CN1555414A - 来源于植物的抗性基因 - Google Patents

Abstract

本发明公开了编码能赋予抗植物病原体如真菌(例如致病疫霉菌和相关分离株)抗性或能被其引发的多肽的核酸分子。优选的核酸分子编码马铃薯(Solanum tuberosum)的R1或其天然产生的多种同源物或其多种衍生物。本发明还公开了通过使用R1抗性基因激活抗性的特殊方法，其在某些情况下导致过敏反应。本发明的另一方面包括特异性引物、载体、宿主细胞、多肽、抗体、适体、转基因植物、制备和利用这些物质的方法以及在植物中影响抗性性状的方法。另外，本发明还提供了鉴定和获得植物保护性化合物的筛选方法。

Description

来源于植物的抗性基因

技术领域

本发明涉及来自马铃薯的R1抗性基因。本发明还涉及利用该基因的方法和材料，及鉴定或产生其他相关基因的方法。本发明还广泛涉及鉴定可以诱导R1基因或其编码的蛋白活性的植物保护剂的方法。另外，本发明涉及由于R1转基因的表达而对晚疫病产生抗性的转基因植物。

背景技术

本说明书中以姓名引用了多个文献。完整的文献目录引文可在紧接序列表或权利要求之前的说明书末尾找到。这里引用的每篇文献(包括任何制造商的说明、指导等等)在此引入作为参考；然而，并不承认引用的任何文献确实是本发明的现有技术。

晚疫病是全球范围内对马铃薯种植最具破坏性的病害，每年造成十亿美元的损失(Kamoun等，1999)。致病病原体是致病疫霉菌(Phytophthora infestans)，其为一种卵菌纲真菌，也可侵染番茄(Judelson 1997)。晚疫病引起的马铃薯作物的彻底毁灭造成了19世纪中期的“爱尔兰马铃薯饥荒”(Salaman 1985)并引发了对抗性植物的寻找。大约100年前在一种墨西哥本地的野生马铃薯品种(5.demissum)中发现了对晚疫病具有抗性的单基因(R基因)。R基因渐渗到马铃薯栽培品种赋予小种专化抗性，然而，因为新的小种迅速地克服了R基因介导的抗性，只能提供对晚疫病的短暂抗性(Wastie 1991，Fry和Goodwin1997)。在野生马铃薯品种中还鉴定了针对晚疫病的数量抗性或田间抗性(Ross 1986)。这种抗性比由R基因介导的抗性更持久，但很难通过杂交和表型选择转移到栽培品种中。晚疫病仍主要通过频繁使用杀真菌剂来控制，该杀真菌剂通过杀真菌剂抗性分离种的选择来释放功效。

使用DNA标记已经将几个R基因定位于马铃薯染色体上(Leonards-Schippers等，1992，EI-Kharbotly等，1994，1996，Li等，1998，Ewing等，2000，Naess等，2000)。R1被定位于染色体V(Leonards-Schippers等，1992)的一段区域上，抗马铃薯X病毒(Potato virus X)的单基因也被定位于该区域(Ritter等，1991，De Jong 1997)。同样的区域还包含抗寄生根胞囊线虫马铃薯白线虫(Globodera pallida)(Kreike等，1994，Rouppe van der Voort等，1997，2000)和晚疫病(Leonards-Schippers等，1994，Oberhagemann等，1999，Collins 1999)的主要的数量性状座位(QTL)。抗性基因热点的存在暗示它们从相同的祖先通过局部基因的复制及随后的功能分化进化而来。(Leonards-Schippers等，1994，Leister等，1996，Oberhagemann等，1999，Gebhardt和Valkonen 2001)。如果确是如此，那么R1基因的分子克隆将使在分子水平上研究定位到该区域和参与调控多种病原体的质量和数量抗性的多个因子成为可能。

发明内容

因此，本发明的主要技术问题是为满足对植物病原体抗性基因和其调控序列的需要。

所述技术问题的解决方法通过在权利要求和下面进一步描述中提供的实施方式来获得。

根据本发明，在分子水平上克隆并鉴定了抗晚疫病的第一个基因，即R1。通过位置克隆和候选基因方法相结合的特定方法鉴定该基因。该基因的分子结构使R1归类于含有保守的NBS-LRR和亮氨酸拉链基序的植物抗性基因中(Ellis等，2000，Dangl和Jones，2001)。

R1是通过位置克隆策略并结合寻找具有与已知植物抗性基因相似的DNA序列的候选基因的方法克隆的(Hammond-Kosack和Jones 1997，Ellis等，2000)。相似的方法也成功地用于克隆抗马铃薯X病毒的马铃薯基因(Rxl，Bendahmane等，1999)和抗根胞囊线虫马铃薯白线虫的马铃薯基因(Gpa2，Van der Vossen等，2000)。向R1的染色体步查起始于两个位于R1侧翼短基因距离为0.1厘摩(cM)的标记座位SPUD237和AFLP1。然而，由于缺乏具有AFLP1标记的BAC和YAC克隆(Leister等，1997)，从标记AFLP1的步查没有结果。通过BAC技术并结合使用BAC克隆的大矩阵促进了鉴定带有重叠插入物的马铃薯基因组克隆。在水稻(Nakamura等，1997，Yang等，1997，Yang等，1998)和番茄(Folkertsma等，1998)中已成功采用了上述方法。物理图谱(图1)覆盖马铃薯基因组的至少250kb。根据与BAC末端标记连锁而不重组，约200kb是含有R1基因的候选区域。因为在物理图谱中不包括分离R1和AFLP1的单重组事件，该候选区域对AFLP1座位是开放式的。从该候选区域的部分序列信息鉴定了一个RGL抗性基因类似基因片段，该基因片段检测到成员均存在于携带敏感等位基因r1或抗性等位基因R1的染色体上的基因家族。事实上，用于鉴定针对R1的cDNA和BAC克隆的RGL探针是r1敏感等位基因的一部分。根据从编码部分R1的cDNA克隆中进行的等位基因特异性PCR分析，显示候选基因家族的有功能的成员存在于具有R1抗性等位基因的植物中而不存在于敏感植物中。从BAC BA87d17中亚克隆该候选基因并稳定转化到敏感栽培品种Desirée中。在几个转基因植物中R1表型的互补表明该候选基因确实是R1基因。

因此，本发明涉及一种核酸分子，其编码在植物中表达并能赋予所述植物抵抗病原体抗性的多肽，该核酸分子包含或由选自以下组的核苷酸序列组成：

(a)至少编码含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白(R1)的成熟形式的核苷酸序列；

(b)至少含有SEQ ID NO：1所示DNA序列的一个或一个以上编码区域的核苷酸序列；

(c)在严格杂交条件下与(a)或(b)中定义的核苷酸序列的互补链杂交的核苷酸序列；

(d)编码一种蛋白的核苷酸序列，所述蛋白通过在(a)或(b)的核苷酸序列编码的氨基酸序列中替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸，而由(a)或(b)的核苷酸序列编码的蛋白衍生获得；

(e)编码一种蛋白的核苷酸序列，所述蛋白具有与由(a)或(b)的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少60％一致性的氨基酸序列；

(f)一种核苷酸序列，该核苷酸序列至少编码相当于SEQ ID NO：2中氨基酸308-329位置的亮氨酸拉链(LZ)结构域，相当于SEQ ID NO：2中氨基酸572-682位置的核酸结合位点(NBS)结构域，和/或相当于SEQ ID NO：2中氨基酸780-1280位置的富含亮氨酸重复序列(LRR)结构域；

(g)编码由(a)或(b)中核苷酸序列编码的R1蛋白的携带抗原决定簇部分的核苷酸序列；

(h)包含(a)到(g)的任一核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列；

(i)编码包含SEQ ID NOs：10和12、图4中所示的一个或一个以上基序或氨基酸序列LHD的多肽的核苷酸序列；

(j)在严格条件下用探针筛选合适的文库而获得的DNA序列，所述探针具有SEQ ID NOs：1或5到8的任一核苷酸序列的至少17个连续核苷酸；

(k)编码由(a)或(b)的核苷酸序列编码的蛋白的至少6个连续氨基酸的片段的核苷酸序列；和

(1)由于对(a)到(i)任一核苷酸序列的遗传密码的简并，而产生的核苷酸序列。

第一方面，本发明提供了一种核酸分子，其编码在植物中表达并能赋予所述植物抵抗病原体例如真菌抗性的多肽。

根据本发明，可采用感兴趣或原始种的核酸或基因的重组形式或游离或基本游离形式提供核酸分子而不是以编码具所需功能的多肽的序列形式。核酸分子(及它们编码的多肽产物)也可以为(i)从它们的天然环境中分离和/或纯化(虽然纯化形式本身并不是必需的)，或(ii)基本纯化或均一形式。

根据本发明，核酸可包括cDNA、RNA、基因组DNA，优选完整的基因，可以是完全或部分合成的(构建)。当指定一个DNA序列，如根据一个图或SEQ ID NO，除非上下文要求，否则包括用U替代T的RNA等价物。也包括各种公开序列的互补序列，其可用于探测试验或序列的负调控中。

本发明的一个具体方面是具有SEQ ID NO：1所示序列的所有或部分序列，包括(合适地)编码和/或非编码区的核酸分子。在SEQ ID NO：1中显然有一个大的开放阅读框(ORF)。随后基因组DNA序列和cDNA序列的比较显示该基因含有三个外显子和三个内含子；参见实施例5和图4。推测的R1多肽序列显示于图4中并指定为SEQ ID NO：2。R1含有1293个氨基酸残基，分子量为149.4千道尔顿(kDa)。本发明这一方面的具体的核酸分子包括编码R1蛋白产物的核酸分子和cDNA，据信是除所示的内含子(包含4878-4970和6130-6229)外的碱基2223-6321。令人惊奇地，R1与R蛋白的L.Zip-NBS-LRR类型(Hammond-Kosack和Jones 1997)的一级结构相似。根据推测的蛋白序列，R1属于植物抗性基因的L.Zip/NBS/LRR类型(Hammond-Kosack和Jones 1997)。认为氨基端区域的亮氨酸拉链基序(L.Zip)在二聚作用或与其他蛋白相互作用中起重要作用。下游推测的核苷酸结合位点(NBS)结构域可能参与引起发生抗性反应的信号传导途径。C-末端的富含亮氨酸重复序列(LRR)结构域符合Jones和Jones(1997)描述的细胞质LRR结构域的一致序列，并可能在蛋白-蛋白相互作用和配基结合上起作用。已显示亚麻锈病抗性基因L的等位基因的LRR结构域决定病原体特定小种的识别(Ellis等，1999)。计算机预测R1序列中的四个十四烷基化和43个磷酸化位点暗示R1蛋白可能锚定在质膜上，其磷酸化/去磷酸化步骤，分别参与信号传导(Dangl和Jones 2001)。

R1定位在染色体V的短臂上(Leonards-Schippers等，1992，Dong等，2000)是与抗丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的番茄Prf基因相关的序列，Prf基因定位于番茄染色体5上Pto/Fen抗性基因簇中(Salmeron等，1996)。马铃薯和番茄的染色体5除了短臂上的臂内倒位外彼此是共线性的(Tanksley等，1992)。对应于Pto/Fen的马铃薯座位StPto与最邻近的R1定位超过10cM(Leister等，1996)，因此排除了R1和Prf定位于共线性基因组区域的可能性。然而当考虑赋予抗细菌病原体野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)抗性的番茄Bs4基因时确是这种情况。对应于Bs4的马铃薯座位的位置可从Bs4和标记TG432(Ballvora等，2001)的紧密连锁(1cM)推断出，所述标记TG432在番茄分子图谱上的定位与GP21距离3.8cM(Tanksley等，1992)。当考虑两基因组之间的臂内倒位时，从GP21标记延伸的番茄染色体5的这一区域应和马铃薯含有R1的GP21-GP179区间是共线性的。

抗马铃薯X病毒的两个马铃薯基因Rx2和Nb也和R1定位于相似位置(Ritter等，1991，Leonards-Schippers等，1992，De Jong等，1997)。Rx2基因得到克隆，并且像R1一样，其是抗性基因L.Zip/NBS/LRR类型的成员(Bendahmane等，2000)。这两个抗性基因的序列一致性只有32％，因此是同一基因超家族中非常不同的成员。Nb定位于不含R1的GP21-SPUD237区间(De Jong等，1997)，因此通常与R1分离。

另一方面，本发明公开了有活性的同源的R1序列变异体，例如该变异体可以是突变体或其他衍生物或天然产生的R1同源物如等位变异体、侧向同源物(来自相同的种但在不同的位置如连锁座位的拟等位基因)或直向同源物(来自不同的种的相关基因)。下面显示了这些的例子。每种情况中，变异体编码与R1同源(相似)的产物，其可根据那个序列分离或制备，并能赋予对一种或一种以上病原体的病原体抗性。

抗性基因的活性可用本领域已知的与待测抗性本质适合的常规方法检测。可在下列出版物中找到示例性方法：细菌的(Grant，(1995)《科学(Science)》269，843-846)；真菌的(Dixon，(1996)《细胞(Cell)》84，451-459；Jones，(1994)《科学》266，789-793；Thomas，(1997)《植物细胞(The Plant Cell)》9，2209-2224)；线虫和病毒的(Whitham，(1994)《细胞》78，1101-1115)。典型地，通过植物性状互补检测活性；参见实施例4。这可用分离的基因完成或者例如将推测的活性变异体与用于植物中表达的启动子和终止子耦合并将其转化到缺乏特定的抗性性状的敏感植物中。然后R1变异体的活性通过合适的病原体的攻击而被证实。作为选择，也可使用类似于Mindrinos使用的(Mindrinos，(1994)《细胞》78，1089-1099)瞬时表达分析检测R1变异体的活性。简要地，推测的活性R1变异体和来源于病原体的基因及报告基因(如GUS)从质粒中共表达，其中所述来源于病原体的基因是推测的R1同源物特异性抗性的激发子。如果变异体被来源于病原体基因的持续表达激活，那么会导致过敏反应(HR)，报告基因活性消失。如果没有活性产生，则可检测到报告基因。

可定义变异体和R1的相似性或同源性并可通过本领域标准使用的TBLASTN程序测定，(Altschul，(1990)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》，215，403-10)，或者优选标准程序BestFit，其是1999年1月第10版威斯康星程序包(Wisconsin Package)的一部分(GeneticsComputer Group，575 Science Drive，麦迪逊，威斯康星，美国，威斯康星53711)，在本申请中被用于计算序列同源性。也可采用具有PAM250残基量表(缺口处罚(gap penalty)10，缺口长度(gap length)10)的CLUSTAL方法的DNASTAR软件。同源性(或相似性，或一致性)可以在核苷酸序列水平和/或表达的氨基酸序列水平。优选地，核酸序列和/或氨基酸序列与SEQ ID NO：1的编码序列或核苷酸序列编码的序列或在此提到的其他序列具有同源性，优选同源性至少约50％、或60％、或70％、或80％，最优选同源性至少约90％、95％、96％、97％、98％或99％。同源性可以覆盖在此显示的相关序列的全长，或视具体情况，与相关的氨基酸序列或核苷酸序列相比，可更优选覆盖大约或超过约例如20、100、200、300、500、600个或更多氨基酸或密码子的连续序列。

据信在马铃薯基因组中有两个以上的R1同源物。一种或一种以上的这些同源物可能是抗病毒、真菌、细菌或线虫的R基因。

根据本发明，天然存在的R1变异体可以毫不费力地从任何适合的植物中分离到。天然存在的R1变异体可以从，如基因组或cDNA中分离。如在图4中指定，推测的抗性基因可使用基于R1独有区域的材料(如引物或探针)获得。正如在所附的实施例中讨论的，根据本发明在马铃薯中鉴定的R1基因被认为是植物抗性基因的一种新类型。因此编码显示相似特性的蛋白的对应基因应该也存在于其他植物中。本发明的核酸分子可以通过，如将上述核酸分子与任何来源的核酸分子(样品)杂交获得。与上述核酸分子杂交的核酸分子通常可从任何具有该分子的植物中得到，优选双子叶植物，特别是农业、园艺或木材培育中感兴趣的植物，如农作物，茄科植物如马铃薯和番茄，还有植物如木薯植物，豆科植物，产油植物如油菜、亚麻籽(linenseed)等等，用多肽作为储藏物质的植物如大豆，用蔗糖作为储藏物质的植物如甜菜或甘蔗，树，观赏植物和用于制造生物燃料、再生能源或建筑材料的植物如苎麻等。

因此，本发明的另一方面提供从植物中鉴定和/或克隆同源的R1基因的方法，此方法利用全部或部分上述核苷酸序列。因此在一个实施方式中，本文提供的核苷酸序列信息可用于数据库(如ESTs、或STSs、或其他基因组序列信息)检索以找到同源序列，可检测所述同源序列的表达产物的病原体抗性活性，例如使用基于本发明的瞬时分析方法或常规的转基因植物表型分析方法。

作为选择，基于该序列的探针可用于，如DNA印迹中。例如，从显示合适的抗性性状的植物上取得的细胞中提取DNA，用不同的限制性酶消化。然后在变性前将限制性片段分开(如用琼脂糖凝胶电泳法)并转移到硝酸纤维素滤膜上。标记好的探针可在滤膜上与DNA片段杂交然后判断结合。

预备实验可以在低严格条件下通过杂交进行。对于探针，优选条件是足够严格的以使其成为具有少量杂交反应被鉴定为阳性的单一模式，并可进一步检测所述阳性杂交。例如，杂交反应可以用含有下列组分的杂交液进行：5×SSC(其中SSC＝0.15M氯化钠；0.15M柠檬酸钠；pH＝7)，5×Denhardt试剂，0.5％-1.0％SDS，100μg/ml变性的断裂的鲑鱼精DNA，0.05％焦磷酸钠和可达50％的甲酰胺。在37-42℃进行杂交至少六小时。杂交后，依下列步骤洗滤膜：(1)在2×SSC和1％SDS中于室温洗滤膜5分钟；(2)在2×SSC和0.1％SDS中于室温洗滤膜15分钟；(3)在1×SSC和1％SDS中于37℃洗滤膜30分钟到1小时；(4)在1×SSC和1％SDS中于42-65℃洗滤膜2小时，每30分钟更换溶液。

用于计算获得特定序列同源性的核酸分子间的杂交所需的严格条件的一个通用公式(Sambrook等，1989)是：Tm＝81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)-600/#bp双链体中。作为上述公式的例证，使用[Na+]＝[0.368]和50％甲酰胺，GC含量为42％，探针平均大小为200碱基，Tm是57℃。同源性每减少1％，DNA双链体的Tm降低1-1.5℃。因此，序列一致性大于约75％的靶标可以用42℃的杂交温度观察到。这样的序列可认为与本发明的核酸序列基本同源。本领域中熟知增加杂交的严格性直到只剩下几个阳性克隆。其他适合的条件包括，如为了检测大约80％-90％一致性的序列，在0.25M磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)，pH＝7.2，6.5％SDS，10％硫酸右旋糖酐中于42℃杂交过夜，最后在0.1×SSC，0.1％SDS中于55℃洗滤膜。为了检测超过约90％一致性的序列，合适的条件包括在0.25M Na₂HPO₄，pH＝7.2，6.5％SDS，10％硫酸右旋糖酐中于65℃杂交过夜，最后在0.1×SSC，0.1％SDS中于60℃洗滤膜。

本领域技术人员可任意使用各种的技术检测探针与靶核酸(如DNA)的结合。例如，探针可以用放射性、荧光、或酶标记。不采用探针标记的其他方法包括用PCR扩增(包括，当合适时，RACE PCR)，核糖核酸酶保护和等位基因特异性寡核苷酸探针。

鉴定成功杂交后分离已杂交的核酸，其可包括通过在适当宿主中复制的载体中克隆，进行一个或一个以上PCR或扩增步骤。

在每种情况下，如果需要，在检索中鉴定的克隆(如λ、粘粒、质粒、BACs、biBACS)或片段都能被延伸或补充。例如，如果怀疑它们不完整，可再次访问原始的DNA来源(如克隆文库、mRNA制备物等)以分离缺失的部分，如使用基于已获得的序列、探针或引物来鉴定含有重叠序列的其他克隆(参见如S B Primrose的“基因组分析原理(Principlesof Genome Analysis)”(1995)Pub.Blackwell Science Ltd，牛津，英国)。

随后，例如，如在实施例中描述的那样，检测核酸分子或相应的基因的功能。用于分离R1同源物的一个方案如下所示：

I)产生一个群体，其中抗性性状是分离的。

II)用基于R1序列(但不是R基因保守基序)的引物对群体中的个体成员进行PCR扩增DNA。

III)检测PCR产物(直接测序分析或限制性酶消化)，寻找和R性状共分离的序列多态性。鉴定合适的多态性标记序列。

IV)分离多态性基因的完整编码序列。这可从合适的克隆文库实现或用R1的5’端和3’端引物扩增实现。在每种情况下，被鉴定的多态性PCR产物或由其提供的序列信息可用来鉴定基因。

然后，可如上述或实施例中的方法检测抗性基因编码活性。

更特定的途径是基于已知同源R1基因可能连锁成簇。已报道马铃薯中成簇的R基因(Leister等，1996；De Jong等，1997)。大的R基因簇之一在马铃薯染色体V的短臂上。

含有R1的马铃薯染色体V的抗性热点还包含抗致病疫霉菌(Leonards-Schippers等，1994，Oberhagemann等，1999，Collins等，1999)和根胞囊线虫马铃薯白线虫(Kreike等，1994，Rouppe van derVoort等，1997，2000)的主要的QTL(数量性状座位)。连锁不平衡作图显示在0.8cM的含有R1的SPUD237-GP179区间中的标记与叶片和块茎对晚疫病的抗性有强烈的联系，证明R1和控制晚疫病数量抗性的因子间紧密连锁。已指出，基于观察到的遗传连锁，R1和控制晚疫病数量抗性的因子可能是同一基因的等位基因或成簇基因家族的成员(Leonards-Schippers等，1994，Oberhagemann等，1999)。现在R1座位的首次分子分析显示更赞成后一观点，因为R1是一个基因家族的成员，其在携带有R1的染色体的DNA插入中作为额外的拷贝而存在。相似的发现在拟南芥(Arabidopsis)的Rpm1座位报道过(Stahl等，1999)。R1基因应该已经通过异源染色体交换从野生品种S.demissum渐渗到马铃薯基因组中。在野生和栽培的茄科植物(Solanum)品种之间交换中经常发生异源染色体成对(Singh等，1989)。R1基因家族的第二个高度同源的成员(其有两个等位基因r1.1和r1.2)物理定位于R1附近。需要对该基因的功能作进一步的研究。因为可获得R1序列，现在可以鉴定R1家族的其他成员，它们可能存在于GP21-Gap179区间中还未被物理图谱所覆盖的那些部分中和/或马铃薯基因组的其他部分中。可分离涉及对致病疫霉菌的数量抗性的马铃薯中的等位基因变异体和其他茄科物种中的同源物。

因此，在本发明的一个优选的实施方式中表达本发明的核酸分子的植物所抵抗的病原体是致病疫霉菌。

R1和晚疫病病原体间的相互作用是与基因对基因假说一致的(Person等，1962，Flor 1971)。单个基因的转化足以使敏感宿主植物在用携带有无毒基因Avr1的致病疫霉菌小种(除了具有小种1专化性的之外的所有小种)侵染时引起过敏抗性反应。在Avr1杂合的致病疫霉菌菌株的后代中Avr1作为单显性因子分离并定位于致病疫霉菌分子图谱的连锁群IV(Van der Lee等，2001)。至今还没克隆到致病疫霉菌的无毒因子。在分子水平对R1作进一步特性描述以及Avr1基因的克隆应该有助于阐明抗性蛋白是怎样识别无毒效应器分子的。克隆识别不同于Avr1的无毒因子的晚疫病抗性基因可能使鉴定决定效应器识别特异性的分子基序成为可能，并且可能有助于设计出具有更广泛和更持久的抗晚疫病的R蛋白。其他，连锁的R1变异体(提供不同的R性状)可以基本根据上述方法分离，但其中用于最初扩增步骤的DNA从群体成员中获得，该群体中所需的R性状与R1本身(或R1变异体)共分离。

本发明者指出，R1序列与番茄中赋予抗细菌病原体即抗丁香假单胞菌抗性的另一不相关的Prf基因的序列相似(Salmeron等，1996)。根据这一信息看来，R1的序列可通过如位点定向或随机突变被修饰，以产生可赋予抗完全不同于致病疫霉菌的其他病原体抗性(即被完全不同于致病疫霉菌的其他病原体开启)的R1突变体或其他衍生物。这可使用下述方法获得，并用上述的瞬时表达实验分析方法检测R1突变体。

优选地，从与SEQ ID NO：1或在此公开的其他序列中显示的全部或部分序列对应的原始核酸直接或间接(如通过一个或一个以上扩增或复制步骤)产生突变的或其他衍生的核酸分子。

因此，本发明的另一个方面是产生编码R1衍生物的核酸的方法，该方法包括修饰编码R1的核酸分子的步骤。该衍生物可以包括核酸分子的改变，其不改变所编码的氨基酸序列(即简并性等价改变)。为产生突变体或衍生物，对序列的改变可以通过对核酸中一个或一个以上核苷酸进行一个或一个以上增加、插入、缺失或替代，从而导致编码的多肽中一个或一个以上氨基酸的增加、插入、缺失或替代。除了在R1序列中的一个或一个以上变化外，变异体核苷酸可编码C-末端和/或N-末端含有增加的氨基酸的氨基酸序列。

特别包括与所提供的序列部分对应的部分或片段(无论什么方式产生)，其编码具有生物活性的多肽，所述生物活性是如病原体抗性或者具有提高或结合R1结合抗体的能力。

一般来说，因为许多理由而值得改变，包括引入或除去下列特征：限制性内切酶序列；密码子选择；翻译后修饰必需的其他位点；编码的多肽中的剪切位点；编码的多肽中用于糖基化、硫辛酰化等的基序。可以在表达的蛋白上加上前导序列或其他靶向序列以决定表达后它的位置。所有这些可以有助于以重组形式有效地克隆和表达活性多肽(参见下述)。优选的修饰包括在QLPL、CFLY或LHD基序中或附近减少该区域的净负电荷。如何修饰抗性基因的手段和方法是本领域技术人员已知的，并在如WO 01/29239中对马铃薯Rx基因描述过。其他可取的突变可以是为改变所编码的多肽的活性(如特异性)或稳定性而进行的随机或定点诱变。

众所周知，氨基酸水平的同源性可根据氨基酸的相似性或一致性测定。相似性允许保守性变异，即一个疏水性残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸替代另一个疏水性残基，或者一个极性残基替代另一个极性残基，如精氨酸替代赖氨酸、谷氨酸替代天冬氨酸、或谷氨酰胺替代天冬酰胺。如本领域技术人员所熟知的，通过保守性替代来改变多肽的一级结构可能不会显著改变该肽的活性，因为插入到序列中的氨基酸的侧链可能形成与被替换出的氨基酸侧链相似的联接和接触。甚至当替代发生在决定肽链构象的关键区域，也是如此。

本发明也包括具有非保守性替代的同源物。如本领域技术人员所熟知的，在对决定肽链构象并不关键的肽链区域的替代可能对它的活性不会有很大影响，因为它们不会极大地改变肽链的三维结构。在决定肽链构象或活性的关键区域，这样的变化可能会改变多肽的性质。实际上，上述的变化可能赋予肽链稍微有利的性质如稳定性或特异性改变，尤其是有更广泛的特异性。

然后具有这些性质的突变体可用上述方法选出。

其他方法可包括将来自相关抗性基因的序列混合或整合到R1序列中。例如，R1的限制性酶片段可以与R1同源物或者与甚至不相关基因的片段连接起来形成R1的重组形式。修饰R1的可选择的策略可采用上述的PCR(Ho等，1989《基因(Gene)》77，51-59)或DNA改组(DNAshuffling)(Crameri等，1998《自然(Nature)》391)。

因此，本发明的方法，如上所述，可包括基于R1序列的一个或一个以上(如两个)探针或引物的杂交，来筛选R1同源物或产生R1衍生物。这样的寡核苷酸、探针或引物构成了本发明的另一个部分。用于探测或PCR的寡核苷酸可具有约30或低于30个核苷酸长(如18、21或24个)。一般来说，特异性引物超过14或15个核苷酸长。对于最佳的特异性和成本效率，优选长度为16-24个核苷酸的引物。本领域技术人员精通如何设计用于如PCR过程的引物。如果需要，可使用在此公开的基因的全部限制性酶片段进行探测，所述限制性酶片段可为100个核苷酸或甚至1000个核苷酸长。

在本发明的一个方面，上述的核酸分子是重组的形式，优选是可复制的载体。

“载体”被定义为包括，尤其是，任何双链或单链的线性或环状的质粒、粘粒、噬菌体或农杆菌双元载体，该载体能或不能自我转移或移动，可通过整合到细胞基因组中或存在于染色体外的形式(如带有复制起始位点的自主复制质粒)转化原核或真核宿主。特别包括穿梭载体，穿梭载体被看作是天然地或通过设计可以在两种不同的宿主生物体中复制的DNA媒介物，可以从放线菌类(actinomycetes)和相关物种、细菌和真核细胞(如高等植物、哺乳动物、酵母或真菌细胞)中挑选出。

含有本发明的核酸的载体不需要含有启动子或其他调控序列，尤其是如果当该载体用于将核酸引入细胞以重组到基因组中时。

优选地，载体中的核酸受控于或可操作地连接于合适的启动子或其他调控序列，以在宿主细胞如微生物(如细菌)或植物细胞中转录。该载体可以是在多种宿主中起作用的双功能表达载体。在基因组DNA情况下，它可包含它自身的启动子或其他调控序列。在cDNA情况下，它可以受控于合适的启动子或其他调控元件，以在宿主细胞中表达。

“启动子”是指一段核苷酸序列，其可操作地连接于其下游的DNA(即，在双链DNA的有义链的3’方向中)使转录从这里开始。

“可操作地连接”是指作为相同的核酸分子的一部分被连接、正确定位和定向而使转录从启动子起始。DNA可操作地连接于启动子是指在启动子的“转录起始调控下”。

因此本发明的这一方面提供了一种基因构建体，优选可复制的载体，所述基因构建体包含与本发明提供的核苷酸序列可操作地连接的启动子，所述核苷酸序列如R1基因或其变异体(如突变体、衍生物或等位基因)的编码区域。一般来说，本领域技术人员都能很好地构建用于重组基因表达的载体并设计流程。可选择或构建合适的含有适当调控序列的载体，所述适当调控序列包括启动子序列、终止子片段、多聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其他适用的序列。更多细节可参见，如，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：a Laboratory Manual)》：第二版，Sambrook等，1989，冷泉港实验室出版(Cold Spring HarborLaboratory Press)。在Ausubel等编辑，John Wiley和Sons，1992年的《分子生物学当前技术(Current Protocols in Molecular Biology)》第二版中详细描述了用于核酸操作和蛋白分析的许多已知的技术和流程如核酸构建体的制备、诱变(参见上述)、测序、将DNA引入细胞和基因表达。Sambrook等和Ausubel等的公开内容引入本文作为参考。

本发明的这一方面的一个实施方式提供一种基因构建体，优选可复制的载体，该基因构建体包含与本发明提供的核苷酸序列可操作地连接的诱导型启动子。

本领域技术人员熟知用于启动子的术语“诱导型”。本质上，受诱导型启动子控制的表达可以响应施加的刺激物而“开启”或增加。启动子的刺激物的性质多种多样。一些诱导型启动子在合适的刺激物不存在的情况下几乎不产生或产生检测不到水平的表达(或不表达)。其他诱导型启动子在刺激物不存在的情况下产生可检测的组成型表达。无论在刺激物不存在的情况下表达的水平如何，在正确的刺激物存在的情况下任何诱导型启动子的表达都会增加。优选的条件是通过施用有效改变表型特性的数量的相关刺激物时，表达的水平增加。因此诱导型(或“可开关型”)启动子可用于在刺激物不存在的情况下产生本底表达水平，该表达水平太低以至于不能产生所需表型(可能实际上为零)。在施用刺激物后，表达增加(或开启)到可引起所需表型的水平。

允许在原核宿主细胞中表达的可能的调控元件包括，如，大肠杆菌中的P_L、lac、trp或tac启动子。可允许在真核宿主细胞中表达的调控元件的例子为酵母中的AOX1或GAL1启动子或者哺乳动物和其他动物细胞中的CMV-、SV40-、RSV-启动子(劳氏肉瘤病毒)、CMV-增强子、SV40-增强子或球蛋白内含子。在上下文中，本领域已知适合的表达载体，例如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(In-vitrogene)、pSPORT1(GIBCO BRL)。

上下文中特别兴趣的是植物载体。Bevan(《核酸研究(Nucl.AcidsRes.)》12，8711-8721(1984))以及Guerineau和Mullineaux(1993)(“植物转化和表达载体(Plant transformation and expressionvectors)”，在《植物分子生物学实验室传真(Plant Molecular BiologyLabfax)》中(Croy RRD编辑)，牛津，BIOS ScientificPublishers，121-148页)描述了以前已广泛成功用于植物的特异性方法和载体。适合在植物中操作的启动子包括实际上在所有的植物组织中以高水平表达的花椰菜花叶病毒35S基因启动子(CaMV 35S)(Benfey等，1990a和1990b)；可在植物体中顶端分生组织和几个局部位置如内生韧皮部、花原基、根和茎的分支点表达的花椰菜meri5启动子，(Medford，1992；Medford等，1991)以及在花发育中表达非常早的拟南芥(Arabidopsis thaliana)LEAFY启动子(Weigel等，1992)。其他启动子包括水稻肌动蛋白启动子。

启动子可包括赋予发育和/或组织特异性表达调控的一个或一个以上的序列基序或元件。

因此，本发明的载体除了要求给其提供复制性、整合性和/或表达功能的多种序列以外，可包含R1基因或其变异体。这样的载体可用于，例如，使引入其的植物对致病疫霉菌或其他真菌具有抗性。

如果想要诱导广谱抗性，根据本公开的内容可获得多种其他选择：

(a)修饰R1序列，以产生上述的突变体或其它衍生物，这样它的功效可被除马铃薯晚疫病菌外的激发子或病原体或在此讨论的其他天然激发子所激发。

(b)直接与合适的激发子一起共表达R1(如无毒菌株中的Avr1)。

(c)共表达R1和激发子基因，该激发子基因的转录或翻译由于R1的激活而抑制。

这将使R1重新偶联到它的激发子上，更好地模拟了对致病疫霉菌的自然响应从而导致广泛的特异性沉默。

(d)与激发子基因一起共表达R1，该激发子基因的翻译只在病原体存在情况下开启。

(e)与激发子基因一起共表达R1，藉此该一种或两种基因失活，并用多种方式再激活基因，这样HR只被限制在植物的特定部位(如体细胞上定义的部分)而防御反应可以延伸出这些部位。这可以用类似于WO95/31564中公开的方法获得，其中在将带有转座子标记的抗性基因(那种情况下是cf-9)加上完整的激发子(Avr-9)的植物与带有激活子转座酶的植物回交后，其后代显示cf-9的体细胞再激活，导致局部的坏死斑反应和整体的抗性。

除了上述的载体和构建体外，本发明还提供了包括将上述R1构建体(如载体)引入宿主细胞的方法和/或通过施用适合的刺激物(一种有效的外源诱导物)在植物细胞中诱导构建体表达的方法。上述载体可用任何适用的方法引入宿主中，如下面进一步详述的接合、转移、转化、转染、转导或电穿孔。

另一个方面，本发明公开一种含有本发明的核酸或载体的宿主细胞，尤其是植物或微生物细胞。所述宿主细胞可以是任何原核或真核细胞，如细菌、昆虫、真菌、植物或动物细胞。优选的真菌细胞如酵母属(Saccharomyces)成员，尤其是啤酒酵母(S.cerevisiae)种的成员。

为了在植物细胞中正义方向或反义方向表达根据本发明的核酸分子，将这些分子置于确保在植物细胞中表达的调控元件控制下。这些调控元件可以与要表达的核酸分子及要转化的植物物种异源或同源。一般来说，这样的调控元件包括在植物细胞中有活性的启动子。为了在转基因植物所有组织中都获得表达，优选使用组成型启动子，如CaMV的35S启动子(Odell，《自然》313(1985)，810-812)或玉米的多聚泛蛋白基因启动子(Christensen，《植物分子生物学》18(1982)，675-689)。为了在转基因植物的特定组织中表达，可以使用组织特异性启动子(参见，如Stockhaus，《欧洲分子生物学组织杂志(EMBO J.)》8(1989)，2245-2251)。已知在马铃薯块茎中或在其他植物物种的种子如玉米、蚕豆、小麦、大麦等中有特异性活性的启动子。为了能够精确控制表达，可使用诱导型启动子。诱导型启动子的一个例子是编码热激蛋白的基因的启动子。同样，在WO96/16182中描述了小孢子特异性调控元件和它们的用途。另外，可以使用化学诱导型的Tet-系统(Gatz，《分子基因与遗传学(Mol.Gen.Genet.)》227(1991)；229-237)。在如Ward(《植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)》22(1993)，361-366)中描述了本领域熟知的其他适合的启动子。调控元件可进一步包括植物细胞中有功能的转录和/或翻译增强子。另外，调控元件可包括转录终止信号，如多聚腺苷酸信号，其使转录本上添加一个多聚腺苷酸尾巴，可能提高转录本的稳定性；可参见前述的文献。

在本发明的核酸分子以正义方向表达的情况下，原则上可以修饰编码序列，以这种方式使蛋白定位于植物细胞任何所需的区室中。它们包括内质网、液泡、线粒体、质体、质外体、细胞质等等。本领域技术人员熟知如何进行这类修饰和确保定位于所需区室的信号序列。

本领域还熟知用于将外源DNA引入植物的方法。它们包括，如用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或毛根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)的T-DNA转化植物细胞或组织，原生质体融合，直接基因转化(参见，如EP-A 164 575)，注射，电穿孔，基因枪法如粒子轰击和本领域其他已知的方法。本发明的方法中使用的载体还可包括功能性元件，如农杆菌T-DNA的“左边界”和“右边界”序列，其有利于稳定地整合到植物基因组中。另外本领域技术人员已知可产生无标记的转基因植物的方法和载体，即在植物发育或植物育种的某个时期丢失了可选择或可计数的标记基因。这可以通过如共转化(Lyznik，《植物分子生物学》13(1989)，151-161；Peng，《植物分子生物学》27(1995)，91-104)和/或利用能使用启动植物中同源重组的酶的系统获得(参见，如WO97/08331；Bayley，《植物分子生物学》18(1992)，353-361)；Lloyd，《分子基因与遗传学》242(1994)，653-657；Maeser，《分子基因与遗传学》230(1991)，170-176；Onouchi，《核酸研究》19(1991)，6373-6378)。在如Sambrook(《分子克隆：实验室手册》第二版(1989)，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约)中描述了用于制备合适载体的方法。

本领域技术人员熟知适合的根癌农杆菌菌株和载体，农杆菌的转化及合适的生长和选择培养基，它们已在现有技术中描述(GV3101(pMK90RK)，Koncz，《分子基因与遗传学》204(1986)，383-396；C58C1(pGV 3850kan)，Deblaere，《核酸研究》13(1985)，4777；Bevan，《核酸研究》12(1984)，8711；Koncz，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》86(1989)，8467-8471；Koncz，《植物分子生物学》20(1992)，963-976；Koncz，用于基因标记和表达研究的特异性载体(Specialized vectors for gene tagging and expression studies)，在《植物分子学手册(Plant Molecular Biology Manual)》中，卷2，Gelvin和Schilperoort(编辑)，Dordrecht，The Netherlands：KluwerAcademic Publ.(1994)，1-22；EP-A-120 516；Hoekema：双元植物载体系统(The Binary Plant Vector System)，Offsetdrukkerij KantersB.V.，Alblasserdarn(1985)，第五章，Fraley，Crit.Rev.Plant.Sci.，4，1-46；《欧洲分子生物学组织杂志》4(1985)，277-287)。虽然在本发明的方法中优选使用根癌农杆菌，但例如如果想要该菌株赋予的表型，也可使用其他农杆菌菌株，如毛根农杆菌。

用基因枪法进行转化的方法是本领域技术人员所熟知的；参见，如Wan，《植物生理(Plant Physiol.)》104(1994)，37-48；Vasil，《生物技术(Bio/Technology)》11(1993)，1553-1558和Christou(1996)《植物科学进展(Trends in Plant Science)》1，423-431。显微注射可参照Potrykus和Spangenberg(编辑)，《将基因转移到植物(GeneTransfer To Plants)》，Springer Verlag，Berlin，NY(1995)进行。

大多数双子叶植物的转化可以用上述方法。但对于单子叶植物的转化，也开发了几个成功的转化技术。它们包括用如上述的基因枪法的转化和原生质体转化、部分渗透性的细胞的电穿孔、用玻璃纤维引入DNA等等。然后用技术人员已知的方法可使得到的转化植物细胞用于再生转化植物。这可以在如Hood，《分子育种(Molecular Breeding)》3(1997)，291-306；Coleman，《美国国家科学院院刊》94(1997)，7094-7097；Shilito，《生物技术(Biotechnology)》7(1989)，581-587找到。

一般来说，根据本发明被修饰的植物和表现为本发明的蛋白过量表达或这样的蛋白合成减少的植物可以从任何想要的植物物种中获得。它们可以是单子叶植物或双子叶植物，优选地它们属于在农业、木材培育或园艺中感兴趣的植物物种，如农作物(如玉米、水稻、大麦、小麦、黑麦、燕麦等)、马铃薯、产油植物(如油菜、向日葵、花生、大豆等)、棉花、甜菜、甘蔗、豆科植物(如菜豆、豌豆等)、生产木材的植物，优选树，等等。

转化技术的特定选择将根据其转化某种植物物种的有效性和有特定选择方法论的具体操作试验人员的经历和偏好决定。对技术人员来说显然将核酸引入植物细胞的转化系统的特定选择并不是本发明的本质或受其限制，对植物再生的技术的选择也不是。如果想要，可使用由嵌合基因构成的选择性遗传标记，其可赋予选择性表型如对抗生素的抗性，所述抗生素如卡那霉素、潮霉素、草丁膦(phosphinotricin)、绿磺隆(chlorsulfuron)、氨甲喋呤、庆大霉素、壮观霉素、咪唑啉酮和草甘磷。

因此，另一个方面本发明提供了一种转化植物细胞的方法，该方法包括将含有本发明的核酸(如R1或R1变异体)的载体引入植物细胞，并引起或允许在载体和植物细胞基因组间发生重组以使核苷酸序列引入基因组。

本发明还包括一种用本发明的核酸分子或载体转化的宿主细胞，尤其是植物或微生物细胞。在转基因植物细胞中(即对所讨论的核酸的转基因)，转基因可以在基因组外的载体上或整合、优选稳定地整合到基因组中。每个单倍体基因组可以有一个以上的异源的核苷酸序列。

在本方面广泛使用的术语“异源的”，是指使用基因工程即通过人类干预，将所讨论的核苷酸的基因/序列引入所述的植物或其祖先的细胞中。异源基因对相应的内源基因而言，可以是附加的。对植物细胞来说异源或外源或外来的核酸可以是在该类型、变种、或物种的细胞中非天然发生的。因此所述异源核酸可包含特定类型的植物细胞或植物物种或变种的编码序列或衍生序列，并将其放置在不同类型的植物细胞或植物物种或变种中。

转化后，植物可从如单细胞、愈伤组织或叶盘再生，如本领域常规技术一样。几乎任何植物都能从植物细胞、组织和器官中再生。可获得的技术的综述见Vasil等，《植物细胞培养和体细胞遗传(Cell Cultureand Somatic Cell Genetics of Plants)》，卷I，II和III，《实验室工作程序和它们的应用(Laboratory Procedures and TheirApplications)》，Academic出版社，1984；Weissbach和Weissbach，《植物分子生物学方法(Methods for Plant Molecular Biology)》，Academic出版社，1989。

已经在谷类如水稻、玉米、小麦、燕麦和大麦中获得可育的转基因植物(综述参见Shimamoto，K.(1994)《生物技术最新进展》5，158-162；Vasil，等，(1992)《生物技术(Bio/Technology)》10，667-674；Vain等，1995，《生物技术进展(Biotechnology Advances)》13(4)：653-671；Vasil，1996，《自然生物技术(Nature Biotechnology)》14，702页)。

本发明还提供含有本发明植物细胞的植物，连同其任何的部分或繁殖体、种子、自交或杂交子代和后代。根据本发明的植物可能在一个或一个以上性质上不是纯育的。可能不包括植物变种，尤其是根据植物育种者的权利(Plant Breeders’Rights)登记的植物变种。需要指出的是，不必仅仅因为一种植物的基因组中稳定地含有引入该植物或其祖先的细胞中的转基因，就认为这种植物是“植物变种”。

在本发明的一个优选的实施方式中，由于存在本发明的R1基因，本发明的转基因植物获得或改善了抗相应野生型植物敏感的病原体的抗性。

术语“抗性”涵盖从延缓到完全抑制病症发展的保护范围。重要的病原体的例子包括致病疫霉菌，即马铃薯晚疫病病因；大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)，即大豆根腐病的病原体；寄生霜霉菌(Peronospora parasitica)(霜霉病)；稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)，稻瘟病的病因；白粉菌(Erysiphe spp)(白粉病)；丁香假单胞菌，(细菌疫病的病因)；解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)(火疫病)；胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)(软腐病)；灰霉病菌(Botrytiscinerea)(葡萄霜霉病)；棉花立枯丝核病菌(Rhizoctonia solani)和德巴利腐霉(Pythium debaryanum)，(苗疫病或猝倒病的病因)。优选地，本发明的转基因植物获得抗致病疫霉菌抗性。

除了再生植物，本发明包括所有下列：这样的植物、种子、自交或杂交子代或后代(如F1和F2代)的无性系及上述的任何部分，如插条、种子。本发明也提供了来自这样的植物的植物繁殖体，即任何可用于再生或繁殖、有性或无性的部分，包括插条、种子等等。

作为将R1(或其变异体)引入植物的分子生物学方法的替换，在此公开的序列也可用于促进植物的选择，其中在上述植物中期望用常规植物育种方法引入抗性性状。带有该基因的杂交后代可通过基于R1序列，尤其是R1特征性序列的筛选，而很容易地鉴定出。

在此公开的用于鉴定R1座位最近标记的方法一般来说也可应用于基因簇中发现的其他基因(如来源于植物的抗性基因)。这样的方法的特征在于用不含保守序列基序的非简并性引物采用低严格性PCR的步骤。一般程序可概括如下：(a)准备一个群体，其中感兴趣的基因正在分离，(b)根据高度保守的(抗性基因)基序和高度简并性引物，鉴定与感兴趣座位连锁的抗性基因同源物(Leister等，1996)《自然遗传学(NatureGenet.)》14，421-428，(c)用不含保守序列基序的非简并性引物采用低严格性PCR，进一步鉴定与同源基因对应的标记，该标记在(抗性)座位内并非常接近该基因，(d)用所述进一步得到的标记，从抗性植物的感兴趣的基因组文库中鉴定带有(抗性)基因的克隆，可选地，结合对活性的瞬时分析(Mindrinos等(1994)或如本文所述)，(e)可选地，根据转基因植物中的表型证实克隆到的基因的特性。

本发明还包括任何R1或上述的变异体核酸序列的表达产物及因此在适合条件下通过编码核酸分子的表达制备表达产物的方法，所述编码核酸分子可在体外适合的宿主细胞中或化学合成，尤其是当想获得用于产生抗体的抗原时。

可使用本领域已知的任何方法将抗体制成纯化的R1/变异体多肽或肽(综述参见如Roitt，Brostoff，Male的“免疫学-第五版(Immunology-5th Edition)”：Pub 1998-Mosby出版社，伦敦)。这样的抗体或其片段或衍生物可用于结合R1或用于鉴定和/或分离与R1同源的蛋白(即带有相同抗原决定簇)，从而可提供上述方法的一种替代方法以分离它们的编码基因。

同样地，可使用与本发明的R1多肽结合的适体(aptamers)。本领域技术人员已知适体的制备(参见，如Thomas，和Dinshaw(2000)通过核酸适体的适应性识别(Adaptive recognition by nucleicaptamers)，《科学(Science)》287：820-825)。

本发明进一步提供影响或改变植物中抗性性状的方法，该方法包括在植物细胞中引起或允许上述异源核酸序列(如R1或R1变异体，所有情况下都加有可选择的激发子)表达的步骤。

作为选择，可期望负调控R1活性。这可通过如反义技术获得(参见Bourque，(1995)，《植物科学(Plant Science)》105，125-149，和Flavell，(1994)，《美国国家科学院院刊》91，3490-3496)。除了反义，另一选择是以正义(与靶基因同样方向)插入完整或部分靶基因的拷贝，以获得由共抑制引起的靶基因的表达降低；例如，参见van der Krol等，(1990)《植物细胞》2，291-299；Napoli等，(1990)《植物细胞》2，279-289；Zhang等，(1992)《植物细胞》4，1575-1588，和US-A-5,231,020。

这样，本发明也涉及一种转基因植物细胞、含有这样的植物细胞的转基因植物，所述转基因植物细胞包含优选稳定地整合到所述基因组中的本发明的核酸分子或其部分，其中所述核酸分子或其部分的转录和/或表达导致R1蛋白的合成降低。在一个优选的实施方式中，这种降低通过R1基因的反义、正义、核酶、共抑制、显性突变效应或敲除突变获得。

然而，优选地，本发明提供了一种方法，该方法包括在将核酸引入植物或其祖先的细胞的初步步骤后，在植物细胞中表达SEQ ID NO：1或其变异体(由此产生编码的多肽)。一般来说，可使用所述的方法将真菌抗性引入到植物中，藉此R1介导的抗性通过与适当的真菌激发子或其他的起始物或诱导物接触而引发。广泛地说，激发子或其他引发子可由侵入的真菌直接编码(如：致病疫霉菌或某种其他真菌的毒性蛋白)。可选择地，可由其本身受真菌侵染而引发或正调控的分离的构建体或转基因表达。另外，在这两种情况下，如果优选，允许非天然激发子激发R1(变异体)序列的修饰。

针对一个推测或已知的激发子来评价R1或R1衍生物的功能，上述这种形式本身构成了本发明的另一方面，特别是用于确定激发子和抗性基因之间的基因对基因的相容性的方法，其特征在于包括下列步骤：(a)导致或允许R1或R1衍生物和激发子在细胞内共表达，(b)观察上述细胞的HR现象，(c)将(b)中得到的观察结果与R1或R1衍生物对激发子的特异性联系起来。

如上所示，本发明还涉及与相应的野生型植物相比，对晚疫病侵染更敏感的转基因植物。同样地，本发明涉及这样植物的可收获部分和繁殖材料。

如实施例所述，已分离了R1基因，将其转化到敏感马铃薯种植品种Desirée后可赋予抗致病疫霉菌的抗性。因为相应DNA序列为SEQ ID NO：1的基因组克隆能够产生这种效果，显然在分离的DNA序列中含有在病原体侵染中介导R1多肽表达所必需和充分的R1基因调控序列。对于本领域技术人员来说很显然这样的调控序列本身具有重要的应用性，例如，在病原体侵染中用于特异性表达异源DNA序列，如诱导针对特定病原体的过敏反应。

因此，本发明也涉及启动子的调控序列，其天然地调控上述本发明的核酸分子的表达或与本发明核酸分子同源的核酸分子的表达，所述调控序列在病原体侵染时能赋予或调节异源DNA序列的表达。

在本发明的上下文中，术语“调控序列”是指影响表达特异性和/或表达水平的序列，例如在此意义上，它们赋予细胞和/或组织特异性。这样的区域可定位于转录起始位点的上游，也可定位在它的下游，如在转录但不翻译的前导序列中或在内含子中。

术语“启动子”在本发明中的含义是指转录起始(即RNA聚合酶结合和进行性转录本形成的成功起始)所必需的核苷酸序列，也可能含有，如TATA框。

如本文使用的术语“与本发明核酸分子同源的核酸分子”，包括如来自其他物种如番茄的其他R1基因的启动子区域和调控序列，这些R1基因与马铃薯R1基因同源并基本表现相同的表达模式。这样的启动子的特性在于它们在病原体侵染时能赋予在植物中表达，优选专有表达异源DNA序列的能力。

如本文使用的术语“可在病原体侵染时赋予或调节异源DNA序列的表达”，意思是上述启动子能在侵染位点控制异源DNA序列在植物中的表达，与在多数不相容性寄主/病原体相互作用的天然抗性中涉及的病原体相关基因的控制表达类似或非常相关，如在植物一部分的侵染位点的过敏性细胞死亡。因此，本发明的调控序列的特性在于其能响应病原体攻击或响应模拟病原体攻击的刺激如从病原体如真菌或细菌或其衍生物制得的激发子，选择性地介导局部转录活性。由于细胞-细胞相互作用，本发明调控序列的转录活性也可在实际侵染位点周围的细胞中出现。有利地，其他刺激如非生物胁迫可不诱导或只很小程度地诱导本发明的调控序列和含有这样序列的嵌合启动子。优选地，在病原体攻击或激发子处理下，嵌合启动子的诱导比其在非生物胁迫下的激活，如果有的话，至少约高10倍，优选高20倍，更优选高30倍。

然而，本发明的调控序列所赋予的表达特异性，并不限制于由于病原体的局部基因表达，例如，它们可以进一步和提供组织特异性基因表达的其他的调控序列联合。特定的表达模式也可以依赖于所采用的植物/载体系统。然而，除非本领域技术人员使用和设计本发明的某种元件以调控特定细胞类型异源DNA序列的表达，由本发明的调控序列驱动的异源DNA序列的表达主要发生在病原体侵染或用相应的激发子处理时。

因此，根据本发明，也可使用来自其他物种的调控序列，该调控序列与上述的R1特异性核酸分子的启动子、或显示相同或相似表达模式的基因启动子的调控序列在功能上是同源的。特定的表达模式也可以依赖于所采用的植物/载体系统。然而，除非本领域技术人员使用和设计本发明的调控序列的某种元件以调控异源DNA序列在特定组织中表达或其他调控方式，由本发明的调控序列驱动的异源DNA序列的表达主要发生在被特定的病原体侵染的任何细胞中。

根据本发明，可分离R1基因新的调控序列并且将其作为马铃薯R1基因的调控序列的例证。例如，可用合适的限制性酶消化基因组DNA，变性并使其退火到来源于本发明的cDNA序列的反向引物上。在引物延伸后，可连上平端接头并使用来源于上述cDNA序列的套式反向引物和来源于接头序列的正向引物进行PCR。在另一个克隆本发明调控序列的策略中，编码区上游的基因组序列的物理图谱可以用基因组印迹分析方法构建。具有了这一信息，基因组DNA可以用选出的限制性酶消化，含有上游序列和编码序列的基因组片段可用凝胶纯化并大量自连以有利于形成环状分子，其随后可通过用来源于该基因的编码序列的正向和反向引物进行PCR扩增。在克隆的基因组序列中，转录起始位点可用每一个本领域技术人员熟知的常规方法来确定，如5’-RACE、引物延伸或S1作图。为了确定转录起始位点上游的顺式调控元件(即在推测的启动子区域中)，将各区域与标记基因如编码GUS或GFP的基因融合，并产生这些构建体的5’缺失的衍生物。将它们转化到合适的植物材料中，测定依赖于剩余的上游序列(推测的启动子)的标记基因的表达。这些技术是本领域技术人员所熟知的。

在一个实施方式中，本发明的调控序列包含选自如下的DNA序列：

(a)包含SEQ ID NO：1中所示核苷酸1到2222的核苷酸序列或其部分的DNA序列；

(b)包含SEQ ID NO：1中所示核苷酸1到2222的核苷酸序列的至少14个连续核苷酸的DNA序列；

(c)在严格条件下与(a)或(b)中所述核苷酸序列杂交的DNA序列；

(d)具有权利要求1中所述核苷酸序列的探针筛选合适的基因组DNA文库而获得的片段的基因的DNA序列；

(e)包含(a)、(b)和(c)中保守的核苷酸序列的DNA序列。

同源的调控序列与(a)或(b)中的调控序列在一个或一个以上位点不同，但仍然有同样的特异性，即它们包含相同或相似的负责上述表达模式的序列基序，优选6到10个核苷酸长。优选地，该调控序列与一个上述的调控序列的杂交，最优选地，在严格条件下杂交。特别优选地，调控序列与上述的调控序列之一的序列一致性至少为85％，更优选为90％-95％，最优选为96％-99％，并具有相同或基本相同的特异性。该调控序列还包含那些被改变的调控序列，例如与上述核苷酸序列相比，通过单独或联合对一个或一个以上核苷酸进行的缺失、插入、替代、添加和/或重组和/或任何本领域已知的修饰而获得的改变。本领域技术人员熟知将这样的修饰引入本发明调控序列的核苷酸序列中的方法。对本领域技术人员来说很显然其他的调控元件也可添加到本发明的调控序列中。例如，可以采用本发明调控序列的转录增强子和/或涉及诱导表达的序列。例如，适合的诱导性系统为如Gatz(见上)的受四环素调控的基因表达。

通过如不影响调控序列整体结构或结合基序的核苷酸代替的方法修饰上述的调控序列或其序列基序是可能的，因此在病原体侵染时其仍可赋予基因表达。本发明的调控序列可来源于马铃薯R1基因(见实施例)，但是其他植物也可以是这样调控序列的合适的来源。另外本发明的核苷酸序列可用本领域已知的适用的计算机程序进行比较，如代表局部比对基本查询工具(Basic Local Alignment Search Tool)的BLAST，其可用于局部序列比对(Altschul，1997；Altschul，J.Mol.Evol.36(1993)，290-390；Altschul，J.Mol.Biol.215(1990)；403-410)。BLAST产生核苷酸序列的比对以确定序列相似性。因为比对的局部特性，BLAST在确定精确配对或鉴定同源物中特别有用。用这些方法，可能鉴定在病原体特异性表达中起作用的保守的核苷酸序列。

通常，所述的调控序列是重组DNA分子的一部分。在本发明的一个优选的实施方式中，将重组DNA分子中的调控序列可操作地与异源DNA序列连接。术语“与本发明调控序列可操作地连接的DNA序列的异源”是指所述DNA序列不是天然地与本发明调控序列连接。所述异源的DNA序列的表达包括DNA序列的转录，优选转录成可翻译的mRNA。确保在真核细胞，优选在植物细胞中表达的调控元件，是本领域技术人员所熟知的。它们通常包含可确保转录终止和转录本稳定的多聚腺苷酸信号，也参见前述。另外的调控元件可包含转录和翻译的增强子；见前述。

在一个优选的实施方式中，上述重组DNA分子的异源DNA序列编码肽、蛋白、反义RNA、正义RNA和/或核酶。可单独使用或作为表达异源DNA序列的载体的一部分使用本发明的重组DNA分子，其中例如所述异源DNA序列编码蛋白如种子贮藏蛋白、毒素、抗体(“植物抗体”)或用于诊断R1相关基因的表达。将含有编码感兴趣蛋白的DNA序列的重组DNA分子或载体引入细胞中从而产生感兴趣的蛋白。例如，可将本发明的调控序列可操作地与分别编码芽孢杆菌RNA酶抑制剂和芽孢杆菌RNA酶的序列连接，用于在植物中产生HR反应。对本领域技术人员来说本发明的调控序列的应用性是显然的，可以从文献如Strittmatter和Wegener，Zeitschrift für Naturforschung 48c(1993)，673-688；Kahl，《微生物生物技术杂志(J.Microbiol.Biotechnol.)》11(1995)，449-460和在此引用的参考文献获得。

另一方面，上述蛋白可以是可计数的标记，如，荧光素酶、绿色荧光蛋白或β-半乳糖苷酶。这一实施方式特别有利于简便和快速地筛选下述的能调节R1基因表达的化合物和物质。例如，可以在存在或不存在候选化合物的情况下种植转基因植物，以确定该化合物是否影响受控于本发明调控序列的基因的表达，其可以用如监控上述标记的表达来测定。对本领域技术人员来说很显然也可利用其他标记基因，如编码对诱导或抑制上述标记表达的化合物进行直接选择的选择性标记。

本发明的调控序列也可用于反义方法中。反义RNA可以是一段短的核苷酸序列(一般至少10个核苷酸，优选地至少14个，任选地长达100个或100个以上核苷酸)，将该核苷酸序列设计为与感兴趣基因的特异性mRNA序列和/或DNA序列的一部分互补。涉及反义技术的常规方法已有描述；参见，如Klann，《植物生理》112(1996)，1321-1330和前述。在将DNA序列转录为反义RNA后，反义RNA在细胞中与其靶序列结合，从而抑制mRNA转录并负调控mRNA编码的蛋白的表达。

在另一个实施方式中，本发明涉及至少15个核苷酸长的核酸分子，该核酸分子与上述的调控序列或其互补链特异性地杂交。特异性杂交优选发生在严格条件下，并意味着与不具有或具有基本不同的调控特性的核酸分子之间没有或很少有交叉杂交现象。该核酸分子可用作探针和或用于基因表达控制。核酸探针技术是本领域技术人员熟知的并且很容易理解这样的探针在长度上可变化。优选17到35个核苷酸长的核酸探针。当然，使用长达100个或100个以上核苷酸的核酸也是合适的。本发明的核酸探针具有多种应用。另一方面，它们可以用作扩增本发明调控序列的PCR引物。另一个应用是作为杂交探针通过基因组DNA文库的同源筛选来鉴定可与本发明调控序列杂交的调控序列。根据本发明的这一优选的实施方式，与上述的调控序列互补的核酸分子也可用于抑制含有该调控序列的基因的表达，例如，由于反义、共抑制或三链螺旋效应，或用于构建适用的核酶(参见，如EP-B1 0 291 533，EP-A1 0321 201，EP-A20 360 257)，该核酶可特异性剪切含有本发明调控序列的基因的(前体)mRNA。适用的靶位点和对应的核酶的选择可用已述的方法进行，如Steinecke，核酶(Ribozymes)，《细胞生物学方法(Methods in CellBiology)》50，Galbraith等编辑，Academic Press，Inc.(1995)，449-460。另外，本领域技术人员会意识到也可能使用有特殊应用的适合的标记来标记这样的核酸探针，如用于在来源于生物体的样本中检测本发明核酸分子的存在。

上述核酸分子可以是DNA或RNA或其杂合体。另外上述核酸分子可含有在寡核苷酸反义方法中常用的，例如，硫酯键和/或核苷酸类似物；参见前述。

本发明也涉及载体，尤其是在基因工程中常用的质粒、粘粒、病毒和噬菌体，所述载体包含本发明的调控序列或相应的重组DNA分子。

优选地，所述载体是表达载体和/或进一步包含植物的选择标记的载体。适合的选择标记的例子参见前述。可使用本领域技术人员熟知的方法构建重组载体；参见，如在Sambrook，《分子克隆，实验室手册》冷泉港实验室(1989)纽约，和Ausubel，《分子生物学当前技术》，GreenPublishing Associates和Wiley Interscience，纽约(1989)中描述的技术。可选择地，本发明的重组DNA分子和载体可被重新构建于脂质体中以便运送到靶细胞中。

另外，本发明还涉及用本发明的调控序列、DNA分子或载体转化的宿主细胞。所述宿主细胞可以是原核或真核细胞。存在于宿主细胞中的本发明的调控序列、载体或重组DNA分子可整合到宿主细胞的基因组中或保持在染色体外。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞，如细菌、昆虫、真菌、植物、动物或人类细胞。优选的细胞是植物细胞。

在另一个优选的实施方式中，本发明提供制备转基因植物、植物细胞或植物组织的方法，该方法包括将本发明的核酸分子、重组DNA分子或载体引入所述植物、植物细胞或植物组织的基因组中。为了在植物细胞中表达受控于根据本发明的调控序列的异源DNA序列，可融合其他调控序列如聚腺苷酸尾巴，优选融合到异源DNA序列3’末端，参见前述。另外也有可能加入可增强基因表达的转录或翻译增强子或增加mRNA稳定性的序列。用于在植物、植物细胞和植物组织中引入外源DNA的方法参见上述。

因此，本发明也涉及含有，优选稳定地整合到基因组中的本发明的调控序列、重组DNA分子或载体的转基因植物细胞。另外，本发明也涉及包含上述转基因植物细胞的转基因植物和植物组织。

另外，本发明涉及用于鉴定植物防护剂的方法，该方法包括下列步骤：

(a)在化合物或含有多种化合物的样品存在下，培养含有重组DNA分子的植物细胞或组织或维护含有重组DNA分子的植物，所述重组DNA分子包含与本发明的调控序列可操作地连接的读出系统，所述培养或维护是在允许所述读出系统表达的条件下进行的；

(b)分别鉴定或证实样品和化合物，该样品和化合物导致在所述植物、植物细胞和植物组织中，所述读出系统的表达抑制、激活和/或增强。

在本发明上下文中术语“读出系统”是指在细胞、组织或生物体中转录和/或表达后的DNA序列提供可计数的和/或可选择的表型。所述读出系统是本领域技术人员所熟知的，包括，例如，上述的重组DNA分子和标记基因。

在本发明的方法中的术语“多种化合物”可理解为可相同或不相同的多种化合物。

所述化合物或多种化合物可以是无机或有机的、天然存在的或人造的化合物，可以包含在，例如，样品中，如从植物、动物或微生物的细胞提取物中。另外，上述化合物可以是本领域已知的但至今对其抑制、激活和/或增强R1基因转录的能力未知。可将多种化合物，例如，加到培养基，或注射到植物、植物细胞或组织中，或喷到植物上，或由土壤中提供。

如果用本发明的方法鉴定含有化合物或多元化合物的样品，那么从已鉴定含有能抑制、激活和/或增强R1基因转录的化合物的原始样品中有可能分离到该化合物，或者如果它由多种不同的化合物组成的话，可以进一步地细分原始样品，以致于减少每个样品中不同物质的数目并用原始样品的一部分重复该方法。根据样品的复杂性，可多次进行上述步骤，优选直到根据本发明方法鉴定的样品只包括有限数目的物质或只有一种物质。优选地，所述样品包含具有相似的化学和/或物理特性的物质，更优选地，所述样品是相同的。优选地，根据上述方法鉴定的化合物进一步地设计为适合应用于植物育种或植物细胞和组织培养的形式。

根据本发明方法检测和鉴定的化合物可以是表达文库，如，cDNA表达文库、肽、蛋白、核酸、抗体、有机小化合物、激素、肽模拟物、PNAs或类似物(Milner，《自然医学(Nature Medicine)》1(1995)，879-880；Hupp，《细胞(Cell)》83(1995)，237-245；Gibbs，《细胞》79(1994)，193-198和前述的文献)。另外，编码R1基因推测的调控子的基因可用下列方法鉴定，例如，用本领域已知的基因靶向载体进行的插入诱变(参见，如，Hayashi，《科学》258(1992)，1350-1353；Fritze和Walden，通过T-DNA标签的基因激活(Gene activation by T-DNA tagging)，在《分子生物学方法(Methods in Molecular biology)》中，44(Gartland，K.M.A.和Davey，M.R.编辑)，Totowa：Human Press(1995)，281-294)或转座子标签(Chandlee，Physiologia Plantarum 78(1990)，105-115)。所述化合物也可以是已知的抑制剂或激活剂的功能性衍生物或类似物。用于制备化学衍生物和类似物的方法是本领域技术人员熟知的，并在如Beilstein，《有机化学手册(Handbook of OrganicChemistry)》，Springer edition New York Inc.，175 Fifth Avenue，纽约，N.Y.10010美国和《有机合成(Organic Synthesis)》，Wiley，纽约，美国)中描述。另外，所述的衍生物和类似物可根据本领域已知的方法检测它们的功效。另外，例如，根据上述方法，也可使用肽模拟物和/或适用的衍生物和类似物的计算机辅助设计。

确定一种化合物是否能抑制、激活和/或增强R1基因转录可以通过，如在植物中监控报告基因来进行。还可监控接触该化合物的本发明的转基因植物的表型特征，并将其与野生型植物的表型特征进行比较。在另一个实施方式中，所述特征可与接触化合物(已知该化合物能或不能抑制、激活和/或增强R1基因转录或该蛋白的活性)的转基因植物的特征进行比较。认为根据本发明的方法鉴定的化合物是非常有益的，因为到目前为止已知的启动子只有有限的用途，这是由于它们的调控序列没有或没有紧密调控的病原体特异性。

由上述方法鉴定的抑制剂或激活剂可证明作为除草剂、杀虫剂和/或作为植物生长调控剂是有用的。因此，在另一个实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法获得或鉴定的化合物。该有用的化合物可以是，例如，结合到本发明的调控序列的反式作用因子。可以用本领域常规方法进行反式作用因子的鉴定(参见，如，Sambrook，如前述，和Ausubel，如前述)。为了确定蛋白是否结合到本发明的调控序列上，可使用常规的DNA足迹法和/或非变性凝胶转移分析。为了鉴定与本发明的调控序列结合的反式作用因子，可以将所述调控序列用作常规蛋白纯化方法中的亲和试剂，或作为筛选表达文库的探针。一旦鉴定了反式作用因子，就可以继续对其与本发明的调控序列的结合进行调节，这种调节是以，例如，筛选用于抵制反式作用因子与本发明的调控序列结合的抑制剂而开始的。然后R1基因在植物中的激活或抑制可通过例如在用于转基因植物的载体中应用该反式作用因子(或抑制剂)或其编码基因获得。另外，如果反式作用因子的活性形式是一个二聚体，可使该反式作用因子显性失活突变以抑制其活性。另外，基于对反式作用因子的鉴定，可鉴定该途径中导致受控于本发明调控序列的基因的激活(如，信号传导)或抑制的其他化合物。然后可继续对这些化合物活性进行调节，以开发出用于调节受控于本发明调控序列的基因的表达的其他药物和方法。

优选地，将根据上述方法鉴定的化合物或其类似物或衍生物，进一步设计为适合应用于植物育种或植物细胞和组织培养的形式。例如，它可以与本领域已知的农业上可接受的载体联合。可通过采用本发明上述方法以及以满足农业使用的剂量合成被鉴定为抑制剂或激活剂的化合物制备植物防护性组合物。因此，本发明也涉及用于制备农业植物防护性组合物的方法，该方法包括本发明方法的上述步骤以及合成这样鉴定的化合物或其类似物或衍生物。

在本发明的植物防护性组合物中，由上述方法鉴定的化合物可以用常规方法优选地设计为常用的如除草剂和杀虫剂或能诱导系统获得性抗性(SAR)的制剂。例如，可以使用本领域技术人员已知的某种添加剂，例如金刚砂或0.01％SDS(十二烷基硫酸钠)溶液，所述添加剂包含稳定剂或易于植物细胞、植物组织或植物吸收的物质。

在另一个实施方式中，本发明涉及鉴定和获得病原体的无毒或毒性因子的方法，该方法包括下列步骤：

(a)在一个读出系统中以来源于病原体的肽或蛋白表达文库为背景筛选本发明的R1蛋白或其片段，所述筛选是在允许所述读出系统中蛋白和肽相互作用的合适的条件下进行的；

(b)鉴定或证实导致读出系统抑制或激活的cDNA。

除了在具修饰特性的植物的基因工程中使用根据本发明的核酸分子的上述可能性以及它们在鉴定同源分子中的作用之外，还可以将上述核酸分子用于几个其他用途，例如，用于鉴定编码与上述R1蛋白相互作用的蛋白的核酸分子。这可以用本领域熟知的实验来实现，例如，如Scofield(《科学》274(1996)，2063-2065)中所述，通过使用通常所说的酵母“双杂交系统”。在这一系统中，本发明的核酸分子编码的蛋白或其较小部分被连接到GAL4转录因子的DNA结合结构域。表达该融合蛋白并包含有合适的启动子驱动的lacZ报告基因的酵母菌株，用cDNA文库进行转化，其中所述启动子被GAL4转录因子识别，所述cDNA文库可表达融合到激活结构域的植物蛋白或肽。因此，如果由一个cDNA编码的肽能够与包含本发明蛋白的肽的融合肽相互作用，该复合体能够指导报告基因的表达。用这种方法，可将根据本发明的核酸分子和编码的肽用于鉴定与R1蛋白相互作用的肽和蛋白。也可将该方法用于鉴定上述的抑制剂和激活剂。

用于鉴定与根据本发明的蛋白或编码该分子的核酸分子相互作用的化合物的其它方法有，例如，用噬菌体展示系统和滤膜结合试验进行体外筛选或者使用如BlAcore仪器(Pharmacia)进行相互作用的“实时”监测；参见前述的文献。

也可用通常所说的三杂交系统进行相似的策略。

酵母双杂交系统最初由Fields和Song描述(《自然》340(1989)，245-246；也可参见综述Vidal，M，在Bartel，P.L.和Fields，S.(编辑)，《酵母双杂交系统(The yeast two-hybrid system)》中，牛津大学出版社(Oxford University Press)，纽约，NY，(1997)，109-147)。酵母双杂交系统的一个优化版本已描述于(Gyuris，《细胞》75(1993)，223-232；Zervos，《细胞》72(1993)，223-232。)简短地说，使用多肽的一个结构域作为结合化合物的饵。通过它们可在缺少亮氨酸的平板上生长的能力选出阳性克隆，然后进一步地检测在含X-gal平板上变蓝的能力，如以前详述；也可参见WO 95/31544。一个优化版本是“反式酵母双杂交系统”，其使用负性选择策略用于选择相互作用缺乏的等位基因，例如在Vidal，《美国国家科学院院刊》93(1996)，10321-10326；Vidal，《美国国家科学院院刊》93(1996)，10315-10320中描述的。该系统使用反选择性报告基因URA3。表达Ura3p的酵母细胞将化合物5-氟乳清酸(FOA)转化为毒性衍生物5-氟尿嘧啶。因此在FOA存在的情况下可反选择导致URA3报告基因激活的双杂交相互作用，而且失去功能的突变体可从大的野生型等位基因池中特异地选出。

例如，另一个方便的方法可为如SenGupta，《美国国家科学院院刊》93(1996)，8496-8501所述的酵母三杂交系统。开发酵母三杂交选择系统是为了分离与RNA相互作用的蛋白的基因，并研究RNA-蛋白的相互作用。基于酵母双杂交系统的这一系统，包含与已知的RNA结合蛋白融合的DNA结合结构域、与预期的RNA结合蛋白融合的激活结构域以及杂合的RNA。只有当两杂合蛋白均和杂合的RNA相互作用时才会发生报告基因的转录。在反式三杂交系统中，蛋白和杂合的RNA的相互作用导致其产物对酵母细胞有害的报告基因的表达。根据上述本发明的方法可采用所有这些方法，其中将R1蛋白或其肽片段作为饵，用于鉴定和获得无毒或毒性因子和它们的编码cDNA或其部分。用于获得在筛选分析中检测为阳性的那些克隆的DNA序列的方法是本领域技术人员所熟知的，并在上述参考的文献中描述。

本发明还涉及用上述方法获得或鉴定的cDNA及它们编码的产物。

本发明还涉及组合物，该组合物包含至少一个上述的核酸分子和/或包含与这样的核酸分子互补的核酸分子、本发明的载体、本发明的R1蛋白或其具免疫学或生物学活性的片段或者特异性识别这样的蛋白或片段的抗体或适体；调控序列或重组DNA、或本发明的相应的载体、根据本发明的蛋白定向设计的化合物和/或根据上述方法鉴定的化合物和/或特异性识别这样的化合物或调控序列的抗体，以及任选地，涉及用于检测的适合的方法或植物细胞和组织培养检测的适合的方法。

可将诊断组合物用于通过检测相应mRNA的存在来检测R1基因的表达的方法中，该方法包括从细胞中分离的mRNA并在杂交条件下将所获得的mRNA与包含上述核酸探针的探针接触，检测与探针杂交的mRNA的存在，并由此检测细胞中的基因表达。检测根据本发明的蛋白存在的其他方法包括本领域熟知的免疫技术，如酶联免疫吸附分析。

另外，本发明涉及一种试剂盒，该试剂盒包含至少一个本发明的上述的核酸分子、载体、蛋白、化合物、抗体或适体。本发明的试剂盒还可进一步含有下列成分，如适用于产生转基因植物细胞、植物组织或植物的选择性培养基的选择标记和组分。另外，试剂盒可包含可在本发明的重组基因或载体中存在的报告基因的缓冲液和底物。本发明的试剂盒可以方便地用于进行本发明的方法，尤其是能用于在此提及的多种应用，如在诊断领域或作为研究工具。本发明的试剂盒的各部分可独立包装于小瓶中或合并于容器或多容器单元中。试剂盒的制造优选地依照本领域技术人员已知的标准程序进行。可将根据本发明的试剂盒或其成分用于植物细胞和植物组织培养中，例如，用于上述的检测R1基因抑制剂和激活剂的任何方法中。本发明的试剂盒和其成分在培育新品种上非常有用，例如，呈现改善的特性如营养价值或病害抗性的植物新品种。

对本领域技术人员来说显然，可以将本发明的调控序列、重组DNA分子、载体和化合物用于产生具有想要的性状的转基因植物；参见综述TIPTEC Plant Product & Crop Biotechnology 13(1995)，312-397。

另外，可以将根据本发明核酸分子作为在植物育种中的分子标记使用。此外，可将根据本发明核酸分子的过量表达用于改变或修饰植物/病原体相互作用。术语“病原体”包括，例如，细菌、病毒和真菌及原生动物。优选地，上述病原体是致病疫霉菌。

另外，本发明涉及本发明的核酸分子、载体、宿主细胞、蛋白、调控序列、适体重组DNA分子、载体、化合物、适体和/或抗体的用途，其中将上述物质用于鉴定病原体毒性和无毒基因的筛选方法、筛选植物保护性化合物、在植物中诱导病原体抗性、作为在标记辅助的植物育种中的标记。优选将本发明的调控序列或重组DNA分子用于异源DNA序列的表达。

本发明的描述和实施例公开和涵盖了这些和其他的实施方式。涉及本发明的任何一种方法、用途和化合物的其他文献可以用如电子设备从公共图书馆中获得。例如可利用因特网上提供的“Medline”公共数据库，如在地址http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html。另外的数据库和地址，如http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/，http：//www.infobiogen.fr/，http：//www.fmi.ch/biology/ research_tools.html，http：//www.tigr.org/，都是本领域技术人员熟知的并可以用如http：//www.lycos.com获得。Berks的TIBTECH12(1994)，352-364中提供了用于回溯检索和目前关注的生物技术中专利信息的总评和专利信息相关来源的纵览。

参考下列非限制性的附图和实施例进一步描述本发明。

附图说明：

图1.R1区域的遗传和物理图谱。GP21和GPl79是用于构建R1区域的高分辨率图谱的标记。SPUD237和AFLPl是改造过的在R1侧翼的AFLP标记(Meksem等，1995，De Jong等，1997)。遗传距离以厘摩(cM)表示。CosS是用SPUD237选择的粘粒克隆。物理图谱中的其余克隆是长度为70到90kb的BACs克隆。黑色实心棒：来自携带R1的染色体的BACs克隆。灰色棒：来自携带r1的染色体的BACs克隆。白色棒：未确定BAC来源。用将BAC末端与R1分离的重组子的数目表示定位的BAC末端。用于染色体步查的粘粒和BAC末端用垂直箭头表示。RGL：抗性基因类似片段。

图2.用等位基因特异性引物76-2sf2和76-2SR和DNA模板PCR扩增R1基因的1.4kb片段，其中DNA模板来自(A)Desirée；(B)抗性亲本P41；(C)敏感亲本P40；(D)转基因Desirée植物10-2_5；(E)携带R1等位基因的BAC克隆BA87d17；(F)、(G)、(H)、(I)、(J)分别是BAC克隆BAl22p13，BAl2101，BA76011，BA47F2和BA27c1；(K)阴性对照。

图3.R1互补试验。接种9天后(A)敏感的Desirée；(B)用g10-2克隆转化的转基因Desirée系No：10-2_5和(C)抗性亲本P41(R1r1)的叶片上呈现病害症状。

图4.R1基因。(A)结构构成。框型表示外显子，折线表示内含子。(B)推测的氨基酸序列。双下划线表示亮氨酸拉链基序。斜体字表示LRR区域。在框中表示预测的激酶基序，粗体字表示N-糖基化位点。植物抗性蛋白的特异性保守基序QLPL、CFLY和LHD加下划线。氨基酸为标准的单字母密码子。

图5.染色体5的R1座位附近区域的图示。填充垂直线的框代表携带R1和r1等位基因的染色体间的同源区域。用开放框表示功能性等位基因R1.1和R1.2/r1.2。折线表示与R1染色体相比在r1染色体上存在的缺失。

具体实施方式

实施例

材料和方法：

植物材料：

将杂合二倍体克隆H79.1506/l(R1 r1)和H80.696/4(r1 r1)间杂交的Fl后代，分别称为P41和P40(Gebhardt等，1989，Leonards-Schippers等，1992)，并用于R1的高分辨率遗传图谱作图。如所述(Meksem等，1995)选出来源于P41亲本(R1 r1)的标记GP21到GPl79区间的重组子。将从P41×P40杂交而来的携带有杂合状态的R1的杂种克隆P6/210(Leister等，1997)用于构建基因组粘粒和BAC文库。将亲本P41(R1r1)用于构建cDNA文库。

检测对致病疫霉菌的抗性：

除了用整个叶片代替叶盘进行接种，如(Leonards-Schippers等，1992)所述确定对具有相应无毒因子Avr1的致病疫霉菌菌株(小种4)的抗性。接种后8-10天评定过敏反应(HR)存在与否。

马铃薯基因组文库：

由LION Bioscience AG(海德尔堡，德国)提供BAC文库。如(Meksem等，2000)所述，在双元载体pCLD04541(Jones等，1992)中用HindIII部分消化P6/210克隆的高分子量基因组DNA构建所述BAC文库。该BAC文库由101.376个克隆组成，平均插入长度为70kb。在含有冷冻缓冲液(5.5w/v％甘氨酸、7mM(NH₄)SO₄，1.5mM柠檬酸钠，0.3mM MgSO₄，13mM KH₂PO₄，27mM K₂HPO₄)的2YT培养基(Sambrook等，1989)中将克隆贮存在264个384孔微量滴定板(Genetix，牛津，英国)中。

用常规方法(Sambrook等，1989)从Sau3AI部分消化的P6/210的基因组DNA(17-23kb的片段)和在与BAC文库相同的载体(BamHI克隆位点)中构建大约150 000个克隆的粘粒文库。用Gigapack II Gold Packagingextract(Stratagene，加利福尼亚，美国)包装粘粒并将其转染到大肠杆菌(E.coli)菌株SURE^TM(Stratagene，加利福尼亚，美国)中。从含大约1500个细菌菌落的池中提取质粒DNA(Sambrook等，1989)。用SPUD237特异性引物产生和筛选了一百零三个粘粒池(De Jong等，1997)。用常规程序铺板并通过菌落杂交筛选阳性池(Sambrook等，1989)。

BAC文库的筛选和重叠群的构建：

用BioGRID自动装置(牛津，英国)制备用于以杂交为基础筛选BAC文库的高密度菌落滤膜。使用5×5阵列将克隆在双位点点样，每个22.5×22.5厘米尼龙膜(PALL，Biodyne，Portsmouth，英国)上具有6×384阵列的5×5阵列。每5×5阵列包括2×12个菌落并使pSW1克隆(PEBiosystems，Foster City，加利福尼亚，美国)占据阵列的对照位置。该点阵模式使27,648个克隆在每张膜上被显示两次。用一组四张带有101,376个克隆的滤膜进行文库筛选。在LB培养基上于37℃培养菌落滤膜15小时，然后用标准方法进行菌落杂交(Sambrook等，1989)，如(Gebhardt等，1989)所述进行滤膜杂交，不同之处是将300pg pSW1对照插入和探针一起标记和杂交，以便于鉴定阳性克隆的位置。从阳性克隆中纯化质粒DNA，并用T3和T7寡核苷酸作为测序引物从两端对插入片段进行测序。将BAC插入末端的DNA序列信息用于设计特异性PCR引物对。将用这些引物扩增的PCR产物和作为模板的各自的BAC克隆用作新的膜杂交的探针以鉴定重叠的BAC克隆，用于重叠的BAC克隆相对于彼此间的定位和在重组植物中的作图。通过对PCR产物测序来证实重叠。通过用重组植物和RFLP或基于PCR的标记分析进行的遗传作图来证实重叠群延伸的方向。为了测定BAC插入的大小，用NotI消化BAC DNA，并使用CHEF DRIII(BioRad，Hercules，加利福尼亚，美国)上的脉冲场凝胶电泳在11℃电泳12小时来分离片段，起始脉冲间隔为5秒，最终脉冲间隔为10秒，120°角，6伏特/厘米(V/cm)。

BAC DNA的分离：

根据稍微改进的生产商说明，用QlAfilter质粒纯化试剂盒100(Qiagen，Hilden，德国)提取BAC DNA。将单菌落在液体LB培养基中于37℃预培养8小时，将75μl预培养物加到75ml LB培养基中并于37℃继续培养15小时。将上清通过QlAfilter滤膜之前加入一个离心步骤，以除去细菌细胞碎片。

制备来自BAC插入的探针：

用HindIII和EcoRI彻底消化1.5μg的BAC DNA，并在0.8％低熔点琼脂糖凝胶(Sea Plaque GTG琼脂糖，Bioproducts，Rockland，Maine，美国)上与载体分离开。使用GELase体系(Epicentre Technologies orBiozym)根据供应商的说明，从凝胶中溶解插入的DNA。使用乙醇沉淀DNA，使其溶解于水中并用随机引物标记法标记上³²P-dCTP(Feinberg和Vogelstein 1984)。

BAC BA87d17的亚克隆：

于65℃将10μg的BAC DNA用1个单位的Tsp509I部分消化15分钟并在0.8％低熔点琼脂糖凝胶(Sea Plaque GTG琼脂糖，Bioproducts，Rockland，Maine，美国)上分离片段。使用GELase体系(EpicentreTechnologies，麦迪逊，美国)根据供应商的说明，洗脱大小约10kb的片段。将纯化的片段克隆入用EcoRI线性化并用SHRIMP磷酸酶(Roche，德国)去磷酸化的pCLD04541双元载体中，并转化到大肠杆菌菌株DH10B(Life Technologies，美国)中。将两百个重组菌落挑选到微量滴定板中。

cDNA文库的构建和筛选：

用致病疫霉菌小种4侵染约8周大的亲本植物P41(R1 r1)和敏感品种Desirée的切枝，并将其在玻璃缸下(为增加湿度)在17℃于生长箱中的水中光照16小时。在这些条件下，敏感对照的叶子在8天后长满了致病疫霉菌菌丝体。在接种2小时、19小时、3天、7天和9天后采集相同量的未感病的亲本P41的叶片和感病的叶片。用RNeasy植物小量提取试剂盒(RNeasy Plant Mini Kit)或Oligotex mRNA小量提取试剂盒(Oligotex mRNA Mini Kit)(Qiagen，Hilden，德国)根据供应商的说明，分离Poly A⁺RNA。根据生产商的说明，用该Poly A⁺RNA构建λZAPII cDNA文库(Stratagene，加利福尼亚，美国)。在连到λZAP载体之前收集不同的cDNA制备物。将5×10⁵pfu’s置于板上并通过噬菌斑杂交方法用BAC克隆BA121o1和BA76o11的插入片段作为探针进行筛选。

5’端的cDNA末端快速扩增(RACE)分析：

使用RNeasy植物小量提取试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)根据供应商的说明，从未感病的P41叶片(R1r1)组织中分离完整的RNA。使用SMART^TM Race cDNA扩增试剂盒(SMART^TM Race cDNA Amplification Kit，Clontech，加利福尼亚，美国)根据生产商的说明，用1μg完整RNA进行RACE分析。用于PCR扩增的套式基因特异性引物是：第一条RT1-1：5’-AAACCCGGTGTTCCAAATCTAACACT-3’(SEQID NO：3)，第二条RT2-1：5’-CATGTAGTGAGGATATGTCACGAGTG-3’(SEQ ID NO：4)。将RACE反应的最终PCR产物克隆到pGEM-T载体(Promega，加利福尼亚，美国)中。已将两个独立克隆测序。

DNA序列分析：

使用Max Planck育种研究所的(Max Planck Institute forBreeding Research)ADIS设备进行常规的DNA测序。使用ABI PRISM染色终止循环测序迅速反应试剂盒(ABI PRISM Dye Terminator CycleSequencing Ready Reaction Kit)和AB1377自动DNA测序仪(PEBiosystems，Foster City，加利福尼亚，美国)进行双脱氧链终止测序法。

使用威斯康星程序包10.0版本(Wisconsin Package Version 10.0，遗传学计算机组(Genetics Computer Group(GCG))，麦迪逊，威斯康星，美国)进行DNA序列分析。用国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information，Bethesda，MD，美国)和ExPASY wwwserver(Appel等，1994)提供的BlastX和其它运算法则检索序列数据库。

根瘤农杆菌的转化：

根据Wen-jun和Forde(1989)，将BAC克隆BA87d17的亚克隆g10电转移到根瘤农杆菌菌株LBA4404中。将三个农杆菌菌株LBAg10-2、LBAg10-5和LBAg10-23用于转化马铃薯。

根瘤农杆菌介导的马铃薯转化和转基因植物的分析：

在所有转化实验中使用敏感的马铃薯栽培品种Desirée。根瘤农杆菌介导的转化如Rocha-Sosa等(1989)所述进行，不同之处是MS培养基含有250mg/l凯福隆(Claforan)。通过聚合酶链式反应(PCR)，用针对插入的特异性引物87e(5’-ATTACAATGGGTTGAACTCAG-3’(SEQ ID NO：5))和87s(5’-ACCTCTTTCAATTGTTCTGGTG-3’(SEQ ID NO：6))检测卡那霉素抗性转基因植物中g10插入的存在。PCR条件是：于55℃保温(Ta)45秒，于72℃聚合60秒。用来源于cDNA c76-2的R1特异性引物76-2sf2(5’-CACTCGTGACATATCCTCACTA-3’(SEQ ID NO：7))和76-2SR(5’CAACCCTGGCATGCCACG-3’(SEQ ID NO：8))筛选转基因植物。PCR条件是：于55℃保温45秒，于72℃聚合90秒。在每个实验中使用每种植物的三个叶片进行对致病疫霉菌小种4的抗性的检测。

实施例1：R1座位的高分辨率遗传作图

为方便R1座位的物理作图，从588个植物中选出了16个位于R1侧翼的标记GP21和GP179之间(Leonards-Schippers等，1992)的重组子，并检测了其对带有相应的无毒因子Avr1的致病疫霉菌的抗性。和在同样区间先前选出的15个重组子一起(Meksem等，1995)，1049个植物中总共有31个在GP21-GP179区间的重组子，与3.0％的重组率(3厘摩)相对应。GP21和R1间的重组率与R1和Gp179间的重组率分别是2.2％和0.8％(表1)。

表1.从分离的F1群体的1049个植物中选出在GP21-R1，GP179-R1和GP21-GP179区间的重组个体的数目

                      GP21-R1    GP179-R1     GP21-GP179

重组子数目            23         8            31

基因型R1r1的重组子    12         4            16

基因型r1r1的重组子    11         4            15

重组率(％)            2.2        0.8          3.0

定位于GP21-GP179区间的标记SPUD237和AFLP1，(De Jong等，1997，Meksem等，1995)位于R1座位的侧翼。在1049个植物中这两个标记都通过一个重组事件与R1分离(0.1厘摩，图1)。

实施例2：向R1座位的染色体步查和R1候选基因的鉴定

将标记SPUD237用于筛选粘粒文库的探针。鉴定了一个阳性克隆CosS(图1)。对CosS插入进行末端测序产生了一个新的标记，其通过一个重组事件(0.1厘摩)与R1座位分离。用这个标记筛选BAC文库鉴定了BAC克隆BA100e13。三个重组事件将BA100e13的远端与R1分离。用接近R1的BA100e13末端鉴定了BA47f2。远离R1的BA47f2末端与BA100e13重叠并通过一个重组事件与R1分离。其近端与R1共分离，类似所有后续分析的BAC末端(图1的右边部分)。用与R1共分离的BA47f2末端鉴定了BA27c1克隆。与BA47f2不重叠的BA27c1末端鉴定了BA122p13和BA121o1克隆。与BA27cl不重叠的BA121o1末端显示与抗丁香假单胞菌的番茄基因Prf(Salmeron等，1996)具有非常高的序列相似性(翻译的氨基酸序列具有37％一致性、56％相似性)。将该抗性基因类似(RGL)片段用作探针再次筛选BAC文库。除了BA122p13，该RGL探针鉴定了几个新的阳性克隆，对其中的两个：BA87d17和BA76o11进一步进行分析。它们含有被设想为可能是R1候选者的RGL基因的全长拷贝。BA76o11和BA87d17的非重叠端与R1共分离。

也可使用便于物理图谱构建的BAC末端标记将BAC克隆定位到携带有r1或R1等位基因的P6/210(R1r1)染色体上。BA100e13、BA47f2和BA87d17克隆(图1)与R1等位基因顺式，而BA121o1、BA122p13和BA76o11从携带有r1的同源物而来(图1)。基于使用的标记，不能将BA27c1克隆定位到r1或R1染色体。

实施例3：R1候选cDNA克隆

用BAC克隆BA121o1和BA76o11的完整插入片段作为探针，从由基因型P41(R1r1)被侵染的叶片制备的cDNA文库中，分别分离了六个和八个cDNA克隆。这14个cDNA克隆中的八个与已知的植物抗性基因相似。与抗丁香假单胞菌的番茄基因Prf可获得最高的相似性(Salmeron等，1996)。这八个候选cDNA的序列彼此间有大约80％-90％的一致性。2292个核苷酸长的cDNA克隆c76-2与g10克隆(一个代表部分BA87d17的亚克隆)的基因组序列，除内含子外，是一致的(见后)。在数据库中与已知抗性基因的序列比较显示不是全长c76-2。用RACE分析，该cDNA向5’端延伸1943个核苷酸，得到4235个核苷酸的全长cDNA序列，该全长cDNA序列包含59个核苷酸的5’-非翻译区和在终止密码子和多聚腺苷酸尾巴之间的297个核苷酸的3’-非翻译区。该cDNA在基因组序列的2223位点包含一个起始密码子，其与g10克隆推测的氨基酸序列的第一个甲硫氨酸相对应(图4B)。在-3和+4位点(ATG的a是+1位点)的两个腺嘌呤相当于植物、昆虫、酵母和哺乳动物中的核糖体识别序列(Kozak1991)。

基于与其他七个候选cDNA的序列比对分析，设计cDNA c76-2的特异性PCR引物。引物76-2sf2和76-2SR(参见材料和方法)只有在亲本P41(R1r1)中产生1.4kb的PCR产物，而在亲本P40(r1r1)中没有产生(图2)。这一多态性表明即使图谱数据显示BAC BA87d17克隆(来源于含有R1的染色体)的远端和R1没有发生重组，但该BAC克隆仍然可能含有R1基因。

实施例4：R1表型的互补

从BA87d17(76kb)构建了在携带有平均10kb插入片段的双元载体pCLD04541(参见材料和方法)中的基因组亚文库。用BA121o1的RGL探针进行菌落杂交来筛选该文库。通过用从载体边界而来的正向引物(T3和T7)和从RGL而来的反向引物进行PCR而获得的扩增产物的大小来判断存在候选的RGL基因完整拷贝的阳性克隆。也可以用c76-2 cDNA特异性引物76-2sf2和76-2SR检测克隆。选出亚克隆g10-2并使其转化入根瘤农杆菌。使用三个不同的细菌克隆转化敏感栽培品种Desirée。从三个转化实验中，再生出15个独立的转基因系，并在四个独立实验中检测其表现的对致病疫霉菌小种4的抗性(表2)。

表2.检测用g10克隆转化的转基因马铃薯系对致病疫霉菌小种4的抗性。在四个独立实验中通过每个系的三个叶片表现的对致病疫霉菌小种4的过敏抗性，检测转基因系。

转基因系号              抗性c

10-2^a  1^b              敏感

10-2    2                抗性

10-2    3                抗性

10-2    4                抗性

10-5    1                抗性

10-5    2                敏感

10-5    3                未检测到(n.d.)

10-5    4                未检测到

10-5    5                抗性

10-23   1                未检测到

10-23   2                抗性

10-23   3                抗性

10-23   4                抗性

10-23   5                抗性

10-23   6                敏感

九个转基因系持续地显出典型的HR反应，与含有R1的抗性系P41相似(图3)；三个给出了不持续的结果而其余三个是敏感性的，类似未转化的Desirée对照。基于这些结果，得出的结论为g10亚克隆包含了有功能的R1基因。

所有具有R1表型的转基因系都包含与cDNA 76-2相应的基因，原因在于用引物76-2sf2和76-2SR扩增，产生1.4kb的PCR产物。该产物不存在于未转化的Desirée(对照)和图1中报道的作为R1附近的重叠群成员中除了BA87d17之外的所有BAC克隆中(图2)。

实施例5：R1基因的结构

将含有R1基因的亚克隆g10测序，参见SEQ ID NO：1。该序列为10,388个核苷酸长，并含有一个与其他植物抗性基因序列相似的基因。在GenEMBL数据库中没有鉴定出其他开放阅读框或序列同源性。与cDNAc76-2和5’RACE产物的序列相似性比对显示存在三个外显子和三个内含子。92bp(4878到4970位点)和126bp(6103到6229位点)的这两个内含子打断了编码区。81bp(6323到6404位点)的第三个内含子定位于紧接着终止密码子下游的3’非翻译区(图4A)。对推测的氨基酸序列进行预测，其为一个分子量为149.4kDa的1293个氨基酸的多肽(图4B)。R1基因的推测氨基酸序列与番茄的抗丁香假单胞菌的Prf因(Salmeron等，1996)最相似(40％一致性)。预测的R1蛋白具有由P-环构成的推定的核糖体结合位点(NBS)结构域(氨基酸572-578)、激酶2(氨基酸649-653)和激酶3a(氨基酸677-682)基序(图4B)。激酶基序下游是与在抗性基因中功能未知的保守结构域相似的其它序列：GLPL(在R1中为QLPL(SEQID NO：10))，CKLY(在R1中为CFLY(SEQ ID NO：12))和MHD(在R1中为LHD)。用ExPASY运算法则检索保守的基序，在推测的R1氨基酸序列中找到了推定的4个十四烷基化、9个糖基化、43个磷酸化和1个酰胺化位点。在该基因的羧基端部分，R1的推定的富含亮氨酸重复序列(LRR)结构域具有15-16个不完全的重复。像具有细胞质富含亮氨酸重复序列的其他植物的R蛋白一样，R1蛋白含有从氨基酸位置308到329的亮氨酸拉链(Hammond-Kosack和Jones，1997)。

实施例6：R1座位的基因组结构

DNA凝胶印迹分析表明R1是一个基因家族的成员。

R1特异性引物76-2sf2和76-2SR在BA87d17(R1)中扩增了1.4kb片段但在重叠克隆BA121o1、BA122p13和BA76o11(r1)中则不能(图2)。对BAC克隆BA87d17(R1)和BA122p13(r1)的DNA序列分析显示BA87d17含有R1基因家族的两个高度同源的成员：与有功能的R1基因相对应的R1，和与BA122p13中的r1.2等位基因直向同源的r1.1。有功能的R1基因是在携带R1的染色体中由BA87d17表示的区域中的15kb插入的一部分，但在携带r1的染色体中不存在(图5)。

显然除了如在前面的描述和实施例中特别描述的之外，也可实施本发明。根据上述教导，可以对本发明进行无数的修改和改变，因此，这些修改和改变也在所附的权利要求的范围内。

在本发明的背景技术、描述、实施例和序列表中引用的每篇文献的全部内容(包括专利、专利申请、杂志文章、摘要、实验室手册、书、序列或其他内容)都引入本文作为参考。

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               序列表

<110>马克思-普朗克科学促进协会公司

     KWS SAAT公司

<120>来源于植物的抗性基因

<130>P04DE023002

<150>EP 01120670.3

<151>2001-08-31

<160>12

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>10388

<212>DNA

<213>马铃薯

<220>

<221>内含子

<222>(4878)..(4970)

<223>

<220>

<221>内含子

<222>(6103)..(6229)

<223>

<220>

<221>内含子

<222>(6323)..(6404)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(2223)..(4877)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(4971)..(6102)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(6230)..(6321)

<223>

<220>

<221>5′UTR

<222>(2164)..(2222)

<223>

<220>

<221>启动子

<222>(1)..(2164)

<223>

<220>

<221> 3′UTR

<222>(6405)..(6702)

<223>

<400>1

ttaatatata gatggaatcg gtgttttaaa aggcagggcg cgaggcgaga cgttttactt          60

agtatagagc gaggcgtaag cctaatgatt catttttcta agaacgatat taattcatta          120

aattacttaa ttataataaa tttatacact tcaaatacac ttggatatga ataagtaatt          180

atccttcacg agattcaaat gaaaaataag tggagttaat tagagtaaag tagagtaatt          240

taaacacttt agtctgaatc tttatacatt atacaaaaaa agtaattata tttcaccaaa          300

ttcaaatgga aattaaaaat atatgaagat aattacaaca caagtgttat gtgtcagttg          360

gaaagctcaa gcgtgggtcc taccatactc catgacattt cacttttagg gtatgattcg          420

taatttaatg aaaatgatga cctttttttt tggagttagt aatgaggtct aaataactaa          480

acatagagga caaccctctt aagcaagcaa atcttgcaat aacatttcaa agaccatgat          540

atcctcaaat tttttattaa tgactaaaaa ctaacatgtt aaactctcct gtgtattatt          600

cattgtaata ttttttttgg ttaaatcatt cattgtaaaa taaattcatt atacataatg          660

ttaatttttt cttaataatc aaatattatt catcgtatat ttactaaaaa tattcaatgt          720

atgatgatga gagaataaac tatataagaa atataagaaa tttaatgaaa ccatattcaa          780

aaatggcttc tcaatgtgtc aaaaaatcaa caatgacaga tcaaatacat tatcttattt          840

ctttaaattg tgttagatat atttgtactt ttagaggatt attaatttat aatatcaatg          900

aagccatata tttatataag agtcttctga aaatatatta tcttattatc ttatcaaaat          960

ggatgatttt ttccattgat ccaagtcggg accaaaaaag aatattatct caaagagatt          1020

attaatttac caaatattaa tttagtgagg ttttactgta atttgggtgt ggtccatgac          1080

catatatatt ttgaaaaaaa actgctttgt aaattccaag ttggaacgac atttctacag          1140

ccaatgttga aatactattc ttgtcctgat taggagactt attatttcat ttcatatata          1200

gataggtccc ttgagaacta gaaagattaa attaaagatt gagatccaat aatgcatatg          1260

aacacagaac atttgtcttt tttccaaagg ggaccatata tatataagat gtcattgtgc          1320

tttatgtatg gaagagagaa taacgatctc atatatatat ctcatatata tatatatcat          1380

ctaaaataag atgttttaaa ccatctggta ttcggtatac aatttacact aaaaagacca          1440

aacaggtggg aaggacacaa acattagatc aaaaattaag gttaagtgat tcagatatca          1500

agaggaacaa tatactaatt ggaacaaatt aaagtatcct cacttacaat ggtcatatat          1560

agaagctact taggtaatac tctcactatc cctaattatt tgtccacttt taaattagca          1620

cacctattaa taaaacaatt attggcatag tgagtttacc attttacctt tttaattatg          1680

aagcgaatga attaaaaact taagatatta aaaaaattct gcctttaaca aagtaattat          1740

ttgagggtat aataggtaaa aagaaattgt ccttttttta tttgtcaaaa tgaacaagta          1800

gttagggaca actaaaaaag gaaaaatgga tgagtaatta ggaacggagg gagtataaaa          1860

cactgtcatc actcaaaaaa tatgagtatc ttgacttgca caacataggt acttaatcaa          1920

agactcaata tacaaatctc taaagtaaat ttgtatttgt atatacagtc tctttgaaag          1980

cccaatttgt ataaaatatt taaatgcagc tagatataca aacggaaatt agcatagcaa          2040

ctgaaactat agatatagaa cataattagg caatgacttt gttttttgtt tgtctgcctc          2100

acactttatt tgactgcctt ccttgaatac tttgaatatt ctaagtacgc cagctataag          2160

gtgaagaaag aattaaacta taatactctg tattgctctt cttccataat agtgtaacaa          2220

gg atg aat ttc aac aat gaa ttg tct gat ctg aaa aat cgc ttc cta             2267

   Met Asn Phe Asn Asn Glu Leu Ser Asp Leu Lys Asn Arg Phe Leu

   1               5                   10                  15

ttt agg acg ctg aga gcc cag aaa tgc tcg gat gtt gca aga gat cga            2315

Phe Arg Thr Leu Arg Ala Gln Lys Cys Ser Asp Val Ala Arg Asp Arg

                20                  25                  30

ata gat ttc ttt ata tgg gag tta aaa ttc ctt aat tgt ttt ctc cat            2363

Ile Asp Phe Phe Ile Trp Glu Leu Lys Phe Leu Asn Cys Phe Leu His

            35                  40                  45

ttg cag agc ttc gct ttt gca agt gaa tgt ggt atg cta gat atc tca            2411

Leu Gln Ser Phe Ala Phe Ala Ser Glu Cys Gly Met Leu Asp Ile Ser

        50                  55                  60

cag aaa atg ata gaa atttgc aag agg ttt aat aca cca cct cca cat             2459

Gln Lys Met Ile Glu Ile Cys Lys Arg Phe Asn Thr Pro Pro Pro His

    65                  70                  75

aat tca ttt gca tac tgg aag gag gta att tgc aag agg ctg tgc gct            2507

Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Lys Glu Val Ile Cys Lys Arg Leu Cys Ala

80                  85                  90                  95

att agc atc cag ccg gat gct agt tca gat gat gga ttt gca tgc tgg            2555

lle Ser lle Gln Pro Asp Ala Ser Ser Asp Asp Gly Phe Ala Cys Trp

                100                 105                 110

aag aaa gta att tgg aag act aag caa gaa ttc aga gct aaa tac tcc            2603

Lys Lys Val Ile Trp Lys Thr Lys Gln Glu Phe Arg Ala Lys Tyr Ser

            115                 120                 125

ttt cca aaa aca cta ctt gca gac aac aag gta tat gat gat gat gat            2651

Phe Pro Lys Thr Leu Leu Ala Asp Asn Lys Val Tyr Asp Asp Asp Asp

        130                 135                 140

act aat ccc aaa ttt gtg atg gaa ttc atc gat gct gtt gtg ggg aat            2699

Thr Asn Pro Lys Phe Val Met Glu Phe Ile Asp Ala Val Val Gly Asn

   145                  150                 155

ctc aat gtt cta gtc aag atc aat gat cca tct tca ttg ctt ttt gtt            2747

Leu Asn Val Leu Val Lys Ile Asn Asp Pro Ser Ser Leu Leu Phe Val

160                 165                 170                 175

cca gga ccc aag gaa caa ata gaa caa gtg tta aag gag ttg aag tta            2795

Pro Gly Pro Lys Glu Gln Ile Glu Gln Val Leu Lys Glu Leu Lys Leu

                180                 185                 190

ttg aga ttt ttt gtc tgc ttt gtt tca aac aaa tgt ata gag cct caa            2843

Leu Arg Phe Phe Val Cys Phe Val Ser Asn Lys Cys Ile Glu Pro Gln

            195                 200                 205

tac caa cat act act ttt tat act cac gct tta att gag gct agc cac            2891

Tyr Gln His Thr Thr Phe Tyr Thr His Ala Leu Ile Glu Ala Ser His

        210                 215                 220

atc gca atg gtt gtg tgg ttg aat ttg cca atc tat gga aac aga aat            2939

Ile Ala Met Val Val Trp Leu Asn Leu Pro Ile Tyr Gly Asn Arg Asn

    225                 230                 235

caa gac ttg gct tca agt gaa gtt agt tgt ttg ctt tct gat ttc atg            2987

Gln Asp Leu Ala Ser Ser Glu Val Ser Cys Leu Leu Ser Asp Phe Met

240                 245                 250                 255

gaa atg aag att aag tcc att cag cca gac atc agc cgc aac aat att            3035

Glu Met Lys Ile Lys Ser Ile Gln Pro Asp Ile Ser Arg Asn Asn Ile

                260                 265                 270

tat att gat gtc ttg agg gcg ttg aag tca acc ata cca caa gct caa            3083

Tyr Ile Asp Val Leu Arg Ala Leu Lys Ser Thr Ile Pro Gln Ala Gln

            275                 280                 285

gat aag cat gct gct gag agt ggc att gtg gag act cca aca cac aat            3131

Asp Lys His Ala Ala Glu Ser Gly Ile Val Glu Thr Pro Thr His Asn

        290                 295                 300

ctg atg gtt ggt ttg agt gat caa atg gcc aac ctt cag gag atg ctc            3179

Leu Met Val Gly Leu Ser Asp Gln Met Ala Asn Leu Gln Glu Met Leu

    305                 310                 315

tgc ctt cta aga gac aat ctc att cat ctg cca ata eta gat ctg gaa            3227

Cys Leu Leu Arg Asp Asn Leu Ile His Leu Pro Ile Leu Asp Leu Glu

320                 325                 330                 335

ttt cat ctt caa gat atg gat tct gtt att gtt gat gcc gga ctt ctt            3275

Phe His Leu Gln Asp Met Asp Ser Val Ile Val Asp Ala Gly Leu Leu

                340                 345                 350

att tac tca tta tat gat atc aag ggg cag aag gaa gac aca aca ttg            3323

Ile Tyr Ser Leu Tyr Asp Ile Lys Gly Gln Lys Glu Asp Thr Thr Leu

            355                 360                 365

gag gat atc aac cag gca ctt ggt ttt gat ctt ccc aga aac att gag            3371

Glu Asp Ile Asn Gln Ala Leu Gly Phe Asp Leu Pro Arg Asn Ile Glu

        370                 375                 380

cct atc aag gca atg atc aac ctt gtc atg caa aag gca ttt caa tgt            3419

Pro Ile Lys Ala Met Ile Asn Leu Val Met Gln Lys Ala Phe Gln Cys

    385                 390                 395

aac ttg cca agg att cat gga cta ggt tat gtc gat ttt cta ttg aaa            3467

Asn Leu Pro Arg Ile His Gly Leu Gly Tyr Val Asp Phe Leu Leu Lys

400                 405                 410                 415

aac ctg aag gat ttc caa ggc cgt tat tca gat tca ctc gat ttc ctc            3515

Asn Leu Lys Asp Phe Gln Gly Arg Tyr Ser Asp Ser Leu Asp Phe Leu

                420                 425                 430

aag aat caa ctt caa gtt att caa act gaa ttt gag agc ttg caa cct            3563

Lys Asn Gln Leu Gln Val Ile Gln Thr Glu Phe Glu Ser Leu Gln Pro

            435                 440                 445

ttc ttg aag gtt gtc gta gaa gag cca cac aat aag ctc aag aca ctg            3611

Phe Leu Lys Val Val Val Glu Glu Pro His Asn Lys Leu Lys Thr Leu

           450            455            460

aat gaa gat tgt gct aca cag ata att agg aaa gca tat gag gtg gaa            3659

Asn Glu Asp Cys Ala Thr Gln Ile Ile Arg Lys Ala Tyr Glu Val Glu

    465                 470                 475

tat gta gtt gat gct tgt ata aac aaa gag gtt cct cag tgg tgc atc            3707

Tyr Val Val Asp Ala Cys Ile Asn Lys Glu Val Pro Gln Trp Cys Ile

480                 485                 490                 495

gag cgt tgg ctc ctg gat atc ata gag gag att act tgt atc aaa gca            3755

Glu Arg Trp Leu Leu Asp Ile Ile Glu Glu Ile Thr Cys Ile Lys Ala

                500                 505                 510

aag att cag gaa aag aac acg gtt gag gat aca atg aag act gtc att            3803

Lys Ile Gln Glu Lys Asn Thr Val Glu Asp Thr Met Lys Thr Val Ile

            515                 520                 525

gct cgt aca tca tca aaa ctg gca agg act cca agg atg aat gaa gag            3851

Ala Arg Thr Ser Ser Lys Leu Ala Arg Thr Pro Arg Met Asn Glu Glu

        530                 535                 540

att gtt ggg ttt gag gat gtc ata gaa aat tta aga aaa aaa cta ctg            3899

Ile Val Gly Phe Glu Asp Val Ile Glu Asn Leu Arg Lys Lys Leu Leu

    545                 550                 555

aat gga acc aaa ggg caa gat gtc att tca att cac ggc atg cca ggt            3947

Asn Gly Thr Lys Gly Gln Asp Val Ile Ser Ile His Gly Met Pro Gly

560                 565                 570                 575

tta ggt aag acg act tta gcc aac agt ctc tat tct gac agg tca gtt            3995

Leu Gly Lys Thr Thr Leu Ala Asn Ser Leu Tyr Ser Asp Arg Ser Val

                580                 585                 590

ttt tct caa ttt gat att tgt gca caa tgt tgt gtg tct caa gta tat            4043

Phe Ser Gln Phe Asp Ile Cys Ala Gln Cys Cys Val Ser Gln Val Tyr

            595                 600                 605

tct tat aag gac tta ata ttg gcc ttg cta cgt gat gct att ggt gag            4091

Ser Tyr Lys Asp Leu Ile Leu Ala Leu Leu Arg Asp Ala Ile Gly Glu

        610                 615                 620

ggt tct gtg cgt aga gaa ctt cat gcc aat gaa tta gct gat atg ctt            4139

Gly Ser Val Arg Arg Glu Leu His Ala Asn Glu Leu Ala Asp Met Leu

    625                 630                 635

cgc aaa act cta ttg ccc cga agg tac ctt atc ctt gtt gat gac gtg            4187

Arg Lys Thr Leu Leu Pro Arg Arg Tyr Leu Ile Leu Val Asp Asp Val

640                 645                 650                 655

tgg gaa aat agt gtt tgg gat gat tta aga ggt tgt ttt cca gat gtc            4235

Trp Glu Asn Ser Val Trp Asp Asp Leu Arg Gly Cys Phe Pro Asp Val

                660                 665                 670

aat aac aga agc aga atc att cta aca aca aga cat cat gaa gtt gcc            4283

Asn Asn Arg Ser Arg Ile Ile Leu Thr Thr Arg His His Glu Val Ala

            675                 680                 685

aaa tat gct agt gtt cat agt gat ccc ctt cat ctt cgt atg ttt gac            4331

Lys Tyr Ala Ser Val His Ser Asp Pro Leu His Leu Arg Met Phe Asp

        690                 695                 700

gaa gtt gaa agt tgg aag ttg ctt gaa aag aaa gtg ttt ggt gaa gaa            4379

Glu Val Glu Ser Trp Lys Leu Leu Glu Lys Lys Val Phe Gly Glu Glu

    705                 710                 715

agc tgt tcc cct ctc cta aaa aat gtt ggg cta aga ata gca aaa atg            4427

Ser Cys Ser Pro Leu Leu Lys Asn Val Gly Leu Arg Ile Ala Lys Met

720                 725                 730                 735

tgt gga caa cta cct ctt tca att gtt ctg gtg gct ggt att ctg tca            4475

Cys Gly Gln Leu Pro Leu Ser Ile Val Leu Val Ala Gly Ile Leu Ser

                740                 745                 750

gag atg gaa aag gaa gta gaa tgt tgg gaa caa gtg gcc aac aat ttg            4523

Glu Met Glu Lys Glu Val Glu Cys Trp Glu Gln Val Ala Asn Asn Leu

            755                 760                 765

ggt tcc tac att cac aat gac tca aga gcc att gta gac aaa agt tat            4571

Gly Ser Tyr Ile His Asn Asp Ser Arg Ala Ile Val Asp Lys Ser Tyr

        770                 775                 780

cat gtt tta cct tgt cat ctt aag tct tgc ttc ctt tat ttt gga gca            4619

His Val Leu Pro Cys His Leu Lys Ser Cys Phe Leu Tyr Phe Gly Ala

    785                 790                 795

ttt tta gaa gat aga gtg att gac att tca agg tta ata agg cta tgg            4667

Phe Leu Glu Asp Arg Val Ile Asp Ile Ser Arg Leu Ile Arg Leu Trp

800                 805                 810                 815

ata tca gaa gca ttt ata aaa agt agt gaa ggc agg agg ttg gag gat            4715

Ile Ser Glu Ala Phe Ile Lys Ser Ser Glu Gly Arg Arg Leu Glu Asp

                820                 825                  830

ata gca gaa ggt tac ttg gag aat ctt att gga aga aat cta gta atg            4763

Ile Ala Glu Gly Tyr Leu Glu Asn Leu Ile Gly Arg Asn Leu Val Met

            835                 840                 845

gtt act cag agg tcc att tca gat ggt aag gcg aaa gaa tgt cgc ctt            4811

Val Thr Gln Arg Ser Ile Ser Asp Gly Lys Ala Lys Glu Cys Arg Leu

        850                 855                 860

cat gat gta tta ctc gac ttc tgc aag gaa aga gca gct gag gag aat            4859

His Asp Val Leu Leu Asp Phe Cys Lys Glu Arg Ala Ala Glu Glu Asn

    865                 870                 875

ttt cta eta tgg ata aat aggtaatatg ataagtaact gtactttcaa                   4907

Phe Leu Leu Trp Ile Asn

880                 885

tcaatcaagt atttcaagtt atatctgaaa attaatgata tgattttgct aattgatata          4967

ttc agg gat cag att acc aaa cct tct tcc tgt gtt tac tct cac aag            5015

    Arg Asp Gln Ile Thr Lys Pro Ser Ser Cys Val Tyr Ser His Lys

                    890                 895                 900

cag cat gct cac ttg gcc ttc act gaa atg cat aat ctt gta gaa tgg            5063

Gln His Ala His Leu Ala Phe Thr Glu Met His Asn Leu Val Glu Trp

                905                 910                 915

agt gcg tct tgc tca ttt gtt ggc tcg gta gta ctt tcc aat aaa tat            5111

Ser Ala Ser Cys Ser Phe Val Gly Ser Val Val Leu Ser Asn Lys Tyr

            920                 925                 930

gac tca tac ttt tcc act cgt gac ata tcc tca cta cat gat ttt tca            5159

Asp Ser Tyr Phe Ser Thr Arg Asp Ile Ser Ser Leu His Asp Phe Ser

        935                 940                 945

att tca cgc att tta cca aat ttc aag ttt cta aaa gtg tta gat ttg            5207

Ile Ser Arg Ile Leu Pro Asn Phe Lys Phe Leu Lys Val Leu Asp Leu

    950                 955                 960

gaa cac cgg gtt ttt att gat ttt att cca act gag ctt gtt tac ttg            5255

Glu His Arg Val Phe Ile Asp Phe Ile Pro Thr Glu Leu Val Tyr Leu

965                 970                 975                 980

aag tat ttt tct gca cac att gaa cag aat tca att cct tca agc ata            5303

Lys Tyr Phe Ser Ala His Ile Glu Gln Asn Ser Ile Pro Ser Ser Ile

                985                 990                 995

tcc aat ctt tgg  aac ctt gaa act ctt  ata tta aaa agt cca  ata             5348

Ser Asn Leu Trp  Asn Leu Glu Thr Leu  Ile Leu Lys Ser Pro  Ile

            1000                 1005                 1010

tat gcg tta cgt  tgc acg cta cta cta  cct agt aca gtt tgg  gat             5393

Tyr Ala Leu Arg  Cys Thr Leu Leu Leu  Pro Ser Thr Val Trp  Asp

           1015                  1020                 1025

atg gtt aaa ttg  aga cat ctg tat att  cct gac ttc agc aca  agg             5438

Met Val Lys Leu  Arg His Leu Tyr Ile  Pro Asp Phe Ser Thr  Arg

            1030                 1035                 1040

att gaa gca gca  tta ctt gag aac tct  gca aaa ctt tat aat  ttg             5483

Ile Glu Ala Ala  Leu Leu Glu Asn Ser  Ala Lys Leu Tyr Asn  Leu

           1045                  1050                 1055

gaa acc ctt tcc  act cta tat ttc tct  cgt gtt gag gat gca  gaa             5528

Glu Thr Leu Ser  Thr Leu Tyr Phe Ser  Arg Val Glu Asp Ala  Glu

           1060                  1065                 1070

ttg atg ctg aga  aaa aca cct aat ctt  cga aaa ctg ata tgt  gaa             5573

Leu Met Leu Arg  Lys Thr Pro Asn Leu  Arg Lys Leu Ile Cys  Glu

           1075                  1080                 1085

gtt gaa tgt tta  gaa tac ccc cct cag  tac cat gtg ttg aat  ttt             5618

Val Glu Cys Leu  Glu Tyr Pro Pro Gln  Tyr His Val Leu Asn  Phe

           1090                  1095                 1100

cca ata cgg ctt  gaa ata cta aag ctt  tat cga tca aaa ttt  aaa             5663

Pro Ile Arg Leu  Glu Ile Leu Lys Leu  Tyr Arg Ser Lys Phe  Lys

            1105                 1110                 1115

acc atc ccc ttt  tgc atc tct gca cca  aat ctc aaa tac ttg  aaa             5708

Thr Ile Pro Phe  Cys Ile Ser Ala Pro  Asn Leu Lys Tyr Leu  Lys

            1120                 1125                 1130

ctc tgt ggc ttt  tcc ctg gat tct cag  tac tta tca gaa act  gct             5753

Leu Cys Gly Phe  Ser Leu Asp Ser Gln  Tyr Leu Ser Glu Thr  Ala

            1135                 1140                 1145

gat cat ctc aag  cac ctt gag gta ctc  ata ctg tac aag gtt  gaa             5798

Asp His Leu Lys  His Leu Glu Val Leu  Ile Leu Tyr Lys Val  Glu

            1150                 1155                 1160

ttt ggt gat cat  agg gaa tgg aaa gtg  agc aat ggc aag ttc  cct             5843

Phe Gly Asp His  Arg Glu Trp Lys Val  Ser Asn Gly Lys Phe  Pro

            1165                 1170                 1175

caa ctc aaa atc  ttg aaa cta gaa tat  ttg tcc ttg gtg aaa  tgg             5888

Gln Leu Lys Ile  Leu Lys Leu Glu Tyr  Leu Ser Leu Val Lys  Trp

            1180                 1185                 1190

att gta gct gat  gat gcc ttt cct aac  ctt gaa caa ttg gtt  ttg             5933

Ile Val Ala Asp  Asp Ala Phe Pro Asn  Leu Glu Gln Leu Val  Leu

            1195                 1200                 1205

cgt gga tgt caa  gat ctt atg gag atc  cct tct tgt ttc atg  gac             5978

Arg Gly Cys Gln  Asp Leu Met Glu Ile  Pro Ser Cys Phe Met  Asp

            1210                 1215                 1220

atc ctt tct ctc  aag tac atc ggg gta  gaa tac tgc aat gag  tcg             6023

Ile Leu Ser Leu  Lys Tyr Ile Gly Val  Glu Tyr Cys Asn Glu  Ser

            1225                 1230                 1235

gtt gtc aag tca  gcc ttg aat ata caa  gaa aca caa gtc gaa  gat             6068

Val Val Lys Ser  Ala Leu Asn Ile Gln  Glu Thr Gln Val Glu  Asp

            1240                 1245                 1250

tat caa aat act  aat ttc aag ctc gtt  ctc atc g aggtacacta                 6112

Tyr Gln Asn Thr  Asn Phe Lys Leu Val  Leu Ile

            1255                 1260

ctgaaaaaag ctttattctg catgattttg atgaatcaga aatcgcctaa attttacaaa          6172

ctgttttctc agttatcttt acctcgtggc ctcgttttac atttgggttc ttctctt             6229

ag  ttt tct  ttg cag aaa aag gcg  tgg aaa tta aat tta  act gat             6273

Glu Phe Ser  Leu Gln Lys Lys Ala  Trp Lys Leu Asn Leu  Thr Asp

        1265                 1270                 1275

gcg gaa gat  atg cac aat gca gta  aaa aat att ctt gca  gaa ata             6318

Ala Glu Asp  Met His Asn Ala Val  Lys Asn Ile Leu Ala  Glu Ile

        1280                 1285                 1290

aga taggtactac tttttttttt ttctttcctt tttttaaata caccaaatag                 6371

Arg

atagattcat cttttttgtc ttttcgatat gaaagggata gaatcagttt catctgatga          6431

gaaagagaag aaacttactg tgaccggaga tgtggatgct gatgaagttc aattagttgt          6491

ggagaaactg agaaagcgtg gcatgccagg gttgtagtcc caacttgtca acacaaatgt          6551

gctatactca ttttgcttac tgtaatacca tttcatgaca cacacacaca aacattaact          6611

gtagtaaagt tttgatggat cagtaaatct gagttcaacc cattgtaatc cgttcaaatt          6671

caactcaaaa aattcccatt gagttattct ttaacagggt atccagagtt tgtagctgga          6731

gcaatttgga atatcacatg taatttcttt atgagttaat tcgtttaata aaagattctg          6791

taaaacgtcc aacggctgtt gcattcattg taaactaaat atatctcagt atgtaactat          6851

tgaacaaatt tttcatttta gtccctgagg tttgatgtaa gtcattagat tttacggatc          6911

ctgaagtgaa tggttttagc cttttctatt ttcttatgag ttcaccaaaa tgttgtgatg          6971

ccactctgct acatgttaga gaaatgagaa tgttagcacc cgagagtatg gcctagcggt          7031

caatcaatga agcaggtgaa aacaacaaaa gcaaaaaata ctaagagatt tcttcacatc          7091

tatctaagta ccgctaagca aagatactgt aatgaccctc ctggtcattt atgtgtcttg          7151

ccttctgtgt gtcgtttaga gtgttcctat agcgacccca agtcatttat gacttgctgg          7211

gactaacggt tcggtcacat ggtcgttcgt ttggttttgg tgcgagtttt tgtgttttgg          7271

agcttatgaa tcttgaacga tgattttcga tcaaaaattc aagaagatga catcggaatc          7331

catttctaac gattccatca gctccggaag ggtcatttta ggctagtagc ttggtcggca          7391

tgactcccgg tgcgattagg ccttttaact ttaagtttaa gcctaagttt gactttggtc          7451

aacattctga gtaaacgcgc tcggatgaga attccgtcag tgcggttagc tccggaatgt          7511

caagtttggt ttagattgac ctttcttttg tgtctcgagg tttttgatat ttttcggagc          7571

tcttttgtgg gttttgactt aaaatggcat ttgggtgtgg aatccacttt ttgtcaagat          7631

gacctcgtat agaaattttg gctgtgccat tgagtccgaa atatcgaatt tgatatgatt          7691

gcatatctcg tttgtgtgca cggggttccg aacgagttcg gagaaccttg tcgcagtttt          7751

taaattttgg ggtaagtgca gaaaaatctg cacttttgga aaaccttaaa aacctcatcc          7811

ctctctcatc cctctctcat ctctcaatca tttaggcgat tcgaagtgtg ggaactttgt          7871

atttttgatg gcttcgctgt agagtattca gaagctgttg ggtgcgcgta gttcgaggta          7931

aatttcgtaa aatacctgct gccacgatcc ctttttgtgg cttgattttg gaatttttga          7991

gatttgtttt cttagccatt tttggtccga tttcagtgat tcttgaggct atcttgagtg          8051

gtttttcgag gagagcatcg tggtgttgtc ggaatttact gtagaccacc catttttggt          8111

aaatatgctg aattaacttc tgtcccattt ctttagtttt tgagaaaaat ttgggttttg          8171

gttgcatgtt ggttatgtgt tgtttttgat ccccgaatgg tgtcccatca tggaacacaa          8231

tttggggagc tgttaagaac ctatttttgg ggttaattcc ggagtttcca gcgcgggtcc          8291

cacttctccc gttttgaccc cgaaattgat atgtctccgt ttcttgcgat tttagtgtct          8351

aaacgaccgt aataacattg tgactctatt tttgatagcg gggcagcgtt tcgaggccgt          8411

tcggaaaggg aaagctccgg agaagtgatt tttggagcgt gcgtgatctg cccacaagta          8471

gggtatggtt tccctctctt agattgagct tgagagtgtg aatgcatgtt gattagttgg          8531

gatttgggtt ggtagttatt gaatcatgca taggtgttta gaaatcatgt tttggccttt          8591

tcgggaatta tcgggtaact gtgagcatgc tatgtgttac taattgaccc tccttgctat          8651

gtggagtgct tgaatgcttg attactattt atctgaagca tgttgggcct tagtttaggt          8711

ttgactaggg cttgccttag agatgcatga ttcggatttg ataggcctta gtttttgccc          8771

cgacgtcgct cggtcgactt agatccatgt agactggtgt agcaacttga gtctgatagt          8831

ttgggcctta gctaggcgat acgcttgctc cgatgataat tatcttcttc ttcttttttt          8891

cgttgttacg gcttcacgag ttacgttggc gacattgatt ctgcttcgcg atttgaagtt          8951

gattttttat tcggttccaa ggacttacat tgattggcta agtgtggacg gcgttccacg          9011

gaaatttata agcatggatc gattgagacc ctttcagcag ctacattggc acttatatag          9071

agcatccgat ttaaggtccg gcctctatcg cccaaatact tatatagagc aaccggttta          9131

aggtccggcc tctatcgccc agatacttgt atagagcatc cggttagagg tctggcctca          9191

gttacttgat acttgtgatt ggttacttgg gtacttttgg tgagcatccg gttcgaggtc          9251

cggcctccgt actgtcagat tctactaatt ggggttgaga ttctggttcg atgttttccg          9311

ttcttgggtt cttatatgca attttcttta gttatagtta ttttgtgtac tcatcgggct          9371

tatggggatc cgtttaggtt tttatttaac ttgcgcacga gtgtaccttc tgggcttatg          9431

ggggcccagt taggtgtagt tagcttatag attactttag ttagttcttt ttacacttgt          9491

gtgctttcca tggtttactt agattgtcat tcttgacctc tgtttgtgtt attccttctt          9551

ttcatattgc ctttactttt caagttcagt cggcctataa tgcatactgg gtacctgttg          9611

ttttggtact catgctacgc tctgcatctg tttcgtgatg caggtctgag caccagtggc          9671

cagcgttgat ccagtttgga gtagtctgat ccggagacgg gggtgagcac atggcgtttt          9731

gtactatttc agtctccatc tgtgtatata gacttgtctt ttacctttcg agacagtcca          9791

atctctgtgg tccacttttg ggacttgtac tcgttttgtt agtagctctg tactggtgac          9851

ttcctggttc taggagggat ctttatttgt atatatgttt tggttcgctt ccgcctgttt          9911

atattgttat cataaaattt tgcctactct tgttagtttc taccctcaga cccattactt          9971

gttattccgg gttacgggtt ggcttaccta ctggtgggtt atagtatgtg ccaccatgac          10031

tcgagaaatc gggtcgtgac agatacatga tgcctctttg gttggaagaa gcgggtactc          10091

agtcaaatgg tcgaggtgag ctcgacacca tcaataacat cccaaaaaag gaacaatgag          10151

aaagttacaa atcacaatac atgtccatat gctttggaac taaagaattc aaagcacaca          10211

atgtatttca ataatctttt atctctgcct gcagttgaat ataccagata tcagatctga          10271

gacgatgttt aaaaaggaaa ctattattcg accctattcc tttctcaaac ctcgaaacca          10331

acaccagtta tacaacaata tatgcagaac cctttaacta tatactatat acaaatt             10388

<210>2

<211>1293

<212>PRT

<213>马铃薯

<400>2

Met Asn Phe Asn Asn Glu Leu Ser Asp Leu Lys Asn Arg Phe Leu Phe

1               5                   10                  15

Arg Thr Leu Arg Ala Gln Lys Cys Ser Asp Val Ala Arg Asp Arg Ile

            20                  25                  30

Asp Phe Phe Ile Trp Glu Leu Lys Phe Leu Asn Cys Phe Leu His Leu

        35                  40                  45

Gln Ser Phe Ala Phe Ala Ser Glu Cys Gly Met Leu Asp Ile Ser Gln

    50                  55                  60

Lys Met Ile Glu Ile Cys Lys Arg Phe Asn Thr Pro Pro Pro His Asn

65                  70                  75                  80

Ser Phe Ala Tyr Trp Lys Glu Val Ile Cys Lys Arg Leu Cys Ala Ile

                85                  90                  95

Ser Ile Gln Pro Asp Ala Ser Ser Asp Asp Gly Phe Ala Cys Trp Lys

            100                 105                 110

Lys Val Ile Trp Lys Thr Lys Gln Glu Phe Arg Ala Lys Tyr Ser Phe

        115                 120                 125

Pro Lys Thr Leu Leu Ala Asp Asn Lys Val Tyr Asp Asp Asp Asp Thr

    130                 135                     140

Asn Pro Lys Phe Val Met Glu Phe Ile Asp Ala Val Val Gly Asn Leu

145                 150                 155                 160

Asn Val Leu Val Lys Ile Asn Asp Pro Ser Ser Leu Leu Phe Val Pro

                165                 170                 175

Gly Pro Lys Glu Gln Ile Glu Gln Val Leu Lys Glu Leu Lys Leu Leu

            180                 185                 190

Arg Phe Phe Val Cys Phe Val Ser Asn Lys Cys Ile Glu Pro Gln Tyr

        195                 200                 205

Gln His Thr Thr Phe Tyr Thr His Ala Leu Ile Glu Ala Ser His Ile

    210                 215                 220

Ala Met Val Val Trp Leu Asn Leu Pro Ile Tyr Gly Asn Arg Asn Gln

225                 230                 235                 240

Asp Leu Ala Ser Ser Glu Val Ser Cys Leu Leu Ser Asp Phe Met Glu

                245                 250                 255

Met Lys Ile Lys Ser Ile Gln Pro Asp Ile Ser Arg Asn Asn Ile Tyr

            260                 265                 270

Ile Asp Val Leu Arg Ala Leu Lys Ser Thr Ile Pro Gln Ala Gln Asp

        275                 280                 285

Lys His Ala Ala Glu Ser Gly Ile Val Glu Thr Pro Thr His Asn Leu

    290                 295                 300

Met Val Gly Leu Ser Asp Gln Met Ala Asn Leu Gln Glu Met Leu Cys

305                 310                 315                 320

Leu Leu Arg Asp Asn Leu Ile His Leu Pro Ile Leu Asp Leu Glu Phe

                325                 330                 335

His Leu Gln Asp Met Asp Ser Val Ile Val Asp Ala Gly Leu Leu Ile

            340                 345                 350

Tyr Ser Leu Tyr Asp Ile Lys Gly Gln Lys Glu Asp Thr Thr Leu Glu

        355                 360                 365

Asp Ile Asn Gln Ala Leu Gly Phe Asp Leu Pro Arg Asn Ile Glu Pro

    370                 375                 380

Ile Lys Ala Met Ile Asn Leu Val Met Gln Lys Ala Phe Gln Cys Asn

385                 390                 395                 400

Leu Pro Arg Ile His Gly Leu Gly Tyr Val Asp Phe Leu Leu Lys Asn

                405                 410                 415

Leu Lys Asp Phe Gln Gly Arg Tyr Ser Asp Ser Leu Asp Phe Leu Lys

            420                 425                 430

Asn Gln Leu Gln Val Ile Gln Thr Glu Phe Glu Ser Leu Gln Pro Phe

        435                 440                 445

Leu Lys Val Val Val Glu Glu Pro His Asn Lys Leu Lys Thr Leu Asn

    450                 455                 460

Glu Asp Cys Ala Thr Gln Ile Ile Arg Lys Ala Tyr Glu Val Glu Tyr

465                 470                 475                 480

Val Val Asp Ala Cys Ile Asn Lys Glu Val Pro Gln Trp Cys Ile Glu

                485                 490                 495

Arg Trp Leu Leu Asp Ile Ile Glu Glu Ile Thr Cys Ile Lys Ala Lys

            500                 505                 510

Ile Gln Glu Lys Asn Thr Val Glu Asp Thr Met Lys Thr Val Ile Ala

        515                 520                 525

Arg Thr Ser Ser Lys Leu Ala Arg Thr Pro Arg Met Asn Glu Glu Ile

    530                 535                 540

Val Gly Phe Glu Asp Val Ile Glu Asn Leu Arg Lys Lys Leu Leu Asn

545                 550                 555                 560

Gly Thr Lys Gly Gln Asp Val Ile Ser Ile His Gly Met Pro Gly Leu

                565                 570                 575

Gly Lys Thr Thr Leu Ala Asn Ser Leu Tyr Ser Asp Arg Ser Val Phe

            580                 585                 590

Ser Gln Phe Asp Ile Cys Ala Gln Cys Cys Val Ser Gln Val Tyr Ser

        595                 600                 605

Tyr Lys Asp Leu Ile Leu Ala Leu Leu Arg Asp Ala Ile Gly Glu Gly

    610                 615                 620

Ser Val Arg Arg Glu Leu His Ala Asn Glu Leu Ala Asp Met Leu Arg

625                 630                 635                 640

Lys Thr Leu Leu Pro Arg Arg Tyr Leu Ile Leu Val Asp Asp Val Trp

                645                 650                  655

Glu Asn Ser Val Trp Asp Asp Leu Arg Gly Cys Phe Pro Asp Val Asn

            660                 665                 670

Asn Arg Ser Arg Ile Ile Leu Thr Thr Arg His His Glu Val Ala Lys

        675                 680                 685

Tyr Ala Ser Val His Ser Asp Pro Leu His Leu Arg Met Phe Asp Glu

    690                 695                 700

Val Glu Ser Trp Lys Leu Leu Glu Lys Lys Val Phe Gly Glu Glu Ser

705                 710                 715                 720

Cys Ser Pro Leu Leu Lys Asn Val Gly Leu Arg Ile Ala Lys Met Cys

                725                 730                 735

Gly Gln Leu Pro Leu Ser Ile Val Leu Val Ala Gly Ile Leu Ser Glu

            740                 745                 750

Met Glu Lys Glu Val Glu Cys Trp Glu Gln Val Ala Asn Asn Leu Gly

        755                 760                 765

Ser Tyr Ile His Asn Asp Ser Arg Ala Ile Val Asp Lys Ser Tyr His

     770                775                 780

Val Leu Pro Cys His Leu Lys Ser Cys Phe Leu Tyr Phe Gly Ala Phe

785                 790                 795                 800

Leu Glu Asp Arg Val Ile Asp Ile Ser Arg Leu Ile Arg Leu Trp Ile

                805                 810                 815

Ser Glu Ala Phe Ile Lys Ser Ser Glu Gly Arg Arg Leu Glu Asp Ile

            820                 825                 830

Ala Glu Gly Tyr Leu Glu Asn Leu Ile Gly Arg Asn Leu Val Met Val

        835                 840                 845

Thr Gln Arg Ser Ile Ser Asp Gly Lys Ala Lys Glu Cys Arg Leu His

    850                 855                 860

Asp Val Leu Leu Asp Phe Cys Lys Glu Arg Ala Ala Glu Glu Asn Phe

865                 870                 875                 880

Leu Leu Trp Ile Asn Arg Asp Gln Ile Thr Lys Pro Ser Ser Cys Val

                885                 890                 895

Tyr Ser His Lys Gln His Ala His Leu Ala Phe Thr Glu Met His Asn

            900                 905                 910

Leu Val Glu Trp Ser Ala Ser Cys Ser Phe Val Gly Ser Val Val Leu

        915                 920                 925

Ser Asn Lys Tyr Asp Ser Tyr Phe Ser Thr Arg Asp Ile Ser Ser Leu

    930                 935                 940

His Asp Phe Ser Ile Ser Arg Ile Leu Pro Asn Phe Lys Phe Leu Lys

945                 950                 955                 960

Val Leu Asp Leu Glu His Arg Val Phe Ile Asp Phe Ile Pro Thr Glu

                965                 970                 975

Leu Val Tyr Leu Lys Tyr Phe Ser Ala His Ile Glu Gln Asn Ser Ile

            980                 985                 990

Pro Ser Ser Ile Ser Asn Leu Trp  Asn Leu Glu Thr Leu  Ile Leu Lys

        995                 1000                 1005

Ser Pro  Ile Tyr Ala Leu Arg  Cys Thr Leu Leu Leu  Pro Ser Thr

    1010                 1015                 1020

Val Trp  Asp Met Val Lys Leu  Arg His Leu Tyr Ile  Pro Asp Phe

    1025                 1030                 1035

Ser Thr  Arg Ile Glu Ala Ala  Leu Leu Glu Asn Ser  Ala Lys Leu

    1040                 1045                 1050

Tyr Asn  Leu Glu Thr Leu Ser  Thr Leu Tyr Phe Ser  Arg Val Glu

    1055                 1060                 1065

Asp Ala  Glu Leu Met Leu Arg  Lys Thr Pro Asn Leu  Arg Lys Leu

    1070                 1075                 1080

Ile Cys  Glu Val Glu Cys Leu  Glu Tyr Pro Pro Gln  Tyr His Val

    1085                 1090                 1095

Leu Asn  Phe Pro Ile Arg Leu  Glu Ile Leu Lys Leu  Tyr Arg Ser

    1100                 1105                 1110

Lys Phe  Lys Thr Ile Pro Phe  Cys Ile Ser Ala Pro  Asn Leu Lys

    1115                 1120                 1125

Tyr Leu  Lys Leu Cys Gly Phe  Ser Leu Asp Ser Gln  Tyr Leu Ser

    1130                 1135                 1140

Glu Thr  Ala Asp His Leu Lys  His Leu Glu Val Leu  Ile Leu Tyr

    1145                 1150                 1155

Lys Val  Glu Phe Gly Asp His  Arg Glu Trp Lys Val  Ser Asn Gly

    1160                 1165                 1170

Lys Phe  Pro Gln Leu Lys Ile  Leu Lys Leu Glu Tyr  Leu Ser Leu

    1175                 1180                 1185

Val Lys  Trp Ile Val Ala Asp  Asp Ala Phe Pro Asn  Leu Glu Gln

    1190                 1195                 1200

Leu Val  Leu Arg Gly Cys Gln  Asp Leu Met Glu Ile  Pro Ser Cys

    1205                 1210                 1215

Phe Met  Asp Ile Leu Ser Leu  Lys Tyr Ile Gly Val  Glu Tyr Cys

    1220                 1225                 1230

Asn Glu  Ser Val Val Lys Ser  Ala Leu Asn Ile Gln  Glu Thr Gln

    1235                 1240                 1245

Val Glu  Asp Tyr Gln Asn Thr  Asn Phe Lys Leu Val  Leu Ile Glu

    1250                 1255                 1260

Phe Ser  Leu Gln Lys Lys Ala  Trp Lys Leu Asn Leu  Thr Asp Ala

    1265                 1270                 1275

Glu Asp  Met His Asn Ala Val  Lys Asn Ile Leu Ala  Glu Ile Arg

    1280                 1285                 1290

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>3

aaacccggtg ttccaaatct aacact                                               26

<210>4

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>4

catgtagtga ggatatgtca cgagtg                                               26

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>5

attacaatgg gttgaactca g                                                    21

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>6

acctctttca attgttctgg tg                                                   22

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>7

cactcgtgac atatcctcac ta                                                   22

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>8

caaccctggc atgccacg                                                        18

<210>9

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>保守结构域

<400>9

Gly Leu Pro Leu

1

<210>10

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>保守结构域

<400>10

Gln Leu Pro Leu

1

<210>11

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>保守结构域

<400>11

Cys Lys Leu Tyr

1

<210>12

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>保守结构域

<400>12

Cys Phe Leu Tyr

1

Claims (20)

1.一种核酸分子，其编码在植物中表达并能赋予所述植物抵抗病原体抗性的多肽，该核酸分子包含或由选自以下组的核苷酸序列组成：

(a)至少编码含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白(R1)的成熟形式的核苷酸序列；

(b)至少含有SEQ ID NO：1所示DNA序列的一个或一个以上编码区域的核苷酸序列；

(c)在严格杂交条件下与(a)或(b)中定义的核苷酸序列的互补链杂交的核苷酸序列；

(d)编码一种蛋白的核苷酸序列，所述蛋白通过在(a)或(b)的核苷酸序列编码的氨基酸序列中替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸，而由(a)或(b)的核苷酸序列编码的蛋白衍生获得；

(e)编码一种蛋白的核苷酸序列，所述蛋白具有与由(a)或(b)的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少60％一致性的氨基酸序列；

(f)一种核苷酸序列，该核苷酸序列至少编码相当于SEQ ID NO：2中氨基酸308-329位置的亮氨酸拉链(LZ)结构域，相当于SEQ ID NO：2中氨基酸572-682位置的核酸结合位点(NBS)结构域，和/或相当于SEQ ID NO：2中氨基酸780-1280位置的富含亮氨酸重复序列(LRR)结构域；

(g)编码由(a)或(b)的核苷酸序列编码的R1蛋白的携带抗原决定簇部分的核苷酸序列；

(h)包含(a)到(g)的任一核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列；

(i)编码包含SEQ ID NOs：10和12中所示一个或一个以上基序或氨基酸序列LHD的多肽的核苷酸序列；

(j)在严格条件下用探针筛选合适的文库而获得的DNA序列，所述探针具有SEQ ID NOs：1或5到8的任一核苷酸序列的至少17个连续核苷酸；

(k)编码由(a)或(b)的核苷酸序列编码的蛋白的至少6个连续氨基酸的片段的核苷酸序列；

(l)由于对(a)到(i)任一核苷酸序列的遗传密码的简并，而产生的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的核酸分子，其中所述的病原体是致病疫霉菌。

3.一种至少15个核苷酸长的核酸分子，该核酸分子与权利要求1或2所述的核酸分子或其互补链特异性地杂交。

4.一种载体，该载体包含权利要求1到3任一项所述的核酸分子。

5.如权利要求4所述的载体，该载体为一种表达载体，其中所述的核酸分子可操作地与一个或一个以上的控制序列连接，该控制序列允许在原核和/或真核宿主细胞中转录和选择地表达。

6.一种宿主细胞，该宿主细胞包含权利要求4或5所述的载体或权利要求1到3任一项所述的核酸分子。

7.由权利要求1或2所述的核酸分子编码的R1蛋白或其具有免疫学活性或功能的片段。

8.一种抗体或适体，该抗体或适体特异性地识别权利要求7所述的蛋白或其片段或抗原决定簇。

9.一种转基因植物细胞，该转基因植物细胞包含权利要求1到3任一项所述的核酸分子，该核酸分子可操作地与使DNA序列在植物细胞中转录和/或表达的调控元件连接。

10.一种转基因植物或植物组织，该转基因植物或植物组织包含权利要求9所述的植物细胞。

11.一种启动子的调控序列，其调控包含权利要求1或2所述的核酸分子的基因的表达，该调控序列能在病原体侵染时赋予或调节异源DNA序列的表达。

12.如权利要求11所述的调控序列，该调控序列包含选自下列组的DNA序列：

(a)包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸1到2222的核苷酸序列或其部分的DNA序列；

(b)包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸1到2222的核苷酸序列的至少14个连续核苷酸的DNA序列；

(c)在严格条件下与(a)或(b)中所定义的核苷酸序列杂交的DNA序列；

(d)用具有权利要求1中所述核苷酸序列的探针筛选合适的基因组DNA文库而获得的片段的基因的DNA序列；

(e)包含(a)、(b)和(c)中保守的核苷酸序列的DNA序列。

13.一种重组DNA分子，该重组DNA分子包含权利要求11或12所述的调控序列。

14.如权利要求13所述的重组DNA分子，其中所述的调控序列可操作地与异源DNA序列连接。

15.一种用权利要求11或12所述的调控序列或用权利要求13或14所述的重组DNA分子转化的宿主细胞。

16.一种转基因植物、植物组织或植物细胞，该转基因植物、植物组织或植物细胞包含权利要求11或12所述的调控序列或权利要求13或14所述的重组DNA分子。

17.一种鉴定植物保护剂的方法，该方法包括下列步骤：

(a)在化合物或含有多种化合物的样品存在下，培养含有重组DNA分子的植物细胞或组织或维护含有重组DNA分子的植物，所述重组DNA分子包含与权利要求11或12所述的调控序列可操作地连接的读出系统，所述培养或维护是在允许所述读出系统表达的条件下进行的；

(b)分别鉴定或证实样品和化合物，该样品和化合物导致在所述植物、植物细胞或植物组织中，所述读出系统的表达被抑制或激活和/或增强。

18.一种鉴定和获得病原体的无毒或毒性因子的方法，该方法包括下列步骤：

(a)在一个读出系统中以来源于病原体的肽或蛋白表达文库为背景筛选权利要求7所述的R1蛋白或其片段，所述筛选是在允许所述读出系统中蛋白和肽相互作用的合适的条件下进行的；

(b)鉴定或证实导致所述读出系统被抑制或激活的cDNA。

19.由权利要求17或18所述的方法获得或鉴定的cDNA或其编码的产物。

20.一种组合物，该组合物包含权利要求1到3任一项所述的核酸分子、权利要求4或5所述的载体、权利要求7所述的蛋白、权利要求8所述的抗体或适体、权利要求11或12所述的调控序列或权利要求13或14任一项所述的重组DNA分子以及选择性地用于检测的适合方法或用于植物细胞和组织培养的适合方法。

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