CN101376890B

CN101376890B - 农杆菌介导转化海岛棉的方法

Info

Publication number: CN101376890B
Application number: CN2007100766468A
Authority: CN
Inventors: 陈全家; 曲延英; 贺雅婷; 孔庆平
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2007-08-29
Filing date: 2007-08-29
Publication date: 2012-01-04
Anticipated expiration: 2027-08-29
Also published as: CN101376890A

Abstract

本发明提供了农杆菌介导转化海岛棉的方法，包括以下步骤：1)受体培养；2)农杆菌的培养；3)受体与带有植物表达载体的农杆菌共培养；4)诱导抗性愈伤组织；5)分化抗性体细胞胚胎；6)体细胞胚胎分化抗性植株。本发明获得农杆菌介导转化海岛棉再生植株，以下胚轴直接做为转化受体，诱导出抗性愈伤组织以及抗性体细胞胚胎，并且体细胞成胚率达到30％、体细胞成苗率20％。提高了海岛棉的遗传转化效率提高了使现代生物技术可以大规模的用于海岛棉育种上，解决了农杆菌介导法在海岛棉上应用的关键问题，为海岛棉遗传改良提供技术理论。

Description

农杆菌介导转化海岛棉的方法

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及农杆菌介导转化海岛棉的方法。

背景技术

棉花是世界上重要的纤维作物，高效快速培养出多种优良性状于一体的棉花优良品种是棉花生产中急需解决的难题。现代生物技术在植物育种中的应用大多是在植物组织培养技术的基础上获得成功的。与其它植物相比，棉花组织培养工作开展的较晚。棉花野生种克劳斯基棉最早实现了胚胎发生，但当时没有能得到再生植株。1983年Davidonis等用诱导两年的陆地棉柯字310胚性愈伤组织得到了再生植株。其它研究者也报道成功的胚胎发生和植株再生。Umbeck等在1987年首次报道用陆地棉柯字312的下胚轴作为外植体，在根癌农杆菌LBA4404介导下，转入nptII(新霉素乙酞转移酶)和cat(氯霉素乙酞转移酶)基因，启动子为nos。同年，Firoozabady等用柯字201子叶组织作为外植体，转入nptII基因。但这种方法比较适用于柯字棉系列，而且再生的植株会有一定程度上的细胞学和形态学的反常。1987年，陈志贤等将Trolinder的技术引入中国，成功的再生了多个国内品种。但仍然受转化周期长、成胚率低、易出现畸形胚、体细胞胚植株再生比例低和缺乏茎的伸长等因素的限制。围绕这些问题研究者做了大量的工作，提出了各种解决办法，也获得了一些相应的解决方法。尽管棉花的遗传改良已经十分成功，但是其转化组织经由胚胎发生再生出植株很困难，属于比较难组培的物种。胚胎发生潜力具有遗传多样性、低的遗传力和高的基因型依赖性，1994年，张家明和孙济中，研究发现具有胚胎发生能力的品种具有较为明显的地域性特征，黄河流域品种比长江流域品种容易获得再生植株。1991年，张献龙等建立了一个较易获得再生植株和试管苗移栽的技术体系。1994年，王武等发现油菜素内酷(Brassinolide)对陆地棉体细胞胚胎发生和根器官发生有一定的促进作用。2005年，孙玉强等成功再生克劳斯基棉，并从柯字201的六种外植体的原生质体通过体细胞胚胎发生得到再生植株。尽管农杆菌介导的棉花遗传转化法已获得了成功，但是大部分的重要的商业化品种还是无法再生出植株，主要困难是棉花体细胞胚胎发生和植株再生。农杆菌介导的转化系统局限于那些少数能通过组织培养获得再生植株的品种。随着组织培养技术的发展我国获得泗棉3号等具有优良性状的陆地棉品种的转基因品种。由于这些问题的存在阻碍了农杆菌介导法在棉花转基因育种上的应用，解决此问题关键也就是获得棉花体细胞发生。棉花体细胞组织培养中，影响因素很多。在众多因素中，基因型对棉花体细胞胚胎发生和植株再生具有决定性作用，棉属的不同棉种之间及同一棉属不同品种之间体细胞胚胎发生和植株再生的能力存在很大差异。其中珂字201、珂字312是棉花组织培养应用的模式品种，目前国内许多实验室都已建立了模式品种的再生体系。近年来，国内已获得体细胞胚或再生植株的棉种有戴维逊氏棉、雷蒙德氏棉、瑟伯氏棉、拟似棉、草棉(非洲棉)、亚洲棉、海岛棉和陆地棉。有关海岛棉的再生体系的成功报道直到2001年才公开，此体系体细胞再生频率低，成苗周期较长利用细胞悬浮培养，条件不稳定不适于转基因植株的大规模生产。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种农杆菌介导转化海岛棉的方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

一种农杆菌介导转化海岛棉的方法，包括以下步骤：

1)受体培养：选用海岛棉无菌苗的下胚轴做为农杆菌转化受体，将培养7天的无菌苗下胚轴切段，切成0.5-1cm大小；

2)农杆菌的培养；

3)受体与带有植物表达载体的农杆菌共培养：将切段的下胚轴浸泡在带有植物表达载体的农杆菌菌液中；

4)诱导抗性愈伤组织：将菌液浸泡过的下胚轴置于共培养培养基上共培养，共培养培养基成分是MSB为基本培养基附加NAA和KT；

5)分化抗性体细胞胚胎：将下胚轴受体接种于诱导抗性愈伤组织培养基上诱导分化，诱导培养基是MSB为基本培养基附加NAA、KT以及相应的选择性抗生素；

6)体细胞胚胎分化抗性植株：将抗性愈伤组织接种于分化培养基上使其分化出抗性体细胞胚胎，愈伤组织分化培养基是MSB为基本培养基氮素加倍附加选择性抗生素；挑出抗性体细胞胚胎诱导其分化成苗，细胞胚胎分化培养基是MSB为基本培养基附加谷氨酰氨和天门冬酰氨。

所述共培养培养基为MS大量元素、微量元素及铁盐，B5的有机元素为基本培养基附加0.5mg/LNAA和0.1mg/LKT。

所述诱导培养基为MS大量元素、微量元素及铁盐，B5的有机元素为基本培养基附加0.5mg/L NAA、0.1mg/L KT及选择性抗生素。

所述愈伤组织分化培养基为无激素改良MSB培养基，用6g/L的琼脂粉做凝固剂，所述MSB培养基为MS大量元素、微量元素及铁盐，B5的有机元素。

所述细胞胚胎分化培养基为MS大量元素、微量元素及铁盐，B5的有机元素为基本培养基附加0.5mg/L谷氨酰氨和0.5mg/L天门冬酰氨。

所述选择性抗生素的种类根据农杆菌的抗性来确定。

本发明获得农杆菌介导转化海岛棉再生植株，以下胚轴直接做为转化受体，诱导出抗性愈伤组织以及抗性体细胞胚胎，并且体细胞成胚率达到30％、体细胞成苗率20％。在此基础上不断提高转化周期使转化周期缩短到3-4个月而且传统的海岛棉培养体系的培养周期比较长一般为7-8个月甚至一到两年，这就降低了对遗传改造及其他研究的效率，提高了海岛棉的遗传转化效率提高了使现代生物技术可以大规模的用于海岛棉育种上，解决了农杆菌介导法在海岛棉上应用的关键问题，为海岛棉遗传改良提供技术理论。

附图说明

图1是受体在以MSB为基本培养基附加NAA、KT及选择性抗生素的培养基上诱导出抗性愈伤组织。

图2是由胚性细胞团进一步分化出抗性体细胞胚胎。

具体实施方式

农杆菌介导转化海岛棉的方法，包括以下步骤：

1)受体培养：取用海岛棉种子表面消毒，消毒方法是首先在75％酒精中浸泡30秒，除去酒精后浸泡在10％双氧水中4小时，然后在超净工作台中用灭过菌的蒸馏水反复冲洗4-5遍，最后加入适当的无菌蒸馏水浸泡过夜。将经过表面消毒的种子接种于1/2MS培养基上培养，培养条件是在28℃，三天暗培养后转为每天8小时2000LX光照与16小时黑暗交替培养4天。将获得无菌苗的下胚轴用锋利的手术刀切成0.5-1cm的小段，注意切口不能过大，切口过大会导致褐化及污染。

2)农杆菌的培养：挑取单菌落，在同样条件下的YEB液体培养基中28℃，160r/min振荡培养过夜，待菌株进入对数生长期(OD600值在0.5左右为宜)，浸染外植体，进行农杆菌介导转化。

3)受体与带有植物表达载体的农杆菌共培养：将切断的下胚轴受体浸泡在带有植物表达载体的农杆菌菌液中，浸泡时间为15分钟。将浸泡后的受体表面菌液吸干后接种于共培养培养基上，培养基是MSB为基本培养基附加NAA和KT，具体为MS大量元素、微量元素及铁盐，B5的有机元素为基本培养基附加0.5mg/LNAA和0.1mg/LKT。

4)诱导抗性愈伤组织：将共培养过的受体接种于诱导培养基上，培养基是MSB为基本培养基附加0.5mg/L NAA、0.1mg/L KT及选择性抗生素50mg/L卡那霉素。接种后10天左右会出现下胚轴生根或者切口褐化问题，将切口出现褐化的下胚轴转接到新鲜培养基上继续培养，将完全褐化死亡的剔除。30天后即可获得抗性愈伤组织，如愈伤量比较少继续在诱导培养基上增殖。

5)分化抗性体细胞胚胎：在获得大量抗性愈伤组织的前提下诱导愈伤组织分化出体细胞胚胎，挑选密度较大的黄色、绿色愈伤组织进行分化培养，接种在无激素改良MSB培养基上，用6g/L的琼脂粉做凝固剂增加培养基的硬度诱导愈伤组织分化。15天左右观察发现有些愈伤表面有程序化死亡，底部无褐化现象，将这些愈伤组织挑出转接到新鲜培养基上，15-20天后观察发现从原来愈伤组织周围分化出颗粒状细胞团即为胚性细胞(镜检观察结果)。

6)体细胞胚胎分化抗性植株：将胚性细胞团转接于MSB附加0.5mg/L谷氨酰氨和0.5mg/L天门冬酰氨，以gelrite做为凝固剂的培养基上，此外诱导分化时需要增加外界胁迫在培养基上铺垫滤纸或者减少培养基水份，防止水份过多造成大量有毒物质毒害体胚抑制分化成苗。

Claims

1.农杆菌介导转化海岛棉的方法，包括以下步骤：

1)受体培养：选用海岛棉无菌苗的下胚轴作为农杆菌转化受体，将培养7天的无菌苗下胚轴切段，切成0.5-1cm大小；

2)农杆菌的培养；

4)诱导抗性愈伤组织：将菌液浸泡过的下胚轴置于共培养培养基上共培养，共培养培养基成分是MSB为基本培养基，附加0.5mg/LNAA和0.1mg/L KT;

5)分化抗性体细胞胚胎：将下胚轴受体接种于诱导抗性愈伤组织培养基上诱导分化，诱导培养基是MSB为基本培养基，附加0.5mg/LNAA、0.1mg/L KT以及相应的选择性抗生素;

6)体细胞胚胎分化抗性植株：将抗性愈伤组织接种于分化培养基上使其分化出抗性体细胞胚胎，愈伤组织分化培养基是MSB为基本培养基氮素加倍附加选择性抗生素；挑出抗性体细胞胚胎诱导其分化成苗，细胞胚胎分化培养基是MSB为基本培养基附加0.5mg/L谷氨酰氨和0.5mg/L天门冬酰氨。