BR112013025665B1

BR112013025665B1 - molécula de ácido nucleico recombinante, vetor, microrganismo transgênico, polipeptídeo recombinante e seu método de produção, composição, métodos para controlar ou exterminar uma população de pragas, para proteger uma planta de uma praga, e para aumentar o rendimento em uma planta

Info

Publication number: BR112013025665B1
Application number: BR112013025665-6A
Authority: BR
Inventors: Duane Lehtinen; Nalini Manoj Desai; Volker Heinrichs
Original assignee: Athenix Corp
Priority date: 2011-04-05
Filing date: 2012-04-04
Publication date: 2021-06-08
Also published as: AU2019210561B2; ES2901155T3; PL2694659T3; CA2832087A1; RS59239B1; UA120584C2; UA122856C2; MX2019009896A; MX367427B; US9982274B2; CN103635579B; EP2694659B1; HUE045066T2; UY34005A; AU2019210561A1; ES2743322T3; EP3971297A1; EP2694659A1; EA201391444A1; EA036053B1

Abstract

molécula de ácido nucleico recombinante, vetor, célula hospedeira, polipeptídeo recombinante e seu método de produção, composição, métodos para controlar ou exterminar uma população de pragas, para proteger uma planta de uma praga, e para aumentar o rendimento em uma planta. são fornecidos composições e métodos para conferir atividade pesticida a bactérias, plantas, células de planta, tecidos e sementes. as sequências que codificam a toxina podem ser usadas em construtos de dna ou cassetes de expressão para a expressão em plantas e bactérias. as composições também incluem bactérias, plantas, células de planta, tecidos e sementes transformadas. em particular, são fornecidas sequências de polinucleotídeos e as proteínas da toxina codificadas por elas. também são fornecidos anticorpos que se ligam especificamente a essas sequências de aminoácidos. em particular, a invenção abrange sequências de nucleotídeos que codificam proteínas de fusão assim como variantes e fragmentos dessas biologicamente ativos, em que a proteína de fusão contém a porção c terminal de seq id no:43. a proteína de fusão também pode conter a porção n terminal de seq id no:45. a invenção também inclui a sequência de nucleotídeos de seq id no:47 e 1 a 14 ou a sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos descrita na seq id no:48 e 15 a 31, incluindo variantes e fragmentos dessas biologicamente ativos.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Esse pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S.No. de Série 61/471.848, depositado em 5 de abril de 2011, cujos conteúdos estão incorporados aqui por referência em sua totalidade.

REFERÊNCIA A LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS APRESENTADA ELETRONICAMENTE

[0002] A cópia oficial da listagem de sequências é apresentadaeletronicamente através de EFS-Web como uma listagem de sequências formatada em ASCII com um arquivo denominado “2916693-093977-SEQLIST.txt”, criado em 2 de abril de 2012 e que possui um tamanho de 241 kilobytes e é depositado concomitantemente com o pedido. A listagem de sequências contida nesse documento formatado em ASCII é parte do pedido e está incorporada aqui por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0003] Essa invenção se refere ao campo da biologia molecular.São fornecidos novos genes que codificam proteínas pesticidas. Essas proteínas e as sequências de ácido nucleico que as codificam são úteis no preparo de formulações pesticidas e na produção de plantas transgênicas resistentes a pragas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0004] O Bacillus thuringiensis é uma bactéria do solo Gram positiva que forma esporo caracterizado por sua habilidade de produzir inclusões cristalinas que são especificamente tóxicas para certas ordens e espécies de insetos, mas que não causam danos a plantas e outros organismos não visados. Por essa razão, as composições que incluem as cepas de Bacillus thuringiensis ou suas proteínas inseticidas podem ser usadas como inseticidas ambientalmente aceitáveis para controlar pragas de insetos na agricultura ou vetores de insetos para uma variedade de doenças humanas ou de animais.

[0005] As proteínas (delta-endotoxinas) cristalinas (Cry) de Bacillusthuringiensis possuem atividade inseticida potente contra predominantemente larvas de Lepidópteros, Hemípteros, Dípteros e Coleópteros. Essas proteínas também têm mostrado atividade contra as ordens de pragas Hymenoptera, Homoptera, Phthiraptera, Mallophaga, e ordens de praga Acari, assim como outras ordens de invertebrados tais como Nematelmintos, Platelmintos e Sarcomastigorfora (Feitelson (1993) The Bacillus Thuringiensis family tree. Em Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.). A proteína cristalina não exibe atividade inseticida até que tenha sido ingerida e solubilizada no intestino médio do inseto. A pró-toxina ingerida é hidrolisada pelas proteases no trato digestivo do inseto em uma molécula tóxica ativa. (Hõfte and Whiteley (1989) Microbiol. Rev. 53:242-255). Essa toxina se liga aos receptores apicais da borda em escova no intestino médio das larvas-alvo e se insere na membrana apical criando canais de íons ou poros, resultando na morte da larva.

[0006] Em adição às endotoxinas, o B. thuringiensis também produzproteínas inseticidas secretadas durante seu estágio de crescimento vegetativo, ou seja, proteínas inseticidas vegetativas (Vip). Desde a descoberta do primeiro grupo de proteínas Vip, dois grupos principais de toxinas Vip foram identificados no B. thuringiensis. Um grupo de toxinas Vip consiste em toxinas binárias que são feitas de dois componentes, Vip1 e Vip2 (Warren (1997). Em N. B. Carozzi and M. G. Koziel (ed.), Advances in insect control: the role of transgenic plants. Taylor & Francis, London, United Kingdom). A combinação de Vip1 e Vip2 é altamente inseticida para um inseto agricolamente importante, larva da lagarta da raiz do milho ocidental (Diabrotica virgifera), mas não mostra qualquer atividade inseticida contra qualquer inseto lepidóptero (Han et al. (1999) Nat. Struct. Biol. 6:932-936). O outro grupo consiste em toxinas Vip3, que não compartilham similaridade de sequência com Vip1 ou Vip2. A primeira toxina Vip3 identificada, Vip3Aa1, é altamente inseticida para a maioria das pragas lepidópteras principais do milho e do algodão, incluindo a lagarta de cartucho Spodoptera frugiperda e a lagarta do aldodão Helicoverpa zea, mas não mostra nenhuma atividade contra a broca do milho europeu Ostrinia nubilalis, a principal praga do milho (Estruch et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5389-5394). A deleção do gene vip3Aa1 de uma cepa de B. thuringiensis resultou em uma redução significativa da atividade inseticida daquela cepa de B. thuringiensis, sugerindo que Vip3 contribui para a toxicidade global das cepas de B. thuringiensis (Donovan et al. (2001) J. Invertebr. Pathol. 78:45-51). Também foi observado que Vip3Aa1 mata insetos pela lise das células do intestino médio (Yu et al. (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63:532-536) através da formação de poro na membrana celular (Lee et al. (2003) Appl. Environ. Microbiol. 69:4648-4657).

[0007] O uso aumentado de inseticidas baseados em B.thuringiensis já deu origem a resistência nas populações do campo de larvas de traça, Plutella xylostella (Ferré and Van Rie (2002) Annu. Rev. Entomol. 47:501-533). O mecanismo de resistência mais comum é a redução da ligação da toxina aos seus receptores específicos no intestino médio. Isso pode conferir também resistência cruzada com outras toxinas que compartilham o mesmo receptor (Ferré and Van Rie (2002)).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0008] São fornecidas composições e métodos para conferiratividade pesticida a bactérias, plantas, células de planta, tecidos e sementes. As composições incluem moléculas de ácido nucleico que codificam sequências para polipeptídeos pesticidas e inseticidas, vetores que compreendem essas moléculas de ácido nucleico e células hospedeiras que compreendem os vetores. As composições também incluem as sequências de polipeptídeo pesticida e os anticorpos para esses polipeptídeos. As sequências de nucleotídeos podem ser usadas em construtos de DNA ou cassetes de expressão para a transformação e expressão em organismos, incluindo microrganismos e plantas. As sequências de nucleotídeos ou aminoácidos podem ser sequências sintéticas que não tenham sido designadas para expressão em um organismo incluindo, mas não limitados a um microrganismo ou planta. As composições também compreendem bactérias, plantas, células de planta, tecidos e sementes que compreendem a sequência de nucleotídeos da invenção.

[0009] Em particular, as moléculas de ácido nucleico isoladas quesão fornecidas codificam uma proteína pesticida. Adicionalmente, as sequências de aminoácidos que correspondem à proteína pesticida são abrangidas. Em particular, a presente invenção fornece uma molécula de ácido nucleico isolada ou recombinante que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de fusão, assim como variantes e seus fragmentos biologicamente ativos, em que a proteína de fusão compreende a porção C terminal de SEQ ID NO: 43. Em várias modalidades, a proteína de fusão compreende a porção N terminal de SEQ ID NO: 45. Em modalidades específicas, a molécula de ácido nucleico abrangida pela presente invenção (incluindo vetores, células hospedeiras, plantas e sementes que compreendem a molécula de ácido nucleico) compreende a sequência de nucleotídeos descrita na SEQ ID NO: 47 e 1 a 14 ou uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 48 e 15 a 31, incluindo variantes e seus fragmentos biologicamente ativos. As sequências de nucleotídeos que são complementares a uma sequência de nucleotídeos da invenção ou que hibridizam com uma sequência da invenção ou um complemento dessa também são abrangidas. Proteínas de fusão isoladas ou recombinantes codificadas pela molécula de ácido nucleico da invenção também são abrangidas aqui.

[00010] São fornecidos métodos para a produção dos polipeptídeos da invenção e para a utilização desses polipeptídeos para o controle e morte de uma praga lepidóptera, hemíptera, coleóptera, nematoide ou díptera. Métodos e kits para a detecção de ácidos nucleicos e polipeptídeos da invenção em uma amostra também estão incluídos.

[00011] As composições e métodos da invenção são úteis para a produção de organismos com resistência ou tolerância intensificadas a praga. Esses organismos e as composições que compreendem os organismos são desejáveis para propósitos agrícolas. As composições da invenção também são úteis para gerar proteínas alteradas ou aperfeiçoadas que possuem atividade pesticida ou para detectar a presença de proteínas pesticidas ou ácidos nucleicos em produtos ou organismos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00012] A Figura 1 mostra um diagrama dos construtos de fusão.

[00013] A Figura 2 mostra os resultados do bioensaio em disco defolha in vitro. pAG6585 contém optAxmi115v01 (N=14) e pAG6141 contém optAxmi115v02.01.01 (N=8).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00014] A presente invenção é direcionada para composições e métodos para regular a resistência ou a tolerância a uma praga em organismos, particularmente em plantas ou células de planta. Por “resistência” é pretendido que a praga (por exemplo, inseto) seja morta depois da ingestão ou de outro contato com os polipeptídeos da invenção. Por “tolerância” é pretendido uma deficiência ou redução do movimento, alimentação, reprodução ou outras funções da praga. Os métodos envolvem transformar os organismos com uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína pesticida da invenção. Em particular, as sequências de nucleotídeos da invenção são úteis para a preparação de plantas e microrganismos que possuam atividade pesticida. Portanto, as bactérias, plantas, células de planta, tecidos de planta e sementes transformadas são fornecidas. Composições são ácidos nucleicos e proteínas pesticidas de Bacillus ou de outras espécies. As sequências encontram uso na construção de vetores de expressão para a transformação subsequente em organismos de interesse, como sondas para o isolamento de outros genes homólogos (ou parcialmente homólogos) e para a geração de proteínas pesticidas alteradas pelos métodos conhecidos na técnica, tais como troca de domínios ou shuffling de DNA, por exemplo, com membros das famílias Vip1, Vip2 ou Vip3 de toxinas. As proteínas encontram uso no controle ou na morte de populações de pragas de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, dípteros ou nematódeos e para a produção de composições com atividade pesticida.

[00015] Por “toxina pesticida” ou “proteína pesticida” é pretendida uma toxina que tem atividade tóxica contra uma ou mais pragas, incluindo, mas não limitadas a membros das ordens Lepidoptera, Diptera, e Coleoptera do filo Nematoda ou uma proteína que tenha homologia a tal proteína. Proteínas pesticidas têm sido isoladas de organismos que incluem, por exemplo, Bacillus sp., Clostridium bifermentans e Paenibacillus popilliae. Proteínas pesticidas incluem sequências de aminoácidos deduzidas das sequências de nucleotídeos de extensão completa aqui descritas e sequências de aminoácidos que são mais curtas do que as sequências de extenso completa, devido ao uso de um sítio de iniciação a jusante alternativo ou devido ao processamento que produz uma proteína mais curta que possui atividade pesticida. O processamento pode ocorrer no organismo onde a proteína é expressa ou na praga depois da ingestão da proteína.

[00016] Portanto, são fornecidas aqui novas sequências de nucleotídeos isoladas ou recombinantes que conferem atividade pesticida. Essa sequências de nucleotídeos codificam polipeptídeos com homologia a toxinas conhecidas. Também são fornecidas as sequências de aminoácidos das proteínas pesticidas. A proteína resultante da tradução desse gene permite que as células controlem ou matem as pragas ingeridas.Moléculas de Ácido Nucleico Isoladas e Suas Variantes e Fragmentos

[00017] Um aspecto da invenção diz respeito a moléculas de ácido nucleico isoladas ou recombinantes que compreendem sequências de nucleotídeos que codificam proteínas e polipeptídeos pesticidas ou porções biologicamente ativas desses, assim como moléculas de ácido nucleico que codificam proteínas com regiões com homologia de sequência. Também são abrangidas aqui sequências de nucleotídeos capazes de hibridizar com as sequências de nucleotídeos da invenção sob condições estringentes como definidas aqui em outro lugar. Como usada aqui, a expressão “molécula de ácido nucleico” é pretendida incluir moléculas de DNA (por exemplo, DNA recombinante, cDNA ou DNA genômico) e moléculas de RNA (por exemplo, mRNA) e análogos de DNA e RNA gerados usando análogos de nucleotídeos. A molécula de ácido nucleico pode ser de fita simples ou de fita dupla, mas preferivelmente é DNA de fita dupla.

[00018] Uma sequência de ácido nucleico (ou DNA) “isolada” ou “recombinante” é usada aqui para se referir a uma sequência de ácido nucleico (ou DNA) que não está mais em seu ambiente natural, por exemplo, em uma célula hospedeira de planta ou bactéria in vitro ou recombinante. Em algumas modalidades, um ácido nucleico isolado ou recombinante é livre de sequências (preferivelmente sequências que codificam proteínas) que flanqueiam naturalmente o ácido nucleico (isto é, sequências localizadas nas extremidades 5’ e 3’ do ácido nucleico) no DNA genômico do organismo a partir do qual o ácido nucleico é derivado. Para os propósitos da invenção, “isolado” quando usado para se referir a moléculas de ácido nucleico exclui cromossomos isolados. Por exemplo, em várias modalidades, a molécula de ácido nucleico isolada que codifica a delta-toxina pode conter menos do que cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, ou 0,1 kb de sequências de nucleotídeos que flanqueiam naturalmente a molécula de ácido nucleico no DNA genômico da célula a partir da qual o ácido nucleico é derivado. Em várias modalidades, uma proteína delta-endotoxina que é substancialmente livre de material celular inclui preparações de proteína que possuem menos do que cerca de 30%, 20%, 10% ou 5% (em peso seco) de proteína não delta-endotoxina (também referida aqui como uma “proteína contaminante”).

[00019] As sequências de nucleotídeos que codificam as proteínas da presente invenção incluem a sequência descrita na SEQ ID NO: 47 e 1 a 14 e variantes, fragmentos e complementos dessas. Por “complemento” é pretendida uma sequência de nucleotídeos que é suficientemente complementar a uma dada sequência de nucleotídeos tal que ela pode hibridizar com uma dada sequência de nucleotídeos para dessa maneira formar um dúplice estável. As sequências de aminoácidos correspondentes para as proteínas pesticidas codificadas por essas sequências de nucleotídeos estão descritas nas SEQ ID NO: 48 e 15 a 3.

[00020] As moléculas de ácido nucleico que são fragmentos dessas sequências de nucleotídeos que codificam as proteínas pesticidas também são abrangidas pela presente invenção. Por “fragmento” é pretendido uma porção da sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína pesticida. Um fragmento de uma sequência de nucleotídeos pode codificar uma porção biologicamente ativa de uma proteína pesticida ou ele pode ser um fragmento que pode ser usado como uma sonda de hibridização ou iniciador de PCR usando os métodos descritos abaixo. As moléculas de ácido nucleico que são fragmentos de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína pesticida compreendem pelo menos cerca de 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1350, 1400 nucleotídeos contíguos ou até o número de nucleotídeos presentes em uma sequência de nucleotídeos de extensão completa que codifica uma proteína pesticida aqui descrita, dependendo do uso pretendido. Por nucleotídeos “contíguos” são pretendidos resíduos de nucleotídeos que são imediatamente adjacentes um ao outro. Os fragmentos das sequências de nucleotídeos da presente invenção codificarão fragmentos de proteína que retêm a atividade biológica da proteína pesticida e, portanto, retém a atividade pesticida. Portanto, fragmentos biologicamente ativos dos polipeptídeos aqui descritos também são abrangidos. Por “retém a atividade” é pretendido que o fragmento tenha pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, 80%, 90%, 95% ou mais da atividade pesticida da proteína pesticida. Em várias modalidades, a atividade pode e aperfeiçoada ou prolongada em relação a uma proteína pesticida de referência (por exemplo, aperfeiçoada ou prolongada em relação à atividade de SEQ ID NO: 43 ou 45) como definida aqui em outro lugar. Em uma modalidade, a atividade pesticida é uma atividade coleoptericida. Em outra modalidade, a atividade pesticida é uma atividade lepidoptericida. Em outra modalidade, a atividade pesticida é uma atividade nematicida. Em outra modalidade, a atividade pesticida é uma atividade diptericida. Em outra modalidade, a atividade pesticida é uma atividade hemiptericida. Métodos para medir a atividade pesticida são bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290293; e a Patente U.S. No. 5.743.477, todas incorporadas aqui por referência em sua totalidade.

[00021] Um fragmento de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína pesticida que codifica uma porção biologicamente ativa de uma proteína da invenção codificará pelo menos cerca de 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450aminoácidos contíguos ou até o número total de aminoácidos presentes em uma proteína pesticida de extensão completa da invenção. Em algumas modalidades, o fragmento é um fragmento de clivagem proteolítica. Por exemplo, o fragmento de clivagem proteolítica pode ter um truncamento N terminal ou C terminal de pelo menos cerca de 100 aminoácidos, cerca de 120, cerca de 130, cerca de 140, cerca de 150 ou cerca de 160 aminoácidos em relação a SEQ ID NO: 48 e 15-31. Em algumas modalidades, os fragmentos abrangidos aqui resultam da remoção do domínio de cristalização C terminal, por exemplo, por proteólise ou pela inserção de um códon de parada na sequência codificadora. Em outras modalidades, a proteína de fusão compreende um fragmento do domínio C terminal de SEQ ID NO: 43 e/ou um fragmento do domínio N terminal de SEQ ID NO: 45.

[00022] As proteínas pesticidas preferidas da presente invenção são codificadas por uma sequência de nucleotídeos suficientemente idêntica à sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 47 e 1 a 14 ou as proteínas pesticidas são suficientemente idênticas à sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 48 e 15 a 31. Em outra modalidade, a sequência de nucleotídeos codifica uma proteína de fusão, em que a porção N terminal é suficientemente idêntica à porção N terminal de SEQ ID NO: 45 ou em que a porção N terminal é suficientemente idêntica à porção N terminal de SEQ ID NO: 45 e a porção C terminal é suficientemente idêntica à SEQ ID NO: 43. Por “suficientemente idêntica” é entendido uma sequência de aminoácidos ou de nucleotídeos que tem pelo menos cerca de 60% ou 65% de identidade de sequência, cerca de 70% ou 75% de identidade de sequência, cerca de 80% ou 85% de identidade de sequência, cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência, comparada com uma sequência de referência usando um dos programas de alinhamento aqui descritos usando parâmetros padronizados. Aquele versado na técnica reconhecerá que esses valores podem ser apropriadamente ajustados para determinar a identidade de proteínas correspondentes codificadas pelas duas sequências de nucleotídeos levando em consideração a degeneração de códon, similaridade de aminoácido, posicionamento da fase de leitura e semelhantes.

[00023] Para determinar o percentual de identidade de duas sequências de aminoácidos ou de dois ácidos nucleicos, as sequências são alinhadas com o propósito de comparação ótima. O percentual de identidade entre as duas sequências é uma função do número e posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, percentual de identidade = número de posições idênticas/número total de posições (por exemplo, posições superpostas) x 100). Em uma modalidade, as duas sequências têm a mesma extensão. Em outra modalidade, o percentual de identidade é calculado através da totalidade da sequência de referência (isto é, a sequência descrita aqui como qualquer uma de SEQ ID NO: 1 a 31, 47 ou 48). O percentual de identidade entre as duas sequências pode ser determinado usando técnicas similares aquelas descritas abaixo, com ou sem a permissão de espaços. No cálculo do percentual de identidade, combinações tipicamente exatas são contadas. Um espaço, isto é, uma posição em um alinhamento onde um resíduo está presente em uma sequência, mas não na outra, é considerada como uma posição com resíduos não idênticos.

[00024] A determinação do percentual de identidade entre duas sequências pode ser obtido usando um algoritmo matemático. Um exemplo não limitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, modificado como em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Tal algoritmo é incorporado nos programas BLASTN e BLASTX de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. As pesquisas de nucleotídeo BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTN, escore = 100, tamanho da palavra = 12, para obter sequências de nucleotídeos homólogas às moléculas de ácido nucleico semelhantes ao pesticida da invenção. As pesquisas de proteína com BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTX, escore = 50, tamanho da palavra = 3, para obter sequências deaminoácidos homólogas às moléculas de proteína pesticida da invenção. Para obter alinhamentos abertos com propósitos de comparação, pode ser utilizado Gapped BLAST (em BLAST 2.0) como descrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, PSI-Blast pode ser usado para realizar uma busca repetida que detecte relacionamentos distantes entre as moléculas. Veja Altschul et al. (1997) supra. Quando se utilize os programas BLAST, Gapped BLAST e PSI- Blast, os parâmetros padronizados dos respectivos programas (por exemplo, BLASTX e BLASTN) podem ser usados. O alinhamento também pode ser realizado manualmente pela inspeção.

[00025] Outro exemplo não limitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo ClustalW (Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). ClustalW compara sequências a alinha a totalidade da sequência de aminoácidos ou DNA e, portanto, pode fornecer dados a cerca da conservação da sequência da sequência de aminoácidos completa. O algoritmo ClustalW é usado em vários pacotes de programas de análise de DNA/aminoácidos comercialmente disponíveis, tais como o módulo ALIGNX de Vector NTI Program Suite (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Depois do alinhamento das sequências de aminoácidos com ClustalW, o percentual de identidade de aminoácidos pode ser avaliado. Um exemplo não limitante de um programa útil para a análise do alinhamento por ClustalW é GENEDOC™. GENEDOC™ (Karl Nicholas) permite a avaliação da similaridade e da identidade de aminoácidos (ou DNA) entre múltiplas proteínas. Outro exemplo não limitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de Myers e Miller (1988) CABIOS 4:11-17. Tal algoritmo está incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), que é parte do GCG Wisconsin Genetics Software Package, Version 10 (disponibilizado por Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, CA, USA). Quando se utiliza o programa ALIGN para comparar sequências de aminoácidos, uma tabela de peso de resíduo PAM120, uma penalidade de extensão de espaço de 12 e uma penalidade de espaço de 4 podem ser usadas.

[00026] A menos que estabelecido de outra maneira, GAP Versão 10, que usa o algoritmo de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453 será usado para determinar a identidade de sequência ou a similaridade usando os seguintes parâmetros: % de identidade e % de similaridade para uma sequência de nucleotídeos usando Peso de GAP de 50 e Peso da Extensão de 3 e a matriz de pontuação nwsgapdna.cmp; % de identidade ou % de similaridade para uma sequência de aminoácidos usando um peso de GAP de 8 e o peso da extensão de 2 e o programa de pontuação BLOSUM62. Programas equivalentes também podem ser usados. Por “programa equivalente” é pretendido qualquer programa de comparação de sequência que, para quaisquer duas sequências em questão, gere um alinhamento que tenha combinações de resíduos de nucleotídeos idênticos e um percentual idêntico de identidade de sequência quando comparado com o alinhamento correspondente gerado por GAP Versão 10.

[00027] A invenção também abrange moléculas variantes de ácido nucleico. Sequências de nucleotídeos que codificam “variantes” da proteína pesticida incluem aquelas sequências que codificam as proteínas pesticidas aqui descritas, mas que diferem conservativamente devido a degeneração do código genético, assim como aquelas que são suficientemente idênticas como discutidas acima. Variantes alélicas que ocorrem naturalmente podem ser identificadas com o uso de técnicas de biologia molecular bem conhecidas, tais como a reação em cadeia da polimerase (PCR) e as técnicas de hibridização como delineadas abaixo. Sequências de nucleotídeos variantes também incluem sequências de nucleotídeos sinteticamente derivadas que tenham sido geradas, por exemplo, pelo uso da mutagênese direcionada ao sítio, mas que ainda codificam as proteínas pesticidas descritas na presente invenção como discutido abaixo. Proteínas variantes abrangidas pela presente invenção são biologicamente ativas, ou seja, elas continuam a possuir a atividade biológica desejada da proteína nativa, ou seja, a atividade pesticida. Por “retém a atividade” é pretendido que a variante tenha pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70% ou pelo menos cerca de 80% da atividade pesticida da proteína nativa. Em algumas modalidades, a atividade é aperfeiçoada ou prolongada em relação a uma proteína de referência como definida aqui em outro lugar. Métodos para medir a atividade pesticida são bem conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290- 293; e Patente U.S. No. 5.743.477, todos incorporados aqui por referência em sua totalidade.

[00028] Aquele versado na técnica apreciará adicionalmente que as alterações podem ser introduzidas pela mutação das sequências de nucleotídeos da invenção levando dessa maneira a alterações na sequência de aminoácidos das proteínas pesticidas codificadas, sem alterar a atividade biológica das proteínas. Portanto, moléculas de ácido nucleico variantes isoladas podem ser criadas pela introdução de uma ou mais substituições, adições ou deleções de nucleotídeos na sequência de nucleotídeos aqui descrita, tal que uma ou mais substituições, adições ou deleções sejam introduzidas na proteína codificada. As mutações podem ser introduzidas por técnicas padronizadas, tais como a mutagênese direcionada ao sítio e a mutagênese mediada por PCR. Tais sequências de nucleotídeos variantes também são abrangidas pela presente invenção.

[00029] Por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos podem ser feitas em um ou mais resíduos de aminoácidos preditos, não essenciais. Um resíduo de aminoácido “não essencial” é um resíduo que pode ser alterado a partir da sequência de tipo selvagem de uma proteína pesticida sem alterar a atividade biológica, enquanto que um resíduo de aminoácido “essencial” é necessário para a atividade biológica. Uma “substituição conservativa de aminoácido” é aquela na qual o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que possui uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácidos que possuem cadeias laterais similares têm sido definidas na técnica. Essas famílias incluem os aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).

[00030] As substituições de aminoácidos podem ser feitas em regiões não conservadas que retêm função. Em geral, tais substituições não poderão ser feitas em resíduos de aminoácidos conservados ou em resíduos de aminoácidos que residem dentro de um motivo conservado, onde tais resíduos são essenciais para a atividade da proteína. Exemplos de resíduos que são conservados e que podem ser essenciais para a atividade da proteína incluem, por exemplo, resíduos que são idênticos entre todas as proteínas contidas em um alinhamento de toxinas similares ou relacionadas com as sequências da invenção (por exemplo, resíduos que são idênticos em um alinhamento de proteínas homólogas). Exemplos de resíduos que são conservados, mas que podem permitir substituições conservativas de aminoácidos e ainda retêm atividade incluem, por exemplo, resíduos que possuem apenas substituições conservativas entre todas as proteínas contidas em um alinhamento de toxinas similares ou relacionadas com as sequências da invenção (por exemplo, resíduos que possuem apenas substituições conservativas entre todas as proteínas contidas no alinhamento da proteína homóloga). Entretanto, aquele versado na técnica compreenderá que as variantes funcionais podem ter alterações menores conservadas ou não conservadas nos resíduos de nucleotídeos.

[00031] Alternativamente, sequências de nucleotídeos variantes podem ser feitas pela introdução de mutações aleatoriamente ao longo de toda ou parte da sequência codificadora, tal como pela mutagênese por saturação e os mutantes resultantes podem ser rastreados quanto a habilidade de conferir atividade pesticida para identificar os mutantes que retêm a atividade. Depois da mutagênese, a proteína codificada pode ser expressa recombinantemente e a atividade da proteína pode ser determinada usando técnicas de ensaio padronizadas.

[00032] Usando métodos tais como PCR, hibridização e semelhantes as sequências pesticidas correspondentes podem ser identificadas, tais sequências possuindo identidade substancial com as sequências da invenção. Veja, por exemplo, Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) e Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY).

[00033] Em um método de hibridização, toda ou parte da sequência de nucleotídeos pesticida pode ser usada para rastrear bibliotecas de cDNA ou genômicas. Métodos para construção de tais bibliotecas de cDNA ou genômicas são comumente conhecidos na técnica e estão descritos em Sambrook e Russell, 2001, supra. As assim chamadas sondas de hibridização podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA e outros oligonucleotídeos e podem ser marcadas com um grupo detectável tal como 32P ou qualquer outro marcador detectável, tais como outros radioisótopos, um composto fluorescente, uma enzima ou um cofator enzimático. As sondas para a hibridização podem ser feitas pela marcação de oligonucleotídeos sintéticos com base na sequência de nucleotídeos que codifica a proteína pesticida aqui descrita. Iniciadores degenerados designados com base em nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos conservados na sequência de nucleotídeos ou na sequência de aminoácidos codificada podem ser adicionalmente usados. A sonda compreende tipicamente uma região de sequência de nucleotídeos que hibridiza sob condições estringentes a pelo menos cerca de 12, pelo menos cerca de 25, pelo menos cerca de 50, 75, 100, 125, 150, 175 ou 200 nucleotídeos consecutivos da sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína pesticida da invenção ou um fragmento ou variante dessa. Métodos para a preparação de sondas para hibridização são geralmente conhecidos na técnica e são descritos em Sambrook and Russell, 2001, supra, incorporado aqui por referência.

[00034] Por exemplo, a sequência pesticida completa aqui descrita, ou uma ou mais porções dessa, podem ser usadas como uma sonda capaz de hibridizar especificamente a sequências semelhantes a proteína pesticida e RNAs mensageiros. Para obter a hibridização específica sob uma variedade de condições, tais sondas incluem sequências que são únicas e têm preferivelmente pelo menos cerca de 10 nucleotídeos de extensão ou pelo menos cerca de 20 nucleotídeos de extensão. Tais sondas podem ser usadas para amplificar as sequências pesticidas correspondentes a partir do organismo escolhido por PCR. Essa técnica pode ser usada para isolar sequências codificadoras adicionais a partir de um organismo desejado ou como um ensaio diagnóstico para determinar a presença de sequências codificadoras em um organismo. As técnicas de hibridização incluem o rastreamento da hibridização de bibliotecas de DNA plaqueado (ou placas ou colônias; veja, por exemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).

[00035] Portanto, a presente invenção abrange sondas para a hibridização, assim como sequências de nucleotídeos capazes de hibridizar a toda ou a uma porção de uma sequência de nucleotídeos da invenção (por exemplo, pelo menos cerca de 300 nucleotídeos, pelo menos cerca de 400, pelo menos cerca de 500, 1000, 1200, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500 ou até a extensão completa de uma sequência de nucleotídeos aqui descrita. A hibridização de tais sequências pode ser realizada sob condições estringentes. Por “condições estringentes” ou “condições estringentes de hibridização” entende-se condições sob as quais uma sonda irá hibridizar com sua sequência-alvo em um grau detectavelmente maior do que outras sequências (por exemplo, pelo menos 2 vezes acima do fundo). Condições estringentes são dependentes da sequência e serão diferentes em circunstancias diferentes. Pelo controle da estringência da hibridização e/ou das condições de lavagem, as sequências-alvo que são 100% complementares à sonda podem ser identificadas (sondagem homóloga). Alternativamente, as condições de estringência podem ser ajustadas para permitir algum não pareamento nas sequências tal que graus menores de similaridade sejam detectados (sondagem heteróloga). Geralmente, uma sonda é menor do que cerca de 1000 nucleotídeos de extensão, preferivelmente menor do que 500 nucleotídeos de extensão.

[00036] Tipicamente, as condições estringentes serão aquelas nas quais a concentração de sal é menor do que cerca de 1,5 M de íon de Na, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de íon de Na (ou outros sais) em pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é de pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (por exemplo, maiores do que 50 nucleotídeos). Condições estringentes também podem ser obtidas com a adição de agentes de desestabilização tais como a formamida. Condições de baixa estringência exemplificadoras incluem a hibridização com uma solução tampão de formamida 30 a 35%, NaCl 1M, SDS 1% (dodecil sulfato de sódio) a 37°C e uma lavagem em 1X a 2X SSC (20X SSC = NaCl 3,0 M/citrato trisódico 0,3M) de 50 a 55°C. Condições de estringência moderada exemplificadoras incluem a hibridização com uma solução tampão de formamida 40 a 45%, NaCl 1M, SDS 1% a 37°C e uma lavagem em 0,5X a 1X SSC de 55 a 60°C. Condições de estringência elevada exemplificadoras incluem a hibridização com uma solução tampão de formamida 50%, NaCl 1M, SDS 1% a 37°C e uma lavagem em 0,1X de 60 a 65°C. Opcionalmente, tampões de lavagem podem compreender cerca de 0,1% a cerca de 1% de SDS. A duração da hibridização é geralmente de menos do que cerca de 24 horas, comumente cerca de 4 a cerca de 12 horas.

[00037] A especificidade é tipicamente a função das lavagens pós- hibridização, os fatores críticos sendo a força iônica e a temperatura da solução de lavagem final. Para híbridos de DNA-DNA, a Tm pode ser aproximada a partir da equação de Meinkoth e Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/L; onde M é a molaridade de cátions monovalentes, %GC é o percentual de nucleotídeos guanosina e citidina no DNA, %form é o percentual de formamida na solução de hibridização e L é a extensão do híbrido em pares de base. A Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) na qual 50% de uma sequência-alvo complementar hibridiza com uma sonda perfeitamente pareada. A Tm é reduzida em cerca de 1°C para cada 1% de não pareamento; portanto Tm, hibridização e/ou condições de lavagem podem ser ajustadas para hibridizar sequências da identidade desejada. Por exemplo, se sequências com > 90% de identidade são procuradas, a Tm pode ser diminuída em 10°C. Geralmente, as condições estringentes são selecionadas para ser 5°C menores do que o ponto de fusão térmico (Tm) para a sequência específica e seu complemento em uma força iônica e pH definidos. Entretanto, condições severamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem em 1,2, 3 ou 4°C abaixo do ponto de fusão térmica (Tm); condições moderadamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem em 6, 7, 8, 9 ou 10°C abaixo do ponto de fusão térmica (Tm); condições estringentes baixas podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem em 11, 12, 13, 14, 15 ou 20°C abaixo do ponto de fusão térmica (Tm). Usando a equação, as composições de hibridização e lavagem e a Tm desejada, aqueles versados na técnica compreenderão que variações na estringência de hibridização e/ou soluções de lavagem estão inerentemente descritas. Se o grau desejado de não pareamentos resulta em uma Tm de menos do que 45°C (solução aquosa) ou 32°C (solução de formamida), é preferido aumentar a concentração de SSC tal que uma temperatura mais elevada possa ser usada. Um guia extenso para a hibridização de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York); e Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). Veja Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).

Proteínas Isoladas e Suas Variantes e Fragmentos

[00038] As proteínas pesticidas também estão englobadas dentro da presente invenção. Por “proteína pesticida” é pretendido uma proteína que possui a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 48 e 15 a 31. Fragmentos, porções biologicamente ativas e variantes dessas também são fornecidas e podem ser usadas para praticar os métodos da presente invenção. Uma “proteína isolada” ou uma “proteína recombinante” são usadas para se referir a uma proteína que não está mais em seu ambiente natural, por exemplo, in vitro ou em uma célula hospedeira recombinante de planta ou bacteriana.

[00039] “Fragmentos” ou “porções biologicamente ativas” incluem fragmentos de polipeptídeo que compreendem sequências de aminoácidos suficientemente idênticas as sequências de aminoácidos descritas nas SEQ ID NO: 48 e 15 a 31 e que exibem atividade pesticida. Uma porção biologicamente ativa de uma proteína pesticida pode ser um polipeptídeo que tenha, por exemplo, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350 ou mais aminoácidos de extensão. Tais porções biologicamente ativas podem ser preparadas pelas técnicas recombinantes e avaliadas quanto a atividade pesticida. Métodos para medir a atividade pesticida são bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:24802485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; e Patente U.S. No. 5.743.477, todos incorporados aqui por referência em sua totalidade. Como usado aqui, um fragmento compreende pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 48 e 15 a 31. Entretanto, a invenção abrange outros fragmentos, tal como qualquer fragmento de proteína maior do que cerca de 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350 ou mais aminoácidos de extensão.

[00040] Por “variantes” entende-se proteínas ou polipeptídeos que possuem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 60%, 65%, cerca de 70%, 75%, cerca de 80%, 85%, cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica àsequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 48 e 15 a 31. As variantes também incluem polipeptídeos codificados por uma molécula de ácido nucleico que hibridiza à molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 47 e 1 a 14 ou um complemento dessas, sob condições estringentes. As variantes incluem polipeptídeos que diferem na sequência de aminoácidos devido à mutagênese. Proteínas variantes abrangidas pela presente invenção são biologicamente ativas, ou seja, elas continuam a possuir a atividade biológica da proteína nativa, ou seja, retém a atividade pesticida. Em algumas modalidades, as variantes possuem atividade aperfeiçoada em relação à proteína nativa. Métodos para medir a atividade pesticida são bem conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; e Patente U.S. No. 5.743.477, todos incorporados aqui por referência em sua totalidade.

[00041] Os genes bacterianos, tais como os genes axmi dessa invenção, muito frequentemente possuem múltiplos códons de iniciação de metionina na proximidade do início da fase de leitura aberta. Frequentemente, a iniciação da tradução em um ou mais desses códons de partida levará a geração de uma proteína funcional. Esses códons de partida podem incluir códons ATG. Entretanto, bactérias tais como Bacillus sp. também reconhecem o códon CTG como um códon de partida e proteínas que iniciam a tradução em códons CTG contêm uma metionina no primeiro aminoácido. Em raras ocasiões, a tradução em sistemas bacterianos pode iniciar em um códon TTG, apesar de que nesse evento TTG codifica uma metionina. Além disso, frequentemente não é determinado a priori quais desses códons são usados naturalmente na bactéria. Portanto, é entendido que o uso de um desses códons de metionina alternativos também pode levar a geração de proteínas pesticidas. Essas proteínas pesticidas são abrangidas na presente invenção e podem ser usadas nos métodos da presente invenção. Será compreendido que, quando expresso em plantas, será necessário alterar o códon de partida alternativo para ATG para a tradução apropriada.

[00042] Anticorpos para os polipeptídeos da presente invenção ou para variantes ou fragmentos desses também estão englobados. Métodos para produzir anticorpos são bem conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; Patente U.S. No. 4.196.265).

Variantes Alteradas ou Aperfeiçoadas

[00043] É sabido que sequências de DNA de uma proteína pesticida podem ser alteradas por vários métodos e que essas alterações podem resultar em sequências de DNA que codificam proteínas com sequências de aminoácidos diferentes daquelas codificadas por uma proteína pesticida da presente invenção. Essa proteína pode ser alterada de várias maneiras incluindo substituições, deleções, truncamentos e inserções de aminoácidos de um ou mais aminoácidos de SEQ ID NO: 48 e 15 a 31, incluindo até cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 15, cerca de 20, cerca de 25, cerca de 30, cerca de 35, cerca de 40, cerca de 45, cerca de 50, cerca de 55, cerca de 60, cerca de 65, cerca de 70, cerca de 75, cerca de 80, cerca de 85, cerca de 90, cerca de 100, cerca de 105, cerca de 110, cerca de 115, cerca de 120, cerca de 125, cerca de 130, cerca de 135, cerca de 140, cerca de 145, cerca de 150, cerca de 155 ou mais substituições, deleções e inserções de aminoácidos dentro da porção terminal C ou da porção terminal N ou em ambas. Os métodos para tais manipulações são geralmente conhecidos na técnica. Por exemplo, sequências de aminoácidos variantes de uma proteína pesticida podem ser preparadas pelas mutações no DNA. Isso pode ser obtido por uma de várias formas de mutagênese e/ou na evolução direcionada. Em alguns aspectos, as alterações codificadas na sequência de aminoácidos não afetarão substancialmente a função da proteína. Tais variantes possuirão a atividade pesticida desejada. Entretanto, é compreendido que a habilidade de uma proteína pesticida em conferir atividade pesticida pode ser aperfeiçoada pelo uso de tais técnicas nas composições dessa invenção. Por exemplo, pode-se expressar uma proteína pesticida em células hospedeiras que exiba altas taxas de incorporação errada de base durante a replicação de DNA, tal como XL-1 Red (Stratagene, La Jolla, CA). Depois da propagação em tais cepas, pode-se isolar o DNA (por exemplo, pela preparação de um plasmídeo de DNA ou pela amplificação por PCR e clonagem do fragmento de PCR resultante em um vetor), cultivar as mutações de proteína pesticida em uma cepa não mutagênica e identificar os genes mutados com a atividade pesticida, por exemplo, pela realização de um ensaio para testar a atividade pesticida. Geralmente, a proteína é misturada e usada em ensaios de alimentação. Veja, por exemplo, Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293. Tais ensaios podem incluir contatar as plantas com uma ou mais pragas e determinar a habilidade da planta em sobreviver e/ou causar a morte das pragas. Exemplos de mutações que resultam em toxicidade aumentada são encontradas em Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806.

[00044] Alternativamente, as alterações podem ser feitas para a sequência de proteína de várias proteínas na terminação amino ou carbóxi sem afetar substancialmente a atividade. Isso pode incluir inserções, deleções ou alterações introduzidas por métodos moleculares modernos, tais como PCR, incluindo amplificações por PCR que alterem ou estendam a sequência codificadora da proteína em virtude da inclusão de sequências que codifiquem aminoácidos no oligonucleotídeo utilizado na amplificação por PCR. Alternativamente, as sequências de proteínas adicionadas podem incluir sequências inteiras codificadoras de proteínas, tais como aquelas usadas comumente na técnica para gerar proteínas de fusão. Tais proteínas de fusão são comumente usadas para (1) aumentar a expressão de uma proteína de interesse, (2) introduzir um domínio de ligação, atividade enzimática ou epítopo para facilitar a purificação da proteína, detecção da proteína ou outros usos experimentais conhecidos na técnica, secreção do alvo ou tradução de uma proteína para uma organela subcelular, tal como o espaço periplasmático de bactérias Gram negativas ou o retículo endoplasmático de células eucarióticas, o último dos quais geralmente resulta na glicosilação da proteína.

[00045] Sequências variantes de nucleotídeos e aminoácidos da presente invenção também abrangem sequências derivadas de procedimentos mutagênicos e recombinantes tais como shuffling de DNA. Com tal procedimento, uma ou mais regiões codificadoras de proteína pesticida podem ser usadas para criar uma nova proteína pesticida que possua as propriedades desejadas. Dessa maneira, bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são criadas a partir de uma população de sequências de polinucleotídeos que compreendem regiões de sequências que possuem identidade de sequência substancial e podem ser homologamente recombinadas in vitro ou in vivo. Por exemplo, usando essa abordagem motivos de sequência que codificam um domínio de interesse podem ser misturados entre um gene pesticida da invenção e outros genes pesticidas conhecidos para obter um novo gene que codifique uma proteína com a propriedade de interesse aperfeiçoada, tal como uma atividade inseticida aumentada. Estratégias para tal shuffling de DNA são conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1074710751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; e Patentes U.S. Nos. 5.605.793 e 5.837.458.

[00046] A troca ou shuffling de domínio é outro mecanismo para a geração de proteínas pesticidas alteradas. Os domínios podem ser trocados entre proteínas pesticidas, resultando em toxinas híbridas ou quiméricas com atividade pesticida ou espectro de alvos aperfeiçoados. Métodos para gerar proteínas recombinantes e testá-las quanto a atividade pesticida são bem conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Naimov et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328-5330; de Maagd et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543; Ge et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:17954-17958; Schnepf et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:2092320930; Rang et al. 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918-2925).

[00047] Portanto, em várias modalidades da presente invenção, as sequências de ácidos nucleicos englobadas nessas (assim como composições, vetores, células hospedeiras, plantas e sementes que compreendam a sequência de ácido nucleico) compreendem uma porção de uma ou mais toxinas e uma porção de uma ou mais toxinas diferentes. Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a porção N terminal de Axmi005 (que está descrita na SEQ ID NO: 45) e a porção C terminal de Axmi115 (que está descrita na SEQ ID NO: 43). Em modalidades específicas, a porção N terminal de Axmi005 compreende os resíduos de aminoácidos 1 a 173 ou do resíduo de aminoácido 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ou 50 ao resíduo de aminoácido 150, 155, 160, 165, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 250, 300, 325, ou 350 de Axmi005 e a porção C terminal de Axmi115 compreende do resíduo de aminoácido 174 ao resíduo de aminoácido 803 de Axmi115, ou do resíduo de aminoácido 170, 171, 172, 173, 174,175, 176, 177, 178, 179, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220,225, 230, 250, 300, 325, ou 350 ao resíduo de aminoácido 600, 650,700, 750, 760, 770, 780, 790, 795, 796, 797, 798, 799, 800, 801, 802,ou 803. Aquele versado na técnica reconhecerá que variantes menores e deleções dentro de cada uma das sequências de aminoácidos podem ser feitas e ainda reterem (ou aperfeiçoarem) a atividade da proteína de fusão. Em algumas modalidades, as sequências de ácido nucleico da invenção codificam uma proteína de fusão Axmi005/Axmi115 com uma mutação (em relação à região correspondente da proteína Axmi005 ou Axmi115 parentais) em uma ou mais das posições que correspondem aos resíduos de aminoácidos nas posições 544, 588 e 771 em relação a SEQ ID NO: 43 (veja, por exemplo, as sequências de fusão variantes encontradas nas SEQ ID NO: 18-22), Em outras modalidades, a sequência de nucleotídeos abrangida aqui é descrita em qualquer uma de SEQ ID NO: 47 e 1-14 e a sequência de aminoácidos é descrita em qualquer uma de SEQ ID NO: 48 e 15-31.

[00048] Em várias modalidades, a fusão de Axmi005 com Axmi115 resulta em uma sequência de aminoácidos que possui atividade aperfeiçoada ou prolongada comparada com Axmi005 ou Axmi115 sozinhos. Por atividade “aperfeiçoada” é pretendido um aumento na morte de pelo menos uma praga ou um aumento visível na redução do crescimento, alimentação ou desenvolvimento fisiológico normal de uma praga em relação à proteína nativa. Por atividade “prolongada” é pretendida uma ativa contra uma praga que não foi demonstrada por Axmi005 e Axmi115. Por exemplo, a fusão de uma porção de Axmi005 com uma porção de Axmi115 poderá resultar em uma proteína única que possui o perfil de atividade de ambas Axmi005 e Axmi115. Em algumas modalidades, a atividade contra uma praga individual está aperfeiçoada na proteína de fusão acima de uma ou de ambas Axmi005 e/ou Axmi115.

Vetores

[00049] Uma sequência pesticida da invenção pode ser fornecida em um cassete de expressão para a expressão em uma planta de interesse. Por ‘cassete de expressão em planta” é pretendido um construto de DNA que seja capaz de resultar na expressão de uma proteína a partir de uma fase de leitura aberta em uma célula de planta. Tipicamente, esse contém um promotor e uma sequência codificadora. Frequentemente, tais construtos também conterão uma região 3’ não traduzida. Tais construtos podem conter uma “sequência de sinal” ou “sequência líder” para facilitar o transporte co-traducional ou pós- traducional do peptídeo para certas estruturas intracelulares, tais como o cloroplasto (ou outro plastídeo), retículo endoplasmático ou aparelho de Golgi.

[00050] Por “sequência de sinal” é pretendida uma sequência que é conhecida ou suspeita de resultar no transporte co-traducional ou pós- traducional do peptídeo através da membrana celular. Em eucariotos, isso envolve tipicamente a secreção no aparelho de Golgi, com alguns resultando em glicosilação. Toxinas inseticidas de bactérias são frequentemente sintetizadas como pró-toxinas, que são proteoliticamente ativadas no intestino da praga-alvo (Chang (1987) Methods Enzymol. 153:507-516). Em algumas modalidades da presente invenção, a sequência de sinal está localizada na sequência nativa ou pode ser derivada de uma sequência da invenção. Por “sequência líder” é pretendida qualquer sequência que, quando traduzida, resulte em uma sequência de aminoácidos suficiente para desencadear o transporte co-traducional da cadeia de peptídeo para uma organela subcelular. Portanto, isso inclui sequências líderes que direcionam o transporte e/ou a glicosilação pela passagem no retículo endoplasmático, passagem pelos vacúolos, plastídeos incluindo cloroplastos, mitocôndrias e semelhantes.

[00051] Por “vetor de transformação de planta” é pretendido uma molécula de DNA que é necessária para a transformação eficiente de uma célula de planta. Tal molécula pode consistir em um ou mais cassetes de expressão em planta e pode ser organizada em mais do que uma molécula de “vetor” de DNA. Por exemplo, vetores binários são vetores de transformação de planta que utilizam dois vetores de DNA não contíguos que codificam todos os requisitos para funções cis e trans-atuantes para transformação de células de planta (Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). “Vetor” refere-se a um construto de ácido nucleico designado para transferir entre células hospedeiras diferentes. “Vetor de expressão” refere-se a um vetor que tem a habilidade de incorporar, integrar e expressar sequências ou fragmentos de DNA heterólogo em uma célula estranha. O cassete incluirá sequências regulatórias 5’ e/ou 3’ operativamente ligadas a uma sequência da invenção. Por “operativamente ligada” é pretendido uma ligação funcional entre um promotor e uma segunda sequência, em que a sequência promotora inicia e media a transcrição da sequência de DNA que corresponde à segunda sequência. Geralmente, operativamente ligado significa que as sequências de ácido nucleico a serem ligadas são contíguas e onde necessário unir duas regiões codificadoras de proteína, contíguas e na mesma fase de leitura. O cassete pode conter adicionalmente pelo menos um gene adicional a ser co-transformado no organismo. Alternativamente, os genes adicionais podem ser fornecidos em múltiplos cassetes de expressão.

[00052] Em várias modalidades, a sequência de nucleotídeos da invenção está operativamente ligada a um promotor, por exemplo, um promotor de planta. “Promotor” refere-se a uma sequência de ácido nucleico que funciona para direcionar a transcrição de uma sequência codificadora a jusante. O promotor junto com outras sequências de ácido nucleico regulatória da transcrição e da tradução (também denominadas “sequências de controle”) são necessárias para a expressão de uma sequência de DNA de interesse.

[00053] Tal cassete de expressão é fornecido com uma pluralidade de sítios de restrição para que a inserção da sequência pesticida seja sob a regulação transcricional das regiões regulatórias.

[00054] O cassete de expressão incluirá na direção de 5’ - 3’ da transcrição, uma região de iniciação da transcrição e da tradução (isto é, um promotor), uma sequência de DNA da invenção e uma região de terminação da transcrição e da tradução (isto é, região de terminação) funcional em plantas. O promotor pode ser nativo ou análogo ou estranho ou heterólogo para a planta hospedeira e/ou para a sequência de DNA da invenção. Adicionalmente, o promotor pode ser a sequência natural ou alternativamente uma sequência sintética. Onde o promotor é “nativo” ou “homólogo” para a planta hospedeira, é pretendido que o promotor seja encontrado na planta nativa na qual o promotor é introduzido. Onde o promotor é “estranho” ou “heterólogo” para a sequência de DNA da invenção, é pretendido que o promotor não seja o promotor nativo ou que ocorre naturalmente para a sequência de DNA operativamente ligada da invenção.

[00055] A região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação da transcrição, pode ser nativa com a sequência de DNA de interesse operativamente ligada, pode ser nativa com a planta hospedeira ou pode ser derivada de outra fonte (isto é, estranha ou heteróloga ao promotor, à sequência de DNA de interesse, à planta hospedeira ou qualquer combinação dessas). Regiões de terminação convenientes estão disponíveis a partir do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, tais como as regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase. Veja também Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; e Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.

[00056] Onde apropriado, o (s) gene(s) pode/podem ser otimizado(s) para aumentar a expressão na célula hospedeira transformada. Ou seja, os genes podem ser sintetizados usando os códons preferidos da célula hospedeira para a expressão aperfeiçoada ou podem ser sintetizados usando códons em uma utilização de códon preferido do hospedeiro. Os métodos estão disponíveis na técnica para a síntese dos genes preferidos de plantas. Veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5.380.831 e 5.436.391, Publicação de Patente U.S. No. 20090137409, e Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, incorporados aqui por referência.

[00057] Em uma modalidade, a proteína pesticida é direcionada para o cloroplasto para expressão. Dessa maneira, onde a proteína pesticida não está diretamente inserida no cloroplasto, o cassete de expressão conterá adicionalmente um ácido nucleico que codifica um peptídeo de transito para direcionar a proteína pesticida para os cloroplastos. Tais peptídeos de transito são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res.Commun. 196:1414-1421; e Shah et al. (1986) Science 233:478-481.

[00058] O gene pesticida a ser direcionada para o cloroplasto pode ser otimizado para a expressão no cloroplasto para ser responsável por diferenças na utilização de códon entre o núcleo da planta e essa organela. Dessa maneira, os ácidos nucleicos de interesse podem ser sintetizados usando os códons preferidos para o cloroplasto. Veja, por exemplo, a Patente U.S. No. 5.380.831, incorporada aqui por referência. Transformação de planta

[00059] Os métodos da invenção envolvem introduzir um construto de nucleotídeo em uma planta. Por “introdução” pretende-se apresentar a planta ao construto de nucleotídeo de tal maneira que o construto ganhe acesso ao interior de uma célula de planta. Os métodos da invenção não requerem que um método particular para a introdução de um construto de nucleotídeo em uma planta seja usado, apenas que o construto de nucleotídeo ganhe acesso ao interior de pelo menos uma célula de planta. Os métodos para a introdução de construtos de nucleotídeo em plantas são conhecidos na técnica incluindo, mas não limitados a métodos de transformação estável, métodos de transformação transitórios e métodos mediados por vírus.

[00060] Por “planta” é pretendido plantas completas, órgãos deplanta (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), sementes, células de planta, propágulos, embriões e a progênie das mesmas. As células de planta podem ser diferenciadas ou não diferenciadas (por exemplo, calos, culturas de célula em suspensão, protoplastos, células de folha, células de raiz, células de floema, pólen).

[00061] “Plantas transgênicas” ou “plantas transformadas” ou plantas ou células ou tecidos “estavelmente transformados” referem-se a plantas que possuem sequências de ácido nucleico ou fragmentos de DNA exógenos incorporados ou integrados na célula de planta. Essas sequências de ácido nucleico incluem aquelas que são exógenas ou não presentes na célula de planta não transformada, assim como aquelas que podem ser endógenas ou presentes na célula de planta não transformada. “Heterólogos” refere-se de modo geral às sequências de ácido nucleico que não são endógenas para a célula ou parte do genoma nativo na qual elas estão presentes e que foram adicionadas à célula pela infecção, transfecção, microinjeção, eletroporação, microprojeção ou semelhantes.

[00062] As plantas transgênicas da invenção expressam uma ou mais das novas sequências de toxinas aqui descritas. Em várias modalidades, a planta transgênica compreende ainda um ou mais genes adicionais para a resistência a inseto (por exemplo, Cry1, tal como membros das famílias de Cry1A, Cry1B, Cry1C, Cry1D, Cry1E e Cry1F; Cry2, tal como membros da família de Cry2A; Cry9, tal como membros das famílias de Cry9A, Cry9B, Cry9C, Cry9D, Cry9E e Cry9F; etc.). Será compreendido por aquele versado na técnica que a planta transgênica pode compreender qualquer gene que transmita uma característica agronômica de interesse.

[00063] A transformação de células de planta pode ser obtida por uma de várias técnicas conhecidas. O gene pesticida da invenção pode ser modificado para obter ou intensificar a expressão em células de plantas. Tipicamente, um construto que expressa tal proteína poderá conter um promotor para direcionar a transcrição do gene, assim como uma região 3’ não traduzida para permitir a terminação da transcrição e a poliadenilação. A organização de tais construtos é bem conhecida na técnica. Em algumas circunstancias, pode ser útil manipular o gene tal que o peptídeo resultante seja secretado ou, de outra maneira, direcionado para dentro da célula de planta. Por exemplo, o gene pode ser manipulado para conter um peptídeo de sinal para facilitar a transferência do peptídeo para o retículo endoplasmático. Também pode ser preferível manipular o cassete de expressão em planta para conter um íntron, tal que o mRNA de processamento do íntron seja necessário para a expressão.

[00064] Tipicamente, esse “cassete de expressão em planta” será inserido em um “vetor de transformação de planta”. Esse vetor de transformação de planta pode ser compreendido por um ou mais vetores de DNA necessários para obter a transformação da planta. Por exemplo, é uma prática comum na técnica utilizar vetores de transformação de planta que sejam compreendidos por mais do que segmento contíguo de DNA. Esses vetores são geralmente referidos na técnica como “vetores binários”. Os vetores binários assim como vetores com plasmídeos auxiliares são mais frequentemente usados para a transformação mediada por Agrobacterium, onde o tamanho e a complexidade dos segmentos de DNA para obter a transformação eficiente é muito grande e é vantajoso para separar funções sobre moléculas de DNA separadas. Vetores binários contêm tipicamente um vetor de plasmídeo que contém as sequências que atuam em cis necessárias para a transferência de T-DNA (tal como borda esquerda e borda direita), um marcador selecionável que é manipulado para ser capaz de expressão em uma célula de planta e um “gene de interesse” (um gene manipulado para ser capaz de expressão em uma célula de planta para a qual a geração de plantas transgênicas é desejada). Também presentes sobre esse vetor de plasmídeo estão as sequências necessárias para a replicação bacteriana. As sequências que atuam em cis são arranjadas de uma maneira a permitir a transferência eficiente em células de planta e a expressão nelas. Por exemplo, o gene marcador selecionável e o gene pesticida estão localizados entre as bordas esquerda e direita. Frequentemente, um segundo vetor de plasmídeo contém fatores que atuam em cis que mediam a transferência do T-DNA da Agrobacterium para as células de planta, O plasmídeo geralmente contém as funções de virulência (genes Vir) que permitem a infecção de células de planta pela Agrobacterium e transfere o DNA pela clivagem nas sequências de borda e a transferência de DNA mediada por vir, como é compreendido na técnica (Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). Vários tipos de cepas de Agrobacterium (por exemplo, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) podem ser usados para a transformação de planta. O segundo vetor de plasmídeo não é necessário para a transformação de plantas pelos outros métodos tais como microprojeção, microinjeção, eletroporação, polietileno glicol, etc.

[00065] Em geral, os métodos de transformação em planta envolvem transferir o DNA heterólogo para as células da planta-alvo (por exemplo, embriões imaturos ou maduros, culturas em suspensão, calo não diferenciado, protoplastos, etc.), seguido pela aplicação de um nível máximo de limiar de seleção apropriada (dependendo do gene marcador selecionável) para recuperar as células da planta transformada de um grupo de massa de célula não transformada. Os explantes são tipicamente transferidos para um suprimento fresco do mesmo meio e cultivados rotineiramente. Subsequentemente, as células transformadas são diferenciadas em mudas depois colocadas no meio de regeneração suplementado com um nível limiar máximo de agente de seleção. As mudas são então transferidas para um meio de enraizamento seletivo para recuperar uma muda enraizada ou plântula. A plântula transgênica então se desenvolve em uma planta madura e produz sementes férteis (por exemplo, Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745750). Os explantes são tipicamente transferidos para um suprimento fresco do mesmo meio e cultivadas rotineiramente. Uma descrição geral das técnicas e métodos para gerar plantas transgênicas é encontrada em Ayres and Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 e Bommineni and Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. Como o material transformado contém várias células, ambas as células transformadas e não transformadas estão presente em qualquer pedaço do calo ou tecido ou grupo de células objetivados. A habilidade de matar células não transformadas e permitir que células transformadas proliferem resulta em culturas de plantas transformadas. Frequentemente, a habilidade para remover células não transformadas é uma limitação para recuperar rapidamente as células de plantas transformadas e a geração bem-sucedida de plantas transgênicas.

[00066] Os protocolos de transformação assim como os protocolos para a introdução de sequências de nucleotídeos em plantas podem variar dependendo do tipo de planta ou de célula de planta, isto é, monocotiledôneas ou dicotiledôneas, objetivadas para transformação. A geração de plantas transgênicas pode ser realizada por um de vários métodos incluindo, mas não limitados a microinjeção, eletroporação, transferência direcionada de gene, introdução de DNA heterólogo por Agrobacterium em células de planta (transformação mediada por Agrobacterium), bombardeio de células de planta com DNA estranho heterólogo aderido a partículas, aceleração de partícula balística, transformação de feixe de aerossol (Pedido Publicado U.S. No. 20010026941; Patente U.S. No. 4,945,050; Publicação Internacional No. WO 91/00915; Pedido Publicado U.S. No. 2002015066), transformação de Lec1 e vários outros métodos sem partícula mediados diretamente para transferir DNA.

[00067] Métodos para a transformação de cloroplastos são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. O método recai na liberação por uma arma de partícula de DNA contendo um marcador selecionável e no direcionamento do DNA para o genoma do plastídeo através da recombinação homóloga. Adicionalmente, a transformação do plastídeo pode ser obtida pela transativação de um transgene silencioso originado no plastídeo pela expressão preferencial para o tecido de uma RNA polimerase direcionada para o plastídeo e codificada para o núcleo. Tal sistema foi relatado em McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305.

[00068] Acompanhando a integração de DNA estranho heterólogo em células de planta, pode-se aplicar um nível limiar máximo de seleção apropriada no meio para matar as células não transformadas e separar e proliferar as células putativamente transformadas que sobreviveram a esse tratamento de seleção pela transferência, regularmente, para um meio fresco. Pela passagem e inoculação contínuas com a seleção apropriada, as células que são transformadas com o vetor de plasmídeo são identificadas e proliferadas. Métodos moleculares e bioquímicos podem então ser usados para confirmar a presença de gene de interesse heterólogo integrado no genoma da planta transgênica.

[00069] As células que foram transformadas podem ser desenvolvidas em plantas de acordo com meios convencionais. Veja, por exemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Essas plantas podem então ser cultivadas e polinizadas com a mesma cepa transformada ou cepas diferentes e o híbrido resultante que possui expressão constitutiva da característica fenotípica desejada identificado. Duas ou mais gerações podem ser cultivadas para assegurar que a expressão da característica fenotípica desejada é estavelmente mantida e herdada e depois as sementes coletadas para assegurar que a expressão da característica fenotípica desejada tenha sido obtida. Dessa maneira, a presente invenção fornece uma semente transformada (também referido como “semente transgênica”) que possui o construto de nucleotídeos da invenção, por exemplo, um cassete de expressão da invenção, estavelmente incorporado em seu genoma.

Avaliação da Transformação da Planta

[00070] Depois da introdução do DNA estranho heterólogo nas células de planta, a transformação ou a integração do gene heterólogo no genoma da planta é confirmado por vários métodos tais como a análise de ácidos nucleicos, proteínas e metabolitos associados com o gene integrado.

[00071] A análise por PCR é um método rápido para rastrear células transformadas, tecidos ou mudas quanto a presença do gene incorporado no estágio precoce antes do transplante para o solo (Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). PCR é realizada usando iniciadores de oligonucleotídeo específicos para o gene de interesse ou as informações de fundo do vetor de Agrobacterium, etc.

[00072] A transformação de planta pode ser confirmada pela análise Southern blot de DNA genômico (Sambrook e Russel, 2001, supra). Em geral o DNA total é extraído a partir do transformante, digerido com as enzimas de restrição apropriadas, fracionado em gel de agarose e transferido para uma membrana de nitrocelulose ou nylon. A membrana ou “blot” é então sondada com, por exemplo, um fragmento de DNA alvo radiomarcado com 32P para confirmar a integração do gene introduzido no genoma da planta de acordo com técnicas padronizadas (Sambrook e Russel, 2001, supra).

[00073] Na análise Northern blot, o RNA é isolado de tecidos específicos do transformante, fracionado em um gel de agarose formaldeído e colocado sobre um filtro de nylon de acordo com procedimentos padronizados que são rotineiramente usados na técnica (Sambrook e Russel, 2001, supra). A expressão do RNA codificado pelo gene pesticida é então testado pela hibridização do filtro a uma sonda radioativa deriva de um gene pesticida, por métodos conhecidos na técnica (Sambrook e Russel, 2001, supra).

Atividade Pesticida em Plantas

[00074] Em outro aspecto da invenção, podem ser geradas plantas transgênicas que expressam uma proteína pesticida que tem atividade pesticida. Os métodos descritos acima, por exemplo, podem ser utilizados para gerar plantas transgênicas, mas a maneira pela qual as células de planta transgênica são geradas não é crítica para essa invenção. Métodos conhecidos ou descritos na técnica tais como a transformação mediada por Agrobacterium, transformação biolística e métodos não mediados por partícula podem ser usados de acordo com os critérios do experimentador. As plantas que expressam uma proteína pesticida podem se isoladas por métodos comuns descritos na técnica, por exemplo, pela transformação do calo, seleção de calo transformado e regeneração de plantas férteis a partir de tal calo transgênico. Em tais processos, pode-se usar qualquer gene como marcador selecionável desde que sua expressão em plantas confira a habilidade de identificar ou selecionar células transformadas.

[00075] Vários marcadores têm sido desenvolvidos para uso com células de planta, tais como a resistência ao cloranfenicol, ao aminoglicosídeo G418, higromicina ou semelhantes. Outros genes que codificam um produto envolvido no metabolismo do cloroplasto também podem ser usados como marcadores selecionáveis. Por exemplo, genes que fornecem resistência a herbicidas de planta tais como glifosato, bromoxinil ou imidazolinona podem encontrar uso particular. Tais genes foram descritos (Stalker et al. (1985) J. Biol. Chem.263:6310-6314 (gene de nitrilase de resistência ao bromoxinil); e Sathasivan et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18:2188 (gene de resistência à imidazolinona AHAS). Adicionalmente, os genes aqui descritos são úteis como marcadores para avaliar a transformação de células bacterianas ou de planta. Métodos para detectar a presença de um transgene em uma planta, órgão de planta (por exemplo, folhas, caules, raízes. etc.), sementes, célula de planta, propágulo, embrião ou progênie da mesma, são bem conhecidos na técnica. Em uma modalidade, a presença do transgene é detectada pelo teste da atividade pesticida.

[00076] Plantas férteis que expressam uma proteína pesticida podem ser testadas quanto a atividade pesticida e as plantas que mostram a atividade ótima selecionadas para reprodução posterior. Métodos estão disponíveis na técnica para avaliar a atividade da praga. Geralmente, a proteína é misturada e usada em ensaios de alimentação. Veja, por exemplo, Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293.

[00077] A presente invenção pode ser usada para a transformação de qualquer espécie de planta incluindo, mas não limitadas a monocotiledôneas e dicotiledôneas. Exemplos de plantas de interesse incluem, mas não são limitadas a milho, sorgo, trigo, girassol, tomate, crucíferas, pimentas, batata, algodão, arroz, soja, beterraba açucareira, cana de açúcar, tabaco, cevada e óleo de semente de canola, Brassica sp., alfafa, centeio, milheto, açafrão, amendoim, batata doce, mandioca, café, coco, abacaxi, árvores de cítricos, cacau, chá, banana, abacate, figo, goiaba, azeitona, papaia, castanha, macadâmia, amêndoa, aveia, vegetais, plantas ornamentais e coníferas.

[00078] Vegetais incluem, mas não são limitados a tomates, alface, feijão verde, feijão de lima, ervilhas e membros do gênero Curcumis tais como pepino, melão cantalupo e melão. Plantas ornamentais incluem, mas não são limitadas a azaleia, hortênsia, hibisco, rosas, tulipas, narcisos, petúnias, cravos, copo de leite e crisântemo. Preferivelmente, as plantas da presente invenção são plantas de cultivo agrícola (por exemplo, milho, sorgo, trigo, girassol, tomate, crucíferas, pimentão, batata, algodão, arroz, soja, beterraba açucareira, cana de açúcar, tabaco, cevada, canola, etc.).

Uso no Controle Pesticida

[00079] Métodos gerais para o emprego de cepas que compreendem uma sequência de nucleotídeos da presente invenção ou uma variante dessa, no controle de pragas ou na manipulação de outros organismos como agentes pesticidas são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, a Patente U.S. No. 5.039.523 e EP 0480762A2.

[00080] As cepas de Bacillus que contêm uma sequência de nucleotídeos da presente invenção ou uma variante dessa ou os microrganismos que tenham sido geneticamente alterados para conter um gene pesticida da invenção e a proteína podem ser usados para proteger culturas e produtos agrícolas contra pragas. Em um aspecto da invenção, células completas, isto é, não lisadas de um organismo que produz uma toxina (pesticida) são tratadas com reagentes que prolongam a atividade da toxina produzida na célula quando a célula é aplicada ao ambiente das pragas-alvo.

[00081] Alternativamente, o pesticida é produzido pela introdução de um gene pesticida em uma célula hospedeira. A expressão do gene pesticida resulta, diretamente ou indiretamente, na produção intracelular e manutenção do pesticida. Em um aspecto dessa invenção, essas células são então tratadas sob condições que prolongam a atividade da toxina produzida na célula quando a célula é aplicada ao ambiente das pragas-alvo. O produto resultante retém a toxicidade da toxina. Esses pesticidas naturalmente encapsulados podem então ser formulados de acordo com técnicas convencionais para a aplicação ao ambiente que hospeda a praga-alvo, por exemplo, solo, água e folhagem das plantas. Veja, por exemplo, EPA 0192319 e as referências citadas nesse. Alternativamente, pode-se formular células que expressam um gene dessa invenção tal como permitir a aplicação do material resultante como um pesticida.

[00082] Os ingredientes ativos da presente invenção são normalmente aplicados na forma de composições e podem ser aplicados à área de cultivo ou na planta a ser tratada, simultaneamente ou em sucessão, com outros compostos. Esses compostos podem ser fertilizantes, herbicidas, crioprotetores, tensoativos, detergentes, sabões pesticidas, óleos inativos, polímeros e/ou formulações transportadoras de liberação controlada ou biodegradáveis que permitem a dosagem a longo prazo de uma área alvo acompanhando uma única aplicação da formulação. Eles também podem ser herbicidas seletivos, inseticidas químicos, viricidas, microbiocidas, amebicidas, pesticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, moluscicidas ou misturas de várias dessas preparações, se desejado, junto com veículos, tensoativos agricolamente aceitáveis ou adjuvantes que promovam a aplicação comumente empregados na técnica da formulação. Veículos e adjuvantes adequados podem ser sólidos ou líquidos e correspondem as substancias comumente usadas na tecnologia da formulação, por exemplo, substancias minerais naturais ou regeneradas, solventes, dispersantes, agentes umectantes, promotores da adesão, aglutinantes ou fertilizantes. Igualmente, as formulações podem ser preparadas como “iscas” comestíveis ou adaptadas em armadilhas para pragas para permitir a alimentação ou a ingestão por uma praga-alvo da formulação de pesticida.

[00083] Métodos para a aplicação de um ingrediente ativo da presente invenção ou uma composição agroquímica da presente invenção que contenha pelo menos uma das proteínas pesticidas produzidas pelas cepas bacterianas da presente invenção incluem aplicação nas folhas, revestimento da semente e aplicação no solo. O número de aplicações e a taxa de aplicação dependem da intensidade da infestação pela praga correspondente.

[00084] A composição pode ser formulada como um pó, névoa, pélete, grânulo, spray, emulsão, coloide, solução ou semelhantes e pode ser preparada por meios convencionais tais como a dessecação, liofilização, homogeneização, extração, filtração, centrifugação, sedimentação ou concentração de uma cultura de células que compreende o polipeptídeo. Em todas as composições que contêm pelo menos um de tais polipeptídeos pesticidas, o polipeptídeo pode estar presente em uma concentração entre cerca de 1% a cerca de 99% em peso.

[00085] Pragas lepidópteras, hemípteras, dípteras ou coleópteras podem ser mortas ou reduzidas em números em uma dada área pelos métodos da invenção ou podem ser profilaticamente aplicados em uma área ambiental para evitar a infestação por uma praga suscetível. Preferivelmente, a praga ingere ou é contatada com uma quantidade pesticidamente eficaz do polipeptídeo. Por “quantidade pesticidamente eficaz” é pretendida uma quantidade do pesticida que é capaz de causar a morte de pelo menos uma praga oi reduzir notavelmente o desenvolvimento da praga, alimentação ou o desenvolvimento fisiológico normal. Essa quantidade variará dependendo de fatores tais como, por exemplo, as pragas-alvo específicas a serem controladas, o ambiente específico, localização, planta, cultura ou sítio agrícola a ser tratado, as condições ambientais e o método, taxa, concentração, estabilidade e quantidade de aplicação da composição de polipeptídeo pesticidamente eficaz. As formulações também podem variar com relação a condições climáticas, considerações ambientais e/ou frequência de aplicações e/ou severidade da infestação da praga.

[00086] As composições pesticidas aqui descritas podem ser feitas pela formulação em célula bacteriana, suspensão de cristal e/ou esporo ou o componente de proteína isolada com o veículo agricolamente aceitável desejado. As composições podem ser formuladas antes da administração em um meio apropriado tal como um meio liofilizado, seco por congelamento, dessecado ou em um veículo aquoso ou diluente adequado tal como salina ou outro tampão. As composições formuladas podem estar na forma de uma névoa ou material granulado ou uma suspensão em óleo (vegetal ou mineral) ou água ou emulsões de óleo/água ou como um pó umidificável ou em combinação com outro material veiculador adequado para aplicação agrícola. Veículos agrícolas adequados podem ser sólidos e líquidos e são bem conhecidos na técnica. A expressão “veículo agricolamente aceitável” cobre todos os adjuvantes, componentes inertes, dispersantes, tensoativos, adesivos, aglutinantes, etc. que são comumente usados na tecnologia de formulação de pesticida; esses são bem conhecidos por aqueles versados na formulação de pesticida. As formulações podem ser misturadas com um ou mais adjuvantes sólidos ou líquidos e preparadas por vários meios, por exemplo, pela mistura homogênea, combinação e/ou trituração da composição pesticida com adjuvantes adequados usando técnicas de formulação convencionais. Formulações adequadas e métodos de aplicação estão descritas na Patente U.S. No. 6.468.523, incorporada aqui por referência.

[00087] “Praga” inclui, mas não está limitada a insetos, fungos, bactérias, nematódeos, ácaros, carrapatos e semelhantes. Pragas de insetos incluem insetos selecionados das ordens Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Siphonaptera, Trichoptera, Lepidoptera, e Diptera.

[00088] A ordem Coleoptera inclui as subordens Adephaga e Polyphaga. A subordem Adephaga inclui as superfamílias Caraboidea e Gyrinoidea, enquanto que a subordem Polyphaga inclui as superfamílias Hydrophiloidea, Staphylinoidea, Cantharoidea, Cleroidea, Elateroidea, Dascilloidea, Dryopoidea, Byrrhoidea, Cucujoidea, Meloidea, Mordelloidea, Tenebrionoidea, Bostrichoidea,Scarabaeoidea, Cerambycoidea, Chrysomeloidea, e Curculionoidea. A superfamília Caraboidea inclui as famílias Cicindelidae, Carabidae, e Dytiscidae. A superfamília Gyrinoidea inclui a família Gyrinidae. A superfamília Hydrophiloidea inclui a família Hydrophilidae. A superfamília Staphylinoidea inclui as famílias Silphidae e Staphylinidae. A superfamília Cantharoidea inclui as famílias Cantharidae e Lampyridae. A superfamília Cleroidea inclui as famílias Cleridae e Dermestidae. A superfamília Elateroidea inclui as famílias Elateridae e Buprestidae. A superfamília Cucujoidea inclui a família Coccinellidae. A superfamília Meloidea inclui a família Meloidae. A superfamília Tenebrionoidea inclui a família Tenebrionidae. A superfamília Scarabaeoidea inclui as famílias Passalidae e Scarabaeidae. A superfamília Cerambycoidea inclui a família Cerambycidae. Asuperfamília Chrysomeloidea inclui a família Chrysomelidae. Asuperfamília Curculionoidea inclui as famílias Curculionidae e

Scolytidae.

[00089] A ordem Diptera inclui as subordens Nematocera, Brachycera, e Cyclorrhapha. A subordem Nematocera inclui as famílias Tipulidae, Psychodidae, Culicidae, Ceratopogonidae, Chironomidae, Simuliidae, Bibionidae, e Cecidomyiidae. A subordem Brachycera inclui as famílias Stratiomyidae, Tabanidae, Therevidae, Asilidae, Mydidae, Bombyliidae, e Dolichopodidae. A subordem Cyclorrhapha inclui as Divisões Aschiza e Aschiza. Division Aschiza inclui as famílias Phoridae, Syrphidae, e Conopidae. A divisão Aschiza inclui as Seções Acalyptratae e Calyptratae. A Seção Acalyptratae inclui as famílias Otitidae, Tephritidae, Agromyzidae, e Drosophilidae. A seção Calyptratae inclui as famílias Hippoboscidae, Oestridae, Tachinidae, Anthomyiidae, Muscidae, Calliphoridae, e Sarcophagidae.

[00090] A ordem Lepidoptera inclui as famílias Papilionidae, Pieridae, Lycaenidae, Nymphalidae, Danaidae, Satyridae, Hesperiidae,Sphingidae, Saturniidae, Geometridae, Arctiidae, Noctuidae, Lymantriidae, Sesiidae, e Tineidae.

[00091] Pragas de inseto da invenção para as culturas principais incluem: Milho: Ostrinia nubilalis, broca do milho europeu; Agrotis ipsilon, lagarta preta; Helicoverpa zea, larva do grão de milho; Spodoptera frugiperda, lagarta de cartucho; Diatraea greiosella, broca do milho do sudoeste; Elasmopalpus lignosellus, lagarta elasmo; Diatraea saccharalis, broca da cana de açúcar; Diabrotica virgifera, verme da raiz do milho ocidental; Diabrotica longicornis barberi, verme da raiz do milho do norte; Diabrotica undecimpunctata howardi, verme da raiz do milho do sul; Melanotus spp., vermes filiformes; Cyclocephala borealis, besouro mascarado do norte (larva branca); Cyclocephala immaculata, besouro mascarado do sul (larva branca); Popillia japonica, besouro japonês; Chaetocnema pulicaria, alticínio do milho; Sphenophorus maidis, bicudo do milho; Rhopalosiphum maidis, afídeo da folha do milho; Anuraphis maidiradicis, afídeo da raiz do milho; Blissus leucopterus leucopterus, percevejo; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto; Melanoplus sanguinipes, gafanhoto migratório; Hylemya platura, larva da semente do milho; Agromyza parvicornis, bicho mineiro do milho; Anaphothrips obscrurus, tripes da grama; Solenopsis milesta, formiga; Tetranychus urticae, ácaro rajado; Sorgo: Chilo partellus, broca do sorgo; Spodoptera frugiperda, lagarta de cartucho; Helicoverpa zea, larva do grão do milho; Elasmopalpus lignosellus, lagarta elasmo; Feltia subterranea, lagarta; Phyllophaga crinita, larva branca; Eleodes, Conoderus, e Aeolus spp., vermes filiformes; Oulema melanopus, besouro da folha do cereal; Chaetocnema pulicaria, alticínio do milho; Sphenophorus maidis, bicudo; Rhopalosiphum maidis; afídeo da folha do milho; Sipha flava, afídeo amarelo da cana de açúcar; Blissus leucopterus leucopterus, percevejo; Contarinia sorghicola, mosca do sorgo; Tetranychus cinnabarinus, ácaro carmim; Tetranychus urticae, ácaro rajado; Trigo: Pseudaletia unipunctata, lagarta de cartucho; Spodoptera frugiperda, lagarta de cartucho do outono; Elasmopalpus lignosellus, lagarta elasmo; Agrotis orthogonia, lagarta do ocidente; Elasmopalpus lignosellus, lagarta elasmo; Oulema melanopus, besouro da folha do cereal; Hypera punctata, gorgulho da folha do trevo; Diabrotica undecimpunctata howardi, verme da raiz do milho do sudeste; afídeo do trigo russo; Schizaphis graminum, besouro verde; Macrosiphum avenae, afídeo do grão ingles; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto; Melanoplus differentialis, gafanhoto diferencial; Melanoplus sanguinipes, gafanhoto migratório; Mayetiola destructor, mosca Hessiana; Sitodiplosis mosellana, mosca do trigo; Meromyza americana, larva do caule do trigo; Hylemya coarctata, mosca do trigo; Frankliniella fusca, tripes do tabaco; Cephus cinctus, vespão do caule do trigo; Aceria tulipae, ácaro do enrolamento do trigo; Girassol: Suleima helianthana, traça do broto do girassol; Homoeosoma electellum, traça do girassol; zygogramma exclamationis, besouro do girassol; Bothyrus gibbosus, besouro da cenoura; Neolasioptera murtfeldtiana, mosca da semente do girassol; Algodão: Heliothis virescens, curuquere; Helicoverpa zea, verme da maçã do algodão; Spodoptera exigua, lagarta de cartucho da beterraba; Pectinophora gossypiella, lagarta rosada; Anthonomus greis, bicudo; Aphis gossypii, afídeo do algodão; Pseudatomoscelis seriatus, gafanhoto do algodão; Trialeurodes abutilonea, mosca branca; Lygus lineolaris, percevejo; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto; Melanoplus differentialis, gafanhotodiferencial; Thrips tabaci, tripes da cebola; Franklinkiella fusca, tripes do tabaco; Tetranychus cinnabarinus, ácaro vermelho; Tetranychus urticae, ácaro rajado; Arroz: Diatraea saccharalis, broca da cana de açúcar; Spodoptera frugiperda, lagarta de cartucho do outono; Helicoverpa zea, verme do milho; Colaspis brunnea, besouro da uva; Lissorhoptrus oryzophilus, gorgulho do arroz; Sitophilus oryzae, gorgulho do arroz; Nephotettix nigropictus, gafanhoto do arroz; Blissus leucopterus leucopterus, percevejo; Acrosternum hilare, besouro verde; Soja: Pseudoplusia includens, lagarta da soja; Anticarsia gemmatalis, lagarta da soja; Plathypena scabra, verme do trevo; Ostrinia nubilalis, broca do milho europeu; Agrotis ipsilon, lagarta preta; Spodoptera exigua, lagarta de cartucho da beterraba; Heliothis virescens, curuquerê; Helicoverpa zea, verme da maçã do algodão; Epilachna varivestis, besouro do feijão mexicano; Myzus persicae, afídeo verde do pessego; Empoasca fabae, gafanhoto da batata; Acrosternum hilare, besouro verde; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto; Melanoplus differentialis, gafanhoto diferencial; Hylemya platura, larva da semente do milho; Sericothrips variabilis, tripes da soja; Thrips tabaci, tripes da cebola; Tetranychus turkestani, acaro do morango; Tetranychus urticae, ácaro rajado; Cevada: Ostrinia nubilalis, broca do milho europeu; Agrotis ipsilon, lagarta preta; Schizaphis graminum, besouro verde; Blissus leucopterus leucopterus, percevejo; Acrosternum hilare, besouro verde; Euschistus servus, besouro marrom; Delia platura, larva da semente do milho; Mayetiola destructor, mosca Hessiana; Petrobia latens, ácaro marrom do trigo; Colza: Brevicoryne brassicae, afídeo do repolho; Phyllotreta cruciferae, besouro; Mamestra configurata, lagarta de cartucho; Plutella xylostella, traça; Delia ssp., larvas da raiz.

[00092] Nematódeos incluem nematódeos parasitas tais como nematódeos dos galhos, de cistos e lesões por nematódeos, incluindo Heterodera spp., Meloidogyne spp., e Globodera spp.; membros particulares dos nematódeos de cisto incluem, mas não são limitados a Heterodera glycines (nematódeo de cisto da soja); Heterodera schachtii (nematódeo de cisto da beterraba); Heterodera avenae (nematódeo de cisto da de cereal); e Globodera rostochiensis e Globodera pailida (nematódeo de cisto da batata). Nematódeos de lesão incluem Pratylenchus spp.Métodos para aumentar o rendimento da planta

[00093] São fornecidos métodos para aumentar o rendimento da planta. Os métodos compreendem fornecer uma planta ou célula de planta que expresse um polinucleotídeo que codifique uma sequência de polipeptídeo pesticida aqui descrito e cultivar a planta ou uma semente dessa em uma área infestada com (ou suscetível a infestação por) uma praga contra a qual o polipeptídeo tem atividade pesticida. Em algumas modalidades, o polipeptídeo tem atividade pesticida contra uma praga de lepidóptero, coleóptero, díptero, hemíptero ou de nematódeo e a dita área é infestada com uma praga de lepidóptero, coleóptero, díptero, hemíptero ou de nematódeo. Como definido aqui, o “rendimento” da planta refere-se a qualidade e/ou a quantidade de biomassa produzida pela planta. Por “biomassa” é pretendido qualquer produto de planta medido. Um aumento na produção de biomassa é qualquer melhora no rendimento de um produto de planta medido. O aumento do rendimento da planta tem várias aplicações comerciais. Por exemplo, o aumento do rendimento de biomassa de folha pode aumentar o rendimento de vegetais folhosos para consumo humano ou animal. Adicionalmente, o aumento da biomassa de folha pode ser usado para aumentar a produção de produtos farmacêuticos ou industriais derivados de planta. Um aumento no rendimento pode compreender qualquer aumento estatisticamente significativo incluindo, mas não limitado a um aumento de pelo menos 1%, um aumento de pelo menos 3%, um aumento de pelo menos 5%, um aumento de pelo menos 10%, um aumento de pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 50%, pelo menos 70%, pelo menos 100% ou um aumento maior no rendimento comparado com uma planta que não expressa a sequência pesticida. Em métodos específicos, o rendimento da planta está aumentado como resultado de resistência aperfeiçoada contra a praga de uma planta que expressa uma proteína pesticida aqui descrita. A expressão da proteína pesticida resulta em uma habilidade reduzida de uma praga em infestar ou se alimentar.

[00094] As plantas podem ser tratadas com uma ou mais composições químicas, incluindo um ou mais herbicidas, inseticidas ou fungicidas. Composições químicas exemplificadoras incluem:

[00095] Herbicidas para Frutas/Vegetais: Atrazina, Bromacil, Diuron, Glifosato, Linuron, Metribuzina, Simazina, Trifluralina, Fluazifop, Glifosinato, Halosulfuron Gowan, Paraquat, Propizamida, Setoxidim, Butafenacil, Halosulfuron, Indaziflam; Inseticidas para Frutas/Vegetais: Aldicarb, Bacillus thuriengiensis, Carbaril, Carbofuran, Clorpirifos, Cipermetrina, Deltametrina, Abamectina, Ciflutrina/beta-ciflutrina, Esfenvalerato, Lambda-cialotrina, Acequinocil, Bifenazato,Metoxifenozida, Novaluron, Cromafenozida, Tiacloprid, Dinotefuran, Fluacripirim, Espirodiclofeno, Gama-cialotrina, Espiromesifen,Espinosade, Rinaxipir, Ciazipir, Triflumuron, Espirotetramat, Imidacloprida, Flubendiamida, Tiodicarb, Metaflumizona, Sulfoxaflor, Ciflumetofen, Cianopirafen, Clotianidina, Tiametoxam, Espinotoram, Tiodicarb, Flonicamid, Metiocarb, Benzoto de Emamectina, Indoxacarb, Fenamifos, Piriproxifen, Óxido de Fenbutatina; Fungicidas para Frutas/Vegetais: Ametoctradin, Azoxistrobina, Bentiavalicarb, Boscalid, Captan, Carbendazim, Clorotalonil, Cobre, Ciazofamid, Ciflufenamida, Cimoxanil, Ciproconazol, Ciprodinil, Difenoconazol, Dimetomorf, Ditianon, Fenamidona, Fenexamid, Fluazinam, Fludioxonil, Fluopicolida, Fluopiram, Fluoxastrobina, Fluxapiroxad, Folpet, Fosetil, Iprodiona, Iprovalicarbr, Isopirazam, Kresoxim-metil, Mancozeb, Mandipropamid,Metalaxil/mefenoxam, Metiram, Metrafenona, Miclobutanil, Penconazol, Pentiopirad, Picoxistrobin, Propamocarb, Propiconazol, Propineb, Proquinazid, Protioconazol, Piraclostrobina, Pirimetanil, Quinoxifen, Espiroxamina, Enxofre, Tebuconazol, Tiofanato-metil, Trifloxistrobin; Herbicidas para Cereais: 2.4-D, Amidosulfuron, Bromoxinil, Carfentrazone- E, Clorotoluron, Chlorsulfuron, Clodinafop-P, Clopiralid, Dicamba, Diclofop-M, Diflufenican, Fenoxaprop, Florasulam, Flucarbazona-NA, Flufenacet, Flupirosulfuron-M, Fluroxipir, Flurtamone, Glifosato, Iodosulfuron, Ioxinil, Isoproturon, MCPA, Mesosulfuron, Metsulfuron, Pendimetalin, Pinoxaden, Propoxicarbazona, Prosulfocarb, Piroxsulam, Sulfosulfuron, Tifensulfuron, Tralkoxidim, Triasulfuron, Tribenuron, Trifluralin, Tritosulfuron; Fungicidas para Cereais: Azoxistrobina, Bixafen, Boscalid, Carbendazim, Clorotalonil, Ciflufenamid, Ciproconazol,Ciprodinil, Dimoxistrobin, Epoxiconazol, Fenpropidin, Fenpropimorf,Fluopiram, Fluoxastrobin, Fluquinconazol, Fluxapiroxad, Isopirazam,Kresoxim-metil, Metconazol, Metrafenona, Pentiopirad, Picoxistrobin, Procloraz, Propiconazol, Proquinazid, Protioconazol, Piraclostrobina, Quinoxifen, Espiroxamina, Tebuconazol, Tiofanato-metil, Trifloxistrobina; Inseticidas para Cereais: Dimetoato, Lambda-cialtrina, Deltametrina, alfa- Cipermetrina, β-ciflutrina, Bifentrina, Imidacloprid, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprid, Acetamiprid, Dinetofuran, Clorfirifos, Pirimicarb, Metiocarb, Sulfoxaflor; Herbicidas para Milho: Atrazina, Alaclor, Bromoxinil, Acetoclor, Dicamba, Clopiralid, (S-)Dimetenamid, Glifosinato, Glifosato, Isoxaflutol, (S-)Metolaclor, Mesotriona, Nicosulfuron, Primisulfuron, Rimsulfuron, Sulcotriona, Foramsulfuron, Topramezona, Tembotriona, Saflufenacil, Tiencarbazona, Flufenacet, Piroxasulfon; Inseticidas para Milho: Carbofuran, Clorpirifos, Bifentrina, Fipronil, Imidacloprid, Lambda- Cialotrina, Teflutrina, Terbufos, Tiametoxam, Clotianidina, Espiromesifen, Flubendiamida, Triflumuron, Rinaxipir, Deltametrina, Tiodicarb, β- Ciflutrina, Cipermetrina, Bifentrina, Lufenuron, Tebupirimfos, Etiprole, Ciazipir, Tiacloprid, Acetamiprid, Dinetofuran, Avermectina; Fungicidas para Milho: Azoxistrobina, Bixafen, Boscalid, Ciproconazol,Dimoxistrobina, Epoxiconazol, Fenitropan, Fluopiram, Fluoxastrobina, Fluxapiroxad, Isopirazam, Metconazol, Pentiopirad, Picoxistrobina, Propiconazol, Protioconazol, Piraclostrobina, Tebuconazol,Trifloxistrobina; Herbicidas para Arroz: Butaclor, Propanil, Azimsulfuron, Bensulfuron, Cialofop, Daimuron, Fentrazamida, Imazosulfuron, Mefenacet, Oxaziclomefona, Pirazosulfuron, Piributicarb, Quinclorac, Tiobencarb, Indanofan, Flufenacet, Fentrazamida, Halosulfuron, Oxaziclomefona, Benzobiciclon, Piriftalid, Penoxsulam, Bispiribac, Oxadiargil, Etoxisulfuron, Pretilaclor, Mesotriona, Tefuriltriona, Oxadiazona, Fenoxaprop, Pirimisulfan; Inseticidas para Arroz: Diazinon, Fenobucarb, Benfuracarb, Buprofezin, Dinotefuran, Fipronil, Imidacloprid, Isoprocarb, Tiacloprid, Cromafenozide, Clotianidin, Etiprole, Flubendiamida, Rinaxipir, Deltametrina, Acetamiprid, Tiametoxam, Ciazipir, Espinosad, Espinotoram, Benzoato de Emamectina, Cipermetrina, Clorpirifos, Etofenprox, Carbofuran, Benfuracarb,Sulfoxaflor; Fungicidas para Arroz: Azoxistrobina, Carbendazim, Carpropamida, Diclocimet, Difenoconazol, Edifenfos, Ferimzone, Gentamicina, Hexaconazol, Himexazol, Iprobenfos (IBP), Isoprotiolano, Isotianil, Kasugamicina, Mancozeb, Metominostrobina, Orisastrobina, Pencicuron, Probenazol, Propiconazol, Propineb, Piroquilon, Tebuconazol, Tiofanato-metil, Tiadinil, Triciclazol, Trifloxistrobina, Validamicina; Herbicidas para Algodão: Diuron, Fluometuron, MSMA, Oxifluorfen, Prometrina, Trifluralin, Carfentrazona, Cletodim, Fluazifop- butil, Glifosato, Norflurazon, Pendimetalina, Piritiobac-sodio, Trifloxisulfuron, Tepraloxidim, Glifosinato, Flumioxazina, Tidiazuron; Inseticidas para Algodão: Acefate, Aldicarb, Clorpirifos, Cipermetrina, Deltametrina, Abamectina, Acetamiprid, Benzoato de Emamectina, Imidacloprid, Inadoxacarb, Lambda-Cialotrina, Espinosade, Tiodicarbe, Gama-Cialotrina, Espiromesifen, Piridalil, Flonicamid, Flubendiamida, Triflumuron, Rinaxipir, Beta-Ciflutrina, Espirotetramat, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprid, Dinaetofuran, Flubendiamida, Ciazipir, Espinosade, Espinotoram, gama Cialotrina, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Tiodicarb, Avermectina, Flonicamid, Piridalil, Espiromesifen, Sulfoxaflor; Fungicidas para Algodão: Azoxistrobina, Bixafen, Boscalid, Carbendazim, Clorotalonil, Cobre, Ciproconazol, Difenoconazol, Dimoxistrobina, Epoxiconazol, Fenamidona, Fluazinam, Fluopiram, Fluoxastrobina, Fluxapiroxad, Iprodiona, Isopirazam, Isotianil, Mancozeb, Maneb, Metominaostrobina, Pentiopirad, Picoxistrobina, Propinaeb, Protioconazol, Piraclostrobina, Quinatozene, Tebuconazol, Tetraconazol, Tiofanato-metil, Trifloxistrobina; Herbicidas para Soja: Alaclor, Bentazona, Trifluralina, Clorimuron-Etil, Cloransulam- Metil, Fenoxaprop, Fomesafen, Fluazifop, Glifosato, Imazamox, Imazaquina, Imazetapir, (S)Metolaclor, Metribuzina, Pendimetalina, Tepraloxidim, Glufosinato; Inseticidas para Soja: Lambda-cialotrina, Metomil, Imidacloprid, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprid, Acetamiprid, Dinaetofuran, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, Espinosad, Espinotoram, Benzoato de Emamectina, Fipronil, Etiprol, Deltametrina, β-Ciflutrina, gama e lambda Cialotrina, 4-[[(6-Clorpiridina-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Espirotetramat, Espinodiclofen,Triflumuron, Flonicamid, Tiodicarb, beta-Ciflutrina; Fungicidas para Soja: Azoxistrobina, Bixafen, Boscalid, Carbendazim, Clorotalonil, Cobre, Ciproconazol, Difenoconazol, Dimoxistrobina, Epoxiconazol, Fluazinam, Fluopiram, Fluoxastrobina, Flutriafol, Fluxapiroxad, Isopirazam, Iprodione, Isotianil, Mancozeb, Maneb, Metconazol, Metominostrobina, Miclobutanil, Pentiopirad, Picoxistrobina, Propiconazol, Propineb, Protioconazol, Piraclostrobina, Tebuconazol, Tetraconazoe, Tiofanato-metil,Trifloxistrobina; Herbicidas para Beterraba Açucareira: Cloridazon, Desmedifam, Etofumesato, Fenmedifam, Triallate, Clopiralid, Fluazifop, Lenacil, Metamitron, Quinamerac, Cicloxidim, Triflusulfuron, Tepraloxidim, Quizalofop; Inseticidas para Beterraba Açucareira: Imidacloprid,Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprid, Acetamiprid, Dinaetofuran, Deltametrina, β-Ciflutrina, gama/lambda Cialotrina, 4-[[(6-Clorpiridina-3- il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Teflutrina, Rinaxipir, Ciaxipir, Fipronil, Carbofuran; Herbicidas para Canola: Clopiralid, Diclofop, Fluazifop, Glufosinato, Glifosato, Metazaclor, Trifluralina Etametsulfuron, Quinamerac, Quizalofop, Cletodim, Tepraloxidim; Fungicidas para Canola: Azoxistrobina, Bixafen, Boscalid, Carbendazim, Ciproconazol, Difenoconazol, Dimoxistrobina, Epoxiconazol, Fluazinam, Fluopiram, Fluoxastrobina, Flusilazol, Fluxapiroxad, Iprodiona, Isopirazam, Mepiquat- cloreto, Metconazol, Metominostrobina, Paclobutrazol, Pentiopirad., Picoxistrobina, Procloraz, Protioconazol, Piraclostrobina, Tebuconazol, Tiofanato-metil, Trifloxistrobina, Vinaclozolina; Inseticidas para Canola: Carbofuran, Tiacloprid, Deltametrina, Imidacloprid, Clotianidina, Tiametoxam, Acetamiprid, Dinetofuran, β-Ciflutrina, gama e lambda Cialotrina, tau-Fluvalerato, Etiprole, Espinosade, Espinotoram, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, 4-[[(6-Clorpiridina-3-il)metil](2,2-diflure- til)amino]furan-2(5H)-ona.

[00096] Os exemplos a seguir são oferecidos por meio de ilustração e não como limitação.

EXEMPLOS EXPERIMENTAISExemplo 1. Projeto e teste de proteínas de fusão Axmi115

[00097] Axmi115 está descrito na Publicação de Patente U.S. 20100004176 (a sequência de aminoácidos está descrita aqui como SEQ ID NO: 43). Esse gene compartilha 70% de homologia de sequência com Vip3Aa. Uma versão do códon otimizado de Axmi115 (também referido aqui como Axmi115v01 e descrita na SEQ ID NO: 42) foi clonada e expressa usando o vetor de expressão em E. coli. A proteína produzida foi mostrada em um bioensaio in vitro possuir atividade pesticida contra várias pragas de insetos, incluindo a broca do milho europeu (ECB), larva do grão do milho (CEW), lagarta de cartucho do outono (FAW) e lagarta preta (BCW).

[00098] Axmi005 também está descrito na Publicação de Patente U.S. 20100004176. Esse gene compartilha 94% de homologia de sequência com Vip3Aa. Uma versão do códon otimizado de Axmi005 (optAxmi005, que é descrito na SEQ ID NO: 44) foi clonada e expressa usando o vetor de expressão em E. coli. A proteína produzida foi mostrada em um bioensaio in vitro possuir atividade pesticida contra várias pragas de insetos, incluindo Helicoverpa zea (Hz), Heliothis virescens (Hv), FAW, BCW, broca da cana de açúcar (SCB) e a lagarta do feijão (VBC).

[00099] A atividade relativa de Axmi115 era baixa contra Hz e FAW comparado com Axmi005. Também como notado acima, Axmi005 não teve atividade contra ECB. Em uma tentativa para identificar os domínios responsáveis pela especificidade diferencial assim como pela atividade das duas proteínas, construtos que expressão fusões de oprAxmi005 e uma versão de Axmi115 com códon otimizado (prtAxmi115v01) foram feitos como descrito abaixo e diagramado na Figura 1. SA proteína foi expressa em E. coli e testada contra ECB, Hz, FAW e BCW em um bioensaio in vitro. A proteína expressa por pAX6307 (Axmi115v02.01, descrita aqui como SEQ ID NO: 1) mostrou atividade intensificada quando comparada com a proteína expressa por pAX5477 (Axmi115v01, descrita aqui como SEQ ID NO: 42) contra todas as quatro pragas testadas.

[000100] O gene expresso em pAX6307 (Axmi115v02.01) foi veiculado no vetor de expressão em planta pAG6141 no qual a expressão da proteína foi direcionada pelo promotor de Ubiquitina de cana de açúcar.

[000101] Amostras de folha de plantas transgênicas que expressam Axmi115v01 e Axmi115v02.01 foram testadas em um bioensaio de inseto de laboratório contra ECB, Hz, ADAW e BCW e nos testes de campo contra ECB, Hz e FAW. Os resultados mostram que o gene Axmi115v02.01 aperfeiçoado teve uma eficácia melhor contra todas as pragas testadas.Descrição dos construtos:

[000102] As sequências de aminoácidos derivadas pela tradução in silico da sequência de DNA de Vip3Aa, Axmi005, Axmi115v01, Axmi163, e Axmi184 foram alinhadas para identificar aminoácidos conservados em todos os homólogos (Axmi163 e Axmi184 também estão descritos na Publicação de Patente U.S. 20100004176).

[000103] Iniciadores de PCR foram planejados para três regiões conservadas de Axmi005 e Axmi115v01 usando a sequência de optAxmi005 encontrada em pAX5478 (que contém uma versão de códon otimizado de Axmi005, descrita na SEQ ID NO: 44) e a sequência de optAxmi115 encontrada em pAX5477 (que contém uma versão de códon otimizado de Axmi115). Três genes de fusão foram gerados pela PCR por superposição (veja a Figura 1).

[000104] O DNA dos genes de fusão produzidos por essas reações de PCR foi clonado no vetor de expressão pRSf1B. Os vetores de expressão resultantes são mostrados na Tabela 1. A proteína foi expressa usando métodos conhecidos e o extrato de E.coli foi testado em um bioensaio in vitro.Tabela 1. Construtos de gene de fusão

Bioensaio in vitro

[000105] Extratos brutos de E. coli expressos em vetores foram ensaiados contra Hz, ECB, FAW e BCW. Os resultados são mostrados na Tabela 2 (redução de crescimento) e na Tabela 3 (mortalidade).Tabela 2. Escore de redução de crescimento

*Sistema de pontuação:0 = nenhum efeito observado1 = redução do crescimento não uniforme leve2 = redução do crescimento não uniforme moderada3 = redução do crescimento uniforme moderada a severa4 = mortalidade (<100%) com redução do crescimento uniforme5 = mortalidade completa

[000106] A proteína expressa pelo vetor pAX6307 (fusão A) variou em seis aminoácidos e foi designada Axmi115v02.01. A sequência de aminoácidos para essa proteína de fusão é descrita na SEQ ID NO: 15.

[000107] Vetores de expressão em E. coli que expressam Axmi115v01 (pAX5476) e Axmi115v02.01 (pAX6307) tinham 6X HisTags N terminais. As duas proteínas foram purificadas usando as propriedades de ligação do níquel do 6X His tag. Várias concentrações da proteína purificada foram ensaiadas por um bioensaio in vitro contra ECB, FAW, BCW e Lagarta de cartucho da beterraba (BAW). Os resultados mostram que Axmi115v02.01 tem atividade intensificada comparada com Axmi115v01 em todos os casos (Tabelas 4 e 5).Tabela 4. Escore de redução do crescimento

Bioensaio de disco de folha de planta

[000108] Axmi115v01 (SEQ ID NO: 42) e Axmi115v02.01 (SEQ ID NO: 1) foram clonados nos vetores de expressão em planta pAG6585 r pAG6141, respectivamente e plantas de milho transgênico foram produzidas. As amostras foram retiradas para PCR e análise Western e para o bioensaio de disco de folha in vitro contra Hz, ECB, FAW e BCW. O bioensaio foi classificado como sem dano, dano baixo (1 a poucos furos), dano moderado e dano acentuado. Sem dano e dano leve foram considerados um resultado positivo enquanto que o dano acentuado foi considerado como um resultado negativo.

[000109] Material de folha de plantas positivas por PCR e western foram ensaiadas em um bioensaio de disco de folha in vitro. A Figura 2A mostra o percentual de plantas positivas por PCR que forneceram um escore de bioensaio de não danificado, dano leve, dano moderado ou dano acentuado para cada construto. Westerns blots indicaram que o nível de expressão de proteína em plantas que expressam optAxmi115v02.01 é, em geral, maior do que plantas que expressam Axmi115v01.

[000110] Plantas transgênicas adicionais foram produzidas expressando Axmi115v02.01. O material de folha de plantas positivas por PCR e Western foi ensaiado em um bioensaio de disco de folha in vitro contra Hz, ECB, FAW e BCW. Os resultados são mostrados na Figura 2b.

Testes com plantas no campo

[000111] Plantas que expressam os genes mostrados na Tabela 6 foram plantadas em Polk County, localização de teste IA. Segregados negativos foram identificados e removidos usando uma aplicação de 1X de Glifosato (591,47 ml (20 oz)/A de Buccaneer 5, Tenkoz, Inc.) quando as plantas estavam no estágio de folha V3-V4. A pressão de inseto resultou das infestações manuais de ECB, Hz e FAW.

[000112] As infestações por ECB mimetizaram a ocorrência natural da primeira e segunda gerações. Para ECB, no total, aproximadamente 340 larvas foram infestadas nas espirais da folha (primeira geração, ECB1) ou nas axilas foliares (segunda geração, ECB2) de cada planta. ECB1 foi avaliada pela escala de classificação de 1 a 9 de Guthrie. ECB2 era uma medida da extensão total da penetração do caule medida em cm.

[000113] Vinte larvas de Hz foram infestadas sobre as pontas de espigas primárias sobre cada planta. Também houve uma infestação natural moderada de Hz que aumentou essas infestações manuais. O dano na espiga foi medido em cm quadrados.

[000114] Aproximadamente 60 larvas de FAW foram infestadas nas espirais das folhas. O dano foi medido pela escala de classificação de Davis Modificada de 1 a 9 como descrita abaixo.

[000115] Os resultados desses testes são mostrados na Tabela 6.Tabela 6. Resultados do teste de campo

[000116] FAW - Descrição d a escala de ava iação de 1-9 de DavisModificada1. Sem dano visível ou apenas lesões puntiformes nas espirais das folhas.2. Lesões puntiformes e circulares pequenas presentes nas espirais das folhas.3. Pequenas lesões circulares e algumas lesões pequenas alongadas (forma retangular) de até 1,3 cm (1/2”) de comprimento presentes nas espirais e dobras das folhas.4. Várias lesões alongadas de tamanho pequeno a moderado 1,3 a 2,5 cm (1/2” a 1”) de comprimento presentes sobre algumas espirais e dobras das folhas.5. Várias lesões alongadas grandes maiores do que 2,5 cm (1”) de comprimento presentes em algumas espirais e dobras das folhas e/ou alguns orifícios de tamanho pequeno a médio de formato uniforme a irregular (membrana basal consumida) comidos das espirais e/ou dobras das folhas. 6. Várias lesões grandes alongadas presentes sobre várias espirais e dobras das folhas e/ou vários orifícios grandes de formato uniforme a irregular comidos nas dobras /espirais das folhas.7. Muitas lesões alongadas de todos os tamanhos presentes sobre várias espirais e dobras das folhas mais vários orifícios de formato uniforme a irregular comidos nas espirais e dobras da folha.8. Muitas lesões alongadas de todos os tamanhos presentes sobre a maioria das espirais e dobras das folhas mais muitos orifícios de tamanho moderado a grande de formato uniforme a irregular comidos nas espirais e dobras das folhas.9. Espirais e dobras das folhas quase totalmente destruídas.

[000117] Davis, F. M., S. S. Ng, and W.P. Williams. 1992. Visual rating scales for screening whorl-stage corn for resistance to fall armyworm. Miss. Agric. Forestry Exp. Stn. Tech. Bull. 186.

[000118] ECB - Descrição da escala de classificação de 1 a 9 de Guthrie.1. Nenhuma lesão visível na folha.2. Pequena quantidade de lesão em buraco de bala sobre algumas folhas.3. Lesão em buraco de bala sobre várias folhas.4. Várias folhas com buracos de bala e lesões alongadas.5. Várias folhas com lesões alongadas.6. Várias folhas com lesões alongadas com cerca de 2,5 cm de comprimento.7. Lesões longas comuns em cerca de metade das folhas.8. Lesões longas comuns em cerca de dois terços das folhas.9. Maioria das folhas com lesões longas.

[000119] Guthrie, W. D., F. F. Dicke, and C. R. Neiswander. 1960. Leaf and sheath feeding resistance to the European corn borer in eight inbred lines of dent corn. Ohio. Agric. Exp. Sta. Res. Bull. 860. Exemplo 2. Evolução direcionada de Axmi115v02

[000120] A evolução direcionada tem sido usada para aperfeiçoar a potência e o perfil de atividade de Axmi115 contra ECB, Hz, FAW, BCW e VBC. Para identificar as regiões de Axmi115 envolvidas na toxicidade para o inseto, várias variantes por troca de sequência de Axmi115/Axmi005 na parte C terminal de Axmi115 foram criadas. Vinte e um blocos de divergência de sequência entre Axmi115 e Axmi005 foram designados (veja Publicação de Patente U.S. No. 20100004176, que está incorporado aqui por referência em sua totalidade) e esses blocos de sequências em Axmi115 foram substituídos pelos blocos de sequência correspondentes de Axmi005. Os bioensaios de proteínas híbridas mostraram que as substituições nos blocos 2, 3, 10 e 18 estão ligadas para aumentar a toxicidade para o inseto.

[000121] Bibliotecas de mutantes pontuais foram criadas para atingir as posições nos blocos 2, 3, 10 e 18. Essas bibliotecas de mutantes pontuais foram ensaiadas contra ECB, Hz, FAW, BCW e VBC em uma cobertura de 1,5x no nível de replicata 4. Foram realizados re-ensaios no nível de replicata 4 e foram feitas extrapolações no nível de replicata 16. Os seguintes mutantes pontuais mostraram atividade aperfeiçoada contra uma ou mais pragas:Tabela 7. Atividade de mutantes pontuais de Axmi115

[000122] Essas variantes ontem mutações na parte C-terminal.Para observar as melhorias sinérgicas com Axmi115v02 (pAX6307), a parte C terminal de vários mutantes acima foi clonada em Axmi115v02 (pAX6307). Os ensaios das extrapolações foram realizados e as variantes com atividade aperfeiçoada comparadas com Axmi115v02 foram identificadas.Tabela 8. Atividade de mutantes de Axmi115v02

[000123] A variante axmi115 B2L11H6 (v02) mostra atividade aperfeiçoada contra H. zea, VBC, FAW. Foi designada como Axmi115v02(evo27). A sequência de nucleotídeos para Axmi115v02(evo27) está descrita na SEQ ID NO: 4 e a sequência de aminoácidos codificada está descrita na SEQ ID NO: 18.

[000124] A variante axmi115 B18L12B10 (v02) mostraaperfeiçoamentos contra ECB. Foi designada comoAxmi115v02(evo28). A sequência de nucleotídeos para Axmi115v02(evo28) está descrita na SEQ ID NO: 5 e a sequência de aminoácidos codificada está descrita na SEQ ID NO: 19.

[000125] A variante axmi115 B2L11F9 (v02) mostra aperfeiçoamentos contra H. zea, VBC, FAW. Foi designada como Axmi115v02 (evo29). A sequência de nucleotídeos para Axmi115v02 (evo29) está descrita na SEQ ID NO: 6 e a sequência de aminoácidos codificada está descrita na SEQ ID NO: 20.

[000126] Mutações adicionais foram feitas na sequência de AXMI115v02 na região C terminal. Três variantes foram identificadas com atividade aperfeiçoada em relação a AXMI115v02 (Tabela 9). Os valores de LC50 e EC50 foram determinados para dois desses mutantes C terminais (Tabela 10).

[000127] AXMI115v02 (EVO31) mostrou mortalidade aperfeiçoada contra FAW, lagarta da soja (SBL) e VBC em relação a AXMI115v02. A sequência de nucleotídeos para Axmi115v02 (evo31) está descrita na SEQ ID NO: 7 e a sequência de aminoácidos está descrita na SEQ ID NO: 21.

[000128] AXMI115v02 (EVO32) mostrou mortalidade aperfeiçoada contra ECB e H. zea em relação a AXMI115v02. A sequência de nucleotídeos para Axmi115v02 (evo32) está descrita na SEQ ID NO: 8 e a sequência de aminoácidos está descrita na SEQ ID NO: 22.

[000129] AXMI115v02 (EVO38) mostrou mortalidade aperfeiçoada contra BCW em relação a AXMI115v02. A sequência de nucleotídeos para Axmi115v02 (evo38) está descrita na SEQ ID NO: 47 e a sequência de aminoácidos está descrita na SEQ ID NO: 48.Tabela 9. Atividade de mutantes C terminais de Axmi115v02

SBL = Lagarta da soja Exemplo 3: Ensaios adicionais para Atividade Pesticida

[000130] As sequências de nucleotídeos da invenção podem ser testadas quanto a sua habilidade para produzir proteínas pesticidas. A habilidade de uma proteína pesticida para atuar como pesticida sobre uma prega é geralmente avaliada de várias maneiras. Uma maneira bem conhecida na técnica é realizar um ensaio de alimentação. Em tal ensaio de alimentação, expõe-se a praga a uma amostra que contém compostos a ser testados ou amostras de controle. Comumente isso é realizado pela colocação do material a ser testado ou uma diluição adequada de tal material sobre um material que a praga irá ingerir, tal como uma dieta artificial. O material a ser testado pode ser composto por um líquido, sólido ou pasta. O material a ser testado pode ser colocado sobre a superfície e deixado secar. Alternativamente, o material a ser testado pode ser misturado com uma dieta artificial fundida e depois colocado na câmara de ensaio. A câmara de ensaio pode ser, por exemplo, um copo, um prato ou um poço de uma placa de microtitulação.

[000131] Ensaios para pragas sugadoras (por exemplo, afídeos) podem envolver separar o material de teste do inseto por uma divisão, idealmente uma porção que possa ser perfurada pelas partes sugadoras da boca do inseto sugador, para permitir a ingestão do material de teste. Comumente o material de teste é misturado com um estimulante da alimentação, tal com a sacarose, para promover a ingestão do composto de teste.

[000132] Outros tipos de ensaios podem incluir a microinjeção do material de teste na boca ou no intestino da praga, assim como o desenvolvimento de plantas transgênicas, seguido pelo teste da habilidade da praga em se alimentar sobre a planta transgênica. O teste com a planta pode envolver o isolamento das partes da planta normalmente consumidas, por exemplo, gaiolas pequenas acopladas a uma folha ou isolamento de plantas completas nas gaiolas que contêm os insetos.

[000133] Outros métodos e abordagens para ensaiar pragas são conhecidos na técnica e podem ser encontrados, por exemplo, em Robertson and Preisler, eds. (1992) Pesticide bioassays with arthropods, CRC, Boca Raton, FL. Alternativamente, os ensaios são comumente descritos nos jornais Arthropod Management Tests e Journal of Economic Entomology pela discussão com membros da Entomological Society of America (ESA).

[000134] Em algumas modalidades, as regiões de DNA que codificam a região da toxina das proteínas pesticidas aqui descritas são clonadas no vetor de expressão em E.coli pMAL-C4x após o gene malE que codifica a proteína de ligação a Maltose (MBP). Essas fusões em fase resultam na expressão de proteínas de fusão MBP-Axmi em E. coli.

[000135] Para a expressão em E. coli, BL21*DE3 são transformadas com plasmídeos individuais. Colônias isoladas são inoculadas em LB suplementado com carbenicilina e glicose e cultivadas por uma noite a 37°C. No dia seguinte, o meio fresco é inoculado com 1% da cultura de uma noite e cultivado a 37°C até a fase logarítmica. Subsequentemente, as culturas são induzidas com IPTG 0,3 mM por uma noite a 20°C. Cada pélete celular é suspenso em tampão Tris-Cl 20 mM, pH 7,4 + NaCl 200 mM + DTT 1 mM + inibidores de protease e sonicado. A análise por SDS- PAGE pode ser usada para confirmar a expressão de proteínas de fusão.

[000136] Extratos totais sem células são então corridos sobre uma coluna de amilose acoplada para cromatografia liquida rápida de proteína (FPLC) para purificação por afinidade de proteínas de fusão MBP-axmi. As proteínas de fusão ligadas são eluidas da resina com uma solução de maltose 10 mM. As proteínas de fusão purificadas são então clivadas com o Fator Xa ou tripsina para remover o tag amino terminal de MBP da proteína Axmi. A clivagem e a solubilidade das proteínas podem ser determinadas por SDS-PAGE.Exemplo 4. Construção de sequências sintéticas

[000137] Em um aspecto da invenção, as sequências sintéticas de axmi são geradas. Essas sequências sintéticas possuem uma seuqncia de DNA alterada em relação a sequência parental de axmi e codificam uma proteína que é colinear com a proteína AXMI parental a qual ela corresponde, mas carece do “domínio cristal” C terminal presente em várias proteínas delta-endotoxina.

[000138] Em outro aspecto da invenção, versões modificadas de genes sintéticos são designadas tal que o peptídeo resultante é direcionado para uma organela da planta tal como o retículo endoplasmático ou o apoplasto. As sequências de peptídeo conhecidas por resultar no direcionamento de proteínas de fusão para organelas de planta são conhecidas na técnica. Por exemplo a região N terminal do gene da fosfatase ácida do tremoço branco Lupinus albus (Genebank ID GI:14276838; Miller et al. (2001) Plant Physiology 127: 594-606) é conhecida na técnica por resultar no direcionamento para o retículo endoplasmático de proteínas heterólogas. Se a proteína de fusão resultante também contém uma sequência de retenção endoplasmática que compreende o peptídeo terminação N-lisina-ácido aspártico-ácido glutâmico-leucina (isto é, o motivo “KDEL” (SEQ ID NO: 46) na terminação C, a proteína de fusão pode ser direcionada para o retículo endoplasmático. Se a proteína de fusão carece de uma sequência de direcionamento para o retículo endoplasmático na terminação C, a proteína será direcionada para o retículo endoplasmático, mas será finalmente sequestrada no apoplasto.Exemplo 5. Transformação de células de milho com genes de proteína pesticida aqui descritos

[000139] Espigas de milho são melhor coletadas 8 a 12 dias depois da polinização. Os embriões são isolados das espigas e aqueles embriões com 0,8 a 1,5 mm de tamanho são preferidos para uso na transformação. Os embriões são plaqueados com o escutelo para cima sobre um meio de incubação adequando, tal como o meio DN62A5S (3,98 g/L de Sais N6; 1 mL/L (de um Concentrado 1000x) de Vitaminas N6; 800 mg/L de L-Asparagina; 100 mg/L de Mio-inositol; 1,4 g/L de L- Prolina; 100 mg/L de Casaminoácidos; 50 g/L de sacarose; 1 mL/L (de um Concentrado 1 mg/mL) de 2,4-D). Entretanto, meios e sais diferentes de DN62A5S são adequados e conhecidos na técnica. Os embriões são incubados por uma noite a 25°C no escuro. Entretanto, não é necessário per se incubar os embriões por uma noite.

[000140] Os explantes resultantes são transferidos para telas quadradas (30 a 40 por placa), transferidas para meios osmóticos por cerca de 30 a 45 minutos, depois transferidos para uma placa radiante (veja, por exemplo, Publicação PCT No. WO/0138514 e Patente U.S. No. 5.240.842).

[000141] Os construtos de DNA designados para os genes da invenção em células de planta são acelerados no tecido de planta usando um acelerador de feixe de aerossol, usando condições essencialmente como descritas na Publicação PCT No. WO/0138514. Depois de irradiar, os embriões são incubados por cerca de 30 min. sobre meio osmótico e colocados sobre meio de incubação por uma noite a 25°C no escuro. Para evitar o dano desnecessário dos explantes irradiados, eles foram incubados por pelo menos 24 horas antes de transferir para o meio de recuperação. Os embriões são então espalhados sobre o meio de período de recuperação por cerca de 5 dias, 25°C no escuro, depois transferidos para um meio de seleção. Os explantes são incubados em meio de seleção por até oito semanas, dependendo da natureza e das características da seleção particular utilizada. Depois do período de seleção. o calo resultante é transferido para um meio de maturação de embrião, até que a formação de embriões somáticos maduros seja observada. Os embriões somáticos maduros resultantes são então colocados sob pouca luza e o processo de regeneração é iniciado por meios conhecidos na técnica. As mudas resultantes são deixadas enraizar em meio de enraizamento e as plantas resultantes são transferidas para potes berçários e propagadas como plantas transgênicas. Materiais

[000142] O pH da solução é ajustado para 5,8 com KOH 1N/KCl 1N,Gelrite (Sigma) é adicionado em uma concentração de até 3g/L e o meio é autoclavado. Depois de resfriar para 50°C, 2ml/L de uma solução concentrada 5mg/ml de nitrato de prata (Phytotechnology Labs) é adicionada. Exemplo 6. Transformação de genes da invenção em Células de Planta pela Transformação Mediada por Agrobacterium

[000143] Espigas de milho são melhor coletadas 8 a 12 dias depois da polinização. Os embriões são isolados das espigas e aqueles embriões com 0,8 a 1,5 mm de tamanho são preferidos para uso na transformação. Os embriões são plaqueados com o escutelo para cima sobre um meio de incubação adequando e incubados a 25°C por uma noite no escuro. Entretanto, não é necessário per se incubar os embriões por uma noite. Os embriões são contatados com uma cepa de Agrobacterium contendo os vetores apropriados para a transferência mediada pelo plasmídeo Ti por cerca de 5 a 10 min. e depois plaqueados sobre meio de cocultivo por cerca de 3 dias (25°C no escuro). Os explantes são incubados em meio de seleção por até oito semanas, dependendo da natureza e das características da seleção particular utilizada. Depois do período de seleção, o calo resultante é transferido para o meio de maturação do embrião, até a formação de embriões somáticos maduros seja observada. Os embriões somáticos resultantes são então colocados sob pouca luz e o processo de regeneração é iniciado como conhecido na técnica.

[000144] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados nesse pedido são indicativos do nível de experiência daqueles versados na técnica a qual essa invenção pertence. Todas as publicações e pedidos de patente estão incorporados aqui por referência na mesma extensão como se cada publicação ou pedido de patente estivesse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

[000145] Embora a invenção precedente tenha sido escrita em alguns detalhes como meio de ilustração e exemplo com o propósito de clareza de compreensão, ficará obvio que certas alterações e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações em anexo.

Claims

1. Molécula de ácido nucleico recombinante, caracterizada pelo fato de que consiste em uma sequência de nucleotídeos, que codifica um polipeptídeo que possui atividade pesticida, em que a referida sequência de nucleotídeos é selecionada a do grupo consistindo em:(a) a sequência de nucleotídeos apresentada em qualquer uma de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6; e(b) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 20.

2. Molécula de ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida sequência de nucleotídeos é uma sequência sintética que foi designada para expressão em planta.

3. Molécula de ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a referida sequência de nucleotídeos está operacionalmente ligada a um promotor capaz de direcionar a expressão da dita sequência de nucleotídeos em uma célula de planta.

4. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico recombinante como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

5. Vetor de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo heterólogo.

6. Microrganismo transgênico, caracterizado pelo fato de que contém o ácido nucleico recombinante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou o vetor como definido na reivindicação 4 ou 5.

7. Microrganismo transgênico de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que é uma bactéria transgênica.

8. Polipeptídeo recombinante apresentando atividade pesticida, caracterizado pelo fato de que consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste na sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 20.

9. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende ainda sequências de aminoácidos heterólogas.

10. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo, como definido na reivindicação 8 ou 9 em combinação com um veículo agricolamente aceitável.

11. Composição de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que é selecionada do grupo que consiste em um pó, nevoa, pélete, granulo spray, emulsão, coloide e solução.

12. Composição de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que é preparada pela dessecação, liofilização, homogeneização, extração, filtração, centrifugação, sedimentação ou concentração de uma cultura de células bacterianas.

13. Composição de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que compreende entre 1% a 99% em peso do referido polipeptídeo.

14. Método para controlar uma população de pragas de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, nematódeos ou dípteros, caracterizado pelo fato de que compreende contatar a referida população com uma quantidade eficaz, como pesticida, do polipeptídeo, como definido na reivindicação 8 ou 9, ou a composição, como definida na reivindicação 11, 12, ou 13.

15. Método para exterminar uma população de pragas de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, nematódeos ou dípteros, caracterizado pelo fato de que compreende contatar a referida praga com uma quantidade eficaz, como pesticida, do polipeptídeo, como definido na reivindicação 8 ou 9, ou a composição, como definida na reivindicação 11, 12, ou 13.

16. Método para produção de um polipeptídeo com atividade pesticida, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar um microrganismo transgênico como definido na reivindicação 6, sob condições nas quais a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo seja expressa.

17. Método para proteger uma planta de uma praga, caracterizado pelo fato de que compreende expressar em uma planta ou sua célula uma molécula de ácido nucleico que consiste na sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que possui atividade pesticida, em que a referida sequência de nucleotídeos é selecionada do grupo consistindo em:(a) a sequência de nucleotídeos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6; e(b) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 20.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de nucleotídeos é selecionada do grupo que consiste em:(a) a sequência de nucleotídeos apresentada em qualquer uma de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6; e(b) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 20.

19. Método de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que a referida planta produz um polipeptídeo pesticida que possui atividade pesticida contra uma praga de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, nematódeos ou dípteros

20. Método para aumentar o rendimento em uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar em um campo uma planta ou sua semente que possua estavelmente incorporado em seu genoma uma construção de DNA que consiste em uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que a referida sequência de nucleotídeos é selecionada do grupo que consiste em:(a) a sequência de nucleotídeos apresentada em qualquer uma de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6; e(b) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 20.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de nucleotídeos é selecionada do grupo que consiste em:(a) a sequência de nucleotídeos apresentada em qualquer uma de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6; e(b) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 20.