CN1708588A

CN1708588A - Cot102杀虫棉花

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Publication number: CN1708588A
Application number: CNA2003801021378A
Authority: CN
Inventors: D·M·埃利斯; D·V·奈格罗特; 施良; F·A·施特科斯基; C·R·托马斯
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 2002-10-29
Filing date: 2003-10-23
Publication date: 2005-12-14
Anticipated expiration: 2023-10-23
Also published as: EP1565560B1; GB0225129D0; EP1565560A1; AR041851A1; EP2275579A3; AU2003283295A1; ZA200502625B; ES2447818T3; ES2388276T3; CN100439507C; CY1114948T1; EP2275579B1; PT1565560E; US7803547B2; US20080090241A1; US20100298553A1; US20060130175A1; BRPI0315775B1; BR0315775A; PT2275579E

Abstract

本发明涉及抗昆虫转基因棉花植物。特别地，本发明涉及命名为COT102的特定事件。本发明也涉及COT102事件特有的多核苷酸，包含所述多核苷酸的植物，和检测COT102事件的方法。该COT102事件显示了包含2个表达盒的新基因型。第一个盒子包含用于在植物中表达的适合启动子和适合的聚腺苷酸化信号，该启动子可操作地连接编码VIP3A杀虫毒素的基因，该VIP3A杀虫毒素可用于控制广谱鳞翅目昆虫害虫。第二个盒子包含当其表达时能用做选择性标记的基因。

Description

COT102杀虫棉花

技术领域

本发明涉及植物的基因工程，特别是抗昆虫的转基因棉花植物。本发明也涉及检测来源于该植物的材料的方法。

背景技术

植物害虫是世界上重要农作物损失的主要因素。在美国，由于非哺乳动物害虫(包括昆虫)侵袭植物，每年损失约80亿美元。除了农田作物损失外，昆虫害虫对于蔬菜和水果种植者，对于观赏花卉的生产者，和对于家宅园丁也是负担。

主要通过化学杀虫剂的广泛应用控制昆虫害虫，该化学杀虫剂具有抑制昆虫生长，妨碍昆虫进食或繁殖，或引起死亡的活性。因此可以达到良好的昆虫害虫控制，但是这些化学药品有时也影响其它有益昆虫。化学杀虫剂广泛应用引起的另一问题是抗药性昆虫品种的出现。通过各种抗药性处理实践已经部分缓解了这种现象，但是对可替代的害虫控制剂存在日益增加的需要。生物害虫控制剂，诸如表达杀虫毒素象δ-内毒素的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)株系也已经被施用给作物植物，并且取得了满意的结果，提供了化学杀虫剂的可替代物或补充物。已经分离了一些编码这些δ-内毒素的基因，表明在异源宿主中它们的表达提供了用于经济上重要的昆虫害虫控制的另一种工具。特别地，转基因植物中杀虫毒素如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)δ-内毒素的表达提供了免受所选择昆虫害虫侵害的有效保护，并且已经商品化了表达这种毒素的转基因植物，使得农民能够减少化学昆虫控制药剂的施用。

最近，鉴定了芽孢杆菌属(Bacillus spp.)营养生长阶段期间产生的一类新的杀虫蛋白质(营养杀虫蛋白质(VIPs))。美国专利5,877,012，6,107,279，和6,137,033描述了从芽孢杆菌属(Bacillus)物种分离的vip3A毒素基因。VIP3A毒素具有抗广谱鳞翅目昆虫，包括但不限于草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)，小地老虎(Agrotis ipsilon)，小蔗螟(Diatraea saccharalis)和南美玉米苗斑螟(Elasmopalpuslignosellus)的杀虫活性，并且当在转基因植物例如棉花中表达它时，给植物提供了免受昆虫进食损害的保护。

棉类植物棉属(Gossypium)是锦葵科(Malvaceae)的成员，包含39个物种，其中陆地棉(Gossypium hirsutum)是最常栽培的物种。也栽培3种其它物种：树棉(G.arboreum)，海岛棉(G.barbadense)和草棉(G.herbaceum)。种植这些栽培品种主要是为了制成纺织品的种子纤维。棉花适于做为纺织纤维，因为成熟的干纤维捻在一起，使得可从中纺出结实的细线。其它产品，诸如棉籽油、油饼和棉籽绒是纤维生产的副产品。

每年，世界上由于昆虫害虫对棉花作物的损害引起了严重的产量损失。有效地控制这些害虫以最小化产量损失具有重要的经济意义。棉花昆虫害虫的例子包括甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)，棉铃象(Anthonomusgrandis grandis)，粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)，云纹盲蝽(Neurocolpusnubilus)，棉蚜(Aphis gossypii)，谷实夜蛾(Heliocoverpa zea)，切根虫(粒肤地虎(Feltia subterranean)，豆杂色夜蛾(Peridroma saucia)，小地老虎(Agrotis ipsilon))，欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)，草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)，花蓟马属(Frankliniella spp.)，大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)，蝽象(稻绿蝽(Nezara viridula)，喜绿蝽(Acrosternumhilare)，褐臭蝽(Euschistus servus))，牧草盲蝽(Lygus lineolaris)，烟蚜夜蛾(Heliothis virescens)和粉虱(结翅粉虱(Trialeurodes abutilonea)，甘薯粉虱(Bemisia tabaci))。

现在，棉花植物的转化和再生是非常完善的方法，典型地基于根瘤农杆菌(Agrobacterium tumfaciens)介导外源DNA转移到棉花植物部分中，并且在组织培养中再生所述植物部分为完全可育的转基因棉花植物。

需要产生抗昆虫的棉花植物，以减少由于昆虫害虫对棉花作物的损害造成的产量损失。抗昆虫棉花植物可以减少施用化学杀虫剂的需要，化学杀虫剂可能对其它有益昆虫和环境是有害的。

发明内容

因此，本发明涉及命名为COT102的抗昆虫转基因棉花事件。本发明也涉及检测来源该事件的植物材料的方法。在本申请上下文中“COT102事件”指这里所述的原始杀虫转基因棉花植物。这里所用的“杀虫”指对昆虫的任何抑制作用，包括但不限于进食减少、生长阻滞、生殖力减弱，麻痹或死亡。“生殖力”包括与繁殖有关的所有方面，诸如繁殖能力、繁殖频率和后代数量。本发明也包括来源于该COT102事件的任何植物材料，包括种子。

COT102事件显示了包含2个表达盒的新基因型。第一个盒子包含用于在植物中表达的适合启动子和适合的聚腺苷酸化信号，该启动子可操作地连接编码VIP3A杀虫毒素的基因，该VIP3A杀虫毒素可用于控制广谱鳞翅目昆虫害虫。尤其可以从植物分离适合的启动子。已经分离和表征了大量植物启动子，包括组成型、开关型和/或组织特异性启动子。适合的启动子可以选自下列非限制性的群组：CaMV35S，FMV35S，遍在蛋白，Act2，NOS，OCS，夜香树属(Cestrum)黄叶卷曲病毒启动子，Patatin，E9，alcA/alcR开关，GST开关，RMS开关，油质蛋白，Gelvin，核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基，肌动蛋白7，MR7启动子(玉米)，Gos9(水稻)，GOS2启动子，MasOcs(或超启动子(super promoter))，RolD启动子(毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes))，SuperMAS启动子和Suc2启动子(拟南芥属(Arabidopsis))。在本发明的一个实施方式中，启动子是来源于拟南芥属(Arabidopsis)的肌动蛋白启动子Act2。另外的元件诸如增强子序列也可以掺入表达盒中以加强基因表达水平，例如转录或翻译增强子，诸如烟草蚀刻病毒(TEV)翻译激活子(translationactivator)，CaMV35S增强子和FMV35S增强子。做为可替代方案，可能期望包含导向序列，例如以引导VIP3A毒素转运到特定细胞区室。例如，如果期望提供细胞外蛋白质，那么可以连接细胞外导向序列和编码VIP蛋白质的多核苷酸。其它靶向的例子包括靶向特定的细胞内细胞器或区室，例如利用‘KDEL’保留序列，靶向内质网。已经分离和表征了大量聚腺苷酸化信号。植物中起作用的适合聚腺苷酸化信号的例子包括来源于根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂氨酸合酶基因(nos)，来源于蛋白酶抑制剂基因II和来源于α-微管蛋白基因的聚腺苷酸化信号(EP-A 652,286)。在本发明一个实施方式中，聚腺苷酸化信号是来源于根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)nos基因的聚腺苷酸化信号。

根据本发明，也可以密码子优化或者以其它方式改变编码VIP3A蛋白质的多核苷酸，这样一旦该多核苷酸被掺入到植物材料中，例如就可以增强转录。这种密码子优化也可以用于改变任何转化细胞中产生的RNA转录物的预测二级结构，或者用于破坏未改变的转录物中存在的隐蔽RNA不稳定性元件，因此增加转化细胞中转录物的稳定性和可利用性(Abler和Green(1996)Plant Molecular Biology(32)，63-78页)。

第二个盒子包含当表达时可以用做选择性标记的基因。已经表征了大量选择性标记，包括赋予对抗生素耐受性的一些选择性标记和赋予对除草剂耐受性的其它选择性标记。适合的选择性标记基因的例子包括赋予对潮霉素、卡那霉素或庆大霉素耐受性的选择性标记基因。其它适合的选择性标记包括赋予对除草剂诸如基于草甘膦的除草剂的耐受性或对毒素诸如eutypine的抗性的基因。也可以利用其它形式筛选诸如基于激素的筛选系统诸如Hiroyrasu Ebinuma等(1997)PNAS，94卷，2117-2121页的多自动转化(MAT)系统；使用已知绿色荧光蛋白、β-葡糖醛酸酶的可观察的筛选系统和任何其它筛选系统诸如甘露糖异构酶(Positech^TM)，木糖异构酶和2-脱氧葡萄糖(2-DOG)。在本发明一个实施方式中，选择性标记基因是赋予对潮霉素耐受性的选择性标记基因。其它表达盒可选地包含在COT102事件中。例如，这些表达盒可以提供其它的期望益处诸如除草剂抗性。

第一和第二个表达盒可以在相同或不同质粒上被引入植物中。如果第一和第二表达盒存在相同质粒上，并且通过农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化方法被引入到植物中，则它们可以存在于相同或不同T-DNA区中。在本发明一个实施方式中，第一和第二个表达盒存在于相同T-DNA区上。

根据本发明的第一方面，提供了多核苷酸，其包含来自于SEQ ID NO：1的26个核苷酸序列的至少17个邻接核苷酸。在一个实施方式中，所述多核苷酸包含来自于SEQ ID NO：1的至少18个邻接核苷酸。在进一步实施方式中，所述多核苷酸包含来自于SEQ ID NO：1的至少20个邻接核苷酸。在另一实施方式中，所述多核苷酸包含来自于SEQ ID NO：1的至少22个邻接核苷酸。在进一步实施方式中，所述多核苷酸包含来自于SEQ IDNO：1的至少24个邻接核苷酸。在进一步实施方式中，本发明提供了包含SEQ ID NO：1序列的多核苷酸。

在本发明另一个方面，提供了多核苷酸，其包含来自于SEQ ID NO：2的26个核苷酸序列的至少17个邻接核苷酸。在一个实施方式中，所述多核苷酸包含来自于SEQ ID NO：2的至少18个邻接核苷酸。在进一步实施方式中，所述多核苷酸包含来自于SEQ ID NO：2的至少20个邻接核苷酸。在进一步实施方式中，所述多核苷酸包含来自于SEQ ID NO：2的至少22个邻接核苷酸。然而，在进一步实施方式中，所述多核苷酸包含来自于SEQ ID NO：2的至少24个邻接核苷酸。在再进一步实施方式中，本发明提供了包含SEQ ID NO：2序列的多核苷酸。

在本发明另一方面，提供了包含SEQ ID NO：7序列的上述多核苷酸。在本发明另一方面，提供了包含SEQ ID NO：21序列的上述多核苷酸。

在本发明另一方面，提供了一种包含多核苷酸的植物，该多核苷酸包含SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的至少17个邻接核苷酸。在一个实施方式中，所述植物包含SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的至少18个邻接核苷酸。在进一步实施方式中，所述植物包含SEQ ID NO：1和/或SEQ IDNO：2的至少20个邻接核苷酸。在进一步实施方式中，所述植物包含SEQ IDNO：1和/或SEQ ID NO：2的至少22个邻接核苷酸。在进一步实施方式中，所述植物包含SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的至少24个邻接核苷酸。然而，在进一步实施方式中，所述植物包含SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的序列。还是在进一步实施方式中，所述植物还包含SEQ ID NO：7序列。在另一个实施方式中，所述植物包含SEQ ID NO：21序列。在本发明一个实施方式中，所述植物是棉花植物。在进一步实施方式中，所述植物是作为COT102事件的杀虫棉花植物，或者来源于它的植物。

本领域技术人员熟悉植物转化方法。特别地，已经在广泛植物物种中表征了两种主要的技术：通过农杆菌属(Agrobacterium)的转化和通过直接DNA转移的转化。

农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化是用于双子叶植物转化的常用方法。将要引入到植物中的外源DNA克隆到双元载体的左和右边界共有序列之间。这是T-DNA区。双元载体被转化到农杆菌属(Agrobacterium)细胞中，随后，该农杆菌属(Agrobacterium)细胞用于感染植物组织。包含外源DNA的载体T-DNA区被插入到植物基因组中。标记基因盒和性状基因盒可以存在于相同载体中的相同T-DNA区上，不同T-DNA区上，或者甚至是不同载体中的不同T-DNA区上。在本发明的一个实施方式中，这些盒子存在于相同T-DNA区上。

做为可替代方案，直接DNA转移可以用于将DNA直接引入到植物细胞中。直接转移的一个适合方法可以是利用基因枪，用包含插入用DNA的载体轰击植物细胞(粒子介导的生物弹击转化)；另一种确立的方法是‘whiskers’，其包括将DNA包被到刺穿细胞的碳化硅纤维上。转化植物细胞的其它方法包括原生质体转化(可选地在聚乙二醇存在的情况下)；在包含多核苷酸或载体的介质中超声处理植物组织、细胞或原生质体；多核苷酸或载体显微插入到植物材料中(可选地利用已知的碳化硅‘whiskers’技术)，电穿孔等等。

转化后，必须从转化的植物组织再生转基因植物，并且利用适合的标记诸如潮霉素抗性标记选择具有外源DNA的后代。本领域技术人员熟悉适当再生介质的组成。

如这里所述，本发明这方面的植物对来自于实夜蛾属(Heliothissp.)，Helicoverpa sp.和贪夜蛾属(Spodoptera sp.)的一个或多个物种的、可能侵袭该植物的昆虫具有杀虫作用。这里所用的“侵袭”指一种或多种昆虫以任何方式的攻击、进食或损害。因此，例如，本发明植物将提供抗害虫昆虫诸如谷实夜蛾(Helicoverpa zea)侵袭的自卫机制。结果，与相同品种非转基因棉花植物比较，在所述植物栽培期间需要减少数量的杀虫喷雾剂。并且昆虫害虫造成的产量损失保持在最小水平。

本发明不限于COT102事件本身，而是进一步延及包括来源于其的任何植物材料，包括种子，只要它们含有至少一种本发明多核苷酸。本发明包括但不限于来源于与COT102事件育种杂交的植物，或者通过常规育种或其它方法由此来源的衍生物。本发明也包括来源于COT102事件的植物材料，该植物材料与COT102事件比较，可以包含另外的、修饰的或较少的多核苷酸序列，或者显示其它的表型特征。例如，可能期望转化来源于COT102事件的植物材料以产生具有另外性状诸如第二昆虫抗性基因的新事件。这个方法称为基因堆积(gene stacking)。第二个昆虫抗性基因可以编码例如来源于苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophilus)，发光光杆状菌(Photorabdusluminescens)物种的杀虫凝集素，杀虫蛋白酶抑制剂和杀虫蛋白质。

优选地，第二个昆虫抗性基因编码来源于细菌苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的Cry基因，该Cry基因产生具有和VIP不同的作用方式或昆虫肠道中的结合位点的毒素用以控制不同的昆虫物种。本发明进一步提供了来源于COT102事件的植物材料，该植物材料具有另外的性状诸如除草剂抗性、线虫抗性或真菌抗性。在一个实施方式中，所述另外性状是除草剂抗性。在进一步实施方式中，所述除草剂抗性性状提供了对包含草甘膦酸或农业学上可接受的其盐的除草剂的抗性。还是在进一步实施方式中，由编码EPSP合酶或其突变体的基因提供所述的除草剂抗性性状。

本发明进一步提供了控制昆虫的方法，该方法包括在所述昆虫取食地点，提供来源于COT102事件的植物材料。本发明进一步提供了控制昆虫的方法，该方法包括在所述昆虫取食地点，提供来源于COT102事件的植物材料，并且给所述植物材料施用其它农用化学品诸如除草剂、杀真菌剂和包括其它杀虫蛋白质的其它杀虫化合物。可能的杀虫化合物的例子包括杀虫凝集素、杀虫蛋白酶抑制剂和来源于苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)，嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophilus)或发光光杆状菌(Photorabdus luminescens)物种的杀虫蛋白质。可能的化学药品的例子包括合成除虫菊酯类、氨基甲酸酯类、吡虫啉、有机氯制剂和大分子诸如多杀菌素，阿维菌素或依马菌素。

然而，根据本发明的另一方面，本发明提供了检测来源于COT12转基因事件的植物材料的方法，该方法包括获得用于分析的样品；从样品提取DNA；提供设计用于结合多核苷酸的引物对，该多核苷酸包含SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的至少17个邻接核苷酸；扩增位于引物结合位点之间的区域；并且检测扩增产物的存在。因为可以得到SEQ ID NOs1和2，所以可以利用分子生物学领域技术人员熟知的参数，设计该检测方法中使用的适合引物对。例如，可以将引物对的1个或2个引物设计成载体特异性，性状基因特异性，启动子特异性的，或者对插入DNA和基因组DNA之间连接处序列特异和/或标记特异性的。在一个实施方式中，所述引物序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所描述。

在本发明一个实施方式中，用所述方法扩增的区域(“扩增子”)长度是在300和1000碱基对之间。在进一步实施方式中，扩增子长度是在500和900碱基对之间。还是在进一步实施方式中，扩增子长度是800碱基对。在进一步实施方式中，利用上述方法，联合序列SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4引物产生了扩增子，并且其长度是800碱基对。

可以联合使用以检测COT102事件的可替代引物包括对COT102事件特异并且产生962bp扩增子的SEQ ID NOs 18和19，对VIP基因特异并且产生556bp扩增子的SEQ ID NOs 22和23，或者对赋予对抗生素潮霉素抗性的基因特异并且产生367bp扩增子的SEQ ID NOs 24和25。

根据本发明的这方面，有许多可以使用的扩增方法。基本的原理，本领域技术人员已知的技术，是聚合酶链式反应(PCR)。典型地在利用琼脂糖凝胶电泳大小分离后，通过用溴化乙锭染色和用UV光激发可以观察来自于该PCR反应的扩增产物。

本发明的一个实施方式利用了PCR原理的变型诸如TaqMan^TM。这种方法包括用荧光染料标记参与扩增过程的至少一个引物。当未结合时，引物采取检测不到荧光的构象。然而，当引物结合一段DNA时，构象改变，并且可以检测到荧光。用这种方式，可以实时监测扩增过程，荧光的强度直接对应于扩增的水平。本发明的进一步实施方式包括，但不限于RACE PCR。

本发明的进一步实施方式包括利用多重PCR(multiplex PCR)区分纯合COT102植物材料和杂合COT102植物材料。本领域技术人员称之为接合性测试(zygosity testing)，并且其包括结合棉花基因组和/或插入DNA的特定部分的3种PCR引物的使用。用在这种接合性测试中的适合引物被描述为SEQ ID NOs 18到20。

本发明的另一个方面提供了检测来源于COT102事件的植物材料的方法，该方法包括获得用于分析的样品；提供探针，该探针被设计成当多核苷酸是单链时结合所述多核苷酸的互补序列，该多核苷酸包含SEQ IDNO：1和/或SEQ ID NO：2的至少17个邻接核苷酸；杂交所述探针和样品；并且检测该探针是否已经杂交。在一个实施方式中，所述探针包括SEQ IDNO：1和/或SEQ ID NO：2序列。在本发明一个实施方式中提供了利用选自SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的探针，检测来源于COT102事件的植物材料的方法。在一个实施方式中，所述探针包含SEQ ID NO：5。在进一步实施方式中，所述探针由SEQ ID NO：5组成。例如，探针可以是PCR产物或限制消化片段。在进一步实施方式中，可以用荧光、放射性、酶性或其它适合的标记标记这里所述的探针，以能够检测到杂交。由于本领域技术人员已经从本公开受益，所以他们将知道如何设计适合的引物。

在本发明进一步实施方式中，提供了在严格条件下杂交探针和样品，并且检测探针是否已经杂交的方法。严格杂交条件是本领域技术人员所熟知的，并且包括，例如在约65℃，在含有6x SSC，0.01％SDS和0.25％脱脂奶粉的溶液中杂交，接着在相同的温度，在含有0.2x SSC和0.1％SDS的溶液中洗涤。

基于杂交原理，用于检测来源于COT102事件的植物材料的适合技术包括但不限于Southern印迹，Northern印迹和原位杂交。本领域技术人员熟悉这些技术。

典型地，这些技术包括温育探针和样品，洗涤以移除未结合的探针和检测探针是否已经杂交。所述的检测方法取决于探针所附标记的类型，例如，通过X光片曝光和显影可以检测放射性标记的探针。做为可替代的方案，通过底物转化实现颜色变化可以检测酶标记的探针。

在本发明的进一步方面，提供了检测来源于COT102事件的植物材料的方法，该方法包括获得用于分析的样品；提供设计的抗体，该抗体可结合植物中所包含的VIP蛋白质，该植物包含来源于SEQ ID NO：1和/或SEQID NO：2的至少17个邻接核苷酸；温育所述的抗体和样品；检测是否该抗体已经结合。在本发明的一个实施方式中，所述VIP蛋白质包含SEQ IDNO：8序列。

基于所述抗体结合，检测来源于COT102事件的植物材料的适合方法包括，但不限于Western印迹，酶联免疫吸附测定法(ELISA)和SELDI质谱分析。本领域技术人员熟悉这些免疫学技术。典型的步骤包括：温育样品和结合VIP蛋白质的抗体，冲洗以移除未结合的抗体，和检测是否抗体已经结合。许多这种检测方法是基于酶促反应的，例如可以用酶诸如辣根过氧化物酶标记抗体，并且在应用适合的底物后，检测颜色改变。适合的抗体可以是单克隆或多克隆抗体。

在本发明的另一方面，提供了检测来源于COT102事件的植物材料的方法，该方法包括获得用于分析的样品；制备样品的蛋白质提取物；提供设计用来检测样品中VIP蛋白质的存在的检测条；温育检测条和样品；和检测VIP蛋白质是否存在。在本发明的一个实施方式中，所述VIP蛋白质包含SEQ ID NO：8序列。

用于COT102的可替代的基于抗体的检测方法利用测量棒(dipsticks)或检测条。典型的步骤包括温育检测条和样品，并且观察检测条上存在或不存在有色条带。有色条带表明样品中蛋白质的存在。这种测量棒(dipsticks)或检测条检测是蛋白质特异性的，并且可以用于田地中样品的快速检测。

在本发明的进一步方面，提供了检测来源于COT102事件的植物材料的方法，该方法包括获得用于分析的样品；使物种草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)(对VIP3A敏感)的一个或多个昆虫暴露于样品；使物种欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)的一个或多个昆虫暴露于样品，做为对照；检测是否样品对来源于每个物种的昆虫具有杀虫作用；并且比较该结果和真实的COT102生物测定模式(bioassay profile)。利用相同条件的昆虫产生真实COT102生物测定模式，其中，将该昆虫暴露于相同剂量和类型COT102植物材料，并且在将昆虫暴露于COT102样品后相同长度的时间检测杀虫作用。草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)是COT102阳性对照，因为它对适合剂量的VIP3A敏感，而欧洲玉米螟(Ostrinianubilalis)是阴性对照，因为它对适合剂量的VIP3A不敏感。

在本发明一个实施方式中，检测来源于COT102事件的植物材料的方法包括但不限于叶片饲喂的生物测定法，其中用一种或多种害虫昆虫侵袭COT102事件或者来源于COT102事件的任何植物材料的叶片或其它适合的植物部分。通过在给定时间期间后估测叶片或植物部分的损害，估测死亡率或对昆虫的另一种杀虫作用可以进行检测。可以用于这种生物测定的可替代植物部分包括棉铃和棉蕾。可以在田地或温室中进行这种生物测定，并且可以经历天然或人工昆虫侵袭。

在本发明另一方面，本发明提供了试剂盒(kit of parts)，其包含用于检测样品中来源于COT102事件的植物材料存在的手段(means)。优选地，所述试剂盒包含用于检测样品中多核苷酸或上述多核苷酸编码的蛋白质或VIP蛋白质存在的手段，该多核苷酸包含来源于SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的至少17个邻接核苷酸。在本发明的实施方式中，所述试剂盒可以包含DNA扩增检测技术诸如PCR或TaqMan^TM。在本发明的进一步实施方式中，所述试剂盒可以包含探针杂交检测技术诸如Southern印迹，Northern印迹或原位杂交。在本发明另一个实施方式中，所述试剂盒可以包含抗体结合检测技术诸如Western印迹，ELISAs，SELDI质谱分析或检测条。在本发明的进一步实施方式中，所述试剂盒可以包含昆虫生物测定检测技术诸如叶片饲喂生物测定或死亡率生物测定。在本发明进一步实施方式中，所述试剂盒可以包含上述检测技术的任意组合。还是在进一步实施方式中，所述试剂盒可以以说明书形式包含上述一种或多种方法。

实施例

通过下面非限制性实施例结合下面有关序列表，本发明将更清楚明了。

SEQ ID NO 1：延伸越过下述连接处的多核苷酸序列，在事件COT102中，COT102插入片段5’末端在该连接处插入到棉花基因组中。

SEQ ID NO 2：延伸越过下述连接处的多核苷酸序列，在COT102事件中，COT102插入片段3’末端在该连接处插入到棉花基因组中。

SEQ ID NO 3-4：适于用做COT102事件检测引物的多核苷酸序列。

SEQ ID NO 5-7：适于用做COT102事件检测探针的多核苷酸序列。

SEQ ID NO 8：VIP3A毒素蛋白质的氨基酸序列。

SEQ ID NOs 9-17：适于用做COT102事件检测中的TaqMan引物的多核苷酸序列。

SEQ ID NOs 18-20：适于用做通过接合性测试检测COT102事件的引物的多核苷酸序列。

SEQ ID NO 21：表征COT102事件的多核苷酸序列。

SEQ ID NOs 22-25：适于用做COT102事件检测引物的多核苷酸序列。

实施例1：克隆和转化

1.1载体克隆

使用从自制载体限制消化和片段连接的标准基因克隆技术构建转化载体pNOV3001。该载体包含选择性标记盒，该标记盒包含泛素(UBQ3)启动子、UBQ3内含子、编码赋予潮霉素抗性的蛋白质的基因序列和nos聚腺苷酸化序列。该载体也包含靶基因表达盒，该表达盒包含肌动蛋白(Act2)启动子、Act2内含子、密码子已经被优化用于玉米中表达的编码VIP3A基因的序列和nos聚腺苷酸化序列。选择性标记盒和包含VIP3A的盒子被克隆到载体pNOV3001的T-DNA区中，位于左和右边界序列之间。为了进行原核生物筛选，该载体也包含赋予对抗生素，壮观霉素抗性的基因。

利用标准农杆菌属(Agrobacterium)转化技术，将该载体转化到根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系EHA101中，并且通过转化细胞对壮观霉素的抗性筛选它们。

1.2植物转化

通过农杆菌介导的陆地棉栽培品种Coker312(Gossypium hirsutum L.cv Coker 312)转化产生COT102事件。

利用足以覆盖要消毒种子量的乙醇，在70％乙醇中对Coker 312种子进行表面消毒30秒。用乙醇洗种子，在无菌水中漂洗，并且浸泡在12％Clorox+吐温20溶液中20分钟。进行3次这种洗涤程序。然后，将种子放置在发芽培养基上(Stewart和Hsu，1977)，并且允许在30℃萌发7-10天。

在适合的抗生素中过夜培养2ml含有pNOV3001构建体的农杆菌培养物，然后在无菌培养皿中用MSNH培养基(19∶1)稀释。将下胚轴切割成6-8mm长，并且放置在稀释的农杆菌溶液中至少30秒。从农杆菌溶液中移走下胚轴外植体，在无菌滤纸上吸干以除去过量的细菌。将下胚轴放置在T2培养基(MS盐，B5维生素，0.1mg/L 2，4-D，0.5mg/L细胞分裂素，30g/L葡萄糖，2g/L Phytagel-pH5.8)上，并且在黑暗中与农杆菌共培养72小时。

再一次在无菌滤纸上吸干下胚轴外植体，并且转移到含有MS2NK培养基(MS盐，B5维生素，2mg/L NAA，0.1mg/L细胞分裂素，30g/L葡萄糖，2g/L Phytogel，500mg/L头孢噻肟，10mg/L潮霉素-pH 5.8)的平板上。用parafilm包裹该平板，并且在30℃，在光照下温育几个月直到形成愈伤组织。

将愈伤组织分割得尽可能地小，并且放置在含有10ml液体MSNH培养基(MS盐，B5维生素，30g/L葡萄糖-pH 5.8)的50ml锥形瓶中。在30℃，在光照下，以110rpm振荡悬浮的愈伤组织直到可以观察到小白色稍微圆形的细胞簇为止。洗细胞，并且铺在固体MSNH培养基(MS盐，B5维生素，30g/L葡萄糖，2g/L Phytogel-pH 5.8)平板上。每月检查平板的体细胞胚发育。

从平板挑取成熟的体细胞胚，并且放置在含有SA培养基(Stewart和Hsu盐，20g/L蔗糖，20g/L琼脂-pH 5.8)的平板上。将胚平板放置在黑暗中大约14天。修剪成熟胚的根，并且将胚转移到SGA培养基(Stewart和Hsu盐，5g/L蔗糖，1.5g/L Phytagel，5g/L琼脂-pH 6.8)。

第一片真叶出现后，将年幼的植物移到含有SGA培养基的小型罐头瓶中。当植物达到7-10cm高度时，切下顶部，并且转移到另一个罐头瓶中。当发育出良好的根系时，将这样生根的插条移植到盆中，并且在温室中培养。

1.3转基因学的鉴定和筛选

用PCR筛选推定的转基因植物的VIP3A基因的存在。利用抗草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的杀昆虫活性通过昆虫生物测定法鉴定和筛选阳性事件(参见实施例7)。通过TaqMan^TM分析表征杀昆虫品系的拷贝数(参见实施例2)。在田间试验中观察来源于3个单拷贝&2个双拷贝事件的T1种子的昆虫抗性和农艺学性状。根据具有单拷贝转基因、通过ELISA鉴定到的良好蛋白质表达(参见实施例4)、抗谷实夜蛾(Helicoverpa zea)的良好杀昆虫活性和田间性能，选定了两个事件COT101和COT102。在田间试验第二年末，比较两个事件的结果，COT102是进步的。

1.4COT102序列的证实

从COT102事件分离基因组DNA。利用该基因组DNA，利用标准DNA测序技术，测序在COT102事件中DNA插入位点和棉花基因组DNA的连接处。

实施例2：用TaqMan^TM进行COT102检测

2.1DNA提取

利用Wizard^TM Magnetic 96 DNA植物系统(Promega，#FF3760)，根据制造商的说明书，从叶片组织提取DNA，同时在开始该方法前进行下面附加的步骤：研磨叶片材料后，向每个孔添加0.9ml棉花提取缓冲液(0.2MTris pH 8.0，50mM EDTA，0.25M NaCl，0.1％v/v 2-巯基乙醇，2.5％w/v聚乙烯-吡咯烷酮)，重悬浮植物组织，以4,000rpm(2755g)离心该板10分钟。吸取和弃掉上清液后，添加300μl裂解缓冲液A(Promega)，并且从这点以后利用制造商的方案。该方法产生了大约85μl纯化的基因组DNA，浓度大约是10ng/μl。

2.2TaqMan PCR反应

利用标准反应混合物建立TaqMan^TM PCR反应，该反应混合物包含：

625μl 2x用于Q-PCR的Jumpstart Master Mix(Sigma，#P2893)，补加有15mM MgCl₂和200nM Strata-ROX

25μl 50x FAM引物/探针混合物

25μl 50x TET引物/探针混合物

200μl 水。

50x引物/探针混合物包含1mM浓度的每种引物各45μl，100μM浓度的探针50μl和860μl 1x TE，并且在4℃，贮藏在琥珀试管中。所使用的适宜引物/探针序列组合的例子是：

引物名称引物序列5’-3’ SEQ ID

GhCHI2b-F GGTCCCTGGATACGGTGTCA SEQ ID NO：9

正向

GhCHI2b-R TTGAGGGTTGGATCCTTTGC SEQ ID NO：10

反向

GhCHI2b-TET CCAACATCATCAATGGTGGCATCGAAT SEQ ID NO：11

探针 (5’标记＝TET，3’标记＝TAMRA)

潮霉素-F CAGGCAGGTCTTGCAACGT SEQ ID NO：12

正向

潮霉素-R CGAGAGCCTGACCTATTGCAT SEQ ID NO：13

反向

潮霉素-FAM ACACCCTGTGCACGGCGGG SEQ ID NO：14

探针 (5’标记＝FAM，3’标记＝TAMRA)

Vip3-F ATGAAGACCCTGCGCTACGA SEQ ID NO：15

正向

Vip3-R ACGCCCAGTGGCATGTAGA SEQ ID NO：16

反向

Vip3-FAM AGCGAGGCCGAGTACCGCACC SEQ ID NO：17

探针 (5’标记＝FAM，3’标记＝TAMRA)

将7μl Master Mix分配到384孔TaqMan^TM测定板的每个孔中。向适合的孔添加3μl DNA模板。将3μl拷贝对照稀释系列添加到特定孔中做为对照。利用下面的循环条件，在ABI7900(Applied Biosystems)中进行反应：

步骤温度时间

1 50℃ 2分钟

2 95℃ 10分钟

3 95℃ 15秒

4 60℃ 1分钟

5 回到步骤3，重复40次

利用SDS2.0软件(Applied Biosystems)分析数据。

实施例3：通过PCR进行COT102检测

3.1基因组DNA提取

如实施例2.1中所述从COT102提取基因组DNA。

3.2多重PCR接合性测定

设计PCR引物以结合COT102盒插入位点上游的棉花基因组DNA序列(SEQ ID NO：18)；COT102盒序列本身(SEQ ID NO：19)；和插入COT102序列时置换的棉花基因组DNA序列(SEQ ID NO：20)。当存在COT102插入片段时，引物对SEQ ID NO：18和19扩增962bp大小的PCR片段。对于每个待检测的样品建立如下50μl PCR反应：

1x JumpState ReadyMix REDTaq PCR(SigmaP-1107) 25μl

40pmole引物1(SEQ ID NO：18) 4μl

40pmole引物2(SEQ ID NO：19) 4μl

40pmole引物3(SEQ ID NO：20) 4μl

40ng基因组DNA 4μl

ddH₂O 9μl

在热循环仪中94℃加热PCR反应物2分钟，接着进行下面的35个循环：94℃，30秒，60℃，30秒，72℃，1分钟。通过在72℃加热5分钟完成反应。

3.3分析

在琼脂糖凝胶上电泳PCR反应物，并且用溴化乙锭染色后，在UV光下观察DNA条带。3条条带的存在表明样品是COT102纯合植物；2条带(其中一条带是962bp大小)表明样品是COT102杂合植物；2条带(没有962bp大小的条带)表明样品是纯合野生型棉花植物。

3.4事件特异性PCR

设计一种PCR引物以结合VIP3A基因的3’末端(SEQ ID NO：3)。设计另一种PCR引物以结合COT102插入位点3’末端下游的侧翼基因组DNA序列的互补链(SEQ ID NO：4)。利用COT102基因组，在PCR反应中一起使用这些引物，产生800bp片段扩增物。当该引物用在利用Coker312未转化棉花基因组DNA样品的PCR反应中时，没有片段被扩增。

在第二对引物中，设计一种引物以结合潮霉素基因(SEQ ID NO：19)，并且设计另一种引物以结合COT102插入位点5’末端上游的侧翼基因组DNA序列(SEQ ID NO：18)。在利用COT102基因组DNA的PCR反应中一起使用这些引物，产生962bp片段扩增物。当该引物用在利用Coker 312未转化棉花基因组DNA样品的PCR反应中时，没有片段被扩增。

实施例4：通过Southern印迹进行COT102检测

4.1用于Southern印迹的DNA提取

利用研钵和研杵，在液氮中研磨大约5到10g植物组织。在12.5ml提取缓冲液A(0.2M Tris pH 8.0，50mM EDTA，0.25M NaCl，0.1％v/v β-巯基乙醇，2.5％w/v聚乙烯-吡咯烷酮)中重悬浮植物组织，以4,000rpm离心10分钟(2755g)。弃掉上清液后，在2.5ml提取缓冲液B(0.2M TrispH8.0，50mM EDTA，0.5M NaCl，1％v/v β-巯基乙醇，2.5％w/v聚乙烯-吡咯烷酮，3％肌氨酰，20％乙醇)中重悬浮沉淀，并且在37℃温育30分钟。在温育期间，用无菌环混合样品一次。温育后，添加等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，通过倒置轻轻混合，以4,000rpm离心20分钟。收集含水层，并且在添加0.54体积异丙醇后以4,000rpm离心5分钟以沉淀DNA。弃掉上清液，并且在500μl TE中重悬浮DNA沉淀。为了降解任何存在的RNA，在37℃，将DNA和1μl 30mg/ml RNAase A温育30分钟，以4,000rpm离心5分钟，并且在0.5体积7.5M醋酸铵和0.54体积异丙醇存在的情况下，通过以14,000rpm离心10分钟沉淀DNA。弃掉上清液后，用500μl 70％乙醇洗沉淀，并且使其干燥后在100μl TE中重悬浮。

4.2限制酶消化

利用分光光度计或荧光计定量DNA(利用1xTNE和Hoechst染料)。在总体积50μl中，每次消化利用8μg DNA，制备适宜的酶消化产物。消化包括BamHI，EcoRI，EcoRV，HindIII，NcoI，SacI，ScaI，SpeI和PstI的单独和组合。特别地，BamHI和EcoRI双消化用于检测VIP3A基因的完整性；BamHI和EcoRV双消化用于检测VIP3A基因座数和潮霉素基因的完整性；BamHI单消化用于检测VIP3A基因座数量。对于每种酶，在适当的温度下温育过夜消化物。以真空离心蒸发浓缩器(speed vacuum)旋转样品以减少体积到30μl。

4.3凝胶电泳

向来源于上述4.2的每个样品添加溴酚蓝加样染料，并且将每个样品加样到含有溴化乙锭的0.8％TBE琼脂糖凝胶上。在60伏特下电泳凝胶过夜。

在0.25M HCl中洗凝胶15分钟以使DNA脱嘌呤，然后用水洗。设定Southern印迹如下：在盘中放置20张厚的干燥印迹纸，其上再放置4张薄的干燥印迹纸。在0.4M NaOH中预先湿润1张薄印迹纸，并且放置在该堆纸上，接着放置也在0.4M NaOH中预先湿润的1张Hybond-N+转移膜(Amersham Pharmacia Biotech，#RPN303B)。凝胶置放在上部确保在凝胶和膜之间没有气泡。3张另外预先浸泡的印迹纸被放置在凝胶上部，并且用0.4M NaOH填满缓冲液盘。用预先浸泡在0.4M NaOH中的灯芯连接凝胶堆层和缓冲液盘，开始DNA转移到膜上。在室温下进行大约4小时的DNA转移。转移后，在2x SSC中漂洗Hybond膜10秒，DNA通过UV交联与膜结合。

4.4杂交

用PCR制备适合的DNA探针。在4μl TE中煮沸25ng探针DNA 5分钟，放置在冰上7分钟，然后转移到Rediprime II(Amersham PharmaciaBiotech，#RPN1633)试管中。向Rediprime试管添加5μl P32标记的dCTP后，在37℃温育探针15分钟。根据制造商的说明书，通过微离心G-50柱子(Amersham Pharmacia Biotech，#27-5330-01)离心，以移除未掺入的dNTPs，纯化该探针。利用闪烁计数仪测量探针活性。

通过在65℃用20ml预加温的Church预杂交溶液(500mMNaPO₄，1mMEDTA，7％SDS，1％BSA)湿润该Hybond膜30分钟，预杂交该Hybond膜。煮沸标记的探针5分钟，并且放置在冰上10分钟。向预杂交缓冲液添加适合量的探针(每1ml预杂交缓冲液1百万次计数)，在65℃过夜进行杂交。第二天，弃掉杂交缓冲液，在用20ml Church冲洗溶液1(40mMNaPO₄，1mM EDTA，5％SDS，0.5％BSA)漂洗后，在65℃，在150ml Church冲洗溶液1中洗膜20分钟。用Church冲洗溶液2(40mMNaPO₄，1mM EDTA，1％SDS)重复该过程2次。将该膜暴露于磷光屏或X光片以检测探针结合的位置。

实施例5：通过ELISA进行COT102检测

5.1蛋白质提取

收获用于分析的棉花植物组织，并且在-70℃冷冻。将新鲜组织研磨成细粉末，并且称重，放入标记的聚丙烯试管中。对于新鲜组织以2∶1比率(提取缓冲液体积：样品鲜重)，或者对于冻干组织以30∶1比率(提取缓冲液体积：样品干重)，向样品添加提取缓冲液(100mM Tris，100mM硼酸钠，5mMMgCl₂，0.05％吐温20，0.2％抗坏血酸钠，水，pH7.8，1mMAEBSF，0.001mM亮抑酶肽)。利用装配有PTA 10TS减少泡沫发生器的Brinkman PT10/35 Polytron漩涡样品和匀浆，直到混合物变成液态为止。以10,000xg离心提取物15分钟。蛋白质提取物上清液贮藏在2-8℃。

5.2ELISA方法

ELISA方法使用了下面的标准技术。在乙醇中浸泡96孔板2小时，并且空气干燥。用每孔50μl山羊抗VIP3A抗体包被该板，并且在2-8℃过夜温育。用1X ELISA冲洗缓冲液(100mM Tris，0.5％吐温-20，75mM NaCl，pH8.5)冲洗3次后，通过简单地在纸巾上倒置轻拍，干燥该板。向每孔添加150μl封闭溶液(10mM NaPO₄，140mM NaCl，1％BSA，0.02％叠氮化钠，用单碱价的NaPi和二碱价的NaPi滴定到pH7.4)，接着在室温下温育45分钟。如上所述冲洗该板3次。

VIP3A标准和蛋白质提取物样品一式三份地施用到该板的适合孔中，每孔50μl总体积。在2-8℃温育该板1小时30分钟，接着室温下进一步温育30分钟。用ELISA冲洗溶液冲洗该板3次，然后在35-39℃与每孔50μl兔抗VIP3A抗体温育1小时。用ELISA冲洗缓冲液冲洗该板3次，并且在室温下与每孔50μl驴抗兔碱性磷酸酶温育30分钟。接着，用ELISA冲洗溶液再冲洗3次，向每孔添加50μl磷酸酶底物溶液，并且在室温下温育该板30分钟。通过向每孔添加50μl 3M NaOH终止反应。在405nm，利用Ceres 900C多孔板读数器测量每孔中溶液的吸光度，利用KC3曲线拟合软件(Bio-Tek Instruments Inc.)分析结果。通过参照VIP3A蛋白质标准品，计算样品中VIP3A的浓度。

实施例6：通过测量棒(dip stick)进行COT102检测

6.1蛋白质提取

将约2cm2的一片叶片组织放置在含有提取缓冲液的试管中。通过用塑料搅拌器切割和浸解(mascerate)组织，从组织提取蛋白质。

6.2测量棒检测

检测条被放置在试管中，并且温育5-10分钟以产生结果。检测条包含抗VIP3A抗体结合的第一条带，和对照抗体结合的第二条带。温育后，检测条结果视窗中双红色线表明存在VIP3A。下边的线表明Vip3A蛋白质的存在，而下边的线是对照，表明该检测方法正确地工作。

实施例7：通过昆虫生物测定进行COT102检测

7.1叶片生物测定

按如下所述，对草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)，谷实夜蛾(Helicoverpa zea)和烟蚜夜蛾(Heliothis virescens)进行叶片测定：用300μl到500μl蒸馏水浸泡垫片，并且放置在Gelman皿中。从8到12英寸高的棉花植物切下测量的约0.5平方英寸到0.75平方英寸之间的叶片，并且放置在垫片上。在每个皿中放置8到10条昆虫幼虫，用盖子盖住该皿。在28℃温育该皿。在侵袭后第3和第6天，计数每个皿中叶片的损害，并且与对照植物比较。

7.2棉铃生物测定

用水饱和4个吸水垫，并且放置在大塑料杯里面。每个用100μl蒸馏水浸泡的另外3个厚玻璃滤器放置在小玻璃杯中，该小玻璃杯装在大玻璃杯里面。切下1.25英寸长的棉铃，浸入在10mg/ml到20mg/ml制霉菌素(Nystatin)中，并且放置在小玻璃杯中滤器上。将50条昆虫幼虫放置在棉蕾或棉铃上，并且用盖子盖上大玻璃杯。7天后，用外加50条幼虫再次侵袭棉蕾或棉铃。

在室温下温育该试验大约3周。然后切开棉铃以检测损害。将棉铃的损害与对照样品比较。

7.3冻干叶片生物测定

如下，利用冷冻干燥的叶组织，对烟蚜夜蛾(Heliothis virescens)进行生物测定：

在摘取叶片时，在干冰上快速冷冻末端叶，并且过夜冻干。在研钵和研杵中将冷冻干燥的组织研磨成细粉末，并且重悬浮在0.2％琼脂溶液中以制备8％(0.08g/ml)叶粉末悬浮液。将悬浮液覆盖在96孔板中人工昆虫饵料上面，并且让其干燥。向每个孔放入单条新生昆虫幼虫，并且密封该板。在28℃，温育该板。在侵袭后第6天，计数幼虫的死亡率，并且与对照样品比较。所获得的结果如下：

品种	％叶粉末悬浮液	％幼虫死亡率(5次检测的平均值)
品种	％叶粉末悬浮液	％幼虫死亡率(5次检测的平均值)	Coker312	8	6.7
COT102	8	98.3	Coker312	8	6.7

序列表

<110>SYNGENTA LIMITED

<120>COT102杀虫棉花

<130>70159

<160>25

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>COT102核苷酸基序

<400>1

ggcaaatatt caggtaaaca aattga

26

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>COT102核苷酸基序

<400>2

ctatcagtgt ttaataaata tgggca

26

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>COT102核苷酸基序

<400>3

aaggacgtga gcgagatgtt

20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>COT102核苷酸基序

<400>4

tgtgacaccg atccacctaa

20

<210>5

<211>290

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>COT102核苷酸基序

<400>5

gacaaggaca gcttgagcga ggtgatctac ggcgacatgg acaagctgct gtgtccggac

60

cagagcgagc aaatctacta caccaacaac atcgtgttcc cgaacgagta cgtgatcacc

120

aagatcgact tcaccaagaa gatgaagacc ctgcgctacg aggtgaccgc caacttctac

180

gacagcagca ccggcgagat cgacctgaac aagaagaagg tggagagcag cgaggccgag

240

taccgcaccc tgagcgcgaa cgacgacggc gtctacatgc cactgggcgt

290

<210>6

<211>347

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>COT102核苷酸基序

<400>6

cgccgtgcac agggtgtcac gttgcaagac ctgcctgaaa ccgaactgcc cgctgttctg

60

cagccggtcg cggaggccat ggatgcgatc gctgcggccg atcttagcca gacgagcggg

120

ttcggcccat tcggaccgca aggaatcggt caatacacta atggcgtgat ttcatatgcg

180

cgattgctga tccccatgtg tatcactggc aaactgtgat ggacgacacc gtcagtgcgt

240

ccgtcgcgca ggctctcgat gagctgatgc tttgggccga ggactgcccc gaagtccggc

300

acctcgtgca cgcggatttc ggctccaaca atgtcctgac ggacaat

347

<210>7

<211>7474

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>COT102核苷酸基序

<400>7

gtaaacaaat tgacgcttag acaacttaat aacacattgc ggacgttttt aatgtacgcc

60

atgctggccg cccggggtac ccaattcccg atctagtaac atagatgaca ccgcgcgcga

120

taatttatcc tagtttgcgc gctatatttt gttttctatc gcgtattaaa tgtataattg

180

cgggactcta atcataaaaa cccatctcat aaataacgtc atgcattaca tgttaattat

240

tacatgctta acgtaattca acagaaatta tatgataatc atcgcaagac cggcaacagg

300

attcaatctt aagaaacttt attgccaaat gtttgaacga tcggggaaat tcggggatcc

360

cggtcggcat ctactctatt cctttgccct cggacgagtg ctggggcgtc ggtttccact

420

atcggcgagt acttctacac agccatcggt ccagacggcc gcgcttctgc gggcgatttg

480

tgtacgcccg acagtcccgg ctccggatcg gacgattgcg tcgcatcgac cctgcgccca

540

agctgcatca tcgaaattgc cgtcaaccaa gctctgatag agttggtcaa gaccaatgcg

600

gagcatatac gcccggagcc gcggcgatcc tgcaagctcc ggatgcctcc gctcgaagta

660

gcgcgtctgc tgctccatac aagccaacca cggcctccag aagaagatgt tggcgacctc

720

gtattgggaa tccccgaaca tcgcctcgct ccagtcaatg accgctgtta tgcggccatt

780

gtccgtcagg acattgttgg agccgaaatc cgcgtgcacg aggtgccgga cttcggggca

840

gtcctcggcc caaagcatca gctcatcgag agcctgcgcg acggacgcac tgacggtgtc

900

gtccatcaca gtttgccagt gatacacatg gggatcagca atcgcgcata tgaaatcacg

960

ccatgtagtg tattgaccga ttccttgcgg tccgaatggg ccgaacccgc tcgtctggct

1020

aagatcggcc gcagcgatcg catccatggc ctccgcgacc ggctgcagaa cagcgggcag

1080

ttcggtttca ggcaggtctt gcaacgtgac accctgtgca cggcgggaga tgcaataggt

1140

caggctctcg ctgaatgccc caatgtcaag cacttccgga atcgggagcg cggccgatgc

1200

aaagtgccga taaacataac gatctttgta gaaaccatcg gcgcagctat ttacccgcag

1260

gacatatcca cgccctccta catcgaagct gaaagcacga gattcttcgc cctccgagag

1320

ctgcatcagg tcggagacgc tgtcgaactt ttcgatcaga aacttctcga cagacgtcgc

1380

ggtgagttca ggctttttca tatcttattg cccccctaga gtcgagatcc acctgaaata

1440

aaacaataga acaagtagaa accaatcagc gaacatatac caaatcaaaa gccgtaagag

1500

aaatcaaaac aacaccaaag agaaacggat ctaaacataa gaaacctaaa acagagagaa

1560

tcgaacaaag aaaacacaaa aattgaatag atcgtccttg aaaatcctaa tttcacaatc

1620

aagcaagaaa ttacacagat gtaaacacta cgaatcgata tcttagtaat caggacaaaa

1680

tttagaagct ggattgacga aacgaacaat attgtcaaaa gcaatttata caaaagattc

1740

aataatccac ataacaaaaa ttggagatca gatacgaatc aaaaacaaaa agaatcagaa

1800

aatatacctt gaaagagaga gtcgcgagag atttgcagag atcgctttag gctttgggag

1860

agattgaaga gtcagaaaaa gacgaaagga tgaattatta tcttccacac gaaggtcttc

1920

tttatatcgc aaaccaaaag cccaaaaccg tcttttctat taatgagaat aaaatatctt

1980

tagccaaaac aaaaaaagga agatatcagt tgaggattat tatcacgaaa ctaaaggaag

2040

gaatcatatg atacgtgtca tattttccac cgtgcgtttt taaaagaccg actcaagtag

2100

aaacatccta tggtggtggt tggattaggt catccattac atctgcttca ctgacatttt

2160

tctatttttc tttttgtata tacttttcct caaataattt ctttcttttc tatagaagaa

2220

tttaatcaat aaggaaaaag ttcaaaaaag attctttcca ttaagactat gtcttggtta

2280

acccaaccca ttaagaataa gcaatcataa tatatataga gaatactaat actatatatg

2340

agatttttct tttaatttca tgttgattat gatagtttat cttcttgatt taatttatca

2400

atacttggca taaaagattc taatctactc taataaagaa aagaaaaaaa agtatctacc

2460

attgactaat taaaataagg aaacttatct accaaatttg agtatttttt agaacaatct

2520

ttttggttta attccaaaac tctaaaccta attgttggga aaaaggacct aatttttaag

2580

aaaagttaat aattagaaga tctgtatgtt tttttttgat ccaagttttt atttcttttc

2640

tctttttttc atgataaaat ctatgttttt ttagtctaca attaaagtaa ttgttattat

2700

tttctttatc tttttttgtt gttgttgtta attccctttt ttttttttaa cagcaacttc

2760

ttaaaaaaaa aaacagttgg gccttgaatt tatttcaggc ctgcgttatt aagcccagat

2820

aataactcaa aacaaaaaaa atgttgaacc ggaataaacc cgcgagatta aatgccggtt

2880

ttcaggtaac atagaagaag aatatatgag gattgaagaa gtattcaaga ggcggaacaa

2940

ttcacaagtc caagagctta aatttctcct cactcttctg ctacagactc ggaactcttt

3000

ctctttgcta aaataagatg ttcaggattt ttgttgcccg acaattcatg tatctcacac

3060

tctctctctt ctctgttctt actactctgt tacattacca ccaactcaag actttcttcc

3120

acaatggcgt ttatgagact tggctccaaa tccggtaccg gagctcgaat tcgaagcttg

3180

catgcctgca gtgatcacca tggtcgacaa aatttagaac gaacttaatt atgatctcaa

3240

atacattgat acatatctca tctagatcta ggttatcatt atgtaagaaa gttttgacga

3300

atatggcacg acaaaatggc tagactcgat gtaattggta tctcaactca acattatact

3360

tataccaaac attagttaga caaaatttaa acaactattt tttatgtatg caagagtcag

3420

catatgtata attgattcag aatcgttttg acgagttcgg atgtagtagt agccattatt

3480

taatgtacat actaatcgtg aatagtgaat atgatgaaac attgtatctt attgtataaa

3540

tatccataaa cacatcatga aagacacttt ctttcacggt ctgaattaat tatgatacaa

3600

ttctaataga aaacgaatta aattacgttg aattgtatga aatctaattg aacaagccaa

3660

ccacgacgac gactaacgtt gcctggattg actcggttta agttaaccac taaaaaaacg

3720

gagctgtcat gtaacacgcg gatcgagcag gtcacagtca tgaagccatc aaagcaaaag

3780

aactaatcca agggctgaga tgattaatta gtttaaaaat tagttaacac gagggaaaag

3840

gctgtctgac agccaggtca cgttatcttt acctgtggtc gaaatgattc gtgtctgtcg

3900

attttaatta tttttttgaa aggccgaaaa taaagttgta agagataaac ccgcctatat

3960

aaattcatat attttcctct ccgctttgaa ttgtctcgtt gtcctcctca ctttcatcag

4020

ccgttttgaa tctccggcga cttgacagag aagaacaagg aagaagacta agagagaaag

4080

taagagataa tccaggagat tcattctccg ttttgaatct tcctcaatct catcttcttc

4140

cgctctttct ttccaaggta ataggaactt tctggatcta ctttatttgc tggatctcga

4200

tcttgttttc tcaatttcct tgagatctgg aattcgttta atttggatct gtgaacctcc

4260

actaaatctt ttggttttac tagaatcgat ctaagttgac cgatcagtta gctcgattat

4320

agctaccaga atttggcttg accttgatgg agagatccat gttcatgtta cctgggaaat

4380

gatttgtata tgtgaattga aatctgaact gttgaagtta gattgaatct gaacactgtc

4440

aatgttagat tgaatctgaa cactgtttaa ggttagatga agtttgtgta tagattcttc

4500

gaaactttag gatttgtagt gtcgtacgtt gaacagaaag ctatttctga ttcaatcagg

4560

gtttatttga ctgtattgaa ctctttttgt gtgtttgcag ctcataaaaa ggatccacca

4620

tgaacaagaa caacaccaag ctgagcaccc gcgccctgcc gagcttcatc gactacttca

4680

acggcatcta cggcttcgcc accggcatca aggacatcat gaacatgatc ttcaagaccg

4740

acaccggcgg cgacctgacc ctggacgaga tcctgaagaa ccagcagctg ctgaacgaca

4800

tcagcggcaa gctggacggc gtgaacggca gcctgaacga cctgatcgcc cagggcaacc

4860

tgaacaccga gctgagcaag gagatcctta agatcgccaa cgagcagaac caggtgctga

4920

acgacgtgaa caacaagctg gacgccatca acaccatgct gcgcgtgtac ctgccgaaga

4980

tcaccagcat gctgagcgac gtgatgaagc agaactacgc cctgagcctg cagatcgagt

5040

acctgagcaa gcagctgcag gagatcagcg acaagctgga catcatcaac gtgaacgtcc

5100

tgatcaacag caccctgacc gagatcaccc cggcctacca gcgcatcaag tacgtgaacg

5160

agaagttcga agagctgacc ttcgccaccg agaccagcag caaggtgaag aaggacggca

5220

gcccggccga catcctggac gagctgaccg agctgaccga gctggcgaag agcgtgacca

5280

agaacgacgt ggacggcttc gagttctacc tgaacacctt ccacgacgtg atggtgggca

5340

acaacctgtt cggccgcagc gccctgaaga ccgccagcga gctgatcacc aaggagaacg

5400

tgaagaccag cggcagcgag gtgggcaacg tgtacaactt cctgatcgtg ctgaccgccc

5460

tgcaggccca ggccttcctg accctgacca cctgtcgcaa gctgctgggc ctggccgaca

5520

tcgactacac cagcatcatg aacgagcact tgaacaagga gaaggaggag ttccgcgtga

5580

acatcctgcc gaccctgagc aacaccttca gcaacccgaa ctacgccaag gtgaagggca

5640

gcgacgagga cgccaagatg atcgtggagg ctaagccggg ccacgcgttg atcggcttcg

5700

agatcagcaa cgacagcatc accgtgctga aggtgtacga ggccaagctg aagcagaact

5760

accaggtgga caaggacagc ttgagcgagg tgatctacgg cgacatggac aagctgctgt

5820

gtccggacca gagcgagcaa atctactaca ccaacaacat cgtgttcccg aacgagtacg

5880

tgatcaccaa gatcgacttc accaagaaga tgaagaccct gcgctacgag gtgaccgcca

5940

acttctacga cagcagcacc ggcgagatcg acctgaacaa gaagaaggtg gagagcagcg

6000

aggccgagta ccgcaccctg agcgcgaacg acgacggcgt ctacatgcca ctgggcgtga

6060

tcagcgagac cttcctgacc ccgatcaacg gctttggcct gcaggccgac gagaacagcc

6120

gcctgatcac cctgacctgt aagagctacc tgcgcgagct gctgctagcc accgacctga

6180

gcaacaagga gaccaagctg atcgtgccac cgagcggctt catcagcaac atcgtggaga

6240

acggcagcat cgaggaggac aacctggagc cgtggaaggc caacaacaag aacgcctacg

6300

tggaccacac cggcggcgtg aacggcacca aggccctgta cgtgcacaag gacggcggca

6360

tcagccagtt catcggcgac aagctgaagc cgaagaccga gtacgtgatc cagtacaccg

6420

tgaagggcaa gccatcgatt cacctgaagg acgagaacac cggctacatc cactacgagg

6480

acaccaacaa caacctggag gactaccaga ccatcaacaa gcgcttcacc accggcaccg

6540

acctgaaggg cgtgtacctg atcctgaaga gccagaacgg cgacgaggcc tggggcgaca

6600

acttcatcat cctggagatc agcccgagcg agaagctgct gagcccggag ctgatcaaca

6660

ccaacaactg gaccagcacc ggcagcacca acatcagcgg caacaccctg accctgtacc

6720

agggcggccg cggcatcctg aagcagaacc tgcagctgga cagcttcagc acctaccgcg

6780

tgtacttcag cgtgagcggc gacgccaacg tgcgcatccg caactcccgc gaggtgctgt

6840

tcgagaagag gtacatgagc ggcgccaagg acgtgagcga gatgttcacc accaagttcg

6900

agaaggacaa cttctacatc gagctgagcc agggcaacaa cctgtacggc ggcccgatcg

6960

tgcacttcta cgacgtgagc atcaagtagg agctctagat ccccgaattt ccccgatcgt

7020

tcaaacattt ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct tgcgatgatt

7080

atcatataat ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta atgcatgacg

7140

ttatttatga gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat tatacattta atacgcgata

7200

gaaaacaaaa tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc atctatgtta

7260

ctagatcggg aattgggtac cgagctcgaa ttcggcgcgc ccaattgatt taaatggccg

7320

ctgcggccaa ttcctgcagc gttgcggttc tgtcagttcc aaacgtaaaa cggcttgtcc

7380

cgcgtcatcg gcgggggtca taacgtgact cccttaattc tccgctcatg atcagattgt

7440

cgtttcccgc cttcagttta aactatcagt gttt

7474

<210>8

<211>789

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VIP3A蛋白质基序

<400>8

Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro Ser Phe

1 5 10 15

Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp

20 25 30

Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu

35 40 45

Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp Ile Ser Gly Lys

50 55 60

Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn

65 70 75 80

Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln

85 90 95

Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr

100 105 110

Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val

115 120 125

Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys

130 135 140

Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val

145 150 155 160

Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile

165 170 175

Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr

180 185 190

Ser Ser Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu

195 200 205

Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val

210 215 220

Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly

225 230 235 240

Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile

245 250 255

Thr Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr

260 265 270

Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Gln Ala Phe Leu Thr

275 280 285

Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr

290 295 300

Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val

305 310 315 320

Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala

325 330 335

Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys

340 345 350

Pro Gly His Ala Leu Ile Gly Phe Glu Ile Ser Asn Asp Ser Ile Thr

355 360 365

Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp

370 375 380

Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu Leu

385 390 395 400

Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe

405 410 415

Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys

420 425 430

Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly

435 440 445

Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr

450 455 460

Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val

465 470 475 480

Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala

485 490 495

Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg

500 505 510

Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile

515 520 525

Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly Ser Ile

530 535 540

Glu Glu Asp Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr

545 550 555 560

Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr Val His

565 570 575

Lys Asp Gly Gly Ile Ser Gln Phe Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys

580 585 590

Thr Glu Tyr Val Ile Gln Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ser Ile His

595 600 605

Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn

610 615 620

Asn Leu Glu Asp Tyr Gln Thr Ile Asn Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr

625 630 635 640

Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu Ile Leu Lys Ser Gln Asn Gly Asp Glu

645 650 655

Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu Glu Ile Ser Pro Ser Glu Lys

660 665 670

Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Thr Asn Asn Trp Thr Ser Thr Gly

675 680 685

Ser Thr Asn Ile Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gln Gly Gly Arg

690 695 700

Gly Ile Leu Lys Gln Asn Leu Gln Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg

705 710 715 720

Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg Ile Arg Asn Ser

725 730 735

Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys Asp Val

740 745 750

Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr Ile Glu

755 760 765

Leu Ser Gln Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Val His Phe Tyr

770 775 780

Asp Val Ser Ile Lys

785

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>COT102核苷酸基序

<400>9

ggtccctgga tacggtgtca

20

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>COT102核苷酸基序

<400>10

ttgagggttg gatcctttgc

20

<210>11

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>COT102核苷酸基序

<220>

<221>modified_base

<222>(1)..(1)

<223>5’端的TET标记

<220>

<221>modified_base

<222>(27)..(27)

<223>3’端的TAMRA标记

<400>11

ccaacatcat caatggtggc atcgaat

27

<210>12

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>COT102核苷酸基序

<400>12

caggcaggtc ttgcaacgt

19

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>COT102核苷酸基序

<400>13

cgagagcctg acctattgca t

21

<210>14

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>COT102核苷酸基序

<220>

<221>modified_base

<222>(1)..(1)

<223>5’端的FAM标记

<220>

<221>modified_base

<222>(19)..(19)

<223>3’端的TAMRA标记

<400>14

acaccctgtg cacggcggg

19

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>COT102核苷酸基序

<400>15

atgaagaccc tgcgctacga

20

<210>16

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>COT102核苷酸基序

<400>16

acgcccagtg gcatgtaga

19

<210>17

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>COT102核苷酸基序

<220>

<221>modified_base

<222>(1)..(1)

<223>5’端的FAM标记

<220>

<221>modified_base

<222>(21)..(21)

<223>3’端的TAMRA标记

<400>17

agcgaggccg agtaccgcac c

21

<210>18

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>COT102核苷酸基序

<400>18

ccaacctatt cttcctctc

19

<210>19

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>COT102核苷酸基序

<400>19

gtatatgctc cgcattggt

19

<210>20

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>COT102核苷酸基序

<400>20

gtgttgcatt agaagatgt

19

<210>21

<211>9356

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>COT102核苷酸基序

<400>21

ctatagggca cgcgtggtcg acggcccggg ctggtgtcga aactactttg taatatacaa

60

ccaccttttc agttaaattg catccctaat tctagccatg ccatgcattt agatattacc

120

tgaatatttc aatcaaaatc catttccaaa tcatgtaagt accagcacac aaacaattcc

180

aactaagttc attgatgagc tccactcaac tattttaaag aaaatctacc ccaatcctta

240

ctgatgagtg aaagcaccta gcagtgtgaa aagaaaacca aatatgcatt gatccatgga

300

cagactaata tgcaacacct tagcactaga taaaatgcaa gacttttcac tctaaatatg

360

accatgttct tctagttaaa attgatgtta attgaaccca gtgtctctta ctttcgattc

420

tattagaaaa cacacaacaa tgccatacaa actgcatttt tccttgaaaa aagaaaatca

480

aacagcaatt gtataaggaa agtggcctta aatatatatt aactgaagat taaatgaaaa

540

cagccaagtg ttcaagtaat tggaaacagc tattccctga ccttaaatat ataaaaaaac

600

tgtagattaa aggatatcaa cctcatttaa cactcaagat caaacttacc agtaaacaga

660

gagtaggctt cccctaacat acctatatct tgacagttca gaaaattaca gcataacttt

720

ttcacattgt cctaatcaaa tttctaaata catcaaactt tggcaactta gaacaaacct

780

aataaactgc tccaacttgg gcatggacag caaatgtaga tatggacaac tttgacccaa

840

aattcaaaga taaaggtcca aaagtggaac cactactagg gtcttttagt cgtaagtgtg

900

gagctgcctt atcctaagtt tcccaaaccc ttttatgctt catttgaggt tagaatctcg

960

ggaaggcagg tcttttacaa gcgttagcac aatttagttg catcattgtt ggtgccaaac

1020

catttttttc tcaaccaacc tattcttcct ctctgtttta aggtactatt cacagaagaa

1080

gataggtagt ttttaaggag aattactatc caacattagc aaatagaaac ccaactatct

1140

gctggcttca aaatgtagcg acagactaat accaaacaaa accatgagat tgtagagaga

1200

taccttgggt ttgatatgaa tggccgacgt cctcaaaaga gaaatcttcg ttttctacat

1260

aattaacaat gccaaagcaa aagatgagta atttggattt tttgaaaaat aaaccaataa

1320

tacaattcaa atatgaaac tttgaaagaaa acactcattg taagatcaaa aaaggcaaat

1380

attcaggtaa acaaattgac gcttagacaa cttaataaca cattgcggac gtttttaatg

1440

tacgccatgc tggccgcccg gggtacccaa ttcccgatct agtaacatag atgacaccgc

1500

gcgcgataat ttatcctagt ttgcgcgcta tattttgttt tctatcgcgt attaaatgta

1560

taattgcggg actctaatca taaaaaccca tctcataaat aacgtcatgc attacatgtt

1620

aattattaca tgcttaacgt aattcaacag aaattatatg ataatcatcg caagaccggc

1680

aacaggattc aatcttaaga aactttattg ccaaatgttt gaacgatcgg ggaaattcgg

1740

ggatcccggt cggcatctac tctattcctt tgccctcgga cgagtgctgg ggcgtcggtt

1800

tccactatcg gcgagtactt ctacacagcc atcggtccag acggccgcgc ttctgcgggc

1860

gatttgtgta cgcccgacag tcccggctcc ggatcggacg attgcgtcgc atcgaccctg

1920

cgcccaagct gcatcatcga aattgccgtc aaccaagctc tgatagagtt ggtcaagacc

1980

aatgcggagc atatacgccc ggagccgcgg cgatcctgca agctccggat gcctccgctc

2040

gaagtagcgc gtctgctgct ccatacaagc caaccacggc ctccagaaga agatgttggc

2100

gacctcgtat tgggaatccc cgaacatcgc ctcgctccag tcaatgaccg ctgttatgcg

2160

gccattgtcc gtcaggacat tgttggagcc gaaatccgcg tgcacgaggt gccggacttc

2220

ggggcagtcc tcggcccaaa gcatcagctc atcgagagcc tgcgcgacgg acgcactgac

2280

ggtgtcgtcc atcacagttt gccagtgata cacatgggga tcagcaatcg cgcatatgaa

2340

atcacgccat gtagtgtatt gaccgattcc ttgcggtccg aatgggccga acccgctcgt

2400

ctggctaaga tcggccgcag cgatcgcatc catggcctcc gcgaccggct gcagaacagc

2460

gggcagttcg gtttcaggca ggtcttgcaa cgtgacaccc tgtgcacggc gggagatgca

2520

ataggtcagg ctctcgctga atgccccaat gtcaagcact tccggaatcg ggagcgcggc

2580

cgatgcaaag tgccgataaa cataacgatc tttgtagaaa ccatcggcgc agctatttac

2640

ccgcaggaca tatccacgcc ctcctacatc gaagctgaaa gcacgagatt cttcgccctc

2700

cgagagctgc atcaggtcgg agacgctgtc gaacttttcg atcagaaact tctcgacaga

2760

cgtcgcggtg agttcaggct ttttcatatc ttattgcccc cctagagtcg agatccacct

2820

gaaataaaac aatagaacaa gtagaaacca atcagcgaac atataccaaa tcaaaagccg

2880

taagagaaat caaaacaaca ccaaagagaa acggatctaa acataagaaa cctaaaacag

2940

agagaatcga acaaagaaaa cacaaaaatt gaatagatcg tccttgaaaa tcctaatttc

3000

acaatcaagc aagaaattac acagatgtaa acactacgaa tcgatatctt agtaatcagg

3060

acaaaattta gaagctggat tgacgaaacg aacaatattg tcaaaagcaa tttatacaaa

3120

agattcaata atccacataa caaaaattgg agatcagata cgaatcaaaa acaaaaagaa

3180

tcagaaaata taccttgaaa gagagagtcg cgagagattt gcagagatcg ctttaggctt

3240

tgggagagat tgaagagtca gaaaaagacg aaaggatgaa ttattatctt ccacacgaag

3300

gtcttcttta tatcgcaaac caaaagccca aaaccgtctt ttctattaat gagaataaaa

3360

tatctttagc caaaacaaaa aaaggaagat atcagttgag gattattatc acgaaactaa

3420

aggaaggaat catatgatac gtgtcatatt ttccaccgtg cgtttttaaa agaccgactc

3480

aagtagaaac atcctatggt ggtggttgga ttaggtcatc cattacatct gcttcactga

3540

catttttcta tttttctttt tgtatatact tttcctcaaa taatttcttt cttttctata

3600

gaagaattta atcaataagg aaaaagttca aaaaagattc tttccattaa gactatgtct

3660

tggttaaccc aacccattaa gaataagcaa tcataatata tatagagaat actaatacta

3720

tatatgagat ttttctttta atttcatgtt gattatgata gtttatcttc ttgatttaat

3780

ttatcaatac ttggcataaa agattctaat ctactctaat aaagaaaaga aaaaaaagta

3840

tctaccattg actaattaaa ataaggaaac ttatctacca aatttgagta ttttttagaa

3900

caatcttttt ggtttaattc caaaactcta aacctaattg ttgggaaaaa ggacctaatt

3960

tttaagaaaa gttaataatt agaagatctg tatgtttttt tttgatccaa gtttttattt

4020

cttttctctt tttttcatga taaaatctat gtttttttag tctacaatta aagtaattgt

4080

tattattttc tttatctttt tttgttgttg ttgttaattc cctttttttt ttttaacagc

4140

aacttcttaa aaaaaaaaac agttgggcct tgaatttatt tcaggcctgc gttattaagc

4200

ccagataata actcaaaaca aaaaaaatgt tgaaccggaa taaacccgcg agattaaatg

4260

ccggttttca ggtaacatag aagaagaata tatgaggatt gaagaagtat tcaagaggcg

4320

gaacaattca caagtccaag agcttaaatt tctcctcact cttctgctac agactcggaa

4380

ctctttctct ttgctaaaat aagatgttca ggatttttgt tgcccgacaa ttcatgtatc

4440

tcacactctc tctcttctct gttcttacta ctctgttaca ttaccaccaa ctcaagactt

4500

tcttccacaa tggcgtttat gagacttggc tccaaatccg gtaccggagc tcgaattcga

4560

agcttgcatg cctgcagtga tcaccatggt cgacaaaatt tagaacgaac ttaattatga

4620

tctcaaatac attgatacat atctcatcta gatctaggtt atcattatgt aagaaagttt

4680

tgacgaatat ggcacgacaa aatggctaga ctcgatgtaa ttggtatctc aactcaacat

4740

tatacttata ccaaacatta gttagacaaa atttaaacaa ctatttttta tgtatgcaag

4800

agtcagcata tgtataattg attcagaatc gttttgacga gttcggatgt agtagtagcc

4860

attatttaat gtacatacta atcgtgaata gtgaatatga tgaaacattg tatcttattg

4920

tataaatatc cataaacaca tcatgaaaga cactttcttt cacggtctga attaattatg

4980

atacaattct aatagaaaac gaattaaatt acgttgaatt gtatgaaatc taattgaaca

5040

agccaaccac gacgacgact aacgttgcct ggattgactc ggtttaagtt aaccactaaa

5100

aaaacggagc tgtcatgtaa cacgcggatc gagcaggtca cagtcatgaa gccatcaaag

5160

caaaagaact aatccaaggg ctgagatgat taattagttt aaaaattagt taacacgagg

5220

gaaaaggctg tctgacagcc aggtcacgtt atctttacct gtggtcgaaa tgattcgtgt

5280

ctgtcgattt taattatttt tttgaaaggc cgaaaataaa gttgtaagag ataaacccgc

5340

ctatataaat tcatatattt tcctctccgc tttgaattgt ctcgttgtcc tcctcacttt

5400

catcagccgt tttgaatctc cggcgacttg acagagaaga acaaggaaga agactaagag

5460

agaaagtaag agataatcca ggagattcat tctccgtttt gaatcttcct caatctcatc

5520

ttcttccgct ctttctttcc aaggtaatag gaactttctg gatctacttt atttgctgga

5580

tctcgatctt gttttctcaa tttccttgag atctggaatt cgtttaattt ggatctgtga

5640

acctccacta aatcttttgg ttttactaga atcgatctaa gttgaccgat cagttagctc

5700

gattatagct accagaattt ggcttgacct tgatggagag atccatgttc atgttacctg

5760

ggaaatgatt tgtatatgtg aattgaaatc tgaactgttg aagttagatt gaatctgaac

5820

actgtcaatg ttagattgaa tctgaacact gtttaaggtt agatgaagtt tgtgtataga

5880

ttcttcgaaa ctttaggatt tgtagtgtcg tacgttgaac agaaagctat ttctgattca

5940

atcagggttt atttgactgt attgaactct ttttgtgtgt ttgcagctca taaaaaggat

6000

ccaccatgaa caagaacaac accaagctga gcacccgcgc cctgccgagc ttcatcgact

6060

acttcaacgg catctacggc ttcgccaccg gcatcaagga catcatgaac atgatcttca

6120

agaccgacac cggcggcgac ctgaccctgg acgagatcct gaagaaccag cagctgctga

6180

acgacatcag cggcaagctg gacggcgtga acggcagcct gaacgacctg atcgcccagg

6240

gcaacctgaa caccgagctg agcaaggaga tccttaagat cgccaacgag cagaaccagg

6300

tgctgaacga cgtgaacaac aagctggacg ccatcaacac catgctgcgc gtgtacctgc

6360

cgaagatcac cagcatgctg agcgacgtga tgaagcagaa ctacgccctg agcctgcaga

6420

tcgagtacct gagcaagcag ctgcaggaga tcagcgacaa gctggacatc atcaacgtga

6480

acgtcctgat caacagcacc ctgaccgaga tcaccccggc ctaccagcgc atcaagtacg

6540

tgaacgagaa gttcgaagag ctgaccttcg ccaccgagac cagcagcaag gtgaagaagg

6600

acggcagccc ggccgacatc ctggacgagc tgaccgagct gaccgagctg gcgaagagcg

6660

tgaccaagaa cgacgtggac ggcttcgagt tctacctgaa caccttccac gacgtgatgg

6720

tgggcaacaa cctgttcggc cgcagcgccc tgaagaccgc cagcgagctg atcaccaagg

6780

agaacgtgaa gaccagcggc agcgaggtgg gcaacgtgta caacttcctg atcgtgctga

6840

ccgccctgca ggcccaggcc ttcctgaccc tgaccacctg tcgcaagctg ctgggcctgg

6900

ccgacatcga ctacaccagc atcatgaacg agcacttgaa caaggagaag gaggagttcc

6960

gcgtgaacat cctgccgacc ctgagcaaca ccttcagcaa cccgaactac gccaaggtga

7020

agggcagcga cgaggacgcc aagatgatcg tggaggctaa gccgggccac gcgttgatcg

7080

gcttcgagat cagcaacgac agcatcaccg tgctgaaggt gtacgaggcc aagctgaagc

7140

agaactacca ggtggacaag gacagcttga gcgaggtgat ctacggcgac atggacaagc

7200

tgctgtgtcc ggaccagagc gagcaaatct actacaccaa caacatcgtg ttcccgaacg

7260

agtacgtgat caccaagatc gacttcacca agaagatgaa gaccctgcgc tacgaggtga

7320

ccgccaactt ctacgacagc agcaccggcg agatcgacct gaacaagaag aaggtggaga

7380

gcagcgaggc cgagtaccgc accctgagcg cgaacgacga cggcgtctac atgccactgg

7440

gcgtgatcag cgagaccttc ctgaccccga tcaacggctt tggcctgcag gccgacgaga

7500

acagccgcct gatcaccctg acctgtaaga gctacctgcg cgagctgctg ctagccaccg

7560

acctgagcaa caaggagacc aagctgatcg tgccaccgag cggcttcatc agcaacatcg

7620

tggagaacgg cagcatcgag gaggacaacc tggagccgtg gaaggccaac aacaagaacg

7680

cctacgtgga ccacaccggc ggcgtgaacg gcaccaaggc cctgtacgtg cacaaggacg

7740

gcggcatcag ccagttcatc ggcgacaagc tgaagccgaa gaccgagtac gtgatccagt

7800

acaccgtgaa gggcaagcca tcgattcacc tgaaggacga gaacaccggc tacatccact

7860

acgaggacac caacaacaac ctggaggact accagaccat caacaagcgc ttcaccaccg

7920

gcaccgacct gaagggcgtg tacctgatcc tgaagagcca gaacggcgac gaggcctggg

7980

gcgacaactt catcatcctg gagatcagcc cgagcgagaa gctgctgagc ccggagctga

8040

tcaacaccaa caactggacc agcaccggca gcaccaacat cagcggcaac accctgaccc

8100

tgtaccaggg cggccgcggc atcctgaagc agaacctgca gctggacagc ttcagcacct

8160

accgcgtgta cttcagcgtg agcggcgacg ccaacgtgcg catccgcaac tcccgcgagg

8220

tgctgttcga gaagaggtac atgagcggcg ccaaggacgt gagcgagatg ttcaccacca

8280

agttcgagaa ggacaacttc tacatcgagc tgagccaggg caacaacctg tacggcggcc

8340

cgatcgtgca cttctacgac gtgagcatca agtaggagct ctagatcccc gaatttcccc

8400

gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg

8460

atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc

8520

atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac

8580

gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct

8640

atgttactag atcgggaatt gggtaccgag ctcgaattcg gcgcgcccaa ttgatttaaa

8700

tggccgctgc ggccaattcc tgcagcgttg cggttctgtc agttccaaac gtaaaacggc

8760

ttgtcccgcg tcatcggcgg gggtcataac gtgactccct taattctccg ctcatgatca

8820

gattgtcgtt tcccgccttc agtttaaact atcagtgttt aataaatatg ggcaatcttt

8880

ccctacaccg actgtactgt tactgtaata gactccggcc tagactgatt ctgaattctg

8940

tctgtttact gactgttact ctagtaaggg gattacacac tgagttttag taaactcacc

9000

ccgtttatta actgtgcagg taatccccaa cattaggtgg atcggtgtca cagaaggact

9060

cggagacgac cacacaactg cacatgtttt tttatttcgt ttatttagtc aagcactttg

9120

gtttttgatt tgggttgtat taaggcctct ttattttctt aaccttttat ttgggaaatt

9180

tatttagtat gcttaatata tgttagaagt agggcacggt tttccaaaac aacaattggc

9240

tttcaaaata tctcgtttcc gtaactgttt aaaagtatgc ttctgcagca aataaggttt

9300

taagggaatt aacgtttcac aagttttaaa tggctagagg ttttgagtag taagaa

9356

<210>22

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>COT102核苷酸基序

<400>22

gatcggggtc aggaaggtct

20

<210>23

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>COT102核苷酸基序

<400>23

cagcatcatg aacgagcact

20

<210>24

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>COT102核苷酸基序

<400>24

cagcgagagc ctgacctatt

20

<210>25

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>COT102核苷酸基序

<400>25

caggacattg ttggagccga

20

Claims

1、一种多核苷酸，其包含来自SEQ ID NO：1的26个核苷酸序列的至少17个邻接核苷酸。

2、如权利要求1所述的多核苷酸，其包含来自SEQ ID NO：1的26个核苷酸序列的至少18个邻接核苷酸。

3、如权利要求1所述的多核苷酸，其包含来自SEQ ID NO：1的26个核苷酸序列的至少20个邻接核苷酸。

4、如权利要求1所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：1的序列。

5、一种多核苷酸，其包含来自SEQ ID NO：2的26个核苷酸序列的至少17个邻接核苷酸。

6、如权利要求5所述的多核苷酸，其包含来自SEQ ID NO：2的26个核苷酸序列的至少18个邻接核苷酸。

7、如权利要求5所述的多核苷酸，其包含来自SEQ ID NO：2的26个核苷酸序列的至少20个邻接核苷酸。

8、如权利要求5所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：2的序列。

9、根据前述任何一个权利要求所述的多核苷酸，其包含SEQ IDNO：21的序列。

10、一种抗昆虫的植物，其包含VIP3A蛋白质和如权利要求1至9任一权利要求所述的多核苷酸。

11、如权利要求10所述的植物，其是棉花植物。

12、如权利要求11所述的一种杀虫棉花植物，其来源于COT102事件。

13、一种检测来源于COT102事件的植物材料的方法，该方法包括：

●获得用于分析的样品；

●提供该样品的DNA；

●提供一对引物，该引物被设计成当如权利要求1至9任一权利要求所述的多核苷酸是单链时，能结合该多核苷酸；

●扩增位于该引物结合位点之间的区域；和

●检测扩增产物的存在；

由此，扩增产物的存在表明样品来源于COT102事件。

14、如权利要求13所述的方法，其中第一个引物具有SEQ ID NO：3的序列，第二个引物具有SEQ ID NO：4的序列。

15、一种检测来源于COT102事件的植物材料的方法，该方法包括：

●获得用于分析的样品；

●提供探针，该探针被设计成当如权利要求1至9任一权利要求所述的多核苷酸是单链时，能结合所述多核苷酸的互补链；

●使所述探针和样品杂交；和

●检测该探针是否已经杂交；

由此，探针的杂交表明该样品来源于COT102事件。

16、如权利要求15所述的方法，其中探针的序列选自SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7。

17、如权利要求15或16所述的方法，其中在严格杂交条件下，该探针与样品杂交。

18、一种检测来源于COT102事件的植物材料的方法，该方法包括：

●获得用于分析的样品；

●提供抗体，该抗体被设计成结合如权利要求10到12任一权利要求所述植物中包含的VIP蛋白质；

●温育所述抗体和样品；和

●检测该抗体是否已经结合；

由此，已经结合的抗体的存在表明该样品来源于COT102事件。

19、一种检测来源于COT102事件的植物材料的方法，该方法包括：

●获得用于分析的样品；

●制备样品的蛋白质提取物；

●提供检测条，该检测条被设计成检测存在于样品中的VIP蛋白质的存在；

●温育检测条和样品；和

●检测VIP蛋白质是否存在；

其中，VIP蛋白质的存在表明该样品来源于COT102事件。

20、如权利要求18或19所述的方法，其中VIP蛋白质具有SEQ IDNO：8的序列。

21、一种检测来源于COT102事件的植物材料的方法，该方法包括：

●获得用于分析的样品；

●使草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)物种的一个或多个昆虫暴露于该样品；

●使欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)物种的一个或多个昆虫暴露于该样品，做为对照；

●检测样品是否对每个物种的昆虫具有杀虫作用；和

●比较该结果和真实的COT102生物测定模式。

22、一种试剂盒，其包含用于检测样品中来源于COT102事件的植物材料的存在的手段。

23、如权利要求22所述的试剂盒，其包含用于检测样品中如权利要求1至9任一权利要求所述多核苷酸，或者如权利要求1至9任一权利要求所述多核苷酸编码的蛋白质，或者VIP蛋白质的存在的手段。

24、如权利要求22或23所述的试剂盒，其包含说明书形式的如权利要求13至21任一权利要求所述一种或多种方法。