KR100581163B1 - 하이브리드 바실러스 튜린지엔시스 독소, 이를 암호화하는 핵산 및 이를 사용한 해충의 방제방법 - Google Patents
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Abstract
식물에서의 발현을 위해 최적화된 합성 뉴클레오타이드 서열은 독소 부분이 Cry1Ab의 도메인 I 및 II과 Cry1C의 도메인 III을 함유하는 다양한 형태의 하이브리드 바실러스 튜린지엔시스 델타-내독소 H04를 암호화한다. 당해 살충성 독소를 함유하는 조성물 및 제형은 곤충 해충을 방제할 수 있다. 추가로, 본 발명은 하이브리드 독소의 제조방법 및 당해 뉴클레오타이드 서열을 예를 들어 미생물에서 사용하여 해충을 방제하고 형질전환 식물에서 사용하여 곤충 내성을 부여하는 방법에 관한 것이다.
하이브리드 바실러스 튜린지엔시스 독소, 형질전환, 키메라 유전자, 살충성 독소
Description
본 발명은, 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 살충성 결정 단백질로부터 유래된 살충성 독소, 발현하여 당해 독소를 생성하는 핵산 서열 및 당해 독소 및 상응하는 핵산 서열을 제조 및 사용하여 해충을 방제하는 방법에 관한 것이다.
해충은 작물 손실의 주된 원인이다. 미국에서만, 다양한 곤충 속에 의한 감염으로 인해 매년 수조 달러가 손실되고 있다. 밭작물의 손실 이외에도, 해충은 야채 및 과일 재배자, 관상용 꽃 생산자에게 부담을 가하여 원예사 및 자택소유자에게도 손해를 입힌다.
해충은 주로 곤충 성장의 억제, 곤충 영양공급이나 번식의 예방 또는 곤충의 사멸을 통해 활성인 화학 살충제를 집중 적용함으로써 방제된다. 따라서, 우수한 곤충 방제가 달성될 수 있으나, 상기 화학물질은 때때로 다른 익충에게도 영향을 미칠 수 있다. 화학 살충제의 광범위한 사용으로 초래되는 또 다른 문제는 내성 곤충 변종의 출현이다. 이는 다양한 내성 조정 전략으로 부분적으로 완화되었으나, 대안적 해충 방제제에 대한 요구가 증가하고 있다.
살충성 독소를 발현하는 바실러스 튜린지엔스 균주와 같은 생물학적 곤충 방제제가 적용되어 만족스러운 결과와 함께 화학 살충제에 대한 대안 또는 보완물을 제공한 바 있다. 바실러스 튜린지엔시스는 그람 양성 호기성 내포자 형성 세균의 대규모 그룹에 속한다. 비. 세레우스(B. cereus) 또는 비. 안트라시스(B. anthracis)와 같은 매우 밀접하게 관련된 다른 바실러스 종과 달리, 이제까지 공지된 바실러스 튜린지엔스 종의 대부분은 포자형성 과정중에 이의 결정 구조에 기인하며 일반적으로 결정체로서도 지칭되는 부포자 봉입체를 생산한다. 상기 결정체는 소위 δ-내독소인, 살충적으로 활성인 결정 전독소 단백질로 이루어진다. 이들 단백질 결정은 바실러스 튜린지엔시스의 곤충에 대한 독성을 야기한다. δ-내독소는 결정체를 경구 섭취한 후 결정체가 표적 곤충의 위액에 용해될 때까지 살충 활성을 나타내지 않는다. 대부분의 경우에, 실제 독성 성분은 곤충의 소화관으로부터의 프로테아제 작용에 의해 유발되는 단백질분해 절단의 결과로서 전독소로부터 방출된다. 다양한 바실러스 튜린지엔스 균주의 δ-내독소는 특정 표적 곤충, 특히 다양한 인시류, 초시류 및 파리류 유충에 관한 높은 특이성 및 이들 유충에 대한 고도의 활성을 특징으로 한다. 바실러스 튜린지엔스의 δ-내독소를 사용할 경우의 추가의 잇점은 당해 독소가 사람, 기타 포유동물, 조류 및 어류에는 무해하다는 사실에 있다.
서열 상동성 및 살충 특이성에 기초하여, 바실러스 튜린지엔스 결정 단백질은 상이한 부류로 분류되었다. 140kDa 전독소로서 생산되며 인시목에 대해 활성인 Cry1 부류의 단백질이 가장 잘 연구되어 있다. 결정 단백질의 작용 방식은 어느 정도까지는 설명되어 있다. 경구 섭취 후 결정은 유충의 중간창자의 알칼리성 환경에서 용해된다. 이어서, 가용화된 단백질은 중간창자 프로테이나제(예: 트립신)에 의해, 곤충 중간창자의 상피 세포 상의 수용체에 결합하여 세포막으로 침투하는 약 65kDa의 프로테이나제-내성 독성 단편으로 처리된다. 이는 결국에 세포의 파열 및 유충의 사멸을 초래한다.
특정 결정 단백질의 활성 스펙트럼은 민감성 곤충의 중간창자 상피 세포 상의 수용체 발생에 의해 상당한 범위까지 측정된다. 스펙트럼은 결정 단백질의 가용화의 효율성 및 이의 생체내 단백질분해 활성화에 의해 동시-측정된다. 결정 단백질의 중간창자 상피 수용체에의 결합의 중요성은 결정 단백질 중 하나에 대한 발전된 내성을 지니는 곤충에 있어 내성 곤충의 중간창자 상피 세포에 대한 결정 단백질의 결합이 현저하게 감소된다는 것으로 추가로 입증된다.
과거 수년간, 이들 결정 단백질의 일부를 암호화하는 유전자가 분리되었으며 이종 숙주에서 이들의 발현은 경제적으로 중요한 해충의 방제를 위한 또 다른 도구를 제공하는 것으로 나타났다. 특히, 바실러스 튜린지엔스 결정 단백질과 같은 형질전환 식물내의 살충성 독소의 발현은 선택된 해충에 대한 효과적 보호를 제공하였으며 이러한 독소를 발현하는 형질전환 식물이 상품화되어 농부들은 화학적 곤충 방제제의 적용을 감소시킬 수 있었다. 또한, 특정 곤충 또는 곤충류에 대한 살충 활성의 정도를 증가시키거나 독소 단백질이 활성을 나타내는 곤충의 스펙트럼을 확장시키도록 디자인된 선택된 조합의 기능을 갖는 재조합 독소를 발현시킬 수도 있다. 예를 들어, 천연에서 발견되지 않는 신규 서열을 갖는 키메라 살충성 단백질은 하나의 δ-내독소로부터의 독소 부분과 상이한 δ-내독소의 전독소 (테일) 부분을 조합하여 작제할 수 있다[참조문헌: WO 98/15170, 이는 본원에서 참조로 인용된다].
결정 단백질의 독성 단편은 3개의 개별적 구조 도메인으로 이루어진 것으로 사료된다. 가장 N-말단에 위치한 도메인인 도메인 I은 7개의 α-헬릭스로 이루어지며, 부분적으로 또는 전체적으로 표적 세포 막내에 삽입되어 있을 수 있다. 도메인 II는 소위 격자-입체형태의 3 β-시트를 포함한다. 대부분의 조사자들은 도메인 II가 수용체와 상호작용하여 이로써 독소 특이성을 결정하는 것으로 사료하고 있다. 또한, 특이적 독성 및 높은 친화성 결합에 있어 도메인 II 잔기와 관련되는 다수의 증거가 있다. 가장 C-말단에 위치한 도메인인 도메인 III은 소위 젤리롤 입체형태의 2개의 β-시트로 이루어지며, 또한 특이성을 결정한다. 예를 들어, 암호화 영역 간의 생체내 재조합에 의해 독소들 간에 도메인 III을 교환하여 특이적 활성을 변화시킬 수 있다. 이러한 하이브리드를 사용한 결합 실험은 도메인 III이 표적 곤충의 추정된 수용체에 결합하는 것과 관련된다는 것을 제시하며, 이는 도메인 III이 수용체 인식에서의 역활을 통해 특이성에서 그 역활을 발휘할 수 있다는 것을 시사한다. Cry1 서열에 비추어 볼때, 도메인 I은 아미노산 잔기 28번부터 260번까지, 도메인 II은 약 260번부터 460번까지, 도메인 III은 약 460번부터 600번까지에 해당된다[참조문헌: Nakamura et al., Agric. Biol. Chem. 54(3): 715-724 (1990); Li et al., Nature 353: 815-821 (1991); Ge et al., J. Biol. Chem. 266(27): 17954-17958 (1991); and Honee et al., Mol. Microbiol. 5(11): 2799-2806 (1991); 각각은 본원에서 참조로 인용된다]. 본원에서 참조로 인용되는 미국 특허 제5,736,131호에는, C-말단에 제1 Cry 단백질의 도메인 III을 포함하며 N-말단에 제2 Cry 단백질의 도메인 I과 II를 포함하는 바실러스 튜린지엔스 하이브리드 독소 단편이 기재되어 있다. 이러한 하이브리드 결정 단백질은 변경된 살충 특이성을 갖는다. 예를 들어, 문헌[참조문헌: De Maagd et al., Appl. Environ Microbiol. 62(5): 1537-1543 (1996)]에 또한 기재되어 있는 H04 하이브리드 독소는 N-말단에 Cry1Ab의 도메인 I과 II를 포함하며 C-말단에 Cry1C의 도메인 III을 포함한다. 보고에 의하면 H04는 모체 Cry1Ab 독소에 비해 스포돕테라 엑시구아(Spodoptera exigua; 파밤나방)에 대해 고도로 독성이며 Cry1C 모체 독소에 비해 보다 독성이다[참조문헌: Bosch et al., FEMS Microbiology Letters 118: 129-134 (1994); Bosch et al., Bio/Technology 12: 915-918 (1994); De Maagd et al., Appl. Environ. Microbiol. 62(8): 2753-2757 (1996); 및 De Maagd et al., Mol. Microbiol. 31(2): 463-471 (1999); 각각은 본원에서 참조로 인용된다].
육종 프로그램 및 유전공학을 통해 곤충 내성 유전자의 혼입으로 달성된 이전의 성공에도 불구하고, 신규하고 효과적인 곤충 방제제를 발견에 대한 요구가 절실하지만 실현되지 않고 있다. 특히, 유럽조명나방(European Corn Borer) 및 밤나방(Fall Army Worm)과 같이 경제적으로 중요한 해충을 표적으로 하며 현재의 곤충 방제제에 내성인 곤충 종을 효과적으로 방제하는 방제제가 필요하다. 또한, 적용되어 환경에 대한 부담을 최소화시키는 제제가 바람직하다.
본 발명은, 식물에서의 발현을 위해 최적화된 합성 뉴클레오타이드 서열을 포함하여, 하이브리드 바실러스 튜린지엔스 독소를 암호화하는 신규 유전자를 제공 함으로써 상기한 요구를 충족시킨다. 바람직한 양태에서, 신규 유전자 서열은 독소 부분이 Cry1Ab의 도메인 I과 II 및 Cry1C의 도메인 III를 함유하는 하이브리드 바실러스 튜린지엔시스 델타-내독소 H04의 다양한 형태를 암호화한다. 당해 신규 유전자에 의해 암호화되는 하이브리드 바실러스 튜린지엔시스 독소는 밤나방, 분홍면화씨벌레(pink bollworm), 담배나방(tobacco budworm), 유럽조명나방 및 배추좀나방(diamondback moth)과 같이 경제적으로 중요한 해충에 대해 고도로 활성이다. 하이브리드 바실러스 튜린지엔시스 독소를 다수의 곤충 방제 전략에서 사용하여 환경에 대한 영향력을 최소로 하면서 최대의 효율성을 수득할 수 있다.
본 발명은 추가로 본 발명의 뉴클레오타이드 서열의 발현으로 생성되는 하이브리드 살충성 독소, 및 생존, 성장 또는 번식하는 해충의 능력을 억제하거나 농작물에서 곤충과 관련된 손상 또는 손실을 제한할 수 있는 당해 하이브리드 살충성 독소를 함유하는 조성물 및 제형에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 하이브리드 독소의 제조방법 및 예를 들어, 형질전환 식물에서 당해 뉴클레오타이드 서열을 사용하여 살충 내성을 부여하는 방법, 및 독소 및 당해 독소를 포함하는 조성물 및 제형을 사용하는 방법, 예를 들어, 당해 독소, 조성물 또는 제형을 곤충 감염된 지역, 예방적으로 처리될 곤충 민감성 지역 또는 식물에 적용하여 해로운 곤충에 대한 보호 또는 내성을 부여하는 방법에 관한 것이다. 하이브리드 독소를 다수의 곤충 방제 전략에서 사용하여 환경에 대한 영향력을 최소로 하면서 최대의 효율성을 수득할 수 있다.
하나의 양상에 따라서, 본 발명은 Cry1C 독소로부터의 도메인 III에 아미노 에서 카복시 방향으로 결합된 Cry1Ab 독소로부터의 도메인 I과 II을 포함하는 하이브리드 바실러스 튜린지엔시스 독소의 유효량을 곤충에게 전달함을 포함하여, 밤나방, 분홍면화씨벌레, 담배나방, 유럽조명나방 및 배추좀나방으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 곤충을 방제하는 방법을 제공한다. 바람직한 양태에서, 하이브리드 바실러스 튜린지엔시스 독소는 서열 2, 4, 6, 8 또는 10과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 보다 바람직한 양태에서, 하이브리드 바실러스 튜린지엔시스 독소는 서열 2, 4, 6, 8 또는 10을 포함한다.
본 발명의 상기 기술한 방법의 다른 양태에서, 하이브리드 바실러스 튜린지엔시스 독소는 Cry1C 테일 영역 또는 Cry1Ab 테일 영역과 같은 C-말단 테일 영역을 포함한다. C-말단 테일 영역은 전장일 수 있거나, 예를 들어, 약 40개의 아미노산 길이로 절단될 수 있다.
본 발명의 상기 기술한 방법의 바람직한 양태에서, 유효량의 하이브리드 바실러스 튜린지엔시스 독소를 곤충에게 전달하는 것은, 곤충에게 하이브리드 바실러스 튜린지엔시스 독소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 DNA 서열로 형질전환된 형질전환 식물 조직을 공급하거나 곤충을 이와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 형질전환 식물 조직에서 하이브리드 바실러스 튜린지엔시스 독소의 발현은 곤충에 대한 내성을 부여한다. 바람직하게는, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열 1, 3, 5, 7 또는 9와 실질적으로 동일하다.
다른 양상에 따라서, 본 발명은, (a) Cry1C 독소로부터의 도메인 III에 아미노에서 카복시 방향으로 결합된 Cry1Ab 독소로부터의 도메인 I 및 II을 포함하는 N-말단 독소 부분 및 (b) Cry1Ab 독소로부터의 C-말단 테일 영역을 포함하는 하이브리드 바실러스 튜린지엔시스 독소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 바람직하게는, 하이브리드 바실러스 튜린지엔시스 독소는 서열 6, 8 또는 10과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 하이브리드 바실러스 튜린지엔시스 독소는 서열 6, 8 또는 10을 포함한다. 보다 더욱 바람직하게는, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열 5, 7 또는 9와 90% 이상 동일하다. 가장 바람직하게는, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열 5, 7 또는 9를 포함한다.
본 발명은 상기 기술한 바와 같은 본 발명의 핵산 분자에 작동적으로 연결된 이종 프로모터 서열을 포함하는 키메라 유전자; 상기 키메라 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 상기 키메라 유전자를 포함하는 형질전환 숙주 세포(예: 식물 세포); 상기 형질전환 식물 세포를 포함하는 형질전환 식물(예: 옥수수, 면화, 벼 또는 양배추 식물); 및 상기 형질전환 식물 유래의 종자를 추가로 제공한다.
또 다른 양상에 따라서, 본 발명은, (a) 식물내에서 연관된 암호화 서열의 전사를 상승된 수준으로 촉진시키는 핵산 프로모터 서열 및 (b) 상기 프로모터 서열에 작동적으로 연결된 본 발명에 따르는 핵산 분자를 포함하는 키메라 유전자로 형질전환된 식물에서 하이브리드 바실러스 튜린지엔시스 독소를 발현시킴을 포함하여, 식물을 곤충으로부터 보호하는 방법으로서, 상기 식물에서 하이브리드 바실러스 튜린지엔시스 독소의 발현이 상기 식물을 곤충으로부터 보호하는 방법을 제공한다.
또 다른 양상에 따라서, 본 발명은 (a) 본 발명에 따르는 형질전환 숙주 세포를 수득하는 단계 및 (b) 본 발명의 핵산 분자를 상기 형질전환 숙주 세포에서 발현시켜 곤충에 대해 활성인 하이브리드 바실러스 독소를 수득하는 단계를 포함하여, 곤충에 대해 활성인 하이브리드 바실러스 튜린지엔시스 독소를 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 양상에 따라서, 본 발명은, 본 발명에 따르는 핵산 분자를 식물내로 도입함을 포함하여, 곤충에 대해 내성인 식물을 제조하는 방법으로서, 상기 핵산 분자가 상기 식물내에서 곤충을 방제하기에 유효한 양으로 발현될 수 있는 방법을 제공한다.
또 다른 양상에 따라서, 본 발명은, 서열 3, 5, 7, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17을 포함하는 분리된 핵산 분자; 이러한 핵산 분자에 작동적으로 연결된 이종 프로모터 서열을 포함하는 키메라 유전자; 이러한 키메라 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 이러한 키메라 유전자를 포함하는 형질전환 숙주 세포(예: 식물 세포); 이러한 형질전환 식물 세포를 포함하는 형질전환 식물(예: 옥수수, 면화, 벼 또는 양배추 식물); 및 이러한 형질전환 식물 유래의 종자를 제공한다.
추가의 양상에 따라서, 본 발명은 (a) Cry1C 독소로부터의 도메인 III에 아미노에서 카복시 방향으로 결합된 Cry1Ab 독소로부터의 도메인 I 및 II을 포함하는 N-말단 독소 부분 및 (b) Cry1Ab 독소로부터의 C-말단 테일 영역을 포함하는 하이브리드 바실러스 튜린지엔시스 독소를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 하이브리드 바실러스 튜린지엔시스 독소는 서열 6, 8 또는 10과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 하이브리드 바실러스 튜린지엔시스 독소는 서열 6, 8 또는 10을 포함한다.
추가의 양상에 따라서, 본 발명은 본 발명의 하이브리드 바실러스 튜린지엔시스 독소를 곤충을 방제하는데 유효한 양으로 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양상 및 잇점은 하기의 본 발명의 설명 및 비제한적 실시예의 연구로부터 당해 분야의 숙련가에 명백할 것이다.
서열 목록의 서열에 대한 간단한 설명
서열 1은 독소 부분이 N-말단에 Cry1Ab의 도메인 I과 II를 포함하며 C-말단에 Cry1C의 도메인 III을 포함하는, 문헌[참조문헌: De Maagd et al., Appl. Environ. Microbiol. 62(5): 1537-1543 (1996)]에 기술된 H04 하이브리드 독소와 전장 Cry1C 테일 부분을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열 2는 Cry1Ab의 독소 도메인 I과 II 및 Cry1C의 독소 도메인 III과 함께 전장 Cry1C 테일 부분을 포함하는, 서열 1에 설명된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 H04 하이브리드 독소의 아미노산 서열을 제시한다.
서열 3은 트립신 부위가 절단된 것처럼 테일을 포함하지 않는 H04의 독소 부분을 암호화하는 합성 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열 4는 서열 3에 설명된 합성 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 H04 독소 부분의 아미노산 서열을 제시한다.
서열 5는 H04의 독소 부분과 전장 Cry1Ab 테일 부분을 암호화하는 합성 뉴클 레오타이드 서열을 제시한다.
서열 6은 서열 5에 설명된 합성 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 H04+Cry1Ab 테일의 아미노산 서열을 제시한다.
서열 7은 H04의 독소 부분과 전장 Cry1Ab 테일 부분을 암호화하는 또 다른 합성 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열 8은 서열 7에 설명된 합성 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 H04+Cry1Ab 테일의 아미노산 서열을 제시한다.
서열 9는 H04의 독소 부분과 Cry1Ab 테일 부분의 처음 40개의 아미노산을 암호화하는 합성 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열 10은 서열 9에 설명된 합성 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 H04+ 40개 아미노산으로 절단된 Cry1Ab 테일의 아미노산 서열을 제시한다.
서열 11은 서열 3에 제시된 바와 같은 테일을 포함하지 않는 H04의 독소 부분을 암호화하는 합성 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 구성적 옥수수 유비퀴틴 프로모터를 함유하는 작제물 pNOV1308의 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열 12는 서열 5에 제시된 바와 같은 H04의 독소 부분과 전장 Cry1Ab 테일 부분을 암호화하는 합성 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된, 뿌리에 바람직한 옥수수 MTL 프로모터를 함유하는 작제물 pNOV1436의 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열 13은 서열 5에 제시된 바와 같은 H04의 독소 부분과 전장 Cry1Ab 테일 부분을 암호화하는 합성 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 구성적 옥수수 유비퀴틴 프로모터를 함유하는 작제물 pNOV1441의 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열 14는 서열 7에 제시된 바와 같은 H04의 독소 부분과 전장 Cry1Ab 테일 부분을 암호화하는 합성 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 구성적 옥수수 유비퀴틴 프로모터를 함유하는 작제물 pNOV1305의 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열 15는 서열 7에 제시된 바와 같은 H04의 독소 부분과 전장 Cry1Ab 테일 부분을 암호화하는 합성 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 구성적 옥수수 유비퀴틴 프로모터를 함유하는 작제물 pNOV1313의 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열 16은 서열 9에 제시된 바와 같은 H04의 독소 부분과 Cry1Ab 테일의 처음 40개의 아미노산을 암호화하는 합성 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된, 뿌리에 바람직한 옥수수 MTL 프로모터를 함유하는 작제물 pNOV1435의 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열 17은 서열 9에 제시된 바와 같은 H04의 독소 부분과 Cry1Ab 테일의 처음 40개의 아미노산을 암호화하는 합성 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 아라비돕시스 액틴-2(Arabidopsis actin-2) 프로모터를 함유하는 작제물 pZU578의 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
정의
본 발명의 독소의 "활성"은 경구적 활성인 곤충 방제제로서의 독소 기능이 독성 효과를 나타내거나 곤충 영양공급을 중단 또는 방해할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명의 독소가 곤충에게 전달되는 경우, 그 결과는 통상적으로 곤충의 사멸이거나 곤충은 당해 독소를 곤충이 이용할 수 있도록 하는 공급원을 섭취하지 않는다.
"연관된/작동적으로 연결된"은 물리적으로 또는 기능적으로 관련된 두 핵산 서열을 의미한다. 예를 들어, 프로모터 또는 조절 DNA 서열은, 두 서열이 작동적으로 연결되거나 조절 DNA 서열이 암호화 또는 구조 DNA 서열의 발현 수준에 영향을 미칠 수 있는 상황에 놓이는 경우에 RNA 또는 단백질을 암호화하는 DNA 서열과 "연관된"다고 언급된다.
"결합 부위"는 부위와 독성 사이의 결합이 부위와 독성 사이의 Ka가 약 104dm3mole-1 이상인 정도로 가역적인 분자 상의 부위를 의미한다.
"키메라 유전자"는, 프로모터 또는 조절 핵산 서열이 mRNA를 암호화하거나 단백질로서 발현되는 핵산 서열에 작동적으로 연결 또는 연관되어 있어, 조절 핵산 서열이 연관된 핵산 서열의 전사 또는 발현을 조절할 수 있는 재조합 핵산 서열이다. 키메라 유전자의 조절 핵산 서열은 천연에서 발견되는 바와 같이, 정상적으로는 연관된 핵산 서열에 작동적으로 연결되어 있지 않다.
"암호화 서열"은 mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, 센스 RNA 또는 안티센스 RNA와 같은 RNA로 전사되는 핵산 서열이다. 바람직하게는, RNA는 유기체내에서 후속적으로 해독되어 단백질을 생산한다.
상보적: "상보적"은 역평행 뉴클레오타이드 서열내의 상보적 염기 잔기 사이에 수소 결합이 형성된 후 서로 쌍을 이룰 수 있는 역평행 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 두 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
특정 핵산 서열의 "보존적으로 변형된 변이"는 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 의미하거나, 핵산 서열이 아미노산 서열을 암호화하지 않을 경우에는 본질적으로 동일한 서열을 의미한다. 유전암호의 축퇴로 인해, 다수의 기능적으로 동일한 핵산은 임의 기정의 폴리펩타이드를 암호화한다. 예를 들어, 코돈 CGT, CGC, CGA, CGG, AGA 및 AGG는 모두 아미노산 아르기닌을 암호화한다. 따라서, 아르기닌이 코돈에 의해 정의되는 모든 위치에서, 코돈은 암호화된 단백질을 변경하지 않으면서 기술한 상응하는 코돈 중 어느 하나로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 "보존적으로 변형된 변이"의 한 종류인 "침묵 변이(silent variation)"이다. 단백질을 암호화하는, 본원에서 기술하는 모든 핵산 서열은 달리 언급하지 않는 한 모든 가능한 잠재성 변이를 또한 가리킨다. 당해 숙련가는 표준 기술을 사용하여 핵산내의 각 코돈(통상적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 ATG 제외)을 변형시켜 기능적으로 동일한 분자를 수득할 수 있음을 인지할 수 있다. 따라서, 단백질을 암호화하는 핵산의 각 "잠재성 변이"는 각 기술된 서열에 내재되어 있다.
또한, 당해 숙련가는 아미노산 서열내의 적은 비율(통상적으로 5% 미만, 보다 통상적으로 1% 미만)의 아미노산을 변경, 첨가 또는 결실시키는 개개의 치환, 결실 또는 첨가가 변경으로 인해 아미노산이 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환 된 "보존적으로 변형된 변이"라는 것을 인지할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 다음의 5개 그룹은 각각 서로에 대한 보존적 치환인 아미노산을 함유한다: 지방족: 글리신(G), 알라닌(A), 발린(V), 류신(L), 이소류신(I); 방향족: 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W); 황-함유: 메티온닌(M), 시스테인(C); 염기성: 아르기닌(R), 라이신(K), 히스티딘(H); 산성: 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 아스파라긴(N), 글루타민(Q)[참조문헌: Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company]. 또한, 암호화된 서열내의 단일 아미노산 또는 적은 비율의 아미노산을 변경, 첨가 또는 결실시키는 개개의 치환, 결실 또는 첨가도 "보존적으로 변형된 변이"이다.
곤충을 "방제"한다는 것은 생존, 성장, 영양공급 및/또는 번식하는 해충의 능력을 억제하거나 농작물에서 곤충과 관련된 손상이나 손실을 독성 효과를 통해 제한하는 것을 의미한다. 비록 곤충을 "방제"한다는 것이 바람직하게는 곤충을 치사시키는 것을 의미한다 해도, 곤충을 치사시키는 것을 의미할 수 있거나 의미할 수 없다.
상응하는: 본 발명의 범주에서, "에 상응하는" 또는 "에 상응하다"는 바실러스 튜린지엔시스의 상이한 δ-내독소의 핵산 암호화 서열 또는 아미노산 서열들이 서로 정렬될 경우에 특정 계산된 위치에 "상응하는" 핵산 또는 아미노산이 상기 위치와는 정렬되지만 특정 δ-내독소의 각각의 핵산 암호화 서열 또는 아미노산 서열에 대한 이러한 정확한 숫자상 위치에 반드시 존재하지 않는 핵산 또는 아미노산인 것을 의미한다. 마찬가지로, 특정 δ-내독소(예를 들어, Cry1B)의 암호화 또는 아 미노산 서열이 참조 δ-내독소(예를 들어, Cry1Ab)의 암호화 또는 아미노산 서열과 정렬되는 경우 Cry1Ab 서열의 임의 계산된 위치와 "상응하는" Cry1B 서열내의 핵산 또는 아미노산은, Cry1Ab의 상기 위치와는 정렬되나 Cry1B 독소의 각각의 핵산 암호화 서열 또는 아미노산 서열의 이러한 정확한 숫자상 위치에 반드시 존재하지 않는 핵산 또는 아미노산이다.
독소를 "전달"한다는 것은 독소를 곤충과 접촉시켜 독성 효과 및 곤충의 방제를 초래하는 것을 의미한다. 독소는 다수의 인정된 방식, 예를 들어, 곤충에 의한 섭취에 의해 경구적으로 또는 곤충과의 접촉에 의해 형질전환 식물 발현, 제형화된 단백질 조성물(들), 분무가능한 단백질 조성물(들), 베이트 매트릭스(bait matrix) 또는 분야에 인정된 임의 기타 독소 전달 시스템을 통해 전달될 수 있다.
본원에서 사용되는 "발현 카세트"는 종결 시그널에 작동가능하게 연결되어 있는 관심있는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 프로모터를 포함하여, 적절한 숙주 세포에서 상기 뉴클레오타이드 서열의 발현을 유도할 수 있는 핵산 서열을 의미한다. 발현 카세트는 또한 통상적으로 뉴클레오타이드 서열의 적절한 해독에 필요한 서열을 포함한다. 관심있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 카세트는 키메라일 수 있으며, 이는 발현 카세트의 성분 중 하나 이상이 발현 카세트의 다른 성분 중 하나 이상에 대해 이종임을 의미한다. 또한, 발현 카세트는 천연적으로 발생하는 것이지만 이종 발현에 유용한 재조합 형태로 수득된 것일 수 있다. 그러나 통상적으로, 발현 카세트는 숙주에 대해 이종이다. 즉, 발현 카세트의 특정 DNA 서열은 숙주 세포내에 천연적으로 존재하지 않으며 형질전환 과정에 의해 숙주 세포 또는 숙주 세포의 선조내로 도입되어야 한다. 발현 카세트내의 뉴클레오타이드 서열의 발현은 숙주 세포가 일부 특정 외부 자극원에 노출될 경우에만 전사를 개시하는 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터의 조절하에 있을 수 있다. 식물과 같은 다세포 유기체의 경우에서, 프로모터는 또한 특정 조직 또는 기관이나 발육 단계에 대해 특이적일 수 있다.
유전자: 용어 "유전자"는 생물학적 기능과 연관된 DNA의 임의 분절을 의미하며 광범위하게 사용된다. 따라서, 유전자는 발현에 필요한 암호화 서열 및/또는 조절 서열을 포함한다. 또한, 유전자는 예를 들어, 기타 단백질에 대한 인식 서열을 형성하는 비발현된 DNA 분절을 포함한다. 유전자는 관심있는 공급원으로부터의 클로닝 또는 공지되거나 추정된 서열 정보로부터의 합성을 포함하여 다양한 공급원으로부터 수득할 수 있으며 바람직한 파라미터를 지니도록 디자인된 서열을 포함할 수 있다.
"관심있는 유전자"는 식물에게 전달될 경우 식물에게 항생제 내성, 바이러스 내성, 곤충 내성, 질병 내성 또는 다른 해충에 대한 내성, 제초제 내용성, 개선된 영양가, 공업 공정에서 개선된 효율 또는 변경된 생식 능력과 같은 바람직한 특성을 부여하는 임의 유전자를 의미한다. 또한, "관심있는 유전자"는 식물에서 상업적으로 가치있는 효소 또는 대사체의 생산을 위해 식물에게 전달되는 유전자일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "H04"는 독소 부분이 N-말단에 Cry1Ab의 도메인 I과 II를 포함하며 C-말단에 Cry1C의 도메인 III을 포함하는, 문헌[참조문헌: De Maagd et al., Appl. Environ. Microbiol. 62(5): 1537-1543 (1996)]에 기술된 하이브리드 Bt 독소를 의미한다.
이종 핵산 서열: 본원에서 사용되는 용어 "이종 핵산[또는 DNA] 서열", "외인성 핵산[또는 DNA] 분절" 또는 "이종 유전자"는 각각 특정 숙주 세포에 대해 외래적인 공급원으로부터 기원하거나, 동일한 공급원으로부터 유래될 경우에는 이의 본래 형태로부터 변형된 서열을 의미한다. 따라서, 숙주 세포내의 이종 유전자는, 특정 숙주 세포에 대해 내인성이지만 예를 들어, 코돈 최적화의 사용을 통해 변형된 유전자를 포함한다. 본 용어는 또한 천연적으로 발생하는 서열의 비천연적으로 발생하는 다수의 복사체를 포함한다. 따라서, 본 용어는 세포에 대해 외래적 또는 이종성이거나, 세포에는 상동성이지만 그 요소가 전형적으로 발견되지 않는 숙주 세포 핵산 내의 위치에 존재하는 핵산 분절을 의미한다. 외인성 핵산 분절은 발현되어 외인성 펩타이드를 산출한다.
"상동" 핵산[또는 DNA] 서열은 도입된 숙주 세포와 천연적으로 연관된 핵산[또는 DNA] 서열이다.
"상동 재조합"은 상동 핵산 분자 사이의 핵산 단편의 상호 교환이다.
"일원형체성(homoplastidic)"은 모든 색소체가 유전적으로 동일한 식물, 식물 조직 또는 식물 세포를 의미한다. 이는 색소체가 형질전환되거나 돌연변이되거나 유전학적으로 변형되지 않았을 경우의 식물의 정상적인 상태이다 상이한 조직 또는 발달 단계에서, 색소체는 예를 들어, 엽록체, 전색소체, 에티오플라스트(etioplast), 녹말체 및 유색체 등과 같은 다른 형태를 취할 수 있 다.
2개 이상의 핵산 또는 단백질 서열의 범주에서 용어 "동일한" 또는 % "동일성"은 하기에서 기술하는 서열 비교 알고리듬을 사용하거나 시각적 검사에 의해 측정된 바와 같이, 비교하고 최대 상응성을 위해 정렬할 경우에, 동일하거나 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드의 명시된 비율을 지니는 2개 이상의 서열 또는 부서열을 의미한다.
"살충성"은 곤충을 방제할 수 있는, 바람직하게는 곤충을 사멸시킬 수 있는 독성의 생물학적 활성도로서 정의된다.
핵산 서열은 당해 핵산 서열이 참조 핵산 서열에 의해 암호화되는 폴리펩타이드와 동일한 아미노산 서열을 지니는 폴리펩타이드를 암호화할 경우 상기 핵산 서열과 "동일코딩(isocoding)"이다.
"분리된" 핵산 분자 또는 분리된 효소는 사람의 손에 의해 이의 천연 환경으로부터 떨어져 존재함으로써 천연의 생성물이 아닌 핵산 분자 또는 효소이다. 분리된 핵산 분자 또는 효소는 정제된 형태로 존재하거나, 예를 들어 재조합 숙주 세포와 같은 비천연 환경에 존재할 수 있다.
하이브리드 독소내의 독소 도메인 사이, 즉 본 발명에 따르는 하이브리드 살충성 독소의 도메인 II과 III 사이의 "연접부"는 하이브리드내의 상동 교차 영역 또는 부위이다. 교차 부위 좌측의 아미노산은 하나의 모체 독소로부터 유래되며, 교차 부위 좌측의 아미노산은 다른 모체 독소로부터 유래된다.
성숙 단백질: 정상적으로 세포내 소기관을 표적으로 하며 전이 펩타이드가 제거된 단백질.
최소 프로모터: 불활성이거나 상부 활성화의 부재하에서 프로모터 활성이 크게 감소된 프로모터 요소, 특히 TATA 요소. 적합한 전사 인자의 존재하에서 최소 프로모터는 전사가 일어나도록 작용한다.
천연의: 본 용어는 비형질전환된 세포의 게놈내에 존재하는 유전자를 의미한다.
천연적으로 발생하는: 용어 "천연적으로 발생하는"은 사람에 의해 인공적으로 생산된 것과 구별되는, 천연에서 발견될 수 있는 대상을 기술하는데 사용된다. 예를 들어, 천연의 공급원으로부터 분리될 수 있으며 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 변형되지 않은, 유기체(바이러스를 포함)내에 존재하는 단백질 또는 뉴클레오타이드 서열이 천연적으로 발생하는 것이다.
핵산: 용어 "핵산"은 일본쇄 또는 이본쇄 형태인 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 또는 이들의 중합체를 의미한다. 달리 한정하지 않는 한, 본 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 지니며 천연적으로 발생하는 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사되는, 천연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 명시하지 않는 한, 특정 핵산 서열은 이의 보존적으로 변형된 변이(예: 축퇴 코돈 치환) 및 상보적 서열과 명백하게 명시된 서열도 잠재적으로 포함한다. 구체적으로, 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈 중 제3 위치가 혼합된-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성시킴으로써 달성될 수 있다[참조문헌: Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608(1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)]. 용어 "핵산" 또는 "핵산 서열"은 유전자, cDNA 및 유전자에 의해 암호화되는 mRNA와 교환해서 사용할 수도 있다.
"ORF"는 개방 판독 프레임(Open Reading Frame)을 의미한다.
단백질의 "부분"이란, 상기 단백질에 포함되며 이의 연속적 서열의 80% 이상을 지니는 펩타이드를 의미한다.
"식물"은 임의 발단 단계상의 임의 식물, 특히 종자 식물이다.
"식물 세포"는 원형질체 및 세포 벽을 포함하는 식물의 구조적 및 생리학적 단위이다. 식물 세포는 분리된 단일 세포 또는 배양된 세포의 형태일 수 있거나 예를 들어, 식물 조직, 식물 기관 또는 완전한 식물과 같은 고등하게 조직화된 단위의 일부일 수 있다.
"식물 세포 배양물"은 예를 들어, 다양한 발달 단계상의 원형질체, 세포 배양 세포, 식물 조직내 세포, 화분, 화분관, 배주, 배낭, 접합체 및 배아와 같은 식물 단위의 배양물을 의미한다.
"식물질"은 잎, 줄기, 뿌리, 꽃 또는 꽃 부분, 과실, 화분, 난세포, 접합체, 종자, 삽목, 세포 또는 조직 배양물 또는 식물의 기타 다른 일부분 또는 생성물을 의미한다.
"식물 기관"은 뿌리, 줄기, 잎, 꽃눈 또는 배아와 같은 식물의 가시적으로 구조화되고 분화된 별개의 부분이다.
본원에서 사용되는 "식물 조직"은 구조적 및 기능적 단위로 조직화된 식물 세포의 그룹을 의미한다. 식물내 또는 배양물중의 식물의 임의 조직이 포함된다. 상기 용어는 완전한 식물, 식물 기관, 식물 종자, 조직 배양물 및 구조적 및/또는 기능적 단위로 조직화된 식물 세포의 임의 그룹을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 기재한 바와 같거나 본 정의에 포함되는 식물 조직의 임의 특정 유형과 관련하여 또는 이의 부재하에 상기 용어의 사용은 임의 기타 유형의 식물 조직을 배제하지 않는다.
"프로모터"는 RNA 폴리머라제 II에 대한 결합 부위를 함유하며 DNA의 전사를 개시하는 암호화 영역의 상부에 위치하는 해독되지 않는 DNA 서열이다. 프로모터 영역은 또한 유전자 발현의 조절자로서 작용하는 기타 요소를 포함할 수 있다.
"원형질체"는 세포 벽을 함유하지 않거나 세포 벽의 일부만을 함유하는 분리된 식물 세포이다.
정제: 용어 "정제된"은 핵산 또는 단백질에 적용할 경우 핵산 또는 단백질이 천연 상태에서 관련된 다른 세포내 성분을 본질적으로 함유하지 않은 것을 가리킨다. 무수 또는 수용액중일 수 있으나 바람직하게는 균질 상태이다. 순도 및 균질성은 통상적으로 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 분석적 화학 기술을 사용하여 측정한다. 제제중에 존재하는 주된 화학종인 단백질이 실질적으로 정제된다. 용어 "정제된"은 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에 필수적으로 하나의 밴드를 생성시키는 것을 가리킨다. 특히, 본 용어는 핵산 또는 단백질이 50% 이상 순수한, 보다 바람직하게는 85% 이상, 가장 바람직하게는 약 99% 이상 순수한 것을 의미한다.
두 핵산은, 이 두 핵산 각각으로부터의 서열이 자손 핵산으로서 배합된 경우 "재조합"된 것이다. 두 서열은 핵산 둘다가 재조합에 대한 기질이 될 경우 "직접적으로" 재조합된다. 두 서열은 이 서열들이 교차 올리고뉴클레오타이드와 같은 중간체를 사용하여 재조합될 경우 "간접적으로" 재조합된다. 간접적 재조합에 있어, 단지 하나의 서열만이 재조합에 대한 실제 기질이며, 일부 경우에서는 어떠한 서열도 재조합에 대한 기질이 아니다.
"조절 요소"는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 조절하는데 관련된 서열을 의미한다. 조절 요소는 관심있는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 및 종결 시그날을 포함한다. 이들은 또한 통상적으로 뉴클레오타이드 서열의 적절한 전사에 필요한 서열을 포함한다.
실질적으로 동일한: 2개의 핵산 또는 단백질 서열의 범주에서, 구 "실질적으로 동일한"은 하기의 서열 비교 알고리듬 중 하나를 사용하거나 시각적 검사에 의해 측정된 바와 같이, 비교하고 최대 상응성을 위해 정렬할 경우 60% 이상, 바람직하게는 80%, 보다 바람직하게는 90%, 보다 더욱 바람직하게는 95% 및 가장 바람직하게는 99% 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기 동일성을 나타내는 2개 이상의 서열 또는 부서열을 의미한다. 바람직하게는 실질적 동일성은 길이가 약 50개 이상의 잔기인 서열의 영역, 보다 바람직하게는 약 100개 이상의 잔기의 영역에 걸쳐서 나타나며, 가장 바람직하게는 서열은 약 150개 이상의 잔기가 실질적으로 동일하다. 가장 바람직한 양태에서, 서열은 암호화 영역의 전체 길이에 걸쳐서 실 질적으로 동일하다. 또한, 실질적으로 동일한 핵산 또는 단백질 서열은 실질적으로 동일한 기능을 수행한다.
서열 비교에 있어, 통상적으로 하나의 서열이 시험 서열과 비교되는 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리듬을 사용할 경우, 시험 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요에 따라 부서열 좌표를 디자인하고 서열 알고리듬 프로그램 매개변수를 디자인한다. 이어서, 서열 비교 알고리듬은 디자인된 프로그램 매개변수에 기초하여 참조 서열에 대한 시험 서열(들)의 % 서열 동일성을 계산한다.
비교를 위한 최적의 서열 정렬은 문헌[참조문헌: Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국부적 상동성 알고리듬, 문헌[참조문헌: Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 알고리듬, 문헌[참조문헌: Pearson & Lipman, Proc. Natl'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1989)]의 유사성 방법용 탐색, 상기 알고리듬들의 컴퓨터화된 실행(GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, 제조원: Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) 또는 시각적 검사[참조문헌: Ausubel et al.)에 의해 수행할 수 있다.
% 서열 동일성 및 서열 유사성을 측정하는데 적합한 알고리듬의 한 예는, 문헌[참조문헌: Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]에 기술되어 있는 BLAST 알고리듬이다. BLAST 분석 수행용 소프트웨어는 기관[National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)]을 통해 공개적으로 이용가능하다. 상기 알고리듬은 데이터베이스 서열내의 동일한 길이의 워드와 정렬되는 경우에 일부 양성-평가된 역치 스코어 T와 매치되거나 이를 만족시키는, 조회 서열내의 짧은 길이의 워드 W를 동정함으로써 높은 스코어의 서열 쌍(HSP)을 먼저 동정하는 것과 관련된다[참조문헌: Altschul et al., 1990]. 이러한 초기의 근접한 워드의 적중은 이들을 함유하는 보다 긴 HSP를 찾기 위해 탐색을 개시하는데 있어 기초로서 작용한다. 이어서 워드 명중은 누적 정렬 스코어가 보다 증가할 수 있는 한은 각 서열을 따라서 두 방향으로 확장된다. 누적 스코어는, 뉴클레오타이드 서열의 경우에는 매개변수 M(매치되는 잔기의 쌍에 대한 보상 스코어; 항상 >0) 및 N(미스매치되는 잔기에 대한 페널티 스코어; 항상 <0)을 사용하여 계산한다. 아미노산 서열의 경우에는, 득점 매트릭스를 사용하여 누적 스코어를 계산한다. 각 방향으로의 워드 적중의 확장은, 누적 정렬 스코어가 이의 최대로 성취된 값으로부터 X량 만큼 감소되고 누적 스코어가 하나 이상의 음성-득점 잔기 정렬의 축적으로 인해 0 또는 그 이하로 가까워지거나 서열의 말단에 도달할 경우에 중지된다. BLASTN 알고리듬 매개변수 W, T 및 X는 정렬의 민감성 및 속도를 결정한다. BLAST 프로그램(뉴클레오타이드 서열용)은 데폴트로서 워드길이 11, 기대값(E) 10, 컷오프 100, M=5, N=-4 및 두 서열의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 데폴트로서 워드길이(W) 3, 기대값(E) 10 및 BLOSUM62 득점 매트릭스[참조문헌: Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)]를 사용한다.
% 서열 동일성을 계산하는 것 이외에, BLAST 알고리듬은 두 서열 간의 유사성에 대한 통계학적 분석을 또한 수행한다[참조문헌: Karlin & Altschun, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)]. BLAST 알고리듬에 의해 제공된 유사성의 한가지 척도는 2개의 뉴클레오타이드나 아미노산 서열 간의 매치가 우연히 발생할 확률의 지표를 제공하는 최소 총 확률(P(N))이다. 예를 들어, 시험 핵산 서열은 시험 핵산 서열과 참조 핵산 서열을 비교하여 최소 총 확률이 약 0.1 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만 및 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우에 참조 서열과 유사한 것으로 고려된다.
두 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 지표는 상기 두 분자가 엄격한 조건(stringent condition)하에 서로 하이브리드화되는 가이다. 구 "에 특이적으로 하이브리드화하는"은 특정 뉴클레오타이드 서열이 복합 혼합물(예를 들어, 전체 세포의) DNA 또는 RNA 중에 존재하는 경우에 분자가 엄격한 조건하에 이 특정 뉴클레오타이드 서열에만 결합, 이중화 또는 하이브리드화하는 것을 의미한다. "실질적으로 결합하는"은 프로브 핵산과 표적 핵산 간의 상보적 하이브리드화를 의미하며, 표적 핵산 서열의 목적하는 검출을 수행하기 위해 하이브리드화 매질의 엄격도를 감소시켜 수용할 수 있는 소수의 미스매치를 포함한다.
서던(Southern) 및 노던(Northern) 하이브리드화와 같은 핵산 하이브리드화 실험의 범주에서 "엄격한 하이브리드화 조건" 및 "엄격한 하이브리드화 세척 조건"은 서열 의존적이며 상이한 환경 매개변수하에 상이하다. 보다 긴 서열은 보다 고온에서 특이적으로 하이브리드화한다. 핵산의 하이브리드화에 관한 폭넓은 지침은 문헌[참조문헌: Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" Elsevier, New York]에서 찾아볼 수 있다. 일반적으로, 고도로 엄격한 하이브리드화 및 세척 조건은 소정의 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 열 용융점(Tm)보다 약 5℃가 낮도록 선택한다. 통상적으로, "엄격한 조건"하에 프로브는 이의 표적 부서열과 하이브리드화할 수 있으나 다른 서열과는 하이브리드화하지 않는다.
Tm은 (소정의 이온 강도 및 pH하에) 표적 서열의 50%가 완벽하게 매치된 프로브에 하이브리드화하는 온도이다. 매우 엄격한 조건은 특정 프로브에 대한 Tm과 동일하도록 선택한다. 서던 또는 노던 블롯에서 필터 상에 100개 이상의 상보적 잔기를 지니는 상보적 핵산의 하이브리드화에 대한 엄격한 하이브리드화 조건은 42℃에서 50% 포름아미드와 헤파린 1mg에서 밤새 하이브리드화를 수행하는 것이다. 고도로 엄격한 세척 조건의 예는 72℃에서 15분 동안 0.15M NaCl이다. 엄격한 세척 조건의 예는 65℃에서 15분 동안의 0.2×SSC 세척이다[참조문헌: SSC 완충액의 기술에 관한 Sambrook, infra,]. 흔히, 고도의 엄격도 세척은 배경 프로브 시그날을 제거하기 위해 낮은 엄격도 세척으로 진행한다. 예를 들어, 100개 이상의 뉴클레오타이드의 이중체에 대한 매질 엄격도 세척의 예는 45℃에서 15분 동안의 1×SSC이다. 예를 들어, 100개 이상의 뉴클레오타이드의 이중체에 대한 낮은 엄격도 세척의 예는 40℃에서 15분 동안의 4 내지 6×SSC이다. 짧은 프로브(예를 들어, 약 10개 내지 50개의 뉴클레오타이드)의 경우, 엄격한 조건은 통상적으로 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0M 미만의 Na 이온의 염 농도, 통상적으로 약 0.01 내지 1.0M Na 이온 농도(또는 기타 염)이며 온도는 통상적으로 약 30℃ 이상이다. 엄격한 조건은 포름아미드와 같은 불안정화제를 첨가하여 달성할 수도 있다. 일반적으로, 특정 하이브리드화 검정시에 비관련된 프로브에서 관찰되는 것의 2배(또는 그 이상)인 시그날 대 노이즈 비는 특이적 하이브리드화의 검출을 나타낸다. 엄격한 조건하에 서로 하이브리드화하지 않는 핵산이라도 이들이 암호화하는 단백질이 실질적으로 동일한 경우에는 여전히 실질적으로 동일하다. 이는 예를 들어, 핵산의 복사체가 유전암호에 의해 허용된 최대 코돈 축퇴성을 사용하여 생성될 경우에 발생한다.
다음은 본 발명의 참조 서열과 실질적으로 동일한 상동성 뉴클레오타이드 서열을 클로닝하는데 사용할 수 있는 하이브리드화/세척 조건 세트의 예이다: 참조 뉴클레오타이드 서열은 바람직하게는 50℃에서 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO4, 1mM EDTA에서와 50℃에서 2×SSC, 0.1% SDS에서의 세척, 보다 바람직하게는 50℃에서 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO4, 1mM EDTA에서와 50℃에서 1×SSC, 0.1% SDS에서의 세척, 보다 바람직하게는 50℃에서 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO4, 1mM EDTA에서와 50℃에서 0.5×SSC, 0.1% SDS에서의 세척, 바람직하게는 50℃에서 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO4, 1mM EDTA에서와 50℃에서 0.1×SSC, 0.1% SDS에서의 세척, 보다 바람직하게는 50℃에서 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO4, 1mM EDTA에서와 50℃에서 0.1×SSC, 0.1% SDS에서의 세척 조건하에 하이브리드화한다.
2개의 핵산 서열 또는 단백질이 실질적으로 동일하다는 추가의 지표는 제1 핵산에 의해 암호화되는 단백질이 제2 핵산에 의해 암호화되는 단백질과 면역학적으로 교차 반응성이거나 이와 특이적으로 결합하는 것이다. 따라서, 단백질이 통상적으로 제2 단백질과 실질적으로 동일하다면, 이때는 예를 들어, 두 단백질이 보존적 치환만이 상이한 경우이다.
구 "항체에 특이적으로(또는 선택적으로) 결합하는" 또는 "와 특이적으로(또는 선택적으로) 면역반응성인"은 단백질 또는 펩타이드를 가리킬 경우 단백질의 이종 집단 및 기타 생물제제(biologics)의 존재하에 단백질의 존재의 결정요인인 결합 반응을 의미한다. 따라서, 디자인된 면역검정 조건하에, 명시된 항체는 특정 단백질에 결합하며 샘플 중에 존재하는 다른 단백질에는 상당량으로 결합하지 않는다. 이러한 조건하에 항체에의 특이적 결합은 특정 단백질에 대한 특이성을 위해 선택된 항체를 요한다. 예를 들어, 본 발명의 핵산 서열 중 어느 하나에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 함유하는 단백질에 대해 발생한 항체를 선택하여 상기 단백질과는 특이적으로 면역반응성이나 다형 변이체를 제외한 다른 단백질과는 면역반응성이 아닌 항체를 수득할 수 있다. 다양한 면역검정 형식을 특정 단백질과 특이적으로 면역반응성인 항체를 선택하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 고체상 ELISA 면역검정, 웨스턴 블롯 또는 면역조직화학을 단백질과 특이적으로 면역반응 성인 모노클로날 항체를 선택하는데 통상적으로 사용한다[참조문헌: 특이적 면역반응성을 측정하는데 사용할 수 있는 면역검정 형식 및 조건에 관해, Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York "Harlow and Lane")]. 통상적으로, 특이적 또는 선택적 반응은 2배 이상의 배경 시그날 또는 노이즈일 수 있으며, 보다 통상적으로는 10배 내지 100배 이상의 배경 시그날 또는 노이즈일 수 있다.
"부서열"은 보다 긴 각각의 핵산 또는 아미노산(예: 단백질) 서열의 일부를 포함하는 핵산 또는 아미노산의 서열을 의미한다.
"합성 "은 천연 서열에 존재하지 않는 구조적 특징을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 예를 들어, 단자엽식물 및/또는 쌍자엽식물 유전자의 G+C 함량 및 정상 코돈 분포와 보다 밀접하게 유사한 인공 서열이 합성이라고 언급된다.
"형질전환"은 이종 핵산을 숙주 세포 또는 유기체내로 도입하는 과정이다. 특히, "형질전환"은 DNA 분자를 관심있는 유기체의 게놈내로 안정하게 삽입하는 것을 의미한다. 형질전환된 세포, 조직 또는 곤충은 형질전환 과정의 최종 생성물 뿐만 아니라 이의 형질전환 자손도 포함하는 것으로 이해된다.
"형질전환된/형질전환/재조합"은 이종 핵산 분자가 도입된 세균 또는 식물과 같은 숙주 유기체를 의미한다. 핵산 분자는 숙주의 게놈내로 안정하게 삽입될 수 있거나, 염색체외 분자로서 존재할 수도 있다. 이러한 염색체외 분자는 자가 복제할 수 있다. 형질전환된 세포, 조직 또는 식물은 형질전환 과정의 최종 생성물 뿐만 아니라, 이의 형질전환 자손도 포함하는 것으로 이해된다. "비형질전환된", " 비형질전환" 또는 "비재조합" 숙주는 야생형 유기체, 예를 들어, 이종 핵산 분자를 함유하지 않는 세균 또는 식물을 의미한다.
뉴클레오타이드는 다음의 표준 약어에 의한 염기로 명시한다: 아데닌(A), 사이토신(C), 티민(T) 및 구아닌(G). 마찬가지로 아미노산을 다음 표준 약어로 명시한다: 알라닌(Ala; A), 아르기닌(Arg; R), 아스파라긴(Asn; N), 아스파르트산(Asp; D), 시스테인(Cys; C), 글루타민(Gln; Q), 글루탐산(Glu; E), 글리신(Gly; G), 히스티딘(His: H), 이소류신(Ile; I), 류신(Leu; L), 라이신(Lys; K), 메티오닌(Met; M), 페닐알라닌(Phe; F), 프롤린(Pro; P), 세린(Ser; S), 트레오닌(Thr; T), 트립토판(Trp; W), 티로신(Tyr; Y) 및 발린(Val; V). 또한, (Xaa; X)는 임의 아미노산을 나타낸다.
본 발명은 발현하여 신규한 독소를 생성하는 신규한 핵산 서열 및 당해 독소를 제조 및 사용하여 해충을 방제하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 독소 부분이 Cry1Ab의 도메인 I과 II 및 Cry1C의 도메인 III를 함유하는 다양한 형태의 하이브리드 바실러스 튜린지엔시스 델타-내독소 H04를 암호화하는, 식물에서의 발현을 위해 최적화된 합성 유전자 서열에 관한 것이다. 천연 Cry1Ab 및 Cry1C 유전자로부터 작제된, H04 하이브리드 독소를 암호화하는 하이브리드 유전자는 미국 특허 제5,736,131호 및 문헌[참조문헌: De Maagd et al., Appl. Environ. Microbiol. 62(5): 1537-1543 (1996)]에 기재되어 있다. 본 발명의 합성 H04 유전자를 작제하기에 바람직한 방법은 WO 93/07278에 기재되어 있다. 당해 신규한 유전자 서열에 의해 암호화되는 하이브리드 바실러스 튜린지엔시스 독소는 밤나방, 분홍면화씨벌 레, 담배나방, 유럽조명나방 및 배추좀나방과 같은 경제적으로 중요한 해충에 대해 고도로 활성적이다. 하이브리드 바실러스 튜린지엔시스 독소를 다수의 곤충 방제 전략에서 사용하여 환경에 대한 영향력을 최소로 하면서 최대의 효율성을 수득할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 살충성 독소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함한다. 본 발명은 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 추가로 포함한다. 상기 벡터에서, 핵산 서열은 바람직하게는 뉴클레오타이드 서열을 발현할 수 있는 숙주 세포내에서 뉴클레오이드 서열을 발현하기 위한 조절 요소를 포함하는 발현 카세트내에 포함된다. 이러한 조절 요소는 통상적으로 프로모터 및 종결 시그널을 포함하며, 바람직하게는 본 발명의 핵산 서열에 의해 암호화되는 단백질이 효율적으로 전사되도록 하는 요소를 또한 포함한다. 당해 핵산 서열을 포함하는 벡터는 통상적으로 특히 숙주 세포내에서 바람직하게는 염색체외 분자로서 복제할 수 있으므로 본 발명의 핵산 서열을 숙주 세포내에서 증폭시키는데 사용된다. 하나의 양태에서, 이러한 벡터용 숙주 세포로는 세균, 특히 바실러스 튜린지엔시스 또는 이. 콜라이와 같은 미생물이 있다. 다른 양태에서, 이러한 재조합 벡터용 숙주 세포로는 내생식물 또는 착생식물이 있다. 이러한 벡터용으로 바람직한 숙주 세포로는 식물 세포와 같은 진핵 세포가 있다. 옥수수 세포와 같은 식물 세포가 가장 바람직한 숙주 세포이다.
특히 바람직한 양태에서, 본 발명의 살충성 독소는 식물에서 발현된다. 상기 경우에, 유효량의 독소를 발현하는 형질전환 식물은 식물 자신을 해충으로부터 보호한다. 곤충이 이러한 형질전환 식물을 먹이로 할 경우, 발현된 독소도 섭취하게 된다. 이는 곤충이 식물 조직을 먹어들어가는 것을 방해하거나 심지어 곤충을 손상시키거나 치사시킬 수 있다.
본원에서 기술하는 핵산 서열은 종래의 재조합 DNA 기술을 사용하여 식물 세포내로 혼입할 수 있다. 일반적으로, 이는 본 발명의 암호화 서열을 당해 분야에 공지된 표준 클로닝 과정을 사용하여 당해 암호화 서열에 대해 이종인(즉, 당해 암호화 서열이 존재하지 않는) 발현 시스템내로 삽입시키는 것과 관련된다. 벡터는 삽입된 단백질-암호화 서열의 전사 및 해독에 필수적인 요소를 함유한다. 플라스미드, 박테리오파지 바이러스 및 기타 변형된 바이러스와 같은 당해 분야에 공지된 다수의 벡터 시스템을 사용할 수 있다. 적합 벡터는, 바이러스 벡터(예: 람다 벡터 시스템 λgtl1, λgtl0 및 Charon 4), 플라스미드 벡터(예: pBI121, pBR322, pACYC177, pACYC184, pAR 시리즈, pKK223-3, pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pLG339, pRK290, pKC37, pKC101, pCDNAII) 및 기타 유사한 시스템을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 형질전환된 세포를 완전한 식물로 재생시켜 본 발명의 뉴클레오타이드 서열이 형질전환 식물에게 곤충 내성을 부여하게 할 수 있다.
본 발명에 따라서 형질전환된 식물은 단자엽식물 또는 쌍자엽식물일 수 있으며, 옥수수, 밀, 보리, 호밀, 고구마, 잠두, 완두, 치커리, 상추, 양배추, 꽃양배추, 브로콜리, 순무, 무, 시금치, 아스파라거스, 양파, 마늘, 후추, 셀러리, 호박(squash), 펌프킨 호박(pumpkin), 삼, 주키니 호박(zucchini), 사과, 배, 모과, 멜론(예: 수박), 서양자두, 체리, 복숭아, 승도복숭아, 살구, 딸기, 포도, 나무딸기, 검은딸기, 파인애플, 아보카도, 파파야, 망고, 바나나, 대두, 토마토, 수수, 사탕수수, 사탕무, 해바라기, 평지, 클로버, 담배, 당근, 면화, 알팔파, 감자, 가지, 오이, 아라비돕시스(Arabidopsis), 및 침엽수와 낙엽수와 같은 목본 식물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일단 목적하는 뉴클레오타이드 서열이 특정한 식물 종으로 형질전환되면, 그 종내에서 전파시킬 수 있거나, 종래의 육종 기술을 사용하여 특히, 시판용 변종을 포함하는 동일한 종의 다른 변종으로 이동시킬 수 있다.
형질전환 식물에서의 발현을 위해 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 변형 및 최적화를 필요로 할 수 있다. 다수의 경우에서 미생물로부터의 유전자를 변형시키기 않고 식물내에서 고수준으로 발현시킬 수 있으나, 형질전환 식물에서의 낮은 발현은 식물에서 바람직하지 않은 코돈을 가진 이종 뉴클레오타이드 서열로부터 기인할 수 있다. 당해 분야에는 모든 유기체가 코돈 용법에 대해 특정한 선호도를 나타내며 본 발명에서 기술하는 뉴클레오타이드 서열의 코돈은 이에 의해 암호화된 아미노산을 유지하면서 식물의 선호도에 맞게 변형될 수 있는 것으로 공지되어 있다. 게다가, 식물내에서의 높은 발현은 약 35% 이상, 바람직하게는 약 45% 이상, 보다 바람직하게는 약 50% 이상 및 가장 바람직하게는 약 60% 이상의 GC 함량을 갖는 암호 서열로부터 최적으로 달성된다. 낮은 GC 함량을 갖는 미생물의 뉴클레오타이드 서열은 메시지를 불안정하게 할 수 있는 ATTTA 모티프 및 부적절한 폴리아데닐화를 유발할 수 있는 AATAAA 모티프의 존재로 인해 식물내에서 불량하게 발현할 수 있다. 비록 바람직한 유전자 서열이 적절하게 단자엽식물 및 쌍자엽식물 종 모두에서 발현될 수 있다 해도, 서열은 선호도가 상이하게 나타남에 따라[참조문헌: Murray et al., Nucl. Acids Res. 17: 477-498 (1989))] 단자엽식물 또는 쌍자엽식물의 특정한 코돈 선호도 및 GC 함량 선호도를 책임지도록 변형시킬 수 있다. 또한, 뉴클레오타이드는 메시지 절단을 유발할 수 있는 변칙적인 스플라이싱(splicing) 부위의 존재를 선별한다. 상기 기술한 바와 같은 뉴클레오타이드 서열내에서 이루어질 필요가 있는 모든 변형은 부위 지정 돌연변이유발, PCR 등, 및 공개 특허원 EP 0 385 962, EP 0 359 472 및 WO 93/07278에 기술된 방법을 사용한 유전자 합성법과 같은 익히 공지된 기술을 사용하여 이루어진다.
해독의 효율적인 개시를 위해 개시 메티오닌에 인접한 서열은 변형을 요할 수 있다. 예를 들어, 식물에서 효과적인 것으로 공지된 서열을 삽입하여 변형시킬 수 있다. 조시(Joshi)는 식물에 적절한 컨센서스(consensus)를 보고한 바 있으며[참조문헌: NAR 15: 6643-6653 (1987)] 클론테크(Clontech)는 추가의 컨센서스 해독 개시인자를 제시하고 있다[참조문헌: 1993/1994 catalog, page 210]. 이들 컨센서스는 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 함께 사용하기에 적합하다. 상기 서열들은 ATG를 포함하여 여기까지(제2 아미노산은 변형되지 않은 상태로 남아 있음) 또는 ATG 다음의 GTC를 포함하여 여기까지(형질전환유전자의 제2 아미노산이 변형될 가능성이 있음)의 뉴클레오타이드 서열을 포함한 작제물내로 삽입된다.
형질전환 식물내에서 뉴클레오타이드 서열의 발현은 식물에서 기능적인 것으로 나타난 프로모터에 의해 추진된다. 프로모터의 선택은 발현을 위한 시공간적인 요건 및 표적 종에 따라 다양할 수 있다. 따라서, 잎, 열매, 화서(예: 수상화서, 원추화서, 속대(cob) 등), 뿌리 및/또는 종자에서의 본 발명의 뉴클레오타이드 서열의 발현이 바람직하다. 그러나, 다수의 경우에 한 종류 이상의 해충에 대한 보호가 요구되므로 다수의 조직에서의 발현이 바람직하다. 쌍자엽식물의 많은 프로모터가 단자엽식물에서 작동되고 반대로 단자엽 식물의 많은 프로모터가 쌍자엽식물에서 작동되는 것으로 제시되어 왔으나, 쌍자엽식물에서의 발현에는 쌍자엽 프로모터가 선택되고 단자엽식물에서의 발현에는 단자엽식물 프로모터가 선택되는 것이 이상적이다. 그러나, 선택된 프로모터의 유래에 대한 제한은 없으며, 즉, 이들 프로모터가 목적하는 세포에서 뉴클레오타이드 서열의 발현을 추진하는데 작용하는 것이면 충분하다.
구조적으로 발현되는 바람직한 프로모터로는 액틴 또는 유비퀴틴을 암호화하는 유전자로부터의 프로모터, 및 CaMV 35S 및 19S 프로모터가 포함된다. 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 또한 화학적으로 조절되는 프로모터의 조절하에서 발현될 수 있다. 이는 작물이 유도 화학물질로 처리된 경우에만 살충성 독소가 합성되게 할 수 있다. 유전자 발현의 화학적 유도에 바람직한 기술은 공개 출원 제EP 0 332 104호 및 미국 특허 제5,614,395호에 상세히 기술되어 있다. 화학적 유도에 바람직한 프로모터는 담배 PR-1a 프로모터이다.
프로모터의 바람직한 카테고리는 상처 유도성인 것이다. 상처 부위 및 식물병원체의 감염 부위에서 발현하는 많은 프로모터들이 기술되어 있다. 이상적으로, 이러한 프로모터는 감염 부위에서만 국소적으로 활성을 나타내며, 이러한 방식으로 침입 해충을 치사시키는 살충성 독소를 합성하는데 필요한 살충성 독소만이 세포내 에 축척된다. 이러한 종류의 바람직한 프로모터로는 문헌[참조문헌: Stanford et al., Mol. Gen. Genet. 215: 200-208 (1989), Xu et al., Plant Molec. Biol. 22: 573-588 (1993), Logemann et al., Plant Cell 1: 151-158 (1989), Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22: 783-792 (1993), Firek et al. Plant Molec. Biol. 22: 129-142 (1993) and Warner et al., Plant J. 3: 191-201 (1993)]에 기술된 프로모터가 포함된다.
바람직한 조직 특이적 발현 패턴은 녹색 조직 특이적, 뿌리 특이적, 줄기 특이적, 과실 특이적 및 꽃 특이적인 것을 포함한다. 녹색 조직에서의 발현에 적합한 프로모터로는 광합성에 관련된 유전자를 조절하는 많은 것들이 포함되며 이들 중에서 다수가 단자엽식물 및 쌍자엽식물로부터 클로닝되어 왔다. 바람직한 프로모터는 포스포에놀 카르복실라제 유전자로부터의 옥수수 PEPC 프로모터이다[참조문헌: Hudspeth & Grula, Plant Molec. Biol. 12: 579-589 (1989)]. 뿌리 특이적 발현에 바람직한 프로모터는 문헌[참조: de Framond, FEBS 290: 103-106 (1991); EP 0 452 269]에 기술된 옥수수 메탈로티오네인(metallothinein)형 프로모터이다. 바람직한 줄기 특이적 프로모터는 미국 특허 제5,625,136호에 기술되어 있는 것으로 옥수수 trpA 유전자의 발현을 추진하는 프로모터이다.
본 발명의 특히 바람직한 양태는 뿌리에 바람직한 또는 뿌리-특이적 방식으로 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 중 하나 이상을 발현하는 형질전환 식물이다. 추가의 바람직한 양태는 상처-유도성 또는 병원체 감염-유도성 방식으로 뉴클레오타이드 서열을 발현하는 형질전환 식물이다.
적합한 프로모터의 선택 이외에, 살충성 독소를 식물내에서 발현하기 위한 작제는 이종 뉴클레오타이드 서열의 하부에 연결되는 적절한 전사 터미네이터를 요한다. 이러한 터미네이터의 몇 가지는 입수가능하며 당해 분야에 공지되어 있다(예: CaMV로부터 tm1, rbcS로부터의 E9). 식물에서 작용하는 것으로 공지된 모든 입수가능한 터미네이터를 본 발명에서 사용할 수 있다.
다수의 다른 서열을 본 발명에 기술된 DNA 분자용 발현 카세트내로 혼입할 수 있다. 이들 서열로는 인트론 서열(예: Adh1 및 bronze1로부터의 인트론 서열) 및 바이러스 리더 서열(예: TMV, MCMV 및 AMV로부터의 리더 서열)과 같이 발현을 증강시키는 것으로 나타난 서열이 포함된다.
본 발명의 뉴클레오타이드 서열의 발현이 식물내의 상이한 세포내 국재화를 표적으로 하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 경우에서, 세포질내의 국재화가 바람직할 수 있으며, 다른 경우에서는 일부 아세포 소기관내의 국재화가 바람직할 수 있다. 효소를 암호화하는 형질전환유전자의 아세포 국재화는 당해 분야에 익히 공지된 기술을 사용하여 이루어진다. 통상적으로, 공지된 소기관을 표적으로 하는 유전자 생성물로부터의 표적 펩타이드를 암호화하는 DNA를 조작하고 뉴클레오타이드 서열의 상부에 융합시킨다. 이러한 다수의 표적 세열은 엽록체용으로 공지되어 있으며, 이종 작제물에서의 이의 작용이 제시되어 있다. 본 발명의 뉴클레오타이드의 발현은 또한 숙주 세포의 소포체 또는 액포를 표적으로 한다. 이를 달성하기 위한 기술은 당해 분야에 익히 공지되어 있다.
식물의 형질전환에 적합한 벡터는 본 명세서의 다른 곳에도 기술되어 있다. 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 형질전환을 위해 하나 이상의 T-DNA 경계 서열을 지니는 이원 벡터 또는 하나 이상의 T-DNA 경계 서열을 지닌 벡터가 적합한 반면, 직접적인 유전자 전달을 위해서는 어떠한 백터도 적합하며 관심있는 작제물만을 함유한 선형 DNA가 바람직할 수 있다. 직접적인 유전자 전달의 경우에, 단일 DNA 종으로의 형질전환 또는 동시형질전환이 사용될 수 있다[참조문헌: Schocher et al. Biotechnology 4: 1093-1096 (1986)]. 직접적인 유전자 전달 및 아그로박테리움-매개된 전달 둘다의 경우, 형질전환은 통상적으로(반드시 필수적인 것은 아니지만) 항생제(예: 가나마이신, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트) 또는 제초제(바스타)에 대한 내성을 제공할 수 있는 선택성 마커를 사용하여 수행한다. 그러나, 이러한 마커의 예로는, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제, 디하이드로폴레이트 리덕타제, 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼사제, 2, 2-디클로로프로피온산 데할로게나제, 아세토하이드록시산 신타제, 5-에놀피루빌-시키메이트-포스페이트 신타제, 할로아릴니트릴라제, 프로토포르히리노겐 옥시다제, 아세틸-코엔자임 A 카복실라제, 디하이드로프테로에이트 신타제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 및 β-글루쿠로니다제가 있다. 명확한 선택을 제공하는 또 다른 종류의 마커로는 만노스 만노스-6-포스페이트 이소머라제를 대사시키는 능력을 제공하는 만노스-6-포스페이트 이소머라제(MPI/PMI) 유전자가 있다. 그러나, 식물 형질전환을 위한 선택가능한 또는 선별가능한 마커의 선택은 본 발명에서 중요하지 않다.
상기 기술한 재조합 DNA는 당해에 인정된 다수의 방식으로 식물 세포내로 도입할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 방법의 선택이 형질전환의 대상이 되는 식물의 종류에 따라 결정된다는 것을 이해할 것이다. 식물 세포를 형질전환시키기에 적합한 방법으로는 미세주입[참조문헌: Crossway et al., BioTechniques 4:320-334 (1986)], 전기천공[참조문헌: Riggs at al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606 (1986)], 아그로박테리움-매개된 형질전환[참조문헌: Hinchee et al., Biotechnology 6:915-921 (1988); Ishida et al., Nature Biotechnology 14:745-750 (June 1996)(옥수수 형질전환에 관해)], 직접적인 유전자 전달[참조문헌: Paszkowski et al., EMBO J. 3:2717-2722 (1984); Hayashimoto et al., Plant Physiol. 93:857-863 (1990)](벼), 및 아그라세투스 인코포레이티드(Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin) 및 듀퐁 인코포레이티드(Dupont, Inc., Wilmington, Dalaware)에서 입수한 장비를 사용한 탄도 입자 가속이 포함된다[참조문헌: Sanford et al., 미국 특허 제4,945,050호; 및 McCabe et al., Biotechnology 6:923-926(1988); Weissinger et al., Annual Rev. Genet. 22:421-477(1988); Sanford et al., Particulate Science and Technology 5:27-3791987)(양파); Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8526-8530(1990)(담배 엽록체); Christou et al., Plant Physiol. 87:671-674(1998)(대두); McCabe et al., Bio/Technology 6:923-926(1998)(대두); Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4305-4309(1998)(옥수수); Klein et al., Bio/Technology 6:559-563(1988)(옥수수); Klein et al., Plant Physiol. 91:440-444(1998)(옥수수); Fromm et al., Bio/Technology 8:833-839(1990); and Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603-618(1990)(옥수수); Koziel et al., Biotechnology 11:194-200(1993)(옥수수); Shimamoto et al., Nature 338:274-277(1998)(벼); Christou et al., Biotechnology 9:957-962(1991)(벼); Datta et al., Bio/Technology 8:736-740(1990)(벼); 유럽 특허원 제EP 0 332 581호(오리새 및 기타 벼과); Vasil et al., Biotechnology 11:1153-1558(1993)(밀); Weeks et al., Plant Physiol. 102:1077-1084(1993)(밀); Wan et al., Plant physiol. 104:37-48(1994)(보리); Jahne et al., Theor. Appl. Genet. 89:525-533(1994)(보리); Umbeck et al., Bio/Techonology 5:263-266(1987)(면화); Casas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11212-11216(Dec. 1993)(수수); Somer et al., Bio/Technology 10:1589-1594(Dec. 1992)(귀리), Torbert et al., Plant Cell Reports 14:635-640(1995)(귀리); Weeks et al., Plant Physiol. 102:1077-1084(1993)(밀); Chang et al., WO 94/13822(밀) and Nehra et al., The Plant Journal 5:285-297(1994)(밀)]. 재조합 DNA 분자를 미세사출성 충격(microprojectile bombardment)에 의해 옥수수내로 도입하기에 특히 바람직한 양태는 문헌[참조문헌: Koziel et al., Biotechnology 11: 194-200 (1993), Hill et al., Euphytica 85:119-123 (1995) 및 Koziel et al., Annals of the New York Academy of Sciences 792:164-171 (1996)]에서 찾아볼 수 있다. 추가의 바람직한 양태는 EP 0 292 435에 기술된 옥수수용 원형질체 형질전환 방법이다. 식물의 형질전환은 단일 DNA 종 또는 다수의 DNA 종(즉, 동시형질전환)으로 이루어질 수 있으며 이들 두 기술은 본 발명의 암호화 서열과 함께 사용하기에 적합하다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 플라스미드 게놈내로 직접적으로 형질전환된다. 색소체 형질전환의 주된 잇점은 색소체가 일반적으로 충분한 변형없이도 세균 유전자를 발현할 수 있으며 단일 프로모터의 조절하에 다수의 개방 판독 프레임을 발현할 수 있다는 점이다. 색소체 형질전환 기술은 미국 특허 제5,451,513호, 제5,545,817호 및 제5,545,818호, PCT 출원 제WO 95/16783호 및 문헌[참조문헌: McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7301-7305]에 광범위하게 기술되어 있다. 엽록체 형질전환용 기본 기술은, 예를 들어, 생물제제 또는 원형질체 형질전환(예: 염화칼슘 또는 PEG 매개된 형질전환)을 사용하여 선택가능한 마커에 플랭킹된 클로닝된 색소체 DNA의 영역과 함께 관심있는 유전자를 적합한 표적 조직내로 도입하는 것과 관련된다. 표적 서열로 지정한 1 내지 1.5kb 플랭킹 영역은 색소체 게놈과의 상동 재조합을 용이하게 하며 이로써 플라스톰(plastome)의 특정 영역의 치환 또는 변형을 가능케 한다. 처음에는, 엽록체 16S rRNA에서의 점 돌연변이 및 스펙티노마이신 및/또는 스트렙토마이신에 대한 내성을 제공하는 rps12 유전자를 형질전환에 대한 선택가능한 마커로서 사용한다[참조문헌: Svab, Z., Hajdukiewicz, P., and Maliga, P. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8526-8530; Staub, J. M., and Maliga, P. (1992) Plant Cell 4, 39-45]. 이로 인해 표적 잎의 100회 충돌당 약 1회의 빈도로 안정한 일원형체성 형질전환체가 생성된다. 이들 마커 간의 클로닝 부위의 존재는 외래 유전자의 도입을 위한 색소체 표적 벡터의 형성을 가능케 했다[참조문헌: Staub, J. M., and Maliga, P.(1993) EMBO J. 12: 601-606]. 형질전환 빈도의 실질적인 증가는 열성 rRNA 또는 r-단백질 항생제 내성 유전자를 우성 선택가능한 마커(스펙티노마이신-해독 효소 아미노글리코시드-3'-아데닐트랜스퍼라제를 암호화하는 세균 aadA 유전자)로 대체함으로써 수득한다[참조문헌: Svab, Z., and Maliga, P. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 913-917]. 이전에, 상기 마커는 녹조류 클라미도모나스 레인하드티의 색소체 게놈의 고-빈도 형질전환에 성공적으로 사용되었다[참조문헌: Goldschmidt-Clermont, M. (1991) Nucl. Acids Res. 19, 4083-4089]. 색소체 형질전환에 유용한 기타 선택가능한 마커는 당해 분야에 공지되어 있으며 본 발명의 범주에 포함된다. 통상적으로 형질전환 후에 약 15회 내지 20회의 세포분열 주기가 일원형체성 상태에 도달하는데 요구된다. 유전자가 상동 재조합에 의해 각각의 식물 세포내에 존재하는 환상 색소체 게놈의 모든 수천개의 복사체에 삽입되는 색소체 발현은 전체 가용성 식물 단백질의 10%를 쉽게 초과할 수 있는 발현 수준을 허용하는 핵-발현된 유전자에 비해 보다 유리한 막대한 복제수를 사용한다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 색소체 표적 벡터내로 삽입되어 목적하는 식물 숙주의 색소체 게놈내로 형질전환된다. 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 색소체 게놈에 대해 일원형체성이며, 바람직하게는 당해 뉴클레오타이드 서열을 고도로 발현할 수 있는 식물이 수득된다.
본 발명은 다음의 상세한 실시예를 참조로 하여 추가로 설명될 것이다. 이 들 실시예는 단지 설명을 위해 제공되며 달리 명시하지 않는 한 제한되지 않는다. 본원에서 사용되는 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당해 분야에 익히 공지되어 있으며 문헌[참조문헌: Ausubel (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994); T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1989); 및 T.J. Silhavy, M.L.Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1984)]에 기술되어 있다.
실시예 1: H04 독소 단편의 발현 및 정제
필수적으로 Cry1Ab의 도메인 I과 II 및 Cry1C의 도메인 III으로 이루어진 Bt 독소를 암호화하는 H04 하이브리드 독소 유전자로부터 절단된 형태(문헌[참조문헌: De Maagd et al., Appl. Environ. Microbiol. 62(5): 1537-1543 (1996)]에 기술되어 있음)를 이. 콜라이에서 과발현시키기 위해 pBluescript SK-, 바실러스 셔틀 벡터 또는 pET 21b(+)와 같은 발현 벡터내로 클로닝시킨다. 세포를 50㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 LB 배지에서 24시간 내지 48시간 동안 37℃ 진탕기(250rpm)로 증식시킨다. 세포를 10분 동안 7,000rpm에서 원심분리하여 수거한다. 펠렛을 브론슨(Bronson) 초음파기를 사용하여 10분 동안 2초 펄스로 초음파처리한다. 완전한 초음파처리를 현미경으로 점검한다. 가용성 분획을 10,000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 제거한다. 결정 단백질을 함유하는 생성된 펠렛을 0.5M NaCl을 함유 하는 2% 트리톤 X-100로 4회 내지 5회 세척한다. 0.5M NaCl(4 내지 5배)로 연속적으로 세척하고 최종 펠렛을 증류수(2배)로 세척한다. 수득되는 펠렛은 37℃에서 2시간 동안 10mM 디티오트레이톨을 함유하는 50mM Na2CO3 완충액속에 가용성이다. 가용화된 단백질을 12,000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 불용성 물질로부터 분리한다. 단백질 샘플을 생물검정을 위해 50mM Na2CO3 완충액(pH 9.0)으로 투석한다.
실시예 2: 생물검정
LC50를, 예를 들어, 실시예 1에서 상기 기술한 바와 같이 생성된 정제된 절단된 H04 단백질을 사용하여 밤나방, 분홍면화씨벌레, 담배나방 및 유럽조명나방에서 수행한다. 결과는 다음과 같다:
LC50 밤나방 133ng/cm2
LC50 분홍면화씨벌레 691ng/cm2
LC50 담배나방 299ng/cm2
LC50 유럽조명나방 31ng/cm2
실시예 3: 합성 H04 유전자 작제
H04의 독성 부분을 암호화하는 합성 뉴클레오타이드 서열은, 옥수수 선호도 코돈 표[참조문헌: Murray et al., Nucl Acids Res. 17:477-498, 1989; 이는 본원 에 참조로 인용된다]를 사용한 프로그램의 위스콘신 대학 GCG 프로그램 그룹에서 개발된 "Backtranslation" 프로그램을 사용하여, 문헌[참조문헌: De Maagd et al., Appl. Environ. Microbiol. 62(5): 1537-1543 (1996)]에 기술된 H04 하이브리드 독소 단편(Cry1Ab의 도메인 I과 II 및 Cry1C의 도메인 III)의 아미노산 서열을 역방향전사(backtrnaslating)시켜 디자인한다. 바람직하게는, 가장 빈번하게 사용된 옥수수 코돈을 WO 93/07278에 기술된 바와 같이 각각의 아미노산에 대해 사용한다.
H04의 독소 부분을 암호화하는 합성 뉴클레오타이드 서열은 수개의 단편으로서 작제할 수 있다. 각 단편은 유전자의 쇄 둘다를 나타내는 60 내지 75개 뉴클레오타이드 길이의 올리고머 10쌍을 하이브리드화하여 작제한다. 정확한 배향 및 집합을 위해 약 15개 뉴클레오타이드 중복부를 순차적 올리고뉴클레오타이드 쌍 사이에 디자인한다. 올리고뉴클레오타이드는 예를 들어, 제노시스 바이오테크놀로지(Genosys Biotechnologies Inc., TX)에 의해 작제될 수 있다. 올리고머의 각 쌍을 하이브리드화하고, 예를 들어, 판매원이 명시한 조건으로 효소 폴리뉴클레오타이드 키나제(제조원: New England Biolabs, Inc., MA)를 사용하여 인산화시킨다. 이어서 인산화된 단편 쌍을 예를 들어, 암피실린 내성 유전자를 함유하는 고복제 플라스미드 벡터내로 하이브리드 및 연결시키고, 예를 들어, 수용능이 있는 DH5α세포내로 형질전환시킨다. 상기 세포를 암피실린 함유 배지에 도말하고 37℃에서 밤새 배양한다. 콜로니를 삽입된 DNA에 대해 선별한다. DNA를 서열화하고 정확한 서열을 함유하는 클론을 선택한다. 이어서 단편을 단편들 사이의 고유한 제한 부위를 사용한 제한 분해, 연결 및 형질전환에 의해 연결시킨다.
서열 3은 H04의 631개 아미노산 독소 부위(전독소 테일 영역을 함유하지 않음)를 암호화하는 합성 뉴클레오타이드 서열을 나타내며, 서열 4는 서열 3에 설명된 합성 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 H04 독소의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열 11은 서열 3에 제시된 합성 H04 유전자 서열에 작동적으로 연결된 구성적 옥수수 유비퀴틴 프로모터를 함유하는 작제물 pNOV1308의 아미노산 서열을 나타낸다.
H04 하이브리드의 독소 부분(Cry1Ab의 도메인 I과 II 및 Cry1C의 도메인 III)만을 암호화하는 상기 기술한 합성 유전자(서열 3) 이외에, 추가의 합성 H04 유전자를, 미국 특허 제5,625,136호(본원에서 참조로 인용된다)에 기술된 합성 cry1Ab 테일 영역 모두 또는 일부를 H04 독소 부분의 3' 말단에 융합시켜 작제한다.
서열 5는 H04의 독소 부분을 암호화하는 합성 뉴클레오타이드 서열과 전장 Cry1Ab 테일 부분을 암호화하는 합성 뉴클레오타이드 서열을 제시하며, 서열 6은 서열 5에 설명된 합성 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 H04+Cry1Ab 테일의 아미노산 서열을 제시한다. 서열 12는 서열 5에 제시된 합성 H04 유전자 서열에 작동적으로 연결된, 뿌리에 바람직한 옥수수 MTL 프로모터를 함유하는 작제물 pNOV1436의 뉴클레오타이드 서열을 제시한다. 서열 13은 서열 5에 제시된 합성 H04 유전자 서열에 작동적으로 연결된 구성적 옥수수 유비퀴틴 프로모터를 함유하는, 작제물 pNOV1441의 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열 7은 H04의 독소 부분과 전장 Cry1Ab 테일 부분을 암호화하는 또 다른 합성 뉴클레오타이드 서열을 제시하며, 서열 8은 서열 7에 설명된 합성 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 H04+Cry1Ab 테일의 아미노산 서열을 제시한다. 서열 14는 서열 7에 제시된 합성 H04 유전자 서열에 작동적으로 연결된 구성적 옥수수 유비퀴틴 프로모터를 함유하는 작제물 pNOV1305의 뉴클레오타이드 서열을 제시한다. 서열 15는 서열 7에 제시된 합성 H04 유전자 서열에 작동적으로 연결된 구성적 옥수수 유비퀴틴 프로모터를 함유하는 작제물 pNOV1313의 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열 9는 H04의 독소 부분과 Cry1Ab 테일의 단지 처음 40개의 아미노산을 암호화하는 합성 뉴클레오타이드 서열을 제시하며, 서열 10은 서열 9에 설명된 합성 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 H04+40개 아미노산으로 절단된 Cry1Ab 테일의 아미노산 서열을 제시한다. 서열 16은 서열 9에 제시된 합성 H04 유전자 서열에 작동적으로 연결된 뿌리에 바람직한 옥수수 MTL 프로모터를 함유하는 작제물 pNOV1435의 뉴클레오타이드 서열을 제시한다. 서열 17은 서열 9에 제시된 합성 H04 유전자 서열외에 작동적으로 연결된 아라비돕시스 액틴-2 프로모터를 함유하는 작제물 pZU578의 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
실시예 4: 암호화 서열 및 인접 서열의 변형
본원에서 기술하는 뉴클레오타이드 서열은 형질전환 숙주 세포에서 발현시키기 위해 변형시킬 수 있다. 당해 뉴클레오타이드 서열을 발현하며 세포내에서 살충성 독소를 생산하는 숙주 식물는 곤충 공격에 대한 증강된 내성을 나타내며, 이 로써 이러한 공격과 관련된 작물 손실을 방지하는데 필요한 것을 보다 잘 갖추고 있다.
미생물원으로부터 유래된 유전자의 식물내 형질전환 발현은 식물에서 당해 유전자 발현을 달성하고 최적화하기 위해 당해 유전자의 변형을 요할 수 있다. 특히, 개별적인 효소를 암호화하나 천연 미생물내에서 동일한 전사체에 의해 암호화되는 세균 ORF는 식물에서 개별적 전사체로서 유수하게 발현된다. 이를 달성하기 위해, 각각의 미생물 ORF를 개별적으로 분리하고, 당해 ORF의 5' 말단에 식물 프로모터 서열을, ORF의 3' 말단에 식물 전사 터미네이터를 제공하는 카세트내에서 클로닝시킨다. 분리된 ORF 서열은 바람직하게는 개시 ATG 코돈 및 종결 STOP 코돈을 포함하나, 개시 ATG 및 STOP 코돈 이외의 추가 서열을 포함할 수 있다. 또한, ORF는 절단뒬 수 있으나 필요한 활성은 여전히 유지할 수 있으며, 활성을 유지하는 절단된 형태인, 특히 긴 ORF가 형질전환 유기체내의 발현에서 바람직할 수 있다. "식물 프로모터" 및 "식물 전사 터미네이터"란, 식물 세포내에서 작동하는 프로모터 및 전사 터미네이터를 의미한다. 이는 바이러스(예: 컬리플라워 모자이크 바이러스)와 같은 비-식물 공급원으로부터 유래될 수 있는 프로모터 및 전사 터미네이터를 포함한다.
일부 경우에서, ORF 암호화 서열 및 인접 서열의 변형이 요구된다. 변형은 관심있는 ORF를 함유하는 단편을 분리하고 이를 식물 프로모터의 하부에 삽입하는는 것만으로 충분하다. 예를 들어, 가프니(Gaffney) 등[참조문헌: Science 261: 754-756 (1993)]은 슈도모나스 nahG 유전자를, 암호화 서열을 변형시키지 않고 ATG 의 상부에 위치하는 슈도모나스 유전자 x bp와 STOP 코돈의 하부에 위치하는 y bp를 nahG ORF에 연결시킨채 CaMV 35S 프로모터 및 CaMV tml 터미네이터의 조절하에 형질전환 식물내에서 성공적으로 발현시킨 바 있다. 바람직하게는, 가능한 한 소량의 인접 미생물 서열이 ATG의 상부 및 STOP 코돈의 하부에 연결되어야 한다. 사실상, 이러한 작제는 제한 부위의 유용성에 따라 좌우될 수 있다.
다른 경우에서, 미생물원으로부터 유래된 유전자의 발현은 발현에 있어 문제를 제공할 수 있다. 이들 문제는 당해 분야에 잘 설명되어 있으며, 특히 바실러스와 같은 특정 공급원으로부터 유래된 유전자에서는 통상적인 것이다. 이들 문제는 본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 적용될 수 있으며 이들 유전자의 변형을 당해 분야에 익히 공지된 기술을 사용하여 이룰 수 있다. 직면할 수 있는 문제는 다음과 같다:
1. 코돈 용법
식물에서 바람직한 코돈 용법은 특정 미생물에서 바람직한 코돈 용법과 다르다. 클로닝된 미생물 ORF내의 코돈 용법과 식물 유전자(및 특히 표적 식물로부터의 유전자)에서의 용법을 비교하여, 바람직하게는 변형되어야 하는 ORF내에서 코돈을 동정할 수 있다. 통상적으로, 식물 진화는 단자엽식물의 제3 염기 위치에서 뉴클레오타이드 C 및 G를 강하게 선호하는 경향이 있는 반면에, 쌍자엽식물은 흔히 상기 위치에 뉴클레오타이드 A 또는 T를 사용한다. 유전자를 변형시켜 특정 표적 형질전환 식물에 바람직한 코돈 용법을 포함하도록 함으로써, 하기에서 기술하는 GC/AT 함량 및 변칙적 스플라이싱에 관한 다수의 문제를 해결할 수 있다.
2. GC/AT 함량
식물 유전자는 통상적으로 35% 이상의 GC 함량을 지닌다. A 및 T 뉴클레오타이드가 풍부한 ORF 서열은 식물에서 몇 가지 문제를 일으킬 수 있다. 먼저, ATTTA 모티프는 메세지의 불안정화를 유발하는 것으로 사료되며 반감기가 짧은 많은 mRNA의 3' 말단에서 발견된다. 둘째로, 메세지내의 부적절한 위치에서 AATAAA와 같은 폴리아데닐화 시그날의 발생은 전사의 조기 중단을 유발하는 것으로 사료된다. 또한, 단자엽식물은 AT가 풍부한 서열을 스플라이싱 부위로서 인식할 수 있다(하기 참조).
3. 개시 메티오닌에 인접한 서열
식물은 이의 메세지가 한정된 리보좀 결합 부위를 지니지 않는다는 점에서 미생물과 구별된다. 오히려, 리보좀이 메세지의 5' 말단에 결합하여 전사가 개시되는 첫번째 유효한 ATG를 탐색하는 것으로 사료된다. 그럼에도 불구하고, ATG에 인접한 특정 뉴클레오타이드에 대한 선호도가 있으며 미생물 유전자의 발현은 ATG에 진핵 컨센서스 전사 개시인자를 포함시킴으로써 증강시킬 수 있다. 클론텍[참조문헌: 1993/1994 catalog, page 210; 이는 본원에서 참조로 인용된다]은 한 서열을 식물에서 이. 콜라이 uidA 유전자를 발현시키기 위한 컨센서스 전사 개시인자로서 제시한 바 있다. 또한, 조시[참조문헌: NAR 15:6643-6653 (1987), 이는 본원에 참조로 인용된다]는 ATG에 인접한 다수의 식물 서열을 비교하였고 다른 컨센서스 서열을 제시한 바 있다. 식물에서 미생물 ORF의 발현시키는데 어려움에 직면한 상황하에서는 이들 서열 중 하나를 개시 ATG에 포함시켜 전사를 개선시킬 수 있다. 이러한 경우에, 컨센서스의 마지막 3개의 뉴클레오타이드는 이의 두번째 AA 잔기의 변형으로 인해, 변형된 서열내에 포함시키기에 적절하지 않을 수 있다. 개시 메티오닌에 인접한 바람직한 서열은 상이한 식물 종 간에 상이할 수 있다. 진뱅크(GenBank) 데이터베이스에 위치한 14개의 옥수수 유전자의 조사는 다음 결과를 제공한다:
14개 옥수수 유전자에서 개시 ATG 앞의 위치
상기 분석은 뉴클레오타이드 서열이 혼입된 목적하는 식물 종, 및 바람직한 뉴클레오타이드를 포함하도록 변형된 ATG에 인접한 서열에 대해 수행할 수 있다.
4. 변칙적 스플라이싱 부위의 제거
비-식물 공급원으로부터 클로닝되었으며 식물에서의 발현에 최적화되지 않은 유전자는 식물에서 5' 또는 3' 스플라이싱 위치로서 인식되고 절단될 수 있기 때문에 절단되거나 결실된 메세지를 생성할 수 있는 모티프를 함유할 수도 있다. 이들 부위는 당해 분야에 익히 공지된 기술을 사용하여 제거할 수 있다.
암호화 서열 및 인접 서열을 변형시키기 위한 기술은 당해 분야에 익히 공지 되어 있다. 미생물 ORF의 초기 발현이 저조하고 상기 기술한 서열에 대한 변경이 이루어지는 것이 바람직하다고 간주되는 경우에, 합성 유전자의 작제를 당해 분야에 익히 공지된 방법에 따라서 달성할 수 있다. 이들 방법은 예를 들어, 모두 본원에서 참조로 인용되는 공개특허공보 제EP 0 385 962호, 제EP 0 359 472호 및 제WO 93/07278호에 기재되어 있다. 대부분의 경우에 유전자 작제물의 발현은 유전자를 형질전환 식물로 전달시키기 전에 일시적 검정 프로토콜(이는 당해 분야에 익히 공지되어 있다)을 사용하여 검정하는 것이 바람직하다.
실시예 5: 식물 발현 카세트의 작제
먼저, 형질전환 식물에서 발현시키고자 하는 암호화 서열을 식물에서 발현가능한 적합한 프로모터 뒤에서 발현 카세트로서 집합시킨다. 발현 카세트는 형질전환유전자의 발현을 위해 필요하거나 선택된 임의 추가의 유전자를 포함할 수도 있다. 이러한 서열은 전사 터미네이터, 발현을 증강시키는 외인성 서열(예: 인트론), 중추적 서열, 및 유전자 생성물을 특정 기관 및 세포 격실로 표적화시키기 위한 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이로써 이러한 발현 카세트는 하기에서 기술하는 형질전환 벡터로 쉽게 전달시킬 수 있다. 다음은 통상의 발현 카세트의 다양한 성분에 관한 설명이다.
1. 프로모터
발현 카세트에서 사용되는 프로모터의 선택은 형질전환 식물내의 형질전환유전자의 시공간적 발현 패턴을 결정할 수 있다. 선택된 프로모터는 특정 세포 유형(예: 잎 상피세포, 잎살 세포, 뿌리 피질 세포) 또는 특정 조직이나 기관(예: 뿌리, 잎 또는 꽃)에서 특정 형질전환유전자를 발현할 수 있으며, 선택은 유전자 생성물의 목적하는 축적 위치를 반영할 수 있다. 또는, 선택된 프로모터는 유도성 조건하에 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 프로모터는 이의 강도, 즉 전사를 촉진하는 능력이 다양하다. 사용되는 숙주 세포 시스템에 따라서, 유전자의 천연 프로모터를 포함하여, 다수의 적합한 프로모터의 어느 하나를 사용할 수 있다. 다음은 발현 카세트에서 사용될 수 있는 프로모터의 비제한적 예이다.
a. 구성적 발현, 유비퀴틴 프로모터:
유비퀴틴은 많은 세포 유형에서 축적되어 있는 것으로 공지된 유전자 생성물로서, 형질전환 식물에 사용하기 위해 수가지 종으로부터 이의 프로모터가 클로닝되었다(예: 해바라기[참조문헌: Binet et al. Plant Science 79:87-94(1991)], 옥수수[참조문헌: Christensen et al. Plant Molec.Biol. 12:619-632(1989)]). 옥수수 유비퀴틴 프로모터는 형질전환 단자엽식물에서 개발되었으며, 이의 서열과 단자엽식물 형질전환을 위해 작제한 벡터가 본원에서 참조로 인용되는 특허 공보 제EP 0 342 926호에 기재되어 있다. 또한, 문헌[참조문헌: Taylor et al., Plant Cell Rep. 12: 491-495 (1993)]에는 옥수수 유비퀴틴 프로모터와 제1의 인트론을 포함하며 벡터 및 미세사출성 충격을 통해 도입시킨 경우 다수의 단자엽식물의 세포 현탁액중에서 활성이 높은 벡터가 기재되어 있다. 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 함께 사용하기에는 아라비돕시스 유비퀴틴 프로모터가 이상적이다. 당해 유비퀴틴 프로모터는 형질전환 식물, 단자엽식물 및 쌍자엽식물 둘다에서의 유전자 발현에 적합하다. 적합합 벡터는 pAHC25의 유도체 또는 적절한 유비퀴틴 프로모터 및/또는 인트론 서열을 도입시켜 변형시킨 것으로서, 본원에서 기술하는 임의 형질전환 벡터이다.
b. 구성적 발현, CaMV 35S 프로모터:
플라스미드 pCGN1761의 작제는 본원에서 참조로 인용되는 공개 특허원 제EP 0 392 225호(실시예 23)에 기재되어 있다. pCGN1761은 "이중" CaMV 35S 프로모터, tml 전사 터미네이터 및 상기 프로모터와 터미네이터 사이의 고유한 EcoRI 부위를 포함하고 pUC형의 골격을 갖는다. pCGN1761의 유도체는 기존의 EcoRI 부위 이외에 NotI 및 XhoI 부위를 포함하는 변형된 폴리링커를 갖도록 작제한다. 상기 유도체를 pCGN1761ENX라 지정한다. pCGN1761ENX는 형질전환 식물에서 35S 프로모터의 조절하에 발현시키기 위해 이의 폴리링커내의 cDNA 서열 또는 암호화 서열(미생물 ORF 서열을 포함)을 클로닝하는데 유용하다. 이러한 작제물의 전체 35S 프로모터-암호화 서열-tml 터미네이터 카세트는, 하기 기술하는 바와 같은 형질전환 벡터로 전달시키기 위해 상기 프로모터의 5'에 위치하는 HindIII, SphI, SalI 및 XbaI 부위에서 절단될 수 있고, 터미네이터의 3'에 위치하는 XbaI, BamHI 및 BglI 부위에서 절단할 수 있다. 또한, 다른 프로모터로 대체하기 위해, 이중 35S 프로모터 단편을 HindIII, SphI, SalI, XbaI 또는 PstI로 5' 절단하고 폴리링커 제한 부위(EcoRI, NotI 또는 XhoI) 중 임의 부위 3' 절단하여 제거할 수 있다. 경우에 따라, 클로닝 부위 주변의 변형을 전사를 증강시킬 수 있는 서열을 도입하여 이룰 수 있다. 이는 특히 과발현이 바람직한 경우 유용하다. 예를 들어, pCGN1761ENX 는 본원에서 참조로 인용되는 미국 특허 제5,639,949호의 실시예 37에 기술된 전사 개시 부위를 최적화시켜 변형시킬 수 있다.
c. 구성적 발현, 액틴 프로모터
액틴의 여러 이소형은 대부분의 세포 형태에서 발현되는 것으로 알려져 있으며, 따라서 액틴 프로모터는 구조적 프로모터로서 많이 사용된다. 특히, 벼의 Act1 유전자 유래의 프로모터가 클로닝되었고 특성화되었다[참조: McElroy et al. Plant Cell 2:163-171(1990)]. 상기 프로모터의 1.3kb 단편은 벼의 원형질체내에서 발현되는데 필요한 모든 조절 인자를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 특히 단자엽식물에서 사용하기 위해 Act1 프로모터를 기초로 한 다양한 발현 벡터가 작제되었다[참조: McElroy et al., Mol.Gen.Genet. 231:150-160(1991)]. 이들 벡터는 Act1-인트론 1, Adh1 5' 플랭킹 서열 및 Adh1-인트론 1(옥수수 알콜 데하이드로게나제 유전자 유래) 및 CaMV 35S 프로모터로부터의 서열을 포함한다. 최고의 발현율을 나타내는 벡터는 35S와 Act1 인트론의 융합체 또는 Act1 5' 플랭킹 서열과 Act1 인트론의 융합체이다. 개시 ATG(GUS 리포터 유전자의 ATG) 주위에 있는 서열의 최적화 또한 발현을 향상시킨다. 맥엘로이 등[참조문헌: Mol.Gen.Genet.231:150-160(1991)]에 의해 기재된 프로모터 발현 카세트는 유전자의 발현을 위해 용이하게 변형시킬 수 있고, 특히 단자엽 숙주에서 사용하기에 매우 적합하다. 예를 들어, 맥엘로이 작제물로부터 프로모터 함유 단편을 제거하고 pCGN1761ENX 내의 이중 35S 프로모터를 대체시키면 특정 유전자 서열 또는 삽입용으로 사용할 수 있다. 이와 같이 작제된 융합 유전자는 적당한 형질전환 벡터로 전달시킬 수 있다. 별도의 보고서에서 제1 인트론을 지닌 벼의 Act1 프로모터가 배양된 보리 세포에서 높은 발현을 유도하는 것으로 밝혀져 있다[참조: Chibbar et al., Plant Cell Rep. 12: 506-509 (1993)].
d. 유도성 발현, PR-1 프로모터:
pCGN1761ENX 내의 이중 35S 프로모터는 적합하게 높은 발현 수준을 야기할 수 있는 선택된 어떠한 다른 프로모터로도 대체시킬 수 있다. 예를 들어, 담배 PR-1a 프로모터와 같이 미국 특허 제5,614,395호에 기재된 화학적으로 조절가능한 프로모터 중 하나가 이중 35S 프로모터를 대체할 수 있다. 또는, 문헌[참조문헌: Lebel et al., Plant J. 16:223-233 (1998)]에 기재된 아라비돕시스 PR-1 프로모터를 사용할 수 있다. 선택된 프로모터는 바람직하게는 제한 효소를 사용하여 이의공급원으로부터 절단하지만, 적절한 말단 제한 부위를 지니는 프라이머를 사용하여 PCR-증폭시킬 수 있다. PCR 증폭을 수행해야할 경우, 증폭 에러를 점검하기 위해 표적 벡터내의 증폭된 프로모터를 클로닝한 후에 프로모터를 재서열화해야 한다. 화학적으로/병원체 조절가능한 담배 PR-1a 프로모터를 플라스미드 pCIB1004로부터 절단하고(작제를 위해, 본원에서 참조로 인용되는 EP 0 332 104의 실시예 21 참조) 플라스미드 pCGN1716ENX로 전달시킨다[참조문헌: Uknes et al., Plant Cell 4: 645-656 (1992)]. pCIB1004는 NcoI로 절단하고 수득되는 선형화된 단편의 3' 돌출부를 T4 DNA 폴리머라제로 처리하여 평활 말단화시킨다. 이어서 단편을 HindIII로 절단하고 수득되는 PR-1a 프로모터 함유 단편을 겔 정제하고, 이중 35S 프로모터가 제거된 pCGN1761ENX로 클로닝한다. 이는 XhoI로 절단하고 T4 폴리머라제로 평활 말단화시킨 다음, HindIII로 절단하고 pCIB1004 프로모터 단편이 클로닝된 보다 큰 벡터-터미네이터 함유 단편을 분리함으로써 수행한다. 이로써 PR-1a 프로모터와 tml 터미네이터를 함유하는 PRpCGN1761ENX 및 EcoRI과 NotI 부위를 함유하는 개재 폴리링커가 수득된다. 선택된 암호화 서열을 상기 벡터내로 삽입시킬 수 있으며, 이어서 융합 생성물(즉, 프로모터-유전자-터미네이터)을 상기 기술한 벡터를 포함하는 임의 선택된 형질전환 벡터로 전달시킬 수 있다. 미국 특허 제5,523,311호 및 제5,614,395호에 기술된 벤조티아디아졸, 이소니코틴산 및 살리실산 화합물을 포함하는 다양한 화학적 조절제를 사용하여, 본 발명에 따라서 형질전환된 식물에서 선택된 암호화 서열의 발현을 유도할 수 있다.
e. 유도성 발현, 에탄올-유도성 프로모터:
에탄올과 같은 특정 알콜이나 케톤에 의해 유도될 수 있는 프로모터도 본 발명의 암호화 서열의 발현을 유도하는데 사용할 수 있다. 이러한 프로모터로는 아스퍼질러스 니듈란스(Aspergillus nidulans)로부터의 alcA 유전자 프로모터[참조문헌: Caddick et al.(1998) Nat Biotechnol 16:177-180]가 있다. 에이.니듈란스에서, alcA 유전자는 화학적 유도인자의 존재하에 AlcR 전사 인자에 의해 발현이 조절되는 알콜 데하이드로게나제 I을 암호화한다. 본 발명의 목적을 위해, 최소 35S 프로모터에 융합되어 있는 alcA 유전자 프로모터 서열을 포함하는 플라스미드 palcA:CAT 내의 CAT 암호화 서열[참조문헌: Caddick et al. (1988) Nat Biotechnol 16:177-180]을 본 발명의 암호화 서열로 대체시켜, alcA 유전자 프로모터의 조절하에 암호화 서열을 지니는 발현 카세트를 형성시킨다. 이는 당해 분야에 공지된 방 법을 사용하여 수행한다.
f. 유도성 발현, 글루코코르티코이드-유도성 프로모터
스테로이드 호르몬에 기초한 시스템을 사용하는 본 발명의 핵산 서열의 발현 유도 또한 본 발명에 포함된다. 예를 들어, 글루코코르티코이드-매개된 유도 시스템을 사용하고[참조문헌: Aoyama and Chua(1997) The Plant Journal 11:605-612]. 글루코코르티코이드, 예를 들어, 합성 글루코코르티코이드, 바람직하게는 덱사메타손을 바람직하게는 0.1 내지 1mM의 농도, 보다 바람직하게는 10mM 내지 100mM 범위의 농도로 적용하여 유전자 발현을 유도한다. 본 발명의 목적을 위해, 루시퍼라제 유전자 서열을 본 발명의 핵산 서열로 대체시켜, GAL4 상부스트림 활성화 서열의 6개 복사체의 조절하에 본 발명의 핵산 서열이 35S 최소 프로모터에 융합되어 있는 발현 카세트를 제조한다. 이는 당해 분야에 익히 공지된 방법을 사용하여 수행한다. 트랜스-작용 인자는 랫트 글루코코르티코이드 수용체의 호르몬-결합 도메인[참조문헌: Picard et al.(1988) Cell 54: 1073-1080]에 융합된 헤르페스 바이러스 단백질 VP16의 트랜스활성화 도메인[참조문헌: Triezenberg et al. (1988) Genes Devel. 2:718-729]과 융합된 GAL4 DNA-결합 도메인[참조문헌: Keegan et al. (1986) Science 231:699-704]을 포함한다. 상기 융합 단백질의 발현은 당해 분야에 공지되어 있거나 본원에서 기술하는 식물에서 발현시키기에 적합한 임의 프로모터에 의해 조절된다. 또한, 상기 발현 카세트는 6xGAL4/최소 프로모터에 융합되어 있는 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 식물에 포함되어 있다. 따라서, 융합 단백질의 조직-특이성 또는 기관-특이성은 당해 살충성 독소의 유도적 조직-특이성 또 는 기관-특이성을 유도하여 달성된다.
g. 뿌리 특이적 발현:
유전자 발현의 다른 패턴은 뿌리 발현이다. 적합한 뿌리 프로모터는 본원에서 참조로 인용되는 문헌[참조: de Framond, FEBS 290:103-106(1991)] 및 미국 특허 제 5,466,785호에 기술된 옥수수 메탈로티오네인형(MTL) 유전자의 프로모터이다. 상기 "MTL" 프로모터를 선택된 유전자의 삽입을 위해 pCGN1761ENX와 같은 적당한 벡터에 전달시키고 이어서 전체 프로모터-유전자-터미네이터 카세트를 관심있는 형질전환 벡터에 전달시킨다.
h. 상처-유도성 프로모터:
상처-유도성 프로모터 또한 유전자 발현에 적합할 수 있다. 다수의 이러한 프로모터는 문헌[참조문헌: Xu et al. Plant Molec. Biol. 22:573-588 (1993), Logemann et al. Plant Cell 1:151-158 (1989), Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22:783-792 (1993), Firek et al. Plant Molec. Biol. 22:129-142(1993), Warner et al. Plant J. 3:191-201(1993)]에 기재되어 있고, 모두 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 로지맨(Logemann) 등은 쌍자엽 감자 wunI 유전자의 5' 상부 서열을 기술하고 있다. 수(Xu) 등은 쌍자엽 감자로부터의 상처 유도성 프로모터(pin2)가 단자엽 벼에서 활성적임을 제시하고 있다. 또한, 로마이어(Rohrmeier) 및 렐레(Lehle)는 상처 유도성이고 표준 기술에 의해 동족 프로모터를 분리하는데 사용할 수 있는 옥수수 Wip1 cDNA의 클로닝에 대해서 기술하고 있다. 유사하게, 피렉(Firek) 등과 워너(Warner) 등은 국소적 상처 및 병원균 침입 부위에서 발현되는 단자엽 아스파라거스 오피시날리스(Asparagus officinalis)로부터의 상처 유도성 유전자를 기술하였다. 이들 프로모터는 당해 분야에 공지된 클로닝 기술을 사용하여 적합한 벡터로 전달시키고 본 발명에 따르는 유전자에 융합시켜, 상기 유전잘를 식물 상처 부위에서 발현시키는데 사용할 수 있다.
i. 목수(木髓)에 바람직한 발현:
본원에서 참조로 인용되는 특허원 제WO93/07278호에는 목수 세포에서 우선적으로 발현되는 옥수수 trpA 유전자의 분리가 기술되어 있다. 전사 시작 부위부터 약 1726bp까지에 해당되는 유전자 서열 및 프로모터가 존재한다. 표준 분자생물학 기술을 사용하여, 상기 프로모터 또는 이의 일부를 pCGN1761과 같은 벡터로 전달시킬 수 있고, 여기서 상기 프로모터는 35S 프로모터를 대체하여 외래 유전자를 목수에 바람직한 방식으로 발현시키는데 사용할 수 있다. 실제로, 목수에 바람직한 프로모터 또는 이의 일부를 함유하는 단편은 임의 벡터로 전달시켜 형질전환 식물에 유용하게 변형시킬 수 있다.
j. 잎-특이적 발현:
포스포에놀 카복실라제(PEPC)를 암호화하는 옥수수 유전자는 문헌[참조: Hudspeth & Grula, Plant Molec Biol 12: 579-589 (1989)]에 기재되어 있다. 표준 분자생물학 기술을 사용하여, 상기 유전자의 프로모터를 형질전환 식물에서 임의 유전자의 발현을 잎 특이적 방식으로 추진하는데 사용할 수 있다.
k. 화분(花粉)-특이적 발현:
WO 93/07278에는 화분 세포에서 발현되는 옥수수의 칼슘 의존적 단백질 키나제(CDPK) 유전자의 분리가 기재되어 있다. 상기 유전자 서열과 프로모터는 전사 시작 부위부터 1400bp까지에 해당된다. 표준 분자생물학 기술을 사용하여, 상기 프로모터 또는 이의 일부를 pCGN1761과 같은 벡터로 전달시킬 수 있고, 여기서 상기 프로모터는 35S 프로모터를 대체하여 본 발명의 핵산 서열을 화분 특이적 방식으로 발현시키는데 사용할 수 있다.
1. 화학적 리간드의 존재하에 수용체 매개된 트랜스활성화:
본원에서 참조로 인용되는 미국 특허 제5,880,333호에는 이종이량체로서 함께 작용하는 에크디손 수용체(EcR) 및 울트라스피라클(Ultraspiracle; USP)과 같은 II형 호르몬 수용체가 식물 세포에서 적절한 화학적 리간드, 예를 들어, 테부페노지드의 존재하에 표적 폴리펩타이드의 발현을 조절하는 시스템이 기재되어 있다.
2. 전사 터미네이터
발현 카세트에는 다양한 전사 터미네이터를 사용할 수 있다. 이들 전사 터미네이터는 형질전환유전자 이후의 전사 종결 및 정확한 폴리아데닐화와 관련된다. 적절한 전사 터미네이터는 식물에서 작용하는 것으로 공지되어 있는 터미네이터이며 CaMV 35S 터미네이터, tml 터미네이터, 노팔린 신타제 터미네이터 및 완두 rbcS E9 터미네이터를 포함한다. 이들 터미네이터는 단자엽 및 쌍자엽 식물 둘다에 사용할 수 있다. 또한, 유전자의 천연 전사 터미네이터를 사용할 수 있다.
3. 발현의 증강 또는 조절을 위한 서열
다수의 서열이 전사 단위내에서 유전자 발현을 증강시키는 것으로 밝혀졌으 며 이들 서열을 본 발명의 유전자와 함께 사용하여 형질전환 식물에서 발현을 증가시킬 수 있다.
다양한 인트론 서열은 특히 단자엽식물 세포에서 발현을 향상시키는 것으로 제시되었다. 예를 들어, 옥수수 Adh1 유전자의 인트론은 옥수수 세포에 도입시켰을 경우 동족 프로모터하에 야생형 유전자의 발현을 현저하게 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 인트론 1은 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자를 함유하는 융합 작제물의 발현을 특히 효적으로 증강시키는 것으로 밝혀졌다[참조문헌: Callis et al., Genes Develop 1:1183-1200 (1987)]. 동일한 실험 시스템에서, 옥수수 bronze 1 유전자로부터의 인트론 또한 발현을 증강시키는데 유사한 효과를 지닌다. 인트론 서열은 통상적으로 식물 형질전환 벡터내에, 통상적으로 비해독 리더내에 포함되어 있다.
바이러스로부터 유래된 다수의 비해독된 리더 서열이 발현을 증강시킨다고 공지되어 있으며, 이러한 리더 서열은 쌍자엽식물 세포에서 특히 효과적이다. 구체적으로, 담배 모자이크 바이러스(TMV, "W-서열"), 옥수수 반엽 바이러스(MCMV) 및 알파파 모자이크 바이러스(AMV)로부터의 리더 서열이 발현의 증가에 효과적인 것으로 제시되었다[참조문헌: Gallie et al. Nucl.Acids Res. 15:8693-8711 (1987); Skuzeski et al. Plant Molec. Biol. 15: 65-79 (1990)].
4. 세포내에서 유전자 생성물의 표적화
유전자 생성물을 표적화하는 다양한 기작이 식물에 존재하는 것으로 공지되어 있으며, 이러한 기작의 기능을 조절하는 서열도 다소 상세하게 설명되어 있다. 예를 들어, 색소체(예: 엽록체)에 대한 유전자 생성물의 표적화는, 다양한 단백질의 아미노말단 단부에서 발견되고 엽록체 유입 동안 절단되어 성숙한 단백질을 생성하는 시그널 서열에 의해 조절된다[참조문헌: Comai et al. J.Biol.Chem. 263:15104-15109(1988)]. 이들 시그널 서열은 이종 유전자 생성물에 융합되어 이종 생성물을 엽록체내로 유입시키는데 효과적일 수 있다[참조문헌: van den Broeck et al., Nature 313:358-363(1985)]. 적절한 시그널 서열을 암호하는 DNA는 RUBISCO 단백질, CAB 단백질, EPSP 신타제 효소, GS2 단백질, 및 엽록체에 위치하는 것으로 공지된 많은 기타 단백질을 암호하는 cDNA의 5' 말단으로부터 분리할 수 있다[참조: 미국 특허 제5,639,949호의 실시예에서 "Expression With Chloroplast Targeting"를 표제로 하는 단락].
다른 유전자 생성물은 미토콘드리아 및 퍼옥시좀과 같은 다른 소기관에 국재화되어 있다[참조문헌: Unger et al., Plant Molec. Biol. 13:411-418 (1989)]. 이러한 생성물을 암호하는 cDNA를 또한 조작하여 이종 유전자 생성물을 상기 소기관에 표적화시킬 수 있다. 이러한 서열의 예로는 핵-암호화되는 ATPase 및 미토콘드리아에 특이적인 아스파르테이트 아미노 트랜스퍼라제 이소형이 있다. 세포 단백질체의 표적화는 문헌[참조문헌: Rogers et al. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82: 6512-6516(1985)]에 기재되어 있다.
또한, 유전자 생성물을 다른 세포 격실로 표적화할 수 있는 서열도 설명되었다. 아미노말단 서열은 ER, 아포플라스트에 대한 표적화 및 호분 세포로부터의 세포외 분비와 관련된다[참조문헌: Koehler & Ho, Plant Cell 2:769-783 (1990)]. 또한, 아미노 말단 서열은 카복시 말단 서열과 함께 유전자 생성물의 액포로의 표적화와 관련된다[참조문헌: Shinshi et al. Plant Molec. Biol. 14:357-368 (1990)].
상기 기술한 적절한 표적화 서열을 형질전환유전자에 융합시켜, 형질전환유전자 생성물을 임의 소기관 또는 세포 격실로 지시할 수 있다. 엽록체 표적화를 위해, 예를 들어, RUBISCO 유전자, CAB 유전자, EPSP 신타제 유전자 또는 GS2 유전자로부터의 엽록체 시그널 서열을 프레임내에서 형질전환유전자의 아미노말단 ATG에 융합시킨다. 선택된 시그널 서열은 공지된 절단 부위를 포함해야 하며, 작제된 융합체는 절단에 필요한 절단 부위 이후의 임의 아미노산을 고려해야 한다. 일부 경우에서 이러한 요건은 절단 부위와 형질전환유전자 ATG 간에 소수의 아미노산을 첨가하거나, 또는 형질전환유전자 서열내의 일부 아미노산을 대체시켜 충촉시킬 수 있다. 엽록체 유입을 위해 작제된 융합체는 시험관내 전사된 작제물을 시험관내 해독시킨 다음, 문헌[참조문헌: Bartlett et al. In: Edelmann et al.(Eds.) Methods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier, pp 1081-1091(1982); Wasmann et al. Mol. Gen. Genet. 205:446-453 (1986)]에 기재된 기술을 사용하여 시험관내에서 엽록체를 흡수시킴으로써 엽록체 흡수 효능에 대하여 시험할 수 있다. 이러한 작제 기술은 당해 분야에 익히 공지되어 있으며 미토콘드리아 및 퍼옥시좀에 동일하게 적용할 수 있다.
상기 기술한 세포내 표적화 기작은, 표적 시그널이 유래되는 프로모터의 발현 패턴과는 상이한 발현 패턴을 가진 프로모터의 전사 조절하에 특정 세포로의 국 소화 목표를 이룰 수 있도록, 동족 프로모터와 함께 사용할 뿐만 아니라, 이종 프로모터와 함께 사용될 수도 있다.
실시예 6: 식물 형질전환 벡터의 작제
식물 형질전환에 유용한 다수의 형질전환 벡터는 식물 형질전환 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며, 본 발명에 적절한 유전자는 이러한 어떠한 벡터와도 함께 사용할 수 있다. 벡터의 선택은 바람직한 형질전환 기술과 형질전환용 표적 종에 따라 좌우될 수 있다. 특정 표적 종의 경우에는 상이한 항생물질 또는 살충제 선택 마커가 바람직할 수 있다. 형질전환에 통상적으로 사용되는 선택 마커로는 가나마이신 및 관련 항생제에 대한 내성을 부여하는 nptII 유전자[참조문헌: Messing & Vieira, Gene 19: 259-268(1982); Bevan et al., Nature 304:184-187(1983)], 제초제 포스피노트리신에 대한 내성을 부여하는 bar 유전자[참조문헌: White et al., Nucl. Acids Res 18: 1062 (1990), Spencer et al. Theor. Appl. Genet 79: 625-631 (1990)], 항생제 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hph 유전자[참조문헌: Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol 4:2929-2931] 및 메타트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr 유전자[참조문헌: Bourouis and Jarry, EMBO J.2(7): 1099-1104(1983)], 글리포세이트에 대한 내성을 부여하는 EPSPS 유전자[참조문헌: 미국 특허 제4,940,935호 및 제5,188,642호] 및 만노스를 대사시키는 능력을 제공하는 만노스-6-포스페이트 이소머라제 유전자[참조문헌: 미국 특허 제5,767,378호 및 제5,994,629호]가 포함된다.
1. 아그로박테리움 형질전환에 적합한 벡터
다수의 벡터가 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens)를 사용한 형질전환에 유용하다. 이들 벡터는 통상적으로 하나 이상의 T-DNA 경계 서열을 지니며, pBIN18[참조문헌: Bevan, Nucl.Acids Res.(1984)] 및 pXYZ와 같은 벡터를 포함한다. 하기에서 아그로박테리움 형질전환에 적합한 2개의 통상적 벡터를 기술한다.
a. pCIB200 및 pCIB2001:
아그로박테리움과 사용하기 위한 재조합 벡터를 작제하기 위해 이중 벡터 pCIB200과 pCIB2001을 사용하고, 다음과 같은 방식으로 작제한다. pTJS75kan는, pTJS75[참조문헌: Schmidhauser & Helinski, J Bacteriol. 164: 446-455(1985)]를 NarI 분해하여 테트라사이클린 내성 유전자를 절단한 다음, NPTII를 지니는 pUC4K[참조문헌: Vieira & Messing, Gene 19:259-268(1982); Bevan et al., Nature 304:184-187(1983); McBride et al., Plant Molecular Biology 14:266-276(1990)]로부터의 AccI 단편을 삽입하여 작제한다. XhoI 링커를 좌측 및 우측 T-DNA 경계, 식물 선택가능한 nos/nptII 키메라 유전자 및 pUC 폴리링커[참조문헌: Rothstein et al., Gene 53:153-161(1987)]를 함유하는 pCIB7의 EcoRV 단편에 연결시키고, XhoI-분해된 단편을 SalI-분해된 pTJS75kan에 클로닝하여 pCIB200을 제조한다[참조: EP 0 332 104, 실시예 19]. pCIB200은 다음의 고유한 폴리링커 제한 부위를 함유한다: EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI 및 SalI. pCIB2001은 폴리링커내로 추가의 제한 부위를 삽입하여 제조한 pCIB200의 유도체이다. pCIB2001의 폴리링커 내의 고유한 제한 부위는 EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI, SalI, MluI, BcII, AvrII, ApaI, HpaI 및 StuI이다. pCIB2001은 이러한 고유한 제한 부위 이외에도 식물 및 박테리아 가나마이신 선택 유전자, 아그로박테리움-매개된 형질전환을 위한 좌측 및 우측 T-DNA 경계 유전자, 이. 콜라이와 다른 숙주 간의 이동을 위한 RK2-유래의 trfA 작용 유전자, 및 또한 RK2로부터의 OriT 및 OriV 작용 유전자를 함유한다. pCIB2001 폴리링커는 자신의 조절 시그널을 함유하는 식물 발현 카세트를 클로닝하는데 적합하다.
b. pCIB10 및 이의 하이그로마이신 선택 유도체
이중 벡터 pCIB10은 식물에서 선택을 위한 가나마이신 내성을 암호화하는 유전자 및 T-DNA 우측 및 좌측 경제 유전자를 함유하며, 숙주 범위가 넓은 플라스미드 pRK252를 포함하여 이. 콜라이 및 아그로박테리움 둘다에서 복제할 수 있다. 이의 작제는 문헌[참조문헌: Rothstein et al. Gene 53:153-161(1987)]에 기재되어 있다. pCIB10의 다양한 유도체는 문헌[참조문헌: Gritz et al., Gene 25: 179-188(1983)]에 기술된 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제의 유전자를 포함하도록 작제한다. 이들 유도체는 하이그로마이신에 대해서만(pCIB743) 또는 하이그로마이신과 가나마이신에 대해서(pCIB715, pCIB717) 형질전환 식물 세포를 선택할 수 있게 한다.
2. 비-아그로박테리움 형질전환에 적합한 벡터
아그로박테리움 튜머페이션스를 사용하지 않는 형질전환은 선택된 형질전환 벡터에서 T-DNA 서열을 반드시 필요로 않으므로, T-DNA 서열을 함유하는 상기 기술한 벡터 이외에 상기 서열이 결실된 벡터를 사용할 수도 있다. 아그로박테리움에 의존하지 않는 형질전환 기술은 입자 충격을 통한 형질전환, 원형질체 흡수(예: PEG 및 전기침투) 및 미세주입을 포함한다. 벡터의 선택은 형질전환되는 종의 바람직한 선택에 따라 크게 좌우된다. 하기에서 비-아그로박테리움 형질전환에 적합한 통상의 벡터를 설명한다.
a. pCIB3064
pCIB3064는 제초제 바스타(Basta)(또는 포스피노트리신)에 의한 선택과 함께 직접적인 유전자 전달 기술에 적합한 pUC 유래의 벡터이다. 플라스미드 pCIB246은 이. 콜라이 GUS 유전자에 작동적으로 융합되어 있는 CaMV 35S 프로모터 및 CaMV 35S 전사 터미네이터를 포함하고, PCT 공개 출원 제WO 93/07278호에 기술되어 있다. 상기 벡터의 35S 프로모터는 출발 부위의 5'에 2개의 ATG 서열을 포함한다. 이들 부위는 ATG를 제거하고 제한 부위 Ssp1 및 PvuII가 생성되게 하는 방식으로 표준 PCR 기술을 사용하여 돌연변이시킨다. 새로운 제한 부위는 고유한 SalI 부위로부터 96bp 및 37bp, 실제 개시 부위로부터 101bp 및 42bp 떨어져있다. 수득되는 pCIB246의 유도체를 pCIB3025라 지정한다. 이어서, SalI 및 SacI으로 분해하여 pCIB3025로부터 GUS 유전자를 제거하고, 말단을 평활 말단화시키고 재연결시켜 플라스미드 pCIB3060을 제조한다. 플라스미드 pJIT82는 존 인네스 센터(John Innes Centre, Norwich)로부터 입수하고 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes)로부터의 bar 유전자를 함유 하는 400bp SmaI 단편을 절단하여 pCIB3060의 HpaI 부위에 삽입한다[참조문헌: Thompson et al. EMBO J 6: 2519-2523(1987)]. 이로써 CaMV 35S 프로모터 및 터미네이터 조절하의 제초제 선택용 bar 유전자, 암피실린 내성용(이. 콜라이 선택용) 유전자 및 고유한 부위 SphI, PstI, HindIII 및 BamHI을 지닌 폴리링커를 포함하는 pCIB3064를 수득한다. 상기 벡터는 자신의 조절 시그널을 함유하는 식물 발현 카세트를 클로닝하는데 적합하다.
b. pSOG19 및 pSOG35
pSOG35는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 선택가능한 마커로서 이. 콜라이 유전자 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)를 사용하는 형질전환 벡터이다. PCR을 사용하여 35S 프로모터(약 800bp), 옥수수 Adh1 유전자로부터의 인트론 6( 약 550bp) 및 pSOG10로부터의 GUS 비해독된 리더 서열 18bp를 증폭시킨다. 또한, 이. 콜라이 디하이드로폴레이트 리덕타제 II형 유전자를 암호하는 250bp 단편을 PCR로 증폭시키고 이들 2가지 PCR 단편을, pUC19 벡터 골격과 노팔린 신타제 터미네이터를 포함하는 pBI221(제조원: Clontech)으로부터의 SacI-PstI 단편과 통합시킨다. 이들 단편을 집합시켜 인트론 6 서열, GUS 리더, DHFR 유전자 및 노팔린 신타제 터미네이터와 융합되어 있는 35S 프로모터를 함유하는 pSOG19를 수득한다. pSOG19 내의 GUS 리더를 옥수수 엽반병 바이러스(MCMV)로부터의 리더 서열로 대체시켜 벡터 pSOG35를 제조한다. pSOG19 및 pSOG35는 암피실린 내성에 대한 pUC 유전자를 함유하며, 외래 물질의 클로닝에 유용한 HindIII, SphI, PstI 및 EcoRI 부위를 지닌다.
3. 엽록체 형질전환에 적합한 벡터
본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 식물 색소체에서 발현시키기 위해, 색소체 형질전환 벡터 pPH143(WO 97/32011의 실시예 36)을 사용한다. 뉴클레오타이드 서열을 pPH143에 삽입하여 PROTOX 암호 서열을 대체하도록 한다. 이어서, 상기 벡터를 색소체 형질전환 및 스펙티노마이신 내성에 대한 형질전환체의 선택에 사용한다. 또는, 뉴클레오타이드 서열을 pPH143에 삽입하여 aadA 유전자를 대체하도록 한다. 상기 경우에 형질전환체는 PROTOX 억제제에 대한 내성으로 선택한다.
실시예 7: 형질전환
일단 본 발명의 핵산 서열을 발현 시스템으로 클로닝한 후, 식물 세포내로 형질전환시킨다. 식물의 형질전환 및 재생 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 예를 들어, Ti 플라스미드 벡터를 외래 DNA의 전달과 직접적인 DNA 흡수, 리포좀, 전기침투, 미세주입 및 미세사출에 사용하였다. 또한, 아그로박테리움 속으로부터의 세균을 사용하여 식물 세포를 형질전환시킬 수 있다. 하기에서, 쌍자엽식물 및 단자엽식물 둘다를 형질전환시키는 대표적 기술과 대표적 색소체 형질전환 기술을 설명한다.
1. 쌍자엽식물의 형질전환
쌍자엽식물용 형질전환 기술은 당해 분야에 익히 공지되어 있으며 아그로박테리움계 기술 및 아그로박테리움을 요하지 않는 기술을 포함한다. 비-아그로박테 리움 기술은 외인성 유전 물질이 색소체 또는 세포에 의해 직접적으로 흡수되는 것과 관련된다. 이는 PEG 또는 전기침투 매개된 흡수, 입자 충격-매개된 전달 또는 미세주입에 의해 달성할 수 있다. 이러한 기술의 예는 문헌[참조문헌: Paszkowski et al., EMBO J 3: 271-2722 (1984), Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199: 169-177 (1985), Reich et al., Biotechnology 4: 1001-1004 (1986), 및 Klein et al., Nature 327:70-73 (1987)]에 기술되어 있다. 각 경우에 형질전환된 세포는 당해 분야에 공지된 표준 기술을 사용하여 완전한 식물로 재생시킨다.
아그로박테리움-매개된 형질전환은 형질전환 효율성이 높고 많은 상이한 종에서 광범위하게 사용할 수 있기 때문에 쌍자엽식물의 형질전환에 바람직한 기술이다. 아그로박테리움 형질전환은 통상적으로 관심있는 외래 DNA를 지니는 이원 벡터(예: pCIB 200 또는 pCIB 2001)를 적절한 아그로박테리움 균주로 전달하는 것과 관련되며, 전달은 숙주 아그로박테리움 균주가 동시상주하는 Ti 플라스미드 상에 또는 염색체내에(예: pCIB200 및 pCIB2001에 대한 균주 CIB542) 보유하는 vir 유전자의 보완[참조문헌: Uknes et al. Plant Cell 5: 159-169 (1993)]에 따라 좌우될 수 있다. 재조합 이원 벡터의 아그로박테리움으로의 전달은 재조합 이원 벡터를 지니는 이. 콜라이, pRK2013과 같은 플라스미드를 지니며 재조합 이원 벡터를 표적 아그로박테리움 균주로 이동시킬 수 있는 보조 이. 콜라이 균주를 사용한 삼중모계 교배(triparental mating) 과정을 사용하여 달성한다. 또는, 재조합 이원 벡터는 DNA 형질전환으로 아그로박테리움으로 전달시킬 있다[참조문헌: Hofgen & Wilmitzer, Nucl. Acids Res. 16: 9877 (1988)].
재조합 아그로박테리움에 의한 표적 식물 종의 형질전환은 통상적으로 아그로박테리움과 식물로부터의 외식체의 동시배양과 관련되며 당해 분야에 익히 공지된 프로토콜에 따른다. 이원 플라스미드 T-DNA 경계 사이에 존재하는 항생제 또는 제초제 내성 마커를 지닌 형질전환 조직을 선택가능한 배지 상에서 재생시킨다.
식물 세포를 유전자로 형질전환시키는 또 다른 접근법은 불활성이거나 생물학적으로 활성인 입자를 식물 조직 및 세포로 추진시키는 것과 관련된다. 상기 기술은 미국 특허 제4,945,050호, 제5,036,006호 및 제5,100,792호에 기술되어 있다. 일반적으로 이러한 과정은 불활성이거나 생물학적으로 활성인 입자를 세포의 외부 표면으로 침투시켜, 세포의 내부에 혼입시키기에 효과적인 조건하에 세포로 추진시키는 것과 관련된다. 불활성 입자를 사용할 경우에, 벡터는 입자를 목적하는 유전자를 함유하는 벡터로 피복시켜 세포내로 도입할 수 있다. 또는, 표적 세포를 벡터로 둘러싸서 상기 벡터가 입자의 궤적을 통해 세포내로 전달되게 할 수 있다. 생물학적 활성 입자(예: 각각 도입하고자 하는 DNA를 함유하는 건조된 효모 세포, 건조된 세균 또는 박테리오파지)를 식물 세포 조직내로 추진시킬 수도 있다.
2. 단자엽식물의 형질전환
현재는 대부분의 단자엽식물 종의 형질전환도 통상적인 것이다. 바람직한 기술로는 PEG 또는 전기침투 기술을 사용한 유전자의 원형질체내로의 직접적인 전달 및 유합조직내로의 입자 충격과 관련된다. 형질전환은 단일 DNA 종 또는 다수의 DNA 종(즉, 동시형질전환)에서 수행할 수 있으며 이들 기술은 둘다 본 발명에서 사용하기에 적합한다. 동시형질전환은 완전한 벡터 작제를 피하고, 관심있는 유전자의 위치와 선택가능한 마커가 연결되어 있지 않아서 다음 세대에서 선택가능한 마커를 제거할 수 있는 형질전환 식물을 생성시킨다는 잇점을 가질 수 있다. 그러나, 동시형질전환 사용시의 단점은 개별적 DNA 종이 100% 미만의 빈도로 게놈내로 삽입된다는 점이다[참조문헌: Schocher et al. Biotechnology 4: 1093-1096 (1986)].
특허원 제EP 0 292 435호, 제EP 0 392 225호 및 제WO 93/07278호에는 옥수수의 우량 근교계로부터 유합조직 및 원형질체를 제조하는 기술, PEG 또는 전기침투를 사용한 원형질체의 형질전환 및 형질전환된 원형질체로부터 옥수수 식물의 재생에 관해 기술되어 있다. 고든-캄(Gordon-Kamm) 등[참조문헌: Plant Cell 2: 603-618 (1990)] 및 프롬 등[참조문헌: Biotechnology 8: 833-839 (1990)]은 입자 충격을 사용한 A188로부터의 옥수수 주의 형질전환 기술을 공개하였다. 또한, WO 93/07278 및 문헌[참조문헌: Koziel et al., Biotechnology 11: 194-200 (1993)]에는 입자 충격을 사용한 옥수수의 우량 근교계의 형질전환 기술이 기재되어 있다. 상기 기술은 수분한지 14 내지 15일 후의 옥수수 알로부터 절단된 1.5 내지 2.5mm 길이의 미성숙 옥수수 배아 및 충격용 PDS-1000He 바이오리스틱스 장치를 사용한다.
벼의 형질전환은 원형질체를 사용한 직접적인 유전자 전달 기술 또는 입자 충격으로 수행할 수 있다. 일반계(Japonica) 품종 및 다수계(Indica) 품종에 관해 원형질체-매개된 형질전환이 기술되어 있다[참조문헌: Zhang et al. Plant Cell Rep 7: 379-384 (1988); Shimamoto et al. Nature 338: 274-277 (1989); Datta et al. Biotechnology 8: 736-740 (1990)]. 또한, 두 품종은 통상적으로 입자 충격을 사용하여 형질전환시킬 수 있다[참조문헌: Christou et al. Biotechnology 9: 957-962 (1991)]. 또한, WO 93/21335에는 전기침투를 통한 벼의 형질전환 기술이 기재되어 있다.
특허원 제EP 0 332 581호에는 벼과 원형질체의 발생, 형질전환 및 재생 기술이 기재되어 있다. 상기 기술로 오리새 및 밀을 형질전환시킬 수 있다. 또한, 입자 충격을 사용한 C형 장기 재생성 유합조직의 세포로의 밀 형질전환[참조문헌: Vasil et al., Biotechnology 10:667-674 (1992)] 및 미성숙 배아 및 미성숙 배아로부터 유래된 유합조직의 입자 충격을 사용한 밀 형질전환[참조문헌: Vasil et al., Biotechnology 11: 1553-1558 (1993) 및 Weeks et al., Plant Physiol. 102: 1077-1084 (1993)]이 기술된 바 있다. 그러나, 바람직한 밀 형질전환 기술은 미성숙 배아의 입자 충격에 의한 밀의 형질전환과 관련되며, 유전자 전달에 앞서 높은 슈크로스 또는 높은 말토스 단계를 포함한다. 충격에 앞서, 체세포 배아를 도입하기 위해, 임의 수의 배아(길이가 0.75 내지 1mm)를 3% 슈크로스[참조문헌: Murashiga & Skoog, Physiologia Plantarum 15:473-497 (1962)] 및 3mg/ℓ2,4-D를 함유하는 MS 배지에 도말하고 이를 암실에서 진행시킨다. 충격처리 당일에, 배아를 도입 배지로부터 제거하고 삼투조절제(osmoticum)상에 놓는다(즉, 슈크로스 또는 말토스가 목적하는 농도, 통상적으로 15%로 첨가된 도입 배지). 상기 배아를 2 내지 3시간 동안 원형질체를 분리한 다음, 충격을 가한다. 중요한 것은 아니지만 표적 플레이트당 20개의 배아가 통상적이다. 적절한 유전자 함유 플라스미드(예: pCIB3064 또는 pSG35)를 표준 공정을 사용하여 마이크로미터 크기의 금 입자 위로 침전시킨다. 배아의 각 플레이트에 약 1000psi의 파열압과 표준 80 메쉬 스크린을 사용한 DuPont BiolositicsR 헬륨 장치를 사용하여 발사한다. 충격을 가한 후, 배아를 다시 암실에 놓아서 약 24시간 동안 (삼투조절제 상에서) 회복시킨다. 24시간 후, 배아를 삼투조절제로부터 제거하여 다시 도입 배지 상에 놓고, 재생시키 전에 약 1달 동안 방치한다. 약 1달 후, 배아형성 유합조직이 발달하고 있는 배아 이식체를 적절한 선택제(pCIB3064의 경우에는 10mg/ℓ바스타 및 pSOG35의 경우에는 2mg/ℓ 메토트렉세이트)를 추가로 함유하는 재생 배지(MS+1mg/ℓ NAA, 5mg/ℓ GA)로 전달시킨다. 약 1달 후, 발육한 싹을 1/2 농도의 MS, 2% 슈크로스 및 동일한 농도의 선택제를 함유하는 "GA7"로서 공지된 대형 멸균 용기로 전달시킨다.
아그로박테리움을 사용한 단자엽식물의 형질전환도 기술되었다[참조문헌: WO 94/00977 및 미국 특허 제5,591,616호; 둘다 본원에서 참조로 인용된다].
3. 색소체의 형질전환
반수체 담배(Nicotiana tabacum cv. 'Xanthi nc')의 종자를 T 아가 배지상에서 1인치 원형 배열로 플레이트당 7개씩 발아시키고, 문헌[참조: Svab,Z. and Maliga,P.(1993) PNAS 90, 913-917]에 실질적으로 기재된 바와 같이, 플라스미드 pPH143 및 pPH145로부터의 DNA로 피복한 1㎛ 텅스텐 입자(M10, 제조원: Biorad, Hercules, CA)와 함께 파종한지 12 내지 14일 후 충격을 가한다. 충격을 가한 실생을 T 배지에서 2일 동안 배양한 후, 잎을 절개하고, 500㎍/㎖ 스펙트로마이신 디하이드로클로라이드(제조원: Sigma, St. Louis, MO)를 함유하는 RMOP 배지[참조문헌: Svab, Z., Hajdukiewicz, P. and Maliga, P. (1990)]의 플레이트에 배축면을 위로 하여 밝은 광하에 놓는다. 충격을 가한지 3주 내지 8주 후에, 표백된 잎의 아래에 나타나는 내성 싹을 동일한 선택가능한 배지로 아클로닝시켜 유합조직을 형성시키고, 2차 싹을 분리하여 아클로닝시킨다. 독립적 아클론에서 형질전환된 색소체 게놈 복사체(일원형체성)의 완전한 분리를 서던 블롯팅[참조문헌: Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor]의 표준 기술을 사용하여 평가한다. BamHI/EcoRI-분해된 전체 세포 DNA[참조문헌: Maettler, I.J. (1987) Plant Mol Biol Reporter 5, 346-349]를 1% 트리스-보레이트(TBE) 아가로스 겔 상에서 분리하고 나일론 막(제조원: Amersham)으로 전달시킨 다음, rps7/12 색소체 표적화 서열의 일부를 함유하는 pC8로부터의 0.7kb BamHI/HindIII DNA 단편에 상응하는 32P-표지된 무작위 프라이밍된 DNA 서열로 프로빙한다[참조문헌: 특허원 제WO 98/11235호). 일원형체성 싹을 스펙티노마이신 함유 MS/IBA 배지[참조문헌: McBride,K.E.et al. (1994) PNAS 91, 7301-7305]에 무균적으로 정착시킨 다음, 온실로 옮긴다.
실시예 8: 육종
본 발명의 핵산 서열로의 형질전환을 통해 수득된 식물은 단자엽 및 쌍자엽을 포함하는 매우 다양한 식물 종 중 어느 하나일 수 있으나, 본 발명의 방법에서 사용되는 식물은 바람직하게는 상기 제시한 농업적으로 중요한 표적 작물 목록으로부터 선택된다. 본 발명의 유전자와 함께 생산 및 품질에 중요한 기타 특성의 발현은 육종을 통해 식물 주로 혼입될 수 있다. 육종 접근법 및 기술은 당해 분야에 공지되어 있다[참조문헌: Welsh J. R., Fundamentals of Plant Genetics and Breeding, John Wiley & Sons, NY (1981); Crop Breeding, Wood D. R. (Ed.) American Society of Agronomy Madisons, Wisconsin (1983); Mayo O., The Theory of Plant Breeding 2nd Edition, Clarendon Press, Oxford (1987); Singh, D.P., Breeding for Resistance to Diseases and Insect Pests, Springer-Verlag, NY (1986); Wricke and Weber, Quantitative Genetics and Selection Plant Breeding, Walter de Gruyter and Co., Berlin (1986)].
상기 기술한 형질전환 종자 및 식물로 조작된 유전적 특성은 유성 생식 또는 영양생장에 의해 전달되므로 자손 식물에서 유지되고 전파될 수 있다. 일반적으로 이러한 유지 및 전파는 경작, 파종 또는 수확과 같은 특수한 목적에 맞게 개발된 공지된 농업 방법을 사용한다. 수경재배 또는 온실 기술과 같은 전문화된 과정을 또한 적용할 수 있다. 재배 식물이 곤충이나 감염에 의해 유발된 공격 뿐만 아니라 잡초 식물에 의한 경쟁에 취약하기 때문에, 잡초, 식물 질병, 곤충, 선충류 및 기타 악조건을 방제하여 수율을 향상시키기 위해서는 대책이 강구되어야 한다. 이는 토양 경작 또는 잡초와 감염된 식물의 제거와 같은 수단 뿐만 아니라, 제초제, 살진균제, 생식자소멸제, 살선충제, 숙성제 및 살충제와 같은 농약의 적용을 포함한다.
추가로, 본 발명에 따르는 형질전환 식물 및 종자의 유리한 유전적 특성은 해충, 제초제 또는 스트레스에 대한 내용성과 같은 개선된 특성, 개선된 영양가, 증가된 수율 또는 도복(倒伏)이나 탈립(脫粒)으로 인한 손실을 덜 유발하는 개선된 구조를 갖는 식물을 개발하는 것을 목적으로 하는 식물 육종에서 사용할 수 있다. 다양한 육종 단계는 교배시키고자 하는 주의 선택, 모주의 직접적인 수분 또는 적합한 자손 식물의 선택 같은 잘-정의된 사람 중재를 특징으로 한다. 목적하는 성질에 따라서, 상이한 육종 수단을 취한다. 관련 기술은 당해 분야에 익히 공지되어 있으며, 하이브리드화, 근교배, 역교배 육종, 다중주 육종, 종 혼합, 이종간 하이브리드화, 이수체 기술 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 하이브리드화 기술은 또한 기계적, 화학적 또는 생물학적 수단을 사용하여 식물을 불임화시켜 웅성 또는 자성 불임 식물을 생산하는 것을 포함한다. 웅성 불임 식물의 상이한 주의 화분을 사용한 타화 수분은, 웅성 불임이지만 자성 수정능력이 있는 식물의 게놈이 균일하게 두 모계 주의 특성들을 수득할 것이라는 것을 보증한다. 따라서, 본 발명에 따르는 형질전환 종자 및 식물은 예를 들어, 제초제 또는 살충제 처리와 같은 종래의 방법의 효과를 증가시키거나 이의 변형된 유전자 특성으로 인해 상기 방법을 불필요하게 만드는 개선된 식물주의 육종에 사용될 수 있다. 또는, 최적화된 유전자 "장착(equipment)"으로 인해, 비교할만한 발달상의 악조건에 대하여 내용성이 없을 수 있는 생성물에 비해 보다 우수한 품질의 수확된 생성물을 생산할 수 있는 개선된 스트레스 내용성을 갖는 신규한 작물을 수득할 수 있다.
실시예 9: 종자 생산
종자 생산에 있어, 종자의 발아 특성 및 균일성은 필수적 생산 특성인 반면에 농부가 수확하여 시판하는 종자의 발아 특성 및 균일성은 중요하지 않다. 작물을 다른 작물 및 잡초 종자로부터 분리시켜 보관하고 종자전염성 질병을 조절하고 발아가 우수한 종자를 생산하는 것이 어렵기 때문에, 순수 종자의 성장, 조건화 및 판매 분야에 종사하는 종자 생산자에 의해 매우 광범위하고 잘 정의된 종자 생산 수단이 개발되어 왔다. 따라서, 농부가 자신의 작물로부터 수확된 종자를 사용하는 것 대신에 특정 품질 기준을 만족시키는 보증된 종자를 구매하는 것이 관례이다. 종자로서 사용하고자 하는 번식 물질은 관례적으로 제초제, 살충제, 살진균제, 살균제, 살선충제, 살연체동물제 또는 이들의 혼합물을 포함하는 보호성 피복제로 처리한다. 관례적으로 사용되는 보호성 피복제는 캅탄, 카복신, 티람(TMTDR), 메탈락실(ApronR) 및 피리미포스-메틸(ActellicR)과 같은 화합물을 포함한다. 경우에 따라, 이들 화합물을 담체, 표면활성제 또는 제형 분야에서 통상적으로 사용되는 적용-촉진 보조제와 함께 제형화하여 세균, 진균 또는 동물 해충에 의해 유발되는 손상으로부터 보호한다. 보호성 피복제는 번식 물질을 액체 제형으로 침지시키거나 배합된 습윤 또는 건조 제형으로 피복시켜 적용할 수 있다. 기타 적용 방법으로 싹 또는 열매를 대상으로 한 처리와 같은 것이 가능하다.
실시예 10: 옥수수 식물 분석
아그로박테리움-매개된 형질전환을 통해 플라스미드 pNOV1436, pNOV1441 및 pNOV1313로 형질전환된 옥수수 식물은 유럽조명나방 및 밤나방에 대해 100%의 치사율을 나타낸다. ELISA 데이터를 하기에 제시한다:
실시예 11: 벼 식물 분석
아그로박테리움-매개된 형질전환을 통해 플라스미드 pNOV1305로 형질전환된 벼 식물은 유럽조명나방 및 밤나방에 대해 100%의 치사율을 나타낸다. ELISA 데이터를 하기에 제시한다:
실시예 12: 양배추 식물 분석
아그로박테리움-매개된 형질전환을 통해 플라스미드 pZU578(서열 17)로 형질 전환된 양배추 식물을 배추좀나방(Plutella xylostella)에 대해 시험한다. 형질전환 식물 및 대조 식물은 (양배추 식물과) 사육한 배추좀나방 배양물로부터 16마리의 유충을 페인트 붓으로 잎 4장에 각각 유충 4마리씩 옮겨서 감염시킨다. 감염된 식물을 시험 기간 동안 1×1×1 케이지로 옮긴다. 대조 식물은 비형질전환된 양배추 식물(민감성 대조군) 및 시판되는 Bt 살충제 Dipel로 분무한 비형질전환된 양배추 식물(내성 대조군)을 포함한다. 스코어(2주 후)는, -=손상 없음(또는 단지 작은 구멍=내성); += 식물에 큰 구멍(=민감성); ++= 다수의 큰 구멍, 식물이 심하게 손상됨(=민감성)으로 기입한다. Dipel 식물은 항상 - 스코어를 기록하며 민감성 대조군은 ++ 스코어를 기록한다. 형질전환 식물 및 대조 식물의 곤충 손상 등급 및 ELISA 데이터를 하기에 제시한다.
상기 기술한 양태는 예시적이다. 본 발명의 내용은 본 발명의 다수의 변형을 포함하여 당해 분야의 숙련가들에게 명백하다. 이러한 모든 명백하고 예지가능한 변형은 본 발명에 의해 포함된다.
<110> Syngenta Participations AG
<120> Novel insecticidal toxins derived from Bacillus thuringiensis insecticidal
crystal proteins
<130> 5-2000-054004-2
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<170> KopatentIn 1.7
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tail
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atg gat aac aat ccg aac atc aat gaa tgc att cct tat aat tgt tta 48
Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu
1 5 10 15
agt aac cct gaa gta gaa gta tta ggt gga gaa aga ata gaa act ggt 96
Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly
20 25 30
tac acc cca atc gat att tcc ttg tcg cta acg caa ttt ctt ttg agt 144
Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu Ser
35 40 45
gaa ttt gtt ccc ggt gct gga ttt gtg tta gga cta gtt gat ata ata 192
Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile Ile
50 55 60
tgg gga att ttt ggt ccc tct caa tgg gac gca ttt ctt gta caa att 240
Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile
65 70 75 80
gaa cag tta att aac caa aga ata gaa gaa ttc gct agg aac caa gcc 288
Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala
85 90 95
att tct aga tta gaa gga cta agc aat ctt tat caa att tac gca gaa 336
Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu
100 105 110
tct ttt aga gag tgg gaa gca gat cct act aat cca gca tta aga gaa 384
Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu
115 120 125
gag atg cgt att caa ttc aat gac atg aac agt gcc ctt aca acc gct 432
Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala
130 135 140
att cct ctt ttt gca gtt caa aat tat caa gtt cct ctt tta tca gta 480
Ile Pro Leu Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val
145 150 155 160
tat gtt caa gct gca aat tta cat tta tca gtt ttg aga gat gtt tca 528
Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser
165 170 175
gtg ttt gga caa agg tgg gga ttt gat gcc gcg act atc aat agt cgt 576
Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg
180 185 190
tat aat gat tta act agg ctt att ggc aac tat aca gat cat gct gta 624
Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp His Ala Val
195 200 205
cgc tgg tac aat acg gga tta gag cgt gta tgg gga ccg gat tct aga 672
Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg
210 215 220
gat tgg ata aga tat aat caa ttt aga aga gaa tta aca cta act gta 720
Asp Trp Ile Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val
225 230 235 240
tta gat atc gtt tct cta ttt ccg aac tat gat agt aga acg tat cca 768
Leu Asp Ile Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr Pro
245 250 255
att cga aca gtt tcc caa tta aca aga gaa att tat aca aac cca gta 816
Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val
260 265 270
tta gaa aat ttt gat ggt agt ttt cga ggc tcg gct cag ggc ata gaa 864
Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile Glu
275 280 285
gga agt att agg agt cca cat ttg atg gat ata ctt aac agt ata acc 912
Gly Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile Thr
290 295 300
atc tat acg gat gct cat aga gga gaa tat tat tgg tca ggg cat caa 960
Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Glu Tyr Tyr Trp Ser Gly His Gln
305 310 315 320
ata atg gct tct cct gta ggg ttt tcg ggg cca gaa ttc act ttt ccg 1008
Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe Pro
325 330 335
cta tat gga act atg gga aat gca gct cca caa caa cgt att gtt gct 1056
Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala
340 345 350
caa cta ggt cag ggc gtg tat aga aca tta tcg tcc act tta tat aga 1104
Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg
355 360 365
aga cct ttt aat ata ggg ata aat aat caa caa cta tct gtt ctt gac 1152
Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp
370 375 380
ggg aca gaa ttt gct tat gga acc tcc tca aat ttg cca tcc gct gta 1200
Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val
385 390 395 400
tac aga aaa agc gga acg gta gat tcg ctg gat gaa ata ccg cca cag 1248
Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln
405 410 415
aat aac aac gtg cca cct agg caa gga ttt agt cat cga tta agc cat 1296
Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His
420 425 430
gtt tca atg ttt cgt tca ggc ttt agt aat agt agt gta agt ata ata 1344
Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile
435 440 445
aga gct cct atg ttc tct tgg ata cat cgt agt gca act ctt aca aat 1392
Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Thr Leu Thr Asn
450 455 460
aca att gat cca gag aga att aat caa ata cct tta gtg aaa gga ttt 1440
Thr Ile Asp Pro Glu Arg Ile Asn Gln Ile Pro Leu Val Lys Gly Phe
465 470 475 480
aga gtt tgg ggg ggc acc tct gtc att aca gga cca gga ttt aca gga 1488
Arg Val Trp Gly Gly Thr Ser Val Ile Thr Gly Pro Gly Phe Thr Gly
485 490 495
ggg gat atc ctt cga aga aat acc ttt ggt gat ttt gta tct cta caa 1536
Gly Asp Ile Leu Arg Arg Asn Thr Phe Gly Asp Phe Val Ser Leu Gln
500 505 510
gtc aat att aat tca cca att acc caa aga tac cgt tta aga ttt cgt 1584
Val Asn Ile Asn Ser Pro Ile Thr Gln Arg Tyr Arg Leu Arg Phe Arg
515 520 525
tac gct tcc agt agg gat gca cga gtt ata gta tta aca gga gcg gca 1632
Tyr Ala Ser Ser Arg Asp Ala Arg Val Ile Val Leu Thr Gly Ala Ala
530 535 540
tcc aca gga gtg gga ggc caa gtt agt gta aat atg cct ctt cag aaa 1680
Ser Thr Gly Val Gly Gly Gln Val Ser Val Asn Met Pro Leu Gln Lys
545 550 555 560
act atg gaa ata ggg gag aac tta aca tct aga aca ttt aga tat acc 1728
Thr Met Glu Ile Gly Glu Asn Leu Thr Ser Arg Thr Phe Arg Tyr Thr
565 570 575
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Asp Phe Ser Asn Pro Phe Ser Phe Arg Ala Asn Pro Asp Ile Ile Gly
580 585 590
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Ile Ser Glu Gln Pro Leu Phe Gly Ala Gly Ser Ile Ser Ser Gly Glu
595 600 605
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Leu Tyr Ile Asp Lys Ile Glu Ile Ile Leu Ala Asp Ala Thr Phe Glu
610 615 620
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Ala Glu Ser Asp Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val Asn Ala Leu Phe
625 630 635 640
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Thr Ser Ser Asn Gln Ile Gly Leu Lys Thr Asp Val Thr Asp Tyr His
645 650 655
att gat caa gta tcc aat tta gtg gat tgt tta tca gat gaa ttt tgt 2016
Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val Asp Cys Leu Ser Asp Glu Phe Cys
660 665 670
ctg gat gaa aag cga gaa ttg tcc gag aaa gtc aaa cat gcg aag cga 2064
Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu Ser Glu Lys Val Lys His Ala Lys Arg
675 680 685
ctc agt gat gag cgg aat tta ctt caa gat cca aac ttc aga ggg atc 2112
Leu Ser Asp Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro Asn Phe Arg Gly Ile
690 695 700
aat aga caa cca gac cgt ggc tgg aga gga agt aca gat att acc atc 2160
Asn Arg Gln Pro Asp Arg Gly Trp Arg Gly Ser Thr Asp Ile Thr Ile
705 710 715 720
caa gga gga gat gac gta ttc aaa gag aat tac gtc aca cta ccg ggt 2208
Gln Gly Gly Asp Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val Thr Leu Pro Gly
725 730 735
acc gtt gat gag tgc tat cca acg tat tta tat cag aaa ata gat gag 2256
Thr Val Asp Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln Lys Ile Asp Glu
740 745 750
tcg aaa tta aaa gct tat acc cgt tat gaa tta aga ggg tat atc gaa 2304
Ser Lys Leu Lys Ala Tyr Thr Arg Tyr Glu Leu Arg Gly Tyr Ile Glu
755 760 765
gat agt caa gac tta gaa atc tat ttg atc cgt tac aat gca aaa cac 2352
Asp Ser Gln Asp Leu Glu Ile Tyr Leu Ile Arg Tyr Asn Ala Lys His
770 775 780
gaa ata gta aat gtg cca ggc acg ggt tcc tta tgg ccg ctt tca gcc 2400
Glu Ile Val Asn Val Pro Gly Thr Gly Ser Leu Trp Pro Leu Ser Ala
785 790 795 800
caa agt cca atc gga aag tgt gga gaa ccg aat cga tgc gcg cca cac 2448
Gln Ser Pro Ile Gly Lys Cys Gly Glu Pro Asn Arg Cys Ala Pro His
805 810 815
ctt gaa tgg aat cct gat cta gat tgt tcc tgc aga gac ggg gaa aaa 2496
Leu Glu Trp Asn Pro Asp Leu Asp Cys Ser Cys Arg Asp Gly Glu Lys
820 825 830
tgt gca cat cat tcc cat cat ttc acc ttg gat att gat gtt gga tgt 2544
Cys Ala His His Ser His His Phe Thr Leu Asp Ile Asp Val Gly Cys
835 840 845
aca gac tta aat gag gac tta ggt gta tgg gtg ata ttc aag att aag 2592
Thr Asp Leu Asn Glu Asp Leu Gly Val Trp Val Ile Phe Lys Ile Lys
850 855 860
acg caa gat ggc cat gca aga cta ggg aat cta gag ttt ctc gaa gag 2640
Thr Gln Asp Gly His Ala Arg Leu Gly Asn Leu Glu Phe Leu Glu Glu
865 870 875 880
aaa cca tta tta ggg gaa gca cta gct cgt gtg aaa aga gcg gag aag 2688
Lys Pro Leu Leu Gly Glu Ala Leu Ala Arg Val Lys Arg Ala Glu Lys
885 890 895
aag tgg aga gac aaa cga gag aaa ctg cag ttg gaa aca aat att gtt 2736
Lys Trp Arg Asp Lys Arg Glu Lys Leu Gln Leu Glu Thr Asn Ile Val
900 905 910
tat aaa gag gca aaa gaa tct gta gat gct tta ttt gta aac tct caa 2784
Tyr Lys Glu Ala Lys Glu Ser Val Asp Ala Leu Phe Val Asn Ser Gln
915 920 925
tat gat aga tta caa gtg gat acg aac atc gcg atg att cat gcg gca 2832
Tyr Asp Arg Leu Gln Val Asp Thr Asn Ile Ala Met Ile His Ala Ala
930 935 940
gat aaa cgc gtt cat aga atc cgg gaa gcg tat ctg cca gag ttg tct 2880
Asp Lys Arg Val His Arg Ile Arg Glu Ala Tyr Leu Pro Glu Leu Ser
945 950 955 960
gtg att cca ggt gtc aat gcg gcc att ttc gaa gaa tta gag gga cgt 2928
Val Ile Pro Gly Val Asn Ala Ala Ile Phe Glu Glu Leu Glu Gly Arg
965 970 975
att ttt aca gcg tat tcc tta tat gat gcg aga aat gtc att aaa aat 2976
Ile Phe Thr Ala Tyr Ser Leu Tyr Asp Ala Arg Asn Val Ile Lys Asn
980 985 990
ggc gat ttc aat aat ggc tta tta tgc tgg aac gtg aaa ggt cat gta 3024
Gly Asp Phe Asn Asn Gly Leu Leu Cys Trp Asn Val Lys Gly His Val
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gat gta gaa gag caa aac aac cac cgt tcg gtc ctt gtt atc cca gaa 3072
Asp Val Glu Glu Gln Asn Asn His Arg Ser Val Leu Val Ile Pro Glu
1010 1015 1020
tgg gag gca gaa gtg tca caa gag gtt cgt gtc tgt cca ggt cgt ggc 3120
Trp Glu Ala Glu Val Ser Gln Glu Val Arg Val Cys Pro Gly Arg Gly
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tat atc ctt cgt gtc aca gca tat aaa gag gga tat gga gag ggc tgc 3168
Tyr Ile Leu Arg Val Thr Ala Tyr Lys Glu Gly Tyr Gly Glu Gly Cys
1045 1050 1055
gta acg atc cat gag atc gaa gac aat aca gac gaa ctg aaa ttc agc 3216
Val Thr Ile His Glu Ile Glu Asp Asn Thr Asp Glu Leu Lys Phe Ser
1060 1065 1070
aac tgt gta gaa gag gaa gta tat cca aac aac aca gta acg tgt aat 3264
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aat tat act ggg act caa gaa gaa tat gag ggt acg tac act tct cgt 3312
Asn Tyr Thr Gly Thr Gln Glu Glu Tyr Glu Gly Thr Tyr Thr Ser Arg
1090 1095 1100
aat caa gga tat gac gaa gcc tat ggt aat aac cct tcc gta cca gct 3360
Asn Gln Gly Tyr Asp Glu Ala Tyr Gly Asn Asn Pro Ser Val Pro Ala
1105 1110 1115 1120
gat tac gct tca gtc tat gaa gaa aaa tcg tat aca gat gga cga aga 3408
Asp Tyr Ala Ser Val Tyr Glu Glu Lys Ser Tyr Thr Asp Gly Arg Arg
1125 1130 1135
gag aat cct tgt gaa tct aac aga ggc tat ggg gat tac aca cca cta 3456
Glu Asn Pro Cys Glu Ser Asn Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Thr Pro Leu
1140 1145 1150
ccg gct ggt tat gta aca aag gat tta gag tac ttc cca gag acc gat 3504
Pro Ala Gly Tyr Val Thr Lys Asp Leu Glu Tyr Phe Pro Glu Thr Asp
1155 1160 1165
aag gta tgg att gag atc gga gaa aca gaa gga aca ttc atc gtg gat 3552
Lys Val Trp Ile Glu Ile Gly Glu Thr Glu Gly Thr Phe Ile Val Asp
1170 1175 1180
agc gtg gaa tta ctc ctt atg gag gaa 3579
Ser Val Glu Leu Leu Leu Met Glu Glu
1185 1190
<210> 2
<211> 1193
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: H04 with Cry1C
tail
<400> 2
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1 5 10 15
Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly
20 25 30
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Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala
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225 230 235 240
Leu Asp Ile Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr Pro
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Glu Tyr Tyr Trp Ser Gly His Gln
305 310 315 320
Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe Pro
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu Ser Glu Lys Val Lys His Ala Lys Arg
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690 695 700
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Leu Glu Trp Asn Pro Asp Leu Asp Cys Ser Cys Arg Asp Gly Glu Lys
820 825 830
Cys Ala His His Ser His His Phe Thr Leu Asp Ile Asp Val Gly Cys
835 840 845
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850 855 860
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885 890 895
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980 985 990
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<210> 3
<211> 1896
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic gene
encoding the toxin portion of H04 without a tail
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1896)
<223> H04 toxin portion without a tail
<400> 3
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Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu
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85 90 95
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Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu
100 105 110
agc ttc cgc gag tgg gag gcc gac ccc acc aac ccc gcc ctg cgc gag 384
Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu
115 120 125
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130 135 140
atc ccc ctg ttc gcc gtg cag aac tac cag gtg ccc ctg ctg agc gtg 480
Ile Pro Leu Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val
145 150 155 160
tac gtg cag gcc gcc aac ctg cac ctg agc gtg ctg cgc gac gtc agc 528
Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser
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180 185 190
tac aac gac ctg acc cgc ctg atc ggc aac tac acc gac cac gcc gtg 624
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195 200 205
cgc tgg tac aac acc ggc ctg gag cgc gtg tgg ggt ccc gac agc cgc 672
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gac tgg atc agg tac aac cag ttc cgc cgc gag ctg acc ctg acc gtg 720
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ctg gac atc gtg agc ctg ttc ccc aac tac gac agc cgc acc tac ccc 768
Leu Asp Ile Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr Pro
245 250 255
atc cgc acc gtg agc cag ctg acc cgc gag att tac acc aac ccc gtg 816
Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val
260 265 270
ctg gag aac ttc gac ggc agc ttc cgc ggc agc gcc cag ggc atc gag 864
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Gly Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile Thr
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Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Glu Tyr Tyr Trp Ser Gly His Gln
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atc atg gcc agc ccc gtc ggc ttc agc ggc ccc gag ttc acc ttc ccc 1008
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ctg tac ggc acc atg ggc aac gct gca cct cag cag cgc atc gtg gca 1056
Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala
340 345 350
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385 390 395 400
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Ala Glu Ser Asp Leu Glu Arg
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<210> 4
<211> 631
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic gene
encoding the toxin portion of H04 without a tail
<400> 4
Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu
1 5 10 15
Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly
20 25 30
Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu Ser
35 40 45
Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile Ile
50 55 60
Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile
65 70 75 80
Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala
85 90 95
Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu
100 105 110
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp His Ala Val
195 200 205
Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg
210 215 220
Asp Trp Ile Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val
225 230 235 240
Leu Asp Ile Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr Pro
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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610 615 620
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agc aac ccc gag gtg gag gtg ctg ggc ggc gag cgc atc gag acc ggc 96
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20 25 30
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35 40 45
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130 135 140
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Ile Pro Leu Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val
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tac gtg cag gcc gcc aac ctg cac ctg agc gtg ctg cgc gac gtc agc 528
Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser
165 170 175
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Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg
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Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp His Ala Val
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Asp Trp Ile Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val
225 230 235 240
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic gene
encoding H04 with full-length Cry1Ab tail
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85 90 95
atc agc cgc ctg gag ggc ctg agc aac ctg tac caa atc tac gcc gag 336
Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu
100 105 110
agc ttc cgc gag tgg gag gcc gac ccc acc aac ccc gcc ctg cgc gag 384
Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu
115 120 125
gag atg cgc atc cag ttc aac gac atg aac agc gcc ctg acc acc gcc 432
Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala
130 135 140
atc ccc ctg ttc gcc gtg cag aac tac cag gtg ccc ctg ctg agc gtg 480
Ile Pro Leu Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val
145 150 155 160
tac gtg cag gcc gcc aac ctg cac ctg agc gtg ctg cgc gac gtc agc 528
Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser
165 170 175
gtg ttc ggc cag cgc tgg ggc ttc gac gcc gcc acc atc aac agc cgc 576
Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg
180 185 190
tac aac gac ctg acc cgc ctg atc ggc aac tac acc gac cac gcc gtg 624
Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp His Ala Val
195 200 205
cgc tgg tac aac acc ggc ctg gag cgc gtg tgg ggt ccc gac agc cgc 672
Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg
210 215 220
gac tgg atc agg tac aac cag ttc cgc cgc gag ctg acc ctg acc gtg 720
Asp Trp Ile Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val
225 230 235 240
ctg gac atc gtg agc ctg ttc ccc aac tac gac agc cgc acc tac ccc 768
Leu Asp Ile Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr Pro
245 250 255
atc cgc acc gtg agc cag ctg acc cgc gag att tac acc aac ccc gtg 816
Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val
260 265 270
ctg gag aac ttc gac ggc agc ttc cgc ggc agc gcc cag ggc atc gag 864
Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile Glu
275 280 285
ggc agc atc cgc agc ccc cac ctg atg gac atc ctg aac agc atc acc 912
Gly Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile Thr
290 295 300
atc tac acc gac gcc cac cgc ggc gag tac tac tgg agc ggc cac cag 960
Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Glu Tyr Tyr Trp Ser Gly His Gln
305 310 315 320
atc atg gcc agc ccc gtc ggc ttc agc ggc ccc gag ttc acc ttc ccc 1008
Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe Pro
325 330 335
ctg tac ggc acc atg ggc aac gct gca cct cag cag cgc atc gtg gca 1056
Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala
340 345 350
cag ctg ggc cag gga gtg tac cgc acc ctg agc agc acc ctg tac cgt 1104
Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg
355 360 365
cga cct ttc aac atc ggc atc aac aac cag cag ctg agc gtg ctg gac 1152
Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp
370 375 380
ggc acc gag ttc gcc tac ggc acc agc agc aac ctg ccc agc gcc gtg 1200
Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val
385 390 395 400
tac cgc aag agc ggc acc gtg gac agc ctg gac gag atc ccc cct cag 1248
Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln
405 410 415
aac aac aac gtg cca cct cga cag ggc ttc agc cac cgt ctg agc cac 1296
Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His
420 425 430
gtg agc atg ttc cgc agt ggc ttc agc aac agc agc gtg agc atc atc 1344
Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile
435 440 445
cgt gca ccc atg ttc agc tgg att cac cgc agc gcc acc ctg acc aac 1392
Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Thr Leu Thr Asn
450 455 460
acc atc gac ccc gag cgc atc aac cag atc ccc ctg gtg aag ggc ttc 1440
Thr Ile Asp Pro Glu Arg Ile Asn Gln Ile Pro Leu Val Lys Gly Phe
465 470 475 480
cgg gtg tgg ggc ggc acc agc gtg atc acc ggc ccc ggc ttc acc gga 1488
Arg Val Trp Gly Gly Thr Ser Val Ile Thr Gly Pro Gly Phe Thr Gly
485 490 495
ggc gac atc ctg cgc aga aac acc ttc ggc gac ttc gtg agc ctg cag 1536
Gly Asp Ile Leu Arg Arg Asn Thr Phe Gly Asp Phe Val Ser Leu Gln
500 505 510
gtg aac atc aac agc ccc atc acc cag cgt tac cgc ctg cgc ttc cgc 1584
Val Asn Ile Asn Ser Pro Ile Thr Gln Arg Tyr Arg Leu Arg Phe Arg
515 520 525
tac gcc agc agc cgc gac gcc cgt gtg atc gtg ctg act ggc gcc gct 1632
Tyr Ala Ser Ser Arg Asp Ala Arg Val Ile Val Leu Thr Gly Ala Ala
530 535 540
agc acc ggt gtg ggc ggt cag gtg agc gtg aac atg ccc ctg cag aag 1680
Ser Thr Gly Val Gly Gly Gln Val Ser Val Asn Met Pro Leu Gln Lys
545 550 555 560
act atg gag atc ggc gag aac ctg act agt cgc acc ttc cgc tac acc 1728
Thr Met Glu Ile Gly Glu Asn Leu Thr Ser Arg Thr Phe Arg Tyr Thr
565 570 575
gac ttc agc aac ccc ttc agc ttc cgc gcc aac ccc gac atc atc ggc 1776
Asp Phe Ser Asn Pro Phe Ser Phe Arg Ala Asn Pro Asp Ile Ile Gly
580 585 590
atc agc gag cag ccc ctg ttc ggt gcc ggc agc atc agc agc ggc gag 1824
Ile Ser Glu Gln Pro Leu Phe Gly Ala Gly Ser Ile Ser Ser Gly Glu
595 600 605
ctg tac atc gac aag atc gag atc atc ctg gcc gac gcc acc ttc gag 1872
Leu Tyr Ile Asp Lys Ile Glu Ile Ile Leu Ala Asp Ala Thr Phe Glu
610 615 620
gcc gag agc gac ctg gag cgc gcc cag aag gcc gtg aac gcc ctg ttc 1920
Ala Glu Ser Asp Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val Asn Ala Leu Phe
625 630 635 640
acc agc agc aac cag atc ggc ctg aag acc gac gtg acc gac tac cac 1968
Thr Ser Ser Asn Gln Ile Gly Leu Lys Thr Asp Val Thr Asp Tyr His
645 650 655
atc gac cag gtg agc aac ctg gtg gac tgc tta agc gac gag ttc tgc 2016
Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val Asp Cys Leu Ser Asp Glu Phe Cys
660 665 670
ctg gac gag aag aag gag ctg agc gag aag gtg aag cac gcc aag cgc 2064
Leu Asp Glu Lys Lys Glu Leu Ser Glu Lys Val Lys His Ala Lys Arg
675 680 685
ctg agc gac gag cgc aac ctg ctg cag gac ccc aac ttc cgc ggc atc 2112
Leu Ser Asp Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro Asn Phe Arg Gly Ile
690 695 700
aac cgc cag ctg gac cgc ggc tgg cga ggc agc acc gat atc acc atc 2160
Asn Arg Gln Leu Asp Arg Gly Trp Arg Gly Ser Thr Asp Ile Thr Ile
705 710 715 720
cag ggc ggc gac gac gtg ttc aag gag aac tac gtg acc ctg cag ggc 2208
Gln Gly Gly Asp Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val Thr Leu Gln Gly
725 730 735
acc ttc gac gag tgc tac ccc acc tac ctg tac cag ccg atc gac gag 2256
Thr Phe Asp Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln Pro Ile Asp Glu
740 745 750
agc aag ctg aag gcc tac acc cgc tac cag ctg cgc ggc tac atc gag 2304
Ser Lys Leu Lys Ala Tyr Thr Arg Tyr Gln Leu Arg Gly Tyr Ile Glu
755 760 765
gac agc cag gac ctg gaa atc tac ctg atc cgc tac aac gcg aag cac 2352
Asp Ser Gln Asp Leu Glu Ile Tyr Leu Ile Arg Tyr Asn Ala Lys His
770 775 780
gag acc gtg aac gtg ccc ggc acc ggc agc ctg tgg ccc ctg agc gcc 2400
Glu Thr Val Asn Val Pro Gly Thr Gly Ser Leu Trp Pro Leu Ser Ala
785 790 795 800
ccc agc ccc atc ggc aag tgc ggg gag ccg aat cga tgc gct ccg cac 2448
Pro Ser Pro Ile Gly Lys Cys Gly Glu Pro Asn Arg Cys Ala Pro His
805 810 815
ctg gag tgg aac ccg gac cta gac tgc agc tgc agg gac ggg gag aag 2496
Leu Glu Trp Asn Pro Asp Leu Asp Cys Ser Cys Arg Asp Gly Glu Lys
820 825 830
tgc gcc cac cac agc cac cac ttc agc ctg gac atc gac gtg ggc tgc 2544
Cys Ala His His Ser His His Phe Ser Leu Asp Ile Asp Val Gly Cys
835 840 845
acc gac ctg aac gag gac ctg ggc gtg tgg gtg atc ttc aag atc aag 2592
Thr Asp Leu Asn Glu Asp Leu Gly Val Trp Val Ile Phe Lys Ile Lys
850 855 860
acc cag gac ggc cac gcc cgc ctg ggc aat cta gag ttc ctg gag gag 2640
Thr Gln Asp Gly His Ala Arg Leu Gly Asn Leu Glu Phe Leu Glu Glu
865 870 875 880
aag ccc ctg gtg ggc gag gcc ctg gcc cgc gtg aag cgt gct gag aag 2688
Lys Pro Leu Val Gly Glu Ala Leu Ala Arg Val Lys Arg Ala Glu Lys
885 890 895
aag tgg cgc gac aag cgc gag aag ctg gag tgg gag acc aac atc gtg 2736
Lys Trp Arg Asp Lys Arg Glu Lys Leu Glu Trp Glu Thr Asn Ile Val
900 905 910
tac aag gag gcc aag gag agc gtg gac gcc ctg ttc gtg aac agc cag 2784
Tyr Lys Glu Ala Lys Glu Ser Val Asp Ala Leu Phe Val Asn Ser Gln
915 920 925
tac gac cgc ctg cag gcc gac acc aac atc gcc atg atc cac gcc gcc 2832
Tyr Asp Arg Leu Gln Ala Asp Thr Asn Ile Ala Met Ile His Ala Ala
930 935 940
gac aag cgc gtg cac agc att cgc gag gcc tac ctg ccc gag ctg agc 2880
Asp Lys Arg Val His Ser Ile Arg Glu Ala Tyr Leu Pro Glu Leu Ser
945 950 955 960
gtg atc ccc ggt gtg aac gcc gcc atc ttc gag gaa ctc gag ggc cgc 2928
Val Ile Pro Gly Val Asn Ala Ala Ile Phe Glu Glu Leu Glu Gly Arg
965 970 975
atc ttc acc gcc ttc agc ctg tac gac gcc cgc aac gtg atc aag aac 2976
Ile Phe Thr Ala Phe Ser Leu Tyr Asp Ala Arg Asn Val Ile Lys Asn
980 985 990
ggc gac ttc aac aac ggc ctg agc tgc tgg aac gtg aag ggc cac gtg 3024
Gly Asp Phe Asn Asn Gly Leu Ser Cys Trp Asn Val Lys Gly His Val
995 1000 1005
gac gtg gag gag cag aac aac cac cgc agc gtg ctg gtg gtg ccc gag 3072
Asp Val Glu Glu Gln Asn Asn His Arg Ser Val Leu Val Val Pro Glu
1010 1015 1020
tgg gag gcc gag gtg agc cag gag gtg cgc gtg tgc ccc ggc cgc ggc 3120
Trp Glu Ala Glu Val Ser Gln Glu Val Arg Val Cys Pro Gly Arg Gly
1025 1030 1035 1040
tac atc ctg cgc gtg acc gcc tac aag gag ggc tac ggc gag ggc tgc 3168
Tyr Ile Leu Arg Val Thr Ala Tyr Lys Glu Gly Tyr Gly Glu Gly Cys
1045 1050 1055
gtg acc atc cac gag atc gag aac aac acc gac gag ctc aag ttc agc 3216
Val Thr Ile His Glu Ile Glu Asn Asn Thr Asp Glu Leu Lys Phe Ser
1060 1065 1070
aac tgc gtg gag gag gag gtt tac ccc aac aac acc gtg acc tgc aac 3264
Asn Cys Val Glu Glu Glu Val Tyr Pro Asn Asn Thr Val Thr Cys Asn
1075 1080 1085
gac tac acc gcg acc cag gag gag tac gaa ggc acc tac acc tct cgc 3312
Asp Tyr Thr Ala Thr Gln Glu Glu Tyr Glu Gly Thr Tyr Thr Ser Arg
1090 1095 1100
aac agg ggt tac gac ggc gcc tac gag tcc aac agc tcc gtg cca gct 3360
Asn Arg Gly Tyr Asp Gly Ala Tyr Glu Ser Asn Ser Ser Val Pro Ala
1105 1110 1115 1120
gac tac gcc agc gcc tac gag gag aaa gcc tac acc gac ggt aga cgc 3408
Asp Tyr Ala Ser Ala Tyr Glu Glu Lys Ala Tyr Thr Asp Gly Arg Arg
1125 1130 1135
gac aac cca tgt gag agc aac aga ggc tac ggc gac tac acc ccc ctg 3456
Asp Asn Pro Cys Glu Ser Asn Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Thr Pro Leu
1140 1145 1150
ccc gct gga tac gtg acc aag gag ctg gag tac ttc ccc gag acc gac 3504
Pro Ala Gly Tyr Val Thr Lys Glu Leu Glu Tyr Phe Pro Glu Thr Asp
1155 1160 1165
aag gtg tgg atc gag att ggc gag acc gag ggc acc ttc atc gtg gac 3552
Lys Val Trp Ile Glu Ile Gly Glu Thr Glu Gly Thr Phe Ile Val Asp
1170 1175 1180
agc gtg gag ctg ctg ctg atg gag gag tag 3582
Ser Val Glu Leu Leu Leu Met Glu Glu
1185 1190
<210> 8
<211> 1193
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic gene
encoding H04 with full-length Cry1Ab tail
<400> 8
Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu
1 5 10 15
Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly
20 25 30
Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu Ser
35 40 45
Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile Ile
50 55 60
Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile
65 70 75 80
Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala
85 90 95
Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu
100 105 110
Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu
115 120 125
Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala
130 135 140
Ile Pro Leu Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val
145 150 155 160
Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser
165 170 175
Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg
180 185 190
Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp His Ala Val
195 200 205
Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg
210 215 220
Asp Trp Ile Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val
225 230 235 240
Leu Asp Ile Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr Pro
245 250 255
Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val
260 265 270
Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile Glu
275 280 285
Gly Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile Thr
290 295 300
Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Glu Tyr Tyr Trp Ser Gly His Gln
305 310 315 320
Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe Pro
325 330 335
Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala
340 345 350
Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg
355 360 365
Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp
370 375 380
Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val
385 390 395 400
Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln
405 410 415
Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His
420 425 430
Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile
435 440 445
Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Thr Leu Thr Asn
450 455 460
Thr Ile Asp Pro Glu Arg Ile Asn Gln Ile Pro Leu Val Lys Gly Phe
465 470 475 480
Arg Val Trp Gly Gly Thr Ser Val Ile Thr Gly Pro Gly Phe Thr Gly
485 490 495
Gly Asp Ile Leu Arg Arg Asn Thr Phe Gly Asp Phe Val Ser Leu Gln
500 505 510
Val Asn Ile Asn Ser Pro Ile Thr Gln Arg Tyr Arg Leu Arg Phe Arg
515 520 525
Tyr Ala Ser Ser Arg Asp Ala Arg Val Ile Val Leu Thr Gly Ala Ala
530 535 540
Ser Thr Gly Val Gly Gly Gln Val Ser Val Asn Met Pro Leu Gln Lys
545 550 555 560
Thr Met Glu Ile Gly Glu Asn Leu Thr Ser Arg Thr Phe Arg Tyr Thr
565 570 575
Asp Phe Ser Asn Pro Phe Ser Phe Arg Ala Asn Pro Asp Ile Ile Gly
580 585 590
Ile Ser Glu Gln Pro Leu Phe Gly Ala Gly Ser Ile Ser Ser Gly Glu
595 600 605
Leu Tyr Ile Asp Lys Ile Glu Ile Ile Leu Ala Asp Ala Thr Phe Glu
610 615 620
Ala Glu Ser Asp Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val Asn Ala Leu Phe
625 630 635 640
Thr Ser Ser Asn Gln Ile Gly Leu Lys Thr Asp Val Thr Asp Tyr His
645 650 655
Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val Asp Cys Leu Ser Asp Glu Phe Cys
660 665 670
Leu Asp Glu Lys Lys Glu Leu Ser Glu Lys Val Lys His Ala Lys Arg
675 680 685
Leu Ser Asp Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro Asn Phe Arg Gly Ile
690 695 700
Asn Arg Gln Leu Asp Arg Gly Trp Arg Gly Ser Thr Asp Ile Thr Ile
705 710 715 720
Gln Gly Gly Asp Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val Thr Leu Gln Gly
725 730 735
Thr Phe Asp Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln Pro Ile Asp Glu
740 745 750
Ser Lys Leu Lys Ala Tyr Thr Arg Tyr Gln Leu Arg Gly Tyr Ile Glu
755 760 765
Asp Ser Gln Asp Leu Glu Ile Tyr Leu Ile Arg Tyr Asn Ala Lys His
770 775 780
Glu Thr Val Asn Val Pro Gly Thr Gly Ser Leu Trp Pro Leu Ser Ala
785 790 795 800
Pro Ser Pro Ile Gly Lys Cys Gly Glu Pro Asn Arg Cys Ala Pro His
805 810 815
Leu Glu Trp Asn Pro Asp Leu Asp Cys Ser Cys Arg Asp Gly Glu Lys
820 825 830
Cys Ala His His Ser His His Phe Ser Leu Asp Ile Asp Val Gly Cys
835 840 845
Thr Asp Leu Asn Glu Asp Leu Gly Val Trp Val Ile Phe Lys Ile Lys
850 855 860
Thr Gln Asp Gly His Ala Arg Leu Gly Asn Leu Glu Phe Leu Glu Glu
865 870 875 880
Lys Pro Leu Val Gly Glu Ala Leu Ala Arg Val Lys Arg Ala Glu Lys
885 890 895
Lys Trp Arg Asp Lys Arg Glu Lys Leu Glu Trp Glu Thr Asn Ile Val
900 905 910
Tyr Lys Glu Ala Lys Glu Ser Val Asp Ala Leu Phe Val Asn Ser Gln
915 920 925
Tyr Asp Arg Leu Gln Ala Asp Thr Asn Ile Ala Met Ile His Ala Ala
930 935 940
Asp Lys Arg Val His Ser Ile Arg Glu Ala Tyr Leu Pro Glu Leu Ser
945 950 955 960
Val Ile Pro Gly Val Asn Ala Ala Ile Phe Glu Glu Leu Glu Gly Arg
965 970 975
Ile Phe Thr Ala Phe Ser Leu Tyr Asp Ala Arg Asn Val Ile Lys Asn
980 985 990
Gly Asp Phe Asn Asn Gly Leu Ser Cys Trp Asn Val Lys Gly His Val
995 1000 1005
Asp Val Glu Glu Gln Asn Asn His Arg Ser Val Leu Val Val Pro Glu
1010 1015 1020
Trp Glu Ala Glu Val Ser Gln Glu Val Arg Val Cys Pro Gly Arg Gly
1025 1030 1035 1040
Tyr Ile Leu Arg Val Thr Ala Tyr Lys Glu Gly Tyr Gly Glu Gly Cys
1045 1050 1055
Val Thr Ile His Glu Ile Glu Asn Asn Thr Asp Glu Leu Lys Phe Ser
1060 1065 1070
Asn Cys Val Glu Glu Glu Val Tyr Pro Asn Asn Thr Val Thr Cys Asn
1075 1080 1085
Asp Tyr Thr Ala Thr Gln Glu Glu Tyr Glu Gly Thr Tyr Thr Ser Arg
1090 1095 1100
Asn Arg Gly Tyr Asp Gly Ala Tyr Glu Ser Asn Ser Ser Val Pro Ala
1105 1110 1115 1120
Asp Tyr Ala Ser Ala Tyr Glu Glu Lys Ala Tyr Thr Asp Gly Arg Arg
1125 1130 1135
Asp Asn Pro Cys Glu Ser Asn Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Thr Pro Leu
1140 1145 1150
Pro Ala Gly Tyr Val Thr Lys Glu Leu Glu Tyr Phe Pro Glu Thr Asp
1155 1160 1165
Lys Val Trp Ile Glu Ile Gly Glu Thr Glu Gly Thr Phe Ile Val Asp
1170 1175 1180
Ser Val Glu Leu Leu Leu Met Glu Glu
1185 1190
<210> 9
<211> 2007
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic gene
encoding H04 plus the first 40 amino acids of the
Cry1Ab tail
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2007)
<223> H04 with truncated Cry1Ab tail
<400> 9
atg gac aac aac ccc aac atc aac gag tgc atc ccc tac aac tgc ctg 48
Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu
1 5 10 15
agc aac ccc gag gtg gag gtg ctg ggc ggc gag cgc atc gag acc ggc 96
Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly
20 25 30
tac acc ccc atc gac atc agc ctg agc ctg acc cag ttc ctg ctg agc 144
Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu Ser
35 40 45
gag ttc gtg ccc ggc gcc ggc ttc gtg ctg ggc ctg gtg gac atc atc 192
Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile Ile
50 55 60
tgg ggc atc ttc ggc ccc agc cag tgg gac gcc ttc ctg gtg cag atc 240
Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile
65 70 75 80
gag cag ttg ata aac caa cgc ata gag gaa ttc gcc cgc aac cag gcc 288
Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala
85 90 95
atc agc cgc ctg gag ggc ctg agc aac ctg tac caa atc tac gcc gag 336
Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu
100 105 110
agc ttc cgc gag tgg gag gcc gac ccc acc aac ccc gcc ctg cgc gag 384
Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu
115 120 125
gag atg cgc atc cag ttc aac gac atg aac agc gcc ctg acc acc gcc 432
Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala
130 135 140
atc ccc ctg ttc gcc gtg cag aac tac cag gtg ccc ctg ctg agc gtg 480
Ile Pro Leu Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val
145 150 155 160
tac gtg cag gcc gcc aac ctg cac ctg agc gtg ctg cgc gac gtc agc 528
Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser
165 170 175
gtg ttc ggc cag cgc tgg ggc ttc gac gcc gcc acc atc aac agc cgc 576
Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg
180 185 190
tac aac gac ctg acc cgc ctg atc ggc aac tac acc gac cac gcc gtg 624
Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp His Ala Val
195 200 205
cgc tgg tac aac acc ggc ctg gag cgc gtg tgg ggt ccc gac agc cgc 672
Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg
210 215 220
gac tgg atc agg tac aac cag ttc cgc cgc gag ctg acc ctg acc gtg 720
Asp Trp Ile Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val
225 230 235 240
ctg gac atc gtg agc ctg ttc ccc aac tac gac agc cgc acc tac ccc 768
Leu Asp Ile Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr Pro
245 250 255
atc cgc acc gtg agc cag ctg acc cgc gag att tac acc aac ccc gtg 816
Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val
260 265 270
ctg gag aac ttc gac ggc agc ttc cgc ggc agc gcc cag ggc atc gag 864
Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile Glu
275 280 285
ggc agc atc cgc agc ccc cac ctg atg gac atc ctg aac agc atc acc 912
Gly Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile Thr
290 295 300
atc tac acc gac gcc cac cgc ggc gag tac tac tgg agc ggc cac cag 960
Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Glu Tyr Tyr Trp Ser Gly His Gln
305 310 315 320
atc atg gcc agc ccc gtc ggc ttc agc ggc ccc gag ttc acc ttc ccc 1008
Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe Pro
325 330 335
ctg tac ggc acc atg ggc aac gct gca cct cag cag cgc atc gtg gca 1056
Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala
340 345 350
cag ctg ggc cag gga gtg tac cgc acc ctg agc agc acc ctg tac cgt 1104
Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg
355 360 365
cga cct ttc aac atc ggc atc aac aac cag cag ctg agc gtg ctg gac 1152
Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp
370 375 380
ggc acc gag ttc gcc tac ggc acc agc agc aac ctg ccc agc gcc gtg 1200
Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val
385 390 395 400
tac cgc aag agc ggc acc gtg gac agc ctg gac gag atc ccc cct cag 1248
Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln
405 410 415
aac aac aac gtg cca cct cga cag ggc ttc agc cac cgt ctg agc cac 1296
Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His
420 425 430
gtg agc atg ttc cgc agt ggc ttc agc aac agc agc gtg agc atc atc 1344
Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile
435 440 445
cgt gca ccc atg ttc agc tgg att cac cgc agc gcc acc ctg acc aac 1392
Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Thr Leu Thr Asn
450 455 460
acc atc gac ccc gag cgc atc aac cag atc ccc ctg gtg aag ggc ttc 1440
Thr Ile Asp Pro Glu Arg Ile Asn Gln Ile Pro Leu Val Lys Gly Phe
465 470 475 480
cgg gtg tgg ggc ggc acc agc gtg atc acc ggc ccc ggc ttc acc gga 1488
Arg Val Trp Gly Gly Thr Ser Val Ile Thr Gly Pro Gly Phe Thr Gly
485 490 495
ggc gac atc ctg cgc aga aac acc ttc ggc gac ttc gtg agc ctg cag 1536
Gly Asp Ile Leu Arg Arg Asn Thr Phe Gly Asp Phe Val Ser Leu Gln
500 505 510
gtg aac atc aac agc ccc atc acc cag cgt tac cgc ctg cgc ttc cgc 1584
Val Asn Ile Asn Ser Pro Ile Thr Gln Arg Tyr Arg Leu Arg Phe Arg
515 520 525
tac gcc agc agc cgc gac gcc cgt gtg atc gtg ctg act ggc gcc gct 1632
Tyr Ala Ser Ser Arg Asp Ala Arg Val Ile Val Leu Thr Gly Ala Ala
530 535 540
agc acc ggt gtg ggc ggt cag gtg agc gtg aac atg ccc ctg cag aag 1680
Ser Thr Gly Val Gly Gly Gln Val Ser Val Asn Met Pro Leu Gln Lys
545 550 555 560
act atg gag atc ggc gag aac ctg act agt cgc acc ttc cgc tac acc 1728
Thr Met Glu Ile Gly Glu Asn Leu Thr Ser Arg Thr Phe Arg Tyr Thr
565 570 575
gac ttc agc aac ccc ttc agc ttc cgc gcc aac ccc gac atc atc ggc 1776
Asp Phe Ser Asn Pro Phe Ser Phe Arg Ala Asn Pro Asp Ile Ile Gly
580 585 590
atc agc gag cag ccc ctg ttc ggt gcc ggc agc atc agc agc ggc gag 1824
Ile Ser Glu Gln Pro Leu Phe Gly Ala Gly Ser Ile Ser Ser Gly Glu
595 600 605
ctg tac atc gac aag atc gag atc atc ctg gcc gac gcc acc ttc gag 1872
Leu Tyr Ile Asp Lys Ile Glu Ile Ile Leu Ala Asp Ala Thr Phe Glu
610 615 620
gcc gag agc gac ctg gag cgc gcc cag aag gcc gtg aac gcc ctg ttc 1920
Ala Glu Ser Asp Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val Asn Ala Leu Phe
625 630 635 640
acc agc agc aac cag atc ggc ctg aag acc gac gtg acc gac tac cac 1968
Thr Ser Ser Asn Gln Ile Gly Leu Lys Thr Asp Val Thr Asp Tyr His
645 650 655
atc gac cag gtg agc aac ctg gtg gac tgc tta agc tag 2007
Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val Asp Cys Leu Ser
660 665
<210> 10
<211> 668
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic gene
encoding H04 plus the first 40 amino acids of the
Cry1Ab tail
<400> 10
Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu
1 5 10 15
Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly
20 25 30
Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu Ser
35 40 45
Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile Ile
50 55 60
Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile
65 70 75 80
Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala
85 90 95
Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu
100 105 110
Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu
115 120 125
Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala
130 135 140
Ile Pro Leu Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val
145 150 155 160
Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser
165 170 175
Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg
180 185 190
Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp His Ala Val
195 200 205
Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg
210 215 220
Asp Trp Ile Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val
225 230 235 240
Leu Asp Ile Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr Pro
245 250 255
Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val
260 265 270
Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile Glu
275 280 285
Gly Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile Thr
290 295 300
Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Glu Tyr Tyr Trp Ser Gly His Gln
305 310 315 320
Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe Pro
325 330 335
Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala
340 345 350
Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg
355 360 365
Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp
370 375 380
Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val
385 390 395 400
Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln
405 410 415
Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His
420 425 430
Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile
435 440 445
Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Thr Leu Thr Asn
450 455 460
Thr Ile Asp Pro Glu Arg Ile Asn Gln Ile Pro Leu Val Lys Gly Phe
465 470 475 480
Arg Val Trp Gly Gly Thr Ser Val Ile Thr Gly Pro Gly Phe Thr Gly
485 490 495
Gly Asp Ile Leu Arg Arg Asn Thr Phe Gly Asp Phe Val Ser Leu Gln
500 505 510
Val Asn Ile Asn Ser Pro Ile Thr Gln Arg Tyr Arg Leu Arg Phe Arg
515 520 525
Tyr Ala Ser Ser Arg Asp Ala Arg Val Ile Val Leu Thr Gly Ala Ala
530 535 540
Ser Thr Gly Val Gly Gly Gln Val Ser Val Asn Met Pro Leu Gln Lys
545 550 555 560
Thr Met Glu Ile Gly Glu Asn Leu Thr Ser Arg Thr Phe Arg Tyr Thr
565 570 575
Asp Phe Ser Asn Pro Phe Ser Phe Arg Ala Asn Pro Asp Ile Ile Gly
580 585 590
Ile Ser Glu Gln Pro Leu Phe Gly Ala Gly Ser Ile Ser Ser Gly Glu
595 600 605
Leu Tyr Ile Asp Lys Ile Glu Ile Ile Leu Ala Asp Ala Thr Phe Glu
610 615 620
Ala Glu Ser Asp Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val Asn Ala Leu Phe
625 630 635 640
Thr Ser Ser Asn Gln Ile Gly Leu Lys Thr Asp Val Thr Asp Tyr His
645 650 655
Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val Asp Cys Leu Ser
660 665
<210> 11
<211> 13269
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: pNOV1308
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1896)
<223> synthetic nucleotide sequence encoding the toxin
portion of H04, without a tail
<220>
<221> misc_feature
<222> (2102)..(4083)
<223> Zea mays ubiquitin promoter
<220>
<221> misc_feature
<222> (4180)..(5283)
<223> PMI marker gene
<220>
<221> misc_feature
<222> (11247)..(12647)
<223> Zm Ubi promoter
<400> 11
atggacaaca accccaacat caacgagtgc atcccctaca actgcctgag caaccccgag 60
gtggaggtgc tgggcggcga gcgcatcgag accggctaca cccccatcga catcagcctg 120
agcctgaccc agttcctgct gagcgagttc gtgcccggcg ccggcttcgt gctgggcctg 180
gtggacatca tctggggcat cttcggcccc agccagtggg acgccttcct ggtgcagatc 240
gagcagttga taaaccaacg catagaggaa ttcgcccgca accaggccat cagccgcctg 300
gagggcctga gcaacctgta ccaaatctac gccgagagct tccgcgagtg ggaggccgac 360
cccaccaacc ccgccctgcg cgaggagatg cgcatccagt tcaacgacat gaacagcgcc 420
ctgaccaccg ccatccccct gttcgccgtg cagaactacc aggtgcccct gctgagcgtg 480
tacgtgcagg ccgccaacct gcacctgagc gtgctgcgcg acgtcagcgt gttcggccag 540
cgctggggct tcgacgccgc caccatcaac agccgctaca acgacctgac ccgcctgatc 600
ggcaactaca ccgaccacgc cgtgcgctgg tacaacaccg gcctggagcg cgtgtggggt 660
cccgacagcc gcgactggat caggtacaac cagttccgcc gcgagctgac cctgaccgtg 720
ctggacatcg tgagcctgtt ccccaactac gacagccgca cctaccccat ccgcaccgtg 780
agccagctga cccgcgagat ttacaccaac cccgtgctgg agaacttcga cggcagcttc 840
cgcggcagcg cccagggcat cgagggcagc atccgcagcc cccacctgat ggacatcctg 900
aacagcatca ccatctacac cgacgcccac cgcggcgagt actactggag cggccaccag 960
atcatggcca gccccgtcgg cttcagcggc cccgagttca ccttccccct gtacggcacc 1020
atgggcaacg ctgcacctca gcagcgcatc gtggcacagc tgggccaggg agtgtaccgc 1080
accctgagca gcaccctgta ccgtcgacct ttcaacatcg gcatcaacaa ccagcagctg 1140
agcgtgctgg acggcaccga gttcgcctac ggcaccagca gcaacctgcc cagcgccgtg 1200
taccgcaaga gcggcaccgt ggacagcctg gacgagatcc cccctcagaa caacaacgtg 1260
ccacctcgac agggcttcag ccaccgtctg agccacgtga gcatgttccg cagtggcttc 1320
agcaacagca gcgtgagcat catccgtgca cccatgttca gctggattca ccgcagcgcc 1380
accctgacca acaccatcga ccccgagcgc atcaaccaga tccccctggt gaagggcttc 1440
cgggtgtggg gcggcaccag cgtgatcacc ggccccggct tcaccggagg cgacatcctg 1500
cgcagaaaca ccttcggcga cttcgtgagc ctgcaggtga acatcaacag ccccatcacc 1560
cagcgttacc gcctgcgctt ccgctacgcc agcagccgcg acgcccgtgt gatcgtgctg 1620
actggcgccg ctagcaccgg tgtgggcggt caggtgagcg tgaacatgcc cctgcagaag 1680
actatggaga tcggcgagaa cctgactagt cgcaccttcc gctacaccga cttcagcaac 1740
cccttcagct tccgcgccaa ccccgacatc atcggcatca gcgagcagcc cctgttcggt 1800
gccggcagca tcagcagcgg cgagctgtac atcgacaaga tcgagatcat cctggccgac 1860
gccaccttcg aggccgagag cgacctggag cgctaagatc tgttctgcac aaagtggagt 1920
agtcagtcat cgatcaggaa ccagacacca gacttttatt catacagtga agtgaagtga 1980
agtgcagtgc agtgagttgc tggtttttgt acaacttagt atgtatttgt atttgtaaaa 2040
tacttctatc aataaaattt ctaattccta aaaccaaaat ccaggggtac cagcttgcat 2100
gcctgcagtg cagcgtgacc cggtcgtgcc cctctctaga gataatgagc attgcatgtc 2160
taagttataa aaaattacca catatttttt ttgtcacact tgtttgaagt gcagtttatc 2220
tatctttata catatattta aactttactc tacgaataat ataatctata gtactacaat 2280
aatatcagtg ttttagagaa tcatataaat gaacagttag acatggtcta aaggacaatt 2340
gagtattttg acaacaggac tctacagttt tatcttttta gtgtgcatgt gttctccttt 2400
ttttttgcaa atagcttcac ctatataata cttcatccat tttattagta catccattta 2460
gggtttaggg ttaatggttt ttatagacta atttttttag tacatctatt ttattctatt 2520
ttagcctcta aattaagaaa actaaaactc tattttagtt tttttattta ataatttaga 2580
tataaaatag aataaaataa agtgactaaa aattaaacaa atacccttta agaaattaaa 2640
aaaactaagg aaacattttt cttgtttcga gtagataatg ccagcctgtt aaacgccgtc 2700
gacgagtcta acggacacca accagcgaac cagcagcgtc gcgtcgggcc aagcgaagca 2760
gacggcacgg catctctgtc gctgcctctg gacccctctc gagagttccg ctccaccgtt 2820
ggacttgctc cgctgtcggc atccagaaat tgcgtggcgg agcggcagac gtgagccggc 2880
acggcaggcg gcctcctcct cctctcacgg caccggcagc tacgggggat tcctttccca 2940
ccgctccttc gctttccctt cctcgcccgc cgtaataaat agacaccccc tccacaccct 3000
ctttccccaa cctcgtgttg ttcggagcgc acacacacac aaccagatct cccccaaatc 3060
cacccgtcgg cacctccgct tcaaggtacg ccgctcgtcc tccccccccc cccctctcta 3120
ccttctctag atcggcgttc cggtccatgg ttagggcccg gtagttctac ttctgttcat 3180
gtttgtgtta gatccgtgtt tgtgttagat ccgtgctgct agcgttcgta cacggatgcg 3240
acctgtacgt cagacacgtt ctgattgcta acttgccagt gtttctcttt ggggaatcct 3300
gggatggctc tagccgttcc gcagacggga tcgatttcat gatttttttt gtttcgttgc 3360
atagggtttg gtttgccctt ttcctttatt tcaatatatg ccgtgcactt gtttgtcggg 3420
tcatcttttc atgctttttt ttgtcttggt tgtgatgatg tggtctggtt gggcggtcgt 3480
tctagatcgg agtagaattc tgtttcaaac tacctggtgg atttattaat tttggatctg 3540
tatgtgtgtg ccatacatat tcatagttac gaattgaaga tgatggatgg aaatatcgat 3600
ctaggatagg tatacatgtt gatgcgggtt ttactgatgc atatacagag atgctttttg 3660
ttcgcttggt tgtgatgatg tggtgtggtt gggcggtcgt tcattcgttc tagatcggag 3720
tagaatactg tttcaaacta cctggtgtat ttattaattt tggaactgta tgtgtgtgtc 3780
atacatcttc atagttacga gtttaagatg gatggaaata tcgatctagg ataggtatac 3840
atgttgatgt gggttttact gatgcatata catgatggca tatgcagcat ctattcatat 3900
gctctaacct tgagtaccta tctattataa taaacaagta tgttttataa ttattttgat 3960
cttgatatac ttggatgatg gcatatgcag cagctatatg tggatttttt tagccctgcc 4020
ttcatacgct atttatttgc ttggtactgt ttcttttgtc gatgctcacc ctgttgtttg 4080
gtgttacttc tgcagggatc cccgatcatg caaaaactca ttaactcagt gcaaaactat 4140
gcctggggca gcaaaacggc gttgactgaa ctttatggta tggaaaatcc gtccagccag 4200
ccgatggccg agctgtggat gggcgcacat ccgaaaagca gttcacgagt gcagaatgcc 4260
gccggagata tcgtttcact gcgtgatgtg attgagagtg ataaatcgac tctgctcgga 4320
gaggccgttg ccaaacgctt tggcgaactg cctttcctgt tcaaagtatt atgcgcagca 4380
cagccactct ccattcaggt tcatccaaac aaacacaatt ctgaaatcgg ttttgccaaa 4440
gaaaatgccg caggtatccc gatggatgcc gccgagcgta actataaaga tcctaaccac 4500
aagccggagc tggtttttgc gctgacgcct ttccttgcga tgaacgcgtt tcgtgaattt 4560
tccgagattg tctccctact ccagccggtc gcaggtgcac atccggcgat tgctcacttt 4620
ttacaacagc ctgatgccga acgtttaagc gaactgttcg ccagcctgtt gaatatgcag 4680
ggtgaagaaa aatcccgcgc gctggcgatt ttaaaatcgg ccctcgatag ccagcagggt 4740
gaaccgtggc aaacgattcg tttaatttct gaattttacc cggaagacag cggtctgttc 4800
tccccgctat tgctgaatgt ggtgaaattg aaccctggcg aagcgatgtt cctgttcgct 4860
gaaacaccgc acgcttacct gcaaggcgtg gcgctggaag tgatggcaaa ctccgataac 4920
gtgctgcgtg cgggtctgac gcctaaatac attgatattc cggaactggt tgccaatgtg 4980
aaattcgaag ccaaaccggc taaccagttg ttgacccagc cggtgaaaca aggtgcagaa 5040
ctggacttcc cgattccagt ggatgatttt gccttctcgc tgcatgacct tagtgataaa 5100
gaaaccacca ttagccagca gagtgccgcc attttgttct gcgtcgaagg cgatgcaacg 5160
ttgtggaaag gttctcagca gttacagctt aaaccgggtg aatcagcgtt tattgccgcc 5220
aacgaatcac cggtgactgt caaaggccac ggccgtttag cgcgtgttta caacaagctg 5280
taagagctta ctgaaaaaat taacatctct tgctaagctg ggagctcgat ccgtcgacct 5340
gcagatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt 5400
gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa 5460
tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa 5520
tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca 5580
tctatgttac tagatctgct agccctgcag gaaatttacc ggtgcccggg cggccagcat 5640
ggccgtatcc gcaatgtgtt attaagttgt ctaagcgtca atttgtttac accacaatat 5700
atcctgccac cagccagcca acagctcccc gaccggcagc tcggcacaaa atcaccactc 5760
gatacaggca gcccatcaga attaattctc atgtttgaca gcttatcatc gactgcacgg 5820
tgcaccaatg cttctggcgt caggcagcca tcggaagctg tggtatggct gtgcaggtcg 5880
taaatcactg cataattcgt gtcgctcaag gcgcactccc gttctggata atgttttttg 5940
cgccgacatc ataacggttc tggcaaatat tctgaaatga gctgttgaca attaatcatc 6000
cggctcgtat aatgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagaccat 6060
gagggaagcg ttgatcgccg aagtatcgac tcaactatca gaggtagttg gcgtcatcga 6120
gcgccatctc gaaccgacgt tgctggccgt acatttgtac ggctccgcag tggatggcgg 6180
cctgaagcca cacagtgata ttgatttgct ggttacggtg accgtaaggc ttgatgaaac 6240
aacgcggcga gctttgatca acgacctttt ggaaacttcg gcttcccctg gagagagcga 6300
gattctccgc gctgtagaag tcaccattgt tgtgcacgac gacatcattc cgtggcgtta 6360
tccagctaag cgcgaactgc aatttggaga atggcagcgc aatgacattc ttgcaggtat 6420
cttcgagcca gccacgatcg acattgatct ggctatcttg ctgacaaaag caagagaaca 6480
tagcgttgcc ttggtaggtc cagcggcgga ggaactcttt gatccggttc ctgaacagga 6540
tctatttgag gcgctaaatg aaaccttaac gctatggaac tcgccgcccg actgggctgg 6600
cgatgagcga aatgtagtgc ttacgttgtc ccgcatttgg tacagcgcag taaccggcaa 6660
aatcgcgccg aaggatgtcg ctgccgactg ggcaatggag cgcctgccgg cccagtatca 6720
gcccgtcata cttgaagcta ggcaggctta tcttggacaa gaagatcgct tggcctcgcg 6780
cgcagatcag ttggaagaat ttgttcacta cgtgaaaggc gagatcacca aagtagtcgg 6840
caaataaagc tctagtggat ctccgtaccc ccgggggatc tggctcgcgg cggacgcacg 6900
acgccggggc gagaccatag gcgatctcct aaatcaatag tagctgtaac ctcgaagcgt 6960
ttcacttgta acaacgattg agaatttttg tcataaaatt gaaatacttg gttcgcattt 7020
ttgtcatccg cggtcagccg caattctgac gaactgccca tttagctgga gatgattgta 7080
catccttcac gtgaaaattt ctcaagcgct gtgaacaagg gttcagattt tagattgaaa 7140
ggtgagccgt tgaaacacgt tcttcttgtc gatgacgacg tcgctatgcg gcatcttatt 7200
attgaatacc ttacgatcca cgccttcaaa gtgaccgcgg tagccgacag cacccagttc 7260
acaagagtac tctcttccgc gacggtcgat gtcgtggttg ttgatctaaa tttaggtcgt 7320
gaagatgggc tcgagatcgt tcgtaatctg gcggcaaagt ctgatattcc aatcataatt 7380
atcagtggcg accgccttga ggagacggat aaagttgttg cactcgagct aggagcaagt 7440
gattttatcg ctaagccgtt cagtatcaga gagtttctag cacgcattcg ggttgccttg 7500
cgcgtgcgcc ccaacgttgt ccgctccaaa gaccgacggt ctttttgttt tactgactgg 7560
acacttaatc tcaggcaacg tcgcttgatg tccgaagctg gcggtgaggt gaaacttacg 7620
gcaggtgagt tcaatcttct cctcgcgttt ttagagaaac cccgcgacgt tctatcgcgc 7680
gagcaacttc tcattgccag tcgagtacgc gacgaggagg tttatgacag gagtatagat 7740
gttctcattt tgaggctgcg ccgcaaactt gaggcagatc cgtcaagccc tcaactgata 7800
aaaacagcaa gaggtgccgg ttatttcttt gacgcggacg tgcaggtttc gcacgggggg 7860
acgatggcag cctgagccaa ttcccagatc cccgaggaat cggcgtgagc ggtcgcaaac 7920
catccggccc ggtacaaatc ggcgcggcgc tgggtgatga cctggtggag aagttgaagg 7980
ccgcgcaggc cgcccagcgg caacgcatcg aggcagaagc acgccccggt gaatcgtggc 8040
aagcggccgc tgatcgaatc cgcaaagaat cccggcaacc gccggcagcc ggtgcgccgt 8100
cgattaggaa gccgcccaag ggcgacgagc aaccagattt tttcgttccg atgctctatg 8160
acgtgggcac ccgcgatagt cgcagcatca tggacgtggc cgttttccgt ctgtcgaagc 8220
gtgaccgacg agctggcgag gtgatccgct acgagcttcc agacgggcac gtagaggttt 8280
ccgcagggcc ggccggcatg gccagtgtgt gggattacga cctggtactg atggcggttt 8340
cccatctaac cgaatccatg aaccgatacc gggaagggaa gggagacaag cccggccgcg 8400
tgttccgtcc acacgttgcg gacgtactca agttctgccg gcgagccgat ggcggaaagc 8460
agaaagacga cctggtagaa acctgcattc ggttaaacac cacgcacgtt gccatgcagc 8520
gtacgaagaa ggccaagaac ggccgcctgg tgacggtatc cgagggtgaa gccttgatta 8580
gccgctacaa gatcgtaaag agcgaaaccg ggcggccgga gtacatcgag atcgagctag 8640
ctgattggat gtaccgcgag atcacagaag gcaagaaccc ggacgtgctg acggttcacc 8700
ccgattactt tttgatcgat cccggcatcg gccgttttct ctaccgcctg gcacgccgcg 8760
ccgcaggcaa ggcagaagcc agatggttgt tcaagacgat ctacgaacgc agtggcagcg 8820
ccggagagtt caagaagttc tgtttcaccg tgcgcaagct gatcgggtca aatgacctgc 8880
cggagtacga tttgaaggag gaggcggggc aggctggccc gatcctagtc atgcgctacc 8940
gcaacctgat cgagggcgaa gcatccgccg gttcctaatg tacggagcag atgctagggc 9000
aaattgccct agcaggggaa aaaggtcgaa aaggtctctt tcctgtggat agcacgtaca 9060
ttgggaaccc aaagccgtac attgggaacc ggaacccgta cattgggaac ccaaagccgt 9120
acattgggaa ccggtcacac atgtaagtga ctgatataaa agagaaaaaa ggcgattttt 9180
ccgcctaaaa ctctttaaaa cttattaaaa ctcttaaaac ccgcctggcc tgtgcataac 9240
tgtctggcca gcgcacagcc gaagagctgc aaaaagcgcc tacccttcgg tcgctgcgct 9300
ccctacgccc cgccgcttcg cgtcggccta tcgcggccgc tggccgctca aaaatggctg 9360
gcctacggcc aggcaatcta ccagggcgcg gacaagccgc gccgtcgcca ctcgaccgcc 9420
ggcgctgagg tctgcctcgt gaagaaggtg ttgctgactc ataccaggcc tgaatcgccc 9480
catcatccag ccagaaagtg agggagccac ggttgatgag agctttgttg taggtggacc 9540
agttggtgat tttgaacttt tgctttgcca cggaacggtc tgcgttgtcg ggaagatgcg 9600
tgatctgatc cttcaactca gcaaaagttc gatttattca acaaagccgc cgtcccgtca 9660
agtcagcgta atgctctgcc agtgttacaa ccaattaacc aattctgatt agaaaaactc 9720
atcgagcatc aaatgaaact gcaatttatt catatcagga ttatcaatac catatttttg 9780
aaaaagccgt ttctgtaatg aaggagaaaa ctcaccgagg cagttccata ggatggcaag 9840
atcctggtat cggtctgcga ttccgactcg tccaacatca atacaaccta ttaatttccc 9900
ctcgtcaaaa ataaggttat caagtgagaa atcaccatga gtgacgactg aatccggtga 9960
gaatggcaaa agctctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta 10020
ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 10080
gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 10140
caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 10200
tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 10260
gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 10320
ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 10380
cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 10440
tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 10500
tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 10560
cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 10620
agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga 10680
agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 10740
gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 10800
aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 10860
ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatccttttg atccggaatt 10920
aattcctgtg gttggcatgc acatacaaat ggacgaacgg ataaaccttt tcacgccctt 10980
ttaaatatcc gattattcta ataaacgctc ttttctctta ggtttacccg ccaatatatc 11040
ctgtcaaaca ctgatagttt aaactgaagg cgggaaacga caatctgatc atgagcggag 11100
aattaaggga gtcacgttat gacccccgcc gatgacgcgg gacaagccgt tttacgtttg 11160
gaactgacag aaccgcaacg ctgcaggaat tggccgcagc ggccatttaa atcaattggg 11220
cgcgccgaat tcgagctcgg tacaagcttg catgcctgca gtgcagcgtg acccggtcgt 11280
gcccctctct agagataatg agcattgcat gtctaagtta taaaaaatta ccacatattt 11340
tttttgtcac acttgtttga agtgcagttt atctatcttt atacatatat ttaaacttta 11400
ctctacgaat aatataatct atagtactac aataatatca gtgttttaga gaatcatata 11460
aatgaacagt tagacatggt ctaaaggaca attgagtatt ttgacaacag gactctacag 11520
ttttatcttt ttagtgtgca tgtgttctcc tttttttttg caaatagctt cacctatata 11580
atacttcatc cattttatta gtacatccat ttagggttta gggttaatgg tttttataga 11640
ctaatttttt tagtacatct attttattct attttagcct ctaaattaag aaaactaaaa 11700
ctctatttta gtttttttat ttaataattt agatataaaa tagaataaaa taaagtgact 11760
aaaaattaaa caaataccct ttaagaaatt aaaaaaacta aggaaacatt tttcttgttt 11820
cgagtagata atgccagcct gttaaacgcc gtcgacgagt ctaacggaca ccaaccagcg 11880
aaccagcagc gtcgcgtcgg gccaagcgaa gcagacggca cggcatctct gtcgctgcct 11940
ctggacccct ctcgagagtt ccgctccacc gttggacttg ctccgctgtc ggcatccaga 12000
aattgcgtgg cggagcggca gacgtgagcc ggcacggcag gcggcctcct cctcctctca 12060
cggcacggca gctacggggg attcctttcc caccgctcct tcgctttccc ttcctcgccc 12120
gccgtaataa atagacaccc cctccacacc ctctttcccc aacctcgtgt tgttcggagc 12180
gcacacacac acaaccagat ctcccccaaa tccacccgtc ggcacctccg cttcaaggta 12240
cgccgctcgt cctccccccc cccccctctc taccttctct agatcggcgt tccggtccat 12300
ggttagggcc cggtagttct acttctgttc atgtttgtgt tagatccgtg tttgtgttag 12360
atccgtgctg ctagcgttcg tacacggatg cgacctgtac gtcagacacg ttctgattgc 12420
taacttgcca gtgtttctct ttggggaatc ctgggatggc tctagccgtt ccgcagacgg 12480
gatcgatttc atgatttttt ttgtttcgtt gcatagggtt tggtttgccc ttttccttta 12540
tttcaatata tgccgtgcac ttgtttgtcg ggtcatcttt tcatgctttt ttttgtcttg 12600
gttgtgatga tgtggtctgg ttgggcggtc gttctagatc ggagtagaat tctgtttcaa 12660
actacctggt ggatttatta attttggatc tgtatgtgtg tgccatacat attcatagtt 12720
acgaattgaa gatgatggat ggaaatatcg atctaggata ggtatacatg ttgatgcggg 12780
ttttactgat gcatatacag agatgctttt tgttcgcttg gttgtgatga tgtggtgtgg 12840
ttgggcggtc gttcattcgt tctagatcgg agtagaatac tgtttcaaac tacctggtgt 12900
atttattaat tttggaactg tatgtgtgtg tcatacatct tcatagttac gagtttaaga 12960
tggatggaaa tatcgatcta ggataggtat acatgttgat gtgggtttta ctgatgcata 13020
tacatgatgg catatgcagc atctattcat atgctctaac cttgagtacc tatctattat 13080
aataaacaag tatgttttat aattattttg atcttgatat acttggatga tggcatatgc 13140
agcagctata tgtggatttt tttagccctg ccttcatacg ctatttattt gcttggtact 13200
gtttcttttg tcgatgctca ccctgttgtt tggtgttact tctgcaggtc gactctagag 13260
gatccaaca 13269
<210> 12
<211> 16179
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: pNOV1436
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3582)
<223> synthetic nucleotide sequence encoding the toxin
portion of H04 plus a full-length Cry1Ab tail
portion
<220>
<221> misc_feature
<222> Complement((10390)..(11598))
<223> PhosphoMannose Isomerase (PMI) marker gene
<220>
<221> misc_feature
<222> Complement((12718)..(13608))
<223> Maize ubiquitin (Zm Ubi) promoter
<220>
<221> misc_feature
<222> (13613)..(16170)
<223> MTL promoter
<400> 12
atggacaaca accccaacat caacgagtgc atcccctaca actgcctgag caaccccgag 60
gtggaggtgc tgggcggcga gcgcatcgag accggctaca cccccatcga catcagcctg 120
agcctgaccc agttcctgct gagcgagttc gtgcccggcg ccggcttcgt gctgggcctg 180
gtggacatca tctggggcat cttcggcccc agccagtggg acgccttcct ggtgcagatc 240
gagcagttga taaaccaacg catagaggaa ttcgcccgca accaggccat cagccgcctg 300
gagggcctga gcaacctgta ccaaatctac gccgagagct tccgcgagtg ggaggccgac 360
cccaccaacc ccgccctgcg cgaggagatg cgcatccagt tcaacgacat gaacagcgcc 420
ctgaccaccg ccatccccct gttcgccgtg cagaactacc aggtgcccct gctgagcgtg 480
tacgtgcagg ccgccaacct gcacctgagc gtgctgcgcg acgtcagcgt gttcggccag 540
cgctggggct tcgacgccgc caccatcaac agccgctaca acgacctgac ccgcctgatc 600
ggcaactaca ccgaccacgc cgtgcgctgg tacaacaccg gcctggagcg cgtgtggggt 660
cccgacagcc gcgactggat caggtacaac cagttccgcc gcgagctgac cctgaccgtg 720
ctggacatcg tgagcctgtt ccccaactac gacagccgca cctaccccat ccgcaccgtg 780
agccagctga cccgcgagat ttacaccaac cccgtgctgg agaacttcga cggcagcttc 840
cgcggcagcg cccagggcat cgagggcagc atccgcagcc cccacctgat ggacatcctg 900
aacagcatca ccatctacac cgacgcccac cgcggcgagt actactggag cggccaccag 960
atcatggcca gccccgtcgg cttcagcggc cccgagttca ccttccccct gtacggcacc 1020
atgggcaacg ctgcacctca gcagcgcatc gtggcacagc tgggccaggg agtgtaccgc 1080
accctgagca gcaccctgta ccgtcgacct ttcaacatcg gcatcaacaa ccagcagctg 1140
agcgtgctgg acggcaccga gttcgcctac ggcaccagca gcaacctgcc cagcgccgtg 1200
taccgcaaga gcggcaccgt ggacagcctg gacgagatcc cccctcagaa caacaacgtg 1260
ccacctcgac agggcttcag ccaccgtctg agccacgtga gcatgttccg cagtggcttc 1320
agcaacagca gcgtgagcat catccgtgca cccatgttca gctggattca ccgcagcgcc 1380
accctgacca acaccatcga ccccgagcgc atcaaccaga tccccctggt gaagggcttc 1440
cgggtgtggg gcggcaccag cgtgatcacc ggccccggct tcaccggagg cgacatcctg 1500
cgcagaaaca ccttcggcga cttcgtgagc ctgcaggtga acatcaacag ccccatcacc 1560
cagcgttacc gcctgcgctt ccgctacgcc agcagccgcg acgcccgtgt gatcgtgctg 1620
actggcgccg ctagcaccgg tgtgggcggt caggtgagcg tgaacatgcc cctgcagaag 1680
actatggaga tcggcgagaa cctgactagt cgcaccttcc gctacaccga cttcagcaac 1740
cccttcagct tccgcgccaa ccccgacatc atcggcatca gcgagcagcc cctgttcggt 1800
gccggcagca tcagcagcgg cgagctgtac atcgacaaga tcgagatcat cctggccgac 1860
gccaccttcg aggccgagag cgacctggag cgcgcccaga aggccgtgaa cgccctgttc 1920
accagcagca accagatcgg cctgaagacc gacgtgaccg actaccacat cgaccaggtg 1980
agcaacctgg tggactgctt aagcgacgag ttctgcctgg acgagaagaa ggagctgagc 2040
gagaaggtga agcacgccaa gcgcctgagc gacgagcgca acctgctgca ggaccccaac 2100
ttccgcggca tcaaccgcca gctggaccgc ggctggcgag gcagcaccga tatcaccatc 2160
cagggcggcg acgacgtgtt caaggagaac tacgtgaccc tgcagggcac cttcgacgag 2220
tgctacccca cctacctgta ccagccgatc gacgagagca agctgaaggc ctacacccgc 2280
taccagctgc gcggctacat cgaggacagc caggacctgg aaatctacct gatccgctac 2340
aacgcgaagc acgagaccgt gaacgtgccc ggcaccggca gcctgtggcc cccgagcgcc 2400
cccagcccca tcggcaagtg cggggagccg aatcgatgcg ctccgcacct ggagtggaac 2460
ccggacctag actgcagctg cagggacggg gagaagtgcg cccaccacag ccaccacttc 2520
agcctggaca tcgacgtggg ctgcaccgac ctgaacgagg acctgggcgt gtgggtgatc 2580
ttcaagatca agacccagga cggccacgcc cgcctgggca atctagagtt cctggaggag 2640
aagcccctgg tgggcgaggc cctggcccgc gtgaagcgtg ctgagaagaa gtggcgcgac 2700
aagcgcgaga agctggagtg ggagaccaac atcgtgtaca aggaggccaa ggagagcgtg 2760
gacgccctgt tcgtgaacag ccagtacgac cgcctgcagg ccgacaccaa catcgccatg 2820
atccacgccg ccgacaagcg cgtgcacagc attcgcgagg cctacctgcc cgagctgagc 2880
gtgatccccg gtgtgaacgc cgccatcttc gaggaactcg agggccgcat cttcaccgcc 2940
ttcagcctgt acgacgcccg caacgtgatc aagaacggcg acttcaacaa cggcctgagc 3000
tgctggaacg tgaagggcca cgtggacgtg gaggagcaga acaaccaccg cagcgtgctg 3060
gtggtgcccg agtgggaggc cgaggtgagc caggaggtgc gcgtgtgccc cggccgcggc 3120
tacatcctgc gcgtgaccgc ctacaaggag ggctacggcg agggctgcgt gaccatccac 3180
gagatcgaga acaacaccga cgagctcaag ttcagcaact gcgtggagga ggaggtttac 3240
cccaacaaca ccgtgacctg caacgactac accgcgaccc aggaggagta cgaaggcacc 3300
tacacctctc gcaacagggg ttacgacggc gcctacgagt ccaacagctc cgtgccagct 3360
gactacgcca gcgcccacga ggagaaagcc tacaccgacg gtagacgcga caacccatgt 3420
gagagcaaca gaggctacgg cgactacacc cccctgcccg ctggatacgt gaccaaggag 3480
ctggagtact tccccgagac cgacaaggtg tggatcgaga ttggcgagac cgagggcacc 3540
ttcatcgtgg acagcgtgga gctgctgctg atggaggagt agtagatctg ttctgcacaa 3600
agtggagtag tcagtcatcg atcaggaacc agacaccaga cttttattca tacagtgaag 3660
tgaagtgaag tgcagtgcag tgagttgctg gtttttgtac cacttagtat gtatttgtat 3720
ttgtaaaata cttctatcaa taaaatttct aattcctaaa accaaaatcc agtgggtacc 3780
agcttgggct gagtggctcc ttcaacgttg cggttctgtc agttccaaac gtaaaacggc 3840
ttgtcccgcg tcatcggcgg gggtcataac gtgactccct taattctccg ctcatgatca 3900
gattgtcgtt tcccgccttc agtttaaact atcagtgttt gacaggatat attggcgggt 3960
aaacctaaga gaaaagagcg tttattagaa taacggatat ttaaaagggc gtgaaaaggt 4020
ttatccgttc gtccatttgt atgtgcatgc caaccacagg gttcccctcg ggagtgcttg 4080
gcattccgta cgataatgac ttctgttcaa ccacccaaac gtcggaaagc ctgacgacgg 4140
agcagcattc caaaaagatc ccttggctcg tctgggtcgg ctagaaggtc gagtgggctg 4200
ctgtggcttg atccctcaac gcggtcgcgg acgtagcgca gcgccgaaaa atcctcgatc 4260
gcaaatccga cgctgtcgaa aagcgtgatc tgcttgtcgc tctttcggcc gacgtcctgg 4320
ccagtcatca cgcgccaaag ttccgtcaca ggatgatctg gcgcgagttg ctggatctcg 4380
ccttcaatcc gggtctgtgg cgggaactcc acgaaaatat ccgaacgcag caagatcgtc 4440
gaccaattct tgaagacgaa agggcctcgt gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat 4500
gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc 4560
tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg 4620
ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc 4680
ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt 4740
gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct 4800
caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac 4860
ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtgtt gacgccgggc aagagcaact 4920
cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa 4980
gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa ccatgagtga 5040
taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt 5100
tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga 5160
agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgca gggggggggg ggggggggac 5220
atgaggttgc cccgtattca gtgtcgctga tttgtattgt ctgaagttgt ttttacgtta 5280
agttgatgca gatcaattaa tacgatacct gcgtcataat tgattatttg acgtggtttg 5340
atggcctcca cgcacgttgt gatatgtaga tgataatcat tatcacttta cgggtccttt 5400
ccggtgatcc gacaggttac ggggcggcga cctcgcgggt tttcgctatt tatgaaaatt 5460
ttccggttta aggcgtttcc gttcttcttc gtcataactt aatgttttta tttaaaatac 5520
cctctgaaaa gaaaggaaac gacaggtgct gaaagcgagg ctttttggcc tctgtcgttt 5580
cctttctctg tttttgtccg tggaatgaac aatggaagtc cccccccccc cccccccctg 5640
cagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc 5700
ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg 5760
cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg 5820
gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga 5880
cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac 5940
tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa 6000
aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca 6060
aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag 6120
gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac 6180
cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa 6240
ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc 6300
accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag 6360
tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac 6420
cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc 6480
gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc 6540
ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca 6600
cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 6660
tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 6720
ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct 6780
ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata 6840
ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc 6900
gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca 6960
ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gtatacactc cgctatcgct 7020
acgtgactgg gtcatggctg cgccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg 7080
ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat 7140
gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgagg cagcagatcc cccgatcaag 7200
tagatacact acatatatct acaatagaca tcgagccgga aggtgatgtt tactttcctg 7260
aaatccccag caattttagg ccagttttta cccaagactt cgcctctaac ataaattata 7320
gttaccaaat ctggcaaaag ggttaacaag tggcagcaac ggattcgcaa acctgtcacg 7380
ccttttgtgc caaaagccgc gccaggtttg cgatccgctg tgccaggcgt taggcgtcat 7440
atgaagattt cggtgatccc tgagcaggtg gcggaaacat tggatgctga gaaccatttc 7500
attgttcgtg aagtgttcga tgtgcaccta tccgaccaag gctttgaact atctaccaga 7560
agtgtgagcc cctaccggaa ggattacatc tcggatgatg actctgatga agactctgct 7620
tgctatggcg cattcatcga ccaagagctt gtcgggaaga ttgaactcaa ctcaacatgg 7680
aacgatctag cctctatcga acacattgtt gtgtcgcaca cgcaccgagg caaaggagtc 7740
gcgcacagtc tcatcgaatt tgcgaaaaag tgggcactaa gcagacagct ccttggcata 7800
cgattagaga cacaaacgaa caatgtacct gcctgcaatt tgtacgcaaa atgtggcttt 7860
actctcggcg gcattgacct gttcacgtat aaaactagac ctcaagtctc gaacgaaaca 7920
gcgatgtact ggtactggtt ctcgggagca caggatgacg cctaacaatt cattcaagcc 7980
gacaccgctt cgcggcgcgg cttaattcag gagttaaaca tcatgaggga agcggtgatc 8040
gccgaagtat cgactcaact atcagaggta gttggcgtca tcgagcgcca tctcgaaccg 8100
acgttgctgg ccgtacattt gtacggctcc gcagtggatg gcggcctgaa gccacacagt 8160
gatattgatt tgctggttac ggtgaccgta aggcttgatg aaacaacgcg gcgagctttg 8220
atcaacgacc ttttggaaac ttcggcttcc cctggagaga gcgagattct ccgcgctgta 8280
gaagtcacca ttgttgtgca cgacgacatc attccgtggc gttatccagc taagcgcgaa 8340
ctgcaatttg gagaatggca gcgcaatgac attcttgcag gtatcttcga gccagccacg 8400
atcgacattg atctggctat cttgctgaca aaagcaagag aacatagcgt tgccttggta 8460
ggtccagcgg cggaggaact ctttgatccg gttcctgaac aggatctatt tgaggcgcta 8520
aatgaaacct taacgctatg gaactcgccg cccgactggg ctggcgatga gcgaaatgta 8580
gtgcttacgt tgtcccgcat ttggtacagc gcagtaaccg gcaaaatcgc gccgaaggat 8640
gtcgctgccg actgggcaat ggagcgcctg ccggcccagt atcagcccgt catacttgaa 8700
gctaggcagg cttatcttgg acaagaagat cgcttggcct cgcgcgcaga tcagttggaa 8760
gaatttgttc actacgtgaa aggcgagatc accaaggtag tcggcaaata atgtctaaca 8820
attcgttcaa gccgacgccg cttcgcggcg cggcttaact caagcgttag agagctgggg 8880
aagactatgc gcgatctgtt gaaggtggtt ctaagcctcg tacttgcgat ggcatcgggg 8940
caggcacttg ctgacctgcc aattgtttta gtggatgaag ctcgtcttcc ctatgactac 9000
tccccatcca actacgacat ttctccaagc aactacgaca actccataag caattacgac 9060
aatagtccat caaattacga caactctgag agcaactacg ataatagttc atccaattac 9120
gacaatagtc gcaacggaaa tcgtaggctt atatatagcg caaatgggtc tcgcactttc 9180
gccggctact acgtcattgc caacaatggg acaacgaact tcttttccac atctggcaaa 9240
aggatgttct acaccccaaa aggggggcgc ggcgtctatg gcggcaaaga tgggagcttc 9300
tgcggggcat tggtcgtcat aaatggccaa ttttcgcttg ccctgacaga taacggcctg 9360
aagatcatgt atctaagcaa ctagcctgct ctctaataaa atgttaggcc tcaacatcta 9420
gtcgcaagct gaggggaacc actagtgtca tacgaacctc caagagacgg ttacacaaac 9480
gggtacattg ttgatgtcat gtatgacaat cgcccaagta agtatccagc tgtgttcaga 9540
acgtacgtcc gaattaattc atcggggtac ggtcgacgat cgtcaacgtt cacttctaaa 9600
gaaatagcgc cactcagctt cctcagcggc tttatccagc gatttcctat tatgtcggca 9660
tagttctcaa gatcgacagc ctgtcacggt taagcgagaa atgaataaga aggctgataa 9720
ttcggatctc tgcgagggag atgatatttg atcacaggca gcaacgctct gtcatcgtta 9780
caatcaacat gctaccctcc gcgagatcat ccgtgtttca aacccggcag cttagttgcc 9840
gttcttccga atagcatcgg taacatgagc aaagtctgcc gccttacaac ggctctcccg 9900
ctgacgccgt cccggactga tgggctgcct gtatcgagtg gtgattttgt gccgagctgc 9960
cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt gtggtgtaaa caaattgacg 10020
cttagacaac ttaataacac attgcggacg tttttaatgt actgaattgt ctagacccgg 10080
ggatctcatg tttgacagct tatcatcgga tctagtaaca tagatgacac cgcgcgcgat 10140
aatttatcct agtttgcgcg ctatattttg ttttctatcg cgtattaaat gtataattgc 10200
gggactctaa tcataaaaac ccatctcata aataacgtca tgcattacat gttaattatt 10260
acatgcttaa cgtaattcaa cagaaattag atgataatca tcgcaagacc ggcaacagga 10320
ttcaatctta agaaacttta ttgccaaatg tttgaacgat ctctgcaggt cgacggatcg 10380
agctcccagc ttagcaagag atgttaattt tttcagtaag ctcttacagc ttgttgtaaa 10440
cacgcgctaa acggccgtgg cctttgacag tcaccggtga ttcgttggcg gcaataaacg 10500
ctgattcacc cggtttaagc tgtaactgct gagaaccttt ccacaacgtt gcatcgcctt 10560
cgacgcagaa caaaatggcg gcactctgct ggctaatggt ggtttcttta tcactaaggt 10620
catgcagcga gaaggcaaaa tcatccactg gaatcgggaa gtccagttct gcaccttgtt 10680
tcaccggctg ggtcaacaac tggttagccg gtttggcttc gaatttcaca ttggcaacca 10740
gttccggaat atcaatgtat ttaggcgtca gacccgcacg cagcacgtta tcggagtttg 10800
ccatcacttc cagcgccacg ccttgcaggt aagcgtgcgg tgtttcagcg aacaggaaca 10860
tcgcttcgcc agggttcaat ttcaccacat tcagcaatag cggggagaac agaccgctgt 10920
cttccgggta aaattcagaa attaaacgaa tcgtttgcca cggttcaccc tgctggctat 10980
cgagggccga ttttaaaatc gccagcgcgc gggatttttc ttcaccctgc atattcaaca 11040
ggctggcgaa cagttcgctt aaacgttcgg catcaggctg ttgtaaaaag tgagcaatcg 11100
ccggatgtgc acctgcgacc ggctggagta gggagacaat ctcggaaaat tcacgaaacg 11160
cgttcatcgc aaggaaaggc gtcagcgcaa aaaccagctc cggcttgtgg ttaggatctt 11220
tatagttacg ctcggcggca tccatcggga tacctgcggc attttctttg gcaaaaccga 11280
tttcagaatt gtgtttgttt ggatgaacct gaatggagag tggctgtgct gcgcataata 11340
ctttgaacag gaaaggcagt tcgccaaagc gtttggcaac ggcctctccg agcagagtcg 11400
atttatcact ctcaatcaca tcacgcagtg aaacgatatc tccggcggca ttctgcactc 11460
gtgaactgct tttcggatgt gcgcccatcc acagctcggc catcggctgg ctggacggat 11520
tttccatacc ataaagttca gtcaacgcgt tttgctgccc caggcatagt tttgcactga 11580
gttaatgagt ttttgcatga tcggggatcc ctgcagaagt aacaccaaac aacagggtga 11640
gcatcgacaa aagaaacagt accaagcaaa taaatagcgt atgaaggcag ggctaaaaaa 11700
atccacatat agctgctgca tatgccatca tccaagtata tcaagatcaa aataattata 11760
aaacatactt gtttattata atagataggt actcaaggtt agagcatatg aatagatgct 11820
gcatatgcca tcatgtatat gcatcagtaa aacccacatc aacatgtata cctatcctag 11880
atcgatattt ccatccatct taaactcgta actatgaaga tgtatgacac acacatacag 11940
ttccaaaatt aataaataca ccaggtagtt tgaaacggcg tctactccga tctagaacga 12000
atgaacgacc gcccaaccac accacatcat cacaaccaag cgaacaaaaa gcatctctgt 12060
atatgcatca gtaaaacccg catcaacatg tatacctatc ctagatcgat atttccatcc 12120
atcatcttca attcgtaact atgaatatgt atggcacaca catacagatc caaaattaat 12180
aaatccacca ggtagtttga aacagaattc tactccgatc tagaacgacc gcccaaccag 12240
accacatcat cacaaccaag acaaaaaaaa gcatgaaaag atgacccgac aaacaagtgc 12300
acggcatata ttgaaataaa ggaaaagggc aaaccaaacc ctatgcaacg aaacaaaaaa 12360
aatcatgaaa tcgatcccgt ctgcggaacg gctagagcca tcccaggatt ccccaaagag 12420
aaacactggc aagttagcaa tcagaacgtg tctgacgtac aggtcgcatc cgtgtacgaa 12480
cgctagcagc acggatctaa cacaaacacg gatctaacac aaacatgaac agaagtagaa 12540
ctaccgggcc ctaaccatgg accggaacgc cgatctagag aaggtagaga gggggggggg 12600
gggaggacga gcggcgtacc ttgaagcgga ggtgccgacg ggtggatttg ggggagatct 12660
ggttgtgtgt gtgtgcgctc cgaacaacac gaggttgggg aaagagggtg tggagggggt 12720
gtctatttat tacggcgggc gaggaaggga aagcgaagga gcggtgggaa aggaatcccc 12780
cgtagctgcc gtgccgtgag aggaggagga ggccgcctgc cgtgccggct cacgtctgcc 12840
gctccgccac gcaatttctg gatgccgaca gcggagcaag tccaacggtg gagcggaact 12900
ctcgagaggg gtccagaggc agcgacagag atgccgtgcc gtctgcttcg cttggcccga 12960
cgcgacgctg ctggttcgct ggttggtgtc cgttagactc gtcgacggcg tttaacaggc 13020
tggcattatc tactcgaaac aagaaaaatg tttccttagt ttttttaatt tcttaaaggg 13080
tatttgttta atttttagtc actttatttt attctatttt atatctaaat tattaaataa 13140
aaaaactaaa atagagtttt agttttctta atttagaggc taaaatagaa taaaatagat 13200
gtactaaaaa aattagtcta taaaaaccat taaccctaaa ccctaaatgg atgtactaat 13260
aaaatggatg aagtattata taggtgaagc tatttgcaaa aaaaaaggag aacacatgca 13320
cactaaaaag ataaaactgt agagtcctgt tgtcaaaata ctcaattgtc ctttagacca 13380
tgtctaactg ttcatttata tgattctcta aaacactgat attattgtag tactatagat 13440
tatattattc gtagagtaaa gtttaaatat atgtataaag atagataaac tgcacttcaa 13500
acaagtgtga caaaaaaaat atgtggtaat tttttataac ttagacatgc aatgctcatt 13560
atctctagag aggggcacga ccgggtcacg ctgcactgca ggcatgcaag cttgcacatg 13620
acaacaattg taagaggatg gagaccacaa cgatccaaca atacttctgc gacgggctgt 13680
gaagtataga gaagttaaac gcccaaaagc cattgtgttt ggaattttta gttattctat 13740
ttttcatgat gtatcttcct ctaacatgcc ttaatttgca aatttggtat aactactgat 13800
tgaaaatata tgtatgtaaa aaaatactaa gcatatttgt gaagctaaac atgatgttat 13860
ttaagaaaat atgttgttaa cagaataaga ttaatatcga aatggaaaca tctgtaaatt 13920
agaatcatct tacaagctaa gagatgttca cgctttgaga aacttcttca gatcatgacc 13980
gtagaagtag ctctccaaga ctcaacgaag gctgctgcaa ttccacaaat gcatgacatg 14040
catccttgta accgtcgtcg ccgctataaa cacggataac tcaattccct gctccatcaa 14100
tttagaaatg agcaagcaag cacccgatcg ctcaccccat atgcaccaat ctgactccca 14160
agtctctgtt tcgcattagt accgccagca ctccacctat agctaccaat tgagaccttt 14220
ccagcctaag cagatcgatt gatcgttaga gtcaaagagt tggtggtacg ggtactttaa 14280
ctaccatgga atgatggggc gtgatgtaga gcggaaagcg cctccctacg cggaacaaca 14340
ccctcgccat gccgctcgac tacagcctcc tcctcgtcgg ccgcccacaa cgagggagcc 14400
cgtggtcgca gccaccgacc agcatgtctc tgtgtcctcg tccgacctcg acatgtcatg 14460
gcaaacagtc ggacgccagc accagactga cgacatgagt ctctgaagag cccgccacct 14520
agaaagatcc gagccctgct gctggtagtg gtaaccattt tcgtcgcgct gacgcggaga 14580
gcgagaggcc agaaatttat agcgactgac gctgtggcag gcacgctatc ggaggttacg 14640
acgtggcggg tcactcgacg cggagttcac aggtcctatc cttgcatcgc tcgggccgga 14700
gtttacggga cttatcctta cgacgtgctc taaggttgcg ataacgggcg gaggaaggcg 14760
tgtggcgtgc ggagacggtt tatacacgta gtgtgcggga gtgtgtttcg tagacgcggg 14820
aaagcacgac gacttacgaa ggttagtgga ggaggaggac acactaaaat caggacgcaa 14880
gaaactcttc tattatagta gtagagaaga gattatagga gtgtgggttg attctaaaga 14940
aaatcgacgc aggacaaccg tcaaaacggg tgctttaata tagtagatat atatatatag 15000
agagagagag aaagtacaaa ggatgcattt gtgtctgcat atgatcggag tattactaac 15060
ggccgtcgta agaaggtcca tcatgcgtgg agcgagccca tttggttggt tgtcaggccg 15120
cagttaaggc ctccatatat gattgtcgtc gggcccataa cagcatctcc tccaccagtt 15180
tattgtaaga ataaattaag tagagatatt tgtcgtcggg cagaagaaac ttggacaaga 15240
agaagaagca agctaggcca atttcttgcc ggcaagagga agatagtggc ctctagttta 15300
tatatcggcg tgatgatgat gctcctagct agaaatgaga gaagaaaaac ggacgcgtgt 15360
ttggtgtgtg tcaatggcgt ccatccttcc atcagatcag aacgatgaaa aagtcaagca 15420
cggcatgcat agtatatgta tagcttgttt tagtgtggct ttgctgagac gaatgaaagc 15480
aacggcgggc atatttttca gtggctgtag ctttcaggct gaaagagacg tggcatgcaa 15540
taattcaggg aattcgtcag ccaattgagg tagctagtca acttgtacat tggtgcgagc 15600
aattttccgc actcaggagg gctagtttga gagtccaaaa actataggag attaaagagg 15660
ctaaaatcct ctccttattt aattttaaat aagtagtgta tttgtatttt aactcctcca 15720
acccttccga ttttatggct ctcaaactag cattcagtct aatgcatgca tgcttggcta 15780
gaggtcgtat ggggttgtta atagcatagc tagctacaag ttaaccgggt cttttatatt 15840
taataaggac aggcaaagta ttacttacaa ataaagaata aagctaggac gaactcgtgg 15900
attattacta aatcgaaatg gacgtaatat tccaggcaag aataattgtt cgatcaggag 15960
acaagtgggg cattggaccg gttcttgcaa gcaagagcct atggcgtggt gacacggcgc 16020
gttgcccata catcatgcct ccatcgatga tccatcctca cttgctataa aaagaggtgt 16080
ccatggtgct caagctcagc caagcaaata agacgacttg tttcattgat tcttcaagag 16140
atcgagcttc ttttgcacca caaggtcgag gatccaaca 16179
<210> 13
<211> 15643
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: pNOV1441
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(1414)
<223> Maize ubiquitin (Mz Ubi) promoter
<220>
<221> misc_feature
<222> (2037)..(5618)
<223> synthetic nucleotide sequence encoding the toxin
portion of H04 plus a full-length Cry1Ab tail
portion
<220>
<221> misc_feature
<222> (5821)..(6711)
<223> Mz Ubi promoter
<220>
<221> misc_feature
<222> (7831)..(9039)
<223> PMI
<400> 13
aagctggtac aagcttgcat gcctgcagtg cagcgtgacc cggtcgtgcc cctctctaga 60
gataatgagc attgcatgtc taagttataa aaaattacca catatttttt ttgtcacact 120
tgtttgaagt gcagtttatc tatctttata catatattta aactttactc tacgaataat 180
ataatctata gtactacaat aatatcagtg ttttagagaa tcatataaat gaacagttag 240
acatggtcta aaggacaatt gagtattttg acaacaggac tctacagttt tatcttttta 300
gtgtgcatgt gttctccttt ttttttgcaa atagcttcac ctatataata cttcatccat 360
tttattagta catccattta gggtttaggg ttaatggttt ttatagacta atttttttag 420
tacatctatt ttattctatt ttagcctcta aattaagaaa actaaaactc tattttagtt 480
tttttattta ataatttaga tataaaatag aataaaataa agtgactaaa aattaaacaa 540
atacccttta agaaattaaa aaaactaagg aaacattttt cttgtttcga gtagataatg 600
ccagcctgtt aaacgccgtc gacgagtcta acggacacca accagcgaac cagcagcgtc 660
gcgtcgggcc aagcgaagca gacggcacgg catctctgtc gctgcctctg gacccctctc 720
gagagttccg ctccaccgtt ggacttgctc cgctgtcggc atccagaaat tgcgtggcgg 780
agcggcagac gtgagccggc acggcaggcg gcctcctcct cctctcacgg cacggcagct 840
acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc gtaataaata 900
gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca cacacacaca 960
accagatctc ccccaaatcc acccgtcggc acctccgctt caaggtacgc cgctcgtcct 1020
cccccccccc ccctctctac cttctctaga tcggcgttcc ggtccatggt tagggcccgg 1080
tagttctact tctgttcatg tttgtgttag atccgtgttt gtgttagatc cgtgctgcta 1140
gcgttcgtac acggatgcga cctgtacgtc agacacgttc tgattgctaa cttgccagtg 1200
tttctctttg gggaatcctg ggatggctct agccgttccg cagacgggat cgatttcatg 1260
attttttttg tttcgttgca tagggtttgg tttgcccttt tcctttattt caatatatgc 1320
cgtgcacttg tttgtcgggt catcttttca tgcttttttt tgtcttggtt gtgatgatgt 1380
ggtctggttg ggcggtcgtt ctagatcgga gtagaattct gtttcaaact acctggtgga 1440
tttattaatt ttggatctgt atgtgtgtgc catacatatt catagttacg aattgaagat 1500
gatggatgga aatatcgatc taggataggt atacatgttg atgcgggttt tactgatgca 1560
tatacagaga tgctttttgt tcgcttggtt gtgatgatgt ggtgtggttg ggcggtcgtt 1620
cattcgttct agatcggagt agaatactgt ttcaaactac ctggtgtatt tattaatttt 1680
ggaactgtat gtgtgtgtca tacatcttca tagttacgag tttaagatgg atggaaatat 1740
cgatctagga taggtataca tgttgatgtg ggttttactg atgcatatac atgatggcat 1800
atgcagcatc tattcatatg ctctaacctt gagtacctat ctattataat aaacaagtat 1860
gttttataat tattttgatc ttgatatact tggatgatgg catatgcagc agctatatgt 1920
ggattttttt agccctgcct tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt tcttttgtcg 1980
atgctcaccc tgttgtttgg tgttacttct gcaggtcgac tctagaggat ccaacaatgg 2040
acaacaaccc caacatcaac gagtgcatcc cctacaactg cctgagcaac cccgaggtgg 2100
aggtgctggg cggcgagcgc atcgagaccg gctacacccc catcgacatc agcctgagcc 2160
tgacccagtt cctgctgagc gagttcgtgc ccggcgccgg cttcgtgctg ggcctggtgg 2220
acatcatctg gggcatcttc ggccccagcc agtgggacgc cttcctggtg cagatcgagc 2280
agttgataaa ccaacgcata gaggaattcg cccgcaacca ggccatcagc cgcctggagg 2340
gcctgagcaa cctgtaccaa atctacgccg agagcttccg cgagtgggag gccgacccca 2400
ccaaccccgc cctgcgcgag gagatgcgca tccagttcaa cgacatgaac agcgccctga 2460
ccaccgccat ccccctgttc gccgtgcaga actaccaggt gcccctgctg agcgtgtacg 2520
tgcaggccgc caacctgcac ctgagcgtgc tgcgcgacgt cagcgtgttc ggccagcgct 2580
ggggcttcga cgccgccacc atcaacagcc gctacaacga cctgacccgc ctgatcggca 2640
actacaccga ccacgccgtg cgctggtaca acaccggcct ggagcgcgtg tggggtcccg 2700
acagccgcga ctggatcagg tacaaccagt tccgccgcga gctgaccctg accgtgctgg 2760
acatcgtgag cctgttcccc aactacgaca gccgcaccta ccccatccgc accgtgagcc 2820
agctgacccg cgagatttac accaaccccg tgctggagaa cttcgacggc agcttccgcg 2880
gcagcgccca gggcatcgag ggcagcatcc gcagccccca cctgatggac atcctgaaca 2940
gcatcaccat ctacaccgac gcccaccgcg gcgagtacta ctggagcggc caccagatca 3000
tggccagccc cgtcggcttc agcggccccg agttcacctt ccccctgtac ggcaccatgg 3060
gcaacgctgc acctcagcag cgcatcgtgg cacagctggg ccagggagtg taccgcaccc 3120
tgagcagcac cctgtaccgt cgacctttca acatcggcat caacaaccag cagctgagcg 3180
tgctggacgg caccgagttc gcctacggca ccagcagcaa cctgcccagc gccgtgtacc 3240
gcaagagcgg caccgtggac agcctggacg agatcccccc tcagaacaac aacgtgccac 3300
ctcgacaggg cttcagccac cgtctgagcc acgtgagcat gttccgcagt ggcttcagca 3360
acagcagcgt gagcatcatc cgtgcaccca tgttcagctg gattcaccgc agcgccaccc 3420
tgaccaacac catcgacccc gagcgcatca accagatccc cctggtgaag ggcttccggg 3480
tgtggggcgg caccagcgtg atcaccggcc ccggcttcac cggaggcgac atcctgcgca 3540
gaaacacctt cggcgacttc gtgagcctgc aggtgaacat caacagcccc atcacccagc 3600
gttaccgcct gcgcttccgc tacgccagca gccgcgacgc ccgtgtgatc gtgctgactg 3660
gcgccgctag caccggtgtg ggcggtcagg tgagcgtgaa catgcccctg cagaagacta 3720
tggagatcgg cgagaacctg actagtcgca ccttccgcta caccgacttc agcaacccct 3780
tcagcttccg cgccaacccc gacatcatcg gcatcagcga gcagcccctg ttcggtgccg 3840
gcagcatcag cagcggcgag ctgtacatcg acaagatcga gatcatcctg gccgacgcca 3900
ccttcgaggc cgagagcgac ctggagcgcg cccagaaggc cgtgaacgcc ctgttcacca 3960
gcagcaacca gatcggcctg aagaccgacg tgaccgacta ccacatcgac caggtgagca 4020
acctggtgga ctgcttaagc gacgagttct gcctggacga gaagaaggag ctgagcgaga 4080
aggtgaagca cgccaagcgc ctgagcgacg agcgcaacct gctgcaggac cccaacttcc 4140
gcggcatcaa ccgccagctg gaccgcggct ggcgaggcag caccgatatc accatccagg 4200
gcggcgacga cgtgttcaag gagaactacg tgaccctgca gggcaccttc gacgagtgct 4260
accccaccta cctgtaccag ccgatcgacg agagcaagct gaaggcctac acccgctacc 4320
agctgcgcgg ctacatcgag gacagccagg acctggaaat ctacctgatc cgctacaacg 4380
cgaagcacga gaccgtgaac gtgcccggca ccggcagcct gtggcccccg agcgccccca 4440
gccccatcgg caagtgcggg gagccgaatc gatgcgctcc gcacctggag tggaacccgg 4500
acctagactg cagctgcagg gacggggaga agtgcgccca ccacagccac cacttcagcc 4560
tggacatcga cgtgggctgc accgacctga acgaggacct gggcgtgtgg gtgatcttca 4620
agatcaagac ccaggacggc cacgcccgcc tgggcaatct agagttcctg gaggagaagc 4680
ccctggtggg cgaggccctg gcccgcgtga agcgtgctga gaagaagtgg cgcgacaagc 4740
gcgagaagct ggagtgggag accaacatcg tgtacaagga ggccaaggag agcgtggacg 4800
ccctgttcgt gaacagccag tacgaccgcc tgcaggccga caccaacatc gccatgatcc 4860
acgccgccga caagcgcgtg cacagcattc gcgaggccta cctgcccgag ctgagcgtga 4920
tccccggtgt gaacgccgcc atcttcgagg aactcgaggg ccgcatcttc accgccttca 4980
gcctgtacga cgcccgcaac gtgatcaaga acggcgactt caacaacggc ctgagctgct 5040
ggaacgtgaa gggccacgtg gacgtggagg agcagaacaa ccaccgcagc gtgctggtgg 5100
tgcccgagtg ggaggccgag gtgagccagg aggtgcgcgt gtgccccggc cgcggctaca 5160
tcctgcgcgt gaccgcctac aaggagggct acggcgaggg ctgcgtgacc atccacgaga 5220
tcgagaacaa caccgacgag ctcaagttca gcaactgcgt ggaggaggag gtttacccca 5280
acaacaccgt gacctgcaac gactacaccg cgacccagga ggagtacgaa ggcacctaca 5340
cctctcgcaa caggggttac gacggcgcct acgagtccaa cagctccgtg ccagctgact 5400
acgccagcgc ccacgaggag aaagcctaca ccgacggtag acgcgacaac ccatgtgaga 5460
gcaacagagg ctacggcgac tacacccccc tgcccgctgg atacgtgacc aaggagctgg 5520
agtacttccc cgagaccgac aaggtgtgga tcgagattgg cgagaccgag ggcaccttca 5580
tcgtggacag cgtggagctg ctgctgatgg aggagtagta gatctgttct gcacaaagtg 5640
gagtagtcag tcatcgatca ggaaccagac accagacttt tattcataca gtgaagtgaa 5700
gtgaagtgca gtgcagtgag ttgctggttt ttgtaccact tagtatgtat ttgtatttgt 5760
aaaatacttc tatcaataaa atttctaatt cctaaaacca aaatccagtg ggtaccagct 5820
tgcatgcctg cagtgcagcg tgacccggtc gtgcccctct ctagagataa tgagcattgc 5880
atgtctaagt tataaaaaat taccacatat tttttttgtc acacttgttt gaagtgcagt 5940
ttatctatct ttatacatat atttaaactt tactctacga ataatataat ctatagtact 6000
acaataatat cagtgtttta gagaatcata taaatgaaca gttagacatg gtctaaagga 6060
caattgagta ttttgacaac aggactctac agttttatct ttttagtgtg catgtgttct 6120
cctttttttt tgcaaatagc ttcacctata taatacttca tccattttat tagtacatcc 6180
atttagggtt tagggttaat ggtttttata gactaatttt tttagtacat ctattttatt 6240
ctattttagc ctctaaatta agaaaactaa aactctattt tagttttttt atttaataat 6300
ttagatataa aatagaataa aataaagtga ctaaaaatta aacaaatacc ctttaagaaa 6360
ttaaaaaaac taaggaaaca tttttcttgt ttcgagtaga taatgccagc ctgttaaacg 6420
ccgtcgacga gtctaacgga caccaaccag cgaaccagca gcgtcgcgtc gggccaagcg 6480
aagcagacgg cacggcatct ctgtcgctgc ctctggaccc ctctcgagag ttccgctcca 6540
ccgttggact tgctccgctg tcggcatcca gaaattgcgt ggcggagcgg cagacgtgag 6600
ccggcacggc aggcggcctc ctcctcctct cacggcacgg cagctacggg ggattccttt 6660
cccaccgctc cttcgctttc ccttcctcgc ccgccgtaat aaatagacac cccctccaca 6720
ccctctttcc ccaacctcgt gttgttcgga gcgcacacac acacaaccag atctccccca 6780
aatccacccg tcggcacctc cgcttcaagg tacgccgctc gtcctccccc cccccccctc 6840
tctaccttct ctagatcggc gttccggtcc atggttaggg cccggtagtt ctacttctgt 6900
tcatgtttgt gttagatccg tgtttgtgtt agatccgtgc tgctagcgtt cgtacacgga 6960
tgcgacctgt acgtcagaca cgttctgatt gctaacttgc cagtgtttct ctttggggaa 7020
tcctgggatg gctctagccg ttccgcagac gggatcgatt tcatgatttt ttttgtttcg 7080
ttgcataggg tttggtttgc ccttttcctt tatttcaata tatgccgtgc acttgtttgt 7140
cgggtcatct tttcatgctt ttttttgtct tggttgtgat gatgtggtct ggttgggcgg 7200
tcgttctaga tcggagtaga attctgtttc aaactacctg gtggatttat taattttgga 7260
tctgtatgtg tgtgccatac atattcatag ttacgaattg aagatgatgg atggaaatat 7320
cgatctagga taggtataca tgttgatgcg ggttttactg atgcatatac agagatgctt 7380
tttgttcgct tggttgtgat gatgtggtgt ggttgggcgg tcgttcattc gttctagatc 7440
ggagtagacg ccgtttcaaa ctacctggtg tatttattaa ttttggaact gtatgtgtgt 7500
gtcatacatc ttcatagtta cgagtttaag atggatggaa atatcgatct aggataggta 7560
tacatgttga tgtgggtttt actgatgcat atacatgatg gcatatgcag catctattca 7620
tatgctctaa ccttgagtac ctatctatta taataaacaa gtatgtttta taattatttt 7680
gatcttgata tacttggatg atggcatatg cagcagctat atgtggattt ttttagccct 7740
gccttcatac gctatttatt tgcttggtac tgtttctttt gtcgatgctc accctgttgt 7800
ttggtgttac ttctgcaggg atccccgatc atgcaaaaac tcattaactc agtgcaaaac 7860
tatgcctggg gcagcaaaac gcgttgactg aactttatgg tatggaaaat ccgtccagcc 7920
agccgatggc cgagctgtgg atgggcgcac atccgaaaag cagttcacga gtgcagaatg 7980
ccgccggaga tatcgtttca ctgcgtgatg tgattgagag tgataaatcg actctgctcg 8040
gagaggccgt tgccaaacgc tttggcgaac tgcctttcct gttcaaagta ttatgcgcag 8100
cacagccact ctccattcag gttcatccaa acaaacacaa ttctgaaatc ggttttgcca 8160
aagaaaatgc cgcaggtatc ccgatggatg ccgccgagcg taactataaa gatcctaacc 8220
acaagccgga gctggttttt gcgctgacgc ctttccttgc gatgaacgcg tttcgtgaat 8280
tttccgagat tgtctcccta ctccagccgg tcgcaggtgc acatccggcg attgctcact 8340
ttttacaaca gcctgatgcc gaacgtttaa gcgaactgtt cgccagcctg ttgaatatgc 8400
agggtgaaga aaaatcccgc gcgctggcga ttttaaaatc ggccctcgat agccagcagg 8460
gtgaaccgtg gcaaacgatt cgtttaattt ctgaatttta cccggaagac agcggtctgt 8520
tctccccgct attgctgaat gtggtgaaat tgaaccctgg cgaagcgatg ttcctgttcg 8580
ctgaaacacc gcacgcttac ctgcaaggcg tggcgctgga agtgatggca aactccgata 8640
acgtgctgcg tgcgggtctg acgcctaaat acattgatat tccggaactg gttgccaatg 8700
tgaaattcga agccaaaccg gctaaccagt tgttgaccca gccggtgaaa caaggtgcag 8760
aactggactt cccgattcca gtggatgatt ttgccttctc gctgcatgac cttagtgata 8820
aagaaaccac cattagccag cagagtgccg ccattttgtt ctgcgtcgaa ggcgatgcaa 8880
cgttgtggaa aggttctcag cagttacagc ttaaaccggg tgaatcagcg tttattgccg 8940
ccaacgaatc accggtgact gtcaaaggcc acggccgttt agcgcgtgtt tacaacaagc 9000
tgtaagagct tactgaaaaa attaacatct cttgctaagc tgggagctcg atccgtcgac 9060
ctgcagagat cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta agattgaatc ctgttgccgg 9120
tcttgcgatg attatcatct aatttctgtt gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat 9180
gtaatgcatg acgttattta tgagatgggt ttttatgatt agagtcccgc aattatacat 9240
ttaatacgcg atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag gataaattat cgcgcgcggt 9300
gtcatctatg ttactagatc cgatgataag ctgtcaaaca tgagatcccc gggtctagac 9360
aattcagtac attaaaaacg tccgcaatgt gttattaagt tgtctaagcg tcaatttgtt 9420
tacaccacaa tatatcctgc caccagccag ccaacagctc cccgaccggc agctcggcac 9480
aaaatcacca ctcgatacag gcagcccatc agtccgggac ggcgtcagcg ggagagccgt 9540
tgtaaggcgg cagactttgc tcatgttacc gatgctattc ggaagaacgg caactaagct 9600
gccgggtttg aaacacggat gatctcgcgg agggtagcat gttgattgta acgatgacag 9660
agcgttgctg cctgtgatca aatatcatct ccctcgcaga gatccgaatt atcagccttc 9720
ttattcattt ctcgcttaac cgtgacaggc tgtcgatctt gagaactatg ccgacataat 9780
aggaaatcgc tggataaagc cgctgaggaa gctgagtggc gctatttctt tagaagtgaa 9840
cgttgacgat cgtcgaccgt accccgatga attaattcgg acgtacgttc tgaacacagc 9900
tggatactta cttgggcgat tgtcatacat gacatcaaca atgtacccgt ttgtgtaacc 9960
gtctcttgga ggttcgtatg acactagtgg ttcccctcag cttgcgacta gatgttgagg 10020
cctaacattt tattagagag caggctagtt gcttagatac atgatcttca ggccgttatc 10080
tgtcagggca agcgaaaatt ggccatttat gacgaccaat gccccgcaga agctcccatc 10140
tttgccgcca tagacgccgc gccccccttt tggggtgtag aacatccttt tgccagatgt 10200
ggaaaagaag ttcgttgtcc cattgttggc aatgacgtag tagccggcga aagtgcgaga 10260
cccatttgcg ctatatataa gcctacgatt tccgttgcga ctattgtcgt aattggatga 10320
actattatcg tagttgctct cagagttgtc gtaatttgat ggactattgt cgtaattgct 10380
tatggagttg tcgtagttgc ttggagaaat gtcgtagttg gatggggagt agtcataggg 10440
aagacgagct tcatccacta aaacaattgg caggtcagca agtgcctgcc ccgatgccat 10500
cgcaagtacg aggcttagaa ccaccttcaa cagatcgcgc atagtcttcc ccagctctct 10560
aacgcttgag ttaagccgcg ccgcgaagcg gcgtcggctt gaacgaattg ttagacatta 10620
tttgccgact accttggtga tctcgccttt cacgtagtga acaaattctt ccaactgatc 10680
tgcgcgcgag gccaagcgat cttcttgtcc aagataagcc tgcctagctt caagtatgac 10740
gggctgatac tgggccggca ggcgctccat tgcccagtcg gcagcgacat ccttcggcgc 10800
gattttgccg gttactgcgc tgtaccaaat gcgggacaac gtaagcacta catttcgctc 10860
atcgccagcc cagtcgggcg gcgagttcca tagcgttaag gtttcattta gcgcctcaaa 10920
tagatcctgt tcaggaaccg gatcaaagag ttcctccgcc gctggaccta ccaaggcaac 10980
gctatgttct cttgcttttg tcagcaagat agccagatca atgtcgatcg tggctggctc 11040
gaagatacct gcaagaatgt cattgcgctg ccattctcca aattgcagtt cgcgcttagc 11100
tggataacgc cacggaatga tgtcgtcgtg cacaacaatg gtgacttcta cagcgcggag 11160
aatctcgctc tctccagggg aagccgaagt ttccaaaagg tcgttgatca aagctcgccg 11220
cgttgtttca tcaagcctta cggtcaccgt aaccagcaaa tcaatatcac tgtgtggctt 11280
caggccgcca tccactgcgg agccgtacaa atgtacggcc agcaacgtcg gttcgagatg 11340
gcgctcgatg acgccaacta cctctgatag ttgagtcgat acttcggcga tcaccgcttc 11400
cctcatgatg tttaactcct gaattaagcc gcgccgcgaa gcggtgtcgg cttgaatgaa 11460
ttgttaggcg tcatcctgtg ctcccgagaa ccagtaccag tacatcgctg tttcgttcga 11520
gacttgaggt ctagttttat acgtgaacag gtcaatgccg ccgagagtaa agccacattt 11580
tgcgtacaaa ttgcaggcag gtacattgtt cgtttgtgtc tctaatcgta tgccaaggag 11640
ctgtctgctt agtgcccact ttttcgcaaa ttcgatgaga ctgtgcgcga ctcctttgcc 11700
tcggtgcgtg tgcgacacaa caatgtgttc gatagaggct agatcgttcc atgttgagtt 11760
gagttcaatc ttcccgacaa gctcttggtc gatgaatgcg ccatagcaag cagagtcttc 11820
atcagagtca tcatccgaga tgtaatcctt ccggtagggg ctcacacttc tggtagatag 11880
ttcaaagcct tggtcggata ggtgcacatc gaacacttca cgaacaatga aatggttctc 11940
agcatccaat gtttccgcca cctgctcagg gatcaccgaa atcttcatat gacgcctaac 12000
gcctggcaca gcggatcgca aacctggcgc ggcttttggc acaaaaggcg tgacaggttt 12060
gcgaatccgt tgctgccact tgttaaccct tttgccagat ttggtaacta taatttatgt 12120
tagaggcgaa gtcttgggta aaaactggcc taaaattgct ggggatttca ggaaagtaaa 12180
catcaccttc cggctcgatg tctattgtag atatatgtag tgtatctact tgatcggggg 12240
atctgctgcc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg 12300
gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg 12360
tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggcgca gccatgaccc agtcacgtag cgatagcgga 12420
gtgtatactg gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccatatgc 12480
ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc tcttccgctt 12540
cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact 12600
caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag 12660
caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 12720
ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc 12780
cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 12840
ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc 12900
tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 12960
gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 13020
ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 13080
ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 13140
gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 13200
aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg 13260
tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 13320
ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat 13380
tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct 13440
aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta 13500
tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa 13560
ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac 13620
gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa 13680
gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag 13740
taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctgca gggggggggg 13800
ggggggggga cttccattgt tcattccacg gacaaaaaca gagaaaggaa acgacagagg 13860
ccaaaaagcc tcgctttcag cacctgtcgt ttcctttctt ttcagagggt attttaaata 13920
aaaacattaa gttatgacga agaagaacgg aaacgcctta aaccggaaaa ttttcataaa 13980
tagcgaaaac ccgcgaggtc gccgccccgt aacctgtcgg atcaccggaa aggacccgta 14040
aagtgataat gattatcatc tacatatcac aacgtgcgtg gaggccatca aaccacgtca 14100
aataatcaat tatgacgcag gtatcgtatt aattgatctg catcaactta acgtaaaaac 14160
aacttcagac aatacaaatc agcgacactg aatacggggc aacctcatgt cccccccccc 14220
cccccccctg caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc 14280
ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc 14340
tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt 14400
atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact 14460
ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc 14520
ccggcgtcaa cacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt 14580
ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg 14640
atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct 14700
gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa 14760
tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt 14820
ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc 14880
acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc 14940
tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtcttcaag aattggtcga cgatcttgct 15000
gcgttcggat attttcgtgg agttcccgcc acagacccgg attgaaggcg agatccagca 15060
actcgcgcca gatcatcctg tgacggaact ttggcgcgtg atgactggcc aggacgtcgg 15120
ccgaaagagc gacaagcaga tcacgctttt cgacagcgtc ggatttgcga tcgaggattt 15180
ttcggcgctg cgctacgtcc gcgaccgcgt tgagggatca agccacagca gcccactcga 15240
ccttctagcc gacccagacg agccaaggga tctttttgga atgctgctcc gtcgtcaggc 15300
tttccgacgt ttgggtggtt gaacagaagt cattatcgta cggaatgcca agcactcccg 15360
aggggaaccc tgtggttggc atgcacatac aaatggacga acggataaac cttttcacgc 15420
ccttttaaat atccgttatt ctaataaacg ctcttttctc ttaggtttac ccgccaatat 15480
atcctgtcaa acactgatag tttaaactga aggcgggaaa cgacaatctg atcatgagcg 15540
gagaattaag ggagtcacgt tatgaccccc gccgatgacg cgggacaagc cgttttacgt 15600
ttggaactga cagaaccgca acgttgaagg agccactcag ccc 15643
<210> 14
<211> 15503
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: pNOV1305
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3582)
<223> synthetic nucleotide sequence encoding the toxin
portion of H04 plus a full-length Cry1Ab tail
portion
<220>
<221> misc_feature
<222> (3790)..(5771)
<223> Zm Ubi promoter
<220>
<221> misc_feature
<222> (5868)..(6971)
<223> PMI
<220>
<221> misc_feature
<222> (12934)..(15494)
<223> MTL promoter
<400> 14
atggacaaca accccaacat caacgagtgc atcccctaca actgcctgag caaccccgag 60
gtggaggtgc tgggcggcga gcgcatcgag accggctaca cccccatcga catcagcctg 120
agcctgaccc agttcctgct gagcgagttc gtgcccggcg ccggcttcgt gctgggcctg 180
gtggacatca tctggggcat cttcggcccc agccagtggg acgccttcct ggtgcagatc 240
gagcagttga taaaccaacg catagaggaa ttcgcccgca accaggccat cagccgcctg 300
gagggcctga gcaacctgta ccaaatctac gccgagagct tccgcgagtg ggaggccgac 360
cccaccaacc ccgccctgcg cgaggagatg cgcatccagt tcaacgacat gaacagcgcc 420
ctgaccaccg ccatccccct gttcgccgtg cagaactacc aggtgcccct gctgagcgtg 480
tacgtgcagg ccgccaacct gcacctgagc gtgctgcgcg acgtcagcgt gttcggccag 540
cgctggggct tcgacgccgc caccatcaac agccgctaca acgacctgac ccgcctgatc 600
ggcaactaca ccgaccacgc cgtgcgctgg tacaacaccg gcctggagcg cgtgtggggt 660
cccgacagcc gcgactggat caggtacaac cagttccgcc gcgagctgac cctgaccgtg 720
ctggacatcg tgagcctgtt ccccaactac gacagccgca cctaccccat ccgcaccgtg 780
agccagctga cccgcgagat ttacaccaac cccgtgctgg agaacttcga cggcagcttc 840
cgcggcagcg cccagggcat cgagggcagc atccgcagcc cccacctgat ggacatcctg 900
aacagcatca ccatctacac cgacgcccac cgcggcgagt actactggag cggccaccag 960
atcatggcca gccccgtcgg cttcagcggc cccgagttca ccttccccct gtacggcacc 1020
atgggcaacg ctgcacctca gcagcgcatc gtggcacagc tgggccaggg agtgtaccgc 1080
accctgagca gcaccctgta ccgtcgacct ttcaacatcg gcatcaacaa ccagcagctg 1140
agcgtgctgg acggcaccga gttcgcctac ggcaccagca gcaacctgcc cagcgccgtg 1200
taccgcaaga gcggcaccgt ggacagcctg gacgagatcc cccctcagaa caacaacgtg 1260
ccacctcgac agggcttcag ccaccgtctg agccacgtga gcatgttccg cagtggcttc 1320
agcaacagca gcgtgagcat catccgtgca cccatgttca gctggattca ccgcagcgcc 1380
accctgacca acaccatcga ccccgagcgc atcaaccaga tccccctggt gaagggcttc 1440
cgggtgtggg gcggcaccag cgtgatcacc ggccccggct tcaccggagg cgacatcctg 1500
cgcagaaaca ccttcggcga cttcgtgagc ctgcaggtga acatcaacag ccccatcacc 1560
cagcgttacc gcctgcgctt ccgctacgcc agcagccgcg acgcccgtgt gatcgtgctg 1620
actggcgccg ctagcaccgg tgtgggcggt caggtgagcg tgaacatgcc cctgcagaag 1680
actatggaga tcggcgagaa cctgactagt cgcaccttcc gctacaccga cttcagcaac 1740
cccttcagct tccgcgccaa ccccgacatc atcggcatca gcgagcagcc cctgttcggt 1800
gccggcagca tcagcagcgg cgagctgtac atcgacaaga tcgagatcat cctggccgac 1860
gccaccttcg aggccgagag cgacctggag cgcgcccaga aggccgtgaa cgccctgttc 1920
accagcagca accagatcgg cctgaagacc gacgtgaccg actaccacat cgaccaggtg 1980
agcaacctgg tggactgctt aagcgacgag ttctgcctgg acgagaagaa ggagctgagc 2040
gagaaggtga agcacgccaa gcgcctgagc gacgagcgca acctgctgca ggaccccaac 2100
ttccgcggca tcaaccgcca gctggaccgc ggctggcgag gcagcaccga tatcaccatc 2160
cagggcggcg acgacgtgtt caaggagaac tacgtgaccc tgcagggcac cttcgacgag 2220
tgctacccca cctacctgta ccagccgatc gacgagagca agctgaaggc ctacacccgc 2280
taccagctgc gcggctacat cgaggacagc caggacctgg aaatctacct gatccgctac 2340
aacgcgaagc acgagaccgt gaacgtgccc ggcaccggca gcctgtggcc cctgagcgcc 2400
cccagcccca tcggcaagtg cggggagccg aatcgatgcg ctccgcacct ggagtggaac 2460
ccggacctag actgcagctg cagggacggg gagaagtgcg cccaccacag ccaccacttc 2520
agcctggaca tcgacgtggg ctgcaccgac ctgaacgagg acctgggcgt gtgggtgatc 2580
ttcaagatca agacccagga cggccacgcc cgcctgggca atctagagtt cctggaggag 2640
aagcccctgg tgggcgaggc cctggcccgc gtgaagcgtg ctgagaagaa gtggcgcgac 2700
aagcgcgaga agctggagtg ggagaccaac atcgtgtaca aggaggccaa ggagagcgtg 2760
gacgccctgt tcgtgaacag ccagtacgac cgcctgcagg ccgacaccaa catcgccatg 2820
atccacgccg ccgacaagcg cgtgcacagc attcgcgagg cctacctgcc cgagctgagc 2880
gtgatccccg gtgtgaacgc cgccatcttc gaggaactcg agggccgcat cttcaccgcc 2940
ttcagcctgt acgacgcccg caacgtgatc aagaacggcg acttcaacaa cggcctgagc 3000
tgctggaacg tgaagggcca cgtggacgtg gaggagcaga acaaccaccg cagcgtgctg 3060
gtggtgcccg agtgggaggc cgaggtgagc caggaggtgc gcgtgtgccc cggccgcggc 3120
tacatcctgc gcgtgaccgc ctacaaggag ggctacggcg agggctgcgt gaccatccac 3180
gagatcgaga acaacaccga cgagctcaag ttcagcaact gcgtggagga ggaggtttac 3240
cccaacaaca ccgtgacctg caacgactac accgcgaccc aggaggagta cgaaggcacc 3300
tacacctctc gcaacagggg ttacgacggc gcctacgagt ccaacagctc cgtgccagct 3360
gactacgcca gcgcctacga ggagaaagcc tacaccgacg gtagacgcga caacccatgt 3420
gagagcaaca gaggctacgg cgactacacc cccctgcccg ctggatacgt gaccaaggag 3480
ctggagtact tccccgagac cgacaaggtg tggatcgaga ttggcgagac cgagggcacc 3540
ttcatcgtgg acagcgtgga gctgctgctg atggaggagt agtagatctg ttctgcacaa 3600
agtggagtag tcagtcatcg atcaggaacc agacaccaga cttttattca tacagtgaag 3660
tgaagtgaag tgcagtgcag tgagttgctg gtttttgtac aacttagtat gtatttgtat 3720
ttgtaaaata cttctatcaa taaaatttct aattcctaaa accaaaatcc aggggtacca 3780
gcttgcatgc ctgcagtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat 3840
tgcatgtcta agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc 3900
agtttatcta tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat aatctatagt 3960
actacaataa tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac atggtctaaa 4020
ggacaattga gtattttgac aacaggactc tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt 4080
tctccttttt ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt tattagtaca 4140
tccatttagg gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta catctatttt 4200
attctatttt agcctctaaa ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt tttatttaat 4260
aatttagata taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag 4320
aaattaaaaa aactaaggaa acatttttct tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa 4380
acgccgtcga cgagtctaac ggacaccaac cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa 4440
gcgaagcaga cggcacggca tctctgtcgc tgcctctgga cccctctcga gagttccgct 4500
ccaccgttgg acttgctccg ctgtcggcat ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt 4560
gagccggcac ggcaggcggc ctcctcctcc tctcacggca ccggcagcta cgggggattc 4620
ctttcccacc gctccttcgc tttcccttcc tcgcccgccg taataaatag acaccccctc 4680
cacaccctct ttccccaacc tcgtgttgtt cggagcgcac acacacacaa ccagatctcc 4740
cccaaatcca cccgtcggca cctccgcttc aaggtacgcc gctcgtcctc cccccccccc 4800
cctctctacc ttctctagat cggcgttccg gtccatggtt agggcccggt agttctactt 4860
ctgttcatgt ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag cgttcgtaca 4920
cggatgcgac ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt ttctctttgg 4980
ggaatcctgg gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga ttttttttgt 5040
ttcgttgcat agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc gtgcacttgt 5100
ttgtcgggtc atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg gtctggttgg 5160
gcggtcgttc tagatcggag tagaattctg tttcaaacta cctggtggat ttattaattt 5220
tggatctgta tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg atggatggaa 5280
atatcgatct aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat atacagagat 5340
gctttttgtt cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc attcgttcta 5400
gatcggagta gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg gaactgtatg 5460
tgtgtgtcat acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc gatctaggat 5520
aggtatacat gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata tgcagcatct 5580
attcatatgc tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg ttttataatt 5640
attttgatct tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg gattttttta 5700
gccctgcctt catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga tgctcaccct 5760
gttgtttggt gttacttctg cagggatccc cgatcatgca aaaactcatt aactcagtgc 5820
aaaactatgc ctggggcagc aaaacggcgt tgactgaact ttatggtatg gaaaatccgt 5880
ccagccagcc gatggccgag ctgtggatgg gcgcacatcc gaaaagcagt tcacgagtgc 5940
agaatgccgc cggagatatc gtttcactgc gtgatgtgat tgagagtgat aaatcgactc 6000
tgctcggaga ggccgttgcc aaacgctttg gcgaactgcc tttcctgttc aaagtattat 6060
gcgcagcaca gccactctcc attcaggttc atccaaacaa acacaattct gaaatcggtt 6120
ttgccaaaga aaatgccgca ggtatcccga tggatgccgc cgagcgtaac tataaagatc 6180
ctaaccacaa gccggagctg gtttttgcgc tgacgccttt ccttgcgatg aacgcgtttc 6240
gtgaattttc cgagattgtc tccctactcc agccggtcgc aggtgcacat ccggcgattg 6300
ctcacttttt acaacagcct gatgccgaac gtttaagcga actgttcgcc agcctgttga 6360
atatgcaggg tgaagaaaaa tcccgcgcgc tggcgatttt aaaatcggcc ctcgatagcc 6420
agcagggtga accgtggcaa acgattcgtt taatttctga attttacccg gaagacagcg 6480
gtctgttctc cccgctattg ctgaatgtgg tgaaattgaa ccctggcgaa gcgatgttcc 6540
tgttcgctga aacaccgcac gcttacctgc aaggcgtggc gctggaagtg atggcaaact 6600
ccgataacgt gctgcgtgcg ggtctgacgc ctaaatacat tgatattccg gaactggttg 6660
ccaatgtgaa attcgaagcc aaaccggcta accagttgtt gacccagccg gtgaaacaag 6720
gtgcagaact ggacttcccg attccagtgg atgattttgc cttctcgctg catgacctta 6780
gtgataaaga aaccaccatt agccagcaga gtgccgccat tttgttctgc gtcgaaggcg 6840
atgcaacgtt gtggaaaggt tctcagcagt tacagcttaa accgggtgaa tcagcgttta 6900
ttgccgccaa cgaatcaccg gtgactgtca aaggccacgg ccgtttagcg cgtgtttaca 6960
acaagctgta agagcttact gaaaaaatta acatctcttg ctaagctggg agctcgatcc 7020
gtcgacctgc agatcgttca aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg 7080
ccggtcttgc gatgattatc atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta 7140
acatgtaatg catgacgtta tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat 7200
acatttaata cgcgatagaa aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg 7260
cggtgtcatc tatgttacta gatctgctag ccctgcagga aatttaccgg tgcccgggcg 7320
gccagcatgg ccgtatccgc aatgtgttat taagttgtct aagcgtcaat ttgtttacac 7380
cacaatatat cctgccacca gccagccaac agctccccga ccggcagctc ggcacaaaat 7440
caccactcga tacaggcagc ccatcagaat taattctcat gtttgacagc ttatcatcga 7500
ctgcacggtg caccaatgct tctggcgtca ggcagccatc ggaagctgtg gtatggctgt 7560
gcaggtcgta aatcactgca taattcgtgt cgctcaaggc gcactcccgt tctggataat 7620
gttttttgcg ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc tgaaatgagc tgttgacaat 7680
taatcatccg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 7740
cagaccatga gggaagcgtt gatcgccgaa gtatcgactc aactatcaga ggtagttggc 7800
gtcatcgagc gccatctcga accgacgttg ctggccgtac atttgtacgg ctccgcagtg 7860
gatggcggcc tgaagccaca cagtgatatt gatttgctgg ttacggtgac cgtaaggctt 7920
gatgaaacaa cgcggcgagc tttgatcaac gaccttttgg aaacttcggc ttcccctgga 7980
gagagcgaga ttctccgcgc tgtagaagtc accattgttg tgcacgacga catcattccg 8040
tggcgttatc cagctaagcg cgaactgcaa tttggagaat ggcagcgcaa tgacattctt 8100
gcaggtatct tcgagccagc cacgatcgac attgatctgg ctatcttgct gacaaaagca 8160
agagaacata gcgttgcctt ggtaggtcca gcggcggagg aactctttga tccggttcct 8220
gaacaggatc tatttgaggc gctaaatgaa accttaacgc tatggaactc gccgcccgac 8280
tgggctggcg atgagcgaaa tgtagtgctt acgttgtccc gcatttggta cagcgcagta 8340
accggcaaaa tcgcgccgaa ggatgtcgct gccgactggg caatggagcg cctgccggcc 8400
cagtatcagc ccgtcatact tgaagctagg caggcttatc ttggacaaga agatcgcttg 8460
gcctcgcgcg cagatcagtt ggaagaattt gttcactacg tgaaaggcga gatcaccaaa 8520
gtagtcggca aataaagctc tagtggatct ccgtaccccc gggggatctg gctcgcggcg 8580
gacgcacgac gccggggcga gaccataggc gatctcctaa atcaatagta gctgtaacct 8640
cgaagcgttt cacttgtaac aacgattgag aatttttgtc ataaaattga aatacttggt 8700
tcgcattttt gtcatccgcg gtcagccgca attctgacga actgcccatt tagctggaga 8760
tgattgtaca tccttcacgt gaaaatttct caagcgctgt gaacaagggt tcagatttta 8820
gattgaaagg tgagccgttg aaacacgttc ttcttgtcga tgacgacgtc gctatgcggc 8880
atcttattat tgaatacctt acgatccacg ccttcaaagt gaccgcggta gccgacagca 8940
cccagttcac aagagtactc tcttccgcga cggtcgatgt cgtggttgtt gatctaaatt 9000
taggtcgtga agatgggctc gagatcgttc gtaatctggc ggcaaagtct gatattccaa 9060
tcataattat cagtggcgac cgccttgagg agacggataa agttgttgca ctcgagctag 9120
gagcaagtga ttttatcgct aagccgttca gtatcagaga gtttctagca cgcattcggg 9180
ttgccttgcg cgtgcgcccc aacgttgtcc gctccaaaga ccgacggtct ttttgtttta 9240
ctgactggac acttaatctc aggcaacgtc gcttgatgtc cgaagctggc ggtgaggtga 9300
aacttacggc aggtgagttc aatcttctcc tcgcgttttt agagaaaccc cgcgacgttc 9360
tatcgcgcga gcaacttctc attgccagtc gagtacgcga cgaggaggtt tatgacagga 9420
gtatagatgt tctcattttg aggctgcgcc gcaaacttga ggcagatccg tcaagccctc 9480
aactgataaa aacagcaaga ggtgccggtt atttctttga cgcggacgtg caggtttcgc 9540
acggggggac gatggcagcc tgagccaatt cccagatccc cgaggaatcg gcgtgagcgg 9600
tcgcaaacca tccggcccgg tacaaatcgg cgcggcgctg ggtgatgacc tggtggagaa 9660
gttgaaggcc gcgcaggccg cccagcggca acgcatcgag gcagaagcac gccccggtga 9720
atcgtggcaa gcggccgctg atcgaatccg caaagaatcc cggcaaccgc cggcagccgg 9780
tgcgccgtcg attaggaagc cgcccaaggg cgacgagcaa ccagattttt tcgttccgat 9840
gctctatgac gtgggcaccc gcgatagtcg cagcatcatg gacgtggccg ttttccgtct 9900
gtcgaagcgt gaccgacgag ctggcgaggt gatccgctac gagcttccag acgggcacgt 9960
agaggtttcc gcagggccgg ccggcatggc cagtgtgtgg gattacgacc tggtactgat 10020
ggcggtttcc catctaaccg aatccatgaa ccgataccgg gaagggaagg gagacaagcc 10080
cggccgcgtg ttccgtccac acgttgcgga cgtactcaag ttctgccggc gagccgatgg 10140
cggaaagcag aaagacgacc tggtagaaac ctgcattcgg ttaaacacca cgcacgttgc 10200
catgcagcgt acgaagaagg ccaagaacgg ccgcctggtg acggtatccg agggtgaagc 10260
cttgattagc cgctacaaga tcgtaaagag cgaaaccggg cggccggagt acatcgagat 10320
cgagctagct gattggatgt accgcgagat cacagaaggc aagaacccgg acgtgctgac 10380
ggttcacccc gattactttt tgatcgatcc cggcatcggc cgttttctct accgcctggc 10440
acgccgcgcc gcaggcaagg cagaagccag atggttgttc aagacgatct acgaacgcag 10500
tggcagcgcc ggagagttca agaagttctg tttcaccgtg cgcaagctga tcgggtcaaa 10560
tgacctgccg gagtacgatt tgaaggagga ggcggggcag gctggcccga tcctagtcat 10620
gcgctaccgc aacctgatcg agggcgaagc atccgccggt tcctaatgta cggagcagat 10680
gctagggcaa attgccctag caggggaaaa aggtcgaaaa ggtctctttc ctgtggatag 10740
cacgtacatt gggaacccaa agccgtacat tgggaaccgg aacccgtaca ttgggaaccc 10800
aaagccgtac attgggaacc ggtcacacat gtaagtgact gatataaaag agaaaaaagg 10860
cgatttttcc gcctaaaact ctttaaaact tattaaaact cttaaaaccc gcctggcctg 10920
tgcataactg tctggccagc gcacagccga agagctgcaa aaagcgccta cccttcggtc 10980
gctgcgctcc ctacgccccg ccgcttcgcg tcggcctatc gcggccgctg gccgctcaaa 11040
aatggctggc ctacggccag gcaatctacc agggcgcgga caagccgcgc cgtcgccact 11100
cgaccgccgg cgctgaggtc tgcctcgtga agaaggtgtt gctgactcat accaggcctg 11160
aatcgcccca tcatccagcc agaaagtgag ggagccacgg ttgatgagag ctttgttgta 11220
ggtggaccag ttggtgattt tgaacttttg ctttgccacg gaacggtctg cgttgtcggg 11280
aagatgcgtg atctgatcct tcaactcagc aaaagttcga tttattcaac aaagccgccg 11340
tcccgtcaag tcagcgtaat gctctgccag tgttacaacc aattaaccaa ttctgattag 11400
aaaaactcat cgagcatcaa atgaaactgc aatttattca tatcaggatt atcaatacca 11460
tatttttgaa aaagccgttt ctgtaatgaa ggagaaaact caccgaggca gttccatagg 11520
atggcaagat cctggtatcg gtctgcgatt ccgactcgtc caacatcaat acaacctatt 11580
aatttcccct cgtcaaaaat aaggttatca agtgagaaat caccatgagt gacgactgaa 11640
tccggtgaga atggcaaaag ctctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg 11700
tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg 11760
gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 11820
ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 11880
ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 11940
acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 12000
tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 12060
ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc 12120
ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 12180
ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 12240
actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 12300
gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc 12360
tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 12420
caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 12480
atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 12540
acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttgat 12600
ccggaattaa ttcctgtggt tggcatgcac atacaaatgg acgaacggat aaaccttttc 12660
acgccctttt aaatatccga ttattctaat aaacgctctt ttctcttagg tttacccgcc 12720
aatatatcct gtcaaacact gatagtttaa actgaaggcg ggaaacgaca atctgatcat 12780
gagcggagaa ttaagggagt cacgttatga cccccgccga tgacgcggga caagccgttt 12840
tacgtttgga actgacagaa ccgcaacgct gcaggaattg gccgcagcgg ccatttaaat 12900
caattgggcg cgccgaattc gagctcggta caagcttgca catgacaaca attgtaagag 12960
gatggagacc acaacgatcc aacaatactt ctgcgacggg ctgtgaagta tagagaagtt 13020
aaacgcccaa aagccattgt gtttggaatt tttagttatt ctatttttca tgatgtatct 13080
tcctctaaca tgccttaatt tgcaaatttg gtataactac tgattgaaaa tatatgtatg 13140
taaaaaaata ctaagcatat ttgtgaagct aaacatgatg ttatttaaga aaatatgttg 13200
ttaacagaat aagattaata tcgaaatgga aacatctgta aattagaatc atcttacaag 13260
ctaagagatg ttcacgcttt gagaaacttc ttcagatcat gaccgtagaa gtagctctcc 13320
aagactcaac gaaggctgct gcaattccac aaatgcatga catgcatcct tgtaaccgtc 13380
gtcgccgcta taaacacgga taactcaatt ccctgctcca tcaatttaga aatgagcaag 13440
caagcacccg atcgctcacc ccatatgcac caatctgact cccaagtctc tgtttcgcat 13500
tagtaccgcc agcactccac ctatagctac caattgagac ctttccagcc taagcagatc 13560
gattgatcgt tagagtcaaa gagttggtgg tacgggtact ttaactacca tggaatgatg 13620
gggcgtgatg tagagcggaa agcgcctccc tacgcggaac aacaccctcg ccatgccgct 13680
cgactacagc ctcctcctcg tcggccgccc acaacgaggg agcccgtggt cgcagccacc 13740
gaccagcatg tctctgtgtc ctcgtccgac ctcgacatgt catggcaaac agtcggacgc 13800
cagcaccaga ctgacgacat gagtctctga agagcccgcc acctagaaag atccgagccc 13860
tgctgctggt agtggtaacc attttcgtcg cgctgacgcg gagagcgaga ggccagaaat 13920
ttatagcgac tgacgctgtg gcaggcacgc tatcggaggt tacgacgtgg cgggtcactc 13980
gacgcggagt tcacaggtcc tatccttgca tcgctcgggc cggagtttac gggacttatc 14040
cttacgacgt gctctaaggt tgcgataacg ggcggaggaa ggcgtgtggc gtgcggagac 14100
ggtttataca cgtagtgtgc gggagtgtgt ttcgtagacg cgggaaagca cgacgactta 14160
cgaaggttag tggaggagga ggacacacta aaatcaggac gcaagaaact cttctattat 14220
agtagtagag aagagattat aggagtgtgg gttgattcta aagaaaatcg acgcaggaca 14280
accgtcaaaa cgggtgcttt aatatagtag atatatatat atagagagag agagaaagta 14340
caaaggatgc atttgtgtct gcatatgatc ggagtattac taacggccgt cgtaagaagg 14400
tccatcatgc gtggagcgag cccatttggt tggttgtcag gccgcagtta aggcctccat 14460
atatgattgt cgtcgggccc ataacagcat ctcctccacc agtttattgt aagaataaat 14520
taagtagaga tatttgtcgt cgggcagaag aaacttggac aagaagaaga agcaagctag 14580
gccaatttct tgccggcaag aggaagatag tggcctctag tttatatatc ggcgtgatga 14640
tgatgctcct agctagaaat gagagaagaa aaacggacgc gtgtttggtg tgtgtcaatg 14700
gcgtccatcc ttccatcaga tcagaacgat gaaaaagtca agcacggcat gcatagtata 14760
tgtatagctt gttttagtgt ggctttgctg agacgaatga aagcaacggc gggcatattt 14820
ttcagtggct gtagctttca ggctgaaaga gacgtggcat gcaataattc agggaattcg 14880
tcagccaatt gaggtagcta gtcaacttgt acattggtgc gagcaatttt ccgcactcag 14940
gagggctagt ttgagagtcc aaaaactata ggagattaaa gaggctaaaa tcctctcctt 15000
atttaatttt aaataagtag tgtatttgta ttttaactcc tccaaccctt ccgattttat 15060
ggctctcaaa ctagcattca gtctaatgca tgcatgcttg gctagaggtc gtatggggtt 15120
gttaatagca tagctagcta caagttaacc gggtctttta tatttaataa ggacaggcaa 15180
agtattactt acaaataaag aataaagcta ggacgaactc gtggattatt actaaatcga 15240
aatggacgta atattccagg caagaataat tgttcgatca ggagacaagt ggggcattgg 15300
accggttctt gcaagcaaga gcctatggcg tggtgacacg gcgcgttgcc catacatcat 15360
gcctccatcg atgatccatc ctcacttgct ataaaaagag gtgtccatgg tgctcaagct 15420
cagccaagca aataagacga cttgtttcat tgattcttca agagatcgag cttcttttgc 15480
accacaaggt cgaggatcca aca 15503
<210> 15
<211> 14946
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: pNOV1313
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(1993)
<223> Zm Ubi promoter
<220>
<221> misc_feature
<222> (2016)..(5597)
<223> synthetic nucleotide sequence encoding the toxin
portion of H04 plus a full-length Cry1Ab tail
portion
<220>
<221> misc_feature
<222> (5805)..(7786)
<223> Zm Ubi promoter
<220>
<221> misc_feature
<222> (7883)..(8986)
<223> PMI
<400> 15
aagcttgcat gcctgcagtg cagcgtgacc cggtcgtgcc cctctctaga gataatgagc 60
attgcatgtc taagttataa aaaattacca catatttttt ttgtcacact tgtttgaagt 120
gcagtttatc tatctttata catatattta aactttactc tacgaataat ataatctata 180
gtactacaat aatatcagtg ttttagagaa tcatataaat gaacagttag acatggtcta 240
aaggacaatt gagtattttg acaacaggac tctacagttt tatcttttta gtgtgcatgt 300
gttctccttt ttttttgcaa atagcttcac ctatataata cttcatccat tttattagta 360
catccattta gggtttaggg ttaatggttt ttatagacta atttttttag tacatctatt 420
ttattctatt ttagcctcta aattaagaaa actaaaactc tattttagtt tttttattta 480
ataatttaga tataaaatag aataaaataa agtgactaaa aattaaacaa atacccttta 540
agaaattaaa aaaactaagg aaacattttt cttgtttcga gtagataatg ccagcctgtt 600
aaacgccgtc gacgagtcta acggacacca accagcgaac cagcagcgtc gcgtcgggcc 660
aagcgaagca gacggcacgg catctctgtc gctgcctctg gacccctctc gagagttccg 720
ctccaccgtt ggacttgctc cgctgtcggc atccagaaat tgcgtggcgg agcggcagac 780
gtgagccggc acggcaggcg gcctcctcct cctctcacgg caccggcagc tacgggggat 840
tcctttccca ccgctccttc gctttccctt cctcgcccgc cgtaataaat agacaccccc 900
tccacaccct ctttccccaa cctcgtgttg ttcggagcgc acacacacac aaccagatct 960
cccccaaatc cacccgtcgg cacctccgct tcaaggtacg ccgctcgtcc tccccccccc 1020
cccctctcta ccttctctag atcggcgttc cggtccatgg ttagggcccg gtagttctac 1080
ttctgttcat gtttgtgtta gatccgtgtt tgtgttagat ccgtgctgct agcgttcgta 1140
cacggatgcg acctgtacgt cagacacgtt ctgattgcta acttgccagt gtttctcttt 1200
ggggaatcct gggatggctc tagccgttcc gcagacggga tcgatttcat gatttttttt 1260
gtttcgttgc atagggtttg gtttgccctt ttcctttatt tcaatatatg ccgtgcactt 1320
gtttgtcggg tcatcttttc atgctttttt ttgtcttggt tgtgatgatg tggtctggtt 1380
gggcggtcgt tctagatcgg agtagaattc tgtttcaaac tacctggtgg atttattaat 1440
tttggatctg tatgtgtgtg ccatacatat tcatagttac gaattgaaga tgatggatgg 1500
aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt gatgcgggtt ttactgatgc atatacagag 1560
atgctttttg ttcgcttggt tgtgatgatg tggtgtggtt gggcggtcgt tcattcgttc 1620
tagatcggag tagaatactg tttcaaacta cctggtgtat ttattaattt tggaactgta 1680
tgtgtgtgtc atacatcttc atagttacga gtttaagatg gatggaaata tcgatctagg 1740
ataggtatac atgttgatgt gggttttact gatgcatata catgatggca tatgcagcat 1800
ctattcatat gctctaacct tgagtaccta tctattataa taaacaagta tgttttataa 1860
ttattttgat cttgatatac ttggatgatg gcatatgcag cagctatatg tggatttttt 1920
tagccctgcc ttcatacgct atttatttgc ttggtactgt ttcttttgtc gatgctcacc 1980
ctgttgtttg gtgttacttc tgcagggatc caacaatgga caacaacccc aacatcaacg 2040
agtgcatccc ctacaactgc ctgagcaacc ccgaggtgga ggtgctgggc ggcgagcgca 2100
tcgagaccgg ctacaccccc atcgacatca gcctgagcct gacccagttc ctgctgagcg 2160
agttcgtgcc cggcgccggc ttcgtgctgg gcctggtgga catcatctgg ggcatcttcg 2220
gccccagcca gtgggacgcc ttcctggtgc agatcgagca gttgataaac caacgcatag 2280
aggaattcgc ccgcaaccag gccatcagcc gcctggaggg cctgagcaac ctgtaccaaa 2340
tctacgccga gagcttccgc gagtgggagg ccgaccccac caaccccgcc ctgcgcgagg 2400
agatgcgcat ccagttcaac gacatgaaca gcgccctgac caccgccatc cccctgttcg 2460
ccgtgcagaa ctaccaggtg cccctgctga gcgtgtacgt gcaggccgcc aacctgcacc 2520
tgagcgtgct gcgcgacgtc agcgtgttcg gccagcgctg gggcttcgac gccgccacca 2580
tcaacagccg ctacaacgac ctgacccgcc tgatcggcaa ctacaccgac cacgccgtgc 2640
gctggtacaa caccggcctg gagcgcgtgt ggggtcccga cagccgcgac tggatcaggt 2700
acaaccagtt ccgccgcgag ctgaccctga ccgtgctgga catcgtgagc ctgttcccca 2760
actacgacag ccgcacctac cccatccgca ccgtgagcca gctgacccgc gagatttaca 2820
ccaaccccgt gctggagaac ttcgacggca gcttccgcgg cagcgcccag ggcatcgagg 2880
gcagcatccg cagcccccac ctgatggaca tcctgaacag catcaccatc tacaccgacg 2940
cccaccgcgg cgagtactac tggagcggcc accagatcat ggccagcccc gtcggcttca 3000
gcggccccga gttcaccttc cccctgtacg gcaccatggg caacgctgca cctcagcagc 3060
gcatcgtggc acagctgggc cagggagtgt accgcaccct gagcagcacc ctgtaccgtc 3120
gacctttcaa catcggcatc aacaaccagc agctgagcgt gctggacggc accgagttcg 3180
cctacggcac cagcagcaac ctgcccagcg ccgtgtaccg caagagcggc accgtggaca 3240
gcctggacga gatcccccct cagaacaaca acgtgccacc tcgacagggc ttcagccacc 3300
gtctgagcca cgtgagcatg ttccgcagtg gcttcagcaa cagcagcgtg agcatcatcc 3360
gtgcacccat gttcagctgg attcaccgca gcgccaccct gaccaacacc atcgaccccg 3420
agcgcatcaa ccagatcccc ctggtgaagg gcttccgggt gtggggcggc accagcgtga 3480
tcaccggccc cggcttcacc ggaggcgaca tcctgcgcag aaacaccttc ggcgacttcg 3540
tgagcctgca ggtgaacatc aacagcccca tcacccagcg ttaccgcctg cgcttccgct 3600
acgccagcag ccgcgacgcc cgtgtgatcg tgctgactgg cgccgctagc accggtgtgg 3660
gcggtcaggt gagcgtgaac atgcccctgc agaagactat ggagatcggc gagaacctga 3720
ctagtcgcac cttccgctac accgacttca gcaacccctt cagcttccgc gccaaccccg 3780
acatcatcgg catcagcgag cagcccctgt tcggtgccgg cagcatcagc agcggcgagc 3840
tgtacatcga caagatcgag atcatcctgg ccgacgccac cttcgaggcc gagagcgacc 3900
tggagcgcgc ccagaaggcc gtgaacgccc tgttcaccag cagcaaccag atcggcctga 3960
agaccgacgt gaccgactac cacatcgacc aggtgagcaa cctggtggac tgcttaagcg 4020
acgagttctg cctggacgag aagaaggagc tgagcgagaa ggtgaagcac gccaagcgcc 4080
tgagcgacga gcgcaacctg ctgcaggacc ccaacttccg cggcatcaac cgccagctgg 4140
accgcggctg gcgaggcagc accgatatca ccatccaggg cggcgacgac gtgttcaagg 4200
agaactacgt gaccctgcag ggcaccttcg acgagtgcta ccccacctac ctgtaccagc 4260
cgatcgacga gagcaagctg aaggcctaca cccgctacca gctgcgcggc tacatcgagg 4320
acagccagga cctggaaatc tacctgatcc gctacaacgc gaagcacgag accgtgaacg 4380
tgcccggcac cggcagcctg tggcccctga gcgcccccag ccccatcggc aagtgcgggg 4440
agccgaatcg atgcgctccg cacctggagt ggaacccgga cctagactgc agctgcaggg 4500
acggggagaa gtgcgcccac cacagccacc acttcagcct ggacatcgac gtgggctgca 4560
ccgacctgaa cgaggacctg ggcgtgtggg tgatcttcaa gatcaagacc caggacggcc 4620
acgcccgcct gggcaatcta gagttcctgg aggagaagcc cctggtgggc gaggccctgg 4680
cccgcgtgaa gcgtgctgag aagaagtggc gcgacaagcg cgagaagctg gagtgggaga 4740
ccaacatcgt gtacaaggag gccaaggaga gcgtggacgc cctgttcgtg aacagccagt 4800
acgaccgcct gcaggccgac accaacatcg ccatgatcca cgccgccgac aagcgcgtgc 4860
acagcattcg cgaggcctac ctgcccgagc tgagcgtgat ccccggtgtg aacgccgcca 4920
tcttcgagga actcgagggc cgcatcttca ccgccttcag cctgtacgac gcccgcaacg 4980
tgatcaagaa cggcgacttc aacaacggcc tgagctgctg gaacgtgaag ggccacgtgg 5040
acgtggagga gcagaacaac caccgcagcg tgctggtggt gcccgagtgg gaggccgagg 5100
tgagccagga ggtgcgcgtg tgccccggcc gcggctacat cctgcgcgtg accgcctaca 5160
aggagggcta cggcgagggc tgcgtgacca tccacgagat cgagaacaac accgacgagc 5220
tcaagttcag caactgcgtg gaggaggagg tttaccccaa caacaccgtg acctgcaacg 5280
actacaccgc gacccaggag gagtacgaag gcacctacac ctctcgcaac aggggttacg 5340
acggcgccta cgagtccaac agctccgtgc cagctgacta cgccagcgcc tacgaggaga 5400
aagcctacac cgacggtaga cgcgacaacc catgtgagag caacagaggc tacggcgact 5460
acacccccct gcccgctgga tacgtgacca aggagctgga gtacttcccc gagaccgaca 5520
aggtgtggat cgagattggc gagaccgagg gcaccttcat cgtggacagc gtggagctgc 5580
tgctgatgga ggagtagtag atctgttctg cacaaagtgg agtagtcagt catcgatcag 5640
gaaccagaca ccagactttt attcatacag tgaagtgaag tgaagtgcag tgcagtgagt 5700
tgctggtttt tgtacaactt agtatgtatt tgtatttgta aaatacttct atcaataaaa 5760
tttctaattc ctaaaaccaa aatccagggg taccagcttg catgcctgca gtgcagcgtg 5820
acccggtcgt gcccctctct agagataatg agcattgcat gtctaagtta taaaaaatta 5880
ccacatattt tttttgtcac acttgtttga agtgcagttt atctatcttt atacatatat 5940
ttaaacttta ctctacgaat aatataatct atagtactac aataatatca gtgttttaga 6000
gaatcatata aatgaacagt tagacatggt ctaaaggaca attgagtatt ttgacaacag 6060
gactctacag ttttatcttt ttagtgtgca tgtgttctcc tttttttttg caaatagctt 6120
cacctatata atacttcatc cattttatta gtacatccat ttagggttta gggttaatgg 6180
tttttataga ctaatttttt tagtacatct attttattct attttagcct ctaaattaag 6240
aaaactaaaa ctctatttta gtttttttat ttaataattt agatataaaa tagaataaaa 6300
taaagtgact aaaaattaaa caaataccct ttaagaaatt aaaaaaacta aggaaacatt 6360
tttcttgttt cgagtagata atgccagcct gttaaacgcc gtcgacgagt ctaacggaca 6420
ccaaccagcg aaccagcagc gtcgcgtcgg gccaagcgaa gcagacggca cggcatctct 6480
gtcgctgcct ctggacccct ctcgagagtt ccgctccacc gttggacttg ctccgctgtc 6540
ggcatccaga aattgcgtgg cggagcggca gacgtgagcc ggcacggcag gcggcctcct 6600
cctcctctca cggcaccggc agctacgggg gattcctttc ccaccgctcc ttcgctttcc 6660
cttcctcgcc cgccgtaata aatagacacc ccctccacac cctctttccc caacctcgtg 6720
ttgttcggag cgcacacaca cacaaccaga tctcccccaa atccacccgt cggcacctcc 6780
gcttcaaggt acgccgctcg tcctcccccc ccccccctct ctaccttctc tagatcggcg 6840
ttccggtcca tggttagggc ccggtagttc tacttctgtt catgtttgtg ttagatccgt 6900
gtttgtgtta gatccgtgct gctagcgttc gtacacggat gcgacctgta cgtcagacac 6960
gttctgattg ctaacttgcc agtgtttctc tttggggaat cctgggatgg ctctagccgt 7020
tccgcagacg ggatcgattt catgattttt tttgtttcgt tgcatagggt ttggtttgcc 7080
cttttccttt atttcaatat atgccgtgca cttgtttgtc gggtcatctt ttcatgcttt 7140
tttttgtctt ggttgtgatg atgtggtctg gttgggcggt cgttctagat cggagtagaa 7200
ttctgtttca aactacctgg tggatttatt aattttggat ctgtatgtgt gtgccataca 7260
tattcatagt tacgaattga agatgatgga tggaaatatc gatctaggat aggtatacat 7320
gttgatgcgg gttttactga tgcatataca gagatgcttt ttgttcgctt ggttgtgatg 7380
atgtggtgtg gttgggcggt cgttcattcg ttctagatcg gagtagaata ctgtttcaaa 7440
ctacctggtg tatttattaa ttttggaact gtatgtgtgt gtcatacatc ttcatagtta 7500
cgagtttaag atggatggaa atatcgatct aggataggta tacatgttga tgtgggtttt 7560
actgatgcat atacatgatg gcatatgcag catctattca tatgctctaa ccttgagtac 7620
ctatctatta taataaacaa gtatgtttta taattatttt gatcttgata tacttggatg 7680
atggcatatg cagcagctat atgtggattt ttttagccct gccttcatac gctatttatt 7740
tgcttggtac tgtttctttt gtcgatgctc accctgttgt ttggtgttac ttctgcaggg 7800
atccccgatc atgcaaaaac tcattaactc agtgcaaaac tatgcctggg gcagcaaaac 7860
ggcgttgact gaactttatg gtatggaaaa tccgtccagc cagccgatgg ccgagctgtg 7920
gatgggcgca catccgaaaa gcagttcacg agtgcagaat gccgccggag atatcgtttc 7980
actgcgtgat gtgattgaga gtgataaatc gactctgctc ggagaggccg ttgccaaacg 8040
ctttggcgaa ctgcctttcc tgttcaaagt attatgcgca gcacagccac tctccattca 8100
ggttcatcca aacaaacaca attctgaaat cggttttgcc aaagaaaatg ccgcaggtat 8160
cccgatggat gccgccgagc gtaactataa agatcctaac cacaagccgg agctggtttt 8220
tgcgctgacg cctttccttg cgatgaacgc gtttcgtgaa ttttccgaga ttgtctccct 8280
actccagccg gtcgcaggtg cacatccggc gattgctcac tttttacaac agcctgatgc 8340
cgaacgttta agcgaactgt tcgccagcct gttgaatatg cagggtgaag aaaaatcccg 8400
cgcgctggcg attttaaaat cggccctcga tagccagcag ggtgaaccgt ggcaaacgat 8460
tcgtttaatt tctgaatttt acccggaaga cagcggtctg ttctccccgc tattgctgaa 8520
tgtggtgaaa ttgaaccctg gcgaagcgat gttcctgttc gctgaaacac cgcacgctta 8580
cctgcaaggc gtggcgctgg aagtgatggc aaactccgat aacgtgctgc gtgcgggtct 8640
gacgcctaaa tacattgata ttccggaact ggttgccaat gtgaaattcg aagccaaacc 8700
ggctaaccag ttgttgaccc agccggtgaa acaaggtgca gaactggact tcccgattcc 8760
agtggatgat tttgccttct cgctgcatga ccttagtgat aaagaaacca ccattagcca 8820
gcagagtgcc gccattttgt tctgcgtcga aggcgatgca acgttgtgga aaggttctca 8880
gcagttacag cttaaaccgg gtgaatcagc gtttattgcc gccaacgaat caccggtgac 8940
tgtcaaaggc cacggccgtt tagcgcgtgt ttacaacaag ctgtaagagc ttactgaaaa 9000
aattaacatc tcttgctaag ctgggagctc gatccgtcga cctgcagatc gttcaaacat 9060
ttggcaataa agtttcttaa gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga ttatcatata 9120
atttctgttg aattacgtta agcatgtaat aattaacatg taatgcatga cgttatttat 9180
gagatgggtt tttatgatta gagtcccgca attatacatt taatacgcga tagaaaacaa 9240
aatatagcgc gcaaactagg ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt tactagatct 9300
gctagccctg caggaaattt accggtgccc gggcggccag catggccgta tccgcaatgt 9360
gttattaagt tgtctaagcg tcaatttgtt tacaccacaa tatatcctgc caccagccag 9420
ccaacagctc cccgaccggc agctcggcac aaaatcacca ctcgatacag gcagcccatc 9480
agaattaatt ctcatgtttg acagcttatc atcgactgca cggtgcacca atgcttctgg 9540
cgtcaggcag ccatcggaag ctgtggtatg gctgtgcagg tcgtaaatca ctgcataatt 9600
cgtgtcgctc aaggcgcact cccgttctgg ataatgtttt ttgcgccgac atcataacgg 9660
ttctggcaaa tattctgaaa tgagctgttg acaattaatc atccggctcg tataatgtgt 9720
ggaattgtga gcggataaca atttcacaca ggaaacagac catgagggaa gcgttgatcg 9780
ccgaagtatc gactcaacta tcagaggtag ttggcgtcat cgagcgccat ctcgaaccga 9840
cgttgctggc cgtacatttg tacggctccg cagtggatgg cggcctgaag ccacacagtg 9900
atattgattt gctggttacg gtgaccgtaa ggcttgatga aacaacgcgg cgagctttga 9960
tcaacgacct tttggaaact tcggcttccc ctggagagag cgagattctc cgcgctgtag 10020
aagtcaccat tgttgtgcac gacgacatca ttccgtggcg ttatccagct aagcgcgaac 10080
tgcaatttgg agaatggcag cgcaatgaca ttcttgcagg tatcttcgag ccagccacga 10140
tcgacattga tctggctatc ttgctgacaa aagcaagaga acatagcgtt gccttggtag 10200
gtccagcggc ggaggaactc tttgatccgg ttcctgaaca ggatctattt gaggcgctaa 10260
atgaaacctt aacgctatgg aactcgccgc ccgactgggc tggcgatgag cgaaatgtag 10320
tgcttacgtt gtcccgcatt tggtacagcg cagtaaccgg caaaatcgcg ccgaaggatg 10380
tcgctgccga ctgggcaatg gagcgcctgc cggcccagta tcagcccgtc atacttgaag 10440
ctaggcaggc ttatcttgga caagaagatc gcttggcctc gcgcgcagat cagttggaag 10500
aatttgttca ctacgtgaaa ggcgagatca ccaaagtagt cggcaaataa agctctagtg 10560
gatctccgta cccccggggg atctggctcg cggcggacgc acgacgccgg ggcgagacca 10620
taggcgatct cctaaatcaa tagtagctgt aacctcgaag cgtttcactt gtaacaacga 10680
ttgagaattt ttgtcataaa attgaaatac ttggttcgca tttttgtcat ccgcggtcag 10740
ccgcaattct gacgaactgc ccatttagct ggagatgatt gtacatcctt cacgtgaaaa 10800
tttctcaagc gctgtgaaca agggttcaga ttttagattg aaaggtgagc cgttgaaaca 10860
cgttcttctt gtcgatgacg acgtcgctat gcggcatctt attattgaat accttacgat 10920
ccacgccttc aaagtgaccg cggtagccga cagcacccag ttcacaagag tactctcttc 10980
cgcgacggtc gatgtcgtgg ttgttgatct aaatttaggt cgtgaagatg ggctcgagat 11040
cgttcgtaat ctggcggcaa agtctgatat tccaatcata attatcagtg gcgaccgcct 11100
tgaggagacg gataaagttg ttgcactcga gctaggagca agtgatttta tcgctaagcc 11160
gttcagtatc agagagtttc tagcacgcat tcgggttgcc ttgcgcgtgc gccccaacgt 11220
tgtccgctcc aaagaccgac ggtctttttg ttttactgac tggacactta atctcaggca 11280
acgtcgcttg atgtccgaag ctggcggtga ggtgaaactt acggcaggtg agttcaatct 11340
tctcctcgcg tttttagaga aaccccgcga cgttctatcg cgcgagcaac ttctcattgc 11400
cagtcgagta cgcgacgagg aggtttatga caggagtata gatgttctca ttttgaggct 11460
gcgccgcaaa cttgaggcag atccgtcaag ccctcaactg ataaaaacag caagaggtgc 11520
cggttatttc tttgacgcgg acgtgcaggt ttcgcacggg gggacgatgg cagcctgagc 11580
caattcccag atccccgagg aatcggcgtg agcggtcgca aaccatccgg cccggtacaa 11640
atcggcgcgg cgctgggtga tgacctggtg gagaagttga aggccgcgca ggccgcccag 11700
cggcaacgca tcgaggcaga agcacgcccc ggtgaatcgt ggcaagcggc cgctgatcga 11760
atccgcaaag aatcccggca accgccggca gccggtgcgc cgtcgattag gaagccgccc 11820
aagggcgacg agcaaccaga ttttttcgtt ccgatgctct atgacgtggg cacccgcgat 11880
agtcgcagca tcatggacgt ggccgttttc cgtctgtcga agcgtgaccg acgagctggc 11940
gaggtgatcc gctacgagct tccagacggg cacgtagagg tttccgcagg gccggccggc 12000
atggccagtg tgtgggatta cgacctggta ctgatggcgg tttcccatct aaccgaatcc 12060
atgaaccgat accgggaagg gaagggagac aagcccggcc gcgtgttccg tccacacgtt 12120
gcggacgtac tcaagttctg ccggcgagcc gatggcggaa agcagaaaga cgacctggta 12180
gaaacctgca ttcggttaaa caccacgcac gttgccatgc agcgtacgaa gaaggccaag 12240
aacggccgcc tggtgacggt atccgagggt gaagccttga ttagccgcta caagatcgta 12300
aagagcgaaa ccgggcggcc ggagtacatc gagatcgagc tagctgattg gatgtaccgc 12360
gagatcacag aaggcaagaa cccggacgtg ctgacggttc accccgatta ctttttgatc 12420
gatcccggca tcggccgttt tctctaccgc ctggcacgcc gcgccgcagg caaggcagaa 12480
gccagatggt tgttcaagac gatctacgaa cgcagtggca gcgccggaga gttcaagaag 12540
ttctgtttca ccgtgcgcaa gctgatcggg tcaaatgacc tgccggagta cgatttgaag 12600
gaggaggcgg ggcaggctgg cccgatccta gtcatgcgct accgcaacct gatcgagggc 12660
gaagcatccg ccggttccta atgtacggag cagatgctag ggcaaattgc cctagcaggg 12720
gaaaaaggtc gaaaaggtct ctttcctgtg gatagcacgt acattgggaa cccaaagccg 12780
tacattggga accggaaccc gtacattggg aacccaaagc cgtacattgg gaaccggtca 12840
cacatgtaag tgactgatat aaaagagaaa aaaggcgatt tttccgccta aaactcttta 12900
aaacttatta aaactcttaa aacccgcctg gcctgtgcat aactgtctgg ccagcgcaca 12960
gccgaagagc tgcaaaaagc gcctaccctt cggtcgctgc gctccctacg ccccgccgct 13020
tcgcgtcggc ctatcgcggc cgctggccgc tcaaaaatgg ctggcctacg gccaggcaat 13080
ctaccagggc gcggacaagc cgcgccgtcg ccactcgacc gccggcgctg aggtctgcct 13140
cgtgaagaag gtgttgctga ctcataccag gcctgaatcg ccccatcatc cagccagaaa 13200
gtgagggagc cacggttgat gagagctttg ttgtaggtgg accagttggt gattttgaac 13260
ttttgctttg ccacggaacg gtctgcgttg tcgggaagat gcgtgatctg atccttcaac 13320
tcagcaaaag ttcgatttat tcaacaaagc cgccgtcccg tcaagtcagc gtaatgctct 13380
gccagtgtta caaccaatta accaattctg attagaaaaa ctcatcgagc atcaaatgaa 13440
actgcaattt attcatatca ggattatcaa taccatattt ttgaaaaagc cgtttctgta 13500
atgaaggaga aaactcaccg aggcagttcc ataggatggc aagatcctgg tatcggtctg 13560
cgattccgac tcgtccaaca tcaatacaac ctattaattt cccctcgtca aaaataaggt 13620
tatcaagtga gaaatcacca tgagtgacga ctgaatccgg tgagaatggc aaaagctctg 13680
cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct 13740
tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac 13800
tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga 13860
gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat 13920
aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac 13980
ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct 14040
gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg 14100
ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg 14160
ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt 14220
cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg 14280
attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac 14340
ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga 14400
aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt 14460
gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt 14520
tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga 14580
ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttgatccgga attaattcct gtggttggca 14640
tgcacataca aatggacgaa cggataaacc ttttcacgcc cttttaaata tccgattatt 14700
ctaataaacg ctcttttctc ttaggtttac ccgccaatat atcctgtcaa acactgatag 14760
tttaaactga aggcgggaaa cgacaatctg atcatgagcg gagaattaag ggagtcacgt 14820
tatgaccccc gccgatgacg cgggacaagc cgttttacgt ttggaactga cagaaccgca 14880
acgctgcagg aattggccgc agcggccatt taaatcaatt gggcgcgccg aattcgagct 14940
cggtac 14946
<210> 16
<211> 14603
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: pNOV1435
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2007)
<223> synthetic nucleotide sequence encoding the toxin
portion of H04 plus the first 40 amino acids of
the Cry1Ab tail
<220>
<221> misc_feature
<222> Complement((8814)..(10022))
<223> PMI
<220>
<221> misc_feature
<222> (11142)..(12032)
<223> Maize ubiquitin promoter
<220>
<221> misc_feature
<222> (12037)..(14594)
<223> MTL promoter
<400> 16
atggacaaca accccaacat caacgagtgc atcccctaca actgcctgag caaccccgag 60
gtggaggtgc tgggcggcga gcgcatcgag accggctaca cccccatcga catcagcctg 120
agcctgaccc agttcctgct gagcgagttc gtgcccggcg ccggcttcgt gctgggcctg 180
gtggacatca tctggggcat cttcggcccc agccagtggg acgccttcct ggtgcagatc 240
gagcagttga taaaccaacg catagaggaa ttcgcccgca accaggccat cagccgcctg 300
gagggcctga gcaacctgta ccaaatctac gccgagagct tccgcgagtg ggaggccgac 360
cccaccaacc ccgccctgcg cgaggagatg cgcatccagt tcaacgacat gaacagcgcc 420
ctgaccaccg ccatccccct gttcgccgtg cagaactacc aggtgcccct gctgagcgtg 480
tacgtgcagg ccgccaacct gcacctgagc gtgctgcgcg acgtcagcgt gttcggccag 540
cgctggggct tcgacgccgc caccatcaac agccgctaca acgacctgac ccgcctgatc 600
ggcaactaca ccgaccacgc cgtgcgctgg tacaacaccg gcctggagcg cgtgtggggt 660
cccgacagcc gcgactggat caggtacaac cagttccgcc gcgagctgac cctgaccgtg 720
ctggacatcg tgagcctgtt ccccaactac gacagccgca cctaccccat ccgcaccgtg 780
agccagctga cccgcgagat ttacaccaac cccgtgctgg agaacttcga cggcagcttc 840
cgcggcagcg cccagggcat cgagggcagc atccgcagcc cccacctgat ggacatcctg 900
aacagcatca ccatctacac cgacgcccac cgcggcgagt actactggag cggccaccag 960
atcatggcca gccccgtcgg cttcagcggc cccgagttca ccttccccct gtacggcacc 1020
atgggcaacg ctgcacctca gcagcgcatc gtggcacagc tgggccaggg agtgtaccgc 1080
accctgagca gcaccctgta ccgtcgacct ttcaacatcg gcatcaacaa ccagcagctg 1140
agcgtgctgg acggcaccga gttcgcctac ggcaccagca gcaacctgcc cagcgccgtg 1200
taccgcaaga gcggcaccgt ggacagcctg gacgagatcc cccctcagaa caacaacgtg 1260
ccacctcgac agggcttcag ccaccgtctg agccacgtga gcatgttccg cagtggcttc 1320
agcaacagca gcgtgagcat catccgtgca cccatgttca gctggattca ccgcagcgcc 1380
accctgacca acaccatcga ccccgagcgc atcaaccaga tccccctggt gaagggcttc 1440
cgggtgtggg gcggcaccag cgtgatcacc ggccccggct tcaccggagg cgacatcctg 1500
cgcagaaaca ccttcggcga cttcgtgagc ctgcaggtga acatcaacag ccccatcacc 1560
cagcgttacc gcctgcgctt ccgctacgcc agcagccgcg acgcccgtgt gatcgtgctg 1620
actggcgccg ctagcaccgg tgtgggcggt caggtgagcg tgaacatgcc cctgcagaag 1680
actatggaga tcggcgagaa cctgactagt cgcaccttcc gctacaccga cttcagcaac 1740
cccttcagct tccgcgccaa ccccgacatc atcggcatca gcgagcagcc cctgttcggt 1800
gccggcagca tcagcagcgg cgagctgtac atcgacaaga tcgagatcat cctggccgac 1860
gccaccttcg aggccgagag cgacctggag cgcgcccaga aggccgtgaa cgccctgttc 1920
accagcagca accagatcgg cctgaagacc gacgtgaccg actaccacat cgaccaggtg 1980
agcaacctgg tggactgctt aagctagaga tctgttctgc acaaagtgga gtagtcagtc 2040
atcgatcagg aaccagacac cagactttta ttcatacagt gaagtgaagt gaagtgcagt 2100
gcagtgagtt gctggttttt gtaccactta gtatgtattt gtatttgtaa aatacttcta 2160
tcaataaaat ttctaattcc taaaaccaaa atccagtggg taccagcttg ggctgagtgg 2220
ctccttcaac gttgcggttc tgtcagttcc aaacgtaaaa cggcttgtcc cgcgtcatcg 2280
gcgggggtca taacgtgact cccttaattc tccgctcatg atcagattgt cgtttcccgc 2340
cttcagttta aactatcagt gtttgacagg atatattggc gggtaaacct aagagaaaag 2400
agcgtttatt agaataacgg atatttaaaa gggcgtgaaa aggtttatcc gttcgtccat 2460
ttgtatgtgc atgccaacca cagggttccc ctcgggagtg cttggcattc cgtacgataa 2520
tgacttctgt tcaaccaccc aaacgtcgga aagcctgacg acggagcagc attccaaaaa 2580
gatcccttgg ctcgtctggg tcggctagaa ggtcgagtgg gctgctgtgg cttgatccct 2640
caacgcggtc gcggacgtag cgcagcgccg aaaaatcctc gatcgcaaat ccgacgctgt 2700
cgaaaagcgt gatctgcttg tcgctctttc ggccgacgtc ctggccagtc atcacgcgcc 2760
aaagttccgt cacaggatga tctggcgcga gttgctggat ctcgccttca atccgggtct 2820
gtggcgggaa ctccacgaaa atatccgaac gcagcaagat cgtcgaccaa ttcttgaaga 2880
cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct 2940
tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc 3000
taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa 3060
tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt 3120
gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct 3180
gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc 3240
cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta 3300
tgtggcgcgg tattatcccg tgttgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac 3360
tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc 3420
atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac 3480
ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg 3540
gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac 3600
gagcgtgaca ccacgatgcc tgcagggggg gggggggggg ggacatgagg ttgccccgta 3660
ttcagtgtcg ctgatttgta ttgtctgaag ttgtttttac gttaagttga tgcagatcaa 3720
ttaatacgat acctgcgtca taattgatta tttgacgtgg tttgatggcc tccacgcacg 3780
ttgtgatatg tagatgataa tcattatcac tttacgggtc ctttccggtg atccgacagg 3840
ttacggggcg gcgacctcgc gggttttcgc tatttatgaa aattttccgg tttaaggcgt 3900
ttccgttctt cttcgtcata acttaatgtt tttatttaaa ataccctctg aaaagaaagg 3960
aaacgacagg tgctgaaagc gaggcttttt ggcctctgtc gtttcctttc tctgtttttg 4020
tccgtggaat gaacaatgga agtccccccc cccccccccc cctgcagcaa tggcaacaac 4080
gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga 4140
ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg 4200
gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact 4260
ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac 4320
tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta 4380
actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt 4440
taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga 4500
gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc 4560
tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt 4620
ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc 4680
gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc 4740
tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg 4800
cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg 4860
gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga 4920
actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc 4980
ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg 5040
gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg 5100
atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt 5160
tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc 5220
tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg 5280
aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcctga tgcggtattt 5340
tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg tgcactctca gtacaatctg 5400
ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat cgctacgtga ctgggtcatg 5460
gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg 5520
gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca 5580
ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagcag atcccccgat caagtagata cactacatat 5640
atctacaata gacatcgagc cggaaggtga tgtttacttt cctgaaatcc ccagcaattt 5700
taggccagtt tttacccaag acttcgcctc taacataaat tatagttacc aaatctggca 5760
aaagggttaa caagtggcag caacggattc gcaaacctgt cacgcctttt gtgccaaaag 5820
ccgcgccagg tttgcgatcc gctgtgccag gcgttaggcg tcatatgaag atttcggtga 5880
tccctgagca ggtggcggaa acattggatg ctgagaacca tttcattgtt cgtgaagtgt 5940
tcgatgtgca cctatccgac caaggctttg aactatctac cagaagtgtg agcccctacc 6000
ggaaggatta catctcggat gatgactctg atgaagactc tgcttgctat ggcgcattca 6060
tcgaccaaga gcttgtcggg aagattgaac tcaactcaac atggaacgat ctagcctcta 6120
tcgaacacat tgttgtgtcg cacacgcacc gaggcaaagg agtcgcgcac agtctcatcg 6180
aatttgcgaa aaagtgggca ctaagcagac agctccttgg catacgatta gagacacaaa 6240
cgaacaatgt acctgcctgc aatttgtacg caaaatgtgg ctttactctc ggcggcattg 6300
acctgttcac gtataaaact agacctcaag tctcgaacga aacagcgatg tactggtact 6360
ggttctcggg agcacaggat gacgcctaac aattcattca agccgacacc gcttcgcggc 6420
gcggcttaat tcaggagtta aacatcatga gggaagcggt gatcgccgaa gtatcgactc 6480
aactatcaga ggtagttggc gtcatcgagc gccatctcga accgacgttg ctggccgtac 6540
atttgtacgg ctccgcagtg gatggcggcc tgaagccaca cagtgatatt gatttgctgg 6600
ttacggtgac cgtaaggctt gatgaaacaa cgcggcgagc tttgatcaac gaccttttgg 6660
aaacttcggc ttcccctgga gagagcgaga ttctccgcgc tgtagaagtc accattgttg 6720
tgcacgacga catcattccg tggcgttatc cagctaagcg cgaactgcaa tttggagaat 6780
ggcagcgcaa tgacattctt gcaggtatct tcgagccagc cacgatcgac attgatctgg 6840
ctatcttgct gacaaaagca agagaacata gcgttgcctt ggtaggtcca gcggcggagg 6900
aactctttga tccggttcct gaacaggatc tatttgaggc gctaaatgaa accttaacgc 6960
tatggaactc gccgcccgac tgggctggcg atgagcgaaa tgtagtgctt acgttgtccc 7020
gcatttggta cagcgcagta accggcaaaa tcgcgccgaa ggatgtcgct gccgactggg 7080
caatggagcg cctgccggcc cagtatcagc ccgtcatact tgaagctagg caggcttatc 7140
ttggacaaga agatcgcttg gcctcgcgcg cagatcagtt ggaagaattt gttcactacg 7200
tgaaaggcga gatcaccaag gtagtcggca aataatgtct aacaattcgt tcaagccgac 7260
gccgcttcgc ggcgcggctt aactcaagcg ttagagagct ggggaagact atgcgcgatc 7320
tgttgaaggt ggttctaagc ctcgtacttg cgatggcatc ggggcaggca cttgctgacc 7380
tgccaattgt tttagtggat gaagctcgtc ttccctatga ctactcccca tccaactacg 7440
acatttctcc aagcaactac gacaactcca taagcaatta cgacaatagt ccatcaaatt 7500
acgacaactc tgagagcaac tacgataata gttcatccaa ttacgacaat agtcgcaacg 7560
gaaatcgtag gcttatatat agcgcaaatg ggtctcgcac tttcgccggc tactacgtca 7620
ttgccaacaa tgggacaacg aacttctttt ccacatctgg caaaaggatg ttctacaccc 7680
caaaaggggg gcgcggcgtc tatggcggca aagatgggag cttctgcggg gcattggtcg 7740
tcataaatgg ccaattttcg cttgccctga cagataacgg cctgaagatc atgtatctaa 7800
gcaactagcc tgctctctaa taaaatgtta ggcctcaaca tctagtcgca agctgagggg 7860
aaccactagt gtcatacgaa cctccaagag acggttacac aaacgggtac attgttgatg 7920
tcatgtatga caatcgccca agtaagtatc cagctgtgtt cagaacgtac gtccgaatta 7980
attcatcggg gtacggtcga cgatcgtcaa cgttcacttc taaagaaata gcgccactca 8040
gcttcctcag cggctttatc cagcgatttc ctattatgtc ggcatagttc tcaagatcga 8100
cagcctgtca cggttaagcg agaaatgaat aagaaggctg ataattcgga tctctgcgag 8160
ggagatgata tttgatcaca ggcagcaacg ctctgtcatc gttacaatca acatgctacc 8220
ctccgcgaga tcatccgtgt ttcaaacccg gcagcttagt tgccgttctt ccgaatagca 8280
tcggtaacat gagcaaagtc tgccgcctta caacggctct cccgctgacg ccgtcccgga 8340
ctgatgggct gcctgtatcg agtggtgatt ttgtgccgag ctgccggtcg gggagctgtt 8400
ggctggctgg tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata 8460
acacattgcg gacgttttta atgtactgaa ttgtctagac ccggggatct catgtttgac 8520
agcttatcat cggatctagt aacatagatg acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg 8580
cgcgctatat tttgttttct atcgcgtatt aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa 8640
aaacccatct cataaataac gtcatgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat 8700
tcaacagaaa ttagatgata atcatcgcaa gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac 8760
tttattgcca aatgtttgaa cgatctctgc aggtcgacgg atcgagctcc cagcttagca 8820
agagatgtta attttttcag taagctctta cagcttgttg taaacacgcg ctaaacggcc 8880
gtggcctttg acagtcaccg gtgattcgtt ggcggcaata aacgctgatt cacccggttt 8940
aagctgtaac tgctgagaac ctttccacaa cgttgcatcg ccttcgacgc agaacaaaat 9000
ggcggcactc tgctggctaa tggtggtttc tttatcacta aggtcatgca gcgagaaggc 9060
aaaatcatcc actggaatcg ggaagtccag ttctgcacct tgtttcaccg gctgggtcaa 9120
caactggtta gccggtttgg cttcgaattt cacattggca accagttccg gaatatcaat 9180
gtatttaggc gtcagacccg cacgcagcac gttatcggag tttgccatca cttccagcgc 9240
cacgccttgc aggtaagcgt gcggtgtttc agcgaacagg aacatcgctt cgccagggtt 9300
caatttcacc acattcagca atagcgggga gaacagaccg ctgtcttccg ggtaaaattc 9360
agaaattaaa cgaatcgttt gccacggttc accctgctgg ctatcgaggg ccgattttaa 9420
aatcgccagc gcgcgggatt tttcttcacc ctgcatattc aacaggctgg cgaacagttc 9480
gcttaaacgt tcggcatcag gctgttgtaa aaagtgagca atcgccggat gtgcacctgc 9540
gaccggctgg agtagggaga caatctcgga aaattcacga aacgcgttca tcgcaaggaa 9600
aggcgtcagc gcaaaaacca gctccggctt gtggttagga tctttatagt tacgctcggc 9660
ggcatccatc gggatacctg cggcattttc tttggcaaaa ccgatttcag aattgtgttt 9720
gtttggatga acctgaatgg agagtggctg tgctgcgcat aatactttga acaggaaagg 9780
cagttcgcca aagcgtttgg caacggcctc tccgagcaga gtcgatttat cactctcaat 9840
cacatcacgc agtgaaacga tatctccggc ggcattctgc actcgtgaac tgcttttcgg 9900
atgtgcgccc atccacagct cggccatcgg ctggctggac ggattttcca taccataaag 9960
ttcagtcaac gcgttttgct gccccaggca tagttttgca ctgagttaat gagtttttgc 10020
atgatcgggg atccctgcag aagtaacacc aaacaacagg gtgagcatcg acaaaagaaa 10080
cagtaccaag caaataaata gcgtatgaag gcagggctaa aaaaatccac atatagctgc 10140
tgcatatgcc atcatccaag tatatcaaga tcaaaataat tataaaacat acttgtttat 10200
tataatagat aggtactcaa ggttagagca tatgaataga tgctgcatat gccatcatgt 10260
atatgcatca gtaaaaccca catcaacatg tatacctatc ctagatcgat atttccatcc 10320
atcttaaact cgtaactatg aagatgtatg acacacacat acagttccaa aattaataaa 10380
tacaccaggt agtttgaaac ggcgtctact ccgatctaga acgaatgaac gaccgcccaa 10440
ccacaccaca tcatcacaac caagcgaaca aaaagcatct ctgtatatgc atcagtaaaa 10500
cccgcatcaa catgtatacc tatcctagat cgatatttcc atccatcatc ttcaattcgt 10560
aactatgaat atgtatggca cacacataca gatccaaaat taataaatcc accaggtagt 10620
ttgaaacaga attctactcc gatctagaac gaccgcccaa ccagaccaca tcatcacaac 10680
caagacaaaa aaaagcatga aaagatgacc cgacaaacaa gtgcacggca tatattgaaa 10740
taaaggaaaa gggcaaacca aaccctatgc aacgaaacaa aaaaaatcat gaaatcgatc 10800
ccgtctgcgg aacggctaga gccatcccag gattccccaa agagaaacac tggcaagtta 10860
gcaatcagaa cgtgtctgac gtacaggtcg catccgtgta cgaacgctag cagcacggat 10920
ctaacacaaa cacggatcta acacaaacat gaacagaagt agaactaccg ggccctaacc 10980
atggaccgga acgccgatct agagaaggta gagagggggg gggggggagg acgagcggcg 11040
taccttgaag cggaggtgcc gacgggtgga tttgggggag atctggttgt gtgtgtgtgc 11100
gctccgaaca acacgaggtt ggggaaagag ggtgtggagg gggtgtctat ttattacggc 11160
gggcgaggaa gggaaagcga aggagcggtg ggaaaggaat cccccgtagc tgccgtgccg 11220
tgagaggagg aggaggccgc ctgccgtgcc ggctcacgtc tgccgctccg ccacgcaatt 11280
tctggatgcc gacagcggag caagtccaac ggtggagcgg aactctcgag aggggtccag 11340
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cgctggttgg tgtccgttag actcgtcgac ggcgtttaac aggctggcat tatctactcg 11460
aaacaagaaa aatgtttcct tagttttttt aatttcttaa agggtatttg tttaattttt 11520
agtcacttta ttttattcta ttttatatct aaattattaa ataaaaaaac taaaatagag 11580
ttttagtttt cttaatttag aggctaaaat agaataaaat agatgtacta aaaaaattag 11640
tctataaaaa ccattaaccc taaaccctaa atggatgtac taataaaatg gatgaagtat 11700
tatataggtg aagctatttg caaaaaaaaa ggagaacaca tgcacactaa aaagataaaa 11760
ctgtagagtc ctgttgtcaa aatactcaat tgtcctttag accatgtcta actgttcatt 11820
tatatgattc tctaaaacac tgatattatt gtagtactat agattatatt attcgtagag 11880
taaagtttaa atatatgtat aaagatagat aaactgcact tcaaacaagt gtgacaaaaa 11940
aaatatgtgg taatttttta taacttagac atgcaatgct cattatctct agagaggggc 12000
acgaccgggt cacgctgcac tgcaggcatg caagcttgca catgacaaca attgtaagag 12060
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tcctctaaca tgccttaatt tgcaaatttg gtataactac tgattgaaaa tatatgtatg 12240
taaaaaaata ctaagcatat ttgtgaagct aaacatgatg ttatttaaga aaatatgttg 12300
ttaacagaat aagattaata tcgaaatgga aacatctgta aattagaatc atcttacaag 12360
ctaagagatg ttcacgcttt gagaaacttc ttcagatcat gaccgtagaa gtagctctcc 12420
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gtcgccgcta taaacacgga taactcaatt ccctgctcca tcaatttaga aatgagcaag 12540
caagcacccg atcgctcacc ccatatgcac caatctgact cccaagtctc tgtttcgcat 12600
tagtaccgcc agcactccac ctatagctac caattgagac ctttccagcc taagcagatc 12660
gattgatcgt tagagtcaaa gagttggtgg tacgggtact ttaactacca tggaatgatg 12720
gggcgtgatg tagagcggaa agcgcctccc tacgcggaac aacaccctcg ccatgccgct 12780
cgactacagc ctcctcctcg tcggccgccc acaacgaggg agcccgtggt cgcagccacc 12840
gaccagcatg tctctgtgtc ctcgtccgac ctcgacatgt catggcaaac agtcggacgc 12900
cagcaccaga ctgacgacat gagtctctga agagcccgcc acctagaaag atccgagccc 12960
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gacgcggagt tcacaggtcc tatccttgca tcgctcgggc cggagtttac gggacttatc 13140
cttacgacgt gctctaaggt tgcgataacg ggcggaggaa ggcgtgtggc gtgcggagac 13200
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cgaaggttag tggaggagga ggacacacta aaatcaggac gcaagaaact cttctattat 13320
agtagtagag aagagattat aggagtgtgg gttgattcta aagaaaatcg acgcaggaca 13380
accgtcaaaa cgggtgcttt aatatagtag atatatatat atagagagag agagaaagta 13440
caaaggatgc atttgtgtct gcatatgatc ggagtattac taacggccgt cgtaagaagg 13500
tccatcatgc gtggagcgag cccatttggt tggttgtcag gccgcagtta aggcctccat 13560
atatgattgt cgtcgggccc ataacagcat ctcctccacc agtttattgt aagaataaat 13620
taagtagaga tatttgtcgt cgggcagaag aaacttggac aagaagaaga agcaagctag 13680
gccaatttct tgccggcaag aggaagatag tggcctctag tttatatatc ggcgtgatga 13740
tgatgctcct agctagaaat gagagaagaa aaacggacgc gtgtttggtg tgtgtcaatg 13800
gcgtccatcc ttccatcaga tcagaacgat gaaaaagtca agcacggcat gcatagtata 13860
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ttcagtggct gtagctttca ggctgaaaga gacgtggcat gcaataattc agggaattcg 13980
tcagccaatt gaggtagcta gtcaacttgt acattggtgc gagcaatttt ccgcactcag 14040
gagggctagt ttgagagtcc aaaaactata ggagattaaa gaggctaaaa tcctctcctt 14100
atttaatttt aaataagtag tgtatttgta ttttaactcc tccaaccctt ccgattttat 14160
ggctctcaaa ctagcattca gtctaatgca tgcatgcttg gctagaggtc gtatggggtt 14220
gttaatagca tagctagcta caagttaacc gggtctttta tatttaataa ggacaggcaa 14280
agtattactt acaaataaag aataaagcta ggacgaactc gtggattatt actaaatcga 14340
aatggacgta atattccagg caagaataat tgttcgatca ggagacaagt ggggcattgg 14400
accggttctt gcaagcaaga gcctatggcg tggtgacacg gcgcgttgcc catacatcat 14460
gcctccatcg atgatccatc ctcacttgct ataaaaagag gtgtccatgg tgctcaagct 14520
cagccaagca aataagacga cttgtttcat tgattcttca agagatcgag cttcttttgc 14580
accacaaggt cgaggatcca aca 14603
<210> 17
<211> 11127
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: pZU578
<220>
<221> misc_feature
<222> (1485)..(3491)
<223> synthetic nucleotide sequence encoding the toxin
portion of H04 plus the first 40 amino acids of
the Cry1Ab tail
<220>
<221> misc_feature
<222> (5052)..(6271)
<223> PMI
<220>
<221> misc_feature
<222> (3859)..(5030)
<223> SMAS promoter
<220>
<221> misc_feature
<222> (56)..(1475)
<223> Actin 2 promoter U41998
<400> 17
ggccgcagcg gccatttaaa tcaattgggc gcgccgaatt cgagctcggt accctgcatg 60
cctgcaggtc gacaaaattt agaacgaact taattatgat ctcaaataca ttgatacata 120
tctcatctag atctaggtta tcattatgta agaaagtttt gacgaatatg gcacgacaaa 180
atggctagac tcgatgtaat tggtatctca actcaacatt atacttatac caaacattag 240
ttagacaaaa tttaaacaac tattttttat gtatgcaaga gtcagcatat gtataattga 300
ttcagaatcg ttttgacgag ttcggatgta gtagtagcca ttatttaatg tacatactaa 360
tcgtgaatag tgaatatgat gaagcattgt atcttattgt ataaatatcc ataaacacat 420
catgaaagac actttctttc acggtctgaa ttaattatga cacaattcta atagaaaacg 480
aattaaatta cgttgaattg tatgaaatct aattgaacaa gccaaccacg acgacgacta 540
acgttgcctg gattgactcg gtttaagtta accactaaaa aaacggagct gtcatgtaac 600
acgcggatcg agcaggtcac agtcatgaag ccatcaaagc aaaagaacta atccaagggc 660
tgagatgatt aattagttta aaaattagtt aacacgaggg aaaaggctgt ctgacagcca 720
ggtcacgtta tctttacctg tggtcgaaat gattcgtgtc tgtcgatttt aattattttt 780
ttgaaaggcc gaaaataaag ttgtaagaga taaacccgcc tatataaatt catatatttt 840
cctctccgct ttgaattgtc tcgttgtcct cctcactttc atcagccgtt ttgaatctcc 900
ggcgacttga cagagaagaa caaggaagaa gactaagaga gaaagtaaga gataatccag 960
gagattcatt ctccgttttg aatcttcctc aatctcatct tcttccgctc tttctttcca 1020
aggtaatagg aactttctgg atctacttta tttgctggat ctcgatcttg ttttctcaat 1080
ttccttgaga tctggaattc gtttaatttg gatctgtgaa cctccactaa atcttttggt 1140
tttactagaa tcgatctaag ttgaccgatc agttagctcg attatagcta ccagaatttg 1200
gcttgacctt gatggagaga tccatgttca tgttacctgg gaaatgattt gtatatgtga 1260
attgaaatct gaactgttga agttagattg aatctgaaca ctgtcaatgt tagattgaat 1320
ctgaacactg tttaagttag atgaagtttg tgtatagatt cttcgaaact ttaggatttg 1380
tagtgtcgta cgttgaacag aaagctattt ctgattcaat cagggtttat ttgactgtat 1440
tgaactcttt ttgtgtgttt gcagctcata aaaaggatcc aacaatggac aacaacccca 1500
acatcaacga gtgcatcccc tacaactgcc tgagcaaccc cgaggtggag gtgctgggcg 1560
gcgagcgcat cgagaccggc tacaccccca tcgacatcag cctgagcctg acccagttcc 1620
tgctgagcga gttcgtgccc ggcgccggct tcgtgctggg cctggtggac atcatctggg 1680
gcatcttcgg ccccagccag tgggacgcct tcctggtgca gatcgagcag ttgataaacc 1740
aacgcataga ggaattcgcc cgcaaccagg ccatcagccg cctggagggc ctgagcaacc 1800
tgtaccaaat ctacgccgag agcttccgcg agtgggaggc cgaccccacc aaccccgccc 1860
tgcgcgagga gatgcgcatc cagttcaacg acatgaacag cgccctgacc accgccatcc 1920
ccctgttcgc cgtgcagaac taccaggtgc ccctgctgag cgtgtacgtg caggccgcca 1980
acctgcacct gagcgtgctg cgcgacgtca gcgtgttcgg ccagcgctgg ggcttcgacg 2040
ccgccaccat caacagccgc tacaacgacc tgacccgcct gatcggcaac tacaccgacc 2100
acgccgtgcg ctggtacaac accggcctgg agcgcgtgtg gggtcccgac agccgcgact 2160
ggatcaggta caaccagttc cgccgcgagc tgaccctgac cgtgctggac atcgtgagcc 2220
tgttccccaa ctacgacagc cgcacctacc ccatccgcac cgtgagccag ctgacccgcg 2280
agatttacac caaccccgtg ctggagaact tcgacggcag cttccgcggc agcgcccagg 2340
gcatcgaggg cagcatccgc agcccccacc tgatggacat cctgaacagc atcaccatct 2400
acaccgacgc ccaccgcggc gagtactact ggagcggcca ccagatcatg gccagccccg 2460
tcggcttcag cggccccgag ttcaccttcc ccctgtacgg caccatgggc aacgctgcac 2520
ctcagcagcg catcgtggca cagctgggcc agggagtgta ccgcaccctg agcagcaccc 2580
tgtaccgtcg acctttcaac atcggcatca acaaccagca gctgagcgtg ctggacggca 2640
ccgagttcgc ctacggcacc agcagcaacc tgcccagcgc cgtgtaccgc aagagcggca 2700
ccgtggacag cctggacgag atcccccctc agaacaacaa cgtgccacct cgacagggct 2760
tcagccaccg tctgagccac gtgagcatgt tccgcagtgg cttcagcaac agcagcgtga 2820
gcatcatccg tgcacccatg ttcagctgga ttcaccgcag cgccaccctg accaacacca 2880
tcgaccccga gcgcatcaac cagatccccc tggtgaaggg cttccgggtg tggggcggca 2940
ccagcgtgat caccggcccc ggcttcaccg gaggcgacat cctgcgcaga aacaccttcg 3000
gcgacttcgt gagcctgcag gtgaacatca acagccccat cacccagcgt taccgcctgc 3060
gcttccgcta cgccagcagc cgcgacgccc gtgtgatcgt gctgactggc gccgctagca 3120
ccggtgtggg cggtcaggtg agcgtgaaca tgcccctgca gaagactatg gagatcggcg 3180
agaacctgac tagtcgcacc ttccgctaca ccgacttcag caaccccttc agcttccgcg 3240
ccaaccccga catcatcggc atcagcgagc agcccctgtt cggtgccggc agcatcagca 3300
gcggcgagct gtacatcgac aagatcgaga tcatcctggc cgacgccacc ttcgaggccg 3360
agagcgacct ggagcgcgcc cagaaggccg tgaacgccct gttcaccagc agcaaccaga 3420
tcggcctgaa gaccgacgtg accgactacc acatcgacca ggtgagcaac ctggtggact 3480
gcttaagcta gagatcctct agagtcgacc atggtgatca ctgcagatcg ttcaaacatt 3540
tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa 3600
tttctgttga attacgttaa gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac gttatttatg 3660
agatgggttt ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa 3720
atatagcgcg caacctagga taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt actagatctc 3780
tagaaagctt cgtacgttaa ttaattcgaa tccggagcgg ccgcagggct agcatcgatg 3840
gtaccgagct cgagactata caggccaaat tcgctcttag ccgtacaata ttactcaccg 3900
gtgcgatgcc ccccatcgta ggtgaaggtg gaaattaatg atccatcttg agaccacagg 3960
cccacaacag ctaccagttt cctcaagggt ccaccaaaaa cgtaagcgct tacgtacatg 4020
gtcgataaga aaaggcaatt tgtagatgtt aacatccaac gtcgctttca gggatcccga 4080
attccaagct tggaattcgg gatcctacag gccaaattcg ctcttagccg tacaatatta 4140
ctcaccggtg cgatgccccc catcgtaggt gaaggtggaa attaatgatc catcttgaga 4200
ccacaggccc acaacagcta ccagtttcct caagggtcca ccaaaaacgt aagcgcttac 4260
gtacatggtc gataagaaaa ggcaatttgt agatgttaac atccaacgtc gctttcaggg 4320
atcccgaatt ccaagcttgg aattcgggat cctacaggcc aaattcgctc ttagccgtac 4380
aatattactc accggtgcga tccccccatc gtaggtgaag gtggaaatta atgatccatc 4440
ttgagaccac aggcccacaa cagctaccag tttcctcaag ggtccaccaa aaacgtaagc 4500
gcttacgtac atggtcgata agaaaaggca atttgtagat gttaacatcc aacgtcgctt 4560
tcagggatcc cgaattccaa gcttgggctg caggtcaatc ccattgcttt tgaagcagct 4620
caacattgat ctctttctcg agggagattt ttcaaatcag tgcgcaagac gtgacgtaag 4680
tatccgagtc agtttttatt tttctactaa tttggtcgtt tatttcggcg tgtaggacat 4740
ggcaaccggg cctgaatttc gcgggtattc tgtttctatt ccaacttttt cttgatccgc 4800
agccattaac gacttttgaa tagatacgct gacacgccaa gcctcgctag tcaaaagtgt 4860
accaaacaac gctttacagc aagaacggaa tgcgcgtgac gctcgcggtg acgccatttc 4920
gccttttcag aaatggataa atagccttgc ttcctattat atcttcccaa attaccaata 4980
cattacacta gcatctgaat ttcataacca atctcgatac accaaatcga gatctgcagg 5040
gatccccgat catgcaaaaa ctcattaact cagtgcaaaa ctatgcctgg ggcagcaaaa 5100
cggcgttgac tgaactttat ggtatggaaa atccgtccag ccagccgatg gccgagctgt 5160
ggatgggcgc acatccgaaa agcagttcac gagtgcagaa tgccgccgga gatatcgttt 5220
cactgcgtga tgtgattgag agtgataaat cgactctgct cggagaggcc gttgccaaac 5280
gctttggcga actgcctttc ctgttcaaag tattatgcgc agcacagcca ctctccattc 5340
aggttcatcc aaacaaacac aattctgaaa tcggttttgc caaagaaaat gccgcaggta 5400
tcccgatgga tgccgccgag cgtaactata aagatcctaa ccacaagccg gagctggttt 5460
ttgcgctgac gcctttcctt gcgatgaacg cgtttcgtga attttccgag attgtctccc 5520
tactccagcc ggtcgcaggt gcacatccgg cgattgctca ctttttacaa cagcctgatg 5580
ccgaacgttt aagcgaactg ttcgccagcc tgttgaatat gcagggtgaa gaaaaatccc 5640
gcgcgctggc gattttaaaa tcggccctcg atagccagca gggtgaaccg tggcaaacga 5700
ttcgtttaat ttctgaattt tacccggaag acagcggtct gttctccccg ctattgctga 5760
atgtggtgaa attgaaccct ggcgaagcga tgttcctgtt cgctgaaaca ccgcacgctt 5820
acctgcaagg cgtggcgctg gaagtgatgg caaactccga taacgtgctg cgtgcgggtc 5880
tgacgcctaa atacattgat attccggaac tggttgccaa tgtgaaattc gaagccaaac 5940
cggctaacca gttgttgacc cagccggtga aacaaggtgc agaactggac ttcccgattc 6000
cagtggatga ttttgccttc tcgctgcatg accttagtga taaagaaacc accattagcc 6060
agcagagtgc cgccattttg ttctgcgtcg aaggcgatgc aacgttgtgg aaaggttctc 6120
agcagttaca gcttaaaccg ggtgaatcag cgtttattgc cgccaacgaa tcaccggtga 6180
ctgtcaaagg ccacggccgt ttagcgcgtg tttacaacaa gctgtaagag cttactgaaa 6240
aaattaacat ctcttgctaa gctgggagct cgtcgacgga tcgaattcct gcagatcgtt 6300
caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta 6360
tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt 6420
tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag 6480
aaaacaaaat atagcgcgca acctaggata aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac 6540
tagatctcta gaactagtgg atctgctagc cctgcaggaa atttaccggt gcccgggcgg 6600
ccagcatggc cgtatccgca atgtgttatt aagttgtcta agcgtcaatt tgtttacacc 6660
acaatatatc ctgccaccag ccagccaaca gctccccgac cggcagctcg gcacaaaatc 6720
accactcgat acaggcagcc catcagaatt aattctcatg tttgacagct tatcatcgac 6780
tgcacggtgc accaatgctt ctggcgtcag gcagccatcg gaagctgtgg tatggctgtg 6840
caggtcgtaa atcactgcat aattcgtgtc gctcaaggcg cactcccgtt ctggataatg 6900
ttttttgcgc cgacatcata acggttctgg caaatattct gaaatgagct gttgacaatt 6960
aatcatcggc tcgtataatg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac acaggaaaca 7020
gaccatgagg gaagcggtga tcgccgaagt atcgactcaa ctatcagagg tagttggcgt 7080
catcgagcgc catctcgaac cgacgttgct ggccgtacat ttgtacggct ccgcagtgga 7140
tggcggcctg aagccacaca gtgatattga tttgctggtt acggtgaccg taaggcttga 7200
tgaaacaacg cggcgagctt tgatcaacga ccttttggaa acttcggctt cccctggaga 7260
gagcgagatt ctccgcgctg tagaagtcac cattgttgtg cacgacgaca tcattccgtg 7320
gcgttatcca gctaagcgcg aactgcaatt tggagaatgg cagcgcaatg acattcttgc 7380
aggtatcttc gagccagcca cgatcgacat tgatctggct atcttgctga caaaagcaag 7440
agaacatagc gttgccttgg taggtccagc ggcggaggaa ctctttgatc cggttcctga 7500
acaggatcta tttgaggcgc taaatgaaac cttaacgcta tggaactcgc cgcccgactg 7560
ggctggcgat gagcgaaatg tagtgcttac gttgtcccgc atttggtaca gcgcagtaac 7620
cggcaaaatc gcgccgaagg atgtcgctgc cgactgggca atggagcgcc tgccggccca 7680
gtatcagccc gtcatacttg aagctaggca ggcttatctt ggacaagaag atcgcttggc 7740
ctcgcgcgca gatcagttgg aagaatttgt tcactacgtg aaaggcgaga tcaccaaggt 7800
agtcggcaaa taaagctcta gtggatcccc gaggaatcgg cgtgacggtc gcaaaccatc 7860
cggcccggta caaatcggcg cggcgctggg tgatgacctg gtggagaagt tgaaggccgc 7920
gcaggccgcc cagcggcaac gcatcgaggc agaagcacgc cccggtgaat cgtggcaagc 7980
ggccgctgat cgaatccgca aagaatcccg gcaaccgccg gcagccggtg cgccgtcgat 8040
taggaagccg cccaagggcg acgagcaacc agattttttc gttccgatgc tctatgacgt 8100
gggcacccgc gatagtcgca gcatcatgga cgtggccgtt ttccgtctgt cgaagcgtga 8160
ccgacgagct ggcgaggtga tccgctacga gcttccagac gggcacgtag aggtttcagc 8220
agggccggcc ggcatggcca gtgtgtggga ttacgacctg gtactgatgg cggtttccca 8280
tctaaccgaa tccatgaacc gataccggga agggaaggga gacaagcccg gccgcgtgtt 8340
ccgtccacac gttgcggacg tactcaagtt ctgccggcga gccgatggcg gaaagcagaa 8400
agacgacctg gtagaaacct gcattcggtt aaacaccacg cacgttgcca tgcagcgtac 8460
gaagaaggcc aagaacggcc gcctggtgac ggtatccgag ggtgaagcct tgattagccg 8520
ctacaagatc gtaaagagcg aaaccgggcg gccggagtac atcgagatcg agctagctga 8580
ttggatgtac cgcgagatca cagaaggcaa gaacccggac gtgctgacgg ttcaccccga 8640
ttactttttg atcgatcccg gcatcggccg ttttctctac cgcctggcac gccgcgccgc 8700
aggcaaggca gaagccagat ggttgttcaa gacgatctac gaacgcagtg gcagcgccgg 8760
agagttcaag aagttctgtt tcaccgtgcg caagctgatc gggtcaaatg acctgccgga 8820
gtacgatttg aaggaggagg cggggcaggc tggcccgatc ctagtcatgc gctaccgcaa 8880
cctgatcgag ggcgaagcat ccgccggttc ctaatgtacg gagcagatgc tagggcaaat 8940
tgccctagca ggggaaaaag gtcgaaaagg tctctttcct gtggatagca cgtacattgg 9000
gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggaa cccgtacatt gggaacccaa agccgtacat 9060
tgggaaccgg tcacacatgt aagtgactga tataaaagag aaaaaaggcg atttttccgc 9120
ctaaaactct ttaaaactta ttaaaactct taaaacccgc ctggcctgtg cataactgtc 9180
tggccagcgc acagccgaag agctgcaaaa agcgcctacc cttcggtcgc tgcgctccct 9240
acgccccgcc gcttcgcgtc ggcctatcgc ggccgctggc cgctcaaaaa tggctggcct 9300
acggccaggc aatctaccag ggcgcggaca agccgcgccg tcgccactcg accgccggcg 9360
ctgaggtctg cctcgtgaag aaggtgttgc tgactcatac caggcctgaa tcgccccatc 9420
atccagccag aaagtgaggg agccacggtt gatgagagct ttgttgtagg tggaccagtt 9480
ggtgattttg aacttttgct ttgccacgga acggtctgcg ttgtcgggaa gatgcgtgat 9540
ctgatccttc aactcagcaa aagttcgatt tattcaacaa agccgccgtc ccgtcaagtc 9600
agcgtaatgc tctgccagtg ttacaaccaa ttaaccaatt ctgattagaa aaactcatcg 9660
agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata tttttgaaaa 9720
agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc 9780
tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa tttcccctcg 9840
tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat 9900
ggcaaaagct ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg 9960
gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc 10020
ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg 10080
aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct 10140
ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca 10200
gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct 10260
cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc 10320
gggaagcgtg gcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt 10380
tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc 10440
cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc 10500
cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg 10560
gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc 10620
agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag 10680
cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga 10740
tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat 10800
tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttgatcc ggaattaatt 10860
cctgtggttg gcatgcacat acaaatggac gaacggataa accttttcac gcccttttaa 10920
atatccgatt attctaataa acgctctttt ctcttaggtt tacccgccaa tatatcctgt 10980
caaacactga tagtttaaac tgaaggcggg aaacgacaat ctgatcatga gcggagaatt 11040
aagggagtca cgttatgacc cccgccgatg acgcgggaca agccgtttta cgtttggaac 11100
tgacagaacc gcaacgctgc aggaatt 11127
Claims (59)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 서열번호 5, 7 및 9로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 하이브리드 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 독소를 암호화하는 합성 뉴클레오타이드 서열.
- 삭제
- 제10항에 있어서, 상기 하이브리드 독소가 서열번호 6, 8 및 10으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 합성 뉴클레오타이드 서열.
- 삭제
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- 서열번호 5, 7, 9, 12, 13, 14, 15, 16 및 17로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 갖는, 하이브리드 바실러스 튜린지엔시스 독소를 암호화하는 분리된 핵산 분자.
- 삭제
- 삭제
- 제10항 또는 제12항의 합성 뉴클레오타이드 서열 또는 제43항의 핵산 분자에 작동적으로 연결된 이종 프로모터 서열을 포함하는 키메라 유전자.
- 제46항의 키메라 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
- 삭제
- 제46항의 키메라 유전자 또는 제47항의 재조합 벡터를 포함하는 형질전환 식물 세포.
- 삭제
- 제49항에 있어서, 옥수수, 면화, 벼 또는 양배추로부터 유래하는 형질전환 식물 세포.
- 삭제
- 해충을 제46항의 키메라 유전자 또는 제47항의 벡터를 함유하는 형질전환 식물과 접촉시킴을 포함하여, 밤나방(fall armyworm), 분홍면화씨벌레(pink bollworm), 담배나방(tobacco budworm), 유럽조명나방(European corn borer) 및 배추좀나방(diamondback moth)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 해충을 방제하는 방법.
- 제53항에 있어서, 형질전환 식물이 옥수수, 면화, 벼 또는 양배추인 방법.
- 제10항에 따르는 합성 뉴클레오타이드 서열을 식물에 도입함을 포함하여, 해충을 방제할 수 있는 곤충-내성 식물을 생산하는 방법.
- 제55항에 있어서, 해충이 인시류의 곤충인 방법.
- 제56항에 있어서, 해충이 밤나방, 분홍면화씨벌레, 담배나방, 유럽조명나방 또는 배추좀나방인 방법.
- 제55항에 있어서, 식물이 옥수수, 면화, 벼 또는 양배추인 방법.
- 삭제
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