CN107074974B - 对鳞翅目害虫具有毒性或抑制性的嵌合杀昆虫蛋白质 - Google Patents

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Abstract

公开了编码新型嵌合杀昆虫蛋白质的核苷酸序列，所述嵌合杀昆虫蛋白质表现出鳞翅目抑制活性。具体实施方案提供了含有编码一种或多种所述嵌合杀昆虫蛋白质的重组核酸分子的组合物以及经过转化的植物、植物部分和种子。

Description

对鳞翅目害虫具有毒性或抑制性的嵌合杀昆虫蛋白质
对相关申请的引用
本申请要求2014年10月16日提交的美国临时申请No.62/064,989的权益，该申请以全文引用的方式并入本文中。
序列表的并入
序列表的计算机可读形式与本申请一起通过电子提交方式提交并且以全文引用的方式并入本申请。序列表包含在2015年10月13日创建的文件中，具有文件名P34230WO00_SEQ_PCT.txt，并且大小是371,735字节(如在
Figure GDA0003298377660000011
操作系统中所测量)。
发明领域
本发明总体上涉及昆虫抑制性蛋白质领域。在本申请中公开了对农作物和种子的农业相关害虫表现出昆虫抑制性活性的一类新型的嵌合杀昆虫蛋白质。具体来说，所公开的类别的蛋白质对鳞翅目昆虫害虫表现出了杀昆虫活性。提供了含有编码所公开的毒素蛋白质中的一种或多种的重组核酸分子的植物、植物部分和种子。
发明背景
提高重要农业植物，尤其包括玉米、大豆、甘蔗、水稻、小麦、蔬菜和棉花的作物产量已经变得越来越重要。除了日益增长的人口对用于提供食物、衣物和能量的农产品的需要日益增长以外，预计气候相关的影响和来自于日益增长的人口将土地用于除农业耕作以外的用途的压力也会减少可耕种耕地的量。这些因素已经导致了关于粮食保障的严峻预测，特别是在植物生物技术和农业技术不存在重大改进的情况下。鉴于这些压力，技术、农业技术和害虫治理的环境可持续改进是在有限量的可耕种耕地上使作物增产的重要工具。
昆虫，特别是鳞翅目内的昆虫，被认为是破坏农田作物，从而降低受侵扰区域中的作物产量的主要原因。会对农业造成负面影响的鳞翅目害虫物种包括但不限于草地粘虫(草地贪夜蛾)、甜菜粘虫(甜菜夜蛾)、披肩粘虫(蓓带夜蛾)、黑切根虫(球菜夜蛾)、甘蓝尺蠖(粉纹夜蛾)、大豆尺蠖(大豆夜蛾)、黎豆毛虫(黎豆夜蛾)、绿叶虫(苜蓿绿夜蛾)、烟草芽虫(烟芽夜蛾)、颗粒切根虫(黄地老虎)、粘虫(一星粘虫)、西方切根虫(灰地老虎)、欧洲玉米钻心虫(欧洲玉米螟)、脐橙虫(脐橙螟)、玉米根结网虫(玉米根网螟)、草地结网虫(水稻切叶野螟)、向日葵蛾(向日葵螟)、小玉米茎钻心虫(南美玉米苗斑螟)、苹果蛾(苹果蠹蛾)、葡萄果蛾(葡萄小食心虫)、东方果蛾(梨小食心虫)、向日葵芽小卷蛾(向日葵芽卷叶蛾)、钻背蛾(小菜蛾)、粉红棉铃虫(棉红铃虫)、粉红钻茎虫(大螟)、吉普赛蛾(舞毒蛾)、棉叶虫(棉叶波纹夜蛾)、果树卷叶虫(果树黄卷蛾)、欧洲卷叶虫(玫瑰黄卷蛾)、亚洲水稻钻心虫或水稻钻茎虫(二化螟)、水稻卷叶虫(稻纵卷叶螟)、玉米根结网虫(玉米根网螟)、蓝草结网虫(早熟禾草螟)、西南玉米钻心虫(西南玉米螟)、蔗螟(小蔗螟)、多刺棉铃虫(埃及金刚钻)、斑点棉铃虫(翠纹金刚钻)、古棉铃虫(棉铃实夜蛾)、玉米穗虫、大豆荚虫或棉铃虫(玉米穗夜蛾)、草地结网虫(水稻切叶野螟)、欧洲葡萄蛾(欧洲葡萄缀穗蛾)、柑桔潜叶虫(柑桔潜叶蛾)、大白蝴蝶(大菜粉蛾)、菜青虫或小白蝴蝶(小菜粉蛾)、烟草切根虫或茶蚕(斜纹夜蛾)和番茄潜叶虫(番茄潜叶蛾)。
在历史上，农业依赖于密集施用作为害虫防治剂的合成化学杀昆虫剂。除了出现抗性问题以外，对环境和人类健康的忧虑也刺激了生物杀虫剂的研究和开发。这种研究工作导致逐渐发现和使用多种昆虫病原微生物物种，包括细菌。
当发现了昆虫病原细菌，尤其是属于芽孢杆菌属的细菌，并且将其开发为生物害虫防治剂时，生物防治模式发生了变化。细菌苏云金芽孢杆菌(Bt)的菌株已经被用作杀昆虫蛋白质的来源，因为人们发现Bt菌株会对特定的昆虫显示出高毒性。已知Bt菌株会在孢子形成开始时和在稳定生长期期间产生位于伴孢结晶包涵体内的δ内毒素(例如Cry蛋白)，而且还已知其能产生分泌型杀昆虫蛋白质。在被易感昆虫摄取后，δ内毒素以及分泌型毒素在中肠皮膜细胞表面发挥其作用，从而破坏细胞膜，导致细胞破环和死亡。除Bt以外的细菌物种中也鉴别出了编码杀昆虫蛋白质的基因，所述细菌物种包括其他芽孢杆菌和多种其他细菌物种，诸如侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)、球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)(“Ls”先前被称为球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus))和日本甲虫芽孢杆菌(Paenibacillus popilliae)。
结晶型和分泌型可溶性杀昆虫蛋白质毒素对其宿主具有高度特异性，并且已经得以在世界范围内被接受作为化学杀昆虫剂的替代物。举例来说，杀昆虫毒素蛋白质已经被用于多种农业应用中，以防止重要农业植物遭到昆虫侵扰，减少对化学杀虫剂施用的需要和增加产量。通过机械方法诸如将含有多种细菌菌株的微生物制剂分散至植物表面上的喷雾和通过使用旨在产生表达杀昆虫毒素蛋白质的转基因植物和种子的基因转化技术将杀昆虫毒素蛋白质用来防治作物植物的农业相关害虫。
表达杀昆虫蛋白质的转基因植物的使用已经在全世界得到了采用。举例来说，在2012年，有2610万公顷种植了表达Bt毒素的转基因作物(James,C.,Global Status ofCommercialized Biotech/GM Crops:2012.ISAAA Brief第44期)。转基因昆虫防护作物的全球使用和被用于这些作物中的杀昆虫蛋白质的有限数目已经对能赋予针对目前所利用的杀昆虫蛋白质的抗性的现有昆虫等位基因产生了选择压力。
目标害虫中发展对杀昆虫蛋白质的抗性引起持续需要发现和开发可用于控制昆虫对表达杀昆虫蛋白质的转基因作物的抗性增加的杀昆虫蛋白质新形式。具有提高的效力并且对更宽范围的易感昆虫物种表现出控制的新杀昆虫蛋白质将减少可能发展抗性等位基因的存活昆虫的数目。另外，在一种植物中使用两种或更多种对同一昆虫害虫有毒并且呈现出不同的作用模式的转基因杀昆虫蛋白质能降低任何单一目标昆虫物种中出现抗性的概率。
因此，极度需要鉴别出具有改善的杀昆虫性质，诸如与农业耕作中目前使用的毒素相比对更宽范围的目标昆虫害虫物种和不同的作用模式的功效有所增加的其他杀昆虫蛋白质。为了满足这个需要，本发明公开了对主要目标鳞翅目害虫物种表现出活性的新型Cry1嵌合杀昆虫蛋白质。
本领域中已知Cry1晶体蛋白质家族成员会对鳞翅目害虫表现出生物活性。Cry1晶体蛋白质的前体形式由两个近似相等尺寸的片段组成。所述前体蛋白质的羧基末端部分，称为原毒素片段，能使晶体形成稳定并且不表现杀昆虫活性。所述前体蛋白质的胺基末端部分包含Cry1蛋白的毒素片段，并且基于Cry1家族成员内的保守或基本保守序列的比对，可以进一步再分成三个结构域，即结构域I、结构域II和结构域III。结构域I包含活性毒素片段的约前三分之一，而且已经被证明对通道形成是不可或缺的。结构域II和结构域III都牵涉受体结合和昆虫物种特异性，这取决于所研究的昆虫和杀昆虫蛋白质。
由对本领域中已知的众多天然杀昆虫蛋白质的结构域结构进行拣选来任意地产生具有增强的嵌合蛋白质的可能性微乎其微。这是蛋白质结构、寡聚和释放杀昆虫蛋白质片段所需的激活(包括对嵌合前体进行正确蛋白水解处理，如果以此种形式表达的话)的复杂特性的结果。只有通过小心地选择各亲本蛋白质内的原毒素和具体靶标来产生嵌合结构才可能构建出与得到嵌合体的亲本蛋白质相比表现出有所改善的杀昆虫活性的功能嵌合杀昆虫毒素。本领域中已知，重新组装原毒素与任何两种或更多种彼此不同的毒素的毒素结构域I、结构域II和结构域III往往会构建出表现出错误晶体形成或完全缺乏针对优选目标昆虫害虫物种的任何可检测杀昆虫活性的蛋白质。只有通过试错法才能设计出有效的杀昆虫嵌合体，而且即使那样，熟练的技术人员最后也不一定能得到与可能得到嵌合体组成原毒素或毒素结构域的任何单个亲本毒素蛋白质相比表现出等效或改善的杀昆虫活性的嵌合体。举例来说，文献报告了由两种或更多种晶体蛋白质前体构建或组装嵌合蛋白质的众多实例。参见例如Jacqueline S.Knight等人,“AStrategy for Shuffling NumerousBacillus thuringiensis Crystal Protein Domains.”J.Economic Entomology,97(6)(2004):1805-1813；Bosch等人(美国专利No.6,204,246)；Malvar和Gilmer(美国专利No.6,017,534)。在这些实例中的每一个中，所得嵌合体中有许多与得到嵌合体组分的前体蛋白质相比不能表现出等效或有所改善的杀昆虫或晶体形成性质。
发明概述
提供了编码对鳞翅类物种的植物害虫具有毒性的嵌合杀昆虫蛋白质的重组核酸分子。每一种嵌合杀昆虫蛋白质都可以单独使用或与彼此以及与其他杀昆虫蛋白质和昆虫抑制剂组合于制剂和活体中；从而提供农业系统中目前使用的杀昆虫蛋白质和杀昆虫化学物质的替代物。
在某些实施方案中，本文中公开了一种嵌合杀昆虫蛋白质，其包含如SEQ ID NO:21、10、28、7、4、13、16、19、23、25、30、33、36、39、41、43、45、47、50或53中的任意者中所示出的氨基酸序列。这种嵌合杀昆虫蛋白质对鳞翅目昆虫物种表现出抑制活性，所述鳞翅目昆虫物种诸如但不限于黎豆夜蛾、小蔗螟、南美玉米苗斑螟、玉米穗夜蛾、烟芽夜蛾、大豆夜蛾、考斯夜蛾、亚热带粘虫、草地贪夜蛾、甜菜夜蛾、棉铃实夜蛾、斜纹夜蛾、棉红铃虫、西南玉米螟、翠纹金刚钻、南美棉铃虫和薄荷灰夜蛾。
在另一个实施方案中，公开了一种编码嵌合杀昆虫蛋白质的多核苷酸，其中所述多核苷酸可操作地连接至异源启动子，并且所述嵌合杀昆虫蛋白质包含如SEQ ID NO:21、10、28、7、4、13、16、19、23、25、30、33、36、39、41、43、45、47、50或53中的任意者中所示出的氨基酸序列。还设想了一种编码嵌合杀昆虫蛋白质的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含的核苷酸序列任选地：在严格条件下与如SEQ ID NO:1、2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、22、24、26、27、29、31、32、34、35、37、38、40、42、44、46、48、49、51或52中的任意者中所示出的多核苷酸序列的反向互补序列杂交；或编码包含如SEQ ID NO:21、10、28、7、4、13、16、19、23、25、30、33、36、39、41、43、45、47、50或53中的任意者中所示出的氨基酸序列的嵌合杀昆虫蛋白质。
在其他实施方案中，本文中公开了一种宿主细胞，其包含SEQ ID NO:1、2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、22、24、26、27、29、31、32、34、35、37、38、40、42、44、46、48、49、51或52中的任意者中所示出的多核苷酸，其中所述宿主细胞是选自由细菌宿主细胞或植物宿主细胞组成的群组。所设想的细菌宿主包括土壤杆菌、根瘤菌、芽孢杆菌、短芽孢杆菌、埃希氏杆菌、假单胞菌、克雷伯氏杆菌和欧文氏菌；并且其中所述芽孢杆菌属是蜡样芽胞杆菌或苏云金芽孢杆菌，所述短芽孢杆菌是侧孢短芽孢杆菌，且所述埃希氏杆菌是大肠埃希氏杆菌。所设想的植物细胞包括单子叶植物和双子叶植物。
本文中所公开的其他实施方案包括昆虫抑制性组合物，其包含有包含如SEQ IDNO:21、10、28、7、4、13、16、19、23、25、30、33、36、39、41、43、45、47、50或53中的任意者中所示出的氨基酸序列的嵌合杀昆虫蛋白质。在某些实施方案中，所述昆虫抑制性组合物还包含与所述嵌合杀昆虫蛋白质不同的至少一种昆虫抑制剂。所设想的与所述嵌合杀昆虫蛋白质不同的昆虫抑制剂包括昆虫抑制性蛋白质、昆虫抑制性dsRNA分子和昆虫抑制性化学物质。这些与所述嵌合杀昆虫蛋白质不同的昆虫抑制剂可以对鳞翅目、鞘翅目、半翅目、同翅目或缨翅目的一种或多种害虫物种表现出活性。
在又另一个实施方案中，本文中公开了一种种子，其包含昆虫抑制有效量的以下各物：包含如SEQ ID NO:21、10、28、7、4、13、16、19、23、25、30、33、36、39、41、43、45、47、50或53中的任意者中所示出的氨基酸序列的嵌合杀昆虫蛋白质；或SEQ ID NO:1、2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、22、24、26、27、29、31、32、34、35、37、38、40、42、44、46、48、49、51或52中的任意者中所示出的多核苷酸。
还设想了一种防治鳞翅目害虫的方法，所述方法包括使所述鳞翅目害虫与抑制量的本发明嵌合杀昆虫蛋白质接触。
在另一个实施方案中，本文中公开了一种转基因植物细胞、植物或植物部分，其包含嵌合杀昆虫蛋白质，其中：所述嵌合杀昆虫蛋白质包含SEQ ID NO:21、10、28、7、4、13、16、19、23、25、30、33、36、39、41、43、45、47、50或53中的任意者中所示出的任意氨基酸序列；或所述嵌合杀昆虫蛋白质包含如下蛋白质：与SEQ ID NO:21、10具有至少94％同一性；与SEQID NO:28具有至少93％同一性；与SEQ ID NO:7具有至少87％同一性；与SEQ ID NO:4具有至少90％同一性；与SEQ ID NO:13具有至少91％同一性；与SEQ ID NO:16具有至少64％同一性；与SEQ ID NO:19具有至少66％同一性；与SEQ ID NO:23具有至少86％同一性；与SEQID NO:25具有至少91％同一性；与SEQ ID NO:30具有至少94％同一性；与SEQ ID NO:33具有至少91％同一性；与SEQ ID NO:36具有至少64％同一性；与SEQ ID NO:39具有至少66％同一性；与SEQ ID NO:41具有至少94％同一性；与SEQ ID NO:43具有至少84％同一性；与SEQ ID NO:45具有至少93％同一性；与SEQ ID NO:47具有至少94％同一性；与SEQ ID NO:50具有至少91％同一性；或与SEQ ID NO:53具有至少93％同一性。还设想了防治鳞翅目害虫的方法，其包括使所述害虫暴露于这种转基因植物细胞、植物或植物部分，其中所述植物细胞、植物或植物部分表达鳞翅目抑制量的所述嵌合杀昆虫蛋白质。
在本文中的其他实施方案中，提供了来源于所述植物细胞、植物或植物部分的商品产品，其中所述产品包含可检测量的所述嵌合杀昆虫蛋白质。所设想的商品产品包括植物生物质、油、膳食、动物饲料、面粉、薄片、糠、棉绒、外壳和经过处理的种子。
本文中所公开的又另一种方法是一种生产包含嵌合杀昆虫蛋白质的种子的方法，所述方法包括：种植至少一个包含嵌合杀昆虫蛋白质的种子；从所述种子长出植物；和从所述植物收获种子，其中所述收获的种子包含所述嵌合杀昆虫蛋白质。
本文中还设想了编码嵌合杀昆虫蛋白质的重组多核苷酸分子，其包含选自由以下各项组成的群组的核苷酸序列：1、2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、22、24、26、27、29、31、32、34、35、37、38、40、42、44、46、48、49、51或52；和任选地，编码与所述嵌合杀昆虫蛋白质不同的昆虫抑制剂的多核苷酸序列。
本文中所设想的另一种重组核酸分子包含可操作地连接至编码嵌合杀昆虫蛋白质的多核苷酸片段的异源启动子，其中：所述嵌合杀昆虫蛋白质包含SEQ ID NO:21、10、28、7、4、13、16、19、23、25、30、33、36、39、41、43、45、47、50或53中的任意者中所示出的任意氨基酸序列；或所述嵌合杀昆虫蛋白质包含如下蛋白质：与SEQ ID NO:21、10具有至少94％同一性；与SEQ ID NO:28具有至少93％同一性；与SEQ ID NO:7具有至少87％同一性；与SEQ IDNO:4具有至少90％同一性；与SEQ ID NO:13具有至少91％同一性；与SEQ ID NO:16具有至少64％同一性；与SEQ ID NO:19具有至少66％同一性；与SEQ ID NO:23具有至少86％同一性；与SEQ ID NO:25具有至少91％同一性；与SEQ ID NO:30具有至少94％同一性；与SEQ IDNO:33具有至少91％同一性；与SEQ ID NO:36具有至少64％同一性；与SEQ ID NO:39具有至少66％同一性；与SEQ ID NO:41具有至少94％同一性；与SEQ ID NO:43具有至少84％同一性；与SEQ ID NO:45具有至少93％同一性；与SEQ ID NO:47具有至少94％同一性；与SEQ IDNO:50具有至少91％同一性；或与SEQ ID NO:53具有至少93％同一性；或者所述多核苷酸片段与具有如SEQ ID NO:1、2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、22、24、26、27、29、31、32、34、35、37、38、40、42、44、46、48、49、51或52中的任意者中所示出的核苷酸序列的多核苷酸杂交。
本发明的其他实施方案、特征和优点将从以下详细描述、实施例和权利要求书中显而易见。
序列简述
SEQ ID SEQ ID NO:1是用于在细菌细胞中表达的编码TIC1100的重组DNA序列。
SEQ ID NO:2是用于在植物细胞中表达的编码TIC1100的合成DNA序列。
SEQ ID NO:3是用于在植物细胞中表达的编码TIC1100的合成DNA序列。
SEQ ID NO:4是TIC1100的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5是用于在细菌细胞中表达的编码TIC860的重组DNA序列。
SEQ ID NO:6是用于在植物细胞中表达的编码TIC860的合成DNA序列。
SEQ ID NO:7是TIC860的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8是用于在细菌细胞中表达的编码TIC867的重组DNA序列。
SEQ ID NO:9是用于在植物细胞中表达的编码TIC867的合成DNA序列。
SEQ ID NO:10是TIC867的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11是用于在细菌细胞中表达的编码TIC867_20的重组DNA序列。
SEQ ID NO:12是用于在植物细胞中表达的编码TIC867_20的合成DNA序列。
SEQ ID NO:13是TIC867_20的氨基酸序列。
SEQ ID NO:14是用于在细菌细胞中表达的编码TIC867_21的重组DNA序列。
SEQ ID NO:15是用于在植物细胞中表达的编码TIC867_21的合成DNA序列。
SEQ ID NO:16是TIC867_21的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17是用于在细菌细胞中表达的编码TIC867_22的重组DNA序列。
SEQ ID NO:18是用于在植物细胞中表达的编码TIC867_22的合成DNA序列。
SEQ ID NO:19是TIC867_22的氨基酸序列。
SEQ ID NO:20是用于在植物细胞中表达的编码TIC867_23的合成DNA序列。
SEQ ID NO:21是TIC867_23的氨基酸序列。
SEQ ID NO:22是用于在植物细胞中表达的编码TIC867_24的合成DNA序列。
SEQ ID NO:23是TIC867_24的氨基酸序列。
SEQ ID NO:24是用于在植物细胞中表达的编码TIC867_24的合成DNA序列。
SEQ ID NO:25是TIC867_25的氨基酸序列。
SEQ ID NO:26是用于在细菌细胞中表达的编码TIC868的重组DNA序列。
SEQ ID NO:27是用于在植物细胞中表达的编码TIC868的合成DNA序列。
SEQ ID NO:28是TIC868的氨基酸序列。
SEQ ID NO:29是用于在植物细胞中表达的编码TIC868_9的合成DNA序列。
SEQ ID NO:30是TIC868_9的氨基酸序列。
SEQ ID NO:31是用于在细菌细胞中表达的编码TIC868_10的重组DNA序列。
SEQ ID NO:32是用于在植物细胞中表达的编码TIC868变体TIC868_10的合成DNA序列。
SEQ ID NO:33是TIC868_10的氨基酸序列。
SEQ ID NO:34是用于在细菌细胞中表达的编码TIC868_11的重组DNA序列。
SEQ ID NO:35是用于在植物细胞中表达的编码TIC868_11的合成DNA序列。
SEQ ID NO:36是TIC868_11的氨基酸序列。
SEQ ID NO:37是用于在细菌细胞中表达的编码TIC868_12的重组DNA序列。
SEQ ID NO:38是用于在植物细胞中表达的编码TIC868_12的合成DNA序列。
SEQ ID NO:39是TIC868_12的氨基酸序列。
SEQ ID NO:40是用于在植物细胞中表达的编码TIC868_13的合成DNA序列。
SEQ ID NO:41是TIC868_13的氨基酸序列。
SEQ ID NO:42是用于在植物细胞中表达的编码TIC868_14的合成DNA序列。
SEQ ID NO:43是TIC868_14的氨基酸序列。
SEQ ID NO:44是用于在植物细胞中表达的编码TIC868_15的合成DNA序列。
SEQ ID NO:45是TIC868_15的氨基酸序列。
SEQ ID NO:46是用于在植物细胞中表达的编码TIC868_29的合成DNA序列。
SEQ ID NO:47是TIC868_29的氨基酸序列。
SEQ ID NO:48是用于在细菌细胞中表达的编码TIC869的重组DNA序列。
SEQ ID NO:49是用于在植物细胞中表达的编码TIC869的合成DNA序列。
SEQ ID NO:50是TIC869的氨基酸序列。
SEQ ID NO:51是用于在细菌细胞中表达的编码TIC836的重组DNA序列。
SEQ ID NO:52是用于在植物细胞中表达的编码TIC836的合成DNA序列。
SEQ ID NO:53是TIC836的氨基酸序列。
发明详述
农业害虫防治领域中的问题的特征是需要对目标害虫有效果、对目标害虫物种表现出广谱毒性、能够在植物中表达而不会引起不希望的农艺学问题并且与市面上用于植物的当前毒素相比可提供替代作用模式的新杀昆虫蛋白质。本文中公开了新型嵌合杀昆虫蛋白质，并且解决了这些需要中的每一个，特别是对抗较宽范围的鳞翅目昆虫害虫。
为了避免发展或规避昆虫对目前使用的杀昆虫蛋白质的抗性，需要具有不同的作用模式(MOA)以及广谱性和功效的新杀昆虫蛋白质用于鳞翅目防治。解决这种需要的一种方式是从不同的生物学来源，优选地从细菌、真菌或植物中发现新的杀昆虫蛋白质。另一种方法是在表现出结构相似性的各种Bt蛋白质之间互换片段以产生具有昆虫抑制性质的新嵌合Bt蛋白质。本领域中已知由对本领域中已知的众多天然杀昆虫晶体蛋白质的结构域结构进行再拣选来产生具有增强的嵌合蛋白质的可能性微乎其微。参见例如JacquelineS.Knight等人,“A Strategy for Shuffling Numerous Bacillus thuringiensisCrystal Protein Domains.”J.Economic Entomology,97(6)(2004):1805-1813。
本文中公开了编码新型嵌合杀昆虫蛋白质的重组核酸分子序列。这些杀昆虫蛋白质解决了本领域中持续需要工程改造其他毒性杀昆虫蛋白质以具有改善的杀昆虫性质(诸如对较宽范围的目标昆虫害虫物种的功效有所增加)和不同的作用模式。这组蛋白质的成员，包括本文中所公开的示例性蛋白质，对鳞翅目昆虫害虫物种表现出杀昆虫活性。
术语“片段(segment/fragment)”在本申请中用于描述比描述所公开的嵌合杀虫蛋白的完整氨基酸或核酸序列短的连续氨基酸或核酸序列。本申请中还公开了表现出昆虫抑制活性的片段，如果将所述片段与所述嵌合杀虫蛋白的相应部分比对，那么将得到在所述片段与所述嵌合杀虫蛋白的相应部分之间存在从约65％至约100％的任何分数百分比的氨基酸序列同一性。
在本申请中提及术语“活性的”或“活性”、“杀虫活性”或“杀虫的”，或者“杀昆虫活性”、“昆虫抑制性”或“杀昆虫的”是指毒性剂，诸如杀昆虫蛋白质，在抑制(抑制生长、摄食、繁殖力或存活力)、遏制(遏制生长、摄食、繁殖力或存活力)、控制(控制害虫侵扰、控制含有有效量的杀昆虫蛋白质的特定作物上的害虫摄食活动)或杀死(引起发病、死亡或降低繁殖力)害虫方面的功效。这些术语意图包括对害虫提供杀虫有效量的杀昆虫蛋白质的结果，其中使所述害虫暴露于所述杀昆虫蛋白质将导致发病、死亡、繁殖力降低或发育迟缓。这些术语还包括由于在植物中或在植物上提供杀虫有效量的杀昆虫蛋白质而将害虫从植物、植物组织、植物部分、种子、植物细胞或从植物可能生长的特定地理位置中驱离。一般来说，杀虫活性是指杀昆虫蛋白质在抑制特定目标害虫(包括但不限于鳞翅目昆虫)的生长、发育、存活力、摄食行为、交配行为、繁殖力方面有效或对由以这种蛋白质、蛋白质片段、蛋白质片段或多核苷酸为食的昆虫引起的不利作用产生任何可测量的减少的能力。所述杀昆虫蛋白质可以由植物产生，或可以被施用至所述植物或施用至所述植物所处位置内的环境。术语“生物活性”、“有效的”、“有效果的”或其变化形式也是本申请中可互换用于描述本发明的嵌合杀昆虫蛋白质对目标昆虫害虫的作用的术语。
当提供于目标害虫的食物中时，杀虫有效量的毒性剂在所述毒性剂接触所述害虫时表现出杀虫活性。毒性剂可以是杀昆虫蛋白质或本领域中已知的一种或多种化学试剂。杀昆虫化学试剂和杀昆虫蛋白质试剂可以单独使用或与彼此组合使用。化学试剂包括但不限于靶向目标害虫中的特定基因以便遏制的dsRNA分子、有机氯化物、有机磷酸酯、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、新烟碱和莱恩碱。杀昆虫蛋白质试剂包括本申请中示出的嵌合杀昆虫蛋白质，以及其他蛋白质毒性剂，包括靶向鳞翅目害虫物种的那些，以及用于防治其他植物害虫的蛋白质毒素，诸如本领域中可用于防治鞘翅目、缨翅目、半翅目和同翅目物种的Cry蛋白质。
意图提及害虫、特别是作物植物的害虫意指作物植物的昆虫害虫，特别是通过所公开的嵌合杀昆虫蛋白质加以防治的那些鳞翅目昆虫害虫。然而，当靶向这些害虫的毒性剂与所述嵌合杀昆虫蛋白质或同所述嵌合杀昆虫蛋白质具有65％至约100％同一性的蛋白质共处或共存时，提及害虫还可以包括植物的鞘翅目、半翅目和同翅目昆虫害虫以及线虫和真菌。
本文中所公开的嵌合杀昆虫蛋白质对鳞翅目昆虫物种的昆虫害虫(包括成虫、蛹、幼虫和初孵幼虫)以及半翅目昆虫物种(包括成虫和若虫)表现出杀昆虫活性。鳞翅目昆虫包括但不限于夜蛾科的粘虫、切根虫、尺蠖和夜蛾，例如草地粘虫(草地贪夜蛾)、甜菜粘虫(甜菜夜蛾)、披肩粘虫(蓓带夜蛾)、黑切根虫(球菜夜蛾)、甘蓝尺蠖(粉纹夜蛾)、大豆尺蠖(大豆夜蛾)、黎豆毛虫(黎豆夜蛾)、绿啃叶虫(苜蓿绿夜蛾)、烟草芽虫(烟芽夜蛾)、颗粒切根虫(黄地老虎)、粘虫(一星粘虫)、西方切根虫(灰地老虎)；螟蛾科的钻心虫、鞘蛾、结网虫、球果虫、甘蓝虫和雕叶虫，例如，欧洲玉米钻心虫(欧洲玉米螟)、脐橙虫(脐橙螟)、玉米根结网虫(玉米根网螟)、草地结网虫(水稻切叶野螟)、向日葵蛾(向日葵螟)、小玉米茎钻心虫(南美玉米苗斑螟)；卷蛾科的卷叶虫、芽虫、种虫和果虫，例如，苹果蛾(苹果蠹蛾)、葡萄果实蛾(葡萄小食心虫)、东方果蛾(梨小食心虫)、向日葵芽小卷蛾(向日葵芽卷叶蛾)；和许多其他经济上重要的鳞翅目昆虫，例如钻背蛾(小菜蛾)、粉红棉铃虫(棉红铃虫)和吉普赛蛾(舞毒蛾)。其他鳞翅目昆虫害虫包括例如棉叶波纹夜蛾(棉叶虫)、果树黄卷蛾(果树卷叶虫)、玫瑰黄卷蛾(欧洲卷叶虫)和其他黄卷蛾属、二化螟(亚洲水稻钻心虫或水稻钻茎虫)、稻纵卷叶螟(水稻卷叶虫)、玉米根网螟(玉米根结网虫)、早熟禾草暝(蓝草结网虫)、西南玉米螟(西南玉米钻心虫)、小蔗螟(蔗螟)、埃及金刚钻(多刺棉铃虫)、翠纹金刚钻(斑点棉铃虫)、棉铃实夜蛾(美洲棉铃虫)、玉米穗夜蛾(玉米穗虫或棉铃虫)、烟芽夜蛾(烟草芽虫)、水稻切叶野螟(草地结网虫)、欧洲葡萄缀穗蛾(欧洲葡萄蛾)、柑桔潜叶蛾(柑桔潜叶虫)、大菜粉蛾(大白蝴蝶)、小菜粉蛾(菜青虫或小白蝴蝶)、小菜蛾(钻背蛾)、甜菜夜蛾(甜菜粘虫)、斜纹夜蛾(烟草切根虫、茶蚕)和番茄潜叶蛾(番茄潜叶虫)。
本申请中提及“分离的DNA分子”或者等效术语或短语意图意指所述DNA分子是单独或与其他组合物组合存在但不在其天然环境内的DNA分子。举例来说，只要生物体基因组DNA内天然存在的核酸元件，诸如编码序列、内含子序列、非翻译前导序列、启动子序列、转录终止序列等在所述生物体基因组内且在天然存在其的基因组内位置上，所述元件就不被认为是“分离的”。然而，只要这些元件中的每一个和这些元件的子部分不是在所述生物体基因组内且在天然存在其的基因组内位置上，所述元件在本公开的范围内就将是“分离的”。类似地，只要编码杀昆虫蛋白质或所述蛋白质的任何天然存在的杀昆虫变体的核苷酸序列不在从中天然存在编码所述蛋白质的序列的细菌DNA内，所述核苷酸序列就将是分离的核苷酸序列。出于本公开的目的，编码天然存在的杀昆虫蛋白质的氨基酸序列的合成核苷酸序列将被认为是分离的。出于本公开的目的，任何转基因核苷酸序列，即插入植物或细菌细胞基因组中或存在于染色体外载体中的DNA的核苷酸序列将被认为是分离的核苷酸序列，无论其存在于质粒内或用于转化所述细胞的类似结构内、所述植物或细菌的基因组内，还是以可检测的量存在于来源于所述植物或细菌的组织、子代、生物样品或商品产品中。
如实施例中进一步描述，通过嵌合工作，由已知杀昆虫毒素(在本文中被称为“亲本蛋白质”的原毒素和毒素结构域构建了约八百四十四(844)个编码嵌合杀昆虫蛋白质的核苷酸序列，并且加以表达且在生物测定中测试鳞翅目活性。与从中得到其毒素组分的亲本蛋白质相比，所构建的嵌合杀昆虫蛋白质中少数表现出提高的鳞翅目活性或增大的鳞翅目谱。
这些具有提高的鳞翅目活性或增大的鳞翅目谱的新型嵌合杀昆虫蛋白质是由以下杀昆虫亲本蛋白质原毒素和毒素结构域构建：Cry1Ah(结构域I)、Cry1Bb1(结构域I和II)、Cry1Be2(结构域I和II)、Cry1Ja1(结构域I和II)、Cry1Fa1(结构域I和II)、Cry1Ac(结构域II和原毒素)、Cry1Ca(结构域III和原毒素)、Cry1Ka(结构域III和原毒素)、Cry1Jx(结构域III)、Cry1Ab(结构域III)、Cry1Ab3(原毒素)、Cry1Da1(原毒素)、Cry4(原毒素)、Cry9(原毒素)、Cry1Be(原毒素)和Cry1Ka(原毒素)。
具体来说，本发明的具有提高的鳞翅目活性或增大的鳞翅目谱的新型嵌合杀昆虫蛋白质包含以下原毒素与结构域组合：TIC1100/SEQ ID NO:4(结构域I-Cry1Ah、结构域II-Cry1Ac、结构域III-Cry1Ca、原毒素-Cry1Ac)、TIC860/SEQ ID NO:7(结构域I-Cry1Bb1、结构域II-Cry1BB1、结构域III-Cry1Ca、原毒素-Cry1Ac)、TIC867/SEQ ID NO:10(结构域I-Cry1Be2、结构域II-Cry1Be2、结构域III-Cry1Ka、原毒素-Cry1Ab3)、TIC868/SEQ ID NO:28(结构域I-Cry1Be2、结构域II-Cry1Be2和结构域III-Cry1Ca、原毒素-Cry1Ab3)、TIC869/SEQ ID NO:50(结构域I-Cry1Ja1、结构域II-Cry1Ja1、结构域III-Cry1Jx、原毒素-Cry1Ab3)和TIC836/SEQ ID NO:53(结构域I-Cry1Fa1、结构域II-Cry1Fa1、结构域III-Cry1Ab、原毒素-Cry1Ac)。
对于嵌合杀昆虫蛋白质TIC867和TIC868，还构建了引入氨基酸取代或替代原毒素结构域的变体。具体来说，TIC867和TIC868的这些变体包含以下氨基酸取代或替代原毒素结构域：TIC867_20/SEQ ID NO:13(替代原毒素结构域Cry1Da1)、TIC867_21/SEQ ID NO:16(替代原毒素结构域Cry4)、TIC867_22/SEQ ID NO:19(替代原毒素结构域Cry9)、TIC867_23/SEQ ID NO:21(替代原毒素结构域Cry1Be)、TIC867_24/SEQ ID NO:23(替代原毒素结构域Cry1Ka)、TIC867_25/SEQ ID NO:25(替代原毒素结构域Cry1Ka)、TIC868_9/SEQ ID NO:30(氨基酸修饰N240S_Y343Q_N349T)、TIC868_10/SEQ ID NO:33(替代原毒素结构域Cry1Da1)、TIC868_11/SEQ ID NO:36(替代原毒素结构域Cry4)、TIC868_12/SEQ ID NO:39(替代原毒素结构域Cry 9),TIC868_13/SEQ ID NO:41(替代原毒素结构域Cry1Be)、TIC868_14/SEQ ID NO:43(替代原毒素结构域Cry1Ka)、TIC868_15/SEQ ID NO:45(替代原毒素结构域Cry1Ca)和TIC868_29/SEQ ID NO:47(氨基酸修饰Q136Y_Y343Q_N349T)。
如实施例中所显示，这些TIC867和TIC868变体中的每一种都能改变亲本嵌合杀昆虫蛋白质的鳞翅目活性和/或减小鳞翅目活性谱，因此表明替代原毒素结构域和氨基酸取代对嵌合杀昆虫蛋白质TIC867和TIC868的杀昆虫活性和谱具有直接后果。
所述嵌合杀昆虫蛋白质中有许多种对多个鳞翅目昆虫害虫物种显示了杀昆虫活性。具体来说，本申请中所公开的新型嵌合杀昆虫蛋白质对一种或多种以下鳞翅目昆虫害虫表现出活性：黎豆毛虫(VBC，黎豆夜蛾)、蔗螟(SCB，小蔗螟)、小玉米茎钻心虫(LSCB，南美玉米苗斑螟)、玉米穗虫(CEW，玉米穗夜蛾)、大豆荚虫(SPW，玉米穗夜蛾)、棉铃虫(CBW，玉米穗夜蛾)、烟草芽虫(TBW，烟芽夜蛾)、大豆尺蠖(SBL，大豆夜蛾)、黑粘虫(BLAW，考斯夜蛾)、南方粘虫(SAW，亚热带粘虫)、草地粘虫(FAW，草地贪夜蛾)、甜菜粘虫(BAW，甜菜夜蛾)、古棉铃虫(OBW，棉铃实夜蛾)、东方叶虫(OLW，斜纹夜蛾)、粉红棉铃虫(PBW，棉红铃虫)、西南玉米钻心虫(SWCB，西南玉米螟)、斑点棉铃虫(SBW，翠纹金刚钻)、美洲棉铃虫(SABW，南美棉铃虫)和向日葵尺蠖(SFL，薄荷灰夜蛾)。因此，本申请中所描述的示例性蛋白质因常见功能而相关并且对鳞翅目昆虫物种的昆虫害虫，包括成虫、幼虫和蛹，表现出杀昆虫活性。
与所述嵌合杀昆虫蛋白质类似的蛋白质可以通过使用本领域中已知的基于计算机的算法与彼此比较来加以鉴别。举例来说，可以使用Clustal W比对，使用以下这些默认参数来分析蛋白质相对于嵌合杀昆虫蛋白质的氨基酸序列同一性：权重矩阵：blosum，空位开放罚分：10.0，空位延伸罚分：0.05，亲水性空位：On，亲水性残基：GPSNDQERK，残基特异性空位罚分：On(Thompson等人,(1994)Nucleic Acids Research,22:4673-4680)。通过100％×(氨基酸同一性/标的蛋白质的长度)的乘积来进一步计算氨基酸同一性百分比。还可利用本领域中的其他比对算法，得到与使用Clustal W比对获得的结果类似的结果，且涵盖在本申请中。
意图本申请中公开一种表现出昆虫抑制活性的查询蛋白质，在比对此类查询蛋白质与SEQ ID NO:4、7、10、13、16、19、21、23、25、28、30、33、36、39、41、43、45、47、50和53中所示出的标的嵌合杀昆虫蛋白质时，在所述查询蛋白质与所述标的蛋白质之间获得至少约64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％氨基酸序列同一性(或此范围中的任何分数百分比)。
如本申请的实施例中进一步描述，设计编码所述嵌合杀昆虫蛋白质的合成序列或人工序列以供用于植物中。设计用于植物中的示例性合成核苷酸序列示出于SEQ ID NO:2和3(TIC1100)、SEQ ID NO:6(TIC860)、SEQ ID NO:9(TIC867)、SEQ ID NO:12(TIC867_20)、SEQ ID NO:15(TIC867_21)、SEQ ID NO:18(TIC867_22)、SEQ ID NO:20(TIC867_23)、SEQID NO:22(TIC867_24)、SEQ ID NO:24(TIC867_25)、SEQ ID NO:27(TIC868)、SEQ ID NO:29(TIC868_9)、SEQ ID NO:32(TIC868_10)、SEQ ID NO:35(TIC868_11)、SEQ ID NO:38(TIC868_12)、SEQ ID NO:40(TIC868_13)、SEQ ID NO:42(TIC868_14)、SEQ ID NO:44(TIC868_15)、SEQ ID NO:46(TIC868_29)、SEQ ID NO:49(TIC869)和SEQ ID NO:52(TIC836)中。
为了在植物细胞中表达，所述嵌合杀昆虫蛋白质可以被表达以存在于细胞溶质中或靶向植物细胞的各种细胞器。举例来说，使蛋白质靶向叶绿体可能导致转基因植物中的表达蛋白质的水平增加，同时防止出现脱靶表型。靶向还可能导致转基因事件中的害虫抗性功效增加。靶标肽或转运肽是指导蛋白质转运至细胞中特定区域，包括细胞核、线粒体、内质网(ER)、叶绿体、质外体、过氧化物酶体和胞质膜的短(3至70个氨基酸长)肽链。在蛋白质被转运之后通过信号肽酶使一些靶标肽从所述蛋白质上裂解。为了靶向叶绿体，蛋白质含有大约40至50个氨基酸的转运肽。关于叶绿体转运肽的使用的描述，参见美国专利No.5,188,642和5,728,925。许多位于叶绿体的蛋白质是从细胞核基因表达为前体，并且通过叶绿体转运肽(CTP)靶向叶绿体。此类分离的叶绿体蛋白质的实例包括但不限于与核酮糖-1,5-双磷酸羧化酶、铁氧化还原蛋白、铁氧化还原蛋白氧化还原酶、捕光复合体蛋白I和蛋白II、硫氧化还原蛋白F、烯醇丙酮莽草酸磷酸合酶(EPSPS)和美国专利No.7,193,133中所描述的转运肽的小亚单元(SSU)缔合的那些。已经在活体内和活体外证明，可以通过使用与异源CTP的蛋白质融合物使非叶绿体蛋白质靶向叶绿体，而且CTP足以使蛋白质靶向叶绿体。并入合适的叶绿体转运肽，诸如阿拉伯芥EPSPS CTP(CTP2)(参见Klee等人,Mol.Gen.Genet.210:437-442,1987)或矮牵牛EPSPS CTP(CTP4)(参见della-Cioppa等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:6873-6877,1986)已经证明异源EPSPS蛋白质序列靶向转基因植物中的叶绿体(参见美国专利No.5,627,061、5,633,435和5,312,910；以及EP0218571、EP 189707、EP 508909和EP 924299)。为了使嵌合杀昆虫蛋白质靶向叶绿体，相对于已经设计的用于在植物细胞中进行最佳表达的编码嵌合杀昆虫蛋白质的合成编码序列，将编码叶绿体转运肽的序列的放在5'处的可操作键联中和框架中。
根据本领域中已知的转化方法和技术来构建含有这些合成或人工核苷酸序列的表达盒和载体并且将其引入玉米、棉花和大豆植物细胞中。使转化细胞再生出转化植物，观察到所述转化植物表达所述嵌合杀昆虫蛋白质。为了测试杀虫活性，在存在鳞翅目害虫幼虫的情况下使用获自转化植物的植物叶盘进行生物测定。设想了编码所述嵌合杀昆虫蛋白质的重组核酸分子组合物。举例来说，可以用重组DNA构建体表达所述嵌合杀昆虫蛋白质，其中编码嵌合杀昆虫蛋白质的具有ORF的多核苷酸分子可操作地连接至诸如启动子之类的基因表达元件和在所述构建体所意图的系统中表达所必需的任何其他调控元件。非限制性实例包括与合成嵌合杀昆虫蛋白质编码序列可操作地连接以便在植物中表达所述嵌合杀昆虫蛋白质的植物功能启动子或与嵌合杀昆虫蛋白质编码序列可操作地连接以便在Bt细菌或其他芽孢杆菌属中表达所述蛋白质的Bt功能启动子。其他元件可以可操作地连接至所述嵌合杀昆虫蛋白质编码序列，包括但不限于增强子、内含子、未翻译前导序列、编码蛋白质固定标签(HIS标签)、转位肽(即，质粒转运肽、信号肽)、针对翻译后修饰酶的多肽序列、核糖体结合位点和RNAi标靶位点。
本文中所提供的示例性重组多核苷酸分子包括但不限于与编码具有如SEQ IDNO:4(TIC1100)、7(TIC860)、10(TIC867)、13(TIC867_20)、16(TIC867_21)、19(TIC867_22)、21(TIC867_23)、23(TIC867_24)、25(TIC867_25)、28(TIC868)、30(TIC868_9)、33(TIC868_10)、36(TIC868_11)、39(TIC867_12)、41(TIC867_13)、43(TIC867_14)、45(TIC867_15)、47(TIC867_29)、50(TIC869)和53(TIC836)中所示出的氨基酸序列的多肽或蛋白质的诸如SEQID NO:1、2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、22、24、26、27、29、31、32、34、35、37、38、40、42、44、46、48、49、51和52之类的多核苷酸可操作地连接的异源启动子。异源启动子还可以可操作地连接至编码质粒靶向的嵌合杀昆虫蛋白质和未靶向的嵌合杀昆虫蛋白质的合成DNA编码序列。设想编码本文中所公开的嵌合杀昆虫蛋白质的重组核酸分子的密码子可以被同义密码子取代(在本领域中被称为沉默取代)。
包含嵌合杀昆虫蛋白质编码序列的重组DNA分子或构建体可以进一步包含编码一种或多种毒性剂的DNA区域，所述DNA区域可以经配置以便与编码嵌合杀昆虫蛋白质、不同于嵌合杀昆虫蛋白质的蛋白质、昆虫抑制性dsRNA分子或辅助蛋白质的DNA序列伴随表达或共同表达。辅助蛋白质包括但不限于辅因子、酶、结合伴侣或功能在于辅助昆虫抑制剂的效果，例如通过辅助其表达、影响其在植物中的稳定性、优化寡聚自由能、加强其毒性和增加其活性谱的其他试剂。辅助蛋白质可以例如促进一种或多种昆虫抑制剂的吸收或增强毒性剂的毒性效果。
可以组装重组DNA分子或构建体，使得所有蛋白质或dsRNA分子都可以从一种启动子表达，或者每一种蛋白质或dsRNA分子都在单独启动子控制或其一些组合下。本发明的蛋白质可以由多基因表达系统表达，其中嵌合杀昆虫蛋白质由常见核苷酸片段表达，所述核苷酸片段还含有其他开放阅读框和启动子，取决于所选表达系统的类型。举例来说，细菌多基因表达系统可以利用单个启动子来驱动多个连接/串联开放阅读框从单个操纵子内表达(即，多顺反子表达)。在另一个实例中，植物多基因表达系统可以利用多个未连接的表达盒，每一个表达盒表达不同的蛋白质或其他毒性剂，诸如一或多个dsRNA分子。
可以通过载体，例如质粒、杆状病毒、合成染色体、病毒体、粘粒、噬菌粒、噬菌体或病毒载体，将包含嵌合杀昆虫蛋白质编码序列的重组核酸分子或重组DNA构建体递送至宿主细胞。此类载体可用于实现嵌合杀昆虫蛋白质编码序列在宿主细胞中的稳定或暂时表达或者所编码的多肽的后续表达。包含嵌合杀昆虫蛋白质序列编码序列并且被引入宿主细胞中的外源重组多核苷酸或重组DNA构建体在本文中被称为“转基因”。
本文中提供了含有编码所述嵌合杀昆虫蛋白质中的任何一种或多种的多核苷酸的转基因细菌、转基因植物细胞、转基因植物和转基因植物部分。术语“细菌细胞”或“细菌”可以包括但不限于土壤杆菌、芽孢杆菌、埃希氏杆菌、沙门氏菌、假单胞菌或根瘤菌细胞。术语“植物细胞”或“植物”可以包括但不限于双子叶细胞或单子叶细胞。所设想的植物和植物细胞包括但不限于苜蓿、香蕉、大麦、豆、茎椰菜、甘蓝、芸苔、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑桔、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭菜、莴苣、火炬松、小米、甜瓜、坚果、燕麦、橄榄树、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、白杨树、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、水稻、根茎、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、香枫、甜薯、柳枝稷、茶树、烟草、番茄、黑小麦、草坪草、西瓜和小麦植物细胞或植物。在某些实施方案中，提供了由转基因植物细胞再生的转基因植物和转基因植物部分。在某些实施方案中，所述转基因植物可以获自转基因种子、通过插枝、折断、研磨或其他方式使部分从植物脱离。在某些实施方案中，所述植物部分可以是种子、蒴、叶、花、茎、根或其任何部分，或者转基因植物部分的不可再生部分。如这种情况下所使用，转基因植物部分的“不可再生”部分是不能受到诱导而形成完整植物或不能受到诱导而形成能够进行有性繁殖和/或无性繁殖的完整植物的部分。在某些实施方案中，植物部分的不可再生部分是转基因种子、蒴、叶、花、茎或根的一部分。
提供了制造包含鳞翅目抑制量的嵌合杀昆虫蛋白质的转基因植物的方法。此类植物可以通过将编码本申请中所提供的嵌合杀昆虫蛋白质的多核苷酸引入植物细胞中和选择表达昆虫或鳞翅目抑制量的嵌合杀昆虫蛋白质的来源于所述植物细胞的植物来制造。植物可以通过再生、种子、花粉或分生组织转化技术而来源于植物细胞。用于转化植物的方法在本领域中是已知的。举例来说，土壤杆菌介导的转化描述于美国专利申请公布2009/0138985A1(大豆)、2008/0280361A1(大豆)、2009/0142837A1(玉米)、2008/0282432(棉花)和2008/0256667(棉花)中。
表达所述嵌合杀昆虫蛋白质的植物可以通过利用表达其他杀昆虫蛋白质和/或表达其他转基因特质(诸如其他昆虫防治特质)的转基因事件、除草剂耐受基因、赋予产量或应力耐受特质的基因等等进行育种来进行杂交，或可以将此类特质组合在单个载体中，从而将所述特质全部联系起来。
本申请中还公开了经过加工的植物产品，其中所述经过加工的产品包含可检测量的嵌合杀昆虫蛋白质、其昆虫抑制性片段或其任何区别部分。在某些实施方案中，所述经过加工的产品是选自由以下各项组成的群组：植物部分、植物生物质、油、膳食、糖、动物饲料、面粉、薄片、糠、棉绒、外壳、经过加工的种子和种子。在某些实施方案中，所述经过加工的产品是不可再生的。所述植物产品可以包含来源于转基因植物或转基因植物部分的商品或其他商业产品，其中所述商品或其他产品可以通过检测编码或包含嵌合杀昆虫蛋白质的特色部分的核苷酸片段或者表达的RNA或蛋白质来通过商业进行追踪。
本申请中还公开了用所述嵌合杀昆虫蛋白质来防治昆虫、特别是鳞翅目昆虫侵扰作物植物的方法。此类方法可以包括种植包含昆虫或鳞翅目抑制量的所述嵌合杀昆虫蛋白质的植物。在某些实施方案中，此类方法可以进一步包括以下操作中的任何一个或多个：(i)向植物或能产生植物的种子施用包含或编码嵌合杀昆虫蛋白质的任何组合物；和(ii)用编码嵌合杀昆虫蛋白质的多核苷酸对植物或能产生植物的植物细胞进行转化。一般来说，设想嵌合杀昆虫蛋白质可以提供于组合物中，提供于微生物中，或提供于转基因植物中，以赋予针对鳞翅目昆虫的昆虫抑制活性。
在某些实施方案中，所述嵌合杀昆虫蛋白质是通过培养经过转化以便在适合表达的条件下表达嵌合杀昆虫蛋白质的重组芽孢杆菌或任何其他重组细菌细胞而制备的昆虫抑制性组合物的杀昆虫活性成分。此类组合物可以通过对表达/产生所述嵌合杀昆虫蛋白质的此类重组细胞的培养物进行干燥、冻干、均质化、提取、过滤、离心、沉降或浓缩来制备。此类方法可以获得芽孢杆菌或其他昆虫病原细菌细胞提取物、细胞悬浮液、细胞匀浆、细胞溶解产物、细胞上清液、细胞滤液或细胞球粒。通过获得如此产生的嵌合杀昆虫蛋白质，包括所述嵌合杀昆虫蛋白质的组合物可以包括细菌细胞、细菌孢子和伴孢包涵体，并且可以经过配制以用于各种用途，包括作为农业昆虫抑制性喷雾产品或作为食物生物测定中的昆虫抑制性制剂。
上述化合物或制剂可以进一步包含农业上可接受的载体，诸如诱饵、粉末、粉尘、球粒、颗粒、喷雾、乳液、胶态悬浮液、水溶液、牙胞杆菌孢子或晶体制剂或种子处理。所述化合物或制剂还可以进一步包含经转化以表达一种或多种所述蛋白质的重组植物细胞、植物组织、种子或植物；或经转化以表达一种或多种所述蛋白质的细菌。取决于所述重组多肽固有的昆虫抑制或杀昆虫抑制水平和应用于植物或食物测定的化合物或制剂水平，所述化合物或制剂可以包括各种以重量计量的所述重组多肽，例如以重量计0.0001％至0.001％至0.01％至1％至99％的所述重组多肽。
在一个实施方案中，为了降低抗性发展的可能性，包含嵌合杀昆虫蛋白质的昆虫抑制组合物或转基因植物可以进一步包含至少一种其他毒性剂，所述毒性剂对相同鳞翅目昆虫物种表现出昆虫抑制活性但不同于所述嵌合杀昆虫蛋白质。用于此类组合物的其他可能毒性剂包括昆虫抑制性蛋白质和昆虫抑制性dsRNA分子。使用此类核糖核苷酸序列来防治昆虫害虫的一个实例描述于Baum等人(美国专利公布2006/0021087A1)中。用于防治鳞翅目害虫的此类其他多肽可以选自由昆虫抑制性蛋白质组成的群组，诸如但不限于Cry1A(美国专利No.5,880,275)、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A.105、Cry1Ae、Cry1B(美国专利公布No.10/525,318)、Cry1C(美国专利No.6,033,874)、Cry1D、Cry1E、Cry1F和Cry1A/F嵌合体(美国专利No.7,070,982、6,962,705和6,713,063)、Cry1G、Cry1H、Cry1I、Cry1J、Cry1K、Cry1L、Cry2A、Cry2Ab(美国专利No.7,064,249)、Cry2Ae、Cry4B、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry15、Cry43A、Cry43B、Cry51Aa1、ET66、TIC400、TIC800、TIC834、TIC1415、Vip3A、VIP3Ab、VIP3B、AXMI-001、AXMI-002、AXMI-030、AXMI-035和AXMI-045(美国专利公布2013-0117884A1)、AXMI-52、AXMI-58、AXMI-88、AXMI-97、AXMI-102、AXMI-112、AXMI-117、AXMI-100(美国专利公布2013-0310543A1)、AXMI-115、AXMI-113、AXMI-005(美国专利公布2013-0104259A1)、AXMI-134(美国专利公布2013-0167264A1)、AXMI-150(美国专利公布2010-0160231A1)、AXMI-184(美国专利公布2010-0004176A1)、AXMI-196、AXMI-204、AXMI-207、AXMI-209(美国专利公布2011-0030096A1)、AXMI-218、AXMI-220(美国专利公布2014-0245491A1)、AXMI-221z、AXMI-222z、AXMI-223z、AXMI-224z、AXMI-225z(美国专利公布2014-0196175A1)、AXMI-238(美国专利公布2014-0033363A1)、AXMI-270(美国专利公布2014-0223598A1)、AXMI-345(美国专利公布2014-0373195A1)、DIG-3(美国专利公布2013-0219570A1)、DIG-5(美国专利公布2010-0317569A1)、DIG-11(美国专利公布2010-0319093A1)、AfIP-1A及其衍生物(美国专利公布2014-0033361A1)、AfIP-1B及其衍生物(美国专利公布2014-0033361A1)、PIP-1APIP-1B(美国专利公布2014-0007292A1)、PSEEN3174(美国专利公布2014-0007292A1)、AECFG-592740(美国专利公布2014-0007292A1)、Pput_1063(美国专利公布2014-0007292A1)、Pput_1064(美国专利公布2014-0007292A1)、GS-135及其衍生物(美国专利公布2012-0233726A1)、GS153及其衍生物(美国专利公布2012-0192310A1)、GS154及其衍生物(美国专利公布2012-0192310A1)、GS155及其衍生物(美国专利公布2012-0192310A1)、如美国专利公布2012-0167259A1中所描述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如美国专利公布2012-0047606A1中所描述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如美国专利公布2011-0154536A1中所描述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如美国专利公布2011-0112013A1中所描述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如美国专利公布2010-0192256A1中所描述的SEQ ID NO:2和4及其衍生物、如美国专利公布2010-0077507A1中所描述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如美国专利公布2010-0077508A1中所描述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如美国专利公布2009-0313721A1中所描述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如美国专利公布2010-0269221A1中所描述的SEQ ID NO:2或4及其衍生物、如美国专利No.7,772,465(B2)中所描述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如WO2014/008054A2中所描述的CF161_0085及其衍生物、如美国专利公布US2008-0172762A1、US2011-0055968A1和US2012-0117690A1中所描述的鳞翅目毒性蛋白质及其衍生物；如US7510878(B2)中所描述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如美国专利No.7812129(B1)中所描述的SEQ ID NO:2及其衍生物；等等。
在其他实施方案中，昆虫抑制组合物或转基因植物可以进一步包含对不受本发明的嵌合杀昆虫蛋白质抑制的昆虫害虫(诸如鞘翅目、半翅目和同翅目害虫)表现出昆虫抑制活性的至少一种其他毒性剂，以便扩大所获得的昆虫抑制的范围。
用于防治鞘翅目害虫的此类其他毒性剂可以选自由昆虫抑制性蛋白质组成的群组，诸如但不限于Cry3Bb(美国专利No.6,501,009)、Cry1C变体、Cry3A变体、Cry3、Cry3B、Cry34/35、5307、AXMI134(美国专利公布2013-0167264A1)、AXMI-184(美国专利公布2010-0004176A1)、AXMI-205(美国专利公布2014-0298538A1)、axmi207(美国专利公布2013-0303440A1)、AXMI-218、AXMI-220(美国专利公布20140245491A1)、AXMI-221z、AXMI-223z(美国专利公布2014-0196175A1)、AXMI-279(美国专利公布2014-0223599A1)、AXMI-R1和其变体(美国专利公布2010-0197592A1)、TIC407、TIC417、TIC431、TIC807、TIC853、TIC901、TIC1201、TIC3131、DIG-10(美国专利公布2010-0319092A1)、eHIP(美国专利申请公布No.2010/0017914)、IP3和其变体(美国专利公布2012-0210462A1)和ω-Hexatoxin-Hv1a(美国专利申请公布US2014-0366227A1)。
用于防治半翅目害虫的此类其他毒性剂可以选自由半翅目活性蛋白质组成的群组，诸如但不限于TIC1415(美国专利公布2013-0097735A1)、TIC807(美国专利No.8609936)、TIC834(美国专利公布2013-0269060A1)、AXMI-036(美国专利公布2010-0137216A1)和AXMI-171(美国专利公布2013-0055469A1)。用于防治鞘翅目、鳞翅目和半翅目昆虫害虫的其他多肽可以在由Neil Crickmore维护的苏云金芽孢杆菌毒素命名网站(互联网btnomenclature.info)上找到。
可以使用本领域技术人员已知的方法，诸如聚合酶链反应(PCR)、热扩增和杂交来鉴别嵌合杀昆虫蛋白质编码序列和与所述嵌合杀昆虫蛋白质具有相当大同一性百分比的序列。举例来说，所述嵌合杀昆虫蛋白质可用于产生特异性结合相关蛋白质的抗体，并且可用于筛选和发现密切相关的其他蛋白质。
此外，编码所述嵌合杀昆虫蛋白质的核苷酸序列可以用作筛选用探针和引物，以便使用热循环或等温扩增和杂交方法来鉴别所述类别的其他成员。举例来说，来源于如SEQID NO:2中所示出的序列的寡核苷酸可用于确定来源于商品产品的脱氧核糖核酸样品中存在或不存在嵌合杀昆虫转基因。鉴于使用寡核苷酸的某些核酸检测方法的敏感性，预期来源于如SEQ ID NO:2中的任意者中所示出的序列的寡核苷酸可用于在来源于汇集来源的商品产品中检测相应嵌合杀昆虫蛋白质，其中仅一部分商品产品来源于含有SEQ ID NO:2中的任意者的转基因植物。
实施例
鉴于上文，本领域技术人员应了解，以下公开实施方案仅代表本发明，本发明可以用多种形式体现。因此，本文中所公开的具体结构和功能细节不应理解为具有限制性。
实施例1
鳞翅目活性新型嵌合杀昆虫蛋白质编码序列的生成和克隆
本实施例说明新型嵌合杀昆虫蛋白质的生成以及所述嵌合杀昆虫蛋白质的克隆和表达。
由用于产生编码新型嵌合杀昆虫蛋白质的多核苷酸序列的已知Cry蛋白质基因构建了重组核酸序列。将所得多核苷酸序列克隆至苏云金芽孢杆菌(Bt)表达质粒载体中。在证实多核苷酸序列之后，将所述表达质粒转化至Bt中并且表达。测定所表达的新型嵌合蛋白质的制剂对各种鳞翅目害虫的活性。
产生了许多编码嵌合杀昆虫蛋白质的多核苷酸序列并且在生物测定中加以测试。不是所有嵌合杀昆虫蛋白质都显示出活性。仅基于其在生物测定中显示的对特定鳞翅目的活性来选择一些嵌合杀昆虫蛋白质。还基于原始嵌合杀昆虫蛋白质TIC867和TIC868产生了引入氨基酸取代或替代原毒素结构域的氨基酸变体。本发明的嵌合杀昆虫蛋白质的组分(结构域I、II和III，以及原毒素)提供于表1中。还提供了TIC868变体中相对于原始TIC868蛋白质序列的氨基酸取代。
表1.新型嵌合杀虫蛋白质和其组分。
Figure GDA0003298377660000291
Figure GDA0003298377660000301
*使用标准IUPAC氨基酸代码来标识氨基酸突变。参见IUPAC-IUB JointCommission on Biochemical Nomenclature.Nomenclature and Symbolism for AminoAcids and Peptides.Eur.J.Biochem.138:9-37(1984)。第一个氨基酸序列缩写表示给定支架蛋白质中的原始氨基酸，数字表示所述氨基酸的位置，而第二个氨基酸序列缩写表示改进的变体蛋白质中放在该位置上的氨基酸。
实施例2
新型嵌合杀昆虫蛋白质对鳞翅目害虫显示出活性
本实施例说明了对实施例1中所描述的嵌合杀昆虫蛋白质的测试和针对所述嵌合杀昆虫蛋白质观测到的鳞翅目活性。
在Bt中表达编码嵌合杀昆虫蛋白质的多核苷酸序列。然后针对已知是玉米、甘蔗、大豆和棉花以及其他作物植物的害虫的多种鳞翅目昆虫来测定所表达的嵌合杀昆虫蛋白质。具体来说，测定杀昆虫蛋白质对黎豆毛虫(VBC，黎豆夜蛾)、蔗螟(SCB，小蔗螟)、小玉米茎钻心虫(LSCB，南美玉米苗斑螟)、玉米穗虫(CEW，玉米穗夜蛾)、烟草芽虫(TBW，烟芽夜蛾)、大豆尺蠖(SBL，大豆夜蛾)、黑粘虫(BLAW，考斯夜蛾)、南方粘虫(SAW，亚热带粘虫)、草地粘虫(FAW，草地贪夜蛾)、甜菜粘虫(BAW，甜菜夜蛾)、古棉铃虫(OBW，棉铃实夜蛾)、东方叶虫(OLW，斜纹夜蛾)、粉红棉铃虫(PBW，棉红铃虫)、黑切根虫(BCW，球菜夜蛾)、西南玉米钻心虫(SWCB，西南玉米螟)、斑点棉铃虫(SBW，翠纹金刚钻)和欧洲玉米钻心虫(ECB，欧洲玉米螟)的活性。玉米穗虫(CEW，玉米穗夜蛾)也称为大豆荚虫(SPW)和棉铃虫(CBW)。通过死亡率与发育迟缓评分以及MIC50评分的组合来测定活性。MIC50是指蜕变抑制浓度，其中将死幼虫和L1幼虫(未能蜕变至第二龄的幼虫)都考虑至所述评分中。表2示出了每一种嵌合杀昆虫蛋白质的活性。‘+’符号表示对特定昆虫害虫观测到的活性。
Figure GDA0003298377660000321
如以上表2中可见，大部分嵌合杀昆虫蛋白质对一种或多种鳞翅目害虫物种表现出活性。
实施例3
合成编码嵌合杀昆虫蛋白质的基因并且用于在植物中表达
本实施例说明合成编码嵌合杀昆虫蛋白质的多核苷酸以便在植物中表达。
构建合成编码序列以用于在植物中表达嵌合杀昆虫蛋白质。根据美国专利5,500,365中大体描述的方法来设计并合成所述合成序列，从而避免某些有害的问题序列，诸如ATTTA和富A/T植物聚腺苷酸化序列，同时保留嵌合杀昆虫蛋白质的氨基酸序列。表3中列出了用于在植物中表达的编码所述嵌合杀昆虫蛋白质的这些基因的核苷酸序列。
表3.设计用于在植物中使用的编码嵌合杀昆虫蛋白质的多核苷酸序列。
Figure GDA0003298377660000331
Figure GDA0003298377660000341
实施例4
用于在植物中表达嵌合杀昆虫蛋白质的表达盒
本实施例说明包含设计用于在植物中使用的编码嵌合杀昆虫蛋白质的多核苷酸序列的表达盒的构建。
用表3中提供的设计用于植物表达的编码嵌合杀昆虫蛋白质的多核苷酸序列构建了多种植物表达盒。此类表达盒可用于在植物原生质体中暂时表达或转化植物细胞。根据蛋白质在细胞内的最终落点来设计典型表达盒。用允许蛋白质被翻译并且保留在细胞溶质中的方式设计一组表达盒。设计具有与毒素蛋白质连续的转运肽以允许靶向细胞的细胞器(诸如叶绿体或质粒)的另一组表达盒。以5'端开始用启动子设计所有表达盒，其可以由可操作地连接以加强转基因的表达的多个启动子元件、增强子元件或本领域技术人员已知的其他表达元件构成。启动子序列通常连续跟随有相对于启动子处于3'的一或多个前导序列。相对于前导序列，内含子序列通常提供在3'以改进转基因的表达。相对于可操作地连接的启动子、前导序列和内含子构形，毒素或转运肽的编码序列和毒素的编码序列通常位于3'。3'UTR序列通常提供在编码序列的3'，以促进转录终止并且提供对所得转录产物的聚腺苷酸化非常重要的序列。以上所描述的所有元件都可操作地连接并且依次布置，通常有为了构建表达盒而设的其他序列。
实施例5
嵌合杀昆虫蛋白质在经稳定转化的玉米中的鳞翅目活性
本实施例说明嵌合杀昆虫蛋白质当表达在玉米植物中并且作为食物提供给相应玉米昆虫害虫时对鳞翅目害虫表现出的抑制活性。
使用土壤杆菌介导的转化方法，用实施例4中所描述的二元转化载体转化玉米品种LH244。通过本领域中已知的方法诱导经转化的细胞以形成植物。以类似于美国专利No.8,344,207中所描述的那些生物测定的方式，使用植物叶盘进行生物测定。使用未转化的LH244植物来获得用作阴性对照的组织。针对玉米穗虫(CEW，玉米穗夜蛾)、草地粘虫(FAW，草地贪夜蛾)、黑切根虫(BCW，球菜夜蛾)和西南玉米钻心虫(SWCB，西南玉米螟)评价来自每一个二元载体的多个转化事件。
对R0和F1代转基因植物进行叶盘生物测定。另外，对受鳞翅目昆虫害虫侵扰的表达某些嵌合杀昆虫蛋白质的完整转基因F1植物，评价叶损伤评级。还评价了表达TIC860和TIC868的F1转基因事件在农田中对FAW、CEW和SWCB的活性。表4中示出了测定结果。‘+’符号表示对特定昆虫害虫观测到的活性。如表4中可见，大部分嵌合杀昆虫蛋白质和许多嵌合杀昆虫蛋白质变体对一种或多种鳞翅目害虫物种显示出活性。
Figure GDA0003298377660000361
实施例6
嵌合杀昆虫蛋白质在经稳定转化的大豆中的鳞翅目活性
本实施例说明嵌合杀昆虫蛋白质当表达在大豆植物中并且作为食物提供给相应昆虫害虫时对鳞翅目害虫表现出的抑制活性。
重新设计所选嵌合杀昆虫蛋白质的编码序列以用于植物表达，克隆至二元植物转化载体中，并且用于转化大豆植物细胞。所述植物转化载体包含用于如实施例4中所描述来表达嵌合杀昆虫蛋白质的第一转基因盒和用于使用壮观霉素选择来选择经转化的植物细胞的第二转基因盒。在一些情况下，诸如在TIC1100、TIC860和TIC836的情况下，将叶绿体转运肽编码序列可操作地连接至嵌合杀昆虫编码序列。用靶向和非靶向TIC1100、TIC860和TIC836的质粒进行测定。以下表5示出了嵌合杀昆虫蛋白质和TIC867变异嵌合杀昆虫蛋白质以及用于在经稳定转化的大豆中表达的相关编码序列。
使用以上所描述的二元转化载体通过土壤杆菌介导的转化来转化大豆植物细胞。诱导所得经转化的植物细胞以形成完整大豆植物。收获叶组织并且用于如实施例5中所描述的生物测定中，或替代地，将冻干组织用于昆虫食物中以用于生物测定。对FAW、南方粘虫(SAW，亚热带粘虫)、大豆尺蠖(SBL，大豆夜蛾)、大豆荚虫(SPW，玉米穗夜蛾)、黎豆毛虫(VBC，黎豆夜蛾)、烟草芽虫(TBW，烟芽夜蛾)、黑粘虫(BLAW，考斯夜蛾)、小玉米茎钻心虫(LSCB，南美玉米苗斑螟)和古棉铃虫(OBW，棉铃实夜蛾)进行生物测定。
表5示出了每一种杀昆虫蛋白质在R0代植物中对所选鳞翅目物种的活性，其中‘+’表示活性。如表5中可见，经稳定转化的大豆中所表达的每一种嵌合杀昆虫蛋白质对多个鳞翅目物种显示出活性。特别值得注意的是，TIC867变体TIC867_23显示了对SPW的活性。
表5·来自经稳定转化的R0大豆叶组织的嵌合杀昆虫蛋白质的生物测定活性。
Figure GDA0003298377660000381
允许所选转化事件自花授粉，并且种植所得种子。从R1代植物收获叶组织并且用于饲喂生物测定。测定表达TIC1100、TIC860、TIC867、TIC868、TIC869和TIC836的R1植物对SAW、SBL、SPW和VBC的活性。表6示出了在这些测试中所观测到的活性。‘+’符号表示对特定昆虫害虫观测到的活性。如表6中所显示，来自R1代植物的大部分表达的嵌合杀昆虫蛋白质对一种或多种鳞翅目物种显示了活性。
表6.来自经稳定转化的R1大豆叶组织的嵌合杀昆虫蛋白质的生物测定活性。
毒素 SAW SBL SPW VBC
TIC1100 + + +
TIC860 + + +
TIC867 +
TIC868 + + +
TIC869 + + +
TIC836 + + +
表7显示在网室中用表达TIC1100、TIC860和TIC836的经稳定转化的R1代大豆植物进行农田测试的结果。在网室中用于侵扰植物的物种包括SAW、SBL和SPW。抗性定义为小于或等于百分之十五的大豆植物发生脱叶。在这些网笼试验中观测到的抗性与表6中提供的在R1代大豆叶组织测定中观测到的抗性一致。‘+’符号表示对特定昆虫害虫观测到的活性。
表7.网室农田测试中所测试的R1代大豆中表达的TC1100、TIC860和TIC836的活性谱。
毒素 SAW SBL SPW
TIC1100 + +
TIC860 + +
TIC836 + +
还在阿根廷的两个不同的地方阿塞维多和冯特左拉(Fontezuela)在网室中用表达TIC867和TIC869的经稳定转化的R1代大豆植物进行农田测试。用于在网室中侵扰植物的物种包括南美棉铃虫(SABW，南美棉铃虫)、VBC、BLAW和向日葵尺蠖(SFL，薄荷灰夜蛾)。抗性定义为小于或等于百分之十五的大豆植物发生脱叶。以下表8示出了观测到的抗性。‘+’符号表示对特定昆虫害虫观测到的活性。如表8中所显示，表达TIC867的转基因大豆植物对BLAW和VBC显示了抗性。表达TIC869的转基因大豆植物对SABW、SFL、BLAW和VBC显示了抗性。
表8.网室农田测试中所测试的R1代大豆中表达的TIC867和TIC869的活性谱。
Figure GDA0003298377660000391
实施例7
嵌合杀昆虫蛋白质在经稳定转化的棉花中的鳞翅目活性
本实施例说明嵌合杀昆虫蛋白质当表达在棉花植株中并且作为食物提供给相应昆虫害虫时对鳞翅目害虫表现出的抑制活性。
重新设计所选嵌合杀昆虫蛋白质的编码序列以用于植物表达，克隆至二元植物转化载体中，并且用于转化棉花植物细胞。所得二元载体类似于实施例4中所描述的那些，并且被用于表达靶向和非靶向TIC860(编码序列：SEQ ID NO:6；蛋白质序列：SEQ ID NO:7)、TIC867(编码序列：SEQ ID NO:9；蛋白质序列：SEQ ID NO:10)、TIC868(编码序列：SEQ IDNO:27；蛋白质序列：SEQ ID NO:28)和TIC867_23(编码序列：SEQ ID NO:20；蛋白质序列：SEQ ID NO:23)的质粒。
通过土壤杆菌介导的转化方法来转化棉花植物细胞。诱导经转化的棉花细胞以形成完整植物。如实施例5中所描述将棉花叶组织用于对棉铃虫(CBW，玉米穗夜蛾)、FAW、TBW和SBL进行生物测定。表9示出了TIC860、TIC867和TIC868在经稳定转化的R0代棉花中对这些鳞翅目物种的观测活性，其中‘+’表示活性。如表9中可见，TIC860、TIC867和TIC868在经稳定转化的R0代棉花中对两种或更多种鳞翅目害虫物种显示了活性。
表9.来自经稳定转化的R0棉花叶组织的TIC860、TIC867和TIC868的生物测定活性。
毒素 CBW FAW TBW SBL
TIC860 + +
TIC867 + + + NT
TIC868 + +
所选转化事件被用于产生R1种子。测定表达TIC860、TIC867和TIC868的R1植物对CBW、FAW、TBW和SBL的抗性。将叶、蕾和蒴组织用于测定。表10示出了在这些测试中观测到的活性。‘+’符号表示对特定昆虫害虫观测到的活性。如表10中所显示，TIC860在叶组织中对FAW显示了活性。此外，嵌合杀昆虫蛋白质TIC867在叶、蕾和蒴组织中对CBW和FAW以及在叶中对TBW和SBL显示了活性。嵌合杀昆虫蛋白质TIC868在叶、蕾和蒴组织中对FAW以及在叶中对TBW和SBL显示了活性。
表10.来自经稳定转化的R1棉花叶组织的嵌合杀昆虫蛋自质的生物测定活性。
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本文中所公开和要求保护的所有组合物都可以在不过度实验的情况下根据本公开内容来制造和执行。尽管已经依据上述说明性实施方案描述了本发明的组合物，但本领域技术人员将显而易见，可以在不背离本发明的真实原理、精神和范围的情况下对本文中所描述的组合物加以变化、改变、修改和变更。更具体来说，将显而易见，在化学上和生理学上相关的某些药剂可以取代本文中所描述的药剂，同时将实现相同或类似的结果。对本领域技术人员显而易见的所有此类取代和修改都被认为在如所附权利要求书所限定的本发明精神、范围和原理内。
本说明书中所引用的所有出版物和公开的专利文件都以引用的方式并入本文中，达到与明确地且个别地指示每一个别出版物或专利申请以引用的方式并入相同的程度。
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Claims (18)

1.一种嵌合杀昆虫蛋白质，其由如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列组成，其中所述嵌合杀昆虫蛋白质对鳞翅目昆虫物种表现出抑制活性。
2.如权利要求1所述的嵌合杀昆虫蛋白质，其中所述昆虫物种是选自由以下各项组成的群组：黎豆夜蛾、小蔗螟、大豆夜蛾、考斯夜蛾、亚热带粘虫、草地贪夜蛾、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、棉红铃虫、西南玉米螟、翠纹金刚钻、南美棉铃虫和薄荷灰夜蛾。
3.一种编码嵌合杀昆虫蛋白质的多核苷酸，其中所述多核苷酸可操作地连接至异源启动子，并且所述嵌合杀昆虫蛋白质由如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列组成。
4.一种编码嵌合杀昆虫蛋白质的多核苷酸，其中所述多核苷酸由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列：
a.在严格条件下与如SEQ ID NO:27所示的多核苷酸序列的反向互补序列杂交；或
b.编码包含如SEQ ID NO:28中所示出的氨基酸序列的嵌合杀昆虫蛋白质。
5.一种宿主细胞，其由SEQ ID NO:27所示的多核苷酸序列组成，其中所述宿主细胞是选自由细菌宿主细胞和不可再生的植物宿主细胞组成的群组。
6.如权利要求5所述的宿主细胞，其中所述细菌宿主细胞是选自由以下各项组成的群组：土壤杆菌、根瘤菌、芽孢杆菌、短芽孢杆菌、埃希氏杆菌、假单胞菌、克雷伯氏杆菌和欧文氏菌。
7.如权利要求6所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是源自选自由单子叶植物和双子叶植物组成的植物群组的植物的不可再生的植物宿主细胞。
8.一种昆虫抑制性组合物，其包含由如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列组成的嵌合杀昆虫蛋白质。
9.如权利要求8所述的昆虫抑制性组合物，其还包含与所述嵌合杀昆虫蛋白质不同的至少一种昆虫抑制剂。
10.如权利要求9所述的昆虫抑制性组合物，其中所述至少一种昆虫抑制剂是选自由以下各项组成的群组：昆虫抑制性蛋白质、昆虫抑制性dsRNA分子和昆虫抑制性化学物质。
11.如权利要求9所述的昆虫抑制性组合物，其中所述至少一种昆虫抑制剂对鳞翅目、鞘翅目、半翅目、同翅目或缨翅目的一个或多个害虫物种表现出活性。
12.一种防治鳞翅目害虫的方法，所述方法包括使所述鳞翅目害虫与抑制量的如权利要求1所述的嵌合杀昆虫蛋白质接触。
13.一种不可再生的转基因植物细胞，其包含嵌合杀昆虫蛋白质，其中所述嵌合杀昆虫蛋白质由如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列组成。
14.一种防治鳞翅目害虫的方法，其包括使所述害虫暴露于如权利要求13所述的不可再生的转基因植物细胞，其中所述不可再生的植物细胞表达鳞翅目抑制量的所述嵌合杀昆虫蛋白质。
15.一种来源于如权利要求13所述的不可再生的植物细胞的商品产品，其中所述产品包含可检测量的所述嵌合杀昆虫蛋白质。
16.如权利要求15所述的商品产品，其中所述产品是选自由以下各项组成的群组：油、膳食、动物饲料、面粉、薄片、糠、棉绒和外壳。
17.一种编码如权利要求1所述的嵌合杀昆虫蛋白质的重组多核苷酸分子，其包含SEQID NO:27的核苷酸序列；和编码与所述嵌合杀昆虫蛋白质不同的昆虫抑制剂的多核苷酸序列。
18.一种重组核酸分子，其包含可操作地连接至编码嵌合杀昆虫蛋白质的多核苷酸片段的异源启动子，其中所述嵌合杀昆虫蛋白质由如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列组成。
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