KR20020031137A

KR20020031137A - 제초제 저항성 형질이 도입된 형질전환 브로콜리와 그에의해 생산된 일대교잡종 브로콜리의 순도검정에 이용

Info

Publication number: KR20020031137A
Application number: KR1020020016902A
Authority: KR
Inventors: 박효근; 백남권; 송융남; 박응준; 김봉규; 이지영; 이경아
Original assignee: 임학태
Priority date: 2002-03-28
Filing date: 2002-03-28
Publication date: 2002-04-26

Abstract

본 발명은 제초제 저항성 유전자를 아그로박테리움(Agrobacterium)방법을 이용하여 브로콜리의 일대잡종의 양친에 도입하여 진정한 일대 교잡종을 획득함으로써 십자화과 작물의 종묘순도 검정기술을 적극적으로 향상시킬 수 있는 방법에 관한 것으로, 본 발명은 본엽과 엽병을 절편체로 사용하여 재분화를 유도하는 조건을 체계화 하고, 그것에 의해 제초제 저항성이 도입된 브로콜리를 개발하였으며, 본 발명의 방법으로 개발된 제초제 저항성 브로콜리는 4세대까지 진전되어 도입시킨 유전자가 안정하게 유지되어 있음을 확인하였다. 또한 본 발명은 체계화 된 형질전환 방법으로 제조된 브로콜리를 부본용으로 이용하여 품종을 육성하는 기술적 측면에서 종묘 순도검정기술을 향상시킬 수 있는 방법임을 확인하였다.

Description

제초제 저항성 형질이 도입된 형질전환 브로콜리와 그에 의해 생산된 일대교잡종브로콜리의 순도검정에 이용 {Development of homogeneous transgenic broccoli lines with stable expression of herbicide resistance and the utilization of hybrid F1 tansgenic broccoli cultivars for their purity test}

제초제는 Glyphosate계 및 Sulphonylureas계, Imidazolinone계 Phosphinothricin계 그리고 Atrazin계 등 여러가지 종류로 나누지는데, 최근에 잡초 방제를 위하여 식물유전공학 기술을 이용한 제초제 저항성 작물이 많이 개발되고 있다. 예를 들어 aromatic amino acids 합성을 저해하는 glyphosate(Fillatti et al., 1987), sulphonylurea 및 imidazolinone(Newhouse et al., 1991), glutamine합성을 저해하는 phosphinothricin(Rathore et al., 1993), 광합성기작을 저해하는 atrazine(Christy et al., 1991)등과 같은 제초제에 대한 저항성 작물의 개발이 활발하게 보고되고 있다. 특히 phosphinothricin(PPT)는 bialaphos의 주 구성성분으로서 식물의 아미노산 대사과정중에 식물의 호흡기 및 뿌리에서의 질소고정중 질소환원동안 glutamin acid에서 glutamine으로 진행되는 과정을 저해한다. 그 결과 체내의 암모니아가 축적되어 식물체의 광합성이 저해되어 식물체를 고사시키는(Tachibana et al., 1986) 강력한 비선택성 제초제로서, 살포 후 2-5일정도 지나면 약효가 나타나고 땅에 떨어지면 곧 분해가 되는 환경오염 정도가 타 제초제에 비하여 대단히 적은 우수한 제초제이다. 이러한 PPT계 제초제를 분해하는 유전자가 Streptomyces hygroscopicus로부터 최근에 클로닝됨으로써(Thompson et al., 1987) 이 유전자를 이용한 형질전환 농작물의 개발에 대한 연구가 이루어졌으며, 많은 제초제 저항성 식물체들이 개발 되고있는데, 감자(Eliseu et al., 1994 : De Greef et al., 1989), 담배(Lee et al., 1994), 밀(Vasil et al., 1992), 쌀(Rathore et al., 1993), 옥수수(Spancer et al., 1990 : Fromn et al., 1990)등 많은 작물에서 제초제 저항성 유전자를 식물체 안으로 도입하였다고 보고하였다.

재배되는 채소나 작물은 전 생육기간동안 잡초와 경쟁하며 자라게 되고 잡초로 인하여 수확량의 감소뿐만 아니라 농작물 관리에도 어려움이 많기 때문에 현대 농업에 있어서 잡초방제를 위한 수많은 제초제가 개발되어 제초제의 사용은 날로 증대되는 추세에 있다. 이런 추세에 따라 내제초제 형질전환 브로콜리를 만들어 재배시 제초제 살포로 인한 약해를 방지하고, 더 나아가 제초제 사용으로 발생되는 환경오염을 억제하고자 한다. 또한 현재 각 민간종묘회사에서는 일대교잡종의 순도검정을 위하여 국내 포장에서의 시험 재배, 외국 열대지방에서의 포장 시험 재배 및 일부 작물의 경우 전기 영동방법 등을 이용하고 있으나, 이 방법 모두가 장시간이 소요되며, 순도 검사 결과가 일정 수준에 미달하면, 그 특정 농가에서 생산된 종자를 전량 폐기 처분해야 하는 방법이다. 이에 본 발명에서는 제초제 저항성을 브로콜리 일대잡종의 양친에 도입하여 일대 교잡종을 획득함으로써 브로콜리 작물의 종묘 순도검정기술을 적극적으로 향상시킬 수 있는 방법을 개발하고자 한다. 이는 노동력과 시간의 절감 효과를 얻고 궁극적으로 우리나라 종묘산업의 기술혁신과 국제경쟁력을 제고시키고자 함에 그 목적이 있다.

도 1은 브로콜리의 효율적인 재분화 조건을 확립하기 위하여 NAA 1mg/l, BAP 2mg/l조합에 Zeatin를 농도별로 처리하여 재분화율을 조사한 결과이다.

도 2는 브로콜리 순계 line별 생장조절제 NAA 1mg/l, BAP 2mg/l, Zeatin 3mg/l 혼용처리 한 후 재분화율을 조사한 결과이다.

도 3은 브로콜리(B. oleracea var. italica)의 A. tumifacines를 매개로 한 형질전환 방법의 모식도이다.

도 4는 본 발명에서 제시된 형질전환 방법으로 생산되는 제초제 저항성 유전자가 도입된 브로콜리의 획득 과정을 보여준다.

도 5a는 선발배지에서 선발한 제초제 저항성 유전자가 도입된 브로콜리를 Bar 프라이머(primer)를 이용하여 PCR반응을 한 후의 모습을 보여준다. (m :marker, p :positive control, n :negative control, 1-4 :transgenic broccoli )

도 5b는 선발배지에서 선발한 제초제 저항성 유전자가 도입된 브로콜리를 NPTⅡ프로브(probe)를 이용하여 southern hybridization 한 모습을 보여준다.

도 6은 선발배지에서 선발한 제초제 저항성 유전자가 도입된 브로콜리(T0 세대)와 control(normal) 식물체의 제초제 저항성 테스트를 한 모습을 보여준다. 살포 5일 후 획득된 브로콜리에서 저항성을 나타내는 것을 확인 할 수 있다.

도 7a은 획득한 T1 세대 브로콜리를 Bar / NPTⅡ primer를 이용하여 PCR반응을 한 후의 모습을 보여준다. ( m :marker, p :positive control, c :negative control, 1-9 : transgenic broccoli )

도 7b은 획득한 T1 세대 브로콜리를 Bar probe를 이용하여 southern hybridization한 모습을 보여준다.

도 7c은 획득한 T1 세대 브로콜리를 Bar probe를 이용하여 northern hybridization 한 모습을 보여준다

도 8a는 T3 세대 브로콜리 개체를 Bar primer를 이용하여 PCR반응을 수행한 모습(위)과 그것을 Bar probe로 southern hybridization 한 모습을 보여준다(아래).

도 8b는 T3 세대 브로콜리 개체를 NPTⅡ primer를 이용하여 PCR반응을 수행한 모습(위)과 그것을 NPTⅡprobe로 southern hybridization 한 모습을 보여준다(아래).

도 9a는 형질전환된 T1 세대 브로콜리를 포장에 전개하여 선발하는 모습을 보여준다.

도 9b는 포트에서의 시판 "바스타"를 일년생 잡초 방제용 사용농도의 2배인 6 mL/L의 농도로 형질전환 된 T2 브로콜리 전면에 고루 살포하여 선발하는 모습이다.

도 10은 형질전환된 T3 브로콜리의 제초제 저항성을 테스트 한 결과이다.

테스트 후, 제초제저항성 유전자가 도입되어 고정되는 것은 저항성을 나타내는 반면 그렇지 못한 것은 죽는 것을 볼 수 있다.

도 11은 형질전환된 T3 브로콜리와 이를 이용한 일대잡종의 제초제 저항성을 이용한 종묘 순도 검정에의 이용 (앞줄 ♀: 비형질전환 계통, 가운뎃줄 F1: 형질전환 계통과 비형질전환 계통간의 일대잡종개체, 뒷줄 ♂: 형질전환 후대 계통)

도 12는 형질전환된 T3 브로콜리와 이를 이용한 일대잡종 포장에서의 제초제 저항성을 이용한 종묘 순도 검정에의 이용 상: 제초제 살포 전, 하: 제초제 살포후(♂: 형질전환 후대 계통 ♀: 비형질전환 계통 F1: 형질전환계통과 비형질전환 계통 간의 일대잡종 개체)

도 13은 형질전환 T4 세대까지 진전된 제초제 저항성 유전자가 도입된 브로콜리의 PCR 검정한 결과이다. ( N: 형질전환 되지 않은 식물체 , T4세대 line별 각각 5개체씩 검정 )

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 기내에서 본엽과 엽병을 확보한 후 브로콜리의 재분화 조건을 체계화하고 , 그것을 이용하여 제초제 저항성 유전자를 도입한 브로콜리를 제조하는 방법 및 그 형질전환 된 브로콜리를 이용하여 종묘순도검정기술을 향상시키는데 이용 가능함을 밝히는 데 있다.

이하 본 발명에 대해 상세하게 설명한다.

본 발명에서는 실험 재료로 본엽과 엽병을 이용한 것은 하배축이나 자엽을 이용할 경우 발생되는 종자보급의 단점을 보완 할 수 있다는 점과 동시에 지속적인 실험 재료의 유지·공급이 가능하다는 장점을 고려하여 선택한다.

본엽과 엽병을 확보하기 위하여 기내에서 브로콜리 종자를 70% 에탄올(EtOH)에 5분동안 침지하여 1차 표면 소독 한 후, 멸균수로 3번 세척하고, 50% 락스에 20분간 소독한 다음, 다시 멸균수로 세척한다. 소독된 종자를 멸균 처리된 고체 발아배지(1/2 Murashige & Skoog medium, 1% sucrose, 0.7% Agar, pH 5.6-5.8)에 파종하고 암상태에서 1일동안 발아시킨 후, 16h light / 8h dark, 500μ㏖-2ㆍs-1, 22℃±1 조건의 배양실로 옮겨 발아시킨다. 발아 4-5일 후 자엽과 하배축을 절단해버리고, 기본배지(Murashige & Skoog salt, 2% sucrose, 0.7% Agar, pH 5.6-5.8)로 계대배양한다. 그리고 적당한 크기의 본엽과 엽병을 얻기 위하여 3-4주동안 16h light / 8h dark, 500μ㏖-2ㆍs-1, 22℃±1 조건의 배양실에서 배양한다.

본 발명에서 브로콜리의 재분화 식물체를 효과적으로 제조하기 위하여 기본고체배지(Murahige & Skoog medium, sucrose 2%, Agar 0.7%, pH 5.6-5.8)에 생장조절제 NAA와 BAP를 처리한 처리조합 중 높은 shoot 분화율을 보인 NAA 1.0mg/l, BAP 2.0mg/l에 Zeatin을 1.0mg/l∼3.0mg/l의 농도별로 처리하여 4주 후에 shoot 분화율을 조사한 후 적정한 재분화 호르몬 조합을 설정하였다. Zeatin 처리를 했을 때 shoot 분화율이 최고 36%를 보여 Zeatin 처리가 본엽에 있어서 shoot 분화를 높이는데 효과적임을 본 발명을 통해 확인 할 수 있었다(도1). B.oleracea var. italica KW line별(Broccoli)로 엽병과 본엽에 생장조절제 NAA 1mg/l, BAP 2mg/l, Zeatin 3mg/l를 혼합처리 했을 경우에 다소 line별로 차이는 있었으나 50%이상의 재분화율을 확인하였다(도2). 상기 실험의 결과로부터 브로콜리 재분화 식물체를 얻고자 할 때 생장조절제 NAA 1mg/l, BAP 2mg/l, Zeatin 3mg/l를 혼합처리하는 것이 바람직하며, 절편체 부위로 지속적으로 재료확보가 가능한 본엽과 엽병을 사용함이 적절하다는 것을 알 수 있다. 또한 본 발명은 제초제 저항성 유전자 (Bar gene)가 도입된 브로콜리를 제조하기 위하여 본엽과 엽병 절편체에 제초제 저항성 유전자가 도입된 아그로박테리움 투마파시엔스 (Agrobaterium tumefaciens)로 감염시켜 형질전환된 재분화 식물체를 효율적으로 제조한다.

본 발명에서의 형질전환 과정은 다음과 같다. 1㎠로 자른 본엽과 엽병 절편체를 2곳의 상처를 내어 재분화 배지에 10개체씩 치상한 후 아그로박테리움에 접종시 식물 절편체의 손상을 줄이고자 전처리(preculture)를 하여 2일 동안 배양하였다. O.D(optical density)값이 거의 A600 ＝ 1.0되도록 배양된 아그로박테리움 현탁배양액을 식물 절편체(explant)가 침지된 페트리디쉬(petri dish)안에 부어 5분-15분동안 공동배양(co-culture) 하였다. 절편체를 다시 꺼내어 멸균처리 된 filter paper위에 놓고 20분 정도 건조시켰다. 페놀성화합물 (phenolic compounds)의 분비로 vir gene이 발현되어 아그로박테리움의 T-DNA가 식물 세포내로 전이 유도되는 최적의 pH가 일반적으로 사용되는 적정 농도(5.6-5.8)보다 낮다(Stachel et al., 1986 : Vernade et al., 1988)는 연구결과에 따라 공동배양배지의 pH를 5.1-5.3으로 조절하였고, 배지표면에 멸균처리 된 filter paper를 놓고 현탁배양 T-cell 1ml을 fiter paper 표면 위에 골고루 뿌려 주어 절편체를 그 위에 치상하여 MicroporeTM tape(3M Corp)로 페트리디쉬를 밀봉하였다. 그런 다음 아그로박테리움의 활동이 왕성할 수 있도록 암상태로 옮겨 2일 동안 배양하였다. 절편체 표면에 접종된 아그로박테리움을 제거하기 위하여 cefotaxime 250mg/l을 첨가하고, 재분화 배지 표면위에 멸균처리 된 filter paper를 놓고 현탁배양 된 T-cell 1ml을 filter paper 표면위에 골고루 뿌려 주어 절편체를 그 위에 치상하였다. 그리고 MicroporeTM tape(3M Corp)로 페트리디쉬를 봉하여 3일-5일 동안 배양하였다. 형질전환체를 선발하기 위해 kanamaycin 40mg/l와, cefotaxime 250mg/l이 첨가된 재분화 배지(Murahige & Skoog medium, sucrose 2%, Agar 0.7%, pH 5.6-5.8, NAA1mg/l, BAP 2mg/l, Zeatin 3mg/l)에 절편체들을 옮겨주었다. 그리고 2주마다 동일한 배지로 계대배양을 하면서 형질전환체라고 판단되는 것들을 선발하여 계속 kanamaycin 40mg/l와, cefotaxime 250mg/l이 첨가된 재분화 배지에서 배양하였다. 선발된 형질전환체를 NAA 0.1mg/l, kanamaycin 40mg/l, cefotaxime 250mg/l이 첨가된 기본 MS배지로 옮겨주어 2-3주 배양하여 뿌리를 유도하였다. 지상부를 지탱해 줄 수 있을 정도로 발달된 뿌리를 가진 형질전환체만 선택하여 배양병에서 꺼내고 뿌리에 묻은 배지를 흐르는 물로 잘 씻은 다음 멸균된 원예 상토를 넣은 8.5㎝ pot에 이식하고, 습윤 상태를 유지하기 위해 폴리프로필렌 봉지(Polypropylen bag)를 사용하여 포트를 덮었다. 그리고 배양기(20℃, 16h 광상태/ 8h 암상태)에 넣어 1-2주 배양한 후 식물체의 양호한 상태에 따라 비닐 하우스 안으로 이식을 하였다(도3). 상기의 실험 결과 제초제 저항성 유전자가 도입된 브로콜리를 획득할 수 있었다(도4).

획득된 형질전환체를 확인하기 위하여 CTAB 방법을 이용하여 genomic DNA를 추출하였으며, 추출한 DNA는 0.7% 아가로오스 겔(agarose gel)에 전기 영동하여 DNA양을 확인한다. 10ng/2㎕의 DNA, 40 pM/2㎕ primers, Dynazme l unit, 10X buffer 2㎕, 증류수 11㎕을 총 20㎕로 섞은 다음, 25㎕ 미네랄 오일을 첨가하였다. 특정한 프라이머(specific primer)를 이용하여 94℃에서 1분간, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분 30초의 조건으로 35 사이클(cycle)을 실시한 후 마지막으로 72℃에서 10분간 post-elongation을 시킨다. 그리고 증폭된 DNA는 0.8% 아가로오스 겔로 전기 영동하여 밴드(band)를 확인한다. 특정한 프라이머로는 kanamycin 항생제 저항성 유전자(NPTⅡ)와 제초제 저항성 유전자 (Bar)를 사용하였으며, 그 sequence는 다음과 같다.

primer	nucleotide sequence ( 5'- 3')	specific band length(bp)
NPTⅡ	A: GAGGCTATTCGGCTATGACTG	about 700
	B: ATGGGGAGCGGCGATACCGTA
Bar	A: AACTTCCGTACCGAGCCGCA	about 370
	B: TGAATGCCAGTTCCCGTGCT

PCR 분석결과 NPT Ⅱ primer는 700bp에서 , Bar primer는 370bp에서 band를 확인함으로써 형질전환체 식물체내로 원하는 유전자가 성공적으로 도입되었음을 확인할 수 있었다(도 5a).또한 southern hybridization 실험을 한 결과, 형질전환 식물체의 genomic DNA를 EcoRⅠ(40unit)의 제한효소로 절단하고 NPT Ⅱ gene을 probe로 사용하여 제초제 저항성 gene(bar-gene)이 식물체 genome안에 안정적으로 삽입되었는지의 여부를 southern방법으로 southern blot hybridization 분석을 수행한 결과, EcoRⅠ으로 절단된 많은 mulitgene이 존재함을 band를 통해 확인할 수 있었다. 형질전환 식물체의 경우 각각 gene이 0.75kbp, 1.4kbp 그리고 2.0kbp이상 등의 많은 영역에서 존재하였다(도5b). Southern blot hybridization 분석 결과. 제초제 저항성 gene(bar-gene)이 식물체 genome안에 안정적으로 도입 되었는지를 확인한 후, 이 형질전환체들을 1-2주 Incubator에서 순화시켰다. 그리고 화분에 옮겨 심고 비닐 하우스내에서 약 2주간 생육시켜 건강한 식물체로 키운 다음, 일반 농가에서 사용되는 제초제(bastar)를 0, 500, 1000, 2000, 3000, 5000ppm의 농도로 대조구와 형질전환체의 잎에 붓으로 발라주었다.처리 후 5일이 되자 대조구인 일반 broccoli는 500ppm에서부터 점차 잎이 노랗게 변하며 반점이 군데군데 생기는 등의 약해를 나타내었다. 처리 후 5일이 지나면서 3000ppm에 이르자 잎이 떨어져 고사하였다. 그러나 형질전환체의 경우, 5000ppm처리에도 아무런 약해가 나타나지 않았다. 따라서 이 결과 제초제 저항성 유전자(bar-gene)이 식물체안에 안정적으로 도입되어 저항성이 발현되었음이 확인되었다(도6).

그 후, 본 발명에서 획득한 제초제 저항성 브로콜리를 다음과 같은 과정으로 4세대까지 진전시킴으로 저항성 형질이 고정되게 하였으며 후대검정에서도 상기의 나타난 분자생물학적인 방법(PCR, Southern, Northern)으로 제초제 저항성 유전자의 도입여부를 확인할 수 있었다(도 7a,7b,7c,8a,8b,14).

또한 본 발명에서 제조되어 세대를 거듭해 오면서 고정되어 온 브로콜리가 실제적인 순도검정에 효율적으로 이용될 수 있는지를 검토하였다. 형질전환 식물체를 포트에 순화 후 10℃에서 10일간의 저온처리로 조기 개화를 유도하여 인공교배에 의해 자식 종자와 비형질전환 식물체의 화분을 이용한 조합종자를 획득하였다. 획득한 후대 종자(T1 세대)를 파종하여 포장에 정식하고 1998년 10월 9일에 화구가 출현한 상태에서 시판 "바스타"를 일년생 잡초 방제용 사용농도의 2배인 6 mL/L의 농도로 잎 전면에 고루 살포하고 5일 후에 저항성 발현 식물체를 선발하였다(도 9a). 바스타 저항성의 발현은 KW13 계통에서 유래한 것으로 자식 후대의 경우 포장에 전개한 16 개체 중 14개체가 저항성으로 나타나 이것을 선발하였으며, 비형질전환 식물체의 화분을 이용한 조합종자에서는 20 개체 중 10 개체가 저항성을 나타내어 선발하였다. 선발한 식물체는 가온 이중플라스틱하우스에 정식하여 개화를 유도하고 인공교배를 통하여 후대 종자를 획득하였다. 브로콜리 T2 10 line에서 제초제 저항성 인자의 동형접합 계통은 선발하지 못하였으며 T2 세대 전체의 저항성과 감수성이 100:45로 나타났으며, F1 21 line에서는 저항성과 감수성이 110:38로 나타났다(도 9b). 형질전환 브로콜리 T2 세대에서 선발된 개체를 인공교배하여 T3 세대를 유기하고 이를 각 50립씩 파종하여 171계통 중에서 제초제 저항성 인자가 고정된 동형접합 67계통을 선발하였다(도 10). 선발한 67계통에서 일대잡종의 실용화에 대한 검정을 수행하기 위하여 비형질전환 계통을 자방친으로 하고 제초제 저항성 인자가 고정된 선발계통의 화분을 인공 수분하여 비형질전환 계통과 형질전환 계통간의 일대잡종 종자를 생산하였다. 여기에서 생산된 비형질전환 계통과 형질전환 계통간의 일대잡종 종자를 파종하여 일부는 포트 육묘 상태에서 제초제 저항성의 발현을 검정하였으며, 일부는 토양에 정식하여 제초제 저항성의 발현을 검정하였다. 포트 상에서나 토양재배 상에서 동일하게 비형질전환 계통과 형질전환 계통간의 일대잡종 식물체가 제초제에 안정적으로 저항성을 나타내었다. 이로써 제초제 저항성 유전자를 형질전환을 통하여 브로콜리 작물 내에 도입하고 제초제 저항성 유전자가 도입된 계통을 부계친으로 사용하여 일대잡종 종자를 생산하는 경우 일대잡종 세대에서 제초제 저항성이 발현되고 이를 이용하여 일대잡종 종자의 효율적 순도 검정이 가능함이 입증되었다(도 11,12).

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 아그로박테리움 투마파시엔을 매개로 본엽과 엽병을 이용하여 형질전환한 브로콜리를 제조하였고, 그 제조된 브로콜리는 4세대까지 진전되어 제초제 저항성 유전자가 안정하게 유지되고 있음을 분자생물학적인 방법과 제초제 선발법을 통해 확인하였다. 이에 의해 제조된 제초제 저항성 브로콜리를 부본용으로 이용하면 일대교잡종 종자중에 진정한 종자는 제초제에 내성을 가지게 되나, 모계의 자가수정에 의한 종자 또는 타 화분에 의한 종자 등 진정한 일대교잡종이 아닌 종자 제초제 살포를 통하여 제거할 수 있다. 본 발명은 생명공학적인 방법으로 개발된 브로콜리를 육종에 이용하여 실제적인 순도검정에 있어서 작물의 순도를 효율적으로 검정하는데 이용될 수 있다. 이상에서 본 발명에 의한 제초제 저항성 브로콜리와 그 제조방법을 도면과 발명의 구성의 내용에 의하여 설명하였으나, 이는 본 발명의 가장 바람직한 예를 기재한 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되지 아니함은 당연하다. 또한, 이 분야에 통상의 지식을 가진 자이면 누구나 본 명세서의 기재내용에 의하여 다양한 변형 및 모방을 행할 수 있을 것이나 , 본 발명의 범위를 벗어난 것이 아님은 명백하다고 할 것이다.

Claims

브코콜리의 본엽과 엽병을 아그로박테리움과 공존 배양하여 캘러스와 슈트를 유도하고, 이로부터 식물체를 재분화 시킨 다음 순화시켜 포장으로 이식하는 제초제 저항성 브로콜리의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 재분화 시키기 전에 브로콜리의 조직은 전배양을 하며, 아그로박테리움과 공존배양을 한 후, 선발배지로는 kanamaycin 40mg/l와, cefotaxime 250mg/l이 첨가된 재분화 배지(Murahige & Skoog medium, sucrose 2%, Agar 0.7%, pH 5.6-5.8, NAA 1mg/l, BAP 2mg/l, Zeatin 3mg/l)를 바탕으로 하는 제초제 저항성브로콜리의 제조 방법.
제초제 저항성 유전자가 도입된 브로콜리는 4세대 진전시킨 계통인 것을 특징으로 하는 제초제 저항성 브로콜리.
제 3항에 있어서, 제초제 저항성 브로콜리는 T4 1-4, T4 2-1, T4 3-1와 T4 4-1인 것을 특징으로 하는 제초제 저항성 브로콜리.
제 3항에 있어서. 제초제 저항성 유전자가 도입된 계통을 부계친으로 사용하여 일대잡종 종자를 생산하는 경우 일대잡종 세대에서 제초제 저항성이 발현되고 이를 이용하여 일대잡종 종자의 순도 검정이 가능함을 특징으로 하는 제초제 저항성 브로콜리.