ES2901155T3

ES2901155T3 - Gen insecticida variante de axmi115 y métodos para su uso

Info

Publication number: ES2901155T3
Application number: ES19153784T
Authority: ES
Inventors: Duane Lehtinen; Nalini Desai; Volker Heinrichs
Original assignee: BASF Agricultural Solutions Seed US LLC
Current assignee: BASF Agricultural Solutions Seed US LLC
Priority date: 2011-04-05
Filing date: 2012-04-04
Publication date: 2022-03-21
Anticipated expiration: 2032-04-04
Also published as: EP3971297A1; BR112013025665B8; EP3498849B1; MX367427B; EA201391444A1; AU2019210561A1; ZA201307363B; UA122856C2; US20180251780A1; UY34005A; AR085939A1; US9982274B2; US9752158B2; EA202091496A1; HUE045066T2; EA036053B1; BR112013025665B1; CA2832087A1; ES2743322T3; CN103635579B

Abstract

Una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida, en donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en: (a) la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID NO: 7; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; y (c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende de una a cinco sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 21, en donde la actividad plaguicida del polipéptido de fusión se mejora con respecto a la actividad plaguicida de la SEQ ID NO:43 en relación con la mortalidad de al menos uno de barrenador europeo del maíz, H. Zea, gusano cogollero y oruga del frijol de terciopelo.

Description

DESCRIPCIÓN

Gen insecticida variante de axmi115 y métodos para su uso

Referencia a la lista de secuencias enviada electrónicamente

La copia oficial de la lista de secuencias se envía electrónicamente a través de EFS-Web como una lista de secuencias con formato ASCII con un archivo llamado "2916693-093977-SEQLIST.txt", creado el 2 de abril de 2012, tiene un tamaño de 241 kilobytes y se presenta al mismo tiempo que la especificación. La lista de secuencias contenida en este documento con formato ASCII es parte de la especificación y se incorpora en la presente descripción como referencia en su totalidad.

Campo de la invención

Esta invención se relaciona con el campo de la biología molecular. Se proporcionan genes novedosos que codifican proteínas plaguicidas. Estas proteínas y las secuencias de ácido nucleico que las codifican son útiles en la preparación de formulaciones plaguicidas y en la producción de plantas transgénicas resistentes a plagas.

Antecedentes de la invención

Bacillus thuringiensis es una bacteria del suelo formadora de esporas Gram-positiva que se caracteriza por su capacidad para producir inclusiones cristalinas que son específicamente tóxicas para ciertos órdenes y especies de insectos, pero que son inofensivas para las plantas y otros organismos no objetivos. Por esta razón, las composiciones que incluyen cepas de Bacillus thuringiensis o sus proteínas insecticidas pueden usarse como insecticidas ambientalmente aceptables para controlar plagas de insectos agrícolas o insectos vectores para una variedad de enfermedades humanas o animales.

Las proteínas cristal (Cry) (delta endotoxinas) de Bacillus thuringiensis tienen una potente actividad insecticida contra las larvas predominantemente de lepidópteros, hemípteros, dípteros, y coleópteros. Estas proteínas también muestran actividad contra las órdenes de plagas Hymenoptera, Homoptera, Phthiraptera, Mallophaga, y Acari, así como también contra otras órdenes de invertebrados como Nemathelminthes, Platyhelminthes, y Sarcomastigorphora (Feitelson (1993) The Bacillus Thuringiensis family tree. En Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.) La proteína cristalina no exhibe actividad insecticida hasta que se ingiere y solubiliza en el intestino medio del insecto. La protoxina ingerida se hidroliza por proteasas en el tracto digestivo de los insectos a una molécula tóxica activa. (Hofte y Whiteley (1989) Microbiol. Rev. 53:242-255). Esta toxina se une a los receptores apicales del borde en cepillo en el intestino medio de las larvas objetivos y se inserta en la membrana apical y crea canales iónicos o poros, lo que provoca la muerte de las larvas.

Además de las endotoxinas, B. thuringiensis también produce proteínas insecticidas secretadas durante su etapa de crecimiento vegetativo, a saber, proteínas insecticidas vegetativas (Vip). Desde el descubrimiento de la primera toxina Vip, se identificaron dos grupos principales de toxinas Vip en B. thuringiensis. Un grupo de toxinas Vip consta de toxinas binarias formadas por dos componentes, Vip1 y Vip2 (Warren (1997) en NB Carozzi y MG Koziel (ed.), Advances in insect control: the role of transgenic plants. Taylor & Francis, Londres, Reino Unido). La combinación de Vip1 y Vip2 es altamente insecticida para un insecto de importancia agrícola, el gusano de la raíz del maíz occidental (Diabrotica virgifera), pero no muestra ninguna actividad insecticida para ningún insecto lepidóptero (Han y otros (1999) Nat. Struct. Biol. 6: 932-936). El otro grupo se forma por toxinas Vip3, que no comparten ninguna similitud de secuencia con Vip1 o Vip2. La toxina Vip3 identificada por primera vez, Vip3Aa1, es altamente insecticida para varias plagas de lepidópteros importantes del maíz y el algodón, que incluyen el gusano cogollero Spodoptera frugiperda y el gusano de la cápsula del algodón Helicoverpa zea, pero no muestra actividad contra el barrenador europeo del maíz Ostrinia nubilalis, una plaga importante del maíz Estruch y otros (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5389-5394). La deleción del gen vip3Aa1 de una cepa de B. thuringiensis resultó en una reducción significativa de la actividad insecticida de esa cepa de B. thuringiensis, lo que sugiere que Vip3 contribuye a la toxicidad general de las cepas de B. thuringiensis (Donovan y otros (2001) J. Invertebr. Pathol. 78:45-51). También se observó que Vip3Aa1 mata insectos al lisar las células del intestino medio de los insectos (Yu y otros (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63:532-536) a través de la formación de poros en la membrana celular (Lee y otros (2003) Appl. Environ. Microbiol. 69:4648-4657).

El uso intensivo de insecticidas a base de B. thuringiensis ya dio lugar a resistencia en las poblaciones de campo de la polilla del dorso de diamante, Plutella xylostella (Ferré y Van Rie (2002) Annu. Rev. Entomol. 47:501-533). El mecanismo de resistencia más común es la reducción de la unión de la toxina a su(s) receptor(es) específico(s) del intestino medio. Esto también puede conferir resistencia cruzada a otras toxinas que comparten el mismo receptor (Ferré y Van Rie (2002)).

Resumen de la invención

Se proporcionan composiciones y métodos para conferir actividad plaguicida a bacterias, plantas, células vegetales, tejidos y semillas. Las composiciones incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican secuencias para polipéptidos plaguicidas e insecticidas, vectores que comprenden esas moléculas de ácido nucleico y células huésped que comprenden los vectores. Las composiciones también incluyen las secuencias de polipéptidos plaguicidas y anticuerpos contra esos polipéptidos. Las secuencias de nucleótidos pueden usarse en construcciones de ADN o casetes de expresión para transformación y expresión en organismos, que incluyen microorganismos y plantas. Las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos pueden ser secuencias sintéticas que se diseñaron para la expresión en un organismo que incluyen, pero no se limitan a, un microorganismo o una planta. Las composiciones también comprenden bacterias, plantas, células vegetales, tejidos, y semillas que comprenden la secuencia de nucleótidos de la invención.

En particular, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican una proteína plaguicida. Por tanto, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de fusión que tiene actividad plaguicida, en donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:

a) la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID NO: 7;

b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21;

c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende de una a cinco sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos con respecto a SEQ ID NO: 21, en donde el polipéptido de fusión comprende una porción C-terminal de SEQ I^dNO:43. Adicionalmente, se incluyen secuencias de aminoácidos correspondientes a la proteína plaguicida. Por tanto, la presente invención proporciona, además, un polipéptido recombinante que tiene actividad plaguicida, en donde dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; y

c) una secuencia de aminoácidos que comprende de una a cinco sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos con respecto a SEQ ID NO: 21, en donde la actividad plaguicida del polipéptido se mejora o se extiende con respecto a la actividad plaguicida de SEQ ID NO:43 en relación a la mortalidad de al menos uno de barrenador europeo del maíz, H. Zea, gusano cogollero, y oruga del frijol de terciopelo.

También se describe una molécula de ácido nucleico aislada o recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión, así como también variantes biológicamente activas y fragmentos de esta, en donde la proteína de fusión comprende la porción C-terminal de SEQ ID NO:43. La presente invención proporciona, además, un vector que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la invención y una célula huésped que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la invención; preferentemente, que sea una célula huésped bacteriana o una célula vegetal. Además, la presente invención proporciona una planta transgénica que comprende una célula huésped de acuerdo con la invención, preferentemente, en donde dicha planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, sorgo, trigo, repollo, girasol, tomate, cruciferas, pimientos, papa, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada y colza; una semilla transgénica que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la invención o el vector de acuerdo con la invención y una composición que comprende el polipéptido de acuerdo con la invención. En varios casos, la proteína de fusión comprende la porción N-terminal de SEQ ID NO:45. En modalidades específicas, la molécula de ácido nucleico abarcada por la presente invención (que incluye vectores, células huésped, plantas, y semillas que comprenden la molécula de ácido nucleico) comprende la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID NO: 7, o una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 21. Se describen variantes biológicamente activas y fragmentos de estas. También se describen secuencias de nucleótidos que son complementarias a una secuencia de nucleótidos de la invención, o que hibridan con una secuencia de la invención o un complemento de esta. Las proteínas de fusión aisladas o recombinantes codificadas por la molécula de ácido nucleico de la invención también se incluyen en la presente descripción.

Se proporcionan métodos para producir los polipéptidos de la invención y para usar esos polipéptidos para controlar o matar una plaga de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, nemátodos, o dípteros. También se describen métodos y kits para detectar los ácidos nucleicos y polipéptidos de la invención en una muestra.

La presente invención proporciona, además, un método para:

(a) controlar una población de plagas de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, nemátodos, o dípteros que comprende poner en contacto dicha población con una cantidad plaguicidamente efectiva del polipéptido de la invención o de la composición de la invención; o

(b) matar una plaga de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, nemátodos, o dípteros, que comprende poner en contacto dicha plaga con, o alimentar a dicha plaga con, una cantidad plaguicidamente efectiva del polipéptido de la invención o de la composición de la invención.

La invención proporciona, además, un método para producir un polipéptido con actividad plaguicida, que comprende cultivar la célula huésped de la invención en condiciones en las que se expresa la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido, preferentemente, en donde dicha planta es una célula vegetal; y un método para proteger una planta de una plaga, que comprende expresar en una planta o célula de esta una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida, en donde dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; y

(b) una secuencia de aminoácidos que comprende de una a cinco sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, en donde la actividad plaguicida del polipéptido se mejora con respecto a la actividad plaguicida de SEQ ID NO: 43 en relación con la mortalidad de al menos uno de barrenador europeo del maíz, H. Zea, gusano cogollero, y oruga del frijol de terciopelo, preferentemente, en donde dicha planta produce un polipéptido plaguicida que tiene actividad plaguicida contra una plaga de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, nemátodos, o dípteros. Además, la presente invención proporciona un método para aumentar el rendimiento en una planta que comprende cultivar en un campo una planta o una semilla de esta que tiene incorporada de manera estable en su genoma una construcción de ADN que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida, en donde dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; y (b) una secuencia de aminoácidos que comprende de una a cinco sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, en donde la actividad plaguicida del polipéptido se mejora en relación con la actividad plaguicida de SEQ ID. NO: 43 en relación con la mortalidad de al menos uno de barrenador europeo del maíz, H. Zea, gusano cogollero, y oruga del frijol de terciopelo.

Además, la presente invención proporciona una planta que tiene incorporada de manera estable en su genoma una construcción de ADN que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida, en donde dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; y

(b) una secuencia de aminoácidos que comprende de una a cinco sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID: NO 21, en donde la actividad plaguicida del polipéptido se mejora con respecto a la actividad plaguicida de SEQ ID NO: 43 en relación con la mortalidad de al menos uno de barrenador europeo del maíz, H. Zea, gusano cogollero y oruga del frijol de terciopelo.

Las composiciones y métodos de la invención son útiles para la producción de organismos con mayor resistencia o tolerancia a plagas. Estos organismos y composiciones que comprenden los organismos son deseables para fines agrícolas. Las composiciones de la invención también son útiles para generar proteínas alteradas o mejoradas que tienen actividad plaguicida, o para detectar la presencia de proteínas plaguicidas o ácidos nucleicos en productos u organismos.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra un diagrama de las construcciones de fusión.

La Figura 2 muestra los resultados del bioensayo de disco foliar in vitro. pAG6585 contiene optAxmi115v01 (N=14) y pAG6141 contiene optAxmi115v02.01.01 (N=8).

Descripción detallada

La presente invención se refiere a composiciones y métodos para regular la resistencia o tolerancia a plagas en organismos, particularmente plantas o células vegetales. Por "resistencia" se entiende que la plaga (por ejemplo, un insecto) muere tras la ingestión u otro contacto con los polipéptidos de la invención. Por "tolerancia" se entiende un impedimento o reducción en el movimiento, alimentación, reproducción, u otras funciones de la plaga. Los métodos implican la transformación de organismos con una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína plaguicida de la invención. En particular, las secuencias de nucleótidos de la invención son útiles para preparar plantas y microorganismos que poseen actividad plaguicida. Por tanto, se proporcionan bacterias, plantas, células vegetales, tejidos vegetales y semillas transformados. Las composiciones son ácidos nucleicos y proteínas plaguicidas de Bacillus u otras especies. Las secuencias encuentran uso en la construcción de vectores de expresión para su posterior transformación en organismos de interés, como sondas para el aislamiento de otros genes homólogos (o parcialmente homólogos), y para la generación de proteínas plaguicidas alteradas mediante métodos conocidos en la técnica, tales como intercambio de dominios o barajado de ADN, por ejemplo, con miembros de las familias de toxinas Vip1, Vip2, o Vip3. Las proteínas encuentran uso para controlar o matar poblaciones de plagas de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, dípteros, y nemátodos y para producir composiciones con actividad plaguicida.

Por "toxina plaguicida" o "proteína plaguicida" se entiende una toxina que tiene actividad tóxica contra una o más plagas, que incluyen, entre otras, a los miembros de las órdenes Lepidoptera, Díptera, y Coleóptera, o el filo Nematoda, o una proteína que tiene homología con tal proteína. Se aislaron proteínas plaguicidas de organismos que incluyen, por ejemplo, Bacillus sp., Clostridium bifermentans y Paenibacillus popilliae. Las proteínas plaguicidas incluyen secuencias de aminoácidos deducidas de las secuencias de nucleótidos de longitud completa descritas en la presente descripción, y secuencias de aminoácidos que son más cortas que las secuencias de longitud completa, ya sea debido al uso de un sitio de inicio alternativo corriente abajo o debido al procesamiento que produce un proteína más corta que tiene actividad plaguicida. El procesamiento puede ocurrir en el organismo en el que se expresa la proteína, o en la plaga después de la ingestión de la proteína.

Por tanto, en la presente descripción se proporcionan nuevas secuencias de nucleótidos aisladas o recombinantes que confieren actividad plaguicida. Estas secuencias de nucleótidos codifican polipéptidos con homología con toxinas conocidas. También se proporcionan las secuencias de aminoácidos de las proteínas plaguicidas. La proteína resultante de la traducción de este gen permite a las células controlar o matar las plagas que lo ingieren. Moléculas de ácido nucleico aisladas, y variantes y fragmentos de estas

Un aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico recombinantes que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican proteínas y polipéptidos plaguicidas o porciones biológicamente activas de estos, en donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:

(a) la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID NO: 7;

(b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; y

(c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende de uno a cinco sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos con respecto a SEQ ⁱD NO: 21,

en donde la actividad plaguicida del polipéptido de fusión se mejora con respecto a la actividad plaguicida de SEQ ID N0:43 en relación con la mortalidad de al menos uno de barrenador europeo del maíz, H. Zea, gusano cogollero, y oruga del frijol de terciopelo. También se describen en la presente descripción secuencias de nucleótidos capaces de hibridar con las secuencias de nucleótidos de la invención en condiciones rigurosas como se define en otra parte de la presente descripción. Como se usa en la presente descripción, el término "molécula de ácido nucleico" pretende incluir moléculas de ADN (por ejemplo, ^aDⁿrecombinante, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos del a Dn o ARN generados mediante el uso de análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser de simple cadena o de doble cadena pero, preferentemente, es ADN de doble cadena.

Una secuencia de ácido nucleico (o ADN) "aislada" o "recombinante" se usa en la presente descripción para referirse a una secuencia de ácido nucleico (o ADN) que ya no se encuentra en su entorno natural, por ejemplo, en una célula huésped vegetal o bacteria recombinante o in vitro. En algunas modalidades, un ácido nucleico aislado o recombinante está libre de secuencias (preferentemente, secuencias que codifican proteínas) que flanquean naturalmente al ácido nucleico (es decir, secuencias ubicadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del que se deriva el ácido nucleico. Para los propósitos de la invención, "aislado" cuando se usa para referirse a moléculas de ácido nucleico excluye los cromosomas aislados. Por ejemplo, en diversas modalidades, la molécula de ácido nucleico que codifica la delta endotoxina aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la que se deriva el ácido nucleico. En varias modalidades, una proteína delta endotoxina que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que tienen menos de aproximadamente 30 %, 20 %, 10 %, o 5 % (en peso seco) de proteína no delta endotoxina (también denominada en la presente descripción "proteína contaminante").

Las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas de la presente invención incluyen la secuencia establecida en SEQ ID NO: 7, un nucleótido que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, y una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende de uno a cinco sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos con respecto a SEQ ID NO: 21;. También se describen variantes, fragmentos, y complementos de estas. Por "complemento" se entiende una secuencia de nucleótidos que es suficientemente complementaria a una secuencia de nucleótidos dada de manera tal que pueda hibridar con la secuencia de nucleótidos dada para formar de esa manera un dúplex estable. Las secuencias de aminoácidos correspondientes para las proteínas plaguicidas codificadas por estas secuencias de nucleótidos se establecen en SEQ ID NO: 21.

También se describen moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de estas secuencias de nucleótidos que codifican proteínas plaguicidas. Por "fragmento" se entiende una porción de la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína plaguicida. Un fragmento de una secuencia de nucleótidos puede codificar una porción biológicamente activa de una proteína plaguicida, o puede ser un fragmento que puede usarse como sonda de hibridación o cebador de PCR mediante el uso de los métodos descritos más abajo. Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína plaguicida comprenden al menos aproximadamente 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1350, 1400 nucleótidos contiguos, o hasta el número de nucleótidos presentes en una secuencia de nucleótidos de longitud completa que codifica una proteína plaguicida descrita en la presente descripción, en dependencia del uso pretendido. Por nucleótidos "contiguos" se entiende los residuos de nucleótidos que están inmediatamente adyacentes entre sí. Los fragmentos de las secuencias de nucleótidos codificarán fragmentos de proteína que retienen la actividad biológica de la proteína plaguicida y, por tanto, retienen la actividad plaguicida. Por tanto, también se describen fragmentos biológicamente activos de los polipéptidos. Por "retiene actividad" se entiende que el fragmento tendrá al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más de la actividad plaguicida de la proteína plaguicida. En diversas modalidades, la actividad puede mejorarse o ampliarse con respecto a una proteína plaguicida de referencia (por ejemplo, mejorarse o ampliarse con respecto a la actividad de la SEQ ID NO:) como se define en otra parte de la presente descripción. En una modalidad, la actividad plaguicida es la actividad coleoptericida. En otra modalidad, la actividad plaguicida es actividad lepidoptericida. En otra modalidad, la actividad plaguicida es actividad nematocida. En otra modalidad, la actividad plaguicida es actividad diptericida. En otra modalidad, la actividad plaguicida es actividad hemiptericida. Los métodos para medir la actividad plaguicida se conocen bien en la técnica. Ver, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol.

83:2480-2485; Andrews y otros (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone y otros (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y Patente de Estados Unidos núm. 5,743,477.

Un fragmento de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína plaguicida que codifica una porción biológicamente activa de una proteína codificará al menos aproximadamente 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en una proteína plaguicida de longitud completa de la invención. En algunos casos, el fragmento es un fragmento de escisión proteolítica. Por ejemplo, el fragmento de escisión proteolítica puede tener un truncamiento N-terminal o C-terminal de al menos aproximadamente 100 aminoácidos, aproximadamente 120, aproximadamente 130, aproximadamente 140, aproximadamente 150, o aproximadamente 160 aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO:48 y 15-31. En algunas modalidades, los fragmentos descritos en la presente descripción resultan de la eliminación del dominio de cristalización C-terminal, por ejemplo, mediante proteólisis o mediante la inserción de un codón de terminación en la secuencia codificante. En otros casos, la proteína de fusión comprende un fragmento del dominio C-terminal de SEQ ID NO:43 y/o un fragmento del dominio N-terminal de SEQ ID ⁿO:45.

Las proteínas plaguicidas preferidas de la presente invención se codifican por una secuencia de nucleótidos suficientemente idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7, o las proteínas plaguicidas son suficientemente idénticas a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 21. En otro caso, la secuencia de nucleótidos codifica una proteína de fusión, en donde la porción N-terminal es suficientemente idéntica a la porción N-terminal de SEQ ID ⁿO:45, o en donde la porción N-terminal es suficientemente idéntica a la porción N-terminal de SEQ ID NO:45 y la porción C-terminal es suficientemente idéntica a SEQ ID NO:43. Por "suficientemente idéntico" se entiende una secuencia de aminoácidos o nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 60 % o 65 % de identidad de secuencia, aproximadamente 70 % o 75 % de identidad de secuencia, aproximadamente 80 % u 85 % de identidad de secuencia, aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mayor de identidad de secuencia en comparación con una secuencia de referencia mediante el uso de uno de los programas de alineación descritos en la presente descripción mediante el uso de parámetros estándar. Un experto en la técnica reconocerá que estos valores pueden ajustarse apropiadamente para determinar la identidad correspondiente de proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos al tener en cuenta la degeneración de codones, similitud de aminoácidos, posicionamiento del marco de lectura, y similares.

Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos, las secuencias se alinean con fines de comparación óptimos. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, porcentaje de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (por ejemplo, posiciones solapadas) x 100). En un caso, las dos secuencias tienen la misma longitud. En otro caso, el porcentaje de identidad se calcula en la totalidad de la secuencia de referencia (es decir, la secuencia descrita en la presente descripción como cualquiera de las SEQ ID NO: 1-31, 47 o 48). El porcentaje de identidad entre dos secuencias puede determinarse mediante el uso de técnicas similares a las que se describen más abajo, con o sin dejar interrupciones. Al calcular el porcentaje de identidad, típicamente se cuentan las coincidencias exactas. Una interrupción, es decir, una posición en una alineación donde un residuo está presente en una secuencia pero no en la otra, se considera una posición con residuos no idénticos.

La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede lograrse mediante el uso de un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Tal algoritmo se incorpora en los programas BLASTN y BLASTX de Altschul y otros (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Las búsquedas de nucleótidos de BLAST pueden realizarse con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico de tipo plaguicida de la invención. Las búsquedas de proteínas de BLAST pueden realizarse con el programa BLASTX, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteínas plaguicidas de la invención. Para obtener alineaciones con interrupciones con fines de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST (en BLAST 2.0) como se describe en Altschul y otros (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, puede usarse PSI-Blast para realizar una búsqueda iterada que detecta relaciones distantes entre moléculas. Ver Altschul y otros (1997) supra. Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST, y PSI-Blast, pueden usarse los parámetros predeterminados de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTX y BLASTN). La alineación también puede realizarse manualmente mediante inspección.

Otro ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo ClustalW (Higgins y otros (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). ClustalW compara secuencias y alinea la totalidad de la secuencia de aminoácidos o de ADN y, por lo tanto, puede proporcionar datos sobre la conservación de la secuencia de toda la secuencia de aminoácidos. El algoritmo ClustalW se usa en varios paquetes de software de análisis de ADN/aminoácidos disponibles comercialmente, tal como el módulo ALIGNX de Vector NTI Program Suite (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Después de la alineación de las secuencias de aminoácidos con ClustalW, puede evaluarse el porcentaje de identidad de aminoácidos. Un ejemplo no limitante de un programa de software útil para el análisis de alineaciones con ClustalW es GENEDOC™. G^eN^eDOC™ (Karl Nicholas) permite la evaluación de la similitud e identidad de aminoácidos (o ADN) entre múltiples proteínas. Otro ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4:11-17. Tal algoritmo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0), que es parte del GCG Wisconsin Genetics Software Package, versión 10 (disponible en Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, CA, EE. UU.). Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, puede usarse una tabla de residuos en peso PAM120, una penalización de longitud de interrupción de 12, y una penalización de interrupción de 4.

A menos que se indique lo contrario, GAP versión 10, que usa el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453, se usará para determinar la identidad o similitud de secuencia mediante el uso de los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos mediante el uso de peso de interrupción de 50 y peso de longitud de 3, y la matriz de puntuación nwsgapdna.cmp; % de identidad o % de similitud para una secuencia de aminoácidos mediante el uso de un peso de interrupción de 8 y un peso de longitud de 2, y el programa de puntuación BLOSUM62. También pueden usarse programas equivalentes. Por "programa equivalente" se entiende cualquier programa de comparación de secuencias que, para cualesquiera dos secuencias en cuestión, genere una alineación que tenga coincidencias idénticas de residuos de nucleótidos y un porcentaje de identidad de secuencia idéntico en comparación con la alineación correspondiente generada por GAP versión 10.

La invención también incluye variantes de moléculas de ácido nucleico. Las "variantes" de las secuencias de nucleótidos que codifican la proteína plaguicida incluyen aquellas secuencias que codifican las proteínas plaguicidas descritas en la presente descripción pero que difieren conservadoramente debido a la degeneración del código genético así como también aquellas que son suficientemente idénticas como se discutió anteriormente. Las variantes alélicas de origen natural pueden identificarse con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y las técnicas de hibridación como se describe más abajo. Las variantes de secuencias de nucleótidos también incluyen secuencias de nucleótidos derivadas sintéticamente que se generaron, por ejemplo, mediante el uso de mutagénesis dirigida al sitio pero que todavía codifican las proteínas plaguicidas descritas en la presente invención como se describe más abajo. Las variantes de proteínas abarcadas por la presente invención son biológicamente activas, es decir, aún poseen la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, actividad plaguicida. Por "retiene la actividad" se pretende que la variante tenga al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 70 %, o al menos aproximadamente un 80 % de la actividad plaguicida de la proteína nativa. En algunas modalidades, la actividad se mejora o se extiende con respecto a una proteína de referencia como se define en otra parte de la presente descripción. Los métodos para medir la actividad plaguicida se conocen bien en la técnica. Ver, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485; Andrews y otros (1988) Biochem. J. 252: 199-206; Marrone y otros (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y Patente de Estados Unidos núm. 5,743,477.

El experto en la técnica apreciará, además, que pueden introducirse cambios mediante la mutación de las secuencias de nucleótidos de la invención, lo que conduce a cambios en la secuencia de aminoácidos de las proteínas plaguicidas codificadas, sin alterar la actividad biológica de las proteínas. Por lo tanto, pueden crearse variantes de moléculas de ácido nucleico aisladas de la invención mediante la introducción de una o más sustituciones, adiciones, o deleciones de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos correspondiente descrita en la presente descripción, de manera tal que se introduzcan de una a cinco sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos en la proteína codificada. Las mutaciones pueden introducirse mediante técnicas estándar, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Una variante de secuencia de nucleótidos abarcada por la presente invención se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende de una a cinco sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos con respecto a SEQ ID NO: 21.

Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones conservadoras de aminoácidos en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales predichos. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede alterarse de la secuencia de tipo salvaje de una proteína plaguicida sin alterar la actividad biológica, mientras que se requiere un residuo de aminoácido "esencial" para la actividad biológica. Una "sustitución de aminoácidos conservadora" es aquella en la que el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se definen familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

Pueden realizarse sustituciones de aminoácidos en regiones no conservadas que retienen la función. En general, tales sustituciones no se realizarían para residuos de aminoácidos conservados, o para residuos de aminoácidos que residen dentro de un resto conservado, donde tales residuos son esenciales para la actividad de la proteína. Ejemplos de residuos que son conservados y que pueden ser esenciales para la actividad proteica incluyen, por ejemplo, residuos que son idénticos entre todas las proteínas contenidas en una alineación de toxinas similares o relacionadas con las secuencias de la invención (por ejemplo, residuos que son idénticos en una alineación de proteínas homólogas). Ejemplos de residuos que son conservados pero que pueden permitir sustituciones conservadoras de aminoácidos y aún retener la actividad incluyen, por ejemplo, residuos que solamente tienen sustituciones conservadoras entre todas las proteínas contenidas en una alineación de toxinas similares o relacionadas con las secuencias de la invención (por ejemplo, residuos que solamente tienen sustituciones conservadoras entre todas las proteínas contenidas en las proteínas homólogas de alineación). Sin embargo, un experto en la técnica entendería que las variantes funcionales pueden tener alteraciones menores conservadas o no conservadas en los residuos conservados.

Alternativamente, pueden prepararse variantes de secuencias de nucleótidos mediante la introducción de mutaciones aleatoriamente a lo largo de toda o parte de la secuencia codificante, tal como mediante mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden cribarse para determinar la capacidad de conferir actividad plaguicida para identificar mutantes que retienen la actividad. Después de la mutagénesis, la proteína codificada puede expresarse recombinantemente, y la actividad de la proteína puede determinarse mediante el uso de técnicas de ensayo estándar.

Mediante el uso de métodos tales como PCR, hibridación, y similares pueden identificarse las secuencias plaguicidas correspondientes, tales secuencias tienen una identidad sustancial con las secuencias de la invención. Ver, por ejemplo, Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Ny ) y Innis, y otros (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY).

En un método de hibridación, la totalidad o parte de la secuencia de nucleótidos plaguicida puede usarse para cribar bibliotecas de ADNc o genómicas. Los métodos para la construcción de tales bibliotecas de ADNc y genómicas se conocen generalmente en la técnica y se describen en Sambrook y Russell, 2001, supra. Las denominadas sondas de hibridación pueden ser fragmentos genómicos de ADN, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN, u otros oligonucleótidos, y pueden marcarse con un grupo detectable tal como P32, o cualquier otro marcador detectable, tal como otros radioisótopos, un compuesto fluorescente, una enzima, o un cofactor enzimático. Las sondas para la hibridación pueden prepararse mediante el marcaje de oligonucleótidos sintéticos basados en la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína plaguicida conocida descrita en la presente descripción. Pueden usarse adicionalmente cebadores degenerados diseñados sobre la base de nucleótidos o residuos de aminoácidos conservados en la secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos codificada. La sonda típicamente comprende una región de secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas con al menos aproximadamente 12, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 50, 75, 100, 125, 150, 175, o 200 nucleótidos consecutivos de secuencia de nucleótidos que codifican una proteína plaguicida de la invención o un fragmento o variante de esta. Los métodos para la preparación de sondas para la hibridación se conocen generalmente en la técnica y se describen en Sambrook y Russell, 2001, supra.

Por ejemplo, una secuencia plaguicida completa descrita en la presente descripción, o una o más porciones de esta, puede usarse como una sonda capaz de hibridar específicamente con secuencias similares a proteínas plaguicidas y ARN mensajeros correspondientes. Para lograr la hibridación específica en una variedad de condiciones, tales sondas incluyen secuencias que son únicas y, preferentemente, tienen al menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud, o al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. Estas sondas pueden usarse para amplificar las secuencias plaguicidas correspondientes de un organismo elegido mediante PCR. Esta técnica puede usarse para aislar secuencias codificantes adicionales de un organismo deseado o como un ensayo de diagnóstico para determinar la presencia de secuencias codificantes en un organismo. Las técnicas de hibridación incluyen el cribado por hibridación de bibliotecas de ADN en placa (placas o colonias; ver, por ejemplo, Sambrook y otros (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2da ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York).

Por lo tanto, la presente invención describe sondas para hibridación, así como también secuencias de nucleótidos capaces de hibridar con la totalidad o una porción de una secuencia de nucleótidos de la invención (por ejemplo, al menos aproximadamente 300 nucleótidos, al menos aproximadamente 400, al menos aproximadamente 500, 1000, 1200, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, o hasta la longitud completa de una secuencia de nucleótidos descrita en la presente descripción). La hibridación de tales secuencias puede llevarse a cabo en condiciones rigurosas. Por "condiciones rigurosas" o "condiciones rigurosas de hibridación" se entienden las condiciones en las que una sonda se hibridará con su secuencia objetivo en un grado detectablemente mayor que con otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces más que el fondo). Las condiciones estrictas dependen de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Controlando la rigurosidad de las condiciones de hibridación y/o lavado, pueden identificarse secuencias objetivo que son 100 % complementarias a la sonda (hibridación de sondas homóloga). Alternativamente, las condiciones de rigurosidad pueden ajustarse para permitir algún desajuste en las secuencias de manera que se detecten grados más bajos de similitud (hibridación de sondas heteróloga). Generalmente, una sonda tiene menos de aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, preferentemente, menos de 500 nucleótidos de longitud.

Típicamente, las condiciones rigurosas serán aquellas en las que la concentración de sal sea inferior a aproximadamente 1,5 M de iones de Na, típicamente aproximadamente de 0,01 a 1,0 M de concentración de iones de Na (u otras sales) a un pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura sea de al menos aproximadamente 30 °C para sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60 °C para sondas largas (por ejemplo, más de 50 nucleótidos). También pueden lograrse condiciones rigurosas con la adición de agentes desestabilizadores tales como formamida. Las condiciones de bajo rigor ejemplares incluyen la hibridación con una solución tampón de formamida del 30 al 35 %, NaCl 1 M, SDS (dodecil sulfato de sodio) al 1 % a 37 °C y un lavado de SSC de I X a 2 X (SSC 20 X = NaCl 3,0 M/citrato trisódico 0,3 M) a 50 a 55 °C. Las condiciones de rigurosidad moderada ejemplares incluyen la hibridación en formamida del 40 al 45 %, NaCl 1,0 M, SDS al 1 % a 37 °C y un lavado en SSC de 0,5 X a I X de 55 a 60 °C. Las condiciones de alta rigurosidad ejemplares incluyen la hibridación en formamida al 50 %, NaCl 1 M, SDS al 1 % a 37 °C y un lavado en SSC 0,1 X de 60 a 65 °C. Opcionalmente, los tampones de lavado pueden comprender de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 1 % de SDS. La duración de la hibridación es generalmente menor de aproximadamente 24 horas, normalmente de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas.

La especificidad es típicamente la función de los lavados posteriores a la hibridación, los factores críticos son la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para los híbridos de ADN-ADN, la T^mpuede determinarse aproximadamente a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: T^m= 81,5 °C 16,6 (log M) 0,41 (% de GC) - 0,61 (% de form) - 500/L; donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, % de GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % de form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La T^mes la temperatura (bajo una fuerza iónica y un pH definidos) a la que el 50 % de una secuencia objetivo complementaria se hibrida con una sonda perfectamente emparejada. La T^mse reduce en aproximadamente 1 °C por cada 1 % de desajuste; por lo tanto, las condiciones de T^m,hibridación y/o lavado pueden ajustarse para hibridar con secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con una identidad >90 %, la T^mpuede reducirse 10 °C. Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 5 °C más bajas que el punto de fusión térmico (T^m) para la secuencia específica y su complemento a una fuerza iónica y un pH definidos. Sin embargo, las condiciones severamente rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1, 2, 3, o 4 °C más baja que el punto de fusión térmico (T^m); condiciones moderadamente rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9, o 10 °C más baja que el punto de fusión térmico (T^m); condiciones de baja rigurosidad pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 11, 12, 13, 14, 15, o 20 °C más baja que el punto de fusión térmico (T^m). Mediante el uso de la ecuación, de las composiciones de hibridación y lavado, y de la T^mdeseada^,los expertos en la técnica entenderán que las variaciones en la rigurosidad de las soluciones de hibridación y/o lavado se describen inherentemente. Si el grado deseado del desajuste resulta en una T^mde menos de 45 °C (solución acuosa) o 32 °C (solución de formamida), se prefiere aumentar la concentración de SSC de manera que una temperatura más alta puede usarse. Una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, parte I, capítulo 2 (Elsevier, Nueva York); y Ausubel y otros, eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, capítulo 2 (Greene Publishing y Wiley-Interscience, Nueva York). Ver Sambrook y otros (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2da ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York).

Proteínas aisladas y variantes y fragmentos de estas

Las proteínas plaguicidas también se incluyen en la presente invención. Por "proteína plaguicida" se entiende una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 21. También se describen fragmentos, porciones biológicamente activas y variantes de estas. Una "proteína aislada" o una "proteína recombinante" se usa para hacer referencia a una proteína que ya no se encuentra en su entorno natural, por ejemplo, in vitro o en una célula huésped bacteriana o vegetal recombinante.

Los "fragmentos" o "porciones biológicamente activas" incluyen fragmentos de polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente idénticas a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 21, y que exhiben actividad plaguicida. Una porción biológicamente activa de una proteína plaguicida puede ser un polipéptido que tiene, por ejemplo, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350 o más aminoácidos de longitud. Tales porciones biológicamente activas pueden prepararse mediante técnicas recombinantes y evaluarse su actividad plaguicida. Los métodos para medir la actividad plaguicida se conocen bien en la técnica. Ver, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews y otros (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone y otros (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y patente de Estados Unidos núm. 5,743,477. Como se describe aquí, un fragmento comprende al menos 8 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 48 y 15-31. La invención describe otros fragmentos, sin embargo, tales como cualquier fragmento en la proteína mayor de aproximadamente 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350 o más aminoácidos de longitud.

Por "variantes" se entienden proteínas o polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que comprende de una a cinco sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21. Los métodos para medir la actividad plaguicida se conocen bien en la técnica. Ver, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews y otros (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone y otros (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y patente de Estados Unidos núm. 5,743,477.

Los genes bacterianos, tales como los genes axmi de esta invención, poseen con bastante frecuencia múltiples codones de iniciación de metionina en las proximidades del inicio del marco abierto de lectura. A menudo, el inicio de la traducción en uno o más de estos codones de inicio conducirá a la generación de una proteína funcional. Estos codones de inicio pueden incluir codones ATG. Sin embargo, bacterias como Bacillus sp. también reconocen el codón GTG como un codón de inicio, y las proteínas que inician la traducción en los codones GTG contienen una metionina en el primer aminoácido. En raras ocasiones, la traducción en sistemas bacterianos puede iniciarse en un codón TTG, aunque en este caso el TTG codifica una metionina. Además, a menudo no se determina a priori cuáles de estos codones se usan de forma natural en la bacteria. Por tanto, se entiende que el uso de uno de los codones de metionina alternativos también puede conducir a la generación de proteínas plaguicidas. Estas proteínas plaguicidas se incluyen en la presente invención y pueden usarse en los métodos de la presente invención. Se entenderá que, cuando se expresa en plantas, será necesario alterar el codón de inicio alternativo a ATG para una traducción adecuada.

También se describen anticuerpos contra los polipéptidos de la presente invención, o contra variantes o fragmentos de estos. Los métodos para producir anticuerpos se conocen bien en la técnica (ver, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; patente de Estados Unidos núm. 4,196,265).

Variantes alteradas o mejoradas

Se reconoce que las secuencias de ADN de una proteína plaguicida pueden alterarse mediante varios métodos, y que estas alteraciones pueden dar como resultado secuencias de ADN que codifiquen proteínas con secuencias de aminoácidos diferentes a las codificadas por una proteína plaguicida de la presente invención. Esta proteína puede alterarse de varias formas, que incluyen sustituciones de aminoácidos, deleciones, truncamientos, e inserciones de uno a cinco aminoácidos de SEQ ID NO: 21, que incluyen hasta aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos dentro de la porción C-terminal o la porción N-terminal, o ambas. Los métodos para tales manipulaciones se conocen generalmente en la técnica. Por ejemplo, pueden prepararse variantes de la secuencia de aminoácidos de una proteína plaguicida mediante mutaciones en el ADN. Esto también puede lograrse mediante una de varias formas de mutagénesis y/o en evolución dirigida. En algunos aspectos, los cambios codificados en la secuencia de aminoácidos no afectarán sustancialmente la función de la proteína. Tales variantes poseerán la actividad plaguicida deseada. Sin embargo, se entiende que la capacidad de una proteína plaguicida para conferir actividad plaguicida puede mejorarse mediante el uso de tales técnicas en las composiciones de esta invención. Por ejemplo, puede expresarse una proteína plaguicida en células huésped que exhiben altas tasas de incorporación errónea de bases durante la replicación del ADN, como XL-1 Red (Stratagene, La Jolla, CA). Después de la propagación en tales cepas, puede aislarse el ADN (por ejemplo, mediante la preparación de ADN plasmídico, o mediante la amplificación por PCR y clonación del fragmento de PCR resultante en un vector), cultivar las mutaciones de la proteína plaguicida en una cepa no mutagénica, e identificar los genes mutados con actividad plaguicida, por ejemplo, mediante la realización de un ensayo para probar la actividad plaguicida. Generalmente, la proteína se mezcla y se usa en ensayos de alimentación. Ver, por ejemplo Marrone y otros (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293. Tales ensayos pueden incluir poner en contacto plantas con una o más plagas y determinar la capacidad de la planta para sobrevivir y/o causar la muerte de las plagas. En Schnepf y otros (1998) Microbiol. Mol. Biol Rev.62:775-806.

Alternativamente, se describen alteraciones que pueden realizarse en la secuencia de proteínas de muchas proteínas en el extremo amino o carboxi sin afectar sustancialmente a la actividad. Esto puede incluir inserciones, deleciones, o alteraciones introducidas por métodos moleculares modernos, como PCR, que incluyen las amplificaciones por PCR que alteran o extienden la secuencia codificante de proteínas en virtud de la inclusión de secuencias codificantes de aminoácidos en los oligonucleótidos utilizados en la amplificación por PCR. Alternativamente, las secuencias de proteínas adicionadas pueden incluir secuencias codificantes de proteínas completas, tales como las que se usan comúnmente en la técnica para generar fusiones de proteínas. Tales proteínas de fusión se usan a menudo para (1) aumentar la expresión de una proteína de interés (2) introducir un dominio de unión, actividad enzimática, o epítopo para facilitar la purificación de proteínas, la detección de proteínas u otros usos experimentales conocidos en la técnica (3) dirigir la secreción o traducción de una proteína a un orgánulo subcelular, tal como el espacio periplásmico de las bacterias Gram negativas, o el retículo endoplásmico de las células eucariotas, el último de los cuales a menudo da como resultado la glicosilación de la proteína.

Las variantes de secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la presente invención también abarcan secuencias derivadas de procedimientos mutagénicos y recombinogénicos tales como el barajado de ADN. Con tal procedimiento, pueden usarse una o más regiones codificantes de proteínas plaguicidas diferentes para crear una nueva proteína plaguicida que posea las propiedades deseadas. De esta manera, se generan bibliotecas de polinucleótidos recombinantes a partir de una población de polinucleótidos de secuencia relacionada que comprenden regiones de secuencia que tienen una identidad de secuencia sustancial y pueden recombinarse de forma homóloga in vitro o in vivo. Por ejemplo, mediante el uso de este enfoque, los motivos de secuencia que codifican un dominio de interés pueden barajarse entre un gen plaguicida de la invención y otros genes plaguicidas conocidos para obtener un nuevo gen que codifica una proteína con una propiedad de interés mejorada, tal como una actividad insecticida aumentada. Se conocen en la técnica estrategias para tal barajado de ADN. Ver, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri y otros (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore y otros (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang y otros (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri y otros (1998) Nature 391:288-291; y patente de Estados Unidos núm. 5,605,793 y 5,837,458.

El intercambio o barajado de dominios es otro mecanismo para generar proteínas plaguicidas alteradas. Los dominios pueden intercambiarse entre proteínas plaguicidas, lo que da como resultado toxinas híbridas o quiméricas con una actividad plaguicida o un espectro objetivo mejorados. Los métodos para generar proteínas recombinantes y probar su actividad plaguicida se conocen bien en la técnica (ver, por ejemplo, Naimov y otros (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328-5330; de Maagd y otros (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543; Ge y otros (1991) J. Biol. Chem. 266:17954-17958; Schnepf y otros (1990) J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Rang y otros 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918-2925).

Por lo tanto, en varios casos, las secuencias de ácido nucleico descritas en la presente descripción (así como también las composiciones, vectores, células huésped, plantas, y semillas que comprenden la secuencia de ácido nucleico) comprenden una porción de una o más toxinas y una porción de una de las toxinas más diferentes. En un caso, la secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la parte N-terminal de Axmi005 (que se establece en SEQ ID NO:45) y la parte C-terminal de Axmi1 15 (que se establece en SEQ ID NO:43). En casos específicos, la porción N-terminal de Axmi005 comprende de aproximadamente los residuos de aminoácidos 1 a 173, o de aproximadamente los residuos de aminoácidos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50 hasta aproximadamente el residuo de aminoácido 150, 155, 160, 165, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 250, 300, 325, o 350 de Axmi005 y la porción C-terminal de Axmi115 comprende de aproximadamente el residuo de aminoácido 174 hasta aproximadamente el residuo de aminoácido 803 de Axmi1 15, o de aproximadamente el residuo de aminoácido 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 250, 300, 325, o 350 hasta aproximadamente el residuo de aminoácido 600, 650, 700, 750, 760, 770, 780, 790, 795, 796, 797, 798, 799, 800, 801, 802, u 803. Un experto en la técnica reconocerá que pueden producirse variantes y deleciones menores dentro de cada una de las secuencias de aminoácidos y aún retener (o mejorar) la actividad de la proteína de fusión. En algunos casos, las secuencias de ácido nucleico codifican una proteína de fusión Axmi005/Axmi115 con una mutación (con respecto a la región correspondiente de la proteína madre Axmi005 o Axmi1 15) en una o más de las posiciones correspondientes a los residuos de aminoácidos en las posiciones 584, 588, y 771 con respecto a SEQ ID NO:43 (ver, por ejemplo, la variante de secuencia de fusión encontrada en SEQ ID NO:21). En otras modalidades, la secuencia de nucleótidos incluida en la presente descripción se establece en cualquiera de SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos se establece en cualquiera de SEQ ID NO: 21.

En diversas modalidades, la fusión de Axmi005 con Axmi1 15 da como resultado una secuencia de aminoácidos que tiene una actividad mejorada o extendida en comparación con la actividad de Axmi005 o Axmi1 15 solas. Por actividad "mejorada" se entiende un aumento en la muerte de al menos una plaga, o un aumento en la reducción notable del crecimiento, alimentación, o desarrollo fisiológico normal de la plaga con respecto a la proteína nativa. Por actividad "extendida" se entiende la actividad contra una plaga que no se demuestra por Axmi005 y Axmi1 15. Por ejemplo, la fusión de una porción de Axmi005 con una porción de Axmi1 15 podría resultar en una sola proteína que tenga el perfil de actividad de Axmi005 y Axmi1 15. En algunas modalidades, la actividad contra una plaga individual se mejora en la proteína de fusión con respecto a una o ambas de Axmi005 y/o Axmi1 15.

Vectores

Puede proporcionarse una secuencia plaguicida de la invención en un casete de expresión para expresión en una planta de interés. Por "casete de expresión en plantas" se entiende una construcción de ADN que es capaz de dar como resultado la expresión de una proteína a partir de un marco de lectura abierto en una célula vegetal. Típicamente estos contienen un promotor y una secuencia codificante. A menudo, tales construcciones también contendrán una región no traducida 3'. Tales construcciones pueden contener una "secuencia señal" o "secuencia líder" para facilitar el transporte cotraduccional o postraduccional del péptido a ciertas estructuras intracelulares tales como el cloroplasto (u otro plastidio), retículo endoplásmico, o aparato de Golgi.

Por "secuencia señal" se entiende una secuencia que se sabe o se sospecha que da como resultado un transporte de péptidos cotraduccional o postraduccional a través de la membrana celular. En eucariotas, esto típicamente implica secreción en el aparato de Golgi, con algo de glicosilación resultante. Las toxinas insecticidas de las bacterias a menudo se sintetizan como protoxinas, que se activan protolíticamente en el intestino de la plaga objetivo (Chang (1987) Methods Enzymol. 153:507-516). En algunas modalidades de la presente invención, la secuencia señal se localiza en la secuencia nativa o puede derivarse de una secuencia de la invención. Por "secuencia líder" se entiende cualquier secuencia que, cuando se traduce, da como resultado una secuencia de aminoácidos suficiente para desencadenar el transporte cotraduccional de la cadena peptídica a un orgánulo subcelular. Por tanto, esto incluye secuencias líder que dirigen al transporte y/o glicosilación por el paso al retículo endoplásmico, paso a vacuolas, plastidios que incluyen cloroplastos, mitocondrias, y similares.

Por "vector de transformación en plantas" se entiende una molécula de ADN que es necesaria para la transformación eficiente de una célula vegetal. Tal molécula puede consistir en uno o más casetes de expresión de plantas y puede organizarse en más de una molécula de ADN "vector". Por ejemplo, los vectores binarios son vectores de transformación de plantas que utilizan dos vectores de ADN no contiguos para codificar todas las funciones de actuación cis y trans necesarias para la transformación de células vegetales (Hellens y Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). "Vector" se refiere a una construcción de ácido nucleico diseñada para la transferencia entre diferentes células huésped. "Vector de expresión" se refiere a un vector que tiene la capacidad de incorporar, integrar y expresar secuencias o fragmentos de ADN heterólogos en una célula extraña. El casete incluirá secuencias reguladoras 5' y/o 3' unidas operativamente a una secuencia de la invención. Por "unida operativamente" se entiende un enlace funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en donde la secuencia del promotor inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN correspondiente a la segunda secuencia. Generalmente, unida operativamente significa que las secuencias de ácido nucleico que se enlazan son contiguas y, cuando sea necesario para unir dos regiones codificantes de proteínas, contiguas y en el mismo marco de lectura. El casete puede contener adicionalmente al menos un gen adicional para ser cotransformado en el organismo. Alternativamente, los genes adicionales pueden proporcionarse en múltiples casetes de expresión. En varias modalidades, la secuencia de nucleótidos de la invención se une operativamente a un promotor, por ejemplo, un promotor vegetal. "Promotor" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que funciona para dirigir la transcripción de una secuencia codificante corriente abajo. El promotor junto con otras secuencias de ácido nucleico reguladoras de la transcripción y traducción (también denominadas "secuencias de control") son necesarios para la expresión de una secuencia de ADN de interés.

Tal casete de expresión está provisto de una pluralidad de sitios de restricción para que la inserción de la secuencia plaguicida esté bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras.

El casete de expresión incluirá en la dirección 5'-3' de la transcripción, una región de inicio de la transcripción y de la traducción (es decir, un promotor), una secuencia de ADN de la invención, y una región de terminación de la transcripción y de la traducción (es decir, una región de terminación) funcional en plantas. El promotor puede ser nativo o análogo, o extraño o heterólogo, a la planta huésped y/o a la secuencia de ADN de la invención. Adicionalmente, el promotor puede ser la secuencia natural o alternativamente una secuencia sintética. Cuando el promotor es "nativo" u "homólogo" a la planta huésped, se pretende que el promotor se encuentre en la planta nativa en la que se introduce el promotor. Cuando el promotor es "extraño" o "heterólogo" a la secuencia de ADN de la invención, se pretende que el promotor no sea el promotor nativo o natural de la secuencia de ADN unida operativamente de la invención.

La región de terminación puede ser nativa con la región de inicio de la transcripción, puede ser nativa con la secuencia de ADN unida operativamente de interés, puede ser nativa con la planta huésped o puede derivarse de otra fuente (es decir, extraña o heteróloga para el promotor, la secuencia de ADN de interés, la planta huésped, o cualquier combinación de estos). Regiones de terminación convenientes están disponibles a partir del plásmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminación de la octopina sintasa y nopalina sintasa. Ver también Guerineau y otros (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon y otros (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen y otros (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe y otros (1990) Gene 91:151-158; Ballas y otros (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; and Joshi y otros (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.

Cuando sea apropiado, el gen o genes pueden optimizarse para aumentar la expresión en la célula huésped transformada. Es decir, los genes pueden sintetizarse mediante el uso de codones preferidos por la célula huésped para mejorar la expresión, o pueden sintetizarse mediante el uso de codones en una frecuencia de uso de codones preferida por el huésped. Generalmente, aumentará el contenido de GC del gen. Ver, por ejemplo, Campbell y Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 para una discusión sobre el uso de codones preferido por el huésped. Hay métodos disponibles en la técnica para sintetizar genes preferidos por plantas. Ver, por ejemplo, patentes de EE. UU. núm.

5,380,831, y 5,436,391, publicación de patente de EE. UU. núm. 20090137409, y Murray y otros (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498.

En una modalidad, la proteína plaguicida se dirige al cloroplasto para su expresión. De esta manera, cuando la proteína plaguicida no se inserta directamente en el cloroplasto, el casete de expresión contendrá adicionalmente un ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito para dirigir la proteína plaguicida a los cloroplastos. Tales péptidos de tránsito se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, Von Heijne y otros (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark y otros (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa y otros (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer y otros (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; y Shah y otros (1986) Science 233:478-481.

El gen plaguicida que se dirigirá al cloroplasto puede optimizarse para la expresión en el cloroplasto para tener en cuenta las diferencias en el uso de codones entre el núcleo de la planta y este orgánulo. De esta manera, los ácidos nucleicos de interés pueden sintetizarse mediante el uso de codones preferidos del cloroplasto. Ver, por ejemplo, la patente de EE. UU. núm. 5,380,831.

Transformación de plantas

Los métodos de la invención implican la introducción de una construcción de nucleótidos en una planta. Por "introducir" se pretende presentar a la planta la construcción de nucleótidos de manera tal que la construcción obtenga acceso al interior de una célula de la planta. Los métodos de la invención no requieren que se use un método particular para introducir una construcción de nucleótidos en una planta, solo que la construcción de nucleótidos obtenga acceso al interior de al menos una célula de la planta. Se conocen en la técnica métodos para introducir construcciones de nucleótidos en plantas que incluyen, pero no se limitan a, métodos de transformación estable, métodos de transformación transitoria, y métodos mediados por virus.

Por "planta" se entienden plantas enteras, órganos vegetales (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semillas, células vegetales, propágulos, embriones y progenie de los mismos. Las células vegetales pueden ser diferenciadas o indiferenciadas (por ejemplo, callos, células de cultivo en suspensión, protoplastos, células de hojas, células de raíces, células de floema, polen).

"Plantas transgénicas" o "plantas transformadas" o plantas, células o tejidos "transformados de forma estable" se refieren a plantas que incorporaron o integraron secuencias de ácidos nucleicos o fragmentos de ADN exógenos en la célula vegetal. Estas secuencias de ácido nucleico incluyen aquellas que son exógenas o no están presentes en la célula vegetal no transformada, así como también aquellas que pueden ser endógenas o están presentes en la célula vegetal no transformada. "Heteróloga" generalmente se refiere a las secuencias de ácido nucleico que no son endógenas a la célula o parte del genoma nativo en el que están presentes, y que se adicionaron a la célula mediante infección, transfección, microinyección, electroporación, microproyección, o similares.

Las plantas transgénicas de la invención expresan una o más de las nuevas secuencias de toxinas descritas en la presente descripción. En diversas modalidades, la planta transgénica comprende, además, uno o más genes adicionales para la resistencia a insectos (por ejemplo, Cry1, tales como los miembros de las familias Cry1A, Cry1B, Cry1C, Cry1D, CrylE, y CrylF; Cry2, tales como los miembros de la familia Cry2A; Cry9, tales como los miembros de las familias Cry9A, Cry9B, Cry9C, Cry9D, Cry9E, y Cry9F; etc.). Un experto en la técnica entenderá que la planta transgénica puede comprender cualquier gen que imparta un rasgo agronómico de interés.

La transformación de células vegetales puede lograrse mediante una de varias técnicas conocidas en la técnica. El gen plaguicida de la invención puede modificarse para obtener o mejorar la expresión en células vegetales. Típicamente una construcción que expresa tal proteína contendría un promotor para impulsar la transcripción del gen, así como también una región no traducida 3' para permitir la terminación de la transcripción y la poliadenilación. La organización de tales construcciones se conoce bien en la técnica. En algunos casos, puede ser útil manipular el gen de manera tal que el péptido resultante se secrete, o se dirija de otro modo dentro de la célula vegetal. Por ejemplo, el gen puede diseñarse para que contenga un péptido señal para facilitar la transferencia del péptido al retículo endoplásmico. También puede ser preferible manipular el casete de expresión de la planta para que contenga un intrón, de manera tal que se requiere el procesamiento de ARNm del intrón para la expresión.

Típicamente este "casete de expresión en plantas" se insertará en un "vector de transformación de plantas". Este vector de transformación de plantas puede estar compuesto por uno o más vectores de ADN necesarios para lograr la transformación de plantas. Por ejemplo, es una práctica común en la técnica utilizar vectores de transformación de plantas que se componen de más de un segmento de ADN contiguo. Estos vectores se denominan a menudo en la técnica "vectores binarios". Los vectores binarios, así como también los vectores con plásmidos auxiliares, se usan con mayor frecuencia para la transformación mediada por Agrobacterium, donde el tamaño y la complejidad de los segmentos de ADN necesarios para lograr una transformación eficiente es bastante grande, y es ventajoso separar funciones en moléculas de ADN separadas. Los vectores binarios normalmente contienen un vector plasmídico que contiene las secuencias que actúan en cis necesarias para la transferencia de T-DNA (tal como el borde izquierdo y el borde derecho), un marcador seleccionable que se diseña genéticamente para ser capaz de expresarse en una célula vegetal, y un "gen de interés" (un gen diseñado genéticamente para ser capaz de expresarse en una célula vegetal para la que se desea la generación de plantas transgénicas). También están presentes en este vector plasmídico las secuencias necesarias para la replicación bacteriana. Las secuencias que actúan en cis están dispuestas de manera que permitan una transferencia eficiente a las células vegetales y la expresión en las mismas. Por ejemplo, el gen marcador seleccionable y el gen plaguicida se ubican entre los bordes izquierdo y derecho. A menudo un segundo vector plasmídico contiene los factores que actúan en trans que median la transferencia de T-DNA desde Agrobacterium a las células vegetales. Este plásmido a menudo contiene las funciones de virulencia (genes Vir) que permiten la infección de células vegetales por Agrobacterium, y la transferencia de ADN por escisión en las secuencias bordes y la transferencia de ADN mediada por vir, como se entiende en la técnica (Hellens y Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). Pueden usarse varios tipos de cepas de Agrobacterium (por ejemplo, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) para la transformación de plantas. El segundo vector plasmídico no es necesario para transformar las plantas por otros métodos como microproyección, microinyección, electroporación, polietilenglicol, etc.

En general, los métodos de transformación de plantas implican la transferencia de ADN heterólogo a las células de la planta objetivo (por ejemplo, embriones inmaduros o maduros, cultivos en suspensión, callos indiferenciados, protoplastos, etc.), seguida de la aplicación de un nivel umbral máximo de selección apropiada (en dependencia del gen marcador seleccionable) para recuperar las células vegetales transformadas de un grupo de masa celular no transformada. Típicamente los explantes se transfieren a un suministro fresco del mismo medio y se cultivan rutinariamente. Subsecuentemente, las células transformadas se diferencian en brotes después de colocarlas en medio de regeneración complementado con un nivel umbral máximo de agente de selección. Después los brotes se transfieren a un medio de enraizamiento selectivo para recuperar brotes o plántulas enraizados. La plántula transgénica después se convierte en una planta madura y produce semillas fértiles (por ejemplo Hiei y otros (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida y otros (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Típicamente los explantes se transfieren a un suministro fresco del mismo medio y se cultivan rutinariamente. Una descripción general de las técnicas y métodos para generar plantas transgénicas se encuentra en Ayres y Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 y Bommineni y Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. Dado que el material transformado contiene muchas células; tanto las células transformadas como las no transformadas están presentes en cualquier pieza de callo o tejido objetivo sometido o grupo de células. La capacidad de matar células no transformadas y permitir que las células transformadas proliferen da como resultado cultivos de plantas transformadas. A menudo, la capacidad de eliminar células no transformadas es una limitación para la recuperación rápida de células vegetales transformadas y la generación exitosa de plantas transgénicas.

Los protocolos de transformación así como también los protocolos para introducir secuencias de nucleótidos en plantas pueden variar en dependencia del tipo de planta o célula vegetal, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea, destinada a la transformación. La generación de plantas transgénicas puede realizarse mediante uno de varios métodos, que incluyen, entre otros, microinyección, electroporación, transferencia directa de genes, introducción de ADN heterólogo por Agrobacterium en células vegetales (transformación mediada por Agrobacterium), bombardeo de células vegetales con ADN extraño heterólogo adherido a partículas, aceleración de partículas balísticas, transformación con haz de aerosol (solicitud publicada de EE. UU. núm. 20010026941; patente de EE. UU. núm.

4,945,050; publicación internacional núm. WO 91/00915; solicitud publicada de EE. UU. núm. 2002015066), transformación de Lecl y varios otros métodos de transferencia directa de ADN sin partículas.

Se conocen en la técnica métodos para la transformación de cloroplastos. Ver, por ejemplo, Svab y otros (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 87:8526-8530; Svab y Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 90:913-917; Svab y Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. El método se basa en el suministro de partículas con pistola de ADN que contiene un marcador seleccionable y el direccionamiento del ADN al genoma del plastidio mediante recombinación homóloga. Adicionalmente, la transformación de plastidios puede lograrse mediante la transactivación de un transgén silente transportado por plastidios mediante la expresión preferida por el tejido de una ARN polimerasa dirigida a plastidios y codificada por el núcleo. Este sistema se informó en McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305.

Después de la integración de ADN extraño heterólogo en células vegetales, se aplica un nivel de umbral máximo de selección apropiada en el medio para matar las células no transformadas y separar y proliferar las células supuestamente transformadas que sobreviven a este tratamiento de selección mediante la transferencia regular a un medio nuevo. Mediante el pase continuo y el desafío con la selección adecuada, se identifican y proliferan las células que se transforman con el vector plasmídico. Después pueden usarse métodos moleculares y bioquímicos para confirmar la presencia del gen heterólogo integrado de interés en el genoma de la planta transgénica.

Las células que se transforman pueden crecer a plantas de acuerdo con formas convencionales. Ver, por ejemplo, McCormick y otros (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Después estas plantas pueden cultivarse y polinizarse con la misma cepa transformada o con cepas diferentes, y puede identificarse el híbrido resultante que tiene la expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada. Pueden cultivarse dos o más generaciones para asegurar que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantiene y se hereda de manera estable y después se cosechan las semillas para asegurar que se logró la expresión de la característica fenotípica deseada. De esta manera, la presente invención proporciona semilla transformada (también denominada "semilla transgénica") que tiene una construcción de nucleótidos de la invención, por ejemplo, un casete de expresión de la invención, incorporado de manera estable en su genoma.

Evaluación de la transformación de plantas

Tras la introducción de ADN extraño heterólogo en células vegetales, la transformación o integración del gen heterólogo en el genoma vegetal se confirma mediante varios métodos tales como el análisis de ácidos nucleicos, proteínas y metabolitos asociados con el gen integrado.

El análisis por PCR es un método rápido para seleccionar células, tejidos o brotes transformados para detectar la presencia de genes incorporados en la etapa anterior antes de trasplantarlos al suelo (Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). La PCR se lleva a cabo mediante el uso de cebadores oligonucleotídicos específicos del gen de interés o del vector de fondo de Agrobacterium, etc.

La transformación de la planta puede confirmarse mediante análisis de transferencia Southern de ADN genómico (Sambrook y Russell, 2001, supra). En general, el ADN total se extrae del transformante, se hidroliza enzimáticamente con las enzimas de restricción apropiadas, se fracciona en un gel de agarosa y se transfiere a una membrana de nitrocelulosa o nailon. Después la membrana o "transferencia" se hibrida con sondas con, por ejemplo, un fragmento de ADN objetivo P32 radiomarcado para confirmar la integración del gen introducido en el genoma de la planta de acuerdo con técnicas estándar (Sambrook y Russell, 2001, supra).

En el análisis de transferencia Northern, el ARN se aísla de tejidos específicos del transformante, se fracciona en un gel de agarosa con formaldehído, y se transfiere a un filtro de nailon de acuerdo con los procedimientos estándar que se usan habitualmente en la técnica (Sambrook y Russell, 2001, supra). La expresión del ARN codificado por el gen plaguicida se comprueba después mediante la hibridación del filtro con una sonda radiactiva derivada de un gen plaguicida, mediante métodos conocidos en la técnica (Sambrook y Russell, 2001, supra).

Transferencia Western, ensayos bioquímicos y similares pueden llevarse a cabo en las plantas transgénicas para confirmar la presencia de la proteína codificada por el gen plaguicida mediante procedimientos estándar (Sambrook y Russell, 2001, supra) mediante el uso de anticuerpos que se unen a uno o más epítopos presentes en la proteína plaguicida.

Actividad plaguicida en plantas

En otro aspecto de la invención, pueden generarse plantas transgénicas que expresan una proteína plaguicida que tiene actividad plaguicida. Los métodos descritos anteriormente a modo de ejemplo pueden utilizarse para generar plantas transgénicas, pero la manera en que se generan las células vegetales transgénicas no es crítica para esta invención. Los métodos conocidos o descritos en la técnica tales como transformación mediada por Agrobacterium, transformación biolística, y métodos no mediados por partículas pueden usarse a discreción del experimentador. Las plantas que expresan una proteína plaguicida pueden aislarse mediante métodos comunes descritos en la técnica, por ejemplo, mediante transformación de callos, selección de callos transformados, y regeneración de plantas fértiles a partir de tales callos transgénicos. En tal proceso, puede usarse cualquier gen como marcador seleccionable siempre que su expresión en células vegetales confiera capacidad para identificar o seleccionar células transformadas.

Se desarrollaron varios marcadores para su uso con células vegetales, tales como resistencia al cloranfenicol, el aminoglucósido G418, higromicina, o similares. También pueden usarse como marcadores seleccionables otros genes que codifican un producto que participa en el metabolismo del cloroplasto. Por ejemplo, los genes que proporcionan resistencia a herbicidas para plantas tales como glifosato, bromoxinil, o imidazolinona pueden encontrar un uso particular. Se informó de tales genes (Stalker y otros (1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314 (gen de nitrilasa de resistencia a bromoxinilo); y Sathasivan y otros (1990) Nucl. Acids Res. 18:2188 (Gen de resistencia a imidazolinona AHAS). Adicionalmente, los genes descritos en la presente descripción son útiles como marcadores para evaluar la transformación de células bacterianas o vegetales. Los métodos para detectar la presencia de un transgén en una planta, órgano vegetal (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semilla, célula vegetal, propágulo, embrión o progenie del mismo se conocen bien en la técnica. En una modalidad, la presencia del transgén se detecta mediante el análisis de la actividad plaguicida.

Las plantas fértiles que expresan una proteína plaguicida pueden comprobarse para determinar la actividad plaguicida, y las plantas que muestran una actividad óptima pueden seleccionarse para su posterior reproducción. Hay métodos disponibles en la técnica para analizar la actividad de plagas. Generalmente, la proteína se mezcla y se usa en ensayos de alimentación. Ver, por ejemplo Marrone y otros (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293.

La presente invención puede usarse para la transformación de cualquier especie vegetal, que incluye, pero no se limita a, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Ejemplos de plantas de interés incluyen, pero no se limitan a, maíz (maíz), sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, papa, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada y colza, Brassica sp., alfalfa, centeno, mijo, cártamo, maní, camote, mandioca, café, coco, piña, cítricos, cacao, té, plátano, aguacate, higo, guayaba, mango, aceituna, papaya, anacardo, macadamia, almendras, avena, hortalizas, ornamentales, y coníferas.

Las verduras incluyen, entre otras, tomates, lechuga, judías verdes, habas, guisantes, y miembros del género Curcumis tales como pepino, melón, y melón almizclero. Las ornamentales incluyen, pero no se limitan a, azalea, hortensia, hibisco, rosas, tulipanes, narcisos, petunias, clavel, poinsettia, y crisantemo. Preferentemente, las plantas de la presente invención son plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, colza, etc.).

Uso en control de plaguicidas

Se conocen en la técnica métodos generales para emplear cepas que comprenden una secuencia de nucleótidos de la presente invención, o una variante de estas, en el control de plagas o en el diseño genético de otros organismos como agentes plaguicidas. Ver, por ejemplo, la patente de EE. UU. núm. 5,039,523 y el documento núm. EP 0480762A2.

Las cepas de Bacillus que contienen una secuencia de nucleótidos de la presente invención, o una variante de esta, o los microorganismos que se alteraron genéticamente para contener un gen plaguicida de la invención y proteína pueden usarse para proteger cultivos y productos agrícolas de plagas. En un aspecto de la invención, las células completas, es decir, no lisadas, de un organismo productor de toxina (plaguicida) se tratan con reactivos que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando la célula se aplica al entorno de la(s) plaga(s) objetivo(s).

Alternativamente, el plaguicida se produce mediante la introducción de un gen plaguicida en un huésped celular. La expresión del gen plaguicida da como resultado, directamente o indirectamente, la producción intracelular y el mantenimiento del plaguicida. En un aspecto de esta invención, estas células se tratan después en condiciones que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando la célula se aplica al entorno de la(s) plaga(s) objetivo(s). El producto resultante conserva la toxicidad de la toxina. Estos plaguicidas encapsulados de forma natural pueden formularse después de acuerdo con técnicas convencionales para su aplicación al medio ambiente que hospeda una plaga objetivo, por ejemplo, suelo, agua, y follaje de plantas. Ver, por ejemplo, documento núm. EPA 0192319, y las referencias citadas en el mismo. Alternativamente, pueden formularse las células que expresan un gen de esta invención para permitir la aplicación del material resultante como plaguicida.

Los ingredientes activos de la presente invención se aplican normalmente en forma de composiciones y pueden aplicarse al área de cultivo o planta a tratar, simultáneamente o en sucesión, con otros compuestos. Estos compuestos pueden ser fertilizantes, herbicidas, crioprotectores, tensioactivos, detergentes, jabones plaguicidas, aceites inactivos, polímeros, y/o formulaciones portadoras biodegradables o de liberación prolongada que permiten la dosificación a largo plazo de un área objetivo después de una sola aplicación de la formulación. También pueden ser herbicidas selectivos, insecticidas químicos, virucidas, microbicidas, amebicidas, plaguicidas, fungicidas, bactericidas, nematocidas, molusquicidas o mezclas de varias de estas preparaciones, si se desea, junto con otros portadores, surfactantes o adyuvantes que promueven la aplicación habitualmente aceptable en agricultura empleada en la técnica de la formulación. Los portadores y adyuvantes adecuados pueden ser sólidos o líquidos y corresponden a las sustancias normalmente empleadas en la tecnología de formulación, por ejemplo, sustancias minerales naturales o regeneradas, disolventes, dispersantes, agentes humectantes, agentes de pegajosidad, aglutinantes o fertilizantes. Asimismo las formulaciones pueden prepararse en "cebos" comestibles o en "trampas" para plagas para permitir la alimentación o ingestión por una plaga objetivo de la formulación plaguicida.

Los métodos para aplicar un ingrediente activo de la presente invención o una composición agroquímica de la presente invención que contiene al menos una de las proteínas plaguicidas producidas por las cepas bacterianas de la presente invención incluye la aplicación foliar, recubrimiento de semillas y aplicación al suelo. El número de aplicaciones y la tasa de aplicación dependen de la intensidad de la infestación por la plaga correspondiente.

La composición puede formularse como un polvo, arenilla, sedimento, gránulo, pulverización, emulsión, coloide, solución, o similar, y puede prepararse por medios convencionales como desecación, liofilización, homogeneización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación, o concentración de un cultivo de células que comprende el polipéptido. En todas estas composiciones que contienen al menos uno de tales polipéptidos plaguicidas, el polipéptido puede estar presente en una concentración de aproximadamente 1 % a aproximadamente 99 % en peso.

Las plagas de lepidópteros, hemípteros, dípteros, o coleópteros pueden matarse o reducirse en número en un área determinada mediante los métodos de la invención, o pueden aplicarse profilácticamente a un área ambiental para prevenir la infestación por una plaga susceptible. Preferentemente, la plaga ingiere, o se pone en contacto con, una cantidad del polipéptido efectiva como plaguicida. Por "cantidad efectiva como plaguicida" se entiende una cantidad del plaguicida que puede provocar la muerte de al menos una plaga, o reducir notablemente el crecimiento, alimentación o desarrollo fisiológico normal de la plaga. Esta cantidad variará en dependencia de factores tales como, por ejemplo, las plagas objetivo específicas que se controlarán, el entorno específico, ubicación, planta, cultivo o sitio agrícola a tratar, las condiciones ambientales y el método, velocidad, concentración, estabilidad y cantidad de aplicación de la composición polipeptídica efectiva como plaguicida. Las formulaciones también pueden variar con respecto a las condiciones climáticas, consideraciones ambientales y/o frecuencia de aplicación y/o gravedad de la infestación de plagas.

Las composiciones plaguicidas descritas pueden prepararse ya sea mediante la formulación de la célula bacteriana, el cristal y/o la suspensión de esporas, o el componente proteico aislado con el portador deseado aceptable en agricultura. Las composiciones pueden formularse antes de la administración en un medio apropiado tal como liofilizado, secado por congelación, desecado, o en un portador, medio o diluyente adecuado acuoso, tal como solución salina u otro tampón. Las composiciones formuladas pueden estar en forma de polvo o material granular, o una suspensión en aceite (vegetal o mineral), o agua o emulsiones de aceite/agua, o como un polvo humectable, o en combinación con cualquier otro material portador adecuado para aplicación agrícola. Los portadores agrícolas adecuados pueden ser sólidos o líquidos y se conocen bien en la técnica. El término "portador agrícolamente aceptable" cubre todos los adyuvantes, componentes inertes, dispersantes, surfactantes, agentes de pegajosidad, aglutinantes, etc. que se usan habitualmente en la tecnología de formulación de plaguicidas; estos se conocen bien por los expertos en formulación de plaguicidas. Las formulaciones pueden mezclarse con uno o más adyuvantes sólidos o líquidos y prepararse por diversos medios, por ejemplo, mediante la mezcla, combinación y/o trituración homogénea de la composición plaguicida con adyuvantes adecuados mediante el uso de técnicas de formulación convencionales. Las formulaciones y los métodos de aplicación adecuados se describen en patente de EE. UU. núm. 6,468,523.

"Plaga" incluye, pero no se limita a, insectos, hongos, bacterias, nemátodos, ácaros, garrapatas, y similares. Las plagas de insectos incluyen insectos seleccionados de los órdenes Coleóptera, Díptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., particularmente Coleoptera, Lepidoptera, y Diptera.

El orden Coleoptera incluye los subórdenes Adephaga y Polyphaga. El suborden Adephaga incluye las superfamilias Caraboidea y Gyrinoidea, mientras que el suborden Polyphaga incluye las superfamilias Hydrophiloidea, Staphylinoidea, Cantharoidea, Cleroidea, Elateroidea, Dascilloidea, Dryopoidea, Byrrhoidea, Cucujoidea, Meloidea, Mordelloidea, Tenebrionoidea, Bostrichoidea, Scarabaeoidea, Cerambycoidea, Chrysomeloidea, y Curculionoidea. La superfamilia Caraboidea incluye las familias Cicindelidae, Carabidae, y Dytiscidae. La superfamilia Gyrinoidea incluye la familia Gyrinidae. La superfamilia Hydrophiloidea incluye la familia Hydrophilidae. La superfamilia Staphylinoidea incluye las familias Silphidae y Staphylinidae. La superfamilia Cantharoidea incluye las familias Cantharidae y Lampyridae. La superfamilia Cleroidea incluye las familias Cleridae y Dermestidae. La superfamilia Elateroidea incluye las familias Elateridae y Buprestidae. La superfamilia Cucujoidea incluye la familia Coccinellidae. La superfamilia Meloidea incluye la familia Meloidae. La superfamilia Tenebrionoidea incluye la familia Tenebrionidae. La superfamilia Scarabaeoidea incluye las familias Passalidae y Scarabaeidae. La superfamilia Cerambycoidea incluye la familia Cerambycidae. La superfamilia Chrysomeloidea incluye la familia Chrysomelidae. La superfamilia Curculionoidea incluye las familias Curculionidae y Scolytidae.

El orden Diptera incluye los subórdenes Nematocera, Brachycera, y Cyclorrhapha. El suborden Nematocera incluye las familias Tipulidae, Psychodidae, Culicidae, Ceratopogonidae, Chironomidae, Simuliidae, Bibionidae, y Cecidomyiidae. El suborden Brachycera incluye las familias Stratiomyidae, Tabanidae, Therevidae, Asilidae, Mydidae, Bombyliidae, y Dolichopodidae. El suborden Cyclorrhapha incluye las Divisiones Aschiza y Aschiza. La división Aschiza incluye las familias Phoridae, Syrphidae, y Conopidae. La División Aschiza incluye las Secciones Acalyptratae y Calyptratae. La sección Acalyptratae incluye las familias Otitidae, Tephritidae, Agromyzidae, y Drosophilidae. La sección Calyptratae incluye las familias Hippoboscidae, Oestridae, Tachinidae, Anthomyiidae, Muscidae, Calliphoridae, y Sarcophagidae.

El orden Lepidoptera incluye las familias Papilionidae, Pieridae, Lycaenidae, Nymphalidae, Danaidae, Satyridae, Hesperiidae, Sphingidae, Saturniidae, Geometridae, Arctiidae, Noctuidae, Lymantriidae, Sesiidae, y Tineidae.

Las plagas de insectos de la invención para los cultivos principales incluyen: Maíz: Ostrinia nubilalis, barrenador europeo del maíz; Agrotis ipsilon, gusano cortador negro; Helicoverpa zea, gusano del maíz; Spodoptera frugiperda, gusano cogollero; Diatraea grandiosella, barrenador del maíz del suroeste; Elasmopalpus lignosellus, barrenador del tallo del maíz; Diatraea saccharalis, barrenador de la caña de surgar; Diabrotica virgifera, gusano de la raíz del maíz occidental; Diabrotica longicornis barberi, gusano de la raíz del maíz del norte; Diabrotica undecimpunctata howardi, gusano de la raíz del maíz del sur; Melanotus spp., gusanos alambre; Cyclocephala borealis, chafer enmascarado del norte (gusano blanco); Cyclocephala immaculata, chafer enmascarado del sur (gusano blanco); Popillia japonica, escarabajo japonés; Chaetocnema pulicaria, escarabajo pulga del maíz; Sphenophorus maidis, picudo del maíz; Rhopalosiphum maidis, pulgón de la hoja del maíz; Anuraphis maidiradicis, pulgón de la raíz del maíz; Blissus leucopterus leucopterus, chinche; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus sanguinipes, saltamontes migratorio; Hylemya platura, gusano de la semilla del maíz; Agromyza parvicornis, minador de hojas de la mancha del maíz; Anaphothrips obscrurus, trips de la hierba; Solenopsis milesta, hormiga ladrona; Tetranychus urticae, araña roja de dos manchas; Sorgo: Chilo partellus, barrenador del sorgo; Spodoptera frugiperda, gusano cogollero; Helicoverpa zea, gusano del maíz; Elasmopalpus lignosellus, barrenador del tallo del maíz; Feltia subterranea, gusano cortador granulado; Phyllophaga crinita, gusano blanco; Eleodes, Conoderus, y Aeolus spp., gusanos alambre; Oulema melanopus, escarabajo de las hojas de los cereales; Chaetocnema pulicaria, escarabajo pulga del maíz; Sphenophorus maidis, picudo del maíz; Rhopalosiphum maidis; pulgón de la hoja del maíz; Sipha flava, pulgón amarillo de la caña de azúcar; Blissus leucopterus leucopterus, chinche; Contarinia sorghicola, mosquito del sorgo; Tetranychus cinnabarinus, araña roja carmín; Tetranychus urticae, araña roja de dos manchas; Trigo: Pseudaletia unipunctata, gusano cogollero; Spodoptera frugiperda, gusano cogollero; Elasmopalpus lignosellus, barrenador del tallo del maíz; Agrotis orthogonia, gusano cortador occidental; Elasmopalpus lignosellus, barrenador del tallo del maíz; Oulema melanopus, escarabajo de las hojas de los cereales; Hypera punctata, gorgojo de la hoja del trébol; Diabrotica undecimpunctata howardi, gusano de la raíz del maíz del sur; pulgón ruso del trigo; Schizaphis graminum, chinche verde; Macrosiphum avenae, pulgón inglés del grano; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus differentialis, saltamontes diferencial; Melanoplus sanguinipes, saltamontes migratorio; Mayetiola destructor, mosca de Hesse; Sitodiplosis mosellana, mosquito del trigo; Meromyza americana, gusano del tallo del trigo; Hylemya coarctata, mosca del bulbo del trigo; Frankliniella fusca, trips del tabaco; Cephus cinctus, mosca de sierra del tallo del trigo; Aceria tulipae, ácaro del rizo del trigo; Girasol: Suleima helianthana, polilla del capullo de girasol; Homoeosoma electellum, polilla del girasol; zygogramma exclamationis, escarabajo de girasol; Bothyrus gibbosus, escarabajo de la zanahoria; Neolasioptera murtfeldtiana, mosquito de semillas de girasol; Algodón: Heliothis virescens, gusano de la yema del algodón; Helicoverpa zea, gusano de la cápsula del algodón; Spodoptera exigua, gusano cogollero de la remolacha; Pectinophora gossypiella, gusano rosado de la cápsula; Anthonomus grandis, picudo del algodonero; Aphis gossypii, pulgón del algodón; Pseudatomoscelis seriatus, saltamontes del algodón; Trialeurodes abutilonea, mosca blanca de alas anilladas; Lygus lineolaris, insecto de la planta deslustrado; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus differentialis, saltamontes diferencial; Thrips tabaci, trips de la cebolla; Franklinkiella fusca, trips del tabaco; Tetranychus cinnabarinus, araña roja carmín; Tetranychus urticae, araña roja de dos manchas; Arroz: Diatraea saccharalis, barrenador de la caña de azúcar; Spodoptera frugiperda, gusano cogollero; Helicoverpa zea, gusano del maíz; Colaspis brunnea, colaspis de uva; Lissorhoptrus oryzophilus, gorgojo de agua del arroz; Sitophilus oryzae, gorgojo del arroz; Nephotettix nigropictus, saltahojas del arroz; Blissus leucopterus leucopterus, chinche; Acrosternum hilare, chinche apestosa verde; Soja: Pseudoplusia includens, falso medidor de la soja; Anticarsia gemmatalis, oruga del frijol de terciopelo; Plathypena scabra, trébol verde; Ostrinia nubilalis, barrenador europeo del maíz; Agrotis ipsilon, gusano cortador negro; Spodoptera exigua, gusano cogollero de la remolacha; Heliothis virescens, gusano de la yema del algodón; Helicoverpa zea, gusano de la cápsula del algodón; Epilachna varivestis, escarabajo mexicano del frijol; Myzus persicae, pulgón verde del melocotón; Empoasca fabae, saltahojas de la patata; Acrosternum hilare, chinche apestosa verde; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus differentialis, saltamontes diferencial; Hylemya platura, gusano de la semilla del maíz; Sericothrips variabilis, trips de la soja; Thrips tabaci, trips de la cebolla; Tetranychus turkestani, ácaro de la fresa; Tetranychus urticae, araña roja de dos manchas; Cebada: Ostrinia nubilalis, barrenador europeo del maíz; Agrotis ipsilon, gusano cortador negro; Schizaphis graminum, chinche verde; Blissus leucopterus leucopterus, chinche; Acrosternum hilare, chinche apestosa verde; Euschistus servus, chinche parda; Delia platura, gusano de la semilla del maíz; Mayetiola destructor, mosca de Hesse; Petrobia latens, ácaro marrón del trigo; Colza: Brevicoryne brassicae, pulgón de la col; Phyllotreta cruciferae, escarabajo pulga; Mamestra configurata, gusano cogollero de Bertha; Plutella xylostella, polilla de espalda de diamante; Delia ssp., gusanos de raíz.

Los nemátodos incluyen nemátodos parásitos tales como nemátodos agalladores, de quistes y de lesiones, que incluyen Heterodera spp., Meloidogyne spp. y Globodera spp.; particularmente miembros de los nemátodos de quiste, que incluyen, pero no se limitan a, Heterodera glycines (nemátodo del quiste de la soja); Heterodera schachtii (nemátodo del quiste de la remolacha); Heterodera avenae (nemátodo del quiste de los cereales); y Globodera rostochiensis y Globodera pailida (nemátodos del quiste de la papa). Los nemátodos de lesiones incluyen Pratylenchus spp.

Métodos para aumentar el rendimiento de las plantas

Se proporcionan métodos para aumentar el rendimiento de las plantas. Los métodos comprenden proporcionar una planta o célula vegetal que exprese un polinucleótido que codifica la secuencia polipeptídica plaguicida descrita en la presente descripción y hacer crecer la planta o una semilla de la misma en un campo infestado con (o susceptible de infestación por) una plaga contra la cual dicho polipéptido tiene actividad plaguicida. En algunas modalidades, el polipéptido tiene actividad plaguicida contra una plaga de lepidópteros, coleópteros, dípteros, hemípteros, o nemátodos, y dicho campo está infestado con una plaga de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, dípteros, o nemátodos. Como se define en la presente descripción, el "rendimiento" de la planta se refiere a la calidad y/o cantidad de biomasa producida por la planta. Por "biomasa" se entiende cualquier producto vegetal medido. Un aumento en la producción de biomasa es cualquier mejora en el rendimiento del producto vegetal medido. El aumento del rendimiento de las plantas tiene varias aplicaciones comerciales. Por ejemplo, el aumento de la biomasa de las hojas de las plantas puede incrementar el rendimiento de hortalizas de hoja para el consumo humano o animal. Adicionalmente, el aumento de la biomasa de las hojas puede usarse para aumentar la producción de productos farmacéuticos o industriales derivados de plantas. Un aumento en el rendimiento puede comprender cualquier aumento estadísticamente significativo que incluye, entre otros, al menos un 1 % de aumento, al menos un 3 % de aumento, al menos un 5 % de aumento, al menos un 10 % de aumento, al menos un 20 % de aumento, al menos un 30 %, al menos un 50 %, al menos un 70 %, al menos un 100 % o un aumento mayor de rendimiento en comparación con una planta que no expresa la secuencia plaguicida. En métodos específicos, el rendimiento de la planta aumenta como resultado de una resistencia mejorada a las plagas de una planta que expresa una proteína plaguicida descrita en la presente descripción. La expresión de la proteína plaguicida da como resultado una capacidad reducida de una plaga para infestar o alimentarse.

Las plantas también pueden tratarse con una o más composiciones químicas, que incluyen uno o más herbicidas, insecticidas, o fungicidas. Ejemplos de composiciones químicas incluyen: Herbicidas para frutas/verduras: Atrazina, Bromacil, Diurón, Glifosato, Linurón, Metribuzina, Simazina, Trifluralina, Fluazifop, Glufosinato, Halosulfuron Gowan, Paraquat, Propizamida, Setoxidim, Butafenacilo, Halosulfuron, Indaziflam; Insecticidas para frutas/verduras: Aldicarb, Bacillus thuriengiensis, Carbarilo, Carbofurano, Clorpirifos, Cipermetrina, Deltametrina, Abamectina, Ciflutrina/betaciflutrina, Esfenvalerato, Lambda-cihalotrina, Acequinocilo, Bifenazato, Metoxifenozida, Novaluron, Cromafenozida, Tiacloprid, Dinotefuran, Fluacripirim, Espirodiclofeno, Gamma-cihalotrin, Espiromesifeno, Spinosad, Rinaxipir, Ciazipir, Triflumuron, Espirotetramato, Imidacloprid, Flubendiamida, Tiodicarb, Metaflumizona, Sulfoxaflor, Ciflumetofeno, Cianopirafeno, Clotianidina, Tiametoxam, Spinotoram, Tiodicarb, Flonicamida, Metiocarb, Emamectinbenzoato, Indoxacarb, Fenamifos, Piriproxifeno, Óxido de fenbutatina; Fungicidas para frutas/verduras. Ametoctradin, Azoxistrobin, Bentiavalicarb, Boscalid, Captan, Carbendacima, Clorotalonil, Cobre, Ciazofamida, Ciflufenamida, Cimoxanilo, Ciproconazol, Ciprodinil, Difenoconazol, Dimetomorf, Ditianón, Fenamidona, Fenhexamida, Fluazinam, Fludioxonil, Fluopicólido, Fluopiram, Fluoxastrobin, Fluxapiroxad, Folpet, Fosetil, Iprodiona, Iprovalicarb, Isopirazam, Kresoxim-metil, Mancozeb, Mandipropamid, Metalaxil/mefenoxam, Metiram, Metrafenona, Miclobutanilo, Penconazol, Pentiopirad, Picoxistrobina, Propamocarb, Propiconazol, Propineb, Proquinazid, Protioconazol, Piraclostrobina, Pirimetanil, Quinoxifeno, Espiroxamina, Azufre, Tebuconazol, Tiofanatometilo, Trifloxistrobina; Herbicidas para cereales: 2,4-D, amidosulfurón, Bromoxinil, Carfentrazona-E, Clorotolurón, Clorsulfurón, Clodinafop-P, Clopiralid, Dicamba, Diclofop-M, Diflufenican, Fenoxaprop, Florasulam, Flucarbazona-NA, Flufenacet, Flupirosulfuron-M, Fluroxipir, Flurtamona, Glifosato, Iodosulfuron, Ioxinil, Isoproturon, MCPA, Mesosulfurón, Metsulfurón, Pendimetalina, Pinoxaden, Propoxicarbazona, Prosulfocarb, Piroxsulam, Sulfosulfurón, Tifensulfurón, Tralkoxidim, Triasulfurón, Tribenurón, Trifluralina, Tritosulfurón; Fungicidas de cereales: Azoxistrobin. Bixafen, Boscalid, Carbendacima, Clorotalonil, Ciflufenamid, Ciproconazol, Ciprodinil, Dimoxistrobina, Epoxiconazol, Fenpropidina, Fenpropimorf, Fluopiram, Fluoxiastrobina, Fluoxastrobina, Fluquinconazol, Fluxapiroxad, Isopirazam, Kresoxim-metil, Metconazol, Metrafenona, Pentiopirad, Picoxistrobina, Procloraz, Propiconazol, Proquinazida, Protioconazol, Piraclostrobina, Quinoxifeno, Espiroxamina, Tebuconazol, Tiofanato-metilo, Trifloxistrobina; Insecticidas para cereales: Dimetoato, lambda-cialtrina, Deltametrina, alfa-cipermetrina, p-ciflutrina, Bifentrina, Imidacloprid, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprid, Acetamiprid, Dinetofurano, Clorfirifos, Pirimicarb, Metiocarb, Sulfoxaflor; Herbicidas de maíz: Atrazina, Alaclor, Bromoxinilo, Acetoclor, Dicamba, Clopiralid, (S-)dimetenamida, Glufosinato, Glifosato, Isoxaflutol, (S-)metolaclor, Mesotriona, Nicosulfurón, Primisulfurón, Rimsulfurón, Sulcotriona, Foramsulfurón, Topramezona, Tembotriona, Saflufenacilo, Tiencarbazona, Flufenacet, Piroxasulfón; Insecticidas de maíz: Carbofurano, Clorpirifos, Bifentrina, Fipronil, Imidacloprid, lambda-cihalotrin, Teflutrina, Terbufos, Tiametoxam, Clotianidina, Espiromesifeno, Flubendiamida, Triflumurón, Rinaxipir, Deltametrina, Tiodicarb, p-Ciflurina, Cipermetrina, Bifentrina, Lufenurón, Tebupirimfos, Etiprol, Ciazipir, Tiacloprid, Acetamiprid, Dinetofuran, Avermectina; Fungicidas de maíz: Azoxistrobina, Bixafen, Boscalid, Ciproconazol, Dimoxistrobina, Epoxiconazol, Fenitropan, Fluopiram, Fluoxastrobina, Fluxpiroxad, Isopirazam, Metconazol, Pentiopirad, Picoxistrobina, Propiconazol, Protioconazol, Piraclostrobina, Tebuconazol, Trifloxistrobina; Herbicidas de arroz: Butacloro, Propanil, Azimsulfurón, Bensulfurón, Cihalofop, Daimurón, Fentrazamida, Imazosulfurón, Mefenacet, Oxaziclomefona, Pirazosulfurón, Piributicarb, Quinclorac, Tiobencarb, Indanofan, Flufenacet, Fentrazamida, Halosulfurón, Oxaziclomefona, Benzobiciclón, Piriftalid, Penoxsulam, Bispiribac, Oxadiargil, Etoxisulfurón, Pretilaclor, Mesotriona, Tefuriltriona, Oxadiazona, Fenoxaprop, Pirimisulfán; Insecticidas de arroz: Diazinón, Fenobucarb, Benfuracarb, Buprofezina, Dinotefuran, Fipronil, Imidacloprid, Isoprocarb, Tiacloprid, Cromafenozid, Clotianidina, Etiprol, Flubendiamida, Rinaxipir, Deltametrina, Acematipirotropiridina, Cirametripiridina, Cirametipiridina, Etofenprox, Carbofurano, Benfuracarb, Sulfoxaflor; Fungicidas de arroz: Azoxistrobina Carbendazima, Carpropamida, Diclocimet, Difenoconazol, Edifenfos, Ferimzona, Gentamicina, Hexaconazol, Himexazol, Iprobenfos (IBP), Isoprotiolano, Isotianil, Kasugamicina, Mancozebona, Metominostrobina, Orisastrobina, Pencicurón, Probenazol, Propiconazol, Propineb, Piroquilón, Tebuconazol, Tiofanato-metilo, Tiadinil, Triciclazol, Trifloxistrobina, Validamicina; Herbicidas de algodón: Diuron, Fluometurón, MSMA, Oxifluorfeno, Prometrina, Trifluralina, Carfentrazona, Cletodim, Fluazifop-butil, Glifosato, Norflurazón, Pendimetalina, Piritiobac-sodio, Trifloxisulfurón, Tepraloxidima, Glufosinato, Flumioxazina, Tidiazurón; Insecticidas de algodón: Acefato, Aldicarb, Clorpirifos, Cipermetrina, Deltametrina, Abamectina, Acetamiprid, Benzoato de emamectina, Imidacloprid, Indoxacarb, lambda-cihalotrina, Spinosad, Tiodicarb, gammacihalotrin, Spiromesifen, Piridalilo, Flonicamida Flubendiamida, Triflumurón, Rinaxipir, Beta-Ciflutrin, Espirotetramat, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprid, Dinetofuran, Flubendiamida, Ciazipir, Espinosad, Spinotoram, gamma cihalotrina, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-on, Tiodicarb, Avermectina, Flonicamid, Piridalilo, Spiromesifen, Sulfoxaflor; Fungicidas de algodón: Azoxistrobina, Bixafen, Boscalid, Carbendacima, Clorotalonil, Cobre, Ciproconazol, Difenoconazol, Dimoxistrobina, Epoxiconazol, Fenamidona, Fluazinam, Fluopiram, Fluoxastrobina, Fluxapiroxadian, Iprodiona, Isopirazam, Isotianil, Mancozeb, Maneb, Metominostrobin, Pentiopirad, Picoxistrobina, Propineb, Protioconazol, Piraclostrobina, Quintozeno, Tebuconazol, Tetraconazol, Tiofanato-metil, Trifloxistrobina: Herbicidas de soja: Alaclor, Bentazona, Trifluralina, Clorimuron-Etilo, Cloransulam-Metilo, Fenoxaprop, Fomesafen, Fluazifop, Glifosato, Imazamox, Imazaquin, Imazetapir, (S-)Metolaclor, Metribuzina, Pendimetalina, Tepraloxidim, Glufosinato; Insecticidas de soja: Lambda-cihalotrin, Metomil, Imidacloprid, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprid, Acetamiprid, Dinetofuran, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, Spinosad, Spinotoram, Emamectin-Benzoato, Fipronil, Etiprol, Deltametrina, p-Ciflurin, gamma y lambda Cihalotrin, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-on, Spirotetramat, Spinodiclofen, Triflumurón, Flonicamid, Tiodicarb, beta-Ciflutrin; Fungicidas de soja: Azoxistrobina, Bixafen, Boscalid, Carbendazima, Clorotalonilo, Cobre, Ciproconazol, Difenoconazol, Dimoxistrobina, Epoxiconazol, Fluazinam, Fluopiram, Fluoxastrobin, Flutriafol, Fluxapiroxad, Isopirazam, Iprodiona, Isotianilo, Mancozeb, Maneb, Metconazol, Metominostrobina, Miclobutanilo, Pentiopirad, Picoxistrobina, Propiconazol, Propineb, Protioconazol, Piraclostrobina, Tebuconazol, Tetraconazol, Tiofanato-metilo, Trifloxistrobina: Herbicidas de remolacha azucarera: Cloridazón, Desmedifam, Etofumesato, Fenmedifam, Trialato, Clopiralid, Fluazifop, Lenacil, Metamitron, Quinmerac, Cicloxidim, Triflusulfuron, Tepraloxidim, Quizalofop; Insecticidas de remolacha azucarera: Imidacloprid, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprid, Acetamiprid, Dinetofuran, Deltametrina, p-ciflutrina, gamma/lambda cialotrina, 4-[[(6-clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-on, Teflutrin, Rinaxipir, Ciaxipir, Fipronil, Carbofurano; Herbicidas de canola: Clopiralida, Diclofop, Fluazifop, Glufosinato, Glifosato, Metazaclor, Trifluralina Etametsulfurón, Quinmerac, Quizalofop, Cletodim, Tepraloxidim; Fungicidas de canola: Azoxistrobina. Bixafen, Boscalid, Carbendazima, Ciproconazol, Difenoconazol, Dimoxistrobina, Epoxiconazol, Fluazinam, Fluopiram, Fluoxastrobina, Flusilazol, Fluxapiroxad, Iprodiona, Isopirazam, Cloruro de mepiquat, Metconazol, Metominostrobina, Paclobutrazonazol, Pentiopiram, Picoxistrobina, Procloraz, Protioconazol, Piraclostrobina, Tebuconazol, Tiofanato-metil, Trifloxistrobin, Vinclozolina; Insecticidas de canola: Carbofuran, Tiacloprid, Deltametrina, Imidacloprid, Clotianidina, Tiametoxam, Acetamiprid, Dinetofuran, p-ciflutrina, gamma y lambda cihalotrina, tau-fluvaleriato, Etiprol, Spinosad, Spinotoram, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, 4-[[(6-Clorpiridin-3-ilmetil] (2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-on.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.

Ejemplos experimentales

Ejemplo 1. Diseño y prueba de proteínas de fusión Axmil 15

Axmil 15 se describe en publicación de patente de EE. UU. núm. 20100004176 (la secuencia de aminoácidos se establece en la presente descripción como SEQ ID NO:43). Este gen comparte una homología de secuencia del 70 % con Vip3Aa. Se clonó y expresó una versión optimizada de codones de Axmi1 15 (también denominada en la presente descripción como Axmi1 15v01 y establecida en SEQ ID NO:42) y se expresó mediante el uso del vector de expresión de E coli. Se demostró en un bioensayo in vitro que la proteína producida tiene actividad plaguicida contra varias plagas de insectos, incluido el barrenador europeo del maíz (ECB), el gusano cogollero del maíz (CEW), el gusano cogollero (FAW) y el gusano cortador negro (BCW).

Axmi005 también se describe en publicación de patente de EE. UU. núm. 20100004176. Este gen comparte una homología de secuencia del 94 % con Vip3Aa. Se clonó y expresó una versión de codón optimizado de Axmi005 (optAxmi005, que se establece en la presente descripción como SEQ ID NO:44) mediante el uso del vector de expresión de E. coli. Se demostró en un bioensayo in vitro que la proteína producida tiene actividad plaguicida contra varias plagas de insectos, entre ellas Helicoverpa zea (Hz), Heliothis virescens (Hv), FAW, BCW, barrenador de la caña de azúcar (SCB) y oruga del frijol terciopelo (VBC).

La actividad relativa de Axmi1 15 fue baja contra Hz y FAW en comparación con Axmi005. Además, como se señaló anteriormente, Axmi005 no tuvo actividad contra ECB. En un intento por identificar los dominios responsables de la especificidad diferencial, así como la actividad de las dos proteínas, se hicieron construcciones que expresan fusiones de optAxmi005 y una versión optimizada de codones de Axmi1 15 (optAxmi1 15v01) como se describe más abajo y se muestra en el diagrama de la Figura 1. La proteína se expresó en E. coli y se probó contra ECB, Hz, FAW y BCW en un bioensayo in vitro. La proteína expresada por pAX6307 (Axmi1 15v02.01, establecida en la presente descripción como SEQ ID NO:1) mostró una actividad mejorada cuando se comparó con la proteína expresada por pAX5477 (Axmi1 15v01, establecida aquí como SEQ ID nO:42) contra las cuatro plagas probadas.

El gen expresado en pAX6307 (Axmi115v02.01) se vectorizó en el vector de expresión vegetal pAG6141 en el que la expresión de la proteína se condujo por el promotor de ubiquitina de caña de azúcar.

Se analizaron muestras de hojas de plantas transgénicas que expresan Axmi1 15v01 y Axmi115v02.01 en bioensayos de laboratorio con insectos contra ECB, Hz, FAW y BCW y en pruebas de campo contra ECB, Hz y FAW. Los resultados muestran que el gen Axmi115v02.01 mejorado tuvo una mejor eficacia contra todas las plagas probadas.

Descripción de las construcciones:

Las secuencias de aminoácidos derivadas por traducción in silico de la secuencia de ADN de Vip3Aa, Axmi005, Axmi1 15v01, Axmi163, y Axmi184 se alinearon para identificar los aminoácidos conservados en todos los homólogos (Axmi163 y Axmi184 también se describen en publicación de patente de EE. UU. núm. 20100004176). Los cebadores de PCR se diseñaron para tres regiones conservadas de Axmi005 y Axmi1 15v01 mediante el uso de la secuencia de optAxmi005 encontrada en pAX5478 (que contiene una versión optimizada de codones de Axmi005, establecida en s Eq ID NO:44) y la secuencia de optAxmi1 15 encontrada en pAX5477 (que contiene una versión optimizada de codones de Axmi115). Se generaron tres genes de fusión mediante PCR solapada (ver Figura 1). El ADN de los genes de fusión producidos por estas reacciones de PCR se clonó en el vector de expresión en E. coli pRSf1B. Los vectores de expresión resultantes se muestran en la Tabla 1. La proteína se expresó mediante el uso de métodos conocidos y el extracto de E. coli se probó en un bioensayo in vitro.

Tabla 1. Construcciones de genes de fusión

Bioensayo in vitro

Se ensayaron extractos brutos de E. coli expresados en vectores frente a Hz, ECB, FAW, y BCW. Los resultados se muestran en la Tabla 2 (retraso) y Tabla 3 (mortalidad).

Tabla 2. Puntuación del retraso

*Sistema de puntuación:

0 = ningún efecto observado

1 = retraso del crecimiento leve no uniforme

2 = retraso del crecimiento moderado no uniforme

3 = retraso del crecimiento uniforme de moderado a grave

4 = mortalidad (<100 %) con retraso del crecimiento uniforme

5 = mortalidad completa

Tabla 3. Porcentaje de mortalidad

La proteína expresada a partir del vector pAX6307 (fusión A) varió en seis aminoácidos y se denominó Axmil 15v02.01. La secuencia de aminoácidos para esta proteína de fusión se establece en SEQ ID NO:15.

Los vectores de expresión de E. coli que expresan Axmi1 15v01 (pAX5476) y Axmi1 15v02.01 (pAX6307) tenían etiquetas N-terminales His 6 X. Las dos proteínas se purificaron mediante el uso de las propiedades de unión al níquel de la etiqueta His 6 X. Se ensayaron diversas concentraciones de la proteína purificada mediante bioensayo in vitro frente a ECB, FAW, BCW y gusano cogollero de la remolacha (BAW). Los resultados muestran que Axmi1 15v02.01 tiene una actividad mejorada en comparación con Axmi1 15v01 en todos los casos (Tablas 4 y 5).

Tabla 4. Puntuación del retraso

Tabla 5. Puntuación de mortalidad

Bioensayo de disco de hoja de planta

Se clonaron Axmi115v01 (SEQ ID NO:42) y Axmi1 15v02.01 (SEQ ID NO:1) en los vectores de expresión en plantas pAG6585 y pAG6141, respectivamente, y se produjeron plantas de maíz transgénicas. Se tomaron muestras para PCR y análisis Western y para bioensayo de disco foliar in vitro contra Hz, ECB, FAW, y BCW. El bioensayo se puntuó en cuanto a daños, daños bajos (1-pocos agujeros), daños moderados, y daños graves. Los daños leves y sin daños se consideraron un resultado positivo, mientras que los daños moderados a graves se consideraron un resultado negativo.

El material de las hojas de las plantas positivas a Western y PCR se analizó en un bioensayo de disco de hojas in vitro. La Figura 2A muestra el porcentaje de plantas positivas a la PCR que dieron una puntuación de bioensayo de daño leve, daño moderado o daño severo para cada construcción. Las transferencias Western indican que el nivel de expresión de proteína en plantas que expresan optAxmi115v02.01 es, en general, más alto que en plantas que expresan Axmi1 15v01.

Se produjeron plantas transgénicas adicionales que expresaban Axmil 15v02.01. El material foliar de las plantas positivas a la PCR y Western se analizó en un bioensayo de disco foliar in vitro frente a Hz, ECB, FAW, y BCW. Los resultados se muestran en la Figura 2b.

Ensayos de campo en plantas

Las plantas que expresan los genes que se muestran en la Tabla 6 se plantaron en el lugar de prueba del condado de Polk, IA. Los segregados negativos se identificaron y eliminaron mediante una aplicación IX de glifosato (20 oz./A de Buccaneer 5, Tenkoz, Inc.) cuando las plantas estaban en la etapa de hoja V3-V4. La presión de los insectos resultó de las infestaciones manuales de ECB, Hz, y FAW.

Las infestaciones de ECB imitaron la ocurrencia natural de la primera y segunda generación. Para ECB, en total, aproximadamente 340 larvas fueron infestadas en los verticilos de las hojas (primera generación, ECB1) o en las axilas de las hojas (segunda generación, ECB2) de cada planta. ECB1 se evaluó por la escala de calificación de Guthrie 1-9. ECB2 fue una medida de la longitud total de los túneles del tallo medida en cm.

Se infestaron veinte larvas de Hz en las puntas de las mazorcas primarias de cada planta. También hubo una infestación natural moderada de Hz que aumentó estas infestaciones manuales. El daño de la mazorca se midió en cm cuadrados.

Aproximadamente 60 larvas de FAW se infestaron en los verticilos de las hojas. El daño se midió en la escala de calificación Davis 1-9 modificada como se describe más abajo.

Los resultados de estos ensayos de campo se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6. Resultados de la prueba de campo

FAW - descripción de la escala de puntuación de Davis 1-9 modificada.

1. No hay daños visibles o solo lesiones por orificios presentes en las hojas de los verticilos.

2. Pequeñas lesiones circulares y por orificios presentes en las hojas de los verticilos.

3. Pequeñas lesiones circulares y algunas pequeñas lesiones alargadas (de forma rectangular) de hasta 1,3 cm (1/2") de longitud presentes en las hojas de los verticilos y con enrollamiento.

4. Varias lesiones alargadas de tamaño pequeño a mediano de 1,3 a 2,5 cm (1/2" a 1") de longitud presentes en algunas hojas de los verticilos y con enrollamiento.

5. Varias lesiones grandes alargadas de más de 2,5 cm (1") de longitud presentes en algunas hojas de los verticilos y con enrollamiento y/o algunos agujeros de forma uniforme a irregular de tamaño pequeño a mediano (membrana basal consumida) comidos en las hojas de los verticilos y/o hojas con enrollamiento. 6. Varias lesiones grandes y alargadas presentes en varias hojas con verticilos y con enrollamiento y/o varios agujeros grandes de forma uniforme a irregular comidos en las hojas de los verticilos/con enrollamiento. 7. Muchas lesiones alargadas de todos los tamaños se presentan en varias hojas de los verticilos y con enrollamiento, además de varios agujeros grandes de formas uniformes a irregulares comidos en las hojas de los verticilos y con enrollamiento.

8. Muchas lesiones alargadas de todos los tamaños se presentan en la mayoría de las hojas de los verticilos y con enrollamiento, además de muchos agujeros de tamaño mediano a grande de formas uniformes a irregulares comidos en las hojas de los verticilos y con enrollamiento.

9. Hojas en espiral y en espiral casi totalmente destruidas.

Davis, F. M., S. S. Ng, y W.P. Williams. 1992. Escalas de puntuación visual para evaluar la resistencia al gusano cogollero del maíz en etapa de verticilos. Miss. Agric. Forestry Exp. Stn. Tech. Bull. 186.

ECB - Descripción de la escala de puntuación 1-9 de Guthrie.

1. Sin daño visible en las hojas.

2. Pequeña cantidad de lesiones de perforaciones en algunas hojas.

3. Lesiones de perforaciones común en varias hojas.

4. Varias hojas con perforaciones y lesiones alargadas.

5. Varias hojas con lesiones alargadas.

6. Varias hojas con lesiones alargadas de unos 2,5 cm de largo.

7. Son frecuentes las lesiones largas en aproximadamente la mitad de las hojas.

8. Son comunes las lesiones largas en aproximadamente dos tercios de las hojas.

9. La mayoría de hojas con lesiones largas.

Guthrie, W. D., F. F. Dicke, y C. R. Neiswander. 1960. Leaf and sheath feeding resistance to the European corn borer in eight inbred lines of dent corn. Ohio. Agric. Exp. Sta. Res. Bull. 860.

Ejemplo 2. Evolución dirigida de Axmi1 15v02.

Se usó la evolución dirigida para mejorar la potencia y el perfil de actividad de Axmi115 contra ECB, Hz, FAW, BCW, y VBC. Para identificar las regiones de Axmi1 15 que participan en la toxicidad a insectos, se crearon varias variantes de intercambio de secuencias de Axmi115/Axmi005 en la parte C-terminal de Axmi1 15. Se designaron veintiún bloques de divergencia de secuencia entre Axmi1 15 y Axmi005 (ver publicación de patente de EE. UU. núm. 20100004176) y estos bloques de secuencia en Axmi1 15 se reemplazaron por los correspondientes bloques de secuencia de Axmi005. Los bioensayos de proteínas híbridas mostraron que las sustituciones en los bloques 2, 3, 10 y 18 se relacionan con una mayor toxicidad a insectos.

Se crearon bibliotecas de mutantes puntuales que apuntaban a posiciones en los bloques 2, 3, 10 y 18. Estas bibliotecas de mutantes puntuales se analizaron frente a ECB, Hz, FAW, BCW y VBC a una cobertura de 1,5 x al nivel de 4 réplicas. Los nuevos ensayos se llevaron a cabo en el nivel de 4 réplicas y las ampliaciones se realizaron en el nivel de 16 réplicas. Los siguientes mutantes puntuales mostraron una actividad mejorada contra una o más plagas:

Tabla 7. Actividad de los mutantes de 15 puntos de Axmi1

Estas variantes contienen mutaciones en la parte C-terminal. Para buscar mejoras sinérgicas con Axmi1 15v02 (pAX6307), la parte C-terminal de varios de los mutantes anteriores se clonó en Axmi1 15v02 (pAX6307). Se llevaron a cabo ensayos de escalado y se identificaron variantes con actividad mejorada en comparación con Axmi115v02.

Tabla 8. Actividad de mutantes de Axmi1 15v02

La variante axmi1 15 B2L11H6 (v02) muestra una actividad mejorada contra H. zea, VBC, FAW. Esta se designó Axmi1 15v02(evo27). La secuencia de nucleótidos para Axmi1 15v02(evo27) se establece en SEQ ID NO:4 y la secuencia de aminoácidos codificada se establece en SEQ ID NO:18.

La variante axmi115 B18L12B10 (v02) muestra mejoras frente a ECB. Esta se designó Axmi1 15v02(evo28). La secuencia de nucleótidos para Axmi1 15v02(evo28) se establece en SEQ ID NO:5 y la secuencia de aminoácidos codificada se establece en SEQ ID NO:19.

La variante axmi1 15 B2L11F9 (v02) muestra mejoras contra H.zea, VBC, FAW. Esta se designó Axmi1 15v02(evo29). La secuencia de nucleótidos para Axmi1 15v02(evo29) se establece en SEQ ID NO:6 y la secuencia de aminoácidos codificada se establece en SEQ ID NO:20.

Se realizaron mutaciones adicionales en la secuencia AXMI115v02 en la región C-terminal. Se identificaron tres variantes con actividad mejorada con respecto a AXMI115v02 (Tabla 9). Se determinaron los valores de LC50 y EC50 para dos de estos mutantes C-terminales (Tabla 10).

AXMI115v02(EV031) mostró una mortalidad mejorada contra FAW, falso medidor de la soja (SBL) y VBC con respecto a AXMI1 15v02. La secuencia de nucleótidos para Axmi1 15v02(evo31) se establece en SEQ ID NO:7 y la secuencia de aminoácidos se establece en SEQ ID NO:21.

AXMI115v02(EVO32) mostró una mortalidad mejorada frente a ECB y H. zea con respecto a AXMI115v02. La secuencia de nucleótidos para Axmi1 15v02(evo32) se establece en SEQ ID NO:8 y la secuencia de aminoácidos se establece en SEQ ID NO:22.

AXMI115v02(EVO38) mostró una mortalidad mejorada contra BCW con respecto a AXMI115v02. La secuencia de nucleótidos para Axmi1 15v02(evo38) se establece en SEQ ID NO:47 y la secuencia de aminoácidos se establece en SEQ ID NO:48.

Tabla 9. Actividad de mutantes C-terminales de Axmi1 15v02

Tabla 10. LC50 y EC50 para mutantes C-terminales

SBL = Falso medidor de la soja

Ejemplo 3. Ensayos adicionales de actividad plaguicida

Las secuencias de nucleótidos de la invención pueden probarse para determinar su capacidad para producir proteínas plaguicidas. La capacidad de una proteína plaguicida para actuar como plaguicida sobre una plaga a menudo se evalúa de varias maneras. Una forma bien conocida en la técnica es realizar un ensayo de alimentación. En un ensayo de alimentación de este tipo, se expone la plaga a una muestra que contiene compuestos a analizar o muestras de control. A menudo, esto se realiza mediante la colocación del material que va a analizarse, o una dilución adecuada de dicho material, sobre un material que la plaga ingiere, tal como una dieta artificial. El material a ensayar puede estar compuesto por un líquido, sólido, o una suspensión. El material a ensayar puede colocarse sobre la superficie y después dejarse secar. Alternativamente, el material a ensayar puede mezclarse con una dieta artificial fundida y después dispensarse en la cámara de ensayo. La cámara de ensayo puede ser, por ejemplo, una taza, un plato, o un pocillo de una placa de microvaloración.

Los ensayos para plagas chupadoras (por ejemplo, pulgones) pueden implicar la separación del material de prueba del insecto mediante un tabique, idealmente una porción que pueda ser perforada por las partes de la boca chupadora del insecto chupador, para permitir la ingestión del material de prueba. A menudo, el material de prueba se mezcla con un estimulante de la alimentación, tal como sacarosa, para promover la ingestión del compuesto de prueba.

Otros tipos de ensayos pueden incluir la microinyección del material de prueba en la boca o el intestino de la plaga, así como también el desarrollo de plantas transgénicas, seguido de una prueba de la capacidad de la plaga para alimentarse de la planta transgénica. La prueba de la planta puede implicar el aislamiento de las partes de la planta que normalmente se consumen, por ejemplo, pequeñas jaulas adheridas a una hoja, o el aislamiento de plantas enteras en jaulas que contienen insectos.

En la técnica se conocen otros métodos y enfoques para analizar plagas y pueden encontrarse, por ejemplo, en Robertson y Preisler, eds. (1992) Pesticide bioassays with arthropods, CRC, Boca Raton, FL. Alternativamente, los ensayos se describen comúnmente en las revistas Arthropod Management Tests y Journal of Economic Entomology o mediante discusión con miembros de la Entomological Society of America (ESA).

En algunas modalidades, las regiones de ADN que codifican la región de la toxina de las proteínas plaguicidas descritas en la presente descripción se clonan en el vector de expresión en E. coli pMAL-C4x detrás del gen malE que codifica la proteína de unión a maltosa (MBP). Estas fusiones en marco dan como resultado la expresión de proteínas de fusión MBP-Axmi en E. coli.

Para la expresión en E. coli, BL21*DE3 se transforma con plásmidos individuales. Se inoculan colonias individuales en LB suplementado con carbenicilina y glucosa, y se cultivan durante la noche a 37 °C. Al día siguiente, se inocula medio fresco con 1 % de cultivo cultivado durante la noche y se deja crecer a 37 °C hasta la fase logarítmica. Subsecuentemente, los cultivos se inducen con IPTG 0,3 mM durante la noche a 20 °C. Cada sedimento celular se suspende en tampón Tris-Cl 20 mM, pH 7,4 NaCl 200 mM DTT 1 mM inhibidores de proteasa y se somete a ultrasonido. Puede usarse el análisis por SDS-PAGE para confirmar la expresión de las proteínas de fusión.

Después los extractos libres de células totales se pasan por una columna de amilosa unida a cromatografía líquida de proteínas rápida (FPLC) para la purificación por afinidad de las proteínas de fusión MBP-axmi. Las proteínas de fusión unidas se eluyen de la resina con una solución de maltosa 10 mM. Después las proteínas de fusión purificadas se escinden con Factor Xa o tripsina para eliminar la etiqueta MBP amino terminal de la proteína Axmi. La escisión y la solubilidad de las proteínas pueden determinarse mediante SDS-PAGE

Ejemplo 4. Construcción de secuencias sintéticas

En un aspecto de la invención, se generan secuencias axmi sintéticas. Estas secuencias sintéticas tienen una secuencia de ADN alterada con respecto a la secuencia axmi parental y codifican una proteína que es colineal con la proteína AXMI parental a la que corresponde, pero carece del "dominio cristalino" C-terminal presente en muchas proteínas delta endotoxinas.

En otro aspecto de la invención, se diseñan versiones modificadas de genes sintéticos de manera tal que el péptido resultante se dirija a un orgánulo vegetal, tal como el retículo endoplásmico o el apoplasto. Se conocen en la técnica secuencias de péptidos que se sabe que dan como resultado el direccionamiento de proteínas de fusión a orgánulos de plantas. Por ejemplo, la región N-terminal del gen de la fosfatasa ácida de White Lupin Lupinus albus (Genebank ID GI: 14276838; Miller y otros (2001) Plant Physiology 127: 594-606) se conoce en la técnica por dar como resultado el direccionamiento del retículo endoplásmico de proteínas heterólogas. Si la proteína de fusión resultante también contiene una secuencia de retención endoplásmica que comprende el péptido N-terminal-lisina-ácido aspártico-ácido glutámico-leucina (es decir, el motivo "KDEL" (SEQ ID NO:46) en el extremo C-terminal, la proteína de fusión se dirigirá al retículo endoplásmico. Si la proteína de fusión carece de una secuencia dirigida al retículo endoplásmico en el extremo C-terminal, la proteína se dirigirá al retículo endoplásmico, pero finalmente será secuestrada en el apoplasto.

Ejemplo 5. Transformación de células de maíz con los genes de proteínas plaguicidas descritos en la presente descripción

Las mazorcas de maíz se recolectan mejor entre 8 y 12 días después de la polinización. Los embriones se aíslan de las mazorcas y se prefieren los embriones de 0,8 a 1,5 mm de tamaño para su uso en la transformación. Los embriones se colocan en placa con el escutelo hacia arriba en un medio de incubación adecuado, tal como el medio DN62A5S (sales N63,98 g/L; Vitaminas N61 ml/L (de 1000x solución madre); L-Asparagina 800 mg/L; Myo —inositol 100 mg/L; L-Prolina 1,4 g/L; casaminoácidos 100 mg/L; sacarosa 50 g/L; 1 mL/L (de 1 mg/mL Stock) 2,4-D). Sin embargo, los medios y las sales distintos de DN62A5S son adecuados y se conocen en la técnica. Los embriones se incuban durante la noche a 25 °C en la oscuridad. Sin embargo, esto no es necesario per se para incubar los embriones durante la noche.

Los explantes resultantes se transfieren a cuadrados de malla (30-40 por placa), se transfieren a un medio osmótico durante aproximadamente 30-45 minutos, después se transfieren a una placa radiante (ver, por ejemplo, publicación PCT núm. WO/0138514 y patente de EE. UU. núm. 5,240,842).

Las construcciones de ADN diseñadas para los genes de la invención en células vegetales se aceleran en el tejido vegetal mediante el uso de un acelerador de haz de aerosol, mediante el uso de condiciones esencialmente como se describe en publicación PCT núm. WO/0138514. Después de la transmisión, los embriones se incuban durante aproximadamente 30 minutos en un medio osmótico y se colocan en un medio de incubación durante la noche a 25 °C en la oscuridad. Para evitar dañar indebidamente los explantes con rayos, se incuban durante al menos 24 horas antes de transferirlos al medio de recuperación. Después los embriones se esparcen en un medio de período de recuperación, durante aproximadamente 5 días, a 25 °C en la oscuridad, después se transfieren a un medio de selección. Los explantes se incuban en medios de selección durante hasta ocho semanas, en dependencia de la naturaleza y características de la selección particular utilizada. Después del período de selección, el callo resultante se transfiere a un medio de maduración embrionaria, hasta que se observa la formación de embriones somáticos maduros. Los embriones somáticos maduros resultantes se colocan después bajo poca luz y el proceso de regeneración se inicia mediante métodos conocidos en la técnica. Los brotes resultantes se dejan enraizar en un medio de enraizamiento y las plantas resultantes se transfieren a macetas de vivero y se propagan como plantas transgénicas.

Materiales

Medios DN62A5S

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida, en donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:

(a) la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID NO: 7;

(c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende de una a cinco sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 21, en donde la actividad plaguicida del polipéptido de fusión se mejora con respecto a la actividad plaguicida de la SEQ ID NO:43 en relación con la mortalidad de al menos uno de barrenador europeo del maíz, H. Zea, gusano cogollero y oruga del frijol de terciopelo.

2. La molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1, en donde:

(a) dicha secuencia de nucleótidos es una secuencia sintética que se diseñó para su expresión en una planta; y/o

(b) dicha secuencia de nucleótidos se une operativamente a un promotor capaz de dirigir la expresión de dicha secuencia de nucleótidos en una célula vegetal.

3. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1 o 2, preferentemente, que comprende, además, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo.

4. Una célula huésped que contiene el ácido nucleico recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 o el vector de la reivindicación 3, preferentemente, que es una célula huésped bacteriana o una célula vegetal.

5. Una planta transgénica que comprende la célula huésped vegetal de la reivindicación 4, preferentemente, en donde dicha planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, sorgo, trigo, repollo, girasol, tomate, cruciferas, pimientos, papa, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada y colza.

6. Una semilla transgénica que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 o el vector de la reivindicación 3.

7. Un polipéptido recombinante que tiene actividad plaguicida, en donde dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; y

(b) una secuencia de aminoácidos que comprende de una a cinco sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, en donde la actividad plaguicida del polipéptido se mejora con respecto a la actividad plaguicida de SEQ ID NO: 43 en relación con la mortalidad de al menos uno de barrenador europeo del maíz, H. Zea, gusano cogollero y oruga del frijol de terciopelo.

8. El polipéptido recombinante de la reivindicación 7 que comprende además secuencias de aminoácidos heterólogas.

9. Una composición que comprende el polipéptido de la reivindicación 7 u 8.

10. La composición de la reivindicación 9, en donde dicha composición:

(a) se selecciona del grupo que consiste en un polvo, arenilla, sedimento, gránulo, pulverización, emulsión, coloide y solución;

(b) se prepara mediante desecación, liofilización, homogeneización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación o concentración de un cultivo de células bacterianas; o

(c) comprende de aproximadamente 1 % a aproximadamente 99 % en peso de dicho polipéptido.

11. Un método para:

(a) controlar una población de plagas de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, nemátodos o dípteros que comprende poner en contacto dicha población con una cantidad plaguicidamente efectiva del polipéptido de la reivindicación 7 o la composición de la reivindicación 9 o 10; o

(b) matar una plaga de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, nemátodos o dípteros, que comprende poner en contacto dicha plaga con, o alimentar a dicha plaga con, una cantidad plaguicidamente efectiva del polipéptido de la reivindicación 7 o la composición de la reivindicación 9 o 10.

12. Un método para producir un polipéptido con actividad plaguicida, que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 4 en condiciones en las que se expresa la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido, preferentemente, en donde dicha planta es una célula vegetal.

13. Una planta que tiene incorporada de manera estable en su genoma una construcción de ADN que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida, en donde dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; y

14. Un método para proteger una planta de una plaga, que comprende expresar en una planta o célula de esta una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida, en donde dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; y

(b) una secuencia de aminoácidos que comprende de una a cinco sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, en donde la actividad plaguicida del polipéptido se mejora con respecto a la actividad plaguicida de SEQ ID NO: 43 en relación con la mortalidad de al menos uno de barrenador europeo del maíz, H. Zea, gusano cogollero y oruga del frijol de terciopelo, preferentemente, en donde dicha planta produce un polipéptido plaguicida que tiene actividad plaguicida contra una plaga de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, nemátodos o dípteros.

15. Un método para aumentar el rendimiento en una planta que comprende cultivar en un campo una planta o una semilla de esta que tiene incorporada de manera estable en su genoma una construcción de ADN que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida, en donde dicho polipéptido comprende un secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; y