KR100649909B1 - 제노르하브두스 네마토필러스로부터의 신규한 살충 독소, 이를 암호화하는 핵산 서열 및 이의 생산 방법 - Google Patents

제노르하브두스 네마토필러스로부터의 신규한 살충 독소, 이를 암호화하는 핵산 서열 및 이의 생산 방법 Download PDF

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Abstract

발현되어 신규한 살충 독소를 생산하는, 제노르하브두스 네마토필러스(Xenorhabdus nematophilus), 제노르하브두스 포이나리(Xenorhabdus poinarii) 및 포토르하브두스 루미네센스(Photorhabdus luminescens)로부터 분리된 신규한 핵산 서열이 본원에 기술되어 있다. 본 발명에는 또한, 해충을 방제할 수 있는 살충 독소를 함유하는 조성물 및 제형이 기술되어 있다. 본 발명에는 또한, 독소를 제조하는 방법, 및 예를 들어, 미생물에서 뉴클레오타이드 서열을 사용하여 해충을 방제하거나 형질전환된 식물에서 사용하여 곤충 내성을 부여하는 방법이 기술되어 있다.
제노르하브두스 네마토필러스(Xenorhabdus nematophilus), 제노르하브두스 포이나리(Xenorhabdus poinarii), 포토르하브두스 루미네센스(Photorhabdus luminescens), 플루텔라 자일로스텔라(Plutella xylostella), 살충 독소, 키메라 유전자, 해충, 곤충 내성

Description

제노르하브두스 네마토필러스로부터의 신규한 살충 독소, 이를 암호화하는 핵산 서열 및 이의 생산 방법{Novel insecticidal toxins from Xenorhabdus nematophilus, nucleic acid sequences coding therefor and a method of producing the same}
본 발명은 제노르하브두스 네마토필러스, 제노르하브두스 포이나리(Xenorhabdus poinarii) 및 포토르하브두스 루미네센스(Photorhabdus luminescens)로부터의 신규한 독소, 발현되어 독소를 생산하는 핵산 서열, 독소를 제조하는 방법, 및 독소 및 상응하는 핵산 서열을 사용하여 곤충을 방제하는 방법에 관한 것이다.
해충은 농작물 손실의 주요 원인이다. 미국에서만, 약 77억 달러가 각종 곤충 속의 침습에 기인하여 매년 손실된다. 농작물의 손실 이외에, 해충은 또한, 채소 및 과일 재배자에게, 관상화 생산자에게 부담이 되며, 이들은 정원사 및 집의 소유자에게 성가신 존재이다.
해충은 주로 화학 살충제를 집중 살포하여 방제되며, 이러한 살충제는 곤충 성장의 억제, 곤충 영양 또는 번식의 방지 또는 곤충의 사멸을 통해 작용한다. 양호한 곤충 방제는 이렇게 성취할 수 있지만, 이들 화학물질은 또한 간혹 다른 유익한 곤충에게 영향을 준다. 광범위한 화학 살충제의 사용으로부터 초래되는 다른 문제는 내성 곤충 변종의 출현이다. 이는 각종 내성 처리 전략에 의해 부분적으로 완화되었지만, 대체 해충 방제제에 대한 요구는 증가하고 있다. 생물학적 곤충 방제제, 예를 들어, δ-내독소와 같은 살충 독소를 발현하는 바실러스 써링지엔시스(Bacillus thuringiensis) 균주가 또한 만족스러운 결과로 적용되어 화학 살충제에 대한 대체물 또는 보충물을 제공한다. 최근에, 이들 δ-내독소 몇가지를 암호화하는 유전자가 분리되었으며, 이종 숙주에서 이의 발현은 경제적으로 중요한 해충의 방제에 대한 다른 도구를 제공하는 것으로 보인다. 특히, 형질전환된 식물에서 살충 독소, 예를 들어, 바실러스 써링지엔시스 δ-내독소의 발현은 선택된 해충에 대해 유효한 보호를 제공하며, 이러한 독소를 발현하는 형질전환된 식물은 상업화되어 농부가 화학적 곤충 방제제의 살포를 감소시키도록 한다. 하지만, 이러한 경우에도조차, 내성의 발달의 가능성은 여전하며, 특정한 몇가지 해충만 방제가능하다. 결국, 농부에게 경제적인 이익을 제공하고 환경학적으로 허용되는 신규하고 유용한 곤충 방제제를 발견하려는 요구가 오랫동안 절실하지만 충족되지 않고 있다.
본 발명은 신규한 곤충 방제제에 대해 오래 지속된 요구에 역점을 두고 있다. 경제적으로 중요한 해충을 표적으로 하고 현존하는 곤충 방제제에 대한 내성 곤충 균주를 효율적으로 방제하는 방제제가 특히 필요하다. 또한, 적용되어 환경에 대한 부담을 최소화하는 제제가 바람직하다.
신규한 곤충 방제제에 대한 조사에서, 헤테로르하브두스(Heterorhabdus) 및 스테이네르네마(Steinernema) 속으로부터의 특정한 종류의 선충은 이의 살충 특성 때문에 특히 흥미롭다. 이들은 곤충 유충을 사멸시키고, 이의 자손은 죽은 유충을 먹이로 한다. 실제로, 이의 살충 활성은 선충에 살아있는 공생 세균에 기인한다. 이들 공생 세균은 헤테로르하브두스의 경우에 포토르하브두스이고, 스테이네르네마의 경우에 제노르하브두스이다.
본 발명에는 발현되어 경제적으로 중요한 해충, 특히 식물 해충에 매우 독성인, 제노르하브두스 네마토필러스로부터 분리된 뉴클레오타이드 서열, 및 이와 실질적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열이 기술되어 있다. 본 발명은 또한, 뉴클레오타이드 서열의 발현으로부터 초래되는 살충 독소, 및 해충이 생존하고, 성장하고 번식하는 능력을 억제하거나, 농작물 식물에서의 곤충-관련 손상 또는 손실을 제한할 수 있는, 살충 독소를 함유하는 조성물 및 제형을 기술하고 있다. 본 발명은 또한, 독소를 제조하는 방법 및 뉴클레오타이드 서열을, 예를 들어, 미생물에서 사용하여 곤충을 방제하거나 형질전환된 식물에 곤충 내성을 부여하는 방법, 및 독소, 및 독소를 포함하는 조성물 및 제형을 사용하는 방법, 예를 들어, 독소, 조성물 또는 제형을 곤충 침해 영역에 적용하거나, 또는 곤충 감수성 영역 또는 식물을 방역하여 유해한 곤충에 대한 보호 또는 내성을 부여하는 방법을 기술하고 있다.
신규한 독소는 경제적으로 중요한 해충인 플루텔라 자일로스텔라(Plutella xylostella (배추좀나방))에 대해 매우 살충성이다. 상기 독소는 다수의 곤충 방제 전략에 사용되어 환경에 최소한의 영향을 주면서 최대한의 효율성을 제공할 수 있다.
한가지 양태에 따라서, 본 발명은 (a) 서열 1의 뉴클레오타이드 569-979, 서열 1의 뉴클레오타이드 1045-2334, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12 및 서열 14로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열, 또는 (b) (a)의 뉴클레오타이드 서열과 동일암호화되는(isocoding) 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 발현되어 곤충에 대해 활성인 하나 이상의 독소를 생산하는, 분리된 핵산 분자를 제공한다. 이러한 양태의 구체적인 예에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열 1의 뉴클레오타이드 서열 569-979, 서열 1의 뉴클레오타이드 1045-2334, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12 또는 서열 14와 실질적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열과 동일암호화된다. 바람직하게는, 뉴클레오타이드 서열은 서열 1의 뉴클레오타이드 569-979, 서열 1의 뉴클레오타이드 1045-2334, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12 또는 서열 14와 실질적으로 유사하다. 더욱 바람직하게는, 뉴클레오타이드 서열은 서열 2, 3, 5, 7, 9, 11, 13 및 15로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 암호화한다. 가장 바람직하게는, 뉴클레오타이드 서열은 서열 1의 뉴클레오타이드 569-979, 서열 1의 뉴클레오타이드 1045-2334, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12 또는 서열 14를 포함한다. 다른 양태에서, 뉴클레오타이드 서열은 pCIB9369(NRRL B-21883)에 포함된 약 3.0kb DNA 단편을 포함한다.
바람직한 양태에 따라서, 본 발명의 핵산 분자의 발현으로부터 초래된 독소는 플루텔라 자일로스텔라에 대해 활성을 갖는다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 서열 1의 뉴클레오타이드 569-979, 서열 1의 뉴클레오타이드 1045-2334, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12 및 서열 14 로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열의 각각의 연속하는 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개(바람직하게는 20개) 염기쌍의 뉴클레오타이드 부분과 서열이 동일한 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개(바람직하게는 20개) 염기쌍의 뉴클레오타이드 부분을 포함하며, 발현되어 곤충에 대해 활성인 하나 이상의 독소를 생산하는, 분리된 핵산 분자를 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 핵산 분자와 작동적으로 결합된 이종 프로모터 서열을 포함하는 키메라 유전자를 제공한다. 또한, 본 발명은 키메라 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 더우기 또한, 본 발명은 이러한 키메라 유전자를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 이러한 양태에 따른 숙주 세포는 세균 세포, 효모 세포 또는 식물 세포이며, 바람직하게는 식물 세포일 수 있다. 더우기 또한, 본 발명은 이러한 식물 세포를 포함하는 식물을 제공한다. 바람직하게는, 식물은 옥수수이다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 DNA 분자의 발현에 의해 생산된 독소를 제공한다. 바람직한 양태에 따라서, 본 발명의 독소는 플루텔라 자일로스텔라에 대한 활성을 갖는다.
한 양태에 있어서, 독소는 NRRL 기탁 번호 B-21883인 이. 콜라이 균주에 의해 생산된다.
다른 양태에서, 본 발명의 독소는 서열 2, 3, 5, 7, 9, 11, 13 및 15로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 살충 유효량의 본 발명 독소를 포함하는 조성물이 제공된다. 다른 양 태에서, 본 발명은, (a) 자체가 본 발명의 핵산 분자에 작동적으로 연결된 이종 프로모터 서열을 포함하는 키메라 유전자를 포함하는 숙주 세포를 수득하고, (b) 곤충에 대해 활성인 하나 이상의 독소를 생산하는 핵산 분자를 세포에서 발현시킴을 특징으로 하여, 곤충에 대해 활성인 독소를 생산하는 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 곤충을 방제하기에 유효한 양으로 식물에서 발현가능한 본 발명의 핵산 분자를 식물에 도입함을 특징으로 하여, 곤충-내성 식물을 생산하는 방법을 제공한다. 바람직한 양태에 따라서, 곤충은 플루텔라 자일로스텔라이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 곤충에게 유효량의 본 발명에 따른 독소를 전달함을 특징으로 하여, 곤충을 방제하는 방법을 제공한다. 바람직한 양태에 따라서, 곤충은 플루텔라 자일로스텔라이다. 바람직하게는, 독소는 곤충에게 경구로 전달된다.
본 발명의 또 다른 양태는, (a) 이본쇄 랜덤 단편의 집단에 상기 이본쇄 주형 폴리뉴클레오타이드에 대해 각각 동일 영역 및 이종 영역을 포함하는 하나 이상의 일본쇄 또는 이본쇄 올리고뉴클레오타이드를 부가하고, (b) 이본쇄 랜덤 단편 및 올리고뉴클레오타이드의 수득된 혼합물을 일본쇄 단편으로 변성시키고, (c) 일본쇄 단편의 수득된 집단을 폴리머라제와 함께, 어닐링된 단편의 쌍을 형성하도록 하는 동일 영역(이때, 동일 영역은 쌍의 한 구성원이 다른 구성원의 복제를 개시하기에 충분하다)에서 일본쇄 단편을 어닐링시키는 조건하에 항온처리하여 돌연변이된 이본쇄 폴리뉴클레오타이드를 형성하고, (d) 제2 및 제3 단계를 2회 이상의 추가 주기로 반복하여, 추가 주기의 제2 단계에서 수득된 혼합물이 이전의 주기의 제3 단계로부터 돌연변이 유발된 이본쇄 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 추가 주기가 추가의 돌연변이 유발된 이본쇄 폴리뉴클레오타이드를 형성하도록 함을 특징으로 하여, 바람직한 크기의 이본쇄 랜덤 단편의 집단으로 절단되는 본 발명에 따른 핵산 분자에 돌연변이를 유발하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 양태 및 잇점은 당해 분야의 전문가에게 본 발명의 설명 및 비-제한적인 실시예의 연구로부터 명백해진다.
정의
본 발명의 독소의 "활성"은 독소가 경구 활성 곤충 방제제로서 작용하고, 독성 효과를 갖거나, 곤충 먹이 섭취를 중단시키거나 방해할 수 있음을 의미하며, 이는 곤충을 사멸시키거나 사멸시키지 않을 수 있다. 본 발명의 독소가 곤충에 전달되는 경우, 결과는 일반적으로 곤충을 사멸시키거나, 곤충이 독소를 곤충에 유효하게 만드는 공급원을 먹지 못하게 하는 것이다.
"결합된/작동적으로 연결된"이란 물리적으로 또는 기능적으로 관련된 두개의 핵산 서열을 의미한다. 예를 들어, 프로모터 또는 조절성 DNA 서열은 두개의 서열이 작동적으로 연결되거나 배치되어 조절 인자 DNA 서열이 암호화 또는 구조 DNA 서열의 발현 수준에 영향을 주게 되는 경우, RNA 또는 단백질을 암호화하는 DNA 서열과 "결합된다"고 한다.
"키메라 유전자"는 프로모터 또는 조절 핵산 서열이 mRNA를 암호화하거나 단백질로서 발현되는 핵산 서열과 작동적으로 연결되거나 결합되어 조절 핵산 서열이 결합된 핵산 서열의 전사 또는 발현을 조절할 수 있도록 하는 재조합 핵산 서열이다. 키메라 유전자의 조절 핵산 서열은 본래 밝혀진 결합된 핵산 서열에 통상적으로 작동적으로 결합되지 않는다.
"암호화 서열"은 RNA(예: mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, 센스 RNA 또는 안티센스 RNA)로 전사되는 핵산 서열이다. 바람직하게는, 이후, RNA는 유기체내에서 해독되어 단백질을 생산한다.
곤충을 "방제한다"는 것은 독성 효과를 통해, 해충이 생존하고, 성장하고, 먹이를 먹고/거나 번식하는 것을 억제하거나, 농작물 식물에서 곤충-관련 손상 또는 손실을 제한하는 것을 의미한다. 곤충을 "방제한다"는 것은 곤충을 사멸시키는 것을 의미하거나 의미하지 않을 수 있지만, 바람직하게는 곤충의 사멸을 의미한다.
독소를 "전달한다"는 것은 독소가 곤충과 접촉하여 독성 효과를 생성하고 곤충을 방제함을 의미한다. 독소는 인식된 많은 방법으로, 예를 들어, 곤충에 의한 섭취에 의해 또는 형질전환된 식물 발현, 제형화된 단백질 조성물(들), 분무성 단백질 조성물(들), 미끼 매트릭스 또는 다른 분야에 인식된 독소 전달 시스템을 통한 곤충과의 접촉에 의해 경구로 전달될 수 있다.
본원에서 사용된 "발현 카세트"는 적합한 숙주 세포에서, 종결 시그날과 작동적으로 연결된 목적하는 뉴클레오타이드 서열과 작동적으로 결합된 프로모터를 포함하는 특정한 뉴클레오타이드 서열의 발현을 지시할 수 있는 핵산 서열을 의미한다. 이는 또한, 일반적으로 뉴클레오타이드 서열의 적당한 해독에 필요한 서열을 포함한다. 목적하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 카세트는 키메라일 수 있으며, 이는 이의 하나 이상의 성분이 이의 하나 이상의 다른 성분에 대해 이종임을 의미한다. 발현 카세트는 또한, 천연적일 수 있지만 이종 발현에 유용한 재조합체 형태로 수득된다. 그러나 일반적으로, 발현 카세트는 숙주에 대해 이종이며, 즉 발현 카세트의 특정한 핵산 서열은 숙주 세포에서 천연적으로 발생하지 않고 숙주 세포로 또는 숙주 세포의 선조로 형질전환 사건에 의해 도입되었음에 틀림없다. 발현 카세트에서 뉴클레오타이드 서열은 지속성 프로모터, 또는 숙주 세포가 특정한 외부 자극에 노출되는 경우에만 전사를 개시하는 유도성 프로모터의 조절하에 발현될 수 있다. 다세포성 유기체(예: 식물)의 경우, 프로모터는 또한, 특정한 조직 또는 기관, 또는 발생의 단계에 특이적일 수 있다.
"유전자"는 게놈내에 위치하고, 상기 언급된 암호화 핵산 서열 이외에, 발현의 조절, 즉 암호화 부분의 전사 및 해독에 관여하는 다른 1차 조절 핵산 서열을 포함하는 정의된 영역이다. 유전자는 또한, 다른 5' 및 3' 비해독 서열 및 종결 서열을 포함할 수 있다. 존재할 수 있는 다른 요소는, 예를 들어, 인트론이다.
"목적하는 유전자"는 식물로 전달되는 경우, 식물에 바람직한 특성(예: 항생제 내성, 바이러스 내성, 곤충 내성, 질병 내성 또는 다른 해충에 대한 내성, 제초제 내성, 개선된 영양가, 산업 공정 또는 변화된 번식능에서 개선된 성능)을 부여하는 유전자를 언급한다. "목적하는 유전자"는 또한, 식물에서 상업적으로 유용한 효소 또는 대사물질을 생산하기 위해 식물로 전달되는 것일 수 있다.
"이종" 핵산 서열은 도입되어지는 숙주 세포와 천연적으로 연관되지 않은 핵산 서열이며, 이는 천연 핵산 서열의 비-천연 다중 복사체를 포함한다.
"동종" 핵산 서열은 도입되어지는 숙주 세포와 천연적으로 연관된 핵산 서열이다.
"상동 재조합"은 동종 핵산 분자 사이의 핵산 단편의 상호 교환이다.
"살충성"은 바람직하게는 곤충을 사멸시킴에 의해 곤충을 방제할 수 있는 독성 생물학적 활성으로 정의된다.
핵산 서열은 핵산 서열이 참고 핵산 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 경우, 참고 핵산 서열과 "동일암호화"된다.
"분리된" 핵산 분자 또는 분리된 효소는 사람의 손에 의해, 이의 천연의 환경과 분리되어 존재하고, 따라서 천연 산물이 아닌 핵산 분자 또는 효소이다. 분리된 핵산 분자 또는 효소는 정제된 형태로 존재할 수 있거나 비-천연 환경, 예를 들어, 재조합 숙주 세포내에 존재할 수 있다.
"핵산 분자" 또는 "핵산 서열"은 공급원으로부터 분리될 수 있는 일본쇄 또는 이본쇄 DNA 또는 RNA의 선형 절편이다. 본 발명에 있어서, 핵산 분자는 바람직하게는 DNA의 절편이다. "ORF"는 개방 판독 프레임을 의미한다.
"식물"은 모든 발달 단계에서의 식물, 특히 종자 식물이다.
"식물 세포"는 원형질체 및 세포벽을 포함하는, 식물의 구조적 및 생리학적 단위이다. 식물 세포는 분리된 단일 세포 또는 배양 세포의 형태로, 또는 고등 조 직 단위의 부분, 예를 들어, 식물 조직, 식물 기관 또는 전체 식물로 존재할 수 있다.
"식물 세포 배양물"은 식물 단위, 예를 들어, 발생의 여러 단계에서의 원형질체, 세포 배양물 세포, 식물 조직내의 세포, 화분, 화분관, 배주, 배낭, 접합체 및 배아의 배양물을 의미한다.
"식물 재료"는 잎, 줄기, 뿌리, 꽃 또는 꽃의 부분, 과실, 화분, 난세포, 접합체, 종자, 삽목, 세포 또는 조직 배양물 또는 식물의 다른 부분 또는 산물을 언급한다.
"식물 기관"은 식물의 상이하고 가시적으로 구조화되고 분화된 부분, 예를 들어, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃봉오리 또는 배아이다.
본원에서 사용된 "식물 조직"은 구조 및 기능 단위로 조직화된 식물 세포의 그룹을 의미한다. 식물내에서 또는 배양물에서 식물의 조직이 포함된다. 이 용어는 전체 식물, 식물 기관, 식물 종자, 조직 배양물 및 구조 및/또는 기능 단위로 조직화된 식물 세포의 그룹을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 상기에서 기재되거나 이 정의에 의해 달리 포함된 식물 조직의 특정한 형태와 함께 또는 이의 부재하에 이 용어의 사용은 식물 조직의 다른 형태를 배제하려는 것이 아니다.
"프로모터"는 RNA 폴리머라제 II에 대한 결합 부위를 함유하고 DNA의 전사를 개시하는 암호화 영역의 상류의 비해독 DNA 서열이다. 프로모터 영역은 또한, 유전자 발현의 조절 인자로서 작용하는 다른 요소를 포함한다.
"원형질체"는 세포벽의 부재하에 또는 세포벽의 일부만의 존재하에 분리된 식물 세포이다.
"조절 요소"는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 조절하는데 관여하는 서열을 언급한다. 조절 요소는 목적하는 뉴클레오타이드 서열에 사용가능하게 결합된 프로모터 및 종결 시그날을 포함한다. 이들은 또한, 일반적으로 뉴클레오타이드 서열의 적합한 해독에 필요한 서열을 포함한다.
가장 넓은 의미에서, 본원에서 뉴클레오타이드 서열에 대해 사용하는 경우, "실질적으로 유사한"이란 용어는 참조 뉴클레오타이드 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 의미하며, 여기에서 상응하는 서열은, 예를 들어, 폴리펩타이드 기능에 영향을 주지 않는 아미노산에서의 변화만 일어나는 일어나는 경우, 참조 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드와 실질적으로 동일한 구조 및 기능을 갖는 폴리펩타이드를 암호화한다. 바람직하게는, 실질적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열은 참조 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 암호화한다. 실질적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열 및 참조 뉴클레오타이드 서열 사이의 동일성의 백분율은 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱 더 바람직하게는 99% 이상이다. 참조 뉴클레오타이드 서열과 "실질적으로 유사한" 뉴클레오타이드 서열은 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO4, 1mM EDTA 중에 50℃에서 2X SSC, 0.1% SDS 중에 50℃에서 세척하는 경우, 더욱 바람직하게는 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO4, 1mM EDTA 중에 50℃에서 1X SSC, 0.1% SDS 중에 50℃에서 세척하는 경 우, 더욱 더 바람직하게는 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO4, 1mM EDTA 중에 50℃에서 0.5X SSC, 0.1% SDS 중에 50℃에서 세척하는 경우, 바람직하게는 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO4, 1mM EDTA 중에 50℃에서 0.1X SSC, 0.1% SDS 중에 50℃에서 세척하는 경우, 더욱 바람직하게는 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO4, 1mM EDTA 중에 50℃에서 0.1X SSC, 0.1% SDS 중에 65℃에서 세척하는 경우, 참조 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화된다.
"합성"은 천연 서열에 존재하지 않는 구조적 특징을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 언급한다. 예를 들어, 쌍자엽식물 및/또는 단자엽식물 유전자의 G+C 함량 및 정상적 코돈 분포와 더욱 근접하게 유사한 인공 서열은 합성된다.
"형질전환"은 이종 핵산을 숙주 세포 또는 유기체에 도입하는 과정이다. 특히, "형질전환"은 DNA 분자를 목적하는 유기체의 게놈으로 안정하게 통합함을 의미한다.
"형질전환된(transformed)/형질전환된(transgenic)/재조합체"는 이종 핵산 분자가 도입된 세균 또는 식물과 같은 숙주 유기체를 언급한다. 핵산 분자는 숙주의 게놈에 안정하게 통합될 수 있거나 핵산 분자는 또한, 염색체외 분자로서 존재할 수 있다. 이러한 염색체외 분자는 자가 복제될 수 있다. 형질전환된 세포, 조직 또는 식물은 형질전환 과정의 최종 산물 뿐만 아니라 이의 형질전환된 자손을 포함하는 것으로 이해된다. "비-형질전환된(non-transformed)", "비-형질전환된 (non-transgenic)" 또는 "비-재조합체" 숙주는 야생형 유기체, 예를 들어, 이종 핵 산 분자를 함유하지 않는 세균 또는 식물을 의미한다.
뉴클레오타이드는 다음 표준 약어에 의한 이의 염기로 지시된다: 아데닌(A), 시토신(C), 티민(T) 및 구아닌(G). 아미노산은 마찬가지로 다음 표준 약어에 의해 지시된다: 알라닌(Ala; A), 아르기닌(Arg; R), 아스파라긴(Asn; N), 아스파르트산(Asp; D), 시스테인(Cys; C), 글루타민(Gln; Q), 글루탐산(Glu; E), 글리신(Gly; G), 히스티딘(His; H), 이소류신(Ile; I), 류신(Leu; L), 리신(Lys; K), 메티오닌(Met; M), 페닐알라닌(Phe; F), 프롤린(Pro; P), 세린(Ser; S), 트레오닌(Thr; T), 트립토판(Trp; W), 티로신(Tyr; Y) 및 발린(Val; V). 또한, (Xaa; X)는 모든 아미노산을 나타낸다.
서열 목록에서 서열의 간단한 설명
서열 1은 제노르하브두스 네마토필러스 클론 pCIB9369에 포함된 약 3.0kb DNA 단편의 서열이며, 이는 특이적인 뉴클레오타이드 위치에서 다음 ORF를 포함한다.
명칭 출발 종료
orf1 569 979
orf2 1045 2334
서열 2는 클론 pCIB9369의 orf1에 의해 암호화된 약 15kDa 단백질의 서열이다.
서열 3은 클론 pCIB9369의 orf2에 의해 암호화된 약 47.7kDa 유충 호르몬 에 스테라제-유사 단백질의 서열이다.
서열 4는 제노르하브두스 네마토필러스 클론 pCIB9381의 orf1의 DNA 서열이다.
서열 5는 클론 pCIB9381의 orf1에 의해 암호화된 단백질의 서열이다.
서열 6은 제노르하브두스 네마토필러스 클론 pCIB9381의 orf2의 DNA 서열이다.
서열 7은 클론 pCIB9381의 orf2에 의해 암호화된 유충 호르몬 에스테라제-유사 단백질의 서열이다.
서열 8은 제노르하브두스 포이나리 클론 pCIB9354의 orf1의 DNA 서열이다.
서열 9는 클론 pCIB9354의 orf1에 의해 암호화된 단백질의 서열이다.
서열 10은 제노르하브두스 포이나리 클론 pCIB9354의 orf2의 DNA 서열이다.
서열 11은 클론 pCIB9354의 orf2에 의해 암호화된 유충 호르몬 에스테라제-유사 단백질의 서열이다.
서열 12는 포토르하브두스 루미네센스 클론 pCIB9383-21의 orf1의 DNA 서열이다.
서열 13은 클론 pCIB9383-21의 orf1에 의해 암호화된 단백질의 서열이다.
서열 14는 포토르하브두스 루미네센스 클론 pCIB9383-21의 orf2의 DNA 서열이다.
서열 15는 클론 pCIB9383-21의 orf2에 의해 암호화된 유충 호르몬 에스테라제-유사 단백질의 서열이다.
기탁
다음 물질은 특허 과정을 위한 미생물 기탁의 국제 인식에 대한 부다페스트 조약의 항목하에 미국 일리노이주 61604 피오리아 노스 유니버시티 스트리트 1815소재의 기탁기관(Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL))에 기탁되었다. 기탁된 물질의 입수가능성에 대한 모든 제한은 특허의 부여시에 최종적으로 해제될 것이다.
클론 수탁 번호 기탁일
pCIB9369 NRRL B-21883 1997년 11월 12일
pCIB9354 NRRL B-30109 1999년 2월 25일
pCIB9381 NRRL B-30110 1999년 2월 25일
pCIB9383-21 NRRL B-30111 1999년 2월 25일
발현되어 살충 독소를 생산하는 신규한 핵산 서열
본 발명은 발현되어 신규한 독소를 생산하는 핵산 서열, 및 독소의 제조 및 이를 사용하여 해충을 방제하는 것에 관한 것이다. 핵산 서열은 엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae) 과의 구성원인 제노르하브두스 네마토필러스, 제노르하브두스 포이나리 및 포토르하브두스 루미네센스로부터 분리된다. 제노르하브두스는 스테이네르네마 속의 선충의 공생 세균이다. 포토르하브두스는 헤테로르하비티스 (Heterorhabditis) 속의 선충의 공생 세균이다. 선충은 곤충 유충을 군집시키고, 이들을 사멸시키고, 이의 자손은 죽은 유충을 먹이로 한다. 살충 활성은 공생 제노르하브두스 및 포토르하브두스 세균에 의해 실질적으로 생산된다. 본 발명자들은 먼저 본 발명의 핵산 서열을 분리한다. 본 발명의 핵산 서열의 발현은 플루텔라 자일로스텔라(배추좀나방)와 같은 인시류(Lepidopteran) 곤충을 방제하는데 사용할 수 있는 독소를 생산한다.
클론 pCIB9369에서 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 특허 기탁물에 대한 부다페스트 조약에 따라서 수탁 번호 NRRL B-21883하에 기탁된 약 3.0kb DNA 단편을 특징으로 한다. 이러한 DNA 단편의 서열은 서열 1에 기재되어 있다. 두개의 개방 판독 프레임(ORF)은 예측 크기 15kDa 및 47.7kDa(각각, 서열 2 및 3)의 단백질을 암호화하는 서열 1(각각, 뉴클레오타이드 569-979 및 뉴클레오타이드 1045-2334)에 존재한다. 두개의 ORF는 오페론-유사 구조로 배열된다. UWGCG Blast 및 Gap 프로그램을 사용하는 각각의 개별적 ORF에 상동성을 나타내는 공지된 서열에 대한 연구는 ORF #1에 대한 유의한 적합성을 확인하지 못하고, ORF #2 및 당해 분야에서 바실러스 써링겐시스 cry3A 단백질 사이에 유의하게 고려되지 않는 21%의 동일성을 확인하였다. Blast 프로그램에 의한 pCIB9369의 ORF #2에 의해 암호화된 단백질의 Gap 분석에 의해 유충 호르몬 에스테라제-관련 단백질과 30.6% AA 동일성 및 44.1% AA 유사성을 확인한다[GenBank 승인번호 2921553; Henikoff 등, PNAS USA 89: 10915-10919(1992)]. 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 또한, 살충 독소 toxb4를 암호화하는 공지된 제노르하브두스 네마토필러스 서열과 비교하지만[WO 95/00647], 유의한 상동성은 밝혀지지 않는다. 3.0kb DNA 단편은 또한, WO 98/08388에 공개된 뉴클레오타이드 서열과 비교한다. WO 98/08388에 기술된 38.2kb DNA 단편으로부터 각각 60개 뉴클레오타이드(60mer)의 22개 서열은 UWGCG Gap 프로그램을 사용하여 본 발명의 3.0kb DNA 단편과 비교한다. 제1 60mer의 뉴클레오타이드 서열은 38.2kb DNA 단편의 염기 1에서 출발하며 다른 60mer들은 약 2.0kb 간격을 두고 위치한다. 각각의 22개의 서열 뿐만 아니라 이의 상보성 서열을 시험한다. 본 발명의 3.0kb DNA 단편 및 이들 60mer 중의 하나 사이의 최고 동일성 백분율은 53%이며, 이는 유의한 상동성은 아니다. 또한, 38.2kb 서열의 5가지 상이한 DNA 단편을 본 발명의 3.0kb 단편에 대한 하이브리드화(hybridization)에 대해 서던 블롯 분석에 의해 시험한다. 이들 중에서 어느 것도 포지티브 하이브리드화 시그날을 나타내지 않는다.
pCIB9381, pCIB9354 및 pCIB9383-21의 뉴클레오타이드 서열은 또한, 이들 클론 각각에서 두개의 개방 판독 프레임을 나타낸다. 각각의 pCIB9381 및 pCIB9383-21에서 두개의 ORF의 뉴클레오타이드 서열은 pCIB9369에서의 것에 매우 상동성이다. 따라서, pCIB9381 및 pCIB9383-21의 ORF #2 단백질은 pCIB9369의 ORF #2 단백질이 그러하듯이 유충 호르몬 에스테라제-관련 단백질에 필수적으로 동일한 상동성을 갖는다. pCIB9354의 ORF #1의 뉴클레오타이드 서열은 pCIB9369의 ORF #1의 뉴클레오타이드 서열에 77% 동일하며, pCIB9354의 ORF #2의 뉴클레오타이드 서열은 pCIB9369의 ORF #2의 뉴클레오타이드 서열에 79% 동일하다. pCIB9354의 ORF #2 단백질은 또한, 유충 호르몬 에스테라제-관련 단백질과 상동성을 갖는다(29.2% AA 동일성 및 42.2% AA 유사성).
바람직한 양태에서, 본 발명은 서열 1의 뉴클레오타이드 569-979, 서열 1의 뉴클레오타이드 1045-2334, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12 및 서열 14와 실질적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 이는 발현되어 살충 독소를 생산한다. 본 발명은 또한, 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 포함한다. 이러한 벡터에서, 핵산 서열은 바람직하게는 뉴클레오타이드 서열을 발현할 수 있는 숙주 세포에서 뉴클레오타이드 서열을 발현하기 위한 조절 요소를 포함하는 발현 카세트내에 포함된다. 이러한 조절 요소는 일반적으로 프로모터 및 종결 시그날을 포함하며, 바람직하게는 또한 본 발명의 핵산 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 유효하게 해독시키는 요소를 포함한다. 핵산 서열을 포함하는 벡터는 일반적으로 특정한 숙주 세포에서, 바람직하게는 염색체외 분자로서 복제될 수 있으므로, 본 발명의 핵산 서열을 이러한 숙주 세포에서 증폭시키는데 사용된다. 한가지 양태에서, 이러한 벡터에 대한 숙주 세포는 미생물, 예를 들어, 세균, 특히 이. 콜라이이다. 다른 양태에서, 이러한 재조합 벡터에 대한 숙주 세포는 체내기생생물 또는 착생생물이다. 이러한 벡터에 바람직한 숙주 세포는 진핵생물 세포, 예를 들어, 효모, 식물 세포 또는 곤충 세포이다. 옥수수 세포와 같은 식물 세포가 가장 바람직한 숙주 세포이다. 다른 바람직한 양태에서, 이러한 벡터는 바이러스 벡터이며 특정한 숙주 세포, 예를 들어, 곤충 세포 또는 식물 세포에서 뉴클레오타이드 서열의 복제에 사용된다. 재조합 벡터는 또한, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 숙주 세포로 형질전환하기 위해 사용되고, 이에 의해 뉴클레오타이드 서열은 이러한 숙주 세포의 DNA로 안정하게 통합된다. 한 양태에서, 이러한 숙주 세포는 원핵생물 세포이다. 바람직한 양태에서, 이러한 숙주 세포는 진핵생물 세포, 예를 들어, 효모 세포, 곤충 세포 또는 식물 세포이다. 가장 바람직한 양태에서, 숙주 세포는 식물 세포, 예를 들어, 옥수수 세포이다.
본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 다음 실시예에 개시된 기술을 사용하여, 또는 PCR 프라이머를 구성하기 위한 기준으로서 열거된 서열에 기재된 서열을 사용하는 PCR에 의해 분리할 수 있다. 예를 들어, 서열 1의 orf1의 대략 제1 및 최종 20 내지 25개 연속 뉴클레오타이드의 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드(예: 서열 1의 뉴클레오타이드 569-588 및 957-976)는 공급 균주(제노르하브두스 네마토필러스 균주 ATCC 19061)로부터 직접 orf1 암호화 서열(서열 1의 뉴클레오타이드 569-976)을 증폭시키는 PCR 프라이머로서 사용될 수 있다. 본 발명의 다른 유전자 서열은 마찬가지로 각각의 공급 균주로부터 PCR 프라이머에 대한 기준으로서 열거된 서열에 기재된 암호화 서열의 말단을 사용하여 PCR에 의해 증폭시킬 수 있다.
다른 바람직한 양태에서, 살충 독소는 본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함한다. 본 발명에 따른 살충 독소의 분자량은 크기 분류 실험에 의해 측정되는 바와 같이, 6,000을 초과한다. 프로테아제 K로 처리한 후, 살충 활성에서 최소 감소만이 곤충 생검법에서 관찰되며, 이는 살충 독소가 프로테아제 K 처리에 대해 실질적으로 내성임을 나타낸다. 살충 독소는 22℃에서 또는 4℃에서 2주 동안 저장한 후에 살충 활성을 유지한다. 이들은 또한, 동결 건조시키고 22℃에서 2주 동안 저장한 후에 살충 활성을 유지한다. 살충 독소는 또한, 5분 동안 60℃에서 항온처리한 후에 여전히 활성이지만, 이들은 5분 동안 100℃ 또는 80℃에서 5분 동안 항온처리한 후에 살충 활성을 상실한다.
추가 양태에서, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 시험관내 재조합 또는 DNA 교체로 공지된 기술로 임의 돌연변이를 혼입하여 개질시킬 수 있다. 이 기술은 문헌[참조: Stemmer et al., Nature 370:389-391 (1994)] 및 미국 특허 제5,605,793호에 기술되어 있으며, 이들은 본원에서 참조로 인용된다. 뉴클레오타이드 서열의 수백만의 돌연변이 복사체는 본 발명의 원래 뉴클레오타이드 서열을 기본으로 하며, 특성이 개선된, 예를 들어, 살충 활성이 증가되거나 안정성이 증진되거나 상이한 특이성 또는 표적 해충의 범위를 갖는 변이체가 회수된다. 이러한 방법은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 주형 이본쇄 폴리뉴클레오타이드로부터 돌연변이 유발된 이본쇄 폴리뉴클레오타이드를 형성함을 포함하며(이때, 주형 이본쇄 폴리뉴클레오타이드는 바람직한 크기의 이본쇄 랜덤 단편으로 분리된다), 이본쇄 랜덤 단편의 수득된 집단에 상기 이본쇄 주형 뉴클레오타이드에 대해 각각 동일한 영역 및 다른 영역을 포함하는 하나 이상의 일본쇄 또는 이본쇄 올리고뉴클레오타이드를 부가하고; 이본쇄 랜덤 단편 및 올리고뉴클레오타이드의 수득된 혼합물을 일본쇄 단편으로 변성시키고; 일본쇄 단편의 수득된 집단을 폴리머라제와 함께, 어닐링된 단편의 쌍을 형성하도록 하는 동일 영역(이때, 동일 영역은 쌍의 한 구성원이 다른 구성원의 복제를 개시하기에 충분하다)에서 일본쇄 단편을 어닐링시키는 조건하에 항온처리하여 돌연변이된 이본쇄 폴리뉴클레오타이드를 형성하고; 제2 및 제3 단계를 2회 이상의 추가 주기로 반복하여, 추가 주기의 제2 단계에서 수득된 혼합물이 이전 주기의 제3 단계로부터 돌연변이 유발된 이본쇄 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 추가 주기가 추가의 돌연변이 유발된 이본쇄 폴리뉴클레오타이드를 형성하도록 하는 단계를 포함한다. 바람직한 양태에서, 이본쇄 랜덤 단편의 집단에서 이본쇄 랜덤 단편의 단일종의 농도는 전체 DNA 중량의 1% 미만이다. 추가의 바람직한 양태에서, 주형 이본쇄 폴리뉴클레오타이드는 약 100종 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 이본쇄 랜덤 단편의 크기는 약 5bp 내지 5kb이다. 추가의 바람직한 양태에서, 상기 방법의 제4 단계는 제2 및 제3 단계를 10회 이상 반복함을 특징으로 한다.
이종 미생물 숙주에서 뉴클레오타이드 서열의 발현
생물학적 곤충 방제제로서, 살충 독소는 뉴클레오타이드 서열을 발현할 수 있는 이종 숙주 세포에서 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 생산된다. 제1 양태에서, 본 발명의 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열의 변형을 이의 염색체 위치에서 포함하는 제노르하브두스 네마토필러스, 제노르하브두스 포이나리 또는 포토르하브두스 루미네센스 세포가 기술되어 있다. 이러한 변형은 존재하는 조절 요소의 돌연변이 또는 결실을 포함하므로, 뉴클레오타이드 서열의 변화된 발현, 또는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 조절하는 신규한 조절 요소의 혼입을 유도한다. 다른 양태에서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열의 추가 복사체를 제노르하브두스 네마토필러스, 제노르하브두스 포이나리 또는 포토르하브두스 루미네센스에 염색체로의 삽입에 의해 또는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 염색체외 복제 분자의 도입에 의해 부가한다.
다른 양태에서, 본 발명의 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열이 프로모터 및 종결 시그날을 포함하는 적합한 발현 카세트내에 삽입된다. 뉴클레오타이드 서열의 발현이 지속성이거나, 전사를 개시하는 다양한 유형의 자극에 반응하는 유도성 프로모터가 사용된다. 바람직한 양태에서, 독소가 발현되는 세포는 미생물, 예를 들어, 바이러스, 세균 또는 진균이다. 바람직한 양태에서, 바이러스, 예를 들어, 바큘로바이러스는 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 이의 게놈에서 함유하며, 바이러스 복제 및 뉴클레오타이드 서열의 발현에 적합한 적당한 진핵생물 세포의 감염 후에 다량의 상응하는 살충 독소를 발현시킨다. 이렇게 생산된 살충 독소는 살충제로서 사용된다. 또는, 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 조작된 바큘로바이러스를 사용하여 곤충을 생체내에서 감염시키고 이들을 살충 독소의 발현에 의해 또는 바이러스 감염 및 살충 독소의 발현의 조합에 의해 사멸시킨다.
세균 세포는 또한, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열의 발현에 대한 숙주이다. 바람직한 양태에서, 식물 조직내에서 생존하고 복제될 수 있는, 소위 체내기생생물인 비-병원성 공생 세균, 또는 필로스피어 또는 토양층에 군집할 수 있는, 소위 착생생물인 비-병원성 공생 세균이 사용된다. 이러한 세균은 아그로박테리움(Agrobacterium), 알칼리게네스(Alcaligenes), 아조스피릴룸 (Azospirillum), 아조토박터(Azotobacter), 바실러스(Bacillus), 클라비박터 (Clavibacter), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 플라보박터 (Flavobacter), 클레브시엘라(Klebsiella), 슈도모나스(Pseudomonas), 리조비움 (Rhizobium), 세라티아 (Serratia), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 및 크산토모나스(Xanthomonas) 속 세균을 포함한다. 공생 진균, 예를 들어, 트리코데르마(Trichoderma) 및 글리오클라디움(Gliocladium)은 또한, 동일한 목적으로 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 발현시키기 위해 가능한 숙주이다.
이들 유전자 조작 기술은 상이하게 사용가능한 숙주에 특이적이며, 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 발현 벡터 pKK223-3 및 pKK223-2를 사용하여 이. 콜라이에서 이종 유전자를 tac 또는 trc 프로모터 뒤에서 전사 또는 해독 융합체로 발현시킬 수 있다. 다수의 ORF를 암호화하는 오페론의 발현을 위해서, 가장 간단한 방법은 오페론을 pKK223-3과 같은 벡터에 전사 융합체로 삽입하는 것이며, 이는 이종 유전자의 동종 리보솜 결합 부위가 사용되게 한다. 그램 양성종(예: 바실러스)에서 과발현에 대한 기술이 또한, 당해 분야에 공지되어 있으며, 본 발명에서 사용될 수 있다[참조: Quax et al. In: Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, Eds. Baltz et al., American Society for Microbiology, Washington (1993)]. 과발현에 대한 대체 시스템은, 예를 들어, 효모 벡터에 따라 다르며, 피치아(Pichia), 사카로마이세스(Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)의 사용을 포함한다[참조: Sreekrishna, In: Industrial microorganisms: basic and applied molecular genetics, Baltz, Hegeman, and Skatrud eds. American Society for Microbiology, Washington (1993); Dequin & Barre, Biotechnology 12:173-177 (1994); van den Berg et al., Biotechnology 8:135-139 (1990)].
다른 바람직한 양태에서, 하나 이상의 기술된 뉴클레오타이드 서열이[공개된 출원 EU 제0 472 494호 및 WO 94/01561에 기술된] 생물조절 특성을 갖는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 균주 CGA267356으로 전달되고 여기에서 발현된다. 다른 바람직한 양태에서, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 또한 생물조절 특성을 갖는 슈도모나스 아우레오패시언스(Pseudomonas aureofaciens) 균주 30-84로 전달된다. 이종 생물조절 균주에서의 발현은 선택된 숙주에서 복제에 적합한 벡터의 선택 및 프로모터의 적합한 선택을 필요로 한다. 그램 음성 및 그램 양성 세균 및 진균에서 발현시키기 위한 기술은 당해 분야에 익히 공지되어 있다.
식물 조직에서 뉴클레오타이드 서열의 발현
특히 바람직한 양태에서, 본 발명의 하나 이상의 살충 독소가 고등 유기체, 예를 들어, 식물에서 발현된다. 이 경우에, 유효량의 독소를 발현하는 형질전환된 식물은 자체를 해충으로부터 보호한다. 곤충이 이러한 형질전환된 식물을 먹이로 먹기 시작하는 경우, 이는 또한 발현된 독소를 섭취한다. 이는 곤충이 식물 조직으로 추가로 무는 것을 방지하거나 심지어 곤충에게 해를 입히거나 곤충을 사멸시킬 수 있다. 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 발현 카세트내에 삽입되고, 이는 이후 바람직하게는, 식물의 게놈내에 안정하게 통합된다. 다른 바람직한 양태에서, 뉴클레오타이드 서열은 비-병원성 자체-복제 바이러스에 포함된다. 본 발명에 따라서 형질전환된 식물은 단자엽식물 또는 쌍자엽식물일 수 있으며, 옥수수, 밀, 보리, 호밀, 고구마, 콩, 완두콩, 치커리, 상추, 양배추, 꽃양배추, 브로컬리, 순무, 무, 시금치,아스파라거스, 양파, 마늘, 후추, 셀러리, 호박, 서양호박, 삼, (오이 비슷한) 서양 호박, 사과, 배, 마르멜로, 멜론, 서양자두, 체리, 복숭아, 승도 복숭아, 살구, 딸기, 포도, 나무딸기, 검은딸기, 파인애플, 아보카도, 파파야, 망고, 바나나, 대두, 토마토, 수수, 사탕수수, 사탕무, 해바라기, 평지씨, 클로버, 담배, 당근, 목화, 자주개자리, 쌀, 감자, 가지, 오이, 아라비돕시스(Arabidopsis) 및 목본 식물(예: 침엽수 및 낙엽수)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
일단 바람직한 뉴클레오타이드 서열이 특정한 식물종으로 형질전환되면, 이 종내에서 증식되거나 특히 상업용 변종을 포함하는 동일한 종의 다른 변종으로 전통적인 교배 기술을 사용하여 이동할 수 있다.
본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 바람직하게는 형질전환된 식물에서 발현되므로, 형질전환된 식물에서 상응하는 독소를 생합성시킨다. 이 방법으로, 곤충에 대한 내성이 증진된 형질전환된 식물이 생산된다. 형질전환된 식물에서 이의 발현을 위해서, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 변경 및 최적화를 필요로 할 수 있다. 많은 경우에 미생물 유기체로부터의 유전자는 식물에서 변경되지 않고 높은 수준으로 발현될 수 있지만, 형질전환된 식물에서 낮은 발현은 식물에 바람직하지 않은 코돈을 갖는 미생물 뉴클레오타이드 서열로부터 초래될 수 있다. 당해 분야에서 모든 유기체는 코돈 사용을 특정하게 선호하는 것이 공지되어 있고, 본 발명에서 기술된 뉴클레오타이드 서열의 코돈은 식물 선호성에 적합하게 변화되는 한편, 이에 의해 암호화된 아미노산을 유지할 수 있다. 또한, 식물에서 높은 발현은 약 35% 이상, 바람직하게는 약 45% 이상, 더욱 바람직하게는 약 50% 이상, 가장 바람직하게는 약 60% 이상의 GC 함량을 갖는 암호화 서열로부터 최상으로 성취된다. GC 함량이 낮은 미생물 뉴클레오타이드 서열은 메시지를 탈안정화시킬 수 있는 ATTTA 모티프, 및 부적합한 폴리아데닐화를 유발할 수 있는 AATAAA 모티프의 존재에 기인하여 식물에서 불량하게 발현될 수 있다. 바람직한 유전자 서열은 단자엽식물 및 쌍자엽식물 종 둘 모두에서 적합하게 발현될 수 있지만, 선호도가 상이하게 나타나는 바와 같이, 서열은 변경되어 단자엽식물 또는 쌍자엽식물의 특정한 코돈 선호성 및 GC 함량 선호성의 원인이 될 수 있다[참조: Murray et al., Nucl. Acids Res. 17: 477-498 (1989)]. 또한, 뉴클레오타이드 서열은 메시지 절단을 유발할 수 있는 부적합한 접합 부위의 존재에 대해 선별된다. 상기에서 기술된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열내에서 수행되는 것을 요하는 모든 변화가 부위 지시된 돌연변이 유발, PCR, 및 공개된 특허원 EP 제0 385 962호(Monsanto), EP 제0 359 472호(Lubrizol) 및 WO 93/07278(Ciba-Geigy)에 기술된 방법을 사용하는 합성 유전자 구성의 익히 공지된 기술을 사용하여 이루어진다.
해독을 유효하게 개시하기 위해서, 개시 메티오닌에 인접한 서열은 변경을 필요로 할 수 있다. 예를 들어, 이들은 식물에서 유효한 것으로 공지된 서열을 포함시켜 변경될 수 있다. 조쉬(Joshi)는 식물에 적합한 컨센서스를 제안하였으며[참조: NAR 15: 6643-6653 (1987)], 클론테크사(Clontech)는 추가의 컨센서스 해독 개시 인자를 제안한다(1993/1994 catalog, page 210). 이들 컨센서스는 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 함께 사용하기에 적합하다. 서열은 ATG까지 및 이를 포함하거나(제2 아미노산을 변형시키지 않고), 또는 ATG에 연속하는 GTC까지 및 이를 포함하는(형질전환된 유전자의 제2 아미노산을 변형시키는 가능성과 함께) 뉴클레 오타이드 서열을 포함하는 작제물내로 혼입된다.
형질전환된 식물에서 뉴클레오타이드 서열의 발현은 식물에서 기능적인 것으로 나타난 프로모터에 의해 구동된다. 프로모터의 선택은 발현에 대한 시간 및 공간 요건, 및 표적 종에 따라서 변한다. 따라서, 잎, 이삭, 꽃(예: 수상화서, 원추화서, 옥수수속 등), 뿌리 및/또는 종자에서 본 발명의 뉴클레오타이드 서열의 발현이 바람직하다. 그러나 많은 경우에, 1종 이상의 해충에 대한 보호가 추구되므로, 다수 조직에서 발현이 바람직하다. 쌍자엽식물로부터 많은 프로모터가 단자엽식물에서 유효하게 나타났으며, 반대로 이상적으로는 쌍자엽식물 프로모터는 쌍자엽식물에서 발현하기 위해 선택되며, 단자엽식물 프로모터는 단자엽식물에서 발현하기 위해 선택된다. 그러나 선택된 프로모터의 기원에 대한 제한은 없으며; 충분히 이들은 바람직한 세포에서 뉴클레오타이드 서열의 발현을 구동하는 데에 유효하다.
지속적으로 발현되는 바람직한 프로모터는 악틴 또는 유비퀴틴을 암호화하는 유전자로부터의 프로모터 및 CaMV 35S 및 19S 프로모터를 포함한다. 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 또한, 화학적으로 조절되는 프로모터의 조절하에 발현될 수 있다. 이에 의해 살충 독소는, 농작물 식물이 유도성 화학물질로 처리되는 경우에만 합성될 수 있다. 유전자 발현의 화학적 유도에 바람직한 기술은 공개된 출원 EP 제0 332 104호(Ciba-Geigy) 및 미국 특허 제5,614,395호에 상세하게 기술되어 있다. 화학적 유도에 바람직한 프로모터는 담배 PR-1a 프로모터이다.
바람직한 범주의 프로모터는 상처 유도성인 것이다. 상처 부위에서 및 식물 병원성 감염 부위에서 발현되는 많은 프로모터가 기술되어 있다. 이상적으로, 이러한 프로모터는 감염 부위에서 국소적으로만 활성이며, 이 방법에서 살충 독소는 침범하는 해충을 사멸시키는 살충 독소를 합성할 필요가 있는 세포에서 축적될 뿐이다. 이러한 종류의 바람직한 프로모터는 문헌에 기술된 것을 포함한다[참조: Stanford et al. Mol. Gen. Genet. 215: 200-208 (1989), Xu et al. Plant Molec. Biol. 22: 573-588 (1993), Logemann et al. Plant Cell 1: 151-158 (1989), Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22: 783-792 (1993), Firek et al. Plant Molec. Biol. 22: 129-142 (1993), and Warner et al. Plant J. 3: 191-201 (1993)].
바람직한 조직 특이적 발현 패턴은 녹색 조직 특이적, 뿌리 특이적, 줄기 특이적 및 꽃 특이적인 것을 포함한다. 녹색 조직에서 발현에 적합한 프로모터는 광합성에 관여하는 유전자를 조절하는 많은 것을 포함하며, 이들 중의 많은 것은 단자엽식물 및 쌍자엽식물 둘 모두로부터 클로닝되었다. 바람직한 프로모터는 포스포에놀 카복실라제 유전자로부터의 옥수수 PEPC 프로모터이다[참조: Hudspeth & Grula, Plant Molec. Biol. 12: 579-589 (1989)]. 뿌리 특이적 발현에 바람직한 프로모터는 de Framond에 의해 기술된 것이다[참조: FEBS 290: 103-106 (1991); EP 제0 452 269호(Ciba-Geigy)]. 바람직한 줄기 특이적 프로모터는 미국 특허 제5,625,136호(Ciba-Geigy)에 기술된 것이며, 이는 옥수수 trpA 유전자의 발현을 구동시킨다.
본 발명의 특히 바람직한 양태는 본 발명의 하나 이상의 뉴클레오타이드 서 열을 뿌리-선호된 또는 뿌리-특이적 방식으로 발현하는 형질전환된 식물이다. 추가의 바람직한 양태는 뉴클레오타이드 서열을 상처-유도성 또는 병원체 감염-유도성 방식으로 발현하는 형질전환된 식물이다.
적합한 프로모터의 선택 이외에, 식물에서 살충 독소의 발현에 대한 작제물은 적합한 전사 터미네이터가 이종 뉴클레오타이드 서열의 하류에 부착되는 것을 필요로 한다. 이러한 많은 터미네이터는 입수가능하며, 당해 분야에 공지되어 있다(예: CaMV로부터의 tm1, rbcS로부터의 E9). 식물에서 기능한다고 공지된 유용한 터미네이터는 본 발명에서 사용될 수 있다.
많은 다른 서열이 본 발명에 기술된 발현 카세트에 혼입될 수 있다. 이들은 인트론 서열(예: Adh1 및 bronze1으로부터의) 및 바이러스 리더 서열(예: TMV, MCMV 및 AMV로부터의)과 같이 발현을 증진시킨다고 나타난 서열을 포함한다.
식물에서 상이한 세포 정위(localization)로 본 발명의 뉴클레오타이드 서열의 발현을 표적화하는 것이 바람직할 수 있다. 특정한 경우, 세포질에서 정위가 바람직한 반면, 다른 경우에 특정한 세포내기관에서 정위가 바람직할 수 있다. 형질전환된 유전자 암호화된 효소의 세포내 정위는 당해 분야에서 익히 공지된 기술을 사용하여 수행된다. 일반적으로, 공지된 세포내기관-표적 유전자 산물로부터 표적 펩타이드를 암호화하는 DNA가 조작되며, 뉴클레오타이드 서열의 상류에 융합시킨다. 많은 이러한 표적 서열이 엽록체에 대해 공지되어 있고, 이종 작제물에서 이의 기능이 제시된 바 있다. 본 발명의 뉴클레오타이드 서열의 발현은 또한, 소포체로 또는 숙주 세포의 액포로 표적화된다. 이를 수행하는 기술은 당해 분야에 익히 공지되어 있다.
식물 형질전환에 적합한 벡터는 본 명세서의 다른 곳에 기술되어 있다. 아그로박테리움-매개된 형질전환을 위해서, 이원 벡터 또는 하나 이상의 T-DNA 경계 서열을 운반하는 벡터가 적합한 한편, 직접 유전자 전달을 위해서, 어떠한 벡터이든지 적합하고, 목적하는 작제물만을 함유하는 선형 DNA가 바람직할 수 있다. 직접 유전자 전달의 경우에, 하나의 DNA 종을 사용하는 형질전환 또는 동시-형질전환이 사용될 수 있다[참조: Schocher et al. Biotechnology 4: 1093-1096 (1986)]. 직접 유전자 전달 및 아그로박테리움-매개된 전달을 위해서, 형질전환은 일반적으로(필수적으로는 아닌) 항생제(카나마이신, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트) 또는 제초제(베스타)에 대한 내성을 제공할 수 있는 선택성 표지로 수행된다. 이러한 표지의 예는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제, 디하이드로폴레이트 리덕타제, 포시피노트리신 아세틸트랜스퍼라제, 2,2-디클로로프로프리온산 데할로게나제, 아세토하이드록시산 신타제, 5-에놀피루빌-시키메이트 -포스페이트 신타제, 할로아릴니트릴라제, 프로토포르하이리노겐 옥시다제, 아세틸 -조효소 A 카복실라제, 디하이드로프테로에이트 신타제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 및 β-글루쿠로니다제이다. 그러나 식물 형질전환에 대한 선택성 또는 선별성 표지의 선택은 본 발명에 중요하지 않다.
상기에서 기술된 재조합 DNA는 식물 세포에 당해 분야에 인식된 다수의 방법으로 도입될 수 있다. 당해 분야의 전문가는 방법의 선택이 형질전환에 표적화된 식물의 종류에 따른다는 것을 이해한다. 식물 세포를 형질전환시키는 적합한 방법은 미세주입법[참조: Crossway et al., BioTechniques 4:320-334 (1986)]; 전기천공법[참조: Riggs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606 (1986)], 아그로박테리움-매개된 형질전환법[참조: Hinchee et al., Biotechnology 6:915-921 (1984)]을 포함하며; 또한, 다음을 참고한다: 옥수수 형질전환에 대한 문헌[참조: Ishda et al., Nature Biotechnology 14:745-750 (June 1996)], 직접 유전자 전달[참조: Paszkowski et al., EMBO J. 3:2717-2722 (1984)]; Hayashimoto et al., Plant Physiol. 93:857-863 (1990)(쌀), 및 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 Agracetus, Inc. 및 미국 델라웨어주 윌밍턴 소재의 Dupont, Inc.로부터 입수가능한 장치를 사용하는 충격 입자 가속법[참조: Sanford et al., 미국 특허 제4,945,050호 및 McCabe et al., Biotechnology 6:923-926 (1988)]. 또한, 다음을 참고한다: 문헌[Weissinger et al., Annual Rev. Genet. 22:421-477 (1988); Sanford et al., Particulate Science and Technology 5:27-37 (1987)(양파); Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8526-8530(1990)(담배 엽록체); Christou et al., Plant Physiol. 87: 671-674(1988)(대두); McCabe et al., Bio/Technology 6: 923-926(1988)(대두); Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 4305-4309(1988)(옥수수); Klein et al., Bio/Technology 6: 559-563(1988)(옥수수); Klein et al., Plant Physiol. 91: 440-444(1988)(옥수수); Fromm et al., Bio/Technology 8: 833-839(1990)(옥수수); Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603-618(1990)(옥수수); Koziel et a., Biotechnology 11: 194-200(1993)(옥수수); Shimamoto et al., Nature 338: 274-277(1989)(쌀); Christou et al., Biotechnology 9: 957-962(1991)(쌀); Datta et al., Bio/Technology 8: 736-740(1990)(쌀); 유럽 특허원 EP 제0 332 581호(새발풀 및 다른 Pooideae); Vasil et al., Biotechnology 11: 1553-1558(1993)(밀); Weeks et al., Plant Physiol, 102: 1077-1084(1993)(밀); Wan et al., Plant Physiol. 104: 37-48(1994)(보리); Jahne et al., Theor. Appl. Genet. 89:525-533(1994)(보리); Umbeck et al., Bio/Technology 5: 263-266(1987)(목화); Casas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11212-11216(1993. 12월)(수수); Somers et al., Bio/Technology 10: 1589-1594(1992, 12월)(귀리); Torbert., Plant Cell Reports 14: 635-640(1995)(귀리); Weeks et al., Plant Physiol. 102: 1077-1084(1993)(밀); Chang et al., WO 94/13822(밀); 및 Nehra et al., The Plant Journal 5: 285-297(1994)(밀)]. 재조합 DNA 분자를 옥수수로 미세투사체 충격법(microprojectile bombardment)에 의해 도입하기 위해 특히 바람직한 양태 세트가 문헌에서 밝혀질 수 있다[참조: Koziel et al., Biotechnology 11: 194-200 (1993), Hill et al., Euphytica 85:119-123 (1995) and Koziel et al., Annals of the New York Academy of Sciences 792:164-171 (1996)]. 추가의 바람직한 양태는 EP 제0 292 435호에서 기술된 원형질체 형질전환법이다. 식물의 형질전환은 단일 DNA 종 또는 다수의 DNA 종으로 수행될 수 있으며(즉, 동시-형질전환), 이들 기술은 둘 모두 퍼옥시다제 암호화 서열로 사용하기에 적합하다.
다른 바람직한 양태에서, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 색소체 게놈으로 직접 형질전환된다. 색소체 형질전환의 주요 잇점은 색소체가 일반적으로 실질적 변경 없이 세균 유전자를 발현시킬 수 있고, 색소체가 단일 프로모터의 조절하에 다수의 개방 판독 프레임을 발현시킬 수 있다는 것이다. 색소체 형질전환 기술은 미국 특허 제5,451,513호, 제5,545,817호 및 제5,545,818호에, PCT 출원 WO 95/16783에 및 문헌[참조: McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7301-7305]에 광범위하게 기술되어 있다. 엽록체 형질전환의 기본 기술은 선택성 표지에 접한 클로닝된 색소체 DNA의 영역을 목적하는 유전자와 함께 적합한 표적 조직으로, 예를 들어, 생물체탄도 또는 원형질체 형질전환(예: 염화칼슘 또는 PEG 매개된 형질전환)을 사용하여 도입함을 포함한다. 표적 서열이라 칭하는 1 내지 1.5kb의 인접 영역은 색소체 게놈과 상동 재조합을 촉진하므로, 색소체내 유전물질의 특이적 영역을 대체 또는 변경시킨다. 최초에, 스펙티노마이신 및/또는 스트렙토마이신에 대한 내성을 부여하는 엽록체 16S rRNA 및 rps12 유전자에서 점 돌연변이는 형질전환에 대한 선택성 표지로서 사용된다[참조: Svab, Z., Hajduklewicz P., and Maliga, P. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8526-8530; Staub, J. M. and Maliga, P. (1992) Plant Cell 4, 39-45]. 이는 표적 잎의 100회 충격당 약 1회의 빈도로 안정한 동종세포형질의 형질전환체를 생산한다. 이들 표지 사이에서 클로닝 부위의 존재에 의해 외래 유전자의 도입을 위한 색소체 표적 벡터를 형성한다[참조: Staub, J.M., and Maliga, P. (1993) EMBO J. 12, 601-606]. 형질전환 빈도의 실질적 증가는 열성 rRNA 또는 r-단백질 항생제 내성 유전자를 우성 선택성 표지, 스펙티노마이신-해독 효소 아미노글리코사이드-3'-아데닐트랜스퍼라제를 암호화하는 세균성 aadA 유전자로 대체하여 수득된다[참조: Svab, Z., and Maliga, P. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 913-917]. 이전에, 이 표지는 녹조류 클라미도모나스 레이하르드티(Chlamydomonas reinhardtii)의 색소체 게놈의 고 빈도 형질전환에 성공적으로 사용되었다[참조: Goldschmidt-Clermont, M. (1991) Nucl. Acids Res. 19:4083-4089]. 색소체 형질전환에 유용한 다른 선택성 표지는 당해 분야에 공지되어 있으며, 본 발명의 범위내에 포함된다. 일반적으로, 형질전환 후에 약 15 내지 20개의 세포 분할 주기가 동종색소체 상태에 도달하는 데에 필요하다. 유전자가 각각의 식물 세포에 존재하는 수 천개의 주형 색소체 게놈의 복사체 모두에 상동 재조합에 의해 삽입되는 색소체 발현은 핵-발현된 유전자보다 막대한 복사체 수의 잇점이라는 잇점을 가져 전체 가용성 식물 단백질의 10%를 용이하게 초과할 수 있는 발현 수준을 허용한다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 색소체 표적 벡터에 삽입되고, 바람직한 식물 숙주의 색소체 게놈으로 형질전환된다. 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 색소체 게놈에 동종세포형질의 식물이 수득되며, 바람직하게는 뉴클레오타이드 서열을 높게 발현시킬 수 있다.
살충 조성물의 제형
본 발명은 또한, 본 발명의 하나 이상의 살충 독소를 포함하는 조성물을 포함한다. 효과적으로 해충을 방제하기 위해서, 이러한 조성물은 바람직하게는 충분한 양의 독소를 함유한다. 이러한 양은 보호하고자 하는 농작물, 표적이 되는 특정 해충 및 환경 조건(예: 토양의 습도, 온도 또는 종류)에 따라 변한다. 바람직한 양태에서, 살충 독소를 포함하는 조성물은 추가로 정제하지 않고 독소를 발현하는 숙주 세포를 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 살충 독소를 발현하는 세포는 살충제로서 사용하기 전에 동결건조시킨다. 다른 양태에서, 살충 독소는 숙주 세포로부터 분비되도록 조작된다. 독소가 발현되는 숙주 세포로부터 독소의 정제가 바람직한 경우에, 살충 독소의 여러 정도의 정제가 수행된다.
본 발명은 또한, 본원에 기술된 하나 이상의 화합물 또는 화합물 그룹과 균질하게 혼합되는, 본 발명의 하나 이상의 살충 독소를 포함하는 조성물의 제조를 포함한다. 본 발명은 또한, 살충 독소 또는 살충 독소를 함유하는 조성물을 식물에 살포함을 특징으로 하여, 식물을 처리하는 방법에 관한 것이다. 살충 독소는 농작물 영역에 처리되는 조성물 또는 식물 형태로, 동시에 또는 연속적으로 추가의 화합물을 사용하여 적용할 수 있다. 이들 화합물은 식물 성장에 영향을 주는 비료 또는 미량영양소 공여체 또는 다른 제제일 수 있다. 이들은 또한, 필요한 경우, 제형의 분야에서 통상적으로 사용되는 추가의 담체, 계면활성제 또는 적용 촉진 보조제와 함께 선택성 제초제, 살충제, 살진균제, 살균제, 살선충제, 살연체동물제 또는 수종의 이들 제제의 혼합물일 수 있다. 적합한 담체 및 보조제는 고체 또는 액체이고, 제형화 기술에 일반적으로 사용되는 물질, 예를 들어, 천연 또는 재생 무기 물질, 용매, 분산제, 습윤제, 점착성부여제, 결합제 또는 비료에 상응할 수 있다.
본 발명의 살충 독소를 살포하는 바람직한 방법은 토양, 물 또는 식물의 잎과 같은 해충이 사는 환경에 분무하는 것이다. 적용의 횟수 및 적용의 비율은 해충에 의해 침범된 유형 및 강도에 따라 다르다. 살충 독소는 또한, 식물의 부위를 액상 조성물로 함침시켜 또는 토양에 고체 형태로, 예를 들어, 입상 형태로 화합물을 적용하여(토양 적용) 토양을 거쳐 뿌리를 통해서 식물로 침투할 수 있다(전신 작용). 살충 독소는 또한, 살충 독소를 함유하는 액상 제형으로 종자를 함침시키거나, 이를 고형 제형으로 도포하여 종자에 살포할 수 있다(토양 살포). 특정한 경우에, 추가 유형의 적용이 또한 가능하며, 예를 들어, 식물 줄기 또는 싹의 선택적 처리이다. 살충 독소는 또한, 땅의 위에 또는 아래에 위치한 미끼로서 제공될 수 있다.
살충 독소는 비개질 형태로 또는 바람직하게는 제형 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제와 함께 사용되며, 따라서 공지된 방법으로 유화성 농축제, 도포성 페이스트, 직접 분무성 또는 희석성 액제, 희석 유제, 습윤성 산제, 가용성 산제, 분산제, 과립제, 및 중합체 물질 중의 봉입제로 제형화된다. 조성물의 특성과 같이, 적용 방법, 예를 들어, 분무, 연무, 분산, 살포 또는 주입이 예정된 대상 및 우세한 환경에 따라서 선택된다.
살충 독소를 함유하는 제형, 조성물 또는 제제 및 필요한 경우, 고체 또는 액체 보조제는 공지된 방법으로, 예를 들어, 살충 독소와 증량제, 예를 들어, 용매, 고형 담체 및 필요한 경우, 계면활성 화합물(계면활성제)을 균질하게 혼합하고/하거나 분쇄하여 제조한다.
적합한 용매에는 방향족 탄화수소, 바람직하게는 탄소수 8 내지 12개의 분획, 예를 들어, 자일렌 혼합물 또는 치환된 나프탈렌, 프탈레이트(예: 디부틸 프탈레이트 또는 디옥틸 프탈레이트), 지방족 탄화수소(예: 사이클로헥산 또는 파라핀), 알콜 및 글리콜 및 이의 에테르 및 에스테르, 예를 들어, 에탄올, 에틸렌 글리콜 모노메틸 또는 모노에틸 에테르, 케톤(예: 사이클로헥산온), 강한 극성 용매(예: N-메틸-2-피롤리돈, 디메틸 설폭사이드 또는 디메틸 포름아미드) 뿐만 아니라 에폭시화 식물성 오일(예: 에폭시화 코코넛 오일 또는 대두유) 또는 물이 포함된다.
예를 들어, 분산제 및 분산성 산제에 사용되는 고체 담체는 일반적으로 천연 무기 충전제(예: 칼사이트, 탈크, 카올린, 몬모릴로나이트 또는 애터펄자이트)이다. 물리적 특성을 개선시키기 위해서, 고분산성 규산 또는 고분산성 흡수제 중합체를 첨가할 수 있다. 적합한 과립상 흡착성 담체는 다공성 형태, 예를 들어, 경석, 깨진 벽돌, 세피올라이트 또는 벤토나이트이며; 적합한 비흡수성 담체는 칼사이트 또는 모래와 같은 물질이다. 또한, 무기 또는 유기 특성의 많은 예비과립화된 물질이 사용될 수 있으며, 예를 들어, 특히 돌로마이트 또는 분쇄된 식물 잔사이다.
적합한 계면활성제 화합물은 우수한 유화, 분산 및 습윤 특성을 갖는 비이온성, 양이온성 및/또는 음이온성 계면활성제이다. "계면활성제"라는 용어는 또한, 계면활성제의 혼합물을 포함하는 것으로 이해된다. 적합한 음이온성 계면활성제는 수용성 비누 및 수용성 합성 계면활성제 화합물일 수 있다.
적합한 비누는 고급 지방산(탄소수 10 내지 22개의 쇄)의 알칼리금속염, 알칼리토금속염 또는 치환되지 않거나 치환된 암모늄염, 예를 들어, 올레인산 또는 스테아르산의 나트륨염 또는 칼륨염, 또는 예를 들어, 코코넛 오일 또는 수지 오일로부터 수득될 수 있는 천연 지방산 혼합물의 것이다. 지방산 메틸타우린염이 또한 사용될 수 있다.
그러나 더욱 빈번하게는, 소위 합성 계면활성제, 특히 지방산 설포네이트, 지방산 설페이트, 설폰화 벤즈이미다졸 유도체 또는 알킬아릴설포네이트가 사용된 다.
지방산 설포네이트 또는 설페이트는 일반적으로 알칼리금속염, 알칼리토금속염 또는 치환되지 않거나 치환된 암모늄염의 형태로 존재하며, 알킬 라디칼의 알킬 잔기를 또한 포함하는 탄소수 8 내지 22개의 알킬 라디칼을 갖고, 예를 들어, 리그논설폰산의, 도데실설페이트의 또는 천연 지방산으로부터 수득된 지방산 알콜 설페이트의 나트륨 또는 칼슘염이다. 이들 화합물은 또한, 지방 알콜/에틸렌 옥사이드 부가물의 황산 에스테르 및 설폰산의 염을 포함한다. 설폰화 벤즈이미다졸 유도체는 바람직하게는 2개의 설폰산 그룹 및 탄소수 8 내지 22개의 지방산 라디칼 하나를 함유한다. 알킬아릴설포네이트의 예는 도데실벤젠설폰산, 디부틸나프탈렌설폰산 또는 나프탈렌설폰산/포름알데히드 축합 생성물의 나트륨, 칼슘 또는 트리에탄올아민염이다. 또한, 상응하는 포스페이트, 예를 들어, p-노닐페놀과 에틸렌 옥사이드 4 내지 14mole의 부가물의 인산 에스테르의 염이다.
비이온성 계면활성제는 바람직하게는 지방족 또는 지환족 알콜, 또는 포화된 또는 불포화 지방산 및 알킬페놀의 폴리글리콜 에테르 유도체이며, 상기 유도체는 (지방족) 탄화수소 잔기에 3 내지 30개의 글리콜 에테르 그룹 및 8 내지 20개의 탄소 원자 및 알킬페놀의 알킬 잔기에 6 내지 18개의 탄소 원자를 함유한다.
추가의 적합한 비이온성 계면활성제는 폴리에틸렌 옥사이드와 폴리프로필렌 글리콜의 수용성 부가물, 에틸렌디아민 프로필렌 글리콜 및 알킬 쇄에 1 내지 10개의 탄소 원자를 함유하는 알킬폴리프로필렌 글리콜이며, 부가물은 20 내지 250개의 에틸렌 글리콜 에테르 그룹 및 10 내지 100개의 프로필렌 글리콜 에테르 그룹을 함유한다. 이들 화합물은 일반적으로 프로필렌 글리콜 단위당 1 내지 5개의 에틸렌 글리콜 단위를 함유한다.
비이온성 계면활성제의 대표적 예는 노닐페놀폴리에톡시에탄올, 피마자유 폴리글리콜 에테르, 폴리프로필렌/폴리에틸렌 옥사이드 부가물, 트리부틸페녹시폴리에톡시에탄올, 폴리에틸렌 글리콜 및 옥틸페녹시에톡시에탄올이다. 폴리옥시에틸렌 소르비탄의 지방산 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리올리에이트는 또한 적합한 비이온성 계면활성제이다.
양이온성 계면활성제는 바람직하게는 N-치환체로서 하나 이상의 C8-22 알킬 라디칼을 갖고, 추가의 치환체로서 저급 치환되지 않거나 할로겐화된 알킬, 벤질 또는 저급 하이드록시알킬 라디칼을 갖는 4급 암모늄염이다. 염은 바람직하게는 할라이드, 메틸설페이트 또는 에틸설페이트, 예를 들어, 스테아릴트리메틸암모늄 클로라이드 또는 벤질디(2-클로로에틸)에틸암모늄 브로마이드 형태이다.
제형 분야에 통상적으로 사용되는 계면활성제는, 예를 들어, 문헌에 기술되어 있다[참조: "McCutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual", MC Publishing Corp. Ringwood, New Jersey, 1979, and Sisely and Wood, "Encyclopedia of Surface Active Agents", Chemical Publishing Co., Inc. New York, 1980].
본 발명은 다음의 상세한 실시예를 참고하여 추가로 기술된다. 이들 실시예는 예시할 목적으로만 제공되며, 달리 언급하지 않는 한, 제한하려는 것은 아니다. 본원에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당해 분야에 익히 공지되어 있으며, 문헌에 기술되어 있다[참조: Ausubel (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994): T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989); and by T.J. Silhavy, M.L. Berman, and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)].
A. 발현되어 인시류 곤충에 대해 활성인 독소를 생산하는 뉴클레오타이드 서열의 분리
실시예 1
제노르하브두스 및 포토르하브두스 균주의 성장
곤충 생물검정을 위해서, 다음 균주를 영양 육즙에서 25℃에서 3일 동안 ATCC에 의해 추천된 성장 배지 중에 성장시킨다. DNA 분리하기 위해서, 배양물을 24시간 동안 동일한 조건하에 성장시킨다.
제노르하브두스 네마토필러스 균주 ATCC 19061
제노르하브두스 네마토필러스 균주 Ps1, USDA 분리물
제노르하브두스 포이나리 균주 ATCC 49122
포토르하브두스 루미네센스 균주 Ps5, USDA 분리물
실시예 2
곤충 생물검정
플루텔라 자일로스텔라(Px) 생물검정은 50㎕의 각각의 이. 콜라이 배양물을 고체 인공 피. 자일로스텔라 식이에 대해 분취하여 수행한다[참조: Biever and Boldt, Annals of Entomological Society of America, 1971; Shelton, et al. J. Ent. Sci 26:17]. 4㎖의 식이를 1 온스의 투명한 플라스틱 컵(Bioserve product #9051)에 붓는다. 식이 적합된 실험실 콜로니로부터 5마리의 신생 피. 자일로스텔라를 각각의 식이를 함유하는 컵에 놓은 다음에, 백색 종이 덮개(Bioserve product #9049)로 덮는다. 농도당 10마리의 유충을 검정한다. 컵의 트레이를 배양기에서 3일 동안 72℉에서 14:10(시간)의 명:암 주기로 배치한다. 각각의 컵에 살아있는 유충의 수를 기록한다.
실시예 3
생물검정의 결과
제노르하브두스 네마토필러스 균주 ATCC 19061의 육즙은 실시예 2의 곤충 생물검정에서 플루텔라 자일로스텔라(Px)에 대해 100%의 사멸율을 제공한다. 제노르하브두스 네마토필러스 균주 Ps1, 제노르하브두스 포이나리 균주 ATCC 49122 및 포토르하브두스 루미네센스 균주 Ps5 각각의 육즙은 마찬가지로 실시예 2의 곤충 생물검정에서 플루텔라 자일로스텔라(Px)에 대해 100%의 사멸률을 제공한다.
실시예 4
코스미드 라이브러리의 구성
전체 DNA는 제노르하브두스 네마토필러스 균주 ATCC 19061로부터, 100mM 트리스 pH 8, 10mM EDTA에 재현탁된 방금 성장한 세포를 2㎎/㎖ 리소자임으로 30분 동안 37℃에서 처리하여 분리한다. 프로테아제 K를 0.5% SDS 중의 100㎍/㎖의 최종 농도로 첨가하고, 45℃에서 배양한다. 용액은 투명하고 매우 점성으로 된다. SDS 농도는 1%까지 증가하고, 300mM NaCl 및 동일 용적의 페놀-클로로포름-이소아밀 알콜을 첨가한다. 샘플은 5분 동안 부드럽게 혼합하고, 3K에서 원심분리한다. 이를 2회 반복한다. 다음에, 수성 상을 0.7용적의 이소프로판올과 혼합하고 원심분리한다. DNA 펠릿을 70% 에탄올로 3회 세척하고, 0.5X TE에 부드럽게 재현탁시킨다. DNA 6㎍을 0.3단위의 Sau3A/㎍ DNA로 37℃에서 3.5분 동안 100㎕의 용적으로 처리한다. 다음에, 샘플을 30분 동안 65℃에서 가열하여 효소를 불활성화시킨 다음에, 소의 장 알칼리 포스파타제 2 단위로 30분 동안 37℃에서 항온처리한다. 샘플을 동일한 용적의 페놀-클로로포름-이소아밀 알콜과 혼합하고 원심분리한다. 수성 상을 제거하고, 0.7용적의 이소프로판올과 혼합하고 원심분리한다. 펠릿을 0.5X TE에 100ng/㎖의 농도로 재현탁시킨다.
SuperCos 코스미드 벡터(캐나다 라 졸라 소재의 Stratagene)는 BamHI 클로닝 부위를 사용하여 공급자에 의해 기술된 바와 같이 제조한다. 100ng/㎖에서 제조된 SuperCos를 2:1 비에서 5㎕의 용적으로 밤새 6℃에서 Sau3A로 미리 절단된 X. 네마토필러스 DNA와 연결시킨다. 연결 혼합물을 공급자에 의해 기술된 바와 같이 Gigapack XL III(Stratagene)을 사용하여 충전한다. 충전된 파아지는 공급자에 의해 기술된 바와 같이 XL-1MR 이. 콜라이 세포(Stratagene)에 감염시킨다. 코스미드 라이브러리를 L-한천 상에서 50㎍/㎖ 카나마이신과 함께 플레이팅하고, 16시간 동안 37℃에서 배양한다. 500개의 콜로니가 신선한 L-kan 플레이트에 50/플레이트의 밀도로 반점을 이룬다. 세포를 L 육즙으로 세척 제거하고, 20% 글리세롤과 혼합하고, -80℃에서 동결시킨다.
엑스. 네마토필러스의 4.2Mb의 큰 게놈의 경우, 평균 크기가 40kb인 클론 450개는 게놈의 4배 적용 범위에 상응한다. 따라서, 450개 클론을 선별하면 유전자 발견의 가능성이 99%로 된다.
제노르하브두스 네마토필러스 균주 Ps1, 제노르하브두스 포이나리 균주 ATCC 49122 및 포토르하브두스 루미네센스 균주 Ps5로부터 코스미드 라이브러리는 유사한 방식으로 작제된다.
실시예 5
살충 활성을 갖는 클론의 코스미드 생물검정 및 동정 결과
각각의 코스미드 라이브러리로부터 400개의 이. 콜라이 클론을 곤충 생물검 정에 의해 선별하여 플루텔라 자일로스텔라에 대한 활성을 갖는 클론을 생산한다. 제노르하브두스 네마토필러스 균주 ATCC 19061로부터 살충성 코스미드 클론은 pCIB9362로 동정된다. 제노르하브두스 네마토필러스 균주 Ps1으로부터 42kb 살충성 코스미드 클론은 pCIB9379로서 동정된다. 제노르하브두스 포이나리 균주 ATCC 49122로부터 42kb 살충성 코스미드 클론은 pCIB9354로서 동정된다. 포토르하브두스 루미네센스 균주 Ps5로부터 7kb 살충성 코스미드 클론은 pCIB9383-21로서 동정된다.
실시예 6
살충 활성을 갖는 서브클론의 분리
클론 pCIB9362를 SaclI로 분해시키고, 9kb DNA 단편을 분리한다. 이 단편을 SacII을 사용하여 Bluescript 절단물로 연결한다. 연결 혼합물을 분자 클로닝 제2판(Sambrook 등)에 기술된 바와 같이 DH5α 이. 콜라이 세포로 형질전환시킨다. 형질전환 혼합물을 L 한천 + 100㎍/㎖ 암피실린 상에 플레이팅하고, 37℃에서 밤새 배양한다. 분리된 콜로니를 L 육즙에서 100㎍/㎖ 암피실린과 함께 증식시키고, 플라스미드 DNA는 분자 클로닝 제2판에 기술된 바와 같이 알칼리 miniprep으로 분리한다. 9kb SacII 클론은 pCIB9362-3으로 동정되며, 플루텔라 자일로스텔라에 대해 생물검정하는 경우, 100%의 사멸율을 제공한다. 3㎍의 pCIB9362-3을 분리하고, 0.3단위의 Sau3A/㎍ DNA로 4, 6 및 8분 동안 37℃에서 절단시키고, 75℃에서 15분 동안 가열한다. 샘플을 풀링하고, 미리 BamHI로 절단된 pUC19내로 연결시키고, 소의 장 알칼리 포스파타제로 처리한다. 연결물은 DH5α 이. 콜라이 세포로 형질전환시키고, 분자 클로닝에 기술된 바와 같이 L 한천 상에서 Xgal/Amp와 함께 플레이팅하고, 밤새 37℃에서 증식시킨다. 백색 콜로니를 꺼내어 L 육즙에서 100㎍/㎖ 암피실린과 함께 증식시키고, 플라스미드 DNA를 앞에서 기술된 바와 같이 분리한다. DNA를 EcoRI/HindIII으로 분해시키고, 신규한 제한 패턴을 서열 분석한다. 서열 분석 프라이머는 Genosys Biotechnologies(미국 텍사스주 우드랜드 소재)로부터 주문한다. 서열 분석은 디데옥시 쇄-말단화 방법을 사용하여 수행하고, Applied Biosystems Inc. model 377 자동화 DNA 서열기(캐나다 포스터 시티 소재)를 사용하여 완결한다. 서열은 Gene Codes Corporation(미국 미시간주 앤 아버 소재)로부터의 서열기 3.0을 사용하여 조립한다.
제한 부위 및 잠재적인 ORF의 동정 후, pCIB9362-3을 ClaI로 절단시키고, 3.0kb 단편을 Bluescript내로 분리하여 클로닝하고, DH5α 이. 콜라이 세포로 형질전환시킨다. 분리된 콜로니를 앞에서 기술된 바와 같이 증식시키고, 플라스미드 DNA는 알칼리 방법으로 분리한다. 서브클론은 pCIB9369로서 동정되고, 생물검정에서 플루텔라 자일로스텔라에 대해 100%의 사멸률을 제공한다. pCIB9369는 1997년 11월 12일에 기탁되었으며, 기탁기관(USDA ARS Patent Culture Collection)에서 NRRL 기탁 번호 B-21883으로 확인되었다.
pCIB9381로 동정된 20kb 단편을 코스미드 pCIB9379로부터 NotI 분해물을 사용하여 서브클로닝한다.
실시예 7
생물검정 결과
곤충 생물검정은 여러 곤충에 대한 pCIB9369에 대해 수행한다.
곤충 pCIB9369
플루텔라 자일로스텔라(Plutella xylostella) 헬리오티스 비레센스(Heliothis virescens) 헬리오베르파 제아(Helioverpa zea) 스포도프테라 엑스귀아(Spodoptera exguia) 씨. 엘레강스(C. elegans) +++ na na na na
na = 활성이 없음 + = 상당한 증식 억제 ++ = 40%를 초과하지만 100% 미만의 사멸율 +++ = 100% 사멸율
이들 결과는 pCIB9369에서 3.0kb 뉴클레오타이드 서열의 발현으로부터 초래된 살충 독소가 플루텔라 자일로스텔라에 대해 매우 활성임을 나타낸다.
pCIB9381, pCIB9354 및 pCIB9383-21에 대한 생물검정은 또한, 플루텔라 자일로스텔라에 대해 높은 살충 활성을 나타낸다.
실시예 8
살충 활성의 크기 분획
이. 콜라이 숙주 DH5에서 제노르하브두스 네마토필러스 코스미드 클론 pCIB9369 및 스트라타진사(Stratagene)의 Blue Script 벡터를 50% 테리픽 육즙 및 50% 루리아 육즙으로 이루어지고 50㎍/㎖의 암피실린으로 보충된 배지에서 증식시킨다. 진탕 플라스크 배양물(1000㎖ 배플 플라스크에서 300㎖)을 250 RPM으로 밤새 37℃에서 증식시킨다. 각 균주의 배양물을 7,000 RPM으로 Sorvall GS-3 회전기 에서 4℃에서 원심분리한다. 펠릿화된 세포를 30㎖의 50mM NaCl, 25mM 트리스 염기, pH 7.0에 재현탁시킨다. 농축된 세포를 Branson 모델 450 초음파처리기를 사용하여 약 8회의 10초 주기 동안 주기 사이에 얼음 위에서 냉각시키면서 초음파처리하여 분해시킨다. 초음파 처리물을 Sorvall SS34 회전기에서 6,000 RPM으로 10분 동안 4℃에서 원심분리한다. 수득된 상등액을 0.2μ 필터를 통해 여과한다. 원심분리된 초음파 처리물로부터의 펠릿을 30㎖의 50mM NaCl, 25mM 트리스 염기, pH 7.0에 재현탁시킨다.
3㎖ 분획의 여액을 10㎖의 50mM NaCl, 25mM 트리스 염기, pH 7.0으로 미리 평형화된 Bio-Rad Econo-Pac 10DG 컬럼에 적용한다. 샘플 부하 동안에 수집된 유동액을 폐기한다. 샘플을 각각 4㎖의 NaCl-트리스 평형 완충액을 2회 연속 부가하여 분배시킨다. 제1의 3개 분획을 시험하기 위해 저장한다. 제1 분획은 분자량의 약 6,000 이상인 물질을 모두 함유한다. 후속 분획은 분자량이 6,000 미만인 물질을 함유한다.
초음파 처리된 여액 및 초음파 처리 후에 재현탁된 펠릿의 샘플을 표면 오염 분석에서 피. 자일로스텔라 신생물에 대한 활성에 대해 10DG 컬럼으로부터 3개의 분획을 사용하여 시험한다. 초음파 처리물의 여과된 상등액 및 9369 샘플로부터 제1 컬럼의 분획은 피. 자일로스텔라에 대해 매우 활성이다. 9369 샘플로부터 제2 및 제3 분획은 활성이 아니다. Blue Script 플라스미드 배양물을 함유하는 DH5a로부터의 샘플은 어느 것도 활성을 갖지 않는다. 이들 결과는 X. 네마토필러스 클론 pCIB9369 뿐만 아니라 pCIB9381, pCIB9354 및 pCIB9383-21로부터의 동족체에 대해 암호화된 살충 활성이 분자량 6,000보다 크다는 것을 암시한다.
실시예 9
살충 활성의 안정성
100㎍/㎖의 암피실린으로 보충된 루리아 육즙 300㎖를 pCIB9369로 접종하고, 밤새 37℃에서 증식시킨다. 샘플을 멸균 15㎖ 나사 뚜껑 튜브에 배치하고, 22℃ 및 4℃에서 저장한다. 샘플 하나를 원심분리하고, 상등액을 제거하고, 동결건조시키고, 22℃에서 저장한다. 이들 샘플은 이러한 조건하에 2주 동안 저장한 다음에, Px 대해 생물검정한다. 동결건조된 물질을 샘플을 동결건조시키기 전과 동일한 용적에 재현탁시킨다. 모든 샘플을 와동(vortexing)에 의해 재현탁시킨다. 다른 샘플을 100℃에서 5분 동안 처리한다.
처리 결과
22℃(2주) ++
4℃(2주) ++
동결 건조(2주) ++
5분 동안 100℃ na
na = 활성이 없음.
실시예 10
살충 활성의 열 불활성화
독소의 열 안정성을 측정한다. 이. 콜라이 균주 pCIB9369의 배양물(제노르하브두스 네마토필러스의 3.0kb DNA를 함유하는 이. 콜라이 숙주 DH5a)을 밤새 루리아 육즙 및 테리픽 육즙의 50:50 혼합물에서 증식시킨다. 배양물을 37℃에서 튜브 롤러 상의 배양 튜브에서 증식시킨다. 각각 1㎖의 배양물 샘플을 1.5㎖ 에펜도르프 튜브에 위치시키고 60℃, 80℃에 둔다. 샘플을 5분 후에 제거하고 실온으로 냉각시킨다. 이 샘플을 배양물의 비처리 부분과 함께 P. 자일로스텔라에 대해 분석한다. 50㎕의 샘플을 식이위에 살포하고, 건조시키고, 신생 유충 P. 자일로스텔라를 표면에 적용한다. 분석물은 5일 동안 실온에서 배양한다.
비처리 샘플 및 60℃에서 처리된 샘플은 100%의 사멸율을 초래한다. 80℃에서 처리된 샘플 및 식이만의 대조군은 측정가능한 사멸율을 초래하지 않는다.
실시예 11
살충 활성의 프로테아제 처리
이. 콜라이 숙주 DH5중의 제노르하브두스 네마토필러스 코스미드 클론 pCIB9369 및 스트라타진사의 Blue Script 벡터를 50% 테리픽 육즙 및 50% 루리아 육즙으로 이루어지고 50㎍/㎖의 암피실린으로 보충된 배지에서 증식시킨다. 진탕 플라스크 배양물(1000㎖ 배플 플라스크에서 300㎖)을 250 RPM으로 밤새 37℃에서 증식시킨다. 각 균주의 배양물을 7,000 RPM으로 Sorvall GS-3 회전기에서 4℃에서 원심분리한다. 펠릿화된 세포를 30㎖의 50mM NaCl, 25mM 트리스 염기, pH 7.0에 재현탁시킨다. 농축된 세포를 Branson 모델 450 초음파처리기를 사용하여 약 8회 의 10초 주기 동안 주기 사이에 얼음 위에서 냉각시키면서 초음파 처리하여 분해시킨다. 초음파 처리물을 Sorvall SS34 회전기에서 6,000 RPM으로 10분 동안 4℃에서 원심분리한다. 수득된 상등액을 0.2μ 필터를 통해 여과한다. 1㎖의 상등액 샘플을 CaCl2를 부가하여 5mM Ca++로 조절한다. 프로테아제 K(Gibco BRL; Gaithersburg, MD)를 500㎍/㎖로 부가한다. 샘플은 2시간 및 24시간 동안 37℃에서 항온처리한다. 대조 샘플을 제조하고, 프로테아제가 아닌 Ca++를 부가하여 항온처리한다.
pCIB9369 및 5mM Ca++의 존재하에 배양된 pCIB9369 샘플로부터 초음파 처리 여액은 플루텔라 자일로스텔라 신생 유충에 대해 100%의 사멸율을 초래한다. Ca++ 이외에 프로테아제 K를 사용하여 배양된 pCIB9369 샘플은 플루텔라에 대해 약간 더 낮은, 약 90%의 사멸율을 나타낸다.
실시예 12
cry3A의 단백질 서열 및 유충 호르몬 에스테라제의 단백질 서열과의 서열 비교
pCIB9369의 뉴클레오타이드 서열(서열 1)은 뉴클레오타이드 569-976 및 1045-2334에서 두개의 개방 판독 프레임(ORF)을 나타낸다. ORF #1은 UWGCG Blast 및 Gap 프로그램으로 조사한 결과 Genbank에서의 서열과 상동성을 전혀 갖지 않는다. Blast 프로그램에 의한 pCIB9369의 ORF #2에 의해 암호화된 단백질의 Gap 분석에 의해 바실러스 써링겐시스 cry3A 단백질에 대해 유의하지 않은 약간의 상동성(21% 동일성)을 확인한다. 그러나 Blast 프로그램에 의한 pCIB9369의 ORF #2(서열 3)에 의해 암호화된 단백질의 Gap 분석에 의해 유충 호르몬 에스테라제-관련된 단백질에 대한 상동성(30.6% AA 동일성 및 44.1% AA 유사성)을 확인한다[GenBank 승인 번호 2921553; Henikoff et al., PNAS USA 89:10915-10919 (1992)].
pCIB9381, pCIB9354 및 pCIB9383-21의 뉴클레오타이드 서열은 또한, 이들 각각의 클론의 경우에 두개의 개방 판독 프레임을 나타낸다. 각각의 pCIB9381 및 pCIB9383-21에서 두개의 ORF의 뉴클레오타이드 서열은 모두 pCIB9369에서의 것에 90% 이상 동일하다. 따라서, pCIB9381 및 pCIB9383-21의 ORF #2 단백질은 pCIB9369의 ORF #2 단백질이 그렇듯이 유충 호르몬 에스테라제-관련 단백질에 필수적으로 동일한 상동성을 갖는다. pCIB9354의 ORF #1의 뉴클레오타이드 서열은 pCIB9369의 ORF #1의 뉴클레오타이드 서열과 77% 동일하며, pCIB9354의 ORF #2의 뉴클레오타이드 서열은 pCIB9369의 ORF #2의 뉴클레오타이드 서열과 79% 동일하다. pCIB9354의 ORF #2 단백질은 또한, 유충 호르몬 에스테라제-관련 단백질에 상동성(29.2% AA 동일성 및 42.2% AA 유사성)을 갖는다.
실시예 13
pCIB9369 및 WO 98/08388로부터의 서열의 서열 비교
각각 60개의 뉴클레오타이드(60mer)의 22개의 서열은 뉴클레오타이드 서열이 WO 98/08388에 기술된 38.2kb DNA 단편으로부터 유도되며, pCIB9369를 포함하는 pCIB9362-3의 뉴클레오타이드 서열과 비교한다. 제1 60mer는 38.2kb DNA 단편의 염기 1에서 출발하는 한편, 다른 60mer들은 DNA 단편상의 약 2kb 간격에 위치한다. 38.2kb DNA 단편상에서 이의 위치는 다음에 기재되어 있다:
1-60; 2,041-2,100; 4,021-4,080; 6,001-6,060; 8,041-8,100; 10,021-10,080; 12,001-12,060; 14,041-14,100; 16,021-16,080; 18,001-18,060; 20,041-20,100; 22,021-22,080; 24,001-24,060; 26,041-26,100; 28,021-28,080; 30,001-30,060; 32,041-32,100; 34,021-34,080; 36,001-36,060; 38,041-38,100; 38,161-38,220.
서열은 UWGCG Gap 프로그램을 사용하여 비교하고, 22개의 60mer 서열 각각 뿐만 아니라 이의 상보성 서열을 시험한다. 이들 배열의 결과는 최고 동일성 비율이 53%이고, 이는 당해 분야에서 유의한 상동성으로 고려되지 않는다.
실시예 14
WO 98/08388 서열로부터 유도된 탐침을 사용하는 서던 블롯 분석
올리고뉴클레오타이드의 쌍은 WO 98/08388에 공개된 38.2kb DNA 단편의 DNA 단편을 증폭시키도록 고안된다. 올리고뉴클레오타이드는 Genosys Biotechnologies (미국 텍사스주 우드랜드 소재)로부터 주문하고, 38.2kb DNA 단편에서 이의 위치는 다음에 지시되어 있다. 또한, 이들의 크기 및 증폭된 PCR 단편의 크기가 기재되어 있다:
VK1046: 위치 20-40
VK1047: 위치 2,078-2,100
VK1046 및 VK1047을 사용하여 증폭된 PCR 단편의 크기: 2,080bp
VK1048: 위치 11,221-11,241
VK1049: 위치 13,360-13,380
VK1048 및 VK1049를 사용하여 증폭된 PCR 단편의 크기: 2,120bp
VK1050: 위치 26,581-26,601
VK1051: 위치 28,537-28,560
VK1050 및 VK1051을 사용하여 증폭된 PCR 단편의 크기: 1,979bp
VK1052: 위치 18,901-18,921
VK1053: 위치 20,321-20,340
VK1052 및 VK1053을 사용하여 증폭된 PCR 단편의 크기: 1,439bp
VK1054: 위치 34,261-34,281
VK1055: 위치 35,320-35,340 BP
VK1054 및 VK1055를 사용하여 증폭된 PCR 단편의 크기: 1,079bp
PCR 반응은 다음 조건으로 퍼킨-엘머 9600 Thermo-Cycler를 사용하여 완결시킨다: 94℃, 2분; 다음에 94℃, 30초에서; 54℃, 30초에서; 72℃, 4분에서 30주기. 샘플은 800ng의 제노르하브두스 네마토필러스 DNA, 0.1-0.5μM의 올리고뉴클레오타이드의 각 쌍, 250μM dNTP, 5U Taq 폴리머라제 및 1X 완충액(퍼킨-엘머)을 100㎕의 최종 용적으로 함유한다. 완결된 반응물을 에탄올에 침전시키고, TE에 재현탁시키고, 1% SeaPlaque(미국 마인 록클랜드 소재의 FMC) TBE 겔상에 놓는다. 전기영동시킨 후, 단편을 브롬화에티듐 염색하고 자외선으로 가시화한 후, 겔로부터 절단한다. 겔 조각을 65℃에서 용융시키고, 10㎕ 분취액을 증류수 10㎕와 혼합하고, 5분 동안 비등시키고, 얼음 위에 놓는다. 다음에, 15㎕의 랜덤 프라이밍 표지 완충액(GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD), 6㎕ dNTP 혼합물(dCTP의 부재하에), 80μCiα-dCT32P 및 1㎕ 클레나우 단편을 혼합한다. 표지 반응은 60분 동안 실온에서 수행한다. 샘플을 공급자의 추천에 따라서 Nick 컬럼(Pharmacia Biotech) 상에서 세척한다. 탐침을 5분 동안 비등시키고, 얼음 위에 놓는다.
서던 블롯은 제노르하브두스 네마토필러스 전체 DNA, 코스미드 pCIB9362 및 pCIB9363으로부터 유도된 DNA(이들 코스미드는 25kb 이상 중복되고, 둘 모두 pCIB9369의 DNA 단편을 함유하며; pCIB9362는 서브클로닝에 사용된다), 서브클론 pCIB9362-3(9kb SacIl 단편) 및 pCIB9369(2.96kb ClaI 단편)로부터 유도된 DNA를 ClaI, SacII 또는 HindIII로 절단시켜 수행한다. 절단 반응물을 0.75% 아가로스 TBE 겔 상에 부하시키고, 밤새 전기영동을 수행한다. 사진 촬영하고, 겔을 Zeta-탐침 하이브리드화 막으로 블롯팅하기 위해 바이오-라드사(Bio-Rad)에 의해 기술된 바와 같이 처리한다. 블롯팅 후, 막을 80℃에서 30분 동안 베이킹한다. 다음에, 막을 7% SDS, 250mM 인산나트륨, pH 7.2에 놓고, 67℃에서 30분 동안 항온처리한다. 신선한 용액을 부가하고, 67℃로 평형화한 후, 상기에서 기술된 방사성 탐침을 가하고, 밤새 하이브리드화시킨다. 막을 2X SSC, 0.5% SDS에서 30분 동안 67℃에서, 다음에 0.5X SSC, 0.5% SDS에서 30분 동안 67℃에서 세척한다. 막을 1시간 및 3시간 동안 필름에 노출시킨다. 필름을 현상하고, 결과는 WO 98/08388 서열로부터의 PCR 탐침이 코스미드의 DNA 또는 본 발명에 기술된 서브클론의 DNA에 하이브리드화되지 않음을 나타낸다. 그러나 강한 하이브리드화 시그날이 엑스. 네마토필러스 DNA 사용시 관찰된다.
이들 결과는 서열 비교의 결과와 일치하며, 클론 pCIB9369가 WO 98/08388에 기술된 뉴클레오타이드 서열과 상이함을 나타낸다.
B. 이종 미생물 숙주에서 본 발명의 핵산 서열의 발현
본 발명의 뉴클레오타이드 서열의 이종 발현에 적합한 미생물은 식물 또는 토양층에 군집할 수 있는 모든 미생물이다. 그 자체로서 이들은 해충과 접촉한다. 이들은 그램-음성 미생물(예: 슈도모나스, 엔테로박터 및 세라티아), 그램-양성 미생물 바실러스 및 진균 트리코데르마(Trichoderma), 글리오클라디움 (Gliocladium) 및 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 포함한다. 특히 바람직한 이종 숙주는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스 세파시아 (Pseudomonas cepacia), 슈도모나스 아우레패시언스(Pseudomonas aureofaciens), 슈도모나스 아루란티아카(Pseudomonas aurantiaca), 엔테로박터 클로아카에 (Enterobacter cloacae), 세라티아 마르세센스(Serratia marscesens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 트리코데르마 비리데(Trichoderma viride), 트리코데르마 하브지아눔(Trichoderma harzianum), 글리오클라디움 비렌스(Gliocladium virens) 및 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)이다.
실시예 19
이. 콜라이 및 다른 그램-음성 세균에서 뉴클레오타이드 서열의 발현
많은 유전자는 그램-음성 세균에서 이종 방식으로 발현되었다. 발현 벡터 pKK223-3(Pharmacia catalogue # 27-4935-01)은 이. 콜라이에서의 발현을 허용한다. 이 벡터는 lac 레프레서에 의해 조절되고 IPTG에 의해 유도되는 강한 tac 프로모터를 갖는다[참조: Brosius, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81]. 많은 다른 발현 시스템이 이. 콜라이에 사용하기 위해 개발되었다. 열유도성 발현 벡터 pPL(Pharmacia #27-4946-01)은 단백질의 높은 수준 발현을 허용하는 긴밀하게 조절된 박테리오파아지 λ 프로모터를 사용한다. lac 프로모터는 다른 발현 수단을 제공하지만, 이 프로모터는 tac 프로모터와 같은 높은 수준으로 발현되지는 않는다. 이들 발현 시스템 벡터에 넓은 숙주 범위의 레플리콘을 부가하여, 밀접하게 관련된 그램-음성 세균(예: 슈도모나스, 엔테로박터, 세라티아 및 에르위니아)에서 뉴클레오타이드 서열의 발현이 가능하다. 예를 들어, pLRKD211[참조: Kaiser & Kroos, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5816-5820 (1984)]은 많은 그램-음성 세균의 복제를 허용하는 넓은 숙주 범위의 레플리콘 ori T를 함유한다.
이. 콜라이에서, IPTG에 의한 유도는 tac(즉, trp-lac) 프로모터의 발현에 필요하다. 이러한 동일한 프로모터(예: 넓은 숙주 범위의 플라스미드 pLRKD211 상에서)가 슈도모나스로 도입되는 경우, 이는 IPTG에 의해 유도되지 않으면서 지속성으로 활성이다. 이 trp-lac 프로모터는 이러한 유전자의 지속성 발현을 위해 슈도모나스 또는 다른 밀접하게 관련된 세균에서의 발현을 위해 목적하는 유전자 또는 오페론의 앞에 배치된다. 따라서, 발현되어 살충 독소를 생산하는 뉴클레오타이드 서열은 따라서 강한 지속성 프로모터 뒤에 배치되고, 식물 또는 토양층 군집 특성을 갖는 세균으로 옮겨서, 이러한 유기체를 살충제로 사용한다. 다른 가능한 프로모터는 그램-음성 세균에서 뉴클레오타이드 서열의 지속성 발현에 사용할 수 있다. 이들은, 예를 들어, 슈도모나스 조절 유전자 gafA 및 lemA[WO 94/01561] 및 슈도모나스 사바스타노이(Pseudomonas savastanoi) JAA 오페론 프로모터[Gaffney et al., J. Bacteriol. 172:5593-5601 (1990)]로부터의 프로모터를 포함한다.
실시예 20
그램-양성 세균에서 뉴클레오타이드 서열의 발현
그램-양성 세균에서 뉴클레오타이드 서열의 이종 발현은 살충 독소를 생산하는 또 다른 수단이다. 바실러스 및 스트렙토마이세스에 대한 발현 시스템이 가장 잘 특성화되어 있다. 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)로부터의 에리트로마이신 내성 유전자(ermR)에 대한 프로모터는 그램-양성 호기성균 및 혐기성균 및 또한 이. 콜라이에서 활성인 것으로 나타난다[참조: Trieu-Cuot et al., Nucl Acids Res 18:3660 (1990)]. 티오스트렙톤 유전자로부터의 추가 항생제 내성 프로모터는 스트렙토마이세스 클로닝 벡터에서 사용되었다[참조: Bibb, Mol Gen Genet 199:26-36 (1985)]. 셔틀 벡터 pHT3101는 또한, 바실러스에서의 발현에 적합하다[참조: Lereclus, FEMS Microbiol Lett 60:211-218 (1989)]. 이러한 접근법의 중요한 잇점은 많은 그램-양성 세균이 살충제를 생산하는 제형에 사용될 수 있는 긴 저장 수명을 갖는 포자를 생산한다는 것이다. 바실러스 및 스트렙토마이세스 종은 토양의 공격적인 군집형성 세균이다.
실시예 21
진균에서 뉴클레오타이드 서열의 발현
트리코데르마 하르지아눔(Trichoderma harzianum) 및 글리오클라디움 비렌스(Gliocladium virens)는 현장에서 변화하는 생물조절의 수준을 제공하는 것으로 나타난다[US 제5,165,928호 및 US 제4,996,157호, 둘 모두 Cornell Research Foundation]. 발현되어 살충 독소를 생산하는 뉴클레오타이드 서열은 이러한 진균에서 발현될 수 있다. 이는 당해 분야에 익히 공지된 많은 방법으로 수행될 수 있다. 하나는 PEG 또는 전기천공법-매개된 기술에 의한 진균의 원형질체-매개된 형질전환법이다. 또는, 입자 충격법을 사용하여 재생된 성숙한 구조물로 발생하는 능력을 갖는 원형질체 또는 다른 진균 세포를 형질전환시킬 수 있다. 아스퍼질러스(Aspergillus) 형질전환용으로 원래 개발되어, 현재 진균 형질전환에 광범위하게 사용되는 벡터 pAN7-1은[참조: Curragh et al., Mycol. Res. 97(3):313-317 (1992); Tooley et al., Curr. Genet. 21:55-60 (1992); Punt et al., Gene 56:117-124 (1987)] 뉴클레오타이드 서열을 함유하도록 조작된다. 이러한 플라스미드는 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans) gpd 프로모터 및 trpC 터미네이터에 인접한 이. 콜라이의 하이그로마이신 B 내성 유전자를 함유한다[참조: Punt et al., Gene 56:117-124 (1987)].
바람직한 양태에서, 본 발명의 핵산 서열은 효모 사카로마이세스 세레비지애에서 발현된다. 예를 들어, pCIB9369, pCIB9381, pCIB9354 또는 pCIB9383으로부터 두개의 ORF는 각각 GAL1 유도성 프로모터 및 CYC1 터미네이터를 갖는 개별 벡터로 클로닝된다. 각각의 벡터는 암피실린 내성 및 2μ 레플리콘을 갖는다. 벡터는 바람직하게는 효모 증식 표지가 상이하다. 작제물은 S. 세레비지애내로 독립적으로 및 함께 형질전환된다. ORF는 함께 발현되며, 단백질 발현 및 살충 활성에 대해 시험한다.
C. 살충 독소의 제형화
살충제 제형화는 분리된 독소를 또는 대신에 이를 생산하며 상기 실시예에서 기술된 세포의 현탁액 또는 농축물을 포함하는 활성 성분을 사용하여 이루어진다. 예를 들어, 살충 독소를 발현하는 이. 콜라이 세포는 해충의 방제에 사용될 수 있다. 제형은 액체 또는 고체 형태로 제조되며, 다음에 기술되어 있다.
실시예 18
살충 조성물의 액상 제형
다음 실시예에서, 조성물의 백분율은 중량 단위이다.
1. 유화성 농축제 a b c
활성 성분 20% 40% 50%
칼슘 도데실벤젠설포네이트 5% 8% 6%
피마자유 폴리에틸렌 글리콜 5% - -
에테르(에틸렌 옥사이드 36mole)
트리부틸페놀 폴리에틸렌 글리콜 - 12% 4%
에테르(에틸렌 옥사이드 30mole)
사이클로헥산온 - 15% 20%
자일렌 혼합물 70% 25% 20%
필요한 농도의 유제가 이러한 농축제로부터 물로 희석하여 제조될 수 있다.
2. 액제 a b c d
활성 성분 80% 10% 5% 95%
에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르 20% - - -
폴리에틸렌 글리콜 400 - 70% - -
N-메틸-2-피롤리돈 - 20% - -
에폭시화 코코넛 오일 - - 1% 5%
석유 증류액 - - 94% -
(비등 범위 160-190℃)
이들 액제는 미량점적제 형태로 적용하기에 적합하다.
3. 과립제 a b
활성 성분 5% 10%
카올린 94% -
고분산성 규산 1% -
애터펄자이트 - 90%
활성 성분을 메틸렌 클로라이드에 용해시키고, 용액을 담체 위에 분무하고, 용매를 이어서 진공중에 증발 제거한다.
4. 분산제 a b
활성 성분 2% 5%
고분산성 규산 1% 5%
탈크 97% -
카올린 - 90%
즉시 사용가능한 분산제는 활성 성분을 담체와 긴밀하게 혼합하여 수득한다.
실시예 19
살충 조성물의 고체 제형
다음 실시예에서, 조성물의 백분율은 중량 단위이다.
1. 습윤성 산제 a b c
활성 성분 20% 60% 75%
리그노설폰산나트륨 5% 5% -
나트륨 라우릴 설페이트 3% - 5%
나트륨 디이소부틸나프탈렌 설포네이트 - 6% 10%
옥틸페놀 폴리에틸렌 글리콜 에테르 - 2% -
(에틸렌 옥사이드 7-8mole)
고분산성 규산 5% 27% 10%
카올린 67% - -
활성 성분을 보조제와 함께 철저히 혼합하고, 혼합물을 적합한 분쇄기에서 철저하게 분쇄하여 물로 희석하여 바람직한 농도의 현탁액을 제공할 수 있는 습윤성 산제를 수득한다.
2. 유화성 농축제
활성 성분 10%
옥틸페놀 폴리에틸렌 글리콜 에테르 3%
(에틸렌 옥사이드 4-5mole)
칼슘 도데실벤젠설포네이트 3%
피마자유 폴리글리콜 에테르 4%
(에틸렌 옥사이드 36mole)
사이클로헥산온 30%
자일렌 혼합물 50%
필요한 농도의 유제는 이 농축제로부터 물로 희석시켜 수득할 수 있다.
3. 분산제 a b
활성 성분 5% 8%
탈크 95% -
카올린 - 92%
즉시 사용가능한 분산제는 활성 성분을 담체와 혼합하고, 혼합물을 적합한 분쇄기에서 분쇄하여 수득한다.
4. 압출 과립제
활성 성분 10%
리그노설폰산나트륨 2%
카복시메틸셀룰로스 1%
카올린 87%
활성 성분을 혼합하고, 보조제로 분쇄하고, 이어서 혼합물을 물로 습윤화한 다. 혼합물을 압출시킨 다음에, 공기 스트림에서 건조시킨다.
5. 제피 과립제
활성 성분 3%
폴리에틸렌 글리콜 200 3%
카올린 94%
미분된 활성 성분을 믹서에서, 폴리에틸렌 글리콜로 습윤된 카올린에 균질하게 적용한다. 비-분산성 제피 과립제가 이 방식으로 수득된다.
6. 현탁 농축제
활성 성분 40%
에틸렌 글리콜 10%
노닐페놀 폴리에틸렌 글리콜 6%
(에틸렌 옥사이드 15mole)
리그노설폰산나트륨 10%
카복시메틸셀룰로스 1%
37% 포름알데히드 수용액 0.2%
75% 수성 유제 중의 실리콘 오일 0.8%
물 32%
미분된 활성 성분을 보조제와 긴밀하게 혼합하여 현탁액 농축제를 수득하고, 이로부터 물로 희석하여 바람직한 농도의 현탁액을 수득할 수 있다.
상기에서 기술된 살충제 제형을 당해 분야에 익히 공지된 방법에 따라서, 해충이 살충 독소에 의해 방제되는 양으로 적용한다.
D. 형질전환된 식물에서 뉴클레오타이드 서열의 발현
본원에 기술된 핵산 서열은 식물 세포에 통상적인 재조합 DNA 기술을 사용하여 혼입할 수 있다. 일반적으로, 이는 본 발명의 암호화 서열을, 암호화 서열이 이종인(즉, 일반적으로 존재하지 않는) 발현 시스템내로 당해 분야에 공지된 표준 클로닝 방법을 사용하여 삽입함을 포함한다. 벡터는 삽입된 단백질-암호화 서열의 전사 및 해독에 필요한 요소를 함유한다. 당해 분야에 공지된 다수의 벡터 시스템을 사용할 수 있으며, 예를 들어, 플라스미드, 박테리오파아지 바이러스 및 다른 변경된 바이러스이다. 적합한 벡터는 바이러스 벡터(예: λ 벡터 시스템 λgtl1, λgtl0 및 Charon 4); 플라스미드 벡터(예: pBl121, pBR322, pACYC177, pACYC184, pAR 시리즈, pKK223-3, pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pLG339, pRK290, pKC37, pKC101, pCDNAII); 및 다른 유사한 시스템을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 발현 시스템의 성분은 또한, 변경되어 발현을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 절단된 서열, 뉴클레오타이드 치환 또는 다른 변형이 사용될 수 있다. 본원에 기술된 발현 시스템을 사용하여 농작물 식물 세포를 적당한 조건하에 실질적으로 형질전환시킬 수 있다. 형질전환된 세포는 전체 식물로 재생되어 본 발명의 뉴클레오타이 드 서열은 형질전환된 식물에 곤충 내성을 부여할 수 있다.
실시예 22
암호화 서열 및 인접 서열의 변형
본원에 기술된 뉴클레오타이드 서열은 형질전환된 식물 숙주에서 발현하기 위해 변형될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열을 발현하고 숙주 식물의 세포에서 살충 독소를 생산하는 숙주 식물은 곤충 공격에 증진된 내성을 나타내므로, 이러한 공격과 연관된 농작물 손실을 감소시키는데 더 잘 갖추어져 있다.
미생물 공급원으로부터 유도된 유전자의 식물에서 형질전환된 유전자 발현은 식물에서 이의 발현을 수행하고 최적화하기 위한 유전자의 변형을 필요로 할 수 있다. 특히, 별도의 효소를 암호화하지만 본래의 미생물에서 동일한 전사체에 의해 암호화되는 세균 ORF가 식물에서 별도의 전사체에 대해 가장 잘 발현된다. 이를 수행하기 위해서, 각각의 미생물 ORF를 개별적으로 분리하고, ORF의 5' 말단에서 식물 프로모터 서열 및 ORF의 3' 말단에서 식물 전사 터미네이터를 제공하는 카세트내에 클로닝한다. 분리된 ORF 서열은 바람직하게는 개시 ATG 코돈 및 종결 STOP 코돈을 포함하지만, 개시 ATG 및 STOP 코돈 이외에 추가의 서열을 포함할 수 있다. 또한, ORF는 말단-절단될 수 있지만, 여전히 필요한 활성을 보유하며; 특히 긴 ORF에 대해서, 활성을 보유하는 말단-절단된 변형은 형질전환된 유기체에서 발현하는데 바람직할 수 있다. "식물 프로모터" 및 "식물 전사 터미네이터"는 식물 세포내에서 작용하는 프로모터 및 전사 터미네이터를 의미하는 것이다. 이는 바이러스( 예, 꽃양배추 모자이크 바이러스)와 같은 비-식물 공급원으로부터 유도될 수 있는 프로모터 및 전사 터미네이터를 포함한다.
특정한 경우, ORF 암호화 서열 및 인접 서열에 대한 변형은 필요하지 않다. 목적하는 ORF를 함유하는 단편을 분리하고 식물 프로모터의 하류에 이를 삽입하는 것으로 충분하다. 예를 들어, Gaffney 등[참조: Science 261:754-756 (1993)]은 형질전환된 식물에서 CaMV 35S 프로모터 및 CaMV tml 터미네이터의 성공적인 조절에서 암호화 서열을 변형하지 않고, 여전히 부착된 ATG의 상류의 슈도모나스 유전자의 x bp 및 nahG ORF에 여전히 부착된 STOP 코돈의 하류의 y bp와 함께 슈도모나스 nahG 유전자를 발현시켰다. 바람직하게는 소수의 인접한 미생물 서열은 ATG의 상류 및 STOP 코돈의 하류에 부착되지 않은 채로 남아 있다. 실제로, 이러한 작제물은 제한 부위의 유용성에 따를 수 있다.
다른 경우에, 미생물 공급원으로부터 유도된 유전자의 발현은 발현에서 문제를 야기할 수 있다. 이들 문제는 당해 분야에 익히 특성화되어 있으며, 특정한 공급원(예: 바실러스)으로부터 유도된 유전자에 특히 일반적이다. 이들 문제는 본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 적용될 수 있으며, 이들 유전자의 변형은 현재 당해 분야에 익히 공지된 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 다음 문제가 일어날 수 있다.
1. 코돈 사용
식물에서 바람직한 코돈 사용은 특정한 미생물에서 바람직한 코돈 사용과 상 이하다. 식물 유전자에서(및 표적 식물로부터 특정한 유전자에서) 사용에 대한 클로닝된 미생물 ORF내에서 코돈의 사용의 비교에 의해 바람직하게 변화되는 ORF내에서의 코돈을 확인할 수 있다. 일반적으로, 식물 진화는 단자엽식물의 제3 염기 위치에서 뉴클레오타이드 C 및 G를 강하게 선호하는 경향이 있는 반편, 쌍자엽식물은 빈번하게 이 위치에서 뉴클레오타이드 A 또는 T를 사용한다. 유전자를 변형하여 특정한 표적 형질전환된 종에 바람직한 코돈 사용을 도입함으로써, GC/AT 함량 및 부적합한 스플라이싱에 대해 다음에서 기술된 많은 문제가 극복된다.
2. GC/AT 함량
식물 유전자는 일반적으로 35% 이상의 GC 함량을 갖는다. A 및 T 뉴클레오타이드가 풍부한 ORF 서열은 식물에서 많은 문제를 야기할 수 있다. 우선, ATTTA의 모티프는 메시지의 탈안정화를 야기한다고 믿어지며, 많은 짧은 수명의 mRNA의 3' 말단에서 발견된다. 두번째로, 메시지내에서 부적합한 위치에서 폴리아데닐화 시그날(예: AATAAA)의 발생은 전사의 조기 절단을 초래한다고 믿어진다. 또한, 단자엽식물은 AT-풍부 서열을 스플라이싱 부위로서 인식할 수 있다(다음 참고).
3. 개시 메티오닌에 인접한 서열
식물은 메시지가 정의된 리보솜 결합 부위를 갖지 않는다는 점에서 미생물과 상이하다. 오히려, 리보솜은 메시지의 5' 말단으로 부착되고 해독을 개시하는 제1 유용한 ATG를 찾아 활주한다고 믿어진다. 하지만, ATG에 인접한 특정 뉴클레오타 이드가 선호되며, 미생물 유전자의 발현은 ATG에서 진핵생물 컨센서스 해독 개시 인자의 포함에 의해 증진될 수 있다고 믿어진다. 본원에서 참고로 인용된 문헌[참조: Clontech, 1993/1994 catalog, page 210]에는 식물에서 이. 콜라이 uidA 유전자의 발현에 대한 컨센서스 해독 개시 인자로서 하나의 서열이 제안되었다. 또한, 본원에서 참고로 인용된 문헌[참조: Joshi, NAR 15:6643-6653 (1987)]에서는 ATG에 인접한 많은 식물 서열을 비교하고, 또 다른 컨센서스 서열을 제안하고 있다. 식물에서 미생물 ORF의 발현에서 난점에 부딪히는 상황에서, 개시 ATG에서 이들 서열 중의 하나를 포함시켜 해독을 개선시킬 수 있다. 이러한 경우, 컨센서스의 마지막 3개의 뉴클레오타이드는 제2 AA 잔기의 변형에 기인하여 변형된 서열에 포함시키기 위해 적합하지 않을 수 있다. 개시 메티오닌에 인접한 바람직한 서열은 상이한 식물 종 사이에서 상이할 수 있다. GenBank 데이터베이스에 위치한 14개의 옥수수 유전자를 조사하면 다음 결과를 제공한다:
14개의 옥수수 유전자에서 개시 ATG 전의 위치
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1
C 3 8 4 6 2 5 6 0 10 7
T 3 0 3 4 3 2 1 1 1 0
A 2 3 1 4 3 2 3 7 2 3
G 6 3 6 0 6 5 4 6 1 5
이 분석은 뉴클레오타이드 서열이 혼입되고, ATG에 인접한 서열이 변형되어 바람직한 뉴클레오타이드를 혼입하는 바람직한 식물 종에 대해 수행할 수 있다.
4. 부적합한 스플라이싱 부위의 제거
비-식물 공급원으로부터 클로닝되고 식물에서 발현하기에 최적화되지 않은 유전자는 또한, 식물에서 5' 또는 3' 스플라이싱 부위로서 인식되어, 절단되고, 따라서 말단-절단되거나 결실된 메시지를 생산할 수 있는 모티프를 함유할 수 있다. 이들 부위는 당해 분야에 익히 공지된 기술을 사용하여 제거할 수 있다.
암호화 서열 및 인접 서열을 변형하기 위한 기술은 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 미생물 ORF의 최초 발현이 낮고 상기에서 기술된 바와 같이 서열을 변화시키기에 적합하게 간주되는 경우, 합성 유전자의 작제는 당해 분야에 익히 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있다. 이들은, 예를 들어, 문헌[공개된 특허 명세서 EP 제0 385 962호(Monsanto), EP 제0 359 472호(Lubrizol) 및 WO 93/07278(Ciba-Geigy)]에 기술되어 있으며, 이들은 모두 본원에서 참고로 인용되어 있다. 대부분의 경우, (당해 분야에 익히 공지된) 일시적 분석 프로토콜을 사용하여 형질전환된 식물에 이를 전달하기 전에 유전자 작제물의 발현을 분석하는 것이 바람직하다.
실시예 23
식물 발현 카세트의 작제
형질전환된 식물에서의 발현을 위해 의도된 암호화 서열은 먼저 식물에서 발현가능한 적합한 프로모터 뒤의 발현 카세트에서 조립된다. 발현 카세트는 또한, 형질전환된 유전자의 발현을 위해 필요하거나 선택된 추가의 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열은 전사 터미네이터, 인트론과 같은 발현을 증진시키는 외인성 서열, 필수 서열, 및 특정한 세포내기관 및 세포 구획으로 유전자 산물의 표적화를 위해 의도된 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이후, 이들 발현 카세트는 다음에 기술된 식물 형질전환 벡터로 용이하게 전달될 수 있다. 다음은 대표적 발현 카세트의 여러 성분에 대한 설명이다.
1. 프로모터
발현 카세트에서 사용되는 프로모터의 선택에 의해 형질전환된 식물에서 형질전환된 유전자의 공간 및 시간적 발현 패턴이 결정된다. 선택된 프로모터는 특정한 세포 종류(예: 잎 표피 세포, 엽육 세포, 뿌리 피질 세포)에서 또는 특정한 조직 또는 기관(예: 뿌리, 잎 또는 꽃)에서 형질전환된 유전자를 발현시키고, 상기 선택은 유전자 산물 축적의 바람직한 위치에 영향을 준다. 또는, 선택된 프로모터는 많은 유도 조건하에 유전자의 발현을 구동할 수 있다. 프로모터는 이의 강도, 즉 전사를 촉진하는 능력이 다양하다. 사용된 숙주 세포 시스템에 따라서, 유전자의 본래 프로모터를 포함하여 많은 적합한 프로모터 중의 하나가 사용될 수 있다. 다음은 발현 카세트에 사용될 수 있는 프로모터의 비제한 예이다.
a. 지속성 발현, 유비퀴틴 프로모터
유비퀴틴은 많은 세포 유형에서 축적된다고 공지된 유전자 산물이며, 이의 프로모터는 형질전환된 식물에 사용하기 위한 많은 종으로부터 클로닝되었다[참조: 해바라기 - Binet et al, Plant Science 79:87-94 (1991); 옥수수 - Christensen et al. Plant Molec. Biol. 12:619-632 (1989); 및 아라비돕시스-Norris et al., Plant Mol. Biol. 21:895-906 (1993)]. 옥수수 유비퀴틴 프로모터는 형질전환된 단자엽식물 시스템에서 개발되었으며, 단자엽식물 형질전환을 위해 작제된 이의 서열 및 벡터는 본원에서 참고로 인용된 특허 공보 EP 제0 342 926호(Lubrizol)에 기술되어 있다. Taylor 등은[참조: Plant Cell Rep. 12:491-495 (1993)] 옥수수 유비퀴틴 프로모터 및 제1 인트론 및 미세투사체 충격을 통해 도입되는 경우, 많은 단자엽식물의 세포 현탁액에서 이의 높은 활성을 포함하는 벡터(pAHC25)를 기술하고 있다. 아라비돕시스 유비퀴틴 프로모터는 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 함께 사용하기에 이상적이다. 유비퀴틴 프로모터는 단자엽식물 및 쌍자엽식물의 형질전환된 식물에서 유전자 발현에 적합하다. 적합한 벡터는 pAHC25의 유도체이거나, 적합한 유비퀴틴 프로모터 및/또는 인트론 서열을 도입하여 변형된 본원에서 기술되는 형질전환 벡터이다.
b. 지속성 발현, CaMV 35S 프로모터
플라스미드 pCGN1761의 작제는 공개된 특허원 EP 제0 392 225호(실시예 23)에 기술되어 있으며, 이는 본원에서 참고로 인용되어 있다. pCGN1761은 "이중" CaMV 35S 프로모터 및 tml 전사 터미네이터를 프로모터 및 터미네이터 사이의 유일한 EcoRI 부위와 함께 함유하며, pUC형 골격을 갖는다. EcoRl 부위 이외에 NotI 및 XhoI 부위를 포함하는 변형된 폴리링커를 갖는 pCGN1761의 유도체가 작제된다. 이 유도체는 pCGN1761ENX로 명명된다. pCGN1761ENX는 cDNA 서열 또는 암호화 서열(미생물 ORF 서열을 포함)을 형질전환된 식물에서 35S 프로모터의 조절하에 이를 발현하기 위해 이의 폴리링커내에서 클로닝하기데 유용하다. 이러한 작제물의 전체 35S 프로모터-암호화 서열-tml 터미네이터 카세트는 HindIII, SphI, SalI 및 XbaI 부위에 의해 5' 쪽의 프로모터로 및 XbaI, BamHI 및 BglI 부위에 의해 3' 쪽의 터미네이터로 절단하여 다음에 기술된 것과 같은 형질전환 벡터로 전달시킬 수 있다. 또한, 이중 35S 프로모터 단편은 HindIII, SphI, SalI, XbaI 또는 PstI에 의한 5' 절단, 및 다른 프로모터로 대체하기 위한 폴리링커 제한 부위(EcoRI, NotI 또는 XhoI)에 의한 3' 절단에 의해 제거할 수 있다. 필요한 경우, 클로닝 부위 주위에서 변형은 해독을 증진시킬 수 있는 서열의 도입에 의해 이루어질 수 있다. 이는 과발현이 바람직한 경우에, 특히 유용하다. 예를 들어, pCGN1761ENX은 본원에서 참고로 인용된, 미국 특허 제5,639,949호의 실시예 37에서 기술된 해독 개시 부위의 최적화에 의해 변형될 수 있다.
c. 지속성 발현, 액틴 프로모터
액틴의 여러 동종형태가 대부분의 세포종에서 발현된다고 공지되어 있으며, 결국 액틴 프로모터는 지속성 프로모터에 대한 우수한 선택물이다. 특히, 쌀 ActI 유전자로부터의 프로모터는 클로닝되고 특성화되었다[참조: McElroy et al. Plant Cell 2:163-171 (1990)]. 프로모터의 1.3kb 단편은 쌀 원형질체에서 발현에 필요한 조절 요소를 함유한다고 밝혀졌다. 또한, ActI 프로모터에 기초한 많은 발현 벡터는 단자엽식물에 사용하기에 특정하게 작제되었다[참조: McElroy et al. Mol. Gen. Genet. 231:150-160 (1991)]. 이들은 ActI-인트론 1, Adhl 5' 인접 서열 및 Adhl-인트론 1(옥수수 알콜 데하이드로게나제 유전자로부터) 및 CaMV 35S 프로모터로부터의 서열을 혼입한다. 최고의 발현을 나타내는 벡터는 35S 및 ActI 인트론 또는 ActI 5' 인접 서열 및 ActI 인트론의 융합물이다. (GUS 리포터 유전자의) 개시 ATG 주위에서 서열의 최적화에 의해 발현이 증진된다. 문헌[참조: McElroy et al., Mol. Gen. Genet. 231:150-160 (1991)]에 기술된 프로모터 발현 카세트는 유전자 발현을 위해 용이하게 변형될 수 있으며, 단자엽식물 숙주에 사용하기에 특히 적합하다. 예를 들어, 프로모터-함유 단편은 McElroy 작제물로부터 제거되며, pCGN1761ENX에서 이중 35S 프로모터를 대체하는데에 사용되고, 이는 다음에 특이적 유전자 서열의 삽입에 유용하다. 이후, 이렇게 작제된 융합 유전자는 적합한 형질전환 벡터로 전달될 수 있다. 상이한 보고서에서, 제1 인트론을 갖는 쌀 ActI 프로모터는 또한, 배양된 보리 세포에서 높은 발현을 지시한다고 밝혀졌다[참조: Chibbar et al. Plant Cell Rep. 12:506-509 (1993)].
d. 유도성 발현, PR-1 프로모터
pCGN1761ENX에서 이중 35S 프로모터는 적당히 높은 발현 수준을 초래하는 선택된 다른 프로모터로 대체될 수 있다. 예로서, 미국 특허 제5,614,395호에 기술된 화학적으로 조절가능한 프로모터 중의 하나는 이중 35S 프로모터를 대체할 수 있다. 선택된 프로모터는 바람직하게는 이의 공급원으로부터 제한 효소에 의해 절단되지만, 또는 적합한 말단 제한 부위를 갖는 프라이머를 사용하여 PCR-증폭시킬 수 있다. PCR-증폭이 수행되는 경우, 프로모터는 재서열 분석되어 표적 벡터에서 증폭된 프로모터를 클로닝한 후 증폭 오류를 체크해야 한다. 화학적으로/병원체 조절가능한 담배 PR-1a 프로모터는 플라스미드 pCIB1004로부터 절단되어[작제하기 위해서, 본원에서 참고로 인용된 EP 제0 332 104호의 실시예 21 참고], 플라스미드 pCGN1761ENX[Uknes 등, 1992]로 전달된다. pCIB1004는 NcoI로 절단시키고, 수득된 선형 단편의 3' 돌출부를 T4 DNA 폴리머라제로 처리하여 말단평활화한다. 이후, 단편을 HindIII로 절단시키고, 수득된 PR-1a 프로모터-함유 단편을 겔 정제시키고, 이중 35S 프로모터가 제거된 pCGN1761ENX로 클로닝한다. 이는 XhoI로 절단시키고 T4 폴리머라제로 말단평활화한 다음, HindIII로 절단시키고 pCIB1004 프로모터 단편이 클로닝되는 단편을 함유하는 대형 벡터-터미네이터를 분리하여 수행한다. 이는 PR-1a 프로모터 및 tml 터미네이터를 갖는 pCGN1761ENX 유도체 및 유일한 EcoRI 및 NotI 부위를 사용하여 간섭 폴리링커를 생산한다. 선택된 암호화 서열은 이 벡터로 삽입될 수 있으며, 융합 산물(즉, 프로모터-유전자-터미네이터)은 계속해서 아래에 정의된 것을 포함하여 선택된 형질전환 벡터로 전달될 수 있다. 미국 특허 제5,523,311호 및 제5,614,395호에 기술된 벤조티아디아졸, 이소니코틴산 및 살리실산 화합물을 포함하여, 많은 화학적 조절제를 사용하여 본 발명에 따라 형질전환된 식물에서 선택된 암호화 서열을 발현시킬 수 있다.
e. 유도성 발현, 에탄올-유도성 프로모터
특정한 알콜 또는 케톤, 예를 들어, 에탄올에 의해 유도가능한 프로모터가 또한, 사용되어 본 발명의 암호화 서열의 유도성 발현을 부여할 수 있다. 이러한 프로모터는, 예를 들어, 아스퍼질러스 니둘란스로부터의 alcA 유전자 프로모터이다 [참조: Caddick et al. (1988) Nat. Biotechnol. 16:177-180]. A. 니둘란스에서, alcA 유전자는 알콜 데하이드로게나제 I을 암호화하며, 이의 발현은 화학적 유도물질의 존재하에 AlcR 전사 인자에 의해 조절된다. 본 발명을 위해서, 최소 35S 프로모터[참조: Caddick et al. (1988) Nat. Biotechnol. 16:177-180]에 융합된 alcA 유전자 프로모터 서열을 포함하는 플라스미드 palcA:CAT에서 CAT 암호화 서열은 본 발명의 암호화 서열에 의해 대체되어 alcA 유전자 프로모터의 조절하에 암호화 서열을 갖는 발현 카세트를 형성한다. 이는 당해 분야에 익히 공지된 방법을 사용하여 수행한다.
f. 유도성 발현, 글루코코르티코이드-유도성 프로모터
스테로이드 호르몬에 기초한 시스템을 사용하여 본 발명의 핵산 서열의 발현 유도가 또한 고려된다. 예를 들어, 글루코코르티코이드-매개된 유도 시스템이 사용되며[참조: Aoyama and Chua (1997) The Plant Journal 11:605-612], 유전자 발현은 글루코코르티코이드, 예를 들어, 합성 글루코코르티코이드, 바람직하게는 덱사메타손을, 바람직하게는 0.1 내지 1mM, 더욱 바람직하게는 10 내지 100mM 범위의 농도로 적용하여 유도된다. 본 발명을 위해서, 루시퍼라제 유전자 서열은 본 발명의 핵산 서열에 의해 대체되어 35S 최소 프로모터에 융합된 GAL4 상류 활성화 서열의 6개 복사체의 조절하에 본 발명의 핵산 서열을 갖는 발현 카세트를 형성한다. 이는 당해 분야에 익히 공지된 방법을 사용하여 수행한다. 상호작용 인자는 래트 글루코코르티코이드 수용체의 호르몬-결합 도메인[참조: Picard et al. (1988) Cell 54:1073-1080]에 융합된 헤르페스 바이러스 단백질 VP16의 상호활성화 도메인[참조: Triezenberg et al. (1988) Genes Devel. 2:718-729]에 융합된 GAL4 DNA-결합 도메인[참조: Keegan et al. (1986) Science 231:699-704]을 포함한다. 융합 단백질의 발현은 당해 분야에 공지되거나 본원에서 기술된 식물에서 발현에 적합한 프로모터에 의해 조절된다. 이 발현 카세트는 또한, 6xGAL4/최소 프로모터에 융합된 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 식물에 포함된다. 따라서, 융합 단백질의 조직- 또는 기관-특이성이 수득되어 살충 독소의 유도성 조직- 또는 기관-특이성을 유도한다.
g. 뿌리 특이적 발현
유전자 발현의 다른 패턴은 뿌리 발현이다. 적합한 뿌리 프로모터는 de Framond에 의해[참조: FEBS 290:103-106 (1991)] 및 공개된 특허원 EP 제0 452 269호에 기술되어 있으며, 이들은 본원에서 참조로 인용된다. 이 프로모터는 선택된 유전자의 삽입 및 목적하는 형질전환 벡터로 전체 프로모터-유전자-터미네이터 카세트의 후속적인 전달에 적합한 벡터(예: pCGN1761ENX)로 전달된다.
h. 상처-유도성 프로모터
상처-유도성 프로모터는 또한, 유전자 발현에 적합할 수 있다. 많은 프로모터가 기술되어 있으며[참조: Xu et al. Plant Molec. Biol. 22:573-588 (1993) Logemann et al. Plant Cell 1:151-158 (1989), Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22:783-792 (1993), Firek et al. Plant Molec. Biol. 22:129-142 (1993), Warner et al. Plant J. 3:191-201 (1993)], 모두 본 발명에 사용하기에 적합하다. Logemann 등은 쌍자엽식물 감자 wunI 유전자의 5' 상류 서열을 기술하고 있다. Xu 등은 쌍자엽식물 감자(pin2)로부터의 상처-유도성 프로모터가 단자엽식물 쌀에서 활성임을 나타낸다. 또한, Rohrmeier & Lehle은 상처 유도되고, 표준 기술을 사용하여 동족 프로모터를 분리하는 데에 사용할 수 있는 옥수수 Wipl cDNA의 클로닝을 기술하고 있다. 유사하게, Firek 등 및 Warner 등은 국소 상처 및 병원체 침습 부위에서 발현되는, 단자엽식물 아스파라거스 오피시날리스(Asparagus officinalis)로부터의 상처-유도된 유전자를 기술하고 있다. 당해 분야에 익히 공지된 클로닝 기술을 사용하여, 이들 프로모터는 적합한 벡터로 전달되고, 본 발명에 관한 유전자로 융합되고, 식물 상처 부위에서 이들 유전자의 발현에 사용될 수 있다.
i. 수(pith)-선호 발현
본원에서 참조로 인용된, 특허원 WO 93/07278에는 수 세포(pith cell)에서 우선적으로 발현되는 옥수수 trpA 유전자의 분리가 기술되어 있다. 전사 개시로 부터 -1726bp로 연장되는 유전자 서열 및 프로모터가 나타나 있다. 표준 분자생물학 기술을 사용하여, 이 프로모터 또는 이의 일부는 pCGN1761과 같은 벡터로 전달될 수 있으며(여기에서, 이는 35S 프로모터를 대체할 수 있다), 사용되어 수-선호 방법으로 외래 유전자의 발현을 구동할 수 있다. 사실상, 수-선호 프로모터 또는 이의 일부를 함유하는 단편은 벡터로 전달되고, 형질전환된 식물에서 사용하기 위해 변형될 수 있다.
j. 잎-특이적 발현
포스포에놀 카복실라제(PEPC)를 암호화하는 옥수수 유전자가 문헌에 기술되어 있다[참조: Hudspeth & Grula (Plant Molec. Biol. 12:576-589 (1989)]. 표준 분자생물학 기술을 사용하여, 이 유전자에 대한 프로모터는 형질전환된 식물에서 잎-특이성 방법으로 유전자의 발현을 구동하는 데에 사용할 수 있다.
k. 화분-특이성 발현
WO 93/07278에는 화분 세포에서 발현되는 옥수수 칼슘-의존성 단백질 키나제(CDPK)의 분리가 기술되어 있다. 유전자 서열 및 프로모터는 전사의 개시로부터 1400bp까지 연장된다. 표준 분자생물학 기술을 사용하여, 이 프로모터 또는 이의 일부는 pCGN1761과 같은 벡터로 전달될 수 있으며(여기에서, 이는 35S 프로모터를 대체할 수 있다), 사용되어 화분-특이성 방법으로 본 발명의 핵산 서열의 발현을 구동할 수 있다.

2. 전사 터미네이터
많은 전사 터미네이터가 발현 카세트에 사용하기에 유용하다. 이들은 형질전환된 유전자 이후의 전사의 종결 및 이의 정확한 폴리아데닐화에 관여한다. 적합한 전사 터미네이터는 식물에서 기능한다고 공지된 것이며, CaMV 35S 터미네이터, tml 터미네이터, 노팔린 신타제 터미네이터 및 완두콩 rboS E9 터미네이터를 포함한다. 이들은 단자엽식물 및 쌍자엽식물 둘 모두에 사용될 수 있다. 또한, 유전자의 본래 전사 터미네이터가 사용될 수 있다.
3. 발현의 증진 또는 조절을 위한 서열
많은 서열이 전사 단위내로부터 유전자 발현을 증진시킨다고 밝혀졌으며, 이들 서열은 본 발명의 유전자와 함께 사용되어 형질전환된 식물의 발현을 증가시킬 수 있다.
많은 인트론 서열은 특히 단자엽식물 세포에서 발현을 증진시킨다고 나타났다. 예를 들어, 옥수수 Adhl 유전자의 인트론은 옥수수 세포로 도입하는 경우, 이의 동족 프로모터하에 야생형 유전자의 발현을 상당히 증진시킨다고 밝혀졌다. 인트론 1이 특히 유효하며, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자의 융합 작제물에서 발현을 증진시킨다고 밝혀졌다[참조: Callis et al. Genes Develop. 1:1183-1200 (1987)]. 동일한 실험 시스템에서, 옥수수 bronze 1 유전자로부터의 인트론은 발현 증진에서 유사한 효과를 갖는다. 인트론 서열은 식물 형질전환 벡터에, 일반적으로 비-해독 리더 서열내에 통상적으로 혼입되었다.
바이러스로부터 유도된 많은 비-해독 리더 서열이 또한 발현을 증진시킨다고 공지되어 있으며, 이들은 쌍자엽식물 세포에 특히 유용하다. 특히, 담배 모자이크 바이러스(TMV, "W 서열"), 옥수수 위황변 반점 바이러스(MCMV) 및 자주개자리 모자이크 바이러스(AMV)로부터의 리더 서열은 발현을 증진시키는 데에 유용하다고 나타나 있다[참조: Gallie et al. Nucl. Acids Res. 15:8693-8711 (1987); Skuzeski et al. Plant Molec. Biol. 15:65-79 (1990)].
4. 세포내에서 유전자 산물의 표적화
유전자 산물의 표적화에 대한 많은 메커니즘이 식물에 존재한다고 공지되어 있으며, 이들 메커니즘의 기능을 조절하는 서열이 어느정도 상세하게 특성화되었다. 예를 들어, 엽록체에 대한 유전자 산물의 표적화는 엽록체 흡수 동안에 분해되어 성숙한 단백질을 수득하는 많은 단백질의 아미노 종결 말단에서 발견된 시그날 서열에 의해 조절된다[참조: 예를 들어, Comai et al. J. Biol. Chem. 263:15104-15109 (1988)]. 이들 시그날 서열은 이종 유전자 산물에 융합되어 엽록체로의 이종 산물의 흡수를 유효하게 할 수 있다[참조: van den Broeck, et al. Nature 313:358-363 (1985)]. 적합한 시그날 서열을 암호화하는 DNA는 RUBISCO 단백질, CAB 단백질, EPSP 신타제 효소, GS2 단백질 및 엽록체에 위치한다고 공지된 많은 다른 단백질을 암호화하는 cDNA의 5' 말단으로부터 분리될 수 있다[참조: 미국 특허 제5,639,949호의 실시예 37에서 "Expression With Chloroplast Targeting" 라는 표제의 단락].
다른 유전자 산물은 다른 세포내기관(예: 미토콘드리아 및 퍼옥시좀)에 위치한다[참조: 예를 들어, Unger et al. Plant Molec. Biol. 13:411-418 (1989)]. 이들 산물을 암호화는 cDNA는 또한, 이종 유전자 산물의 이들 세포내기관에 대한 표적화를 유효하게 하도록 조작될 수 있다. 이러한 서열의 예는 핵-암호화 ATPase 및 미토콘드리아에 특이적인 아스파르테이트 아미노 트랜스퍼라제 동종형태이다. 표적화 세포성 단백질체는 문헌에 기술되어 있다[참조: Rogers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6512-6516 (1985)].
또한, 다른 세포 구획으로 유전자 산물의 표적화를 초래하는 서열의 특성이 규명되었다. 아미노 말단 서열은 ER, 아포플라스트에 대한 표적화, 및 호분 세포로부터의 세포외 분비에 관여한다[참조: Koehler & Ho, Plant Cell 2:769-783 (1990)]. 또한, 카복시 말단 서열과 함께 아미노 말단 서열은 유전자 산물의 액포성 표적화에 관여한다[참조: Shinshi et al. Plant Molec. Biol. 14:357-368 (1990)].
상기에서 기술된 적합한 표적화 서열을 목적하는 형질전환된 유전자 서열에 융합시켜, 형질전환된 유전자 산물을 세포내기관 또는 세포 구획으로 지시할 수 있다. 엽록체를 표적화하기 위해서, 예를 들어, RUBISCO 유전자, CAB 유전자, EPSP 신타제 유전자 또는 GS2 유전자로부터의 엽록체 시그날 서열을 형질전환된 유전자의 아미노 말단 ATG에 대한 프레임에 융합시킨다. 선택된 시그날 서열은 공지된 절단 부위를 포함해야 하며, 작제된 융합물은 절단에 필요한 절단 부위 다음의 아미노산을 고려해야 한다. 특정한 경우, 이 요건은 절단 부위 및 형질전환된 유전자 ATG 사이의 소수의 아미노산의 부가에 의해, 또는 형질전환된 유전자 서열내에서 특정한 아미노산의 대체에 의해 충족될 수 있다. 엽록체 흡수를 위해 작제된 융합물은 시험관내 전사된 작제물의 시험관내 해독 및 이후에, 문헌에 개시된 기술을 사용하는 시험관내 엽록체 흡수에 의해 엽록체 흡수능에 대해 시험할 수 있다[참조: Bartlett et al. In: Edelmann et al. (Eds.) Methods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier pp 1081-1091 (1982) and Wasmann et al. Mol. Gen. Genet. 205:446-453 (1986)]. 이러한 작제 기술은 당해 분야에 익히 공지되어 있으며, 미토콘드리아 및 퍼옥시좀에 동일하게 적용할 수 있다.
세포 표적화에 대해 상기에서 기술된 메커니즘은 이의 동족 프로모터와 함께 뿐만 아니라 이종 프로모터와 함께 사용하여, 특이적 세포-표적화 목적을, 표적화 시그날이 유도되는 프로모터의 것과 상이한 발현 패턴을 갖는 프로모터의 전사 조절하에 수행할 수 있다.
실시예 24
식물 형질전환 벡터의 작제
식물 형질전환에 유용한 많은 형질전환 벡터가 식물 형질전환 분야에서 전문가에게 공지되어 있으며, 본 발명에 적합한 유전자는 이러한 벡터와 함께 사용할 수 있다. 벡터의 선택은 바람직한 형질전환 기술 및 형질전환하기 위한 표적 종에 따라 다르다. 특정한 표적 종을 위해서, 상이한 항생제 또는 제초제 선택 표지가 바람직할 수 있다. 형질전환에 통상적으로 사용되는 선택 표지는 카나마이신 및 관련 항생제에 대한 내성을 부여하는 nptII 유전자[참조: Messing & Vierrra, Gene 19:259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304:184-187 (1983)], 제초제 포스피노트리신에 대한 내성을 부여하는 bar 유전자[참조: White et al., Nucl. Acids Res 18:1062 (1990), Spencer et al. Theor. Appl. Genet 79:625-631 (1990)], 항생제 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hph 유전자[참조: Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol 4:2929-2931], 메타트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr 유전자[참조: Bourouis et al., EMBO J. 2(7): 1099-1104 (1983)], 및 글리포세이트에 대한 내성을 부여하는 EPSPS 유전자(미국 특허 제4,940,935호 및 제5,188,642호)를 포함한다.
1. 아그로박테리움 형질전환에 적합한 벡터
많은 벡터가 아그로박테리움 투메패시언스를 사용하는 형질전환에 유용하다. 이들은 일반적으로 하나 이상의 T-DNA 경계 서열을 운반하며, pBlN19[참조: Bevan, Nucl. Acids Res. (1984)] 및 pXYZ와 같은 벡터를 포함한다. 아래에, 아그로박테리움 형질전환에 적합한 두개의 대표적 벡터의 작제물이 기술되어 있다.
a. pCIB200 및 pCIB2001
이원 벡터 pCIB200 및 pCIB2001은 아그로박테리움과 함께 사용하기 위한 재조합 벡터의 구성에 사용되며, 다음 방법으로 구성된다. pTJS75kan은 pTJS75[참조: Schmidhauser & Helinski, J. Bacteriol. 164:446-455 (1985)]을 NarI 분해시켜, 테트라사이클린-내성 유전자를 절단시킨 다음에, NPTII[참조: Messing & Vierra, Gene 19:259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304:184-187 (1983); McBride et al., Plant Molecular Biology 14:266-276 (1990)]를 갖는 pUC4K로부터 AccI 단편을 삽입하여 형성시킨다. XhoI 링커는 좌측 및 우측 T-DNA 경계, 식물 선택성 nos/nptII 키메라 유전자 및 pUC 폴리링커를 함유하는 pCIB7의 EcoRV 단편에 연결되고[참조: Rothstein et al., Gene 53:153-161 (1987)], XhoI-분해된 단편은 SalI-분해된 pTJS75kan으로 클로닝되어 pCIB200을 형성한다[EP 제0 332 104호, 실시예 19 참고]. pCIB200은 다음의 유일한 폴리링커 제한 부위를 함유한다: EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI 및 SalI. pCIB2001은 추가 제한 부위의 폴리링커로 삽입하여 형성된 pCIB200의 유도체이다. pCIB2001의 폴리링커에서 유일한 제한 부위는 EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI, SalI, MluI, BclI, AvrII, ApaI, HpaI 및 StuI이다. 이들 유일한 제한 부위를 함유하는 이외에, pCIB2001은 또한, 식물 및 세균 카나마이신 선택, 아그로박테리움-매개된 형질전환을 위한 좌측 및 우측 T-DNA 경계, 이. 콜라이 및 다른 숙주 사이에서 이동을 위한 RK2-유도된 trfA 기능 및 RK2로부터의 OriT 및 Oriv 기능을 갖는다. pCIB2001 폴리링커는 그 자신의 조절 시그날을 함유하는 식물 발현 카세트의 클로닝에 적합하다.
b. pCIB10 및 이의 하이그로마이신 선택 유도체
이원 벡터 pCIB10은 식물에서의 선택을 위한 카나마이신 내성을 암호화하는 유전자 및 T-DNA 우측 및 좌측 경계 서열을 함유하며, 넓은 숙주 범위 플라스미드 pRK252로부터의 서열을 혼입시켜 이를 이. 콜라이 및 아그로박테리움 둘 모두에서 복제가능하게 한다. 이의 작제는 문헌에 기술되어 있다[참조: Rothstein et al., Gene 53:153-161 (1987)]. 문헌에 기술된 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제에 대한 유전자를 혼입시키는 pCIB10의 많은 유도체가 작제된다[참조: Gritz et al., Gene 25:179-188 (1983)]. 이들 유도체는 하이그로마이신 단독(pCIB743), 또는 하이그로마이신 및 카나마이신(pCIB715, pCIB717)에 대한 형질전환된 식물 세포의 선택을 가능하게 한다.
2. 비-아그로박테리움 형질전환에 적합한 벡터
아그로박테리움 투메패시언스를 사용하지 않는 형질전환은 선택된 형질전환 벡터에서 T-DNA 서열에 대한 요건을 제외하며, 이어서 이들 서열이 부족한 벡터는 T-DNA 서열을 함유하는 상기에서 기술된 것과 같은 벡터 이외에 사용할 수 있다. 아그로박테리움에 따르지 않는 형질전환 기술은 입자 충격법, 원형질체 흡수법(예: PEG 및 전기천공법) 및 미세주입법을 통한 형질전환을 포함한다. 벡터의 선택은 형질전환되는 종에 대한 바람직한 선택에 주로 따른다. 아래에, 비-아그로박테리움 형질전환에 적합한 대표적 벡터의 작제가 기술되어 있다.
a. pCIB3064
pCIB3064는 제초제 바스타 (또는 포스피노트리신)에 의한 선택과 함께 직접 유전자 전달 기술에 적합한 pUC 유도된 벡터이다. 플라스미드 pCIB246은 이. 콜라이 GUS 유전자에 유효한 융합물에서 CaMV 35S 프로모터 및 CaMV 35S 전사 터미네이터를 포함하며, 공개된 PCT 출원 WO 93/07278에 기술되어 있다. 이 벡터의 35S 프로모터는 출발 부위에서 5' 쪽에 두 개의 ATG 서열을 함유한다. 이들 부위는 표준 PCR 기술을 사용하여 ATG를 제거하고 제한 부위 SspI 및 PvuII을 생성하는 방식으로 돌연변이된다. 신규한 제한 부위는 유일한 SalI 부위로부터 96 및 37bp 떨어져 있고, 실질적인 출발 부위로부터 101 및 42bp 떨어져 있다. 수득된 pCIB246의 유도체는 pCIB3025로 명명된다. 이후, GUS 유전자는 SalI 및 SacI로 절단시켜 pCIB3025로부터 절단하고, 말단은 평활화하고 재연결하여 플라스미드 pCIB3060을 생산한다. 플라스미드 pJIT82는 미국 노위치 소재의 John Innes Centre로부터 수득하고, 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes)으로부터의 bar 유전자를 함유하는 400bp Smal 단편을 절단하고, pCIB3060의 HpaI 부위로 삽입한다[참조: Thompson et al. EMBO J 6:2519-2523 (1987)]. 이는 제초제 선택을 위한 CaMV 35S 프로모터 및 터미네이터의 조절하의 bar 유전자, 암피실린 내성에 대한(이. 콜라이에서 선택하기 위한) 유전자 및 유일한 부위 SphI, PstI, HindIII 및 BamHI을 갖는 폴리링커를 포함하는 pCIB3064를 생산한다. 이 벡터는 그 자신의 조절 시그날을 함유하는 식물 발현 카세트의 클로닝에 적합하다.
b. pSOG19 및 pSOG35
pSOG35는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 선택성 표지로서 이. 콜라이 유전자 디하이드로폴레이트 리덕타제(DFR)를 사용하는 형질전환 벡터이다. PCR 은 35S 프로모터(-800bp), 옥수수 Adhl 유전자(-550bp)로부터 인트론 6 및 pSOG10으로부터 GUS 비해독 리더 서열의 18bp를 증폭시키는데 사용된다. 이. 콜라이 디하이드로폴레이트 리덕타제 II형 유전자를 암호화하는 250bp 단편은 또한, PCR에 의해 증폭되며, 이들 두개의 PCR 단편은 pUC19 벡터 골격 및 노팔린 신타제 터미네이터를 포함하는 pB1221(Clontech)로부터의 SacI-PstI 단편으로 조립된다. 이들 단편의 조립에 의해 35S 프로모터를 인트론 6 서열, GUS 리더, DHFR 유전자 및 노팔린 신타제 터미네이터와 융합하여 함유하는 pSOG19를 생산한다. pSOG19에서 GUS 리더를 옥수수 위황병 반점 바이러스(MCMV)로부터의 리더 서열로 대체하여 벡터 pSOG35를 생산한다. pSOG19 및 pSOG35는 암피실린 내성을 위한 pUC 유전자를 가지며, 외래 물질의 클로닝에 유용한 HindIII, SphI, PstI 및 EcoRI 부위를 갖는다.
3. 엽록체 형질전환에 적합한 벡터
식물 색소체에서 본 발명의 뉴클레오타이드 서열의 발현을 위해서, 색소체 형질전환 벡터 pPH143(WO 97/32011, 실시예 36)이 사용된다. 뉴클레오타이드 서열을 pPH143내로 삽입하고, 이에 의해 PROTOX 암호화 서열을 대체한다. 이후, 이 벡터를 색소체 형질전환 및 스펙티노마이신 내성을 위한 형질전환물의 선택에 사용한다. 또한, 뉴클레오타이드 서열은 pPH143에 삽입되어 aadH 유전자를 대체하도록 한다. 이 경우에, 형질전환은 PROTOX 억제 인자에 대한 내성을 위해 선택된다.
실시예 25
형질전환
일단 본 발명의 뉴클레오타이드 서열이 발현 시스템으로 클로닝되면, 이는 식물 세포로 형질전환된다. 식물의 형질전환 및 재생 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 예를 들어, Ti 플라스미드 벡터는 외래 DNA의 전달 뿐만 아니라 직접 DNA 흡수, 리포좀, 전기천공법, 미세주입법 및 미세투사체법에 사용되었다. 또한, 아그로박테리움 속 세균을 사용하여 식물 세포를 형질전환시킬 수 있다. 다음에 쌍자엽식물 및 단자엽식물의 형질전환에 대한 대표적 기술 뿐만 아니라 대표적 색소체 형질전환 기술에 대한 설명이 있다.
1. 쌍자엽식물의 형질전환
쌍자엽식물에 대한 형질전환 기술은 당해 분야에 익히 공지되어 있고, 아그로박테리움-기초 기술 및 아그로박테리움을 필요로 하지 않는 기술을 포함한다. 비-아그로박테리움 기술은 원형질체 세포에 의한 외인성 유전 물질의 직접 흡수를 포함한다. 이는 PEG 또는 전기천공법 매개된 흡수, 입자 충격법-매개된 전달 또는 미세주입법에 의해 수행될 수 있다. 이들 기술의 예는 문헌에 기술되어 있다[참조: Paszkowski et al., EMBO J 3:2717-2722 (1984), Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199:169-177 (1985), Reich et al., Biotechnology 4:1001-1004 (1986), and Klein et al., Nature 327:70-73 (1987)]. 각 경우에, 형질전환된 세포는 당해 분야에 공지된 표준 기술을 사용하여 전체 식물로 재생된다.
아그로박테리움-매개된 형질전환은 이의 높은 형질전환 효능 및 많은 상이한 종에 대한 이의 광범위한 유용성에 기인하여 쌍자엽식물의 형질전환에 바람직한 기술이다. 아그로박테리움 형질전환은 일반적으로, 숙주 아그로박테리움 균주에 의해 동시 체재하는 Ti 플라스미드 상에 또는 염색체상으로 운반된 vir 유전자의 보충물에 의존할 수 있는 적합한 아그로박테리움 균주(예: pCIB200 및 pCIB2001에 대한 ClB542 균주)[참고: Ukness et al. Plant Cell 5:159-169 (1993)]로 목적하는 외래 DNA를 운반하는 이원 벡터(예: pCIB200 또는 pCIB2001)의 전달을 포함한다. 아그로박테리움으로 재조합 이원 벡터의 전달은 재조합 이원 벡터를 운반하는 이. 콜라이, pPK2013과 같은 플라스미드를 운반하고 재조합 이원 벡터를 표적 아그로박테리움 균주로 이동시킬 수 있는 헬퍼 이. 콜라이 균주를 사용하여 세어버이(triparental mating) 교배 방법에 의해 수행한다. 또는, 재조합 이원 벡터는 DNA 형질전환에 의해 아그로박테리움으로 전달될 수 있다[참조: Hofgen & Willmitzer, Nucl. Acids Res. 16:9877 (1988)].
재조합 아그로박테리움에 의한 표적 식물 종의 형질전환은 일반적으로 식물로부터의 이식편을 아그로박테리움과 동시배양함을 포함하며, 당해 분야에 익히 공지된 프로토콜에 따른다. 형질전환된 조직은 이원 플라스미드 T-DNA 경계 사이에 존재하는 항생제 또는 제초제 내성 표지를 운반하는 선택성 배지 상에 재생된다.
식물 세포를 유전자로 형질전환시키는 다른 접근법은 불활성 또는 생물학적 활성 입자를 식물 조직 및 세포에서 추진시킴을 포함한다. 이 기술은 모두 Sanford 등에게 허여된 미국 특허 제4,945,050호, 제5,036,006호 및 제5,100,792호에 기술되어 있다. 일반적으로, 이 방법은 불활성, 생물학적 활성 입자를 세포에서, 세포의 외부 표면에 침투하고 이의 내부에 혼입되기에 유효한 조건하에 추진시킴을 포함한다. 불활성 입자를 사용하는 경우, 벡터는 바람직한 유전자를 함유하는 벡터로 입자를 도포하여 세포에 도입시킬 수 있다. 또한, 표적 세포는 벡터에 의해 포위되어 벡터가 입자를 따라 세포로 운반되게 한다. 생물학적 활성 입자(예: 각각 도입시키고자 시도하는 DNA를 함유하는 무수 효모 세포, 무수 세균 또는 박테리오파아지)는 또한 식물 세포 조직으로 추진될 수 있다.
2. 단자엽식물의 형질전환
대부분의 단자엽식물 종의 형질전환은 현재 일상화되었다. 바람직한 기술은 PEG 또는 전기천공법 기술을 사용하는 원형질체로의 직접 유전자 전달을 포함하며, 세포 조직으로의 입자 충격법을 포함한다. 형질전환은 단일 DNA 종 또는 다수의 DNA 종을 사용하여 수행할 수 있으며(즉, 동시-형질전환), 이들 기술은 둘 모두 본 발명에 사용하기에 적합하다. 동시-형질전환은 완전한 벡터 작제를 피하고 목적하는 유전자 및 선택성 표지의 유전자에 대한 비결합 위치를 갖는 형질전환된 식물을 생산한다는 잇점을 가질 수 있으므로, 후속 생산에서 선택성 표지를 제거할 수 있고, 이는 바람직하게 간주된다. 그러나 동시-형질전환을 사용하는 단점은 별도의 DNA 종이 게놈으로 조립되는 빈도가 100% 미만이라는 것이다[참조: Schocher et al. Biotechnology 4:1093-1096 (1986)].
특허원 EP 제0 292 435호, EP 제0 392 225호 및 WO 93/07278에는 옥수수의 선발된 동종교배 라인으로부터 캘러스(callus) 및 원형질체의 제조, PEG 또는 전기 천공법을 사용하는 원형질체의 형질전환 및 형질전환된 원형질체로부터 옥수수 식물의 재생을 위한 기술이 개시되어 있다. Gordon-Kamm 등[참조: Plant Cell 2:603-618 (1990)] 및 Fromm 등[참조: Biotechnology 8:833-839 (1990)]은 입자 충격법을 사용하는 A188-유도된 옥수수주의 형질전환을 위한 기술을 공개하였다. 또한, WO 93/07278 및 Koziel 등[참조: Biotechnology 11:194-200 (1993)]에는 입자 충격법에 의해 옥수수의 선발된 동종교배주의 형질전환을 위한 기술이 개시되어 있다. 이 기술은 수분한 지 14-15일 후에 옥수수 이삭으로부터 절단된 1.5 내지 2.5mm 길이의 미숙한 옥수수 배아 및 충격을 위한 PDS-1000He Biolistics 장치를 사용한다.
쌀의 형질전환은 또한, 원형질체 또는 입자 충격법을 사용하는 직접 유전자 전달 기술에 의해 수행될 수 있다. 원형질체-매개된 형질전환은 자포니카 (Japonica) 유형 및 인디카(Indica) 유형에 대해 기술되어 있다[참조: Zhang et al. Plant Cell Rep 7:379-384 (1988); Shimamoto et al. Nature 338:274-277 (1989); Datta et al. Biotechnology 8:736-740 (1990)]. 이들 유형은 둘 모두 입자 충격법을 사용하여 통상적으로 형질전환될 수 있다[참조: Christou et al. Biotechnology 9:957-962 (1991)]. 또한, WO 93/21335에는 전기천공법을 통한 쌀의 형질전환을 위한 기술이 기재되어 있다.
특허원 EP 제0 332 581호에는 포오이데애(Pooideae) 원형질체의 생산, 형질전환 및 재생을 위한 기술이 기재되어 있다. 이들 기술은 닥틸리스(Dactylis) 및 밀을 형질전환시킨다. 또한, 밀 형질전환은 C형 장기간 재생성가능한 캘러스의 세 포로 입자 충격법을 사용하고[참조: Vasil et al., Biotechnology 10:667-674 (1992)] 미숙한 배아 및 미숙한 배아-유도된 캘러스의 입자 충격법을 사용하는 것이[참조: Vasil et al., Biotechnology 11:1553-1558 (1993) and Weeks et al., Plant Physiol. 102:1077-1084 (1993)] 기술되어 있다. 그러나 밀 형질전환에 바람직한 기술은 미숙한 배아의 입자 충격법에 의한 밀의 형질전환을 포함하며, 유전자 전달 전에 높은 수크로스 또는 높은 말토스 단계를 포함한다. 충격 전에, 어떠한 수의 배아(0.75 내지 1mm 길이)를 3% 수크로스[참조: Murashiga & Skoog, Physiologia Plantarum 15:473-497 (1962)] 및 체성 배아를 유도시키기 위한 3㎎/l 2,4-D를 함유하는 MS 배지 상에서 플레이팅하고, 이는 암상으로 진행시킨다. 선택된 충격일에, 배아를 유도 배지로부터 제거하고, 오스모티쿰(osmoticum 즉, 바람직한 농도, 일반적으로 15%로 첨가된 수크로스 또는 말토스를 함유하는 유도 배지) 위에 놓는다. 배아를 2 내지 3시간 동안 주형질 분리시킨 다음에, 충격을 가한다. 표적 플레이트당 20개의 배아가 일반적이지만, 중요하지 않다. 적합한 유전자-운반 플라스미드(예: pCIB3064 또는 pSG35)를 표준 방법을 사용하여 μm 크기의 금 입자 위에 침전시킨다. 각각의 배아 플레이트를 약 1000psi의 파열 압력 및 표준 80메쉬 스크린을 사용하여 DuPont BiolisticsR 헬륨 장치로 발사한다. 충격 후, 배아를 다시 암상으로 놓아서 약 24시간 동안(여전히 오스모티쿰 상에서) 회복시킨다. 24시간 후, 배아를 오스모티쿰으로부터 제거하고, 이들이 재생되기 약 1개월 전에 잔류하는 유도 배지 상에 다시 놓는다. 약 1개월 후, 배아생성 캘러스가 발 달된 배아 이식편을, 추가로 적합한 선택제(pCIB3064의 경우에 10㎎/l 바스타 및 pSOG35의 경우에 2㎎/l 메토트렉세이트)를 함유하는 재생 배지(MS + 1㎎/l NAA, 5㎎/l GA)로 옮긴다. 약 1개월 후, 발달된 새싹을 반-농도의 MS, 2% 수크로스 및 동일한 농도의 선택제를 함유하는 "GA7s"으로 공지된 대형 멸균 용기로 옮긴다.
아그로박테리움을 사용하는 단자엽식물의 형질전환이 또한 기술되어 있다. 본원에서 참조로 인용된 WO 94/00977 및 미국 특허 제5,591,616호를 참고한다.
3. 색소체의 형질전환
니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) c.v. 'Xanthi nc'의 종자를 T 한천 배지상에서 1" 환상 배열로 플레이트당 7개로 발아시키고, 파종한 지 12 내지 14일 후에 필수적으로 문헌에 기술된 바와 같이[참조: Svab, Z. and Maliga, P. (1993) PNAS 90, 913-917] 플라스미드 pPH143 및 pPH145로부터의 DNA로 피복시킨 1㎛ 텅스텐 입자(M10, Biorad, Hercules, CA)로 충격을 가한다. 충격을 가한 종자를 T 배지 상에서 잎이 절제된 후 2일 동안 배양하고, 축외에서 상부 측면으로 밝은 광(350-500μmol 광자/m2/s)으로 500㎍/㎖ 스펙티노마이신 디하이드로클로라이드(미국 미조리주 세인트 루이스 소재의 Sigma)를 함유하는 RMOP 배지[참조: Svab, Z., Hajdukiewicz, P. and Maliga, P. (1990) PNAS 87, 8526-8530]의 플레이트 상에 놓는다. 충격 후 3 내지 8주에 백변한 잎 아래에 나타나는 내성 새싹을 동일한 선택성 배지 상에서 서브클로닝하여, 캘러스를 형성시키고, 제2 새싹을 분리하고 서브클로닝한다. 독립적인 서브클론에서 형질전환된 색소체 게놈 복사체(동종세포형질성, homoplasmicity)의 완전한 분리는 서던 블롯의 표준 기술에 의해 분석한다[참조: Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor]. BamHI/EcoRI-절단된 전체 세포 DNA[참조: Mettler, I. J. (1987) Plant Mol Biol Reporter 5, 346-349]를 1% 트리스-붕산염(TBE) 아가로스 겔 상에서 분리하고, 나일론 막(Ammersham)으로 옮기고, rps7/12 색소체 표적 서열 부분을 함유하는 pC8로부터의 0.7kb BamHI/HindIII DNA 단편에 상응하는 32P-표지된 랜덤 프라임 DNA 서열로 탐침한다. 동종세포형질성 새싹을 스펙티노마이신-함유 MS/IBA 배지[참조: McBride, K. E. et al. (1994) PNAS 91, 7301-7305] 상에서 무균상태로 처리하여 뿌리를 내리게 하여, 온실로 옮긴다.
E. 교배 및 종자 생산
실시예 26
교배
본 발명의 핵산 서열로 형질전환시켜 수득된 식물은 단자엽식물 및 쌍자엽식물의 것을 포함하여 광범위한 식물 종일 수 있다. 그러나, 본 발명의 방법에서 사용된 식물은 바람직하게는 앞에서 기재된 농업 경영상 중요한 표적 농작물의 목록으로부터 선택된다. 생산 및 품질에 중요한 다른 특성과 함께 본 발명의 유전자의 발현은 교배를 통해 식물주로 혼입될 수 있다. 교배 접근법 및 기술은 당해 분야에 공지되어 있다[참조: 예를 들어, Welsh J. R., Fundamentals of Plant Genetics and Breeding, John Wiley & Sons, NY(1981); Crop Breeding, Wood D. R. (Ed.) American Society of Agronomy Madison, Wisconsin (1983); Mayo O., The Theory of Plant Breeding, Second Edition, Clarendon Press, Oxford (1987); Singh, D.P., Breeding for Resistance to Diseases and Insect Pests, Springer-Verlag, NY (1986); and Wricke and Weber, Quantitative Genetics and Selection Plant Breeding, Walter de Gruyter and Co., Berlin (1986)].
상기에서 기술된 형질전환된 종자 및 식물내로 조작된 유전학적 특성은 유성 생식 또는 무성 성장에 의해 유전되며, 따라서 자손 식물에서 유지되고 증식될 수 있다. 일반적으로 유지 및 증식은 경작, 파종 또는 수확과 같은 특정한 목적에 적합하게 개발된 공지된 농업 방법을 사용하게 한다. 수경법 또는 온실 기술과 같은 전문화된 방법이 또한 적용될 수 있다. 성장하는 농작물은 곤충 또는 감염에 의해 유발된 공격 및 손상에 뿐만 아니라 잡초 식물에 의한 경쟁에 상처 입기 쉬우므로, 잡초, 식물 질병, 곤충, 선충 및 수율을 개선시키는 다른 악조건을 조절하기 위한 방법이 수행된다. 이들은 토양의 경작 또는 잡초 및 감염된 식물의 제거와 같은 기계적 방법 뿐만 아니라 제초제, 살진균제, 살배우자제, 살선충제, 성장 조절제, 숙성제 및 살충제와 같은 농화학물질의 적용을 포함한다.
본 발명에 따르는 형질전환된 식물 및 종자의 유리한 유전학적 특성을 식물 교배에 추가로 사용할 수 있으며, 이는 해충, 제초제 또는 스트레스의 내성과 같은 개선된 특성, 개선된 영양가, 증가된 수율, 또는 쓰러짐 또는 꺾임으로부터의 손실을 적게 하는 개선된 구조를 갖는 식물의 발육을 목표로 한다. 많은 교배 단계는 이종교배되는 라인의 선택, 어버이 라인의 수분 지시 또는 적합한 자손 식물의 선택과 같은 적합하게 정의된 사람의 개입에 의해 특성화된다. 바람직한 특성에 따라서, 상이한 교배 방법이 취해진다. 관련 기술은 당해 분야에 익히 공지되어 있으며, 잡종교배, 동계교배, 역교배, 다선 교배, 변종 배합, 이종간 잡종교배, 이수성 기술 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 잡종교배 기술은 또한, 웅성 또는 자성 생식불능 식물을 기계적, 화학적 또는 생화학적 방법에 의해 수득하는 식물의 불임화를 포함한다. 상이한 라인의 화분을 갖는 웅성 생식불능 식물의 이종 수분에 의해 자성 수정 식물이 아닌 웅성 생식불능 게놈이 양쪽 어버이 라인의 특성을 일정하게 수득함을 보장한다. 따라서, 예를 들어, 제초제 또는 살충제 처리와 같은 통상적인 방법의 효능을 증가시키거나 이의 변경된 유전학적 특성에 기인하여 상기 방법이 필요없게 하는, 본 발명에 따르는 형질전환된 종자 및 식물을 개선된 식물 라인의 교배에 사용할 수 있다. 또는, 스트레스 내성이 개선된 신규한 농작물을 수득할 수 있으며, 이의 최적화된 유전적 "장치"에 기인하여, 상당한 역 발육 조건을 견디지 못하는 산물보다 품질이 우수한 수확 산물을 생산한다.
실시예 27
종자 생산
종자 생산에서, 종자의 발아 품질 및 균일성은 필수적 생산물 특성임에 반하 여, 농부에 의해 수확되고 판매되는 종자의 발아 품질 및 균일성은 중요하지 않다. 농작물을 다른 농작물 및 잡초 종자로부터 유리시켜 유지하고, 종자내포 질병을 조절하고, 발아가 우수한 종자를 생산하는 것은 어렵게 때문에, 매우 광대하고 적합하게 정의된 종자 생산의 실시는 순수한 종자의 성장, 관리 및 판매 분야에 경험이 많은 종자 생산업자에 의해 개발되어져 왔다. 따라서, 보통 농부가 그 자신의 농작물로부터 수확된 종자를 사용하는 대신에 특정한 품질 표준에 부합하는 보증된 종자를 구입하는 것이 일상적이다. 종자로서 사용되는 증식 물질은 통상적으로 제초제, 살충제, 살진균제, 살균제, 살선충제, 살연체동물제 또는 이들의 혼합물을 포함하는 보호 피막으로 처리되어 있다. 통상적으로 사용되는 보호 피막은 캅탄, 카복신, 티람(TMTDR), 메탈락실(ApronR) 및 피리미포스-메틸(ActellicR)과 같은 화합물을 포함한다. 필요한 경우, 이들 화합물은 추가의 담체, 계면활성제 또는 제형 분야에서 통상적으로 사용되는 도포-촉진 보조제와 함께 제형화하여 세균, 진균 또는 동물 해충에 의해 유발되는 손상에 대해 보호할 수 있다. 보호 피막은 증식 물질을 액상 제형으로 함침시키거나 합친 습윤 또는 무수 제형으로 피복하여 적용할 수 있다. 싹 또는 과실에 지시되는 처리와 같은 다른 적용 방법이 또한 가능하다.
본 발명의 추가 양태는 본 발명에 따르는 형질전환된 식물, 형질전환된 식물 물질 또는 형질전환된 종자를 사용하여, 상기에서 예시된 방법과 같은 신규한 농업 방법을 제공하는 것이다.
종자는 적합한 충전 물질로 이루어진 백, 컨테이너 또는 용기로 제공될 수 있으며, 여기에서 백 또는 컨테이너는 종자를 함유하도록 밀봉될 수 있다. 백, 컨테이너 또는 용기는 종자의 단기간 또는 장기간 저장 또는 이들 둘 모두를 위해 고안될 수 있다. 적합한 충전 물질의 예는 종이, 예를 들어, 크라프트지, 경질 또는 연질 플라스틱 또는 다른 중합체 물질, 유리 또는 금속을 포함한다. 바람직하게는 백, 컨테이너 또는 용기는 동일하거나 상이한 종류의 충전 물질의 다수 층으로 이루어진다. 한가지 양태에서, 백, 컨테이너 또는 용기는 종자와 접촉시에 물 및 수분을 배제하거나 제한하도록 제공된다. 한 예에서, 백, 컨테이너 또는 용기는 밀봉되어, 예를 들어, 용봉되어 물 또는 수분의 유입을 방지한다. 다른 양태에서, 수분 흡수성 물질은 충전 물질 층 사이에 또는 이에 인접하여 배치된다. 또다른 양태에서, 백, 컨테이너 또는 용기, 또는 구성 충전 물질을 처리하여 종자의 저장 또는 수송시에 질병, 오염 또는 다른 역효과를 제한하거나 억제하거나 방지한다. 이러한 처리의 예는, 예를 들어, 화학적 수단 또는 방사선 노출에 의한 멸균이다. 본 발명에 의해 야생형 식물에서보다 높은 수준으로 형질전환된 식물에서 발현되는 본 발명의 유전자를 포함하는 형질전환된 식물의 종자를, 적합한 담체와 함께, 식물에 광범위한 질병 내성을 부여하는 이의 용도에 대한 지시 라벨과 함께 포함하는 상업용 백이 구성된다.
상기에서 기술된 양태는 예시적이다. 본 발명의 이러한 기술에 의해 당해 분야의 전문가들은 본 발명의 많은 변형을 확보할 수 있을 것이다. 이러한 모든 명백하고 예측가능한 변형은 첨부된 특허청구의 범위에 포함된다.
<110> Novartis AG <120> NOVEL INSECTICIDAL TOXINS FROM XENORHABDUS NEMATOPHILUS AND NUCLEIC ACID SEQUENCES CODING THEREFOR <130> 30472/A/CGC1992 <150> US 09/063,982 <151> 1998-04-21 <150> US 60/123,500 <151> 1999-03-09 <160> 15 <170> KOPATIN 1.5 <210> 1 <211> 2978 <212> DNA <213> Xenorhabdus nematophilus <220> <221> CDS <222> (569)..(976) <223> orf1 <220> <221> CDS <222> (1045)..(2331) <223> JHE-like orf2 <220> <223> pCIB9369 <400> 1 atcgatgtga cggcagagta tttttattcc tgtaaactga cgacaatgca tttctaagat 60 atcaatataa taatgataaa tttattgatc atatatctgt tatattttga ttgaaaatta 120 ttgaatatac ctcttgtact aaattcatta catttttttt actttaaaca acattaaatt 180 cacacataat acagcttaaa tataacatgt gatatatatt atgattataa aaaacattaa 240 aataaataat acgccacata tattaacaat atctaattac tgatgatact attttctgag 300 tatatataaa tcttaaagaa aataattatt ttttatattt cacatcaatt taaaatctgc 360 ttagaatgcc ccccggcatc acaagaaaac aaaatcattc aagtaataca atagagttaa 420 atttaaaaat aacatgtata acaaaataca tagacaatta tacatgtaaa tgacagacaa 480 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orf2 of pCIB9381 <400> 6 atg aat aat gaa ccg atg aat act aat gaa tca caa gtt tca gag ata 48 Met Asn Asn Glu Pro Met Asn Thr Asn Glu Ser Gln Val Ser Glu Ile 1 5 10 15 gta ccc tca atg aat gaa tct ata tta gca gca cct tat tca att tct 96 Val Pro Ser Met Asn Glu Ser Ile Leu Ala Ala Pro Tyr Ser Ile Ser 20 25 30 aca cct aat tat gaa tgg gat atg tca tca ata ata aaa gat gcc att 144 Thr Pro Asn Tyr Glu Trp Asp Met Ser Ser Ile Ile Lys Asp Ala Ile 35 40 45 att ggt ggt ata ggc ttt att cct ggt ccg ggc tca gca ata tca ttt 192 Ile Gly Gly Ile Gly Phe Ile Pro Gly Pro Gly Ser Ala Ile Ser Phe 50 55 60 ttg tta ggg tta ttt tgg cca caa caa acc gac aat act tgg gag caa 240 Leu Leu Gly Leu Phe Trp Pro Gln Gln Thr Asp Asn Thr Trp Glu Gln 65 70 75 80 att ctc caa aaa gta gaa caa atg atc gag caa gcc aat ctc aaa act 288 Ile Leu Gln Lys Val Glu Gln Met Ile Glu Gln Ala Asn Leu Lys Thr 85 90 95 att caa gga ata ttg aac ggc gat ata caa gaa att aaa ggc aaa atg 336 Ile Gln Gly Ile Leu Asn Gly Asp Ile Gln Glu Ile Lys Gly Lys 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Phe Ala Asn Asp Ala Ser Tyr Thr 325 330 335 ctc ggt aca gta act tca gaa gta aac tca att gaa ctg aat gac agc 1056 Leu Gly Thr Val Thr Ser Glu Val Asn Ser Ile Glu Leu Asn Asp Ser 340 345 350 gtt ata acc agc ctg gaa gta tgg gga aat ggc gct gtt gat gag gca 1104 Val Ile Thr Ser Leu Glu Val Trp Gly Asn Gly Ala Val Asp Glu Ala 355 360 365 ttc ttt aca tta agt gac gga cgt caa ttt agg ctt ggc caa cgc tat 1152 Phe Phe Thr Leu Ser Asp Gly Arg Gln Phe Arg Leu Gly Gln Arg Tyr 370 375 380 gcc agt aac tat aga aaa tat gct gtc gat aac cac tat att tca gga 1200 Ala Ser Asn Tyr Arg Lys Tyr Ala Val Asp Asn His Tyr Ile Ser Gly 385 390 395 400 ttg tac tta gcc agt gat gaa cct tca ttg gca ggt caa gca gca ggc 1248 Leu Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Pro Ser Leu Ala Gly Gln Ala Ala Gly 405 410 415 att gca gtt tca tac cat atg ata gct gat aaa aaa tca tag 1290 Ile Ala Val Ser Tyr His Met Ile Ala Asp Lys Lys Ser 420 425 <210> 7 <211> 429 <212> PRT <213> Xenorhabdus nematophilus <400> 7 Met Asn Asn Glu Pro Met Asn Thr Asn Glu Ser Gln Val Ser Glu Ile 1 5 10 15 Val Pro Ser Met Asn Glu Ser Ile Leu Ala Ala Pro Tyr Ser Ile Ser 20 25 30 Thr Pro Asn Tyr Glu Trp Asp Met Ser Ser Ile Ile Lys Asp Ala Ile 35 40 45 Ile Gly Gly Ile Gly Phe Ile Pro Gly Pro Gly Ser Ala Ile Ser Phe 50 55 60 Leu Leu Gly Leu Phe Trp Pro Gln Gln Thr Asp Asn Thr Trp Glu Gln 65 70 75 80 Ile Leu Gln Lys Val Glu Gln Met Ile Glu Gln Ala Asn Leu Lys Thr 85 90 95 Ile Gln Gly Ile Leu Asn Gly Asp Ile Gln Glu Ile Lys Gly Lys Met 100 105 110 Glu His Val Gln Phe Met Leu Glu Ser Ser Pro Gly Thr Gln Glu Ser 115 120 125 His Asp Ala Tyr Met Phe Leu Ala Arg Tyr Leu Val Ser Ile Asp Glu 130 135 140 Lys Phe Lys Ser Phe Asp Asn Lys Thr Asn Tyr Gln Ile Leu Pro Met 145 150 155 160 Tyr Thr Asn Thr Ile Met Leu Gln Ala Pro Tyr Trp Lys Met Gly Ile 165 170 175 Glu Arg Lys Asp Glu Ile Lys Leu Thr Asp Ile Glu Val Asn Glu Leu 180 185 190 Lys Glu Leu Ile Gly Lys Leu Ser Thr Ser Ala Asp Lys Tyr Ile His 195 200 205 Asp Val Tyr Thr Arg Glu Tyr Asp Asn Ala Met Asn Thr Ser Thr Ala 210 215 220 Ala Asn Ile Thr Asn Asn Leu Leu Ser Val Arg Gly Tyr Cys Leu Leu 225 230 235 240 His Gly Leu Glu Cys Leu Glu Val Ile Asn His Ile Gln Asn Asn Ser 245 250 255 Leu Glu Gln Ser Phe Tyr Pro Lys Thr Ile Ser Tyr Ser Thr Val Phe 260 265 270 Asp Arg Gln Thr Asn Lys Thr Arg Val Gln Ala Leu Thr Glu Asp Asp 275 280 285 Gln Met Gln Glu Pro Phe Lys Pro Ala Leu Ile Asn Gly Lys Tyr Asn 290 295 300 Lys Ile Lys Ser Leu Ile Gly Tyr Val Gln Arg Ile Gly Asn Ala Pro 305 310 315 320 Arg Val Gly Gly Ile Lys Val Thr Phe Ala Asn Asp Ala Ser Tyr Thr 325 330 335 Leu Gly Thr Val Thr Ser Glu Val Asn Ser Ile Glu Leu Asn Asp Ser 340 345 350 Val Ile Thr Ser Leu Glu Val Trp Gly Asn Gly Ala Val Asp Glu Ala 355 360 365 Phe Phe Thr Leu Ser Asp Gly Arg Gln Phe Arg Leu Gly Gln Arg Tyr 370 375 380 Ala Ser Asn Tyr Arg Lys Tyr Ala Val Asp Asn His Tyr Ile Ser Gly 385 390 395 400 Leu Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Pro Ser Leu Ala Gly Gln Ala Ala Gly 405 410 415 Ile Ala Val Ser Tyr His Met Ile Ala Asp Lys Lys Ser 420 425 <210> 8 <211> 408 <212> DNA <213> Xenorhabdus poinarii <220> <221> CDS <222> (1)..(405) <223> orf1 of pCIB9354 <400> 8 atg atc aca atc aat atc agt ggt ggt aat gta aca att aat aac aat 48 Met Ile Thr Ile Asn Ile Ser Gly Gly Asn Val Thr Ile Asn Asn Asn 1 5 10 15 atc agt tca gta acg gat atc caa aaa ccc ctt gat gca gaa ccc ctc 96 Ile Ser Ser Val Thr Asp Ile Gln Lys Pro Leu Asp Ala Glu Pro Leu 20 25 30 tca gtc acg aat tat aga gat ctg aca ata gag ccg cac tca tct att 144 Ser Val Thr Asn Tyr Arg Asp Leu Thr Ile Glu Pro His Ser Ser Ile 35 40 45 caa gca gac aga acg gac acc ccc att att cct gaa aca cgc cct gat 192 Gln Ala Asp Arg Thr Asp Thr Pro Ile Ile Pro Glu Thr Arg Pro Asp 50 55 60 tat tat atc gct aac tca ggc cct gct tca tca gtc aaa gct gtg ttt 240 Tyr Tyr Ile Ala Asn Ser Gly Pro Ala Ser Ser Val Lys Ala Val Phe 65 70 75 80 tat tgg tcg cat tcg ttt aca tcg gaa tgg ttc gag tat tca tct atc 288 Tyr Trp Ser His Ser Phe Thr Ser Glu Trp Phe Glu Tyr Ser Ser Ile 85 90 95 acg gta aaa gca gga gaa gat gga ata tta aaa tca ccg agt aat gct 336 Thr Val Lys Ala Gly Glu Asp Gly Ile Leu Lys Ser Pro Ser Asn Ala 100 105 110 gta tat tac agt aaa gta gtc att tat aat gat aca gat aag cgg gct 384 Val Tyr Tyr Ser Lys Val Val Ile Tyr Asn Asp Thr Asp Lys Arg Ala 115 120 125 ttt gtg act gga tat aac atg taa 408 Phe Val Thr Gly Tyr Asn Met 130 135 <210> 9 <211> 135 <212> PRT <213> Xenorhabdus poinarii <400> 9 Met Ile Thr Ile Asn Ile Ser Gly Gly Asn Val Thr Ile Asn Asn Asn 1 5 10 15 Ile Ser Ser Val Thr Asp Ile Gln Lys Pro Leu Asp Ala Glu Pro Leu 20 25 30 Ser Val Thr Asn Tyr Arg Asp Leu Thr Ile Glu Pro His Ser Ser Ile 35 40 45 Gln Ala Asp Arg Thr Asp Thr Pro Ile Ile Pro Glu Thr Arg Pro Asp 50 55 60 Tyr Tyr Ile Ala Asn Ser Gly Pro Ala Ser Ser Val Lys Ala Val Phe 65 70 75 80 Tyr Trp Ser His Ser Phe Thr Ser Glu Trp Phe Glu Tyr Ser Ser Ile 85 90 95 Thr Val Lys Ala Gly Glu Asp Gly Ile Leu Lys Ser Pro Ser Asn Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Ser Lys Val Val Ile Tyr Asn Asp Thr Asp Lys Arg Ala 115 120 125 Phe Val Thr Gly 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288 Pro Gln Gln Thr Asp Asn Thr Trp Glu Gln Ile Leu Gln Lys Val Glu 85 90 95 caa atg atc gag caa gcc aat ctc aaa act att caa gga ata ttg aac 336 Gln Met Ile Glu Gln Ala Asn Leu Lys Thr Ile Gln Gly Ile Leu Asn 100 105 110 ggc gat ata caa gaa att aaa ggc aaa atg gaa cat gtg caa ttc atg 384 Gly Asp Ile Gln Glu Ile Lys Gly Lys Met Glu His Val Gln Phe Met 115 120 125 cta gaa tcc tca cct ggc act caa gaa agc cat gac gca tac atg ttt 432 Leu Glu Ser Ser Pro Gly Thr Gln Glu Ser His Asp Ala Tyr Met Phe 130 135 140 ctg gcg aga tat ctg gtc agt ata gac gaa aaa ttc aag tct ttt gat 480 Leu Ala Arg Tyr Leu Val Ser Ile Asp Glu Lys Phe Lys Ser Phe Asp 145 150 155 160 aac aaa aca aat tat caa att ctt ccc atg tat acc aat acg att atg 528 Asn Lys Thr Asn Tyr Gln Ile Leu Pro Met Tyr Thr Asn Thr Ile Met 165 170 175 tta caa gcc cct tat tgg aaa atg ggt ata gag aga aaa gat gag ata 576 Leu Gln Ala Pro Tyr Trp Lys Met Gly Ile Glu Arg Lys Asp Glu Ile 180 185 190 aaa cta aca gat ata gaa gtt aat gaa tta aaa gag ctg ata 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ata aaa tca ttg att 960 Lys Pro Ala Leu Ile Asn Gly Lys Tyr Asn Lys Ile Lys Ser Leu Ile 305 310 315 320 ggg tat gta caa aga atc gga aac gca ccc aga gtt gga ggc att aaa 1008 Gly Tyr Val Gln Arg Ile Gly Asn Ala Pro Arg Val Gly Gly Ile Lys 325 330 335 gtc aca ttt gca aac gat gca tct tat acc ctc ggt aca gta act tca 1056 Val Thr Phe Ala Asn Asp Ala Ser Tyr Thr Leu Gly Thr Val Thr Ser 340 345 350 gaa gta aac tca att gaa ctg aat gac agc gtt ata acc agc ctg gaa 1104 Glu Val Asn Ser Ile Glu Leu Asn Asp Ser Val Ile Thr Ser Leu Glu 355 360 365 gta tgg gga aat ggc gct gtt gat gag gca ttc ttt aca tta agt gac 1152 Val Trp Gly Asn Gly Ala Val Asp Glu Ala Phe Phe Thr Leu Ser Asp 370 375 380 gga cgt caa ttt agg ctt ggc caa cgc tat gcc agt aac tat aga aaa 1200 Gly Arg Gln Phe Arg Leu Gly Gln Arg Tyr Ala Ser Asn Tyr Arg Lys 385 390 395 400 tat gct gtc gat aac cac tat att tca gga ttg tac tta gcc agt gat 1248 Tyr Ala Val Asp Asn His Tyr Ile Ser Gly Leu Tyr Leu Ala Ser Asp 405 410 415 gaa cct tca ttg gca ggt caa gca gca ggc att gca gtt tca tac cat 1296 Glu Pro Ser Leu Ala Gly Gln Ala Ala Gly Ile Ala Val Ser Tyr His 420 425 430 atg ata gct gat aaa aaa tca tag 1320 Met Ile Ala Asp Lys Lys Ser 435 <210> 15 <211> 439 <212> PRT <213> Photorhabdus luminescens <400> 15 Met Asn Asn Glu Pro Met Asn Thr Asn Glu Ser Gln Ala Ser Glu Ile 1 5 10 15 Val Pro Ser Met Asn Glu Ser Ile Leu Asn Glu Ser Ile Leu Asn Glu 20 25 30 Ser Ile Leu Ala Ala Pro Tyr Ser Ile Ser Thr Pro Asn Tyr Glu Trp 35 40 45 Asp Met Ser Ser Ile Ile Lys Asp Ala Ile Ile Gly Gly Ile Gly Phe 50 55 60 Ile Pro Gly Pro Gly Ser Ala Ile Ser Phe Leu Leu Gly Leu Phe Trp 65 70 75 80 Pro Gln Gln Thr Asp Asn Thr Trp Glu Gln Ile Leu Gln Lys Val Glu 85 90 95 Gln Met Ile Glu Gln Ala Asn Leu Lys Thr Ile Gln Gly Ile Leu Asn 100 105 110 Gly Asp Ile Gln Glu Ile Lys Gly Lys Met Glu His Val Gln Phe Met 115 120 125 Leu Glu Ser Ser Pro Gly Thr Gln Glu Ser His Asp Ala Tyr Met Phe 130 135 140 Leu Ala Arg Tyr Leu Val Ser Ile Asp Glu Lys Phe Lys Ser Phe Asp 145 150 155 160 Asn Lys Thr Asn Tyr Gln Ile Leu Pro Met Tyr Thr Asn Thr Ile Met 165 170 175 Leu Gln Ala Pro Tyr Trp Lys Met Gly Ile Glu Arg Lys Asp Glu Ile 180 185 190 Lys Leu Thr Asp Ile Glu Val Asn Glu Leu Lys Glu Leu Ile Gly Lys 195 200 205 Leu Ser Thr Ser Ala Asp Lys Tyr Ile His Asp Val Tyr Thr Arg Glu 210 215 220 Tyr Asp Asn Ala Met Asn Thr Ser Thr Ala Ala Asn Ile Thr Asn Asn 225 230 235 240 Leu Leu Ser Val Arg Gly Tyr Cys Leu Leu His Gly Leu Glu Cys Leu 245 250 255 Glu Val Ile Asn His Ile Gln Asn Asn Ser Leu Glu Gln Ser Phe Tyr 260 265 270 Pro Lys Thr Ile Ser Tyr Ser Thr Val Phe Asp Arg Gln Thr Asn Lys 275 280 285 Thr Arg Val Gln Ala Leu Thr Glu Asp Asp Gln Met Gln Glu Pro Phe 290 295 300 Lys Pro Ala Leu Ile Asn Gly Lys Tyr Asn Lys Ile Lys Ser Leu Ile 305 310 315 320 Gly Tyr Val Gln Arg Ile Gly Asn Ala Pro Arg Val Gly Gly Ile Lys 325 330 335 Val Thr Phe Ala Asn Asp Ala Ser Tyr Thr Leu Gly Thr Val Thr Ser 340 345 350 Glu Val Asn Ser Ile Glu Leu Asn Asp Ser Val Ile Thr Ser Leu Glu 355 360 365 Val Trp Gly Asn Gly Ala Val Asp Glu Ala Phe Phe Thr Leu Ser Asp 370 375 380 Gly Arg Gln Phe Arg Leu Gly Gln Arg Tyr Ala Ser Asn Tyr Arg Lys 385 390 395 400 Tyr Ala Val Asp Asn His Tyr Ile Ser Gly Leu Tyr Leu Ala Ser Asp 405 410 415 Glu Pro Ser Leu Ala Gly Gln Ala Ala Gly Ile Ala Val Ser Tyr His 420 425 430 Met Ile Ala Asp Lys Lys Ser 435

Claims (35)

  1. (a) 서열 1의 뉴클레오타이드 569-979, 서열 4, 서열 8 및 서열 12로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열;
    (b) 서열 1의 뉴클레오타이드 1045-2334, 서열 6, 서열 10 및 서열 14로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열; 또는
    (c) 상기 (a) 및 (b)의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지고, 발현되어 곤충에 대해 활성인 하나 이상의 독소를 생산하는 분리된 핵산 분자.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열이 (a) 서열 1의 뉴클레오타이드 569-979, 서열 4, 서열 8 및 서열 12로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열인 분리된 핵산 분자.
  7. 제6항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열이 서열 2, 서열 5, 서열 9 또는 서열 13으로 나타낸 아미노산 서열을 암호화하는 분리된 핵산 분자.
  8. 제1항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열이 (b) 서열 1의 뉴클레오타이드 1045-2334, 서열 6, 서열 10 및 서열 14로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열인 분리된 핵산 분자.
  9. 제8항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열이 서열 3, 서열 7, 서열 11 또는 서열 15로 나타낸 아미노산 서열을 암호화하는 분리된 핵산 분자.
  10. 제1항에 있어서, NRRL B-21883으로서 기탁된 pCIB9369에 포함된 약 3.0kb DNA 단편으로 이루어진 분리된 핵산 분자.
  11. 제1항에 있어서, 독소가 플루텔라 자일로스텔라(Plutella xylostella)에 대해 활성인 분리된 핵산 분자.
  12. 삭제
  13. 제1항의 핵산 분자에 작동적으로 결합된 이종 프로모터 서열을 포함하는 키메라 유전자.
  14. 제13항의 키메라 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  15. 제13항의 키메라 유전자를 포함하는 숙주 세포.
  16. 제15항에 있어서, 세균 세포인 숙주 세포.
  17. 제15항에 있어서, 효모 세포인 숙주 세포.
  18. 제15항에 있어서, 식물 세포인 숙주 세포.
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 제1항에 따른 DNA 분자의 발현에 의해 생산된 독소.
  22. 제21항에 있어서, 플루텔라 자일로스텔라에 대해 활성인 독소.
  23. 제21항에 있어서, NRRL 기탁 번호 제B-21883호인 이. 콜라이(E. coli) 균주에 의해 생산되는 독소.
  24. 제21항에 있어서, 서열 2, 3, 5, 7, 9, 11, 13 및 15로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 독소.
  25. 제24항에 있어서, 서열 2, 5, 9 및 13으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 독소.
  26. 제24항에 있어서, 서열 3, 7, 11 및 15로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 독소.
  27. 제21항에 따른 독소를 포함하는 살충 조성물.
  28. (a) 제15항에 따른 숙주 세포를 수득하고,
    (b) 핵산 분자를 상기 세포에서 발현시켜 곤충에 대해 활성인 하나 이상의 독소를 생산함을 특징으로 하여, 곤충에 대해 활성인 독소를 생산하는 방법.
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 유효량의 제21항에 따른 독소를 곤충에게 전달함을 특징으로 하여, 곤충을 방제하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 곤충이 플루텔라 자일로스텔라인 방법.
  33. 제31항에 있어서, 독소가 곤충에 경구로 전달되는 방법.
  34. 삭제
  35. 제1항에 있어서, 뉴클레타이드 서열이
    (a) 서열 1의 뉴클레오타이드 569-979, 서열 4, 서열 8 및 서열 12로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열; 및
    (b) 서열 1의 뉴클레오타이드 1045-2334, 서열 6, 서열 10 및 서열 14로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 뉴클레오타이드 서열인 분리된 핵산 분자.
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