技術が現在存在している（国際公開第９１０９９５７号参 照）。植物細胞の中に挿入された外来遺伝子が示す活性は、挿入された個々の遺 伝子が示す発現特質に依存しており、これは、制御領域（プロモーター、ポリア デニル化領域、エンハンサ−など）の結果であると共にキメラ挿入断片に隣接し ている内因性植物ＤＮＡの影響の結果であり、そしてそのコピー数によって生じ る。

選択するプロモーターは、蛋白質を昆虫制御量で産生させるに充分な発現を生じ させる能力を有するべきである。適切なプロモーターには、植物中で天然に発現 する遺伝子から誘導されるものと、過多か或は非相同性を示すエンハンサ−配列 を含んでいてもよい合成プロモーター配列の両方が含まれ得る。この配列を植物 源から誘導する場合、その特別な遺伝子に自然にコンジュゲートしている５′お よび３゛の非翻訳領域を用いることができる。植物細胞の中で活性を示す数多く のプロモーターの中には、アグロバクテリウム・ツメファシェンスの腫瘍誘発プ ラスミドから得られるツバリンシンターゼ、オクトビンシンターゼおよびマンノ ピンシンターゼプロモーターが含まれる。

殺昆虫量よりは少ない量であるが中腸有効性を示す植物シスタチンを産生ずる種 では、同じ植物内、並びにそれを誘導するための組織内で、その中腸有効性を示 す植物シスタチンを過剰発現させるのが好適であり、ここでは、この中腸有効性 を示す植物シスタチンを、通常に見いだされるレベルよりも有意に高いレベルで 発現させる。有意に高いレベルは、この中腸有効性を示す植物シスタチンを、同 じ種の未形質転換植物の中で通常に見いだされるレベルよりも少な（とも５０％ 高い１ノベルで産生ずることを意味している。従って、本発明は、この形質転換 した植物が昆虫有害生物に対して高い抵抗力を示すようにする構成プロモーター を意図している。構成プロモーターの例には、ＣａＭＶ１９Ｓおよび３５Ｓプロ モーター（特開昭６３−２８７４５８号）、ユビキチンプロモーター、ライスア クチンプロモーター（国際公開第９Ｈ！９９４８号）が含まれる。

昆虫が通常に外寄生する組織の中で産生されないか或はその組織に分配されない 、先天的、中腸有効性を示す植物シスタチンを産生ずる種では、組織に特異的な プロモーターを用いて、この中腸有効性を示す植物シスタチンを局所的に発現さ せるか或は過剰産生させることができる。

組織に特異的なプロモーターの例には、根に特異的なプロモーター、例えばトウ モロコシのメタロチオネイン（ヨーロッパ特許第４５２２６９号）、根に特異的 なプロモーター（国際公開第９１１３９９２号）、植物の種子貯蔵体のプロモー ター（国際公開第９１１３９９３号）、およびアルコールデヒドロゲナーゼ−１ プロモーターが含まれる。光透発性を示すことが知られているプロモーターには 、大豆から得られるリブロース−１，５，−ビスホスフェートカルボキシラーゼ の小型サブユニット（Ｓ　Ｓ）をコード化する遺伝子のプロモーター、並びに青 葉内のクロロフィルａ／ｂ結合蛋白質をコード化する遺伝子のプロモーターが含 まれる（Ｃｏｒｕｚｚｉ他、ＪＢｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２５８：１３９９　（１ ９８３）；およびＤｕｎｓｍｕｉｒ他、Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ａ ｐｐ、　Ｇｅｎ、、２：２８５　（１９８３））。

最後に、創傷または病原体誘発性プロモーターを用いることで、組織が植物有害 生物の攻撃を受けた時にこの中腸有効性を示す植物シスタチンを発現させるよう にすることができる。創傷または病原体誘発性プロモーターの例には、プロテイ ナーゼ阻害剤ＩＩプロモーターが含まれる。

植物組織およびプロトプラストを形質転換するに適切なベクター類は、文献の中 に記述されていると共にそこに列挙されており（ｄｅＦｒａｍｍｏｎｄ他、Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１：２６２　（１９８３）；　Ａｎ他、ＥＭＢＯＪ、 　４：２７７　（１９８５）；　Ｐｏｔｒｙｋｕｓ池、Ｍｏｌ、　Ｇｅｎ、　Ｇ ｅｎｅｔ、　１９９：１８３　（１９８５）；　Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ他、Ｇｅｎ ｅ、５３：１５３（１９８７）；　ｔｏ　９０１０８８２９およびＷｏ　８４１ ０２９１３参照）、そして好適な態様において、ｐＤＡＢ２１９Δ−Ｎｏｔ（実 施例に記述する如き）である□実施において、その選択性マーカー遺伝子をつな ぎ止めるベクターは、興味の持たれている遺伝子を必ずしも含んでいる必要はな い。むしろ、上記ベクターの共形質転換を用いて、植物細胞を形質転換すること ができる。

成熟した形質転換植物を生産するに適当な操作は、使用する植物種に従って選択 され得る。再生は、植物の種から種で変化する。効率の良い再生は、培地、遺伝 子型、並びに培養物の履歴に依存している。全体植物が得られたならば、繁殖の 子孫細胞の中にその配列の少なくとも１つのコピーを存在させるような様式で、 これらを性的もしくはクローン的に繁殖させ得る。上記操作は、用いる植物種に 従って選択され得る。

これらの形質転換した植物細胞から発育した成熟植物を自殖させて、自殖植物を 生じさせる。二倍体植物の場合、典型的には、一方の親を形質転換させ、そして もう一方の親を野生型にしてもよい。この親を交雑させて、第一世代のハイブリ ッド（Ｆ、）を作り出し、これらを自殖させて、第二世代のハイブリッド（Ｆ２ ）を作り出す。中腸有効性を示す植物シスタチン／牛腸有効性を示す植物シスタ チンの遺伝的メーキャプを有するＦ２ハイブリッドを選択して自殖させることに より、自殖植物を生じさせる。

交雑および戻し交雑を通してその中腸有効性を示す植物シスタチン構造遺伝子を 転移させる目的で、通常の植物品種改良方法を用いることができる。上記方法は 、（ａ）昆虫に感受性を示す変種から得られる植物と、昆虫に耐性を示す植物と を性的に交雑させ、（ｂ）この交雑の子孫から繁殖用材料を回収し、そして（Ｃ ）この繁殖材料を用いて昆虫に耐性を示す植物を発育させる、更に一層の段階を 含んでいる。望ましいか或は必要とされている場合、この子孫の中に、昆虫耐性 を与える遺伝子と共にその感受性を示す変種の特質が所望パーセントで存在する まで、繰り返して、（ｄ）その感受性を示す変種から得られる昆虫に感受性を示 す植物と、昆虫に耐性を示す子孫とを戻し交雑させ、モして（ｅ）この戻し交雑 の子孫の中から昆虫耐性の発現（または関連したマーカー遺伝子）を選択する、 更に一層の段階を含む、上記方法を延長することによって、その感受性を示す変 種が有する農業経営的特質を本質的に保存することができる。その結果として、 本発明に従う自殖体を、別の０殖系と交雑させて、ハイブリッドを生じさせるこ とも可能である。

本発明は更に、標的有害生物のスペクトルを広げるか、この牛腸有効性を示す植 物シスタチンが示す有効期間を延ばすか、或はこの牛腸有効性を示す植物シスタ チンを含んでいる農学組成物を安定化させる補助を行う努力の中で、この牛腸有 効性を示す植物シスタチンと共に、アジュバント、化学添加剤または生物学添加 剤を用いることを意図している。

例となる増強剤には、レクチン類、両親媒性蛋白質、または相補的プロテイナー ゼ阻害剤が含まれる。例えば、他の防御蛋白質存在下で１種以上の防御蛋白質が 存在していると、これは昆虫攻撃に対する植物防御で重要な役割を果し得る。半 し目およびしようし目昆虫は、特定のプロテイナーゼ阻害剤を高レベルで含んで いる食物の蛋白質消化に関して、代替経路を発展させることは知られている。Ｋ ｕｎｉｔｚ型の阻害剤、Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ阻害剤、大麦トリジョン阻害剤 、ジャガ芋阻害剤ｌおよびＩＩ、カポチャ阻害剤、Ｒａｇｉ　１−２／　トウモ ロコシの三機能的阻害剤、カルボキシペプチダーゼＡおよびＢ阻害剤、並びにア スバルチルプロテイナーゼ阻害剤などの集団からの阻害剤を含有させるのが有利 であり得る（Ｒｙａｎ、Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｐｈｔｙｏｐａｔｈｏｌ、２８ ＋４２５−４９　（１９９０）参照）。

本発明は、消化ンステインプロテアーゼ類を有する昆虫、特にコーンルートワー ム、メキシカンビーンビートル、レッドフラワービートル、コンヒューズドフラ ワービートル、フジマメのそうむし、わたのぞうむし、コロラドじゃがいもはむ し、スリーラインドボテドビートル、米のぞうむし、とうもろこしのそうむし、 穀倉のそうむし、レッサーグレインボアラ、のみとびよろいむし、エジプトアル ファルファのそうむし、豆のぞうむし、イエローミールワーム、アスパラガスビ ートルおよびかめむしなどの１種以上による外寄生および損傷に感受性を示す分 類群の如何なる植物も保護することを意図している。言葉「分類群」は、ここで は、植物学分類分けの属またはそれ以下の単位を意味している。従って、これに は、属、種、品種、変種、変異型、並びに一致した学名が不足している他の少数 系統群が含まれる。

例となる植物には、トウモロコシ、モロコシ、トマト、ジャガ芋、綿、大豆、乾 燥豆、菜種、アルファルファ、アスパラガスおよびサツマイモが含まれる。しか しながら、これらの昆虫は他の特定の作物に外寄生する可能性があることから、 それに限定するものと見なされるべきではない。従って、本発明の方法は、上に 挙げた植物種に感受性を示すことが見いだされたならば、数多くの植物種に容易 に適用可能であり、これらの植物種には、これに限定されるものではないが、メ デイカゴ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）、シロッメグサ（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ）　、ビグ ナ（Ｖｉｇｎａ）　、シトラス（Ｃｉｔｒｕｓ）　、ダウカス（Ｄａｕｃｕｓ） 　、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）　、ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃ ａ）　、ラファナス（Ｒａｐｈａｎｕｓ）　、シナビス（Ｓｉｎａｐｉｓ）　、 トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）　、リコベルシコン（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏ ｎ）　、ニコチニア（Ｎｉｃｏｔｉｎｉａ）　、ナス（Ｓｏｌａｎｕｎ＋）　、 ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）　、ブロムス（Ｂｒｏｍｕｓ）　、アスパラ ガス（＾ｓｐａｒａｇｕｓ）　、バニクム（Ｐａｎｉｃｕｍ）　、ペニセタム（ Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）　、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ）　、ダイス（Ｇｌｙｃ ｉｎｅ）　、口１功ム（ＬＯｌｉｕｌｌｌ）、トリチクム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ） およびトウモロコシ（Ｚｅａ）などの属の種が含まれる。

衷塵撚 以下の実施例を用いて本発明を更に詳しく説明する。これらの実施伊１は説明の 目的のみであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

全ての部およびノ（−セントは、特に明記されてし）なし１限り重量である。全 てのＤＮＡ配列は、通常通り５′力Ｘら３°の方向に示す。全てのアミノ酸配列 は、通常通りアミノ末端からカルボン酸末端の方向に示す。

実施例トジャガ芋パパイン阻害剤の精製および特徴付けＡ、精製 本質的に文献（上記ＲｏｄｉｓおよびＤｏｆｆ、　（１９８４）　）　ｌこに２ 述されて（するように、マーケットで購入したジャガ芋塊茎の皮からジャガ芋／ ＜ツクインｌ且害剤（ＰＰＩ）を精製した。典型的な収量は、１０ポンドの塊茎 力Ａら得られる皮を用いて純粋なＰＰＩで１０−５０ｍｇであった。精製１麦、 この蛋白質は、ドデシル硫酸ナトリウムーポリアクｌＪ７レアミドゲル電気泳動 法と共にイオン交換および逆相高性能液クロで測定して同質であつｔこ。

Ｂ、蛋白質限定加水分解によるＰＰＩのフラグメント化ヒＰＰＩをフラグメント 化して、より小さいポリペプチド類を生じさせたが、これらは、５ＱｍＭのトリ ス緩衝液、ｐＨ７，５の中で２時間３７℃で、ＰＰＩとトリプシン［Ｌ−１−ク ロロ−計（４−トシルアミド）−７−アミノ−２−ヘプタノン知ライドで処理し た］とを２０＝１（重量を基準）のＰＰＩ：ｌ−リブシン比で培養した時システ ィンプロテアーゼ類を阻害する能力を保持していた。これによって、〜１０ｋＤ のポリペプチド類と〜３２ｋＤのポリペプチド類から成る安定な集団が生じた。

ＰＰＩのフラグメント化はまた、同じ条件を用い、キモトリプシン、スブチリシ ンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、プロテアーゼにおよびサーモリシンの如き他のプロテア ーゼ類を用いることでも達成された。このような場合、１０ｋＤ種に加えて、２ ２ｋＤ　（３２ｋＤではなく）種が放出された。

トリプシンで処理したＰＰＩを、５ｕｐｅｒｏｓｅ　１２カラム（Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ　Ｌ）［Ｂ。

Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）使用サイズエクスクル−ジョンクロマトグラフ ィーで分別した。これによって、２つのピークが得られ、その１番目のものは、 〜３２ｋＤ種を含んでおり、そして２番目のものは〜１０ｋＤ種を含んでいる。

これらを更に、２０ｍＭのトリス（ｐＨ７，５）中で平衡にしそして１ｍＬ／分 の流量で３０分かけて０−１５０ｍＭのＮａＣ１勾配で展開したＭｏｎｏ　Ｑ　 ＨＲＴＭ５　／　５カラム使用イオン交換クロマトグラフイーで精製した。これ らの得られるフラグメント（２種の〜３２ｋＤ種および６種の〜１０ｋＤ種）は 全て、パパインおよびジアブロチカ腸プロテアーゼの可能な阻害剤である（実施 例２参照）。

０．１％のトリフルオロ酢酸中で平衡にしそして０−６０％のアセトニトリル勾 配で展開したＶｙｄａｃ　ＣＪカラム使用逆相クロマトグラフィーにより、トリ プシンで消化させたＰＰＩもまた分離させた。これにより、〜１０ｋＤのポリペ プチド類を含んでいる５つのピーク（ＰＰＩ−１０に−１から５と名付ける）お よび〜３２ｋＤのポリペプチド類を含んでいる２つのピーク（ＰＰＩ−３２にお よびＰＰｌ−３３にと名付ける）が得られた。

Ｃ，ＰＰＩおよびトリプシンフラグメントに関する化学量論および阻害定数 ＰＰＩを種々の量で存在させてパパインの阻害を監視することにより、このポリ ペプチドの阻害活性を評価した。「蛋白分解酵素：実用アプローチＪ　（Ｐｒｏ ｔｅｏｌｙｔｉｃ　Ｅｎｚｙｍｅｓ：　ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａ ｃｈ）　、Ｒ，Ｊ、　Ｂｅｎｙ。

ｎおよびＪ、　Ｓ、Ｂｏｎｄ編集（１９８９）、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮＹの 中に記述されておりそして言及されている方法を用いて、パパイン活性を測定し た。基質は、アゾカゼイン、ベンゾイル−アルギニンパラ−ニトロアニリド（Ｂ ＡＰＮＡ）（分光光度測定アッセイ）またはＺ−ｐｈｅ−ａｒｇ−ＮＭｅｃ（こ こで、「Ｚ」＝ベンゾイルオキシカルボニルモしてＮＭｅｃ＝７−アミド−４− メチルクマリン）（蛍光測定アッセイ）であった。

基質としてＢＡＰＮＡを用い、ＰＰＩでパパインを滴定し、そしてパラ−ニトロ フェノールの放出を４４０ｎｍで分光光度測定的に監視することにより、２８ｐ モルのＰＰＩは化学量論的に２１７ｐモルのパパインを阻害することが示された 。典型的に、０．１ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６）　、４ｍＭのジチ オトレイトール、２ｍＭのＥＤＴＡナトリウム中のＰＰＩで、５μｇのパパイン が滴定された。領　１ｍＬのＢＡＰＮＡを用いて反応を開始させ、そして１時間 後、ミクロプレート読み機を用いて４１０の吸収を記録した。得られる化学量論 は、パパインに関しては、ＰＰ１分子当たり８個の結合部位が存在していること を示している。この化学量論は、トリプシンで処理してこの蛋白質をフラグメン ト化することで１０ｋＤおよび３２ｋＤのポリペプチド類を生じさせた後でも変 化せず、このことは、ンステインブロテアーゼを阻害する能力は蛋白質限定加水 分解後でも維持されることを示している。

Ｚ−Ｐｈ　ｅ−Ａ　ｒ　ｇ−ＮＭｅ　ｃを用いた高感度蛍光測定アッセイ（Ｂａ ｒｒｅｔｔおよびＫｉｒｓｃｈｋｅＳＭｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｌｏｌ、、８ｏ 、５４０−５４１　（１９８１）を修正）により、ＰＰｌ−８７に、ＰＰｌ−１ ０におよびＰＰｌ−３２Ｋに関する、パパインに対する阻害定数（Ｋｉ値）を測 定した。最初に、最終基質濃度を２０ａＭにし、種々のＰＰＩ濃度（１０−１０ ０ｎｇ）を用いてパパイン（５０ｎｇ）の滴定を行うことにより、各々のポリペ プチドに関する阻害プロファイルを得た。Ｃｏ５ｔａｒマルチピペッタ−を用い てＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＮＭｅｃ　（０，２ｍＬ）を加えて最終体積を０．３ｍ Ｌにすることにより、反応を開始させた。このミクロタイタープレートとＰＰＩ が疎水相互作用を示すことで、感度が低いＢＡＰＮＡアッセイを用いた時のより 高いパパイン／阻害剤濃度で見られるデータに匹敵するデータを得るためには、 Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を０．０１％（ｖ　／　ｖ　）添加する必要があった 。このＴｒｉｔｏｎの存在有り無しは、計算したＫｉ値に明らかな影響を与えな かった。動的容量を有するＢｉｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ”データ収集ソフトウェア システムに取り付けた、Ｆｌｕｒｏｓｋａｎ　ＩＩ”蛍光ミクロタイタープレー ト読み機を用いてデータを収集した。励起および発光波長はそれぞれ３８０およ び４６０ｎｍであった。Ｋｉデータを引き出す動的検定を、典型的に、３０．５ ０および７０％のパパイン阻害レベルが得られるに必要な阻害剤濃度、および１ から２０μＭの範囲の基質濃度で行った。ＰＰｌ−８７に、ＰＰｌ−３２におよ びＰＰｌ−１０Ｋに関するＫｉ値はそれぞれ０．１（士領　０１）、０．７（± ０．０６）および０．５（±０．０２）ｎＭであり、このことは、これらのフラ グメントの阻害効力はその親分子のそれと同様であることを示している。

Ｄ、ＰＰＩおよびトリプシンフラグメントのアミノ酸配列逆相クロマトグラフィ ーで精製したＰＰＩフラグメントに、オンラインの１２０Ａ　ＰＴＨアミノ酸分 析装置が備わっているＡＢＩ　４７７液相シークエンサーを用いたＮ末端アミノ 酸配列決定を受けさせた。ＰＰ１−１０に−４およびＰＰｌ−１０に−５に関す る広域配列情報が得られた。この親８７ｋＤポリペプチド（ＰＰＩ−８７Ｋ）も また配列決定したが、これはＥｄｍａｎ分解に抵抗を示した。ＰＰｌ−１０に− ２もまたＮ末端配列決定に抵抗を示すことから、これは恐ら（は、ＰＰｌ−８７ Ｋから派生したＮ末端フラグメントであろう。ＰＰｌ−１０に−２を尿素中で変 性し、そして更にトリプシンで消化させた後、この得られるベプヂド類を逆相ク ロマトグラフィーで分離した。この精製したオリゴヌクレオチドフラグメントの ３種：　ＰＰＴ−１０に−２−７７７、ＰＰｌ−ｌ０Ｋ−２−Ｔ５１およびＰＰ ｌ−１０に−２−Ｔ３２に関しても配列決定を行った。

これらのアミノ酸配列を図３に示す。これらの配列の間には広範な相同性があり 、このことは、これらのフラグメントは全て関係していることを示している。Ｐ Ｐｌ−１０に−５から得られる広域配列データを、めん鶏の卵シスタチンおよび 米シスタチンのそれと比較した（図４）。

これらのデータは、ＰＰＩは８個のドメインを含んでおり、そしてこれらは全て 密に関係していると共に、これらは全て、システィンプロテアーゼ阻害剤のシス タチン集団の一員である。

実施例２：ＰＰＩによるジアブロチ力幼虫発育の阻害ＰＰＩは、無傷の８７ｋＤ ポリペプチドとしてか、或はより小さい１．２または３個のドメインフラグメン トに蛋白分解開裂させた後でも、プロテアーゼ阻害剤として機能する。

ジアブロチ力種の幼虫発育に対するＰＰＩの効果を下記の如く監視した：ウエル が２４個備わっているプレートの中に入っている０、２５ｍＬの人工餌（Ｒｏｓ ｅ　ａｎｄ　ＭｃＣａｂｅ、　Ｊ、　Ｅｃｏｎ、　Ｅｎｔｏｍｏｌｌ、６６：３ ９８−４００．１９７３を修正）の表面に、精製したＰＰＩ溶液（水中）を０． ０３ｍＬ付けた後、無菌フローフードの中で空気乾燥した。次に、これらのウェ ルに、殺菌した卵からふ化させた新生ササン・コーン・ルートワーム（ＳＣＲ。

Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ　ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ　ｈｏｗａｒｄｉ）を １匹外寄生させるか、或は予め重量測定した第二令ウェスタン・コーン・ルート ワーム（ＷＣＲ。

Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ　ｖｉｒｇｉｆｅｒａ　ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）を１匹外寄 生させた。次に、これらのプレートを、殺菌して密封したプラスチック製容器の 中に入れた後、最終的な重量測定を行うに先立って、２５℃に維持されている湿 った発育チャンバの中に６日間（ＳＣＲ）か或は３，５日間（ＷＣＲ）置いた。

Ａ、ＳＣＲ新生幼虫に対する効果 上に記述した如き新生ＳＣＲを用いた食餌試験において、精製したＰＰＩの濃度 を上昇させて試験を行った。ＰＰＩは、幼虫の発育に関して用量依存阻害を生じ させ、餌１ｇ当たり約０．２ｍｇの時５０％阻害が生じた（図５）。最大の阻害 が、餌１ｇ当たり２．Ｑｍｇの時観察され７９％であった。これらのデータは、 ＰＰＩがＳＣＲ新生幼虫発育の有効な阻害剤であることを示している。

Ｂ、第二令ＷＣＲおよびＳＣＲに対する効果ＷＣＲの幼虫は、人工餌では発育す ることができないことから、新生児として生物検定することはできなかった。し かしながら、第二令幼虫は人工餌で成長および発育することから、上に記述した 如（食餌試験を行った。ＰＰＩは、ＷＣＲ幼虫の発育に関して用量依存阻害を生 じさせ、餌１ｇ当たり約Ｑ、２５ｍｇのＰＰＩの時５０％阻害が生じた（図６） 。

試験した最大用量（餌１ｇ当たり１．０ｍｇ）の時、ＰＰＩは本質的に発育を停 止させた。第二令ＳＣＲを用いた同様な実験は、幼虫の発育に対するＰＰＩの効 果は新生幼虫に比較して低いことを示していた（餌１ｇ当たり〜１．０ｍｇのＰ ＰＩの時５０％の阻害）。これらのデータは、ＰＰＩがＷＣＲ幼虫発育に関する 有効な阻害剤であることを示している。

加うるに、ＳＣＨにおける時期特異的ＰＰＩ効果は、新生ＷＣＲ幼虫の方が新生 ＳＣＲよりもＰＰＩの影響に対して高い感受性を示し得ることを示唆している。

実施例３：カルボキシペプチダーゼ阻害剤との組み合わせにおけるＰＰｌ−１０ にの相乗作用 実施例１で示すように、無傷のＰＰ１分子をトリプシン消化することで〜１０お よび〜３２ｋＤのフラグメントが得られ、これらはインビトロで有効なパパイン 阻害剤である。無傷のＰＰＩおよび単離したＰＰＩの〜１０ｋＤフラグメントも また、同じアッセイシステムを用いた時、ジアブロチ力・ルートワーム腸抽出物 による蛋白分解を阻害する。しかしながら、これらのフラグメントは、新生ＳＣ Ｒまたは第二令ＷＣＲのどちらかを用いた食餌アッセイにおいて、成長抑制効果 をほとんどか全く示さない（表１）。この差を解決する目的で、無傷のＰＰＩま たはＰＰＩフラグメントを摂取した後の幼虫の腸液内におけるシスティン蛋白分 解活性を直接監視する高感度アッセイを開発した。

水中０．０３ｍＬのＰＰｌ−８７ＫまたはＰＰｌ−１０Ｋ　（８７ｋＤのトリプ シン消化で得られる）を、上述した如き０．２５ｍＬの人工餌の表面に、餌１ｍ Ｌ当たり０．５ｍｇの最終濃度で投与した。次に、１０個のウェルからその餌を 取り出して、無菌ベトリ皿の中に入れた。次に、この餌の上に新生５ＣＲ（）ウ モロコシの根で育てた）を２２匹置き、そ；ノで３時間食べさせた。食べさせた 後、各々の幼虫から消化管を取り出して、５０ＩＩＬの５０ｍＭ酢酸ナトリウム 緩衝液、ｐＨ６，０＋４ｍＭ０）ＥＤＴＡ＋８ｍＭのジチオトレイトールが入っ ている冷却した個々のＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管の中に入れた後、激しく渦動させた 。次に、各々の管から得られる抽出液の５ミクロリツトルを、９６個ウェルのプ レートの中に入っている０、０９５ｍＬの同じ緩衝液に加えた後、１０分間放置 した。Ｃｏａｓｔａｒの９６個ウェルピペッタ−を用いて０．２ｍＬのＺ−Ｐｈ ｅ−Ａｒｇ−ＮＭｅｃを、その希釈した抽出液に加えることで最終濃度を２０℃ Ｍにした。動的容量を有するＢｉｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ”データ収集ソフトウェ アシステムに取り付けたＦｌｕｒｏｓｋａｎ　ＩＩ”蛍光ミクロタイタープレー ト読み機を用いてデータを集めた。励起および発光波長はそれぞれ３８０および ４６０であった。基質開裂の初期速度を、蛍光単位７分として表した。

これらのデータは、ＰＰｌ−１０にの摂取によるルートワーム幼虫の牛腸内にお けるシスティンプロテアーゼ活性の阻害は比較的小さいことを示している。それ とは対照的に、ＰＰｌ−８７Ｋが摂取されると、その腸内のシスティンプロテア ーゼ活性は有効に阻害される。

表１・ＰＰＩ誘導体を食べた後のルートワーム幼虫の牛腸内における、システィ ンプロテアーゼ活性の比較 対照　２９７．１±３６．　５　１００ＰＰＩ−８７Ｋ　７０．８±１４．　７ 　２４ＰＰＩ−１０Ｋ　２４２．５±３２．９　８２昆虫食餌アッセイにより、 ＰＰｌ−１０に存在下におけるジャガ芋カルボキシペプチダーゼ阻害剤の効果を 測定した。そのデータを表２に示す。

表２：新生サザン・コーン・ルートワーム幼虫の発育に対するＰＰＩトリプシン フラグメントの効果 処理（ｍｇ／ｇ餌）　幼虫の体重（ｍｇ）対照　３．５０±０．１１＊ ＰＰｌ−１０（１，０）　３．４０±０．２１ＰＰＩ−１０（０，２５）　３． ０９±０．１９ＰＰＩ−３２（０，２５）　３．７０±０．２８ＣＰＩ　（０， ２５）　３．６０±０１４ＰＰＩ−１０（０，２５）＋　２．１５±０．１５Ｃ ＰＩ　（０，２５） ＊−値は５つの独立した実験の平均値±ＳＥＭである。

ジャガ芋カルボキシペプチダーゼ阻害剤またはＰＰｌ−１０に単独のどちらも（ 各々０．２５ｍｇ／ｇ餌）、ルートワーム幼虫の発育に全く効果を示さなかった 。しかしながら、この２つの蛋白質をその餌の中に混ぜると、等しい濃度の無傷 のＰＰＩで見られるそれに比較して、有意な発育低下が見られた。ペプスタチン （Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）　、即ちカルボキシルプロテアーゼ阻害剤は、その効果 は小さいが同様な効果を示した。

第二令ＷＣＲの食餌アッセイでは、ＰＰｌ−１０Ｋに関する有意な効果は全く見 られなかった（表３）。追加的に、第二令ＷＣＲの食餌アッセイでカルボキシペ プチダーゼ阻害剤を用いても、ＰＰｌ−、ＩＯＫの有意な効果は全く見られなか った（データには示されていない）。

表３：第二令のウスタン・コーン・ルートワーム幼虫の発育に関するＰＰＩトリ プシンフラグメントの効果 処理Ｃｍｇ／ｇ餌）　幼虫の体重（ｍｇ）対照　７．６５±０．３５＊ ＰＰｌ−８＋３２ｋＤ　（０，２５）　５．９９±０．４１ＰＰＩ−８７ｋＤ（ 領２５）　２．８１±０．４４＊値は２つの独立した実験の平均値±ＳＥＭであ る。

実施例４−カルボキシルプロテアーゼ阻害剤との組み合わせにおけるＰＰＩの効 果 このアッセイにおける基質として用いる蛋白質の種類に応じて、ＰＰＩは、ルー トワームの腸蛋白分解の６０−９０％を阻害した。その残存している蛋白分解活 性は、ペプスタチン、即ちカルボキシルプロテアーゼ阻害剤で有効に阻害された 。このことは下記の如く示された。全体体積が０．０５ｍＬである、１００ｍＭ の酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）十５ｍＭのＥＤＴＡ＋５ｍＭのジチオトレイ トールの中で、希釈したＳＣＲ腸抽腸液出液当な阻害剤を一緒にした（ＰＰＩを ４０＋ｇ／ｍＬの最終濃度で用い、そしてペプスタチンをＢａｇ／ｍＬの最終濃 度で用いた）　。Ｔｗｉｎｉｎｇ　（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ％１４３：３ ０）の中に記述されている如く製造した鉤　５％のフルオレセインイソチオシア ネート（Ｆ　Ｉ　ＴＣ）に連結させたヘモグロビンまたはカゼインを２０ｐＬ用 いて、このアッセイを開始させ、そして３７℃で３時間後、１２．５％のトリク ロロ酢酸を７５ａＬ用いてクエンチした。４℃で３０分後、サンプルを遠心分離 にかけ、そして１１０μＬのＭトリスｐＨと混合した後、上澄み液の蛍光を測定 した。阻害剤が入っていない対照と比較した阻害パーセントとして結果を示す。

　゛ 表４　：　ＳＣＲ幼虫の腸液出液を用いたインビトロ蛋白分解に対するＰＰＩと ペプスタチンの効果 阻害剤　基質　阻害 ＰＰＩ　ＦＩＴＣカゼイン　９１．４ ＰＰＩＦＩＴＣヘモグロビン　５９．０ペプスタチン　ＦＩＴＣカゼイン　３９ ，４ペプスタチン　ＦＩＴＣヘモグロビン　４８．６ＰＰＩ＋ペプスタチン　Ｆ ＩＴＣカゼイン　９７．ＧＰＰＩ＋ペプスタチン　ＦＩＴＣヘモグロビン　９９ ．２基質としてアゾアルブミンおよびアゾカゼインを用いたＷＣＲ腸抽腸液出液 同じ結果が得られた。ＰＰＩによる幼虫腸蛋白分解の阻害度合は、蛋白質基質に 従って変化し、その順はカゼイン〉アルブミン〉ヘモグロビンである。ペプスタ チンによる阻害は逆の順であり、基質としてヘモグロビンを用いた時最大の阻害 が観察された。ＰＰＩ単独でも一貫してペプスタチン単独よりも高い率でルート ワーム腸蛋自分解を阻害するが、どちらの阻害剤も完全な阻害を示さない。しか しながら、両方の阻害剤を組み合わせると、全ての蛋白質基質に関してほとんど 完全な蛋白分解阻害が得られる。餌の中にＰＰＩと一緒にアスパラギン酸塩プロ テアーゼ阻害剤を混ぜると、実施例２で記述した如く評価した時、ジアブロチ力 幼虫発育の阻害が増強される。

実施例５：植物発現プラスミド類の構築プラスミドｐＤＡＢ２１９Δ−Ｎｏｔは 、２つの遺伝子を含んでいる二重目的のベクターを表しており、それらの各々は 、カルス組織の中で発現するプロモーターの制御下にある。この第一遺伝子であ るスクリーン性マーカーは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの翻訳制御下の大腸菌 から得られる修飾したベーターグルクロニダーゼ（ｇｕｓ）遺伝子である。植物 の転写および承り−アデニル化付加シグナルを、ツバリンジンダーゼ遺伝子から 誘導される配列によって供給する。第二遺伝子であるｂａｒは、ホスフィノトリ シンアセチルトランスフェラーゼの遺伝情報を指定する選択性マーカーであり、 これは、ストレプトマイセス・ヒグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　 ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）から誘導される。この遺伝子もまた、該ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターおよびツバリンジンダーゼ転写停止ポリアデニル化配列の調 節下にある。このｇｕｓ遺伝子は、商業的に入手可能な蛍光測定またはヒストケ ミカルアッセイを用いた発現の迅速分析を可能にするものである。このｂａｒ遺 伝子の発現は、活性材料としてビアラホス（ｂｊａｌａｐｈｏｓ）を含んでいる 除草剤ＢｅｓｔａＴＭ（Ｈ。

ｅｃｈｓｔ）に対する耐性を与え、その結果として、選択圧力下の形質転換した 細胞に選択的有利さを与えるものである。カリフラワーモザイクウィルス（Ｃａ ’ＭＶ）から誘導される配列は、Ｃａｂｂ　Ｓ菌株を表している。

これらはＧｅｎＢａｎｋのＭＣＡＳＴＲＡＳ配列として入手可能であり、Ｆｒａ ｎｃｋ他、Ｃｅ１１．２１・２８５−２９４　（１９８０）が公開している。

Ａ、３５ＳプロモーターとアグロバクテリウムＮｏｓ　Ｐｏ１ｙ　Ａ配列を用い たプラスミド類 出発材料は、ＣＬＯＮＴＥＣｔｌ　（Ｐａｌｏ　ＡｌｔｏＳＣＡ）から購入した プラスミドであるｐＢ１２２１である。このプラスミドは、Ｂｅｖａｎ他、ＥＩ ａＢＯＪ、、４：１９２１−１９２６：　Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ他、Ｎａｔｕｒｅ 、　３２１：４４６−４４９　（１９８６）　；　Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ他、ＯＢ ＯＪ、、６：３９０１−３９０７　（１９８７）　；およびＪｅｆｆｅｒｓｏｎ 、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ。

Ｒｅｐｏｒｔｅｒ、５：３８７−４０　（１９８７）の中に記述されている如く 、ＣａＭＶ３５Ｓブｏモーターの修飾コピーを含んでいる。ｐ　Ｕ　Ｃ１９（Ｙ ａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ他、Ｇｅｎｅ、３３：１０３−１１９　（１９８５ ）のＰｓｔＩ部位の３°末端で開始して、ｐＵｃ１９のＬａｃ　Ｚ遺伝子をコー ド化するそれと同じストランドの上を読むと、この配列は、リンカ−ヌクレオチ ド類ＧＴＣＣＣＣに続いてＣａＭＶヌクレオチド類６６０５から７４３９、そし て続いてリンカ−配列ＧＧＧＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＧＧ ＴＣＡＧＴＣＣＣＴＴ、で構成されており、ここで、このアンダーラインを付け た塩基は、ＢａｍＨＩ認識配列を表している。これらの塩基に続いて、ｂ−グル クロニダーゼ（ＧＵＳ）蛋白質をコード化する大腸菌ＵｉｄＡ遺伝子のコーディ ング配列を含んでいる１８０９個の塩基対（ｂｐ）、そして大腸菌ゲノム（Ｊｅ ｆｆｅｒｓｏｎ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、８３：８ ４４７−８４５１　（１９８６）　）から誘導される４４ｂｐの３°　フランキ ング塩基に続いて、５ｓｔＩリンカ−配列ＧＡＧＣＴＣが存在しており、これに リンカ−配列ＧＡＡＴＴＴＣＣＣＣが続く。これらの塩基に続いて、アグロバク テリウム・ツメファシェンスのツバリンシンターゼ（Ｎｏｓ）遺伝子から誘導さ れるＲＮＡ転写停止／ポリアデニル化シグナル配列が存在しており、そしてこれ らは、ＤｅＰｉｃｋｅｒ他０．　Ｍｏ１ｅｃ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、。

１：５６１−５７３　（１９８２）のヌクレオチド類１２９８から１５５４に相 当している２５６ｂｐの５ａｕ３ＡＩフラグメントを含んでおり、そしてそれに 続いて、２個のＣ残基、ＥｃｏＲＩ認識配列ＧＡＡＴＴＣ１そしてｐＵＣ１９の 残りを含んでいる。

ｌ、ｐＢ１２２１のＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化させた後、アガ ロースゲル電気泳動法を用いて、２１６３ｂｌ）の小型フラグメントから３５０ ６ｂｐのフラグメントを分離した後、標準方法で精製シタ。ｐＲＡＪ２７５　（ 上記ＣＬＯＮＴＥＣＩＴ、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ　（１９８７）　）のＤＮＡをＥ ｃｏＲＩと５ａｉｌで消化させた後、アガロースゲルから１８６２ｂｐのフラグ メントを精製した。これらの２つのフラグメントを一緒に混合した後、配列ＧＡ ＴＣＣＧＧＡＴＣＣＧおよびＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧで表される相補的合成オ リゴヌクレオチド類を加えた。これらのフラグメントを一緒に結合させ、そして 結合反応物を、受容能のある大腸菌細胞に形質転換した。適当なりＮＡ構造を有 するプラスミドを有している形質転換体を、制限酵素部位地図作成で同定した。

このプラスミドをｐＫＡ８８１と名付けた。

２、ｐＫＡ８８１のＤＮＡをＢａ１ｌとＥｃｏＲＩで消化させた後、アガロース ゲルから４１４８ｂｐの大型フラグメントを精製した。ｐＢ１２２１のＤＮＡも 同様に消化させ、そして１５１７ｂｐのＥｃｏＲＩ／Ｂａ１１フラグメントをゲ ル精製した後、上記ｐＫＡ８８１フラグメントに結合させることでプラスミドｐ ＫＡ８８２を生じさせた。

３、　ｐＫＡ８８２のＤＮＡを５ｓｔｌで消化させた後、これらの突き出ている 末端を、Ｔ４ポリメラーゼを用いた処理で平滑にした後、このフラグメントを配 列ＣＧＧＡＴＣＣＧで表される合成りａｍＨＩリンカ−に結合させた。３７８４ および１８８５ｂｐのＢａｍＨＴフラグメントを有するプラスミドを有している 大腸菌形質転換体を同定し、ｐＫＡ８８２Ｂと名付けた。

４、　ｐＫＡ８８２のＤＮＡをＰｓｔｌで消化させた後、コレラノ線形フラグメ ントを、配列ＣＡＧＡＴＣＴＧＴＧＣＡで表される合成アダプタに結合させた。

Ｐｓｔｌで開裂されないが新規でユニークなりｇ１１１部位を有するプラスミド を有している大腸菌形質転換体を同定した。

このプラスミドをｐＫＡ８８２−Ｂｇと名付けた。

５、ｐＫＡ８８２−ＢｇのＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化させた後、これらの線形フ ラグメントを、配列ＡＡＴＴＧＡＧＡＴＣＴＣで表される合成アダプタに結合さ せた。ＥｃｏＲＩで開裂されないが３０２７および２６５８ｂｐの８ｇｌｌｌフ ラグメントを生じるプラスミドを有している大腸菌形質転換体を同定した。この プラスミドをｐＫＡ８８２−２ｘＢｇと名付けた。

６、ｐＫＡ８８２ＢのＤＮＡをＢａｍＨＩで消化させた後、フラグメントの混合 物を結合させた。ＢａｍＨＩで消化させると単一の３７８３ｂｐフラグメントを 生じるプラスミドを有している大腸菌形質転換体を同定し、そしてｐ３５Ｓ／Ｎ ｏｓと名付けた。このプラスミドは、ＧＵＳ遺伝子のコーディング配列が欠失し ている以外はｐＢＩ２２１の必須ＤＮＡ構造を有している。従って、ＣａＭＶの ヌクレオチド類６６０５から７４３９に続いて、リンカ−配列ＧＧＧＧＡＣＴＣ ＴΔＧＡＧＧＡＴＣＣＣＧＡＡＴＴＴＣＣＣＣが存在しており、これに続いてＮ ｏｓポリアデニル化配列配列ｐＢＩ２２１の残りが存在している。

７、　ｐ３５Ｓ／ＮｏｓのＤＮＡをＥｃｏＲＶとＰｓｔｌで消化させ、３０３７ ｂｐのフラグメントを精製した後、ｐ３５Ｓ／Ｅｎ２のＤＮＡ（実施例５、セク ションＣ５参照）をＥｃｏＲＶとＰｓｔｌで消化させることによって得られる５ ３’４ｂｐフラグメントに結合させた。ＥｃｏＲＶとＰｓｔｌで消化させた時３ ０３１と５３４ｂｐのフラグメントを生じるプラスミドを有している大腸菌形質 転換体を同定し、そしてこのプラスミドをｐ３５Ｓ　Ｅｎ２／Ｎｏｓと名付けた 。このプラスミドは実施例５、セクションＣ，５のｐ３５Ｓ　Ｅｎ２に関して記 述した、その複製された３５Ｓプロモーターエンハンサ−領域を含んでいる。こ のプロモーターの配列を、ユニークなりａｍＨ１部位を含んでいるリンカ−配列 によって、Ｎｏｓポリアデニル化配列配列分離した。

Ｂ、３５ＳプロモーターとアグロバクテリウムＯＲＦ　２５／２６ＰｏｌｙＡ配 列を用いたプラスミド 出発材料はプラスミドｐｌｃ３５である。このプラスミドは、Ｈｉｎｄｌｌｌ認 識部位が維持されるような配向で、ｐ　Ｉ　Ｃ１９Ｒ［Ｍａｒｓｈ他、Ｇｅｎｅ 、　３２：４８１−４８５　（１９８４）　］のＮｒｕＩおよびＨｉｎｄｌ　１ １部位に結合サセタ、ｐＵＣ１３３５ｓ（−３４３）から得られる８４５ｂｐの Ｓｍａ　Ｉ／Ｈｉ　ｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉフラグメントを含んでいる［実施例１２、 セクションＣ参照］。このＡ、ツメファシェンス０ＲＦ２５／２６配列を有する 給源は、プラスミドｐＩｃ１９２５である。このプラスミドは、ｐｌｃ　１９Ｈ のＢａｍＨ１部位がＴ−ＤＮＡフラグメントのＯＲＦ　２５末端に隣接するよう な配向でｐｌｃ１９Ｈ（上記Ｍａｒｓｈ他（１９８４）　）のＳｍａ　１部位の 中に連結させた、Ａ、ツメファシェンスｐＴｉ　１５９５５　Ｔ−ＤＮＡ　（Ｂ ａｒｋｅｒ他、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、、２：３３５−３５０） のヌクレオチド類２１７２８から２２４４０を有している７１３ｂｐのＨｉｎｃ ＩＩフラグメントを含んでいる。

１、　プラスミドｐｌｃ　３５のＤＮＡをＢａｍＨＩで消化させた後、ＢａｍＨ ＩとＢｇｌｌｌでｐｌｃ１９２５のＤＮＡを消化させることによって調製した７ ３８ｂｐのフラグメントに結合させた。３５ＳプロモーターフラグメントとＯＲ Ｆ　２５／２６　Ｐｏ１ｙ　Ａフラグメントの間にＢａｍＨ１部位が位置してい るプラスミドを有している大腸菌形質転換体を同定した。このプラスミドをｐＩ Ｃ１９Ｒ３５／Ａと名付ケた。

２、ｐＩＣ１９Ｒ３５／ＡのＤＮＡを、Ｓｍａ　Ｉを用いそれのユニークな部位 で消化させた後、このＤＮＡを、配列ＣＡＧＡＴＣＴＧで表されるＢｇｌｌｌリ ンカ−に結合させた。これらのＢｇｌｌＩリンカ−のタンドマイゼーション（ｔ ａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ）により、Ｂｇｌｌｌ認識部位の他にまたＰ　ｓ　ｔ 、　Ｉ認識部位であるＣＴＧＣＡＧも生じさせる。前のＳｍａ　１部位の位置に 該リンカ−のコピーを少なくとも２個（および新規なりｇｌｌｌおよびＰｓｔ１ 部位）有する大腸菌形質転換体を同定した。このプラスミドをｐＩＣ３５／Ａと 名付けた。

３、プラスミドｐ　Ｉ　Ｃ２ＯＲ（Ｍａｒｓｈ他、Ｇｅｎｅ、　３２：４８１− ４８５１４　（１９８４））のＤＮＡをＮｒｕ　ＴとＳｍａ　Ｉで消化させた後 、この大型フラグメントの平滑末端を一緒に結合させた。ＮｒｕｌＳＳｍａｌ、 Ｈｉｎｄｌ　ＩＩ。

ｓｐｈ　Ｉ、Ｐｓｔｌ、５ａｉｌ、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ部位のないプラス ミドを有している大腸菌形質転換体を同定した。このプラスミドをｐｌｃ　２０ ＲＤと名付けた。

４、　ｐｌｃ　２０ＲＤのＤＮＡをＢｇｌＩＩで消化させた後、これを、ｐｌｃ ３５／Ａの１６２５ｂｐから成る８ｇｌｌｌフラグメントに結合させた。３５Ｓ プロモーター１０ＲＦ　２５　ｐｏｌｙ　Ａ配列を含んでいるプラスミドを有す る大腸菌形質転換体を同定した。制限酵素部位地図作成により、これらの配列は 、ｐｌｃ２０ＲＤのユニークなＫｐｎＩとＸｈｏ１部位がこのＯＲＦ　２５　Ｐ ｏ１ｙ　Ａ配列の３′末端に位置するような配向で存在していることが分かった 。このプラスミドをｐＳＧ　Ｂｇｌ　３５２５　（Ｐｓｔ）と名付けた。

５、　ｐｓＧＢｇＩＩＩ３５２５（Ｐｓｔ）のＤＮＡを、ＢｇｌｌＩを用い、こ の分子が有する２つのＢｇ１１１部位の１つのみが開裂する条件下で消化させた 。この４３０１ｂｐの線形フラグメントを、配列ＧＡＴＣＧＴＧＡＴＣＡＣ（こ こで、このアンダーラインを付けた塩基はＢｃｌｌ認識配列を表している）で表 される合成アダプタオリゴヌクレオチド類に結合させた。５゛が３５３プロモー ターに向かうように位置している、前のＢｇｌ１１部位の位置にＢｃ１１部位を 有する大腸菌形質転換体を同定した。このプラスミドをｐＳＧ　３５２５　ａ　 （Ｐｓｔ）と名付けた。

Ｃ９二重増強したＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの構築コノ出発材料は、０ｄｅｌ ｌ他（Ｎａｔｕｒｅ、　３１３：８１０−８１２　（１９８５））に記述されて いる如きプラスミドｐＵｃ１３／３５Ｓ　（−３４３）である。このプラスミド は、ｐＵＣ１３（Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、著ｒＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ ｍｏｌｏｇｙＪ（冒ｕ、　Ｒ，他編集）　＋０１：２０−７８　（１９８３）） のＳｍａ　１部位の３゛末端で開始して、このｐＵＣ１３のＬａｃ　Ｚ遺伝子の 非コーディングストランドに隣接しているストランドの上を読むことで、ＣａＭ Ｖののヌクレオチド類である６４９５から６９７２を含んでおり、続いてリンカ −配列ＣＡＴＣＧＡＴＧ　（これはＣ１ａＩ認識部位をコード化する）、続いて ＣａＭＶヌクレオチド類７０８９から７４４３、そして続いてリンカ−配列ＣＡ ＡＧＣＴＴＧを含んでおり、ここで、この後者の配列は、ＨｉｎｄｌｌＩのため の認識配列を含んでおり、これに続いてこのｐＵＣ１３プラスミドＤＮＡの残り を含んでいる。

１．　ｐＵＣ１３／３５Ｓ　（−３４３）のＤＮＡをＣ１ａＩで消化させた後、 この突き出ている末端を、Ｔ４ポリメラーゼで処理することによって平滑にした 。次に、この平滑末端を有するＤＮＡを、Ｎｃｏｌ認識部位を含んでいる配列Ｃ ＣＣＡＴＧＧＧで表される合成オリゴヌクレオチドリンカーに結合させた。前の Ｃｌａｌ部位の所に位置しているＮｃｏ１部位を有するプラスミド（ｐｏｏ＃１ と名付ける）を含んでいる大腸菌形質転換体を同定した。

２、　ｐｏｏ＃１のＤＮＡをＮｃｏＩで消化させた後、この大型フラグメントの 適合性末端を再結合させることで、ｐｏｏ＃１から７０ｂｐを欠失させる結果と して、プラスミドｐｏｏ＃Ｉ　ＮｅｏΔを生じさせる。

３、　ｐｏｏ＃Ｉ　ＮｃｏΔのＤＮＡをＥｃｏＲＶで消化させ、そしテコれらの 平滑末端を、配列ＣＡＴＣＧＡＴＧで表されるＣＩａＩリンカ−に結合させた。

前のＥｃｏＲＶ部位の位置に新しいＣｌａｌ部位を有するプラスミドを有してい る大腸菌形質転換体を同定し、そしてこのプラスミドをｐｏｏ＃Ｉ　ＮｃｏΔＲ Ｖ／Ｃ１ａと名付けた。

４、ｐ００＃１．ＮｃｏΔＲＶ／Ｃ１ａのＤＮＡをＣ１ａｌとＮｃ。

！で消化させ、そして小型（２６８ｂ　ｐ）フラグメントをアガロースゲルから 精製した。次に、このフラグメントを、アガロースゲルから単離することによっ て調製したｐＵＣ１３／３５Ｓ　（−３４３）の３４２９ｂｐから成るＣ１ａｌ ／ＮｃｏＩフラグメントに連結させ、そしてＣＩａｌ／Ｎｃｏｌフラグメント３ ４２９および２６８ｂｐを有するプラスミドを有している大腸菌形質転換体を同 定した。このプラスミドをｐＵＣ１３／３５Ｓ　Ｅｎと名付けた。

５、ｐＬＴｃ　１３／３５Ｓ　ＥｎのＤＮＡをＮｃｏＩで消化させた後、この突 き出ている末端を、Ｔ４ポリメラーゼで処理することによって平滑にした。次に 、この処理したＤＮＡを、Ｓｍａ　Ｉで切断した後、配列ＣＡＧＡＴＣＴＧで表 されるＢｇｌＩＩリンカ−に結合させた。４１６ｂｐのＳｍａＩ／ＮｃｏＩフラ グメントがそのＢｇｌｌｌリンカ−の少なくとも２つのコピーで置換されている プラスミドを有する大腸菌形質転換体を同定し、ｐ３５Ｓ　Ｅｎ２と名付けた。

このｐ３５Ｓ　Ｅｎ”のＤＮＡ構造は下記の通りである。ｐｕｃ　１３のＬａｃ 　Ｚ遺伝子の非コーディングストランドに隣接するストランド上のＳｍａｒ部位 の第３Ｃ残基に続くヌクレオチドで開始して、リンカ−配列ＣＡＧＡＴＣＴＧＣ ＡＧＡＴＣＴＧＣＡＴＧＧＧＣＧＡＴＧ、続いてＣａＭＶヌクレオチド７０９０ から７３４４、続イテｃ　１　ａ　Ｉ　’）　＞カー配列ＣＡＴＣＧＡＴＧ、続 いてＣａＭＶヌクレオチド７０８９から７４４３、続いてＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉリ ンカ−配列ＣＡＡＧＣＴＴ、そして続いてこのｐＵＣ１３配列の残りが存在して いる。この構造は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターのエンハンサ−配列［これは、 ウィルスゲノム内のＥｃｏＲＶ部位の上流に在る領域内に存在している（ヌクレ オチド７０９０から７３４４）］が複製された特徴を有している。このようなプ ロモーター構成は、Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ部位の第−Ａ残基よりも１１ヌクレオチ ド上流に在る先天的３５Ｓ転写開始部位を取り込んでいる。

Ｄ、　合成非翻訳リーダーの構築 メイズストリークウィルス（ＭａｉｚｅＳｔｒｅａｋＶｉｒｕｓ）　（ＭＳＶ） ゲノムの主要な右に向かう転写物の５°非翻訳リ一ダ一部分を含んでいる配列を 含むＤＮＡフラグメントを構築した。このＭＳＶゲノム配列は、Ｍｕｌｌｉｎｅ ａｕｘ他、ＥＭＢＯＪ、、３：３０６３−３０６８　（１９８４）およびＨｏｗ ｅｌｌ、Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、１２ニア３５９−７３７５　（１９ ８４）によって公開され、そして該転写物は、Ｆｅｎｏｉｌ他、ＥＭＢＯＪ、、 ７：１５８９−１５９６　（１９８８）によって記述された。１５４ｂｐから成 るこの配列全体を、合成オリゴヌクレオチド類のブロック（Ａ。

ＢおよびＣ）を組み立てることによる三段階で構築した。

１、　Ａブロック：配列 ＧＡＴＣＣＡＧＣＴＧＡＡＧＧＣＴＣＧＡＣＡＡＧＧＣＡＧＡＴＣＣＡＣＧＧＡ ＧＧＡＧＣＴＧＡＴＡＴＴＴＧＧＴＧＧＡＣＡおよびＡＧＣＴＴＧＴＣＣＡＣＣ ＡＡＡＴＡＴＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＧＴＧＧＡＴＣＴＧＣＣＴＴＧＴＣＧＡＧＣ ＣＴＴＣＡＧＣＴＧで表される相補的オリゴヌクレオチド類を合成した後、標準 操作で精製した。これらのヌクレオチド類をアニールし、て２本鎖構造物を生じ させることにより、４個の塩基から成る粘着性を示す末端を残し、これらの末端 は、この分子の１つの末端（ＧＡＴＣ）上で、ＢａｍＨＩによって生じさせた末 端と適合性を示すと共に、この分子のもう１つの末端（ＡＧＣＴ）上て、Ｈｉｎ ｄｌｌｌで生じさせた１本鏑末端に適合性を示す。

このようにしてアニールした分子を、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄｌｌＩで消化させた プラスミドｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ　（−）　［ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣ ｌｏｎｉｎｇ　ＳｙｓｔｅｍｓＳＬａ　ＪｏｌｌａＳＣＡＩの中に結合させた。

ＢａｍＨｌと■］１ｎｄｌｌＩの制限酵素分析を用いて、このオリゴヌクレオチ ド配列を含んでいるプラスミドを有する大腸菌形質転換体を同定し、このプラス ミドをｐＭＳＶ　Ａと名付けた。

２、８ブロツク・配列 ＾ＧＣＴＧＴＧＧＡＴＡＧＧＡＧＣＡＡＣＣＣＴＡＴＣＣＣＴ＾＾ＴＡＴＡＣＣ ＡＧＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＧＴＡＴＡＴＴＡＧＧＧＡＴＡＧＧＧＴＴＧＣＴＣＣ ＴＡＴＣＣＡＣで表される相補的オリゴヌクレオチド類を合成した後、標準操作 で精製した。アンダーラインを付けた塩基は、制限酵素Ｓｍａ　ＩとＸｍａｌの ための認識配列を表している。これらのヌクレオチド類をアニールして２本鎖構 造物を生じさせることにより、４個の塩基から成る粘着性を示す末端を残し、こ れらの末端は、この分子の１つの末端（Ａ　Ｇ　ＣＴ）上で、ＨｉｎｄＩ　Ｉ　 Ｉによって生じさせた末端と適合性を示すと共に、この分子のもう１つの末端（ ＴＣＧＡ）上で、５ａｉｌで生じさせた粘着性を示す末端に適合性を示す。

ｐＭＳＶ　ＡのＤＮＡをＨｉｎｄｌｌｌと５ａｉｌで消化させた後、上でアニー ルしたオリゴヌクレオチド類に結合させた。制限酵素部位地図作成を用いて、こ の新規なオリゴヌクレオチド類を含んでいるプラスミドを有する大腸菌形質転換 体を同定し、ｐＭＳＶ　ＡＢと名付けた。

３　Ｃブロック：配列 ＣＣＧＧＧＣＣＡＴＴＴＧＴＴＣＣＡＧＧＣＡＣＧＧＧＡＴＡＡＧＣＡＴＧ＾＾ ＴＧＣＴＴＡＴＣＣＣＧＴＧＣＣＴＧＧＡＡＣＡ＾＾ＴＧＧＣで表される相補的 オリゴヌクレオチド類を合成した後、標準操作で精製した。これらのヌクレオチ ド類は、Ｎｃｏ　Ｉ　（ＣＣＡＴＧＧ）　、Ｅｃ。

ＲＶ　（ＧＡＴＡＴＣ）　、Ｈｉ　ｎｄＩ　Ｉ　Ｉ　（ＡＡＧＣＴＴ）およびＢ ａｍＨｌ　（ＧＧＡＴＣＣ）のための認識部位（アンダーラインを付けた）を含 む塩基を取り込んでいる。これらのヌクレオチド類をアニールして２本鎖構造物 を生じさせることにより、４個の塩基から成る粘着性を示す末端を残し、これら の末端は、この分子の１つの末端（ＣＣＧＧ）上で、Ｘｍａｌによって生じさせ た末端と適合性を示すと共に、この分子のもう１つの末端（ＴＣＧＡ）上で、Ｘ ｈｏＩで生じさせた粘着性を示す末端に適合性を示す。このようにしてアニール した分子を、ＸｍａＩとＸｈｏＩで消化させたｐＭＳＶ　ＡＢのＤＮＡの中に結 合させた。制限酵素部位分析を用いて、このオリゴヌクレオチド配列を含んでい るプラスミドを有する大腸菌形質転換体を同定し、そしてこのＤＮＡ構造を配列 決定分析で立証した。このプラスミドをｐＭＳＶ　ＣＰＬと名付け、これは、Ａ ＢＣの逐次的順てＡ、ＢおよびＣブロックのヌクレオチド類を含んでいる。これ らは、−緒に、ＭＳＶコート蛋白質（ｒｃＰＪ）遺伝子の５゛非翻訳リーダー配 列（ｒＬＪ　）を含んでいる。これらは、上記Ｍｕ１１ｉｎｅａｕｘ他（１９８ ４）のＭＳＶ配列のヌクレオチド１６７から１８６とヌクレオチド１８８から３ １７に相当しており、そしてこれらは、その５゛末端で、ＢａｍＨＩリンカ−配 列ＧＧＡＴＣＣＡＧに隣接しており、そしてその３′末端で、リンカ−配列ＧＡ ＴＡＴＣＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣＣに隣接している。野生型ＭＳＶ配列の塩基 １８７に相当しているＡ残基が、クローニングしている間偶然に欠失した。

４、　Ｂｇ１１１部位挿入 ＭＳＶゲノム配列（上記Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ他（１９８４）　）の塩基２７７ に相当しているＳｍａ１部位の所で、ｐＭＳＶ　ＣＰＬのＤＮＡを消化させ、こ のＤＮＡを、配列ＣＡＧＡＴＣＴＧで表されるＢｇｌ１１リンカ−に結合させた 。前のＳｍａ　Ｉ部位の位置にユニークなりｇｌｌＩ部位を有するプラスミドを 有している大腸菌形質転換体を同定し、ＤＮＡ配列決定分析で立証した後、この プラスミドをｐＣＰＬ−Ｂｇ　Ｉと名付けた。

Ｅ、）ウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ１（Ａｄｈｌ）イントロン１の 欠失変形体の構築 この出発材料はプラスミドｐＶＷ１１９である。このプラスミドは、ヌクレオチ ド１１９から６７２のトウモロコシＡｄｈ　１．３遺伝子イントロン１のＤＮＡ 配列を含んでおり、これはＣａ１ｌｉｓ他、Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌ、 、１：１１８３−１２００　（１９８７）に記述されている。Ｄｅｎｎｉｓ他、 Ｎｕｃｌ、＾ｃｆｄｓＲｅｓ、、１２＋３９８３−４０００　（１９８４）の塩 基６７２に続く配列は、ＧＡＣＧＧＡＴＣＣであり、ここで、このアンダーライ ンを付けた塩基はＢａｍＨ■認識部位を表している。このイントロン１の配列全 体（これは１４ｂｐのエキソン１と９ｂｐのエキソン２を含んでいる）が、この プラスミドから、ＢｃｌｌとＢａｍＨＩを用いた消化の後の５５６ｂｐフラグメ ントを基にして得られた。

１、　プラスミドｐＳＧ　３５２５　ａ　（Ｐｓｔ）のＤＮＡ　（実施例のセク ションＢ　５を参照）をＢａｍＨＩとＢｃｌＩで消化させた後、３４３０ｂｐの フラグメントをアガロースゲルがら精製した。ｐＶＷ１１９のＤＮＡをＢａｍＨ ＩとＢｃｌＩで消化さ也そしてゲル精製した５５６ｂｐのフラグメントを、上記 ３４３０ｂｐフラグメントに結合させた。

ＢａｍＨＩとＢｃｌｌを用いた消化で３４３０と５５６ｂｐのフラグメントを生 じるプラスミドを有している大腸菌形質転換体を同定した。このプラスミドをｐ ｓｃ　Ａｄｈ　Ａｌと名付けた。

２、　ｐＳＧ　Ａｄｈ　ＡｌのＤＮＡをＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ　［、ｍれは、Ｄｅ ｎｎｉｓ他（上記（１９８４））の配列、即ち底のストランドの塩基２０９と２ １０の間を切断する］と５ｊｕｌ　（これは塩基５５４と５５５の間を切断する ）で消化させた。これらの末端をＴ４ポリメラーゼ処理で平滑にした後、これら を結合させた。ＨｉｎｄＩＩＩと５ｊｕｌ部位を有していないプラスミドを有す る大腸菌形質転換体を同定し、そしてこのＤＮＡ構造を配列決定分析で立証した 。このプラスミドをｐｓｃ　Ａｄｈ　ＡＩＤと名付けた。この構築では、イント ロン１の内部から３４４ｂｐのＤＮＡが欠失している。この機能的イントロン配 列は、ＢｃｌＩとＢａｍＨＩを用いた消化を行った後の２１３ｂｐフラグメント を基にして得られる。

３、　ｐＣＰＬ−ＢｇｌのＤＮＡ　（実施例５のセクションＤ、４を参照）をＢ ｇｌｌｌで消化させた後、この線形にしたＤＮＡを、ｐｓｃ　Ａｄｈ　ＡＩＤか ら得られるＡｄｈ　１．Ｓイントロン１配列の欠失変形体を含んでいる２１３ｂ ｐのＢｃ　Ｉ　Ｉ／ＢａｍＨＩに結合させた。Ｂｇ１１１／Ｂｃ１１連結部が該 ＭＳＶ　ＣＰＬリーダー配列の５′末端近くにありそしてＢｇｌ　Ｉ　Ｉ／Ｂａ ｍＨＩ連結部がこのＣＰＬの３゛末端近（に存在するような配向で該ＢｇｌｌＩ 部位の中に連結させたイントロン配列を含んでいるプラスミドを有する大腸菌形 質転換体を、制限酵素部位地図作成を用いて同定した。この配向をＤＮＡ配列決 定分析で立証した。このプラスミドをｐＣＰＬ　ＡＩ　Ｉ　ＩＤと名付けた。Ｂ ａｍＨＩとＮｃｏｌを用いた消化を行った後、３７３ｂｐフラグメントを精製す ることにより、このプラスミドからＭＳＶＳ−リーダーントロン配列が得られる 。

Ｆ、　増強した３５ＳブＯモー９−１Ｍ５Ｖ　ＣＰＬ、　およびＡｄｈ　１イン トロン１の欠失変形体を基とする、植物発現ベクターの構築１、プラスミドｐ３ ５Ｓ　Ｅｎ２／Ｎｏｓ　（実施例５のセクションＡ。

７を参照）のＤＮＡを、ＢａｍＨＩで消化させた後、３５６２ｂｐの線形フラグ メントを、ＢａｍＨＩで消化させたｐＭＳＶ　ＣＰＬのＤＮＡから調製した１７ １ｂｐのフラグメントに結合させた。このフラグメントは、セクションＤ　３に 記述するＭＳＶ　ＣＰＬ配列全体を含んでいる。ＮｃｏＩ部位がＮｏｓ　Ｐｏ１ ｙ　Ａ配列近くに位置するような配向で上記配列を含んでいるプラスミドを有し ている大腸菌形質転換体を、制限酵素部位地図作成で同定した。このプラスミド をｐ３５Ｓ　Ｅｎ２ＣＰＬ／Ｎｏｓと名付けた。これは、この誘導した転写物が それの５゛非翻訳部分にＭＳＶ配列を含むように、そのＭＳＶリーダー配列に直 接隣接している３５Ｓプロモーターの増強変形体を含んでいる。

２、　プラスミドｐＫＡ８８２　（実施例５のセクションＡ、２を参照）のＤＮ Ａを旧ｎｄＩＩＩとＮｃｏｌで消化させた後、大型の４７７８ｂｐフラグメント を、増強した３５Ｓプロモ一ター配列とｐ３５Ｓ　Ｅｎ２　ＣＰＬ／Ｎｏｓから 得られるＭＳＶリーダー配列を含んでいる８０２ｂｐのＨｉｎｄＩ　ＩＩ／Ｎｃ ｏｌフラグメントに結合させた。ＨｉｎｄＩＩＩとＮｃｏｌの消化に従う４７７ ８と８０２ｂｐのフラグメントを含んでいるプラスミドを有している大腸菌形質 転換体を同定し、ｐＤＡＢ３１０と名付けた。このプラスミドでは、該３５Ｓプ ロモーターの増強変形体を用いて、ＧＵＳ遺伝子の発現を調節する。この転写物 の５゛非翻訳リ一ダ一部分は、ＭＳＶコート蛋白質遺伝子のリーダー配列を含ん でいる。

３、プラスミドｐＤＡＢ　３１０のＤＮＡをＮｃｏＩと５ｓｔｌで消化させた。

この大きな３７１７ｂｐのフラグメントをアガロースゲルから精製して、配列Ｃ ＧＧＴＡＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＣｔ−ｊｉ、びｃＡＴＧＧＴＴＡＡＣＴＣＧＡ ＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴで表さｔ’Ｌ６相補的合成オリボヌクレオチド類に結合 させる。これらのオリゴヌクレオチド類は、アニールして２本鎖構造を生じた時 、この分子の１つの末端上で、５ｓｔｌによって残される末端（ＡＧＣＴ）に適 合性を示すと共に、この分子のもう１つの末端上で、ＮｃｏＩによって残される 末端（ＣＡＴＧ）に適合性を示す、粘性末端を有する分子を生じる。例えば、酵 素５ＳｔＩ　（ＡＧＣＴ）　、ＮｃｏＩ　（ＣＡＴＧ）　、ＫｐｎＩ　（ＧＧＴ ＡＣＣ）、ＸｈｏＩ　（ＣＴＣＧＡＧ）およびＨｐａｌ　（ＧＴＴＡＡＣ）のた めの部位を含んでいるプラスミドを有する大腸菌形質転換体を同定し、このＤＮ Ａ構造を配列決定分析で立証した。このプラスミドをｐＤＡＢ　１１４８と名付 けた。

４、プラスミドｐＤＡ８　１１４８のＤＮＡをＢａｍＨＩとＮｃｏＩで消化させ 、その大きな３５７７ｂｐのフラグメントをアガロースゲルから精製した後、Ｂ ａｍＨＩとＮｃｏ　Ｉを用いた消化に従うｐＣＰＬＡＩＩＩＤ（実施例５のセク ションＥ、３参照）から精製した３７３ｂｐのフラグメントに結合させた。Ｂａ ｍＨＩとＮｃｏｌを用いた消化の後３５７７と３７３ｂｐのフラグメントを生じ るプラスミドを有している大腸菌形質転換体を同定し、そしてこのプラスミドを ｐＤＡＢ　３０３と名付けた。このプラスミドは下記のＤＮＡ構造を有している 。ｐＵＣ１９のＰｓｔ１部位の最終Ｃ残基の後の塩基（塩基５３４）で開始して 、Ｌａｃ　Ｚ遺伝子のコーディングストランドに隣接しているストランド上を読 むと、リンカ−配列ＡＴＣＴＧＣＡＴＧＧＧＴＧ、ＣａＭ■のＤＮＡのヌクレオ チド類７０９３から７３４４、リンカ−配列ＣＡＴＣＧＡＴＧＳＣａＭＶのヌク レオチド類７０９３から７４３９、リンカ−配列ＧＧＧＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧ ＡＴＣＣＡＧ、ＭＳＶ（７）ヌクＬ。

オチド類１６７から１８６、ＭＳＶのヌクレオチド類１８８から２７７、Ｃ残基 に続いてＡｄｈ　ＩＳイントロン１のヌクレオチド類２６９から３５９、トウモ ロコシＡｄｈ　Ｓイントロン１のヌクレオチド類７０４から８２１、リンカ−配 列ＧＡＣＧＧＡＴＣＴＧ、ＭＳＶ（７）、ｌし、１チド類２７８から３１７、リ ンカ−配列ＧＴＴＡＡＣＴＣＧＡＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＴＣＣＣ ＣＳＮｏｓのヌクレオチド類１２９８から１５５４、モしてＣ残基に続いてｐＵ Ｃ１９配列の残り（ＥｃｏＲ１部位を含む）が存在している。ｐＤＡＢ３０３の ユニークなＥｃｏＲＩとＢｇ１１１部位をそれぞれ、認識配列ＧＣＧＧＣＣＧＣ を含んでいるオリゴヌクレオチド類でＮｏｔ１部位に変換することにより、ｐＤ ＡＢ３０３−Ｎｏｔを生じさせた。

Ｇ、ストレプトマイセス・ヒグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｈｙ ｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）のｂａｒ遺伝子を含んでいる植物形質転換用ベクター の構築この出発材料は、酵素であるホスフィノトリシンアセチルトランスフェラ ーゼ（ＦＡＴ）をコード化するＳ、　ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓのｂａｒ遺伝 子のコーディング領域を含んでいるプラスミドｐＩＪ４１０４　（ｌｌｈｉｔｅ 他、Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄ　Ｒｅｓ、、１８：１０６２　（１９９０））である。

１、　プラスミドｐｌＪ４１０４のＤＮＡをＳｍａ　Ｉで消化させた後、その５ ６９ｂｐのフラグメントをアガロースゲルから精製した。３５Ｓプロモーターと ＯＲＦ　２５　ｐｏｌｙ　Ａ配列の間に存在しているユニークなＨｉｎｃｌｌに おける消化によって、プラスミドｐｓｃ　３５２５　ａ　（Ｐｓｔ）（実施例５ のセクション８．　５を参照）のＤＮＡを線形にした後、この線形フラグメント を、５６９ｂｐのｂａｒ遺伝子フラグメントに結合さぜた。Ｂｇｌｌｌ消化によ って４１１８と７６４ｂｐのフラグメントを生じるような配向でそのｂａｒ遺伝 子を含んでいるプラスミドを有する大腸菌形質転換体を、制限酵素部位地図作成 で同定した。このプラスミドをｐＤＡＢ　２１８と名付けた。

２、プラスミドｐＤＡＢ　２１８のＤＮＡをＢｃｌｌで消化させた後、４８８２ ｂｐの線形フラグメントを、ｐＫＡ８８２−２ｘＢｇ　（実施例５のセクション Ａ、５を参照）のＤＮＡから調製した３１３３ｂｐの８ｇｌｌｌフラグメントに 結合させた。この後者のフラグメントは、Ｎ。

ｓ　Ｐｏ１ｙ　Ａ転写停止シグナルと共に、３５Ｓプロモーターの転写制御下に あるＧＵＳコーディング領域を含んでいる。このＧＵＳとＦＡＴのコーディング 領域を含んでいる大腸菌形質転換体を同定し、制御酵素認識部位地図作成により 、両方のコーディング領域が同じＤＮＡストランドによってコード化されること が確認された。このプラスミドをｐＤＡＢ　２１９と名付けた。

３、　プラスミドｐＤＡＢ　２１９のＤＮＡを、合成オリゴヌクレオチド： ｉ）　ＣＴＣＧＡＧＡＴＣＴＡＧＡＴＡＴＣＧＡＴＧＡＡＴＴＣＣＣ，およびｉ ｉ）　ＴＡＴ匹酊四ＴＧＴＧＡＴＡ＾ＣＣＧＡＣＡＴＡＴＧＣＣＣＣＧＧＴＴＴ ＣＧＴＴＧをプライマーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応（Ｓａｉｋｉ他、５ ｃｉｅｎｃｅ、２３９：４８７−４９１　（１９８８）　’Ｉのための鋳型とし て用いた。プライマーｌ）は、ｐＤＡＢ　２１９のヌクレオチド類４１９から４ ４６を表しており、そしてこれは、Ｘｈｏ　Ｉ　（ＣＴＣＧＡＧ）　、Ｂｇ］　 Ｉ　ｒ　（ＡＧＡＴＣＴ）、Ｘｂａ　Ｉ　（ＴＣＴＡＧＡ）　、ＥｃｏＲＶ　（ ＧＡＴＡＴＣ）　、Ｃｌａ　Ｉ　（ＡＴＣＧＡＴ）およびＥｃｏＲＩ　（ＧＡＡ ＴＴＣ）の認識部位に相当する塩基を含んでいる。プライマーｌｉ）中の１本の アンダーラインを付けた塩基は、ＢａｍＨＩの認識配列を表しておりそして２本 のアンダーラインを付けた塩基は、ｐＤＡＢ　２１９のヌクレオチド類１１３８ がら１１５９を表しており、そしてこれらは、ＯＲＦ　２５　Ｐｏ１ｙ　Ａフラ グメント（実施例５のセクションＢ参照）のヌクレオチド類２１７２８から２１ ７４９に相当している。ＰＣＲ増幅により、７６０ｂｌ）の生成物が生じた。

４、　プラスミドｐＤＡＢ　２１９のＤＮＡをＢｇｌＩＩで消化させた後、その ７２５２ｂｐのフラグメントをアガロースゲルから精製しミモしてこれを、Ｂｇ ｌｌｌとＢａｍＨＩによる上記ＰＣＲ生成物の消化によって生じる７４７Ｍのフ ラグメントに結合させた。該ＯＲＦ　２５ＰｏｌｙＡフラグメントの３′末端に 位置しているユニークなりｇ１１１部位を含んでいるプラスミドを有する大腸菌 形質転換体を同定した。

このＦＡＴコーディング配列の３°末端に関するＤＮＡ構造をＤＮＡ配列決定分 析で立証した。このプラスミドをｐＤＡＢ　２１９Δと名付けた。

このｐＤＡＢ　２１９６のＤＮＡ配列は下記の通りである。ｐｌｃ　２０Ｒ（Ｍ ａｒｓｈ他、Ｇｅｎｅ、　３２：４８１−４８５　（１９８４））のＬａｃ　Ｚ コーディングストランド上のＸｂａ１部位の最後のＡ残基の後の塩基で開始して 、リンカ−ＴＣＣＴＧＡＴＣＴＧＴＧＣＡＧＧＴＣＣＣＣに続いて、ＣａＭＶの ヌクレオチド類６６０５から７４３９に続いて、リンカ−配列ＧＧＧＧＡＣＴＣ ＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＴＣに続いて、大腸菌 のゲノムＤ　Ｎ　Ａ　（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ他（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、、８３：８４４７−８４５１　（１９８６）　）から得られる４ ４ｂｐの３′フランキングと共に、ＧＵＳのコーディング領域の残りが存在して いる。このアンダーラインを付けた塩基は、そのＧＵＳ蛋白質が有する最初の２ 個のアミノ酸のためのコドンを表しており、これらの２番目のアミノ酸は、元の 大腸菌ｕｉｄＡ遺伝子（上記Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ他、（１９８６）　）内のロイ シンから、ｐＲＡＪ２７５　（上記Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ、（１９８７））内のバ リンに変化した。

これらの塩基に続いて、リンカ−配列 ＧＧＧＧ＾＾ＴＴＧＧＡＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＴＣＣＣＣ。

そして続いてＮｏｓ　Ｐｏ１ｙ　Ａ配列（ＤｅＰｉｃｋｅｒ他、Ｊ、　Ｍｏ１ｅ ｃ、　Ａｐｐｌ。

Ｇｅｎｅｔ、、１：５６１−５７３６　（１９８２））の塩基１２９８から１５ ５４が存在している。リンカ−配列 ＧＧＧＡＡＴＴＧＡＧＡＴＣＡＧＧＡＴＣＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＧに続いて、Ｃ ａＭＶの塩基４９５から６９７２、リンカ−ＣＡＴＣＧＡＴＧ、そしてＣａＭＶ 塩基７０９０から７４４３が存在している。これらの塩基に続いて、リンカ− Ｃ＾＾ＧＣＴＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧＴＣ。

そして続いて、ｐｌＪ４１０４　（Ｗｈｉｔｅ他、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ ｅ５１１８：１０６２（１９９１））内のｂａｒクローンヌクレオチド類２０か ら５７９に相当している塩基、リンカ−ＣＴＧＴＧＡＴＡＡＣＣ，そしてＯＲＦ 　２５／２６　ｐｏｌｙ　Ａヌクレオチド類２１７２８から２２４４０　（Ｂａ ｋｅｒ他、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ］ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、２：３３５−３５０１　（１ ９８３））　、リンカ−ＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＣＧＡＴＡＴＣＴＡＧＡＴＣＴＣ Ｇ＾ＧＣＴＣＧＧＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣ。

そしてｐＩＣ２０Ｒの残りが存在している。このＢｇｌｌｌ認識部位（アンダー ラインを付けた）は、他の遺伝子を導入することが可能なユニークな部位を表し ている。ｐＤＡＢ　２１９Δに関する部分的制限地図を添付する。制限酵素Ｎｏ ｔＩのための認識配列（ＧＣＧＧＣＣＧＣ）を含んでいるオリゴヌクレオチドを 該Ｂｇ１１１部位の中に導入することにより、プラスミドｐＤＡＢ２１９Δ−Ｎ ｏｔ（図７の中に示す）が得られた。

実施例６：ジヤガ芋塊茎皮組織からのｃＤＮＡライブラリー構築Ａ、ＲＮＡ精製 ４ｃｍのジャガ芋塊茎（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕＩＩｃｖ、　５ｕｐ ｅｒｉｏｒ）から皮と外側皮質組織を収穫した後直ちに液体窒素の中で凍結した 。凍結した組織を液体窒素下の乳鉢の中で粉砕して細かい粉末を生じさせた。組 織の５ｇを、多量ノ、５０ｍＭのトＩＪス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）　、４％の バラ−アミノサリチル酸、１％のトリーイソプロピルナフタレンスルホン酸、１ ０ｍＭのジチオトレイトールおよび１０ｍＭの異性重亜硫酸ナトリウムで抽出し た。次に、均一化した液を、８−ヒドロキシキノリンが０．１％入っているフェ ノールを等体積用いて抽出した。遠心分離にかけた後、その水層を、クロロホル ム：イソアミルアルコール（２４：　１）を含んでいるフェノールを等体積用い て抽出した後、クロロホルム、オクタツール（２４：１）を用いた抽出を行った 。その後、７．５Ｍの酢酸アンモニウムを加えることで最終濃度を２．５Ｍにし た。このＲＮＡを一２０℃で一晩沈澱さ也遠心分離で集め、２．５Ｍの酢酸アン モニウムで再沈澱させた後、７０％のエタノールで洗浄した。この乾燥したＲＮ Ａを水の中に再懸濁させた後、−８０℃で保存した。１ｌｙｂｏｎｄ　ｍＡＰ” メツセンジャー親和紙（＾ｍｅｒｓｈａｍ）を用いてＰｏ　Ｉ　ｙ　Ａ”ＲＮＡ を単離した。

Ｂ　ライブラリーの構築およびスクリーニング５ａｇのＰｏ　Ｉ　ｙ　Ａ”ＲＮ ＡとＺＡＰ−ｃＤＮＡＴＭ合成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてｃｌ） ＮＡを合成した。大きさで選択したｃＤＮＡを、２ｕｇのＵｎｉＺａｐ　ＸＲ” ベクターアーム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に結合させた後、Ｇｉｇａｐａｃｋ　 ＧｏｌｄＴＭパッケージング抽出物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、ファー ジ粒子の中に詰め込んだ。詰め込み後、推定で約４．２ｘｌＯ’個のクローンが 得られた。このプレート増幅させたライブラリーは、宿主菌株として大腸菌ＰＬ Ｋ−Ｆ’　”細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて滴定して約５゜Ｏｘ　１０ ”ｐ　ｆ　ｕ／ｍＬ含んでいた。ｐｉｃｏＢｌ　ｕｅＴＭ免疫スクリーニングキ ット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）および８７ｋＤのＰＰＩ蛋白質に対するポリクロ ーナルラビット抗血清（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｃｏｍｐａｎｙ ）を用いて、約１５Ｘ１０５個のプラークをスクリーニングにかけた（１０　ｃ ｍのフィルター当たり１．５ｘｌＯ’）。プラークの純度を保証する目的で、最 も強い反応を示すプラークを再び更に３回スクリーニングにかけた。ＵｎｉＺａ ｐラムダベクターの中に工学処理する切除メカニズムを用いて、これらのプラー クからＤＮＡをプラスミドとしてサブクローン化した。

Ｃプラスミドの単離およびササン分析による確認アルカリ性溶菌方法（」二記Ｓ ａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９））を用いてプラスミド１）ＮＡを単離した。Ｅ　 ｃ　ｏＲＩ　／Ｘｈ　ｏ　Ｉ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を 用いた完全消化およびアガロースゲル電気泳動法を用いて、挿入断片の大きさを 測定した。負の対照を１つ含んでいる９つの最大ｃＤＮＡを上の如く消化させた 後、１％のアガロースに通す電気泳動にかけ、ニトロセルロース（Ｓｃｈｌｅｉ ｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ）に対してプロットした。ＰＰＩのアミノ酸配列 が有するＣ末端およびＮ末端領域を基とする２個のオリゴヌクレオチドプローブ を、ＤＮＡシンセサイザー（＾ｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ、　 Ｍｏｄｅｌ　２８Ａ）で合成した後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用い、（ ３２Ｐ）ＡＴＰでそれらの５°末端に櫟識を付けた。５０ｍＬの６ｘＳＳＣ（０ ，９Ｍの塩化ナトリウム、０．０９Ｍのクエン酸ナトリウム）、５ｘのＤｅｎｈ ａｒｄｔｓ溶液、２０ｍＭのＮａＰＯ４（ｐｉ（７，４）　、０．５％のＳＤＳ および２５０Ｍｇ／ｍＬのサケ精液ＤＮＡの中で２時間、フィルターを個別に３ ７℃で予めハイブリッド形成させた。個々のボックスに各々のプローブを１２ｘ ｌＯ’ｃｐｍ添加した同じ溶液の中で、ハイブリッド形成を３７℃で一晩行った 。次に、これらのフィルターを、２ＸのＳＳＣ（０，４５Ｍの塩化ナトリウム、 ０．０４５Ｍのクエン酸ナトリウム）十０１％のＳＤＳ中、室温で３回洗浄した 後、２ｘＳＳＣ＋０，１％ＳＤＳ中３７℃で３０分間、１回洗浄した。これらを 、Ｋｏｄａｋ　Ｘ−ＯＭＡＴフィルムに２４時間暴露した。

これらのｃＤＮＡの２つは、該Ｃ末端およびＮ末端プローブの両方に強い相同性 を示した。これらのクローンの最も長いクローンの長さは１ｋｂであると測定さ れ、そしてこれをジャガ芋シスタチン１　（ＰＣＩ）と名付け、ＤＮＡ配列決定 を用いてこのクローンの更に一層の特徴付けを行った。

実施例７：ＰＰＩの単一シスタチン様単位の遺伝情報を指定する遺伝子集団（ｎ ｅｓｔｅｄ）欠失を生じさせるＥｒａｓｅ−＾−Ｂａｓｅ”キット（Ｐｒｏｍｅ ｇａ、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　ＷＩ）および５ｅｑｕｅｎａｓｅ”キット（ＵＳ　 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ。

０１（）を用いて、ＰＣＩ内挿入断片の完全な配列を測定した。このＤＮＡを、 ＰＰＩメソセージの３゛末端から誘導させた。これの５゛末端は、シスタチン様 単位の遺伝情報を指定する領域内で始まって、そして続いて、そのカルボキシ末 端に、２つの完結した単位の遺伝情報を指定する配列が存在している。これはま た、３゛非翻訳領域とｐｏｌｙＡテールを含んでいる。９４℃で１分、５０’Ｃ で１分および７２°Ｃで３分がら成る２５サイクルを用いて、末端前単位をＰＣ Ｒ増幅させた（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＳＮｏｒｖａｌｋＳＣＴ）　ｏ　３８ ０　Ａ　ＤＮＡシンセサイザー（＾ｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏｓｙｓｔｅｗｓＳＦｏ ｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）を用いてプライマー（ＧＴＣＡＴＡＧ＾＾ＴＴＣ ＡＡＣＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＡＴＧＴＣＣＣＡＡＴＡＣＴＣおよびＧＧ＾ ＾ＣＡＡＴＧＡＴＡＡＧＡＧＣＴＣＡＴＴＡＣＴＴＴＧＣＡＣＴＡＴＣＡＴＣＡ ＣＣ）を組み立てた。これらは、その５°末端に、Ｎｃｏ１部位内の枠内（ｉｎ −ｆｒａｍｅ）開始剤ＡＴＧを付加し、そしてその３′末端に、ＴＡＡ停止コド ンと５ｓｔ１部位を付加する。この増幅したＤＮＡを、ｐＣＲｌｏｏＱ　（Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）にクローン化した。ＮｃｏＩ ’−３ｓｔｌフラグメントを用いて、完全なシスタチン様単位の遺伝情報を指定 する領域を植物発現ベクターであるｐＤＡＢ３０３−Ｎｏｔの中に転移させた。

この構築した遺伝子の機能保全を示す目的で、その得られるプラスミドであるｐ ＤＡＢ１１８９を用いた。これを、培養したトウモロコシ細胞のプロトプラスト の中に導入すると、これは、抗ＰＰＩ抗血消と特異的に交差反応するポリペプチ ドの合成を導いた。

実施例８：ＰＰｌの分泌シスタチン様単位の遺伝情報を指定する遺伝子２３個の アミノ酸から成るアミン末端シグナルペプチドの遺伝情報を指定する配列を、ｐ ＤＡＢ１１８９内のＰＰＩコーディング配列に加えた。プレパタチン（ｐｒｅｐ ａｔａｔｉｎ）　ｃ　ＤＮＡクローン（ｐＤＡＢ１００８）から誘導されるシグ ナル配列を、合成オリゴヌクレオチド類から、下記の３段階で組み立てた。

１、　ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ） を用い、このＤＮＡをＡｆｌｌｌｌで切断し、これらの末端をＤＮＡポリメラー ゼＩのクレノーフラグメントて満たした後、このプラスミドをＴ４ＤＮＡリガー ゼで再環化することによって、ＡｆｌＩＩＩ部位を有していないベクターを調製 した。製造業者のプロトコルに従う酵素を用いた。

２．２つのオリゴヌクレオチド Ａ＾＾ＴＡＡＡＡＴＴＡ＾＾＾ＡＡＧＡＴＴＴＡＧ）を、ｐＫＫ２３３−２誘導 体の中の、ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩ１１部位の間にクローン化した。この得られる プラスミドｐＤＡＢ１０７９は、ＮｃｏｌとＡｆｌ１１１部位（アンダーライン を付けた）の間にこのシグナルの最初の２２個のアミノ酸を含んでいる。

３、　ｐＤＡＢ１０７９のＡｆｌｌｌｌとＨｉｎｄｌ１１部位の間にオリゴヌク レオチド類ＣＡＴＧＴＧＣＣＡＴＧＧとＡＧＣＴＴＣＣＡＴＧＧＣＡをクローン 化することによって、このシグナル配列を完結させた。

これらは、最終コドンに続いて、枠内ＡＴＧコドンを含んでいるＮｃ。

１部位を付加する。Ｎｃｏｌフラグメントを用いて、この完結したシグナルを、 ｐＤＡＢ１１８９内のＰＰＩコーディング配列から導入することでｐＤＡＢ１２ ０９を生じさせた。このプラスミドがコード化する前駆体シスタチン様単位は、 下記のアミノ末端配列を有している。

ｐＤＡＢ１２０９：　ＭＡＴＴＫＳＦＬＩＬＦＦＭＩＬＡＴＴＳＳＴＣＡＭＡＧ ＤＶＰＩＬＧＧ、、。

ｃｆ、ｐＤＡＢ１０８９：　ＭＡＧＤＶＰＩＬＧＧ、、。

実施例９・全長ＰＰＩの遺伝情報を指定するイントロンを有する遺伝子ＰＣＩが 有する６５０ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントを用いて、その塊茎ｃＤＮＡライブ ラリーの再スクリーニングを行うことにより、より長いｃＤＮＡクローンが得ら れた。ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＵｎｉ−Ｚａｐミルマニュアル述されている如く 、このライブラリーを大腸菌ＰＬＫ−Ｆ’　細胞の上に塗布した。プレート（直 径８０ｍｍ）当たり約３０００個のファージから成る低密度でのみ用いた、と言 うのは、ハイブリッド形成プラークの集団が多くなると予測されるからである。

これらのプラークをＮｙｔｒａｎ１フィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　５ｃｈ ｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、　ＮＯ）に移した後、Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ１Ｍ装 置（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内でＵＶ照射することによって固定させた。

このゲル精製したＰＣＩフラグメントを、ランダムプライマー類（Ｂｏｅｈｒｉ ｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　ＩＮ）から、ク レノー重合によりジゴキソゲニン（ｄｉｇｏｘｙｇｅｎｉｎ）て標識した。製造 業者のプロトコルに従い、２ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中６５℃の緊縮洗浄を用 いて、フィルターのハイブリッド形成を行った。アルカリ性ホスファターゼ（Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に連成させた抗ジゴキシゲニン抗体を 用いて結合を検出した。

ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＬｌｎｉ−Ｚａｐ”″マニュアルに記述されている如く 、このファージとへルバーファージ（Ｒ４０８）を共感染させることにより、ハ イブリッド形成ｃＤＮＡをファージミドとして切除した。これらの７フージミト からヘルパーを除去するには、低密度で再形質転換を行う余分な段階が必要であ った。ＮｃｏｌとＸｈｏｌを用いた消化に続くアガロースゲル電気泳動により、 これらのｃＤＮＡ挿入物の大きさを測定した。

最も長い挿入断片（ｐＤＡＢ１０３４内）は、はとんど４種のシスタチン様単位 、非關訳３゛領域およびｐｏｌｙＡテールの遺伝情報を指定した。

３種のシスタチン様単位の遺伝情報を指定するｐＤＡＢ１０３４のＢｓｍ１フラ グメントをゲル精製した後、上と同様にして、ジゴキシゲニンで標識した。この プローブを用いて、ファージラムダＦｉｘ”　ＩＩ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ） 内のジャガ芋ゲノムＤＮＡフラグメントのライブラリーをスクリーニングした。

プレート当たり２０，０００の密度でファージを塗布する以外は上と同じ条件を 用いた。低密度で再塗布してハイブリッド形成するサイクルを３回行うことによ って、１つのクローンであるＢＺ２を精製した。指数増殖している大腸菌ＬＥ３ ９２細胞に、細胞当たり１０個のファージを感染させることによって、上記ファ ージの大規模製造を行った。収率を最大にする目的で、２５Ｏｒｐｍおよび３７ ℃で２゜５時間増殖させた後、この培養物を１０倍希釈し、そして再び一晩培養 した。クロロホルム（４ｍＬ／Ｌ）を添加することによって、細胞溶解を終了し た。６％のＮａＣ１を用いて室温で１．５時間処理した後、低速遠心分離にかけ ることにより、砕片を除去した。７％のＰＥＧ６００Ｑ　（Ｆｌｕｋａ　ＡＧＳ Ｂｕｃｈｓ、　５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎｄ）を用い、水上で５時間処理することに よってそのファージを再び沈澱させた後、１２，０００ｘｇで１０分間遠心分離 することによってそれを集めた。１００ｍＭのＮａＣｌ。

８ｍＭのＭｇ５Ｏ，，０，０１％のゼラチン、５０ｍＭのトリフ、ＨＣＩ（ｐＨ ７，５）の中にファージを再懸濁させた後、ＣｓＣ１（４３％Ｗ／ｗ）中の平衡 密度遠心分離法を用い、１５５，０００ｘｇで一晩遠心分離することによって精 製した。５０％のホルムアミド、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ＭのトリスＨＣＩ 　（ｐＨ８，５）中で一晩培養した後、エタノールで沈澱させることにより、浮 遊密度のＣｓＣｌ中のファージからＤＮＡを調製した。

標準制限酵素分析およびササンブロッティング（上記＾ｕｓｕｂｅｌ他、１９８ ７：　Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）　）により、ＢＺ２のＤＮＡの特徴付け を行った。

このファージは、１３ｋｂの挿入断片を含んでおり、このシスタチン様相同は、 ５ｋｂの中心領域の中に位置していた。このハイブリッド形成領域に渡るフラグ メントを、ｐＵｃｌ８またはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ”ＴＩプラスミド（Ｓｔｒ ａｔａｇｅｎｅ）にサブクローン化した後、上述した如く配列決定した。ＢＺ２ 内のＰＰＩ遺伝子は９個のエクソンと８個のイントロンを含んでいる。これは、 他のドメインを有していない８個のシスタチン様単位から成るポリペプチドの遺 伝情報を指定する。各々の単位のためのＤＮＡには、オリザシスタチン遺伝子（ Ｋｏｎｄｏ　（１９９１）、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｓ　２７８：８７−９０および Ｋｏｎｄｏ　（１８９９）、Ｇｅｎｅ、　８１：２５９−２６５）の中に見いだ されるイントロンと同じ位置にイントロンが割り込んでいる。

プライマー ＴＴＣＧＣＡＧＣＣＡＴＧＧＣＡＡＴＣＧおよびＴＴＴＡＡＡＣＴＣＣＡＡＡＣ ＴＡＧＡＡＴＣを用いたＰＣＲ増幅により、このコーディング配列の５°末端を 修飾することで、該開始剤ＡＴＧの回りにＮｃｏＩ部位を生じさせた。この増幅 させたフラグメントを、ｐＴＡｌ、即ちｐＵｃｌ、９誘導体にクローン化する結 果として、このクローニング配列の３′末端がポリリンカー中のＢａｍＨ１部位 に隣接するようにした。この挿入物内のユニークなＨｐａ■部位とそのベクター 内のＢａｍＨ１部位の間に存在している領域を、ｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ 内のＢＺ２が有する６、２ｋｂのＸｈｏＩフラグメントを含んでいるｐＤＡＢ１ ２８６由来の５ｋｂのＨｐａｌ−ＢａｍＨＩフラグメントて置き換えた。これに よって、１，５ｋｂの３°非翻訳配列と一緒にＰＰＩ遺伝子全体が再構築された 。次に、Ｎｃｏｌフラグメントを用いて、この変異させたコーディング領域を、 植物発現ベクターであるｐＤＡＢ３０３−Ｎｏ　ｔに転移させた。このプラスミ ドからの発現カセットを、Ｎｃｏｌフラグメントとして、ベクターｐＤＡＢ２１ ９Δ−Ｎｏｔの中に転移させた。トウモロコシ植物の形質転換を行う目的で、こ の得られるプラスミドｐＤＡＢ１４００を用いた。

実施例１０：全長ＰＰＩのためのイントロン無し遺伝子コーディング領域の間の ＤＮＡをループアウト（Ｌｏｏｐ　ｏｕｔ）するプライマーを用いた部位特異的 変異誘発により、クローン化したＰＰＩゲノム配列カラソノイントロンを除去す る。ＴｒａｎｓｆｏｒＩＩｌｅｒ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｃ１ｏｎ ｔｅｃｈ、　Ｐａ１ｏ　ＡｌｔｏＳＣ＾）を用いて上記変化を行う。イントロン を有するＰＰＩ遺伝子を含んでいるプラスミドを、２つのプライマーからインビ トロ複製により変異誘発させる。１つのプライマー（ＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＡＴ ＡＣＣＧＡＧＣＴＣ）を用いて、このベクター内のユニークなＫｐｎＩ部位を除 去する。２番目のプライマー （ＧＡＴＴＡＴ＾＾ＴＡＡＧ＾＾＾ＧＡＧＡＡＴＧＣＴＣＡＴＴＴＧＧＡＧＴＴ Ｔ）は、このＰＰＩ遺伝子のイントロン６に隣接しているコーディング配列に相 同性を示す。Ｋｐｎｌ消化に対する耐性を用いて、イントロン６を有していない 変異プラスミドを選択する。変異誘発を連続して繰り返すことによって、このＰ ＰＴゲノムクローンから全てのイントロンを除去してもよい。次に、植物細胞の 中で発現させるためのｐＤＡＢ３０３−Ｎｏｔの中に、そのコーディング配列を 転移させてもよい。このプラスミドから得られる発現カセットを、ＮｏｔＩフラ グメントとして、ベクターｐＤＡＢ２１９Δ−Ｎｏｔの中に転移させた。この得 られるプラスミドを用いて、トウモロコシ植物の形質転換を行った。

実施例１トジャガ芋パパイン阻害剤を発現する形質転換したトウモロコシ植物の 発生 Ａ、　粉になり易い胚形成カルス培養物の引立遺伝子型Ｂ７３　ｘ　Ａ１８８の 未成熟胚から、粉になり易い胚形成するトウモロコシカルスを開始させる。プン トコーン（ｄｅｎｔ−ｃｏｒｎ）同系繁殖体Ｂ７３およびスウィートコーン（ｓ ｗｅｅｔ−ｃｏｒｎ）同系繁殖体Ａ１８８の種を、それぞれＨｏ１ｄｅｎ’ｓ　 Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　５ｅｅｄｓ、　Ｉｎｃ、　、　Ｗｉｌｌｉａｍｓｂｕｒ ｇ。

Ｉ＾およびｔｈｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、　Ｃｒ ｏｐ　Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ、　Ｓｔ、　Ｐａｕｌ 、ＭＮから入手した。乾燥した土壌ミックス（Ｃｏｎｒａｄ　Ｆａｆａｒｄ、　 Ｉｎｃ、、Ｓｐｒｊｎｇｆｉｅｌｄ、　ＭＡ）の約１８ｋｇを湿らせてそのｐＨ を６．０に調整した土が入っているポットの中に、種を独立して撒いた。これら の植物を１６／８光周期下の温室の中に維持する。ポットのレベルの上２ｍの所 の最小光強度が１，５００フィート−キャンドルになるように、高圧ナトリウム および金属ハロゲン化物ランプと組み合わせて周囲日光を補う。温室の温度を日 中３℃から３８℃内に維持し、そして夜は２２℃に維持する。これらの植物を、 必要に応じて、８　ｍ　ｇ　／　Ｌのキレート化鉄（Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ、、 Ｇｒｅｅｎｓｂｏｒｏ、ＮＣ）と共に４００ｍｇ／Ｌの２０−２０−２０肥料（ Ｗ、　Ｒ，Ｇｒａｃｅ　＆　ＣｏＳＦｏｇｅｌｓｖｉｌｌｅ、　ＰＡ）溶液で湿 らす。

撒いた後約５０−６０日で、オスの花序（房）が花粉を落とし、そして絹状物が 、メスの花序（穂）から出て来た。この同系繁殖体系Ａ１８８の植物が有する房 の上に紙袋を置くことで花粉を集める。該同系繁殖系Ｂ７３のメス植物を調製し て、未受精の穂シュートの殻と絹状物の上部を切断することにより、花粉が利用 される前日に授粉の準備を行う。

次の日、これらの絹状物が成長して厚い「ブラシ状物」が全て同じ長さになった 後、花粉を注意深くその絹状物に付け、そしてその穂全体を紙袋で覆う。

この発生分化するハイブリッド胚の長さが約１．５−２．０ｍｍに到達した時点 で（授粉後１０−１４日後）、この穂を切除し、そして７０％Ｖ／Ｖのエタノー ルの中に１０分間浸漬した後、２０％Ｖ／Ｖの市販漂白剤（１％の次亜塩素酸ナ トリウム）の中に３０分間浸漬することによって表面を殺菌した。殺菌した蒸留 水で濯いだ後、未成熟の胚を無菌状態で単離し、そしてこの胚の軸を培地に接触 させた状態（小鱗片側をその培地から離すように）で「カルス」培地の上に置い た。この「カルス」培地は下記の成分を含んでいる：Ｎ６基本塩類およびビタミ ン類（Ｃｈｕ他、Ｐｒｏｃ、　Ｓｙｍｐ、　Ｐｌａｎｔ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ ｔ、、５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｐｅｋｉｎｇ、　４３−５６頁（１９７ ８））　、２０　ｇ／Ｌのスクロース、６９１ｍｇ／Ｌのプロリン、１００ｍｇ ／Ｌのカゼイン加水分解物、１ｍｇ／Ｌの２．４−ジクロロ−フェノキシ酢酸（ ２，４−Ｄ）　、および２．５ｇ／Ｌのゲルライト（ｇｅｌｒｉｔｅ）　（Ｋｅ ｌｃｏ、　Ｉｎｃ、、Ｓａｎ　ＤｉｅｇｏＳＣＡ）　（ｐＨ５，８に調整）。

この未成熟のハイブリッド胚を、暗所中２８℃で１０−３０日間培養したが、こ の間に、カルス組織（これは種々の型の形態を表している）が、この小鱗片領域 から増殖する。この間に生じてくるカルス組織を下記の３つの異なる種類に分類 分けする・ｉ）如何なる明らかな形態学的組織化もなされていない柔らかで顆粒 状の半透明なカルス（非胚形成として知られている）；ｉｉ）明確な小鱗片様お よびコレオプタイル（ＣＯｌｅｏｐｔｉｌ、ｅ）棟構造を有する体細胞胚（しば しば融合している）の群から成る黄色みがかった白色の小型のこぶ状カルス（タ イプＩとして知られている）：および１ｉｉ）胚柄様の構造の上に数多（の小球 体状で長く伸びた体細胞胚を有する柔らかなカルス（タイプＩＩとして知られて いる）。タイプＩＩのカルスが、粉になり易い胚形成培養物を樹立するに最も適 切である。この種類の組織を用いると、時には小鱗片全体が増殖するか、或は時 には、この形態を表す小さい部分のみが発生分化する。

この時点で、いくらか葉えきに抱かれている未分化の軟質組織と一緒に、充分に 明確な小球体状で長く伸びた体細胞胚を有する組織のみを新鮮な「カルス」培地 に移す、選択的継代培養が必要である。

１０−１４日毎に、このカルスを継代培養して「カルス」培地を新しくし、正確 な形態を有する組織のみを注意深く選択する。最初の８−１０週間、タイプＩＩ のカルスのみを選択することにより、この組織の量を多くすると共に、非胚形成 およびタイプＩに対する選択を行う。各々の継代培養で、典型的には、大きさが 約１ｇに到達したカルスから１００ｍｇ未満の組織を選択する。従って、組織の タイプに関する厳密な選択を行うことから、最初の８−１２週間では、タイプＩ Ｉカルスの量は１ｇまでには増大しない。最初の３力月間、い（っかの系統（系 統は、するタイプＩＩ形態を失った場合、これらを廃棄する。約８−１６週の時 、よく樹立されたタイプＩＩ培養物の中で、異なる種類の組織の選択を進めるこ とができる。この組織（タイプＩＩＩとして知られている）は、これは形態学的 にいくらか高い同質性を示しているが、目に見える体細胞胚がないことで比較的 未分化である点で、タイプＴＩとは異なっている。この色は明るいから輝いた黄 色で変化する。通常、このような同質のタイプＩＩＩ組織を常規実験に充分な量 （０，５−１，０ｇ）で得るには約１６−２０週かかる。

タイプＩＩＩのカルスを樹立する１４−２０週の期間の間、選択を繰り返した後 タイプＩＩまたはタイプＩに戻った場合、多くの系統を廃棄する。１４−２０週 令の時、これらの培養物を、それらが植物を再生する能力に関して検査する（実 施例１１のセクションＣ）。再生しない系統を廃棄する。タイプＩＩＩの形態を 維持しておりそして植物を再生し得る培養物を、粉になり易い胚形成カルスと呼 ぶ。

Ｂ、　微粒子推進（Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｐｒｏｐｕｌｓｉｏｎ）によ る形質転換形質転換実験で用いるに先立って、金粒子の表面上にプラスミドＤＮ Ａを吸着させる。これらの金粒子は、直径が約１．　５−３．　０ミクロンの範 囲の直径を有する球である（＾１ｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｍｉ ｌ、ｗａｕｋｅｅ、　ｆＩ）、３００ｕＬのＤＮＡ／金墾濁液（７０ｕｇのｐＤ ＡＢ１４００．０．０１Ｍのトリス緩衝液、および１ｍＭのＥＤＴＡ）に７４ｕ Ｌの２゜５Ｍ塩化カルシウムと３０ｕＬの領　１Ｍスペルミジンを加えることに よって吸着を達成する。このＤＮＡをコートした金粒子を直ちに渦動させた後、 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管の底に沈降させ、そしてその得られる透明な液体を完全に 排出させる。次に、このＤＮＡコートした金粒子を１ｍＬの１００％エタノール の中に再懸濁させる。次に、この懸濁液を希釈することで、］、ｍＬのエタノー ル当たり１５ｍｇのＤＮＡ／金になるようにして、微粒子推進実験で用いる。

継代培養して５−７日後の、粉になり易（・胚形成カルス組織の約２５０ｍｇを 、「カルス」培地の表面上に置いた直径が１ｃｍ片の濾紙（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅ ｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅ１１．　Ｉｎｃ、　、　Ｋｅｅｎｅ、　ＮＨ）の上に、 薄層として配置する。このカルス組織を使用するに先立って、層状流れフードの 中で数分間、このプレートにカバーを付けないまま放置することによって、その 組織を若干乾燥させる。粒子衝撃の準備において、このカルスを１０４ミクロン のステンレス鋼スクリーンで覆う。ヨーロッパ特許出願ＥＰ　０４０５６９６　 Ａｔの中に記述されている粒子衝撃装置を用いて、この粉になり易い胚形成カル ス組織に向かってそのＤＮＡコートした金粒子を加速させる。ＤＮＡコートした 全懸濁液の約１ｕＬを搬送する各々の衝撃で、各々のカルス組織サンプルに１０ −１５回衝撃を与える。

ＩＩｌ、形質転換した組織の選択および植物再生上記サンプルの衝撃を行った後 、カルス組織を、前に記述した条件（実施例１１のセクションＩ参照）下で１− ２日間培養する。１−２日後、各々の組織サンプルを等しく約６０分割（１−３ ｍｍの直径）した後、３０ｍｇ／ＬのＢａ５ｔａが入っている新鮮な「カルス」 培地に移す。３週間毎に、カルス組織を非選択的に、新鮮なりａｓｔａ含有「カ ルス」培地に移す。この濃度の除草剤ではほとんど発育が観察されない。８−１ ６週間後、発育が抑制されている組織の背景から増殖して来る部分が観察される 。この組織を他のカルスから単離して、独立させてＢａ５ｔａ含有「カルス」培 地の上に維持することで、１０−１４日毎に選択的継代培養を行う。この時点で 、アッセイ用緩衝液（０，２Ｍの燐酸ナトリウム（ｐＨ８，０）、各々０．１ｍ Ｍのフェリシアン化カリウムとフェロシアン化カリウム、１．０ＭのＥＤＴＡナ トリウム、およびｌ　ｍ　ｇ　／　Ｌの５−ブロモ−４−クロロ−２−インドリ ル−ベーターＤ−グルクロニド）が約５００ｕＬ入っている２４個ウェルのミク ロリットル皿（ＣｏｒｎｉｎｇＳＮｅｗ　ＹｏｒｋＳＮＹ）の中に、カルス組織 の少量サンプルを置くことによって、ｇｕｓ発現に関するヒストケミカルアッセ イを行う。ジャガ芋パパイン阻害剤抗血清を用いた免疫プロット分析により、ジ ャガ芋パパイン阻害剤遺伝子発現も評価する。

Ｂａ５ｔａ耐性を示すカルス、ｇｕｓ陽性カルス、およびジャガ芋パパイン阻害 剤陽性カルスを選択的に継代培養で「誘導」培地に入れ、弱い光（１２５フィー ト−キャンドル）の中で１週間２８°Ｃで培養した後、冷蛍光ランプによって与 えられる強い光（３２５フィート−キャンドル）の中で１週間培養する。この「 誘導」培地は、ＭＳ塩およびビタミン類（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　ａｎｄ　Ｓｋｏ ｏｇ、　１９６２）　、３０　ｇ／　Ｌのスクロース、１００ｍｇ／Ｌのミオ− イノシトール、５　ｍ　ｇ　／　Ｌのベンジル−アミノプリン、０．０２５ｍｇ ／Ｌの２．４−Ｄ、２．５ｇ／Ｌのゲルライト（Ｇｅｌｒｉｔｅ）（ｐＨを５． ７に調整）を含んでいる。この２週間から成る誘導期間に続いて、このカルスを 非選択的に「再生」培地に移し、そして強い光の中２８℃で培養する。この「再 生」培地は、ＭＳ塩およびビタミン類、３０ｇ／Ｌのスクロース、および２．５ ｇ／Ｌのゲルライト（ｐＨを５．７に調整）を含んでいる。１４−２１日毎に、 このカルスを継代培養で、新鮮な「再生」培地に移すことで、分化する葉と根が 存在していると見られる組織を選択する。両方の「誘導」および「再生」培地は ３０ｍｇ／ＬのＢａ５ｔａを含んでいる。小植物を、約１ｋｇの乾燥土壌ミック スを完全に湿らせた土が入っているｌＱｃｍのポットに移した後、約４日間透明 なプラスチック製カップで覆う。葉の数が３−５枚の段階で、植物をより大きな ポットに移した後、前に記述した如く発育させて（実施例１１のセクションＡ参 照）、成熟させる。同じ培養物から再生させた植物に対して、自己もしくは同胞 授粉を行う。形質転換した子孫に関する解析を得る目的で、形質転換していない 親系統（即ちＢ７３またはＡ１８８）に対する交雑も行うことができる。

ＩＶ、　ジャガ芋パパイン阻害遺伝子の組込みに関する確認再生した植物および 子孫の中にそのジャガ芋パパイン阻害剤遺伝子が存在していることを確認する目 的で、ゲノムＤＮＡのササンプロット分析を行う。下記の如く、凍結乾燥した菓 組織から各々の植物のＤＮＡを調製する。約５００ｍｇの組織を１６ｍＬのポリ プロピレン管（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｅｎｓｏｎ、　Ｌｉｎｃｏｌｎ　Ｐａｒｋ 、　ＮＪ）の中に入れ、これに９ｍＬのＣＴＡＢ抽出用緩衝液（６，５７ｍＬの 水、０．９ｍＬの１．　０Ｍ　Ｉ−リス（ｐＨ７，５）　、１．２６ｍＬの５Ｍ 塩化ナトリウム、０．１８ｍＬの領５Ｍ　ＥＤＴＡ、０．０９ｇの混合アルキル トリーメチルアンモニウムブロマイド、および０．０９ｍＬのベーターメルカプ トエタノール）を加えた後直ちに、６０℃の水浴中で時々撹拌しながら培養する 。約６０分後、２４．１のクロロホルム／オクタツールを４．５ｍＬ加え、そし て約５分間穏やかに混合する。９００ｘｇで１０分間室温で遠心分離した後、上 部の水層を、６ｍＬのイソプロパツールが入っている１　６ｍＬのポリプロピレ ン管の中に注ぎ、ここで、ＤＮＡの沈澱を生じさせる。

この沈澱して来たＤＮＡを直ちにガラス製フックで取り出して、２０分かけて、 １−２ｍＬの７６％エタノールと０．２Ｍの酢酸ナトリウムが入っている５ｍＬ の使い捨て層管に移す。次に、１．ｍＬの７６％エタノールと１０ｍＭの酢酸ア ンモニウムが入っているミクロフユージ管の中て短期間、先にこのＤＮＡをフッ ク上で１で、４００ｕＬのＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリス（ｐＨ８，０）および １ｍＭのＥＤＴＡ）が入っているミクロフユージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）管に移 した後、４℃でロッカの上に一装置く。次の日、溶解していない固体を、高速遠 心分離に１０分間かけることによって除去する。次に、このＤＮＡを含んでいる 上澄み液をピペットで新しいミクロフユージ管に移した後、４℃で保存する。

分光光度測定装置を用い２６０ｎｍの吸収を測定することにより、このサンプル 内のＤＮＡ濃度を測定する。製造業者（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬ ａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）が示すように、制 限酵素であるＢａｍＨｌまたはＥｃｏＲｌのどちらがを用いて約８ｕｇのＤＮＡ を消化させる。このような酵素の組み合わせは、該ジャガ芋パパイン阻害剤遺伝 子を傷付けないで切断する。次に、領　８％のアガロースゲル上でこのＤＮＡを 分別した後、製造業者（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅ１１．　Ｉ ｎｃ、、Ｋｅｅｎｅ。

ＮＨ）が示すように、ナイロン膜の上に移す。ｐＤＡＢ１４００由来のジャガ芋 パパイン阻害剤遺伝子フラグメントをプローブとして用いる。

５０ミクロキユーりの３２−Ｐ−ｄＣＴＰを用い、供給者の指示に従って、Ｃｌ ｉｇｏ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｉｎｃ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）でランダム にプライマーを標識することによって、プローブＤＮＡ１ｉｌｕする。次に、０ ．２５ｘＳＳＣ（３０ｍＭの塩化ナトリウム、３．０ｍＭのクエン酸ナトリ・ラ ム）と０．　２％のドデシル硫酸ナトリウム中６０℃で４５分間、プロットを洗 浄し、吸い取って乾燥した後、増感紙を２枚用いて一晩ＸＸＡＲ−５フィルムに 暴露する。

昆虫の攻撃に対する耐性を評価する目的で、牛腸有効性を示す植物シスタチンを 最大レベルで発現する形質転換した植物を、１２”ポット内の土壌中で発育させ る。この土壌にジアブロチカ・ビルギフェラ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ　ｖｉｒｇ ｉｆｅｒａ）の卵を外寄生させ、そしてこれらの植物を、４週間に渡り、生存、 高さ、根塊、および直立性に関して監視する。牛腸有効性を示す植物ンスタチン を発現する植物は、ジアブロチ力幼虫による損傷の影響から有意に保護される。

二者択一的に、［有害生物ジアブロチカの試験方法Ｊ　（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏ ｒ　ｔｈｅ　５ｔｕｄｙ　ｏｆ　Ｐｅ５ｔ　Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ）　（１９８ ６）、Ｊ、　Ｌ、　ＫｒｙｓａｎおよびＴ、　Ａ、　Ｍｉｌｌｅｒ編集、Ｓｐｒ ｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１７２−１８０頁に詳述さ れている方法を用いて、形質転換した植物およびＰＰＩを発現する形質転換した 植物の集団をジアブロチ力耐性に関して評価する。

実施例１２：ＰＰＩ遺伝子とンヤガ芋カルボキシペプチダーゼ阻害剤を用いたト ウモロコシの共形質転換 ２番目のトウモロコン組織をジャガ芋カルボキシペプチダーゼ阻害剤（ＣＰＩ） 遺伝子で形質転換する以外は本質的に実施例１１の操作を繰り返す。このジャガ 芋ＣＰＩ遺伝子は、Ｇｌｕ−Ｇｉｎ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−１１ｅ −Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓの配列で 表される蛋白質をコード化する。

ボスホアミジト化学が用いられているＭｏｄｅｌ　３８０Ａ　ＤＮＡシンセサイ ザー（＾ｐｐ］ｉｅｄ　ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＳＦｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　Ｃ Ａ）を用いて、相当するコーディングおよび非コーディングオリゴヌクレオチド 配列を合成した。フェノール／クロロホルム抽出、クロロホルム抽出およびエタ ノール沈澱を用いて過剰の試薬を除去した後、これらのフラグメントをＴ４リガ ーゼ緩衝液の中に溶解させる。この混合物を８５°Ｃに加熱した後、ゆっ（りと １５℃に冷却し、そして１５℃で少なくとも４時間維持することにより、これら のフラグメントをアニールさせる。

次に、ｐＤＡＢ３０３上のユニークな制限部位を認識する制限エンドヌクレアー ゼを過剰量て用いてｐＤＡＢ３０３を消化させた後、大きい方のベクターフラグ メントをアガロースゲル電気泳動法て精製する。この得られるフラグメントと合 成したカルボキシペプチダーゼ遺伝子を、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼと一緒に培養す る。

このプラスミドをトウモロコシ細胞に形質転換し、そして安定に形質転換したト ウモロコシ細胞を、実施例１」の操作に従って再生させる。

それぞれ実施例１１および実施例１２で再生させた植物から得られる種子を発芽 させ、そしてその得られる植物を自己授粉させる、即ち１つの植物から得られる 花粉を用いてそれ自身の授粉を行うことで、Ｓｏ集団を生じさせる。この得られ る穂由来の８１種子を発育させ、そして自己授粉させることによって８２生殖質 を生じさせる。それぞれ実施例１１および実施例１２から誘導される選択したＳ ２植物の間での交雑を行う。この得られるＦ１ハイブリッドを、ＰＰＩとＣＰＩ の共発現に関して評価する。

昆虫の攻撃に対する抵抗力を評価する目的で、形質転換したトウモロコシ植物を 発育させた後、実施例１１で考察した如（、ジアブロチカ・ビルギフエラ卵に感 染させる。

実施例１３：稲植物の形質転換 Ｃｈｒｉｓｔｏｕ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　９：９５７−９６２　 （１９９１）の中に示されている操作を本質的に用いて、図１に挙げる配列で表 される遺伝子を稲植物（Ｏｒｙｚａ　５ａｔｉｖａ）の中に導入する。実施例１ １に挙げた形質転換技術を用いて、この遺伝子をその稲組織培養物の中に挿入す る。

昆虫の攻撃に対する抵抗力を評価する目的で、実施例１１の操作を本質的に用い て、形質転換した稲植物を発育させた後、米のぞうむしに感染させる。

実施例１４　綿植物の形質転換 粒子衝撃またはアグロバクテリウム仲介形質転換のどちらかを用いて、図１に挙 げる配列で表される遺伝子を綿（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ　ｈｉｒｓｕｔｕｍ　Ｌ、 　）植物の中に導入する。

Ａ、　粒子衝撃 ＦｉｎｅｒおよびＭｃＭｕｌｌｅｎ、　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ 、８：５８６−５８９　（１９９０）に示されている操作を本質的に用いて、図 １に挙げる配列で表される遺伝子を綿植物の中に導入する。実施例１１に挙げた 形質転換技術を用いて、この遺伝子をその綿組織培養物の中に挿入する。

昆虫の攻撃に対する抵抗力を評価する目的で、実施例１１の操作を本質的に用い て、形質転換した綿植物を発育させた後、わたのぞうむしに感染させる。

Ｂ　アグロバクテリウム仲介形質転換 Ｆｉｒｏｚａｂａｄｙ他、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、 　１０：１０５−１１６　（１９ｇ？）に示されている操作を本質的に用いて、 図１に挙げる配列で表される遺伝子を綿植物の中に導入する。形質転換で用いる バイナリ−ベクターであるｐＨ７０７−Ｎｏｔ　（図８に挙げる）は、幅広い宿 主範囲のプラスミドＲＰ４を基にしている。これは、ユニークなＮｏｔｌクロー ニング部位に隣接しているオクトピン型ＴｉプラスミドのΔおよびＢ縁、選択性 マーカー１９Ｓ−ｎｐｔｌｌ　ｏｒｆ　２６およびスコアラブル（ｓｃｏｒａｂ ｌｅ）マーカー３５Ｓ−ｇｕｓ−ｎｏｓを含んている。ＲＰ４のテトラシフリン 耐性遺伝子を、細菌内の選択に適したエルスロマイジンーおよびカナマイシン− 耐性遺伝子で置き換えた。

昆虫の攻撃に対する抵抗力を評価する目的で、実施例１１の操作を本質的に用い て、形質転換した綿植物を発育させた後、わたのぞうむしに感染させる。

実施例１５：アルファルファ植物の形質転換Ｄ’　Ｈａｌｌｕｉｎ他、Ｃｒｏｐ 　Ｓｃｉ、、３０：８６−８７１　（１９９０）の中に示されている操作を本質 的に用いて、図１に挙げる配列で表される遺伝子をアルファルファ植物の中に導 入する。形質転換で用いるバイナリ−ベクターはｐＨ７０７−Ｎｏｔである。

昆虫の攻撃に対する抵抗力を評価する目的で、実施例１１の操作を本質的に用い て、形質転換したアルファルファ植物を発育させた後、エジプトアルファルファ のぞうむしおよびアルファルファのぞうむしに感染させる。

実施例１６．乾燥豆植物の形質転換 米国特許第５．０１５．５８０号の中に示されているのと同じ操作を本質的に用 いて、ジャガ芋パパイン阻害剤をコード化する図１に挙げる配列で表される遺伝 子を乾燥豆植物（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）の中に導入する。

昆虫の攻撃に対する抵抗力を評価する目的で、実施例１１の操作を本質的に用い て、形質転換した植物を発育させた後、メキシカンビーンビートルに感染させる 。

実施例１７．ジャガ芋植物の形質転換 ５ｈａｈｉｎおよびＳｉｍｐｓｏｎ、　１１ｏｒｔｓｃｉｅｎｃｅ、２１（５） ：１１９９−１２０２　（１９８６）の中に示されているのと同じ操作を本質的 に用いて、図１に挙げる配列で表される遺伝子をジャガ芋植物（Ｓｏｌａｎｕｍ 　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ　Ｌ、　）の中に導入することを行う。形質転換で用いる バイナリ−ベクターはｐＨ７０７−Ｎ。

ｔである。

昆虫の攻撃に対する抵抗力を評価する目的で、実施例１１の操作を本質的に用い て、形質転換したジャガ芋植物を発育させた後、じゃがいもはむしに感染させる 。

実施例１８：菜種植物の形質転換 Ｃｈａｒｅｓｔ他（１９８７）、Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐｌ　Ｇｅｎｅｔ　（１９ ８８）、７５：４３８−４４５の中に示されているのと同じ操作を本質的に用い て、図１に挙げる配列で表される遺伝子を菜種（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ 　Ｌ、　）の中に導入することを行う。形質転換で用いるバイナリ−ベクターは ｐＨ７０７−Ｎｏｔである。

昆虫の攻撃に対する抵抗力を評価する目的で、実施例１１の操作を本質的に用い て、形質転換した菜種植物を発育させた後、のみとびよろいむしに感染させる。

実施例１９　トマトの葉からマルチドメインの牛腸有効性を示すンスタチンの単 離 画用のトマト植物から得られる葉を切除して、葉柄を湿った砂の中に入れた。こ れらの葉を連続した照明の下に４日間維持した後、これらを、各々５０μｇ／ｍ Ｌのロイペプチン、アンチパインおよびペプスタチンと１ｍＭのエチレンジアミ ンテトラアセテートが入っているＯ、１Ｍの燐酸ナトリウム（ｐＨ７，５）を用 い（組織１ｇ当たり２ｍＬ）　、Ｗａｒｉｎｇブレンダーの中で穏やかに均一化 する。４層のチーズ布を通して濾過した後、この濾液を、５ｏｒｖａｌｌ　Ｇ５ ３ｏ−夕−を用い１９当たり１２，０００回転で遠心分離した後、このベレット を鉤　ＩＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４）の中に取り上げる。この溶液を遠心分離 にかけることで不溶材料を除去した後、その上澄み液を００１Ｍのトリス（ｐＨ ７，５）に対して透析する。この透析物をＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｍｏｎｏ　Ｑ　 ＨＲ１０／１０カラムの上に載せ、０−３００ｍＭの塩化ナトリウム勾配を用い ４０分かけて溶離させる。ピークのパパイン阻害活性を含んでいる画分をプール し、水に対して透析した後、濃縮する。この精製したポリペプチドを、実施例１ に記述した如く消化させた後、配列情報を得る。実施例２および３に記述した方 法を用いて、このポリペプチドは、ジアブロチカ幼虫の牛腸プロテアーゼおよび ジアブロチカ発育の有効な阻害剤であることが示された。

本発明の好適な特定具体例を言及して本発明を相当に詳しく記述してきたが、上 述しそして添付請求の範囲に記述する如き本発明の精神および範囲内で変更およ び修飾が行われ得ることは理解されるであろう。

Ｍ工ＶＧＧＬＶＤＶ　ＰＦＥＮＫＶＥＦＤＤ　ＬＡＲＦＡＶＱＤＹＮＱＫＮＤＳ ＳＬＥＦＫ　ＫＶＬＮＶＫＱＱ工Ｖ　ＡＧ工ＭＹＹ工ＴＦＥＡＴＥＧＧＮＫＫＥ Ｙ　ＥＡＫ工ＬＬＲＫＷＥ　ＤＬＫＫＷＧＦＫＬｌｏｏ　１１０　１２０ ＶＧＤＤＳＴＭＰＧＧ　工ＶＮＶＰＮＰＮＮＴ　ＫＦＱＥＬＡＲＦＡ工ＱＤＹＮ ＫＫＱＮＡＨＬＥＦＶＥＮＬＮＶＫ　ＥＱＷＡＧ工ＭＹＹ工ＴＬＭＴＤＤＡＧ　 ＫＫＫ工ＹＫＡＫ工Ｗ　ＶＫＥＷＥＤＦＫＫＶＶＥＦＫＬＶＧＤＤ工　ＡＫＬＧ Ｇ工ＴＤＶＰ　ＦＰＮＮＰＥＦＱＤＬＡＲＦＡ工ＱＶＹＮＫ　ＫＥＮＶＨＬＥＦ ＶＥ　ＮＬＮＶＫＱＱＷＡＧＭＭＹＹ工ＴＬＡＡ　よりＡＧＫＫＫ工ＹＥ　ＴＫ 工ＷＶＫＥＷＥＤＦＫＫＷＥＦＫＬＶ　ＧＤＤＳＡＫＴＧＧ工　工ＮＶＰＮＰＮ ＳＰＥＦｉｇ、　１　（ＣＯＮＴ、） ＥＷＥＤＦＫＫＶより　ＦＫＬＶＧＮＤＳＡＫ　ＫＬＧＧＦＴＥＶＰＦＰＮＳＰ ＥＦＱＤＬＴ　ＲＦＡＶＨＱＹＮＫＤ　ＱＮＡＨＬＥＦＶＥＮＬＮＶＫＫＱＷＡ Ｇ　ＭＬＹＹ工ＴＦＡＡＴ　ＤＧＧＫＫＫ工ＹＥＴに工ＷＶＫＶＷＥＮＦ　ＫＫ ＷＥＦＫＬＶＧ　ＤＤＳＡＫＬＧＧ工工４９０　５００　５１Ｏ ＮＶＰＦＰＮＮＰＥＦ　ＱＤＬＡＲＦＡＶＱＤ　ＹＮＫＫＥＮＡＨＬＥＦＶＥＮ ＬＮＶＫＥＱ　ＬＶＡＧＭＬＹＹ工Ｔ　ＬＶＡよりＡＧＫＫＫ工ＹＥＡＫ工ＷＶ ＫＥ　ＷＥＮＦＫＫＶ工ＥＦ　ＫＬ工ＧＤＤＳＡ工工ＧＧＦＴＤＶＰＦＰＮ　Ｎ ＰＥＦＱＤＬＡＲＦ　ＡＶＱＤＹＮＫＫＥＮＦｉｇ、　１　（ＣＯＮＴ、） ＧＤＡＴＫ ＡＴＣＴＴ　ＣＴＣＣＡ　ＡＡＴＴＧ　ＣＣＴＣＡ　ＡＡＴＴＴ　ＴＡＧＡＴＡ ＴＭＧ　ＣＴＣＣＴ　ＣＴＣＡＡ　ＣＡＴＴＴ　ＣＧＡＴＴ　ＣＴＴＴＴＧＡＣ ＡＴ　ＡＴＴＡＣＣＣＡＴＴ　ＣＡＡＡＡ　ＣＧＧＡＧ　ＣＴＣＧＴＴＣＧＴＧ 　ＧＴＴＡＧ　ＴＣＡＡＡ　ＡＴＴＡＧ　ＡＡＣＴＣＡＡＧＣＴＦｉｇ、２　（ ＣＯＮＴ、） ＴＧＴＧＣＴＴＣＡＡ　ＡＧＴＴＴ　ＣＡＡＣＣＴＴＴＡＧ　ＣＴＴＣＧＡＴＴ ＴＴ　ＣＡＡＣＣＴＡＴＡＧ　ＴＴＡＧＴ　ＡＡＴＴＴ　ＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣ ＡＣＴＴＧ　ＡＴＡＴＧ　ＭＴＡＴ　ＴＧＧＡＴ　ＡＡＴＴＡＦｉｇ、　２　（ ＣＯＮＴ、） ＧＣＴＡＧ　ＣＣＴＴＴ　ＴＴＴＴＴ　ＣＴＣＴＡ　ＴＡＡＡＡ　ＡＧＣＡＧＴ ＴＡＴＧ　ＴＴＣＡＣＣＴＴＣＴ　ＴＣＴＣＡ　ＴＣＡＣＡ　ＡＡＡＡＣＡＴＴ ＣＣＴＴＣＴＴ　ＣＴＴＭ　ＴＴＡＡＧ　ＴＴＡＴＴ　ＭＴＴＡ。

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Claims (49)

【特許請求の範囲】
1. １．消化システインプロテアーゼを有する１種以上の昆虫（類）による昆虫の外 寄生に対して植物または前記植物の一部を保護する方法であつて、前記昆虫（類 ）を制御すべき遺伝子座に阻害量の中腸有効性を示す植物シスタチンを存在させ ることで、阻害量の中腸有効性を示す植物シスタチンを前記昆虫に摂取させるこ とを含んでなる方法。
2. ２．該中腸有効性を示す植物シスタチンが、２個以上のシスタチンドメインを有 する蛋白質である、請求の範囲１の方法。
3. ３．該中腸有効性を示す植物シスタチンが、ジャガ芋パパピン阻害剤またはトマ トパパピン阻害剤である、請求の範囲２の方法。
4. ４．該中腸有効性を示す植物シスタチンが、中腸有効性を示す植物シスタチンと 、この中腸有効性を示す植物シスタチンを不活性化する昆虫消化酵素を不活性化 し得る相乗剤とである、請求の範囲１の方法。
5. ５．該中腸有効性を示す植物シスタチンが、単一シスタチンドメインのペプチド であり、そして該相乗剤がカルボキシペプチダーゼ阻害剤である、請求の範囲４ の方法。
6. ６．該中腸有効性を示す植物シスタチンが、図１に挙げるアミノ酸配列で表され る蛋白質であるか或はそれの機能誘導体である、請求の範囲３の方法。
7. ７．該中腸有効性を示す植物シスタチンを、この中腸有効性を示す植物シスタチ ンを誘導した植物種とは異なる植物種に適用する、請求の範囲１から６の方法。
8. ８．該植物のゲノムの中に、この植物の中で活性を示すプロモーター配列と共に 中腸有効性を示す植物シスタチンの遺伝情報をコードする配列を挿入することに より、該中腸有効性を示す植物シスタチンを昆虫制御量で与えるレベルでこの中 腸有効性を示す植物シスタチン配列を発現させることを含む、請求の範囲１の方 法。
9. ９．（ａ）該植物由来の細胞または組織を培養し、（ｂ）この細胞または組織の 細胞に、該中腸有効性を示す植物シスタチンの遺伝情報を指定する遺伝子の少な くとも１つのコピーを導入し、 （ｃ）この細胞または組織培養物から、耐性を示す全植物を再生させる、 段階を更に含む、請求の範囲８記載の方法。
10. １０．該植物の中で活性を示すプロモーター配列と共に中腸有効性を示す植物シ スタチンの遺伝情報をコードする該配列の少なくとも１つのコピーをその生殖子 孫の細胞中に存在させるような様式で、その全植物を性的もしくはクローン的に 生殖させる更に一層の段階を含む、、請求の範囲９の方法。
11. １１．（ａ）請求の範囲１０の方法で調製した、繁殖力のある、昆虫耐性を示す 植物を選択し、 （ｂ）この昆虫耐性を示す植物と、感受性を示す変種からの昆虫に感受性を示す 植物由来の植物とを性的に交雑させ、（ｃ）この交雑の子孫から生殖材料を回収 し、そして（ｄ）この生殖材料から、耐性を示す植物を発育させる、段階を更に 含む、請求の範囲１０記載の方法。
12. １２．（ａ）該昆虫耐性を示す子孫と、該感受性を示す変種からの、本質的にホ モ接合性を示す、昆虫に感受性を示す植物とを、戻し交雑させ、そして （ｂ）この戻し交雑の子孫の中から、昆虫耐性とその感受性を示す変種が有する 他の特質の両方の発現に関して選択する、更に一層の段階を、その昆虫耐性と共 にその感受性を示す変種の特質が所望パーセントでその子孫の中に存在するまで 繰り返して行うことを含む、 本質的にホモ接合性を示す集団の、感受性を示す変種の植物に、昆虫耐性を与え るための、請求の範囲１１記載の方法。
13. １３．昆虫の感染から保護される植物がトウモロコシ、アルファルファ、綿、菜 種、乾燥豆、ジャガ芋または稲である請求の範囲１の方法。
14. １４．活性材料として昆虫制御量または防除量の、少なくとも１種の中腸有効性 を示す植物シスタチンと担体を含んでいるが農学組成物。
15. １５．該中腸有効性を示す植物シスタチンが、２個以上のシスタチンドメインを 有する蛋白質である、請求の範囲１４の農学組成物。
16. １６．該中腸有効性を示す植物シスタチンが、ジャガ芋パパピン阻害剤またはト マトパパピン阻害剤である、請求の範囲１５の農学組成物。
17. １７．該中腸有効性を示す植物シスタチンが、中腸有効性を示す植物シスタチン と、この中腸有効性を示す植物シスタチンを不活性化する昆虫消化酵素を不活性 化し得る相乗剤とである、請求の範囲１６の農学組成物。
18. １８．該中腸有効性を示す植物シスタチンが、単一シスタチンドメインのペプチ ドであり、そして該相乗剤がカルボキシペプチダーゼ阻害剤である、請求の範囲 １７の農学組成物。
19. １９．該中腸有効性を示す植物シスタチンが、図１に挙げるアミノ酸配列で表さ れる蛋白質であるか或はそれの機能誘導体である、請求の範囲１８の農学組成物 。
20. ２０．中腸有効性を示す植物シスタチンを昆虫制御量で発現する、コーンルート ワーム、とうもろこしのぞうむし、レッサーグレインボアラおよびのみとびよろ いむしの１種以上による攻撃に耐性を示す、形質転換したトウモロコシ植物およ びそれの性的子孫。
21. ２１．該植物が、それのゲノムの中に安定に組み込まれているＤＮＡ配列を含ん でおり、ここで、上記ＤＮＡ配列が、該中腸有効性を示す植物シスタチンを昆虫 制御量で与えるレベルでこの中腸有効性を示す植物シスタチン配列を発現させる ための、この植物の中で活性を示すプロモーター配列の下流に、中腸有効性を示 す植物シスタチンをコード化し得るコーディング領域を含んでいる、請求の範囲 ２０の形質転換したトウモロコシ植物およびそれの性的子孫。
22. ２２．該中腸有効性を示す植物シスタチンが、図１に挙げるアミノ酸配列で表さ れる蛋白質であるか或はそれの機能誘導体である、請求の範囲２１の形質転換し たトウモロコシ植物。
23. ２３．該植物が、それのゲノムの中に安定に組み込まれている第二ＤＮＡ配列を 更に含んでおり、ここで、上記ＤＮＡ配列が、該蛋白質を不活性化し得る昆虫消 化酵素を不活性化するに充分な量で与えるレベルでカルボキシペプチダーゼ阻害 剤を発現させるための、この植物の中で活性を示すプロモーター配列と共に、カ ルボキシペプチダーゼ阻害剤をコード化し得るコーディング領域を含んでいる、 請求の範囲２２の形質転換したトウモロコシ植物。
24. ２４．中腸有効性を示す植物シスタチンを昆虫制御量で発現する、米のぞうむし による攻撃に耐性を示す、形質転換した稲植物およびそれの性的子孫。
25. ２５．該植物が、それのゲノムの中に安定に組み込まれているＤＮＡ配列を含ん でおり、ここで、上記ＤＮＡ配列が、該中腸有効性を示す植物シスタチンを昆虫 制御量で与えるレベルでこの中腸有効性を示す植物シスタチン配列を発現させる ための、この植物の中で活性を示すプロモーター配列と共に、中腸有効性を示す 植物シスタチンをコード化し得るコーディング領域を含んでいる、請求の範囲２ ４の形質転換した稲植物およびそれの性的子孫。
26. ２６．該中腸有効性を示す植物シスタチンが、図１に挙げるアミノ酸配列で表さ れる蛋白質であるか或はそれの機能誘導体である、請求の範囲２５の形質転換し た稲植物。
27. ２７．中腸有効性を示す植物シスタチンを昆虫制御量で発現する、コロラドじゃ がいもはむしおよびスリーラインドポテトビートルの１種以上による攻撃に耐性 を示す、形質転換したジャガ芋植物およびそれの性的子孫。
28. ２８．該植物が、それのゲノムの中に安定に組み込まれているＤＮＡ配列を含ん でおり、ここで、上記ＤＮＡ配列が、該中腸有効性を示す植物シスタチンを昆虫 制御量で与えるレベルでこの中腸有効性を示す植物シスタチン配列を発現させる ための、この植物の中で活性を示すプロモーター配列と共に、中腸有効性を示す 植物シスタチンをコード化し得るコーディング領域を含んでいる、請求の範囲２ ７の形質転換したジャが芋植物およびそれの性的子孫。
29. ２９．該中腸有効性を示す植物シスタチンが、図１に挙げるアミノ酸配列で表さ れる蛋白質であるか或はそれの機能誘導体である、請求の範囲２８の形質転換し たジャガ芋植物。
30. ３０．中腸有効性を示す植物シスタチンを昆虫制御量で発現する、わたのぞうむ しによる攻撃に耐性を示す、形質転換した綿植物およびそれの性的子孫。
31. ３１．該植物が、それのゲノムの中に安定に組み込まれているＤＮＡ配列を含ん でおり、ここで、上記ＤＮＡ配列が、該中腸有効性を示す植物シスタチンを昆虫 制御量で与えるレベルでこの中腸有効性を示す植物シスタチン配列を発現させる ための、この植物の中で活性を示すプロモーター配列と共に、中腸有効性を示す 植物シスタチンをコード化し得るコーディング領域を含んでいる、請求の範囲３ ０の形質転換した綿植物およびそれの性的子孫。
32. ３２．該中腸有効性を示す植物シスタチンが、図１に挙げるアミノ酸配列で表さ れる蛋白質であるか或はそれの機能誘導体である、請求の範囲３１の形質転換し た綿植物。
33. ３３．中腸有効性を示す植物シスタチンを昆虫制御量で発現する、エジプトアル ファルファのぞうむしおよびアルファルファのぞうむしの１種以上による攻撃に 耐性を示す、形質転換したアルファルファ植物およびそれの性的子孫。
34. ３４．該植物が、それのゲノムの中に安定に組み込まれているＤＮＡ配列を含ん でおり、ここで、上記ＤＮＡ配列が、該中腸有効性を示す植物シスタチンを昆虫 制御量で与えるレベルでこの中腸有効性を示す植物シスタチン配列を発現させる ための、この植物の中で活性を示すプロモーター配列と共に、中腸有効性を示す 植物シスタチンをコード化し得るコーディング領域を含んでいる、請求の範囲３ ３の形質転換したアルファルファ植物およびそれの性的子孫。
35. ３５．該中腸有効性を示す植物シスタチンが、図１に挙げるアミノ酸配列で表さ れる蛋白質であるか或はそれの機能誘導体である、請求の範囲３４の形質転換し たアルファルファ植物。
36. ３６．中腸有効性を示す植物シスタチンを昆虫制御量で発現する、のみとびよろ いむしによる攻撃に耐性を示す、形質転換した菜種植物およびそれの性的子孫。
37. ３７．該植物が、それのゲノムの中に安定に組み込まれているＤＮＡ配列を含ん でおり、ここで、上記ＤＮＡ配列が、該中腸有効性を示す植物シスタチンを昆虫 制御量で与えるレベルでこの中腸有効性を示す植物シスタチン配列を発現させる ための、この植物の中で活性を示すプロモーター配列と共に、中腸有効性を示す 植物シスタチンをコード化し得るコーディング領域を含んでいる、請求の範囲３ ６の形質転換した菜種植物およびそれの性的子孫。
38. ３８．該中腸有効性を示す植物シスタチンが、図１に挙げるアミノ酸配列で表さ れる蛋白質であるか或はそれの機能誘導体である、請求の範囲３７の形質転換し た菜種植物。
39. ３９．この蛋白質が２個以上のシスタチンドメインを含んでおりそして消化シス テインプロテアーゼを有する昆虫の１種以上による昆虫の外寄生を制御し得る、 本質的に純粋な、中腸有効性を示す植物シスタチン。
40. ４０．該シスタチンが、図１に挙げるアミノ酸配列で表される蛋白質であるか或 はそれの機能誘導体である、請求の範囲４１の本質的に純粋な中腸有効性を示す 植物シスタチン。
41. ４１．２個以上のシスタチンドメインを含んでいる蛋白質をコード化し得るＤＮ Ａ単離物。
42. ４２．該ＤＮＡ単離物が、図１に挙げるアミノ酸配列またはそれの機能誘導体の 遺伝情報を指定するヌクレオチド配列を有する、請求の範囲４１のＤＮＡ単離物 。
43. ４３．下流コーディング配列の植物細胞内発現を促進するに有効なプロモーター 、２個以上のシスタチンドメインを含む蛋白質を植物細胞内で発現させる遺伝情 報をコードするＤＮＡコーディング領域、および植物細胞内における遺伝構築産 物の転写または翻訳を停止させるに有効な停止配列を含んでおり、ここで、この 遺伝構築が、中腸有効性を示す植物シスタチンを昆虫制御量でその植物の細胞内 で発現させるに有効である、生物学的機能を示す発現伝達体。
44. ４４．該ＤＮＡ単離物が、図１に挙げるアミノ酸配列またはそれの機能誘導体を コード化する、請求の範囲４３の生物学的機能を示す発現伝達体。
45. ４５．この発現伝達体がｐＤＡＢ２１９Δ−Ｎｏｔである、請求の範囲４３の生 物学的機能を示す発現伝達体。
46. ４６．この発現伝達体がｐＤＡＢ２１９Δ−Ｎｏｔである、請求の範囲４４の生 物学的機能を示す発現伝達体。
47. ４７．請求の範囲４３から４６いずれか１項の生物学的機能を示す発現伝達体で 形質転換した宿主細胞。
48. ４８．該植物細胞がトウモロコシ、アルファルファ、綿、菜種、乾燥豆、ジャガ 芋および稲である請求の範囲４７の宿主細胞。
49. ４９．該ＤＮＡ配列が、下流コーディング配列の植物細胞内発現を促進するに有 効なプロモーター、中腸有効性を示す植物シスタチンを植物細胞内で発現させる 遺伝情報をコードするＤＮＡ配列コーディング領域、および植物細胞内における 遺伝構築産物の転写または翻訳を停止させるに有効な停止配列によって制御され ており、ここで、この遺伝構築が、消化システインプロテアーゼを有する１種以 上の昆虫を制御する該中腸有効性を示す植物シスタチンを昆虫制御量でその植物 の細胞内で発現させるに有効である、請求の範囲４８の形質転換した植物細胞。