ES2344691T3

ES2344691T3 - Nuevas toxinas vip3 y sus metodos de uso.

Info

Publication number: ES2344691T3
Application number: ES03716053T
Authority: ES
Inventors: Zhicheng Shen; Gregory W. Warren; Frank Shotkoski; Vance Kramer
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 2002-03-06
Filing date: 2003-02-20
Publication date: 2010-09-03
Anticipated expiration: 2023-02-20
Also published as: US7378493B2; WO2003075655A2; ZA200406879B; EP1499176B1; EP1499176A4; CA2477975C; ATE465628T1; AR072217A2; CA2477975A1; DE60332337D1; US20050210545A1; AU2003219779B2; US9347072B2; JP2006500908A; CN1646006A; US20140212394A1; EP1499176A2; AR038725A1; CN100473724C; US20090328254A1

Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una toxina que es activa contra el barrenador del maíz europeo, donde dicha secuencia de nucleótidos: (a) tiene una secuencia complementaria que se hibrida con los nucleótidos 1981-2367 de SEC. ID Nº:1 en 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), NaPO4 0.5 M, EDTA 1 mM a 50ºC con lavado en 0.1 X SSC, SDS al 0.1% a 65ºC; o (b) es isocodificante con la secuencia de nucleótidos de (a); o (c) tiene al menos 95% de identidad de secuencia con SEC. ID. Nº: 1; o (d) codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 91% de identidad de secuencia con SEC. ID. Nº:2.

Description

Nuevas toxinas Vip3 y sus métodos de uso.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevas toxinas Vip3 de Bacillus thuringiensis, a secuencias de ácido nucleico cuya expresión origina dichas toxinas, y a métodos de preparación y métodos de uso de dichas toxinas y de las secuencias de ácido nucleico correspondientes para controlar insectos.

Antecedentes de la invención

Las plagas vegetales son el principal factor de pérdida mundial de cultivos agrícolas importantes. Aproximadamente 8 mil millones de dólares se pierden cada año sólo en los EE.UU. debido a infecciones de plagas no mamíferas incluidos los insectos. Además de las pérdidas en las cosechas, las plagas de insectos son también una carga económica para los cultivadores de frutas y vegetales, para los productores de flores ornamentales y para los jardineros residenciales.

Las plagas de insectos son controladas principalmente mediante aplicaciones intensivas de plaguicidas químicos, que actúan inhibiendo el crecimiento de los insectos, evitando que los insectos se alimenten o se reproduzcan o causándoles la muerte. Se puede lograr un buen control de los insectos, pero estos químicos pueden afectar a veces a otros insectos beneficiosos. Otro problema que resulta del amplio uso de plaguicidas químicos es la aparición de variedades de insectos resistentes. Esto ha sido parcialmente paliado mediante diversas prácticas de manejo de la resistencia, pero existe una necesidad creciente de agentes alternativos para el control de plagas. Los agentes biológicos para el control de plagas, como las cepas de Bacillus thuringiensis que expresan toxinas plaguicidas como \delta-endotoxinas, también han sido aplicados a plantas de cultivo con resultados satisfactorios, ofreciendo una alternativa o complemento a los plaguicidas químicos. Se han aislado los genes que codifican algunas de esas \delta-endotoxinas y su expresión en huéspedes heterólogos ha demostrado que proporcionan otra herramienta para el control de plagas de insectos importantes desde el punto de vista económico. En particular, la expresión de toxinas insecticidas en plantas transgénicas, como las \delta-endotoxinas de Bacillus thuringiensis, ha proporcionado una protección eficaz contra determinadas plagas de insectos, y las plantas transgénicas que expresan dichas toxinas se han comercializado permitiendo a los granjeros reducir las aplicaciones de agentes químicos para el control de insectos.

En la actualidad, se han identificado otros genes que no son de endotoxinas y se identificaron las proteínas que ellos codifican. Las patentes 5,877,012, 6,107,279, 6,137,033 y 6,291,156 así como Estruch et al. (1996, Proc. Natl. Acad. Sci. 93:5389-5394) y Yu et al. (1997, Appl. Environ. Microbiol. 63:532-536), incorporados en este documento por referencia, describen una nueva clase de proteínas insecticidas denominadas Vip3. Los genes vip3 codifican proteínas de aproximadamente 88 kDa que son producidas y secretadas por el Bacillus durante sus estadios vegetativos de crecimiento (proteínas insecticidas vegetativas, VIP, por sus siglas en inglés). La proteína Vip3 A posee actividad insecticida contra un amplio espectro de plagas lepidópteras, incluidas, pero no exclusivamente, gusano cortador grasiento (BCW, Agrotis ipsilon), gusano cogollero (FAW, Spodoptera frugiperda), gusano cogollero del tabaco (TBW, Heliothis virescens), y gusano elotero (CEW, Helicoverpa zea). Más recientemente, se encontró que plantas que expresan la proteína Vip3A son resistentes al daño por alimentación causado por plagas de insectos hemípteros. Por lo tanto, la proteína Vip3A exhibe un espectro de actividades insecticidas inigualable. Otras divulgaciones, WO 98/18932, WO 98/33991, WO 98/00546 y WO 99/57282, también identificaron actualmente homólogos de la clase de proteínas Vip3.

El uso continuo de agentes químicos y biológicos para controlar plagas de insectos aumenta la probabilidad de que éstos desarrollen resistencia a dichas medidas de control. Asimismo, sólo unas pocas plagas específicas de insectos son controlables con cada agente de control.

Por consiguiente, sigue siendo una necesidad descubrir agentes de control de plagas nuevos y eficaces que proporcionen un beneficio económico a los granjeros y que sean aceptables para el medio ambiente. Son particularmente necesarios agentes de control que estén dirigidos a un amplio espectro de plagas importantes desde el punto de vista económico, agentes de control que controlen eficazmente cepas de insectos que son o podrían tornarse resistentes a los agentes de control de insectos existentes, y aquellos con mayor potencia en comparación con los agentes de control actuales. Además, también son deseables agentes cuya aplicación reduzca al mínimo la carga sobre el ambiente.

Resumen

La presente invención apunta a la necesidad de nuevos agentes de control de plagas proporcionando nuevos genes y toxinas que son diferentes de los divulgados en las patentes de los Estados Unidos 5,877,012, 6,107,279 y 6,137,033, y en Estruch et al. (1996), y Yu et al. (1997), así como en WO 98/18932, WO 99/33991, WO 99/5782 y WO 98/00546.

En la presente invención, se proporcionan composiciones y métodos para controlar plagas vegetales. En particular, se proporcionan nuevas secuencias de ácido nucleico vip3 aisladas de Bacillus thuringiensis y secuencias sustancialmente idénticas a éstas, cuya expresión origina toxinas plaguicidas con toxicidad para plagas de insectos importantes desde el punto de vista económico, particularmente plagas de insectos que infectan plantas. La invención apunta además a nuevas toxinas plaguicidas resultantes de la expresión de las secuencias de ácido nucleico, y a composiciones y formulaciones que contengan toxinas plaguicidas, que sean capaces de inhibir la capacidad de las plagas de insectos para sobrevivir, crecer y reproducirse, o de limitar el daño relacionado con los insectos o la pérdida de las plantas de cultivo.

La invención se dirige además a métodos de uso de las secuencias de ácido nucleico en plantas transgénicas para conferir protección contra el daño causado por insectos, y a un método de uso de las toxinas plaguicidas y composiciones y formulaciones que comprenden las toxinas plaguicidas, por ejemplo mediante la aplicación de las toxinas plaguicidas o las composiciones o formulaciones para tratar profilácticamente áreas o plantas sensibles a los insectos, a fin de conferirles protección contra las plagas de insectos.

Las secuencias de nucleótidos de la presente invención se pueden modificar genéticamente usando métodos conocidos en el área a fin de alterar dichas secuencias de nucleótidos para una diversidad de propósitos que incluyen, pero no exclusivamente, ampliar el espectro de la actividad plaguicida o aumentar la actividad específica contra una plaga específica. Se pueden usar barajado del ADN (transposición de secuencias de ADN por fragmentación aleatoria) y reagrupación por PCR de los fragmentos de genes y oligonucleótidos sintéticos para modificar genéticamente las secuencias de nucleótidos.

Las nuevas toxinas plaguicidas descritas en este documento son sumamente activas contra insectos. Por ejemplo, una cantidad de plagas de insectos económicamente importantes, como los lepidópteros Ostrinia nubilalis (barrenador del maíz europeo), Plutella xylostella (palomilla dorso de diamante), Spodoptera frugiperda (gusano cogollero), Agrotis ipsilon (gusano cortador grasiento), Helicoverpa zea (gusano elotero), Heliothis virescens (gusano cogollero del tabaco), Spodoptera exigua (gusano soldado de la remolacha), Diatraea grandiosella (barrenador del maíz del sudoeste), Diatraea saccharalis (barrenador de la caña de azúcar), Helicoverpa punctigera (gusano nativo) y Helicoverpa armigera (gusano de la cápsula del algodón) se pueden controlar con toxinas plaguicidas. Las toxinas plaguicidas se pueden usar solas o en combinación con otras estrategias de control de insectos para conferir máxima eficacia de control de plagas con mínimo impacto sobre el ambiente.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una toxina que es activa contra insectos, donde la secuencia de nucleótidos: (a) tiene un complemento que se hibrida con los nucleótidos 1981-2367 de SEC. ID Nº: 1 en 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), NaPO_{4} 0.5 M, EDTA 1 mM a 50ºC con lavado en 0.1 X SSC, SDS al 0.1% a 65ºC; o (b) es isocodificante con la secuencia de nucleótidos de (a); o (c) tiene al menos 95% de identidad con SEC. ID. Nº: 1; o (d) codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 91% de identidad de secuencia con SEC. ID. Nº: 2.

En una realización de este aspecto, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que tiene un complemento que se hibrida con los nucleótidos 1981-2367 de SEC. ID. Nº: 1 en 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), NaPO_{4} 0.5 M, EDTA 1 mM a 50ºC con lavado en 0.1 X SSC, SDS al 0.1% a 65ºC.

En otra realización de este aspecto, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que es isocodificante con una secuencia de nucleótidos que tiene un complemento que se hibrida con los nucleótidos 1981-2367 de SEC. ID. Nº: 1 en 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), NaPO_{4} 0.5 M, EDTA 1 mM a 50ºC con lavado en 0.1 X SSC, SDS al 0.1% a 65ºC.

En otra realización, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad de secuencia con los nucleótidos 1981-2367 de SEC. ID. Nº: 1. Preferentemente, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con los nucleótidos 1981-2367 de SEC. ID. Nº: 1. Más preferentemente, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con los nucleótidos 1981-2367 de SEC. ID. Nº: 1. Aún más preferentemente, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 99% de identidad de secuencia con los nucleótidos 1981-2367 de SEC. ID. Nº: 1. Muy preferentemente, la molécula de ácido nucleico aislada comprende los nucleótidos 1981-2367 de SEC. ID. Nº: 1 o SEC. ID. Nº: 3.

En otra realización, la molécula de ácido nucleico aislada comprende la secuencia de nucleótidos que se expone en SEC. ID. Nº: 1, SEC. ID. Nº: 3, SEC. ID. Nº: 10, SEC. ID. Nº: 31 o SEC. ID. Nº: 33.

En una realización de la presente invención, la molécula de ácido nucleico aislada codifica la secuencia de aminoácidos que se expone en SEC. ID. Nº: 2, SEC. ID. Nº: 11 o SEC. ID. Nº: 32. Muy preferentemente, la molécula de ácido nucleico aislada codifica una toxina que comprende los aminoácidos 661-788 de SEC. ID. Nº: 2.

De acuerdo con una realización de la invención, la molécula de ácido nucleico aislada codifica una toxina que es activa contra insectos lepidópteros. Preferentemente, de acuerdo con esta realización, la toxina tiene actividad contra Ostrinia nubilalis (barrenador del maíz europeo), Plutella xylostella (palomilla dorso de diamante), Spodoptera frugiperda (gusano cogollero), Agrotis ipsilon (gusano cortador grasiento), Helicoverpa zea (gusano elotero), Heliothis virescens (gusano cogollero del tabaco), Spodoptera exigua (gusano soldado de la remolacha), Pectinophora gossypiella (lagarta rosada), Trichoplusia ni (gusano falso medidor de la col), Cochylis hospes (polilla de bandas del girasol), y Homeosoma electellum (polilla del girasol).

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La presente invención también proporciona un gen quimérico que comprende una secuencia promotora heteróloga unida operativamente a la molécula de ácido nucleico de la invención. Además, la presente invención proporciona un vector recombinante que comprende dicho gen quimérico. Aún además, la presente invención proporciona una célula huésped transgénica que comprende dicho gen quimérico. Una célula huésped transgénica de acuerdo con este aspecto de la invención puede ser una célula animal, un virus animal, un virus vegetal, una célula bacteriana, una célula de levadura o una célula vegetal, preferentemente, una célula vegetal. Incluso además, la presente invención proporciona una planta transgénica que comprende dicha célula vegetal. Una planta transgénica de acuerdo con este aspecto de la invención puede ser sorgo, trigo, girasol, tomate, hortalizas del grupo de las coles, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, colza oleaginosa o maíz, preferentemente maíz y algodón. Aún además, la presente invención proporciona semillas del grupo de las plantas transgénicas que consisten en sorgo, trigo, girasol, tomate, hortalizas del grupo de las coles, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, colza oleaginosa y maíz. En una realización particularmente preferida, la semilla es de una planta de maíz transgénico o de una planta de algodón transgénico.

La invención también proporciona plantas transgénicas de la invención que comprenden además una segunda secuencia de ácido nucleico o grupos de secuencias de ácido nucleico que codifican un segundo principio activo plaguicida. Las segundas secuencias de ácido nucleico particularmente preferidas son las que codifican una \delta-endotoxina, las que codifican otra toxina VIP (proteína insecticida vegetativa) o las que codifican una ruta para la producción de un principio activo plaguicida no proteico.

Aún en otro aspecto, la presente invención proporciona toxinas aisladas activas contra el barrenador del maíz europeo producidas por la expresión de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención.

En otra realización, las toxinas de la invención son activas contra insectos lepidópteros, preferentemente contra Plutella xylostella (palomilla dorso de diamante), Spodoptera frugiperda (gusano cogollero), Agrotis ipsilon (gusano cortador grasiento), Helicoverpa zea (gusano elotero), Heliothis virescens (gusano cogollero del tabaco), Spodoptera exigua (gusano soldado de la remolacha), Pectinophora gossypiella (lagarta rosada), Trichoplusia ni (gusano falso medidor de la col), Cochylis hospes (polilla de bandas del girasol), y Homeosoma electellum (polilla del girasol).

En una realización, las toxinas de la presente invención son producidas por un aislado de Bacillus thuringiensis seleccionado el grupo que consiste en C1674, designado como el registro NRRL B-30556; y C536, designado como el registro NRRL B-30557.

En otra realización, las toxinas son producidas por un clon de E. coli seleccionado del grupo que consiste en pNOV3910, designado como el registro NRRL B-30553; pNOV3911, designado como el registro NRRL B-30552; pNOV3906, designado como el registro NRRL B-30555; pNOV3905, designado como el registro NRRL B-30554; y pNOV3912, designado como el registro NRRL B-30551.

En otra realización, una toxina aislada de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 91% de identidad con la secuencia de aminoácidos que se expone en SEC. ID. Nº: 2. Preferentemente, la toxina aislada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos que se expone en SEC. ID. Nº: 2. Más preferentemente, la toxina aislada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos que se expone en SEC. ID. Nº: 2. Muy preferentemente, la toxina aislada comprende la secuencia de aminoácidos que se expone en SEC. ID. Nº: 2, SEC. ID. Nº: 11 o SEC. ID. Nº: 32.

La presente invención también proporciona una composición que contiene una cantidad eficaz para el control de insectos de una toxina de acuerdo con la invención.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una toxina activa contra insectos, que comprende: (a) obtener una célula huésped transgénica que comprenda un gen quimérico, el cual a su vez comprenda una secuencia promotora heteróloga unida operativamente a la molécula de ácido nucleico de la invención; y (b) expresar la molécula de ácido nucleico en la célula transgénica, lo que resulta en al menos una toxina activa contra insectos.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una planta transgénica resistente a los insectos, que comprende introducir una molécula de ácido nucleico de la invención en la planta transgénica, donde la molécula de ácido nucleico se puede expresar en la planta transgénica en una cantidad eficaz para controlar insectos. De acuerdo con una realización, los insectos son insectos lepidópteros, preferentemente seleccionados del grupo que consiste en: Ostrinia nubilalis (barrenador del maíz europeo), Plutella xylostella (palomilla dorso de diamante), Spodoptera frugiperda (gusano cogollero), Agrotis ipsilon (gusano cortador grasiento), Helicoverpa zea (gusano elotero), Heliothis virescens (gusano cogollero del tabaco), Spodoptera exigua (gusano soldado de la remolacha), Pectinophora gossypiella (lagarta rosada), Trichoplusia ni (gusano falso medidor de la col), Cochylis hospes (polilla de bandas del girasol) y Homeosoma electellum (polilla del girasol).

Aún en otro aspecto, la presente invención proporciona un método para controlar insectos que comprende suministrar a los insectos una cantidad eficaz de una toxina de la presente invención. De acuerdo con una realización, los insectos son insectos lepidópteros, preferentemente seleccionados del grupo que consiste en: Ostrinia nubilalis (barrenador del maíz europeo), Plutella xylostella (palomilla dorso de diamante), Spodoptera frugiperda (gusano cogollero), Agrotis ipsilon (gusano cortador grasiento), Helicoverpa zea (gusano elotero), Heliothis virescens (gusano cogollero del tabaco), Spodoptera exigua (gusano soldado de la remolacha), Pectinophora gossypiella (lagarta rosada), Trichoplusia ni (gusano falso medidor de la col), Cochylis hospes (polilla de bandas del girasol) y Homeosoma electellum (polilla del girasol). Preferentemente, la toxina se suministra a los insectos oralmente. En una realización preferida, la toxina se suministra oralmente a través de una planta transgénica que comprende la secuencia de ácido nucleico que expresa una toxina de la presente invención.

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La presente invención también proporciona toxinas híbridas activas contra insectos, donde las toxinas híbridas son codificadas por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención.

En una realización, las toxinas híbridas de la invención son activas contra insectos lepidópteros, preferentemente contra Ostrinia nubilalis (barrenador del maíz europeo), Plutella xylostella (palomilla dorso de diamante), Spodoptera frugiperda (gusano cogollero), Agrotis ipsilon (gusano cortador grasiento), Helicoverpa zea (gusano elotero), Heliothis virescens (gusano cogollero del tabaco), Spodoptera exigua (gusano soldado de la remolacha), Pectinophora gossypiella (lagarta rosada), Trichoplusia ni (gusano falso medidor de la col), Cochylis hospes (polilla de bandas del girasol) y Homeosoma electellum (polilla del girasol).

En otra realización, la toxina híbrida es codificada por el fragmento de ADN de aproximadamente 2.4 kb comprendido en el clon de E. coli pNOV3912, designado como el registro NRRL B-30551. En una realización preferida, la toxina híbrida es codificada por la secuencia de nucleótidos que se expone en SEC. ID. Nº: 10.

La presente invención también proporciona una composición que comprende una cantidad insecticidamente eficaz de una toxina híbrida de acuerdo con la invención.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una toxina híbrida que es activa contra insectos, que comprende: (a) obtener una célula huésped transgénica que comprenda un gen quimérico, el cual a su vez comprenda una secuencia promotora heteróloga unida operativamente a la molécula de ácido nucleico de la invención; y (b) expresar la molécula de ácido nucleico en la célula transgénica, lo que resulta en al menos una toxina híbrida que activa contra insectos.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una planta transgénica resistente a los insectos, que comprende introducir una molécula de ácido nucleico de la invención en la planta, donde la molécula de ácido nucleico codifica una toxina híbrida y donde la toxina híbrida se puede expresar en la planta transgénica en una cantidad eficaz para controlar un insecto. De acuerdo con una realización, los insectos son insectos lepidópteros, preferentemente seleccionados del grupo que consiste en Ostrinia nubilalis (barrenador del maíz europeo), Plutella xylostella (palomilla dorso de diamante), Spodoptera frugiperda (gusano cogollero), Agrotis ipsilon (gusano cortador grasiento), Helicoverpa zea (gusano elotero), Heliothis virescens (gusano cogollero del tabaco), Spodoptera exigua (gusano soldado de la remolacha), Pectinophora gossypiella (lagarta rosada), Trichoplusia ni (gusano falso medidor de la col), Cochylis hospes (polilla de bandas del girasol) y Homeosoma electellum (polilla del girasol).

Aún en otro aspecto, la presente invención proporciona un método para controlar un insecto que comprende suministrar a los insectos una cantidad eficaz de una toxina híbrida de la presente invención. De acuerdo con una realización, los insectos son insectos lepidópteros, preferentemente seleccionados del grupo que consiste en Ostrinia nubilalis (barrenador del maíz europeo), Plutella xylostella (palomilla dorso de diamante), Spodoptera frugiperda (gusano cogollero), Agrotis ipsilon (gusano cortador grasiento), Helicoverpa zea (gusano elotero), Heliothis virescens (gusano cogollero del tabaco), Spodoptera exigua (gusano soldado de la remolacha), Pectinophora gossypiella (lagarta rosada), Trichoplusia ni (gusano falso medidor de la col), Cochylis hospes (polilla de bandas del girasol) y Homeosoma electellum (polilla del girasol). Preferentemente la toxina híbrida se suministra a los insectos oralmente. En una realización preferida, la toxina híbrida se suministra oralmente a través de una planta transgénica que comprende una secuencia de ácido nucleico que expresa una toxina híbrida de la presente invención.

La presente invención también proporciona una toxina híbrida activa contra el barrenador del maíz europeo que comprende una región carboxi-terminal de una toxina Vip3 unida en la dirección de amino a carboxi a una región amino-terminal de una toxina Vip3 diferente, donde la región carboxi-terminal comprende los aminoácidos 661-788 de la SEC. ID. Nº: 2; y donde la región amino-terminal tiene al menos 85% de identidad, más preferentemente al menos 95% de identidad, muy preferentemente al menos 99% de identidad con los aminoácidos 1-660 de SEC. ID. Nº: 7. En una realización preferida, la región carboxi-terminal comprende los aminoácidos 661-788 de SEC. ID. Nº: 2, y la región amino-terminal comprende los aminoácidos 1-660 de SEC. ID. Nº: 5. En una realización muy preferida, la toxina híbrida comprende los aminoácidos 1-788 de SEC. ID. Nº: 11.

La toxina híbrida, de acuerdo con este aspecto de la invención, es preferentemente activa contra insectos lepidópteros, más preferentemente contra insectos lepidópteros seleccionados del grupo que consiste en Ostrinia nubilalis (barrenador del maíz europeo), Plutella xylostella (palomilla dorso de diamante), Spodoptera frugiperda (gusano cogollero), Agrotis ipsilon (gusano cortador grasiento), Helicoverpa zea (gusano elotero), Heliothis virescens (gusano cogollero del tabaco), Spodoptera exigua (gusano soldado de la remolacha), Pectinophora gossypiella (lagarta rosada), Trichoplusia ni (gusano falso medidor de la col), Cochylis hospes (polilla de bandas del girasol) y Homeosoma electellum (polilla del girasol).

Este aspecto de la invención también abarca una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la toxina híbrida de este aspecto.

Otros aspectos y ventajas de la presente invención se tornarán evidentes para los expertos a partir del estudio de la descripción siguiente de la invención y de los ejemplos no limitantes.

Breve descripción de las secuencias de la lista de secuencias

SEC. ID. Nº: 1: es una secuencia de nucleótidos de vip3C nativa.

SEC. ID. Nº: 2: es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC. ID. Nº: 1.

SEC. ID. Nº: 3: es una secuencia de nucleótidos de vip3C optimizada para maíz.

SEC. ID. Nº: 4: es una secuencia de nucleótidos de vip3A(a) nativa.

SEC. ID. Nº: 5: es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC. ID. Nº: 4.

SEC. ID. Nº: 6: es una secuencia de nucleótidos de vip3B nativa.

SEC. ID. Nº: 7: es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC. ID. Nº: 6.

SEC. ID. Nº: 8: es una secuencia de nucleótidos de vip3Z nativa.

SEC. ID. Nº: 9: es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC. ID. Nº: 8.

SEC. ID. Nº: 10: es una secuencia de nucleótidos de vip3A(a) híbrida.

SEC. ID. Nº: 11: es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC. ID. Nº: 10.

SEC. ID. Nº: 12-29: son secuencias cebadoras (primers) útiles para practicar la invención.

SEC. ID. Nº: 30: es la secuencia de nucleótidos del vector pNOV2149.

SEC. ID. Nº: 31: es la secuencia de nucleótidos de vip3C-12168.

SEC. ID. Nº: 32: es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC. ID. Nº: 31.

SEC. ID. Nº: 33: es la secuencia de nucleótidos de vip3C-12168 optimizada para maíz.

Depósitos

El material siguiente se depositó en la colección de cultivos a los fines del procedimiento en materia de patentes, Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, bajo los términos del tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en Materia de Patentes. Todas las restricciones sobre la disponibilidad del material depositado serán irrevocablemente eliminadas una vez otorgada la patente.

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Definiciones

"Actividad" de las toxinas de la invención significa que las toxinas actúan como agentes de control de insectos activos por vía oral, tienen un efecto tóxico, o son capaces de interrumpir o impedir que los insectos se alimenten, lo que puede causar, o no, la muerte de los mismos. Cuando una toxina de la invención se suministra al insecto, el resultado es habitualmente la muerte del insecto, o que el insecto no se alimente de la fuente que hace que la toxina esté a su disposición.

"Asociada a/unida operativamente a" se refiere a dos secuencias de ácido nucleico que están relacionadas física o funcionalmente. Por ejemplo, se dice que una secuencia de ADN promotora o reguladora está "asociada a" una secuencia de ADN que codifica un ARN o una proteína, si las dos secuencias están unidas operativamente, o situadas de modo que la secuencia de ADN reguladora afectará el nivel de expresión de la secuencia de ADN codificante o estructural.

Un "gen quimérico" es una secuencia de ácido nucleico recombinante en la cual una secuencia de ácido nucleico promotora o reguladora está unida operativamente, o asociada a, una secuencia de ácido nucleico que codifica un ARNm o que se expresa como una proteína, de modo que la secuencia de ácido nucleico reguladora sea capaz de regular la transcripción o la expresión de la secuencia de ácido nucleico asociada. La secuencia de ácido nucleico reguladora del gen quimérico no está normalmente unida operativamente a la secuencia de ácido nucleico asociada como se encuentra en la naturaleza.

Una "secuencia codificante" es una secuencia de ácido nucleico que se transcribe en ARN como ARNm, ARN r, ARNt, ARNsn, ARN sentido o ARN antisentido. Preferentemente el ARN se traduce después en un organismo para producir una proteína.

"Controlar" insectos significa inhibir, a través de un efecto tóxico, la capacidad de las plagas de insectos para sobrevivir, crecer, alimentarse y/o reproducirse, o limitar el daño o las pérdidas, relacionados con los insectos, en las plantas de cultivo. "Controlar" insectos puede significar, o no, matar los insectos, aunque es preferible que signifique matar los insectos.

Correspondiente a: en el contexto de la presente invención, "correspondiente a" o "corresponde a" significa que cuando las secuencias codificantes de ácido nucleico o las secuencias de aminoácidos de genes o proteínas Vip3 están alineadas unas con otras, el ácido nucleico o los aminoácidos que "corresponden a" determinadas posiciones enumeradas son los que se alinean con esas posiciones pero que no están necesariamente en esas exactas posiciones numéricas en relación con la respectiva secuencia codificante de ácido nucleico o secuencia de aminoácidos de la Vip3 particular. Análogamente, cuando la secuencia codificante o secuencia de aminoácidos de una Vip3 particular (por ejemplo, Vip3Z) se alinea con la secuencia codificante o secuencia de aminoácidos de una Vip3 de referencia (por ejemplo, Vip3C), los ácidos nucleicos o aminoácidos en la secuencia Vip3Z que "corresponden a" determinadas posiciones enumeradas de la secuencia Vip3C son los que se alinean con esas posiciones de la secuencia Vip3C, pero no están necesariamente en esas exactas posiciones numéricas en la respectiva secuencia codificante de ácido nucleico o secuencia de aminoácidos de la proteína Vip3Z.

"Suministrar" una toxina significa que la toxina entra en contacto con un insecto, produciendo un efecto tóxico y el control del insecto. La toxina se puede suministrar de muchas maneras conocidas, p. ej., oralmente mediante ingestión por el insecto o mediante contacto con el insecto a través de: la expresión en una planta transgénica, composiciones de proteínas formuladas, composiciones de proteínas pulverizables, una matriz de cebo, o cualquier otro sistema de suministro de toxinas conocido en el área.

"Cantidad eficaz para controlar insectos" significa esa concentración de toxina que inhibe, a través de un efecto tóxico, la capacidad de los insectos para sobrevivir, crecer, alimentarse y/o reproducirse, o que limita el daño o la pérdida, relacionados con los insectos, en las plantas de cultivo. "Cantidad eficaz para controlar insectos" puede significar, o no, matar los insectos, aunque es preferible que signifique matar los insectos.

"Casete de expresión" como se usa en este documento significa una secuencia de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos particular en una célula huésped adecuada, que comprende un promotor unido operativamente a la secuencia de nucleótidos de interés la cual está unida operativamente a las señales de terminación. También comprende habitualmente las secuencias requeridas para la traducción adecuada de la secuencia de nucleótidos. El casete de expresión que comprende las secuencia de nucleótidos de interés puede ser quimérico, lo que significa que al menos uno de sus componentes es heterólogo con respecto a al menos uno de sus otros componentes. El casete de expresión puede también ser de origen natural pero que haya sido obtenido en forma recombinante útil para la expresión de heterólogos. Habitualmente, sin embargo, el casete de expresión es heterólogo con respecto al huésped, es decir, la secuencia de ácido nucleico particular del casete de expresión no se encuentra naturalmente en la célula huésped y debe ser introducida en la célula huésped o en un ancestro de la célula huésped mediante un fenómeno de transformación. La expresión de la secuencia de nucleótidos en el casete de expresión puede estar bajo el control de un promotor constitutivo o de un promotor inducible que inicie la transcripción sólo cuando la célula huésped es expuesta a algún estímulo externo particular. En el caso de un organismo multicelular, como una planta, el promotor también puede ser específico para un tejido, órgano o etapa del desarrollo particulares.

Un "gen" es una región definida que está ubicada dentro de un genoma y que, además de la secuencia de ácido nucleico codificante mencionada antes, comprende otras secuencias de ácido nucleico, principalmente reguladoras, responsables del control de la expresión, es decir la transcripción y la traducción, de la porción codificante. Un gen también puede comprender otras secuencias 5' y 3' sin traducir y secuencias de terminación. Otros elementos que pueden estar presentes son, por ejemplo, los intrones.

"Gen de interés" se refiere a cualquier gen que, cuando es transferido a una planta, le confiere a la planta una característica deseada como resistencia a los antibióticos, resistencia a los virus, resistencia a los insectos, resistencia a la enfermedad o resistencia a otras plagas, tolerancia a herbicidas, mayor valor nutricional, mayor rendimiento en un proceso industrial o capacidad reproductiva alterada. El "gen de interés" puede también ser un gen que se transfiera a las plantas para producir en la planta enzimas o metabolitos comercialmente valiosos.

Una secuencia de ácido nucleico "heteróloga" es una secuencia de ácido nucleico que no está naturalmente asociada a la célula huésped en la cual es introducida, inclusive las múltiples copias que no son de origen natural de una secuencia de ácido nucleico que es de origen natural.

Una secuencia de ácido nucleico "homóloga" es una secuencia de ácido nucleico asociada naturalmente a la célula huésped en la cual es introducida.

"Recombinación homóloga" es el intercambio recíproco de fragmentos de ácido nucleico entre moléculas de ácido nucleico homólogas.

"Toxina híbrida" como se usa en este documento es una toxina insecticida elaborada por el hombre que comprende regiones de aminoácidos o fragmentos de una toxina unidas con regiones de aminoácidos o fragmentos de otra toxina diferente. Por ejemplo, pero no exclusivamente, unir la región C-terminal de Vip3C, desde los aminoácidos 661 a 788 de SEC. ID. Nº: 2, con la región N-terminal de Vip3A, desde los aminoácidos 1 a 660 de SEC. ID. Nº: 5, crea una toxina híbrida con una secuencia de aminoácidos que se expone en SEC. ID. Nº: 11.

"Insecticida" se define como una actividad biológica tóxica capaz de controlar insectos, preferentemente matándolos.

Una secuencia de ácido nucleico es "isocodificante con" una secuencia de ácido nucleico de referencia cuando la secuencia de ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico de referencia.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" o una proteína o toxina aislada es una molécula de ácido nucleico o proteína o toxina que, por la acción del hombre, existe aparte de su entorno natural y por lo tanto no es un producto de la naturaleza. Una molécula de ácido nucleico o proteína o toxina aislada puede existir en forma purificada o puede existir en un entorno no natural como, por ejemplo, una célula huésped recombinante o una planta transgénica.

Nativo: se refiere a un gen que está presente en el genoma de una célula sin transformar.

De origen natural: la expresión "de origen natural" se usa para describir un objeto que se puede encontrar en la naturaleza en vez de ser producido artificialmente por el hombre. Por ejemplo, una proteína o secuencia de nucleótidos presente en un organismo (inclusive un virus), que se puede aislar de una fuente de la naturaleza y que no ha sido intencionalmente modificada por el hombre en el laboratorio, es de origen natural.

Una "molécula de ácido nucleico" o "secuencia de ácido nucleico" es un segmento lineal de ADN o ARN monocatenario o bicatenario que se puede aislar de cualquier fuente. En el contexto de la presente invención, la molécula de ácido nucleico es preferentemente un segmento de ADN.

Una "planta" es cualquier planta en cualquier etapa del desarrollo, particularmente una planta de semilla.

Una "célula vegetal" es una unidad estructural y fisiológica de una planta, que comprende un protoplasto y una pared celular. La célula vegetal puede estar en forma de una única célula aislada o de una célula cultivada, o como parte de una unidad organizada mayor como, por ejemplo, el tejido de una planta, el órgano de una planta o una planta entera.

"Cultivo celular vegetal" significa cultivos de unidades vegetales, por ejemplo, protoplastos, células de cultivo celular, células de tejidos de plantas, polen, tubos de polen, óvulos, sacos embrionarios, cigotos y embriones en diversas etapas del desarrollo.

"Material vegetal" se refiere a hojas, tallos, raíces, flores o partes de flores, frutas, polen, células huevo, cigotos, semillas, gajos, cultivos celulares o tisulares, o cualquier otra parte o producto de una planta.

Un "órgano de una planta" es una parte definida y visiblemente estructurada y diferenciada de una planta como una raíz, un tallo, una hoja, un botón de una flor o un embrión.

"Tejido vegetal" como se usa en este documento significa un grupo de células vegetales organizado en una unidad estructural y funcional. Se incluye cualquier tejido vegetal en una planta o en cultivo. Este término incluye, pero no exclusivamente, la planta entera, los órganos de la planta, las semillas de la planta, el cultivo tisular y todos los grupos de células vegetales organizadas en unidades estructurales y funcionales. El uso de este término junto con, o en ausencia de, cualquier tipo específico de tejido vegetal como los indicados antes o que de otra manera esté comprendido por esta definición, no pretende ser exclusivo de ningún otro tipo de tejido vegetal.

Un "promotor" es una secuencia ADN sin traducir secuencia arriba de la región codificante que contiene el sitio de unión para la ARN polimerasa 11 y que inicia la transcripción del ADN. La región del promotor también puede incluir otros elementos que actúan como reguladores de la expresión de los genes.

Un "protoplasto" es una célula vegetal aislada sin pared celular o sólo con partes de la pared celular.

"Elementos reguladores" se refiere a las secuencias que participan en el control de la expresión de una secuencia de nucleótidos. Los elementos reguladores comprenden un promotor unido operativamente a la secuencia de nucleótidos de interés y a las señales de terminación. También comprenden típicamente las secuencias requeridas para la traducción adecuada de la secuencia de nucleótidos.

Sustancialmente idénticas: la frase "sustancialmente idénticas", en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico o proteínas, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen al menos 60%, preferentemente 80%, más preferentemente 90%, aún más preferentemente 95%, y muy preferentemente al menos 99% de identidad en los residuos de nucleótidos o aminoácidos, cuando se los compara y alinea para máxima correspondencia, según se mide usando uno de los algoritmos de comparación de secuencias siguientes o mediante inspección visual. Preferentemente, la identidad sustancial existe en una región de las secuencias que es de al menos aproximadamente 50 residuos de longitud, más preferentemente en una región de al menos aproximadamente 100 residuos, y muy preferentemente las secuencias son sustancialmente idénticas en al menos aproximadamente 150 residuos. En una realización especialmente preferida, las secuencias son sustancialmente idénticas en toda la longitud de las regiones codificantes. Además, las secuencias de ácido nucleico o proteínas sustancialmente idénticas realizan prácticamente la misma función.

Para la comparación de secuencias, habitualmente una secuencia actúa como secuencia de referencia respecto a la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se ingresan en una computadora, se designan coordenadas de subsecuencias si es necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmo de secuencias. Después el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de las secuencias para las secuencias de prueba con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros designados del programa.

El alineamiento óptimo de las secuencias para comparación se puede realizar, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante la búsqueda de similitud por el método de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad Sci. EE.UU 85: 2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de esos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de programas informáticos de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección visual (consulte en general, Ausubel et al., más adelante).

Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). El programa informático para realizar análisis BLAST está disponible para el público a través del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica primero identificar pares de secuencias con puntajes altos (HSP, por sus siglas en inglés) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de interrogación, con un puntaje umbral T de correspondencia exacta o algo positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud de una secuencia de una base de datos. T es el puntaje umbral de las palabras del vecindario (Altschul et al., 1990). Estas secuencias similares (hits) iniciales del vecindario actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar pares de segmentos de alto puntaje (HSP) más largos que las contengan. Las secuencias similares (hits) de palabras se extienden después en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tan lejos como se pueda incrementar el puntaje de alineamiento acumulado. Los puntajes acumulados se calculan usando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntaje de recompensa para un par de residuos que se aparean; siempre> 0) y N (puntaje de penalización para residuos que no se aparean; siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos se usa una matriz de puntuación para calcular el puntaje acumulado. La extensión de los hits de palabras en cada dirección se detiene cuando el puntaje de alineación acumulado cae fuera en la cantidad X de su máximo valor alcanzado, el puntaje acumulado tiende a cero o por debajo debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos con puntuación negativa, o cuando se alcanza el extremo de alguna de las secuencias. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, un corte de 100, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas hebras. Para la secuencia de aminoácidos, el programa BLASTP usa por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (consulte Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad Sci. EE.UU. 89:10915 (1989)).

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Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (consulte, por ej., Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. EE.UU. 90: 5873-5787 (1993)). Una medida de la similitud provista por el algoritmo BLAST es la menor suma de probabilidades (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual ocurriría un apareamiento entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos al azar. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico de prueba se considera similar a una secuencia de referencia si la menor suma de probabilidades en una comparación de la secuencia de ácido nucleico de prueba con la secuencia de ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0.1, más preferentemente menor de aproximadamente 0.01 y muy preferentemente menor de aproximadamente 0.001.

Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas se hibriden entre sí en condiciones restrictivas. La frase "se hibrida específicamente con" se refiere a la unión, duplicación o hibridación de una molécula sólo con una secuencia de nucleótidos particular en condiciones restrictivas, cuando esa secuencia está presente en una mezcla compleja (p. ej., celular total) de ADN o ARN "Se une sustancialmente" se refiere a la hibridación complementaria entre un ácido nucleico sonda y un ácido nucleico blanco y abarca los apareamientos erróneos menores que se pueden acomodar reduciendo la restricción del medio de hibridación para lograr la detección deseada de la secuencia de ácido nucleico blanco.

Las "condiciones de hibridación restrictivas" y "condiciones de lavado de hibridación restrictivas" en el contexto de los experimentos de hibridación de ácido nucleico como las hibridaciones Southern y Northern son dependientes de la secuencia y son diferentes bajo parámetros ambientales diferentes. Las secuencias más largas se hibridan específicamente a mayores temperaturas. Una guía extensa para la hibridación de ácido nucleico se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes parte I, capítulo 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" Elsevier, Nueva York. Generalmente, se seleccionan las condiciones de hibridación y de lavado muy restrictivas para que sean aproximadamente 5ºC por debajo del punto de fusión térmico (T_{m}) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. Típicamente, una sonda "en condiciones restrictivas" se hibridará con su subsecuencia blanco, pero no con otras secuencias.

La T_{m} es la temperatura (en las condiciones de fuerza iónica y pH definidas) a la cual 50% de la secuencia blanco se hibrida con una sonda que corresponde perfectamente. Las condiciones muy restrictivas se seleccionan para que sean igual a la T_{m} para una sonda en particular. Un ejemplo de condiciones de hibridación restrictivas para la hibridación en un filtro de ácidos nucleicos complementarios que tengan más de 100 residuos complementarios, en una transferencia Southern o Northern, es 50% de formamida con 1 mg de heparina a 42ºC, donde la hibridación se lleva a cabo durante la noche. Un ejemplo de condiciones de lavado muy restrictivas es NaCl 0.15 M a 72ºC durante aproximadamente 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de lavado restrictivas es un lavado con 0.2 x SSC a 65ºC durante 15 minutos (consulte, Sambrook, más adelante, por una descripción del tampón SSC). A menudo, un lavado muy restrictivo es precedido por un lavado de baja restricción para eliminar la señal de fondo de la sonda. Un ejemplo de lavado con restricción media para un dúplex de, por ej., más de 100 nucleótidos, es 1 x SSC a 45ºC durante 15 minutos. Un ejemplo de lavado con baja restricción para un dúplex de, por ej., más de 100 nucleótidos, es 4 a 6 x SSC a 40ºC durante 15 minutos. Para sondas cortas (p. ej, de aproximadamente 10 a 50 nucleótidos), las condiciones restrictivas implican concentraciones de sal menores de aproximadamente 1.0 M de ión Na, típicamente una concentración entre aproximadamente 0.01 y 1.0 M de ión Na (u otras sales) a pH entre 7.0 y 8.3, y la temperatura es típicamente al menos aproximadamente 30ºC. También se pueden lograr las condiciones restrictivas agregando agentes desestabilizantes como formamida. En general, una relación señal ruido de 2 x (o superior) a la observada para una sonda no relacionada con el ensayo de hibridación particular, indica detección de una hibridación específica. Los ácidos nucleicos que no se hibridan entre sí en condiciones restrictivas son aún sustancialmente idénticos si las proteínas que codifican son sustancialmente idénticas. Esto ocurre, por ej., cuando una copia de un ácido nucleico se crea usando la máxima degeneración de codón permitida por el código genético.

Los siguientes son ejemplos de conjuntos de condiciones de hibridación/lavado que se pueden usar para clonar secuencias de nucleótidos homólogas que son sustancialmente idénticas a las secuencias de nucleótidos de referencia de la presente invención: una secuencia de nucleótidos de referencia se hibrida preferentemente con la secuencia de nucleótidos de referencia en solución de dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, NaPO_{4} 0.5 M, EDTA 1 mM a 50ºC con lavado en 2 X SSC, SDS al 0.1% a 50ºC, más deseablemente en dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, NaPO_{4} 0.5 M, EDTA 1 mM a 50ºC con lavado en 1 X SSC, SDS al 0.1% a 50ºC, aún más deseablemente en dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, NaPO_{4} 0.5 M, EDTA 1 mM a 50ºC con lavado en 0.5 X SSC, SDS al 0.1% a 50ºC, preferentemente en dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, NaPO_{4} 0.5 M, EDTA 1 mM a 50ºC con lavado en 0.1 X SSC, SDS al 0.1% a 50ºC, más preferentemente en dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, NaPO_{4} 0.5 M, EDTA 1 mM a 50ºC con lavado en 0.1 X SSC, SDS al 0.1% a 65ºC.

Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico o proteínas son sustancialmente idénticas es que la proteína codificada por el primer ácido nucleico tenga reactividad inmunológica cruzada con, o se una específicamente a, la proteína codificada por el segundo ácido nucleico. Por lo tanto, una proteína es típicamente sustancialmente idéntica a una segunda proteína, por ejemplo, cuando las dos proteínas difieren sólo en sustituciones conservativas.

"Sintética" se refiere a una secuencia de nucleótidos que comprende caracteres estructurales que no están presentes en la secuencia natural. Por ejemplo, una secuencia artificial que se asemeja lo más posible al contenido de G+C y a la distribución normal de codones de los genes de dicotiledóneas y/o monocotiledóneas se dice que es sintética.

"Transformación" es un proceso para introducir ácido nucleico heterólogo en una célula u organismo huésped. En particular, "transformación" significa la integración estable de una molécula de ADN en el genoma de un organismo de interés.

"Transformado/transgénico/recombinante" se refiere al organismo huésped como una bacteria o una planta en la cual se ha introducido una molécula de ácido nucleico heterólogo. La molécula de ácido nucleico puede estar integrada establemente en el genoma de un huésped o la molécula de ácido nucleico también puede estar presente como una molécula extracromosómica. Dicha molécula extracromosómica puede ser autorreplicativa. Se comprende que las células, los tejidos o las plantas transformados abarcan no sólo el producto final de un proceso de transformación, sino también su progenie transgénica. Un huésped "no transformado", "no transgénico" o "no recombinante" se refiere a un organismo silvestre, p. ej., una bacteria o planta, que no contiene la molécula de ácido nucleico heterólogo.

La "clase de proteínas Vip3" comprende Vip3A(a), Vip3A(b), Vip3A(c), Vip3B, Vip3C(a), Vip3C(b), Vip3Z y sus homólogos. "Homólogo" se usa en todas partes con el significado de que la proteína o polipéptido indicado tiene una relación definida con otros miembros de la clase de proteínas Vip3. Esta relación definida incluye, pero no exclusivamente, 1) proteínas que son al menos 70%, más preferentemente al menos 80% y muy preferentemente al menos 90% idénticas a nivel de la secuencia con otros integrantes de la clase de proteínas Vip3 manteniendo simultáneamente la actividad plaguicida, 2) proteínas que tienen reactividad cruzada con anticuerpos que reconocen inmunológicamente otro integrante de la clase de proteínas Vip3, 3) proteínas que tienen reactividad cruzada con un receptor para otro integrante de la clase de proteínas Vip3 y que retienen la capacidad para inducir la muerte celular programada, y 4) proteínas que son al menos 70%, más preferentemente al menos 80% y muy preferentemente al menos 90% idénticas, a nivel de la secuencia, con la región central tóxica de otro integrante de la clase de proteínas Vip3 manteniendo simultáneamente la actividad plaguicida. Otros homólogos Vip3 se divulgaron en WO 98/18932, WO 98/33991, WO 98/00546 y WO 99/57282.

Los nucleótidos se indican por sus bases mediante las abreviaturas estándar siguientes: adenina (A), citosina (C), timina (T) y guanina (G). De igual manera los aminoácidos se indican mediante las abreviaturas estándar siguientes: alanina (Ala; A), arginina (Arg; R), asparragina (Asn; N), ácido aspártico (Asp; D), cisteína (Cys; C), glutamina (Gln; Q), ácido glutámico (Glu; E), glicina (Gly; G), histidina (His; H), isoleucina (Ile; 1), leucina (Leu; L), lisina (Lys; K), metionina (Met; M), fenilalanina (Phe; F), prolina (Pro; P), serina (Ser; S), treonina (Thr; T), triptofano (Trp; W), tirosina (Tyr; Y) y valina (Val; V).

Descripción detallada de la invención

Esta invención se refiere a secuencias de ácido nucleico cuya expresión produce nuevas toxinas, y a la preparación y uso de las toxinas para controlar plagas de insectos. Las secuencias de ácido nucleico derivan del Bacillus, un microorganismo grampositivo formador de esporas. En particular, se proporcionan nuevas proteínas Vip3, útiles como plaguicidas.

A los fines de la presente invención, las plagas de insectos incluyen insectos seleccionados de, por ejemplo, los órdenes Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera y Trichoptera, particularmente Lepidoptera.

Las tablas 1 a 7 proporcionan una lista de plagas asociadas con las plantas de cultivo principales. Dichas plagas están incluidas en el campo de acción de la invención.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

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TABLA 2

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TABLA 3

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TABLA 4

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TABLA 5

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TABLA 6

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TABLA 7

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La expresión de las secuencias de ácido nucleico de la presente invención produce toxinas que se pueden usar contra insectos lepidópteros, por ejemplo, pero no exclusivamente contra Ostrinia nubilalis (barrenador del maíz europeo), Plutella xylostella (palomilla dorso de diamante), Spodoptera frugiperda (gusano cogollero), Agrotis ipsilon (gusano cortador grasiento), Helicoverpa zea (gusano elotero), Heliothis virescens (gusano cogollero del tabaco), Spodoptera exigua (gusano soldado de la remolacha), Pectinophora gossypiella (lagarta rosada), Trichoplusia ni (gusano falso medidor de la col), Cochylis hospes (polilla de bandas del girasol) y Homeosoma electellum (polilla del girasol).

En una realización preferida, la invención abarca una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que: (a) tiene un complemento que se hibrida con los nucleótidos 1981-2367 de SEC. ID Nº: 1 en 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), NaPO4 0.5 M, EDTA 1 mM a 50ºC con lavado en 0.1 X SSC, SDS al 0.1% a 65ºC; o (b) es isocodificante con la secuencia de nucleótidos de (a); o (c) tiene al menos 95% de identidad de secuencia con SEC. ID. Nº: 1; o (d) codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 91% de identidad de secuencia con SEC. ID. Nº: 2, donde la expresión de la molécula de ácido nucleico aislada produce actividad de control de insectos. Cuando se expresa en un huésped heterólogo, la molécula de ácido nucleico de SEC. ID. Nº: 1, SEC. ID. Nº: 3, SEC. ID. Nº: 10 y SEC. ID. Nº: 31 da lugar a una actividad de control de insectos contra Ostrinia nubilalis (barrenador del maíz europeo), Plutella xylostella (palomilla dorso de diamante), Spodoptera frugiperda (gusano cogollero), Agrotis ipsilon (gusano cortador grasiento), Helicoverpa zea (gusano elotero), Heliothis virescens (gusano cogollero del tabaco), Spodoptera exigua (gusano soldado de la remolacha), Pectinophora gossypiella (lagarta rosada), Trichoplusia ni (gusano falso medidor de la col), Cochylis hospes (polilla de bandas del girasol) y Homeosoma electellum (polilla del girasol), lo que demuestra que la secuencia de nucleótidos que se expone en SEC. ID. Nº: 1, SEC. ID. Nº: 3, SEC. ID. Nº: 10 y SEC. ID. Nº: 31 es suficiente para dicha actividad de control de insectos.

En una realización, la invención abarca una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad de secuencia con los nucleótidos 1981-2367 de SEC. ID. Nº: 1. Preferentemente, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con los nucleótidos 1981-2367 de SEC. ID. Nº: 1. Más preferentemente, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con los nucleótidos 1981-2367 de SEC. ID. Nº: 1. Aún más preferentemente, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 99% de identidad de secuencia con los nucleótidos 1981-2367 de SEC. ID. Nº: 1. Muy preferentemente, la molécula de ácido nucleico aislada comprende los nucleótidos 1981-2367 de SEC. ID. Nº: 1 o SEC. ID. Nº: 3.

En otra realización, la invención abarca una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con SEC. ID. Nº: 1. Más preferentemente, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 99% de identidad de secuencia con SEC. ID. Nº: 1. Muy preferentemente, la molécula de ácido nucleico aislada comprende la secuencia de nucleótidos que se expone en SEC. ID. Nº: 1, SEC. ID. Nº: 3, SEC. ID. Nº: 10, SEC. ID. Nº: 31 o SEC. ID. Nº: 33.

Aún en otra realización, la invención abarca una molécula de ácido nucleico comprendida en un aislado de Bacillus thuringiensis seleccionado del grupo que consiste en C1674, designado como el registro NRRL B-30556; y C536, designado como el registro NRRL B-30557. En una realización preferida, la invención abarca una molécula de ácido nucleico comprendida en un clon de E. coli seleccionado del grupo que consiste en pNOV3910, designado como el registro NRRL B-30553; pNOV3911, designado como el registro NRRL B-30552; pNOV3906, designado como el registro NRRL B-30555; pNOV3905, designado como el registro NRRL B-30554; y pNOV3912, designado como el registro NRRL B-30551, cuya expresión produce una toxina insecticida.

La presente invención también abarca una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la secuencia de aminoácidos que se expone en SEC. ID. Nº: 2, SEC. ID: NO: 11 o SEC. ID. Nº: 32. Muy preferentemente, la molécula de ácido nucleico aislada codifica una toxina que comprende los aminoácidos 661-788 de la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 2.

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La presente invención también abarca vectores recombinantes que comprenden las secuencias de ácido nucleico de la invención. En dichos vectores, las secuencias de ácido nucleico están preferentemente comprendidas en casetes de expresión que contienen elementos reguladores para la expresión de las secuencias de nucleótidos en una célula huésped transgénica capaz de expresar dichas secuencias de nucleótidos. Dichos elementos reguladores comprenden generalmente señales promotoras y de terminación y también comprenden preferentemente elementos que permiten una traducción eficaz de los polipéptidos codificados por las secuencias de ácido nucleico de la presente invención. Los vectores que comprenden las secuencias de ácido nucleico son generalmente capaces de replicarse en células huésped particulares, preferentemente como moléculas extracromosómicas, y se utilizan por consiguiente para amplificar las secuencias de ácido nucleico de esta invención en las células huésped. En una realización, las células huésped para dichos vectores son microorganismos, como bacterias, en particular E. coli. En otra realización, las células huéspedes para dichos vectores recombinantes son endófitos o epífitos. Una célula huésped preferida para dichos vectores es una célula eucariota, como una célula de levadura, una célula vegetal o una célula de un insecto. Las células vegetales como las células de maíz o algodón son células huésped muy preferidas. En otra realización preferida, dichos vectores son vectores virales y se usan para la replicación de las secuencias de nucleótidos en células huésped particulares, por ejemplo células de insectos o células vegetales. Los vectores recombinantes también se usan para la transformación de las secuencias de nucleótidos de esta invención en células huésped transgénicas, mediante lo cual las secuencias de nucleótidos se integran establemente en el ADN de dichas células huésped transgénicas. En una realización, dichas células huésped transgénicas son células procariotas. En una realización preferida, dichas células huésped transgénicas son células eucariotas, como células de levadura, células de insectos o células vegetales. En una realización muy preferida, las células huésped transgénicas son células vegetales, como células de maíz o de algodón.

En realizaciones preferidas, las toxinas insecticidas de la invención comprenden un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos de la invención. En otra realización preferida, la toxina es producida por un aislado de Bacillus thuringiensis seleccionado del grupo que consiste en C1674, designado como el registro NRRL B-30556; y C536, designado como el registro NRRL B-30557.

En otra realización, las toxinas son producidas por un clon de E. coli seleccionado del grupo que consiste en pNOV3910, designado como el registro NRRL B-30553; pNOV3911, designado como el registro NRRL B-30552; pNOV3906, designado como el registro NRRL B-30555; pNOV3905, designado como el registro NRRL B-30554; y pNOV3912, designado como el registro NRRL B-30551. En una realización preferida, la toxina se produce mediante la expresión de la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 1-2367 de SEC. ID. Nº: 1 o los nucleótidos 1-2367 de SEC. ID. Nº: 3 o los nucleótidos 1-2367 de SEC. ID. Nº: 10 o los nucleótidos 1-2367 de SEC. ID. Nº: 31.

En otra realización preferida, una toxina aislada de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 91% de identidad con la secuencia de aminoácidos que se expone en SEC. ID. Nº: 2. Preferentemente, la toxina aislada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos que se expone en SEC. ID. Nº: 2. Más preferentemente, la toxina aislada comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos que se expone en SEC. ID. Nº: 2. Muy preferentemente, la toxina aislada comprende la secuencia de aminoácidos que se expone en SEC. ID. Nº: 2, SEC. ID. Nº: 11 o SEC. ID. Nº: 32.

Las toxinas de la presente invención tienen actividad de control de insectos cuando se las prueba contra plagas de insectos en bioensayos. En otra realización preferida, las toxinas de la invención son activas contra insectos lepidópteros, preferentemente contra Ostrinia nubilalis (barrenador del maíz europeo), Plutella xylostella (palomilla dorso de diamante), Spodoptera frugiperda (gusano cogollero), Agrotis ipsilon (gusano cortador grasiento), Helicoverpa zea (gusano elotero), Heliothis virescens (gusano cogollero del tabaco), Spodoptera exigua (gusano soldado de la remolacha), Pectinophora gossypiella (lagarta rosada), Trichoplusia ni (gusano falso medidor de la col), Cochylis hospes (polilla de bandas del girasol) y Homeosoma electellum (polilla del girasol). Las propiedades de control de insectos de las toxinas insecticidas de la invención se ilustran en mayor profundidad en los ejemplos 6, 8, 9 y 13.

La presente invención también abarca toxinas híbridas que son activas contra insectos, donde dichas toxinas híbridas son codificadas por moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos que: (a) tiene un complemento que se hibrida con los nucleótidos 1981-2367 de SEC. ID. Nº: 1 en dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, NaPO_{4} 0.5 M, EDTA 1 mM a 50ºC con lavado en 0.1 X SSC, SDS al 0.1% a 65ºC; o (b) es isocodificante con la secuencia de nucleótidos de (a); o (c) comprende una porción de nucleótidos de 20 pares de bases consecutivas idéntica en secuencia a una porción de nucleótidos de 20 pares de bases consecutivas de una secuencia de nucleótidos de (a) o (b), donde la expresión de la molécula de ácido nucleico da lugar a actividad de control de insectos. En una realización preferida, la toxina híbrida es codificada por el fragmento de ADN de aproximadamente 2.4 kb comprendido en pNOV3912, depositado en la cepa de E. coli DH5\alpha designada como el registro NRRL B-30551, cuya expresión produce una toxina híbrida insecticida. En este documento se ejemplifica específicamente una toxina híbrida que es codificada por la secuencia de nucleótidos que se expone en SEC. ID. Nº: 10. Cuando se expresa en un huésped heterólogo, la molécula de ácido nucleico de SEC. ID. Nº: 10 da lugar a actividad de control de insectos contra Ostrinia nubilalis (barrenador del maíz europeo), Plutella xylostella (palomilla dorso de diamante), Spodoptera frugiperda (gusano cogollero), Agrotis ipsilon (gusano cortador grasiento), Helicoverpa zea (gusano elotero), Heliothis virescens (gusano cogollero del tabaco), Spodoptera exigua (gusano soldado de la remolacha), Pectinophora gossypiella (lagarta rosada), Trichoplusia ni (gusano falso medidor de la col), Cochylis hospes (polilla de bandas del girasol) y Homeosoma electellum (polilla del girasol). Las propiedades de control de insectos de la toxina híbrida de la invención ejemplificada se ilustran en mayor profundidad en el ejemplo 9.

La presente invención también abarca toxinas híbridas activas contra insectos que comprenden una región carboxi-terminal de una toxina Vip3 unida en la dirección de amino a carboxi a una región amino-terminal de una toxina Vip3 diferente, donde la región carboxi-terminal comprende los aminoácidos 661-788 de la SEC. ID. Nº: 2; y donde la región amino-terminal tiene al menos 85% de identidad, más preferentemente al menos 95% de identidad, muy preferentemente al menos 99% de identidad, con los aminoácidos 1-660 de SEC. ID. Nº:7. En una realización preferida, la región carboxi-terminal comprende los aminoácidos 661-788 de SEC. ID. Nº: 2, y la región amino-terminal comprende los aminoácidos 1-660 de SEC. ID. Nº: 65. En una realización más preferida, la toxina híbrida comprende los aminoácidos 1-788 de SEC. ID. Nº: 11.

Expresión de las secuencias de nucleótidos en huéspedes microbianos heterólogos

Como agentes biológicos para el control de insectos, las toxinas insecticidas se producen mediante expresión de las secuencias de nucleótidos en células huésped heterólogas capaces de expresar las secuencias de nucleótidos. En una primera realización, se preparan células de B. thuringiensis que comprenden modificaciones de una secuencia de nucleótidos de esta invención. Dichas modificaciones abarcan mutaciones o deleciones de elementos reguladores existentes, conduciendo así a una expresión alterada de la secuencia de nucleótidos, o la incorporación de nuevos elementos reguladores que controlan la expresión de la secuencia de nucleótidos. En otra realización, se agregan otras copias de una o más de las secuencias de nucleótidos a las células de Bacillus thuringiensis mediante inserción en el cromosoma o mediante introducción de moléculas que se replican extracromosómicamente que contienen las secuencias de nucleótidos.

En otra realización, al menos una de las secuencias de nucleótidos de la invención es insertada en un casete de expresión adecuado, que comprende un promotor y señales de terminación. La expresión de la secuencia de nucleótidos es constitutiva, o utiliza un promotor inducible que responde a diversos tipos de estímulos para iniciar la transcripción. En una realización preferida, la célula en la cual se expresa la toxina es un microorganismo, como un virus, una bacteria o un hongo. En una realización preferida, un virus, como un baculovirus, contiene una secuencia de nucleótidos de la invención en su genoma y expresa grandes cantidades de la toxina insecticida correspondiente luego de la infección de células eucariotas apropiadas que son adecuadas para la replicación del virus y la expresión de la secuencia de nucleótidos. La toxina insecticida producida de esa manera se usa como un insecticida. Alternativamente, se usan baculovirus modificados genéticamente para incluir la secuencia de nucleótidos a fin de infectar insectos in vivo y matarlos mediante expresión de la toxina insecticida o mediante una combinación de infección viral y expresión de la toxina insecticida.

Las células bacterianas también son huéspedes para la expresión de las secuencias de nucleótidos de la invención. En una realización preferida, se usan bacterias simbióticas no patógenas, que son capaces de vivir y replicarse en tejidos vegetales, denominadas endófitos, o bacterias simbióticas no patógenas, que son capaces de colonizar la filosfera o la rizosfera, denominadas epífitos. Dichas bacterias incluyen bacterias de los géneros Agrobacterium, Alcaligenes, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Clavibacter, Enterobacter, Erwinia, Flavobacter, Klebsiella, Pseudomonas, Rhizobium, Serratia, Streptomyces y Xanthomonas. Los hongos simbióticos como Trichoderma y Gliocladium también son huéspedes posibles para la expresión de las secuencias de nucleótidos de la invención a los mismos efectos.

Las técnicas para estas manipulaciones genéticas son específicas de los diferentes huéspedes disponibles y son conocidas en el área. Por ejemplo, los vectores de expresión pKK223-3 y pKK223-2 se pueden usar para expresar genes heterólogos en E. coli, ya sea en una fusión transcripcional o de traducción, detrás del promotor tac o trc. Para la expresión de los operones que codifican muchos ORF, el procedimiento más simple es insertar el operón en un vector como pKK223- 3 en una fusión transcripcional, permitiendo la utilización del sitio de unión del ribosoma afín de los genes heterólogos. Las técnicas para la sobreexpresión en especies grampositivas como Bacillus también son conocidas en el área y se pueden usar en el contexto de esta invención (Quax et al. In: Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, Eds. Baltz et al., American Society for Microbiology, Washington (1993)). Sistemas alternativos para la sobreexpresión dependen por ejemplo, de vectores de levadura e incluyen el uso de Pichia, Saccharomyces y Kluyveromyces (Sreekrishna, In: Industrial microorganisms: basic and applied molecular genetics, Baltz, Hegeman, and Skatrud eds., American Society for Microbiology, Washington (1993); Dequin & Barre, Biotechnology L2:173-177 (1994); van den Berg et al., Biotechnology 8:135-139 (1990)).

Transformación de plantas

En una realización particularmente preferida, al menos una de las toxinas insecticidas de la invención se expresa en un organismo superior, por ejemplo una planta. En este caso, las plantas transgénicas que expresan cantidades eficaces de las toxinas se protegen a sí mismas de las plagas de insectos. Cuando el insecto comienza a alimentarse de dicha planta transgénica, también ingiere las toxinas expresadas. Por lo tanto esto impedirá que el insecto siga mordiendo el tejido vegetal o incluso lo dañará o matará. Una secuencia de nucleótidos de la presente invención se inserta en un casete de expresión, que luego es, preferentemente, integrado establemente en el genoma de dicha planta. En otra realización preferida, la secuencia de nucleótidos se incluye en un virus no patógeno autorreplicativo. Las plantas transformadas de conformidad con la presente invención pueden ser monocotiledóneas o dicotiledóneas e incluyen, pero no exclusivamente, maíz, trigo, cebada, centeno, batata, frijol, guisante, achicoria, lechuga, repollo, coliflor, brócoli, nabo, radicheta, espinaca, espárrago, cebolla, ajo, pimienta, apio, calabaza, zapallo, cáñamo, zucchini, manzana, pera, membrillo, melón, ciruela, cereza, durazno, nectarina, albaricoque, fresa, uva, frambuesa, mora, ananá, aguacate, papaya, mango, banana, soja, tomate, sorgo, caña de azúcar, remolacha azucarera, girasol, colza, clavo de olor, tabaco, zanahoria, algodón, alfalfa, arroz, patata, berenjena, pepino, arabidopsis, y plantas leñosas como coníferas y árboles de hojas caducas.

Una vez que una secuencia de nucleótidos deseada ha sido transformada en una especie particular de planta, se puede propagar en esa especie o se puede trasladar a otras variedades de la misma especie, particularmente comprendidas las variedades comerciales, usando técnicas de propagación convencionales.

Una secuencia de nucleótidos de esta invención se expresa preferentemente en plantas transgénicas, causando por lo tanto la biosíntesis de la toxina correspondiente en las plantas transgénicas. De esta manera, se generan plantas transgénicas con mayor resistencia a los insectos. Para su expresión en plantas transgénicas, las secuencias de nucleótidos de la invención pueden requerir modificación y optimización. Aunque en muchos casos se pueden expresar en plantas, en altos niveles, genes de organismos microbianos sin modificación, puede darse una baja expresión en plantas transgénicas de secuencias de nucleótidos microbianos que tengan codones que no son los preferidos de las plantas. Se sabe en el área que todos los organismos tienen preferencias específicas por el uso de codones, y los codones de las secuencias de nucleótidos descritos en esta invención se pueden cambiar para que estén de acuerdo con las preferencias de la planta, manteniendo simultáneamente los aminoácidos codificados por ellos. Además, se logra mejor una alta expresión en las plantas, a partir de secuencias de codificación que tengan al menos 35% de contenido de GC, preferentemente más de aproximadamente 45%, más preferentemente más de aproximadamente 50%, y muy preferentemente más de aproximadamente 60%. Las secuencias de nucleótidos microbianas que tienen bajo contenido de GC se pueden expresar poco en plantas, debido a la existencia de motivos ATTTA que muchos desestabilizan los mensajes, y motivos AATAAA que pueden causar una poliadenilación inadecuada. Aunque las secuencias preferidas de genes se pueden expresar adecuadamente tanto en especies de plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas, las secuencias se pueden modificar para que tengan en cuenta las preferencias específicas de codones y las preferencias de contenido de GC de las monocotiledóneas o dicotiledóneas ya que se ha observado que estas preferencias difieren (Murray et al. Nucl. Acids Res. 17:477-498 (1989)). Además, las secuencias de nucleótidos se analizan para determinar la existencia de sitios de empalme ilegítimos que puedan causar un corte del mensaje. Todos los cambios que se requiera hacer dentro de las secuencias de nucleótidos como los descritos antes, se hacen usando técnicas bien conocidas de mutagénesis dirigida al sitio, PCR y construcción de genes sintéticos usando los métodos descritos en las solicitudes de patente publicadas EP 0 385 962 (para Monsanto), EP 0 359 472 (para Lubrizol, y WO 93/07278 (para Ciba-Geigy).

En una realización de la invención los genes sintéticos se preparan de acuerdo con el procedimiento divulgado en la patente de los Estados Unidos 5,625,136, que se incorpora en este documento por referencia. En este procedimiento, se usan los codones preferidos del maíz, es decir el codón único que codifica con mayor frecuencia ese aminoácido en el maíz. El codón preferido del maíz para un aminoácido particular se puede derivar, por ejemplo, de secuencias de genes conocidas del maíz. El uso del codón del maíz para 28 genes de plantas de maíz se encuentra en Murray et al., Nucleic Acids Research 17:477-498 (1989), cuya divulgación se incorpora en este documento por referencia. Las secuencias sintéticas de la presente invención, específicamente ejemplificadas, preparadas con codones optimizados para maíz, se exponen en SEC. ID. Nº: 3 y SEC. ID. Nº: 33.

De esta manera, las secuencias de nucleótidos se pueden optimizar para su expresión en cualquier planta. Se reconoce que toda o cualquier parte de la secuencia de genes se puede optimizar o puede ser sintética. Es decir, también se pueden usar secuencias sintéticas o parcialmente optimizadas.

Para una iniciación eficaz de la traducción, las secuencias adyacentes a la metionina de iniciación pueden requerir modificación. Por ejemplo, pueden ser modificadas mediante inclusión de secuencias que se sabe que son eficaces en plantas. Joshi sugirió una secuencia consenso adecuada para plantas (NAR 15:6643-6653 (1987)) y Clonetech sugirió otra secuencia consenso iniciadora de la traducción (1993/1994 catálogo, página 210). Estas secuencias consenso son adecuadas para usar con las secuencias de nucleótidos de esta invención Las secuencias se incorporan en construcciones que comprenden las secuencias de nucleótidos, hasta e incluido el ATG (dejando sin embargo el segundo aminoácido sin modificar), o alternativamente hasta e incluido el GTC subsiguiente al ATG (con la posibilidad de modificar el segundo aminoácido del transgén).

Los nuevos genes de toxinas vip3 de la presente invención, ya sea en su secuencia nativa o como secuencias sintéticas optimizadas según se describió antes, pueden fusionarse operativamente a una diversidad de promotores para la expresión en plantas, incluidos los promotores constitutivos, inducibles, temporalmente regulados, desarrolladamente regulados, químicamente regulados, preferidos por el tejido y promotores específicos de tejido para preparar moléculas de ADN recombinante, es decir, genes quiméricos. La elección del promotor variará dependiendo de los requisitos temporales y espaciales para la expresión, y dependiendo también de las especies blanco. Por consiguiente, se prefiere la expresión de las secuencias de nucleótidos de esta invención en hojas, en pedúnculos o tallos, en panochas, en inflorescencias (por ejemplo espigas, panojas, mazorcas, etc.), en raíces y/o almácigos. En muchos casos, sin embargo, se procura la protección contra más de un tipo de plagas de insectos y por consiguiente es deseable la expresión en múltiples tejidos. Aunque muchos promotores de las dicotiledóneas han demostrado ser operativos en monocotiledóneas y viceversa, idealmente los promotores de las dicotiledóneas se seleccionan para la expresión en dicotiledóneas y los promotores de monocotiledóneas para la expresión en monocotiledóneas. Sin embargo, no existe restricción para la procedencia de los promotores seleccionados; es suficiente que sean operativos en la conducción de la expresión de las secuencias de nucleótidos en la célula deseada.

Los promotores constitutivos preferidos comprenden los promotores CaMV 35S y 19S (Fraley et al., Patente de los Estados Unidos Nº 5,352,605 emitida el 4 octubre de 1994). Otro promotor preferido deriva de cualquiera de los varios genes de la actina, que se expresan en la mayoría de los tipos celulares. Los casetes de expresión de promotores descritos por McElroy et al. (Mol. Gen. Genet. 231: 150-160 (1991)) se pueden modificar fácilmente para la expresión de los nuevos genes de toxina y son particularmente adecuados para usar en huéspedes monocotiledóneas.

Aún otro promotor constitutivo preferido se deriva de la ubiquitina, que es otro producto génico que se sabe que se acumula en muchos tipos de células. Se clonó un promotor de la ubiquitina de varias especies para usar en plantas transgénicas, por ejemplo, girasol (Binet et al., 1991. Plant Science 79: 87-94), maíz (Christensen et al., 1989. Plant Molec. Biol. 12: 619-632), y arabidopsis (Norris et al. 1993. Plant Molec. Biol. 21:895-906). El promotor de la ubiquitina de maíz se desarrolló en sistemas de monocotiledóneas transgénicos y su secuencia y los vectores construidos para la transformación de monocotiledóneas se divulgan en la publicación de patente EP 0 342 926. El promotor de la ubiquitina es adecuado para la expresión del nuevo gen de toxina en plantas transgénicas, especialmente en monocotiledóneas.

Los promotores específicos de tejido o preferenciales de tejido, útiles para la expresión en plantas de los nuevos genes de toxina de la invención, particularmente maíz, son los que dirigen la expresión a la raíz, la médula, la hoja o el polen. Dichos promotores se divulgan en WO 93/07278, que se incorpora en este documento por referencia en su totalidad. Otros promotores específicos de tejido útiles en la presente invención, comprenden el promotor de la rubisco de algodón divulgado en la patente de los Estados Unidos 6,040,504; el promotor de la sacarosa sintasa del arroz divulgado en la patente de los Estados Unidos 5,604,121; y el promotor del virus del rizado de hoja amarilla de cestrum divulgado en WO 01/73087, todas incorporadas en este documento por referencia. Promotores químicamente inducibles, útiles para dirigir la expresión en plantas del nuevo gen de toxina se divulgan la patente de los Estados Unidos 5,614,395 que se incorpora en este documento por referencia en su totalidad.

Las secuencias de nucleótidos de esta invención también se pueden expresar bajo la regulación de promotores que son regulados químicamente. Esto permite que las toxinas Vip3 se sinteticen sólo cuando las plantas de cultivo se tratan con los productos químicos inductores. La tecnología preferida para la inducción química de la expresión de genes se detalla en la solicitud de patente publicada EP 0 332 104 (para Ciba- Geigy) y en la patente de los Estados Unidos 5,614,395. Un promotor preferido para la inducción química es el promotor PR-1a del tabaco.

Una categoría preferida de promotores es aquella que es inducible por lesión. Se han descrito muchos promotores que se expresan en sitios donde hay una lesión y también en sitios de infección por fitopatógenos. Idealmente, un promotor de ese tipo sólo se activará localmente en los sitios de infección, y de esa manera las toxinas insecticidas se acumularán únicamente en las células que necesiten sintetizar las toxinas insecticidas para matar la plaga de insectos invasora. Los promotores preferidos de este tipo abarcan los descritos por Stanford et al. Mol. Gen. Genet. 215:200-208 (1989), Xu et al. Plant Molec. Biol. 22:573-588 (1993), Logemann et al. Plant Cell 1:151-158 (1989), Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22:783-792 (1993), Firek et al. Plant Molec. Biol. 22:129-142 (1993), y Warner et al. Plant J. 3:191-201 (1993).

Los patrones de expresión específica de tejido que se prefieren comprenden la expresión específica en el tejido verde, específica en la raíz, específica en el tallo y específica en las flores. Los promotores adecuados para la expresión en tejido verde comprenden muchos que regulan genes implicados en la fotosíntesis y muchos de éstos fueron clonados tanto de monocotiledóneas como de dicotiledóneas. Un promotor preferido es el promotor PEPC del maíz del gen de la fosfoenol carboxilasa (Hudspeth & Grula, Plant Molec. Biol. 12:579-589 (1989)). Un promotor preferido para la expresión específica en raíz es el descrito por Framond (FEBS 290:103-106 (1991); EP 0 452 269 para Ciba-Geigy). Un promotor preferido específico del tallo es el descrito en la patente de los Estados Unidos 5,625,136 (para Ciba-Geigy) y que conduce la expresión del gen trpA del maíz.

Otras realizaciones preferidas son plantas transgénicas que expresan las secuencias de nucleótidos de manera inducible por una lesión o inducible por una infección por patógenos.

Además de la selección de un promotor adecuado, las construcciones para la expresión de una toxina insecticida en plantas requieren que un terminador de la transcripción adecuado se una secuencia abajo de la secuencia de nucleótidos heteróloga. Se dispone de varios de dichos terminadores y son conocidos en el área (p. ej. tml de CaMV, E9 de rbcS). Cualquier terminador disponible que se sepa que actúa en plantas se puede usar en el contexto de esta invención.

Se pueden incorporar otras varias secuencias en los casetes de expresión descritos en esta invención. Éstos incluyen secuencias que demostraron que aumentan la expresión como las secuencias de intrones (por ejemplo de Adhl y bronzel) y las secuencias líderes virales (por ejemplo de TMV, MCMV Y AMV).

Puede ser preferible dirigir la expresión de la secuencia de nucleótidos de la presente invención a diferentes localizaciones celulares en la planta. En algunos casos, puede ser deseable la localización en el citosol, en tanto que en otros casos, puede ser preferible la localización en algún organelo subcelular. La localización subcelular de enzimas codificadas por el transgén se emprende usando técnicas bien conocidas en el área. Típicamente, el ADN que codifica el péptido blanco a partir de un producto genético conocido dirigido por un organelo se manipula y fusiona secuencia arriba de la secuencia de nucleótidos. Muchas de esas secuencias blanco se conocen a partir del cloroplasto y se ha demostrado su funcionamiento en construcciones heterólogas. La expresión de las secuencias de nucleótidos de la presente invención también es dirigida al retículo endoplasmático o a las vacuolas de las células huésped. Las técnicas para lograr esto son bien conocidas en el área.

Los expertos en el área de transformación de plantas conocen numerosos vectores de transformación disponibles para la transformación de plantas, y las moléculas de ácido nucleico de la invención se pueden usar conjuntamente con dichos vectores. La selección del vector dependerá de la técnica de transformación preferida y de la especie vegetal blanco de la transformación. Para determinadas especies blanco, pueden ser preferibles diferentes marcadores de selección antibióticos o herbicidas. Los marcadores de selección que se usan corrientemente incluyen el gen nptII, que confiere resistencia a la kanamicina y los antibióticos relacionados (Messing & Vierra., 1982. Gene 19: 259-268; y Bevan et al., 1983. Nature 304:184-187), el gen bar, que confiere resistencia al herbicida fosfinotricina (White et al., 1990. Nucl. Acids Res 18: 1062, y Spencer et al., 1990. Theor. Appl. Genet 79: 625-631), el gen hph, que confiere resistencia al antibiótico higromicina (Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol 4: 2929-2931), y el gen dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Bourouis et al., 1983. EMBO J. 2(7): 1099-1104), el gen EPSPS, que confiere resistencia al glifosato (patentes de los Estados Unidos Nº 4,940,935 y 5,188,642) y el gen de la manosa-6-fosfato isomerasa, que proporciona la capacidad de metabolizar manosa (patentes de los Estados Unidos Nº 5,767,378 y 5,994,629). La elección de los marcadores seleccionables no es, sin embargo, fundamental para la
invención.

En otra realización preferida, una secuencia de nucleótidos de la presente invención es transformada directamente en el genoma del plástido. Una ventaja importante de la transformación del plástido es que los plástidos son capaces en general de expresar genes bacterianos sin una modificación sustancial, y los plástidos son capaces de expresar muchos marcos de lectura abiertos bajo el control de un solo promotor. La tecnología de transformación de plástidos se describe extensamente en la patente de los Estados Unidos Nº 5,451,513, 5,545;817 y 5,545,818, en la solicitud PCT Nº WO 95/16783, y en McBride et aL (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 91, 7301-7305. La técnica básica para la transformación de cloroplastos implica la introducción de regiones del ADN del plástido clonado que flanquean un marcador seleccionable junto con el gen de interés en un tejido blanco adecuado, por ejemplo, usando biobalística o transformación de protoplastos (p. ej., transformación mediada por cloruro de calcio o PEG). Las regiones flanqueantes de 1 a 1.5 kb, denominadas secuencias de acceso, facilitan la recombinación homóloga con el genoma del plástido y de esta manera permiten el reemplazo o la modificación de regiones específicas del plastoma. Inicialmente, se utilizan mutaciones puntuales en los genes ARN r 16S y rps12 del cloroplasto que confieren resistencia a la espectinomicina y/o estreptomicina como marcadores seleccionable para la transformación (Svab, Z., Hajdukiewicz, P., y Maliga, P. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8526-8530; Staub, J. M., y Maliga, P. (1992) Plant Cell 4, 39-45). Esto da lugar a transformantes homoplásmicas estables a una frecuencia de aproximadamente una por 100 bombardeos de hojas blanco. La presencia de sitios de clonación entre esos marcadores permitió la creación de un vector dirigido del plástido para la introducción de genes extraños (Staub, J.M., and Maliga, P. (1993) EMBO J. 12, 601-606). Se obtienen aumentos sustanciales en la frecuencia de transformación mediante el reemplazo de los genes de resistencia a antibióticos recesivos del ARN r o proteína-r con un marcador seleccionable dominante, el gen bacteriano aadA que codifica la enzima desintoxicante de espectinomicina aminoglucósido-3'-adeniltransferasa (Svab, Z., y Maliga, P. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90, 913-917). Previamente, este marcador fue utilizado con éxito para la transformación de alta frecuencia del genoma del plástido del alga verde Chlamydomonas reinhardtii (Goldschmidt-Clermont, M. (1991) Nucl. Acids Res. 19:4083-4089). Acids Res. 19:4083-4089). Otros marcadores seleccionables útiles para la transformación de plástidos son conocidos en el área y están comprendidos por el campo de acción de la invención. Típicamente, se requieren aproximadamente de 15 a 20 ciclos de división celular luego de la transformación para alcanzar el estado homoplástico. La expresión del plástido, en el cual se insertan genes mediante recombinación homóloga en todas las miles de copias del genoma circular del plástido presente en cada célula vegetal, aprovecha la ventaja de la enorme cantidad de copias respecto a los genes expresados a nivel nuclear para permitir niveles de expresión que puedan exceder fácilmente el 10% de la proteína vegetal soluble total. En una realización preferida, una secuencia de nucleótidos de la presente invención se inserta en un vector de acceso de plástidos y se transforma en el genoma del plástido de una planta huésped deseada. Se obtienen plantas homoplásticas para genomas del plástido que contienen una secuencia de nucleótidos de la presente invención, y son preferentemente capaces de una elevada expresión de la secuencia de nucleótidos.

Combinaciones de principios activos para control de insectos

Las toxinas plaguicidas de la invención se pueden usar en combinación con \delta-endotoxinas de Bt u otros principios activos plaguicidas, para aumentar el rango de plagas blanco. Por otra parte, el uso de las toxinas plaguicidas de la invención en combinación con \delta-endotoxinas de Bt u otros principios activos plaguicidas de distinta naturaleza, tiene una utilidad particular para la prevención y/o el manejo de la resistencia a los insectos.

Las diversas proteínas cristalinas insecticidas de Bacillus thuringiensis fueron clasificadas basándose en su espectro de actividad y similitud de secuencia. La clasificación propuesta por Hofte and Whiteley, Microbiol. Rev. 53: 242-255 (1989) colocó las proteínas cristalinas insecticidas conocidas en cuatro clases principales. Generalmente, las clases principales se definen por el espectro de actividad, siendo las proteínas Cry1 activas contra Lepidoptera, las proteínas Cry2 activas contra Lepidoptera y Diptera, las proteínas Cry3 activas contra Coleoptera y las proteínas Cry4 activas contra Diptera.

Dentro de cada clase principal, las \delta-endotoxinas se agrupan de acuerdo con la similitud de secuencia. Las proteínas Cry1 son producidas típicamente como proteínas protoxina de 130-140 kDa que se escinden proteolíticamente para producir toxinas activas que son de aproximadamente 60-70 kDa. La porción activa de las \delta-endotoxinas reside en la porción NH_{2}-terminal de la molécula completa. Hofte y Whiteley, mencionados antes, clasificaron las proteínas Cry1 que se conocían entonces en seis grupos, 1Aa, 1Ab, 1Ac, 1B, 1C y 1D. Desde entonces, las proteínas clasificadas como Cry1Ea, Cry1Fa, Cry9A, Cry9C y Cry9B, al igual que otras, también fueron caracterizadas.

El espectro de actividad insecticida de una \delta-endotoxina individual de Bacillus thuringiensis tiende a ser bastante estrecho, siendo una determinada \delta-endotoxina activa sólo contra unos pocos insectos. La especificidad es el resultado de la eficacia de los diversos pasos involucrados en la producción de una proteína toxina activa y su subsiguiente capacidad para interactuar con las células epiteliales del aparato digestivo del insecto. En una realización preferida, la expresión de las moléculas de ácido nucleico de la invención en plantas transgénicas es acompañada por la expresión de una o más \delta-endotoxinas de Bt. Las \delta-endotoxinas de Bt particularmente preferidas son las que se divulgan en la patente de los Estados Unidos 5,625,136, que se incorpora en este documento por referencia.

Es bien sabido que muchas proteínas \delta-endotoxinas de Bacillus thuringiensis se expresan en realidad como protoxinas. Estas protoxinas se solubilizan en el ambiente alcalino del intestino del insecto y son convertidas proteolíticamente por proteasas en un fragmento central tóxico (Hofte and Whiteley, Microbiol. Rev. 53: 242-255 (1989)). Para las proteínas \delta-endotoxinas de la clase Cry1, el fragmento central tóxico se ubica en la mitad N-terminal de la protoxina. Está comprendido por el campo de acción de la presente invención que genes que codifican la forma completa de la protoxina o el fragmento central tóxico truncado de las nuevas proteínas toxina se pueden usar en vectores de transformación de plantas para conferir a la planta huésped propiedades insecticidas.

Otros principios activos insecticidas incluyen inhibidores de la proteasa (tanto de los tipos serina como cisteína), lectinas, \alpha-amilasa, peroxidasa y colesterol oxidasa. Otros genes Vip, como vip1A(a) y vip2A(a) como los divulgados en la patente de los Estados Unidos Nº 5,849,870 e incorporada en este documento por referencia, también son útiles en la presente invención.

Esta coexpresión de más de un principio activo insecticida en la misma planta transgénica se puede lograr modificando genéticamente una planta para que contenga y exprese todos los genes necesarios. Alternativamente, una planta, antecesor 1, puede ser modificada genéticamente para que exprese los genes de la presente invención. Una segunda planta, antecesor 2, se puede modificar genéticamente para que exprese un principio activo para el control de insectos complementario. Cruzando el antecesor 1 con el antecesor 2, se obtienen plantas de progenie que expresan todos lo genes introducidos en los antecesores 1 y 2.

La presente invención abarca además variantes de las moléculas de ácido nucleico divulgadas. Las secuencias variantes naturales se pueden identificar y/o aislar con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, como, por ejemplo, técnicas de PCR e hibridación como se ilustra a continuación.

Las secuencias de nucleótidos vip3 variantes incluyen secuencias de nucleótidos derivadas sintéticamente, como las generadas, por ejemplo, por mutagénesis dirigida al sitio o las preparadas mediante cambio del dominio entero, pero que igual presentan actividad plaguicida. Los métodos para mutagénesis y alteraciones de secuencias de nucleótidos son bien conocidos en el área. Consulte, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; patente de los Estados Unidos Nº 4,873,192; Walker y Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nueva York) y las referencias citadas allí. Generalmente, una secuencia de nucleótidos de la invención tendrá al menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95%, hasta 98% o más de identidad de secuencia con su respectiva secuencia de nucleótidos vip3 de referencia, y tendrá actividad plaguicida.

Las secuencias de nucleótidos vip3 variantes también comprenden secuencias derivadas de un procedimiento mutagénico o de recombinación génica como barajado del ADN. Con dicho procedimiento, se pueden recombinar una o más secuencias vip3 diferentes de la presente invención, por ejemplo, pero no exclusivamente, vip3C(a), vip3C(b), vip3A-C Y vip3C-12168 juntas o con otras secuencias vip3 o secuencias relacionadas, por ejemplo, pero no exclusivamente, vip3A (SEC. ID. Nº: 4), vip3B (SEC. ID. Nº: 6) y vip3Z (SEC. ID. Nº: 8), para crear nuevas moléculas de ácido nucleico vip3 que codifiquen toxinas Vip3 que posean las propiedades deseadas. De esta manera, se generan genotecas de polinucleótidos vip3 recombinantes a partir de una población de polinucleótidos vip3 relacionados por la secuencia, que comprenden regiones de la secuencia que tienen una identidad de secuencia sustancial y que pueden ser recombinadas homólogamente in vitro o in vivo. Las estrategias para dicho barajado del ADN son bien conocidas en el área. Consulte, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; solicitud de patente internacional WO 99/57128 y patentes de los Estados Unidos Nº 5,605,793, 5,837,458 y 6,335,179.

Los métodos de mutagénesis como los divulgados en este documento se pueden combinar con métodos de cribado de alto rendimiento, para detectar la actividad plaguicida de polipéptidos Vip3 clonados sometidos a mutagénesis en células huésped. Las moléculas de ADN sometidas a mutagénesis que codifican polipéptidos Vip3 activos (p. ej., secretados y detectados por anticuerpos; o insecticidas en un bioensayo para insectos) se pueden recuperar de las células huésped y secuenciar rápidamente usando procedimientos estándar. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de residuos de aminoácidos individuales en un polipéptido Vip3 de interés y se pueden aplicar a polipéptidos de estructura desconocida.

Se criban las genotecas de genes vip3 recombinantes que son producidas usando métodos de barajado del ADN para identificar aquellos que presentan mejores propiedades para usar en la protección de plantas contra plagas. Entre las propiedades por las cuales el barajado del ADN es útil para obtener mejores genes vip3 de resistencia a las plagas son: mayor potencia contra una plaga blanco, mayor rango de plagas blanco, menor susceptibilidad al desarrollo de resistencia por parte de las plagas, mayor nivel de expresión, mayor resistencia a la degradación por proteasas, mayor estabilidad en condiciones ambientales y baja toxicidad para la planta huésped. Usando una estrategia de cribado adecuada, se pueden obtener simultáneamente o secuencialmente genes vip3 que estén optimizados para más de una propiedad.

El barajado del ADN es útil para obtener genes vip3 de resistencia a las plagas que codifiquen toxinas que tengan una mayor potencia contra una plaga blanco. Una vez que se completa el barajado del ADN, se criba la genoteca resultante de los genes vip3 barajados, para identificar los que tienen una mayor actividad plaguicida. Una manera de realizar este cribado es clonar la región de los genes vip3 barajados que codifica la proteína en un vector de expresión adecuado para expresar los genes en una célula huésped elegida como, por ejemplo, E. coli o una cepa menos cristalina de Bacillus thuringiensis. Un experto reconocerá las ventajas y desventajas de usar alguno de estos dos sistemas de expresión. Por ejemplo, el Bacillus thuringiensis será más deseable para producir proteínas Vip3 secretadas. Si se desea, los clones se pueden someter a un cribado preliminar, por ejemplo, mediante inmunoensayo, para identificar los que producen una proteína Vip3 del tamaño correcto. Los que son positivos en el cribado preliminar después se analizan en un cribado funcional para identificar los genes vip3 barajados que codifican una toxina que tiene la actividad potenciada deseada.

Se puede usar un ensayo de insectos completo para determinar la toxicidad. En esos ensayos, las toxinas Vip3 expresadas a partir de genes vip3 barajados se colocan en la dieta del insecto, por ejemplo, dieta artificial o tejido de la planta, y son consumidas por el insecto blanco. Los clones que provocan una inhibición del crecimiento o la mortalidad del insecto blanco pueden ser analizados en bioensayos posteriores para determinar la potencia. Los genes vip3 barajados que codifican toxinas con mayor potencia pueden ser identificados como los que tienen una menor CE_{50} (concentración de toxina necesaria para reducir el crecimiento del insecto en 50%) y/o CL_{50} (concentración de toxina necesaria para causar un 50% de mortalidad).

También se pueden usar ensayos in vitro para cribar genotecas de genes vip3 barajados. Dichos ensayos implican típicamente el uso de células de insectos cultivadas que sean sensibles a las toxinas Vip3, y/o células que expresen un receptor para las toxinas Vip3, ya sea naturalmente o como resultado de la expresión de un gen heterólogo. Se pueden usar otros ensayos in vitro, por ejemplo, la detección de cambios morfológicos en las células, tinciones y etiquetas útiles para detectar la muerte celular, o detección de la liberación de ATPasa por las células. Un ejemplo de un ensayo in vitro adecuado usando células de insectos cultivadas para determinar la toxicidad Vip3 es con células Sf9 (Spodoptera frugiperda). Sf9 es muy que sensible a las toxinas Vip3. Cuando las toxinas Vip3 se mezclan con las células Sf9, la membrana celular se torna muy permeable a las moléculas pequeñas. Cuando se agrega un colorante como azul de tripano a la suspensión de células, las células que mata la toxina Vip3 se tiñen de azul. Por lo tanto, la toxicidad de la toxina Vip3 se puede determinar por análisis de imagenología.

Otros ensayos in vitro que implican el uso de receptores para las toxinas Vip3. Uno de dichos receptores se divulga en la patente de los Estados Unidos 6,291,156, incorporada en este documento por referencia. La proteína del receptor Vip3 se puede inmovilizar en una superficie receptora, por ejemplo, pero no exclusivamente, una placa de 96 pocillos con una membrana de nitrocelulosa y exponer a clones que comprendan los genes vip3 barajados. Por lo tanto, los genes vip3 barajados que codifican toxinas funcionales se pueden identificar basándose en la afinidad de unión al receptor Vip3. Además, el gen que codifica el receptor Vip3 se puede transformar en una línea celular que no sea sensible a Vip3, por ejemplo la línea celular Schneider 2 (S2) Drosophila, usando métodos conocidos en el área (consulte por ejemplo, Clem y Miller, 1194, Mol. Cel. Biol. 14:5212-522). Las células S2 transformadas se pueden exponer después a clones que comprenden los genes vip3 barajados. Por lo tanto, los genes vip3 barajados que codifican toxinas funcionales se pueden identificar basándose en la inducción de la muerte celular.

Ejemplos

La invención se describirá en mayor profundidad por referencia a los ejemplos detallados siguientes. Las técnicas estándar de recombinación del ADN y clonación molecular utilizadas en este documento son bien conocidas en el área y son descritas por Ausubel (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994); J. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª Ed, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001); y por T.J. Silhavy, ML. Berman, y L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984).

Ejemplo 1 Identificación de aislados de Bt que albergan proteínas Vip3 homólogas

Tres conjuntos de cebadores de PCR, cuyas secuencias se basan en el gen vip3A (SEC. ID. Nº: 5), se usaron en una reacción de PCR para amplificar fragmentos de posibles genes vip3 homólogos de aislados de Bacillus thuringiensis (Bt). Los tres conjuntos de cebadores utilizados fueron:

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Se esperaban tres productos de PCR si un aislado de Bt comprendía un gen idéntico al gen vip3A (SEC. ID. Nº: 4). El tamaño del producto de PCR generado por los conjuntos de cebadores 1F/1R, p3/p4 y 4F/4R fue de 377 bp, 344 bp y 419 bp, respectivamente. Los aislados que produjeron sólo uno o dos productos de PCR, lo que indicaba que podían comprender un gen vip3 con alguna diferencia en la secuencia con vip3A, fueron sometidos a otro análisis de secuencia.

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Ejemplo 2 Clonación y secuenciación de productos de PCR para confirmar secuencias homólogas de Vip3

Los aislados de Bt identificados en el ejemplo 1 como productores de uno o dos productos de PCR se sometieron nuevamente a PCR con el conjunto de cebadores 1F/1R (SEC. ID. Nº: 12/SEC. ID. Nº: 13) así como con los dos cebadores siguientes:

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Los productos de PCR se clonaron después en un vector pCR2.1-Topo (Invitrogen) y se secuenciaron usando procedimientos corrientes.

Se identificaron tres aislados de Bt que comprendían genes vip3 homólogos, designados vip3C, con diferencias significativas en la secuencia respecto a vip3A. Estos aislados de Bt se designaron C536, C1674 y AB727.

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Ejemplo 3 Clonación por PCR del gen vip3C completo

El extremo 3' del gen vip3C se obtuvo por PCR usando ADN plasmídico total aislado de Bt cepa C536 o C1674 como molde. Los cebadores utilizados fueron:

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El cebador T7 es un cebador que no es específico del gen que reconoce la secuencia de nucleótidos flanqueante 3' para el gen vip3C

Los productos de PCR se clonaron y secuenciaron usando procedimientos corrientes. El gen vip3C final completo se obtuvo por PCR usando dos cebadores ubicados en los extremos 3' y 5' de vip3C:

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Se obtuvieron dos genes vip3C completos. El gen vip3C del aislado de Bt C536 se designó vip3C(a), y el gen vip3C aislado de C1674 se designó vip3C(b). Vip3C(a) y vip3C(b) difieren en un nucleótido en la posición 2213 (véase SEC. ID. Nº: 1), donde vip3C(a) comprende el nucleótido "a" en la posición 2213, codificando por lo tanto el aminoácido Glu en la posición 738 de SEC. ID. Nº: 2, y donde vip3C(b) comprende el nucleótido "g" en la posición 2213, codificando por lo tanto Gly en la posición 738 de SEC. ID. Nº: 2.

Los genes vip3C(a) y vip3C(b) se clonaron cada uno en los vectores de expresión pET101/D-Topo y se designaron pNOV3911 y pNOV3910, se depositaron en células DH5\alpha de E. coli, y obtuvieron los números de registro NRRL B-30552 y NRRL B-30553, respectivamente.

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Ejemplo 4 Clonación con cósmido del gen vip3Z completo

Se aisló el ADN total de AB727 tratando células recién cultivadas resuspendidas en Tris 100 mM de pH 8, EDTA 10 mM con 2 mg/ml de lisozima durante 30 minutos a 37ºC. Se le agregó proteinasa K a una concentración final de 100 \mug/ml en SDS al 1%, EDTA 50 mM, urea 1 M y se incubó 55ºC. Se le agregó un volumen igual de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico. La muestra se mezcló suavemente durante 5 minutos y se centrifugó a 3 K. Esto se repitió dos veces. Después la fase acuosa se mezcló con 0.7 volúmenes de isopropanol y se centrifugó. El sedimento de ADN se lavó tres veces con etanol al 70% y se resuspendió suavemente en 0.5 X TE. Se trataron 12 \mug de ADN con 0.3 unidades de Sau3A por \mug de ADN a 37ºC en un volumen de 100 \mul. Se tomaron muestras a intervalos de 2 minutos durante 10 minutos. Después se agregó un volumen 1/10 de 10 X TE y las muestras se calentaron durante 30 minutos a 65ºC para inactivar la enzima. Las muestras se sometieron a electroforesis para determinar qué fracción estaba en el rango de 40 kb y esta muestra se usó en la ligación.

El vector cósmido SuperCos (Stratagene, La Jolla, CA) se preparó según describe el fabricante utilizando el sitio de clonación BamHI. El SuperCos preparado a 100 ng/ml se ligó con el ADN AB727 previamente digerido con Sau3A en una proporción de 2:1 en un volumen de 5 \mul durante toda la noche a 6ºC. La mezcla de ligación se empacó usando Gigapack XL III (Stratagene) según describe el fabricante. Los fagos empacados se infectaron en células de E. coli XL-1MR (Stratagene) según describe el fabricante. La genoteca de cósmidos se sembró en placas de L-agar con 50 \mug/ml de kanamicina que se incubaron 16 horas a 37ºC. Se repicaron 200 colonias y se cultivaron para detectar la presencia del gen vip3Z.

Los 200 clones de cósmido se analizaron por PCR para detectar la presencia del gen vip3Z usando el cebador Vip3ZA: 5'-GGCATTTATGGATTTGCCACTGGTATC-3' (SEC. ID. Nº: 28) y el cebador Vip3ZB: 5'-TCCTTTGATACGCAGGTGTAATTTCAG-3' (SEC. ID. Nº: 29).

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Se demostró que un clon de cósmido, designado 5g, comprendía el gen vip3Z (SEC. ID. Nº: 8) que codifica la proteína Vip3Z (SEC. ID. Nº: 9).

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Ejemplo 5 Construcción del gen vip3C optimizado para maíz

Se preparó un gen vip3C optimizado para maíz de acuerdo con el procedimiento divulgado en la patente de los Estados Unidos 5,625,136, incorporada en este documento por referencia. En este procedimiento, se usan los codones preferidos del maíz, es decir, el codón único que codifica con mayor frecuencia ese aminoácido en el maíz. El codón preferido del maíz para un aminoácido particular se deriva de secuencias de genes conocidas del maíz. El uso del codón
del maíz para 28 genes de plantas de maíz se encuentra en Murray et al. (1989, Nucleic Acids Res. 17:477-498).

Se prepararon los genes vip3C(a) y vip3C(b) sintéticos que codifican la secuencia de aminoácidos descrita en SEC. ID. Nº: 2. En las posiciones 2213 y 2214 de SEC. ID. Nº: 3, el gen sintético vip3C(a) comprende nucleótidos "a" y "g", respectivamente, que codifican el aminoácido Glu en la posición 738 de SEC. ID. Nº: 2, y el gen sintético vip3C(b) comprende nucleótidos "g" y "a", respectivamente, que codifican el aminoácido Gly en la posición 738 de SEC. ID. Nº: 2. Los genes sintéticos vip3C(a) y vip3C(b) se clonaron por separado en los vectores de expresión pET101/D-Topo y los vectores resultantes se designaron pNOV3905, que se depositó en células BL21 de E. coli y obtuvo el número de registro NRRL B-30554, y pNOV3906, que se depositó en células BL21 de E. coli y obtuvo el número de registro NRRL B-30555.

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Ejemplo 6 Bioensayo de la proteína Vip3C

Se vertió la dieta del gusano cortador grasiento (BioServ, Frenchtown, NJ) en placas de Petri de 50 mm. La dieta se dejó enfriar y se agregaron con pipeta 200 \mul de suspensión de células de E. coli que comprendían pNOV3905, pNOV3906, pNOV3910 o pNOV3911 sobre la superficie de la dieta. La solución se dispersó uniformemente con un asa bacteriana de modo que la suspensión cubriera toda la superficie de la dieta. La superficie se dejó secar bien. Se colocaron larvas de primer instar de las especies de lepidópteros indicadas en la tabla siguiente con un cepillo de punta fina. Cada especie se analizó por separado. Se registró la mortalidad de las larvas, al igual que la ocurrencia de inhibición de la alimentación y el crecimiento, 3 días y 5 días después de la infección de la dieta con las larvas. Una muestra que contenía células de E. coli sin un vector de expresión actuó como control negativo. La proteína Vip3A también se puede analizar en el mismo bioensayo con fines comparativos o para este ejemplo, los datos de Vip3C se compararon con el espectro de actividad conocida de Vip3A.

Los resultados se muestran en la tabla 8. La actividad insecticida se observó cinco días después de que se infectaran las placas con los insectos. Los datos muestran que Vip3C(a) (de pNOV3911 y pNOV3905) y Vip3C(b) (de pNOV3910 y 3906) tienen un espectro de actividad más amplio que la toxina Vip3A. Las pruebas también indicaron que la toxina Vip3C no es activa contra el insecto beneficioso para el ambiente Danaus plexippus.

TABLA 8

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Ejemplo 7 Creación de plantas de maíz transgénico que contienen el gen vip3C

Se eligió vip3C optimizado para maíz (SEC. ID. Nº: 3) para la transformación en plantas de maíz. Se transfirió un casete de expresión que contenía la secuencia vip3C(a) a un vector adecuado para la transformación de maíz mediada por Agrobacterium. Para este ejemplo, un casete de expresión comprendió además del gen vip3C(a), el promotor de la ubiquitina del maíz y el terminador nos que son conocidos en el área, al igual que el gen de la fosfomanosa isomerasa (PMI) para la selección de líneas transgénicas (Negrotto et al. (2000) Plant Cell Reports 19: 798-803). El vector resultante se designó pNOV2149 (SEC. ID. Nº: 30).

La transformación de embriones de maíz inmaduros se realizó esencialmente según describen Negrotto et al., 2000, Plant Cell Reports 19: 798-803. Para este ejemplo, todos los constituyentes de los medios fueron los descritos en Negrotto et al. mencionado antes. No obstante, se pueden sustituir diversos constituyentes de los medios por otros conocidos.

La cepa LBA4404 (pSB1) de Agrobacterium que contenía el plásmido de transformación de la planta se cultivó en medio sólido YEP (extracto de levadura (5 g/L), peptona (10 g/L), NaCl (5 g/L), agar15 g/l, pH 6.8) durante 2-4 días a 28ºC. Aproximadamente 0.8 X 10^{9} Agrobacterium se suspendieron en medio LS-inf complementado con As 100 \muM (Negrotto et al.,(2000) Plant Cell Rep 19: 798-803). Las bacterias se indujeron previamente en este medio durante 30-60 minutos.

Los embriones inmaduros del genotipo de maíz A188 se separaron de la espiga a los 8-12 días de vida y se colocaron en LS-inf + As 100 \muM. Los embriones se enjuagaron con medio de infección recién preparado. Después se agregó solución de Agrobacterium y los embriones se agitaron por vórtice durante 30 segundos y se los dejó sedimentar con las bacterias durante 5 minutos. Los embriones se transfirieron después con el escudente hacia arriba a medio LSAs y se cultivaron en la oscuridad durante dos o tres días. A continuación, se transfirieron entre 20 y 25 embriones por placa de Petri a medio LSDc complementado con cefotaxima (250 mg/l) y nitrato de plata (1.6 mg/l) y se cultivaron en la oscuridad a 28ºC durante 10 días.

Los embriones inmaduros que produjeron callos embriogénicos se transfirieron a medio LSD 1 M 0.5 S. Los cultivos se seleccionaron en este medio durante 6 semanas con un paso de subcultivo a las 3 semanas. Los callos sobrevientes se transfirieron a medio Reg1 complementado con manosa. Después de cultivar en la luz (régimen de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad), se transfirieron los tejidos verdes a medio Reg2 sin reguladores del crecimiento y se incubaron durante 1 a 2 semanas. Se transfirieron las plántulas a cajas Magenta GA-7 (Magenta Corp, Chicago Ill.) que contenían medio Reg3 y se cultivaron en la luz. Después de 2 a 3 semanas, se analizaron las plantas por PCR para determinar la presencia de genes PMI y del gen vip3C(a). Las plantas positivas en el ensayo de PCR se transfirieron al invernadero y se les analizó la resistencia a las plagas de lepidópteros.

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Ejemplo 8 Análisis de plantas de maíz transgénico

Las plantas se muestrearon a medida que eran trasplantadas desde las cajas Magenta GA-7 al suelo. El muestreo consistió en cortar dos pequeños trozos de hojas (aprox. 2-4 cm de longitud) y colocar cada trozo en una placa de Petri pequeña. Los controles negativos fueron o bien plantas transgénicas con resultado de PCR negativo para el gen vip3C(a) del mismo experimento, o plantas no transgénicas (de un tamaño similar al de las plantas de prueba) que estaban siendo cultivadas en el fitotrón.

Se inocularon muestras de hojas de cada planta con barrenador del maíz europeo (Ostrinia nubilalis) o con gusano cogollero (Spodoptera frugiperda) colocando 10 larvas de primer instar en cada trozo de hoja. Luego las placas de Petri se sellaron ajustadamente.

A los 3-4 días de la inoculación se recogieron los datos. El porcentaje de mortalidad de las larvas se calculó junto con una evaluación visual del daño de las hojas. El daño por alimentación se calificó como alto, moderado, bajó o ausente y se le dio un valor numérico de 3, 2, 1 o 0, respectivamente.

Los resultados que se muestran en la tabla 9 indican que las plantas de maíz transgénico comprenden el gen vip3C(a) y expresan la proteína Vip3C(a), son insecticidas para el barrenador del maíz europeo (ECB, por sus siglas en inglés) y para el gusano cogollero (FAW, por sus siglas en ingles).

TABLA 9

21

22

Ejemplo 9 Toxinas Vip3 híbridas

Vip3C es tóxica para Ostrinia nubilalis (barrenador del maíz europeo) y Plutella xylostella (palomilla dorso de diamante), en tanto que las toxinas homólogas a Vip3, por ejemplo, Vip3A(a), Vip3A(b) y Vip3A(c) no lo son. Vip3C y Vip3A difieren principalmente en la región C-terminal de sus respectivas secuencias de aminoácidos particularmente en la región desde el aminoácido 661 al aminoácido 788 de la SEC. ID. Nº: 2. Para demostrar que esta región C-terminal de Vip3C es la porción de la toxina Vip3C responsable de la actividad contra el barrenador del maíz europeo y la palomilla dorso de diamante, una toxina híbrida que comprendía la región C-terminal de Vip3C, desde el número de aminoácido 661 al número de aminoácido 788 de SEC. ID. Nº: 2, se juntó en la dirección de amino a carboxi con la región N-terminal, desde el número de aminoácido 1 al número de aminoácido 660 de SEC. ID. Nº: 5, de Vip3A. Esta toxina híbrida se designó Vip3A-C.

Se construyó una molécula de ácido nucleico que codificaba la toxina híbrida Vip3A-C, usando dos pasos de PCR con los cebadores siguientes:

23

24

En el primer paso de PCR se usaron los cebadores Vip3A-N (SEC. ID. Nº: 24) y Vip3A2050 (SEC. ID. Nº: 25) para generar un fragmento de aproximadamente 2.0 kb del extremo 5' del gen vip3A, que codifica la región N-terminal, y se usaron los cebadores Vip3C-Cl (SEC. ID. Nº: 26) y Vip3C-C2 (SEC. ID. Nº: 27) para generar un fragmento de aproximadamente 0.4 kb del extremo 3' del gen vip3C, que codifica la región C-terminal. En el segundo paso de PCR, estos dos fragmentos se combinaron como moldes para los cebadores Vip3A-N (SEC. ID. Nº: 24) y Vip3C-C2 (SEC. ID. Nº: 27) para generar un gen híbrido vip3A-vip3C de aproximadamente 2.4, designado vip3A-C.

Se preparó un gen híbrido vip3A-vip3C(b), cuya secuencia se expone en SEC. ID. Nº: 10. El gen híbrido vip3A-C se clonó en pET101D (Novagen), y el vector resultante se designó pNOV3912, y se transformó en DH5\alpha de E. coli para la expresión. Este clon de E coli, (NRRL B-30551), se volvió a probar contra las especies de insectos indicadas en la tabla 10. Se usó la proteína Vip3C como control comparativo. Los datos se compararon con el espectro de actividad conocido de Vip3A.

Los resultados que se muestran en la tabla 10 confirman que la región C-terminal de Vip3C, desde el número de aminoácido 661 al número de aminoácido 788 de SEC. ID. Nº: 2, es suficiente para conferir actividad contra el barrenador del maíz europeo y la palomilla dorso de diamante a la toxina híbrida.

TABLA 10

25

\newpage

Ejemplo 10 Recombinación in vitro de genes vip3 por barajado del ADN

Uno de los genes vip3 de la presente invención (SEC. ID. Nº: 1, 3 o 11) se amplifica por PCR. El fragmento de ADN resultante es digerido mediante tratamiento con DNasaI esencialmente según se describe en Stemmer et al., PNAS 91: 10747-10751 (1994), y los cebadores de PCR se separan de la mezcla de reacción. Se lleva a cabo una reacción de PCR sin cebadores seguida de una reacción de PCR con cebadores, ambas según se describe en Stemmer et al. (1994). Los fragmentos de ADN resultantes se clonan en pTRC99a (Pharmacia, Nº de cat.: 27-5007-01) y se transforman en E. coli cepa SASX38 mediante electroporación usando el pulsador de genes Biorad y las condiciones del fabricante. Las bacterias transformadas se cultivan en medio durante toda la noche y se les determina su actividad insecticida.

En una reacción similar, fragmentos de ADN amplificados por PCR que comprenden uno de los genes vip3 descritos en este documento (SEC. ID. Nº: 1, 3, 5, 7, 9 o 11, o sus mutantes), y fragmentos de ADN amplificados por PCR que comprenden al menos uno de los otros genes vip3 descritos en este documento (o sus mutantes) se recombinan in vitro y se recuperan las variantes resultantes con mayores propiedades insecticidas según se describe a continuación.

Para aumentar la diversidad de la genoteca de genes vip3 barajados, un gen o genes vip3 (denominados genes primarios) se barajan usando barajado de oligonucleótidos sintéticos. Se sintetizan múltiples oligonucleótidos (p. ej., 2, 5, 10, 20, 50, 75 o 100 o más) correspondientes a la al menos una región de diversidad. Esos oligonucleótidos se pueden barajar directamente o se pueden recombinar con una o más de las familias de ácido nucleicos.

La secuencia de oligonucleótidos se puede tomar de otro genes vip3 denominados genes secundarios. Los genes secundarios tienen un cierto grado de homología con los genes primarios. Existen varias maneras de seleccionar partes de los genes secundarios para la síntesis de oligonucleótidos. Por ejemplo, se pueden seleccionar porciones de genes secundarios al azar. El proceso de barajado del ADN seleccionará los oligonucleótidos que se pueden incorporar en los genes barajados.

Las porciones seleccionadas pueden ser de cualquier longitud en tanto sean adecuadas para sintetizar. Los oligonucleótidos también se pueden designar basándose en la homología entre los genes primarios y secundarios. Es necesario un cierto grado de homología para el cruzamiento, que debe ocurrir entre los fragmentos de ADN durante el barajado. Al mismo tiempo, se desea una gran heterogeneidad para la diversidad de la genoteca de genes barajados. Por otra parte, se puede seleccionar una porción específica de los genes secundarios para la síntesis de oligonucleótidos basándose en el conocimiento sobre la relación entre la secuencia de la proteína y la función.

La presente invención ha divulgado que el dominio C-terminal de Vip3 es en parte responsable del espectro de actividad de las toxinas Vip3. Cuando el espectro insecticida es modificado por la invención en curso utilizando la tecnología de barajado del ADN, la región C-terminal de la secuencia de nucleótidos de los genes secundarios se puede seleccionar como una región blanco para sintetizar oligonucleótidos utilizados en un procedimiento de barajado de oligonucleótidos.

Dado que la actividad insecticida de la proteína Vip3 depende, al menos en parte, de la región N-terminal, la región N-terminal de los genes secundarios se puede seleccionar para barajado de oligonucleótidos a fin de obtener una mayor actividad insecticida.

En un aspecto, los genes primarios vip3C(a) y vip3C(b) se barajan con varios oligonucleótidos que son sintetizados basándose en la secuencia del gen secundario vip3A. Vip3C(a) y vip3C(b) son muy homólogos, pero vip3A es sustancialmente diferente de esos genes. Por consiguiente, es deseable barajar vip3A junto con vip3C(a) y vip3C(b) para aumentar la diversidad de los ácidos nucleicos recombinantes barajados resultantes. Se seleccionan porciones de la secuencia vip3A, que son sustancialmente diferentes de las porciones correspondientes de vip3C(a) y vip3C(b), y se sintetiza una serie de oligonucleótidos de 50-mer que cubren esas porciones. Esos oligonucleótidos se barajan con vip3C(a) y vip3C(b). Luego se selecciona una cierta cantidad de clones de la genoteca de genes barajados y se examinan para determinar la diversidad por mapeo de restricción Se prevé que la diversidad sea mayor que la normalmente esperada para el barajado de vip3C(a) y vip3C(b) solos.

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Ejemplo 11 Detección de alto rendimiento de actividad insecticida

Se criban genotecas de genes vip3 barajados en E. coli o en Bacillus thuringiensis para determinar la actividad insecticida. Se repican colonias con un Q-bot (Beckman), se colocan en un medio de cultivo en un formato estándar de 96 pocillos y se cultivan durante toda la noche. Cada clon se distribuye en una capa sobre la superficie de la dieta de un insecto en un formato de 96 pocillos y se deja secar la superficie. Opcionalmente, se agregan mezclas de células transformadas a cada pocillo para aumentar la cantidad de clones probados en la ronda de cribado inicial. Por ejemplo, cribar 100 clones por pocillo y usar 10 000 pocillos proporciona un cribado de 10^{6} clones.

Se agregan varias larvas neonatas de un insecto blanco, por ejemplo, Heliothis virescens, Helicoverpa zea o Spodoptera frugiperda, a cada pocillo. La placa se cubre con una membrana permeable al aire que retenga las larvas en los pocillos en los cuales fueron colocadas. Después de 5 días los pocillos se evalúan para determinar la cantidad de dieta consumida y o la mortalidad del insecto. Los clones de los pocillos que indican que se consumió poca dieta o nada y/o aquellos en los que se observa una gran mortalidad del insecto se seleccionan para análisis posteriores. Se debería encontrar que varios clones tienen mayor actividad contra el insecto blanco.

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Ejemplo 12 Clonación con cósmido del gen vip3C completo

Se aisló el ADN total de C1674 (NRRL B-30556) tratando células recién cultivadas resuspendidas en Tris 100 mM de pH 8, EDTA 10 mM con 2 mg/ml de lisozima durante 30 minutos a 37ºC. Se le agregó proteinasa K a una concentración final de 100 \mug/ml en SDS al 1%, EDTA 50 mM, urea 1 M y se incubó 55ºC. Se le agregó un volumen igual de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico. La muestra se mezcló suavemente durante 5 minutos y se centrifugó a 3 K. Esto se repitió dos veces. Después la fase acuosa se mezcló con 0.7 volúmenes de isopropanol y se centrifugó. El sedimento de ADN se lavó tres veces con etanol al 70% y se resuspendió suavemente en 0.5 X TE. Se trataron 12 \mug de ADN con 0.3 unidades de Sau3A por \mug de ADN a 37ºC en un volumen de 100 \mul. Se tomaron muestras a intervalos de 2 minutos durante 10 minutos. Después se agregó un volumen 1/10 de 10 X TE y las muestras se calentaron durante 30 minutos a 65ºC para inactivar la enzima. Las muestras se sometieron a electroforesis para determinar qué fracción estaba en el rango de 40 kb y esta muestra se usó en la ligación.

El vector cósmido SuperCos (Stratagene, La Jolla, CA) se preparó según describe el fabricante utilizando el sitio de clonación BamHI. El SuperCos preparado a 100 ng/ml se ligó con el ADN de C1674 previamente digerido con Sau3A en una proporción de 2:1 en un volumen de 5 \mul durante toda la noche a 6ºC. La mezcla de ligación se empacó usando Gigapack XL III (Stratagene) según describe el fabricante. Los fagos empacados se infectaron en células de E. coli XL-1MR (Stratagene) según describe el fabricante. La genoteca de cósmidos se sembró en placas de L-agar con 50 \mug/ml de kanamicina que se incubaron 16 horas a 37ºC. Se repicaron 200 colonias y se cultivaron para detectar la presencia del gen vip3C.

Los 200 clones de cósmido se analizaron por PCR para detectar la presencia del gen vip3C usando los cebadores específicos de vip3C.

Se demostró que dos clones de cósmido contenían la secuencia de codificación de vip3C. Después de varias corridas de secuenciación se confirmó que la secuencia era la secuencia que se expone en SEC. ID. Nº: 31. Esta secuencia de codificación de vip3C se designó vip3C-12168 y codifica la proteína Vip3C-12168 (SEC. ID. Nº: 32).

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Ejemplo 13 Bioensayo de Vip3C-12168

Se analizaron células de E. coli que comprendían un vector de expresión (pTrcHis; Invitrogen) que contenía la secuencia de codificación de vip3C-12168 para determinar la actividad biológica usando el protocolo descrito en el ejemplo 6. Las especies de insectos probadas fueron: barrenador del maíz europeo (ECB), gusano cogollero (FAW), gusano cortador grasiento (BCW), gusano cogollero del tabaco (TBW) y gusano elotero (CEW). Se registró la mortalidad de las larvas, al igual que la ocurrencia de inhibición de la alimentación y el crecimiento, 7 días después de la infección de la dieta con las larvas. Una muestra que contenía células de E. coli con un vector de expresión vacío (pTrcHis) actuó como control negativo. Las células de E. coli que expresan la \delta-endotoxina CrylAb y las células de E. coli que expresan la proteína Vip3A también se analizaron en el mismo bioensayo para comparar el espectro de actividad.

Los resultados se muestran en la tabla 11. Los datos muestran que Vip3C-12168 tiene el mismo espectro de actividad que una combinación de CrylAb y Vip3 A.

TABLA 11

26

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Ejemplo 14 Vp3C-12168 optimizado para maíz

Una secuencia de codificación de vip3C-12168 optimizado para maíz se designó de acuerdo con el procedimiento descrito en el ejemplo 5. La secuencia de nucleótidos de la secuencia de codificación de vip3C-12168 optimizado para maíz se muestra en SEC. ID. Nº: 33.

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<110> syngenta Participations AG

\hskip1cm

Shen, Zhicheng

\hskip1cm

Warren, Gregory

\hskip1cm

Shotkoski, Frank

\hskip1cm

Kramer, Vance

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\vskip0.400000\baselineskip

<120> Nuevas toxinas Vip3 y métodos de uso

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 60163PCT

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/362250

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2002-03-06

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn versión 3.2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2367

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(2367)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de codificación de vip3C nativa.

\hskip1cm

Una "r" en la posición 2213 representa el nucleótido g o a.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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27

28

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 788

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacilus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(788)

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<223> Toxina Vip3C

\hskip1cm

Xaa en la posición 738 es el aminoácido Glu o el aminoácido Gly.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

29

30

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2367

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de codificación de vip3C optimizado para maíz.

\hskip1cm

Una "r" en las posiciones 2213 y 2214 representa el nucleótido g o a.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

32

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2370

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(2370)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de codificación nativa de vip3A(a).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

34

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 789

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(789)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Toxina Vip3A

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

36

37

38

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip2.2cm

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2364

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(2364)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de codificación nativa de vip3B.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

40

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 787

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(787)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Toxina Vip3B

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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42

43

44

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2407

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(2406)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de codificación nativa de vip3Z.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

46

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 801

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(801)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Toxina Vip3Z

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

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48

49

50

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2367

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de codificación de la toxina híbrida vip3A-C.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

52

53

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 788

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Toxina híbrida vip3A-C.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

55

56

57

58

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador hacia adelante 1F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador reverso 1R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador P3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador P4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador 4F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador 4R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador P5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador P6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Vip3CF4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador T7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Vip3Cc

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Vip3Cn

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Vip3A-N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Vip3A2050

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vip3C-Cl

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vip3C-C2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Vip3Za

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Vip3Zb

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13829

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> pNOV2149

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

77

78

79

80

81

82

83

84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2367

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(2367)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de codificación de Vip3C-12168

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

85

86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 788

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(788)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Toxina Vip3C-12168

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

87

88

89

90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2367

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vip3C-12168 optimizado para maíz.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

91

92

Claims

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una toxina que es activa contra el barrenador del maíz europeo, donde dicha secuencia de nucleótidos:

(a): tiene una secuencia complementaria que se hibrida con los nucleótidos 1981-2367 de SEC. ID Nº:1 en 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), NaPO_{4} 0.5 M, EDTA 1 mM a 50ºC con lavado en 0.1 X SSC, SDS al 0.1% a 65ºC; o

(b): es isocodificante con la secuencia de nucleótidos de (a); o

(c): tiene al menos 95% de identidad de secuencia con SEC. ID. Nº: 1; o

(d): codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 91% de identidad de secuencia con SEC. ID. Nº: 2.

\vskip1.000000\baselineskip

2. La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende los nucleótidos 1981-2367 de SEC. ID. Nº:1 o SEC. ID. Nº: 3.

3. La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende la secuencia de nucleótidos que se expone en SEC. ID. Nº: 1, SEC. ID. Nº: 3, SEC. ID. Nº: 10, SEC. ID. Nº: 31 o SEC. ID. Nº: 33.

4. La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicha secuencia de nucleótidos codifica la secuencia de aminoácidos que se expone en SEC. ID. Nº: 2, SEC. ID. Nº: 11 o SEC. ID. Nº: 32.

5. La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicha toxina comprende los aminoácidos 681-788 de la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 2.

6. Un gen quimérico que comprende una secuencia promotora heteróloga unida operativamente a la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Un vector recombinante que comprende el gen quimérico de la reivindicación 6.

8. Una célula huésped transgénica que comprende el gen quimérico de la reivindicación 6.

9. La célula huésped transgénica de acuerdo con la reivindicación 8, que es una célula bacteriana.

10. La célula huésped transgénica de acuerdo con la reivindicación 8, que es una célula vegetal.

11. Una planta transgénica que comprende la célula vegetal transgénica de la reivindicación 10.

12. Una semilla transgénica de la planta transgénica de la reivindicación 11, donde la semilla transgénica comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1.

13. Una toxina aislada que es activa contra el barrenador del maíz europeo, donde el extremo C-terminal de dicha toxina comprende los aminoácidos 661-788 de SEC. ID. Nº: 2, y dicha toxina comprende una secuencia de aminoácidos que:

a): tiene al menos 91% de identidad con SEC. ID. Nº: 2; o

b): es producida por la expresión de una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tienen una secuencia complementaria que se hibrida con los nucleótidos 1981-2367 de SEC. ID. Nº: 1 en 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), NaPO_{4} 0.5 M, EDTA 1 mM a 50ºC con lavado en 0.1 X SSC, SDS al 0.1% a 65ºC; o

c): es producida por la expresión de una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es isocodificante con la secuencia de nucleótidos de (b); o

d): es producida por la expresión de una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con SEC. ID. Nº: 1.

\vskip1.000000\baselineskip

14. La toxina aislada de acuerdo con la reivindicación 13 que comprende la secuencia de aminoácidos que se expone en SEC. ID. Nº: 2, SEC. ID. Nº: 11 o SEC. ID. Nº: 32.

\newpage

15. La toxina aislada de acuerdo con la reivindicación 13, donde dicha toxina es producida por la expresión de una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos que se expone en SEC. ID. Nº: 1, SEC. ID. Nº: 3, SEC. ID. Nº: 10, SEC. ID. Nº: 31 o SEC. ID. Nº: 33.

16. La toxina aislada de acuerdo con la reivindicación 13 o una toxina codificada por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicha toxina tiene actividad contra un insecto lepidóptero seleccionado del grupo que consiste en Plutella xylostella (palomilla dorso de diamante), Spodoptera frugiperda (gusano cogollero), Agrotis ipsilon (gusano cortador grasiento), Helicoverpa zea (gusano elotero), Heliothis virescens (gusano cogollero del tabaco), Spodoptera exigua (gusano soldado de la remolacha), Pectinophora gossypiella (lagarta rosada), Trichoplusia ni (gusano falso medidor de la col), Cochylis hospes (polilla de bandas del girasol), y Homeosoma electellum (polilla del girasol).

17. La toxina aislada de acuerdo con la reivindicación 13 o una toxina codificada por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicha toxina es producida por una cepa de Bacillus thuringiensis seleccionada del grupo que consiste en C1674, designada como registro NRRL B-30556; y C536, designada como registro NRRL B-30557.

18. La toxina aislada de acuerdo con la reivindicación 13 o una toxina codificada por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicha toxina es producida por un clon de E. coli seleccionado del grupo que consiste en pNOV3910, designado como registro NRRL B-30553; pNOV3911, designado como registro NRRL B-30552; pNOV3906, designado como registro NRRL B-30555; pNOV3905, designado como registro NRRL B-30554; y pNOV3912, designado como registro NRRL B-3055 1.

19. Una composición que comprende una cantidad eficaz para controlar insectos de la toxina de acuerdo con la reivindicación 13.

20. Un método para producir una planta transgénica resistente a los insectos, que comprende introducir la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 en una célula vegetal; y regenerar una planta transformada a partir de dicha célula vegetal, donde dicha planta transformada es resistente a los insectos.

21. Un método para controlar un insecto que comprende suministrar a dicho insecto una cantidad eficaz de la toxina de acuerdo con la reivindicación 13.

22. Una toxina híbrida activa contra el barrenador del maíz europeo, que comprende una región carboxi-terminal de una toxina Vip3 unida en la dirección de amino a carboxi a una región amino-terminal de una toxina Vip3 diferente, donde dicha región carboxi-terminal comprende los aminoácidos 661-788 de la SEC. ID. Nº: 2; y donde dicha región amino-terminal tiene al menos 85% de identidad con los aminoácidos 1-660 de SEC. ID. Nº: 7.