CN1642977A - 新的苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白质 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物害虫控制领域，特别是昆虫控制。提供了来源于苏云金芽孢杆菌的、编码杀昆虫蛋白质的核苷酸序列。进一步提供了利用所述核苷酸序列控制植物昆虫害虫的方法和手段。
Description
技术领域
本发明涉及植物害虫控制，特别是昆虫控制领域。提供了来源于苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(Bt)菌株的新的核酸序列，其编码营养生长阶段表达的杀昆虫蛋白质。具体地，提供了编码命名为ISP3-1099E，ISP3-327D和ISP3-2245J的蛋白质的DNA序列，其可用于保护植物免受昆虫损害。进一步提供了包含至少一个新的核酸分子的植物和微生物，及利用这些核酸序列降低植物受到的昆虫损害的方法和手段。
背景技术
昆虫害虫使全世界农作物生产遭受着巨大经济损失，并且农民每年都面临由于虫害造成的产量损失威胁。农作物中的昆虫抗性基因工程已经成为降低农作物管理和化学控制实践的相关花费的具有吸引力的方法。基于在植物中表达从革兰氏阳性土壤细菌苏云金芽孢杆菌(Bt)分离的蛋白质，自1996年以来，第一代昆虫抗性农作物已经投放市场。该杀昆虫Bt Cry蛋白质在Bt菌株的孢子形成阶段产生，并且该蛋白质在细菌中以大的胞质晶体积累。当被昆虫摄取时，典型的鳞翅目(Lepidopteran)毒性Bt Cry蛋白质在昆虫中肠中溶解和加工成为约60到65kDa的活性形式。此活性蛋白质通过结合中肠上皮细胞发挥它的毒性作用，在细胞膜中引起穿孔，这引起细胞渗透裂解。
Bt菌株可以产生许多不同的毒素。自从1981年第一个编码杀昆虫晶体蛋白质的Bt基因分离以来(Schnepf和Whiteley 1981)，已经克隆了100多种Bt Cry毒素编码基因，并且通过在农业重要作物物种中表达Bt来源的蛋白质已经有效地控制了昆虫害虫。然而，因为大多数Bt蛋白质主要仅仅对相对小数量的现存昆虫害虫有活性，所以单独Bt蛋白质的应用常常是有限的。据认为，多种因素诸如昆虫肠道中毒素的激活(Haider等，1996)和其结合特异性受体的能力(Hofmann等，1988)决定Bt Cry蛋白质的特异性。
现普遍认识到存在敏感昆虫物种可能发展出对Bt Cry毒性的抗性的风险。因此，已经进行了积极的努力以鉴定新的杀昆虫蛋白质。曾经采用的一个策略是在营养生长阶段，而不是在孢子形成阶段筛选产生杀昆虫蛋白质的芽孢杆菌属(Bacillus)菌株。利用这个方法，已经鉴定了大量“营养期杀昆虫蛋白质”或“VIP”。
Estruch等(1996)、WO94/21795、WO96/10083、WO98/44137、US5,877,012、US 6,107,279、US 6,137,033和US 6,291,156描述了从Bt菌株AB88、AB424和AB51上清液中分离vip3A(a)，vip3A(b)和vip3A(c)。根据作者所述，这些基因编码具有针对广谱鳞翅目(Lepidopteran)昆虫害虫的杀昆虫活性的蛋白质。
WO98/18932和WO99/57282描述了从Bt菌株分离的大量核苷酸序列。这些序列称为mis(mis-1到mis-8)，war和sup。根据作者所述，编码的蛋白质具有抗鳞翅目(Lepidopteran)或鞘翅目(Coleopteran)害虫的活性。
WO00/09697描述了可从侧孢芽孢杆菌(Bacillus Laterosporus)菌株获得的热不稳定性可溶MIS型和WAR型毒素，以及较小的(1到10kDa)毒素，根据作者所述，这些毒素具有抗玉米根叶甲幼虫的活性。
WO98/00546和US6,274,721描述了Bt菌株和Bt毒素的分离，根据作者所述，其具有抗鳞翅目(Lepidopteran)害虫的活性。
WO99/33991描述了Bt菌株和Bt毒素的分离，根据作者所述，其具有抗鳞翅目(Lepidopteran)害虫的活性。
最近，Selvapandiyan等(2001)描述了编码命名为VIP-S的蛋白质的基因的分离。根据作者所述，VIP-S蛋白质显示了抗多种鳞翅目(Lepidopteran)昆虫物种的毒性。
Doss等(2002)描述了来源于菌株Bt kurstaki的VIP3V的克隆。
WO02/078437描述了来源于Bt的VIP3毒素，诸如VIP3A，VIP3B和VIP3A-B杂交毒素。
尽管到目前为止，已经分离和表征了相对大量的不同杀昆虫蛋白质，但是还需要鉴定、分离和表征新的杀昆虫蛋白质。该原因是多方面的。首先，由于杀昆虫蛋白质对特定靶害虫群体(宿主昆虫谱)的特异性，因此需要克隆编码具有不同活性谱的蛋白质的基因，以便对于不同的农作物和不同的地理区域，可得到与昆虫害虫作斗争的合适蛋白质。例如，Bt Cry蛋白质的特异性大多是受限制的。仍期望鉴定具有针对不同靶昆虫的特异性的毒素。其次，在一个地理区域长期使用后，已知昆虫有能力发展出对化学杀虫剂、微生物喷雾剂(例如，基于Bt孢子-晶体混合物)的抗性，并且认为昆虫有能力发展出对表达杀昆虫蛋白质的植物的抗性。昆虫种群中抗性的发展可能潜在地使现有的杀昆虫蛋白质失效，这就提供了对于新的基因和蛋白质的需要。第三，因为健康和环境原因，可能期望鉴定具有高度且特异的杀昆虫效力和对靶昆虫物种的急性生物活性的蛋白质。
此后，包括权利要求书中描述的不同实施方式，描述了从苏云金芽孢杆菌菌株分离的新的核酸序列和氨基酸序列，通过在合适启动子控制下于植物中表达此核酸序列，或者通过给植物外部施用毒素，其可用于保护植物免受昆虫损害。本发明毒素不同于先前描述的杀虫毒素。
发明概述
本发明提供了杀昆虫ISP3蛋白质和编码它们的核酸。提供了杀昆虫蛋白质ISP3-1099E(SEQ ID No.2)，ISP3-327D(SEQ ID No.4)和ISP3-2245J(SEQ ID No.6)和分别编码它们的核酸isp3-1099E(SEQ ID No.1)，isp3-327D(SEQ ID No.3)和isp3-2245J(SEQ ID No.5)。本发明蛋白质具有抗鳞翅目昆虫害虫的杀昆虫活性，特别是抗选自：美洲棉铃虫(Helicoverpazea)，棉铃虫(Helicoverpa Armigera)，Helicoverpa punctigera，烟芽夜蛾(Heliothis vireseens)，欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)，草地粘虫(Spodoptera frugiperda)，小地老虎(Agrotis ipsilon)，棉花红铃虫(Pectinophora gossypiella)，三化螟(Scirpophaga incertulas)，稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)，大螟(Sesamia inferens)，Chilo partellus，藜豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)，苜蓿绿夜蛾(Plathypena scabra)，大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)，甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)，Spodoptera ornithogalli，Epinotia aporema和Rachiplusia nu.的昆虫。
在本发明另一个实施方式中，提供了ISP3蛋白质和编码它们的核酸的杀昆虫变异体和片段。提供的变异体是例如在严格条件下与SEQ ID No.1，SEQ ID No.3或SEQ ID No.5杂交的核酸序列。
在本发明一个实施方式中，提供了包含与SEQ ID No.2至少91％序列同一性，与SEQ ID No.4至少91％序列同一性或与SEQ ID No.6至少88％序列同一性的杀昆虫蛋白质。
在本发明另一实施方式中，提供了包含与SEQ ID No.1至少93％序列同一性，与SEQ ID No.3至少94％序列同一性或与SEQ ID No.5至少97％序列同一性的分离的核酸序列。
在再一实施方式中，提供了编码本发明ISP3蛋白质的核酸序列，其中该核酸序列是已经优化用于单子叶或双子叶植物或植物细胞中表达的合成序列。
本发明另一个目的是提供嵌合基因，其包含可操作地连接核酸序列的启动子序列，该核酸序列编码ISP3蛋白质，特别是ISP3-1099E，ISP3-327D或ISP3-2245J，或其杀昆虫活性变异体或其片段。也提供了包含核苷酸序列的载体，该核苷酸序列编码ISP3蛋白质，特别是ISP3-1099E，ISP3-327D或ISP3-2245J，或其杀昆虫活性变异体或其片段。
本发明还提供了包含嵌合基因的宿主细胞，特别是包含如下核苷酸序列的微生物或转基因植物细胞、植物组织、植物器官、植物种子或整株植物，该核苷酸序列编码ISP3蛋白质，特别是ISP3-1099E，ISP3-327D或ISP3-2245J，或其杀昆虫活性片段或其变异体。在一个实施方式中，转化的植物是玉米或棉花植物。在另一个实施方式中，转化的植物是水稻或大豆植物。在另一实施方式中，转化植物是任何植物，特别是选自以下的任何植物：高梁、小麦、大麦、黑麦、向日葵、甘蔗、烟草、芸苔属种(BrassicaSpecies)(诸如油籽油菜、芥菜、甘蓝、青花椰菜等)、蔬菜物种(番茄、花椰菜、萝卜、菠菜、胡椒、洋葱、菜豆、豌豆、胡萝卜等)、甜菜、树木物种(苹果、梨、李子、针叶树、落叶树等)、马铃薯、紫花苜蓿、芒果、蕃木瓜、香蕉。
在另一实施方式中，提供了保护植物免受昆虫损害的方法，包括用杀昆虫ISP3蛋白质接触所述植物。通过用编码ISP3蛋白质的核苷酸序列转化植物或通过给植物外部施用ISP3蛋白质，植物可以与ISP3蛋白质接触。
在本发明一个实施方式中，提供了包含isp3核酸，特别是isp3-1099E，isp3-327D或isp3-2245J的Bt菌株。
在另一实施方式中，提供了包含杀昆虫有效量ISP3蛋白质的杀昆虫组合物。当将组合物外部施用于植物时，与没有施用这种组合物的对照植物比较，杀昆虫组合物增加植物对昆虫损害的抗性。
在另一实施方式中，提供了进化编码ISP3蛋白质的核酸序列的方法，该方法包括步骤：
(a)提供编码SEQ ID No.2和/或4和/或6氨基酸序列，或SEQ IDNo.2和/或4和/或6氨基酸序列的变异体或片段的核酸序列群，其中所述变异体或片段与SEQ ID No.2或4具有至少91％序列同一性，与SEQ IDNo.6具有至少88％序列同一性，
(b)改组所述变异体或片段的群体以形成重组核酸分子；
(c)选择或筛选编码具有杀昆虫活性的蛋白质的重组核酸分子；
(d)用在步骤(c)中选定的重组核酸分子重复步骤(a)到(c)，直到在步骤(c)中已经发现所编码的蛋白质具有期望的杀昆虫特性的重组核酸分子。
实施方式的详细描述
本发明领域是提供降低害虫，特别是昆虫害虫，更特别是鳞翅目(Lepidopteran)昆虫害虫引起的植物损害的方法和手段。已经鉴定和分离了新的核酸序列和蛋白质，其不同于先前描述的核酸序列和蛋白质，并且通过在植物或植物细胞中整合和表达这些新的核苷酸序列中的至少一种核苷酸序列，或者通过用包含这些核酸分子编码的毒素的组合物外部处理植物或植物部分，所述核酸序列和蛋白质可以用于控制昆虫害虫。
本发明的一个实施方式提供从苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)菌株分离的新的杀虫毒素。具体地，提供了命名为ISP3-1099E蛋白质，ISP3-327D蛋白质和ISP3-2245J蛋白质的杀虫蛋白质。
根据本发明，“核酸序列”指编码本发明任一种ISP3蛋白质的单或双链形式的DNA或RNA分子，优选地，DNA或RNA，特别地是DNA。这里所用“分离的核酸序列”指不再存在于其分离自的天然环境中的核酸序列，例如在其它细菌宿主中或在植物核基因组中的核酸序列。
根据本发明，术语“蛋白质”或“多肽”可交换地用于指由氨基酸链组成的分子，而不涉及任何具体的作用模式、大小、三维结构或来源。因此，这里仍旧称本发明ISP3蛋白质的片段或部分为“蛋白质”。这里所用的“分离的蛋白质”指不再在其天然环境中的蛋白质。蛋白质的天然环境指当编码它的核苷酸序列在其天然环境中，即，核苷酸序列分离自的环境中表达和翻译时，可以发现该蛋白质的环境。例如，分离的蛋白质可以在体外、另一细菌宿主中或植物细胞中存在，或者可以从另一细菌宿主或从植物细胞分泌。
根据本发明，已经分离和鉴定了编码新的ISP3蛋白质的核酸序列，特别是DNA序列。分别命名这些新的基因为isp3-1099E，isp3-327D和isp3-2245J和命名它们编码的蛋白质为ISP3-1099E，ISP3-327D和ISP3-2245J。
根据本发明，“ISP3-1099E蛋白质”指包含SEQ ID No.2氨基酸序列中保留杀昆虫活性的最小片段(此后称为“最小毒性片段”)的任何蛋白质。这包括包含最小毒性片段的杂合-或嵌合蛋白质。该定义也包括SEQ IDNo.2中氨基酸序列的变异体，诸如与SEQ ID No.2基本相似、在氨基酸序列水平具有至少91％，特别地至少92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的氨基酸序列，其中利用Wisconsin GCG包的GAP程序(Madison，Wisconsin，USA，版本10.2)，使用成对联配(alignment)测定该序列同一性。GAP程序使用下面参数用于氨基酸序列比较：“Blosum62”记分矩阵，8的“空位产生罚分”(或“空位权重”)和2的“空位延伸罚分”(或“长度权重”)。优选地，该定义包括这样的蛋白质，即该蛋白质具有一些，优选地5-10个，尤其是少于5个的氨基酸添加、置换或缺失，而不明显改变，优选地不改变蛋白质的杀昆虫活性，或者至少不以不利方式改变蛋白质的杀昆虫活性。
本发明“ISP3-327D蛋白质”指包含SEQ ID No.4氨基酸序列中保留杀昆虫活性的最小片段(此后称为“最小毒性片段”)的任何蛋白质。这包括包含最小毒性片段的杂合-或嵌合蛋白质。该定义也包括SEQ ID No.4中氨基酸序列的变异体，诸如在氨基酸序列水平具有至少91％，特别地至少92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的基本相似氨基酸序列，其中利用Wisconsin GCG包的GAP程序(Madison，Wisconsin，USA，版本10.2)，使用成对联配测定该序列同一性。GAP程序使用下面参数用于氨基酸序列比较：“Blosum62”记分矩阵，8的“空位产生罚分”(或“空位权重”)和2的“空位延伸罚分”(或“长度权重”)。优选地，该定义包括这样的蛋白质，即该蛋白质具有一些，优选地5-10个，特别地少于5个的氨基酸添加、置换或缺失，而不明显改变，优选地不改变蛋白质的杀昆虫活性，或者至少不以不利方式改变蛋白质的杀昆虫活性。
本发明“ISP3-2245J蛋白质”指包含SEQ ID No.6氨基酸序列中保留杀昆虫活性(此后称为“最小毒性片段”)的最小片段的任何蛋白质。这包括包含最小毒性片段的杂合-或嵌合蛋白质。该定义也包括SEQ ID No.6中氨基酸序列的变异体，诸如与SEQ ID No.2基本相似、在氨基酸序列水平具有至少88％，特别地至少89％，90％，91％，92％，93％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的氨基酸序列，其中利用WisconsinGCG包的GAP程序(Madison，Wisconsin，USA，版本10.2)，使用成对联配测定该序列同一性。GAP程序使用下面参数用于氨基酸序列比较：“Blosum62”记分矩阵，8的“空位产生罚分”(或“空位权重”)和2的“空位延伸罚分”(或“长度权重”)。优选地，该定义包括这样的蛋白质，即该蛋白质具有一些，优选地5-10个，特别地少于5个的氨基酸添加、置换或缺失，而不明显改变，优选地不改变蛋白质的杀昆虫活性，或者至少不以不利方式改变蛋白质的杀昆虫活性。
这里所用“包含/包括”解释为尽管规定了所述特征，整数，步骤或成分的存在，但是不排除存在或添加一个或多个特征，整数，步骤或成分或它们组合。因此，这里所用术语“包含序列或区域X的DNA/蛋白质”指包括或含有至少序列或区域“X”的DNA或蛋白质，因此在5’(或N-末端)和/或3’(或C-末端)末端可以包括其它核苷酸或氨基酸序列，例如，EP 0 193 259中公开的选择性标记蛋白质(的核苷酸序列)，转运肽(的核苷酸序列)，和/或5’或3’前导序列。
这里所用的本发明ISP3蛋白质的“最小毒性片段”是可以通过酶促消化全长ISP3蛋白质获得的保留杀昆虫活性的ISP3蛋白质的最小片段或部分，或者是可以通过在编码ISP3蛋白质的DNA中制造核苷酸缺失获得的保留杀昆虫活性的ISP3蛋白质的最小片段或部分。可以理解，也可以化学合成编码较短毒性ISP3片段的DNA，并且最小毒性片段的定义中包括可从合成的DNA转录和翻译获得的最小毒性片段。
在本发明一个实施方式中，ISP3蛋白质的最小毒性片段有通过SDS-PAGE分析(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)测定的约65kDa的分子量。在另一个实施方式中，ISP3蛋白质的最小毒性片段有约23kDa的分子量。在另一个实施方式中，ISP3蛋白质的最小毒性片段有约33kDa的分子量。在另一实施方式中，最小毒性片段包含ISP3蛋白质的中间氨基酸，特别是SEQ ID No.2、SEQ ID No.4或SEQ ID No.6的氨基酸第200位到氨基酸第455位的氨基酸。
如Yu等(1997)所述，通过利用纯化酶或利用昆虫幼虫的消化液(gut-juice)，并且温育消化液提取物和包含ISP蛋白质之一的溶液可以进行ISP3蛋白质的酶促消化。可以在SDS-PAGE上分离和观察蛋白水解产物。为了测定每个蛋白水解片段和其杀昆虫活性之间的关系，可以用处理过的、层析分级的蛋白质片段进行生物测定。用于测定ISP3蛋白质的最小毒性片段的优选消化液是来源于鳞翅目昆虫，优选地来源于：美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)，棉铃虫(Helicoverpa armigera)，NativeBudworm(Helicoverpa punctigera)，烟芽夜蛾(Heliothis virescens)，欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)，草地粘虫(Spodoptera frugiperda)，小地老虎(Agrotis ipsilon)，棉花红铃虫(Pectinophora gossypiella)，三化螟(Scirpophaga incertulas)，稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)，大螟(Sesamia inferens)，玉米斑点螟(Chilo partellus)，藜豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)，大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)，Pod Borer(Epinotia aporema)和Rachiplusia nu.的消化液。
利用本领域常规可用技术，通过上述片段的氨基酸序列测定，可以方便地测定最小毒性片段的N-和C-末端氨基酸序列端。
这里所用术语“isp3-1099E”，“isp3-327D”和“″isp3-2245J”指分别编码如上所述“ISP3-1099E蛋白质”或“ISP3-327D蛋白质”或“ISP3-2245J蛋白质”的任何DNA序列。其包括编码SEQ ID No.2或SEQID No.4或SEQ ID No.6蛋白质，或者如上所述它们的杀昆虫片段或变异体的天然、人工或合成的DNA序列。这里也包括编码杀昆虫蛋白质的如下DNA序列，其与序列表中提供的DNA序列有足够的相似性使得它们能(即，有能力)与这些DNA序列在严格杂交条件下杂交。
这里所用的“严格杂交条件”特别指下面的条件：在滤膜上固定相关DNA，并且在42℃，在50％甲酰胺、5×SSPE、2×Denhardt试剂和0.1％SDS中预杂交滤膜1到2小时，或者在68℃，在6×SSC、2×Denhardt试剂和0.1％SDS中预杂交滤膜1到2小时。然后将变性(地高辛配基-或放射)标记探针直接加入到预杂交液体中，在上述适当温度温育16到24小时。温育后，在室温，在2×SSC，0.1％SDS中洗滤膜30分钟，接着在68℃，0.5×SSC和0.1％SDS中进行各30分钟的2次洗涤。通过在-70℃，用增感屏使滤膜曝光X射线胶片(Kodak XAR-2或等同物)24到48小时确立放射自显影图。[20×SSC＝3M NaCl和0.3M柠檬酸钠；100×Denhart试剂＝2％(w/v)牛血清白蛋白，2％(w/v)FicoilTM和2％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮；SDS＝十二烷基硫酸钠；20×SSPE＝3.6M NaCl，0.2M磷酸钠和0.02MEDTA pH7.7]。当然，在该方法中可以使用等同的条件和参数，但是仍旧保留期望的严格杂交条件。
显然，本领域已知许多可用于分离本发明DNA序列的变异体的方法。例如，可以通过上文所述杂交，和/或通过本领域所知的PCR技术，从Bt菌株分离变异体。可以制备isp3 DNA序列区域的特异或简并引物，并且用于从已知或新的Bt菌株扩增变异体。
本发明isp3-1099E DNA的优选变异体是编码上述杀昆虫ISP3-1099E蛋白质变异体的DNA序列，或者与SEQ ID No.1具有至少93％，特别地至少94％，更优选地至少95％，96％或97％，最优选地至少98％或至少99％序列同一性的编码杀昆虫蛋白质的DNA序列。本发明isp3-327D DNA的优选变异体是编码上述ISP3-327D蛋白质变异体的DNA序列，或者与SEQ ID No.3具有至少94％，优选地至少95％，特别地至少96％，97％，98％或至少99％序列同一性的编码杀昆虫蛋白质的DNA序列。本发明isp3-2245J DNA的优选变异体是编码上述ISP3-2245J蛋白质变异体的DNA序列，或者与SEQ ID No.5具有至少97％，优选地至少98％，或至少99％序列同一性的编码杀昆虫蛋白质的DNA序列。利用Wisconsin GCG包(Madison，Wisconsin，USA)版本10.2的GAP程序计算上述序列同一性。GAP程序与下列用于核酸的参数一起使用：“nwsgapdna”记分矩阵，50的“空位产生罚分”(或“空位权重”)和3的“空位延伸罚分”(或“长度权重”)。严格杂交条件如上所定义。
这里所用的蛋白质的“杀昆虫活性”意指当喂食昆虫这种蛋白质时——优选地通过在重组宿主诸如植物中表达此蛋白质来实现，蛋白质杀死昆虫的能力。应理解，如果蛋白质在昆虫发育阶段的至少一个阶段，优选地幼虫阶段具有杀死昆虫的能力，那么该蛋白质具有杀昆虫活性。
这里所用的蛋白质的“昆虫控制量”指足以将以植物为食的昆虫(例如，昆虫幼虫)造成的植物损害限制到商业可接受水平的蛋白质量，此蛋白质量可以例如通过杀死昆虫或通过抑制昆虫发育、能育性或生长，使昆虫对植物的损害变小并且使植物产量不明显地受到不利影响。
根据本发明，使对本发明新的ISP3蛋白质敏感的昆虫与昆虫控制量，优选地杀昆虫量的该蛋白质接触。本发明蛋白质的优选靶昆虫是玉米、棉花、水稻或大豆植物的经济昆虫害虫，特别是北美和南美国家、亚洲和澳洲的这些害虫。这里所用术语“植物”包括整株植物及植物部分，诸如叶、茎、种子、花或根。本发明ISP3蛋白质的特别优选的靶昆虫是鳞翅目昆虫害虫，诸如实夜蛾属(Heliothis spp.)，棉铃虫属(Helicoverpa spp.)，灰翅夜蛾属(Spodoptera spp.)，秆野螟属(Ostrinia spp.)，红铃虫属(Pectinophora spp)，地虎属(Agrotis spp)，白禾螟属(Scirpophaga spp.)，纵卷叶野螟属(Cnaphalocrocis spp.)，蛀茎夜蛾属(Sesamia spp.)，禾草螟属(Chilo spp.)，Anticarsia spp.，Pseudoplusia spp.，叶小卷蛾属(Epinotia spp)和Rachiplusia spp，优选地烟芽夜蛾(Heliothis virescens)，美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)，棉铃虫(Helicoverpa Armigera)，Helicoverpa punctera，欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)，草地粘虫(Spodoptera frugiperda)，小地老虎(Agrotis ipsilon)，棉花红铃虫(Pectinophora gossypiella)，三化螟(Scirpophaga incertulas)，稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)，大螟(Sesamia inferens)，Chilo partellus，藜豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)，大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)，Epinotia aporema和Rachiplusia nu.。优选地，本发明ISP3蛋白质具有抗至少一种鳞翅目昆虫物种，更优选地抗几种鳞翅目昆虫物种的杀昆虫活性。
这里所用术语“ISP3蛋白质”，“本发明ISP3蛋白质”，“ISP蛋白质”，或“本发明ISP蛋白质”指本发明分离、鉴定和在本文中定义为ISP3-1099E，ISP3-327D，ISP3-2245J蛋白质的新蛋白质中的任何一种蛋白质。
这里所用ISP3蛋白质可以是全长大小的蛋白质，或者保留杀昆虫活性的截短形式的蛋白质，或者其可以是杂合或融合蛋白质中不同蛋白质或蛋白质结构域的联合。“ISP3毒素”指ISP3蛋白质的杀昆虫片段或部分，特别是其最小毒性片段。这里所用“isp基因”，“isp3基因”，“isp DNA”或“isp3 DNA”是编码本发明ISP3蛋白质的DNA序列，特别是指上述isp3-1099E，isp3-327D和isp3-2245J DNA序列中的任何一种DNA序列。
可以合成制备编码本发明ISP3蛋白质的核酸序列，特别是DNA序列，并可以将其插入表达载体中以产生大量的ISP3蛋白质。按照常规方法(Hfte等，1988；Harlow和Lane，1988)，ISP3蛋白质可以用于制备特异性单克隆或多克隆抗体。
在本发明一个实施方式中，提供特异性结合ISP3蛋白质的抗体。特别地，提供了结合ISP3-1099E，ISP3-327D或ISP3-2245J，或其片段或变异体的单克隆或多克隆抗体。其中包括单克隆或多克隆抗体的片段，该片段保留结合引起其产生的ISP3蛋白质或片段的能力。利用本领域已知的方法，诸如在Harlow和Lane″Using Antibodies：A LaboratoryManual″(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1998)中，在Liddell和Cryer，″A Practical Guide to Monoclonal Antibodies″(WILEYand Sons，1991)，中所述的方法，通过在动物(诸如家兔或小鼠)中利用ISP3蛋白质作为抗原可以制备ISP3蛋白质的抗体。抗体可以用于分离、鉴定、表征或纯化与其结合的ISP3蛋白质。例如，可以利用如ELISA或免疫印迹，通过使抗体和蛋白质形成免疫复合体，之后通过检测免疫复合体的存在，抗体可以用于检测样品中的ISP3蛋白质。
此外，本申请提供了用于样品中ISP3蛋白质、蛋白质片段或抗原表位检测的免疫学试剂盒。样品可以是细胞、细胞上清液、细胞悬浮液等。这种试剂盒包含结合ISP3蛋白质(或其片段)的抗体和一种或多种免疫检测试剂。
也可以通过例如ELISA(酶联免疫测定法)或Western印迹，将抗体用于分离具有相似活性的杀昆虫蛋白质。具有期望结合特异性的单克隆抗体系也可以用于克隆编码此特定单克隆抗体的DNA。
在本发明另一实施方式中，提供了用于检测isp3-1099E，isp3-237D或isp3-2245J DNA序列的PCR引物和/或探针和试剂盒。按本领域所知方法(参见，Dieffenbach和Dveksler(1995)PCR Primer：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，和McPherson等.(2000)PCR-Basics：From Background to Bench，第一版，Springer Verlag，Germany)，根据SEQ ID No.1，SEQ ID No.3或SEQ ID No.5，可以合成从样品扩增isp3 DNA的PCR引物对。同样地，SEQ ID No.1，SEQ IDNo.3或SEQ ID No.5的DNA片段可以用作杂交探针。isp3检测试剂盒可以包含isp3特异性引物或isp3特异性探针，和利用引物或探针检测样品中isp3 DNA的相关方案。例如，这种检测试剂盒可以用于测定是否植物已经被本发明isp3基因(或其部分)转化。
因为遗传密码的简并性，可以将一些氨基酸密码子置换为其它氨基酸密码子而不改变蛋白质的氨基酸序列。而且，一些氨基酸可以被其它等同氨基酸置换，而不明显地改变，优选地不改变蛋白质的杀昆虫活性，至少不以不利地方式改变蛋白质的杀昆虫活性。例如，只要不明显地改变，优选地不改变，至少不以不利地方式改变ISP3蛋白质的杀昆虫活性，在碱性(例如，Arg，His，Lys)，酸性(例如，Asp，Glu)，非极性(例如，Ala，Val，Trp，Leu，Ile，Pro，Met，Phe，Trp)或极性(例如，Gly，Ser，Thr，Tyr，Cys，Asn，Gln)范畴内的保守性氨基酸置换落入本发明范围。此外，只要不明显地改变，优选地不改变，至少不以不利地方式改变ISP3蛋白质的杀昆虫活性，非保守性氨基酸置换也落入本发明范围。本发明DNA序列的变异体或等同物包括在严格杂交条件下与SEQ ID No.1或SEQ ID No.3或SEQ IDNo.5的isp3 DNA序列杂交并且编码具有和本发明蛋白质相同的杀昆虫特性的蛋白质的DNA序列，或者与本发明天然isp3基因比较，具有不同密码子使用但是编码具有相同杀昆虫活性和基本相同，优选相同的氨基酸序列的蛋白质的DNA序列。利用可获得的密码子使用表，通过使密码子使用适于植物基因中最优选的密码子使用，特别是适于目的植物属或种之天然基因(Bennetzen & Hall，1982；Itakura等，1977)的密码子使用，可以优化isp3 DNA序列的密码子(例如，使其更适于在棉花、大豆、玉米或水稻中表达)。用于各种植物物种的密码子使用表由例如，Ikemura(1993)和Nakamura等.(2000)公开。
而且，可以移除长段的AT或GC核苷酸序列，并且可以引入适宜的限制性位点。
而且，可以修饰ISP3蛋白质的N-末端以使其具有最佳的翻译起始前后序列，由此在蛋白质的N-末端添加或缺失一个或多个氨基酸。在大多数情况下，为了最佳翻译起始，优选将要在植物细胞中表达的本发明蛋白质起始于Met-Asp或Met-Ala二肽，这需要在isp3 DNA中起始密码子下游插入编码Asp或Ala氨基酸的密码子作为新的第二密码子。可替代地，可以用“G”置换SEQ ID No.1，SEQ ID No.3或SEQ ID No.5的第四个核苷酸，这样(Met后)第二个氨基酸是Asp。同样地，可以用Asp密码子(GAT或GAC)或Ala密码子(GCT，GCC，GCA或GCG)，或用起始于“G”的任何其它密码子置换第二密码子(AAC或AAT，编码Asn)。
也可以修饰DNA序列以除去不适宜的剪接位点。因为细菌基因可能含有在其它宿主中，特别是真核生物宿主诸如植物中被识别为5’或3’剪接位点的基序，所以在这些其它宿主中的转录可能会过早地被终止，产生截短的mRNA。通过本领域已知的DNA序列的计算机分析和/或PCR分析可以鉴定不适宜的剪接位点。
当然，可以根据具体目的，构建其密码子使用不同，但是编码具有基本相同杀昆虫活性的相同蛋白质或相似蛋白质的DNA序列。已经描述了在原核生物和真核生物表达系统中，将密码子使用改变为宿主细胞的密码子使用是外源宿主中基因表达所期望的(Bennetzen & Hall，1982；Itakura等，1977)。在文献中(Wada等，1990；Murray等，1989)和在主要的DNA序列数据库中(例如，德国Heidelberg的EMBL)和如Nakamura等(2000)所述，可获得密码子使用表。因此，可以构建合成的DNA序列，由此产生相同或基本相同的蛋白质。显然，一旦知道本发明ISP3蛋白质的氨基酸序列，就可以制备几种DNA序列。这种其它DNA序列包括合成或半合成的DNA序列，其已被改变而失活基因中的某些位点，例如通过如PCT公开WO91/16432和WO93/09218中所述方式选择性失活天然序列中存在的一些隐蔽的调节或加工元件，或者其全部密码子使用被适应性修改以适于更相关宿主生物体的密码子使用，优选地适于期望在其中进行表达的宿主生物体的密码子使用。在专利和科技文献中可以发现将密码子使用改变为宿主细胞优选的密码子使用的几种技术。只要大多数或所有隐蔽的调节序列或加工元件已经被其它序列所置换，那么修饰密码子使用的精确方法对本发明来说不重要。
可以常规地，即，通过PCR介导的诱变进行诸如上述的DNA序列的小修饰(Ho等，1989，White等，1989)。利用现有技术，通过期望编码区的从头DNA合成可以常规地完成DNA序列的更深入的修饰。
术语“基本相同”，当指ISP3蛋白质的氨基酸序列时意指包括与所比较蛋白质的氨基酸序列相差不超过5％，优选地不超过2％的氨基酸序列；当指ISP3蛋白质的毒性时，意指包括这样的蛋白质，其平均LC50值(其是引起试验种群50％死亡的蛋白质浓度)与从所比较蛋白质获得的平均LC50值相差不超过2倍，其中该蛋白质和所比较蛋白质的平均LC50值均根据相同生物测定条件下进行的3个独立生物测定试验计算。利用程序POLO PC(来自于LeOra软件，1987，Berkely，California)，用Probit分析计算LC50值。可以理解为了确定是否存在LC50值的统计学显著差异，针对比较的两种蛋白质各自的LC50值，计算95％(或90％)置信限(用Probit分析计算的相关参数)。一般地，如果置信限重叠，那么两种蛋白质的毒性被视为基本相同，如果置信限不重叠，那么两种蛋白质的毒性被视为基本不同。
这里所用术语ISP3毒素(或ISP3蛋白质)的“域”意指毒素(或ISP3蛋白质)中具有特定结构或功能的任何部分或域，该部分或域可以被转移到另一蛋白质上以提供具有至少一种本发明ISP3毒素(或ISP3蛋白质)的功能特征(例如，结合和/或毒性特征)的新杂合蛋白质(Ge等，1991)。此部分可以形成具有本发明ISP3蛋白质的结合和/或毒性特征的杂合蛋白质的必要特征。这种杂合蛋白质可以具有扩大的宿主范围，改进的毒性和/或可以用在防止昆虫抗性发展的策略中(EP 408 403；Visser等，1993)。该定义包括编码这些域的DNA序列。这里所用的杂合蛋白质或融合蛋白质意指由不同蛋白质域组成并形成具有每个结构域的特征的功能性嵌合蛋白质的蛋白质。在杂合或嵌合蛋白质中可以包含的另一个域是例如稳定域。稳定域已经被描述例如，存在于VIP3(a)蛋白质的C-末端，并且被认为可以在敏感昆虫的肠道环境中赋予毒性蛋白质稳定性。
除了产生杂合蛋白质外，通过缺失所有或部分的结构域或向结构域中引入突变，并且分析由此在昆虫毒性、蛋白质稳定性、对酶蛋白水解及温度改变的敏感性和结合DNA/蛋白质/特异性细胞方面获得的影响，可以分析特定结构域的功能。
本发明一个实施方式提供了使编码ISP3蛋白质，特别是ISP3-1099E或ISP3-327D或ISP32245J的核酸序列“进化”为新的核酸序列的方法，其中该新的核酸序列编码具有杀昆虫活性的蛋白质。优选地，进化的核酸序列与未进化的核酸序列比较具有改进的杀昆虫活性。这里所用术语“进化”指如在US 5,811,238、WO97/20078和US 6,180,406中所述，通过序列重组增强序列进化的方法，这些文献并入这里为参考文献。这里所用核酸“改组”指核酸群或库中的核酸序列间的体外或体内重组，并且可以如本领域所知和如US 5,811,238、WO97/20078、US 6,180,406、US 6,117,679中所述，进行这种核酸“改组”，这里并入这些文献为参考文献。
进化编码ISP3蛋白质的核酸序列的方法包括下面步骤：
(a)提供编码SEQ ID No.2和/或4和/或6氨基酸序列，或SEQ ID No.2和/或4和/或6氨基酸序列的变异体或片段的核酸序列群，其中所述变异体或片段与SEQ ID No.2或4具有至少91％序列同一性，与SEQ ID No.6具有至少88％序列同一性，
(b)改组所述变异体或片段群以形成重组核酸分子；
(c)选择或筛选编码具有杀昆虫活性的蛋白质的重组核酸分子；
(d)用在步骤(c)中选定的重组核酸分子重复步骤(a)到(c)，直到在步骤(c)中已经发现编码的蛋白质具有期望的杀昆虫特性的重组核酸分子。
未进化的核酸是在步骤(a)中提供的作为起始材料的核酸，而这里所用的相应进化的核酸指当利用步骤(a)中未进化的核酸进行该方法时，在步骤(d)中获得的重组核酸。用在步骤(a)中优选的核酸是编码氨基酸序列ISP3-1099E(SEQ ID No.2)和/或ISP3-327D(SEQ ID No.4)和/或ISP3-2245J(SEQ ID No.6)，或其变异体或片段的核酸序列。步骤(a)中核酸分子和/或核酸分子的变异体和/或片段的群体可以包含编码单个ISP3蛋白质的DNA和/或编码本发明单个ISP3蛋白质的变异体和/或片段的核酸，或者包含编码本发明不同ISP3蛋白质和/或其片段和/或变异体的核酸的混合物。编码氨基酸序列SEQ ID No.2的变异体的核酸序列是编码与SEQ ID No.2在氨基酸水平上具有至少91％，优选地至少92％，最优选地至少93％，94％，95％，98％，99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。编码氨基酸序列SEQ ID No.4的变异体的核酸序列是编码与SEQ ID No.4在氨基酸水平上具有至少91％，优选地至少92％或93％，最优选地至少94％，95％，98％，99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。编码氨基酸序列SEQ ID No.6的变异体的核酸序列是编码与SEQ ID No.6在氨基酸水平上具有至少88％，优选地至少89％或90％，最优选地至少91％，92％，93％，95％，98％，99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。
优选地，步骤(d)中获得的进化的核酸序列编码具有改进杀昆虫活性的蛋白质，即，蛋白质具有，例如比步骤(a)中用作为起始材料的未进化序列编码的蛋白质更高的毒性，或者与未进化序列比较具有抗不同靶昆虫谱的活性，或者它结合靶昆虫中不同的靶结合位点。可以通过进行昆虫生物测定，比较进化和未进化核酸序列编码的蛋白质的杀昆虫活性，选择和筛选期望的较高毒性和/或不同毒性谱(步骤(c))。根据期望的杀昆虫特性，可以进行可替代的或另外的其它功能测定。例如，如果增强的结合是期望的特性，那么在进行昆虫生物测定前可以进行结合测定。
可以在适宜表达载体中连接从总DNA制备的本发明isp3 DNA序列，并且转化细菌菌株，诸如大肠杆菌(E.coli)或Bt菌株，然后可以通过常规菌落免疫探测方法(French等，1986)，用抗ISP3蛋白质产生的单克隆或多克隆抗体，筛选表达毒素的克隆。
然后，可以筛选产生ISP3蛋白质的Bt或大肠杆菌克隆(可以利用标准方法，对无细胞培养物上清液或细胞裂解液进行SDS-PAGE凝胶电泳，并实施标准western印迹方法)，或者可以检测细菌以与对照细菌比较其杀昆虫活性。利用标准PCR方法，诸如RT-PCR，也可以分析克隆是否存在编码ISP3蛋白质的mRNA。
可以用常规方法(Maxam和Gilbert，1980；Sanger，1977)测序编码本发明ISP3蛋白质的基因以获得DNA序列。序列比较表明该基因不同于以前描述的编码具有抗鳞翅目活性的毒素的基因。
基因序列分析后，可以按照常规方法制备这些DNA序列中编码新鉴定的ISP3蛋白质的杀昆虫有效部分的杀昆虫有效部分DNA。从分离的DNA序列的DNA序列可以确定ISP3蛋白质的氨基酸序列。这里也称为“截短基因”或“截短DNA”的编码ISP3蛋白质的DNA序列的“杀昆虫有效部分(或片段)”意指编码如下多肽的DNA序列，该多肽比ISP3全长蛋白质形式具有较少的氨基酸，但是具有杀昆虫活性。
为了在大肠杆菌、在其它Bt菌株和在植物中表达编码本发明ISP3蛋白质的DNA序列的全部或杀昆虫有效部分，可以引入适宜限制位点使其位于DNA序列侧翼。这可以利用熟知的方法(Stanssens等，1989；White等，1989)，通过定点诱变完成。为了在植物中获得改进的表达，可以根据PCT公布WO91/16432和WO93/09218和公布EP 0 385 962、EP 0 359 472和US 5,689,052，修饰本发明isp3基因或杀昆虫有效isp3基因部分的密码子使用以形成等价的、修饰的或人工的基因或基因部分，或者可以将isp3基因或基因部分插入质体、线粒体或叶绿体基因组并且利用适宜启动子在那里进行表达(例如，Mc Bride等，1995；US 5,693,507)。
为了在单子叶植物诸如玉米或水稻中获得增加的表达，也可以向嵌合基因添加内含子，优选地单子叶植物内含子。例如，已经证明将玉米Adh1基因的内含子插入到5’调节区中可以增加玉米中的表达(Callis等，1987)。同样地，如在US 5,859,347中所述的HSP70内含子可以用于增加表达。通过定点内含子插入和/或通过改变密码子使用，例如使密码子使用适应于植物，优选地特定相关植物属的最优选密码子使用(Murray等，1989)，而不明显改变，优选地不改变所编码的氨基酸序列，可以进一步以翻译中性方式改变isp3基因或其杀昆虫部分的DNA序列，以修饰基因部分中存在的可能的抑制DNA序列。
根据本发明一个实施方式，优选将蛋白质靶向细胞内细胞器诸如质体、优选地叶绿体，线粒体，或者从细胞分泌蛋白质从而潜在地优化蛋白质稳定性和/或表达。对于该目的，在本发明一个实施方式中，本发明嵌合基因包含编码信号肽或导向肽的编码区，其连接本发明ISP3蛋白质编码区。本发明蛋白质中待包含的特别优选的肽是用于叶绿体或其它质体导向的转运肽，特别是来自基因产物靶向质体的植物基因的双转运肽区，，Capellades等(US 5,635,618)的优化的转运肽，来源于菠菜的铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶的转运肽(Oelmuller等，1993)，Wong等(1992)中所述的转运肽和在公开的PCT专利申请WO00/26371中的导向肽。也优选引导与其连接的蛋白质分泌到细胞外的肽，诸如马铃薯蛋白酶抑制剂II的分泌信号(Keil等，1986)，稻α-淀粉酶基因3的分泌信号(Sutliff等，1991)和烟草PR1蛋白质的分泌信号(Cornelissen等，1986)。
本发明特别有用的信号肽包括叶绿体转运肽(例如，Van Den Broeck等，1985)或者US 5,510,471和US 5,635,618的优化的叶绿体转运肽——其引起蛋白质向叶绿体的转运，分泌性信号肽或将蛋白质靶向其它质体、线粒体、ER或另外的细胞器的肽。在天然导向蛋白质或分泌蛋白质中存在用于靶向细胞内细胞器或分泌到植物细胞外或分泌到细胞壁的信号序列，优选地，如Klsgen等，(1989)，Klsgen和Weil(1991)，Neuhaus &Rogers(1998)，Bih等(1999)，Morris等(1999)，Hesse等(1989)，Tavladoraki等(1998)，Terashima等(1999)，Park等(1997)，Shcherban等(1995)中所述的信号序列(这里并入所有这些文献为参考文献)，特别是来源于玉米、棉花、大豆或稻的导向或分泌性蛋白质的信号肽序列。
为了使得ISP3蛋白质分泌到转化的宿主细胞外面，可以将适宜分泌信号肽融合到ISP3蛋白质的氨基末端(N-末端)。也可以缺失或用适当的信号肽，诸如上述真核生物分泌性信号肽置换任何推定的天然芽孢杆菌属(Bacillus)分泌性信号肽。具体地，本发明ISP3蛋白质的氨基酸1到54位包含推定的芽孢杆菌属信号肽。可以从ISP3蛋白质移除或者可以用适当的信号肽，特别是上述真核生物信号肽置换第1到10，优选地1到50，更优选地l到54位氨基酸。利用计算机分析，利用程序诸如信号肽检索程序(SignalP 1.1或2.0版)，利用用于原核生物革兰氏阳性细菌的矩阵和小于0.5的阈值，特别是0.25或更小的阈值，可以检测推定的信号肽(Von Heijne，GunnaF，1986和Nielsen等，1996)。
而且，利用本领域已知的方法(例如，Van Rie等，1990)，可以评估本发明ISP3蛋白质的结合特性，以确定本发明ISP3蛋白质是否结合其它Bt蛋白质不识别(或竞争性识别)的昆虫肠道，诸如中肠中的位点。在相关敏感昆虫中不存在结合竞争的具有不同结合位点的杀昆虫Bt蛋白质是非常有价值的，尤其当其在植物中表达时，可以用其置换昆虫可能已经发展了抗性的已知Bt蛋白质，或者将其与具有不同作用方式的杀昆虫Bt蛋白质联合使用以防止或延迟昆虫抗Bt蛋白质抗性的发展。因为新分离的Bt毒素的这些特性，它们尤其可用于转化植物，例如单子叶植物诸如玉米和水稻和双子叶植物诸如棉花和大豆，以保护这些植物免受昆虫损害。预期本发明ISP3蛋白质的结合特性与Cry毒素的结合特性比较将不同。通过上述或US 6,291,156和US 6,137,033中的常规结合测定法可以测定这种不同的结合特性。
特别是为了对特定昆虫害虫进行昆虫抗性控制，优选将本发明ISP3蛋白质与另一种昆虫控制蛋白质，特别是Bt Cry蛋白质或VIP或VIP样蛋白质，优选地不识别这种ISP3蛋白质所识别的至少一个结合位点的蛋白质联合。与本发明ISP3蛋白质联合的优选的昆虫控制蛋白质，特别是对于在植物，优选地玉米、棉花、稻或大豆植物中同时表达而言，包括Cry蛋白质，诸如Cry1F蛋白质或来源于Cry1F蛋白质的杂合体(例如，US 6,326,169；US 6,281,016；US 6,218,188中所述杂合Cry1A-Cry1F蛋白质，或其毒性片段)，Cry1A型蛋白质或其毒性片段，优选地Cry1Ac蛋白质或来源于Cry1Ac蛋白质的杂合体(例如，US 5,880,275中所述杂合Cry1Ab-Cry1Ac蛋白质)，或者如EP451878中所述Cry1Ab或Bt2蛋白质或其杀昆虫片段，如WO02/057664中所述Cry2Ae、Cry2Af或Cry2Ag蛋白质，如WO01/47952中所述Cry蛋白质，如Estruch等(1996)和US 6,291，156中所述VIP3Aa蛋白质或其毒性片段，来源于Xenorhabdus(如WO98/50427中所述)、沙雷氏菌属(Serratia)(特别是来源于嗜虫沙雷氏菌(S.entomophila))或光杆状菌属(Photorhabdus)种菌株的杀昆虫蛋白质，诸如在WO98/08932(例如，Waterfield等，2001；Ffrench-Constant和Bowen，2000)中所述来源于光杆状菌属(Photorhabdus)的Tc蛋白质。在一个实施方式中，通过用本发明ISP3蛋白质转化已经表达昆虫控制蛋白质的植物，或者通过使昆虫控制蛋白质转化的植物和一种或多种本发明ISP3蛋白质转化的植物杂交，可以容易地获得这种共表达。对于玉米、稻、棉花或大豆植物，优选地，ISP3-327D蛋白质或ISP3-1099E蛋白质或ISP3-2245J蛋白质用作第一昆虫控制蛋白质，Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2Ae或VIP3Aa蛋白质或其衍生物用作第二昆虫控制蛋白质。在EP 0 408 403中描述了在相同植物中获得不同Bt(或者相似地，对于其它昆虫控制蛋白质而言)杀昆虫蛋白质表达以最小化或防止针对转基因抗昆虫植物的抗性发展的方法。可以理解，不同蛋白质可以在相同植物中表达，或者每种蛋白质可以分别在一种植物中表达，然后通过植物相互的杂交，在相同植物中联合这些蛋白质。例如，在杂种种子生产中，每种亲本植物可以表达单种蛋白质。一旦亲本植物杂交产生杂种，杂种植物中两种蛋白质将联合。
熟知Bt Cry蛋白质作为原毒素表达，在昆虫肠道中该原毒素通过蛋白酶解转化为毒性核心。当本发明ISP3蛋白质与Bt Cry蛋白质联合时，可以理解，可以利用编码全长原毒素或毒性核心或任何中间形式的Bt Cry基因。
优选地，为了筛选目的也是为了增强杂草控制目的，还可以用编码能赋予针对广谱除草剂的抗性的蛋白质的DNA转化本发明转基因植物，所述除草剂是例如基于草丙膦(glufosinate)和草甘膦的除草剂。
用常规方法，可以将编码ISP3蛋白质的杀昆虫有效部分的杀昆虫有效isp3基因部分或其等同物，优选地isp3嵌合基因稳定地插入到单个植物细胞的核基因组中，并且可以按照常规方法使用这种转化的植物细胞产生具有昆虫抗性的转化植物。在这方面，根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)中含有杀昆虫有效isp3基因部分的T-DNA载体可以用于转化植物细胞，并且以后利用例如在EP 0 116 718，EP 0 270 822，PCT公开WO84/02913和公开的欧洲专利申请EP0242 246和在Gould等(1991)中所述的方法，可以从转化的植物细胞再生转化的植物。本领域熟知用于农杆菌介导的植物转化的T-DNA载体的构建。如EP 0 120 561和EP 0 120515中所述，T-DNA载体可以是双元载体，或者如EP 0 116 718所述，T-DNA载体可以是能通过同源重组整合进入农杆菌Ti质粒的共整合载体。优选的T-DNA载体都在T-DNA边界序列之间，或者至少在右边界序列的左侧含有可操作地连接杀昆虫有效isp3基因部分的启动子。在Gielen，等(1984)中描述了边界序列。当然，利用方法诸如直接基因转移(例如，在EP 0223 247中所述)，花粉介导的转化(例如，在EP 0270 356和WO85/01856中所述)，例如US 4,684,611中所述的原生质体转化，植物RNA病毒介导的转化(例如，在EP 0 067 553和US 4,407，956中所述)，脂质体介导的转化(例如，在US 4,536,475中所述)，和其它方法，诸如最近描述的用于转化一些玉米株系(例如，US 6,140,553；Fromm等，1990；Gordon-Kamm等，1990)和稻(Shimamoto等，1989；Datta等，1990)的方法和一般性用于转化单子叶植物的方法(PCT公开WO92/09696)，可以利用其它类型载体转化植物细胞。对于棉花转化，特别优选的是PCT专利公布WO00/71733中所述的方法。对于稻转化，可以参考WO92/09696，WO94/00977和WO95/06722中所述的方法。
这里所用术语“玉米”指玉米(Zea mays)。这里所用棉花指棉属(Gossypium spp.)，特别是陆地棉(G.hirsutum)和海岛棉(G.barbadense)。术语“稻”指稻属(Oryza spp.)，特别地是稻(O.sativa)。“大豆”指大豆属(Glycine spp.)，特别是大豆(G.max)。
除了核基因组的转化，本发明也包括质体基因组，优选地叶绿体基因组的转化。Kota等(1999)描述了在烟草叶绿体中超表达Cry2Aa蛋白质的方法。
可以在常规植物培育方案中使用由此获得的转化植物用以产生具有相同特征的更多转化植物，或者用以将杀昆虫有效isp3基因部分引入相同或亲缘植物物种的其它品种中。从转化植物获得的种子含有作为稳定插入物的杀昆虫有效isp3基因部分。可以按照常规方法培养转化植物的细胞以产生ISP3毒素或蛋白质的杀昆虫有效部分，然后可以将其回收以用在抗鳞翅目的常规杀昆虫组合物(US 5,254,799)中。
将杀昆虫有效isp3基因部分插入植物细胞基因组中，使该插入基因在启动子下游(即，3’)并且受该启动子控制，其中该启动子可以指导植物细胞中此基因部分的表达。这优选地通过在植物细胞基因组中，特别在核或质体(例如，叶绿体)基因组中插入isp3嵌合基因来完成。
优选的启动子包括：花椰菜花叶病毒(CaMV)分离株CM 1841的强组成型35S启动子(“35S启动子”)(Gardner等，1981)，CabbB-S(Franck等，1980)和CabbB-JI(Hull和Howell，1987)；Odell等(1985)描述的35S启动子，来源于泛素家族的启动子(例如，Christensen等1992，EP0 342 926，也参见Cornejo等1993的玉米泛素启动子)，gos2启动子(dePater等，1992)，emu启动子(Last等，1990)，拟南介肌动蛋白启动子诸如An等(1996)所述的启动子，稻肌动蛋白启动子诸如Zhang等(1991)所述的启动子和US 5,641,876中所述的启动子；木薯脉花叶病毒启动子(WO97/48819，Verdaguer等，(1998))，来源于地下三叶草矮化病毒的pPLEX系列启动子(WO96/06932，特别是S7启动子)，醇脱氢酶启动子，例如pAdh1S(GenBank记录号X04049，X00581)，和TR1′启动子和TR2′启动子(分别是“TR1′启动子”和“TR2′启动子”)——它们分别驱动T-DNA的1′和2′基因的表达(Velten等，1984)。可替代地，可以利用不是组成型，而是对植物一个或多个组织或器官(例如，叶片和/或根)特异的启动子，由此插入的isp3基因部分仅在特定组织或器官的细胞中表达。例如，通过将杀昆虫有效isp3基因部分置于光诱导型启动子的控制下，可以在植物(例如，玉米、棉花、水稻、大豆)叶片中选择性表达杀昆虫有效isp3基因部分，所述光诱导型启动子是诸如US 5,254,799中所公开的植物本身或其它植物，诸如豌豆的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基基因的启动子。例如，可以选择启动子使得仅在靶昆虫害虫为食的那些组织或细胞中表达本发明isp3基因，以便，与不表达isp3基因的植物比较，通过敏感靶昆虫的取食引起对宿主植物减少的昆虫损害。因此，通过表达根特异性启动子控制下的isp3基因，可以有效地控制主要损害根的鳞翅目昆虫害虫。在WO00/29566中描述了优先在根中有活性的启动子。用于根优先表达的优选启动子是US 5,633,363中所述的ZRP启动子(和其修饰物)。另一替代方案是利用诱导型表达的启动子，例如由(如通过昆虫取食引起的)伤口诱导的伤口诱导型启动子诸如，Cordera等(1994)所述MPI启动子，或者由化学试剂诸如Aoyama和Chua(1997)所述的地塞米松诱导的启动子，或者由温度诱导的启动子，诸如US 5,447,858中所述热休克启动子，或者由其它外部刺激诱导的启动子。
将杀昆虫有效isp3基因部分插入到植物基因组中，使插入的基因部分位于适宜的3′末端转录调节信号(即，转录物形成和聚腺苷酸化信号)的上游(即，5′)。优选通过在植物细胞基因组中插入isp3嵌合基因完成上述过程。优选的聚腺苷酸化和转录物形成信号包括CaMV 35S基因、胭脂碱合酶基因(Depicker等，1982)、章鱼碱合酶基因(Gielen等，1984)和T-DNA基因7(Velten和Schell，1985)的这种信号，它们在转化的植物细胞中作为3′-非翻译DNA序列。
利用已知的方法诸如电穿孔或三亲本交配可以将T-DNA载体引入农杆菌。
任选地，该杀昆虫有效isp3基因部分可以作为杂合基因插入到植物基因组中(US 5,254,799；Vaeck等，1987)，并且与可选择或可评价的标记基因，如编码卡那霉素抗性的neo基因(EP 0 242 236)处于相同的启动子控制下，由此，植物表达易检测的融合蛋白质。
也可以利用植物细胞的转化在植物细胞培养中大量生产本发明的蛋白质，例如生产ISP3蛋白质，然后，该蛋白可以在适当配制后施用到玉米作物上。本文中提到转基因植物细胞时，它指分离的或组织培养中的植物细胞(或也指植物原生质体)，或包含在植物中或分化器官或组织中的植物细胞(或原生质体)，而且特别地本文包括这两种可能。因此，在说明书或权利要求书中提到植物细胞不仅仅意指培养中的分离的细胞，也指可能位于任何位置或可能存在于任何类型的植物组织或器官中的任何植物细胞。
也可以用编码抗鳞翅目的蛋白质的整个或部分isp3基因转化有抗鳞翅目或鞘翅目杀昆虫活性的其它微生物，如细菌，诸如苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。由此，可以产生转化的Bt菌株，用于对抗广谱的鳞翅目和/或鞘翅目昆虫害虫或用于对抗其它的鳞翅目昆虫害虫。可以用常规方法，优选用如Mahillon等，(1989)和PCT专利公布WO90/06999中所述常规的电穿孔技术，用引入到适宜克隆载体中的整个或部分本发明isp3基因进行细菌，如假单胞菌属(Pseudomonas)、农杆菌属(Agrobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)或埃希氏菌属(Escherichia)细菌的转化。
可以用常规方法(Dulmage，1981；Bernhard和Utz，1993)发酵含有本发明isp3基因的转化芽孢杆菌属菌株以提供高产量的细胞。在熟知的适当生长条件下，这些菌株以高产量分泌ISP3蛋白质。
可以表达isp3基因的备选适宜宿主微生物是真菌、藻类或病毒，特别是定居植物(例如，内共生)的物种或作为昆虫病原体的物种。
可以用isp3基因转化的微生物或优选它们相应的ISP3蛋白质或ISP3毒素或杀昆虫有效的毒素部分作为活性组分，一起与适宜的载体、稀释剂、乳化剂和/或分散剂(例如，如Bernhard和Utz，1993所述)，通过常规方法制成本发明的杀昆虫的，特别是抗鳞翅目的组合物。该杀昆虫组合物可以制成可湿性粉剂，丸，颗粒或粉剂，或用水或非水溶剂制成液体制剂，如泡沫，凝胶，悬浮液，浓缩物等。WO96/10083中描述了包含杀昆虫Bt孢子的组合物的例子。
根据本发明，控制昆虫，特别是鳞翅目的方法包括向要保护的场所(区域)施用(例如，喷雾)杀昆虫量的ISP3蛋白质或含有ISP3蛋白质或含有用本发明isp3基因转化的宿主细胞的组合物。要保护的场所可以包括，例如昆虫害虫的栖息地或生长的植物(例如，施用到叶)或将要生长植物的区域(例如，施用到土壤或水)。优选的组合物含有(优选通过细菌宿主产生的)杀昆虫量的至少一种本发明ISP3蛋白质，组合物优选的施用方式是叶片施用，土壤施用或种子包衣。
这里所用术语“接触”意指“与......发生物理接触”。用杀昆虫蛋白质接触植物意指内部地(例如，通过在植物中表达)或外部地(例如，通过向植物外部施用包含杀昆虫蛋白质的组合物)使杀昆虫蛋白质与植物细胞接触。可以理解，尽管该术语未指出接触的时间长度，但是包括任何接触时间(例如，短暂接触，长期接触)。当涉及包括用本发明杀昆虫蛋白质接触植物(或其细胞或组织)以保护植物免受昆虫损害的方法时，优选足够长和足够广泛的接触(即，足够大量的细胞接触足够高数量的蛋白质)以防止或减少昆虫损害。
本发明还涉及控制鳞翅目棉花昆虫害虫，特别是棉铃虫、卷叶蛾、earworms的方法，优选地鳞翅目棉花昆虫害虫选自：美洲棉铃虫，棉铃虫，Helicoverpa punctigera(Native Bollworm)，烟芽夜蛾，草地粘虫和棉花红铃虫，该方法包括向要保护的区域或植物施用这里所述的ISP3蛋白质，优选地这里所述的ISP3-1099E蛋白质和/或ISP3-327D蛋白质和/或ISP3-2245J蛋白质(即，例如通过种植用本发明isp3基因转化的棉花植物，或者通过喷雾含有本发明ISP3蛋白质的组合物，用本发明ISP3蛋白质接触棉花植物)。
本发明也涉及本发明ISP3蛋白质，特别是ISP3-1099E蛋白质和/或ISP3-327D蛋白质和/或ISP3-2245J蛋白质对抗鳞翅目棉花昆虫害虫以最小化所述昆虫对棉花植物的损害的用途。
本发明还涉及控制鳞翅目玉米昆虫害虫，特别是earworm、粘虫、玉米螟的方法，优选地，玉米昆虫害虫选自：美洲棉铃虫，小地老虎，欧洲玉米螟，草地粘虫，该方法包括向要保护的区域或植物施用这里所述的ISP3蛋白质，优选地这里所述的ISP3-1099E蛋白质和/或ISP3-327D蛋白质和/或ISP3-2245J蛋白质(即，例如通过种植用本发明isp3基因转化的玉米植物，或者通过喷雾含有本发明ISP3蛋白质的组合物，用本发明ISP3蛋白质接触玉米植物)。本发明也涉及本发明ISP3蛋白质，特别是ISP3-1099E蛋白质和/或ISP3-327D蛋白质和/或ISP3-2245J蛋白质对抗鳞翅目玉米昆虫害虫以最小化所述昆虫对玉米植物的损害的用途。
本发明还涉及控制鳞翅目水稻昆虫害虫，特别是二化螟、稻苞虫、稻切根虫、稻叶夜蛾、稻纵卷叶螟，美洲稻弄蝶的方法，优选地，水稻昆虫害虫选自：三化螟，稻纵卷叶螟，大螟和Corn spotted stem Borer(Chilopartellus)，该方法包括向要保护的区域或植物施用这里所述的ISP3蛋白质，优选地这里所述的ISP3-1099E蛋白质和/或ISP3-327D蛋白质和/或ISP3-2245J蛋白质(即，例如通过种植用本发明isp3基因转化的稻植物，或者通过喷雾含有本发明ISP3蛋白质的组合物，用本发明ISP3蛋白质接触稻植物)。本发明也涉及本发明ISP3蛋白质，特别是ISP3-1099E蛋白质和/或ISP3-327D蛋白质和/或ISP3-2245J蛋白质抗鳞翅目水稻昆虫害虫以最小化所述昆虫对稻植物的损害的用途。
本发明还涉及控制鳞翅目大豆昆虫害虫的方法，优选地，大豆昆虫害虫选自：藜豆夜蛾，大豆夜蛾，甜菜夜蛾，yellow stripedarmvworm(Spodoptera ornithogalli)，美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)，PodBorer(Epinotia aporema)和Rachiplusia nu.，该方法包括向要保护的区域或植物施用这里所述的ISP3蛋白质，优选地这里所述的ISP3-1099E蛋白质和/或ISP3-327D蛋白质和/或ISP3-2245J蛋白质(即，例如通过种植用本发明isp3基因转化的大豆植物，或者通过喷雾含有本发明ISP3蛋白质的组合物，用本发明ISP3蛋白质接触大豆植物)。本发明也涉及本发明ISP3蛋白质，特别是ISP3-1099E蛋白质和/或ISP3-327D蛋白质和/或ISP3-2245J蛋白质对抗鳞翅目大豆昆虫害虫以最小化所述昆虫对大豆植物的损害的用途。
为了获得ISP3毒素或蛋白质，可以通过常规方法在适宜培养基上生长表达ISP3蛋白质的重组宿主细胞。可以从生长培养物分离和纯化分泌的毒素。可替代地，如果蛋白质不被分泌，可以利用常规方法如酶降解或去污剂等裂解细胞。然后，用标准技术，如层析法，提取，电泳等分离和纯化毒素。
术语“基因”意指包含可在细胞中转录为RNA分子(例如，mRNA)的区域(“转录的区域”)的任何DNA或RNA片段，其中所述区域可操作地连接适宜的调节区域，例如植物可表达的启动子。因此，基因可以包含几个可操作地连接的片段，诸如启动子、5’前导序列、编码区和包含聚腺苷酸化位点的3’非翻译序列。特定生物体(诸如植物物种或细菌菌株)的内源基因是在自然界中天然存在于该生物体中的基因。当提到本发明isp3 DNA时，嵌合基因指具有的5’和/或3’调节序列不同于驱动isp3基因在其天然宿主细胞中表达的天然细菌5’和/或3’调节序列的isp3 DNA序列。
术语“基因表达”指可操作地连接适当调节区域，特别是启动子的DNA或RNA区域转录为生物活性RNA的过程，所谓生物活性RNA即该RNA能与另一核酸相互作用，或者其能翻译为生物活性多肽或蛋白质。当基因表达的终产物是生物活性RNA，诸如反义RNA、核酶或复制中间体时，称基因编码RNA。当基因表达终产物是生物活性蛋白质或多肽时，称基因编码蛋白质。
对于本发明目的，以百分数表示的两个相关核苷酸或氨基酸序列的“序列同一性”，指在此两个最佳联配的序列中具有相同残基的位置的数目除以所比较的位置数(×100)。空位，即，联配中在一个序列中存在残基而在另一个序列中不存在残基的位置，其被视为具有不同残基的位置。对于本发明目的，为了计算两个序列之间的序列同一性，利用GAP程序，该程序利用了Needleman和Wunsch算法(1970)，并且由WisconsinPackage，版本10.2，Genetics Computer Group(GCG)，575 Science Drive，Madison，Wisconsin 53711，USA，提供。所用GAP参数是空位产生罚分＝50(核苷酸)/8(氨基酸)，空位延伸罚分＝3(核苷酸)/2(氨基酸)，和记分矩阵″nwsgapdna″(核苷酸)或″blosum62″(氨基酸)。
GAP利用了Needleman和Wunsch全局联配算法以就两个序列的全长进行联配，从而最大化匹配数和最小化空位数。缺省参数是空位产生罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白质)和空位延伸罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白质)。对于核苷酸，所用的缺省记分矩阵是″nwsgapdna″；对于蛋白质，缺省记分矩阵是″blosum62″(Henikoff&Henikoff，1992)。
在权利要求的文字中反映了本发明这些和/或其它实施方式，其形成本
发明说明书的一部分。
下面的实施例示例了本发明，但是不旨在对本发明和其保护范围的限制。实施例、权利要求和说明书中提到的序列表如下：
SEQ ID No.1：DNA序列isp3-1099E
SEQ ID No.2：氨基酸序列ISP3-1099E
SEQ ID No.3：DNA序列isp3-327D
SEQ ID No.4：氨基酸序列ISP3-327D
SEQ ID No.5：DNA序列isp3-2245J
SEQ ID No.6：氨基酸序列ISP3-2245J
除了在实施例中另外说明外，根据标准方法进行所有重组DNA技术，所述标准方法是Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY中，Ausubel等(1994)Current Protocols in Molecular Biology，CurrentProtocols，USA的1和2卷中，和Brown(1998)Molecular Biology Labfax，第二版，Academic Press(UK)的卷I和II中所述的标准方法。在R.D.D.Croy著Plant Molecular Biology Labfax(1 993)(BIOS ScientificPublications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications，UK联合出版)中描述了用于植物分子工作的标准材料和方法。可以在Dieffenbach和Dveksler(1995)PCR Primer：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，中和McPherson等.(2000)PCR-Basics：FromBackground to Bench，第一版，Springer Verlag，Germany中发现用于聚合酶链式反应的标准材料和方法。
实施例
实施例1：细菌菌株的鉴定
从比利时的谷尘(grain dust)分离到这里命名为BTS01099E的细菌菌株。从西班牙的马粪分离到这里命名为BTS00327D的另一种细菌菌株。从菲律宾的谷尘分离到这里命名为BTS02245J的另一种细菌菌株。
在28℃，在LB琼脂板(添加1.5％琼脂的LB培养基；LB培养基：10g/l胰蛋白胨，10g/l NaCl，5g/l酵母提取物，pH7.3)上过夜生长每个菌株。对于小规模培养，接种20ml TB培养基(Terrific肉汤：12g/l胰蛋白胨，24g/l酵母提取物，3.8g/l KH2PO4，12.5g/l K2HPO4，5ml/l甘油，pH7.1)，在28℃，在每分钟约70转的旋转平台上生长65小时。65小时后，向培养物添加蛋白酶抑制剂混合物。该混合物具有下面的组分：(所给的体积为添加到一份20ml培养物所需的体积)：200μl PMSF(100mM)，200μl苯甲脒.HCl(100mM)和ε-氨基-正-己酸(500 mM)的混合物，400μl EGTA(0.5M)，40μl抗蛋白酶(0.5mg/ml)/亮抑酶肽(0.5mg/ml)和20μl β-巯基乙醇(14M)。
然后，在3000rpm，离心已经添加了蛋白酶抑制剂混合物的培养基20分钟。在一些情况下，利用Centriprep YM-10 Centrifugal Filter Devices(Millipore Cat.No.4305)浓缩上清液约4倍。
为了进行长期贮藏，将一环形成孢子的细胞加入到0.5ml的25％甘油中，涡旋后，在-70℃贮藏。通过在LB琼脂板上生长菌株直到孢子形成，获得形成孢子的细胞(在光学显微镜下可观察看到)。
将单细胞菌落在LB琼脂板上培养后，BTS01099E、BTS00327D和BTS02245J菌株培养物的显微镜分析表明存在杆状的、运动的、单个营养细胞和包含卵圆形孢子的孢子囊。在BTS00327D，BTS01099E和BTS02245J培养物中检测到伴胞晶体。
根据杆样形状、有氧生长和伴胞晶体的存在，认为这3株是苏云金芽孢杆菌种菌株。
可以在常规标准培养基上，优选地T3培养基(胰蛋白胨3g/l，胰蛋白2g/l，酵母提取物1.5g/l，5mg MnCl2，0.05M Na2HPO4.2H2O，0.05MNaH2PO4.H2O，pH6.8和1.5％琼脂)上，优选在28℃，培养每个菌株。为了长期贮藏，优选地，混合等体积的孢子晶体悬浮液和等体积的50％甘油，并且将它贮藏在-70℃或冻干孢子晶体悬浮液。优选在28℃，72小时，在T3培养基上生长以实现孢子形成。
实施例2：芽孢杆菌菌株的昆虫生物测定(利用含有杀昆虫蛋白质的培养物悬浮液)
对美洲棉铃虫，烟芽夜蛾(Heliothis virescens)，欧洲玉米螟(Ostrinianubilalis)，草地粘虫(spodoptera frugiperda)，小地老虎(Agrotis ipsilon)的新生幼虫进行生物测定。
在抗各种鳞翅目昆虫的昆虫测定中(“表面污染测定”)，使用不同芽孢杆菌菌株的细菌培养物的无细胞上清液。
在28℃，在TB培养基上生长菌株BTS01099E，BTS00327D或BTS02245J。培养开始后65小时收获无细胞培养物上清液，进行稀释并施用到固化人工饵料(琼脂20g，水1000ml，玉米粉96g，酵母30g，麦胚64g，Wesson盐7.5g，酪蛋白15g，山梨酸2g，金霉素0.3g，Nipagin 1g，麦胚油4ml，蔗糖15g，胆固醇1g，抗坏血酸3.5g，Vanderzand mod.vit.mix12g(根据Vanderzand 1962))表面，所述饵料分配在Costar 48孔平板孔中并允许其固化。将25μl上清液溶液加到每个孔的表面(1cm2)。每个孔放置一个新生(L1：一龄期)昆虫幼虫，每个样品使用18-20个幼虫。保持该培养皿在25℃±1℃，7天后记录死亡率(死亡幼虫对活的幼虫的百分数)。利用TB和标准饵料作为阴性对照。
结果(下面表1中所示)表明菌株BTS01099E，BTS00327D和BTS02245J的无细胞上清液显示了对烟芽夜蛾(Heliothis virescens)，美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)和欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)幼虫的毒性。此外，菌株BTS02245J的上清液还显示了对草地粘虫(Spodopterafrugiperda)幼虫的毒性，BTS00327D的上清液显示了对小地老虎(Agrotisipsilon)幼虫的毒性。
表1：
| 菌株 | Hv死亡率(％) | Hz死亡率(％) | On死亡率(％) | Sf死亡率(％) | Ai死亡率(％) |
| BTS02245J | 11(ir)/33(gi) | 94(gi)/50 | 50(gi) | 78(gi) | nt |
| BTS00327D | 70 | 35-78(gi) | 100 | nt | 100 |
| BTS01099E | 25 | 10 | 46 | nt | nt |
Hv：烟芽夜蛾(Heliothis virescens)，Hz：美洲棉铃虫(Helicoverpazea)；On：欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)，Sf：草地粘虫(Spodopterafrugiperda)；Ai：小地老虎(Agrotis ipsilon)；nt：没有测定。
阴性对照(标准饵料)：
BTS02245J：Hv 9％，Hz 0％，On 0％，Sf 0％
BTS00327D：Hv 10％，Hz 6％，On 4％，Ai 0％
BTS01099E：Hv 10％，Hz 0％，On 0％
其它的观测项目：
gi：幼虫的生长抑制(7天后，活的幼虫仍旧在L1/L2龄期)
ir：幼虫的无规律生长(7天后，活的幼虫一部分在L1/L2龄期，一部分在L3/L4龄期)
菌株BTS02245J的无细胞上清液引起了烟芽夜蛾幼虫11％和33％的死亡率，美洲棉铃虫幼虫94％和50％的死亡率，欧洲玉米螟幼虫50％的死亡率和草地粘虫幼虫78％的死亡率，表明该菌株的上清液有杀昆虫活性，特别是抗美洲棉铃虫和草地粘虫的杀昆虫活性。毒性可能是由于该菌株分泌到培养基中的蛋白质引起的。
菌株BTS00327D的无细胞上清液引起了烟芽夜蛾幼虫70％的死亡率，美洲棉铃虫幼虫35％到78％的死亡率，欧洲玉米螟幼虫100％的死亡率和小地老虎幼虫100％的死亡率。因此，该菌株的上清液显示了对至少4种不同的鳞翅目昆虫物种的强毒性。毒性可能是由于该菌株分泌到培养基中的杀昆虫活性蛋白质引起的。
菌株BTS01099E的无细胞上清液引起了烟芽夜蛾(H.virescens)幼虫25％的死亡率，美洲棉铃虫(H.zea)幼虫10％的死亡率，欧洲玉米螟(O.nubilalis)幼虫46％的死亡率，表明该菌株的上清液有抗不同鳞翅目(Lepidopteran)昆虫物种的毒性活性。毒性可能是由于该菌株分泌到培养基中的杀昆虫活性蛋白质引起的。
实施例3：isp3基因的克隆
从菌株BTS01099E克隆编码ISP3-1099E的核苷酸序列
制备菌株BTS01099E的总DNA，用Sau3A部分消化。在蔗糖梯度上大小分级消化的DNA。BamH1消化和用TsAP(热敏感性碱性磷酸酶)处理克隆载体pUC191(pUC19的衍生物；Yannisch-Perron等，1985)后，将范围从7kb到10kb的片段连接到克隆载体。然后，将连接混合物电穿孔到大肠杆菌(E.coli)XL1-Blue细胞中。在含有X-gal和IPTG的LB-triacillin平板上铺转化体，选择白色菌落用于滤膜杂交试验。然后，用如下制备的DIG标记的探针筛选含有载体的重组大肠杆菌克隆。首先，利用来源于菌株BTS01099E的细胞作为模板进行PCR。凝胶纯化所得的扩增产物，并且克隆到pGEM-T中。利用DIG-标记的dNTPs和与第一次PCR反应中相同的引物，使用所得的质粒做为PCR反应中的模板。在杂交反应中使用适当量的该扩增产物。
鉴定含有包含全长isp3基因的质粒的阳性菌落后，利用染料终止子标记方法和Perkin Elmer ABI Prism-377 DNA测序仪测定该基因的序列。测定编码和非编码链。
SEQ ID No.1中所示的是在阳性菌落的克隆DNA片段中发现的开放读框序列(isp3-1099E)。发现该DNA序列编码SEQ ID No.2中所示的新的蛋白质(ISP3-1099E)。
为了证明该DNA序列是观察到的杀昆虫活性的原因，在细菌菌株中表达该序列，在昆虫生物测定中测定重组菌株的上清液或细胞裂解液的杀昆虫活性。
从菌株BTS00327D克隆编码ISP3-327D的核苷酸序列
制备菌株BTS00327D的总DNA，用Sau3A部分消化。在蔗糖梯度上大小分级消化的DNA。BamH1消化和用TsAP(热敏感性碱性磷酸酶)处理克隆载体pUC191(pUC19的衍生物；Yannisch-Perron等，1985)后，将范围从7kb到10kb的片段连接到克隆载体。然后，将连接混合物电穿孔到大肠杆菌(E.coli)XL1-Blue细胞中。在含有X-gal和IPTG的LB-triacillin平板上涂转化体，选定白色菌落用于滤膜杂交试验。然后，用如下制备的DIG标记的探针筛选含有载体的重组大肠杆菌克隆。首先，利用来源于菌株BTS00327D的细胞作为模板进行PCR。凝胶纯化所得的扩增产物，并且克隆到pGEM-T中。利用DIG-标记的dNTP和与第一次PCR反应中相同的引物，使用所得的质粒做为PCR反应中的模板。在杂交反应中使用适当量的该扩增产物。
鉴定含有包含全长isp3基因的质粒的阳性菌落后，利用染料终止子标记方法和Perkin Elmer ABI Prism-377 DNA测序仪测定该基因的序列。测定编码和非编码链。
SEQ ID No.3中所示的是在阳性菌落的克隆DNA片段中发现的开放读框序列(isp3-327D)。发现该DNA序列编码SEQ ID No.4中所示的新的蛋白质(ISP3-327D)。
为了证明该DNA序列是观察到的杀昆虫活性的原因，在细菌菌株中表达该序列，在昆虫生物测定中测定重组菌株的上清液或细胞裂解液的杀昆虫活性。
从菌株BTS02245J克隆编码ISP3-2245J的核苷酸序列
制备菌株BTS02245J的总DNA，用Sau3A部分消化。在蔗糖梯度上大小分级消化的DNA。BamH1消化和用TsAP(热敏感性碱性磷酸酶)处理克隆载体pUC191(pUC19的衍生物；Yannisch-Perron等，1985)后，将范围从7kb到10kb的片段连接到克隆载体。然后，将连接混合物电穿孔到大肠杆菌XL1-Blue细胞中。在含有X-gal和IPTG的LB-triacillin平板上涂转化体，选定白色菌落用于滤膜杂交试验。然后，用如下制备的DIG标记的探针筛选含有载体的重组大肠杆菌克隆。首先，利用来源于菌株BTS02245J的细胞作为模板进行PCR。凝胶纯化所得的扩增产物，并且克隆到pGEM-T中。利用DIG-标记的dNTP和与第一次PCR反应中相同的引物，使用所得的质粒做为PCR反应中的模板。在杂交反应中使用适当量的该扩增产物。
鉴定含有包含全长isp3基因的质粒的阳性菌落后，利用染料终止子标记方法和Perkin Elmer ABI Prism-377 DNA测序仪测定该基因的序列。测定编码和非编码链。
SEQ ID No.5中所示的是在阳性菌落的克隆DNA片段中发现的开放读框序列(isp3-2245J)。发现该DNA序列编码SEQ ID No.6中所示的新的蛋白质(ISP3-2245J)。
为了证明该DNA序列是观察到的杀昆虫活性的原因，在细菌菌株中表达该序列，在昆虫生物测定中测定重组菌株的上清液或细胞裂解液的杀昆虫活性。
实施例4：ISP3蛋白质在大肠杆菌中的重组表达
将SEQ ID No.1(isp3-1099E)，SEQ ID No.3(isp3-327D)和SEQ ID No.5(isp3-2245J)亚克隆到表达载体中位于cry1Ab启动子的控制下，并且在大肠杆菌菌株WK6中表达。在亚克隆期间，在ATG起始密码子处引入NcoI限制位点，因此将SEQ ID No 2，SEQ ID No 4和SEQ ID No.6的第二个氨基酸从天冬酰胺(Asn)改变为天冬氨酸(Asp)。
转化的大肠杆菌的细胞裂解液的SDS-PAGE分析证明三个基因都产生了预期分子量(±88kDa)的蛋白质。利用未转化的大肠杆菌wK6的细胞裂解液做为阴性对照。
如实施例5所述，在昆虫测定(表面污染测定)中使用表达isp3-327D和isp3-1099E的重组大肠杆菌培养物的细胞裂解液。在下面的表2中概述了该结果。加号表示超过阴性对照的显著性昆虫死亡率。
表2：
| 大肠杆菌中的基因 | Hz | Hv | Sf | Ag | Dvv |
| isp3-327D | + | + | + | + | - |
| isp3-1099E | + | + | + | + | - |
| 阴性对照WK6 | - | - | - | - | - |
Hz：美洲棉铃虫，Hv：烟芽夜蛾，Sf：草地粘虫，Dvv：玉米根虫(Diabroticavirgifera virgifer)，Ag：藜豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)。
生物测定：
Hz：在48多孔Costar平板中，在实夜蛾属食物上表面污染，25μl/孔(1cm2)，每浓度18×1L1，
Hv：在24多孔Costar平板中，在实夜蛾属食物上表面污染，50μl/孔(2cm2)，每浓度20×1L1，
Sf：在48多孔Costar平板中，在littoralis食物上表面污染，25μl/孔(1cm2)，每浓度18×1L1，
Ag：在24多孔Costar平板中，在littoralis食物上表面污染，50μl/孔(2cm2)，每浓度12×2L1，
在25±1℃温育；7天后计数。
对于ISP3-327D和ISP3-1099E蛋白质，在利用美洲棉铃虫，烟芽夜蛾，草地粘虫和藜豆夜蛾的表面污染测定中发现了显著的死亡率。此外，表达ISP3-327D或ISP3-1099E的重组大肠杆菌的没有稀释的细胞裂解液显示了抗欧洲玉米螟的显著性死亡率(与对照WK6的0％的死亡率比较，对于ISP3-327D是50％(gi)死亡率，对于ISP3-1099E是26％(gi)的死亡率)。
实施例5：ISP3蛋白质在Bt中的重组表达
将SEQ ID No.1(isp3-1099E)和SEQ ID No.5亚克隆到穿梭载体中，并且在晶体缺陷型的Bt菌株(IPS 78/11或Berliner 1715cry-)中表达。在生物测定中，利用此未转化的Bt菌株的上清液做为阴性对照。
利用上述(实施例2)和下述(以测定LC50值)表面污染测定法，测定重组Bt菌株的无细胞培养物上清液抗鳞翅目昆虫幼虫，特别地抗烟芽夜蛾，美洲棉铃虫，欧洲玉米螟，草地粘虫，小地老虎，棉花红铃虫和藜豆夜蛾(A.gemmatalis)的毒性。
如下获得重组Bt菌株的上清液。在28℃，在含有红霉素(20μg/ml)的LB琼脂板上过夜生长Bt菌株。对于小规模培养，接种含有红霉素(20μg/ml)的20ml TB培养基，在28℃，在每分钟约70转的旋转平台上生长65小时。65小时后，向培养物添加蛋白酶抑制剂混合物。该混合物具有下面的组分：(所给的体积为添加到一份20ml培养物所需的体积)：200μlPMSF(100mM)，200μl苯甲脒.HCl(100mM)/ε-氨基-正己酸(500mM)的混合物，400μl EGTA(0.5M)，40μl抗蛋白酶(0.5mg/ml)/亮抑酶肽(0.5mg/ml)和20μl β-巯基乙醇(14M)。
然后，在3000rpm，离心已经添加了蛋白酶抑制剂混合物的培养基20分钟。在一些情况下，利用Centriprep YM-10 Centrifugal Filter Devices(Millipore Cat.No.4305)浓缩上清液约4倍。
对于美洲棉铃虫和烟芽夜蛾，在表面污染测定中利用下面的人工饵料：水1L，琼脂20g，大豆粉81g，麦胚36g， Wesson盐混合物10g，蔗糖14.7g，Nipagin 1g，山梨酸1.1g，Vanderzant vit.mix.9.5g，玉米油5ml，制霉菌素0.06g，金霉素0.17g。
在用于其它鳞翅目昆虫的表面污染测定中，利用下面的人工饵料：水1L，琼脂20g，玉米粉112g，麦胚28g，酵母30g，山梨酸1.2g，Nipagin 1g，金霉素0.06g，制霉菌素0.03g，抗坏血酸4.8g。
在Costar 24多孔板的孔中分配人工饵料，使其固化。将50μl稀释的上清液施用到每个孔的表面上(2cm2)。将1或2只幼虫(L1：一龄)放置到每个孔上(这取决于物种，例如对于欧洲玉米螟是2只幼虫/孔)，每个上清液稀释物使用约20到24只幼虫。检测范围在约4050到0.21ng/cm2的6到8个上清液稀释物(稀释倍数约是3)。保持该培养皿在25℃±1℃，7天后记录死亡率(死亡幼虫对活的幼虫的百分数)。利用TB和标准饵料做为阴性对照。利用程序POLO PC(来自LeOra Software，1987，Berkely，California)，用probit分析计算LC50值和/或LC90值。LC50值是当杀死50％试验的昆虫幼虫时的总上清液蛋白质浓度。
生物测定表明克隆序列isp3-1099E和isp3-2245J编码的蛋白质各自都引起了抗所选自鳞翅目昆虫的显著性杀昆虫活性。
将SEQ ID No.3(isp3-327D)亚克隆到穿梭载体中，并且在晶体缺陷型Bt菌株IPS78/11中表达。在生物测定中，利用此未转化的Bt菌株的上清液做为阴性对照。
SDS-PAGE分析表明培养物上清液含有分子量接近ISP3-327D蛋白质的计算分子量(±88kDa)的蛋白质。
利用实施例2中所述的表明污染测定法，表达SEQ ID No.3(isp3-327D)的Bt菌株IPS78/11的无细胞培养物上清液显示了抗欧洲玉米螟(On)，棉花红铃虫(Pg)和美洲棉铃虫(Hz)的显著性杀昆虫活性，如表3中所示：
表3：
| Hz死亡率(％) | On死亡率(％) | Pg死亡率(％) | Dvv死亡率(％) | |
| 在IPS78/11中的isp3-327D | 94(gi)/58(gi) | 19(gi) | 29(gi) | 0 |
| 对照IPS78/11 | 0 | 6 | 0 | 5 |
gi：幼虫的生长抑制/Dvv：玉米根虫(Diabrotica virgifera virgifera)
生物测定：
在TB中26小时培养及随后加入蛋白酶抑制剂混合物后，利用浓缩的上清液进行上述表面污染测定。实夜蛾属人工饵料(如上述)用于美洲棉铃虫，而littorals人工饵料用于欧洲玉米螟和棉花红铃虫。对于美洲棉铃虫和欧洲玉米螟，使用48孔Costar板，25μl/孔(1cm2)，18个孔，每孔1只L1幼虫。对于棉花红铃虫，使用24孔Costar板，50ul/孔(2cm2)，12个孔，每孔2只L1幼虫。Dvv人工饵料(如上述)用于Dvv，24孔板中，50μl/孔(2cm2)，6个孔，每孔4只L1幼虫。
生物测定表明克隆序列isp3-327D编码的蛋白质具有抗所选鳞翅目昆虫的显著性杀昆虫活性。
实施例6：ISP3-327D的进一步鉴定
表达SEQ ID No.3(isp3-327D)的晶体缺陷型Bt菌株IPS78/11的上清液用于检测ISP3-327D蛋白质的胰蛋白酶消化能力和所得到片段的毒性。如SDS-PAGE分析所测定，转化的IPS78/11的培养物上清液的胰蛋白酶处理产生了约65kDa和约23kDa的两条主要条带。
在抗美洲棉铃虫的表面污染测定中，利用胰蛋白酶处理的上清液(4小时处理；用终浓度0.1mM的PMSF终止反应)和没有被胰蛋白酶处理的上清液。在48多孔板的实夜蛾属食物上进行表面污染测定(25μl/孔；1cm2)。检测6种上清液稀释度。每个稀释度18个孔，每个孔使用1个L1幼虫。在7天后，在25±1℃温育后，计算死亡率。
没有处理的和胰蛋白酶处理的ISP3-327D蛋白质的LC50值显示了90％置信区间的重叠，表明胰蛋白酶处理的蛋白质保留了抗美洲棉铃虫的毒性活性。
实施例7：重组ISP3蛋白质的稻昆虫生物测定
在上述大肠杆菌中表达isp3-1099E(SEQ ID No.1)、ISP3-327D(SEQID NO.3)和isp3-2245J(SEQ ID No.5)序列。
在昆虫生物测定中，检测重组大肠杆菌的细胞裂解液抗4种鳞翅目水稻害虫的活性。每种蛋白质检测5到6个剂量。
(a)三化螟的生物测定：
从稻田收集三化螟成虫。收集成虫产出的卵，在30℃保持在培养皿中以孵化。在生物测定中使用新孵出的幼虫。
利用6cm的水稻茎鞘。从敏感品种TN1新切割的水稻茎上切下6cm长的叶鞘段。沿着一个鞘外壳(sheath cover)分别将片段的最内部分浸入不同剂量蛋白质中30秒。在样品试管(7cm长；2.5cm直径)中的2cm琼脂凝胶上垂直固定处理的茎鞘。向每个处理的茎加入10-15只三化螟新生幼虫，密封试管，温育5天。5天后，计算存活和死亡的幼虫数量。
(b)稻纵卷叶螟的生物测定
从北部印度的稻田收集昆虫，在温室中水稻植物上饲养昆虫幼虫。将出现的成虫限于产卵室中，将产卵的植物保持在有水浅盘中进行幼虫孵化。一天龄的幼虫用于生物测定中。
利用从分蘖期水稻植物新切割的叶片，在圆柱形小室中进行生物测定。从水稻分蘖枝中间轮生体切下8cm长的叶片。将叶片放置于小室中，并且施用不同的蛋白质剂量。30分钟后，向每个叶片上加5到10只幼虫。每个蛋白质剂量至少利用3片叶片。温育后5天，计算死亡和存活幼虫的数量。
(c)大螟生物活性测定
从北部印度的稻田收集昆虫，在水稻植物上饲养。利用干豆粉、酿酒酵母、山梨酸、抗坏血酸、羟苯甲酸甲酯、琼脂和水制成的人工饵料，在小玻璃瓶(直径7.5cm×2.5cm)中进行生物测定。将饵料分配到小玻璃瓶中不超过2cm的深度。每种蛋白质剂量至少制备3个小玻璃瓶。将40μl试验剂量均匀地涂抹到每个小玻璃瓶的饵料表面，进行1小时的干燥。每个小玻璃瓶添加10到15只一龄期大螟幼虫。7天后，计算死亡和存活幼虫的数量。
(d)Corn Spotted Stem Borer(Chilo partellus)的生物活性测定：
在由红豆粉、酿酒酵母、山梨酸、高梁叶粉、抗坏血酸、甲基对羟基苯甲酸、维生素、麦胚油、Wesson盐混合物，琼脂，甲醛和水制成的人工饵料上饲养昆虫。在生物测定中使用来自这些培养物的新生幼虫。如用于大螟所述方式进行生物测定。
(e)水稻昆虫生物测定的结果：
在下面表4中概述了昆虫生物测定的结果，表明ISP3-327D和ISP3-1099E对4种鳞翅目水稻害虫，即，三化螟，稻纵卷叶螟，大螟和Corn Spotted Strn Borer(Chilo partellus)具有高度毒性。而且，ISP3-2245J蛋白质显示了对3种鳞翅目水稻害虫，即三化螟，稻纵卷叶螟和大螟的显著性毒性，而没有检测到ISP3-2245J蛋白质抗Chilo partellus的毒性。
表4：
| 大肠杆菌中的基因 | YSB | LF | PSB | SSB |
| isp3-327D | + | + | + | + |
| isp3-1099E | + | + | + | + |
| isp3-2245J | + | + | + | - |
| 阴性对照 | - | - | - | - |
YSB：三化螟，LF：稻纵卷叶螟，PSB：大螟，SSB：Spotted Stem Borer；
加号(+)表示与阴性对照比较显著性的死亡率。
实施例8：转化植物中ISP3蛋白质的产生
构建包含植物可表达启动子的植物表达载体，该启动子可操作地连接编码ISP3-1099E，ISP3-327D或ISP3-2245J(或其毒性片段或变异体)的DNA序列和3’聚腺苷酸化信号。将前导序列，诸如来源于碧冬茄属(Petunia)(Harpster等，1988)叶绿素a/b结合蛋白质基因的前导序列插入isp3 DNA的5’。优选地，例如，如WO94/24264中所述，改变isp3-1099E，isp3-327D和isp3-2245J的密码子使之适于宿主植物(例如，玉米、棉花或水稻)的密码子使用。
用于驱动isp3基因的启动子选自：组成型启动子CaMV 35S(Hull和Howell，1987)，玉米泛素启动子，水稻肌动蛋白启动子和木薯脉花叶病毒启动子。使用的3’35S、3’nos(Depicker等，1982)、3’ocs或3’基因7做为3’转录终止和聚腺苷酸化信号。对于农杆菌介导的转化，将表达盒子插入T-DNA载体的左右边界序列之间。
玉米(Zea mays)，棉花(陆地棉或海岛棉和稻(Oryza sativa)的转化。
如US 6,140,553中所述，通过农杆菌介导的转化法稳定地转化玉米细胞，这里将这篇文献并入为参考文献。如WO00/71733所述，通过农杆菌介导的转化稳定地转化棉花细胞，这里并入这篇文献为参考文献。如WO92/09696所述稳定地转化水稻细胞。
如上述文献所述，再生转化的细胞和小植株。对于另外含有选择性标记基因，诸如除草剂抗性基因，例如赋予对草甘膦抗性的2mEPSPS(EP0508 909和EP 0 507 698，并入其为参考文献)或赋予对草丙膦铵抗性的bar或PAT基因(EP0242236和EP0242246，并入作为参考)的构建体，在含有选择性试剂的选择性培养基上生长转化的细胞，这样大多数选定的再生体都是转化的。
通过ELISA、Southern印迹、Northern印迹和/或PCR分析从再生体中选定表达isp3基因的转化体。然后针对抗鳞翅目昆虫害虫的杀昆虫活性，(利用生物测定)选择转化事件，特别是单拷贝事件。与非转化的对照植物比较，含有嵌合基因isp3-1099E，isp3-327D或isp3-2245J的后代植物显示提高的抗鳞翅目昆虫的抗性。特别地，具有高水平昆虫耐受性的植物表达高水平的ISP3蛋白质和isp3 mRNA。
进一步筛选转化体的农艺学性状(正常的表型、产量、植物体系结构(plant architecture)等)。种子增加后，在存在敏感昆虫害虫的不同地区进行转化的玉米、棉花或水稻植物的田间试验，证明在不同环境的田间条件下，表达ISP3蛋白质的植物具有增加的昆虫耐受性。特别地，与没有转化的对照植物比较，在昆虫害虫的(人工或天然)的侵袭后，转化植物的产量损失减少。
为了产生具有广泛杀昆虫活性的植物，ISP3表达事件可以互相杂交并与表达具有不同，优选地互补杀昆虫谱的杀昆虫蛋白质的其它转基因植物杂交。利用针对一系列不同昆虫害虫的生物测定法，测定杂交后代的杀昆虫活性。以此方式产生抗期望的一系列昆虫的具杀昆虫活性的植物。
本发明不限于上述玉米、棉花、大豆或水稻植物、转化方法、载体构建体(启动子、3’末端等)和所用的特定ISP3蛋白质或DNA序列。本发明包括保留杀昆虫活性的ISP3蛋白质的变异体或等同物。
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序列表
<110>拜尔生物科学公司(Bayer BioScience N.V.)
<120>新的苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白质
<130>isp3
<150>US 60/366276
<151>2002-03-22
<150>US 60/423999
<151>2002-11-06
<160>6
<170>PatentIn version 3.0
<210>1
<211>2364
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>苏云金芽孢杆菌isp3-1099E的核苷酸序列
<400>1
atgaacatga ataatactaa attaaacgca agggccttac caagttttat tgattatttt 60
aatggcattt atggatttgc cactggtatc aaagacatta tgaatatgat ttttaaaacg 120
gatacaggtg gtaatctaac cctagacgaa atcttaaaga atcagcagtt actaaatgag 180
atttctggta aattggatgg ggtaaatggg agcttaaatg atcttatcgc acagggaaac 240
ttaaatacag aattatctaa ggaaatctta aaaattgcaa atgaacagaa tcaagtctta 300
aatgatgtta ataacaaact cgatgcgata aatacgatgc ttcatatata tctacctaaa 360
attacatcta tgttaagtga tgtaatgaag caaaattatg cgctaagcct gcaaatagaa 420
tacttaagta aacaattgca agaaatttcc gataagttag atattattaa cgtaaatgtt 480
cttattaact ctacacttac tgaaattaca cctgcatatc aacggattaa atatgtgaat 540
gaaaaatttg aagaattaac ttttgctaca gaaaccactc taaaagtaaa agaggatgga 600
tcccctgcag atattcttga tgagttaact gagttaactg aattagcgaa aagtgtaaca 660
aaaaatgaag tggatggttt tgaattttac cttaatacat tccacgatgt aatggtagga 720
aataatttat tcgggcgttc agctttaaaa actgcttcgg aattaattgc taaagaaaat 780
gtgaaaacaa gtggcagtga ggtaggaaat gtttataatt tcttaattgt attaacagct 840
ctacaagcaa aagcttttct tactttaaca acatgccgga aattattagg attagcagat 900
attgattata cttctattat gaatgaacat ttaaataagg aaaaagagga atttagagta 960
aacatccttc ctacactttc taatactttt tctaatccta attatgtaaa agctaaagga 1020
agcgatagag atgcaaagat gattgtggaa gctaaaccag gatatgcttt ggttggattt 1080
gaaatgagta atgattcaat gacagtatta aaagcatatc aggccaagct aaagcaagat 1140
tatcaagttg ataaggattc attatcagaa attgtctatg gtgatatgaa taagttatta 1200
tgtccggatc aatctgaaca aatatattat acaaataata tagcatttcc ccgtgaatat 1260
gttattacta aacttacttt tacaaaaaaa atgaacagtt taaggtatga ggcgacagct 1320
aatttttatg attcttctac aggagatatg gatctaaata agacaaaagt agaatcaagt 1380
gaagcggagt atagtaggct aagtgctagt aatgatggag tctatatgcc gttaggtctt 1440
atcagtgaaa catttttgac tccaattaat ggttttggac tcgtagtcga tgaaaattca 1500
agattagtaa ctttaacatg taaatcatat ttaagagaga tattattagc aacagactta 1560
agtaataaag aaactaaatt gattgtccca cctaatggtt ttattagcaa tattgtagaa 1620
aatgggaact tagagggaga aaacttagag ccgtggaaag caaataacaa aaatgcgtat 1680
atagatcata caggcggcgt aaaaggaact aaagtattat atgttcataa ggatggagag 1740
ttctcacaat ttattgggta taaattgaaa tcgaaaacag aatatgtaat tcaatatatt 1800
gtaaaaggaa aagctgttat ttatttaaaa gatgaaaaaa atggggatta catttatgaa 1860
gaaataaata atgaattaga agattttcaa acggttacta aacgttttat tacaggaaca 1920
gattcttcag gagttcattt aatttttacc agtcaaaatg gcgaggaagc attcgggggg 1980
aactttatta tttcagaaat taggccatcc gaagagttat taagtccaga attgattaag 2040
tcggatgctt gggttggaac tcagggagct tggaattcag ggaattctct cacaatttat 2100
actaatacaa atggaacctt tcgacaaaac cttccgttag aaagttattc aacttatagt 2160
atgaacttta atataactgg atttggcaag gtgacaataa ggaattctcg tgaagtatta 2220
tttgaaaaga acttttccca gctttcgcct aaagattatt ctgaaaaatt tacaactgca 2280
gccaataata ccggattcta tgtagagctt tctcgcggaa cgcagggtgg taatataact 2340
ttccgagatt tttcaattaa gtaa 2364
<210>2
<211>787
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>苏云金芽孢杆菌ISP3-1099E的氨基酸序列
<400>2
Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu His Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr
180 185 190
Thr Leu Lys Val Lys Glu Asp Gly Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Glu Val
210 215 220
Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly
225 230 235 240
Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile
245 250 255
Ala Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr
260 265 270
Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr
275 280 285
Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr
290 295 300
Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val
305 310 315 320
Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Val
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Ser Asp Arg Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys
340 345 350
Pro Gly Tyr Ala Leu Val Gly Phe Glu Met Ser Asn Asp Ser Met Thr
355 360 365
Val Leu Lys Ala Tyr Gln Ala Lys Leu Lys Gln Asp Tyr Gln Val Asp
370 375 380
Lys Asp Ser Leu Ser Glu Ile Val Tyr Gly Asp Met Asn Lys Leu Leu
385 390 395 400
Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Ash Asn Ile Ala Phe
405 410 415
Pro Arg Glu Tyr Val Ile Thr Lys Leu Thr Phe Thr Lys Lys Met Asn
420 425 430
Ser Leu Arg Tyr Glu Ala Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly
435 440 445
Asp Met Asp Leu Asn Lys Thr Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr
450 455 460
Ser Arg Leu Ser Ala Ser Asn Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Leu
465 470 475 480
Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Val Val
485 490 495
Asp Glu Asn Ser Arg Leu Val Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg
500 505 510
Glu Ile Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile
515 520 525
Val Pro Pro Asn Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly Asn Leu
530 535 540
Glu Gly Glu Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr
545 550 555 560
Ile Asp His Thr Gly Gly Val Lys Gly Thr Lys Val Leu Tyr Val His
565 570 575
Lys Asp Gly Glu Phe Ser Gln Phe Ile Gly Tyr Lys Leu Lys Ser Lys
580 585 590
Thr Glu Tyr Val Ile Gln Tyr Ile Val Lys Gly Lys Ala Val Ile Tyr
595 600 605
Leu Lys Asp Glu Lys Asn Gly Asp Tyr Ile Tyr Glu Glu Ile Asn Asn
610 615 620
Glu Leu Glu Asp Phe Gln Thr Val Thr Lys Arg Phe Ile Thr Gly Thr
625 630 635 640
Asp Ser Ser Gly Val His Leu Ile Phe Thr Ser Gln Asn Gly Glu Glu
645 650 655
Ala Phe Gly Gly Asn Phe Ile Ile Ser Glu Ile Arg Pro Ser Glu Glu
660 665 670
Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Lys Ser Asp Ala Trp Val Gly Thr Gln
675 680 685
Gly A1a Trp Asn Ser Gly Asn Ser Leu Thr Ile Tyr Thr Asn Thr Asn
690 695 700
Gly Thr Phe Arg Gln Asn Leu Pro Leu Glu Ser Tyr Ser Thr Tyr Ser
705 710 715 720
Met Asn Phe Asn Ile Thr Gly Phe Gly Lys Val Thr Ile Arg Asn Ser
725 730 735
Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Asn Phe Ser Gln Leu Ser Pro Lys Asp
740 745 750
Tyr Ser Glu Lys Phe Thr Thr Ala Ala Asn Asn Thr Gly Phe Tyr Val
755 760 765
Glu Leu Ser Arg Gly Thr Gln Gly Gly Asn Ile Thr Phe Arg Asp Phe
770 775 780
Ser Ile Lys
785
<210>3
<211>2367
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>苏云金芽孢杆菌isp3-327D的核苷酸序列
<400>3
atgaatatga ataatactaa attaaacgca agggccctac cgagttttat tgattatttt 60
aatggcattt atggatttgc cactggtatc aaagacatta tgaatatgat ttttaaaacg 120
gatacaggtg gtaatctaac cttagacgaa atcctaaaga atcagcagtt actaaatgag 180
atttctggta aattggatgg ggtaaatggg agcttaaatg atcttatcgc acagggaaac 240
ttaaatacag aattatctaa ggaaatctta aaaattgcaa atgaacagaa tcaagtctta 300
aatgatgtta ataacaaact cgatgcgata aatacgatgc ttcatatata tctacctaaa 360
attacatcta tgttaagtga tgtaatgaag caaaattatg cgctaagtct gcaaatagaa 420
tacttaagta agcaattgca agaaatttct gataaattag atattattaa cgtaaatgtt 480
cttattaact ctacacttac tgaaattaca cctgcatatc aacggattaa atatgtgaat 540
gaaaaatttg aagaattaac ttttgctaca gaaaccactt taaaagtaaa aaaggatagc 600
tcgcctgctg atattcttga tgagttaact gaattaactg aactagcgaa aagtgttaca 660
aaaaatgacg ttgatggttt tgaattttac cttaatacat tccacgatgt aatggtagga 720
aataatttat tcgggcgttc agctttaaaa actgcttcag aattaattgc taaagaaaat 780
gtgaaaacaa gtggcagtga agtaggaaat gtttataatt tcttaattgt attaacagct 840
ctacaagcaa aagcttttct tactttaaca acatgccgaa aattattagg cttagcagat 900
attgattata cttctattat gaatgaacat ttaaataagg aaaaagagga atttagagta 960
aacatccttc ctacactttc taatactttt tctaatccta attatgcaaa agttaaagga 1020
agtgatgaag atgcaaagat gattgtggaa gctaaaccag gacatgcatt ggttgggttt 1080
gaaatgagca atgattcaat cacagtatta aaagtatatg aggctaagct aaaacaaaat 1140
tatcaagttg ataaggattc cttatcggag gttatttatg gtgatacgga taaattattt 1200
tgtccagatc aatctgaaca aatatattat acaaataaca tagtattccc aaatgaatat 1260
gtaattacta aaattgattt cactaaaaaa atgaaaactt taagatatga ggtaacagcg 1320
aatttttatg attcttctac aggagaaatt gacttaaata agaaaaaagt agaatcaagt 1380
gaagcggagt atagaacgtt aagtgctaat gatgatggag tgtatatgcc attaggtgtc 1440
atcagtgaaa catttttgac tccgataaat gggtttggcc tccaagctga tgaaaattca 1500
agattaatta ctttaacatg taaatcatat ttaagagaac tactgctagc aacagactta 1560
agcaataaag aaactaaatt gatcgtccca ccaagtggtt ttattagcaa tattgtagag 1620
aacgggtcca tagaagagga caatttagag ccgtggaaag caaataataa gaatgcgtat 1680
gtagatcata caggcggagt gaatggaact aaagctttat atgttcataa ggacggagga 1740
ttttcacaat ttattggaga taagttaaaa ccgaaaactg agtatgtaat ccaatatact 1800
gttaaaggaa aaccttctat tcatttaaaa gatgaaaata ctggatatat tcattatgaa 1860
gatacaaata ataatttaaa agattatcaa actattacta aacgttttac tacaggaact 1920
gatttaaagg gagtgtattt aattttaaaa agtcaaaatg gagatgaagc ttggggagat 1980
aaatttacaa ttttagaaat taagcctgcg gaggatttat taagcccaga attaattaat 2040
ccgaattctt ggattacgac tccaggggct agcatttcag gaaataaact tttcattaac 2100
ttggggacaa atgggacctt tagacaaagt ctttcattaa acagttattc aacttatagt 2160
ataagcttta ctgcatcagg accatttaat gtgacggtaa gaaattctag ggaagtatta 2220
tttgaacgaa gcaaccttat gtcttcaact agtcatattt ctgggacatt caaaactgaa 2280
tccaataata ccggattata tgtagaactt tcccgtcgct ctggtggtgg tggtcatata 2340
tcatttgaaa acgtttctat taaataa 2367
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>苏云金芽孢杆菌ISP3-327D的氨基酸序列
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Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe
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Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
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Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
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Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
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Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Iyr Gln Arg Ile
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Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile
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<223>苏云金芽孢杆菌ISP3-2245J的氨基酸序列
<400>6
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Ile Lys
785
Claims (36)
1、包含与SEQ ID No.4具有至少91％序列同一性的氨基酸序列的分离的杀昆虫蛋白质。
2、包含与SEQ ID No.6具有至少88％序列同一性的氨基酸序列的分离的杀昆虫蛋白质。
3、包含与SEQ ID No.2具有至少91％序列同一性的氨基酸序列的分离的杀昆虫蛋白质。
4、包含SEQ ID No.2的氨基酸序列或其最小毒性片段的分离的杀昆虫蛋白质。
5、包含SEQ ID No.4的氨基酸序列或其最小毒性片段的分离的杀昆虫蛋白质。
6、包含SEQ ID No.6的氨基酸序列或其最小毒性片段的分离的杀昆虫蛋白质。
7、如前述权利要求所述的蛋白质，其中所述蛋白质具有抗至少一种选自以下的昆虫物种的杀昆虫活性：美洲棉铃虫、烟芽夜蛾、欧洲玉米螟、草地粘虫、小地老虎、棉花红铃虫、三化螟、稻纵卷叶螟、大螟、Chilopartellus和藜豆夜蛾。
8、编码权利要求1至6任一项所述蛋白质的分离的核酸序列。
9、编码权利要求1至6任一项所述蛋白质的分离的核酸序列，其中所述蛋白质具有抗至少一种选自以下的昆虫物种的杀昆虫活性：美洲棉铃虫、烟芽夜蛾、欧洲玉米螟、草地粘虫、小地老虎、棉花红铃虫、三化螟、稻纵卷叶螟、大螟、Chilo partellus和藜豆夜蛾。
10、包含与SEQ ID No.1具有至少93％序列同一性的核苷酸序列的分离的核酸。
11、包含与SEQ ID No.3具有至少94％序列同一性的核苷酸序列的分离的核酸。
12、包含与SEQ ID No.5具有至少97％序列同一性的核苷酸序列的分离的核酸。
13、包含SEQ ID No.1的第1到2364位核苷酸的分离的核酸序列。
14、包含SEQ ID No.3的第1到2367位核苷酸的分离的核酸序列。
15、包含SEQ ID No.5的第1到2361位核苷酸的分离的核酸序列。
16、包含编码杀昆虫蛋白质的核酸序列的分离的核酸，其中该杀昆虫蛋白质包含在严格杂交条件下与SEQ ID No.1或SEQ ID No.3或SEQID NO.5杂交的核酸序列的翻译产物的氨基酸序列。
17、编码权利要求1至6任一项所述蛋白质的分离的核酸序列，其中所述核酸序列是合成序列，该合成序列已被优化用于单子叶植物或双子叶植物中的表达。
18、包含可操作地连接权利要求8至17任一项所述核酸序列的启动子序列的嵌合基因。
19、包含可操作地连接核酸序列的启动子序列的嵌合基因，该核酸序列编码SEQ ID No.2的氨基酸序列或其最小毒性片段。
20、包含可操作地连接核酸序列的启动子序列的嵌合基因，该核酸序列编码SEQ ID No.4的氨基酸序列或其最小毒性片段。
21、包含可操作地连接核酸序列的启动子序列的嵌合基因，该核酸序列编码SEQ ID No.6的氨基酸序列或其最小毒性片段。
22、包含权利要求18至21任一项所述嵌合基因的载体。
23、包含权利要求18至21任一项所述嵌合基因的转基因宿主细胞。
24、如权利要求23所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是植物细胞。
25、如权利要求23所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是微生物。
26、包含权利要求18至21任一项所述嵌合基因的转基因植物。
27、如权利要求26所述的植物，其中所述植物是玉米、棉花、稻或大豆植物。
28、保护植物免受昆虫损害的方法，包括用杀昆虫蛋白质接触所述植物，其中所述蛋白质具有SEQ ID No.2的氨基酸序列。
29、保护植物免受昆虫损害的方法，包括用杀昆虫蛋白质接触所述植物，其中所述蛋白质具有SEQ ID No.4的氨基酸序列。
30、保护植物免受昆虫损害的方法，包括用杀昆虫蛋白质接触所述植物，其中所述蛋白质具有SEQ ID No.6的氨基酸序列。
31、如权利要求28至30任一项所述的方法，其中所述杀昆虫蛋白质由整合在所述植物的基因组中的嵌合基因编码。
32、如权利要求28至30任一项所述的方法，其中给所述植物外部施用所述蛋白质。
33、如权利要求28至30任一项所述的方法，其中所述植物是玉米、棉花、大豆或稻植物。
34、包含权利要求8所述核酸序列的苏云金芽孢杆菌菌株。
35、包含权利要求1至6任一项所述蛋白质的杀昆虫组合物，当给植物外部施用这种杀昆虫组合物时，与没有施用这种组合物的对照植物比较，该组合物增加植物对昆虫损害的抗性。
36、进化编码ISP3蛋白质的核酸序列的方法，该方法包括步骤：
(a)提供编码SEQ ID No.2和/或4和/或6的氨基酸序列、或SEQID No.2和/或4和/或6的氨基酸序列的变异体或片段的核酸序列群，其中所述变异体或片段与SEQ ID No.2或4具有至少91％序列同一性，与SEQID No.6具有至少88％序列同一性，
(b)改组所述变异体或片段的群体以形成重组核酸分子，
(c)选择或筛选编码具有杀昆虫活性的蛋白质的重组核酸分子，
(d)用在步骤(c)中选择的重组核酸分子重复步骤(a)到(c)，直到在步骤(c)中已经发现编码的蛋白质具有期望的杀昆虫特性的重组核酸分子。
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|---|---|---|---|
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