CN103763916A - 杀虫核酸和蛋白质及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供展现出植物寄生线虫和/或昆虫控制特性的包含编码某些杀虫多肽的核苷酸分子的组合物，并且具体来说是针对控制已知感染作物植物物种的线虫和昆虫的植物寄生害虫物种。本文公开了用于控制害虫的方法，其中在标靶植物害虫的饮食中提供毒性蛋白。本发明还提供组合物如核酸、蛋白质以及含有所述核酸和蛋白质组合物的植物和细菌细胞、植物以及种子，以及用于识别、检测以及分离本发明的组合物的方法和试剂盒。本发明进一步提供由含有编码本发明的杀虫多肽的多核苷酸分子的重组种子产生作物的方法。

Description

杀虫核酸和蛋白质及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求均2011年2月11日提交的美国临时申请序列号61/441,697和美国临时申请序列号61/441,709的优先权，所述临时申请以引用的方式并入本文。

序列表的并入

本申请所附的序列表包含在通过USPTO EFS-Web以电子方式并且与本申请的提交同时递交的计算机可读文件“38-21(57560)SEQUENCELISTING_ST25.txt”之内。所述文件为105千字节(在MS-Windows中测量)、在2012年1月19日上创建并且以引用的方式并入本文。

发明领域

本发明涉及这样的新颖多核苷酸和蛋白质组合物：它们在在植物中表达和或产生时赋予针对植物病原性线虫和害虫侵染的抗性。所述多核苷酸和蛋白质可以在植物和细菌细胞中表达，并且所述植物细胞可以再生成转基因(重组)植物、植物组织、植物部分以及种子。源自于这类植物、植物材料以及种子的含有可检测的量的这类多核苷酸和蛋白质的组合物包含在本发明的范围之内。本发明还涉及用于控制作物植物的植物病原性线虫和昆虫害虫的组合物和方法。

发明背景

日益增长的人口将需要从量日益减少的可耕土地上的作物植物生产更多食物、食料以及纤维。已知若干种类型的昆虫和线虫会减小产自植物的作物的产量。植物害虫损害植物部分，包括根、发育的花芽、花、叶、茎以及种子，这导致产量下降。

用于控制植物害虫的传统方法使用化学控制剂和构建作物与它们的野生型亲缘物种之间的种间杂种来作为抗性种质来源。化学害虫控制剂虽然是有效的，但具有若干缺点。许多化学控制剂的制造成本高，并且化学控制剂被表征为污染物，这是因为它们由于对微生物降解具有抗性而在环境中长存。化学控制剂要求农务制剂，这对农民而言由于暴露于化学剂制剂而增大了安全性风险。化学剂制剂必须每个生长季节施用至少一次，并且经常是多于一次，从而增大了与这些组合物相关的碳足迹。采用植物生物技术害虫控制剂的方法和组合物也是用于例如通过使植物表达在被一种特定的标靶害虫摄入时通常对所述害虫产生选择性毒性的一种或多种害虫控制剂来控制植物害虫的有效手段。与化学剂不同，生物技术方法已被证实是环保的、在农民使用时没有安全性风险、并且在碳足迹影响和农民利用的易用性方面是经济的。然而，仅有很少的用于控制这类害虫的这类生物技术组合物和方法的实例，并且在控制植物病原性线虫方面已显示出功效的任何生物技术方法的任何实例甚至更少。因此，存在对这样的新型组合物和方法的需求：这些组合物和方法是用于保护植物免受这种害虫侵染，一般是出于维持并且增加产自这类组合物的作物的产量的目的，并且是用于持续并且提供食物、食料以及纤维以用于日益增加的人口。

发明概述

本文提供多核苷酸分子，所述多核苷酸分子编码如在以下各项中所示的示例性杀虫多肽：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：50、SEQID NO：54、SEQ ID NO：58以及SEQ ID NO：60。特别是涵盖这样的多肽：所述多肽所具有的氨基酸序列与如在前述蛋白质序列中的任一个中所示的杀虫蛋白质(多肽)序列展现出至少约45％至约99.9％的同一性(45与99.9之间的任何百分比)，并且展现出与这些序列中的任一个实质上相当的(生物功能上相当的)杀虫活性。展现出必要的杀虫活性的这些多肽序列的片段意图在本发明的范围之内。这类多核苷酸可以直接从宿主细胞提取和/或获得或者通过各种合成手段来人工制备，并且在任一情况中皆被视为是重组多核苷酸。

本文提供含有编码本发明的杀虫蛋白质的一个或多个核苷酸序列区段的多核苷酸，所述多核苷酸可以可操作地连接至启始指定宿主细胞中的序列区表达的异源启动子，从而导致在所述宿主细胞中产生或制造杀虫蛋白质。所述启动子可以包括植物可表达的启动子、在一个或多个细菌物种中起作用的启动子以及酵母功能性启动子或其组合。植物可表达的启动子可以包括本领域所已知的任何数量的启动子，包括但不限于玉米蔗糖合成酶1启动子、玉米醇去氢酶1启动子、玉米集光复合物启动子、玉米热休克蛋白启动子、豌豆小亚基RuBP羧化酶启动子、Ti质粒甘露碱合成酶启动子、Ti质粒胭脂碱合成酶启动子、矮牵牛查尔酮异构酶启动子、豆富甘氨酸蛋白1启动子、马铃薯块茎储藏蛋白(patatin)启动子、凝集素启动子、CaMV35S启动子、FMV启动子、泛素启动子启动子以及S E9小亚基RuBP羧化酶启动子。

提供用作探针和/或引物的分离的多核苷酸区段，所述多核苷酸可以长约20至约1000个连续核苷酸或者是在20个与1000个之间的连续核苷酸的任何长度，并且与如在以下各项中的任一个中所示的相同长度的连续核苷酸或前述多核苷酸序列中的任一个的互补序列展现出至少约90％的同一性：SEQID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ IDNO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61以及SEQ ID NO：63。

在本发明的另一方面，编码上文所示的杀虫多肽中的任一个的多核苷酸于重组表达盒中提供。所述表达盒可以提供于载体中以便用于复制、维持和转移编码本发明的杀虫蛋白质的核酸组分。本发明的载体至少含有编码如上文所示的多肽的序列区。载体包括质粒、杆状病毒、人工染色体、病毒体、粘粒、噬菌粒、噬菌体或病毒载体。

宿主细胞可以是任何适当的转基因宿主细胞，包括但不限于微生物细胞(微生物)，如土壤杆菌属(Agrobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、假单胞菌属Pseudomonas)、根瘤菌属(Rhizobium)细菌细胞；酵母细胞，如毕赤酵母或酵母菌物种酵母细胞；或植物细胞。以上描述的载体可以提供于转基因微生物宿主细胞中。所述转基因微生物宿主细胞包括原核或真核宿主细胞。转基因原核宿主细胞是细菌细胞而转基因真核宿主细胞是植物或真菌/酵母细胞。转基因细菌细胞包括重组细菌，包括苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、埃希氏菌、沙门氏菌、土壤杆菌、根瘤菌或假单胞菌细胞。转基因植物宿主细胞包括单子叶或双子叶植物细胞并且可以包括来自下文所示的植物群(Group of Plants或Plant Group)的任何植物细胞。在微生物细胞是植物细胞的情况下，细胞可以获得自选自由任何以下各项组成的组的任何植物、来自这样一种植物的植物组织、植物部分或种子：包括但不限于大麦、豆子、青花菜、卷心菜、油菜(油菜籽)、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、咖啡、玉米(包括甜玉米)、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、落叶树(包括但不限于香蕉树、柑橘树、桉树、坚果树(包括但不限于山核桃木树、长山核桃树和胡桃树)、栎树(包括但不限于槲树、针栎树和星毛栎树)、橄榄树、棕榈树(包括椰子树)、杨树、香枫树以及所有前述树的根茎)、茄子、常青树(包括但不限于花旗松)、亚麻、大蒜、葡萄、草(包括但不限于苜蓿、牧场草、柳枝稷和草坪草)、啤酒花、韭葱、生菜、小米、甜瓜(包括但不限于香瓜、哈密瓜和西瓜)、燕麦、洋葱、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树(包括火炬松、辐射松和南方松)、马铃薯、南瓜、萝卜、水稻、黑麦、红花、灌木、高粱、大豆、菠菜、笋瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、甘薯、茶叶、烟草、番茄、小黑麦或小麦。上述各项在本文中被称为植物群(“Group of Plants”或“Plant Group”)。

重组植物、植物组织、植物部分或种子含有本发明的多核苷酸并且从这类多核苷酸表达本发明的蛋白质。所述植物部分是叶子、茎花、萼片、果实、根或种子。还涵盖产自本发明的重组植物的产品，并且所述产品可以包括以下各项中的至少任何一个：重组植物的油、粉、棉绒以及种子。本发明的多核苷酸和蛋白质以可检测的量存在于植物和植物产品中，并且在作物领域中并且在本文提及的各种实施方案中至少适合用作用于追踪贸易和商业过程中含有所述多核苷酸和蛋白质的种子和植物组织的存在的标记物。

本文提供在或从生物样品中检测出和/或分离编码本发明的杀虫多肽的多核苷酸分子的方法，其中所述方法的步骤包括：(i)选择这样一对寡核苷酸引物：它们当在与含有所述多核苷酸的生物样品一起用于扩增反应中时产生编码所有或代表性量的本发明的杀虫多肽的扩增子；(ii)从所述多核苷酸产生所述扩增子；(iii)检测和/或分离所述扩增子；以及(iv)生成对应于所述扩增子的核苷酸序列信息以便识别和确认编码所有或代表性量的杀虫多肽的多核苷酸分子的区段的存在(或不存在)。或者，所述检测和/或分离步骤可以通过以下方式来实行：提供源自于足够长度的编码杀虫多肽的DNA或RNA的多核苷酸探针，所述多核苷酸探针在特定的或在严格的杂交条件下与编码本发明的杀虫多肽的这种多核苷酸杂交。

本文提供控制或杀死标靶鳞翅目害虫、鞘翅目害虫或植物病原性线虫害虫种群的方法，并且所述方法包括使所述害虫种群与杀虫有效量的如上文所示的多肽相接触。“鳞翅目害虫种群”包括草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、蓓带夜蛾(Mamestra configurata)、小地老虎(Agrotis ipsilon)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)、黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)、苜蓿绿夜蛾(Hypena scabra)、烟芽夜蛾(Heliothis virescens)、黄地老虎(Agrotis subterranea)、一星粘虫(Pseudaletiaunipuncta)、灰地老虎(Agrotis orthogonia)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、脐橙螟蛾(Amyelois transitella)、玉米根草螟(Crambus caliginosellus)、稻切叶野螟(Herpetogramma licarsisalis)、向日葵飞蛾(Homoeosoma electellum)、南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellu)、苹果蠹蛾(Cydia pomonella)、葡萄浆果蛾(Endopiza viteana)、梨小食心虫(Grapholita molesta)、向目葵卷叶蛾(Suleimahelianthana)、小菜蛾(Plutella xylostella)、红铃麦蛾(Pectinophora gossypiella)、舞毒蛾(Lymantria dispar)、东方蛮蠊(Blatta orientalis)、亚洲蟑螂(Blatellaasahinai)、德国蟑螂(Blattella germanica)、棕带蟑螂(Supella longipalpa)、美洲大蠊(Periplaneta americana)、褐斑大蠊(Periplaneta brunnea)、马德拉蜚蠊(Leucophaea maderae)、棉叶波纹夜蛾(Alabama argillacea)、果树黄卷蛾(Archips argyrospila)、玫瑰黄卷蛾(A.rosana)、二化螟(Chila suppressalis)、稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)、玉米根草螟(Crambus caliginosellus)、草螟(C.teterrellus)、西南玉米螟(Diatraea grandiosella)、小蔗杆草螟(D.saccharalis)、棉斑实蛾(Earias insulana)、翠纹钻夜蛾(E.vittella)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)、玉米穗蛾(H.zea)、烟芽夜蛾(Heliothis virescens)、稻切叶野螟(Herpetogramma licarsisalis)、葡萄花翅小卷蛾(Lobesia botrana)、红铃麦蛾(Pectinophora gossypiella)、桔潜蛾(Phyllocnistis citrella)、大菜粉蝶(Pieris brassicae)、菜粉蝶(P.rapae)、小菜蛾(Plutella xylostella)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、斜纹夜蛾(S.litura)、草地贪夜蛾(S.frugiperda)、番茄斑潜蝇(Tuta absoluta)。“鞘翅目害虫种群”包括墨西哥棉铃象(Anthonomusgrandis)、稻水象甲(Lissorhoptrus oryzophilu)、粮仓玉米象(Sitophilusgranaries)、米象(Sitophilus oryzae)、三叶草叶象(Hypera punctata)、玉米隐喙象(Sphenophorus maidis)、马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)、西方玉米根虫(Diabrotica virgifera virgifera)、北方玉米根虫(Diabrotica barberi)、斑点黄瓜甲虫(Diabrotica undecimpunctata howardi)、玉米跳甲(Chaetocnemapulicaria)、十字花科条跳甲(Phyllotreta cruciferae)、葡萄肖叶甲(Colaspisbrunnea)、橙足负泥虫(Oulema melanopus)、向日葵叶甲(Zygogrammaexclamationis)、墨西哥豆瓢虫(Epilachna varivestis)、日本金龟(Popilliajaponica)、北方圆头犀金龟(Cyclocephala boreali)、南方圆头犀金龟(Cyclocephala immaculata)、欧洲金龟(Rhizotrogus majalis)、具毛鳃角金龟(Phyllophaga crinita)、胡萝卜金龟(Ligyrus gibbosus)、梳爪叩甲属(Melanotusspp.)、宽胸叩头虫属(Conoderus spp.)、金针虫属(Limonius spp.)、细胸扣甲属(Agriotes spp.)、金针虫属(Ctenicera spp.)、Aeolus spp.、伪金针虫属(Eleodesspp)。“植物病原性线虫种群”包括大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)(大豆胞囊线虫)、甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)(甜菜胞囊线虫)、禾谷胞囊线虫(Heterodera avenae)、马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)、马铃薯白线虫(Globodera pailida)、玉米短体线虫(Pratylenchus zeae)(根结线虫)、爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica)、最短尾短体线虫(Pratylenchus brachyurus)(根结线虫)、北方根结线虫(Meloidogyne hapla)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)。

用于控制这类植物害虫感染的一种替代方法包括将害虫抑制量的本发明的杀虫多肽提供给对所述多肽敏感的害虫，从而控制所述害虫。所述害虫是昆虫或线虫。所述昆虫可以是在分类学目内的任何昆虫，包括鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目、缨翅目、革翅目、等翅目、虱目、蚤目或毛翅目(下文中是“昆虫目”)。线虫可以来自被称为以下的任何线虫属：标枪属(Acontylus)、粒属(Anguina)、剑咽属(Aorolaimus)、无侧尾腺口属(Aphasmatylenchus)、滑刃属(Aphelenchoides)、真滑刃属(Aphelenchus)、Atalodera、丛垫刃属(Atylenchus)、培克属(Bakernema)、刺属(Belonolaimus)、短锥属(Brachydorus)、伞滑刃属(Bursaphelenchus)、坏死属(Cacopaurus)、卡卢斯属(Caloosia)、秆矛属(Carphodorus)、环属(Criconema)、小环属(Criconemella)、隐皮属(Cryphodera)、茎属(Ditylenchus)、锥属(Dolichodorus)、Eutylenchus、球胞囊属(Globodera)、细小属(Gracilacus)、螺旋属(Helicotylenchus)、半轮属(Hemicriconemoides)、鞘属(Hemicycliophora)、胞囊属(Heterodera)、潜根属(Hirschmanniella)、Histotylenchus、纽带属(Hoplolaimus)、Hoplotylus、长针属(Longidorus)、巨针属(Macrotrophurus)、拟根结属(Meloidodera)、根结属(Meloidogyne)、默林属(Merlinius)、桑咽属Morulaimus)、珍珠属Nacobbus)、伪粒属(Nothanguina)、伪垫刃属(Nothotylenchus)、拟长针属(Paralongidorus)、拟毛刺属Paratrichodorus)、拟尾属(Paratrophurus)、拟垫刃属Paratylenchus)、盾移栖属(Peltamigratus)、拟短体属(Pratylenchoides)、短体属(Pratylenchus)、平滑垫刃属(Psilenchus)、拟穿孔属(Radopholoides)、穿孔属(Radopholus)、细杆滑刃属(Rhadinaphelenchus)、盘旋属(Rototylenchus)、拟盘旋属(Rotylenchoides)、盘旋属(Rotylenchus)、长矛胞囊属(Sarisodera)、盾属(Scutellonema)、球属(Sphaeronema)、亚粒属(Subanguina)、拟端垫刃属Telotylenchoides)、端垫刃属(Telotylenchus)、刺垫刃属(Trichotylenchus)、胖线属(Trophonema)、营养小垫刃属(Trophotylenculus)、大尾属(Trophurus)、矮化属(Tylenchorhynchus)、半穿刺属(Tylenchulus)、垫刃属(Tylenchus)、Tylodorus、剑属(Xiphinema)或接合垫刃属(Zygotylenchus)(下文，“线虫物种”)。在相关实施方案中，线虫物种包括胞囊和相关线虫，如大豆胞囊线虫(大豆胞囊线虫)、甜菜胞囊线虫(大豆胞囊线虫)、禾谷胞囊线虫(大豆胞囊线虫)以及马铃薯金线虫和马铃薯白线虫(马铃薯胞囊线虫)；玉米短体线虫、爪哇根结线虫、最短尾短体线虫、北方根结线虫或南方根结线虫(下文，“胞囊线虫”群)。害虫抑制量的杀虫多肽被提供于所述害虫的饮食中，并且害虫的饮食可以是重组植物的部分、这种植物的种子或所述植物的产品。害虫抑制量的多肽还可以以局部制剂的形式提供给植物。这类制剂可以包括含有这样的细菌细胞、细菌孢子以及伴孢晶体的制剂：它们含有或正产生足以抑制施用所述制剂的植物的害虫侵染的量的一种或多种本发明的多肽/毒性剂。在本发明的范围内的用于控制线虫或昆虫物种的制剂可以由以下各项组成：重组细菌细胞和/或正产生本发明的毒性蛋白的孢子或含有杀虫量的多肽的伴孢晶体。所述细菌细胞、孢子或伴孢晶体通常来自芽孢杆菌物种。本文涵盖特异性结合具有如在以下各项中的任一个中所示的氨基酸序列的多肽或源自于所述多肽的肽或表位的抗体：SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：18、SEQID NO：22、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：54、SEQ IDNO：58、和/或SEQ ID NO：60。具体地说，本文涵盖特异性结合本发明的一种或多种多肽或结合源自于本发明的蛋白质的肽或表位的纯化抗体。

这类抗体至少适合用于检测生物样品中的杀虫多肽的方法中，如在以下各项中所示的那些杀虫多肽：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：46、SEQID NO：50、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：58、和/或SEQ ID NO：60。检测这类蛋白质的方法可以包括以下步骤：使生物样品与特异性结合本发明的一种或多种蛋白质的抗体相接触，以及检测所述抗体与杀虫多肽的结合。或者，本发明的蛋白质或与本发明的蛋白质实质上相关的蛋白质可以通过以下方式在生物样品中检测出或者从生物样品中分离：通过使用例如如上文指示的抗体直接识别所述样品中的所述蛋白质或者通过筛查编码杀虫蛋白质的多核苷酸的存在。检测编码这类蛋白质的多核苷酸可以包括以下步骤：i)选择这样一对引物：当在与所述多核苷酸一起用于扩增反应中时它们产生编码杀虫蛋白质的扩增子；ii)通过在扩增反应中使用所述多核苷酸作为模版而产生所述扩增子；iii)检测/分离所述扩增子；iv)生成对应于所述扩增子的DNA序列信息以便确认所述扩增子编码所述杀虫蛋白质；以及v)测试所述杀虫蛋白质以确认杀虫活性。或者，用于检测生物样品中的本发明的蛋白质或相关的杀虫蛋白质如δ-内毒素多肽的方法可以包括以下步骤：i)获得怀疑含有δ-内毒素多肽的生物样品；ii)在有效允许形成免疫复合物的条件下使所述样品与特异性结合所述多肽的抗体相接触；以及iii)检测由此形成的免疫复合物。用于检测样品中的本发明的标靶杀虫多肽的另一替代方法可以包括以下步骤：i)使所述样品与特异性结合所述标靶杀虫多肽的抗体相接触；ii)检测样品中所述抗体与所述标靶的结合；以及iii)识别所述标靶为与在以下各项中所示的任一蛋白质展现出至少90％氨基酸序列同一性的杀虫多肽：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：42、SEQID NO：46、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：58、和/或SEQ IDNO：60。

检测方法可以使用以试剂盒形式包装在一起的试剂和使用说明来实行并且适合用于检测本发明的蛋白质和多核苷酸。这类试剂盒可以包括第一试剂或特异性结合所述多肽或特异性结合源自于所述多肽的肽或表位的抗体；以及第二试剂，如对应于如在以下各项中的任一个中所示的任何蛋白质的对照多肽、源自于所述对照多肽的肽或表位：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：42、SEQ IDNO：46、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：58、和/或SEQ ID NO：60。

在本发明的另一方面，提供一种制备昆虫抗性植物的方法。这类植物可以通过以下方式来制备：使受体植物细胞与编码本发明的一种或多种多肽的转基因在允许所述细胞摄取所述转基因的条件下相接触，并且选择其中所述转基因已经被并入所述细胞基因组中的受体细胞，并且从所选择的受体细胞再生植物。所再生的植物被确认是展现出害虫抗性的能育的转基因植物，并且所述害虫抗性包括对植物病原性线虫侵染的抗性和选自针对鞘翅目昆虫或针对鳞翅目昆虫的抗性的另一种害虫抗性。所述接触步骤包括本领域所已知的任何一种或多种方法，包括微粒轰击、电穿孔或土壤杆菌介导的植物细胞转化。再生植物对包括以下各项的植物寄生线虫群的成员中的至少一种具有抗性：胞囊属物种、球胞囊属物种、根结属物种、盘旋属物种、纽带属物种、刺属物种、短体属物种、长针属物种、拟毛刺属物种、茎属物种、剑属物种、锥属物种、螺旋属物种、穿孔属物种、潜根属物种、矮化属物种或毛刺属物种。

可以产生含有编码本发明的一种或多种蛋白质的一种或多种多核苷酸区段的转基因种子，其包括以下步骤：用编码如上文所示的多肽的转基因来转化植物，所述转基因可操作地连接至在植物中表达所述转基因的启动子，从而获得包含所述转基因的能育的转基因植物；并且使所述植物在适当条件下生长以产生转基因种子。

害虫抗性增强的能育转基因植物的任一代的子代可以产生自前述植物和种子的这类转基因植物和种子，其中所述子代含有本发明的多核苷酸并且编码本发明的一种或多种蛋白质，并且具有增强的针对与对应的非转基因植物相关的鞘翅目昆虫、鳞翅目昆虫或植物病原性线虫的害虫抗性。

害虫抗性植物可以通过以下方法来产生：(a)将包含编码如上文所示的多肽的转基因的害虫抗性植物与另一种植物进行杂交；(b)获得源自于(a)的杂交的至少一种子代植物；以及(c)选择包含所述转基因的子代，其中所述子代对鞘翅目昆虫、鳞翅目昆虫或植物病原性线虫具有抗性。

可以自本发明的植物产生种子。含有编码本发明的一种或多种蛋白质的多核苷酸分子的种子(无论对于特定的转基因等位基因来说是纯合的(homogyzous)或是杂合的)可以被包装用于种植在田地中，并且可以从种植的种子产生作物。可以收获来自这类植物的作物，并且如果收获世代的种子是作物(如大豆、水稻、小麦、油菜或玉米等)，至少50％的收获的作物是含有所述多核苷酸分子的种子。

含有如上文所述的植物或植物部分的商品产品(或生物样品)可以显示含有可检测的量的具有本发明的任何蛋白质的氨基酸序列的多肽或编码任何这种蛋白质的多核苷酸。对所述商品(或生物样品)中多肽或多核苷酸的检测确定了在所述商品(或生物样品)中植物或植物部分的存在，并且其中可检测到多肽的水平为至少约(i)每百万份组织含一份、(ii)或每克鲜重组织含1纳克的所有这类商品产品皆在本发明的范围之内。本发明的植物细胞可以被再生成重组植物，所述重组植物可以产生含有本发明的任何蛋白质的植物部分。所述植物部分包括叶子、茎花、萼片、果实、根或种子。产自重组植物或植物部分的产品含有可检测的量的本发明的蛋白质中的任一种或编码这类蛋白质的多核苷酸区段。这类产品包括这类重组植物的油、粉、棉绒以及种子。可检测的量的蛋白质和/或多核苷酸适用作用于追踪和/或识别本发明的种子和植物组织在商业过程中移动时它们的存在的分子标记物。

本发明的蛋白质来源于细菌的苏云金芽孢杆菌物种并且因此而可能被表征为δ-内毒素，并且通常产自重组多核苷酸。这类δ-内毒素蛋白将具有与如在以下各项中所示的任何序列中所示的氨基酸序列展现出至少约45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.9％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：26、SEQID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：58以及SEQ ID NO：60。这类蛋白质各自将优选包括至少约50或约50至约100或约50至约300个连续的氨基酸存在于在上文提及的序列中所示的任何全长蛋白质序列中，并且内毒素蛋白优选地由在严格条件下与编码如在以下各项中的任一个中所示的序列的多核苷酸杂交的多核苷酸区段来编码：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ IDNO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61以及SEQ ID NO：63。

含有本发明的蛋白质的组合物于农业上可接受的载剂中提供。所述组合物可以含有重组苏云金芽孢杆菌细胞提取物、细胞悬浮液、细胞匀浆、细胞溶胞物、细胞上清液、细胞滤液或细胞集结粒，其中提供至少害虫抑制量的本发明的一种或多种蛋白质，并且所述组合物可以以粉末、粉剂、球粒、颗粒、喷雾、乳液、胶体或溶液的形式来提供。所述组合物可以通过对含有本发明的一种或多种蛋白质的重组苏云金芽孢杆菌细胞或孢晶的培养物进行干燥、冷冻干燥、均质化、提取、过滤、离心、沉降或浓缩来制备。杀虫组合物优选含有约1重量％至约99重量％的本文所述的一种或多种杀虫蛋白质。

本发明的蛋白质可以通过可以包括以下步骤的方法以实质上浓缩和/或纯化的形式获得：i)在有效产生杀虫蛋白质的条件下培养含有如上文所述的一种或多种重组多核苷酸的重组苏云金芽孢杆菌细胞，并且获得由此产生的杀虫多肽。所述多肽将优选含有如在以下各项中的任一个中所示的连续的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：50、SEQ IDNO：54、SEQ ID NO：58以及SEQ ID NO：60。

序列简要说明

SEQ ID NO1表示编码ET34蛋白的天然Bt核苷酸序列。

SEQ ID NO2表示SEQ ID NO1的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO3表示编码ET34蛋白的人工序列。

SEQ ID NO4表示SEQ ID NO3从核苷酸位置1到核苷酸位置378的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO5表示与编码ET34蛋白的天然Bt核苷酸序列(核苷酸位置76至450)同框融合的编码P139分泌信号肽的核苷酸序列(核苷酸位置1至75)。

SEQ ID NO6表示SEQ ID NO5的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO7表示与编码ET34蛋白的合成核苷酸序列(核苷酸位置76至450)同框融合的编码P139分泌信号肽的核苷酸序列(核苷酸位置1至75)。

SEQ ID NO8表示SEQ ID NO7的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO9表示编码TIC1506蛋白的天然Bt核苷酸序列。

SEQ ID NO10表示SEQ ID NO9的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO11表示编码TIC1506蛋白的人工核苷酸序列。

SEQ ID NO12表示SEQ ID NO11的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO13表示编码TIC1501蛋白的天然Bt核苷酸序列。

SEQ ID NO14表示SEQ ID NO13的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO15表示编码TIC1501蛋白的人工核苷酸序列。

SEQ ID NO16表示SEQ ID NO15的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO17表示编码TIC1503蛋白的天然Bt核苷酸序列。

SEQ ID NO18表示SEQ ID NO17的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO19表示编码TIC1503蛋白的人工核苷酸序列。

SEQ ID NO20表示SEQ ID NO19的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO21表示编码TIC614蛋白的天然Bt核苷酸序列。

SEQ ID NO22表示SEQ ID NO21的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO23表示编码TIC614蛋白的人工核苷酸序列。

SEQ ID NO24表示SEQ ID NO23的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO25表示编码TIC615蛋白的核苷酸序列。

SEQ ID NO26表示SEQ ID NO25的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO27表示编码TIC615蛋白的人工核苷酸序列。

SEQ ID NO28表示SEQ ID NO27的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO29表示编码TIC1277蛋白的天然Bt核苷酸序列。

SEQ ID NO30表示SEQ ID NO29的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO31表示编码TIC1277蛋白的人工核苷酸序列。

SEQ ID NO32表示SEQ ID NO31的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO33表示编码TIC TIC1278蛋白的天然Bt核苷酸序列。

SEQ ID NO34表示SEQ ID NO33的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO35表示编码TIC TIC1278蛋白的人工核苷酸序列。

SEQ ID NO36表示SEQ ID NO35的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO37表示编码TIC TIC1310蛋白的天然Bt核苷酸序列。

SEQ ID NO38表示SEQ ID NO37的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO39表示编码TIC1310蛋白的人工核苷酸序列。

SEQ ID NO40表示SEQ ID NO39的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO41表示编码TIC TIC1311蛋白的天然Bt核苷酸序列。

SEQ ID NO42表示SEQ ID NO41的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO43表示编码TIC1311蛋白的人工核苷酸序列。

SEQ ID NO44表示SEQ ID NO43的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO45表示编码TIC1324蛋白的天然Bt核苷酸序列。

SEQ ID NO46表示SEQ ID NO45的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO47表示编码TIC1324蛋白的人工核苷酸序列。

SEQ ID NO48表示SEQ ID NO47的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO49表示编码TIC1407蛋白的天然Bt核苷酸序列。

SEQ ID NO50表示SEQ ID NO49的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO51表示编码TIC TIC1407蛋白的人工核苷酸序列。

SEQ ID NO52表示SEQ ID NO51的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO53表示编码TIC TIC1408蛋白的天然Bt核苷酸序列。

SEQ ID NO54表示SEQ ID NO53的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO55表示编码TIC1408蛋白的人工核苷酸序列。

SEQ ID NO56表示SEQ ID NO56的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO57表示编码TIC1308蛋白的天然Bt核苷酸序列。

SEQ ID NO58表示SEQ ID NO57的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO59表示编码TIC1442蛋白的天然Bt核苷酸序列。

SEQ ID NO60表示SEQ ID NO59的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO61表示编码TIC1308蛋白的人工核苷酸序列。

SEQ ID NO62表示SEQ ID NO61的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO63表示编码TIC1442蛋白的人工核苷酸序列。

SEQ ID NO64表示SEQ ID NO63的氨基酸序列翻译。

发明详述

本发明涉及用于植物中的害虫控制、特别是线虫和/或昆虫控制的方法和组合物。在一方面，本发明涉及控制、预防或处理转基因植物中的线虫和/或昆虫感染。在一个实施方案中，所述方法包括生成含有重组构建体的转基因植物和表达这种构建体以便赋予植物这种害虫抗性。所述重组构建体可以包含编码一种或多种蛋白质的核苷酸序列，其中所述序列可操作地连接至在植物细胞中起作用的异源启动子，并且连接至用所述重组构建体转化的细胞。包含(意思是包括但不限于)所述重组构建体的细胞可以是原核的或真核的。具体地说，真核细胞可以是植物细胞。还涵盖源自于这类转化的植物细胞的植物和种子。在一个实施方案中，本发明的转基因植物或其部分产生源自于苏云金芽孢杆菌菌株的一种或多种杀虫蛋白质。

本发明提供在宿主细胞的细胞质中表达或者在真核细胞(如植物细胞)中使用的情况下还可能被引导到所述植物的质体中以便提供毒性蛋白的产生的异源分子，并且所述异源分子包括但不限于编码具有杀虫活性的多肽如SEQID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：38、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：54、SEQID NO：58以及SEQ ID NO：60的核苷酸区段。在某些实施方案中，具有杀虫活性的多肽可以与在以下各项中所示的任何一种或多种氨基酸序列共享至少约45％或至少约50％或至少约51％至79％或至少80％或至少85％或至少90％或至少95％或至少98％或至少99％或100％的序列同一性：SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQID NO：26、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：58或SEQ IDNO：60。编码的多肽的功能还可以通过测量编码所述多肽的转基因的存在在减少线虫和/或昆虫感染、生长、繁殖或症状方面的功效来确定。例如，在类似条件下，相对于对照植物(例如不包含异源分子的另外的同基因植物)而言，包含编码本发明的任何蛋白质的异源核苷酸构建体的转基因植物中根瘿、孢囊或蠕虫数目减少20％或更多、25％或更多、50％或更多、80％或更多或95％或更多表明存在功能性分子。

在某些实施方案中，由本发明提供的被引导到植物的质体中以便提供本发明的毒素蛋白的产生的异源分子可以与如在以下各项中所示的一种或多种序列在核苷酸水平上共享至少约60％至约79％或至少80％或至少85％或至少90％或至少95％或至少98％或至少99％或100％的序列同一性：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ IDNO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQID NO：59、SEQ ID NO：61以及SEQ ID NO：63。因此，在特定实施方案中，异源分子可以包含编码异源叶绿体转运肽的序列。

本发明的另一方面提供用于产生和使用本发明的一种或多种蛋白质以便控制线虫和/或昆虫侵染的方法。因此，提供用于例如在植物细胞中产生毒素的方法。所述毒素然后可以在种植作物之前、期间或之后施用于土壤，以便控制或减轻在所述土壤中生长的作物的线虫侵染或症状。

除非另外说明，否则相关领域的普通技术人员根据常规用法来理解术语。分子生物学中的常用术语的定义还可以在Rieger等，Glossary of Genetics：Classical and Molecular，第5版，Springer-Verlag：New York，1991；以及Lewin，Genes V，Oxford University Press：New York，1994中找到。DNA碱基的命名法如美国联邦法规典集的标题37，第1部分，第1.822节中所述。

如本文所使用的，“转基因植物”是其中植物的一个或多个或所有细胞包括转基因的任何植物。转基因可以被整合在核基因组或细胞器基因组内，或者它可以是染色体外复制的DNA。术语“转基因”是指对其被引入到其中的转基因微生物、植物、动物或细胞而言是部分或完全异源、外来的核酸。组成植物的各种细胞和组织类型的细胞包括但不限于种子、根、叶子、枝条、花、花粉以及胚珠。

“重组DNA”是具有通过将内源性和/或外源性分子组合于转录单元中、经由诱变进行操纵、限制酶等等或简单地通过插入多个拷贝的天然转录单元来引入的基因工程改造修饰的多核苷酸。重组DNA可以包含获自不同来源的DNA区段或获自相同来源的DNA区段，但是它们已经经过操作以便接合在天然状况下不是以接合形式存在的DNA区段。分离的重组多核苷酸可以按照以下形式存在：例如作为纯化的分子或被整合到基因组，如植物细胞或细胞器基因组或微生物质粒或基因组中。多核苷酸包含引起RNA在植物细胞中转录的连接的调控分子。

如本文所使用的，“同一性百分数”是指两个最佳对准的DNA或蛋白质区段在整个组分(例如核苷酸序列或氨基酸序列)比对窗口中没有变化的程度。测试序列和参考序列的比对区段的“同一性分数”是在比对窗口上这两个比对区段的序列所共享的相同组分数目除以参考区段中序列组分的总数，这个总数是全测试序列或全参考序列中的较小者。“同一性百分数”(“％同一性”)是同一性分数乘以100。

“表达”是指DNA转录以产生RNA。生成的RNA可以是(但不限于)编码蛋白质的mRNA、反义RNA或用于RNAi技术中的双链RNA。表达还可以指RNA的翻译，即，由mRNA产生所编码的蛋白质。

如本文所使用的，“启动子”是指用于启始转录的调控DNA分子。“植物启动子”是能够在植物细胞中启始转录的启动子(不论它的来源是否是植物细胞)。例如，众所周知的是，某些土壤杆菌启动子在植物细胞中是起作用的。因此，植物启动子包括获自植物、植物病毒(具体是双链DNA病毒)以及细菌(如土壤杆菌和慢生根瘤菌细菌)的启动子DNA。组成型启动子通常在大多数或所有植物细胞中提供转录。具体地说，启动子如FMV启动子(FMV，美国专利6,051,753)、增强型35S启动子(E35S，美国专利5,359,142)、水稻肌动蛋白启动子(美国专利5,641,876)以及各种嵌合启动子(美国专利6,660,911)在本发明中是有用的。在发育控制下的启动子的实例包括优先在某些组织，如叶子、根或种子中启始转录的启动子。这类启动子被称为“组织优先的”。仅在某些组织中启始转录的启动子被称为“组织特异性的”。

相对于其它植物组织在根组织中提供增强的表达的多种根特异性或根增强型启动子或这样的启动子的片段已经鉴别出来并且在本领域中是已知的(例如，美国专利5,110,732；5,837,848；5,837,876；5,633,363；5,459,252；5,401,836；7,196,247；7,232,940；7,119,254；以及7,078,589)。实例包括根增强型或根特异性的启动子，如CaMV源性as-1启动子或小麦POX1启动子(美国专利5,023,179)；酸性甲壳质酶基因启动子(Samac等，Plant Mol.Biol.25：587-596(1994))；CaMV35S启动子的根特异性子结构域(Lam等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)86：7890-7894(1989))；来自发根土壤杆菌的根增强型ORF13启动子(Hansen等，Mol.Gen.Genet.254：337-343(1997)；烟草根特异性基因RB7的启动子(美国专利号5,750,386)；以及由Conkling等(Plant Physiol.93：1203-1211(1990))报告的根细胞特异性启动子。另外的实例包括RCc2和RCc3，它们是在水稻中引导根特异性基因转录的启动子(Xu等，Plant Mol.Biol.27：237，1995)；大豆根特异性谷氨酰胺合成酶启动子(Hire等，Plant Mol.Biol.20：207-218，1992)；法国豆的GRP1.8基因中的根特异性控制元素(Keller和Baumgartner，Plant Cell3：1051-1061，1991.)；根瘤土壤杆菌的甘露碱合成酶(MAS)基因的根特异性启动子(Sanger等，Plant Mol.Biol.14：433-443，1990)；以及编码胞质谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表达(Miao等，Plant Cell3：11-22，1991)。还参见Bogusz等，Plant Cell2：633-641，1990，其中描述了从固氮非豆科植物糙叶山黄麻(Parasponiaandersonii)和相关的非固氮非豆科植物山油麻(Trema tomentosa)的血红素基因中分离的两种根特异性启动子。Leach和Aoyagi(1991)描述了它们对发根土壤杆菌的高度表达的rolC和rolD根诱导性基因的启动子的分析(参见PlantScience(Limerick)79：69-76)。另外的根优先性启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster等，Plant Mol.Biol.29(4)：759-772，1995)；和rolB启动子(Capana等，Plant Mol.Biol.25：681-691，1994)。线虫诱导的启动子的实例包括，例如TobRB7启动子(Opperman等，Science263：221-223，1994)，以及在美国专利6,262,344和7,193,136中描述的启动子。

当在比较转基因植物中的转基因的有效性的情形中使用时，术语“抗性”或“耐受性”是指转基因植物在暴露于线虫侵染压力时相对于在类似条件下由对线虫敏感的非转基因植物呈现的表型维持所希望的表型的能力。抗性水平可以通过将已经暴露于或者尚未暴露于线虫和/或昆虫感染的转基因植物与非转基因植物的物理特征进行对比来确定。要观察的示例性物理特征包括植物高度、有能力幸免于线虫或昆虫挑战的植物种群的增加(即，与寄生性线虫或昆虫相接触的植物可能具有增强的根生长、增强的果实或谷物产量以及降低的侵染植物或作物的线虫或昆虫的繁殖或害虫种群的增长速率的降低)。重组DNA的表达的产物可以直接对线虫具有毒性(杀线虫的)或对昆虫具有毒性(杀昆虫的)，或者可以影响移动性、宿主寻找、取食部位确立、繁殖力或者具有其它除线虫的和/或除昆虫的抑制作用。

“转化的种子”是由转化的植物产生的种子。转化的植物含有转化的细胞。转化的细胞是已经通过引入外源性DNA分子而被改变的细胞，或者在本发明中包含编码本发明的一种或多种蛋白质的异源DNA。

意图属于本发明的范围之内的害虫包括“鳞翅目害虫种群”，如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、蓓带夜蛾(Mamestraconfigurata)、小地老虎(Agrotis ipsilon)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)、黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)、苜蓿绿夜蛾(Hypena scabra)、烟芽夜蛾(Heliothis virescens)、黄地老虎(Agrotis subterranea)、一星粘虫(Pseudaletia unipuncta)、灰地老虎(Agrotis orthogonia)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、脐橙螟蛾(Amyelois transitella)、玉米根草螟(Crambuscaliginosellus)、稻切叶野螟(Herpetogramma licarsisalis)、向日葵飞蛾(Homoeosoma electellum)、南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellu)、苹果蠹蛾(Cydia pomonella)、葡萄浆果蛾(Endopiza viteana)、梨小食心虫(Grapholitamolesta)、向日葵卷叶蛾(Suleima helianthana)、小菜蛾(Plutella xylostella)、红铃麦蛾(Pectinophora gossypiella)、舞毒蛾(Lymantria dispar)、东方蛮蠊(Blattaorientalis)、亚洲蟑螂(Blatella asahinai)、德国蟑螂(Blattella germanica)、棕带蟑螂(Supella longipalpa)、美洲大蠊(Periplaneta americana)、褐斑大蠊(Periplaneta brunnea)、马德拉蜚蠊(Leucophaea maderae)、棉叶波纹夜蛾(Alabama argillacea)、果树黄卷蛾(Archips argyrospila)、玫瑰黄卷蛾(A.rosana)、二化螟(Chilo suppressalis)、稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)、玉米根草螟(Crambus caliginosellus)、草螟(C.teterrellus)、西南玉米螟(Diatraeagrandiosella)、小蔗杆草螟(D.saccharalis)、棉斑实蛾(Earias insulana)、翠纹钻夜蛾(E.vittella)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)、玉米穗蛾(H.zea)、烟芽夜蛾(Heliothis virescens)、稻切叶野螟(Herpetogramma licarsisalis)、葡萄花翅小卷蛾(Lobesia botrana)、红铃麦蛾(Pectinophora gossypiella)、桔潜蛾(Phyllocnistis citrella)、大菜粉蝶(Pieris brassicae)、菜粉蝶(P.rapae)、小菜蛾(Plutella xylostella)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、斜纹夜蛾(S.litura)、草地贪夜蛾(S.frugiperda)以及番茄斑潜蝇(Tuta absoluta)。“鞘翅目害虫种群”包括墨西哥棉铃象(Anthonomus grandis)、稻水象甲(Lissorhoptrus oryzophilu)、粮仓玉米象(Sitophilus granaries)、米象(Sitophilus oryzae)、三叶草叶象(Hyperapunctata)、玉米隐喙象(Sphenophorus maidis)、马铃薯甲虫(Leptinotarsadecemlineata)、西方玉米根虫(Diabrotica virgifera virgifera)、北方玉米根虫(Diabrotica barberi)、斑点黄瓜甲虫(Diabrotica undecimpunctata howardi)、玉米跳甲(Chaetocnema pulicaria)、十字花科条跳甲(Phyllotreta cruciferae)、葡萄肖叶甲(Colaspis brunnea)、橙足负泥虫(Oulema melanopus)、向日葵叶甲(Zygogramma exclamationis)、墨西哥豆瓢虫(Epilachna varivestis)、日本金龟(Popillia japonica)、北方圆头犀金龟(Cyclocephala boreali)、南方圆头犀金龟(Cyclocephala immaculata)、欧洲金龟(Rhizotrogus majalis)、具毛鳃角金龟(Phyllophaga crinita)、胡萝卜金龟(Ligyrus gibbosus)、梳爪叩甲属(Melanotusspp.)、宽胸叩头虫属(Conoderus spp.)、金针虫属(Limonius spp.)、细胸扣甲属(Agriotes spp.)、金针虫属(Ctenicera spp.)以及Aeolus spp.、伪金针虫属(Eleodesspp)。“植物病原性线虫种群”包括植物寄生物种，例如胞囊属物种、球胞囊属物种、根结属物种、盘旋属物种、纽带属物种、刺属物种、短体属物种、长针属物种、拟毛刺属物种、茎属物种、剑属物种、锥属物种、螺旋属物种、穿孔属物种、潜根属物种、矮化属物种以及毛刺属物种等，并且具体包括大豆胞囊线虫(大豆胞囊线虫)、甜菜胞囊线虫(大豆胞囊线虫)、禾谷胞囊线虫、马铃薯金线虫、马铃薯白线虫、玉米短体线虫(根结线虫)、爪哇根结线虫、最短尾短体线虫(根结线虫)、北方根结线虫以及南方根结线虫。

本发明提供包含多核苷酸的重组DNA构建体，所述多核苷酸在被并入植物细胞中时赋予所述植物针对线虫和/或昆虫感染或由这种感染(又称为侵染)所引起的植物疾病的抗性。这类构建体还通常包含操作性地连接至所述多核苷酸以便提供在植物细胞中的表达的启动子。其它构建体组分可以包括另外的调控分子如5’前导区或3’非翻译区(如多腺苷酸化位点)、内含子区以及转运肽或信号肽。这类重组DNA构建体可以使用本领域普通技术人员所已知的方法来组装。

根据本发明制备的重组构建体还通常包括3′非翻译DNA区(UTR)，所述3′非翻译DNA区通常在多核苷酸编码区之后含有多腺苷酸化序列。有用的3’UTR的实例包括但不限于来自以下各项的那些UTR：根瘤土壤杆菌的胭脂碱合成酶基因(nos)、编码核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶-加氧酶的小亚基的基因(rbcS)以及根瘤土壤杆菌的T7转录物。

构建体和载体还可以包括用于使蛋白质产物靶向，具体是靶向叶绿体、白色体或其它质体细胞器、线粒体、过氧化物酶体或液泡或细胞外位置的转运肽。对于叶绿体转运肽的使用的说明，参见美国专利5,188,642和美国专利号5,728,925。许多叶绿体定位的蛋白质从核基因表达为前体，并且通过叶绿体转运肽(CTP)靶向叶绿体。其它这类分离的叶绿体蛋白质的实例包括但不限于与以下各项相关联的那些：核酮糖-1，5，-二磷酸羧化酶的小亚基(SSU)、铁氧还蛋白、铁氧还蛋白氧化还原酶、集光复合物蛋白I和蛋白II、硫氧还蛋白F、烯醇丙酮莽草酸磷酸合成酶(EPSPS)以及美国专利7,193,133中所述的转运肽。已在体内和体外证实，通过使用具有异源CTP的蛋白质融合物可使非叶绿体蛋白质靶向叶绿体，并且所述CTP足以使蛋白质靶向叶绿体。已显示并入合适的叶绿体转运肽，如拟南芥(Arabidopsis thaliana)EPSPS CTP(CTP2，Klee等，Mol.Gen.Genet.210：437-442，1987)和矮牵牛(Petunia hybrida)EPSPS CTP(CTP4，della-Cioppa等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：6873-6877，1986)使异源EPSPS蛋白质序列靶向转基因植物中的叶绿体。通过表达包含氨基末端CTP与草甘膦抗性EPSPS酶的融合蛋白来产生耐草甘膦植物是本领域的普通技术人员所熟知的，(美国专利号5,627,061、美国专利号5,633,435、美国专利号5,312,910、EP0218571、EP189707、EP508909以及EP924299)。本领域的普通技术人员将认识到，可以制备出利用CTP的功能性来将本发明的各种杀虫蛋白质输入植物细胞质体中的各种嵌合构建体。

用于植物转化的合适方法几乎包括可借以将DNA引入细胞中的任何方法，如通过直接递送DNA(例如，通过PEG介导的原生质体转化、通过电穿孔、通过与碳化硅纤维一起搅动以及通过对DNA包覆的粒子进行加速)、通过土壤杆菌介导的转化、通过病毒或其它载体。植物转化的一种优选方法是微粒轰击，例如，如在美国专利5,015,580(黄豆)、5,550,318(玉米)、5,538,880(玉米)、6,153,812(小麦)、6,160,208(玉米)、6,288,312(水稻)和6,399,861(玉米)以及6,403,865(玉米)中所说明。

土壤杆菌介导的植物(尤其是作物植物)转化的详细步骤包括，例如在以下各项中公开的步骤：美国专利5,004,863、5,159,135、5,518,908、5,846,797以及6,624,344(棉花)；5,416,011、5,569,834、5,824,877、5,914,451、6,384,301以及7,002,058(黄豆)；5,591,616、5,981,840以及7,060,876(玉米)；5,463,174和5,750,871(芸薹属物种，包括油菜籽和油菜)；以及美国专利申请公布2004/0244075(玉米)、2004/0087030(棉花)以及2005/0005321(大豆)。土壤杆菌介导的转化的其它步骤公开于WO9506722(玉米)中。类似的方法已经针对许多植物物种(双子叶植物和单子叶植物两者)进行了报告，所述植物包括花生(Cheng等，Plant Cell Rep.，15：653，1996)；芦笋(Bytebier等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，84：5345，1987)；大麦(Wan和Lemaux，Plant Physiol.，104：37，1994)；水稻(Toriyama等，Bio/Technology，6：10，1988；Zhang等，Plant Cell Rep.，7：379，1988)；小麦(Vasil等，Bio/Technology，10：667，1992；Becker等，Plant J.，5：299，1994)；苜蓿(Masoud等，Transgen.Res.，5：313，1996)；芸薹属物种(Radke等，Plant Cell Rep.，11：499-505，1992)；以及番茄(Sun等，Plant Cell Physiol.，47：426-431，2006)和其它物种。当与适当的转化方案如(但不限于)细菌感染(例如，使用如上文所述的土壤杆菌)、双元细菌人工染色体构建体、DNA的直接递送(例如，经由PEG介导的转化、干燥/抑制介导的DNA摄取、电穿孔、与碳化硅纤维一起搅动以及微粒轰击)一起使用时，转基因植物细胞和转基因植物还可以通过使用其它载体进行转化而获得，所述载体如(但不限于)病毒载体(例如，烟草蚀纹病毒(TEV)、大麦条纹花叶病毒(BSMV)以及Edwardson和Christie，“The Potyvirus Group：Monograph No.16”，1991，Agric.Exp.Station，佛罗里达大学中提及的病毒)、质粒、粘粒、YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)或任何其它合适的克隆载体。本领域的普通技术人员将清楚了解，可以使用和修改各种转化方法，用于从多种相关植物物种产生稳定的转基因植物。例如，可以构建稳定遗传的重组DNA构建体和微型染色体用作用于构建转基因植物的载体(美国专利7,235,716)。

本发明的植物包括但不限于：金合欢、苜蓿、小茴香、苹果、杏、朝鲜蓟、芝麻菜、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆子、甜菜(beet)、黑莓、蓝莓、青花菜、抱子甘蓝、卷心菜、油菜、棱瓜、胡萝卜、甜瓜、木薯、菜花、芹菜、樱桃、香菜、柑橘、石刁柏、咖啡、玉米、棉花、黄瓜、花旗松、茄子、苦苣、莴苣、桉树、茴香、无花果、林木、葫芦、葡萄、葡萄柚、蜜露、豆薯、猕猴桃、生菜、韭菜、柠檬、青柠、火炬松、芒果、甜瓜、蘑菇、坚果、燕麦、黄秋葵、洋葱、桔子、观赏植物、番木瓜、香芹菜、豌豆、桃、花生、梨、胡椒、柿子、松树、菠萝、芭蕉、李子、石榴、白杨、马铃薯、南瓜、榅桲、辐射松、菊苣、萝卜、油菜籽、树莓、水稻、黑麦、高粱、南方松、大豆、菠菜、笋瓜、草莓、甜菜(sugarbeet)、甘蔗、向日葵、甘薯、枫香、蜜柑、茶叶、烟草、番茄、草皮、藤、西瓜、小麦、山芋以及西葫芦。作物植物被定义为被栽培来产生一种或多种商业产品的植物。这类作物或作物植物的实例包括但不限于大豆、油菜(canola)、油菜(rape)、棉花(棉籽)、花生、向日葵、木豆、鹰嘴豆等；以及谷物如玉米、小麦、水稻、燕麦、小米和黑麦等。油菜(canola)、油菜籽以及油菜(rape)在本发明中同义使用。

提供含有稳定整合的重组DNA的转基因植物细胞和转基因植物的转化方法优选地在培养基上和受控环境中在组织培养物中实施。受体细胞标靶包括但不限于分生组织细胞、愈伤组织、未成熟的胚胎或胚胎部分、配子细胞，如小孢子、花粉、精子以及卵细胞。可再生出能育植物的任何细胞均被涵盖为用于实施本发明的有用的受体细胞。愈伤组织可以起始于各种组织来源，包括但不限于未成熟的胚胎或胚胎部分、籽苗顶端分生组织、小孢子等。能够增殖作为愈伤组织的那些细胞可以用作用于基因转化的受体细胞。用于制备本发明的转基因植物的实用转化方法和材料(例如，各种培养基和受体标靶细胞、未成熟的胚胎的转化以及能育转基因植物的后续再生)公开于例如美国专利6,194,636和6,232,526以及美国专利申请公布2004/0216189中。

在一般的转化实践中，在任何一个转化实验中DNA仅被引入到小百分比的标靶细胞中。通常使用标记基因来提供用于识别被转基因DNA构建体转化的那些细胞的有效系统。优选的标记基因提供赋予针对选择剂(如抗生素或除草剂)的抗性的选择标记物。植物细胞可以对其具有抗性的任何抗生素或除草剂都可以是用于选择的有用试剂。将潜在地转化的细胞暴露于选择剂。一般赋予抗性的基因以足以容许细胞在选择剂的存在下存活的水平表达的那些细胞将在存活细胞种群中。可对细胞进行进一步测试以确认重组DNA的整合。常用的选择标记基因包括赋予针对以下的抗性的那些基因，抗生素如卡那霉素或巴龙霉素(nptII)、潮霉素B(aphIV)、庆大霉素(aac3和aacC4)和草丁磷(bar或pat)、草甘膦(EPSPS)以及麦草畏(麦草畏单加氧酶)。有用的选择标记基因和选择剂的实例在美国专利5,550,318、5,633,435、5,780,708以及6,118,047中说明。还可以采用可筛查的标记物或报告物，如提供视觉识别转化体的能力的标记物。有用的可筛查的标记物的非限制性实例包括例如表达这样的蛋白质的基因：所述蛋白质通过对显色底物(例如，β-葡萄糖醛酸酶、GUS、uidA或荧光素酶luc)起作用而产生可检测的颜色，或者所述蛋白质本身是可检测的，如绿色荧光蛋白(GFP，gfp)或免疫原性分子。本领域的技术人员将认识到许多其它有用的标记物或报告物是可供使用的。

本发明的重组DNA构建体可以例如通过表达其它转基因而与其它重组DNA堆叠以便赋予另外的农艺性状(如在转化的植物的情况中，性状包括但不限于除草剂抗性、昆虫抗性、冷发芽耐受性、缺水耐受性、产量提高、质量提高、真菌、病毒以及细菌性疾病抗性)。本发明的重组DNA构建体还可以被转化到携带天然害虫或病原体抗性基因的植物品种中以增强抗性表型的功效。用于协同减弱和/或加强基因表达的构建体在美国专利申请公布2004/0126845A1中公开。可以收获转基因能育植物的种子并且用于生长本发明的在它们的基因组中包含重组DNA构建体的转基因植物的后代，包括杂交世代。因此，除了使用本发明的重组DNA构建体直接转化植物之外，本发明的转基因植物还可以通过使具有所述重组DNA的第一种植物与缺乏所述构建体的第二种植物杂交来制备。例如，可将重组DNA引入到适于进行转化的植物系中以产生转基因植物，所述转基因植物可以与第二种植物系杂交以将重组DNA渗入到所生成的子代中。本发明的转基因植物可以与具有其它重组DNA或天然存在的赋予一种或多种另外的性状(如但不限于除草剂抗性、昆虫或疾病抗性、环境应力抗性、改变的营养物含量以及产量提高)的基因区的植物系杂交，以便产生具有赋予所希望的标靶序列表达行为和所述另外的一种或多种性状的重组DNA的子代植物。通常，在这种用于组合性状的繁育中，贡献另外的性状的转基因植物是雄性系，而携带基础性状的转基因植物是雌性系。这种杂交的后代分离以使得一些植物将携带两个亲本性状的DNA而一些植物将携带一个亲本性状的DNA；这类植物可通过与亲本重组DNA相关联的标记物来识别。携带两个亲本性状的DNA的子代植物可以与雌性亲系回交多次，例如，通常为6到8代，以便产生的子代植物除了另一个转基因亲系的重组DNA之外具有与一个初始转基因亲系实质上相同的表型。

其它蛋白质和毒性剂可以与本发明的一种或多种蛋白质一起使用以便控制植物病原性线虫和/或昆虫侵染并且减少发展出对任何单一控制方法的抗性的可能性。这类其它蛋白质和毒性剂包括但不限于(在适用于线虫控制或昆虫控制的情况下)甲基酮合成酶；在细胞中表达并且靶向于抑制一种或多种必需基因、管家基因、繁殖基因或发育基因的dsRNA；本领域已知对植物病原性线虫或昆虫有毒性的其它蛋白质，如Cry和VIP蛋白(万维网上的lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/index.html”，其适当时作为Crickmore等(2010)″Bacillus thuringiensis toxin nomenclature″引用)；以及在种子处理或土壤浇灌中使用的化学杀线虫剂。局部应用的dsRNA方法在本领域中也是已知的，所述方法可以应用于表达本发明的一种或多种蛋白质的植物。这类局部应用可以在植物中引起系统性作用方面是有效的，所述局部应用通过向植物施用靶向于调控植物中涉及这类抗性的基因的dsRNA分子而产生线虫或昆虫控制。所有这类组合皆在本发明的范围之内。

本发明的转基因植物、植物部分、种子或子代植物可以被加工成在商业中有用的产品。这些产品、商品产品包括但不限于粉、面粉、油、干草、淀粉、果汁、蛋白质提取物以及纤维。

本发明的蛋白质已使用多种方法来识别。一种方法是识别先前已知的Bt蛋白，其展现出的质量小于约40kDa或小于约35kDa或小于约30kDa或小于约28kDa或小于约25kDa或小于约20kDa或小于约15kDa。这类蛋白质包括但不限于大多数已知的双元Bt毒素的较小组分，如Cry34/35(PS149B1)、TIC100/101、ET33/34、ET80/76等。本领域已知的其它蛋白质包括TIC901、TIC1201、TIC407、TIC417、TIC431、ET70、VIP蛋白(如VIP3Aa)等，它们都是已知展现出杀昆虫活性的一般小型毒素蛋白。本发明的发明人已鉴别出，这类较小毒素分子当被提供于秀丽隐杆线虫的饮食中时展现出各种水平的抑制作用。出人意料的是，还观察到，可以通过将蛋白质截短成更小的尺寸(不论是在C末端、N末端还是在两者进行截短)经由胞囊线虫的饮食而更有效地赋予这些蛋白质的杀线虫活性。截短型式通常展现出约14至约28-30kDa的质量，并且展现出改进的生物活性，这可能是因为胞囊线虫摄取大于约30kDa的蛋白质的能力受到限制(Urwin等((1997)Plant J.12：455)和Bockenhoff与Grundler((1994)Parasitology109：249))。TIC1501(约27kDa)、TIC1503(约34kDa)以及TIC1506(约36kDa)表示TIC1201蛋白的不同片段，先前显示1201展现出鞘翅目昆虫毒性作用。出人意料的是，小于36kDa的截短型式展现出显著的杀线虫作用。

还已经从头识别出本发明的蛋白质，并且这些蛋白质包括在本文中列举为以下各项的蛋白质：TIC614、TIC615、TIC1277、TIC1278、TIC1308、TIC1310、TIC1311、TIC1324、TIC1407、TIC1408以及TIC1442。这类蛋白质通过各种方法来识别：无论是直接从各种Bt菌株基因组扩增，或者是通过对各种Bt基因组进行高通量序列分析来识别。在任一情况下，获得基因组DNA区段并且使用导致识别出编码蛋白质区段的开放阅读框的全部或部分的生物信息技术进行分析。然后将得到的蛋白质区段相对于本领域所有已知的蛋白质序列进行表征，并且程度达到存在与毒素分子的任何类似性，获得编码所述蛋白质的开放阅读框的完整序列。然后将识别出的展现出小于约40kDa或优选小于约30kDa的质量的蛋白质在秀丽隐杆线虫测定中进行评估以确定是否相对于秀丽隐杆线虫存活观察到任何作用。然后评估展现出杀线虫特性的毒素的其它杀虫特性、特别是杀昆虫活性。出人意料的是，上文提及的蛋白质都展现出杀线虫活性，并且一些展现出杀昆虫活性，如在以下实施例中所报告的。

实施例

以下实施例说明本发明，所述实施例可以以各种形式来实施并且不应被解释为以任何方式限制本发明的范围或内容。

实施例1

编码Bt毒素蛋白的DNA分子

先前已对毒素ET34(SEQ ID NO：1)进行了描述(美国专利号6063756)。将来自基因P139的分泌信号(来自WIPO公布号WO9408010的SEQ ID NO：1的头75个核苷酸)可操作地连接至ET34(SEQ ID NO：5)的5’末端以使它能够分泌到质膜外，从而避免对植物细胞的潜在毒性并且允许蛋白质对于害虫来说容易接近。

TIC1506(SEQ ID NO：9)、TIC1501(SEQ ID NO：13)以及TIC1503(SEQID NO：17)是TIC1201的不同片段的Bt核苷酸，所述TIC1201长364个氨基酸，如在美国专利申请公布号US2006-0191034A1的SEQ ID NO6中所述。TIC1506长321个氨基酸，不具有TIC1201的假定的N端信号肽，并且含有TIC1201的氨基酸44至364，其中在氨基酸位置44处的天然丙氨酸残基被甲硫氨酸残基取代。TIC1501长227个氨基酸，不具有TIC1201的假定的N端信号肽和一部分C端，并且含有TIC1201的氨基酸44至270，其中在位置44处的天然丙氨酸残基被甲硫氨酸残基取代。TIC1503长301个氨基酸，不具有TIC1201的假定的N端信号肽和一部分C端，并且含有TIC1201的氨基酸44至344，其中在位置44处的天然丙氨酸残基被甲硫氨酸残基取代。

已经识别出各种Bt菌株中展现出杀虫特性的蛋白质。识别出了编码氨基酸序列TIC614(SEQ ID NO：22)、TIC615(SEQ ID NO：26)、TIC1277(SEQ IDNO：30)、TIC1278(SEQ ID NO：34)、TIC1310(SEQ ID NO：38)、TIC1311(SEQID NO：42)、TIC1324(SEQ ID NO：46)、TIC1407(SEQ ID NO：50)以及TIC1408(SEQ ID NO：54)的、与先前已知的Bt毒素区段展现出不同程度的同源性的开放阅读框。对这类开放阅读框的完全正向和反向序列分析导致识别出展现出用于杀虫(杀线虫和/或杀昆虫)活性的尺寸和潜能的推导出的氨基酸组成。

已经在各种Bt菌株中识别出展现出杀虫特性的蛋白质。识别出了编码氨基酸序列TIC1308(SEQ ID NO：58)和TIC1442(SEQ ID NO：60)的、与先前已知的Bt毒素区段展现出不同程度的同源性的开放阅读框。对这类开放阅读框的完全正向和反向序列分析导致识别出展现出用于杀虫(杀线虫和/或杀昆虫)活性的尺寸和潜能的推导氨基酸组成。

实施例2

自多核苷酸表达杀虫多肽

将编码实施例1中所示例的推导氨基酸组成的ET34(SEQ ID NO：1)、P139-ET34(SEQ ID NO：5)、TIC1506(SEQ ID NO：9)、TIC1501(SEQ IDNO：13)、TIC1503(SEQ ID NO：17)、TIC614(SEQ ID NO：21)、TIC615(SEQID NO：25)、TIC1277(SEQ ID NO：29)、TIC1278(SEQ ID NO：33)、TIC1310(SEQ ID NO：37)、TIC1311(SEQ ID NO：41)、TIC1324(SEQ ID NO：45)、TIC1407(SEQ ID NO：49)、TIC1408(SEQ ID NO：53)、TIC1308(SEQ ID NO：57)以及TIC1442(SEQ ID NO：59)的开放阅读框克隆到Bt/大肠杆菌穿梭质粒中，从而使得所述推导氨基酸组成能够在无晶体Bt菌株或在大肠杆菌细菌中表达。在确认编码所述多肽的多核苷酸的DNA序列之后，将重组质粒转化到无晶体Bt表达宿主中。将相关基因克隆到芽孢杆菌营养阶段或孢子形成阶段特异性启动子的下游，以允许蛋白质分别在重组Bt菌株的营养生长期间或在孢子形成期间表达。蛋白质的营养表达的条件包括在25℃至28℃下在Terrific Broth培养基中使细胞生长24至48小时。晶体形成是某些Bt毒素蛋白的一个特征。对被确认当在无晶体Bt菌株中表达时产生晶体的蛋白质进行进一步评估。某些蛋白质在细胞中累积和/或被分泌到培养基中。通过SDS-PAGE分析细胞集结粒和培养物两者的预期蛋白质的表达。自孢子形成特异性启动子的表达的条件包括在25℃至28℃下在C2培养基中使细胞生长96小时。蛋白质晶体在孢子形成期间形成并且在孢子形成完成时从溶解的细胞中释放出来。通过在4000xg下离心20分钟收集孢子和晶体、再悬浮于洗涤缓冲液(10mM Tris、0.1mM EDTA以及0.005％Triton X100pH6.8)中并且再次通过离心进行收集。然后将孢晶集结粒再悬浮于1/10的初始培养物体积中。通过SDS-PAGE分析10X浓缩的孢晶制剂中预期蛋白质的存在。

实施例3

线虫和昆虫生物测定

秀丽隐杆线虫取食筛查已经成功地用于识别植物病原性线虫活性毒素，例如针对来自垫刃目的SCN和RKN(Wei等，2003，PNAS，USA，100：2760)。本发明的蛋白质基本上遵循Wei等的方法表达并且提供于秀丽隐杆线虫的饮食中。功效以1-3的分数来计分，其中分数1表示秀丽隐杆线虫健康和繁殖正常，而分数3表示秀丽隐杆线虫不繁殖或不健康。毒素ET34(SEQ ID NO：2)、TIC1501(SEQ ID NO：14)、TIC1503(SEQ ID NO：18)、TIC614(SEQ IDNO：22)、TIC615(SEQ ID NO：26)、TIC1277(SEQ ID NO：30)、TIC1278(SEQID NO：34)、TIC1310(SEQ ID NO：38)、TIC1311(SEQ ID NO：42)、TIC1324(SEQ ID NO：46)以及TIC1407(SEQ ID NO：50)各自展现的分数为3，而TIC1408(SEQ ID NO：54)展现的分数为2.75。蛋白质TIC1308(SEQ ID NO：58)和TIC1442(SEQ ID NO：60)各自展现的分数为1。从营养特异性启动子表达蛋白质并且通过将形成孢子的细菌细胞或培养物上清液施加到人工昆虫饮食中来喂给昆虫。对于从孢子形成特异性启动子表达的多肽，将具有约500-4000ppm蛋白质的10-20X孢晶制剂施加到昆虫饮食中。对于以下这些昆虫中的一个或多个观察到发育迟缓或死亡：CEW(玉米穗虫)；SCR(南方玉米根虫)；WCR(西部玉米根虫)；ECB(欧洲玉米螟)；WTPB(西部牧草盲蝽)；TPB(牧草盲蝽)；FAW(秋粘虫)；CPB(科罗拉多马铃薯甲虫)。发现TIC1277和TIC1311引起ECB显著发育迟缓，并且发现TIC1310引起WTPB显著发育迟缓和CPB显著发育迟缓和死亡。

实施例4

转化的植物

对编码TIC1506(SEQ ID NO：11)、TIC1503(SEQ ID NO：19)、TIC614(SEQ ID NO：3)、TIC1324(SEQ ID NO：27)、TIC1407(SEQ ID NO：31)、TIC1408(SEQ ID NO：35)的核苷酸区段进行密码子优化以供植物表达并且可操作地连接至一个或多个植物功能性启动子并且被引入植物细胞中。从这类转化的植物细胞再生重组植物，并且评估再生植物对害虫侵染的抗性，如昆虫耐受性和/或植物病原性线虫耐受性。

对编码ET34(SEQ ID NO：3)、ET34+P139分泌信号(SEQ ID NO：7)、TIC1501(SEQ ID NO：15)、TIC615(SEQ ID NO：7)、TIC1277(SEQ IDNO：11)、TIC1278(SEQ ID NO：15)、TIC1310(SEQ ID NO：19)、TIC1311(SEQ ID NO：23)、TIC1308(SEQ ID NO：61)以及TIC1442(SEQ ID NO：63)的核苷酸区段进行密码子优化以供植物表达并且可操作地连接至一个或多个植物功能性启动子并且被引入植物细胞中。从这类转化的植物细胞再生重组植物，并且评估再生植物对害虫侵染的抗性，如昆虫耐受性和/或植物病原性线虫耐受性。

实施例5

大豆的转化

这个实施例描述了产生转基因大豆植物和转基因植物部分如种子的方法。植物细胞转化的其它方法在本领域是已知的，所述方法可以应用来转化植物细胞并且使用本发明的重组构建体来再生转基因植物。获得转基因大豆植物和种子的方法基本上如美国专利申请公布号US2009-0138985A1所公开的那样来使用。简单地说，使含有实施例5的构建体的土壤杆菌在28℃下在含有大观霉素的Luria Burtani(LB)培养基中生长过夜。将细菌培养物离心、对离心块进行洗涤、并且再悬浮于INO培养基中以便接种湿的或干的成熟胚胎外植体。将所述外植体与土壤杆菌细胞悬浮液混合并且短暂地暴露于来自标准实验室水浴清洗超声发生器的声波处理能量。使所述外植体排干任何液体并且转移至含有以INO培养基润湿的滤纸的容器中并且在发光室中在约16小时的光照(≥5uE)下在约23℃至28℃下共培养1至5天。在共培养后，将外植体直接放置在含有选择剂(如大观霉素)的再生培养基上约7至约42天。随后将培养物转移至适合于回收转化的小植株的培养基中。具有绿芽和叶子的大观霉素抗性枝条被视为经过转化并且被放置在土壤中或用于在存在或不存在选择剂的情况下生根的土壤替代物上。选择提供害虫抗性、尤其是线虫抗性的子代转基因植物和种子。

实施例6

测试转基因植物的大豆胞囊线虫(SCN)抗性

使用SCN壶测定来评估包含SEQ ID NO：3、7以及15的多核苷酸序列中的一种或多种的转基因大豆植物对由根上的SCN(大豆胞囊线虫(Heterodera glycines))造成的感染和其繁殖的抗性。向三或四英寸直径方壶中装填洁净的沙子并且透彻地浇水。将转基因大豆种子和对照大豆种子，或者任何生根的植物部分在壶的中央以每壶一个进行种植并且充分浇水以去除气袋。将壶在20℃至30℃下在温室或生长室中孵育，直到植物达到适合于接种的年龄为止。始于种子的大豆通常在种植后2到3周进行接种，而移植物在种植后1到3天进行接种。测试接种物由从受侵染大豆植物的土壤和根收集的成年大豆胞囊线虫胞囊的卵组成。使用80微米筛目筛来收集胞囊，然后将所述胞囊在Tenbroeck玻璃组织匀浆器中压碎以释放卵。通过筛分并且在40％蔗糖溶液上在4000RPM下离心5分钟对卵进行进一步纯化。用于实验的接种物由每毫升含有500个蠕虫卵的水组成。将5mL的卵悬浮液施加到含有测试植物的沙子的表面上并且对卵轻轻洒水。然后使测试植物返回到温室或生长室并且孵育3到4周以允许根感染和胞囊形成。然后收获根。通过计数粘附到根系上的线虫胞囊的数目来测量线虫感染的严重度。

在六个不同的构建体中测试包含SEQ ID NO：3的转基因大豆植物，其中在每个构建体中SEQ ID NO：3可操作地连接至不同的启动子。在两个不同的构建体中测试包含SEQ ID NO：7的转基因大豆植物，每个构建体具有不同的启动子。通过从一个构建体表达来测试包含SEQ ID NO：15的转基因大豆植物。

表1报告的数据说明，评估和测定了每多个构建体具有多个事件的植物，与未转化的大豆栽培品种相比较时，SCN的胞囊显著减少。测试的植物根的数目在测试的事件的数目之间大致相等地分布。

表1.大豆植物根上的大豆胞囊线虫胞囊感染的严重度

实施例7

测试转基因拟南芥属植物的甜菜胞囊线虫(BCN)抗性

通过Clough等，1998(Plant J.16：735-743)的方法来产生包含SEQ ID NO3、15、27、31、35、39、43、61以及63的多核苷酸序列中的一种或多种的转基因拟南芥属种子和植物并且通过Sijmons等，1991(Plant J.1：245-254)和Vaghchhipawala等，2004(Genome47：404-13)的方法来评估甜菜胞囊线虫(BCN)抗性。

对拟南芥属(品种Columbia-0)种子进行表面灭菌并且用无菌水冲洗并且铺在B5培养基上。将板在23℃至25℃下在16小时光照/8小时黑暗循环下孵育7到10天。将BCN卵放置在无菌滤纸上并且在25℃下在5mM ZnSO4溶液中孵化5到7天。收集J2期线虫幼虫、用无菌水冲洗、并且用0.5％的二醋酸氯己定(chlorhexidine diacetate)处理10到15分钟。收集处理过的J2线虫幼虫并且用无菌水冲洗两次并且储存在无菌水中用于侵染目的。

对于侵染测定，将约10至15个拟南芥属种子撒在壶中的蒸汽处理过的沙子上，并且用透明塑料圆顶覆盖。将若干这种圆顶/平板组合放置在平板中并且然后用黑色托盘覆盖并且转移至冷室中以便进行春化。在第4天，将平板从冷室中取出，移除黑色托盘，并且将平板放置在生长室中用于在26℃，70％湿度，140-180μE光照，12小时昼长下进行驯化。根据需要对壶进行浇水和灭菌。种植后三周，用3,000个BCN卵对拟南芥属植物进行接种。接种后约35天，收获植物并且通过在一桶水中洗涤植物的根并且将水过滤通过50筛目筛顶部的16筛目筛来提取胞囊。在50筛目筛的顶部收集走胞囊并且计数。与非转基因或转基因对照物相比具有较小数目的胞囊的植物被视为对BCN具有抗性。

表2报告的数据说明，评估和测定了每多个构建体具有多个事件的植物，与未转化的拟南芥亲本背景相比，BCN胞囊的数目较少。测试的植物根的数目在测试的事件的数目之间近似相等地分布。

表2.拟南芥植物根上的甜菜胞囊线虫胞囊感染的严重度

在本文中引用了各种专利和非专利公布，每个公布的公开内容以引用的方式整体并入本文。本文引用的可在某些网址从万维网获得的文件也以引用的方式整体并入本文。

因为可以在不背离本发明的范围的情况下在本文描述和说明的组合物和方法中做出各种修改，所以意图是在前述说明书中包含的或在附图中显示的所有材料都应被解释为是说明性的而非限制性的。因此，本发明的广度和范围不应受到任何上述示例性实施方案的限制，而应该仅按照所附的以下权利要求书和它们的等同物来限定。

Claims (9)

1.一种编码杀虫多肽的多核苷酸分子，

a)其中所述杀虫多肽任选地选自由以下各项组成的组：

i)具有如在以下各项中的任一个中所示的氨基酸序列的蛋白质：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：42、SEQ IDNO：46、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：54、SEQ IDNO：58以及SEQ ID NO：60；

ii)展现出与如在以下各项中的任一个中所示的氨基酸序列约45％至约99.9％相同的氨基酸区段的蛋白质：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQID NO：26、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：38、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：46、SEQ IDNO：50、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：58以及SEQ IDNO：60；或

iii)展现出与如在i)或ii)中所示的所述蛋白质的杀虫活性实质上相当的(生物功能上相当的)杀虫活性的如在i)或ii)中所示的所述蛋白质的片段；

b)其中所述多核苷酸分子提供于重组表达盒中；

c)其中所述多核苷酸分子提供于转基因或重组宿主细胞中；

i)其中所述宿主细胞选自由以下各项组成的组：土壤杆菌属(Agrobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、根瘤菌属(Rhizobium)以及植物细胞；

ii)其中所述植物细胞选自由以下各项组成的组：苜蓿、香蕉、大麦、豆子、青花菜、卷心菜、油菜、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭葱、生菜、火炬松、小米、甜瓜、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧场草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、白杨、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、水稻、根茎、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、笋瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、香枫、甘薯、柳枝稷、茶叶、烟草、番茄、小黑麦、草坪草、西瓜以及小麦植物细胞；

d)其中所述核苷酸分子提供于选自在c)i)中所示的组的重组植物中；并且

e)其中所述多核苷酸分子存在于重组植物的一部分中，所述植物部分选自由以下各项组成的组：叶子、茎花、萼片、果实、根或种子；并且

i)其中由所述重组植物产生产品，并且所述产品包

含可检测的量的所述多核苷酸分子，所述产品选自

由以下各项组成的组：油、粉、棉绒以及种子。

2.一种杀虫多肽：

a)选自由以下各项组成的组：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：58以及SEQ ID NO：60；

b)具有与在以下各项中所示的任一蛋白质展现出约45％至约99.9％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：58以及SEQ ID NO：60；并且

c)展现出与如在a)或b)中所示的所述多肽实质上相当的(生物功能上相当的)杀虫活性的如在a)和b)中所示的所述多肽的杀虫片段。

3.一种控制植物的杀虫感染的方法，所述方法任选地包括提供杀虫多肽，所述杀虫多肽：

a)选自由以下各项组成的组：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：58以及SEQ ID NO：60；

b)具有与在以下各项中所示的任一蛋白质展现出约45％至约99.9％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：58以及SEQ ID NO：60；

c)展现出与如在a)或b)中所示的所述多肽实质上相当的(生物功能上相当的)杀虫活性的如在a)和b)中所示的所述多肽的杀虫片段；

d)如在a)、b)或c)中任一项中所示的被提供给对所述多肽敏感的害虫，从而控制所述害虫；

e)以杀虫有效量被提供给对所述杀虫多肽敏感的植物害虫，从而控制所述害虫；

其中所述害虫是昆虫或线虫；

其中所述昆虫选自由以下任何昆虫目组成的组：鞘翅目(Coleoptera)、双翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthoptera)、缨翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、虱目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)以及毛翅目(Trichoptera)；

其中所述线虫是选自由以下各项组成的组的线虫：标枪属(Acontylus)、粒属(Anguina)、剑咽属(Aorolaimus)、无侧尾腺口属(Aphasmatylenchus)、滑刃属(Aphelenchoides)、真滑刃属(Aphelenchus)、Atalodera、丛垫刃属(Atylenchus)、培克属(Bakernema)、刺属(Belonolaimus)、短锥属(Brachydorus)、伞滑刃属(Bursaphelenchus)、坏死属(Cacopaurus)、卡卢斯属(Caloosia)、秆矛属(Carphodorus)、环属(Criconema)、小环属(Criconemella)、隐皮属(Cryphodera)、茎属(Ditylenchus)、锥属(Dolichodorus)、Eutylenchus、球胞囊属(Globodera)、细小属(Gracilacus)、螺旋属(Helicotylenchus)、半轮属(Hemicriconemoides)、鞘属(Hemicycliophora)、胞囊属(Heterodera)、潜根属(Hirschmanniella)、Histotylenchus、纽带属(Hoplolaimus)、Hoplotylus、长针属(Longidorus)、巨针属(Macrotrophurus)、拟根结属(Meloidodera)、根结属(Meloidogyne)、默林属(Merlinius)、桑咽属Morulaimus)、珍珠属(Nacobbus)、伪粒属(Nothanguina)、伪垫刃属(Nothotylenchus)、拟长针属(Paralongidorus)、拟毛刺属(Paratrichodorus)、拟尾属(Paratrophurus)、拟垫刃属Paratylenchus)、盾移栖属(Peltamigratus)、拟短体属(Pratylenchoides)、短体属(Pratylenchus)、平滑垫刃属(Psilenchus)、拟穿孔属(Radopholoides)、穿孔属(Radopholus)、细杆滑刃属(Rhadinaphelenchus)、盘旋属(Rototylenchus)、拟盘旋属(Rotylenchoides)、盘旋属(Rotylenchus)、长矛胞囊属(Sarisodera)、盾属(Scutellonema)、球属(Sphaeronema)、亚粒属(Subanguina)、拟端垫刃属(Telotylenchoides)、端垫刃属(Telotylenchus)、刺垫刃属(Trichotylenchus)、胖线属(Trophonema)、营养小垫刃属(Trophotylenculus)、大尾属(Trophurus)、矮化属(Tylenchorhynchus)、半穿刺属(Tylenchulus)、垫刃属(Tylenchus)、Tylodorus、剑属(Xiphinema)以及接合垫刃属(Zygotylenchus)线虫；

其中所述杀虫有效量的所述杀虫多肽提供于所述害虫的饮食中；

其中所述杀虫有效量的所述杀虫多肽提供于重组植物、植物部分或所述植物或植物部分的产品中；

其中所述杀虫有效量的所述杀虫多肽以局部制剂的形式提供给植物、植物部分或种子，并且所述制剂包括包含所述多肽的细菌细胞、孢子或伴孢晶体；并且

其中所述细菌细胞、孢子或伴孢晶体是自芽孢杆菌物种获得。

4.一种方法，其：

a)检测生物样品中编码杀虫蛋白质的多核苷酸，所述杀虫蛋白质具有与在以下各项中所示的任一蛋白质展现出约45％至约99.9％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：38、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：50、SEQ IDNO：54、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62以及SEQID NO：64其中所述方法包括以下步骤：

i)选择这样一对引物：当与所述多核苷酸一起用于扩增反应中时，它们形成编码所述杀虫蛋白质的所有或杀虫有效的部分的扩增子；

ii)从所述多核苷酸产生所述扩增子；

iii)检测所述扩增子；以及

iv)从所述扩增子生成DNA序列信息以便确认所述杀虫蛋白质的氨基酸序列同一性；

b)检测生物样品中选自由以下各项组成的组的杀虫蛋白质：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：58以及SEQ IDNO：60，所述方法包括以下步骤：

i)使所述样品与特异性结合所述杀虫蛋白质或源自于其的肽或表位的抗体相接触；以及

ii)检测所述抗体与所述杀虫蛋白质、源自于其的肽或表位的结合；以及

c)从包含编码所述杀虫蛋白质的多核苷酸分子的转基因种子产生作物，所述杀虫蛋白质选自由以下各项组成的组：

i)选自由以下各项组成的组的序列中的任一个：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQID NO：14、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：38、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：46、SEQ IDNO：50、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：58以及SEQ IDNO：60；

ii)具有与在选自由以下各项组成的组的序列中的任一个中所示的氨基酸序列展现出约45％至约99.9％同一性的氨基酸序列的杀虫蛋白质：SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：38、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：46、SEQ IDNO：50、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：58以及SEQ IDNO：60；以及

iii)在a)和b)中所示的任何蛋白质的杀虫片段；

其中所述方法进一步包括以下步骤：

A)种植所述种子；

B)从由所述种子生长出的植物产生作物；以及

C)收获所述作物；并且

其中至少约50％的所述作物种子包含所述多核苷酸。

5.一种对线虫和/或鳞翅目昆虫侵染具有抗性的转基因植物、植物细胞、种子或植物部分，其包含如权利要求1所述的多核苷酸。

6.一种商品产品(或生物样品)，其包含如权利要求5所述的植物、种子或植物部分，并且进一步任选地包含可检测的量的：

a)包含在以下各项中的任一个中所示的蛋白质的氨基酸组成的多肽：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：42、SEQ IDNO：46、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：58以及SEQID NO：60；或

b)编码以下各项的多肽中的任一个的多核苷酸：SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：46、SEQ IDNO：50、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：58以及SEQ ID NO：60；

其中对所述商品(或生物样品)中的a)的所述多肽或b)的所述多核苷酸的检测确定了所述商品(或生物样品)中所述转基因植物、植物细胞、种子或植物部分的存在。

7.一种从包含任选地编码以下各项的多核苷酸分子的种子产生作物的方法：

a)展现出选自由以下各项组成的组的氨基酸序列的杀虫多肽：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：58以及SEQ IDNO：60；

b)具有与选自由以下各项组成的组的氨基酸序列展现出至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的杀虫多肽：SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：46、SEQ IDNO：50、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：58以及SEQ ID NO：60；或

c)(a)或(b)的所述多肽的杀虫片段；

其中所述方法包括以下步骤：种植所述种子；从由所述种子生长出的植物产生作物；以及收获所述作物；并且

其中至少约50％的所述作物包含含有所述多核苷酸分子的种子。

8.一种组合物，其在农业上可接受的载剂中包含如权利要求2所述的杀虫多肽，并且进一步包含重组苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)细胞提取物、细胞悬浮液、细胞匀浆、细胞溶胞物、细胞上清液、细胞滤液或细胞集结粒；其中所述组合物包含害虫抑制量的所述多肽并且被配制为粉末、粉剂、球粒、颗粒、喷雾、乳液、胶体或溶液；

其中所述组合物是通过对包含所述多肽的重组苏云金芽孢杆菌细胞的培养物进行干燥、冷冻干燥、均质化、提取、过滤、离心、沉降或浓缩来制备的，并且所述组合物包含约1重量％至约99重量％的所述多肽。

9.如权利要求6所述的商品产品(或生物样品)，其中可检测到所述多肽的水平为至少约(i)每一百份这种商品产品(或生物样品)含一份或(ii)每克鲜重的这种商品产品(或生物样品)含一纳克。