CN107937434A

CN107937434A - Vip3Ab和Cry1Ab用于管理抗性昆虫的组合用途

Info

Publication number: CN107937434A
Application number: CN201711237516.8A
Authority: CN
Inventors: K·E·纳瓦; T·米德; A·T·伍斯利; S·伯顿; N·P·斯托勒; J·J·希茨
Original assignee: Dow AgroSciences LLC
Current assignee: Corteva Agriscience LLC
Priority date: 2010-12-16
Filing date: 2011-12-16
Publication date: 2018-04-20
Also published as: AR084340A1; MX2013006833A; RU2608500C2; AU2011343472A1; MX348000B; EP2651208A1; RU2013132707A; CA2821519A1; US9045766B2; UY33813A; CN103533828A; NZ612979A; US20120159674A1; UA114596C2; WO2012083219A1; BR112013015261A2; AU2011343472B2; CA2821519C; CL2013001738A1

Abstract

本申请涉及Vip3Ab和Cry1Ab用于管理抗性昆虫的组合用途，具体地，公开内容包括用于控制鳞翅目昆虫的方法和植物，所述植物包含与Cry1Ab蛋白组合的Vip3Ab杀虫蛋白以延迟或防止昆虫，特别是棉铃虫形成抗性。

Description

Vip3Ab和Cry1Ab用于管理抗性昆虫的组合用途

本申请是2011年12月16日提交的申请号为201180067814.1(PCT申请号为PCT/US2011/065585)、发明名称为“Vip3Ab和Cry1Ab用于管理抗性昆虫的组合用途”的发明专利申请的分案申请。

发明背景

人类种植玉米(corn)以供食物和能量应用。人类还种植许多其它作物，包括大豆和棉花。昆虫食用并损害植物，并且由此削弱这些人类努力。每年花费数十亿美元来控制昆虫有害物，并且它们造成的损害损失额外的数十亿。合成的有机化学杀虫剂已经是用于控制昆虫有害物的主要工具，但是生物学杀虫剂，诸如自苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)衍生的杀虫蛋白(insecticidal protein)已经在一些领域中发挥重要作用。经由用Bt杀虫蛋白基因转化生成昆虫抗性植物的能力已经使现代农业发生革命，而且提高杀虫蛋白及其基因的重要性和价值。

已经使用几种Bt蛋白来创建至今已经成功登记并商业化的昆虫抗性转基因植物。这些包括玉米中的Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1F和Cry3Bb、棉花中的Cry1Ac和Cry2Ab、和马铃薯中的Cry3A。

除了在2种蛋白质的组合杀虫谱是期望的(例如，玉米中的Cry1Ab和Cry3Bb组合以分别提供对鳞翅目害虫和根虫的抗性)或蛋白质的独立作用使它们可用作用于延迟易感昆虫群中抗性形成的工具(例如，棉花中的Cry1Ac和Cry2Ab组合以提供烟草蚜虫的抗性管理)的情况中外，表达这些蛋白质的商业产品表达单一蛋白质。还可见US 2009 0313717，其涉及用于控制谷实夜蛾(Helicoverpa zea)或棉铃虫(Helicoverpa armigera)的Cry2蛋白及Vip3Aa、Cry1F、或Cry1A。WO 2009 132850涉及用于控制草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)的Cry1F或Cry1A和Vip3Aa。US 2008 0311096部分涉及用于控制Cry1F抗性ECB的Cry1Ab。

也就是说，已经导致此技术的快速且普遍采用的昆虫抗性转基因植物的一些质量(quality)还引起如下的忧虑，即害虫(pest)群体会形成对由这些植物生成的杀虫蛋白的抗性。已经提示了保留基于Bt的昆虫抗性性状的效用的几种策略，其包括与避难所(refuge)组合以及与不同毒素交替、或在不同毒素共部署中部署(deploy)高剂量的蛋白质(McGaughey等(1998),“B.t.Resistance Management,”Nature Biotechnol.16:144-146)。

为了在IRM叠加中使用而选定的蛋白质需要独立地施加其杀虫效果，使得对一种蛋白质形成的抗性未赋予对第二种蛋白质的抗性(即，没有对蛋白质的交叉抗性)。如果例如在对“蛋白质A”的抗性方面选定的害虫群对“蛋白质B”敏感，那么会推断没有交叉抗性，并且蛋白质A和蛋白质B的组合会有效延迟对单独的蛋白质A的抗性。

在没有抗性昆虫群的情况中，可以基于假设与作用机制和交叉抗性潜力相关的其它特征做出评估。已经提示了受体介导的结合在鉴定有可能不展现出交叉抗性的杀虫蛋白中的效用(van Mellaert等1999)。缺乏此方法中固有的交叉抗性的关键预测物(predictor)是杀虫蛋白在敏感的昆虫物种中不竞争受体。

在两种Bt毒素竞争相同受体的情况中，则若所述受体在所述昆虫中突变，使得毒素之一不再结合所述受体，并且如此针对昆虫不再是杀虫性的，则情况可能是昆虫也会对第二种毒素(其竞争性结合相同受体)有抗性。也就是说，昆虫被说成与这两种Bt毒素有交叉抗性。然而，若两种毒素结合两种不同受体，则这可以是如下的指示，即昆虫不会对那两种毒素同时有抗性。

Cry1Fa可用于控制许多鳞翅目害虫物种，包括欧洲玉米螟(European cornborer)(ECB；玉米螟(Ostrinia nubilalis)(Hübner))和秋粘虫(fall armyworm)(FAW；草地夜蛾(Spodoptera frugiperda))，并且针对甘蔗螟(sugarcane borer)(SCB；小蔗螟(Diatraea saccharalis))是有活性的。Cry1Fa蛋白(如在含有事件TC1507的玉米植物中生成的)负责供FAW控制用的行业领先的昆虫抗性性状。Cry1Fa在SmartStax^TM、和WideStrike^TM产品中进一步部署。

其它Cry毒素列于官方B.t.命名委员会的站点(Crickmore等；lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)。目前有几乎60个“Cry”毒素大类(Cry1-Cry59)，及其它Cyt毒素和VIP毒素等。许多数字组各自具有大写字母亚组，而大写字母亚组具有小写字母亚-亚组。(例如，Cry1具有A-L，而Cry1A具有a-i)。

发明概述

本发明部分涉及如下的发现，即Vip3Ab和Cry1Ab彼此不竞争对来自谷实夜蛾(棉铃虫(corn earworm)；CEW)的肠受体的结合。本发明还部分涉及如下的令人惊讶的发现，即Vip3Ab针对对Cry1Ab有抗性的菱纹背蛾(diamondback moth,DBM)是有活性的。

凭借本公开内容的益处，本领域技术人员会认可，表达Vip3Ab和Cry1Ab，或其杀虫部分的植物会可用于延迟或防止形成针对任一单独的这些杀虫蛋白的抗性。

如此，本发明部分涉及与Cry1Ab蛋白组合使用Vip3Ab蛋白。本发明的范围内包括生成Vip3Ab加Cry1Ab的植物(及种植有此类植物的土地面积)。

本发明还部分涉及三种(或更多种)毒素的三重叠加(triple stack)或“金字塔(pyramid)”，其中Vip3Ab和Cry1Ab是基础对。此类三重叠加可以提供三种蛋白质，其提供针对CEW的非竞争性作用。这可以有助于进一步降低或消除对避难所土地面积的需要。

具体地，本发明涉及：

1.一种转基因植物，其包含编码Vip3Ab杀虫蛋白的DNA和编码Cry1Ab杀虫蛋白的DNA。

2.项1的植物的种子。

3.项1的植物，其中所述DNA渐渗入所述植物中。

4.项3的植物的种子。

5.包含非Bt避难所植物和项1的多个植物的植物田地，其中所述避难所植物占所述田地中的所有作物植物的小于40％。

6.项5的植物田地，其中所述避难所植物占所述田地中的所有作物植物的小于30％。

7.项5的植物田地，其中所述避难所植物占所述田地中的所有作物植物的小于20％。

8.项5的植物田地，其中所述避难所植物占所述田地中的所有作物植物的小于10％。

9.项5的植物田地，其中所述避难所植物占所述田地中的所有作物植物的小于5％。

10.项5的植物田地，其中所述避难所植物在区组或条中(in blocks or strips)。

11.种子混合物，其包含来自非Bt避难所植物的避难所种子和项2的多个种子，其中所述避难所种子占所述混合物中的所有种子的小于40％。

12.项11的种子混合物，其中所述避难所种子占所述混合物中的所有种子的小于30％。

13.项11的种子混合物，其中所述避难所种子占所述混合物中的所有种子的小于20％。

14.项11的种子混合物，其中所述避难所种子占所述混合物中的所有种子的小于10％。

15.项11的种子混合物，其中所述避难所种子占所述混合物中的所有种子的小于5％。

16.一种管理谷实夜蛾昆虫对源自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的杀虫蛋白形成抗性的方法，所述方法包括种植种子以产生项5的植物田地。

17.一种用于控制谷实夜蛾昆虫的组合物，所述组合物包含表达有效量的Cry1Ab杀虫蛋白和Vip3Ab杀虫蛋白两者的细胞。

18.项17的组合物，其包含经过转化以表达Cry1Ab杀虫蛋白和Vip3Ab杀虫蛋白两者的宿主，其中所述宿主是微生物或植物细胞。

19.一种控制谷实夜蛾昆虫的方法，所述方法包括对所述昆虫提供有效量的项17的组合物。

20.项5的田地，其中所述植物占用超过10英亩。

21.项1的植物，其中所述植物选自下组：玉米、大豆、和棉花。

22.项1的植物，其中所述植物是玉米植物。

23.项1、3、21、和22中任一项的植物的植物细胞，其中所述植物细胞包含所述编码所述Cry1Ab杀虫蛋白的DNA和所述编码所述Vip3Ab杀虫蛋白的DNA，其中所述Cry1Ab杀虫蛋白与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:3是至少95％相同的，且所述Vip3Ab杀虫蛋白与SEQ IDNO:2是至少95％相同的。

24.项1、3、21、和22中任一项的植物，其中所述Cry1Ab杀虫蛋白包含SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:3，且所述Vip3Ab杀虫蛋白包含SEQ ID NO:2。

25.一种植物细胞，其包含编码Vip3Ab杀虫蛋白的DNA和编码Cry1Ab杀虫蛋白的DNA。

附图简述

图1：在将纯化的毒素表面应用于人工昆虫饮食时全长Vip3Ab1针对小菜蛾(Linnaeus)(DBM)、和Cry1A抗性小菜蛾(rDBM)、美洲棉铃虫(Heliothis zea)(CEW)、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(J.E.Smith)(FAW)和玉米螟(Ostrinia nubilalis)(Hübner),(ECB)幼虫的死亡率剂量响应。百分比死亡率基于每剂在8个昆虫上对毒素暴露后5天采集的读数。

图2：在将纯化的毒素表面(topically)应用于人工昆虫饮食时全长Vip3Ab1针对小菜蛾(Linnaeus)(DBM)、和Cry1A抗性小菜蛾(rDBM)、美洲棉铃虫(CEW)、草地夜蛾(J.E.Smith)(FAW)和玉米螟(Hübner),(ECB)幼虫的生长抑制剂量响应。百分比生长抑制基于仅用缓冲液处理的8个幼虫的平均重量与暴露于毒素5天的幼虫的重量的比较。

图3：¹²⁵I Cry1Ab对从美洲棉铃虫制备的BBMV蛋白的结合的竞争性置换曲线。BBMV浓度是0.10mg蛋白质/ml，且¹²⁵I Cry1Ab是0.25nM。¹²⁵I Cry1Ab的100％百分比特异性结合以缺乏非标记的Cry1Ab情况下的总体结合减去存在500nM Cry1Ab的情况下测量的非特异性结合测量。在高到1,000nM的浓度(比放射性标记的置换配体的浓度高4,000倍)测试Vip3Ab1，并且其不置换¹²⁵I Cry1Ab的结合。非放射性标记物在约2nM置换¹²⁵I Cry1Ab达50％。

序列简述

SEQ ID NO:1是N端片段Cry1Ab杀虫蛋白。

SEQ ID NO:2是全长Vip3Ab蛋白，其在结合研究中使用时经胰蛋白酶加工成核心片段(残基200-788)。

SEQ ID NO:3是全长Cry1Ab蛋白，其在结合研究中使用时经胰蛋白酶加工成核心片段(残基29-612)。

发明详述

本发明部分得到如下的发现支持，即Vip3Ab和Cry1Ab彼此不竞争对来自谷实夜蛾(棉铃虫；CEW)的肠受体的结合。

本发明包括使用Vip3Ab和Cry1Ab来保护玉米和其它经济上重要的植物物种免于由CEW进食引起的损伤和产量损失及防止CEW群体形成对任一种这些蛋白质的抗性。

本发明提供了用于控制鳞翅目害虫的组合物，其包含生成含有Cry1Ab核心毒素的蛋白质和含有Vip3Ab核心毒素的蛋白质的细胞。

本发明进一步包含经转化以生成Cry1Ab杀虫蛋白和Vip3Ab杀虫蛋白两者的宿主，其中所述宿主是微生物或植物细胞。在一些实施方案中，植物细胞是非增殖/非全能细胞。优选地，主题多核苷酸在遗传构建体中在非苏云金芽孢杆菌启动子(与该启动子可操作连接/包含该启动子)的控制下。主题多核苷酸可以包含实现植物中表达增强的植物密码子选择。

另外，意图本发明提供一种控制鳞翅目害虫的方法，包括使所述害虫或所述害虫的环境与有效量的组合物接触，所述组合物含有含Cry1Ab核心毒素的蛋白质，并且进一步含有含Vip3Ab核心毒素的蛋白质。

本发明的一个实施方案包括玉米植物及此类植物的种子，所述玉米包含编码含Vip3Ab核心毒素的蛋白质的植物表达型基因和编码含Cry1Ab核心毒素的蛋白质的植物表达型基因。

本发明的又一个实施方案包含玉米植物及此类植物的种子，其中编码含Vip3Ab核心毒素的蛋白质的植物表达型基因和编码含Cry1Ab核心毒素的蛋白质的植物表达型基因已经渐渗入所述玉米植物中。

如实施例中描述的，使用经放射性标记的Cry1Ab的竞争性受体结合研究显示了Cry1Ab核心毒素蛋白不竞争与Vip3Ab结合的CEW昆虫组织中的结合。这些结果还指示Cry1Ab和Vip3Ab蛋白的组合是一种减轻CEW群体中对Cry1Ab形成抗性(及同样地，形成对Vip3Ab的抗性)的有效手段，并且可能会提高表达这两种蛋白质的玉米植物中对此害虫的抗性水平。如此，部分基于本文中描述的数据，认为Vip3Ab和Cry1Ab蛋白的共生成(叠加)可以用于产生针对CEW的高剂量IRM叠加。

可以将其它蛋白质添加到此对以扩充昆虫控制谱。另一种部署选项会是与另一种第三毒素/基因组合使用Cry1Ab和Vip3Ab蛋白，以及使用此三重叠加来减轻CEW中对这些中任一种毒素形成抗性。如此，本发明的另一种部署选项会是在CEW能形成抗性群体的作物生长区中使用两种、三种、或更多种蛋白质。

因而，本发明还部分涉及三种(或更多种)毒素的三重叠加或“金字塔(pyramid)”，其中Cry1Ab和Vip3Ab毒素是基础对。在一些优选的金字塔实施方案中，选定的蛋白质提供针对CEW的非竞争性作用。

本发明的范围内包括生成蛋白质的任何主题组合的植物(和种植有此类植物的土地面积)。还可以添加其它毒素/基因，但是上文所讨论的特定叠加有利地且令人惊讶地提供针对CEW的多种作用模式。这可以有助于降低或消除对避难所土地面积的需要。如此，本发明内包括如此种植有超过10英亩的田地。

也可以使用GENBANK来获得本文中公开的或提及的任何基因和蛋白质的序列。

可以使用本发明中描述的蛋白质组合来控制鳞翅目害虫。成年鳞翅目，例如蝴蝶和蛾主要以花蜜为食，并且是传粉的重要实现物(effector)。几乎所有鳞翅目幼虫，即毛虫以植物为食，并且许多是严重的害虫。毛虫在叶上或内部进食或者以植物的根或茎为食，对植物剥夺营养物，而且经常破坏植物的物理支持结构。另外，毛虫以果实、织物、和贮存的谷物和面粉为食，毁坏出售的这些产品或者严重降低其价值。如本文中所使用的，提及鳞翅目害虫指害虫的各个生命阶段，包括幼虫阶段。

本发明的一些嵌合毒素包括Bt毒素的完整N端核心毒素部分，并且在超出核心毒素部分末端的某个点处，蛋白质具有向异源原毒素(protoxin)序列的过渡。Bt毒素的N端杀虫活性的毒素部分称为“核心”毒素。自核心毒素区段至异源原毒素区段的过渡可以大致在毒素/原毒素连接处发生或者，在备选中，可以保留天然原毒素的部分(超出核心毒素部分延伸)，其中在下游发生向异源原毒素部分的过渡。

举例而言，本发明的一个嵌合毒素是Cry1Ab的完整核心毒素部分(约前600个氨基酸)和异源原毒素(C端分子的剩余部分)。在一个优选的实施方案中，嵌合毒素中包含原毒素的部分源自另一Cry1Ab蛋白毒素。

本领域技术人员会领会，Bt毒素(即使在某个种类诸如Cry1A内)在长度和核心毒素部分向原毒素部分过渡的精确位置上会以一定程度有所变化。通常，Cry1Ab毒素的长度是约1150至约1200个氨基酸。自核心毒素部分至原毒素部分的过渡通常会在全长毒素的约50％-约60％发生。本发明的嵌合毒素会包括整段(full expanse)的此N端核心毒素部分。如此，嵌合毒素会包含Cry1Ab Bt毒素蛋白的全长的至少约50％。这通常会是至少约590个氨基酸。关于原毒素部分，整段的Cry1Ab原毒素部分自核心毒素部分末端延伸至分子的C端。

基因和毒素。依照本发明有用的基因和毒素不仅包括公开的全长序列，而且还包括保留本文中明确例示的毒素的特征性杀虫(pesticidal)活性的这些序列、变体、突变体、和融合蛋白的片段。如本文中所使用的，术语基因的“变体”或“变异”指编码相同毒素或编码具有杀虫活性的等同毒素的核苷酸序列。如本文中所使用的，术语“等同毒素”指与要求保护的毒素具有相同或基本上相同的针对靶害虫的生物学活性的毒素。

如本文中所使用的，按照“Revision of the Nomenclature for the Bacillusthuringiensis Pesticidal Crystal Proteins,”N.Crickmore,D.R.Zeigler,J.Feitelson,E.Schnepf,J.Van Rie,D.Lereclus,J.Baum和D.H.Dean.Microbiology andMolecular Biology Reviews(1998)第62卷:807-813，边界代表约95％(Cry1Ab和Vip3Ab)、78％(Cry1F和Vip3A)、和45％(Cry1和Vip3)序列同一性。这些截留也可以仅仅应用于核心毒素(对于例如Cry1Ab)。例如，依照本发明使用的蛋白质可以与本文中例示或明确提出的蛋白质是至少75％,85％,90％,95％,或99％(及此范围内的任何整数增量)相同的(氨基酸同一性)。这包括由依照本发明使用的多核苷酸/DNA编码的蛋白质。

对于本领域技术人员应当显而易见的是，可以经由几种手段鉴定并获得编码活性毒素的基因。可以自保藏于培养物保藏所的分离物获得本文中例示的特定基因或基因部分。也可以例如通过使用基因合成仪以合成方式构建这些基因或其部分或变体。可以使用用于生成点突变的标准技术来容易地构建基因的变异。还有，可以使用商品化的外切核酸酶或内切核酸酶依照标准的规程来生成这些基因的片段。例如，可以使用酶诸如Bal31或定点诱变自这些基因的末端系统性剪断核苷酸。也可以使用多种限制酶来获得编码活性片段的基因。可以使用蛋白酶来直接获得这些蛋白质毒素的活性片段。

保留例示的毒素的杀虫活性的片段和等同物会在本发明的范围内。还有，由于遗传密码的冗余，多种不同DNA序列可以编码本文中公开的氨基酸序列。完全在本领域技术人员的技术内的是创建编码相同的，或基本上相同的毒素的这些备选DNA序列。这些变体DNA序列在本发明的范围内。如本文中所使用的，提及“基本上相同的”序列指具有没有实质性影响杀虫活性的氨基酸取代、缺失、添加、或插入的序列。编码保留杀虫活性的蛋白质的基因的片段也包括在此定义中。

用于鉴定依照本发明有用的编码毒素的基因和基因部分的又一种方法是经由使用寡核苷酸探针。这些探针是可检测的核苷酸序列。这些序列凭借合适的标记物可以是可检出的或者可以以固有荧光生成，如记载于国际申请No.WO93/16094的。如本领域中公知的，若探针分子和核酸样品通过形成两种分子间强烈的键来杂交，则可以合理地假设探针和样品具有实质的同源性。优选地，通过本领域中公知的技术在严格条件下进行杂交，如记载于例如Keller,G.H.,M.M.Manak(1987)DNA Probes,Stockton Press,New York,N.Y.,第169-170页的。盐浓度和温度组合的一些例子如下(以严格性升高的次序)：2X SSPE或SSC于室温；1X SSPE或SSC于42℃；0.1X SSPE或SSC于42℃；0.1X SSPE或SSC于65℃。探针的检测提供了一种用于以已知的方式测定杂交是否已经发生的手段。此类探针分析提供一种用于鉴定本发明的毒素编码基因的快速方法。可以使用DNA合成仪和标准的规程来合成依照本发明作为探针使用的核苷酸区段。也可以使用这些核苷酸序列作为PCR引物以扩增本发明的基因。

变体毒素。已经在本文中明确例示本发明的某些毒素。因为这些毒素仅是本发明的毒素例示性的，所以应当容易显而易见的是，本发明包括具有例示毒素的相同或相似杀虫活性的变体或等同毒素(和编码等同毒素的核苷酸序列)。等同毒素与例示的毒素会具有氨基酸同源性。此氨基酸同源性通常会大于75％，优选大于90％，且最优选大于95％。氨基酸同源性在毒素中负责生物学活性或者牵涉决定最终负责生物学活性的三维构型的至关重要的区域中会是最高的。在这点上，某些氨基酸取代是可接受的，并且若这些取代在对于活性不是至关重要的区域中或者是不影响分子的三维构型的保守氨基酸取代，则可以是预期的。例如，氨基酸可以放入以下种类：非极性、不带电荷的极性、碱性、和酸性。其中的一类氨基酸用相同类型的另一种氨基酸替换的保守取代落入本发明的范围内，只要取代不实质性改变化合物的生物学活性。下文是属于每类的氨基酸的例子的列表。

氨基酸的种类	氨基酸的例子
		非极性	Ala,Val,Leu,Ile,Pro,Met,Phe,Trp
不带电荷的极性	Gly,Ser,Thr,Cys,Tyr,Asn,Gln
		酸性	Asp,Glu
碱性	Lys,Arg,His

在一些情况中，也可以进行非保守取代。至关重要的因素是这些取代必须不显著降低毒素的生物学活性。

重组宿主。可以将编码本发明的毒素的基因导入极其多种微生物或植物宿主中。毒素基因的表达直接或间接导致杀虫剂(pesticide)的胞内生成和维持。可以使用接合转移和重组转移来创建表达本发明的两种毒素的Bt菌株。也可以用一种或两种毒素基因转化其它宿主生物体，所述毒素基因然后用于实现协同效应。凭借合适的微生物宿主，例如假单胞菌属(Pseudomonas)，可以将微生物应用于害虫的位置，在那里它们会增殖并被摄取。结果是对害虫的控制。或者，可以在延长毒素的活性并且稳定细胞的条件下处理为毒素基因做宿主的微生物。然后，可以将经处理的细胞(其保留毒性活性)应用于靶害虫的环境。

在经由合适的载体将Bt毒素基因导入微生物宿主中，且将所述宿主应用于生活状态的环境的情况中，使用某些宿主微生物是必要的。选择如下的微生物宿主，已知所述微生物宿主占据一种或多种感兴趣作物的“植物圈”(叶面(phylloplane)、叶圈、根际、和/或根面)。这些微生物选择为使得能够在特定环境(作物和其它昆虫生境)中与野生型微生物成功竞争，提供表达多肽杀虫剂的基因的稳定维持和表达，且期望地，提供改善的保护杀虫剂免于环境降解和灭活。

已知大量微生物驻留于极其多种重要的作物的叶面(植物叶的表面)和/或根际(植物根周围的土壤)。这些微生物包括细菌、藻类和真菌。特别感兴趣的是微生物，诸如细菌，例如假单胞菌属、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属(Rhizobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、嗜甲基菌属(Methylophilius)、土壤杆菌属(Agrobactenum)、醋杆菌属(Acetobacter)、乳酸菌属(Lactobacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、明串珠菌属(Leuconostoc)、和产碱菌属(Alcaligenes)；真菌，特别是酵母，例如属酵母菌属(Saccharomyces)、隐球酵母属(Cryptococcus)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、红酵母属(Rhodotorula)、和短梗霉属(Aureobasidium)。特别感兴趣的是植物圈细菌物种，诸如丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、根癌土壤杆菌(Agrobactenium tumefaciens)、类球红细胞(Rhodopseudomonas spheroids)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、苜蓿中华根瘤菌(Rhizobium melioti)、真养产碱菌(Alcaligenes entrophus)、和维涅兰德固氮菌(Azotobacter vinlandii)；和植物圈真菌物种，诸如深红类酵母菌(Rhodotorula rubra)、胶红类酵母菌(R.glutinis)、海滨红酵母(R.marina)、橙黄红酵母菌(R.aurantiaca)、白色隐球菌(Cryptococcus albidus)、液化隐球菌(C.diffluens)、劳伦梯氏隐球菌(C.laurentii)、罗氏酵母(Saccharomyces rosei)、S.pretoriensis、酿酒酵母(S.cerevisiae)、玫红掷孢酵母(Sporobolomyces roseus)、香气掷孢酵母(S.odorus)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces veronae)、和出芽短梗霉菌(Aureobasidium pollulans)。特别感兴趣的是色素性微生物。

极其多种方法可用于在容许基因的稳定维持和表达的条件下将编码毒素的Bt基因导入微生物宿主中。这些方法是本领域技术人员公知的，并且记载于例如美国专利No.5135867，通过提及而将其收入本文。

细胞的处理。可以处理表达Bt毒素的苏云金芽孢杆菌或重组细胞以延长毒素活性并稳定细胞。形成的杀虫剂微囊体包含在已经稳定化的细胞结构内的一种或多种Bt毒素，并且在将微囊体应用于靶害虫的环境时会保护毒素。合适的宿主细胞可以包括原核生物或真核生物，通常不限于那些不生成对于高等生物体，诸如哺乳动物有毒性的物质的细胞。然而，可以使用生成对于高等生物体有毒性的物质的生物体，其中毒性物质是不稳定的或应用水平充分降低，从而避免对哺乳动物宿主的毒性的任何可能性。作为宿主，特别感兴趣的会是原核生物和低等真核生物，诸如真菌。

细胞通常会是完整的，并且在处理时基本上为增殖形式，而不是为孢子形式，尽管在一些情况中可以采用孢子。

可以通过化学或物理手段，或者通过化学和/或物理手段的组合来处理微生物细胞，例如含有一种或多种B.t.毒素基因的微生物，只要所述技术没有不利地影响毒素的特性，也不降低保护毒性的细胞性能。化学试剂的例子是卤化剂，特别是原子数17-80的卤素。更特别地，可以将碘在温和(mild)条件下且持续足够的时间使用，使得实现期望的结果。其它合适的技术包括用醛，诸如戊二醛；抗感染药，诸如氯化苄烷铵(zephiran chloride)和西吡氯铵(cetylpyridinium chloride)；醇，诸如异丙基和乙醇；各种组织固定剂，诸如Lugol碘、Bouin氏固定剂、各种酸和Helly氏固定剂(见：Humason,Gretchen L.,AnimalTissue Techniques,W.H.Freeman and Company,1967)；或在对宿主环境施用细胞时保留并延长细胞中生成的毒素的活性的物理(热)和化学剂的组合处理。物理手段的例子是短波长辐射，诸如gamma-辐射和X-辐射、冷冻、UV照射、冻干等。用于处理微生物细胞的方法披露于美国专利No.4,695,455和4,695,462，通过提及而将其收入本文。

细胞一般会具有增强的结构稳定性，这会增强对环境条件的抗性。在杀虫剂为原型(proform)的情况中，细胞处理的方法应当选择为使得不抑制靶害虫病原体将原型加工成杀虫剂的成熟形式。例如，甲醛会交联蛋白质，而且可以抑制对多肽杀虫剂的原型的加工。处理方法应当至少保留毒素的生物利用度或生物活性的实质性部分。

出于生成目的选择宿主细胞中特别感兴趣的特征包括容易将一种或多种B.t.基因导入宿主中、表达系统的利用度、表达效率、杀虫剂在宿主中的稳定性、和辅助遗传性能的存在。作为杀虫剂微囊体使用的感兴趣特征包括杀虫剂的保护质量，诸如厚的细胞壁、色素沉着、和包含体的胞内包装或形成；在水性环境中存活；缺乏哺乳动物毒性；对摄食的害虫的吸引力；在不损害毒素的情况中容易杀死和固定；等等。其它考虑因素包括容易配制和处理、经济、贮存稳定性，等等。

细胞生长。可以将含有一种或多种B.t.杀虫基因的细胞宿主在任何便利的营养培养基中培养，其中DNA构建体提供选择优势，提供选择培养基，使得基本上所有或所有细胞保留B.t.基因。然后，可以依照常规的方式收获这些细胞。或者，可以在收获前处理细胞。

可以使用标准技术培养基和发酵技术来培养生成本发明的毒素的B.t.细胞。在完成发酵周期后，可以如下收获细菌，即首先通过本领域中公知的手段自发酵培养基分离B.t.孢子和晶体。可以通过添加表面活性剂、分散剂、惰性载体和其它组分将回收的B.t.孢子和晶体配制成可湿的粉末、液体浓缩物、颗粒剂或其它配制剂以便于针对特定的靶害虫的处理和应用。这些配制剂和应用规程是本领域中公知的。

配制剂(formulation)。可以将含有引诱剂和B.t.隔离群、或包含自本文中公开的B.t.隔离群可获得的基因的重组微生物的孢子、晶体、和毒素的配制的诱饵颗粒剂应用于土壤。也可以将配制的产物以种子涂层材料或根处理或总体植物处理在作物周期的后期阶段应用。B.t.细胞的植物和土壤处理可以以可湿的粉末、颗粒或粉尘采用，其通过混合各种惰性材料，诸如无机矿物质(叶硅酸盐(phyllosilicate)、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐等)或植物材料(粉状玉米穗轴、稻壳、胡桃壳等)来实现。配制剂可以包含展着剂-粘着剂(spreader-sticker)佐剂、稳定剂、其它杀虫添加剂、或表面活性剂。液体配制剂可以是基于水性的或非水性的，并且以泡沫、凝胶、悬浮液、可乳化的浓缩物等采用。成分可以包括流变剂、表面活性剂、乳化剂、分散剂、或聚合物。

如本领域技术人员会领会的，杀虫浓度会随特定配制剂的性质，特别是它是浓缩物还是要直接使用而广泛变化。杀虫剂会以至少1％(按重量计)存在，并且可以是100％(按重量计)。干配制剂会具有约1-95％(按重量计)的杀虫剂，而液体配制剂一般会是液相中约1-60％(按重量计)的固体。配制剂一般会具有约10²至约10⁴个细胞/mg。这些配制剂会以每公顷约50mg(液体或干的)至1kg或更多施用。

可以通过喷雾、喷粉、喷洒等将配制剂应用于鳞翅目害虫的环境，例如叶或土壤。

植物转化。一种用于生成本发明的杀虫蛋白的优选的重组宿主是经转化的植物。可以使用本领域中公知的多种技术来将如本文中所公开的编码Bt毒素蛋白的基因插入植物细胞中。例如，包含大肠杆菌(Escherichia coli)中的复制系统和容许选择经转化的细胞的标志物的大量克隆载体可用于准备好将外来基因插入高等植物中。例如，载体包括pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184，等等。因而，可以将具有编码Bt毒素蛋白的序列的DNA片段在合适的限制性位点插入载体中。可以使用所得的质粒对大肠杆菌转化将大肠杆菌细胞在合适的营养培养基中培养，然后收获并裂解。将质粒回收。序列分析、限制性分析、电泳、和其它生物化学-分子生物学方法一般作为分析方法实施。在每次操作后，可以将使用的DNA序列切割，并与下一DNA序列连接。可以在同一或其它质粒中克隆每个质粒序列。根据将期望的基因插入植物中的方法，其它DNA序列可以是必要的。如果例如使用Ti或Ri质粒转化植物细胞，那么至少Ti或Ri质粒T-DNA的右侧边界，但是经常是右侧和左侧边界必须作为要插入的基因的侧翼区连接。T-DNA转化植物细胞的用途已经透彻研究，并且充分记载于EP 120 516,Lee和Gelvin(2008),Hoekema(1985),Fraley等,(1986),及An等,(1985)，而且是本领域中完善建立的。

一旦将插入的DNA在植物基因组中整合，它便是相对稳定的。转化载体通常含有选择标志，其对经转化的植物细胞赋予对抗微生物剂或抗生素诸如Bialaphos、卡那霉素、G418、博来霉素、或潮霉素等的抗性。因而，个别采用的标志物应当容许选择经转化的细胞，而不是不含插入的DNA的细胞。

大量技术可用于将DNA插入植物宿主细胞中。那些技术包括使用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或毛根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)作为转化剂用T-DNA的转化、融合、注射、生物射弹(微粒轰击)、或电穿孔以及其它可能的方法。若使用土壤杆菌进行转化，则必须将要插入的DNA克隆入特殊的质粒中，即克隆入中间载体中或克隆入二元载体中。可以通过由于与T-DNA中的序列同源的序列所致的同源重组将中间载体整合入Ti或Ri质粒中。Ti或Ri质粒还包含转移T-DNA必需的vir区。中间载体不能在土壤杆菌中自身复制。可以依靠辅助质粒将中间载体转移入根癌土壤杆菌中(接合)。二元载体在大肠杆菌和土壤杆菌中都能自身复制。它们包含选择标志基因和接头或多接头，其以右侧和左侧T-DNA边界区为框。可以将它们直接转化入土壤杆菌中(Holsters等,1978)。用作宿主细胞的土壤杆菌包含携带vir区的质粒。vir区是将T-DNA转移入植物细胞中必需的。可以含有别的T-DNA。使用如此转化的细菌来转化植物细胞。有利地，可以将植物外植体与根癌土壤杆菌或毛根土壤杆菌一起培养以将DNA转移入植物细胞中。然后，可以在可含有供选择用的抗生素或抗微生物剂的选择培养基中自感染的植物材料(例如，叶块、柄(stalk)段、根，而且还有原生质体或悬浮培养的细胞)再生全植物。然后，可以对如此获得的植物测试插入的DNA的存在。在注射和电穿孔的情况中质粒没有特殊需要。有可能使用普通的质粒，诸如例如pUC衍生物。

经转化的细胞以常见的方式在植物内部生长。它们可以形成生殖细胞，并且将转化的性状传递给后代植物。可以将此类植物以正常的方式培养，并且与具有相同转化遗传因子或其它遗传因子的植物杂交。所得的杂种个体具有相应的表型特性。

在本发明的一个优选的实施方案中，会用基因转化植物，其中已经对植物优化密码子选择。见例如美国专利No.5380831，在此通过提及而将其收录。虽然在本文中例示了一些截短的毒素，但是Bt领域中公知的是，130kDa型(全长)毒素具有作为核心毒素的N端半部分和作为原毒素“尾部”的C端半部分。如此，合适的“尾部”可以与本发明的截短的/核心毒素一起使用。见例如美国专利No.6218188和美国专利No.6673990。另外，用于创建用于植物的合成Bt基因的方法是本领域中已知的(Stewart和Burgin,2007)。优选的转化植物的一个非限制性例子是能育的玉米植物，其包含编码Cry1Ab蛋白的植物可表达基因，而且进一步包含编码Vip3Ab蛋白的第二植物可表达基因。

可以通过轮回选择育种，例如通过回交来实现Cry1Ab-和Vip3Ab-决定性状对近交玉米系的转移(或渐渗入。在此情况中，首先将期望的轮回亲本与携带适合于Cry1F-和Vip3Ab-决定性状的基因的供体近交物(非轮回亲本)杂交。然后，将此杂交的后代与轮回亲本回交(mate back)，接着在所得的后代中选择要自非轮回亲本转移的期望的性状。在与轮回亲本回交及选择期望的性状的3个，优选地4个，更优选地5个或更多个世代后，后代在控制所转移的性状的基因座方面会是杂合的，但是在大多数或几乎所有其它基因方面会与轮回亲本一样(见例如Poehlman和Sleper(1995)Breeding Field Crops,第4版,172-175；Fehr(1987)Principles of Cultivar Development,第1卷:Theory and Technique,360-376)。

昆虫抗性管理(IRM)策略。例如，Roush等概述了2毒素策略，又称作“金字塔化(pyramiding)”或“叠加”，用于管理杀虫转基因作物。(The Royal Society.Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.(1998)353,1777-1786)。

在其网站上，美国环境保护局(epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm)公布了提供与生成针对靶害虫有活性的单一Bt蛋白的转基因作物一起使用的非转基因(即，非B.t.)避难所(非Bt作物/玉米的部分)的下列要求。

“玉米螟防护的Bt(Cry1Ab或Cry1F)玉米产品的特定结构化需要如下：

结构化避难所：玉米带中20％非鳞翅目Bt玉米避难所；

棉花带中50％非鳞翅目Bt避难所

区组

内部(即，在Bt田内)

外部(即，在1/2英里(若可能的话，1/4英里)Bt田内的不同田地以使随机杂交最大化)

田间条(Strip)

条必须宽至少4行(优选地6行)以降低幼虫运动的效果”

另外，国家玉米种植者协会(National Corn Growers Association)，在其网站上：

(ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn)

还提供关于避难所需要的类似指导。例如：

“玉米螟IRM的要求：

-以避难杂种种植至少20％的玉米地

-在棉花生产区中，避难所必须是50％

-必须在1/2英里的避难杂种内种植

-避难所可以在Bt田内以条种植；避难条必须宽至少4行

-只有当对靶昆虫达到经济阈值时，可以用常规的杀虫剂处理避难所

-基于Bt的可喷射的杀虫剂不能对避难玉米使用

-必须在有Bt玉米的每个农场种植合适的避难所”

如由Roush等(例如第1780和1784右栏)所述，各自针对靶害虫有效的且具有很少或没有交叉抗性的两种不同蛋白质的叠加或金字塔化可以容许使用更小的避难所。Roush提示，对于成功的叠加，小于10％避难所的避难所大小可以提供与单一(非金字塔化)性状的约50％避难所相当的抗性管理。对于目前可用的金字塔化Bt玉米产品，美国环境保护局要求比对于单一性状产品(一般为20％)显著更少(一般为5％)的非Bt玉米的结构化避难所。

存在有提供避难所的IRM效果的多种方式，包括田间的各种几何种植样式(如上文所提及的)和袋中种子混合物，如由Roush等(见上文)及美国专利No.6,551,962进一步讨论的。

可以对主题双重或三重叠加或金字塔使用上述百分比、或类似的避难所比率。对于具有针对单一靶害虫的三种作用模式的三重叠加，目的会是0避难所(或例如小于5％避难所)。这特别适用于商业面积—例如超过10英亩的。

本文中提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请、和出版物通过提及以它们与本说明书的明确教导不矛盾的程度完整收录。

如本文中所使用的，除非明确指示或暗示，术语“一个”、“一种”、和“该/所述”表示“至少一个/种”。

以下是例示用于实施本发明的规程的实施例。这些实施例不应解释为限制性的。除非另有记录，所有百分比是按重量计，而所有溶剂混合物比例是按体积计。所有温度以摄氏度计。

实施例

实施例1：实施例概要

以下实施例证明Vip3Ab1针对棉铃虫(CEW)与Cry1Ab具有非交叉抗性活性，由此显示这两种蛋白质可以抵消CEW中形成对单独的任一这些蛋白质的抗性。

我们进一步证明了Vip3Ab1针对小菜蛾(Plutella xylostella)(Linnaeus)(菱纹背蛾(diamondback moth))幼虫及针对Cry1Ab抗性小菜蛾(Linnaeus)幼虫是有活性的。在饮食掺入生物测定法中，Vip3Ab1针对此昆虫的两种品系都是毒素的。

使用¹²⁵I Cry1Ab的经放射性标记的竞争结合研究提供了此抗性管理的进一步支持。呈现了如下的数据，其显示经¹²⁵I放射性标记的Cry1Ab强烈且特异性结合位于来自美洲棉铃虫(Heliothis zea)幼虫中肠的刷状缘膜囊(BBMV)制备物中的特定的一组受体蛋白。放射性Cry1Ab对其受体的结合可以通过使用来自此昆虫的BBMV中的非放射性Cry1Ab竞争性置换。然而，Vip3Ab1(或是为其全长85kDa形式，或是在通过胰蛋白酶酶促加工成较小分子量的经加工的蛋白质时)在此昆虫的情况下不将¹²⁵I Cry1Ab的结合从其受体置换。这些结果显示了Vip3Ab在与Cry1Ab结合的地方不同位置施加其生物学效应。

实施例2：Cry1Ab和Vip3Ab1蛋白的纯化和胰蛋白酶加工。

在荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)表达菌株中表达编码Cry1Ab和Vip3Ab1原毒素的基因，并且将全长蛋白质以不溶性包含体分离。通过于37℃在含有20mMCAPS缓冲液,pH 11,+10mM DDT,+0.1％2-巯基乙醇的缓冲液中搅拌2小时溶解清洗过的包含体。将溶液于37℃以27,000x g离心10分钟，并用经0.5％(w/v)TCPK处理的胰蛋白酶(Sigma)处理上清液。将此溶液在混合的情况下于室温再温育1小时，过滤，然后加载到用20mM CAPS pH10.5平衡的Pharmacia Mono Q 1010柱上。在用2个柱体积的缓冲液清洗加载柱后，以1.0ml/分钟的流速使用15个柱体积中的20mM CAPS中的0至0.5M NaCl的线性梯度洗脱截短的毒素。纯化的经胰蛋白酶截短的Cry蛋白在约0.2-0.3M NaCl处洗脱。通过SDSPAGE并使用考马斯亮蓝染料显现检查蛋白质的纯度。在一些情况中，将纯化毒素的组合级分浓缩，并加载到Superose6柱(直径为1.6cm,长60cm)上，并通过大小排阻层析进一步纯化。将包含单体分子量的单一峰的级分组合，并浓缩，生成在具有约60,000kDa分子量的蛋白质方面超过95％同质的制备物。

以纯化的全长85kDa蛋白(DIG-307)开始，以类似的方式实现Vip3Ab1的加工。将该蛋白质(12mg)透析入50mM磷酸钠缓冲液，pH 8.4中，然后通过添加1mg固体胰蛋白酶，并于室温温育1小时加工。将该溶液加载到MonoQ阴离子交换柱(直径1cm,长10cm)上，并在7个柱体积里用20mM磷酸钠缓冲液，pH 8.4中0至500mM的NaCl线性梯度洗脱。通过SDS-PAGE监测蛋白质的洗脱。主要的经加工的条带具有65kDa的分子量，如使用供比较用的分子量标准品通过SDS-PAGE测定的。

实施例3：昆虫生物测定法。

在人工昆虫饮食上用新生小菜蛾(Linnaeus)和美洲棉铃虫幼虫进行的生物测定法中对纯化的蛋白质测试杀昆虫活性。Cry1A抗性小菜蛾经由使用商业Bt产品的饮食攻击方案形成，并且源自NO-QA品系(Tabashnik等,1996；Tabashnik等,1997)。

在128孔塑料生物测定盘(C-D International,Pitman,NJ)中进行昆虫生物测定法。每孔含有0.5mL多物种鳞翅目饮食(Southland Products,Lake Village,AR)。通过移液到每孔的1.5cm²饮食表面(26.7μL/cm²)上投递40μL在10mM CAPS,pH 10.5中稀释至多个浓度的纯化的Cry或Vip3Ab1蛋白的等分试样，或对照溶液。每份样品测试16个孔。阴性对照是不含蛋白质的缓冲溶液空白。阳性对照包括Cry1Ac或Cry1F的制备物。将经处理的盘在通风橱中保持，直到饮食表面上的液体蒸发或吸收到饮食中。

在羽化的几小时内，将个体幼虫用湿润的骆驼毛刷挑出，并在经处理的饮食上放置，每孔一个幼虫。然后，将侵袭孔用经过开孔以容许气体交换的干净塑料粘合片(C-DInternational,Pitman,NJ)密封。将生物测定盘在受控环境条件(28℃,约40％RH,16:8[L:D]光周期)下保持。在5天后，记录暴露于每种蛋白质样品的昆虫总数、死亡昆虫的数目、和存活昆虫的重量。

实施例4：Cry1Ab毒素的碘化。

使用碘珠(Iodo-Beads)(Pierce)碘化纯化的经胰蛋白酶截短的Cry1Ab核心毒素。简言之，将两个碘珠用500μl PBS(20mM磷酸钠,0.15M NaCl,pH 7.5)清洗两次，并在铅防护后面放入1.5ml离心管中。对此添加，将100μl PBS添加至碘珠。在罩中并且遍及正确放射性处理技术的使用，将0.5mCi Na¹²⁵I(17.4Ci/mg,Perkin Elmer)添加至具有碘珠的PBS溶液。容许组分于室温起反应5分钟，然后，将5μg高度纯的截短的Cry1Ab添加至溶液，并容许再起反应3-5分钟。通过从碘珠除去溶液，并将其应用于10mM CAPS,pH 10.5中平衡的脱盐旋转柱(G-20,GE biosciences)终止反应。将碘珠用50μl PBS清洗两次，并且也将清洗溶液应用于脱盐柱。通过以1,000x g离心2分钟将放射性溶液洗脱流过脱盐柱。经¹²⁵I放射性标记的碘Cry1Ab在gamma计数器中计算放射性量，并基于输入毒素的假设80％回收测定比活。

实施例5：溶解的BBMV的制备和分级。

采用蛋白质量化和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的标准方法，如例如Sambrook等(Sambrook和Russell,2001)及其更新中教导的。将末龄美洲棉铃虫幼虫禁食过夜，然后在冰上冷却15分钟后解剖。从体腔取出中肠组织，留下与体壁附着的后肠。将中肠在9倍体积的冰冷的均质化缓冲液(300mM甘露醇,5mM EGTA,17mM Tris碱,pH7.5)(其补充有如供应商推荐的那样稀释的蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich P-2714))中放置。用玻璃组织匀浆器的15击将组织均质化。通过Wolfersberger的MgCl₂沉淀法(Wolfersberger,1993)制备BBMV。简言之，将等体积的在300mM甘露醇中的24mM MgCl₂溶液与中肠匀浆混合，搅拌5分钟，并容许在冰上竖立15分钟。将溶液于4℃以2,500x g离心15分钟。保存上清液，并将团粒悬浮到初始体积的0.5倍稀释的均质化缓冲液中，并再次离心。将两份上清液组合，并于4℃以27,000x g离心30分钟，从而形成BBMV级分。将团粒悬浮到BBMV贮存缓冲液(10mM HEPES,130mM KCl,10％甘油,pH 7.4)中，至约3mg/ml蛋白质的浓度。使用BSA作为标准品测定蛋白质浓度。

在冷冻样品前测定L-亮氨酸-对硝基酰基苯胺氨肽酶活性(BBMV级分的一种标志物酶)。简言之，将50μl L-亮氨酸-对硝基酰基苯胺(PBS中的1mg/ml)添加至标准小杯中的940ml 50mM Tris HCl。将小杯在Cary 50Bio分光光度计中放置，相对于405nm处的吸光度读数调整归零，并通过添加10μl昆虫中肠均浆或昆虫BBMV制备物启动反应。于室温监测405nm处的吸光度增加，持续5分钟。基于以下等式基于在对测定法添加的每个单位的总蛋白质的吸光度线性增加期间吸光度增加随时间的动力学测定均浆和BBMV制备物的比活：

ΔOD/(min*mg)＝氨肽酶速率(ΔOD/ml*min)/[蛋白质](mg/ml)

与起始中肠均浆级分中找到的比活相比，此酶的比活通常增加7倍。将BBMV等分取样成250μl样品，在液氮中快速冷冻，并于-80℃贮存。

实施例6：电泳。

还原性(即，在5％β-巯基乙醇中,BME)和变性(即，在存在4％SDS的情况中于90°加热5分钟)条件下进行通过SDS-PAGE对蛋白质的分析。将蛋白质加载到4％至20％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶(BioRad；Hercules,CA)的孔中，并以200伏分离60分钟。通过用考马斯亮蓝R-250(BioRad)染色1小时检测蛋白质条带，并用7％乙酸中的5％甲醇溶液脱色。将凝胶使用BioRad Fluro-S Multi Imager^TM成像并分析。通过与在加载到凝胶的一个孔中的BenchMark^TM蛋白质梯(Invitrogen,Carlsbad,CA)样品中观察到的已知分子量蛋白质的迁移率比较测定蛋白质条带的相对分子量。

实施例7：经¹²⁵I放射性标记的Cry1Ab对来自美洲棉铃虫幼虫的BBMV的结合。

产生饱和曲线以确定BBMV蛋白在Cry核心毒素蛋白结合测定法中使用的最佳量。将0.5nM经¹²⁵I放射性标记的Cry1Ab核心毒素蛋白于28°在结合缓冲液(8mM NaHPO₄,2mMKH₂PO₄,150mM NaCl,0.1％BSA,pH7.4)中与范围为0μg/mL至500μg/mL的BBMV蛋白量(总体积0.5mL)一起温育1小时。将与BBMV蛋白结合的经¹²⁵I标记的Cry核心毒素蛋白与未结合的级分分开，其通过将150μL反应混合物一式三份取样到分开的1.5mL离心管中，并于室温以14,000x g离心样品8分钟来进行。将上清液温和除去，并将团粒用冰冷的结合缓冲液清洗三次。将含有团粒的离心管底部切出，放入13x 75-mm玻璃培养管中，并每5分钟将样品在gamma计数器中计数。将获得的CPM(每分钟计数)减去背景CPM(没有BBMV蛋白的反应)相对于BBMV蛋白浓度绘图。在结合测定法中使用的BBMV蛋白的最佳浓度测定为150μg/mL。

使用150μg/mL BBMV蛋白和0.5nM经¹²⁵I放射性标记的Cry核心毒素蛋白进行同质的和异质的竞争结合测定法。对反应混合物添加的竞争性非放射性标记的Cry核心毒素蛋白的浓度范围为0.045nM至1000nM，并与放射性Cry核心毒素蛋白同时添加，从而确保真正的结合竞争。于28°实施温育1小时，，并测量与BBMV结合的经¹²⁵I标记的Cry核心毒素蛋白量(总体结合)，如上文所描述的。非特异性结合以在存在1,000nM同质的非放射性标记的Cry核心毒素蛋白的情况下获得的计数表示。通过从总体结合扣除获得的非特异性结合水平测量比活。认为100％比活是在缺乏任何竞争物配体的情况下获得的结合量减去在存在1,000nM同质的非放射性标记的Cry核心毒素蛋白的情况下获得的结合量。将通过异质配体置换的量与¹²⁵I Cry1Ab对其受体的100％特异性结合比较。

实施例8：结果汇总

图1中显示了来自针对野生型和Cry1A抗性小菜蛾幼虫，和美洲棉铃虫幼虫在多个剂量测试的全长Vip3Ab1蛋白的生物测定法的死亡率结果。图2中绘制了生物测定法的百分比生长抑制结果。测试的Vip3Ab1浓度是9,000,3,000,1,000,333,111,37,和12ng/cm²。毒素针对小菜蛾幼虫最具活性，显示了野生型和Cry1Ab抗性幼虫两者方面等同的死亡率剂量响应。小菜蛾的LC-50是约200ng/cm²。针对美洲棉铃虫幼虫观察到生长抑制，尽管需要较高的浓度来在测定法的时间期间中产生死亡率。针对美洲棉铃虫幼虫观察到的高水平的生长抑制提示若保持一段较长的时间，则这些昆虫最有可能会行进至死亡。

进行放射性标记的竞争结合测定法以测定经胰蛋白酶截短的Vip3Ab1是否与美洲棉铃虫BBMV中含有的经¹²⁵I放射性标记的Cry1Ab受体蛋白的结合竞争。

进行如下的实验，该实验比较Vip3Ab1与从美洲棉铃虫幼虫制备的BBMV中¹²⁵ICry1Ab的结合竞争的能力(图3)。在BBMV制备物中，显示了非放射性标记的Cry1Ab从美洲棉铃虫BBMV蛋白有效竞争去¹²⁵I Cry1Ab的结合，但是Vip3Ab1不从这些BBMV制备物产生经放射性标记的Cry1Ab配体的任何置换。这三项实验证明Vip3Ab1不与美洲棉铃虫幼虫中Cry1Ab的结合竞争。

昆虫能经由许多不同生物化学机制来形成对Cry蛋白毒性的抗性，但是最常见的机制是由于Cry毒素蛋白结合昆虫肠中的其特异性受体的能力降低所致(Heckel等,2007；Tabashnik等,2000；Xu等,2005)。这可以经由小的点突变、大的基因缺失、或者经由其它遗传或生物化学机制引起。

Vip3Ab1补充Cry1Ab的活性，因为它具有针对相似昆虫的生物学活性，但是不结合与这些Cry蛋白相同的受体结合，如此不受会牵涉Cry毒素结合降低的抗性机制影响。我们从这些研究推断Vip3Ab1是一种与Cry1Ab组合作为昆虫抗性管理方法以提供针对可以已经对这些蛋白质中任一种形成抗性的昆虫的生物学活性，而且还防止Cry1A抗性昆虫存活的卓越昆虫毒素。因为Vip3Ab1对Cry1A抗性昆虫有毒性，所以此毒素会是一种与Cry1Ab组合以投递针对野生型和抗性昆虫两者的活性的卓越叠加配偶。

参考文献列表

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序列表

<110> 陶氏益农公司(Dow AGROSCIENCES LLC)

<120> Vip3Ab和Cry1Ab用于管理抗性昆虫的组合用途

<130> DAS-P0177-01

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 612

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Cry1Ab

<400> 1

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1 5 10 15

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115 120 125

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Vip3Ab1

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<210> 3

<211> 1155

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Cry1Ab 全长(full-length) (MR818)

<400> 3

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1 5 10 15

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145 150 155 160

Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser

165 170 175

Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg

180 185 190

Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp Tyr Ala Val

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Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His

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Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile

435 440 445

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465 470 475 480

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485 490 495

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675 680 685

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690 695 700

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705 710 715 720

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1145 1150 1155

Claims

1.一种产生转基因植物以防止Cry抗性谷实夜蛾(Helicoverpa zea)的形成的方法，其包括将由编码由SEQ ID NO:2组成的Vip3Ab杀虫蛋白的DNA、以及编码由SEQ ID NO:3组成的Cry1Ab杀虫蛋白的DNA转化入宿主植物，其中所述Vip3Ab杀虫蛋白和所述Cry1Ab杀虫蛋白在谷实夜蛾的肠中有不同的受体结合位点。

2.一种管理谷实夜蛾昆虫对源自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的杀虫蛋白形成抗性的方法，所述方法包括种植种子以产生植物田地，其中所述植物包含编码由SEQ ID NO:2组成的Vip3Ab杀虫蛋白的DNA和编码由SEQ ID NO:3组成的Cry1Ab杀虫蛋白的DNA，其中所述Vip3Ab杀虫蛋白和所述Cry1Ab杀虫蛋白在谷实夜蛾的肠中有不同的受体结合位点。

3.权利要求2的方法，其中所述植物田地包含非Bt避难所植物和多个转基因植物，其中所述避难所植物占所述田地中的所有作物植物的小于40％。

4.权利要求3的方法，其中所述避难所植物占所述田地中的所有作物植物的小于30％。

5.权利要求3的方法，其中所述避难所植物占所述田地中的所有作物植物的小于20％。

6.权利要求2的方法，其中所述植物田地包含非Bt避难所植物和多个转基因植物，其中所述避难所植物占所述田地中的所有作物植物的小于10％。

7.权利要求2的方法，其中所述植物田地包含非Bt避难所植物和多个转基因植物，其中所述避难所植物占所述田地中的所有作物植物的小于5％。

8.权利要求3的方法，其中所述避难所植物在区组或条中。

9.一种用于控制对杀虫蛋白抗性的谷实夜蛾昆虫的组合物，所述组合物包含表达有效量的Cry1Ab杀虫蛋白和Vip3Ab杀虫蛋白的细胞，其中所述细胞不是植物品种。

10.权利要求9的组合物，其包含经过转化以表达Cry1Ab杀虫蛋白和Vip3Ab杀虫蛋白的宿主，其中所述宿主是微生物或植物细胞，其中所述植物细胞是非全能性的。

11.一种控制谷实夜蛾昆虫的方法，所述方法包括对所述昆虫提供有效量的权利要求9的组合物。

12.权利要求1的方法，其中所述转基因植物选自下组：玉米、大豆、和棉花。

13.权利要求1的方法，其中所述植物是玉米植物。

14.一种植物细胞，其包含编码Vip3Ab杀虫蛋白的DNA和编码Cry1Ab杀虫蛋白的DNA，其中所述植物细胞是非全能性的。