ES2743322T3

ES2743322T3 - Gen insecticida variante AXMI115 y procedimientos de uso

Info

Publication number: ES2743322T3
Application number: ES12714905T
Authority: ES
Inventors: Duane Lehtinen; Nalini Desai; Volker Heinrichs
Original assignee: BASF Agricultural Solutions Seed US LLC
Current assignee: BASF Agricultural Solutions Seed US LLC
Priority date: 2011-04-05
Filing date: 2012-04-04
Publication date: 2020-02-18
Anticipated expiration: 2032-04-04
Also published as: UA122856C2; EP3498849A1; AR085939A1; AU2019210561A1; US20150376244A1; EA201391444A1; EA202091496A1; HUE045066T2; US20180251780A1; MX367427B; AU2012240347A1; US20160186202A1; UA120584C2; EA036053B1; CN103635579A; ZA201307363B; CN110055264A; MX344229B; AU2017202747A1; EP3971297A1

Abstract

Una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida, en la que dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en: (a) la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20; y (c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende de una a cinco sustituciones de aminoácidos, eliminaciones o inserciones relativas a la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID: 20, en la que la actividad plaguicida del polipéptido de fusión se mejora en relación con la actividad plaguicida de SEQ ID NO: 43 en relación con la mortalidad para al menos uno del barrenador de maíz europeo, H. zea, el cogollero del maíz y la oruga de las leguminosas.

Description

DESCRIPCIÓN

Gen insecticida variante AXMI115 y procedimientos de uso

Referencia al listado de secuencias presentado electrónicamente

La copia oficial del listado de secuencias se envía electrónicamente a través de EFS-Web como un listado de secuencias con formato ASCII con un archivo llamado "2916693-093977-SEQLIST.txt", creado el 2 de abril de 2012 y que tiene un tamaño de 241 kilobytes y se presenta simultáneamente con la especificación. El listado de secuencias contenido en este documento con formato ASCII es parte de la memoria descriptiva y se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la biología molecular. Se proporcionan genes novedosos que codifican proteínas plaguicidas. Estas proteínas y las secuencias de ácido nucleico que las codifican son útiles en la preparación de formulaciones plaguicidas y en la producción de plantas transgénicas resistentes a las plagas.

Antecedentes de la invención

Bacillus thuringiensis es una bacteria del suelo formadora de esporas grampositiva caracterizada por su capacidad de producir inclusiones cristalinas que son específicamente tóxicas para ciertos órdenes y especies de insectos, pero son inofensivas para las plantas y otros organismos no diana. Por esta razón, las composiciones que incluyen cepas de Bacillus thuringiensis o sus proteínas insecticidas pueden usarse como insecticidas ambientalmente aceptables para controlar plagas de insectos agrícolas o vectores de insectos para una diversidad de enfermedades humanas o animales.

Las proteínas de cristal (Cry) (delta-endotoxinas) de Bacillus thuringiensis tienen una potente actividad insecticida predominantemente contra larvas de lepidópteros, hemípteros, dípteros y coleópteros. Estas proteínas también han mostrado actividad contra los órdenes de plagas Hymenoptera, Homoptera, Phthiraptera, Mallophaga y Acari, así como otros órdenes de invertebrados tales como Nemathelminthes, Platyhelminthes y Sarcomastigorphora (Feitelson (1993) The Bacillus Thuringiensis family tree. en Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y.) La proteína cristalina no exhibe actividad insecticida hasta que ha sido ingerida y solubilizada en el intestino medio del insecto. La protoxina ingerida se hidroliza por proteasas en el tracto digestivo del insecto a una molécula tóxica activa. (Hofte y Whiteley (1989) Microbiol. Rev. 53:242-255). Esta toxina se une a los receptores apicales del borde en cepillo en el intestino medio de las larvas diana y se inserta en la membrana apical creando canales iónicos o poros, dando como resultado la muerte de la larva.

Además de las endotoxinas, B. thuringiensis también produce proteínas insecticidas secretadas durante su etapa de crecimiento vegetativo, concretamente, proteínas insecticidas vegetativas (Vip). Desde el descubrimiento de la primera toxina Vip, se han identificado dos grupos principales de toxinas Vip en B. thuringiensis. Un grupo de toxinas Vip consiste en toxinas binarias que están formadas por dos componentes, Vip1 y Vip2 (Warren (1997) en N. B. Carozzi y M. G. Koziel (ed.), Advances in insect control: the role of transgenic plants. Taylor y Francis, Londres, Reino Unido). La combinación de Vip1 y Vip2 es altamente insecticida para un insecto agrícolamente importante, el gusano de la raíz del maíz occidental (Diabrotica virgifera), pero no muestra ninguna actividad insecticida para ningún insecto lepidóptero (Han y col. (1999) Nat. Struct. Biol. 6:932-936). El otro grupo consiste en toxinas Vip3, que no comparten similitud de secuencia con Vip1 o Vip2. La primera toxina Vip3 identificada, Vip3Aa1, es altamente insecticida para varias plagas importantes de lepidópteros de maíz y algodón, incluyendo el cogollero del maíz Spodoptera frugiperda y el gusano de algodón Helicoverpa zea, pero no muestra actividad contra el barrenador europeo del maíz Ostrinia nubilalis, una plaga importante de maíz (Estruch y col. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.U^u. 93:5389-5394). La eliminación del gen vip3Aa1 de una cepa de B. thuringiensis resultó en una reducción significativa de la actividad insecticida de esa cepa de B. thuringiensis, sugiriendo que Vip3 contribuye a la toxicidad general de las cepas de B. thuringiensis (Donovan y col. (2001) J. Invertebr. Pathol. 78:45-51). También se observó que Vip3Aa1 mata insectos al lisar las células intestinales del insecto (Yu y col. (1997) Appl. Environ. Microbiol.

63:532-536) a través de la formación de poros de la membrana celular (Lee y col. (2003) Appl. Environ. Microbiol.

69:4648-4657).

El uso intensivo de insecticidas a base de B. thuringiensis ya ha dado lugar a resistencia en las poblaciones de campo de la polilla de la espalda de diamante, Plutella xylostella (Ferré y Van Rie (2002) Annu. Rev. Entomol.

47:501-533). El mecanismo de resistencia más común es la reducción de la unión de la toxina a su receptor o receptores específicos del intestino medio. Esto también puede conferir resistencia cruzada a otras toxinas que comparten el mismo receptor (Ferré y Van Rie (2002)).

Sumario de la invención

Se proporcionan composiciones y procedimientos para conferir actividad plaguicida a bacterias, plantas, células vegetales, tejidos y semillas. Las composiciones incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican secuencias para polipéptidos plaguicidas e insecticidas, vectores que comprenden esas moléculas de ácido nucleico y células hospedadoras que comprenden los vectores. Las composiciones también incluyen las secuencias de polipéptidos plaguicidas. Se desvelan anticuerpos contra esos polipéptidos. Las secuencias de nucleótidos pueden usarse en construcciones de ADN o casetes de expresión para transformación y expresión en organismos, incluyendo microorganismos y plantas. Las secuencias de nucleótidos o aminoácidos pueden ser secuencias sintéticas que se han diseñado para la expresión en un organismo incluyendo, pero no limitado a, un microorganismo o una planta. Las composiciones también comprenden bacterias, plantas, células vegetales, tejidos y semillas que comprenden la secuencia de nucleótidos de la invención.

En particular, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican una proteína plaguicida. Por lo tanto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida, en la que dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en: (a) la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20; y (c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende de una a cinco sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoácidos relativas a la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID: 20, en la que la actividad plaguicida del polipéptido de fusión se mejora en relación con la actividad plaguicida de SEQ ID NO: 43 en relación con la mortalidad para al menos uno del barrenador de maíz europeo, H. zea, el cogollero del maíz y la oruga de las leguminosas. Adicionalmente, se abarcan las secuencias de aminoácidos correspondientes a la proteína plaguicida. Por lo tanto, la presente invención también proporciona un polipéptido recombinante que tiene actividad plaguicida, en el que dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20; y (b) una secuencia de aminoácidos que comprende de una a cinco sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos relativas a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20, en el que la actividad plaguicida del polipéptido se mejora en relación con la actividad plaguicida de SEQ ID NO: 43 en relación con la mortalidad para al menos uno del barrenador de maíz europeo, H. zea, el cogollero del maíz y la oruga de las leguminosas. También se desvela una molécula de ácido nucleico aislada o recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión, así como variantes biológicamente activas y fragmentos de las mismas, en la que la proteína de fusión comprende la porción C-terminal de SEQ ID NO: 43. En diversos casos, la proteína de fusión comprende la porción N-terminal de SEQ ID NO: 45.

En realizaciones específicas, la molécula de ácido nucleico abarcada por la presente invención (incluyendo vectores, células hospedadoras, plantas y semillas que comprenden la molécula de ácido nucleico) comprende la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID NO: 1, 4, 5 o 6 o una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 15, 18, 19 o 20. También se desvelan secuencias de nucleótidos que son complementarias a una secuencia de nucleótidos de la invención o que se hibridan con una secuencia de la invención o un complemento de la misma. Las proteínas de fusión aisladas o recombinantes codificadas por la molécula de ácido nucleico de la invención también se abarcan en el presente documento.

La presente invención proporciona además:

- un vector que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante de la invención, preferentemente que comprende además una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo;

- una célula hospedadora que contiene el ácido nucleico recombinante de la invención o el vector de la invención, preferentemente que es una célula hospedadora bacteriana o una célula vegetal;

- una planta transgénica que comprende la célula hospedadora vegetal de la invención, preferentemente, en la que dicha planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, sorgo, trigo, repollo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada y colza;

- una semilla transgénica que comprende la molécula de ácido nucleico de la invención o el vector de la invención; - una composición que comprende un polipéptido de la invención.

Se proporcionan procedimientos para producir los polipéptidos de la invención y para el uso de esos polipéptidos para controlar o matar a una plaga de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, nematodos o dípteros.

La presente invención proporciona además un procedimiento para:

(a) controlar una población de plaga de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, nematodos o dípteros que comprende poner en contacto dicha población con una cantidad eficaz como plaguicida del polipéptido de la invención o la composición de la invención; o

(b) matar una plaga de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, nematodos o dípteros, que comprende poner en contacto dicha plaga con, o suministrar a dicha plaga, una cantidad eficaz como plaguicida del polipéptido de la invención o la composición de la invención.

También se proporciona un procedimiento para producir un polipéptido con actividad plaguicida, que comprende cultivar la célula hospedadora de la invención en condiciones en las que se expresa la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido, preferentemente en el que dicha planta es una célula vegetal.

La invención proporciona además una planta que ha incorporado establemente en su genoma una construcción de ADN que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida, en la que dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20; y (b) una secuencia de aminoácidos que comprende de una a cinco sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos relativas a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20, en el que la actividad plaguicida del polipéptido se mejora en relación con la actividad plaguicida de SEQ ID NO: 43 en relación con la mortalidad para al menos uno del barrenador de maíz europeo, H. zea, el cogollero del maíz y la oruga de las leguminosas.

La invención proporciona adicionalmente un procedimiento para proteger una planta de una plaga, que comprende expresar en una planta o célula de la misma una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida, en la que dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20; y (b) una secuencia de aminoácidos que comprende de una a cinco sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos relativas a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20, en el que la actividad plaguicida del polipéptido se mejora en relación con la actividad plaguicida de SEQ ID NO: 43 en relación con la mortalidad para al menos uno del barrenador de maíz europeo, H. zea, el cogollero del maíz y la oruga de las leguminosas, preferentemente en la que dicha planta produce un polipéptido plaguicida que tiene actividad plaguicida contra una plaga de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, nematodos o dípteros.

También se proporciona un procedimiento para aumentar el rendimiento en una planta que comprende cultivar en un campo una planta o una semilla de la misma que ha incorporado establemente en su genoma una construcción de ADN que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida, en la que dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20; y (b) una secuencia de aminoácidos que comprende de una a cinco sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos relativas a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20, en el que la actividad plaguicida del polipéptido se mejora en relación con la actividad plaguicida de SEQ ID NO: 43 en relación con la mortalidad para al menos uno del barrenador de maíz europeo, H. zea, el cogollero del maíz y la oruga de las leguminosas.

Las composiciones y procedimientos de la invención son útiles para la producción de organismos con resistencia o tolerancia a plagas mejoradas. Estos organismos y composiciones que comprenden los organismos son deseables para fines agrícolas. Las composiciones de la invención también son útiles para generar proteínas alteradas o mejoradas que tienen actividad plaguicida, o para detectar la presencia de proteínas plaguicidas o ácidos nucleicos en productos u organismos.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra un diagrama de las construcciones de fusión.

La Figura 2 muestra los resultados del bioensayo de disco foliar in vitro. pAG6585 contiene optAxmi115v01 (N = 14) y pAG6141 contiene optAxmi115v02.01.01 (N = 8).

Descripción detallada

La presente invención se basa en composiciones y procedimientos para regular la resistencia o tolerancia a plagas en organismos, particularmente plantas o células vegetales. Por "resistencia" se entiende que la plaga (por ejemplo, insecto) muere tras la ingestión u otro contacto con los polipéptidos de la invención. Por "tolerancia" se entiende un impedimento o reducción en el movimiento, alimentación, reproducción u otras funciones de la plaga. Los procedimientos implican la transformación de organismos con una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína plaguicida de la invención. En particular, las secuencias de nucleótidos de la invención son útiles para preparar plantas y microorganismos que poseen actividad plaguicida. Por lo tanto, se proporcionan bacterias transformadas, plantas, células vegetales, tejidos vegetales y semillas. Las composiciones son ácidos nucleicos plaguicidas y proteínas de Bacillus u otras especies. Las secuencias encuentran uso en la construcción de vectores de expresión para su posterior transformación en organismos de interés, como sondas para el aislamiento de otros genes homólogos (o parcialmente homólogos) y para la generación de proteínas plaguicidas alteradas por procedimientos conocidos en la técnica, tales como el intercambio de dominios o la combinación de ADN, por ejemplo, con miembros de las familias de toxinas Vip1, Vip2 o Vip3. Las proteínas encuentran uso para controlar o matar plagas de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, dípteros y nematodos y para producir composiciones con actividad plaguicida.

Por "toxina plaguicida" o "proteína plaguicida" se entiende una toxina que tiene actividad tóxica contra una o más plagas, incluyendo, pero no limitado a, miembros de los órdenes Lepidoptera, Diptera, y Coleóptera o el filo Nematoda o una proteína que tiene homología a una proteína tal. Se han aislado proteínas plaguicidas de organismos que incluyen, por ejemplo, Bacillus sp., Clostridium bifermentans y Paenibacillus popilliae. Las proteínas plaguicidas incluyen secuencias de aminoácidos deducidas de las secuencias de nucleótidos de longitud completa desveladas en el presente documento, y secuencias de aminoácidos que son más cortas que las secuencias de longitud completa, ya sea por el uso de un sitio alternativo de inicio corriente abajo, o debido al procesamiento que produce una proteína más corta que tiene actividad plaguicida. El procesamiento puede ocurrir en el organismo en el que se expresa la proteína, o en la plaga después de la ingestión de la proteína.

Por lo tanto, se proporcionan en el presente documento nuevas secuencias de nucleótidos aisladas o recombinantes que confieren actividad plaguicida. Estas secuencias de nucleótidos codifican polipéptidos con homología a toxinas conocidas. También se proporcionan las secuencias de aminoácidos de las proteínas plaguicidas. La proteína resultante de la traducción de este gen permite a las células controlar o matar las plagas que lo ingieren.

Moléculas de ácido nucleico aisladas y variantes y fragmentos de las mismas

Un aspecto de la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida, en la que dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en: (a) la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ iD NO: 5 o SEQ ID NO: 6; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20; y (c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende de una a cinco sustituciones de aminoácidos, eliminaciones o inserciones relativas a la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID: 20, en la que la actividad plaguicida del polipéptido de fusión se mejora en relación con la actividad plaguicida de SEQ ID NO: 43 en relación con la mortalidad para al menos uno del barrenador de maíz europeo, H. zea, el cogollero del maíz y la oruga de las leguminosas. También se desvelan en el presente documento secuencias de nucleótidos capaces de hibridarse con las secuencias de nucleótidos de la invención en condiciones rigurosas como se define en otra parte en el presente documento. Como se usa en el presente documento, el término "molécula de ácido nucleico" pretende incluir moléculas de ADN (por ejemplo, ADN recombinante, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos del ADN o ARN generado usando análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferentemente es ADN bicatenario.

Una secuencia de ácido nucleico (o ADN) "aislada" o "recombinante" se usa en el presente documento para referirse a una secuencia de ácido nucleico (o ADN) que ya no está en su entorno natural, por ejemplo en un in vitro o en una célula hospedadora recombinante bacteriana o vegetal. En algunas realizaciones, un ácido nucleico aislado o recombinante está libre de secuencias (preferentemente secuencias que codifican proteínas) que flanquean naturalmente el ácido nucleico (es decir, secuencias ubicadas en los extremos 5 'y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del cual deriva el ácido nucleico. Para los fines de la invención, "aislado" cuando se usa para referirse a moléculas de ácido nucleico excluye cromosomas aislados. Por ejemplo, en diversas realizaciones, la molécula de ácido nucleico que codifica delta-endotoxina aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la cual deriva el ácido nucleico. En diversas realizaciones, una proteína delta-endotoxina que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que tienen menos de aproximadamente el 30%, 20%, 10% o 5% (en peso seco) de proteína distinta de deltaendotoxina (también denominada en el presente documento "proteína contaminante").

Las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas de la presente invención incluyen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1, 4, 5 y 6. Las secuencias de aminoácidos correspondientes para las proteínas plaguicidas codificadas por estas secuencias de nucleótidos se exponen en SEQ ID NO: 15, 18, 19 y 20.

En diversas realizaciones, la secuencia de nucleótidos es aquella que codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida, en la que dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en: (a) la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SeQ ID NO: 5 o SeQ ID NO: 6; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20; y (c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende de una a cinco sustituciones de aminoácidos, eliminaciones o inserciones relativas a la SEQ ID ⁿO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID: 20, en la que la actividad plaguicida del polipéptido de fusión se mejora en relación con la actividad plaguicida de SEQ ID NO: 43 en relación con la mortalidad para al menos uno del barrenador de maíz europeo, H. zea, el cogollero del maíz y la oruga de las leguminosas.

En una realización, la actividad plaguicida es actividad coleoptericida. En otra realización, la actividad plaguicida es actividad lepidoptericida. En otra realización, la actividad plaguicida es actividad nematocida. En otra realización, la actividad plaguicida es actividad diptericida. En otra realización, la actividad plaguicida es actividad hemiptericida. Los procedimientos para medir la actividad plaguicida son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews y col. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone y col. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y la patente de EE.U^u.5.743.477.

Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos, las secuencias se alinean con el fin de una comparación óptima. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, porcentaje de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (por ejemplo, posiciones superpuestas) x 100). En una realización, las dos secuencias tienen la misma longitud. En otro caso, el porcentaje de identidad se calcula a través de la totalidad de la secuencia de referencia (es decir, la secuencia desvelada en el presente documento como cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 4, 5 o 6). El porcentaje de identidad entre dos secuencias puede determinarse usando técnicas similares a las que se describen a continuación, con o sin permitir huecos. Al calcular el porcentaje de identidad, Por lo general, se cuentan las coincidencias exactas. Un hueco, es decir, una posición en una alineación en la que un resto está presente en una secuencia pero no en la otra, se considera como una posición con restos no idénticos.

La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias pueden efectuarse usando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87:2264, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90:5873-5877. Dicho algoritmo se incorpora en los programas BLASTN y BLASTX de Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Las búsquedas de nucleótidos BLAST pueden realizarse con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico de tipo plaguicida de la invención. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden realizarse con el programa BLASTX, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteína plaguicida de la invención. Para obtener alineamientos con huecos con fines comparativos, puede utilizarse el Gapped BLAST (en BLAST 2.0) como se describe en Altschul y col. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Como alternativa, PSI-Blast puede usarse para realizar una búsqueda iterativa que detecta relaciones distantes entre moléculas. Véase Altschul y col. (1997) supra. Al utilizar BLAST, los programas Gapped BLAST y PSI-Blast, pueden usarse los parámetros predeterminados de los respectivos programas (por ejemplo, BLASTX y BLASTN). La alineación también puede realizarse manualmente mediante inspección.

Otro ejemplo no limitante de un algoritmo matemático usado para la comparación de secuencias es el algoritmo ClustalW (Higgins y col. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). ClustalW compara secuencias y alinea la totalidad de la secuencia de aminoácidos o ADN y por lo tanto puede proporcionar datos sobre la conservación de la secuencia de la secuencia de aminoácidos completa. El algoritmo ClustalW se usa en varios paquetes de software de análisis de ADN/aminoácidos disponibles en el mercado, tales como el módulo ALIGNX de Vector NTI Program Suite (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Después de la alineación de las secuencias de aminoácidos con ClustalW, puede evaluarse el porcentaje de identidad de aminoácidos. Un ejemplo no limitante de un programa de software útil para el análisis de alineaciones ClustalW es GENEDOC™. GENEDOC™ (Karl Nicholas) permite evaluar la similitud e identidad de aminoácidos (o ADN) entre múltiples proteínas. Otro ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4:11-17. Dicho algoritmo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0) que es parte del paquete de programas informáticos de alineamiento de secuencias GCG, Versión 10 (disponible de Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, CA, EE.UU.). Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, puede usarse una tabla de restos de peso PAM120, una penalización por longitud de huecos de 12, y una penalización por huecos de 4.

Salvo que se indique de otra manera, GAP Versión 10, que usa el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453, se usará para determinar la identidad o similitud de secuencia usando los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos usando un peso de GAP de 50 y un peso de longitud de 3, y la matriz de puntuación nwsgapdna.cmp; % de identidad o % de similitud para una secuencia de aminoácidos usando un peso de GAP de 8 y un peso de longitud de 2, y el programa de puntuación BLOSUM62. También pueden usarse programas equivalentes. Por "programa equivalente" se entiende cualquier programa de comparación de secuencias que, para cualesquiera dos secuencias en cuestión, genera una alineación que tiene coincidencias idénticas de residuos de nucleótidos y una identidad de secuencia porcentual idéntica en comparación con la alineación correspondiente generada por GAP Versión 10.

La invención también abarca moléculas de ácido nucleico variantes. Una secuencia de nucleótidos variante de la invención es una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende de una a cinco sustituciones de aminoácidos, eliminaciones o inserciones relativas a la S^eQ ⁱD NO: 15, S^eQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID: 20, en la que la actividad plaguicida del polipéptido de fusión se mejora en relación con la actividad plaguicida de SEQ ID NO: 43 en relación con la mortalidad para al menos uno del barrenador de maíz europeo, H. zea, el cogollero del maíz y la oruga de las leguminosas. Las "variantes" de las secuencias de nucleótidos que codifican la proteína plaguicida incluyen aquellas secuencias que codifican las proteínas plaguicidas desveladas en el presente documento pero que difieren conservativamente debido a la degeneración del código genético, así como aquellas que son suficientemente idénticas como se discutió anteriormente. Las variantes alélicas de origen natural pueden identificarse con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y las técnicas de hibridación que se describen a continuación. Las secuencias de nucleótidos variantes también incluyen secuencias de nucleótidos derivadas sintéticamente que se han generado, por ejemplo, usando mutagénesis dirigida al sitio pero que todavía codifica las proteínas plaguicidas desveladas en la presente invención como se discute a continuación. Las proteínas variantes abarcadas por la presente invención son biológicamente activas, es decir, continúan poseyendo la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, actividad plaguicida. Por "retiene actividad" se pretende que la variante tendrá al menos actividad plaguicida mejorada en relación con la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID: 20, en la que la actividad plaguicida del polipéptido de fusión se mejora en relación con la actividad plaguicida de SEQ ID NO: 43 en relación con la mortalidad para al menos uno del barrenador de maíz europeo, H. zea, el cogollero del maíz y la oruga de las leguminosas. En algunas realizaciones, la actividad se mejora o se extiende en relación con una proteína de referencia de la SEQ ID NO: 43 como se define en otra parte en el presente documento. Los procedimientos para medir la actividad plaguicida son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485; Andrews y col. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone y col. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y la patente de EE.UU. 5.743.477.

El experto en la materia apreciará además que pueden introducirse cambios por mutación de las secuencias de nucleótidos de la invención dando lugar de esta manera a cambios en la secuencia de aminoácidos de las proteínas plaguicidas codificadas, sin alterar la actividad biológica de las proteínas. Por lo tanto, pueden crearse variantes de moléculas de ácido nucleico aisladas introduciendo una o más sustituciones de nucleótidos, adiciones o deleciones en la secuencia de nucleótidos correspondiente desvelada en el presente documento, de tal manera que se introducen de una a cinco sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos en la proteína codificada en relación con la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID: 20, en la que la actividad plaguicida del polipéptido de fusión se mejora en relación con la actividad plaguicida de SEQ ID NO: 43 en relación con la mortalidad para al menos uno del barrenador de maíz europeo, H. zea, el cogollero del maíz y la oruga de las leguminosas. Las mutaciones pueden introducirse mediante técnicas convencionales, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Dichas secuencias de nucleótidos variantes también están abarcadas por la presente invención.

Por ejemplo, pueden hacerse sustituciones de aminoácidos conservativas de uno a cinco, restos de aminoácidos no esenciales predichos. Un resto de aminoácido "no esencial" es un resto que puede estar alterado de la secuencia de tipo silvestre de una proteína plaguicida sin alterar la actividad biológica, mientras que se requiere un resto de aminoácido "esencial" para la actividad biológica. Una "sustitución de aminoácido conservativa" es una en la que el resto de aminoácido se sustituye con un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la materia. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

Las sustituciones de aminoácidos se pueden realizar en regiones no conservadas que retienen la función. En general, tales sustituciones no se realizarían para restos de aminoácidos conservados, o para restos de aminoácidos que residen dentro de un motivo conservado, donde tales restos son esenciales para la actividad proteica. Los ejemplos de restos que se conservan y que pueden ser esenciales para la actividad proteica incluyen, por ejemplo, restos que son idénticos entre todas las proteínas contenidas en una alineación de toxinas similares o relacionadas con las secuencias de la invención (por ejemplo, restos que son idénticos en una alineación de proteínas homólogas). Los ejemplos de restos que se conservan pero que pueden permitir sustituciones conservativas de aminoácidos y aún retener actividad incluyen, por ejemplo, restos que tienen solo sustituciones conservativas entre todas las proteínas contenidas en una alineación de toxinas similares o relacionadas con las secuencias de la invención (por ejemplo, restos que tienen solo sustituciones conservativas entre todas las proteínas contenidas en las proteínas homólogas de alineación). Sin embargo, un experto en la materia entenderá que las variantes funcionales pueden tener pequeñas alteraciones conservadas o no conservadas en los restos conservados.

Como alternativa, pueden fabricarse secuencias de nucleótidos variantes introduciendo mutaciones aleatoriamente a lo largo de toda o parte de la secuencia codificante, tal como mediante mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden seleccionarse para la capacidad de conferir actividad plaguicida para identificar los mutantes que retienen la actividad. Después de la mutagénesis, la proteína codificada puede expresarse de forma recombinante y la actividad de la proteína puede determinarse usando técnicas de ensayo convencionales.

Usando procedimientos tales como PCR, hibridación y similares las secuencias plaguicidas correspondientes pueden identificarse, teniendo tales secuencias identidad sustancial con las secuencias de la invención. Véanse, por ejemplo, Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York) e Innis y col. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY).

En un procedimiento de hibridación, la totalidad o parte de la secuencia de nucleótidos plaguicidas puede usarse para seleccionar bibliotecas de ADNc o genómicas. Los procedimientos para la construcción de tales bibliotecas de ADNc y genómicas son generalmente conocidos en la técnica y se desvelan en Sambrook y Russell, 2001, citado anteriormente. Las llamadas sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN u otros oligonucleótidos y pueden marcarse con un grupo detectable tales como 32P o cualquier otro marcador detectable, tales como otros radioisótopos, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimático. Las sondas para hibridación pueden fabricarse marcando oligonucleótidos sintéticos basados en la secuencia de nucleótidos codificante de proteínas plaguicidas conocida desvelada en el presente documento. Pueden usar adicionalmente cebadores degenerados diseñados a base de nucleótidos conservados o restos de aminoácidos en la secuencia de nucleótidos o la secuencia de aminoácidos codificada. La sonda típicamente comprende una región de secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas con al menos aproximadamente 12, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 50, 75, 100, 125, 150, 175 o 200 nucleótidos consecutivos de secuencia de nucleótidos que codifican una proteína plaguicida de la invención o un fragmento o variante de la misma. Los procedimientos para la preparación de sondas para hibridación son generalmente conocidos en la técnica y se desvelan en Sambrook y Russell, 2001, citado anteriormente.

Por ejemplo, una secuencia plaguicida completa desvelada en el presente documento o una o más porciones de la misma, puede usarse como una sonda capaz de hibridarse específicamente con secuencias de proteínas plaguicidas y ARN mensajeros correspondientes. Para lograr la hibridación específica en una diversidad de condiciones, tales sondas incluyen secuencias que son únicas y tienen preferentemente al menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud, o al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. Tales sondas pueden usarse para amplificar las secuencias plaguicidas correspondientes de un organismo elegido por PCR. Esta técnica puede usarse para aislar secuencias codificantes adicionales de un organismo deseado o como un ensayo de diagnóstico para determinar la presencia de secuencias codificantes en un organismo. Las técnicas de hibridación incluyen la selección de hibridación de bibliotecas de ADN en placa (bien placas o colonias; véase, por ejemplo, Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York).

Por lo tanto, también se desvelan sondas para hibridación, así como secuencias de nucleótidos capaces de hibridarse con toda o una parte de una secuencia de nucleótidos de la invención (por ejemplo, al menos aproximadamente 300 nucleótidos, al menos aproximadamente 400, al menos aproximadamente 500, 1000, 1200, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, o hasta la longitud completa de una secuencia de nucleótidos desvelada en el presente documento). La hibridación de tales secuencias puede llevarse a cabo en condiciones rigurosas. Por "condiciones rigurosas" o "condiciones de hibridación rigurosas" se entiende las condiciones bajo las cuales una sonda hibridará con su secuencia diana en un grado detectablemente mayor que con otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces sobre el fondo). Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. Al controlar la rigurosidad de las condiciones de hibridación y/o lavado, pueden identificarse secuencias diana que son 100 % complementarias a la sonda (sondeo homólogo). Como alternativa, las condiciones de rigurosidad pueden ajustarse para permitir cierta falta de coincidencia en las secuencias de modo que se detecten grados más bajos de similitud (sondeo heterólogo). En general, una sonda tiene menos de aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, preferentemente menos de 500 nucleótidos de longitud.

Típicamente, las condiciones rigurosas serán aquellas en las que la concentración de sal es inferior a aproximadamente 1,5 M de iones Na, típicamente de aproximadamente 0,01 a 1,0 M de concentración de iones de Na (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3 y la temperatura es de al menos aproximadamente 30 °C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60 °C para sondas largas (por ejemplo, más de 50 nucleótidos). También pueden lograrse condiciones rigurosas con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. Las condiciones ejemplares de baja rigurosidad incluyen hibridación con una solución tampón de formamida del 30 al 35 %, NaCl 1 M, SDS (dodecil sulfato sódico) al 1 % a 37 °C y un lavado en SSC 1X a 2X (SSC 20X = NaCl 3,0 M/citrato trisódico 0,3 M) a 50 a 55 °C. Los ejemplos de condiciones de rigurosidad moderada incluyen hibridación en formamida del 40 al 45 %, NaCl 1,0 M, s Ds al 1 % a 37 °C y un lavado en 0,5X a SSC 1X a 55 a 60 °C. Las condiciones ejemplares de alta rigurosidad incluyen hibridación en formamida al 50%, NaCl 1 M, SDS al 1 % a 37 °C, y un lavado en SSC 0,1X a 60 a 65 °C. Opcionalmente, los tampones de lavado pueden comprender de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 1 % de SDS. La duración de la hibridación es generalmente menor de aproximadamente 24 horas, generalmente de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas.

La especificidad es típicamente la función de los lavados posteriores a la hibridación, los factores críticos son la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para híbridos de ADN-ADN, la T^mpuede aproximarse a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: T^m= 81,5 °C 16,6 (log M) 0,41 (% GC) - 0,61 (% forma) - 500/l; donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, % GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % de forma es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La T^mes la temperatura (bajo la fuerza iónica y pH definidos) a la cual el 50 % de una secuencia diana complementaria hibrida con una sonda perfectamente coincidente. T^mse reduce en aproximadamente 1 °C por cada 1 % de falta de coincidencia; por lo tanto, T^m, las condiciones de hibridación y/o lavado pueden ajustarse para hibridarse con secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con >90% de identidad, la T^mpuede disminuirse 10 °C. En general, se seleccionan las condiciones rigurosas para ser aproximadamente 5 °C menores que el punto de fusión térmica (T^m) para la secuencia específica un pH con una fuerza iónica definida. Sin embargo, las condiciones severamente estrictas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1, 2, 3 o 4 °C por debajo del punto de fusión térmica (T^m); las condiciones moderadamente estrictas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9 o 10 °C por debajo del punto de fusión térmica (T^m); las condiciones de baja rigurosidad pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 11, 12, 13, 14, 15 o 20 °C por debajo del punto de fusión térmica (T^m). Usando la ecuación, la hibridación y las composiciones de lavado y Tm deseadas, aquellos expertos en la materia entenderán que las variaciones en la rigurosidad de las soluciones de hibridación y/o lavado se describen inherentemente. Si el grado deseado de desajuste resulta en una Tm de menos de 45 °C (solución acuosa) o 32 °C (solución de formamida), se prefiere aumentar la concentración de SSC para poder usar una temperatura más alta. Una guía extensiva para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, Nueva York); y Ausubel y col., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing y Wiley-Interscience, Nueva York). Véase Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York).

Proteínas aisladas y variantes y fragmentos de las mismas

Las proteínas plaguicidas también están abarcadas en la presente invención. Por "proteína plaguicida" se entiende una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20. La presente invención proporciona un polipéptido recombinante que tiene actividad plaguicida, en el que dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20; y (b) una secuencia de aminoácidos que comprende de una a cinco sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos relativas a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20, en el que la actividad plaguicida del polipéptido se mejora en relación con la actividad plaguicida de SEQ ID NO: 43 en relación con la mortalidad para al menos uno del barrenador de maíz europeo, H. zea, el cogollero del maíz y la oruga de las leguminosas. Una "proteína aislada" o una "proteína recombinante" se usa para referirse a una proteína que ya no está en su entorno natural, por ejemplo in vitro o en una célula hospedadora recombinante bacteriana o vegetal.

Los procedimientos para medir la actividad plaguicida son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews y col. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone y col. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y la patente de EE.U^u.5.743.477.

Por "variantes" se entiende una secuencia de aminoácidos que comprende de una a cinco sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos relativas a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20, en las que la actividad plaguicida del polipéptido se mejora en relación con la actividad plaguicida de SEQ ID NO: 43 en relación con la mortalidad para al menos uno del barrenador de maíz europeo, H. zea, el cogollero del maíz y la oruga de las leguminosas. Los procedimientos para medir la actividad plaguicida son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews y col. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone y col. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y la patente de EE.UU. 5.743.477.

Los genes bacterianos, tales como los genes axmi de la presente invención, muy a menudo poseen múltiples codones de iniciación de metionina cerca del inicio del marco de lectura abierto. A menudo, el inicio de la traducción en uno o más de estos codones de inicio dará lugar a la generación de una proteína funcional. Estos codones de inicio pueden incluir codones ATG. Sin embargo, las bacterias como Bacillus sp. también reconocen el codón GTG como un codón de inicio y las proteínas que inician la traducción en los codones GTG contienen una metionina en el primer aminoácido. En raras ocasiones, la traducción en sistemas bacterianos puede iniciarse en un codón TTG, aunque en este caso el TTG codifica una metionina. Adicionalmente, a menudo no se determina a priori cuál de estos codones se usa de forma natural en la bacteria. Por lo tanto, se entiende que el uso de uno de los codones alternativos de metionina también puede dar lugar a la generación de proteínas plaguicidas. Estas proteínas plaguicidas están abarcadas en la presente invención y pueden usarse en los procedimientos de la presente invención. Se entenderá que, cuando se expresa en plantas, será necesario alterar el codón de inicio alternativo a ATG para una traducción adecuada.

Los anticuerpos para los polipéptidos de la presente invención, o para variantes o fragmentos de los mismos, también se desvelan. Los procedimientos para producir anticuerpos son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; patente de EE.UU. N.° 4.196.265).

Variantes alteradas o mejoradas

Se reconoce que las secuencias de ADN de una proteína plaguicida pueden alterarse por diversos procedimientos, y que estas alteraciones pueden dar como resultado secuencias de ADN que codifican proteínas con secuencias de aminoácidos diferentes a las codificadas por una proteína plaguicida de la presente invención. La invención proporciona una secuencia de aminoácidos que comprende de una a cinco sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos relativas a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20, en las que la actividad plaguicida del polipéptido se mejora en relación con la actividad plaguicida de SEQ ID NO: 43 en relación con la mortalidad para al menos uno del barrenador de maíz europeo, H. zea, el cogollero del maíz y la oruga de las leguminosas. Por lo tanto, la proteína puede alterarse de varias maneras, incluyendo las sustituciones de aminoácidos, supresiones, truncamientos e inserciones de uno a cinco aminoácidos de SEQ ID NO: 15, 18, 19 o 20, incluyendo hasta aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4 o 5 sustituciones de aminoácidos, eliminaciones o inserciones dentro de la porción C-terminal o la porción N-terminal, o ambas. Los procedimientos para tales manipulaciones son generalmente conocidos en la técnica. Por ejemplo, las variantes de secuencia de aminoácidos de una proteína plaguicida pueden prepararse mediante mutaciones en el ADN. Esto también puede lograrse mediante una de varias formas de mutagénesis y/o en evolución dirigida. En algunos aspectos, los cambios codificados en la secuencia de aminoácidos no afectarán sustancialmente la función de la proteína. Dichas variantes poseerán la actividad plaguicida deseada. Sin embargo, se entiende que la capacidad de una proteína plaguicida para conferir actividad plaguicida puede mejorarse mediante el uso de tales técnicas sobre las composiciones de la presente invención. Por ejemplo, uno puede expresar una proteína plaguicida en las células hospedadoras que exhiben altas tasas de incorporación incorrecta de bases durante la replicación del ADN, tales como XL-1 Red (Stratagene, La Jolla, CA). Después de la propagación en tales cepas, uno puede aislar el ADN (por ejemplo, preparando ADN plasmídico, o amplificando por pCr y clonando el fragmento de PCR resultante en un vector), cultivar las mutaciones proteicas plaguicidas en una cepa no mutagénica e identificar genes mutados con actividad plaguicida, por ejemplo, realizando un ensayo para evaluar la actividad plaguicida. En general, la proteína se mezcla y se usa en ensayos de alimentación. Véase, por ejemplo Marrone y col. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293. Dichos ensayos pueden incluir poner en contacto las plantas con una o más plagas y determinar la capacidad de la planta para sobrevivir y/o causar la muerte de las plagas. Algunos ejemplos de mutaciones que resultan en una mayor toxicidad se encuentran en Schnepf y col. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev.

62:775-806.

Como alternativa, las secuencias de proteínas añadidas pueden incluir secuencias completas de codificación de proteínas, tales como aquellas utilizadas comúnmente en la técnica para generar fusiones de proteínas. Tales proteínas de fusión a menudo se usan para (1) aumentar la expresión de una proteína de interés (2) introducir un dominio de unión, actividad enzimática o epítopo para facilitar la purificación de proteínas, detección de proteínas u otros usos experimentales conocidos en la técnica (3) secreción diana o traducción de una proteína a un orgánulo subcelular, tales como el espacio periplásmico de bacterias gramnegativas o el retículo endoplasmático de células eucariotas, el último de los cuales a menudo da como resultado la glucosilación de la proteína.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos variantes de la presente invención también abarcan secuencias derivadas de procedimientos mutagénicos y recombinogénicos tales como la combinación aleatoria de ADN. Con un procedimiento tal, pueden usarse una o más regiones diferentes de codificación de proteínas plaguicidas para crear una nueva proteína plaguicida que posea las propiedades deseadas. De esta manera, las bibliotecas de polinucleótidos recombinantes se generan a partir de una población de polinucleótidos de secuencia relacionada que comprende regiones de secuencia que tienen una identidad de secuencia sustancial y se pueden recombinar de forma homóloga in vitro o in vivo. Por ejemplo, usando este enfoque, los motivos de secuencia que codifican un dominio de interés pueden mezclarse entre un gen plaguicida de la invención y otros genes plaguicidas conocidos para obtener un nuevo gen que codifica una proteína con una propiedad de interés mejorada, tales como una mayor actividad insecticida. Las estrategias para tal combinación de ADN se conocen en la técnica. Véanse, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri y col. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore y col. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang y col. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 94:4504-4509; Crameri y col. (1998) Nature 391:288-291; y las patentes de EE.UU. N.° 5.605.793 y 5.837.458.

El intercambio o la combinación de dominios es otro mecanismo para generar proteínas plaguicidas alteradas. Los dominios pueden intercambiarse entre proteínas plaguicidas, dando como resultado toxinas híbridas o quiméricas con actividad plaguicida mejorada o espectro diana. Los procedimientos para generar proteínas recombinantes y probar su actividad plaguicida son bien conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, Naimov y col. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328-5330; de Maagd y col. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543; Ge y col. (1991) J. Biol. Chem. 266:17954-17958; Schnepf y col. (1990) J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Rang y col. 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918-2925).

En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos abarcada en el presente documento se expone en cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 4, 5 y 6 y la secuencia de aminoácidos se establece en cualquiera de las SEQ ID NO: 15, 18, 19 o 20.

En diversas realizaciones, la fusión de Axmi005 con Axmi115 da como resultado una secuencia de aminoácidos que tiene una actividad mejorada o extendida en comparación con la actividad de Axmi005 o Axmi115 solo. Por actividad "mejorada" se entiende un aumento de la muerte de al menos una plaga, o un aumento en la reducción notable del crecimiento de plagas, alimentación o desarrollo fisiológico normal en relación con la proteína nativa. Por actividad "extendida" se entiende la actividad contra una plaga que no fue demostrada tanto por Axmi005 como por Axmi115. Por ejemplo, la fusión de una porción de Axmi005 con una porción de Axmi115 podría dar como resultado una proteína única que tenga el perfil de actividad de Axmi005 y Axmi115. En algunas realizaciones, se mejora la actividad contra una plaga individual en la proteína de fusión sobre uno o ambos Axmi005 y/o Axmi115.

Vectores

Puede proporcionarse una secuencia plaguicida de la invención en un casete de expresión para expresión en una planta de interés. Por "casete de expresión vegetal" se entiende una construcción de ADN que es capaz de dar como resultado la expresión de una proteína a partir de un marco de lectura abierto en una célula vegetal. Típicamente, estos contienen un promotor y una secuencia de codificación. A menudo, tales construcciones también contendrán una región 3' no traducida. Tales construcciones pueden contener una "secuencia señal" o "secuencia líder" para facilitar el transporte co-traduccional o post-traduccional del péptido a ciertas estructuras intracelulares tales como el cloroplasto (u otro plastidio), retículo endoplásmico o aparato de Golgi.

Por "secuencia señal" se entiende una secuencia que se sabe o se sospecha que da como resultado el transporte de péptidos co-traduccionales o post-traduccionales a través de la membrana celular. En eucariotas, esto generalmente implica la secreción en el aparato de Golgi, con algo de glicosilación resultante. Las toxinas insecticidas de las bacterias a menudo se sintetizan como protoxinas, que se activan protolíticamente en el intestino de la plaga diana (Chang (1987) Methods Enzymol. 153:507-516). En algunas realizaciones de la presente invención, la secuencia señal se localiza en la secuencia nativa o puede derivar de una secuencia de la invención. Por "secuencia líder" se entiende cualquier secuencia que, cuando se traduce, da como resultado una secuencia de aminoácidos suficiente para desencadenar el transporte co-traduccional de la cadena peptídica a un orgánulo subcelular. Por lo tanto, esto incluye secuencias líderes dirigidas al transporte y/o glicosilación por pasaje al retículo endoplásmico, pasaje a las vacuolas, a plástidos incluyendo cloroplastos, mitocondrias y similares.

Por "vector de transformación vegetal" se entiende una molécula de ADN que es necesaria para la transformación eficiente de una célula vegetal. Dicha molécula puede consistir en uno o más casetes de expresión de plantas, y puede organizarse en más de una molécula de ADN "vector". Por ejemplo, los vectores binarios son vectores de transformación de plantas que utilizan dos vectores de ADN no contiguos para codificar todas las funciones de acción cis y trans necesarias para la transformación de células vegetales (Hellens y Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). "Vector" se refiere a una construcción de ácido nucleico diseñada para la transferencia entre diferentes células hospedadoras. "Vector de expresión" se refiere a un vector que tiene la capacidad de incorporar, integrar y expresar secuencias o fragmentos de ADN heterólogo en una célula extraña. El casete incluirá secuencias reguladoras 5' y/o 3' unidas operativamente a una secuencia de la invención. Por "operativamente unido" se entiende un enlace funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en el que la secuencia promotora inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN correspondiente a la segunda secuencia. En general, unido operativamente significa que las secuencias de ácido nucleico que se unen son contiguas y, donde sea necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, contiguas y en el mismo marco de lectura. El casete puede contener adicionalmente al menos un gen adicional para cotransformarse en el organismo. Como alternativa, el gen o genes adicionales pueden proporcionarse en casetes de expresión múltiple.

En diversas realizaciones, la secuencia de nucleótidos de la invención está operativamente unida a un promotor, por ejemplo, un promotor vegetal. "Promotor" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que funciona para dirigir la transcripción de una secuencia codificante corriente abajo. El promotor junto con otras secuencias de ácido nucleico reguladoras transcripcionales y traduccionales (también denominadas "secuencias control") son necesarias para la expresión de una secuencia de ADN de interés.

Tal casete de expresión está provisto de una pluralidad de sitios de restricción para que la inserción de la secuencia plaguicida esté bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras.

El casete de expresión incluirá en la dirección de transcripción 5'-3', una región de iniciación transcripcional y traduccional (es decir, un promotor), una secuencia de ADN de la invención y una región de terminación traduccional y transcripcional (es decir, región de terminación) funcional en plantas. El promotor puede ser nativo o análogo, o extraño o heterólogo, al hospedador vegetal y/o a la secuencia de ADN de la invención. Adicionalmente, el promotor puede ser la secuencia natural o, alternativamente, una secuencia sintética. Cuando el promotor es "nativo" u "homólogo" al hospedador vegetal, se pretende que el promotor se encuentre en la planta nativa en la que se introduce el promotor. Cuando el promotor es "extraño" o "heterólogo" a la secuencia de ADN de la invención, se pretende que el promotor no sea el promotor nativo o natural para la secuencia de ADN operativamente unida de la invención.

La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación transcripcional, puede ser nativa con la secuencia de ADN operativamente unida de interés, puede ser nativa con el hospedador vegetal o puede derivar de otra fuente (es decir, extraña o heteróloga al promotor, la secuencia de ADN de interés, el hospedador vegetal o cualquier combinación de los mismos). Están disponibles regiones de terminación convenientes del plásmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminación octopina sintasa y nopalina sintasa. Véanse también Guerineau y col. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon y col. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen y col. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe y col. (1990) Gene 91:151-158; Ballas y col. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi y col. (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627-9639.

Cuando sea adecuado, el gen o genes pueden optimizarse para aumentar la expresión en la célula hospedadora transformada. Esto es, los genes pueden sintetizarse usando codones preferidos por la célula hospedadora para una expresión mejorada, o pueden sintetizarse usando codones a una frecuencia de uso de codón preferida por el hospedador. En general, se aumentará el contenido de GC del gen. Véanse, por ejemplo, Campbell y Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 para una discusión sobre el uso de codones preferidos por el hospedador. Los procedimientos están disponibles en la técnica para sintetizar genes preferidos por plantas. Véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 5.380.831 y 5.436.391, Publicación de Patente de EE.UU. N.° 20090137409 y Murray y col. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498.

En una realización, la proteína plaguicida se dirige al cloroplasto para su expresión. De esta manera, cuando la proteína plaguicida no se inserta directamente en el cloroplasto, el casete de expresión contendrá adicionalmente un ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito para dirigir la proteína plaguicida a los cloroplastos. Tales péptidos de tránsito son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Von Heijne y col. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark y col. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa y col. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer y col. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; y Shah y col. (1986) Science 233:478-481. El gen plaguicida que se dirigirá al cloroplasto puede optimizarse para la expresión en el cloroplasto para tener en cuenta las diferencias en el uso de codones entre el núcleo de la planta y este orgánulo. De esta manera, los ácidos nucleicos de interés pueden sintetizarse usando codones preferidos de cloroplasto. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 5.380.831.

Transformación en plantas

Los procedimientos de la invención implican la introducción de una construcción de nucleótidos en una planta. Por "introducción" se pretende presentar a la planta la construcción de nucleótidos de tal manera que la construcción tenga acceso al interior de una célula de la planta. Los procedimientos de la invención no requieren que se use un procedimiento particular para introducir una construcción de nucleótidos en una planta, solo que la construcción de nucleótidos obtiene acceso al interior de al menos una célula de la planta. Los procedimientos para introducir construcciones de nucleótidos en plantas son conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitado a, procedimientos de transformación estables, procedimientos de transformación transitoria y procedimientos mediados por virus. Por "planta" se entiende plantas enteras, órganos de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semillas, células vegetales, propágulos, embriones y progenie de los mismos. Las células vegetales pueden ser diferenciadas o indiferenciadas (por ejemplo, callos, células de cultivo en suspensión, protoplastos, células foliares, células radiculares, células de floema, polen).

"Plantas transgénicas" o "plantas transformadas" o plantas o células o tejidos "transformados establemente" se refiere a plantas que han incorporado o integrado secuencias de ácido nucleico exógeno o fragmentos de ADN en la célula vegetal. Estas secuencias de ácido nucleico incluyen aquellas que son exógenas, o que no están presentes en la célula vegetal no transformada, así como aquellos que pueden ser endógenos o estar presentes en la célula vegetal no transformada. "Heterólogo" generalmente se refiere a las secuencias de ácido nucleico que no son endógenas a la célula o parte del genoma nativo en el que están presentes, y que se han añadido a la célula por infección, transfección, microinyección, electroporación, microproyección o similar.

Las plantas transgénicas de la invención expresan una o más de las nuevas secuencias de toxinas desveladas en el presente documento. En diversas realizaciones, la planta transgénica además comprende uno o más genes adicionales para la resistencia a los insectos (por ejemplo, Cry1, tales como los miembros de las familias Cry1A, Cry1B, Cry1C, Cry1D, Cry1E y Cry1F; Cry2, tales como miembros de la familia Cry2A; Cry9, tales como los miembros de las familias Cry9A, Cry9B, Cry9C, Cry9D, Cry9E y Cry9F; etc.). Un experto en la materia entenderá que la planta transgénica puede comprender cualquier gen que imparta un rasgo agrícola de interés.

La transformación de las células vegetales puede lograrse mediante una de varias técnicas conocidas en la técnica. El gen plaguicida de la invención puede modificarse para obtener o mejorar la expresión en células vegetales. Típicamente, una construcción que expresa dicha proteína contendría un promotor para impulsar la transcripción del gen, así como una región no traducida 3' para permitir la terminación de la transcripción y la poliadenilación. La organización de tales construcciones es bien conocida en la técnica. En algunos ejemplos, puede ser útil diseñar el gen de tal manera que el péptido resultante sea secretado o dirigido de otro modo dentro de la célula vegetal. Por ejemplo, el gen puede diseñarse para contener un péptido señal para facilitar la transferencia del péptido al retículo endoplásmico. También puede ser preferible diseñar el casete de expresión de la planta para que contenga un intrón, de tal manera que se requiere el procesamiento de ARNm del intrón para la expresión.

Típicamente, este "casete de expresión de planta" se insertará en un "vector de transformación de planta". Este vector de transformación de la planta puede estar compuesto por uno o más vectores de ADN necesarios para lograr la transformación de la planta. Por ejemplo, es una práctica común en la técnica utilizar vectores de transformación de plantas que están compuestos por más de un segmento de ADN contiguo. Estos vectores a menudo se denominan en la técnica "vectores binarios". Los vectores binarios, así como los vectores con plásmidos auxiliares, se usan con mayor frecuencia para transformación mediada por Agrobacterium, donde el tamaño y la complejidad de los segmentos de ADN necesarios para lograr una transformación eficiente es bastante grande, y es ventajoso separar las funciones en moléculas de ADN separadas. Los vectores binarios típicamente contienen un vector plasmídico que contiene las secuencias de acción cis requeridas para la transferencia de ADN-T (como el borde izquierdo y el borde derecho), un marcador seleccionable que está diseñado para ser capaz de expresarse en una célula vegetal, y un "gen de interés" (un gen diseñado para ser capaz de expresarse en una célula vegetal para el que se desea la generación de plantas transgénicas). También están presentes en este vector plasmídico las secuencias requeridas para la replicación bacteriana. Las secuencias que actúan en cis están dispuestas de manera que permitan una transferencia eficiente a las células vegetales y su expresión. Por ejemplo, el gen marcador seleccionable y el gen plaguicida se encuentran entre los bordes izquierdo y derecho. A menudo, un segundo vector plasmídico contiene los factores de acción trans que median la transferencia de ADN-T desde Agrobacterium a células vegetales. Este plásmido a menudo contiene las funciones de virulencia (genes Vir) que permiten la infección de las células vegetales por Agrobacterium y transferencia de ADN por escisión en secuencias de borde y transferencia de ADN mediada por vir, como se entiende en la técnica (Hellens y Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). Varios tipos de cepas de Agrobacterium (por ejemplo, LBA4404, GV3101, e Ha 101, EHA105, etc.) pueden usarse para la transformación en plantas. El segundo vector plasmídico no es necesario para transformar las plantas por otros procedimientos tales como la microproyección, microinyección, electroporación, polietilenglicol, etc.

En general, los procedimientos de transformación de plantas implican la transferencia de ADN heterólogo a células vegetales diana (por ejemplo, embriones inmaduros o maduros, cultivos en suspensión, callo indiferenciado, protoplastos, etc.), seguido de la aplicación de un nivel umbral máximo de selección apropiada (dependiendo del gen marcador seleccionable) para recuperar las células vegetales transformadas de un grupo de masa celular no transformada. Los explantes generalmente se transfieren a un suministro nuevo del mismo medio y se cultivan de manera rutinaria. Posteriormente, Las células transformadas se diferencian en brotes después de colocarlas en un medio de regeneración complementado con un nivel umbral máximo de agente de selección. Los brotes se transfieren luego a un medio de enraizamiento selectivo para recuperar brotes enraizados o plántulas. La plántula transgénica se convierte en una planta madura y produce semillas fértiles (por ejemplo, Hiei y col. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida y col. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Los explantes generalmente se transfieren a un suministro nuevo del mismo medio y se cultivan de manera rutinaria. Una descripción general de las técnicas y procedimientos para generar plantas transgénicas se encuentra en Ayres y Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 y Bommineni y Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. Dado que el material transformado contiene muchas células; tanto las células transformadas como las no transformadas están presentes en cualquier pieza de callo o tejido diana objeto o grupo de células. La capacidad de matar células no transformadas y permitir que las células transformadas proliferen da como resultado cultivos de plantas transformados. A menudo, la capacidad de eliminar células no transformadas es una limitación para la recuperación rápida de células vegetales transformadas y la generación exitosa de plantas transgénicas.

Los protocolos de transformación y los protocolos para introducir secuencias de nucleótidos en las plantas pueden variar según el tipo de planta o célula vegetal, es decir, monocotiledóneas o dicotiledóneas, dirigido a la transformación. La generación de plantas transgénicas se puede realizar por uno de varios procedimientos, incluyendo, pero no limitado a, microinyección, electroporación, transferencia directa de genes, introducción de ADN heterólogo por Agrobacterium en células vegetales (transformación mediada por Agrobacterium), bombardeo de células vegetales con ADN heterólogo extraño adherido a partículas, aceleración de partículas balísticas, transformación del haz de aerosol (Solicitud Publicada de EE.UU. N.° 20010026941; patente de EE.UU. N.° 4.945.050; Publicación internacional N.° WO 91/00915; Solicitud Publicada de EE.UU. N.° 2002015066), transformación de Lec1 y varios otros procedimientos de mediación directa sin partículas para transferir ADN.

Se conocen en la técnica procedimientos para la transformación de cloroplastos. Véanse, por ejemplo, Svab y col. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87:8526-8530; Svab y Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90:913-917; Svab y Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. El procedimiento se basa en el suministro de ADN con pistola de partículas que contiene un marcador seleccionable y la orientación del ADN al genoma del plástido a través de recombinación homóloga. Adicionalmente, la transformación de plastidios puede lograrse mediante la transactivación de un transgen silencioso transmitido por plastidios mediante la expresión preferida de tejido de una ARN polimerasa codificada en el núcleo y dirigida por plastidios. Tal sistema se ha informado por McBride y col. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 91:7301-7305.

Tras la integración de ADN extraño heterólogo en células vegetales, uno aplica después un nivel de umbral máximo de selección apropiada en el medio para matar las células no transformadas y separar y proliferar las células supuestamente transformadas que sobreviven de este tratamiento de selección transfiriéndolas regularmente a un medio nuevo. Por pasaje continuo y desafío con la selección apropiada, uno identifica y prolifera las células que se transforman con el vector plasmídico. Los procedimientos moleculares y bioquímicos se pueden utilizar para confirmar la presencia del gen heterólogo integrado de interés en el genoma de la planta transgénica.

Las células que se han transformado pueden crecer en plantas de acuerdo con las formas convencionales. Véase, por ejemplo, McCormick y col. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas se pueden cultivar y polinizar con la misma cepa transformada o cepas diferentes, y el híbrido resultante tiene una expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada identificada. Se pueden cultivar dos o más generaciones para asegurar que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantenga y herede de manera estable y luego se cosechen las semillas para asegurar que se haya logrado la expresión de la característica fenotípica deseada. De esta manera, la presente invención proporciona semilla transformada (también denominada "semilla transgénica") que tiene una construcción de nucleótidos de la invención, por ejemplo, un casete de expresión de la invención, establemente incorporado en su genoma.

Evaluación de transformación de plantas

Tras la introducción de ADN extraño heterólogo en células vegetales, la transformación o integración del gen heterólogo en el genoma de la planta se confirma mediante diversos procedimientos, tales como el análisis de ácidos nucleicos, proteínas y metabolitos asociados con el gen integrado.

El análisis por PCR es un procedimiento rápido para seleccionar células transformadas, tejido o brotes para la presencia del gen incorporado en la etapa anterior antes del trasplante al suelo (Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). La PCR se lleva a cabo utilizando cebadores oligonucleotídicos específicos para el gen de interés o vector de fondo de Agrobacterium, etc.

La transformación de la planta puede confirmarse mediante análisis de transferencia Southern de ADN genómico (Sambrook y Russell, 2001, citado anteriormente). En general, el ADN total se extrae del transformante, se digiere con enzimas de restricción apropiadas, fraccionado en un gel de agarosa y transferido a una membrana de nitrocelulosa o nailon. La membrana o "transferencia" se sondea con, por ejemplo, un fragmento de ADN diana radiomarcado con 32P para confirmar la integración del gen introducido en el genoma de la planta de acuerdo con técnicas convencionales (Sambrook y Russell, 2001, citado anteriormente).

En el análisis de transferencia Northern, el ARN se aísla de tejidos específicos de transformante, se fracciona en un gel de agarosa de formaldehído y se transfiere a un filtro de nailon de acuerdo con procedimientos convencionales que se usan habitualmente en la técnica (Sambrook y Russell, 2001, citado anteriormente). La expresión de ARN codificado por el gen plaguicida se prueba hibridando el filtro con una sonda radioactiva derivada de un gen plaguicida, por procedimientos conocidos en la técnica (Sambrook y Russell, 2001, citado anteriormente).

La transferencia Western, ensayos bioquímicos y similares pueden llevarse a cabo en las plantas transgénicas para confirmar la presencia de proteína codificada por el gen plaguicida mediante procedimientos convencionales (Sambrook y Russell, 2001, citado anteriormente) usando anticuerpos que se unen a uno o más epítopos presentes en la proteína plaguicida.

Actividad plaguicida en plantas

En otro aspecto de la invención, uno puede generar plantas transgénicas que expresan una proteína plaguicida que tiene actividad plaguicida. Los procedimientos descritos anteriormente a modo de ejemplo pueden utilizarse para generar plantas transgénicas, pero la manera en que se generan las células vegetales transgénicas no es crítica para la presente invención. Los procedimientos conocidos o descritos en la técnica, tales como transformación mediada por Agrobacterium, transformación biolística y los procedimientos sin mediación de partículas pueden usarse a discreción del experimentador. Las plantas que expresan una proteína plaguicida pueden aislarse mediante procedimientos comunes descritos en la técnica, por ejemplo por transformación de callo, selección de callo transformado y regeneración de plantas fértiles a partir de dicho callo transgénico. En tal procedimiento, se puede usar cualquier gen como marcador seleccionable siempre que su expresión en células vegetales confiera la capacidad de identificar o seleccionar células transformadas.

Se han desarrollado varios marcadores para su uso con células vegetales, tales como la resistencia al cloranfenicol, el aminoglucósido G418, higromicina, o similares. Otros genes que codifican un producto implicados en el metabolismo del cloroplasto también pueden usarse como marcadores seleccionables. Por ejemplo, genes que proporcionan resistencia a los herbicidas vegetales como el glifosato, bromoxinilo o imidazolinona pueden encontrar un uso particular. Tales genes se han informado (Stalker y col. (1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314 (gen de nitrilasa de resistencia a bromoxinilo); y Sathasivan y col. (1990) Nucl. Acids Res. 18:2188 (gen de resistencia a la imidazolinona AHAS). Adicionalmente, Los genes desvelados en el presente documento son útiles como marcadores para evaluar la transformación de células bacterianas o vegetales. Los procedimientos para detectar la presencia de un transgen en una planta, órgano de planta (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semilla, célula vegetal, propágulo, embrión o progenie de los mismos son bien conocidos en la técnica. En una realización, la presencia del transgen se detecta mediante la prueba de actividad plaguicida.

Las plantas fértiles que expresan una proteína plaguicida pueden analizarse para determinar su actividad plaguicida, y las plantas que muestran una actividad óptima se seleccionan para su posterior reproducción. Los procedimientos están disponibles en la técnica para analizar la actividad de plagas. En general, la proteína se mezcla y se usa en ensayos de alimentación. Véase, por ejemplo Marrone y col. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293.

La presente invención puede usarse para la transformación de cualquier especie de planta, incluyendo, pero no limitado a, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los ejemplos de plantas de interés incluyen, pero no se limitan a, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada y colza, Brassica sp., alfalfa, centeno, mijo, cártamo, cacahuetes, batata, mandioca, café, coco, piña, árboles cítricos, cacao, té, plátano, aguacate, higo, guayaba, mango, aceituna, papaya, anacardo, macadamia, almendra, avena, verduras, ornamentales y coníferas.

Las verduras incluyen, pero no se limitan a, tomates, lechuga, judías verdes, judías de Lima,, guisantes y miembros del género Cucumis tales como pepino, melón cantalupo y melón almizclero. Las ornamentales incluyen, pero no se limitan a, azalea, hortensia, hibisco, rosas, tulipanes, narcisos, petunias, clavel, flor de pascua y crisantemo. Preferentemente, las plantas de la presente invención son plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, colza oleaginosa, etc.).

Uso en control plaguicida

Se conocen en la técnica procedimientos generales para emplear cepas que comprenden una secuencia de nucleótidos de la presente invención, o una variante de la misma, en el control de plagas o en el diseño por ingeniería de otros organismos como agentes plaguicidas. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 5.039.523 y el documento EP 0480762A2.

Las cepas de Bacillus que contienen una secuencia de nucleótidos de la presente invención, o una variante de la misma, o los microorganismos que han sido genéticamente alterados para contener un gen plaguicida de la invención y proteínas pueden usarse para proteger cultivos agrícolas y productos de las plagas. En un aspecto de la invención, las células enteras, es decir, sin lisar, de un organismo productor de toxina (plaguicida) se tratan con reactivos que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando la célula se aplica al ambiente de la plaga o plagas diana.

Como alternativa, el plaguicida se produce al introducir un gen plaguicida en un hospedador celular. La expresión del gen plaguicida da como resultado, directa o indirectamente, en la producción intracelular y el mantenimiento del plaguicida. En un aspecto de la presente invención, estas células se tratan después en condiciones que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando la célula se aplica al ambiente de la plaga o plagas diana. El producto resultante retiene la toxicidad de la toxina. Estos plaguicidas encapsulados de forma natural pueden formularse de acuerdo con las técnicas convencionales para su aplicación al medio ambiente que alberga una plaga diana, por ejemplo, suelo, agua y follaje de plantas. Véase, por ejemplo, el documento EPA 0192319 y las referencias citadas en el mismo. Como alternativa, uno puede formular las células que expresan un gen de la presente invención para permitir la aplicación del material resultante como plaguicida.

Los principios activos de la presente invención se aplican normalmente en forma de composiciones y se pueden aplicar al área de cultivo o planta a tratar, simultáneamente o en sucesión, con otros compuestos. Estos compuestos pueden ser fertilizantes, herbicidas, crioprotectores, tensioactivos, detergentes, jabones plaguicidas, aceites latentes, polímeros y/o formulaciones de vehículos de liberación prolongada o biodegradables que permiten la dosificación a largo plazo de un área diana después de una sola aplicación de la formulación. También pueden ser herbicidas selectivos, insecticidas químicos, virucidas, microbicidas, amebicidas, plaguicidas, fungicidas, bactericidas, nematocidas, molusquicidas o mezclas de varias de estas preparaciones, si se desea, junto con otros vehículos agrícolamente aceptables, tensioactivos o adyuvantes promotores de la aplicación empleados habitualmente en la técnica de la formulación. Los vehículos y adyuvantes adecuados pueden ser sólidos o líquidos y corresponden a las sustancias comúnmente empleadas en la tecnología de formulación, por ejemplo, sustancias minerales naturales o regeneradas, disolventes, dispersantes, agentes humectantes, pegamentos, aglutinantes o fertilizantes. Igualmente las formulaciones pueden prepararse en "cebos" comestibles o transformarse en "trampas" de plagas para permitir la alimentación o ingestión por una plaga diana de la formulación plaguicida.

Los procedimientos para aplicar un principio activo de la presente invención o una composición agroquímica de la presente invención que contiene al menos una de las proteínas plaguicidas producidas por las cepas bacterianas de la presente invención incluyen la aplicación foliar, el recubrimiento de semillas y la aplicación al suelo. El número de aplicaciones y la tasa de aplicación dependen de la intensidad de la infestación por la plaga correspondiente.

La composición puede formularse como un polvo, espolvoreado, microgránulo, gránulo, pulverización, emulsión, coloide, solución, o similares, y puede prepararse por medios convencionales tales como desecación, liofilización, homogeneización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación o concentración de un cultivo de células que comprende el polipéptido. En todas esas composiciones que contienen al menos uno de dichos polipéptidos plaguicidas, el polipéptido puede estar presente en una concentración de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 99 % en peso.

Las plagas de lepidópteros, hemípteros, dípteros o coleópteros pueden matarse o reducirse en número en un área dada por los procedimientos de la invención, o pueden aplicarse profilácticamente a un área ambiental para prevenir la infestación por una plaga susceptible. Preferentemente, la plaga ingiere, o se pone en contacto con, una cantidad eficaz como plaguicida del polipéptido. Por "cantidad eficaz como plaguicida" se entiende una cantidad del plaguicida que puede provocar la muerte de al menos una plaga, o reducir notablemente el crecimiento de plagas, la alimentación o el desarrollo fisiológico normal. Esta cantidad variará dependiendo de factores como, por ejemplo, las plagas diana específicas a controlar, el entorno específico, la localización, la planta, el cultivo o el sitio agrícola a tratar, las condiciones ambientales y el procedimiento, la tasa, la concentración, la estabilidad y la cantidad de aplicación de la composición de polipéptido eficaz como plaguicida. Las formulaciones también pueden variar con respecto a las condiciones climáticas, las consideraciones ambientales y/o la frecuencia de aplicación y/o gravedad de la infestación de plagas.

Las composiciones plaguicidas descritas pueden prepararse formulando la célula bacteriana, el cristal y/o la suspensión de esporas, o el componente de proteína aislado con el vehículo deseado agrícolamente aceptable. Las composiciones pueden formularse antes de la administración en un medio apropiado tales como liofilizado, secado por congelación, desecado, o en un vehículo acuoso, diluyente o medio adecuado, como solución salina u otro tampón. Las composiciones formuladas pueden estar en forma de polvo o material granular, o una suspensión en aceite (vegetal o mineral), o emulsiones de agua o aceite/agua, o como un polvo humectable, o en combinación con cualquier otro material vehículo adecuado para aplicación agrícola. Los vehículos agrícolas adecuados pueden ser sólidos o líquidos y son bien conocidos en la técnica. El término "vehículo agrícolamente aceptable" abarca todos los adyuvantes, componentes inertes, dispersantes, tensioactivos, pegamentos, aglutinantes, etc. que normalmente se usan en la tecnología de formulación de plaguicidas; estos son bien conocidos por los expertos en formulación de plaguicidas. Las formulaciones pueden mezclarse con uno o más adyuvantes sólidos o líquidos y prepararse por diversos medios, por ejemplo, mezclando homogéneamente, mezclando y/o moliendo la composición plaguicida con adyuvantes adecuados usando técnicas de formulación convencionales. Las formulaciones y los procedimientos de aplicación adecuados se describen en la patente de EE.UU. 6.468.523.

"Plaga" incluye pero no se limita a, insectos, hongos, bacterias, nematodos, ácaros, garrapatas y similares. Las plagas de insectos incluyen insectos seleccionados de los órdenes Coleóptera, Díptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., particularmente Coleoptera, Lepidoptera y Diptera.

El orden Coleoptera incluye los subórdenes Adephaga y Polyphaga. El suborden Adephaga incluye las superfamilias Caraboidea y Gyrinoidea, mientras que el suborden Polyphaga incluye las superfamilias Hydrophiloidea, Staphylinoidea, Cantharoidea, Cleroidea, Elateroidea, Dascilloidea, Dryopoidea, Byrrhoidea, Cucujoidea, Meloidea, Mordelloidea, Tenebrionoidea, Bostrichoidea, Scarabaeoidea, Cerambycoidea, Chrysomeloidea y Curculionoidea. La superfamilia Caraboidea incluye las familias Cicindelidae, Carabidae y Dytiscidae. La superfamilia Gyrinoidea incluye la familia Gyrinidae. La superfamilia Hydrophiloidea incluye la familia Hydrophilidae. La superfamilia Staphylinoidea incluye las familias Silphidae y Staphylinidae. La superfamilia Cantharoidea incluye las familias Cantharidae y Lampyridae. La superfamilia Cleroidea incluye las familias Cleridae y Dermestidae. La superfamilia Elateroidea incluye las familias Elateridae y Buprestidae. La superfamilia Cucujoidea incluye la familia Coccinellidae. La superfamilia Meloidea incluye la familia Meloidae. La superfamilia Tenebrionoidea incluye la familia Tenebrionidae. La superfamilia Scarabaeoidea incluye las familias Passalidae y Scarabaeidae. La superfamilia Cerambycoidea incluye la familia Cerambycidae. La superfamilia Chrysomeloidea incluye la familia Chrysomelidae. La superfamilia Curculionoidea incluye las familias Curculionidae y Scolytidae.

El orden Diptera incluye los subórdenes Nematocera, Brachycera y Cyclorrhapha. El suborden Nematocera incluye las familias Tipulidae, Psychodidae, Culicidae, Ceratopogonidae, Chironomidae, Simuliidae, Bibionidae y Cecidomyiidae. El suborden Brachycera incluye las familias Stratiomyidae, Tabanidae, Therevidae, Asilidae, Mydidae, Bombyliidae y Dolichopodidae. El suborden Cyclorrhapha incluye las divisiones Aschiza y Aschiza. La división Aschiza incluye las familias Phoridae, Syrphidae y Conopidae. La división Aschiza incluye las Secciones Acalyptratae y Calyptratae. La sección Acalyptratae incluye las familias Otitidae, Tephritidae, Agromyzidae y Drosophilidae. La sección Calyptratae incluye las familias Hippoboscidae, Oestridae, Tachinidae, Anthomyiidae, Muscidae, Calliphoridae y Sarcophagidae.

El orden Lepidoptera incluye las familias Papilionidae, Pieridae, Lycaenidae, Nymphalidae, Danaidae, Satyridae, Hesperiidae, Sphingidae, Saturniidae, Geometridae, Arctiidae, Noctuidae, Lymantriidae, Sesiidae y Tineidae.

Las plagas de insectos de la invención para los principales cultivos incluyen: Maíz: Ostrinia nubilalis, barrenador europeo del maíz; Agrotis ipsilon, gusano cortador negro; Helicoverpa zea, gusano de la mazorca de maíz; Spodoptera frugiperda, cogollero del maíz; Diatraea grandiosella, barrenador del maíz del sudoeste; Elasmopalpus lignosellus, barrenador menor de tallo de maíz; Diatraea saccharalis, barrenador de la caña de azúcar; Diabrotica virgifera, gusano de la raíz del maíz del oeste; Diabrotica longicornis barberi, gusano de la raíz del maíz del norte; Diabrotica undecimpunctata howardi, gusano de la raíz del maíz del sur; Melanotus spp., gusano del alambre; Cyclocephala borealis, chafer enmascarado del norte (gusano blanco); Cyclocephala immaculata, chafer enmascarado del sur (gusano blanco); Popillia japonica, escarabajo japonés; Chaetocnema pulicaria, escarabajo pulga del maíz; Sphenophorus maidis, chinche del maíz; Rhopalosiphum maidis, pulgón de la hoja del maíz; Anuraphis maidiradicis, pulgón de la raíz del maíz; Blissus leucopterus leucopterus, insecto chinchudo; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus sanguinipes, saltamontes migratorio; Hylemya platura, gusano de la semilla del maíz; Agromyza parvicornis, minador de hojas del maíz; Anaphothrips obscrurus, trips de hierba; Solenopsis milesta, hormiga ladrona; Tetranychus urticae, ácaro araña de dos puntos; Sorgo: Chilo partellus, barrenador del sorgo; Spodoptera frugiperda, cogollero del maíz; Helicoverpa zea, gusano de la mazorca de maíz; Elasmopalpus lignosellus, barrenador menor de tallo de maíz; Feltia subterranea, gusano cortador granulado; Phyllophaga crinita, gusano blanco; Eleodes, Conoderus y Aeolus spp., gusano del alambre; Oulema melanopus, escarabajo de hoja de cereal; Chaetocnema pulicaria, escarabajo pulga del maíz; Sphenophorus maidis, chinche del maíz; Rhopalosiphum maidis; pulgón de la hoja del maíz; Sipha flava, pulgón amarillo de la caña de azúcar; Blissus leucopterus leucopterus, insecto chinchudo; Contarinia sorghicola, mosquita del sorgo; Tetranychus cinnabarinus, ácaro araña carmín; Tetranychus urticae, ácaro araña de dos puntos; Trigo: Pseudaletia unipunctata, cogollero; Spodoptera frugiperda, cogollero del maíz; Elasmopalpus lignosellus, barrenador menor de tallo de maíz; Agrotis ortogonia, gusano cortador occidental; Elasmopalpus lignosellus, barrenador menor de tallo de maíz; Oulema melanopus, escarabajo de hoja de cereal; Hypera punctata, gorgojo de hoja de trébol; Diabrotica undecimpunctata howardi, gusano de la raíz del maíz del sur; pulgón de trigo ruso; Schizaphis graminum, pulgón de los cereales; Macrosiphum avenae, pulgón de grano inglés; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus differentialis, saltamontes diferencial; Melanoplus sanguinipes, saltamontes migratorio; Mayetiola destructor, mosca del trigo; Sitodiplosis mosellana, mosquita del trigo; Meromyza americana, gusano del tallo del trigo; Hylemya coarctata, mosca de bulbo del trigo; Frankliniella fusca, trips del tabaco; Cephus cinctus, mosca del tallo del trigo; Aceria tulipae, ácaro del trigo; Girasol: Suleima helianthana, polilla capullo del girasol; Homoeosoma electellum, polilla del girasol; Zygogramma exclamationis, escarabajo del girasol; Bothyrus gibbosus, escarabajo de la zanahoria; Neolasioptera murtfeldtiana, mosquita de las semillas del girasol; Algodón: Heliothis virescens, gusano del algodón; Helicoverpa zea, gusano del algodón; Spodoptera exigua, barrenador de la remolacha; Pectinophora gossypiella, gusano rosa; Anthonomus grandis, gorgojo de la cápsula; Aphis gossypii, pulgón del algodón; Pseudatomoscelis seriatus, saltamontes del algodón; Trialeurodes abutilonea, mosca blanca de alas anilladas; Lygus lineolaris, chinche opaca de las plantas; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus differentialis, saltamontes diferencial; Thrips tabaci, trips de la cebolla; Franklinkiella fusca, trips del tabaco; Tetranychus cinnabarinus, ácaro araña carmín; Tetranychus urticae, ácaro araña de dos puntos; Arroz: Diatraea saccharalis, barrenador de la caña de azúcar; Spodoptera frugiperda, cogollero del maíz; Helicoverpa zea, gusano de la mazorca de maíz; Colaspis brunnea, colaspis de la uva; Lissorhoptrus oryzophilus, gorgojo de agua del arroz; Sitophilus oryzae, gorgojo del arroz; Nephotettix nigropictus, saltahojas del arroz; Blissus leucopterus leucopterus, insecto chinchudo; Acrosternum hilare, chinche verde; Soja: Pseudoplusia incluyens, gusano falso medidor; Anticarsia gemmatalis, oruga de las leguminosas; Plathypena scabra, gusano verde; Ostrinia nubilalis, barrenador europeo del maíz; Agrotis ipsilon, gusano cortador negro; Spodoptera exigua, barrenador de la remolacha; Heliothis virescens, gusano del algodón; Helicoverpa zea, gusano del algodón; Epilachna varivestis, escarabajo mejicano de la judía; Myzus persicae, pulgón verde del melocotón; Empoasca fabae, saltahojas de la patata; Acrosternum hilare, chinche verde; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus differentialis, saltamontes diferencial; Hylemya platura, gusano de la semilla del maíz; Sericothrips variabilis, trips de la soja; Thrips tabaci, trips de la cebolla; Tetranychus turkestani, ácaro araña de la fresa; Tetranychus urticae, ácaro araña de dos puntos; Cebada: Ostrinia nubilalis, barrenador europeo del maíz; Agrotis ipsilon, gusano cortador negro; Schizaphis graminum, pulgón de los cereales; Blissus leucopterus leucopterus, insecto chinchudo; Acrosternum hilare, chinche verde; Euschistus servus, chinche marrón; Delia platura, gusano de la semilla del maíz; Mayetiola destructor, mosca del trigo; Petrobia latens, ácaro del trigo pardo; Colza oleaginosa: Brevicoryne brassicae, pulgón del repollo; Phyllotreta cruciferae, Escarabajo pulga de las crucíferas; Mamestra configurata, barrenador Bertha; Plutella xylostella, polilla de espalda de diamante; Delia ssp., gusanos de la raíz.

Los nematodos incluyen nematodos parásitos tales como nematodos inductores de agallas en las raíces, inductores de quistes y de lesiones, incluyendo Heterodera spp., Meloidogyne spp. y Globodera spp.; particularmente miembros de los nematodos del quiste, incluyendo, pero no limitado a, Heterodera glycines (nematodo del quiste de la hoja); Heterodera schachtii (nematodo del quiste de la remolacha); Heterodera avenae (nematodo de quiste del cereal); y Globodera rostochiensis y Globodera pailida (nematodos del quiste de la patata). Los nematodos de la lesión incluyen Pratylenchus spp.

Procedimientos para aumentar el rendimiento de la planta

Se proporcionan procedimientos para aumentar el rendimiento de la planta. Los procedimientos comprenden proporcionar una planta o célula vegetal que expresa un polinucleótido que codifica la secuencia de polipéptido plaguicida desvelada en el presente documento y cultivar la planta o una semilla de la misma en un campo infestado (o susceptible de infestación por) una plaga contra la cual dicho polipéptido tiene actividad plaguicida. En algunas realizaciones, el polipéptido tiene actividad plaguicida contra una plaga de lepidópteros, coleópteros, dípteros, hemípteros o nematodos y dicho campo está infestado con una plaga de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, dípteros o nematodos. Como se define en el presente documento, el "rendimiento" de la planta se refiere a la calidad y/o cantidad de biomasa producida por la planta. Por "biomasa" se entiende cualquier producto vegetal medido. Un aumento en la producción de biomasa es cualquier mejora en el rendimiento del producto vegetal medido. El aumento del rendimiento de la planta tiene varias aplicaciones comerciales. Por ejemplo, aumentar la biomasa de las hojas de las plantas puede aumentar el rendimiento de las verduras de hoja para consumo humano o animal. Adicionalmente, el aumento de la biomasa de las hojas se puede utilizar para aumentar la producción de productos farmacéuticos o industriales derivados de plantas. Un aumento en el rendimiento puede comprender cualquier aumento estadísticamente significativo que incluya, pero no limitado a, al menos un aumento del 1 %, al menos un aumento del 3 %, al menos un aumento del 5 %, al menos un aumento del 10 %, al menos un aumento del 20 %, al menos un 30 %, al menos un 50 %, al menos un 70 %, al menos un aumento del 100 % o mayor en el rendimiento en comparación con una planta que no expresa la secuencia plaguicida. En procedimientos específicos, el rendimiento de la planta aumenta como resultado de la resistencia mejorada a las plagas de una planta que expresa una proteína plaguicida desvelado en el presente documento. La expresión de la proteína plaguicida da como resultado una capacidad reducida de una plaga para infestar o alimentarse.

Las plantas también se pueden tratar con una o más composiciones químicas, incluyendo uno o más herbicidas, insecticidas o fungicidas. Las composiciones químicas ejemplares incluyen: Herbicidas de Frutas/Verduras: Atrazina, Bromacil, Diuron, Glifosato, Linuron, Metribuzin, Simazina, Trifluralin, Fluazifop, Gufosinato, Halosulfuron Gowan, Paraquat, Propizamida, Setoxidim, Butafenacil, Halosulfuron, Indaziflam; Insecticidas de frutas/verduras: Aldicarb, Bacillus thuriengiensis, Carbarilo, Carbofurano, Clorpirifos, Cipermetrin, Deltametrin, Abamectina, Ciflutrin/betaciflutrin, Esfenvalerato, Lambda-cihalotrin, Acequinocil, Bifenazato, Metoxifenozida, Novaluron, Cromafenozida, Tiacloprid, Dinotefurano, Fluacripirim, Espirodiclofeno, Gamma-cihalotrin, Espiromesifeno, Espinosad, Rinaxipir, Ciazipir, Triflumuron, Espirotetramat, Imidacloprid, Flubendiamida, Tiodicarb, Metaflumizona, Sulfoxaflor, Ciflumetofeno, Cianopirafeno, Clotianidin, Tiametoxam, Espinotoram, Tiodicarb, Flonicamid, Metiocarb, Benzoato de emamectina, Indoxacarb, Fenamifos, Piriproxifeno, Fenbutatina-óxido; Fungicidas de Frutas/Verduras: Ametoctradina, Azoxistrobina, Benthiavalicarb, Boscalid, Captano, Carbendazim, Clorotalonilo, Cobre, Ciazofamid, Ciflufenamida, Cimoxanilo, Ciproconazol, Ciprodinilo, Difenoconazol, Dimetomorf, Ditianona, Fenamidona, Fenhexamid, Fluazinam, Fludioxonilo, Fluopicolida, Fluopiram, Fluoxastrobin, Fluxapiroxad, Folpet, Fosetilo, Iprodiona, Iprovalicarb, Isopirazam, Kresoxim-metilo, Mancozeb, Mandipropamida, Metalaxil/mefenoxam, Metiram, Metrafenona, Miclobutanilo, Penconazol, Pentiopirad, Picoxistrobin, Propamocarb, Propiconazol, Propineb, Proquinazida, Protioconazol, Piraclostrobin, Pirimetanilo, Quinoxifeno, Espiroxamina, Azufre, Tebuconazol, Tiofanato-metilo, Trifloxistrobina; Herbicidas de Cereales: 2,4-D, Amidosulfuron, Bromoxinilo, Carfentrazona-E, Clorotoluron, Clorsulfuron, Clodinafop-P, Clopiralid, Dicamba, Diclofop-M, Diflufenican, Fenoxaprop, Florasulam, Flucarbazona-NA, Flufenacet, Flupirosulfuron-M, Fluroxipir, Flurtamona, Glifosato, Yodosulfuron, Ioxinil, Isoproturon, MCPA, Mesosulfuron, Metsulfuron, Pendimetalin, Pinoxaden, Propoxicarbazona, Prosulfocarb, Piroxsulam, Sulfosulfuron, Tifensulfuron, Tralkoxidim, Triasulfuron, Tribenuron, Trifluralin, Tritosulfuron; Fungicidas de Cereales: Azoxistrobina, Bixafen, Boscalid, Carbendazim, Clorotalonilo, Ciflufenamida, Ciproconazol, Ciprodinilo, Dimoxistrobina, Epoxiconazol, Fenpropidin, Fenpropimorf, Fluopiram, Fluoxastrobin, Fluquinconazol, Fluxapiroxad, Isopirazam, Kresoxim-metilo, Metconazol, Metrafenona, Pentiopirad, Picoxistrobin, Procloraz, Propiconazol, Proquinazida, Protioconazol, Piraclostrobin, Quinoxifeno, Espiroxamina, Tebuconazol, Tiofanato-metilo, Trifloxistrobina; Insecticidas de Cereales: Dimetoato, Lambda-cihaltrin, Deltametrin, Alfa-cipermetrin, p-ciflutrina, Bifentrin, Imidacloprid, Clotianidin, Tiametoxam, Tiacloprid, Acetamiprid, Dinetofurano, Clorpirifos, Pirimicarb, Metiocarb, Sulfoxaflor; Herbicidas de maíz: Atrazina, Alaclor, Bromoxinilo, Acetoclor, Dicamba, Clopiralid, (S-)Dimetenamida, Gufosinato, Glifosato, Isoxaflutol, (S-)Metolacloro, Mesotriona, Nicosulfuron, Primisulfuron, Rimsulfuron, Sulcotriona, Foramsulfuron, Topramezona, Tembotriona, Saflufenacil, Tiencarbazona, Flufenacet, Piroxasulfon; Insecticidas de maíz: Carbofurano, Clorpirifos, Bifentrin, Fipronilo, Imidacloprid, Lambda-cihalotrin, Teflutrin, Terbufos, Tiametoxam, Clotianidin, Espiromesifeno, Flubendiamida, Triflumuron, Rinaxipir, Deltametrin, Tiodicarb, p-ciflutrina, Cipermetrin, Bifentrin, Lufenuron, Tebupirimfos, Etiprol, Ciazipir, Tiacloprid, Acetamiprid, Dinetofurano, Avermectina; Fungicidas de Maíz: Azoxistrobina, Bixafen, Boscalid, Ciproconazol, Dimoxistrobina, Epoxiconazol, Fenitropan, Fluopiram, Fluoxastrobin, Fluxapiroxad, Isopirazam, Metconazol, Pentiopirad, Picoxistrobin, Propiconazol, Protioconazol, Piraclostrobin, Tebuconazol, Trifloxistrobina; Herbicidas de arroz: Butaclor, Propanil, Azimsulfuron, Bensulfuron, Cihalofop, Daimurón, Fentrazamida, Imazosulfuron, Mefenacet, Oxaziclomefona, Pirazosulfuron, Piributicarb, Quinclorac, Tiobencarb, Indanofan, Flufenacet, Fentrazamida, Halosulfuron, Oxaziclomefona, Benzobiciclon, Piriftalid, Penoxsulam, Bispiribac, Oxadiargilo, Etoxisulfuron, Pretilaclor, Mesotriona, Tefuriltriona, Oxadiazon, Fenoxaprop, Pirimisulfan; Insecticidas de arroz: Diazinón, Fenobucarb, Benfuracarb, Buprofezina, Dinotefurano, Fipronilo, Imidacloprid, Isoprocarb, Tiacloprid, Cromafenozida, Clotianidin, Etiprol, Flubendiamida, Rinaxipir, Deltametrin, Acetamiprid, Tiametoxam, Ciazipir, Espinosad, Espinotoram, Benzoato de emamectina, Cipermetrin, Clorpirifos, Etofenprox, Carbofurano, Benfuracarb, Sulfoxaflor; Fungicidas De Arroz: Azoxistrobina, Carbendazim, Carpropamid, Diclocimet, Difenoconazol, Edifenfos, Ferimzona, Gentamicina, Hexaconazol, Himexazol, Iprobenfos (IBP), Isoprotiolano, Isotianilo, Kasugamicina, Mancozeb, Metominostrobin, Orisastrobin, Pencicuron, Probenazol, Propiconazol, Propineb, Piroquilona, Tebuconazol, Tiofanato-metilo, Tiadinilo, Triciclazol, Trifloxistrobina, Validamicina; Herbicidas de algodón: Diuron, Fluometuron, MSMA, Oxifluorfen, Prometrin, Trifluralin, Carfentrazona, Cletodim, Fluazifop-butilo, Glifosato, Norflurazon, Pendimetalin, Piritiobac-sódico, Trifloxisulfurón, Tepraloxidim, Gufosinato, Flumioxazin, Tidiazuron; Insecticidas de algodón: Acefato, Aldicarb, Clorpirifos, Cipermetrin, Deltametrin, Abamectina, Acetamiprid, Benzoato de emamectina, Imidacloprid, Indoxacarb, Lambda-cihalotrin, Espinosad, Tiodicarb, Gamma-cihalotrin, Espiromesifeno, Piridalilo, Flonicamid FlubendiamidA, Triflumuron, Rinaxipir, Beta-ciflutrin, Espirotetramat, Clotianidin, Tiametoxam, Tiacloprid, Dinetofurano, Flubendiamida, Ciazipir, Espinosad, Espinotoram, gamma Cihalotrin, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-on, Tiodicarb, Avermectina, Flonicamid, Piridalilo, Espiromesifeno, Sulfoxaflor; Fungicidas de Algodón: Azoxistrobina, Bixafen, Boscalid, Carbendazim, Clorotalonilo, Cobre, Ciproconazol, Difenoconazol, Dimoxistrobina, Epoxiconazol, Fenamidona, Fluazinam, Fluopiram, Fluoxastrobin, Fluxapiroxad, Iprodiona, Isopirazam, Isotianilo, Mancozeb, Maneb, Metominostrobin, Pentiopirad, Picoxistrobin, Propineb, Protioconazol, Piraclostrobin, Quintozeno, Tebuconazol, Tetraconazol, Tiofanato-metilo, Trifloxistrobina; Herbicidas de soja: Alaclor, Bentazona, Trifluralin, Clorimuron-etilo, Cloransulam-metilo, Fenoxaprop, Fomesafen, Fluazifop, Glifosato, Imazamox, Imazaquin, Imazetapir, (S-)Metolacloro, Metribuzin, Pendimetalin, Tepraloxidim, Gufosinato; Insecticidas de soja: Lambda-cihalotrin, Metomilo, Imidacloprid, Clotianidin, Tiametoxam, Tiacloprid, Acetamiprid, Dinetofurano, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, Espinosad, Espinotoram, Benzoato de emamectina, Fipronilo, Etiprol, Deltametrin, p-ciflutrina, gamma y lambda Cihalotrin, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-on, Espirotetramat, Espinodiclofen, Triflumuron, Flonicamid, Tiodicarb, beta-ciflutrin; Fungicidas de soja: Azoxistrobina, Bixafen, Boscalid, Carbendazim, Clorotalonilo, Cobre, Ciproconazol, Difenoconazol, Dimoxistrobina, Epoxiconazol, Fluazinam, Fluopiram, Fluoxastrobin, Flutriafol, Fluxapiroxad, Isopirazam, Iprodiona, Isotianilo, Mancozeb, Maneb, Metconazol, Metominostrobin, Miclobutanilo, Pentiopirad, Picoxistrobin, Propiconazol, Propineb, Protioconazol, Piraclostrobin, Tebuconazol, Tetraconazol, Tiofanato-metilo, Trifloxistrobina; Herbicidas de remolacha azucarera: Cloridazon, Desmedifam, Etofumesato, Fenmedifam, Trialato, Clopiralid, Fluazifop, Lenacil, Metamitron, Quinmerac, Cicloxidim, Triflusulfuron, Tepraloxidim, Quizalofop; Insecticidas de remolacha azucarera: Imidacloprid, Clotianidin, Tiametoxam, Tiacloprid, Acetamiprid, Dinetofurano, Deltametrin, p-ciflutrina, gamma/lambda cihalotrin, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-on, Teflutrin, Rinaxipir, Ciaxipir, Fipronilo, Carbofurano; Herbicidas de canola: Clopiralid, Diclofop, Fluazifop, Gufosinato, Glifosato, Metazaclor, Trifluralin Etametsulfuron, Quinmerac, Quizalofop, Cletodim, Tepraloxidim; Fungicidas de canola: Azoxistrobina, Bixafen, Boscalid, Carbendazim, Ciproconazol, Difenoconazol, Dimoxistrobina, Epoxiconazol, Fluazinam, Fluopiram, Fluoxastrobin, Flusilazol, Fluxapiroxad, Iprodiona, Isopirazam, Mepiquat-cloruro, Metconazol, Metominostrobin, Paclobutrazol, Pentiopirad, Picoxistrobin, Procloraz, Protioconazol, Piraclostrobin, Tebuconazol, Tiofanato-metilo, Trifloxistrobina, Vinclozolin; Insecticidas de canola: Carbofurano, Tiacloprid, Deltametrin, Imidacloprid, Clotianidin, Tiametoxam, Acetamiprid, Dinetofurano, p-ciflutrina, gamma y lambda Cihalotrin, tau-Fluvaleriato, Etiprol, Espinosad, Espinotoram, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-on.

Los ejemplos siguientes se proporcionan a modo de ilustración únicamente y no como limitación.

Ejemplos experimentales

Ejemplo 1. Diseño y prueba de proteínas de fusión Axmi115

Axmi115 se describe en la Publicación de Patente de EE.UU. 20100004176 (la secuencia de aminoácidos se expone en el presente documento como SEQ ID NO: 43). Este gen comparte un 70 % de homología de secuencia con Vip3Aa. Una versión optimizada de codón de Axmi115 (también denominada en el presente documento Axmi115v01 y establecida en la s Eq ID NO: 42) se clonó y se expresó usando el vector de expresión de E. coli. La proteína producida se mostró en un bioensayo in vitro que tiene actividad plaguicida contra varias plagas de insectos incluyendo el barrenador europeo del maíz (ECB), gusano de la mazorca de maíz (CEW), cogollero del maíz (FAW) y gusano cortador negro (BCW).

Axmi005 también se describe en la Publicación de Patente de EE.UU. 20100004176. Este gen comparte un 94 % de homología de secuencia con Vip3Aa. Una versión optimizada de codón de Axmi005 (optAxmi005, que se expone en el presente documento como SEQ ID NO: 44) se clonó y se expresó usando el vector de expresión de E. coli. La proteína producida se mostró en un bioensayo in vitro que tiene actividad plaguicida contra diversas plagas de insectos incluyendo Helicoverpa zea (Hz), Heliothis virescens (Hv), FAW, BCW, barrenador de la caña de azúcar (SCB) y oruga de las leguminosas (VBC).

La actividad relativa de Axmi115 fue baja frente a Hz y FAW en comparación con Axmi005. Además, como se señaló anteriormente, Axmi005 no tenía actividad ECB. En un intento por identificar los dominios responsables de la especificidad diferencial, así como la actividad de las dos proteínas, se fabricaron construcciones que expresan fusiones de optAxmi005 y una versión optimizada de codones de Axmi115 (optAxmi115v01) como se describe a continuación y se diagraman en la Figura 1. La proteína se expresó en E. coli y se probó contra ECB, Hz, FAW y BCW en un bioensayo in vitro. La proteína expresada por pAX6307 (Axmi115v02.01, expuesta en el presente documento como SEQ ID NO: 1) mostró una mayor actividad en comparación con la proteína expresada por pAX5477 (Axmi115v01, establecida aquí como SEQ ID NO: 42) contra las cuatro plagas probadas.

El gen expresado en pAX6307 (Axmi115v02.01) se vectorizó en el vector de expresión de plantas pAG6141 en el que la expresión de la proteína fue impulsada por el promotor de Ubiquitina de caña de azúcar.

Las muestras de hojas de plantas transgénicas que expresan Axmi115v01 y Axmi115v02.01 se analizaron en un bioensayo de insectos de laboratorio contra el ^eC^b, Hz, FAW y BCW y en pruebas de campo contra ECB, Hz y FAW. Los resultados muestran que el gen Axmi115v02.01 mejorado tenía una mejor efectividad contra todas las plagas analizadas.

Descripción de construcciones:

Las secuencias de aminoácidos derivadas por traducción in silico de la secuencia de ADN de Vip3Aa, Axmi005, Axmi115v01, Axmi163 y Axmi184 se alinearon para identificar los aminoácidos conservados en todos los homólogos (Axmi163 y Axmi184 también se describen en la Publicación de Patente de EE.UU. 20100004176).

Los cebadores de PCR se diseñaron en tres regiones conservadas de Axmi005 y Axmi115v01 utilizando la secuencia de optAxmi005 que se encuentra en pAX5478 (que contiene una versión optimizada de codones de Axmi005, expuesto en SEQ ID NO: 44) y la secuencia de optAxmi115 encontrada en pAX5477 (que contiene una versión de Axmi115 optimizada para codones). Se generaron tres genes de fusión por PCR superpuesta (véase la Figura 1).

El ADN de los genes de fusión producidos por estas reacciones de PCR se clonó en el vector de expresión de E. coli pRSflB. Los vectores de expresión resultantes se muestran en la Tabla 1. La proteína se expresó utilizando procedimientos conocidos y el extracto de E. coli se probó en un bioensayo in vitro.

T l 1. n r i n ni f i n

Bioensayo in vitro

Los extractos brutos de E. coli expresado en vectores se ensayó contra Hz, ECB, FAW y BCW. Los resultados se muestran en la Tabla 2 (retraso del crecimiento) y la Tabla 3 (mortalidad).

Tabla 2. Puntuación de retraso del crecimiento

T l . P r n m r li

La proteína expresada a partir del vector pAX6307 (fusión A) varió en seis aminoácidos y se denominó Axmi115v02.01. La secuencia de aminoácidos para esta proteína de fusión se establece en SEQ ID NO: 15.

Los vectores de expresión de E. coli que expresaban Axmi115v01 (pAX5476) y Axmi115v02.01 (pAX6307) tenían etiquetas His 6X N-terminales. Las dos proteínas se purificaron utilizando las propiedades de unión de níquel de la etiqueta His 6X. Se analizaron diversas concentraciones de la proteína purificada mediante in vitro bioensayo contra el BCE, FAW, BCW y barrenador de la remolacha (BAW). Los resultados muestran que Axmi115v02.01 ha mejorado la actividad en comparación con Axmi115v01 en todos los casos (Tablas 4 y 5).

Tabla 4. Puntuación de retraso del crecimiento

continuación

Tabla 5. Puntuación de mortalidad

Bioensayo de disco foliar de planta

Axmi115v01 (SEQ ID NO: 42) y Axmi115v02.01 (SEQ ID NO: 1) se clonaron en los vectores de expresión de plantas pAG6585 y pAG6141, respectivamente, y se produjeron plantas de maíz transgénico. Se tomaron muestras para PCR y análisis Western y para bioensayo in vitro de disco foliar contra Hz, ECB, FAW y BCW. El bioensayo se calificó como sin daños, bajo daño (1-pocos agujeros), daño moderado y daño pesado. Los daños no dañados y leves se consideraron un resultado positivo, mientras que los daños moderados a graves se consideraron un resultado negativo.

El material foliar de PCR y plantas positivas Western se analizó en bioensayo in vitro de disco foliar. La Figura 2A muestra el porcentaje de plantas positivas para PCR que dieron una puntuación de bioensayo sin daños, daño leve, daño moderado o daño fuerte para cada construcción. Las transferencias Western indican que el nivel de expresión de proteína en plantas que expresan optAxmi115v02.01 es, en general, más alto que las plantas que expresan Axmi115v01.

Se produjeron plantas transgénicas adicionales que expresaban Axmi115v02.01. El material foliar de PCR y plantas positivas Western se analizó en bioensayo in vitro de disco foliar contra Hz, ECB, FAW y BCW. Los resultados se muestran en la Figura 2b.

Pruebas de campo de planta

Las plantas que expresan los genes que se muestran en la Tabla 6 se plantaron en el Condado de Polk, Lugar de prueba IA. Los segregados negativos se identificaron y se retiraron usando una aplicación 1X de Glifosato (20 oz./A de Buccaneer 5, Tenkoz, Inc.) cuando las plantas estaban en la etapa de hoja V3-V4. La presión del insecto resultó de infestaciones manuales de BCE, Hz y FAW.

Las infestaciones de ECB imitaron la ocurrencia natural de la primera y segunda generación. Para ECB, en total, aproximadamente 340 larvas fueron infestadas en los vástagos de las hojas (primera generación, ECB1) o las axilas de las hojas (segunda generación, ECB2) de cada planta. ECB1 se evaluó por la escala de calificación Guthrie 1-9. ECB2 fue una medida de la longitud total del túnel de tallo medido en cm.

Veinte larvas de Hz fueron infestadas en las puntas de las orejas primarias en cada planta. También hubo una infestación natural moderada de Hz que aumentó estas infestaciones manuales. El daño de las orejas se midió en cm2.

Aproximadamente 60 larvas FAW fueron infestadas en los espirales de las hojas. El daño se midió en la escala de calificación Davis 1-9 modificada como se describe a continuación.

Los resultados de estos ensayos de campo se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6. Resultados de ensa os de cam o

FAW - Descripción modificada de la escala de calificación de Davis 1-9.

1. No hay daños visibles o solo hay lesiones de poros presentes en las hojas en espiral.

2. Agujero de alfiler y pequeñas lesiones circulares presentes en las hojas en espiral.

3. Pequeñas lesiones circulares y algunas pequeñas lesiones alargadas (de forma rectangular) de hasta 1,3 cm de longitud presentes en hojas en espiral y enrolladas.

4. Varias lesiones alargadas pequeñas a medianas de 1,3 a 2,5 cm de longitud se presentan en algunas hojas en espiral y enrolladas.

5. Varias lesiones alargadas grandes de más de 2,5 cm de longitud se presentan en unas pocas hojas en espiral y enrolladas y/o unos pequeños agujeros de tamaño uniforme a irregular de tamaño pequeño a mediano (membrana basal consumida) comidos de la espiral y/o hojas enrolladas.

6. Varias lesiones alargadas grandes se presentan en varias hojas en espiral y enrolladas y/o en varios agujeros grandes de forma uniforme a irregular que se comen de las hojas en espiral.

7. Muchas lesiones alargadas de todos los tamaños se presentan en varias hojas en espiral y enrolladas, además de varios agujeros grandes de forma uniforme a irregular comidos de las hojas en espiral y enrolladas.

8. Muchas lesiones alargadas de todos los tamaños están presentes en la mayoría de las hojas en espiral y enrolladas además de muchos agujeros de tamaño medio a grande de forma uniforme a irregular comidos de las hojas en espiral y enrolladas.

9. Hojas en espiral y enrolladas casi totalmente destruidas.

Davis, F. M., S. S. Ng y W.P. Williams. 1992. Escalas de clasificación visual para el cribado del maíz en etapa de espiral para resistencia al cogollero del maíz. Miss. Agric. Forestry Exp. Stn. Tech. Bull. 186.

BCE - Descripción de la escala de calificación Guthrie 1-9.

1. No hay lesiones visibles en la hoja.

2. Pequeña cantidad de orificio de bala en algunas hojas.

3. La lesión por orificio de bala es común en varias hojas.

4. Varias hojas con orificios de bala y lesiones alargadas.

5. Varias hojas con lesiones alargadas.

6. Varias hojas con lesiones alargadas de unos 2,5 cm de largo.

7. Las lesiones largas son comunes en aproximadamente la mitad de las hojas.

8. Las lesiones largas son comunes en aproximadamente dos tercios de las hojas.

9. La mayoría se va con lesiones largas.

Guthrie, W. D., F. F. Dicke y C. R. Neiswander. 1960. Leaf and sheath feeding resistance to the European corn borer in eight inbred lines of dent corn. Ohio. Agric. Exp. Sta. Res. Bull. 860.

Ejemplo 2. Evolución dirigida de Axmi115v02.

La evolución dirigida se ha utilizado para mejorar la potencia y el perfil de actividad de Axmi115 frente a ECB, Hz, FAW, BCW y VBC. Para identificar regiones de Axmi115 implicadas en la toxicidad de insectos, se crearon varias variantes de intercambio de secuencias Axmi115/Axmi005 en la parte C-terminal de Axmi115. Se designaron veintiún bloques de divergencia secuencia entre Axmi115 y Axmi005 (véase la Publicación de Patente de EE.UU. N.° 20100004176 que se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad) y estos bloques de secuencia en Axmi115 se reemplazaron con los bloques de secuencia Axmi005 correspondientes. Los bioensayos de proteínas híbridas mostraron que las sustituciones en los bloques 2, 3, 10 y 18 están relacionadas con una mayor toxicidad por insectos.

Se crearon bibliotecas mutantes puntuales que apuntaban a posiciones en los bloques 2, 3, 10 y 18. Estas bibliotecas mutantes puntuales se analizaron contra ECB, Hz, FAW, BCW y VBC con cobertura 1,5x en el nivel de 4 réplicas. Se volvieron a realizar ensayos en el nivel de 4 réplicas, y se realizaron ampliaciones en el nivel de 16 réplicas. Los siguientes mutantes puntuales mostraron una actividad mejorada contra una o más plagas:

T l 7. A ivi m n n l Axmi11

Estas variantes contienen mutaciones en la parte C-terminal. Para buscar mejoras sinérgicas con Axmi115v02 (pAX6307), la parte C-terminal de varios de los mutantes anteriores se clonó en Axmi115v02 (pAX6307). Se llevaron a cabo ensayos de ampliación y se identificaron variantes con actividad mejorada en comparación con Axmi115v02.

Tabla 8. Actividad de los mutantes Axmi115v02

La variante axmi115 B2L11H6 (v02) muestra una actividad mejorada contra H. zea, VBC, FAW. Se designó Axmi115v02 (evo27). La secuencia de nucleótidos para Axmi115v02 (evo27) se expone en SEQ ID NO: 4 y la secuencia de aminoácidos codificada se expone en SEQ ID NO: 18.

La variante axmi115 B18L12B10 (v02) muestra mejoras contra ECB. Se designó Axmi115v02(evo28). La secuencia de nucleótidos para Axmi115v02(evo28) se expone en SEQ ID NO: 5 y la secuencia de aminoácidos codificada se expone en SEQ ID NO: 19.

La variante axmi115 B2L11F9 (v02) muestra mejoras frente a H.zea, VBC, FAW. Se designó Axmi115v02(evo29). La secuencia de nucleótidos para Axmi115v02(evo29) se expone en SEQ ID NO: 6 y la secuencia de aminoácidos codificada se expone en SEQ ID NO: 20.

Se realizaron mutaciones adicionales en la secuencia AXMI115v02 en la región C-terminal. Se identificaron tres variantes con actividad mejorada en relación con AXMI115v02 (Tabla 9). Los valores de LC50 y EC50 se determinaron para dos de estos mutantes C-terminales (Tabla 10).

AXMI115v02(EV031) mostró una mejor mortalidad contra FAW, gusano falso medidor (SBL) y VBC en relación con AXMI115v02. La secuencia de nucleótidos para Axmi115v02(evo31) se expone en SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos codificada se expone en SEQ ID NO: 21.

AXMI115v02(EVO32) mostró una mejor mortalidad contra BCE y H. zea en relación con AXMI115v02. La secuencia de nucleótidos para Axmi115v02(evo32) se expone en SEQ ID NO: 8 y la secuencia de aminoácidos codificada se expone en SEQ ID NO: 22.

AXMI115v02 (EVO38) mostró una mejor mortalidad contra BCW en relación con AXMI115v02. La secuencia de nucleótidos para Axmi115v02(evo38) se expone en SEQ ID NO: 47 y la secuencia de aminoácidos codificada se expone en SEQ ID NO: 48.

Tabla 9. Actividad de mutantes C-terminales Axmi115v02

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Ejemplo 3. Ensayos adicionales de actividad plaguicida

Las secuencias de nucleótidos de la invención pueden analizarse para determinar su capacidad para producir proteínas plaguicidas. La capacidad de una proteína plaguicida para actuar como plaguicida sobre una plaga a menudo se evalúa de varias maneras. Una forma bien conocida en la técnica es realizar un ensayo de alimentación. En tal ensayo de alimentación, uno expone la plaga a una muestra que contiene compuestos para analizar o muestras de control. A menudo, esto se realiza colocando el material a analizar, o una dilución adecuada de dicho material, sobre un material que la plaga ingiere, tal como una dieta artificial. El material a analizar puede estar compuesto de un líquido, sólido o suspensión. El material a probar puede colocarse sobre la superficie y luego dejarse secar. Como alternativa, el material a analizar puede mezclarse con una dieta artificial fundida y luego dispensarse en la cámara de ensayo. La cámara de ensayo puede ser, por ejemplo, una taza, un plato o un pozo de una placa de microtitulación.

Los ensayos para plagas chupadoras (por ejemplo, pulgones) pueden implicar separar el material de prueba del insecto por una partición, idealmente una porción que puede ser perforada por las partes de la boca de succión del insecto de succión, para permitir la ingestión del material de prueba. A menudo, el material de prueba se mezcla con un estimulante de alimentación, tal como la sacarosa, para promover la ingestión del compuesto de prueba.

Otros tipos de ensayos pueden incluir microinyección del material de prueba en la boca o el intestino de la plaga, así como el desarrollo de plantas transgénicas, seguido de una prueba de la capacidad de la plaga para alimentarse de la planta transgénica. Las pruebas de planta pueden involucrar el aislamiento de las partes de la planta que normalmente se consumen, por ejemplo, jaulas pequeñas unidas a una hoja, o aislamiento de plantas enteras en jaulas que contienen insectos.

Otros procedimientos y enfoques para analizar plagas son conocidos en la técnica, y se pueden encontrar, por ejemplo en Robertson y Preisler, eds. (1992) Pesticide bioassays with arthropods, CRC, Boca Raton, FL. Como alternativa, los ensayos se describen comúnmente en las revistas Arthropod Management Tests y Journal of Economic Entomology o por discusión con miembros de la Entomological Society of America (ESA).

En algunas realizaciones, las regiones de ADN que codifican la región de toxina de las proteínas plaguicidas desveladas en el presente documento se clonan en el vector de expresión de E. coli pMAL-C4x detrás del gen malE que codifica para la proteína de unión a maltosa (MBP). Estas fusiones en marco dan como resultado la expresión de proteínas de fusión MBP-Axmi en E. coli.

Para la expresión en E. coli, BL21*DE3 se transforman con plásmidos individuales. Las colonias individuales se inoculan en LB suplementado con carbenicilina y glucosa, y se cultivan durante la noche a 37 °C. Al día siguiente, se inocula medio fresco con 1 % de cultivo durante la noche y se cultiva a 37 °C hasta la fase logarítmica. Posteriormente, se inducen cultivos con IPTG 0,3 mM durante la noche a 20 °C. Cada sedimento celular se suspende en tampón Tris-Cl 20 mM, pH 7,4 200 mM NaCl 1 mM DTT inhibidores de proteasa y se somete a ultrasonidos. El análisis por SDS-PAGE puede usarse para confirmar la expresión de las proteínas de fusión.

Los extractos libres de células totales se procesan sobre una columna de amilosa unida a cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) para la purificación por afinidad de proteínas de fusión MBP-axmi. Las proteínas de fusión unidas se eluyen de la resina con solución de maltosa 10 mM. Luego, las proteínas de fusión purificadas se cortan con factor Xa o con tripsina para eliminar la etiqueta MBP amino terminal de la proteína Axmi. La escisión y la solubilidad de las proteínas se pueden determinar mediante SDS-PAGE

Ejemplo 4. Construcción de secuencias sintéticas

En un aspecto de la invención, se generan secuencias axmi sintéticas. Estas secuencias sintéticas tienen una secuencia de ADN alterada en relación con el la secuencia axmi parental y codifica una proteína que es colineal con la proteína AXMI original a la que corresponde, pero carece del "dominio cristalino" C-terminal presente en muchas proteínas delta-endotoxina.

En otro aspecto de la invención, las versiones modificadas de genes sintéticos están diseñadas de tal manera que el péptido resultante está dirigido a un orgánulo de la planta, tales como el retículo endoplásmico o el apoplasto. Las secuencias de péptidos que se sabe que dan como resultado el direccionamiento de proteínas de fusión a orgánulos vegetales se conocen en la técnica. Por ejemplo, la región N-terminal del gen de la fosfatasa ácida del altramuz blanco Lupinus albus (ID de Genebank GI: 14276838; Miller y col. (2001) Plant Physiology 127: 594-606) se sabe en la técnica que da como resultado un retículo endoplásmico que marca como diana a proteínas heterólogas. Si la proteína de fusión resultante también contiene una secuencia de retención endoplásmica que comprende el péptido N-terminal-lisina-ácido aspártico-ácido glutámico-leucina (es decir, el motivo "KDE^l" (SEQ ID NO: 46)) en el extremo C-terminal, la proteína de fusión se dirigirá al retículo endoplásmico. Si la proteína de fusión carece de una secuencia dirigida al retículo endoplásmico en el extremo C, la proteína se dirigirá al retículo endoplásmico, pero finalmente será secuestrado en el apoplasto.

Ejemplo 5. Transformación de células de maíz con los genes de proteínas plaguicidas descritos en el presente documento

Las mazorcas de maíz se recogen mejor 8-12 días después de la polinización. Los embriones se aíslan de las orejas, y se prefieren aquellos embriones de 0,8-1,5 mm de tamaño para su uso en la transformación. Los embriones se colocan en placa con escutelo hacia arriba en un medio de incubación adecuado, tales como medios DN62A5S (3,98 g/l de sales N6; 1 ml/l (de 1000x solución madre) de Vitaminas N6; 800 mg/l de L-Asparagina; 100 mg/l de Mioinositol; 1,4 g/l de L-Prolina; 100 mg/l de casaminoácidos; 50 g/l de sacarosa; 1 ml/l (de 1 mg/ml solución madre) 2,4-D). Sin embargo, los medios y sales distintos de DN62A5S son adecuados y son conocidos en la técnica. Los embriones se incuban durante la noche a 25 °C en la oscuridad. Sin embargo, no es necesario per se incubar los embriones durante la noche.

Los explantes resultantes se transfieren a cuadrados de malla (30-40 por placa), se transfieren a medios osmóticos durante aproximadamente 30-45 minutos, después se transfieren a una placa de emisión (véase, por ejemplo, la Publicación PCT N.° WO/0138514 y la patente de EE.UU. N.° 5.240.842).

Las construcciones de ADN diseñadas para los genes de la invención en las células vegetales se aceleran en el tejido vegetal usando un acelerador de haz de aerosol, utilizando condiciones esencialmente como se describe en la Publicación PCT N.° WO/0138514. Después de emitir, los embriones se incuban durante aproximadamente 30 minutos en medios osmóticos y se colocan en medios de incubación durante la noche a 25 °C en la oscuridad. Para evitar los explantes emitidos indebidamente dañinos, se incuban durante al menos 24 horas antes de la transferencia a los medios de recuperación. Los embriones se extienden a los medios del período de recuperación, durante aproximadamente 5 días, 25 °C en la oscuridad, después se transfieren a un medio de selección. Los explantes se incuban en medios de selección durante hasta ocho semanas, dependiendo de la naturaleza y características de la selección particular utilizada. Después del período de selección, el callo resultante se transfiere a los medios de maduración del embrión, hasta que se observe la formación de embriones somáticos maduros. Los embriones somáticos maduros resultantes se colocan luego con poca luz, y el procedimiento de regeneración se inicia mediante

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida, en la que dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:

(a) la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6;

(b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20; y

(c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende de una a cinco sustituciones de aminoácidos, eliminaciones o inserciones relativas a la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID: 20, en la que la actividad plaguicida del polipéptido de fusión se mejora en relación con la actividad plaguicida de SEQ ID NO: 43 en relación con la mortalidad para al menos uno del barrenador de maíz europeo, H. zea, el cogollero del maíz y la oruga de las leguminosas.

2. La molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1, en la que:

(a) dicha secuencia de nucleótidos es una secuencia sintética que se ha diseñado para la expresión en una planta; y/o

(b) dicha secuencia de nucleótidos está operativamente unida a un promotor capaz de dirigir la expresión de dicha secuencia de nucleótidos en una célula vegetal.

3. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1 o 2, preferentemente que comprende además una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo.

4. Una célula hospedadora que contiene el ácido nucleico recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 o el vector de la reivindicación 3, preferentemente que es una célula hospedadora bacteriana o una célula vegetal.

5. Una planta transgénica que comprende la célula hospedadora de la planta de la reivindicación 4, preferentemente, en la que dicha planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, sorgo, trigo, repollo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada y colza.

6. Una semilla transgénica que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 o el vector de la reivindicación 3.

7. Un polipéptido recombinante que tiene actividad plaguicida, en el que dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20; y

(b) una secuencia de aminoácidos que comprende de una a cinco sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos relativas a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20, en la que la actividad plaguicida del polipéptido se mejora en relación con la actividad plaguicida de SEQ ID NO: 43 en relación con la mortalidad para al menos uno del barrenador de maíz europeo, H. zea, el cogollero del maíz y la oruga de las leguminosas.

8. El polipéptido recombinante de la reivindicación 7 que comprende además secuencias de aminoácidos heterólogas.

9. Una composición que comprende el polipéptido de la reivindicación 7 u 8.

10. La composición de la reivindicación 9, en la que dicha composición:

(a) se selecciona del grupo que consiste en polvo, espolvoreado, microgránulo, gránulo, pulverización, emulsión, coloide y solución;

(b) se prepara por desecación, liofilización, homogeneización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación o concentración de un cultivo de células bacterianas; o

(c) comprende de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 99 % en peso de dicho polipéptido.

11. Un procedimiento para:

(a) controlar una plaga de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, nematodos o dípteros que comprende poner en contacto dicha población con una cantidad eficaz como plaguicida del polipéptido de la reivindicación 7 o la composición de la reivindicación 9 o 10; o

(b) matar a una plaga de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, nematodos o dípteros, que comprende poner en contacto dicha plaga con, o alimentar a dicha plaga, una cantidad eficaz como plaguicida del polipéptido de la reivindicación 7 o la composición de la reivindicación 9 o 10.

12. Un procedimiento de producción de un polipéptido con actividad plaguicida, que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 4 en condiciones en las que se expresa la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido, preferentemente en el que dicha planta es una célula vegetal.

13. Una planta que ha incorporado establemente en su genoma una construcción de ADN que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida, en la que dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(b) una secuencia de aminoácidos que comprende de una a cinco sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos relativas a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20, en la que la actividad plaguicida del polipéptido se mejora en relación con la actividad plaguicida de SEQ ID NO: 43 en relación con la mortalidad para al menos uno de entre barrenador de maíz europeo, H. zea, el cogollero del maíz y la oruga de las leguminosas.

14. Un procedimiento de protección de una planta de una plaga, que comprende expresar en una planta o célula de la misma una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida, en la que dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(b) una secuencia de aminoácidos que comprende de una a cinco sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos relativas a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20, en la que la actividad plaguicida del polipéptido se mejora en relación con la actividad plaguicida de SEQ ID NO: 43 en relación con la mortalidad para al menos uno deentre barrenador de maíz europeo, H. zea, el cogollero del maíz y la oruga de las leguminosas,

preferentemente en el que dicha planta produce un polipéptido plaguicida que tiene actividad plaguicida contra una plaga de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, nematodos o dípteros.

15. Un procedimiento para aumentar el rendimiento en una planta que comprende cultivar en un campo una planta o una semilla de la misma que ha incorporado establemente en su genoma una construcción de ADN que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida, en el que dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(b) una secuencia de aminoácidos que comprende de una a cinco sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos relativas a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20, en la que la actividad plaguicida del polipéptido se mejora en relación con la actividad plaguicida de SEQ ID NO: 43 en relación con la mortalidad para al menos uno de entre barrenador de maíz europeo, H. zea, el cogollero del maíz y la oruga de las leguminosas.