UA123481C2 - Химерний інсектицидний білок, інгібіторний відносно лускокрилих шкідників - Google Patents

Abstract

Винахід стосується химерного інсектицидного білка, який має інгібіторну активність відносно видів комах ряду Lepidoptera. Винахід також стосується полінуклеотиду, який кодує химерний інсектицидний білок, клітини-хазяїна, яка містить полінуклеотид, композиції, яка має інгібіторну активність відносно комах, насіння, трансгенної клітини рослини, товарного продукту, рекомбінантної полінуклеотидної молекули, молекули рекомбінантної нуклеїнової кислоти, способу боротьби з лускокрилим шкідником та способу отримання насіння.

Description

Винахід стосується химерного інсектицидного білка, який має інгібіторну активність відносно видів комах ряду І ерідорієга.

Винахід також стосується полінуклеотиду, який кодує химерний інсектицидний білок, клітини-хазяїна, яка містить полінуклеотид, композиції, яка має інгібіторну активність відносно комах, насіння, трансгенної клітини рослини, товарного продукту, рекомбінантної полінуклеотидної молекули, молекули рекомбінантної нуклеїнової кислоти, способу боротьби з лускокрилим шкідником та способу отримання насіння.

Ця заявка заявляє пріоритет за попередньою заявкою на патент США Мо 62/064989, поданої 16 жовтня 2014 року, зміст якої в повному обсязі включено в цей документ за допомогою посилання.

Перелік послідовностей у машиночитаній формі, поданий з цією заявкою в електронному форматі й включений в цю заявку за допомогою посилання в повному обсязі. Перелік послідовностей міститься в файлі, створеному 23 серпня 2016 року, з ім'ям файлу

РЗ4230МО000 бед РОСТ АпЗ4х та розміром 898,229 байт (як виміряно в операційній системі

М5-Міпдомв52).

Цей винахід в цілому належить до області білків, які здійснюють інгібуючу дію на комах. У цій заявці описаний новий клас химерних інсектицидних білків, які проявляють інгібуючу активність проти сільськогосподарських шкідників культурних рослин і насіння. Зокрема, розкритий клас білків має інсектицидну активність відносно лускокрилих комах-шкідників. Передбачені рослини, частини рослин і насіння, що містять молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти, яка кодує один або більше описаних токсичних білків.

Все більшого значення набуває підвищення врожайності сільськогосподарських культур, в тому числі кукурудзи, сої, цукрового очерету, рису, пшениці, овочів і бавовнику. За прогнозами, на додаток до зростаючої потреби в сільськогосподарській продукції для забезпечення їжею, одягом та забезпечення енергією населення, що росте, кліматичних наслідків і тиску з боку зростаючого населення на використання землі, відмінної від сільськогосподарської, зменшується кількість доступних орних земель для ведення сільського господарства. Ці фактори привели до неоптимістичних прогнозів відносно продовольчої безпеки, особливо в умовах відсутності значних поліпшень в галузі біотехнології рослин і агрономічних прийомів. У світлі цих факторів, екологічно стійкі удосконалення в області технологій, агротехніки та боротьби зі шкідниками є життєво важливими інструментами для розширення виробництва сільськогосподарських культур на обмеженій кількості орних земель, доступних для ведення сільського господарства.

Комахи, особливо комахи в межах ряду лускокрилих, вважаються основною причиною пошкодження польових культур, та які знижують врожайність культур в заражених районах.

Види лускокрилих шкідників, які мають негативний вплив на сільське господарство, включають, без обмеження, кукурудзяну листову совку (Зродоріега Ігидірегда), совку малу (Зродоріега ехідча), совку латукову (Матезіга сопіїдигада), совку-іпсилон (Адгоїї5 ірзхіоп), совку капустяну (Ттіспоріизіа пі), соєву совку (Спгузодеїхі5 іпсіцдеп5), совку оксамитових бобів (Апіїсагвіа деттаїгаїї5), совку конюшинову (Нурепа з5сабга), тютюнову листовійку (Неїїоїпі5 мігезсеп5), совку бавовняну (Адгоїї5 з,ибіеггапеа), совку лугову (Рзецдаїейа ипірипсіа), совку прямокутну (Аадгоїі5 огпподопіа), метелика стеблового кукурудзяного (О5ігіпіа пибрііайй5), метелика-вогнівку (Атуеїоі5 іїгапо5йейПа), кукурудзяну вогнівку (Статбри5 саїїдіпозеПи5), лугового метелика (Негредгатта

Ісагвізаїі5), вогнівку соняшникову (Нотоеозота еїесіеПшт), точильника зернового кукурудзяного (Еіаєтораїрих Імщдпозеййи5), плодожерку яблуневу (Судіа ротопеїа), листовійку виноградну (Епдоріла міеапа), листовійку східну персикову (Сгарпоїйа тоїевіа), листовійку брунькову соняшнику (Зцівїта Пеїйап(папа), капустяну моль (Рішейа хуЇозіейа), рожевого коробкового хробака (Ресііпорпога доззуріейа), рожеву стеблову совку (Зезатіа іптегеп5), шовкопряда непарного (Гутапіга аїзраг), совку бавовняну американську (АІабата агодіНасеа), листовійку плодових дерев (АгсПпір5 агдугозрііа), листовійку різану золотисту (Агопір5 гозапа), вогнівку азіатську стеблову або вогнівку жовту рисову (Спйо зирргеззаїї5), листовійку рисову (Спарпаосгосі5 теадіпаїї5), кукурудзяну вогнівку (Статриз5 саїїдіпозеПи5), метелика трав'яного (Статрих еїегтеїйи5), вогнівку кукурудзяну південно-західну (Оіаїйгаєа дгапаїозейПа), вогнівку цукрової тростини (Оіаїгаєа засспагаїїє), совку бавовняну єгипетську (Еагіазх іп5шапа), совку плямисту (Еагіа5 мійеПйа), совку американську (Неїїсомегра агтідега), совку бавовняну або американську кукурудзяну совку (Неїїсомегра 7еа), лугового метелика (Негре(одгатта

Іісагвізаїі5), гронову листовійку (І обезіа роїгапа), цитрусового мінуючого метелика (РпуПоспівіів5 сітеїІа), білявку капустяну (Ріегі5 Бгаззісає), репніцу або білявку ріпняну (Ріегі5 гарає), азіатську бавовникову совку або азіатську бавовняну совку (Зродоріеєга Ійшига) і пасльонового мінера (Тша арзоїша).

Історично склалося так, що синтетичні хімічні інсектициди інтенсивно застосовували як засіб боротьби з шкідниками в сільському господарстві. Занепокоєність з приводу навколишнього середовища і здоров'я людини, крім виникаючих проблем зі стійкістю, стимулювала дослідження та розробку біологічних пестицидів. Це дослідження привело до прогресивного відкриття і застосування різних ентомопатогенних видів мікроорганізмів, включаючи бактерій.

Коли відкрили потенціал ентомопатогенних бактерій, особливо бактерій, що відносяться до 60 роду Васійи5, і застосували його в розробці агентів для біологічної боротьби зі шкідниками,

змінилася парадигма біологічних методів боротьби. Штами бактерії Васійн5 «(Пигіпдіепвів5 (ВО використовували як джерело інсектицидних білків, оскільки було виявлено, що штами Ві проявляють високу токсичність проти конкретних комах. Відомо, що штами Ві продукують дельта-ендотоксини, які локалізовані в параспоральному кристалічному тільці включення на початку споруляции та під час фази стаціонарного росту (наприклад, білки Сгу), і також відомо, що вони продукують інсектицидний білок, що секретується. При ковтанні сприйнятливою комахою, дельта-ендотоксини, а також токсини, що секретуються, надають свою дію на поверхню епітелію середньої кишки, руйнують клітинну мембрану, приводячи до руйнування та загибелі клітин. Гени, що кодують інсектицидні білки, також були ідентифіковані у бактеріальних видів, відмінних від Ві, включаючи інші Васійй5 і безліч інших видів бактерій, таких як

Вгемібасійи5 Іагегозрогив, І узіпірасійи5 5рпаегісив ("/5" раніше відомий як Васійи5 5рпаеєгісив) і

Раепібасійи5 рорійав.

Кристалічні і що секретуються розчинні інсектицидні білкові токсини є високоспецифічними для їх хазяїв і отримали світове визнання як альтернатива хімічним інсектицидам. Наприклад, інсектицидні токсичні білки застосовують в різних сільськогосподарських цілях для захисту господарсько-цінних рослин від зараження комахами, зменшення потреби в застосуванні хімічних пестицидів і підвищення врожайності. Інсектицидні токсичні білки застосовують для боротьби з сільськогосподарськими шкідниками культурних рослин механізованими способами, такими як розпорошення дисперсних мікробних препаратів, що містять різні штами бактерій, на поверхні рослин, і з використанням способів генетичної трансформації для отримання трансгенних рослин і насіння, що експресують інсектицидний токсичний білок.

Застосування трансгенних рослин, які експресують інсектицидні білки, визнано в світовому масштабі. Наприклад, у 2012 році 26,1 мільйона гектарів були засаджені трансгенними культурами, експресуючими Ві-токсини (датев, С., сіоба! Єайшв5 ої Соттегсіаіїїйгей Віотїесп/ЗмМ

Сторе: 2012. Короткий зміст звіту ІЗААА (Міжнародна служба зі збору відомостей про застосування біотехнологій в сільському господарстві) Мо 44). Глобальне застосування трансгенних культур, захищених від комах, і обмежена кількість інсектицидних білків, що застосовуються для цих культур, створило тиск відбору для існуючих алелей комах, які надають стійкість до застосовуваних в цей час інсектицидних білків.

Розвиток резистентності у цільових шкідників до інсектицидних білків створює постійну потребу у відкритті і розробці нових форм інсектицидних білків, які корисні для контролю над підвищенням резистентності комах трансгенних культур, експресуючих інсектицидні білки. Нові інсектицидні білки з підвищеною ефективністю, і які контролюють більш широкий спектр сприйнятливих видів комах, зменшують число комах, що вижили, і які можуть розвинути резистентні алелі. Крім того, застосування в одній рослині двох або більше трансгенних інсектицидних білків, токсичних для одного і того ж комахи-шкідника і які демонструють різні способи впливу, знижує ймовірність резистентності у будь-яких окремих цільових видів комах.

Отже, існує загальна необхідність ідентифікувати додаткові інсектицидні білки з поліпшеними інсектицидними властивостями, такими як підвищена ефективність проти більш широкого спектру цільових видів комах-шкідників і різні механізми дії в порівнянні з токсинами, що застосовуються в цей час в агрономічних прийомах. Для задоволення цієї потреби цей винахід описує нові химерні інсектицидні білки Стгу!, які проявляють активність проти численних цільових видів лускокрилих шкідників.

Члени сімейства кристалічних білків Стгу!, відомі в цій галузі техніки, проявляють біологічну активність проти лускокрилих-шкідників. Форма попередника кристалічних білків Сгу! складається з двох сегментів приблизно рівних розмірів. Карбоксікінцева частина білка- попередника, що відома як сегмент протоксину, стабілізує утворення кристалів і не проявляє інсектицидної активності. Амінокінцева половина білка- попередника містить сегмент токсину білка Сту!ї і, грунтуючись на вирівнюванні консервативних або по суті консервативних послідовностей в межах членів сімейства Сгу!, може бути додатково розділена на три структурних домени: домен І, домен ЇЇ та домен І. Домен І містить близько першої третини активного сегмента токсину і, як було показано, є істотним для формування каналу. Домени ЇЇ та

І залучені до зв'язування рецепторів і специфічні до видів комах, залежно від досліджуваної комахи та інсектициду.

Імовірність довільного створення химерного білка з покращеними властивостями з асортименту доменних структур численних нативних інсектицидних білків, відомих в цій області техніки, є незначною. Це є результатом складного характеру структури білка, олігомеризації й активації (включаючи відповідний протеолітичний процесинг химерного попередника, якщо він експресований в такій формі), необхідної для вивільнення сегмента інсектицидного білка. Тільки 60 шляхом ретельного відбору протоксинів і конкретних мішеней в кожному вихідному білку для створення химерної структури можуть бути створені функціональні химерні інсектицидні токсини, які проявляють поліпшену інсектицидну активність в порівнянні з вихідними білками, з яких отримані химери. У цій області техніки відомо, що повторна збірка протоксину і токсинових доменів І, ІІ ї ПІ будь-яких двох або більше токсинів, які відрізняються один від одного, часто призводить до отримання білків, які проявляють дефектне утворення кристалів або у яких повністю відсутня будь-яка інсектицидна активність, що детектують, яка спрямована на переважний вид комах-шкідників. Тільки метод проб і помилок є ефективним в отриманні інсектицидних химер, і навіть в такому випадку кваліфікований фахівець не впевнений, в кінцевому підсумку, в химері, що проявляє інсектицидну активність, яка еквівалентна або поліпшена в порівнянні з будь-яким єдиним вихідним токсичним білком, з якого отримані домени протоксину або токсинів химери. Наприклад, в літературі наводяться численні приклади конструювання або збірки химерних білків з двох або більше попередників кристалічного білка.

Див., наприклад, Часдцеїйпе 5. Кпідні еї а). "А бБігаїєду їог ЗпМИитЩШіпуд Митегоиз5 Васійи5

ТІигіпдієпвіз Стувіа! Ргоївіїп ботаїпв". У. Есопотіс Епіотоіоау, 97 (6) (2004): 1805-1813; Вовспи, єї ам. (патент США Мо 6204246); МаїЇмаг апа Сійтег (патент США 6017534). У кожному з цих прикладів багато з отриманих химер не проявляли інсектицидних або кристалоутворюючих властивостей, які були еквівалентні або поліпшені в порівнянні з білками-попередниками, з яких були отримані компоненти химер.

Запропоновані молекули рекомбінантної нуклеїнової кислоти, які кодують химерні інсектицидні білки, токсичні відносно видів лускокрилих-шкідників рослин. Кожен з химерних інсектицидних білків може застосовуватися окремо або в комбінації один з одним і з іншими інсектицидними білками й агентами, що мають інгібуючу активність відносно комах, в препаратах і в умовах іп ріапіа (в рослині)) таким чином, забезпечуючи альтернативи інсектицидним білкам і хімікатам-інсектицидам, що застосовуються в цей час в сільськогосподарських системах.

У деяких варіантах реалізації винаходу в цьому документі розкритий химерний інсектицидний білок, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в будь-якій з послідовностей 5ЕО ІЮ МО: 21, 10, 28, 7, 4, 13, 16, 19, 23, 25, 30, 33, 36, 39, 41, 43, 45, 47, 50, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109 або 111. Цей химерний інсектицидний білок проявляє інгібуючу активність проти видів комах ряду І ерідорієга, таких як, без обмежень, Апіїсагзіа деттагаїї5, Оіаїгаєа засспагаїї5,

Еіазтора!|риз ІдпозеїПв5, Неїїсомегра 2єа, Неїоїйів мігезсепв, Спгузодеїхів іпсіидепв5, Ззродорівга созтіоїде5, 5родорієга егідапіа, 5родорієга идірегаа, Зродорієга ехідца, Неїїсомегра аптідега,

Зродорієга ІШига, Ресіїпорпога доззурієейа, Оіаїйаєа агапаіозеПа, Еагавз мйейа, Неїїсомегтра деІюореоп, та Каспіріивзіа пи.

В іншому варіанті реалізації винаходу полінуклеотид, який кодує химерний інсектицидний білок, причому полінуклеотид, функціонально зв'язаний з гетерологічним промотором, і химерний інсектицидний білок містить амінокислотну послідовність, представлену в будь-якій з послідовностей 5ЕО ІЮ МО: 21, 10, 28, 7,4, 13, 16, 19, 23, 25, 30, 33, 36, 39, 41, 43, 45, 47, 50, 53,55,57,59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99,101, 103, 105, 107, 109 або 111. Також розглядається полінуклеотид, який кодує химерний інсектицидний білок, причому полінуклеотид містить нуклеотидну послідовність, яка необов'язково гібридизується в жорстких умовах зі зворотним комплементом полінуклеотидної послідовності, зазначеної в будь-якій з ЗЕО ІЮО МО: 1, 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 14,15, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 29,

З1, 32, 34, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 або 130; або кодує химерний інсектицидний білок, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в будь-якій з ЗЕО ІЮ

МО: 21, 10, 28, 7, 4, 13, 16, 19, 23, 25, 30, 33, 36, 39, 41, 43, 45, 47, 50, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67,69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109 або 111.

В інших варіантах реалізації винаходу в цьому документі розкрита клітина-хазяїн, яка містить полінуклеотид, зазначений в будь-якій з 5ЕО ІЮ МО: 1, 2, 3, 5,6, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 29, 31, 32, 34, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 або 130; причому клітина-хазяїн вибрана з групи, що складається з бактеріальної клітини-хазяїна або рослинної клітини-хазяїна. Розглянуті бактеріальні клітини-господарі включають Адгобасіегішт,

КПпі2орішт, Васійив5, Вгемірасіїйй5, Евспегіспіа, Рхеендотопав, КіерзієїІа, і Егміпіа; і причому види роду Васійй5 являють собою Васійй5 сегеи5 або ВасШив5 игіпдіепві5, зазначена Вгемірасійи5 являє собою Вгемібасіїйи5 Іаг(егозрегоц5, та зазначена Ебспегіспіа являє собою ЕзсопПегіспіа соїї.

Крім того, передбачувані рослинні клітини-хазяї включають однодольні або дводольні рослини.

В інших варіантах реалізації винаходу в цьому документі розкриті композиції, які мають інгібуючу активність відносно комах, що містять химерний інсектицидний білок, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в будь-якій з ЗЕО ІЮО МО: 21, 10, 28, 7, 4, 13, 16, 19, 23, 25, 30, 33, 36, 39, 41, 43, 45, 47, 50, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109 або 111. У деяких варіантах реалізації винаходу композиція, яка має інгібуючу активність відносно комах, може додатково містити щонайменше один агент, який має інгібуючу активність відносно комах, відмінний від химерного інсектицидного білка. Розглянуті агенти, які мають інгібуючу активністю відносно комах, відмінні від химерного інсектицидного білка, включають білок, що має інгібуючу активність відносно комах, молекулу длРНК, що має інгібуючу активність відносно комах, і хімічний склад, що має інгібуючу активність відносно комах. Ці агенти, які мають інгібуючу активність відносно комах, відмінні від химерного інсектицидного білка, можуть проявляти активність відносно одного або більше видів шкідників із рядів І ерідоріега, СоіІеорієга, Нетірієега, Ноторіега, або Тпузапоріега.

У ще одному варіанті реалізації винаходу в цьому документі описано насіння, що містить інгібуючу ефективну відносно комах кількість химерного інсектицидного білка, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в будь-якій з послідовностей 5ЕО ІЮ МО: 21, 10, 28, 7, 4, 13, 16, 19, 23, 25, 30, 33, 36, 39, 41, 43, 45, 47, 50, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109 або 111;; або полінуклеотид, зазначений в будь-якій з 5ЕО ІЮ МО: 1, 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 29, 31, 32, 34, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 46, А8, 49, 51, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 або 130.

Також розглядаються способи боротьби з лускокрилими-шкідниками, що включають приведення у контакт лускокрилого-шкідника з інгібуючою кількістю химерного інсектицидного білка за цим винаходом.

В іншому варіанті реалізації винаходу в цьому документі розкрита трансгенна рослинна клітина, рослина або частина рослини, яка містить химерний інсектицидний білок, причому химерний інсектицидний білок містить будь-яку амінокислотну послідовність, зазначену в будь- якій з ФЕО ІЮ МО: 21, 10, 28, 7, 4, 13, 16, 19, 23, 25, 30, 33, 36, 39, 41, 43, 45, 47, 50, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109 або 111; або химерний інсектицидний білок містить білок, який має щонайменше 94 95 ідентичності з БЗЕО ІО МО: 21, 10; щонайменше 93 95 ідентичності з БЕО ІЮ МО: 28, щонайменше 87 95 ідентичності з БЕО ІЮО МО: 7; щонайменше 90 95 ідентичності з БЕО ІЮО МО: 4; щонайменше 9195 ідентичності з ЗЕО І МО: 13; щонайменше 64 95 ідентичності з 5БЕО ІО МО: 16; щонайменше 66 95 ідентичності з 5ЕО ІЮ МО: 19; щонайменше 86 95 ідентичності з БЕО ІЮ МО: 23; щонайменше 91 95 ідентичності з ЕО ІЮО МО: 25; щонайменше 94 95 ідентичності з зЕО ІЮ

МО: 30; щонайменше 91 95 ідентичності з «ЕО ІЮ МО: 33; щонайменше 64 95 ідентичності з «ЕО

ІО МО: 36; щонайменше 66 95 ідентичності з БЕО ІЮО МО: 39; щонайменше 94 95 ідентичності з

ЗБЕО ІО МО: 41; щонайменше 84 95 ідентичності з 5ЕО ІЮ МО: 43; щонайменше з 93 95 ідентичності з БЕО ІЮ МО: 45; щонайменше 94 95 ідентичності з БЕО ІЮ МО: 47; щонайменше 91 95 ідентичності з «ЕО ІЮ МО: 50; або щонайменше 93 95 ідентичності з ЗЕО ІЮ МО: 53; або щонайменше 87 95 ідентичності з «ЕО ІЮ МО: 85, 93, 105; або щонайменше 85 95 ідентичності з

ЗЕО І МО: 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79; або щонайменше 88 95 ідентичності з

ЗБЕО ІО МО: 91, 87, 89; або щонайменше 89 95 ідентичності з ЗЕО ІЮ МО: 107, 111; або щонайменше 90 95 ідентичності з 5ЕО ІЮО МО: 97; щонайменше 91 95 ідентичності з БЕО ІЮ МО: 109; або щонайменше 93 95 ідентичності з з«ЕО ІО МО: 83; або щонайменше 94 95 ідентичності з

ЗЕО ІЮ МО: 91 або 103; або щонайменше 95 95 ідентичності з «ЕО ІЮ МО: 95, 101; или по меньшей мере 98 95 ідентичності с 5ЕО ІЮ МО: 99. Також розглядаються способи боротьби з лускокрилими-шкідниками, що включають вплив трансгенної рослинної клітини, рослини або частини рослини на шкідника, причому зазначені рослинна клітина, рослина або частина рослини експресують інгібуючу відносно лускокрилих кількість химерного інсектицидного білка.

В інших варіантах реалізації винаходу в цьому документі запропоновані продукти, отримані з рослинної клітини, рослини або частини рослини, причому продукт містить кількість химерного інсектицидного білка, яка виявляється. Розглянуті товари включають біомасу рослин, масло, борошно грубого помелу, корм для тварин, борошно, пластівці, висівки, волокно, шкірку та оброблене насіння.

Ще один спосіб, розкритий в цьому документі, являє собою спосіб отримання насінини, яка 60 містить химерний інсектицидний білок, що включає: висаджування щонайменше однієї насінини,

яка містить химерний інсектицидний білок; вирощування рослин із зазначеної насінини; та збір насіння від рослин, причому зібрана насінина містить інсектицидний білок.

Рекомбінантні полінуклеотидні молекули, які кодують химерний інсектицидний білок, що містить нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО: 1, 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15,17, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 29, 31, 32, 34, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 4Аб, А8, 49, 51, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 або 130; і необов'язково полінуклеотидну послідовність, яка кодує агента, що має інгібіторну активність відносно комах, відмінного від химерного інсектицидного білка.

Інша розглянута в цьому документі молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти містить гетерологічний промотор, функціонально зв'язаний з полінуклеотидним сегментом, що кодує химерні інсектицидні білки, причому химерний інсектицидний білок містить будь-яку амінокислотну послідовність, зазначену в будь-якій з ЗЕО ІЮО МО: 21, 10, 28, 7, 4, 13, 16, 19, 23, 25, 30, 33, 36, 39, 41, 43, 45, 47, 50, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109 або 111; або химерний інсектицидний білок містить білок, який має: щонайменше 94 95 ідентичності з «ЕО ІЮО МО: 21, 10; щонайменше 93 95 ідентичності з БЕО ІЮ МО: 28; щонайменше 87 95 ідентичності з «ЕО ІО МО: 7; щонайменше 9095 ідентичності з ЗЕО ІО МО: 4; щонайменше 9195 ідентичності з 5БО ІО МО: 13; щонайменше 64 95 ідентичності з 5ЕО ІЮ МО: 16; щонайменше 66 95 ідентичності з БЕО ІЮ МО: 19; щонайменше 86 95 ідентичності з БЕО ІО МО: 23; щонайменше 91 95 ідентичності з «ЕО ІЮ

МО: 25; щонайменше 94 95 ідентичності з «ЕО ІЮ МО: 30; щонайменше 91 95 ідентичності з «ЕО

ІО МО: 33; щонайменше 64 95 ідентичності з БЕО ІЮО МО: 36; щонайменше 66 95 ідентичності з

ЗБО І МО: 39; щонайменше 94 95 ідентичності з 5ЕБО І МО: 41; щонайменше 84 95 ідентичності з БЕО ІЮ МО: 43; щонайменше 93 95 ідентичності з БЕО ІЮ МО: 45; щонайменше 94 95 ідентичності з БЕО ІЮ МО: 47; щонайменше 91 95 ідентичності з 5ЕО ІЮ МО: 50; або щонайменше 93 95 ідентичності з «ЕО ІЮ МО: 53 або щонайменше 87 95 ідентичності з ЗЕО ІЮ

МО: 85, 93, 105; або щонайменше 85 95 ідентичності з зЗЕО ІЮО МО: 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 19; або щонайменше 88 95 ідентичності з БЕО ІЮ МО: 91, 87, 89; або щонайменше 89 95 ідентичності з «ЕО ІЮ МО: 107, 111; або щонайменше 90 95 ідентичності з БЕО ІЮ МО: 97; або щонайменше 91 95 ідентичності з ЗЕО ІЮ МО: 109; або щонайменше 93 95 ідентичності з

ЗЕО ІЮО МО: 83; або щонайменше 94 95 ідентичності з БЕО ІЮО МО: 91, 103; або щонайменше 95 95 ідентичності з зЗЕО ІЮ МО: 95, 101; або щонайменше 98 95 ідентичності з 5ЕО ІЮ МО: 99; або полінуклеотидний сегмент гібридизується з полінуклеотидом, який має нуклеотидну послідовність, зазначену в будь-якій з зЕО ІЮ МО: 1, 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20,22, 24,26, 27, 29, 31, 32, 34, 35, 37, 38, 40, 42, 44, Аб, 48, 49, 51, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 або 130.

Інші варіанти реалізації, особливості та переваги цього винаходу будуть очевидні з наступного детального опису, прикладів і формули винаходу.

ЗБО ІЮ МО: 1 являє собою послідовність рекомбінантної ДНК, яка кодує ТІС1100, використовувану для експресії в бактеріальній клітині.

ЗЕО ІЮО МО: 2 являє собою синтетичну послідовність ДНК, яка кодує ТІС1100, для експресії в рослинній клітині.

ЗЕО ІЮ МО: З являє собою синтетичну послідовність ДНК, яка кодує ТІС1100, для експресії в рослинній клітині.

ЗЕО ІЮ МО: 4 являє собою амінокислотну послідовність ТІС1100.

ЗБО ІЮ МО: 5 являє собою послідовність рекомбінантної ДНК, яка кодує ТІС860, використовувану для експресії в бактеріальній клітині.

ЗЕО ІЮ МО: 6 являє собою синтетичну послідовність ДНК, яка кодує ТІС860, для експресії в рослинній клітині.

ЗЕО ІО МО: 7 являє собою амінокислотну послідовність ТІС860.

ЗБО ІЮ МО: 8 являє собою послідовність рекомбінантної ДНК, яка кодує ТІС867, використовувану для експресії в бактеріальній клітині.

ЗЕО ІЮ МО: 9 являє собою синтетичну послідовність ДНК, яка кодує ТІС867, для експресії в рослинній клітині.

ЗЕО ІЮ МО: 10 являє собою амінокислотну послідовність ТІС867.

ЗБЕО ІЮ МО: 11 являє собою послідовність рекомбінантної ДНК, яка кодує ТІС867 20, використовувану для експресії в бактеріальній клітині.

ЗБЕО ІЮ МО: 12 являє собою синтетичну послідовність ДНК, яка кодує ТІС867 20 для 60 експресії в рослинній клітині.

ЗЕО ІЮ МО: 13 являє собою амінокислотну послідовність ТІС867 20.

ЗБЕО ІЮ МО: 14 являє собою послідовність рекомбінантної ДНК, яка кодує ТІС867 21, використовувану для експресії в бактеріальній клітині.

ЗБЕО І МО: 15 являє собою синтетичну послідовність ДНК, яка кодує ТІС867 21, для експресії в рослинній клітині.

ЗЕО ІЮ МО: 16 являє собою амінокислотну послідовність ТІС867 21.

ЗБЕО ІЮ МО: 17 являє собою послідовність рекомбінантної ДНК, яка кодує ТІС867 22, використовувану для експресії в бактеріальній клітині.

ЗБЕО ІЮО МО: 18 являє собою синтетичну послідовність ДНК, яка кодує ТІС867 22, для експресії в рослинній клітині.

ЗЕО ІЮ МО: 19 являє собою амінокислотну послідовність ТІС867 22.

ЗБЕО І МО: 20 являє собою синтетичну послідовність ДНК, яка кодує ТІС867 23, для експресії в рослинній клітині.

ЗЕО ІЮ МО: 21 являє собою амінокислотну послідовність ТІС867 23.

ЗБЕО І МО: 22 являє собою синтетичну послідовність ДНК, яка кодує ТІС867 24, для експресії в рослинній клітині.

ЗЕО ІЮ МО: 23 являє собою амінокислотну послідовність ТІС867 24.

ЗБЕО І МО: 24 являє собою синтетичну послідовність ДНК, яка кодує ТІС867 24, для експресії в рослинній клітині.

ЗЕО ІЮ МО: 25 являє собою амінокислотну послідовність ТІС867 25.

ЗБО І МО: 26 являє собою послідовність рекомбінантної ДНК, яка кодує ТІС868, використовувану для експресії в бактеріальній клітині.

ЗЕО ІЮ МО: 27 являє собою синтетичну послідовність ДНК, яка кодує ТІС868 для експресії в рослинній клітині.

ЗЕО ІЮ МО: 28 являє собою амінокислотну послідовність ТІС868.

ЗБО ІЮ МО: 29 являє собою синтетичну послідовність ДНК, яка кодує ТІС868 9, для експресії в рослинній клітині.

ЗЕО ІЮ МО: 30 являє собою амінокислотну послідовність ТІС868 9.

ЗЕО ІЮ МО: 31 являє собою послідовність рекомбінантної ДНК, яка кодує ТІС868 10, використовувану для експресії в бактеріальній клітині.

ЗБЕО ІО МО: 32 являє собою синтетичну послідовність ДНК, яка кодує варіант ТІС868,

ТІС868 10, для експресії в рослинній клітині.

ЗЕО ІЮ МО: 33 являє собою амінокислотну послідовність ТІС868 10.

ЗБЕО Ір МО: 34 являє собою послідовність рекомбінантної ДНК, яка кодує ТІС868 11, використовувану для експресії в бактеріальної клітині.

ЗБЕО ІЮО МО: 35 являє собою синтетичну послідовність ДНК, яка кодує ТІС868 11, для експресії в рослинній клітині.

ЗЕО ІЮ МО: 36 являє собою амінокислотну послідовність ТІС868 11.

ЗБЕО ІЮ МО: 37 являє собою послідовність рекомбінантної ДНК, яка кодує ТІС868 12, використовувану для експресії в бактеріальної клітині.

ЗБЕО ІЮО МО: 38 являє собою синтетичну послідовність ДНК, яка кодує ТІС868 12, для експресії в рослинній клітині.

ЗЕО ІЮ МО: 39 являє собою амінокислотну послідовність ТІС868 12.

ЗБЕО І МО: 40 являє собою синтетичну послідовність ДНК, яка кодує ТІС868 13, для експресії в рослинній клітині.

ЗЕО ІЮ МО: 41 являє собою амінокислотну послідовність ТІС868 13.

ЗБЕО І МО: 42 являє собою синтетичну послідовність ДНК, яка кодує ТІС868 14, для експресії в рослинній клітині.

ЗЕО ІЮ МО: 43 являє собою амінокислотну послідовність ТІС868 14.

ЗБЕО І МО: 44 являє собою синтетичну послідовність ДНК, яка кодує ТІС868 15, для експресії в рослинній клітині.

ЗЕО ІЮ МО: 45 являє собою амінокислотну послідовність ТІС868 15.

ЗБЕО І МО: 46 являє собою синтетичну послідовність ДНК, яка кодує ТІС868 29, для експресії в рослинній клітині.

ЗЕО ІЮ МО: 47 являє собою амінокислотну послідовність ТІС868 29.

ЗБО І МО: 48 являє собою послідовність рекомбінантної ДНК, яка кодує ТІС869, використовувану для експресії в бактеріальній клітині.

ЗЕО ІЮ МО: 49 являє собою синтетичну послідовність ДНК, яка кодує ТІС869, для експресії в рослинній клітині. 60 ЗЕО ІЮ МО: 50 являє собою амінокислотну послідовність ТІС869. б

ЗБО ІЮ МО: 51 являє собою послідовність рекомбінантної ДНК, яка кодує ТІС836, використовувану для експресії в бактеріальній клітині.

ЗЕО І МО: 52 являє собою синтетичну послідовність ДНК, яка кодує ТІС836, для експресії в рослинній клітині.

ЗЕО ІЮ МО: 53 являє собою амінокислотну послідовність ТІС836.

ЗБО ІЮ МО: 54 являє собою послідовність ДНК, яка кодує химерну амінокислотну послідовність ТІС713.

ЗБЕО І МО: 55 являє собою амінокислотну послідовність ТІС713, яка трансльовона з відкритої рамки зчитування, зазначеної в ЗЕО ІЮО МО: 54.

ЗБО ІЮ МО: 56 являє собою послідовність ДНК, яка кодує химерну амінокислотну послідовність ТІС843.

ЗБЕО ІЮ МО: 57 являє собою амінокислотну послідовність ТІС843, яка трансльована з відкритої рамки зчитування, зазначеної в ЗЕО І МО: 56.

ЗБО ІЮ МО: 58 являє собою послідовність ДНК, яка кодує химерну амінокислотну послідовність ТІС862.

ЗБЕО І МО: 59 являє собою амінокислотну послідовність ТІС862, яка трансльована з відкритої рамки зчитування, зазначеної в ЗЕО ІЮО МО: 58.

ЗБО ІЮ МО: 60 являє собою послідовність ДНК, яка кодує химерну амінокислотну послідовність ТІС1099.

ЗБЕО ІЮ МО: 61 являє собою амінокислотну послідовність ТІС1099, яка трансльована з відкритої рамки зчитування, зазначеної в ЗЕО І МО: 60.

ЗБО ІЮ МО: 62 являє собою послідовність ДНК, яка кодує химерну амінокислотну послідовність ТІС1099-1507Е.

ЗЕО ІЮ МО: 63 являє собою амінокислотну послідовність ТІС1099-1507Е, яка трансльована з відкритої рамки зчитування, зазначеної в ЗЕО І МО: 62.

ЗБО ІЮ МО: 64 являє собою послідовність ДНК, яка кодує химерну амінокислотну послідовність ТІС1099-8522К.

ЗЕО ІО МО: 65 являє собою амінокислотну послідовність ТІС1099-2522К, яка трансльована з відкритої рамки зчитування, представленої в ЗЕО ІЮ МО: 64.

ЗБЕО ІЮ МО: 6б являє собою послідовність ДНК, яка кодує химерну амінокислотну послідовність ТІС1099-К4905.

ЗЕО ІО МО: 67 являє собою амінокислотну послідовність ТІС1099-К4905, яка трансльована з відкритої рамки зчитування, зазначеної в ЗЕО ІЮ МО: 66.

ЗБЕО ІЮ МО: 68 являє собою послідовність ДНК, яка кодує химерну амінокислотну послідовність ТІС1099-1562Н8.

ЗЕО ІЮ МО: 69 являє собою амінокислотну послідовність ТІС1099-1562Е, яка трансльована з відкритої рамки зчитування, зазначеної в ЗЕО І МО: 68.

ЗБО ІЮ МО: 70 являє собою послідовність ДНК, яка кодує химерну амінокислотну послідовність ТІС1099-55538.

ЗЕО ІЮ МО: 71 являє собою амінокислотну послідовність ТІС1099-5553Е,, яка трансльована з відкритої рамки зчитування, зазначеної в ЗЕО І МО: 70.

ЗБО ІЮ МО: 72 являє собою послідовність ДНК, яка кодує химерну амінокислотну послідовність ТІС1099-(34980.

ЗЕО ІЮ МО: 73 являє собою амінокислотну послідовність ТІС1099-054980, яка трансльована з відкритої рамки зчитування, зазначеної в ЗЕО ІЮО МО: 72.

ЗБО ІО МО: 74 являє собою послідовність ДНК, що кодує химерну амінокислотну послідовність ТІС1099-КА9ОА.

ЗЕО ІЮ МО: 75 являє собою амінокислотну послідовність ТІС1099-К490А, яка трансльована з відкритої рамки зчитування, зазначеної в ЗЕО ІЮО МО: 74.

ЗБО ІЮ МО: 76 являє собою послідовність ДНК, яка кодує химерну амінокислотну послідовність ТІС1099-Е564А.

ЗЕО ІЮ МО: 77 являє собою амінокислотну послідовність ТІС1099-Е564А, яка трансльована з відкритої рамки зчитування, зазначеної в ЗЕО І МО: 76.

ЗБО ІЮ МО: 78 являє собою послідовність ДНК, яка кодує химерну амінокислотну послідовність ТІС1103.

ЗБЕО ІЮ МО: 79 являє собою амінокислотну послідовність ТІС1103, яка трансльована з відкритої рамки зчитування, зазначеної в ЗЕО ІЮО МО: 78.

ЗБО ІЮ МО: 80 являє собою послідовність ДНК, яка кодує химерну амінокислотну послідовність ТІС1101.

ЗБЕО ІЮ МО: 81 являє собою амінокислотну послідовність ТІС1101, яка трансльована з відкритої рамки зчитування, зазначеної в ЗЕО І МО: 80.

ЗБО ІЮ МО: 82 являє собою послідовність ДНК, яка кодує химерну амінокислотну послідовність ТІС845.

ЗБЕО І МО: 83 являє собою амінокислотну послідовність ТІС845, яка трансльована з відкритої рамки зчитування, зазначеної в ЗЕО ІЮ МО: 82.

ЗБО ІЮ МО: 84 являє собою послідовність ДНК, яка кодує химерну амінокислотну послідовність ТІС846.

ЗБЕО Ір МО: 85 являє собою амінокислотну послідовність ТІС846, яка трансльована з відкритої рамки зчитування, зазначеної в ЗЕО ІЮ МО: 84.

ЗБЕО ІЮ МО: 86 являє собою послідовність ДНК, яка кодує химерну амінокислотну послідовність ТІС858.

ЗБЕО І МО: 87 являє собою амінокислотну послідовність ТІС858, яка трансльована з відкритої рамки зчитування, зазначеної в ЗЕО І МО: 86.

ЗБЕО І МО: 88 являє собою послідовність ДНК, яка кодує химерну амінокислотну послідовність ТІС865.

ЗБЕО І МО: 89 являє собою амінокислотну послідовність ТІС865, яка трансльована з відкритої рамки зчитування, зазначеної в ЗЕО ІЮ МО: 88.

ЗБО ІЮ МО: 90 являє собою послідовність ДНК, яка кодує химерну амінокислотну послідовність ТІС866.

ЗЕО ІЮ МО: 91 являє собою амінокислотну послідовність ТІС866, трансльована з відкритої рамки зчитування, зазначеної в ЗЕО ІЮ МО: 90.

ЗБО ІЮ МО: 92 являє собою послідовність ДНК, яка кодує химерну амінокислотну послідовність ТІС838.

ЗБЕО І МО: 93 являє собою амінокислотну послідовність ТІС838, яка трансльована з відкритої рамки зчитування, зазначеної в ЗЕО ІЮО МО: 92.

ЗБО ІЮ МО: 94 являє собою послідовність ДНК, яка кодує химерну амінокислотну послідовність ТІС839.

ЗБЕО Ір МО: 95 являє собою амінокислотну послідовність ТІС839, яка трансльована з відкритої рамки зчитування, зазначеної в ЗЕО ІЮО МО: 94.

ЗБО ІЮ МО: 96 являє собою послідовність ДНК, яка кодує химерну амінокислотну послідовність ТІС841.

ЗБЕО І МО: 97 являє собою амінокислотну послідовність ТІС841, яка трансльована з відкритої рамки зчитування, зазначеної в ЗЕО І МО: 96.

ЗБО ІЮ МО: 98 являє собою послідовність ДНК, яка кодує химерну амінокислотну послідовність ТІС842.

ЗЕБЕО І МО: 99 являє собою амінокислотну послідовність ТІС842, яка трансльована з відкритої рамки зчитування, зазначеної в ЗЕО І МО: 98.

ЗБО ІЮО МО: 100 являє собою послідовність ДНК, яка кодує химерну амінокислотну послідовність ТІС850.

ЗБЕО ІЮ МО: 101 являє собою амінокислотну послідовність ТІС850, яка трансльована з відкритої рамки зчитування, зазначеної в ХЕО ІЮ МО: 100.

ЗБО ІЮО МО: 102 являє собою послідовність ДНК, яка кодує химерну амінокислотну послідовність ТІС859.

ЗБЕО ІЮ МО: 103 являє собою амінокислотну послідовність ТІС859, яка трансльована з відкритої рамки зчитування, зазначеної в ХЕО ІЮ МО: 102.

ЗБО ІЮО МО: 104 являє собою послідовність ДНК, яка кодує химерну амінокислотну послідовність ТІС861.

ЗБЕО ІЮ МО: 105 являє собою амінокислотну послідовність ТІС861, яка трансльована з відкритої рамки зчитування, зазначеної в ХЕО ІЮ МО: 104.

ЗБЕО ІЮО МО: 106 являє собою послідовність ДНК, яка кодує химерну амінокислотну послідовність ТІС848.

ЗБЕО ІЮ МО: 107 являє собою амінокислотну послідовність ТІС848, яка трансльована з відкритої рамки зчитування, зазначеної в ХЕО ІЮ МО: 106.

ЗБЕО ІЮО МО: 108 являє собою послідовність ДНК, яка кодує химерну амінокислотну послідовність ТІС849.

ЗБЕО ІЮ МО: 109 являє собою амінокислотну послідовність ТІС849, яка трансльована з відкритої рамки зчитування, зазначеної в ХЕО ІЮ МО: 108.

ЗБО ІЮО МО: 110 являє собою послідовність ДНК, яка кодує химерну амінокислотну 60 послідовність ТІС847.

ЗБЕО ІЮ МО: 111 являє собою амінокислотну послідовність ТІС847, яка трансльована з відкритої рамки зчитування, зазначеної в 5ХЕО ІЮ МО: 110.

ЗЕО ІЮ МО: 112 являє собою синтетичну послідовність ДНК для експресії в клітині рослини, яка кодує ТІС713.

ЗЕО ІЮ МО: 113 являє собою синтетичну послідовність ДНК для експресії в клітині рослини, яка кодує ТІС713.

ЗЕО ІЮ МО: 114 являє собою синтетичну послідовність ДНК для експресії в клітині рослини, яка кодує ТІС843.

ЗЕО ІЮ МО: 115 являє собою синтетичну послідовність ДНК для експресії в клітині рослини, яка кодує ТІС862.

ЗЕО ІЮ МО: 116 являє собою синтетичну послідовність ДНК для експресії в клітині рослини, яка кодує ТІС1099.

ЗЕО ІЮ МО: 117 являє собою синтетичну послідовність ДНК для експресії в клітині рослини, яка кодує ТІС1103.

ЗЕО ІЮ МО: 118 являє собою синтетичну послідовність ДНК для експресії в клітині рослини, яка кодує ТІС845.

ЗЕО ІЮ МО: 119 являє собою синтетичну послідовність ДНК для експресії в клітині рослини, яка кодує ТІС846.

ЗЕО ІЮ МО: 120 являє собою синтетичну послідовність ДНК для експресії в клітині рослини, яка кодує ТІС858.

ЗЕО ІЮ МО: 121 являє собою синтетичну послідовність ДНК для експресії в клітині рослини, яка кодує ТІС866.

ЗЕО ІЮ МО: 122 являє собою синтетичну послідовність ДНК для експресії в клітині рослини, яка кодує ТІС838.

ЗЕО ІЮ МО: 123 являє собою синтетичну послідовність ДНК для експресії в клітині рослини, яка кодує ТІС841.

ЗЕО ІЮ МО: 124 являє собою синтетичну послідовність ДНК для експресії в клітині рослини, яка кодує ТІС842.

ЗЕО ІЮ МО: 125 являє собою синтетичну послідовність ДНК для експресії в клітині рослини, яка кодує ТІС850.

ЗЕО ІЮ МО: 126 являє собою синтетичну послідовність ДНК для експресії в клітині рослини, яка кодує ТІС859.

ЗЕО ІЮ МО: 127 являє собою синтетичну послідовність ДНК для експресії в клітині рослини, яка кодує ТІС861.

ЗЕО ІЮ МО: 128 являє собою синтетичну послідовність ДНК для експресії в клітині рослини, яка кодує ТІС848.

ЗЕО ІЮ МО: 129 являє собою синтетичну послідовність ДНК для експресії в клітині рослини, яка кодує ТІС849.

ЗЕО ІЮ МО: 130 являє собою синтетичну послідовність ДНК для експресії в клітині рослини, яка кодує ТІС847.

Проблема в галузі боротьби з сільськогосподарськими шкідниками може бути охарактеризована як потреба в нових інсектицидних білках, які ефективні проти цільових шкідників, проявляють токсичність широкого спектра відносно цільових видів шкідників, здатні експресувати в рослинах, не викликаючи небажаних агрономічних проблем, і забезпечують альтернативний спосіб впливу в порівнянні з існуючими на сьогодні токсинами, які використовують в рослинах в комерційних цілях. В цьому документі розкриті нові химерні інсектицидні білки й розглянута кожна з цих потреб, зокрема, відносно широкого спектра лускокрилих комах-шкідників.

Щоб уникнути розвитку резистентності комах до використовуваних в цей час інсектицидним білкам, усуваючи їх недоліки, необхідні нові інсектицидні білки з різними механізмами дії (МД), а також з широким спектром дії й ефективністю для боротьби з І ерідоріега. Одним зі шляхів вирішення цієї проблеми є виявлення нових інсектицидних білків з різних біологічних джерел, переважно з бактерій, грибів або рослин. Іншим підходом є перестановка сегментів між різними

Ві-білками, які демонструють структурну подібність для створення нових химерних Ві-білків, що мають інгібуючі властивості відносно комах. Імовірність створення химерного білка з покращеними властивостями рекомбінацією доменних структур численних нативних інсектицидних кристалічних білків, відомих в цій області техніки, незначна. Див., наприклад,

Уасацеїїпе 5. Кпідні, єї аї. "А Бігаїеду ог Зп!иніпуд Митегоизв Васіїи5 Ійигіпдіеєпвів Стувіа! Ргоївїп ротаїпв". У. Есопотіс Епіото!оду, 97 (6) (2004): 1805-1813.

В цьому документі розкриті послідовності молекул рекомбінантної нуклеїнової кислоти, які кодують нові химерні інсектицидні білки. Ці інсектицидні білки враховують поточну потребу в цій області техніки в розробці додаткових токсичних інсектицидних білків з поліпшеними інсектицидними властивостями, такими як підвищена ефективність проти більш широкого спектра цільових видів комах-шкідників і різних механізмів дії. Члени цієї групи білків, включаючи наведені в цьому документі ілюстративні білки, виявляють інсектицидну активність відносно видів лускокрилих комах-шкідників.

Термін "сегмент" або "фрагмент" використовується в цій заявці для опису безперервних послідовностей амінокислот або нуклеїнових кислот, які коротше, ніж повна амінокислотна або нуклеотидна послідовність, яка описувала розкритий химерний інсектицидний білок. Сегмент або фрагмент, що виявляє інгібуючу активність відносно комах, також розкрито в цій заявці, якщо вирівнювання такого сегмента або фрагмента з відповідною ділянкою химерного інсектицидного білка призводить до ідентичності амінокислотної послідовності будь-якого відсотка фракції від близько 65 до близько 100 відсотків між сегментом або фрагментом і відповідною ділянкою химерного інсектицидного білка.

У контексті цієї заявки терміни "активна" або "активність", "пестицидна активність" або "пестицидна" або "інсектицидна активність", "інгібітор відносно комах" або "інсектицидна" відносяться до ефективності токсичного агента, такого як інсектицидний білок, в інгібуванні (інгібуванні зростання, годування, плодючості або життєздатності), пригніченні (пригніченні зростання, годування, плодючості або життєздатності), контролі (контролі зараження комахами- шкідниками, контролі інтенсивності годування комах-шкідників на певній культурі, що містить ефективну кількість інсектицидного білка), або знищення (викликають захворюваність, смертність або зниження плодючості) шкідника. Ці терміни охоплюють результат забезпечення пестицидно ефективної кількості інсектицидного білка для шкідника, при якому надання шкіднику інсектицидного білка призводить до захворюваності, смертності, зниження плодючості або затримки росту. Ці терміни також включають відлякування шкідника від рослини, тканини рослини, частини рослини, насіння, рослинних клітин або від конкретного географічного місця розташування, причому рослина може рости, в результаті надання пестицидно ефективної кількості інсектицидного білка в або на рослині. Загалом, пестицидна активність відноситься до здатності токсичного агента бути ефективним в інгібуванні росту, розвитку, життєздатності, кормової поведінки, шлюбної поведінки, плодючості або будь-якого вимірного зниження, викликаного несприятливими ефектами, в зв'язку з наданням у раціон комахи цього білка, фрагмента білка, сегмента білка або полінуклеотиду, конкретному цільовому шкіднику, включаючи, але не обмежуючись ними, комах ряду І ерідорієега. Інсектицидний білок може бути продукований рослиною або може бути застосований до рослини або до навколишнього середовища в тому місці, де знаходиться рослина. Терміни "біоактивність", "ефективний", "ефективний" або їх варіації також є термінами, які взаємозамінно використовувані в цій заявці, для опису впливу химерних інсектицидних білків відповідно до цього винаходу на цільових комах-шкідників.

Пестицидно ефективна кількість токсичного агента, якщо вона передбачена в раціоні цільового шкідника, проявляє пестицидну активність при контакті токсичного агента зі шкідником. Токсичним агентом може бути інсектицидний білок, або один або більше хімічних агентів, відомих в цій області техніки. Інсектицидні хімічні агенти та інсектицидні білкові агенти можна застосовувати окремо або в комбінації один з одним. Хімічні агенти включають, без обмежень, молекули длРНК, націлені на специфічні гени для пригнічення в цільовому шкіднику, органохлоріди, органофосфати, карбамати, піретроїди, неонікотиноїди та ріаноіди. Інсектицидні білкові агенти включають химерні інсектицидні білки, представлені в цій заявці, а також інші білкові токсичні агенти, в тому числі такі, які націлені на види лускокрилих-шкідників, а також білкові токсини, які використовуються для боротьби з іншими шкідниками рослин, такі як Сту- білкі, доступні в цій області техніки для застосування в боротьбі з видами рядів СоіІеорієга,

Твпузапоріега, Нептірієга і Ноторіега.

Передбачається, що посилання на шкідника, особливо шкідника сільськогосподарської рослини, означає шкідників культурних рослин, особливо тих лускокрилих-шкідників, які контролюються описаними химерними інсектицидними білками. Однак посилання на комаху- шкідника може також включати комах-шкідників рядів СоіІеорієга, Нетіріега і Ноторіега, а також нематод і гриби при тих умовах, коли токсичні агенти, націлені на цих шкідників, спільно локалізуються або присутні разом з химерним інсектицидним білком або білком, який має від близько 65 до близько 100 95 ідентичності з химерним інсектицидним білком.

Химерні інсектицидні білки, які розкриті в цьому документі, демонструють інсектицидну 60 активність відносно комах-шкідників з видів лускокрилих комах, включаючи імаго, лялечок,

личинок та новонароджених, а також представників ряду Нептірієга, включаючи імаго та німф.

Комахи ряду І ерідорієга, включають, без обмежень, совок лугових, совок, листокруток, і совок з родини Мосіцідає, наприклад, кукурудзяну листову совку (Зродоріега Ітидірегаа), совку малу (Зродорієега ехідца), совку латукову (Матезіга сопіїдигага), совку-іпсилон (Адгоїї5 ірзіоп), совку капустяну (Тгіспоріизіа пі), соєву совку (Рзецйдоріизіа іпсішдеп5), совку оксамитових бобів (Апіїсагзіа детитаїйаїїє), совку конюшинову (Нурепа 5сарга), тютюнову листовійку (Неїйоїтпів мігезсеп5), совку бавовняну (Аагоїї5 5,ибріетапеа), совку лугову (Рзецдаїейна ипірипсіа), совку прямокутну (Адгоїїх огіподопіа); точильників, чехлоносок, метеликів, вогнівок шишкових, гусениць метелика капустянки та піроморфід з родини Ругаїїдає, наприклад, метелика стеблового кукурудзяного (О5ігіпіа пирііаій5), метелика-вогнівку (Атуеїоїі5 ігап5йейПа), кукурудзяну вогнівку (Статбривз саїїдіпозеПйи5), лугового метелика (Негрефодгатта Іісагвізаїї5), вогнівку соняшникову (Нотоеозота еїесіеПит), точильника зернового кукурудзяного (ЕІазхтораїрив5

ІдпозеїІи5); листокруток, димчастих листокруток, плодожерок і плодових листокруток з родини

Топгісідае, наприклад, плодожерки яблуні (Судіа ротопеїІа), листовійку виноградну (Епаоріа міеапа), листовійку східну персикову (Сгарпоїйа тоїевіа), листовійку соняшнику (Зйівіта

Пеїапіпапа); і багатьох інших економічно важливих представників ряду Геріаорієга, наприклад, капустяну міль (Рішейа хуїовіейа), рожевого коробкового хробака (Ресіїпорпога доззуріеє|Іа) і шовкопряда непарного (Гутапігіа дізраг). Інші комахи-шкідники ряду Іерідорієга включає, наприклад, АіІабата агодійасеа (совка бавовняна американська), Агспір5 агдуго5ріїіа (листовійка плодових дерев), Агопір5 гозапа (листовійка різана золотиста) та інші види АгсПпір5, Спо зирргеззаїї5 (вогнівка азіатська стеблова або жовта рисова вогнівка), Спарпаіосгосіх теаіпаїї (листовійка рисова), Статриз саїїдіпозеПи5 (кукурудзяна вогнівка), Статбриз егегтейПи5 (метелик трав'яний), Оіайгаєа дгапаїозеїйа (вогнівка кукурудзяна південно-західна), Оіаїгаєа засспагаїїб (вогнівка цукрової тростини), Еагіа5 іп5ціапа (совка бавовняна єгипетська), Еагав5 міце!а (совка плямиста), Неїїсомегра аптідега (совка американська), Неїїсомегра 7еа (совка бавовняна або американська кукурудзяна совка), Неїоїпі5 мігезсеп5 (тютюнова листовійка), Негреїосдгатта

Ісагвізай5 (луговий метелик), ГоБрезіа бБоїгапа (листовійка гронова), РПуїЇоспівіїв сйгейПа (цитрусова мінуючая моль), Ріегіє Бгаззісає (білявка капустяна), Ріегіз гарає (ріпниця або білявка ріпнака), Рішеїа хуїовіеЇІа (капустяна моль), Зродорієга ехідца (совка мала), зродорієега

Ійига (азіатська бавовникова совка, азіатська бавовняна совка) та Тша абзоїша (пасльоновий мінер).

Зазначена в цій заявці "виділена молекула ДНК" або еквівалентний термін або фраза означає, що молекула ДНК являє собою молекулу ДНК, яка присутня окремо або в поєднанні з іншими композиціями, але не в її природному середовищі. Наприклад, елементи нуклеїнової кислоти, такі як кодуюча послідовність, інтронна послідовність, нетрансльована лідерна послідовність, промоторна послідовність, послідовність термінації транскрипції і т.п., які, природно, знаходяться в ДНК геному організму, не вважаються "виділеними" до тих пір, поки елемент знаходиться в геномі організму та в тому місці, де він знаходиться, в природному геномі. Проте, кожен з цих елементів та їх частини були б "виділеними" в рамках цього опису, якщо елемент не знаходиться всередині геному організму та в тому місці, де він знаходиться, в геномі, в якому він природним чином знаходиться. Саме так нуклеотидна послідовність, що кодує інсектицидний білок або будь-який інсектицидний варіант цього білка, який зустрічається в природі, буде являти собою виділену нуклеотидну послідовність, якщо нуклеотидна послідовність не перебуває у ДНК бактерії, в якій природним чином знаходиться послідовність, що кодує білок. Синтетична нуклеотидна послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність природного інсектицидного білка, буде вважатися виділеною для цілей цього розкриття. Для цілей цього розкриття будь-яка трансгенна нуклеотидна послідовність, тобто нуклеотидна послідовність ДНК, яка вставлена в геном клітин рослини чи бактерії або присутня у позахромосомному векторі, буде вважатися виділеною нуклеотидною послідовністю незалежно від того, чи присутня вона в плазміді або подібній структурі, що використовується для трансформації клітин, в геномі рослини або бактерії або присутній в кількостях, які виявляються в тканинах, потомстві, біологічних зразках або продуктах, отриманих з рослини або бактерії.

Як описано далі в прикладах, за допомогою хімерогенеза з доменів протоксину та токсину відомих інсектицидних токсинів (які називаються в цьому документі "вихідні білки") сконструювали близько восьмисот сорок чотири (844) нуклеотидних послідовностей, які кодують химерні інсектицидні білки, і експресували та проводили випробування в біотесті на активність відносно лускокрилих. Невелика кількість сконструйованих химерних інсектицидних білків продемонструвала поліпшену активність відносно лускокрилих або посилений спектр відносно лускокрилих в порівнянні з вихідними білками, з яких були отримані його токсинові компоненти.

Ці нові химерні інсектицидні білюим з підвищеною активністю відносно лускокрилих або посиленим спектром відносно лускокрилих були сконструйовані з наступних протоксинових і токсинових доменів вихідних інсектицидних білків: СгутАйп (домен Ї), Сту1!ВБ1 (домени | і |),

Сту!Ве2 (домени І і ІІ), СтуМШа! (домени І ї Ії), СтуїРа1 (домени І ї ІІ), СтулАс (домен І і протоксин), СтуїСа (домен ІІ ї протоксин), СтуїКа (домен ІІ ії протоксин), Стуїух (домен І),

СтутАБбБ (домен І), СтултАбБЗ (протоксин), СтуїОаї1 (протоксин), Сгу4 (протоксин), Сгу9 (протоксин), Сту1Ве (протоксин) і СтуїКа (протоксин).

Зокрема, нові химерні інсектицидні білки відповідно до цього винаходу з підвищеною активністю відносно лускокрилих або посиленим спектром відносно лускокрилих включають такі комбінації протоксину та доменів: ТІС1100/5ЕО ІЮ МО: 4 (домен І-СгутАйЙ, домен ІІ-СтутАс, домен ПІ-СтуїСа, протоксин-СтуТАс), ТІС860/5ЕО ІЮ МО: 7 (домен І-Стгу!ВЬ1, домен ІІ-Сту! ВВ, домен ІПІ-СтуїСа, протоксин-СтуТтАс), ТІС867/5ЕО ІО МО: 10 (домен І-Сту!Вег, домен 1ІІ-Сту!1Вег, домен ПІ-СтуїКа, протоксин-СтутАрЗ), ТІС868/5БО ІЮО МО: 28 (домен І-Стгу!Ве2, домен І-

Сту!Ве2 і домен П-Стуї!Са, протоксин-СтгутАбБЗ), ТІС869 / 5ЕО ІЮ МО: 50 (домен І-Стуїдаї, домен ІПІ-Стуїда!1, домен ПІ-Сту1.)х, протоксин-Сту! АБЗ) ії ТІС836 / 5ЕБЕО ІЮ МО: 53 (домен І-

СтуїРаї1, домен ІІ-Стгуї!Ра1, домен ІПІ-СтутАБ, протоксин-Сту Ас).

Варіанти, в які вводили амінокислотні заміни або альтернативні протоксинові домени, також були сконструйовані для химерних інсектицидних білків ТІС867 і ТІС868. Зокрема, ці варіанти

ТІС867 і ТІС868 включають такі амінокислотні заміни або альтернативні протоксинові домени: ТІС867 20/5Б609 ІО МО: 13 (альтернативний протоксиновий домен Сту1!Оа1), ТІС867 21 /5БО І

МО: 16 (альтернативний протоксиновий домен Сгу4), ТІС867 22/5БО І МО: 19 (альтернативний протоксиновий домен Сгу9), ТІС867 23/5ЕБО ІЮО МО: 21 (альтернативний протоксиновий домен Сгу1Ве), ТІС867 24/5ЕБО ІО МО: 23 (альтернативний протоксиновий домен СтгуїКа), ТІС867 25/5Б60 10 МО: 25 (альтернативний протоксиновий домен СгуїкКа),

ТІС868 9/5ЕО ІО МО: 30 (амінокислотна модифікація М2405 У3430) М349Т), ТІС868 10/5ЕБО ІЮ

МО: 33 (альтернативний протоксиновий домен СгуїМра1!), ТІС868 11/56 10 МО: 36 (альтернативний протоксиновий домен Сгу4), ТІС868 12/5ЕБО ІО МО: 39 (альтернативний протоксиновий домен Сгу 9), ТІС868 13/56О ІЮО МО: 41 (альтернативний протоксиновий домен

Сту1Ве), ТІС868 14/5Е0 ІЮ МО: 43 (альтернативний протоксиновий домен СтуїКа), ТІС868 15 /

ЗЕО ІЮ МО: 45 (альтернативний протоксиновий домен Сгуї!Са) і ТІС868 29/5Б60 ІЮ МО: 47 (модифікація амінокислоти О136У У3430) М349Т).

Як продемонстровано в прикладах, у кожного з цих варіантів ТІС867 і ТІС868 змінена активність відносно лускокрилих та/або знижений спектр активності вихідного химерного інсектицидного білка відносно лускокрилих, вказуючи, таким чином, на те, що альтернативний протоксиновий домен і амінокислотні заміни мали прямий вплив на інсектицидну активність та спектр химерних інсектицидних білків ТІС867 і ТІС868.

Багато з химерних інсектицидних білків демонструють інсектицидну активність відносно численних видів лускокрилих комах-шкідників. Зокрема, нові химерні інсектицидні білки, які розкриті в цій заявці, проявляють активність відносно одного або більше з таких лускокрилих комах-шкідників: совки оксамитових бобів (УВС, Апіїсагзіа детіпаїаїй5), вогнівку цукрової тростини (ЗСВ, бОіаїгаєа з5асспвагаїї5), точильника зернового кукурудзяного (І 5СВ, ЕІазтораїрив

Ідпозеїйи5), американської кукурудзяної совки (СЕМУ, Неїїсомегра 7еа), соєвої совки (ЗРУУ,

Неїїсомегра 7еа), совки бавовняної СВМУМ, Неїїсомегра 7еа), совки тютюнової (ТВМУ, Неїоїтів мігезсеп5), соєвої совки (5ВІ, СПгузодеїхіє іпсішдеп5), совки чорної (ВГАМУ, зродоріега со5тіоіде5), південної совки (ЗАММ, Зродорієга егідапіа), кукурудзяної листової совки (БАМУ,

Зродорієга Ігидірегда), совки малої (ВАМУ, Зродоріега ехідца), совки американської (ОВУУ,

Неїїсомегра агтідега), совки азіатської бавовняної (ОЇМУ, Бродоріега Ійига), рожевого коробкового хробака (РВУМ, Ресііпорпога доззурієїЇа), південно-західного кукурудзяного метелика (ЗМУСВ, Оіаїйтаєа дгапаійобзеМПйа), совки плямистої (ЗВУМ, Еагіа5 мйейа), південноамериканської совки (ЗАВМУ, Неїїсомегра деІоїореоп), та п'ядуна соняшникового (5БРЇ.,

Каспіріизіа пи). Таким чином, ілюстративні білки, описані в цій заявці, пов'язані спільною функцією та проявляють інсектицидну активність відносно видів комах-шкідників із ряду

І ерідорієега, включаючи імаго, личинок і лялечок.

Білки, які мають схожість з химерними інсектицидними білками, можуть бути ідентифіковані шляхом порівняння один з одним із використанням різних комп'ютерних алгоритмів, відомих в цій області техніки. Наприклад, ідентичність амінокислотних послідовностей білків, зв'язаних з химерними інсектицидними білками, може бути проаналізована з використанням вирівнювання

Сінияїа! МУ з використанням цих параметрів за замовчуванням: матриця порівняння: Біозит, штраф на внесення делеції в вирівнювання: 10,0, штраф на продовження делеції: 0, 05, 60 гідрофільні делеції: увімк., гідрофільні залишки: СРОМООЕКК, штраф на залишкоспецифічні делеції: увімк. (Тпотрз5оп, еї аі/ (1994) Мисіеіс Асій5 Кезеагсі, 22:4673-4680). Відсоток ідентичності амінокислот далі розраховують у вигляді виразу 10095 помножених на (ідентичності амінокислот/довжина бажаного білка). Інші алгоритми вирівнювання, також доступні в цій області техніки і забезпечують результати, аналогічні результатам, які отримані з використанням вирівнювання Сіизіа! МУ, і розглянуті в цій заявці.

Передбачається, що бажаний білок, який проявляє інгібуючу активність відносно комах, розкритий в цій заявці, якщо вирівнювання такого бажаного білка з досліджуваними химерними інсектицидними білками, зазначеними в ЗЕО ІЮ МО: 4, 7, 10, 13, 16, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 33, 36, 39, 41, 43, 45, 47, 50, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109 и 111 дає в результаті щонайменше близько 64 95, 65 9, 66 95, 67 то, 68 95, 69 в, 70 90, 71 96, 72 95, 73 ув, 7490, 75 о, бю, 77 о, 78 Уо, 79 ую, 80 Ус, 81 Уо, 82 Ор, 83 У, 84 95, 85 У, 86 95, 87 У, 88 95, 89 У, 90 9, 91 У, 92 Ус, 93 У, 94 Ус, 95 У, 96 Ус, 97 У, 98 9, 99 95 або близько 100 95 ідентичності амінокислотної послідовності (або будь-який відсоток в цьому діапазоні) між шуканим і досліджуваним білком.

Як описано далі в прикладах цієї заявки, синтетичні або штучні послідовності, що кодують химерні інсектицидні білки, були сконструйовані для застосування в рослинах. Ілюстративні синтетичні нуклеотидні послідовності, які були сконструйовані для застосування в рослинах, зазначені в ЗЕО ІЮ МО: 2 і З (ТІС1100), 5ЕО ІЮ МО: 6 (ТІС860), 5ЕО ІО МО: 9 (ТІС867), 5ЕО І

МО: 12 (1ІС867 20), 5ЕО ІЮО МО: 15 (ТІС867 21), 5ЕО ІЮО МО: 18 (ТІС867 22), 5ЕО І МО: 20 (ТІС867 23), БЕО І МО: 22 (ТІС867 24), БО І МО: 24 (ТІС867 25), 5ЕО ІЮ МО: 27 (ТІС868),

ЗЕО ІЮ МО: 29 (ТІС868 9), 5ЕО ІО МО: 32 (ТІС868 10), 5ЕО І МО: 35 (ТІС868 11), 5ЕО І МО: 38 (ТІС868 12), 5ЕО 10 МО: 40 (ТІС868 195), 5БО І МО: 42 (ТІС868 14), 5БО ІЮО МО: 44 (ТІС868 15), 5ЕО ІЮ МО: 46 (ТІС868 29), 5ЕО І МО: 49 (ТІС869) і БЕО ІЮ МО: 52 (ТІС836), 5ЕО

ІО МО: 112 ї 113 (ТІС713), ЗЕО ІО МО: 114 (ТІС843), ЗЕО ІЮ МО: 115 (ТІС862), 5ЕО ІО МО: 116 (ТІС1099), БЕО ІЮ МО: 117 (ТІС1103), 5ЕО ІО МО: 118 (ТІС845), 5ЕО ІЮО МО: 119 (ТІС846), 5ЕО

ІО МО: 120 (ТІС858), 5ЕО ІО МО: 121 (ТІС866), 5ЕО ІЮ МО: 122 (ТІС838), 5ЕО ІЮ МО: 123 (ТІС841), 5ЕО ІЮ МО: 124 (ТІС842), 5ЕО ІЮ МО: 125 (ТІС850), 5ЕО І МО: 126 (ТІС859), 5ЕО І

МО: 127 (ТІС861), 5ЕБО ІО МО: 128 (ТІС848), 5БО ІО МО: 129 (ТІС849), і 5БО ІО МО: 130 (ТІС847).

Для експресії в рослинних клітинах химерні інсектицидні білки можуть експресуватися так, щоб вони знаходилися в цитоплазмі або були націлені на різні органели рослинної клітини.

Наприклад, націлювання білка на хлоропласт може призводити до збільшення рівнів експресії білка в трансгенній рослині, запобігаючи появі ознак інших фенотипів. Націлювання може також призводити до підвищення резистентності до шкідників у трансгенного об'єкта. Цільовий пептид або транзитний пептид являє собою короткий пептидний ланцюг (довжиною 3-70 амінокислот), який спрямовує перенесення білка в певну область клітини, включаючи ядро, мітохондрії, ендоплазматичний ретикулум (ЕР), хлоропласт, апопласт, пероксисом і плазматичну мембрану.

Деякі сигнальні пептиди відщеплюються від білка під дією сигнальної пептідази після транспортування білків. Для націлювання на хлоропласт, білки містять транзитні пептиди, які містять близько 40-50 амінокислот. Для опису застосування хлоропластних транзитних пептидів, див. патенти США МоМо 5188642 та 5728925. Багато з локалізованих на хлоропласті білків експресуються з ядерних генів як попередники і націлені на хлоропласт транзитним пептидом хлоропласта (ТПХ). Приклади таких виділених хлоропластних білків включають, без обмежень, такі, які зв'язані з малою субодиницею (МСУ) рибулозо-1,5,-бісфосфаткарбоксілази, ферредоксином, ферредоксин-оксидоредуктазою, білком ! і білком І/| світлозбирального комплексу, тіоредоксином Е, енолпіруват шикімат фосфатсінтазою (ЕПШФС) і транзитними пептидами, описаними в патенті США Мо 7193133. В умовах іп хмімо і іп міо було продемонстровано, що нехлоропластні білки можуть бути націлені на хлоропласт з використанням білкових гібридів з гетерологічним ТПХ і що наявність ТПХ достатьно для націлювання білка на хлоропласт. Включення відповідного хлоропластного транзитного пептиду, такого як ЕПШФС ТПХ Агабідорзів Інаійапа (ТПХ2) (див. Кієе еї аї., Мої. Сеп. Сепеї. 210:437-442, 1987) або ЕПШФС ТПХ Рейшпіа Нубгіа (ТПХ4) (див., деїМПа-Сіорра еї а!., Ргос. Маї!).

Асад. Осі БА 83: 6873-6877, 1986) було показано, що вони націлюють гетерологічні послідовності білла ЕПШФС на хлоропласти в трансгенних рослинах (див., патенти США МоМо 5627061, 5633435 та 5312910 і ЕР 0218571, ЕР 189707, ЕР 508909 і ЕР 924299). Для націлювання химерних інсектицидних білків на хлоропласт, послідовність, який кодує транзитний пептид хлоропласта, розташована 5'-кінці у функціональному зв'язку і в рамці до синтетичної кодуючої послідовності, що кодує химерний інсектицидний білок, який був сконструйований для оптимальної експресії в рослинних клітинах.

Експресійні касети та вектори, що містять ці синтетичні або штучні нуклеотидні послідовності, конструювали та вводили в клітини рослин кукурудзи, бавовнику та сої відповідно до способів та методик трансформації, відомих в цій галузі техніки. Трансформовані клітини регенерували в трансформовані рослини, які, як було виявлено, експресували химерний інсектицидний білок. Для перевірки пестицидної активності, біотестування проводили в присутності личинок лускокрилих-шкідників з використанням дисків з листя рослин, отриманих з трансформованих рослин. Розглядаються композиції молекул рекомбінантної нуклеїнові кислоти, які кодують химерні інсектицидні білки. Наприклад, химерні інсектицидні білки можуть бути експресувати конструктами рекомбінантної ДНК, в яких молекула полінуклеотида з ОКЕ, що кодує химерний інсектицидний білок, функціонально зв'язаний з генетичними експресійними елементами, такими як промотор і будь-яким іншим регуляторним елементом, необхідним для експресії в системі, для яких призначений конструкт. Необмежуючі приклади включають рослинний функціональний промотор, функціонально зв'язаний з синтетичним химерним інсектицидним білком, що кодує послідовності, для експресії химерного інсектицидного білка в рослинах, або ВІ - функціональний промотор, функціонально зв'язаний з послідовністю, що кодує химерний інсектицидний білок, для експресії білка в Ві-бактерії або в інших видах роду

Васійй5. Інші елементи можуть бути функціонально зв'язані з послідовностями, що кодують химерні інсектицидні білки, включаючи, без обмежень, енхансери, інтрони, нетрансльовані лідери, кодовані білкові іммобілізаційні мітки (гістидинові мітки), транслокаційні пептиди (тобто, пластидні транзитні пептиди, сигнальні пептиди), поліпептидні послідовності для посттрансляційних модифікуючих ферментів, сайти зв'язування рибосом і сайти-мішені РНКІ.

Наведені в цьому документі приклади рекомбінантних полінуклеотидних молекул включають, без обмежень, гетерологічний промотор, функціонально зв'язаний з полінуклеотидом, таким як ЗЕО ІЮ МО: 1, 2, 3, 5,6, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 29, 31, 32, 34, 35, 37, 38, 40, 42, 44, Аб, 48, 49, 51, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 і 130; який кодує поліпептид або білок, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 4 (ТІС1100), 7 (ТІС860), 10 (ТІС867), 13 (ТІС867 20), 16 (ТІС867 21), 19 (ТІС867 22), 21 (1ІС867 23), 23 (ТІС867 24), 25 (ТІС867 25), 28 (ТІС868), 30 (ТІС868 9), 33 (ТІС868 10), 36 (ТІС868 11), 39 (ТІС867 12), 41 (ТІС867 13), 43 (ТІС867 14), 45 (ТІС867 15), 47 (ТІС867 29), 50 (ТІС869), 53 (ТІС836), 55 (ТІС713), 57 (ТІС843), 59 (ТІС862), 61 (ТІС1099), 63 (ТІС1099-1507Е), 65 (ТІС1099-8522К), 67 (ТІС1099-К4905), 69 (ТІС1099-15628Н8), 71 (ТІС1099-55338), 73 (ТІС1099-2534980), 75 (ТІС1099-

К490А), 77 (ТІС1099-Е564А), 79 (ТІС1103), 81 (ТІС1101), 83 (ТІС845), 85 (ТІС846), 87 (ТІС858), 89 (ТІС865), 91 (ТІС866), 93 (ТІС838), 95 (ТІС839), 97 (ТІС841), 99 (ТІС842), 101 (ТІС850), 103 (ТІС859), 105 (ТІС861), 107 (ТІС848), 109 (ТІС849) і 111 (ТІС847). Гетерологічний промотор також може бути функціонально зв'язаний з синтетичними кодуючими послідовностями ДНК, які кодують химерний інсектицидний білок, націлений на пластиду, і ненацілений химерний інсектицидний білок. Передбачається, що кодони молекули рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодують химерний інсектицидний білок, розкритий в цьому документі, можуть бути замінені синонімічні кодонами (відомими в цій області техніки як мовчазні заміни).

Молекула рекомбінантної ДНК або конструкт, який містить послідовність, що кодує химерний інсектицидний білок, може додатково містити область ДНК, яка кодує один або більше токсичних агентів, які можуть бути сконструйовані для одночасної експресії або коекспресії з послідовністю ДНК, що кодує химерний інсектицидний білок, відмінний від химерного інсектицидного білка, молекулу длРНК, що має інгібуючу активність відносно комах, або допоміжний білок. Допоміжні білки включають, без обмежень, кофактор, ферменти, партнери по зв'язуванню або інші агенти, які діють з метою підвищення ефективності агента, який має інгібуючу активністю відносно комах, наприклад, шляхом впливу на його експресію, впливу на його стабільність в рослинах, оптимізації вільної енергії для олігомеризації, збільшуючи його токсичність і збільшуючи спектр його активності. Допоміжний білок може полегшувати захоплення одного або більше агентів, що мають інгібуючий вплив на комах, наприклад, або посилювати токсичний ефект токсичного агента.

Рекомбінантну молекулу ДНК або конструкт можна сформувати так, щоб всі білки або молекули длРНК експресувалися від одного промотору, або кожен білок, або молекула длРНК перебувала під контролем окремого промотору, або деякої їх комбінації. Білки за винаходом можуть бути експресовані системою множинної експресії генів, в якій сконструйований інсектицидний білок експресується із загального нуклеотидного сегмента, який також містить інші відкриті рамки зчитування і промотори, залежно від вибраного типу системи експресії. 60 Наприклад, бактеріальна система множинної експресії генів може використовувати єдиний промотор для керування експресією багатократнозв'язаних/лгандемних відкритих рамок зчитування з одного оперону (тобто, поліцистронної експресії). В іншому прикладі рослинна система множинної експресії генів може використовувати багатократнозв'язані експресійні касети, кожна з яких експресує інший білок або інший токсичний агент, такий як одна або більше молекул длРНК.

Рекомбінантні молекули нуклеїнової кислоти або рекомбінантні конструкти ДНК, що містять послідовність, яка кодує химерний інсектицидний білок, можуть бути доставлені в клітини-хазяї за допомогою векторів, наприклад, плазмідного, бакуловірусного, синтетичної хромосоми, віріону, космідного, фагмідного, фагового або вірусного вектора. Такі вектори можуть бути використані для досягнення стабільної або транзієнтної експресії послідовності, що кодує химерний інсектицидний білок, в клітині-хазяїні, або подальшої експресії кодованого поліпептиду. Екзогенний рекомбінантний полінуклеотид або конструкт рекомбінантної ДНК, який містить послідовність, що кодує химерний інсектицидний білок, і який вводиться у клітину- хазяїна, згадуваний в цьому документі як "трансген".

У цьому документі запропоновано трансгенні бактерії, трансгенні клітини рослин, трансгенні рослини і трансгенні частини рослин, які містять полінуклеотид, що кодує будь-який один або більше химерних інсектицидних білків. Термін "бактеріальна клітина" або "бактерія" може включати, без обмежень, клітину видів родів Адгобасіегішт, Васійи5, Евспегіспіа, ЗаІтопеїа,

Рзейдотопах або ЕПігорішт. Термін "клітина рослини" або "рослина" може включати, без обмежень, клітину дводольної рослини або клітину однодольної рослин. Розглянуті рослини і клітини рослин включають, але не обмежуються ними, люцерну, банан, ячмінь, боби, броколі, капусту, капусту декоративну, моркву, маніок, рицину, капусту кольорову, селеру, нут, капусту пекінську, цитрусові, кокосовий горіх, каву, кукурудзу, конюшину, бавовник, гарбузові, огірок, сосну Дугласа, баклажан, евкаліпт, льон, часник, виноград, хміль, цибулю-порей, салат латук, сосну Лоболі, просо, дині, горіх, овес, маслину, цибулю, декоративні рослини, пальму, пасовищну траву, горох, арахіс, перець, голубиний горох, сосну, картоплю, тополю, гарбуз, сосну променисту, редис, рапс, рис, кореневищні злаки, жито, сафлор, чагарникові троянди, сорго, сосну південну, сою, шпинат, гарбуз гігантський, полуницю, цукровий буряк, цукрову тростину, соняшник, кукурудзу цукрову, ліквідамбар смолоносний, солодку картоплю, просо, чай, тютюн, томат, тритікалє, дернову траву, кавун і клітину або рослину пшениці. У деяких варіантах реалізації винаходу представлені трансгенні рослини і частини трансгенних рослин, які регенерували з трансгенної рослинної клітини. У деяких варіантах реалізації винаходу трансгенні рослини можуть бути отримані з трансгенної насінини, шляхом живцювання, відщипування, подрібнення або іншим способом роз'єднання частини з рослиною. В певних варіантах винаходу частина рослини може являти собою насінину, коробочку, лист, квітку, стебло, корінь або будь-яку їх частину або частину трансгенної частини рослини, яка регенерується. Використовуваний в цьому контексті термін частина трансгенної частини рослини, "яка не регенерується" є частиною, з якої не може бути індуковано утворення цілої рослини, або з якої не може бути індуковано утворення цілої рослини, здатної до статевого та/або вегетативного розмноження. У деяких варіантах реалізації винаходу частина частини рослини, яка не регенерується, являє собою частину трансгенної насінини, коробочки, листа, квітки, стебла або кореня.

Запропоновані способи отримання трансгенних рослин, які містять інгібуючу відносно комах

І ерідорієга кількість химерних інсектицидних білків. Такі рослини можуть бути отримані шляхом введення полінуклеотида, який кодує химерні інсектицидні білки, запропоновані в цій заявці, в рослинну клітину та відбору рослини, отримане з зазначеної рослинної клітини, яка експресує інгібуючу відносно комах або комах ряду І ерідорієга кількість інсектицидної речовини. Рослини можуть бути отримані з рослинних клітин шляхом регенерації насіння, пилку або меристеми, отриманих способами трансформації. Способи трансформації рослин відомі в цій області техніки. Наприклад, трансформація, опосередкована Адгобасіегішт, описана в публікаціях патентної заявки США, 2009/0138985А1 (соя), 2008/0280361А1 (соя), 2009/0142837А1 (кукурудза), 2008/0282432 (бавовник) та 2008/0256667 (бавовник).

Рослини, які експресують химерні інсектицидні білки, можна схрещувати шляхом селекції з трансгенними об'єктами, які експресують інші інсектицидні білки та/або експресують інші трансгенні ознаки, такі як інші ознаки для боротьби з комахами, гени стійкості до гербіцидів, гени, що підвищують врожайність або стійкість до стресу, і т.п. або ознаки можуть бути об'єднані в один вектор, так що всі ознаки будуть пов'язані між собою.

Оброблені рослинні продукти, причому процесований продукт містить кількість (придатну для виявлення) химерного інсектицидного білка, сегменти та фрагменти, що мають інгібуючу 60 активність відносно комах, або його фрагмент або будь-яку його відмінну частину, також розкриту в цій заявці. У деяких варіантах реалізації винаходу оброблений продукт вибраний з групи, що складається з частин рослини, біомаси рослини, олії, борошна грубого помелу, цукру, корму для тварин, борошна, пластівців, висівок, волокна, лузги, обробленого насіння та насіння.

У деяких варіантах реалізації винаходу оброблений продукт являє собою той, що не здатен регенеруватися. Рослинний продукт може включати товар або інші комерційні продукти, отримані з трансгенної рослини або частини трансгенних рослин, причому товар або інші продукти можна відстежити шляхом виявлення нуклеотидних сегментів або експресованих РНК або білків, які кодують або містять відмінні частини химерного інсектицидного білка.

Також в цій заявці розкриті способи боротьби з комахами, зокрема, зараженнями культурних рослин лускокрилими комахами з використанням химерних інсектицидних білків. Такі способи можуть включати вирощування рослини, що містить інгібуючу відносно комах ІГерідоріега кількість химерного інсектицидного білка. У деяких варіантах реалізації винаходу такі способи можуть додатково включати будь-яке одне або більше з наступного: (ї) застосування будь-якої композиції, яка містять або кодує сконструйований інсектицидний білок, до рослини або насінини, що призводить до утворення рослини; і (її) трансформацію рослини або рослинної клітини, що призводить до утворення рослини з полінуклеотидом, що кодує сконструйований інсектицидний білок. Загалом, передбачається, що химерний інсектицидний білок може бути забезпечений в композиції, забезпечений в мікроорганизмі, або забезпечений в трансгенній рослині, щоб забезпечити інгібуючу активність відносно лускокрилих комах.

У деяких варіантах реалізації винаходу химерний інсектицидний білок є інсектицидно активним інгредієнтом композиції, яка має інгібуючу активність відносно комах, отриманої культивуванням рекомбінантного Васійш5 або будь-якої іншої рекомбінантної бактеріальної клітини, трансформованої для експресії химерного інсектицидного білка в умовах, придатних для експресії. Така композиція може бути отримана шляхом висушування, ліофілізації, гомогенізації, екстракції, фільтрації, центрифугування, седиментації або концентрування культури таких рекомбінантних клітин, що експресують/продукують химерний інсектицидний білок. Такий процес може призводити до утворення клітинного екстракту, клітинної суспензії, клітинного гомогенату, клітинного лізату, клітинного супернатанта, клітинного фільтрату або клітинного осаду з клітин Васіїи5 або інших ентомопатогенних бактерій. Отримавши химерний інсектицидний білок, таким чином створюють, композицію, яка містить химерний інсектицидний білок, може містити бактеріальні клітини, бактеріальні спори, а також параспоральні тільця, і може поставлятися для різних застосувань, включаючи продукти-спреї, що мають інгібуючу активність відносно сільськогосподарських комах або препарати кормової біомаси, що мають інгібуючу активність відносно комах в кормових біотестах.

Вищезазначена сполука або препарат може додатково містити сільськогосподарсько прийнятний носій, такий як приманка, порошок, пил, таблетки, гранули, спреї, емульсія, колоїдна суспензія, водний розчин, спори Васійи5 або кристалічні препарати або оброблене насіння. Сполука або препарат також можуть додатково містити рекомбінантну рослинну клітину, рослинну тканину, насіння або рослину, трансформовані для експресії одного або більше білків; або бактерії, трансформовані для експресії одного або більше білків. Залежно від рівня інгібування відносно комах або інсектицидного інгібування, властивого рекомбінантному поліпептиду, і рівня сполуки або препарату, який повинен застосовуватися в аналізі рослин або раціону, з'єднання або препарат можуть містити різні масові кількості рекомбінантного поліпептиду, наприклад, від 0,0001 95 до 0,001 95, до 0,0195, до 195, до 995905 від маси рекомбінантного поліпептиду.

У варіанті реалізації винаходу для зниження ймовірності розвитку резистентності, композиція, що проявляє інгібуючу активність відносно комах, або трансгенна рослина, яка містить химерний інсектицидний білок, може додатково містити щонайменше один додатковий токсичний агент, який проявляє інгібуючу активність проти тих самих видів лускокрилих комах, але який відрізняється від химерного інсектицидного білка. Можливі додаткові токсичні агенти для такої композиції містять білок, яка має інгібуючу активність проти комах, і молекулу длРНК, яка має інгібуючу активність проти комах. Один приклад використання таких рибонуклеотидних послідовностей для боротьби з комахами-шкідниками описаний в Ваицйт, еї аї. (публікація патенту США 2006/0021087 АТ). Такий додатковий поліпептид(и) для боротьби з лускокрилими- шкідниками може бути вибраний з групи, що складається з білка, який проявляє інгібуючої активністю щодо комах, такого як, без обмежень, СтгутА (патент США Мо 5880275), Стут АБ,

СтгутАс, СтутА.105, Сту1Аеє, Сту1В (публікація патенту США 10/525318), Сту1С (патент США Мо 6033874), кримери Сгту10, Сту1Е, СтуїЕ і СтулА/Е (патенти США 7070982, 6962705 і 6713063),

Сту1б, СтуїН, СгутІ, Сгу1у, СтуїК, Стуті, Сту2А, Стгу2АБ (патент США Мо 7064249), СтугАвє, 60 Сту4аВ, Стуб, Сту7, Сту8, Сту9, Сту15, Студ4ЗА, Сту4З3В, СтубіАа!т, ЕТб66, ТІС400, ТІС800, ТІС834,

ТІС1415, МірзА, МІРЗАБ, МІРЗВ, АХМІ-001, АХМІ-002, АХМІ-030, АХМІ-035 ії АХМІ-045 (патентна публікація США 2013-0117884 Ат), АХМІ-52, АХМІ-58, АХМІ-88, АХМІ-97, АХМІ-102, АХМІ-112,

АХМІ-117, АХМІ-100 (патентна публікація США 2013-0310543 АТ), АХМІ-115, АХМІ-113, АХМІ- 005 (патентна публікація США 2013-0104259 АТ), АХМІ-134 (патентна публікація США 2013- 0167264 Ат), АХМІ-150 (патентна публікація США 2010-0160231 Ат), АХМІ-184 (патентна публікація США 2010-0004176 Ат) АХМІ-196, АХМІ-204, АХМІ-207, АХМІ-209 (патентна публікація США 2011-0030096 АТ), АХМІ-218, АХМІ-220 (патентна публікація США 2014-0245491

АТ), АХМІ-2217, АХМІ-2227, АХМІ-2237, АХМІ-2247, АХМІ-2257 (патентна публікація США 2014- 0196175 АТ), АХМІ-238 (патентна публікація США 2014-0033363 Ат), АХМІ-270 (патентна публікація США 2014-0223598 АТ), АХМІ-345 (патентна публікація США 2014-0373195 АТ), БІС-3 (патентна публікація США 2013-0219570 АТ), 0І2-5 (патентна публікація США 2010-0317569

А1), 0106-11 (патентна публікація США 2010-0319093 АТ), АПР-1А і його похідні (публікація патентної заявки США 2014-0033361 АТ), АТПР-18В і його похідні (патентна публікація США 2014- 0033361 Ат), РІР-ТАРІР-1В (патентна публікація США 2014-0007292 АТ), РЗЗЕЕМ3174 (патентна публікація США 2014-0007292 Ат), АЕСРИ-592740 (патентна публікація 2014-0007292 АТ),

Рриї 1063 (патентна публікація США 2014-0007292 АТ), Рриї 1064 (патентна публікація США 2014-0007292 АТ), 555-135 і його похідні (патентна публікація США 2012-0233726 АТ), 55153 і його похідні (патентна публікація США 2012-0192310 АТ), 55154 і його похідні (публікація патенту США 2012-0192310 АТ), 55155 і його похідні (публікація патенту 2012-0192310 АТ), 5ЕО

ІО МО: 2 і її похідні, як описано в патентній публікації США 2012-0167259 АТ, 5ЕО ІЮО МО: 2 і її похідні, як описано в патентній публікації США 2012-0047606 АТ, 5ЕО ІЮ МО: 2 і її похідні, як описано в патентній публікації США 2011-0154536 А1, 5ЕО ІЮ МО: 2 і її похідні, як описано в патентній публікації у США 2011-0112013 АТ, 5ЕО ІЮ МО: 2 і 4, ї її похідні, як описано в патентній публікації США 2010-0192256 АТ, 5ЕО ІО МО: 2 і її похідні, як описано в патентній публікації США 2010-0077507 АТ, ЗЕО ІЮ МО: 2 ії її похідні, як описано в патентній публікації

США 2010-0077508 АТ, 5ЕО ІО МО: 2 і її похідні, як описано в патентній публікації США 2009- 0313721 АТ, 5ЕО ІЮО МО: 2 або 4, і їх похідних, як описано в патентній публікації США 2010- 0269221 АТ, БЕО ІЮ МО: 2 і її похідні, як описано в патенті США Мо 7772465 (82), СЕ161 00851 його похідні, як описано в УМО 2014/008054 А2, токсичні білки до лускокрилих комах і їх похідні, як описано в патенті США 052008-0172762 АТ, О052011-0055968 А1 ії 052012-0117690 А1; 5ЕО

ІО МО: 2 ії її похідні, як описано в 57510878 (В2), БЕО ІЮО МО: 2 і її похідні, як описано в патенті

США Мо 7812129 (В1); і тому подібне.

В інших варіантах реалізації винаходу композиція або трансгенні рослини, що мають інгібуючу активність відносно комах, може додатково містити щонайменше один додатковий токсичний агент, який проявляє інгібуючу активність відносно комах-шкідників, для яких не відзначено інгібування химерними інсектицидними білками за цим винаходом (наприклад, жорстокрилих, напівжорсткокрилих і прямокрилих шкідників) з тим, щоб розширити спектр інгібуючої активності відносно комах.

Такий додатковий токсичний агент для боротьби з жорсткокрилими комахами-шкідниками може бути вибраний з групи, що складається з білка, що проявляє інгібуючу активність відносно комах, такого як, без обмежень, СтузВЬ (патент США Мо 6501009), варіанти Сту1С, варіанти

СтузЗА, Стгу3, СтуЗВ, Сту34/35, 5307, АХМІ134 (патентна публікація США 2013-0167264 А1) АХМІ- 184 (патентна публікація США 2010-0004176 АТ), АХМІ-205 (патентна публікація США 2014- 0298538 Ат), ахті207 (патентна публікація США 2013-0303440 Ат), АХМІ-218, АХМІ-220 (патентна публікація США 20140245491А1), АХМІ-2217, АХМІ-2237 (патентна публікація США 2014-0196175 АТ), АХМІ-279 (патентна публікація США 2014-0223599 АТ), АХМІ-КІ і їх варіанти (патентна публікація США 2010-0197592 АТ, ТІС407, ТІС417, ТІС431, ТІС807, ТІС853, ТІС9О1,

ТІС1201, ТІСЗ3131, 0ІС-10 (патентна публікація США 2010-0319092 АТ), енНіІРз (публікація патентної заявки США 2010/0017914) ІРЗ і його варіанти (патентна публікація США 2012- 0210462 АТ) і о-гексатоксин-Нм1а (публікація патентної заявки О52014-0366227 АТ).

Такий додатковий токсичний агент для боротьби з напівжорсткокрилими шкідниками може бути вибраний з групи, що складається з білків, що мають активність відносно напівжорсткокрилих, таких як, але не обмежуючись ними, ТІС1415 (патентна публікація США 2013-0097735 АТ), ТІС807 (патент США Мо 8609936), ТІС834 (патентна публікація США 2013- 0269060 Ат), АХМІ-036 (патентна публікація США 2010-0137216 АТ) ії АХМІ-171 (патентна публікація США 2013-0055469 А1). Додаткові поліпептиди для боротьби з жорсткокрилими, лускокрилими й равнокрилими комахами-шкідниками можна знайти на сайті номенклатури токсинів Васійи5 (пПигіпдіепоі5, що знаходиться у веденні Нілом Крікмором (у всесвітній павутині за адресою ріпотепсіайиге.іпго).

Послідовності, що кодують химерні інсектицидні білки, і послідовності, які мають значну відсоткову ідентичність з химерними інсектицидними білками, можна ідентифікувати з використанням способів, відомих фахівцям в цій області техніки, таких як полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), термічна ампліфікація та гібридизація. Наприклад, химерні інсектицидні білки можуть бути використані для отримання антитіл, які специфічно зв'язуються з білками, і можуть бути використані для скринінгу і пошуку інших білків, які тісно пов'язані.

Крім того, нуклеотидні послідовності, що кодують химерні інсектицидні білки, можуть бути використані в якості зондів і праймерів для скринінгу з метою виявлення інших представників класу з використанням методів термічного циклу або ізотермічної ампліфікації та гібридизації.

Наприклад, олігонуклеотиди, отримані з послідовностей, зазначених в ЗЕО ІО МО: 2, можуть бути використані для визначення присутності або відсутності химерного інсектицидного трансгену в зразку дезоксирибонуклеїнової кислоти, отриманої з продукту. З огляду на чутливість певних способів виявлення нуклеїнових кислот, які використовують олігонуклеотиди, передбачається, що олігонуклеотиди, отримані з послідовностей, зазначених в будь-якій з ФЕО

ІО МО: 2, можуть бути використані для виявлення відповідного химерного інсектицидного білка в продуктах, отриманих з об'єднаних джерел, де тільки частина продукту отримана з трансгенної рослини, яка містить будь-яку з БЕО ІЮО МО: 2.

ПРИКЛАДИ

Зважаючи на вищезазначене фахівцям в цій області техніки буде зрозуміло, що наступні розкриті варіанти реалізації є виключно репрезентативними для цього винаходу, який може бути реалізований в різних формах. Таким чином, конкретні структурні та функціональні деталі, розкриті в цьому документі, не слід інтерпретувати як обмеження.

ПРИКЛАД 1

Створення і клонування послідовностей, що кодують нові химерні інсектицидні білки, активні відносно лускокрилих

Цей приклад ілюструє створення нових химерних інсектицидних білків і клонування, і експресію химерних інсектицидних білків.

Послідовності рекомбінантної нуклеїнової кислоти були сконструйовані з відомих генів Сгу- білка для отримання полінуклеотидних послідовностей, які кодують нові химерні інсектицидні білки. Отримані полінуклеотидні послідовності клонували в плазмідний експресійний вектор

Васійи5 Шигіпдіеєпзіз (ВО. Після підтвердження полінуклеотидної послідовності експресійну плазміду трансформували в Ві та експресували. Препарати нових химерних білків аналізували на активність проти різних лускокрилих-шкідників.

Багато з полінуклеотидних послідовностей, що кодують химерні інсектицидні білки, були отримані й випробувані в біотесті. Не всі химерні інсектицидні білки демонстрували активність.

Тільки кілька з химерних інсектицидних білків були відібрані на підставі їх активності відносно конкретних лускокрилих, продемонстрованої в біотесті. Варіанти амінокислот, в які були введені амінокислотні заміни або альтернативні протоксинові домени, також були отримані на основі вихідних химерних інсектицидних білків ТІС867 і ТІС868. Компоненти химерних інсектицидних білків (домени І, ЇЇ й ПІ та протоксин) відповідно до цього винаходу представлені в таблиці 1.

Також представлені амінокислотні заміни в варіантах ТІС868 щодо вихідної послідовності білка

ТІС868.

Таблиця 1

Нові химерні пестицидні білки і їх компоненти

ПРТ

Токсин ЗЕО І рот! Ботег рот3 Протоксин | Амінокислотні мутації"

МО: тІСт100 14 0СуїАп |Сутас СуїСа |Суллйс | -: б тсвбо 17 Стуїврі |Сутврї оСуїа |Сулдс | г Ф Ф тСВ867 | ло о Стуїве2 |Суте2 Сука |Сул тС867 20 | 13 СтуїВе2 |Стуте?2 Сука |Сушба! | (

ТС867 21 | 16 СтуїВе2 |Суте?2 Сука |Сує

ТС867 22 | 19 СтуїВе2 |Суїте?2 Сука |Субї// тС867 23 | 21 СтуїВе2 |СтутВе?2 Сука |СуїВе

ТС867 24 | 23 СтуїВе2 |СуїтВе?2 СуїКа |Суїжа (ТСе867 25 | 25 )|СтуїВе?2 |СтуїВег2 |Суїка |Суїба

Продовження Таблиця 1 тсвб8 | 28 |СтуїтВе2 |СуїВе2 |СуїСса (Су тсвб8 10 | 33 |СтуїтВе2 |СтуїВе2 |СуїСса Суюа! тсвб8 11 | 36 |СтуїтВе2 |СуїтВе? |Суїса Су тсвб8 12 | 39 |СтуїтВе2 |СуїтВе? |Суїса Суб тсвб8 13 | 41 |Стуїте2 |СуїВе?2 |СуїСса СуВе тсвб8 14 | 43 |СтуїтВе2 |СуїВе?2 |Суїса Сука тсвб8 15 | 45 |СтуїВе2 |СуїВе?2 |Суїса Суїба тсв6б9 | 50 |Стуша! |Стуша!ї |Суцх Су (тісв36 | 53 |Стутга! |Стутгаї |Сутар (Сус | (: "Амінокислотні мутації ідентифікуються з використанням стандартного коду амінокислот

ІЮПАК. Див. Об'єднана комісія з біохімічної номенклатурі ІЮПАК-ІШВ по біохімічній номенклатурі. Номенклатура і система позначень амінокислот і пептидів. Еимг. У. Віоспет. 138:9-37(1984). Перша абревіатура амінокислотної послідовності вказує на вихідну амінокислоту в цьому каркасному білку, число вказує положення амінокислоти, а друга абревіатура амінокислотної послідовності, вказує на амінокислоту, розташовану в цьому положенні в удосконаленому варіанті білка.

ПРИКЛАД 2

Нові химерні інсектицидні білки демонструють активність проти лускокрилих-шкідників

Цей приклад ілюструє тестування химерних інсектицидних білків, описаних в прикладі 1, і активність відносно лускокрилих, що спостерігається для химерних інсектицидних білків.

Полінуклеотидні послідовності, які кодують химерні інсектицидні білки, експресували в Ві.

Експресовані химерні інсектицидні білки потім аналізували відносно різних лускокрилих, відомих як шкідники кукурудзи, цукрового очерету, сої та бавовнику, а також інших культурних рослин.

Зокрема, інсектицидні білки аналізували на активність проти совки оксамитових бобів (УВС,

Апіісагзіа деттаїйаїї5), вогнівки цукрової тростини (5СВ, бОіангаєа засспвагаїї5), точильника зернового кукурудзяного (І5СВ, ЕІазтораїризх ІдпозейПи5), совки бавовняної (СЕМУ, Неїїсомегра 7еа), тютюнової листовійки (ТВУМ, Неїоів міге5сепв5), соєвої совки (ЗВІ., Спгузодеїхів іпсійдепв), совки чорної (ВІАМУ, Зродоріега со5ітіоідев5), південної совки (ЗАМУ, Зроаоріега егідапіа), кукурудзяної листової совки (БАММ, Зродоріега Іігидірегда), совки малої (ВАМ, 5родорієга ехідца), совки американської (ОВМУ, Неїїсомегра агтідега), совки азіатської бавовняної (ОЇ МУ,

Зродоріеєга Ійига), рожевого коробкового хробака (РВУМ, Ресііпорпога доззуріеЇПа), совки-іпсилон (ВСМУ, Адгої5 ірзіоп), південно-західного кукурудзяного метелика (З5УУСВ, Оіаїгаєа дгапайіозейа), совки плямистої (ЗВУМ, Еагіає мійейа), і метелика стеблового кукурудзяного (ЕСВ, Оз5ігіпіа пибіїайв). Американська кукурудзяна совка (СЕММ, Неїїсомегра 7е6а) також називається як коробковий черв'як (ЗРУМ) і як совка бавовняна (СВУМ). Активність визначали за допомогою комбінації показників смертності й затримки росту, а також оцінки МІК5БО (мінімальна інгібуюча концентрація для 50 95). МІК5О відноситься до концентрації інгібуючої линьку, причому як мертві личинки, так і личинки 11 (личинки, які позбавлені линьки до других віків) враховуються в оцінці.

У таблиці 2 продемонстрована активність кожного химерного інсектицидного білка. Знак я вказує на активність, що спостерігається у конкретної комахи-шкідника.

Жаслиця Ї. Бізатічня зекнаність прати вабраних луквакриляв,

КЕ т 5Е о ме | чн | | т | СЕТАМ | БІА | ТВ| БК | А | КА | БА | ОБ | ОБ | вБО| ВС ОЇ БУЯЄ | ВЕС) БЕ

Токсдв : Ем З В БЖ КУ БУ ї КУ я 5 Зк Я БУ З Б В КЗ ж ТІ 1 іа я Яся нт КЕ

Посоаа ШЕЛІ ПВ По ПО ПОЛОН ПОН НБН НО КОНЯ ПОН НОЛБНОХ НОННННЯ НОНБННЯ КОНЯ КОНЯ КОНЯ НОЯ ПОН в СТ

ТВ

Щі ня

Ку 15 т Пон я поя по НО КО НІ шо т

Ж пОЖЕ.

Е теж | 58 | я Ж т ев пТСТСЇ вк о по он ПО вія ни пи по п По По НОЯ НОЯ

Як можна бачити з таблиці 2 вище, більшість химерних інсектицидних білків проявляли активність проти одного або більше видів лускокрилих-шкідників.

ПРИКЛАД З

Синтез генів, що кодують химерні інсектицидні білки, для експресії в рослинах

Цей приклад ілюструє синтез полінуклеотидів, що кодують химерні інсектицидні білки, для експресії в рослинах.

Синтетичні кодуючі послідовності були сконструйовані для застосування в експресії химерних інсектицидних білків в рослинах. Синтетичні послідовності були сконструйовані і синтезовані відповідно до способів, як правило, описаними в патенті США 5500365, уникаючи деяких невідповідних проблемних послідовностей, таких як послідовності поліаденілювання рослин, збагачені АТТТА й А/І, при збереженні амінокислотної послідовності химерного інсектицидного білка. Нуклеотидні послідовності для цих генів, що кодують химерні інсектицидні білки для експресії в рослинах, перераховані в таблиці 3.

Таблиця З

Полінуклеотидні послідовності, що кодують химерні інсектицидні білки, призначені для застосування в рослинах тІвввО11111111111111111111111111111111611111111117

НЕТ ої: У ДН КОН: ПОН КОН Кт КО

ПРИКЛАД 4

Експресійні касети для експресії химерних інсектицидних білків в рослинах

Цей приклад ілюструє конструкцію експресійних касет, що містять призначені для застосування в рослинах полінуклеотидні послідовності, які кодують химерні інсектицидні білки.

Різноманітні експресійні касети рослин були сконструйовані із застосуванням полінуклеотидних послідовностей, що кодують химерні інсектицидні білки, запропоновані в таблиці З і призначені для експресії в рослинах. Такі експресійні касети корисні для транзієнтної експресії в протопластах рослин або трансформації рослинних клітин. Типові експресійні касети були розроблені з урахуванням можливого розміщення білка всередині клітини. Один набір експресійних касет був сконструйований таким чином, щоб білок був трансльований і зберігався в цитоплазмі. Інший набір експресійних касет був сконструйований так, щоб утримувати транзитний пептид, суміжний з білком токсину, для забезпечення націлювання на органели клітини, такі як хлоропласт або пластиду. Усі експресійні касети були сконструйовані, щоб починатися на 5'-кінці з промотору, який може складатися з декількох промоторних елементів, енхансерних елементів або інших експресійних елементів, відомих фахівцям в цій області техніки, функціонально зв'язаних, для підвищення експресії трансгена. За промоторною послідовністю, як правило, послідовно розташована одна або більше лідерних послідовностей на 3"-кінці промотору. Інтронна послідовність, як правило, розташована на З "-кінці лідерної послідовності, для поліпшення експресії трансгену. Послідовність, що кодує токсин або транзитний пептид, і послідовність, що кодує токсин, як правило, розташована на 3'-кінці функціонально зв'язаного промотору, лідера і інтрону. Послідовність 3-НТО, як правило, розташована на 3'-кінці послідовності, що кодує для полегшення термінації транскрипції і забезпечення послідовності, важливою для поліаденілювання одержуваного транскрипта. Всі елементи, описані вище, були функціонально зв'язані між собою і розташовані послідовно, часто з додатковими послідовностями, використовуваними для конструювання експресійної касети.

ПРИКЛАД 5

Активність по відношення до лускокрилих химерного інсектицидного білка в стабільно трансформованій кукурудзі

Цей приклад ілюструє інгібиторну активність, що проявляється химерними інсектицидними білками відносно лускокрилих-шкідників, які експресовані рослинами кукурудзи («І запропонованими у вигляді корму для відповідних комах-шкідників кукурудзи.

Сорт кукурудзи І Н244 трансформували в бінарні вектори для трансформації, описані в прикладі 4, із застосуванням способу трансформації, опосередкованої Аадгобасіегішт.

Трансформовані клітини індукували для утворення рослин за допомогою способів, відомих в цій області техніки. Біотести з використанням дисків з листя рослин були проведені аналогічно тим, які описані в патенті США Мо 8344207. Тканину, отриману з нетрансформованих рослин сорту

І Н244, використовували в якості негативного контролю. Безліч об'єктів трансформації для кожного бінарного вектора оцінювали проти американської кукурудзяної совки (СЕМУ,

Неїїсомегра 7еа), кукурудзяної листової совки (ЕАМУ, Зродоріега Ігидірегаа), совки-іпсилон (ВСМ/,

Адкгоїїі5 ірзіоп) і південно-західного кукурудзяного метелика (ЗУУСВ, Оіаїгаєа дгапаїозепПа).

Біотести з використанням листових дисків виконували на трансгенних рослинах Ко та РЕ. поколінь. Крім того, ступінь пошкодження листя оцінювали для цілих трансгенних Е; рослин, які експресують певні химерні інсектицидні білки, заражених лускокрилими комахами-шкідниками.

ЕК: трансгенні об'єкти, які експресують ТІС860 і ТІС868, також оцінювали за активністю в полі проти ГАМУ, СЕМУ, і 5УУСВ. Результати аналізу наведені в таблиці 4. Знак - вказує на активність, що спостерігається у конкретної комахи-шкідника. Як видно з таблиці 4, більшість химерних інсектицидних білків і багато варіантів химерних інсектицидних білків демонстрували активність відносно одного або більше видів лускокрилих-шкідників.

Таблякя 4. Біотестувзнвя зктиевності Інмерного інсектинБнивого білюев ї стабільно чтранеформованої ткаБШшНнЕ лЕКТаКУКУряН. ннннипшнинининшшш

ПЕТ з ре

Тек |: | ВЕ | ЗОВ ЕВ НСВТ | ВББАЖЕ | КВТ | ЗЕ. | ЗАЖК| КАТІ вх | ВК | ОБ | ВВХЖ | ВОЖ | ев | СВ ЗВ и ВБВБ31 Ї0101101011 1 01111

По ВИ БА Б ИБОХ КОМИ КОНІ НБН НЯ НЕ КБ НБК НИК КБ НКАУ НБН НА Я

Я «6 2222 «Я 5 2 1 2 2 1

Божій й й Б МІ НОЯ БИ МИ Б Б НН Бо НИ Б Б ОМ БАКИ БА БА 2053 1 1 1 11111711 прп ппппп пп тп пп т

В ой Б НИ НИ ПОН НОЯ НИ НО ННЯ НОЯ НАННЯ КОНЯ КАН НОЯ НАННЯ НА БА

ПРИКЛАД 6

Активність відносно лускокрилих химерного інсектицидного білка в стабільно трансформованій сої

Цей приклад ілюструє інгібіторну активність, що проявляється химерним інсектицидним білком відносно лускокрилих-шкідників, які експресовані рослинами сої та запропонованим у вигляді корму для відповідних комах-шкідників.

Кодуючі послідовності для обраного химерного інсектицидного білка змінювали для експресії в рослинах, клонували в бінарний вектор для трансформації рослин, і застосовували для трансформації клітин рослини сої. Вектори для трансформації рослин містили першу трансгенну касету для експресії химерного інсектицидного білка, як описано в прикладі 4 і другу трансгенну касету для селекції трансформованих рослинних клітин, із застосуванням спектиноміцинової селекції. У деяких випадках, наприклад, в разі ТІС1100, ТІС860 і ТІС836,

послідовність, яка кодує транзитний пептид хлоропласта, була функціонально зв'язана з послідовністю, яка кодує химерний інсектицидний білок. Аналізи виконували з використанням

ТІС1100, ТІС860 і ТІС836, націленими і ненаціленими на пластиду. У таблиці 5 нижче показаний химерний інсектицидний білок і варіант ТІС867 химерного інсектицидного білка і зв'язані кодуючі послідовності, що застосовуються для експресії в стабільно трансформованій сої.

Рослинної клітини сої трансформували в бінарні вектори для трансформації, описані вище, із застосуванням способу трансформації, опосередкованої Адгобрасіегішт. В результаті трансформовані рослинні клітини індукували для формування рослин сої. Тканину листа збирали і використовували в біотесті, як описано в Прикладі 5, або, в альтернативному варіанті, ліофілізовану тканину використовували в раціоні комах для біотестів. Біотестування виконували проти ЕАМУ, південної совки (5АММУ, Зродоріега егідапіа), соєвої совки (ЗВІ, СНгузоаеїхів іпсічдеп5), коробкового хробака (5РУМ, Неїїсомегра 7еа), совки оксамитових бобів (МВС,

Апіісагзіа детітаїйаїї5), тютюнової листовійки (ТВУМ, Неїїоїйіб мігезсеп5), чорної совки (ВІ АМУ, зродорієга со5тіоіде5), точильника зернового кукурудзяного (І 5СВ, ЕІазтораїриз ІдпозейПив5) та совки американської (ОВМУ, Неїїсомегра агтідега).

У таблиці 5 показана активність відносно окремих видів лускокрилих для кожного інсектицидного білка в рослинах покоління Ко, причому "- вказує на активність. Як видно з таблійиці 5, кожен з химерних інсектицидних білків, експресованих в стабільно трансформованій сої, демонстрував активність проти кількох видів лускокрилих. Варто окремо відзначити, що варіант ТІС867, ТІС867 23 продемонстрував активність відносно 5РУУ.

Таблиця 5

Біотестування активності химерного інсектицидного білка з тканини листа стабільно трансформованої Ко сої тісто 7 Ї їх 1-5 | 5 Її 151 1511 тісвво/ ЇЇ я 1-5 | 5 Її 17 151 її тісвб7 7 ЇЇ її 5 | 5 Її 1511111 тісСвб7 20 ЇЇ 77771775 ЇЇ тісвб7 21 Ї7717171711я3 ЇЇ тісвб7 22 | 71775 ЇЇ 51111111 тісвб7 23 | її я | я | я ЇЇ тісвб7 24. |! 77175151 тісвб7 25. | 771775 ЇЇ 11111111 тсвб68 ЇЇ її ЇЇ 5 Її 17151151

ВЕТої: С: В ПОЛЯ КОНЯ ПОХОДИ НОЯ КО НН НО ОН КОКОН ОХ я КОХ тсв3б | її 5 | 5 ЇЇ 5-15 ЇЇ 1

Вибраним трансформованим об'єктам забезпечили самозапилення та отримане зерно вирощували. Тканини листа збирали з рослин покоління Кі і використовували в кормовому біотесті. Кі рослини, які експресують ТІС1100, ТІС860, ТІС867, ТІС868, ТІС869 і ТІС836, досліджували на активність проти 5АМУ, 5ВІ, 5РУМ і МВС. В таблиці 6 продемонстрована активність, що спостерігається в цих тестах. Знак" вказує на активність, що спостерігається у конкретної комахи-шкідника. Як видно з таблиці б, найбільш експресований химерний інсектицидний білок з рослин К ї покоління проявив активність відносно одного або більше видів лускокрилих.

Таблиця 6

Біотести активності химерного інсектицидного білка з тканини листа стабільно трансформованої КК. сої

ТІС1100 нин чининининнишиш чи

ТІСВбО нин чининининнишиш чи

ТІС867 ниипш нини ші

ТІСВе8 нин чининининнишиш чи

ТІСВбО нин чининининнишиш чи

ТІСВ836 низин чний

У таблиці 7 представлені результати польових випробувань, проведених в теплиці з використанням стабільно трансформованих рослин сої покоління Кі, що експресують ТІС1100,

ТІС860, і ТІС836. Види, які використовуються для зараження рослин в теплиці, включають ЗАМУ,

ЗВІ і 5РМУ. Резистентність визначали як дефоліацію в рослинах сої, яка становить менше ніж або дорівнює п'ятнадцяти відсотків. Резистентність, яка спостерігається в експериментальній клітці, відповідає резистентності, що спостерігається в тканині листя рослини сої покоління Кі, аналізу, представленого в таблиці б. Знак я- вказує на активність, що спостерігається у конкретної комахи-шкідника.

Таблиця 7

Профіль активності ТІС1100, ТІС860 і ТІС836, експресованих в сої покоління Кі, досліджуваний в польових випробуваннях в теплиці

ТІС1100 низинні

ТІСВбО низинні

ТІСВ836 нини,

Польові випробування в теплицях з використанням стабільно трансформованих рослин сої покоління Кі, що експресують ТІС867 і ТІС869, також проводили в двох різних місцях в Аргентині, в Асеведо та Фонтесуеєеле. Види, які використовуються для зараження рослин в теплицях, включають американську совку (БАВММ, Неїїсомегра деІоїореоп), МВС, ВІ АМУ, і п'ядуна соняшникового (5РЕЇ,

Каспіріизіа пи). Резистентність визначали як дефоліацію в рослинах сої, яка становить менше ніж або дорівнює п'ятнадцяти відсотків. В таблиці 8 нижче показана резистентність, що спостерігається. Знак вказує на активність, що спостерігається у конкретної комахи-шкідника.

Як показано в таблиці 8, трансгенні рослини сої, які експресують ТІС867, продемонстрували резистентність до ВІАМУ і МВС. Трансгенні рослини сої, які експресують ТІС869, продемонстрували резистентність до ЗАВММ, ЗЕ, ВІ АМУ, і МВС.

Таблиця 8

Профіль активності ТІС867 і ТІС869, експресованих в сої покоління Кі, тестували в польових випробуваннях в теплиці 11071011 Асеведо////// | ///////// Фонтесуєла./7///:З"«ИС

ЗАВМУ ЗАВМУ ВІ-АМУ/

ТІС867 нн я Я Я ПО Я ПО

ТІСВбО пи п ПЕ Я ПО Я ПО я ПО о

ПРИКЛАД 7

Активність відносно лускокрилих химерного інсектицидного білка в стабільно трансформованому бавовнику

В цьому прикладі показана інгібіторна активність, що проявляється химерним інсектицидним білком проти лускокрилих комах-шкідників, при експресії в рослинах бавовнику, і запропоновані в якості корму для відповідних комах-шкідників.

Кодуючі послідовності для вибраного химерного інсектицидного білка змінені для експресії в рослинах, клонували в бінарний вектор для трансформації рослин, і застосовували для трансформації клітин рослини бавовнику. Отримані бінарні вектори були схожі на ті, що описані в прикладі 4, і їх використовували, щоб експресувати ТІС860, націлені і ненацілені на пластиди, (кодуюча послідовність: ЗЕО ІЮО МО: 6; послідовність білка: БЕО ІЮО МО: 7), ТІС867 (кодуюча послідовність: ЗЕО ІО МО: 9; послідовність білка: ЗЕО ІЮО МО: 10), ТІС868 (кодуюча послідовність: ЗЕО ІЮ МО: 27; послідовність білка: 5ЕО ІЮ МО: 28) і ТІС867 23 (кодуюча послідовність: зЕО ІЮ МО: 20; послідовність білка: ФЕО ІЮ МО: 23).

Рослинні клітини бавовнику трансформували за допомогою способу трансформації, опосередкованої Адгобасіегішт. Трансформовані клітини бавовнику індукували для формування цілих рослин. Тканину листя бавовнику використовували в біотестуванні, як описано в прикладі 5, проти совки бавовняної (СВУМ, Неїїсомегра 7еа), ЕАМУ, ТВУМ і 5ВІ. У таблиці 9 продемонстрована активність, яка спостерігається відносно цих видів лускокрилих для ТІС860,

ТІС867, і ТІС868 в стабільно трансформованому бавовнику покоління Ко, причому "- вказує на активність. Як видно з таблиці 9, ТІС860, ТІС867, і ТІС868 продемонстрували активність відносно двох або більше видів лускокрилих комах-шкідників в стабільно трансформованому бавовнику покоління Ко.

Таблиця 9

Біотестування активності ТІС860, ТІС867 і ТІС868 з листової тканини стабільно трансформованого бавовнику покоління Ко

НЕТ ої: То ПНЯ ПОН КО ННЯ КОН КО

НЕТ: Гі: ПНЯ ПОН КО ННЯ КОН НО

Вибрані трансформовані об'єкти використовували для того, щоб отримати К.: насіння. Кі рослини, які експресують ТІС860, ТІС867, і ТІС868, досліджували на резистентність до СВМУ,

ЕАМУ, ТВУУ, і ВІ. Тканини листа, бутона і коробочки використовували в аналізі. В таблиці 10 продемонстрована активність, що спостерігається в цих тестах. Знак" вказує на активність, що спостерігається у конкретної комахи-шкідника. Як показано в таблиці 10, ТІС860 продемонстрував активність проти ЕАМУ в тканини листя. Крім того, химерний інсектицидний білок ТІС867 продемонстрував активність проти СВМУ і ЕАМУ в тканині листя, бутону і коробочки, а також ТВУУ і ЗВІ. в листях. Химерний інсектицидний білок ТІС868 продемонстрував активність проти ГАМУ в тканинах листа, бутону і коробочки, а також ТВУУ і ЗВІ. в листях.

Таблиця 10

Біотестування активності химерного інсектицидного білка з тканини листа стабільно трансформованого ЕК: бавовнику 11111117 свмМ11111117 11111711 РАМ 7777 | тв | Ві тісвво | 7 Ї77117ї11111111171Ї1я5 11111111 свв | (ЇЇ (Її 5 5 | 5-1

ПРИКЛАД 8

Клонування послідовностей, які кодують нові химерні інсектицидні білки, активні відносно лускокрилих

Послідовності рекомбінантних нуклеїнових кислот були сконструйовані з відомих генів Сгу- білка для отримання кодуючих послідовностей, які кодують нові химерні інсектицидні білки.

Отримані кодучі послідовності клонували в плазмідний експресійний вектор Васіїйи5 (пигіпдіепвів (ВО. Після підтвердження клонованої послідовності експресійну плазміду трансформували в Ві і експресували. Препарати нових химерних Сгу-білків досліджували на активність проти різних лускокрилих-шкідників. Багато кодуючих послідовностей, які кодують химерні інсектицидні білки, були отримані і випробувані в біоаналізі. Не всі химерні інсектицидні білки демонстрували активність. Тільки декілька з химерних інсектицидних білків були відібрані на підставі їх активності відносно конкретних лускокрилих і представлені нижче в таблиці 11.

Таблиця 11

Нові химерні пестицидні білки та їх відповідні бактеріальні кодуючі послідовності та послідовності білка тІствяя 11111116 Ї111111116бс1

Те БТ:Х ПОН КОН. ПОН КОН: НО

НЕТ: 1: ПН КОН ООН КОН: у ДО

НЕТ: 1 НН КОН: КОНЯ КОН: 7: ХО

НЕТ: 1: ННЯ КОНТ ПОН КОН: х НО

Ів 1111111111111111111111111119611111111171Ї1111111111971 ес: КУ ОД ПОН С: ПОН КОН: 7: ПОН

ПРИКЛАД 9

Нові химерні інсектицидні білки демонструють активність проти лускокрилих-шкідників

Кодуючі послідовності, які кодують химерні інсектицидні білки, експресували в Ві. Потім експресовані білки аналізували відносно різних І ерідорієга, відомих як шкідники кукурудзи, цукрового очерету, сої та бавовнику, а також інших культурних рослин. Інсектицидні білки аналізували на активність проти совки оксамитових бобів (МВС, Апіїсагвіа деттаїаїї5), вогнівки цукрової тростини (З5СВ, Оіайгаєа засспагаїї5), точильника зернового кукурудзяного (І5СВ,

ЕІазтораїрих Імщдпозеїйи5), коробкового черв'яка (СЕМУ, Неїїсомегра 7еа), тютюнової листовійки (ТВУМ, Неїйоїйі5 мігезсеп5), соєвої совки (ЗВГ, СПгузодеїхіз іпсіцдеп5), чорної совки (ВІГАМУ, зродорієга соз5тіоідев5), південної совки (ЗАМУ, зродоріега егідапіа), кукурудзяної листової совки (ЕАМУ, зродоріега Ігидірегада), совки малої (ВАМУ, 5родоріега ехідца), совки американської (ОВУУ,

Неїїсомегра агтідега), азіатської бавовняної совки (ОЇМУ, Бродоріега Ійига), рожевого коробкового хробака (РВМУ, Ресііпорпога доззурієїЇа), совки-іпсилон (ВСМУ/, Адгоїї5 ірвійоп), вогнівки кукурудзяної південно-західної (ЗМУСВ, Оіаїгаєа дгапаїозеПйа) та мотилка стеблового кукурудзяного (ЕСВ, О5ігіпіа пибійаій5). Американська кукурудзяна совка (СЕМУ, Неїїсомегра 2еа) також називається як коробковий черв'як (5РМУ) і совка бавовняна (СВУМ). Активність визначали за допомогою комбінації показників смертності і затримки росту, а також оцінки МІК5О. МІКбО відноситься до концентрації інгібуючої линьку, причому як мертві личинки, так і личинки 11 (личинки, які позбавлені линьки до других віків), враховуються в оцінці. У таблиці 12 нижче показана активність кожного химерного інсектицидного білка. Знак вказує на активність, що спостерігається у конкретного комахи-шкідника.

Таблиця 12

Біологічна активність проти вибраних І ерідоріега 11011110 Комаха.7//////7/771111111111С

ПРТ

5ЕО се

І МВОЇ СВ 5СВ)| ЗР ТВ ВІ) ВІ АУМ ЗАМ РАМУ ВАМ/ ОВУ ОЇ М РВУМ ВСУМ ЗУУСВІ ЕСВ , Сву

МО: 55Б/Іч|«|ч |||: | | ||| || | 5 з 571 ч:| «|з | «| «ЇЇ | | ї1-5| || /- 59: «| | «| «Її! |! | | Її її ве: |-5| Ї5:|Ї5 7951:|5Ї |-|-515:|5| | (||| 55| 5 81:15 | ЇЇ 1:51 її 1 1 її 1 1 1 831: | ЇЇ 1-Ї 1: 15| | 1551 1 85 -|Ї | ЇЇ 1-7 1:51 1 ЇЇ 111 її 871: | ЇЇ 1-А,Ї 1:11 15| 1551 1 891. «|| ||| «5-51 | | Її Її ЇЇ е1:|-5Ї ЇЇ ЇЇ 1-7 1 11 | 1111 1 9/5 |: 1 її 1 її її 1 1 1 1 851: | Її ЇЇ 51: 1 | її 1 1 971: | ЇЇ 1: її 1 1 її 11 1 895: 5| | ||| «є || я я | «| | | «| 5 111, ГГ | 1 1:11 11 11 10315 | |: || | 1 ло5 ЇЇ 1 1 1-71 1:11 її 11 1 107155 || -|:| | || | «51 її 109915! || -/|:| | | хї-| | «5 її 1711-51 1 151, 1:11 1151 1

Як можна бачити з таблиці 12 вище, все химерні інсектицидні білки проявляють активність проти декількох видів лускокрилих комах.

ПРИКЛАД 10

Варіанти амінокислот ТІС1099 демонструють активність по відношенню до лускокрилих

Кодуючу послідовність для ТІС1099 (5ЕО ІЮ МО: 60) модифікували відомими в цій галузі техніки способами для зміни конкретних амінокислот з вихідної білкової послідовності ТІС1099 (ЗЕО ІО МО: 61). Отримані варіанти досліджували на активність проти вибраних І ерідоріега. У таблиці 13 нижче показані варіанти ТІС1099 і відповідні ДНК і білкові ФЕО ІЮ МО.

Таблиця 13

Варіанти ТІС1099 ее: Ехо: В ПО ООН КО су" ОО ее: ЕВ: 15 Я ПОН: ЗОН КОН с: ПО

Для кожного варіанта досліджували смертність і затримку росту кукурудзяної листової совки (ЕАМУ, Зродорієега Ігидірегаа), американської кукурудзяної совки (СЕМУ, Неїїсомегра 7еа), совки- іпсилон (ВСМУ, Адгоїз ірзіоп), соєвої совки (ЗВГ, Спгузоавеїхі5 іпсійдепв) та вогнівки кукурудзяної південно-західної (ЗМУСВ, Оіайгаєа дгапаійобеПа). У таблиці 14 нижче показана активність відносно кожного лускокрилого-шкідника. Активність оцінували від «й» до «ї--» залежно від відсотка смертності.

Таблиця 14

Активність варіантів ТІС1099 відносно І ерідорієга

ПІСт099-Т7Бб2А 11110169 хз | зх53 | зх | їх 1113

Всі варіанти ТІС1099 продемонстрували активність проти п'яти тестованих видів

І ерідоріегап. Декілька варіантів продемонстрували більш низьку активність у порівнянні з іншими для конкретних шкідників.

ПРИКЛАД 11

Химерні інсектицидні білки, експресовані в стабільно трансформованій кукурудзі, демонструють активність відносно лускокрилих-шкідників.

Синтетичні кодуючі послідовності конструювали для експресії кодованого білка в рослинах, клонували в бінарний рослинний вектор для трансформації, і використовували для трансформації клітин рослини кукурудзи. Вектори для трансформації рослин містять першу трансгенну касету для експресії химерного інсектицидного білка, який містить конститутивний промотор, функціонально зв'язаний 5' з лідером, функціонально зв'язаним 5' з інтроном, функціонально зв'язаним 5' з послідовністю, яка кодує химерний інсектицидний білок, який в свою чергу функціонально зв'язаний 5' з 3-НТО; і другу трансгенну касету для селекції трансформованих клітин рослин із застосуванням гліфосатной селекції. Нижче в таблиці 15 показані послідовності, що кодують химерні інсектицидні білки, що застосовуються для експресії в кукурудзі та відповідні ФЕО ІЮ МО.

Таблиця 15

Послідовності, які кодують інсектицидні білки, та відповідні ФЕО ІЮ МО ес: КУ ОДН КО КУ КО: С ПОН

Сорт кукурудзи ГН244 трансформували за допомогою бінарних векторів для трансформації, описаних вище, із застосуванням способу трансформації, опосередкованої Адгобасіегішт.

Трансформовані клітини індукували для формування рослин за допомогою методів, відомих в цій області техніки. Біотести з використанням листових дисків рослини виконували за аналогією з тими, які опісані в патенті США Мо 8344207. Тканину, отриману з нетрансформованих рослин сорту ГН244, використовували в якості негативного контролю. Безліч об'єктів трансформації для кожного бінарного вектора оцінювали проти американської кукурудзяної совки (СЕМУ,

Неїїсомегра 7єа), кукурудзяної листової совки (ЕАММ, Зродоріега їгидірегаа), совки-іпсилон (ВСУУ,

Адгоїіх ірзйоп) і вогнівки кукурудзяної південно-західної (5МУСВ, Оіамгаєа дгапаїйозейа).

Результати аналізу показані в таблиці 16, де «я» позначає активність.

Таблиця 16

Біотестування активності химерного інсектицидного білка зі стабільно трансформованої тканини листа кукурудзи кет АЄ ПИ ПОП ОНИ НО ОН НОЯ КО о: ЕЕ В ПОП ОНИ НО ОН НОЯ КО

ВЕТої: У Я ПОП ОНИ НО ОН НОЯ КО ех БТ: х НН ПО ОНИ ОО ОН НОЯ КО

НЕТ: КН ПО ОНИ НО ОН НОЯ КО ої: ЕТ ПО ОНИ НО ОН НОЯ КО

НЕТ: 1: ПНЯ ПО ОНИ ОО ОН НОЯ КО

НЕТ: 1: ННЯ ПО ОНИ ОО ОН НОЯ КО

ВТої: КІ: ПНЯ ПОН КО ОН НОЯ КО

ВЕТої: СУ ПНЯ ПО ОНИ ОО ОН НОЯ КО

ВЕТої: БТ ПНЯ ПО ОНИ ОО ОН НОЯ КО ої: С НЯ ПО ОНИ НО ОН НОЯ КО

ПЕТ ої: ся ПОН НО ОНИ ОО ОН НОЯ КО ої: 21: ПНЯ ПО ОНИ ОО ОН НОЯ КО ог: КС Я ПО ОНИ НО ОН НОЯ КО ої: СУ ДОН ПОН КО ОН НОЯ КО

Як можна бачити в таблиці 16 вище, всі химерні інсектицидні білки продемонстрували активність проти двох або більше видів лускокрилих-комах.

ПРИКЛАД 12

Химерні інсектицидні білки, експресовані в стабільно трансформованій сої, демонструють активність відносно лускокрилих-шкідників.

Кодуючі послідовності для вибраного химерного інсектицидного білка змінювали для експресії в рослинах, клонували в бінарний вектор для трансформації рослин, і застосовували для трансформації клітин рослини сої. Вектори для трансформації рослин містять першу трансгенну касету для експресії химерного інсектицидного білка, який містить конститутивний промотор, функціонально зв'язаний 5' з лідером, функціонально зв'язаним 5' з кодуючою послідовністю химерного інсектицидного білка, який, в свою чергу, функціонально зв'язаний 5' з

З-НТО і; другу трансгенну касету для селекції трансформованих рослинних клітин з використанням спектиноміцинової селекції. У таблиці 17 нижче показані послідовності, що кодують химерні інсектицидні білки, які застосовуються для експресії в сої, та відповідні ФЕО ІЮ

МО.

Таблиця 17

Послідовності, які кодують інсектицидні білки, та відповідні ФЕО ІЮ МО о: КУ ОН НО КД ОН: 7: ПИ

Рослинної клітини сої трансформували за допомогою бінарних векторів для трансформації, описаних вище, із застосуванням способу трансформації, опосередкованої Адгобасіегішт. В результаті трансформовані рослинні клітини індукували для формування рослин сої. Тканини листя збирали та використовували в біотестах, як описано в прикладі 11, або альтернативно, ліофілізовані тканини використовували у вигляді корму для комах у біотестах. Біотести виконували проти кукурудзяного листової совки (ЕАМУ, 5роаоріега Іидірегаа), південної совки (ЗАМУ, Зродоріега егідапіа), соєвої совки (ЗВІ, СпПгузоадеїхі5 іпсіндеп5), коробкового хробака

(ЗРММ, Неїїсомегра 7єа), совки оксамитових бобів (УВС, Апіісагзіа деттагаїїв), соєвої совки (ЗВІ.,

Спгузодеїхі5 іпсічцадеп5), тютюнової листовійки (ТВУМ, Неїїоїпі5 мігезсеп5), чорної совки (ВІ АМУ, зродоріега со5тіоіїде5), південної совки (ЗАМУ, Зродоріега егідапіа), точильника зернового кукурудзяного (І5СВ, ЕІазтораїри5 ІдпозеПйи5) і совки американської (ОВУМУ, Неїїсомегра аппідега). Нижче в таблиці 18 показана активність відносно вибраних видів Іерідорієга для кожного інсектицидного білка в рослинах покоління Ко.

Таблиця 18

Біотестування активності химерного інсектицидного білка з тканини листа стабільно трансформованої Ко сої тісто | | 5 | ях 1 5 | я 151111 тсвбб | їх | | | ї /!/ їз з тсвда | ях | я | її | я 1 я 1 ях | 11 псв439 | | 5 | їх 1 я | я Її я 1 Її 17151

Як видно з таблиці 18, кожен з химерних інсектицидних білків, експресований в стабільно трансформованій сої, демонстрував активність проти кількох видів лускокрилих.

Вибраним трансформованим об'єктам забезпечили самозапилення й отримане зерно вирощували. Тканину листа збирали з рослин покоління КІ! та використовували в кормових біотестах. У таблиці 19 показана активність інсектицидних білків, експресованих в тканинах листа сої КІ, яка спостерігається по відношенню деяких видів лускокрилих.

Таблиця 19

Біотестування активності химерного інсектицидного білка з тканини листа стабільно трансформованої КІ1 сої ех БТ: х Я ПОН НО ОН НО ОНИ НО о

НЕТ: (1: НЯ ПО ООН НО ОН КОН НО о о: У У ПОН КО ОН НО ОНИ НО ої: 2 Я ПОН НО ОН НО ОНИ НО

Як можна бачити з вищенаведеної таблиці 19, експресовані химерні інсектицидні білки з рослин покоління К1 продемонстрували активність відносно двох або більше видів лускокрилих.

Всі композиції, розкриті і заявлені в цьому документі, можуть бути зроблені і виконані без зайвого експериментування в межах цього розкриття. Хоча композиції винаходу були описані з точки зору вищезазначених ілюстративних варіантів реалізації, фахівцям в цій області техніки буде зрозуміло, що варіанти, зміни, модифікації та перебудови можуть бути застосовані до композиції, описаної в цьому документі, без відступу від концепції, сутності та обсягу цього винаходи. Більш конкретно, буде очевидно, що певні агенти, які схожі й хімічно, та фізіологічно, можуть бути використані замість агентів, описаних в цьому документі, досягаючи тих самих або подібних результатів. Всі такі аналогічні заміни та модифікації, очевидні фахівцям в цій області техніки, вважаються такими, що виходять за межі суті, об'єму і концепції цього винаходу, як визначено в поданій формулі винаходу.

Всі публікації та опубліковані патентні документи, цитовані в цій специфікації, включені в цей документ за допомогою посилання в тій самій мірі, як якби кожна індивідуальна публікація або патентна заявка були конкретно й індивідуально вказана для включення за допомогою посилання.

Claims (20)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Химерний інсектицидний білок, який відрізняється тим, що химерний інсектицидний білок містить амінокислотну послідовність, яка містить ЗЕО ІЮ МО: 10, і виявляє інгібіторну активність відносно видів комах ряду І ерідоріега.

2. Химерний інсектицидний білок за п. 1, який відрізняється тим, що види комахи вибрані з групи, яка складається з: Апіїсагзіа деттаїаїї5, Оіаїгаєа засспагаїйїв5, ЕІазтора!рив ІдпозеїПсв, Неїїсомегра 7єа, Неїїоїтів мігезсепв5, СНгузодеїхів іпсішдепе, 5родорієга созтіоіде5, Зродорієга епйдапіа, Зродорієга Мидірегда, бродорієга ехідца, Неїїсомегра аптідега, бЗродорієга Ійка, Ресііпорпога доззурієЇа, Оіаїгаєа дгапаіозеїа, Еагіах міїеПа, Неїїсомегра деюїюреоп і Наспіріивіа пи.

3. Полінуклеотид, який кодує химерний інсектицидний білок, який виявляє інгібіторну активність відносно видів комах ряду Іерідорієга, який відрізняється тим, що полінуклеотид функціонально зв'язаний з гетерологічним промотором, а химерний інсектицидний білок містить ЗЕОІО МО: 10.

4. Полінуклеотид, який кодує химерний інсектицидний білок, який виявляє інгібіторну активність відносно видів комах ряду Герідоріега, який відрізняється тим, що вказаний полінуклеотид містить нуклеотидну послідовність, яка: а) представлена 5ЕО ІЮ МО: 9; або р) кодує химерний інсектицидний білок, який містить ЗЕО І МО: 10.

5. Клітина-хазяїн, яка містить полінуклеотид, представлений 5ЕО ІЮО МО: 9, яка відрізняється тим, що вказана клітина-хазяїн вибрана з групи, яка складається з бактеріальної клітини-хазяїна і рослинної клітини-хазяїна.

6. Клітина-хазяїн за п. 5, яка відрізняється тим, що вказана бактеріальна клітина-хазяїн вибрана з групи, яка складається з Адгобасієгішт, ВНіг2обіт, Васіїїшв5, Вгемірасійшв5, ЕзсНегісніа, Рзепдотопазв, КіІебзівїІа і Епгміпіа.

7. Клітина-хазяїн за п. 5, яка відрізняється тим, що вказана рослинна клітина-хазяїн вибрана з групи рослин, яка складається з однодольних і дводольних.

8. Композиція, яка має інгібіторну активність відносно комах, яка містить химерний інсектицидний білок, який виявляє інгібіторну активність відносно видів комах ряду І ерідорієга, який містить БЕО ІЮ МО: 10.

9. Композиція, яка має інгібіторну активність відносно комах, за п. 8, яка додатково містить щонайменше один агент, який має інгібіторну активність відносно комах, відмінний від химерного інсектицидного білка, який виявляє інгібіторну активність відносно видів комах ряду Іерідорієга.

10. Композиція, яка має інгібіторну активність відносно комах, за п. 9, яка відрізняється тим, що вказаний щонайменше один агент, який має інгібіторну активність відносно комах, вибраний з групи, яка складається з білка, який має інгібіторну активність відносно комах, і молекули длРНК, яка має інгібіторну активність відносно комах.

11. Композиція, яка має інгібіторну активність відносно комах, за п. 9, яка відрізняється тим, що вказаний щонайменше один агент, який має інгібіторну активність відносно комах, виявляє активність відносно одного або більше видів шкідників рядів І ерідорієга, СоІеорієга, Нептіріега, Ноторієга або Тпузапоріега.

12. Насіння, яке містить: а) інгібувальну ефективну відносно комах кількість химерного інсектицидного білка, який виявляє інгібіторну активність відносно видів комах ряду І ерідорієга, який містить зБЕО ІЮ МО: 10; або р) полінуклеотид, представлений 5ЕО ІЮ МО: 9.

13. Спосіб боротьби з лускокрилим шкідником, який включає годування лускокрилого шкідника інгібувальною кількістю химерного інсектицидного білка за п. 1.

14. Трансгенна клітина рослини, рослина або частина рослини, які містять химерний інсектицидний білок, який виявляє інгібіторну активність відносно видів комах ряду ГІ ерідорієга, де химерний інсектицидний білок містить 5ЕО ІЮ МО: 10.

15. Спосіб боротьби з лускокрилим шкідником, який включає годування лускокрилого шкідника трансгенною клітиною рослини, рослиною або частиною рослини за п. 14, де вказана клітина рослини, рослина або частина рослини експресує інгібувальну відносно лускокрилих кількість химерного інсектицидного білка, який виявляє інгібіторну активність відносно видів комах ряду І ерідорієга.

16. Товарний продукт, отриманий з трансгенної рослинної клітини, рослини або частини рослини за п. 14, де вказаний продукт містить химерний інсектицидний білок.

17. Товарний продукт за п. 16, який відрізняється тим, що вказаний продукт вибраний з групи, яка складається з рослинної біомаси, борошна грубого помелу, корму для тварин, борошна, пластівців, висівок, волокна, лузги і обробленого насіння.

18. Спосіб отримання насіння, яке містить химерний інсектицидний білок за п. 1, який включає: 60 а) посадку множини насіння, яке містить химерний інсектицидний білок за п. 1;

Юр) вирощування рослин із вказаного насіння; і с) збирання насіння від указаних рослин, де указане зібране насіння містить химерний інсектицидний білок за п. 1.

19. Рекомбінантна полінуклеотидна молекула, яка кодує химерний інсектицидний білок за п. 1, яка містить 5ЕО ІЮ МО: 9; і полінуклеотидну послідовність, яка кодує агент, який має інгібіторну активність відносно комах, відмінний від вказаного химерного інсектицидного білка.

20. Молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти, яка містить гетерологічний промотор, функціонально зв'язаний з сегментом полінуклеотиду, який кодує химерний інсектицидний білок, який виявляє інгібіторну активність відносно видів комах ряду І ерідорієга, де а) химерний інсектицидний білок містить ЗЕО ІЮ МО: 10; або р) сегмент полінуклеотиду містить 5ЕО ІЮ МО: 9.