EA008599B1 - Полипептид r1, обеспечивающий устойчивость растений к патогенам, кодирующая его нуклеотидная последовательность и способы их применения - Google Patents

Abstract

Описаны молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептиды, которые способны придавать устойчивость к растительным патогенам, таким как грибы (например, Phytophthora infestans и родственные изоляты), и которые инициируются этими же патогенами. Предпочтительные молекулы нуклеиновой кислоты кодируют R1 из Solanum tuberosum или множество его гомологов, природных или производных. Описаны предпочтительные способы активации устойчивости с использованием гена устойчивости R1, которые в определенных случаях вызывают гиперчувствительную реакцию. Другие аспекты изобретения включают специфические праймеры, векторы, клетки-хозяева, полипептиды, антитела, аптамеры, трансгенные растения, способы их получения и использования, а также способы воздействия на признак устойчивости в растениях. Кроме того, предложены методики скрининга для идентификации и получения соединений для защиты растений.

Description

Данное изобретение относится к гену устойчивости К1 из картофеля. Оно также относится к способам и материалам, использующим этот ген, и способам идентификации или выработки других родственных генов. Оно также относится, в целом, к способам идентификации соединений для защиты растений, способных индуцировать ген К.1 или активность кодируемого им протеина. Кроме того, данное изобретение относится к трансгенным растениям, которые становятся устойчивыми к фитофторозу картофеля в результате экспрессии трансгена К1.

Некоторые документы упомянуты в тексте данного описания в виде названий. Полные библиографические ссылки можно найти в конце описания перед формулой изобретения. Каждый из документов, упоминаемых здесь (включая описания производителей, инструкции и т.д.), включен в данную заявку в виде ссылки; однако, это не является признанием того, что какой-либо из упомянутых документов является прототипом данного изобретения.

Фитофтороз картофеля представляет собой наиболее опасное заболевание выращиваемого картофеля во всем мире, приносящим миллиардные убытки каждый год (Катоип е! а1. 1999). Патогеном, вызывающим это заболевание, является Рйу!орйШота шГезИпз, оомицетный гриб, поражающий также томаты (Л1бе1зоп 1997). Полное уничтожение урожая картофеля фитофторозом вызвало ирландский картофельный голод в середине XIX века (8а1атап 1985) и активизировало поиск устойчивых растений. Одиночные гены устойчивости к фитофторозу (К-гены) были открыты почти 100 лет назад в 8. бегтззит, диком сорте картофеля, произрастающем в Мексике. Интрогрессия К-генов в культурные сорта картофеля принесла расоспецифическую устойчивость, однако, лишь временную устойчивость к фитофторозу, поскольку новые расы быстро преодолевали устойчивость, опосредованную К-геном (ХУазйе 1991, Егу апб Оообтеш 1997). Количественная или полевая устойчивость к фитофторозу также была идентифицирована в диких сортах картофеля (Козз 1986). Эта устойчивость более длительная, чем опосредованная Кгенами, но трудно переносится в культурные сорта путем скрещивания и фенотипической селекции. Борьба с фитофторозом все еще осуществляется, главным образом, путем частого нанесения фунгицидов, которые теряют эффективность в результате выведения фунгицид-устойчивых изолятов. Некоторые К-гены были картированы в хромосомы картофеля с использованием ДНК-маркеров (Ьеопатбз-8сЫрретз е! а1. 1992, Е1-КйатЬоЙу е! а1. 1994, 1996, Ь1 е! а1. 1998, Етешд е! а1. 2000, Иаезз е! а1. 2000). К1 расположен в хромосоме V (Ьеопатбз-8сЫрретз е!. а1. 1992) в области, где также были картированы гены устойчивости к Ро!а!о У1тиз X (картофельному вирусу X) (Кй!ет е! а1. 1991, Эе 1опд 1997). Одна и та же область содержит основные локусы количественных признаков (ОТБ) устойчивости к паразитической корневой нематоде 01оЬобета раШба (Кге1ке е! а1. 1994, Коирре уап бег Vоо^ι е! а1. 1997, 2000) и фитофторозу (Ьеопатбз-8сЫррегз е! а1. 1994, ОЬегНадетапп е! а1. 1999, СоШпз 1999). Присутствие горячей точки генов устойчивости предполагает их эволюцию из общего предшественника путем локальной генной дупликации с последующей функциональной диверсификацией (Беопагбз-8с1иррегз е! а1. 1994, Ье1з!ет е! а1. 1996, ОЬегНадетапН е! а1. 1999, СеЬйатб! апб Vа1копеп 2001). Если это так, молекулярное клонирование гена К1 должно открыть возможности изучения на молекулярном уровне нескольких факторов картирования этой области и регулирования качественной и количественной устойчивости к различным патогенам.

Таким образом, техническая задача данного изобретения состояла в удовлетворении потребности в растительных генах устойчивости к патогенам и их регуляторных последовательностях. Решение этой технической задачи достигается путем создания вариантов осуществления, определенных в формуле изобретения и подробно описанных ниже.

По данному изобретению был клонирован и описан на молекулярном уровне К1, первый ген устойчивости к фитофторозу. Этот ген был идентифицирован путем специального комбинированного позиционного клонирования и с использованием подхода на основе генов-кандидатов. Молекулярная структура гена позволяет отнести К1 к растительным генам устойчивости, содержащим законсервированный ΝΒ8ЬКК. и лейцин-зипперный мотивы (ЕШз е! а1. 2000, Эаид1 апб 1опез 2001).

К1 был клонирован с использованием стратегии позиционного клонирования в сочетании с поиском генов-кандидатов, имеющих сходство ДНК-последовательности с известными растительными генами устойчивости (Наттопб-Козаск апб 1опез 1997, ЕШз е! а1. 2000). Подобный подход оказался успешным для клонирования картофельных генов устойчивости к Ро!а!о νίπ.^ X (Кх1, Вепбайтапе е! а1. 1999) и корневой нематоде 01оЬобета раШба (Ора2, Vап бег ^ззеп е! а1. 2000). Прогулка по хромосоме к К1 была инициирована от двух маркерных локусов 8ΡϋΌ237 и ЛБЕР1, фланкирующих К1 на коротких генетических расстояниях 0,1 сМ. Однако прогулка от маркера ЛБЬР1 оказалась непродуктивной из-за дефицита клонов ВАС и УАС (Ье1з!ег е! а1. 1997), содержащих маркер АБЕРЕ Идентификацию картофельных геномных клонов с перекрывающимися инсерциями облегчили при помощи ВАС-технологии в сочетании с использованием макромассивов клонов ВАС. Применение этого подхода было успешным для риса ^акашига е! а1. 1997, Уапд е! а1. 1997, Уапд е! а1. 1998) и томатов (Ео1кейзта е! а1. 1998). Физическая карта (фиг. 1) охватывает по меньшей мере 250 кЬ генома картофеля. Около 200 кЬ представляли собой кандидатную область на содержание гена К1, исходя из связи без рекомбинации с концевыми маркерами ВАС. Эта кандидатная область была открытой на концах по отношению к локусу АЕЬР1, поскольку единственное рекомбинационное событие, отделяющее К1 и АЕЬР1, не было включено в физическую карту. Частичная информация последовательности из кандидатной области идентифицировала

- 1 008599

ЯСЬ-фрагмент гена, подобный гену устойчивости, что позволило выявить семейство генов, члены которого присутствуют в обеих хромосомах, несущих аллель восприимчивости г1 или аллель устойчивости Я1. Фактически, ЯОЬ-зонд, используемый для идентификации кДНК и ВАС-клонов Я1, был частью аллели восприимчивости г1. Анализом на основе аллельспецифической ПЦР выведенной из кДНК-клона кодирующей части Я1 было выявлено, что функциональный член семейства генов-кандидатов присутствует в растениях, содержащих аллель устойчивости Я1, и отсутствует в восприимчивых растениях. Этот ген-кандидат субклонировали из ВАС ВА87617 и стабильно трансформировали в восприимчивый культурный сорт Эс51гсс. Комплементация фенотипа Я1 в нескольких трансгенных растениях показала, что ген-кандидат, в самом деле, представлял собой ген Я1.

Таким образом, данное изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, который способен придавать устойчивость к патогену растению, в котором упомянутый полипептид экспрессируется, при этом указанная нуклеиновая кислота содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, включающей:

(a) нуклеотидную последовательность, кодирующую, по меньшей мере, зрелую форму полипептида (Я1), который содержит аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ N0: 2;

(b) нуклеотидную последовательность, включающую по меньшей мере одну или более кодирующих областей последовательности ДНК 8Е0 ΙΌ N0: 1;

(c) нуклеотидную последовательность, гибридизующуюся с комплементарной цепью нуклеотидной последовательности, определенной в (а) или (Ь) в жестких условиях гибридизации;

(ά) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, полученный из полипептида, кодируемого нуклеотидной последовательностью (а) или (Ь), путем замещения, делеции и/или присоединения одной или нескольких аминокислот;

(е) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 60% идентичную аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеотидными последовательностями (а) или (Ь);

(Г) нуклеотидную последовательность, кодирующую один, или любые два, или три домена, выбранных из домена лейциновой молнии (ΤΖ), соответствующего аминокислотным положениям 308-329 8Е0 ΙΌ N0: 2, домена сайта нуклеинового связывания (ΝΒ8), соответствующего аминокислотным положениям 572-682 8Е0 ΙΌ N0: 2, и домена, богатого лейциновыми повторами (ЬЯЯ), соответствующего аминокислотным положениям 780-1280 8Е0 ΙΌ N0: 2;

(д) нуклеотидную последовательность, кодирующую эпитопнесущую часть полипептида Я1, кодируемого нуклеотидной последовательностью (а) или (Ь);

(11) нуклеотидную последовательность, включающую по меньшей мере 15 последовательных нуклеотидов нуклеотидной последовательности любого из пп.(а)-(д);

(ί) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, включающий один или более мотивов, приведенных в 8Е0 ΙΌ N0: 10 и 12, приведенных на фиг. 4, или аминокислотную последовательность ЯНЭ;

(ί) последовательность ДНК, полученную путем скрининга соответствующей библиотеки в жестких условиях при помощи зонда, включающего по меньшей мере 17 последовательно расположенных нуклеотидов любой нуклеотидной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 1 или 5-8;

(k) нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент по меньшей мере из 6 последовательных аминокислот протеина, кодируемого нуклеотидной последовательностью (а) или (Ь); и (l) нуклеотидную последовательность, полученную из любой нуклеотидной последовательности (а)-(1), на основе принципа вырожденности генетического кода.

В первом аспекте данное изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, способный придавать устойчивость к патогену, например к грибкам в растении, в котором упомянутый полипептид экспрессируется.

Молекулы нуклеиновой кислоты по данному изобретению могут иметь рекомбинантную форму или форму, свободную или, в основном, свободную от нуклеиновых кислот или генов представляющего интерес вида или источника, отличающихся от последовательности, кодирующей полипептид с требуемой функцией. Молекулы нуклеиновой кислоты и кодируемые ими полипептидные продукты также могут быть (ί) изолированы и/или очищены из их природной среды (не обязательно в чистой форме), или (ίί) в чистой (в основном) форме или гомогенной форме.

Нуклеиновая кислота по изобретению может включать кДНК, РНК, геномную ДНК, предпочтительно целый ген, и может быть полностью или частично синтетической (конструктов). Если последовательность ДНК определена, например имеет ссылку на некоторую аигуру или последовательность (8Е0 ΙΌ N0), то, если контекст не требует иного, она включает РНК-эквивалент с замещениями и на Т там, где они есть. Также включается комплемент различных описанных последовательностей, который может быть использован в опытах с зондированием или в даунрегуляции последовательности.

Отдельным аспектом данного изобретения является молекула нуклеиновой кислоты, имеющая последовательность, которая является полностью или частично последовательностью, показанной в 8Е0 ΙΌ N0: 1, включая (где это возможно) кодирующую и/или некодирующую области. Внутри 8Е0 ΙΌ N0: 1

- 2 008599 явно присутствует большая открытая рамка считывания (ОКБ). Дальнейшее сравнение последовательности геномной ДНК с последовательностью кДНК показало, что ген содержит три экзона и три интрона; см. пример 5 и фиг. 4. Предполагаемая полипептидная последовательность К1 показана на фиг. 4 и обозначена 8ЕЦ ГО N0: 2. Предположительно, К1 содержит 1293 аминокислотных остатка и имеет молекулярную массу 149,4 кДа. Отдельные молекулы нуклеиновй кислоты по данному аспекту изобретения включают такие молекулы, которые кодируют протеиновый продукт К1 и кДНК, предположительно основания 2223-6321, исключая интроны, обозначенные, как показано на схеме (4878-4970 и 6130-6229 включительно). Неожиданно первичная структура К1 оказалась сходной со структурой К-протеинов класса Ь. Ζίρΐ ΝΒδ-ЬКК (Нашшопб-Козаск апб 1опс5 1997). Исходя из дедуцированной протеиновой последовательности, К1 принадлежит к классу Ε.Ζίρ/ΝΒδ/ΕΚΚ растительных генов устойчивости (Нашшопб-Козаск апб 1опс5 1997). Лейциновый зипперный мотив (Ε.Ζίρ) в аминоконцевой области предположительно является признаком димеризации или взаимодействия с другими протеинами. Находящийся ниже предполагаемый домен сайта нуклеотидного связывания (ΝΒ8) может быть задействован в пути трансдукции сигнала, что приводит к выработке реакции устойчивости. С-концевой повторяющийся домен, богатый лейцином (ЬКК), совпадает с консенсусной последовательностью цитоплазматического домена ЬКК, описанного 1опез апб 1опс5 (1997), и может функционировать в протеин-протеиновых взаимодействиях и связывании лигандов. Доказано, что домены ЬКК аллелей гена устойчивости Ь к ржавчине льна определяют узнавание специфических рас патогена (ЕШз е! а1. 1999). Предсказание ш 8Й1со четырех сайтов миристилирования и 43 сайтов фосфорилирования в последовательности К1 предполагает возможное прикрепление протеина К1 к плазматической мембране и участие этапов фосфорилирования/дефосфорилирования, соответственно, в трансдукции сигнала (Эапщ апб 1опс8 2001).

К1 расположен на короткой ветви хромосомы V (Ееопатбз-ЗсЫрретз е! а1. 1992, Эопд е! а1. 2000) и представляет собой последовательность, родственную гену устойчивости РгГ томата к Рзеибошопаз зуппдае, который расположен в хромосоме 5 томата внутри кластера генов устойчивости Р!о/Беп (8а1шетоп е! а1. 1996). Хромосомы 5 картофеля и томата являются колинеарными друг другу, за исключением парацентрической инверсии короткой ветви (Тапк81еу е! а1. 1992). Локус картофеля 8!Р!о, соответствующий картам Р!о/Беп, более чем на 10 сМ ближе к К1 (Ее18!ет е! а1. 1996), поэтому исключается возможность того, что К1 и РгГ расположены в колинеарной геномной области. Однако именно так обстоит дело при рассмотрении гена Вв4 томата, придающего устойчивость к бактериальному патогену ХапЮошопаз сашрезйтз. Предположение о местонахождении локуса катофеля, соответствующего Вв4, может быть сделано исходя из тесной связи (1 сМ) между Вв4 и маркером ТС432 (Ва11уога е! а1. 2001), который расположен на 3,8 сМ от СР21 в молекулярной карте томата (Тапкз1еу е! а1. 1992). Эта область хромосомы томата 5, которая расположена дальше от маркера СР21, должна быть колинеарна с интервалом картофеля СР21-СР179, включающим К1, с учетом парацентрической инверсии между этими двумя геномами.

Два гена устойчивости картофеля к Ро1а1о νίιυδ X, Кх2 и N6, также находятся в положениях, подобных К1 (К1йет е! а1. 1991, Ееопатбз-ЗсЫрретз е! а1. 1992, Эе 1опд е! а1. 1997). Ген Кх2 был клонирован и, как и К1, принадлежит к классу Ь^р/ЖЗ/ЬКК генов устойчивости (Вепбайтапе е! а1. 2000). Этих два гена устойчивости имеют лишь 32% идентичности последовательности и поэтому являются весьма различными членами одного суперсемейства генов. N6 расположен в интервале СР21-8РиЭ237 (Эе 1опд е! а1. 1997), не содержащем К1, и поэтому является генетически отделенным от К1.

В следующем аспекте изобретение относится к активным гомологичным вариантам последовательностей К1, которые могут быть, например, мутантами или другими производными или же природными гомологами К1, такими как аллельные варианты, паралоги (из того же вида, но на другом участке, например псевдоаллели в сцепленных локусах), или ортологи (родственные гены из разных видов). Их примеры приведены ниже. В каждом случае вариант кодирует продукт, гомологичный (подобный) К1, который может быть изолирован или выработан на основе этой последовательности и способен придавать устойчивость к одному или более патогенам.

Активность гена устойчивости может быть испытана обычными способами, известными в науке, в соответствии с природой исследуемой устойчивости. Примеры испытательных методик можно найти в следующих публикациях: бактериальная устойчивость (Сгап!, (1995) 8с1епсе 269, 843-846); устойчивость к грибам (О1хоп, (1996) Се11 84, 451-459; 1опе8, (1994) 8с1епсе 266, 789-793; Тйошаз, (1997) Тйе Р1ап! Се11 9, 2209-2224); к нематодам и вирусам (^йййаш, (1994) Се11 78, 1101-1115). Как правило, активность испытывают путем комплементации признака в растении; см. пример 4. Это можно осуществить путем использования изолированного гена или, например, путем сцепления предполагаемого активного варианта с промотором и терминатором для экспрессии в растениях и трансформации его в восприимчивое растение, не имеющее признака данной устойчивости. Затем активность варианта К1 подтверждают путем проверки соответствующим патогеном. В альтернативе, для испытания активности варианта К1 может быть использован анализ временной экспрессии, аналогичный анализу, используемому Мшбтшоз, (1994) Се11 78, 1089-1099. В кратком изложении, предполагаемый активный вариант К1 коэкспрессируют с плазмидой, содержащей патогенпроизводный ген, который является элиситором устойчивости, определяемой исследуемым гомологом К1, и ген-репортер (например, СИ8). Если при непрерывной экспрессии патогенпроизводного гена вариант К1 активируется, то произойдет НК (гомологичная рекомбинация), и

- 3 008599 активность гена-репортера будет уничтожена. Если активность не инициируется, то ген-репортер будет обнаружим.

Подобие или гомология между вариантом и В1 может быть определена по Л115сНи1. (1990) 1. Мо1. ΒίοΙ. 215, 403-10, при помощи программы ΤΒΕΆδΤΝ, которая в настоящее время широко используется в биотехнологии. или, и это может быть предпочтительнее, при помощи стандартной программы ВсйРй, являющейся частью ХУйсопмп Раскадс, Усгмоп 10, 1апиату 1999 (Сспсбсх Сошри1ег Сгоир, 575 8сюпсс Опус, МаШкои, ^щсощш, И8Л, ХУСсопмп 53711), которая использовалась для расчета гомологичности последовательностей в данной заявке. Также может быть использовано программное обеспечение ΌΝΆ8ΤΆΒ, использующее методику СЬи8ТАЕ с таблицей масс остатков РАМ250 (штраф за пропуск 10, длина пропуска 10). Гомология (или подобие, или идентичность) может быть на уровне нуклеотидной последовательности и/или на уровне экспрессируемой аминокислотной последовательности. Предпочтительно нуклеиновокислотная и/или аминокислотная последовательность имеет гомологию с кодирующей последовательностью или последовательностью, кодируемой нуклеотидной последовательностью 8Еф ΙΌ ΝΟ: 1 или другими последовательностями, описанными здесь, предпочтительно по меньшей мере на 50, или 60, или 70, или 80%, наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно на 90, 95, 96, 97, 98 или 99%. Гомология может быть по всей длине соответствующей последовательности, представленной здесь, или, более предпочтительно, может быть вдоль непрерывной последовательности, длиной, например, 20, 100, 200, 300, 500, 600 или более аминокислот или кодонов, в сравнении с соответствующей аминокислотной последовательностью или нуклеотидной последовательностью, в зависимости от обстоятельств.

Предположительно существует более двух гомологов В1 в геноме картофеля. Вполне вероятно, что один или более из этих гомологов являются В-генами против вирусов, грибов, бактерий или нематод.

Природные варианты В1 могут быть изолированы, в свете данного описания, без дополнительной нагрузки из любого подходящего растения. Природные варианты В1 могут быть изолированы, например, из геномной или кДНК. Предполагаемые гены устойчивости могут быть получены с использованием необходимых материалов (например, праймеров или зондов) на основе областей, специфических для В1, например, показанных на фиг. 4. Как описано в прилагаемых примерах, ген В1, идентифицированный по данному изобретению в картофеле, должен определить новый класс растительных генов устойчивости. Поэтому соответствующие гены, кодирующие протеины, которые доказывают подобные свойства, должны присутствовать также и в других растениях.

Молекулы нуклеиновй кислоты по изобретению могут быть получены, например, путем гибридизации вышеописанных нуклеиново-кислотных молекул с нуклеиново-кислотными молекулами (образцами) любого происхождения. Молекулы нуклеиновй кислоты, гибридизирующиеся с вышеописанными молекулами нуклеиновой кислоты, в целом, могут быть получены из любого растения, содержащего такие молекулы, предпочтительно из двудольных растений, в частности из любого растения, представляющего интерес в сельском хозяйстве, садоводстве или лесоводстве, например из посевных культур, в частности из семейства 8о1апассас, таких как картофель и томаты, но также и из таких растений, как маниока, бобовых растений, масличных растений, таких как масличный рапс, лен, и т.д., растений, накапливающих полипептиды, таких как соя, растений, накапливающих сахарозу, таких как сахарная свекла или сахарный тростник, деревьев, декоративных растений, а также растений, которые могут использоваться для производства биомассы, рекуперативной энергии или строительных материалов, например газонной травы и т. д.

Таким образом, в следующем аспекте данное изобретение относится к способу идентификации и/или клонирования гомологичных генов В1 из растения, при этом упомянутый способ включает все или часть нуклеотидных последовательностей, описанных выше. Так, в одном из вариантов осуществления информация о нуклеотидных последовательностях, предоставленная здесь, может быть использована в базе данных (например, Е8Т§, или 8Т8§, или информация о других геномных последовательностях) для поиска гомологичных последовательностей продукты экспрессии которых могут быть испытаны на активность устойчивости к патогену, например, с использованием методик на основе временной экспрессии по данному изобретению или обычных фенотипических анализов в трансгенных растениях.

В альтернативе, могут быть использованы зонды на основе последовательностей, например, в саузерн-блоте. В частности, ДНК может быть экстрагирована из клеток, взятых у растений, показывающих соответствующий признак устойчивости, и расщеплена различными рестрикционными ферментами. Рестрикционные фрагменты могут быть затем отделены (например, путем электрофореза на геле агарозы) перед денатурацией и перенесены на нитроцеллюлозный фильтр. На фильтре с фрагментами ДНК может быть гибридизирован меченый зонд, и затем может быть определено связывание.

Предварительные эксперименты могут выполняться путем гибридизации в нежестких условиях. Предпочтительными условиями для зондирования являются такие, которые будут достаточно жесткими для создания простого шаблона с малым числом гибридизаций, идентифицированных как положительные, которые могут быть подвергнуты дальнейшему исследованию. Например, гибридизации могут выполняться с использованием гибридизационного раствора, содержащего 5Х 88С (где 88С=0,15М хлорид натрия; 0,15М цитрат натрия; рН 7), 5Х реагента Денхардта, 0,5-1,0% 8Ό8, 100 мкг/мл денатурирован

- 4 008599 ной, фрагментированной ДНК спермы лосося, 0,05% пирофосфата натрия и до 50% формамида. Гибридизацию проводят при 37-42°С в течение, минимум, 6 ч. После гибридизации фильтры промывают следующим образом: (1) 5 мин при комнатной температуре в 2Х 88С и 1% 8Ό8; (2) 15 мин при комнатной температуре в 2Х 88С и 0,1% 8Ό8; (3) 30 мин-1 ч при 37°С в IX 88С и 1% 8Ό8; (4) 2 ч при 42-65°С в IX 88С и 1% 8Ό8, со сменой раствора каждые 30 мин.

Одна из общепринятых формул расчета жесткости условий, требуемых для обеспечения гибридизации между нуклеиново-кислотными молекулами с заданной гомологичностью последовательности такова (ЗатЬгоок е! а1. 1989): Тт=81,5°С+16,6Ьод |Να+|+0.41 (% О+С)-0,63 (% формамида)-600/#Ьр (число пар оснований) в дуплексе. Например, в соответствии с формулой при использовании |Να+|=|0,368| и 50% формамида, с содержанием ОС 42% и средним размером зонда 200 оснований, Тт составляет 57°С. Тт дуплексной ДНК снижается на 1-1,5°С с каждым 1% снижением гомологичности. Так, при использовании температуры гибридизации 42°С будут получены целевые последовательности с >75% идентичности. Такая последовательность будет рассматриваться как, по существу, гомологичная нуклеиново-кислотной последовательности по данному изобретению. В биотехнологии хорошо известно постепенное повышение жесткости гибридизации, пока не останется лишь несколько положительных клонов. Другие подходящие условия включают, например, для обнаружения последовательностей, идентичных примерно на 80-90%, гибридизацию в течение ночи при 42°С в 0,25М №₂ΗΡΟ₄, рН 7,2, 6,5% 8Ό8, 10% сульфата декстрана и конечную промывку при 55°С в 0,1Х 88С, 0,1% 8Ό8. Для обнаружения последовательностей, идентичных более чем на 90%, применимые условия включают гибридизацию в течение ночи при 65°С в 0,25М №₂ΗΡΟ₄, рН 7,2, 6,5% 8Ό8, 10% сульфата декстрана и конечную промывку при 60°С в 0,1Х 88С, 0,1% 8Ό8.

Связывание зонда с целевой нуклеиновой кислотой (например, ДНК) может быть измерено с использованием любой из множества существующих методик. Например, зонды могут быть меченными радиоактивными, флуоресцентными или ферментными метками. Другие методики, не использующие меток зондов, включают амплификацию с использованием ПЦР (в том числе там, где это возможно, ПЦР КАСЕ), РНазную защиту и аллельспецифическое олигонуклеотидное зондирование.

После идентификации успешной гибридизации проводят изолирование гибридизированной нуклеиновой кислоты, которое может включать один или более этапов ПЦР или амплификации путем клонирования в вектор, реплицирующийся в подходящем хозяине.

В случае необходимости, клоны (например, лямбда, космида, плазмида, ВАСк, ЫВАС8) или фрагменты, идентифицированные во время поиска, могут быть удлинены или дополнены. Например, если есть подозрение, что они неполные, можно вернуться к исходному источнику ДНК (например, библиотеке клонов, препарату мРНК и т.д.) для изолирования отсутствующих частей, например, с использованием последовательностей, зондов или праймеров на основе той части, которая уже была получена, для идентификации других клонов, содержащих перекрывающуюся последовательность (см., например, ΡπηοίρΙοκ о£ Оепоте Апа1укЦ Ьу З.В. Рптгокс (1995) РиЬ. В1аск\\с11 ЗОепсе Ь!б., Οχίοτά, ИК).

Молекулы нуклеиновй кислоты или соответствующие гены могут быть затем испытаны на функциональность, например, как описано в примерах. Одна из схем изолирования гомологов К1 включает следующие этапы:

I) получение популяции, в которой признак устойчивости является сегрегирующим;

II) ПЦР-амплификация ДНК из отдельных членов популяции с использованием праймеров на основе последовательности К1 (но не из законсервированных мотивов гена К);

III) испытание продуктов ПЦР (прямым анализом последовательности или рестрикционным ферментным расщеплением) на полиморфизм последовательности, который косегрегирует с признаком К. Идентификация соответствующей полиморфной маркерной последовательности;

IV) изолирование полной кодирующей последовательности полиморфного гена. Она может быть изолирована из соответствующей клонированной библиотеки или путем амплификации с использованием праймеров из 5'- и 3'-экстремумов К1. В каждом случае идентифицированный продукт ПЦР или информация о последовательности, предоставляемая им, используется для идентификации гена.

Кодирующая активность гена устойчивости может быть затем испытана, как описано выше или как описано в примерах.

Более специфический подход основан на понимании того, что гомологичные гены К1 могут быть сцеплены в кластеры. Существование кластеров К-генов в картофеле уже было описано (Ее1к!ет е! а1. 1996; Эе 1опд е! а1. 1997). Один из больших кластеров К-генов находится в короткой ветви хромосомы V картофеля.

Горячая точка устойчивости в хромосоме V картофеля, которая включает К1, также содержит основные ЦТ Б (количественные локусы признака) устойчивости к РйуйрЫйота ш£ек!апк (ЬеопагбкЗсЫрретк е! а1. 1994, ОЬетйадетапп е! а1. 1999, СоШпк е! а1. 1999) и корневой нематоде 01оЬобета раШба (Кге1ке е! а1. 1994, Коирре уап бег Vοο^ι е! а1. 1997, 2000). Картирование неравновесия сцеплений показало сильную связь между маркерами в 0,8 сМ интервале 8ΡυΌ237-ΟΡ179, содержащем К1, и устойчивостью листьев и клубней к фитофторозу, что подтверждает тесную связь между К1 и факторами, регулирующими количественную устойчивость к фитофторозу. На основе наблюдаемой генетической связи

- 5 008599 было сделано предположение, что К1 и факторы, регулирующие количественную устойчивость к фитофторозу, могут быть аллелями одного и того же гена или членами семейства кластеризованных генов (Ьеоиагб8-§сЫррег8 е! а1. 1994, ОЬегйадетапи е! а1. 1999). Первый молекулярный анализ локуса К1 показал, что последний вариант более предпочтителен, так как К1 является членом семейства генов и присутствует в виде дополнительной копии в ДНК-инсерции в хромосоме, несущей К1. Подобные сведения описаны для локуса Крт1 в ЛгаЫборщк (8!ай1 е! а1. 1999). Ген К1 нужно было интрогрессировать в геном

8. 1иЬего8ит из дикого вида 8. бетАит путем гетерогенетического хромосомного кроссинговера. В кроссах между дикими и культурными видами 8о1апит часто обнаруживается гетерогенетическое хромосомное спаривание (8шдй е! а1. 1989). Второй высокогомологичный член семейства генов К1, имеющий две аллели г1.1 и г1.2, расположен физически близко к К1. Необходимы дальнейшие исследования функциональности этого гена. При известной последовательности К1 теперь могут быть идентифицированы другие члены семейства К1, которые могут присутствовать в тех частях интервала СР21-СР179, которые еще не известны в физической карте, и/или в других частях генома картофеля. Могут быть изолированы аллельные варианты 8. ШЬегоыип и гомологи в других видах 8о1аиасеае, которые задействованы в количественной устойчивости к Р. шГеЧащ.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления данного изобретения упомянутый патоген, против которого является устойчивым растение, экспрессирующее молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению, представляет собой Рйу1йорй1йога шГейапк.

Взаимодействие между К1 и патогеном фитофтороза картофеля согласуется с концепцией ген за ген (Регаоп е! а1. 1962, Р1ог 1971). Перенос одного гена был достаточным для придания восприимчивому растению-хозяину гиперчувствительной реакции устойчивости к инфицированию расой Р. шГейапк, несущей ген авирулентности Луг1 (все расы, за исключением расы со специфичностью расы 1). Луг1 сергегируется как одиночный доминантный фактор в потомственных штаммах Р. 1иГе81ап8, гетерозиготных к Луг1, и был картирован в группу связей IV молекулярной карты Р. шГеЧащ (Уап бег Ьее е! а1. 2001). До сих пор ни один фактор авирулентности Р. шГеЧащ не был клонирован. Дальнейшее описание К1 на молекулярном уровне и клонирование гена Луг1 должно прояснить, как протеин устойчивости узнает эффекторную молекулу авирулентности. Клонирование генов устойчивости к фитофторозу, которые узнают факторы авирулентности, отличные от Луг1, должно облегчить идентификацию молекулярных мотивов, которые определяют специфичность узнавания эффектора и могут оказать помощь в конструировании К-протеинов с более широкой и более длительной устойчивостью к фитофторозу. Другие, сцепленные, варианты К1 (предоставляющие другие К-признаки) могут быть изолированы, в основном, так, как описано выше, но с использованием для этапа первоначальной амплификации ДНК, взятой из членов популяции, в которой требуемый признак К косегрегирует с самим К1 (или вариантом К1).

Авторами данного изобретения было сделано наблюдение, что последовательность К1 подобна последовательности неродственного гена РгГ, который придает устойчивость томатам к бактериальному патогену, т.е. Р. кугшдае (8а1тегоп е! а1. 1996). В свете этой информации, становится ясно, что последовательность К1 может быть модифицирована, например, путем сайт-направленной или случайной мутации, для получения мутантов К1 или других производных, которые могут придавать устойчивость к патогенам (т.е. инициируются ими), совершенно отличным от Р. шГейапк. Это может осуществляться, как описано ниже, с тестированием мутантов К1 при помощи методов анализа временной экспрессии, описанных выше.

Предпочтительно молекулу нуклеиновой кислоты, являющуюся мутантом или другим производным, получают прямым или косвенным путем (например, при помощи одного или нескольких этапов амплификации или репликации) из исходной нуклеиновой кислоты, соответствующей всей или части последовательности, показанной в 8ЕЦ ГО N0: 1 или других последовательностях, описанных здесь. Таким образом, следующим аспектом данного изобретения является способ получения нуклеиновой кислоты, кодирующей К1-производное, который включает этап модификации молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей К1. Производное может включать такие изменения в молекуле нуклеиновой кислоты, которые не оказывают влияния на кодируемую аминокислотную последовательность (т. е. дегенеративно эквивалентные). Изменения в последовательности для получения мутанта или производного могут быть реализованы путем одного или более присоединений, инсерций, делеций или замещений одного или более нуклеотидов в нуклеиновой кислоте, что приводит к присоединению, инсерции, делеции или замещению одной или более аминокислот в кодируемом полипептиде. В дополнение к одному или более изменениям внутри последовательности К1, вариантная нуклеиновая кислота может кодировать аминокислотную последовательность, включающую дополнительные аминокислотные последовательности у Сокончания и/или Ν-окончания.

Данное изобретение также относится к частям или фрагментам (синтезированным), которые соответствуют участкам описанных здесь последовательностей и кодируют полипептиды, обладающие биологической активностью, например устойчивостью к патогенам или способностью вырабатывать или связывать К1-связывающие антитела.

Вообще говоря, изменения могут быть желательны по ряду причин, включая введение или удаление следующих функций: последовательностей рестрикционной эндонуклеазы; использования кодонов; дру

- 6 008599 гих сайтов, необходимых для посттрансляционной модификации; сайтов расщепления в кодируемом пептиде; мотивов гликозилации, липоилации в кодируемом пептиде и т.д. К экспрессируемому протеину могут присоединяться лидерные или другие таргетинг-последовательности для определения его локализации после экспрессии. Все это может помочь в эффективном клонировании и экспрессировании активного полипептида в рекомбинантной форме (как описано ниже). Предпочтительные модификации включают такие модификации, которые снижают результирующий отрицательный заряд области, расположенной внутри или вокруг мотивов ОЬРЬ, СЕЬУ или ЬНО. Средства и способы модификации устойчивых генов известны специалистам и описаны, например, в νθ 01/29239 для гена Вх 8о1апит 1иЬсго5ит. Другие желательные мутации могут быть результатом случайного или сайт-направленного мутагенеза для видоизменения активности (например, специфичности) или стабильности кодируемого полипептида.

Понятно, что гомология на аминокислотном уровне определяется на основе подобия или идентичности аминокислот. Подобие дает возможность консервативных вариаций, т. е. замещения гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин, на другой или замещения одного полярного остатка на другой, такой как аргинин вместо лизина, глутаминовая кислота вместо аспарагиновой или глутамин вместо аспарагина. Специалистам хорошо известно, что видоизменение первичной структуры полипептида путем консервативного замещения может не оказывать существенного влияния на активность этого пептида, поскольку боковая цепь аминокислоты, которая вставляется в последовательность, может быть способна образовывать такие же связи и контакты, как и боковая цепь аминокислоты, которая была замещена. Это справедливо, даже когда замещение происходит в области, которая является критической в определении конформации пептидов. Изобретение также относится к гомологам, содержащим неконсервативные замещения. Специалистам хорошо известно, что замещения в тех областях пептида, которые не являются критическими в определении их конформации, могут не оказывать большого влияния на их активность, так как они не изменяют существенным образом трехмерную структуру пептида. В областях, которые являются критическими в определении конформации или активности пептидов, такие изменения могут изменить свойства полипептида. В самом деле, изменения, подобные описанным здесь, могут придавать пептиду достаточно благоприятные свойства, например измененную стабильность или специфичность, в частности более широкую специфичность. Мутанты, имеющие эти свойства, могут быть затем селектированы, как описано выше.

Другие способы могут включать смешивание или встраивание последовательностей из родственных генов устойчивости в последовательность К1. Например, рестрикционные фрагменты К1 могут быть дотированы с фрагментами гомолога К.1 или даже неродственного гена с образованием рекомбинантных версий К1. Альтернативная концепция модификации К1 использует ПЦР, как описано выше (Но е! а1. 1989 Сеие 77, 51-59) или ДНК-шаффлинг (Сгатеп е! а1. 1998 Ыа1иге 391).

Таким образом, способы по изобретению, описанные выше, могут включать гибридизацию одного или более (например, двух) зондов или праймеров на основе последовательности К1 либо для скрининга К1-гомологов, либо для выработки К1-производных. Таким образом, олигонуклеотиды, зонды или праймеры образуют следующую часть данного изобретения. Олигонуклеотид для использования в зондировании или ПЦР может иметь длину 30 или менее нуклеотидов (например, 18, 21 или 24). Обычно специфические праймеры имеют длину 14 или 15 нуклеотидов. Для оптимальной специфичности и эффективности затрат могут быть предпочтительны праймеры из 16-24 нуклеотидов. Специалистам хорошо известны принципы конструирования праймеров для использования в таких технологиях, как ПЦР. Если необходимо, зондирование может быть проведено с целыми рестрикционными фрагментами генов, описанными здесь, которые могут состоять из сотен или даже тысяч нуклеотидов.

По одному из аспектов данного изобретения молекула нуклеиновой кислоты, описанная выше, имеет форму рекомбинантного и предпочтительно реплицирующегося вектора. Понятие вектор включает, среди прочего, любой бинарный вектор - плазмиду, космиду, фаг или агробактерию в дву- или однонитевой линейной или кольцевой форме, - который может быть или может не быть самопередающимся или мобилизуемым и который может трансформировать прокариотические или эукариотические хозяева путем встраивания в геном клетки или существует во внехромосомной форме (например, автономная реплицирующаяся плазмида с источником репликации). В частности, изобретение включает челночные векторы, под которыми следует понимать ДНК-носитель, способный, от природы или путем конструирования, к репликации в двух различных организмах-хозяевах, которые могут быть выбраны из актиномицет и родственных им видов, бактерий и эукариотических клеток (например, клеток высших растений, млекопитающих, дрожжей или грибов). Вектор, включающий нуклеиновую кислоту по изобретению, не обязательно содержит промотор или другую регуляторную последовательность, особенно если вектор должен использоваться для введения этой нуклеиновой кислоты в клетки для рекомбинации в геном.

Предпочтительно нуклеиновая кислота в векторе находится под контролем соответствующего промотора и оперативно связана с ним или с другими регуляторными элементами для транскрипции в клетку-хозяина, такую как микробная клетка, например бактериальная или растительная. Вектор может представлять собой бифункциональный вектор экспрессии, который функционирует во множестве хозяев. В случае геномной ДНК он содержит свой собственный промотор или другие регуляторные элементы, а в случае кДНК он может находиться под контролем соответствующего промотора или других регулятор

- 7 008599 ных элементов для экспрессии в клетке-хозяине. Под промотором следует понимать последовательность нуклеотидов, с которой может быть начата транскрипция оперативно связанной ДНК в З'-направлении смысловой нити двунитевой ДНК.

Оперативно-связанная означает присоединенная в виде части той же молекулы нуклеиновой кислоты, удобно расположенная и ориентированная для транскрипции, начинаемой с промотора. ДНК, оперативно связанная с промотором, и находится под действием регуляции инициирования транскрипции данного промотора.

Таким образом, в этом аспекте изобретение относится к генной конструкции, предпочтительно реплицирующемуся вектору, включающему промотор, оперативно связанный с нуклеотидной последовательностью по данному изобретению, такой как кодирующая область гена КТ или ее вариант (мутант, производное или аллель). В целом, специалисты в биотехнологии знакомы с конструированием векторов и протоколами конструирования для экспрессии рекомбинантных генов. Могут быть выбраны или сконструированы подходящие векторы, содержащие соответствующие регуляторные последовательности, включая промоторные последовательности, терминирующие фрагменты, полиаденилационные последовательности, энхансерные последовательности, гены-маркеры и другие подходящие последовательности. Подробности см., например, в Мо1еси1аг С1ошид: А БаЬога!огу Мапиа1, 2ий еййюи, 8атЬгоок е! а1. 1989, Со1й 8рпид НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк. Многие известные технологии и протоколы обработки нуклеиновых кислот, например получения нуклеиново-кислотных конструкций, мутагенеза (см. выше), секвенирования, введения ДНК в клетки и экспрессии генов, а также анализ протеинов, подробно описаны в Сиггеи! Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 8есоий Еййюи, Аи8иЬе1 е! а1. ейк., 1ойи XVНеу & 8оиз, 1992. Описания 8атЬгоок е!. а1. и Аи8иЬе1 е! а1. включены в данную заявку в виде ссылки.

Один из вариантов осуществления данного изобретения относится к генной конструкции, предпочтительно реплицирующемуся вектору, включающему индуцируемый промотор, оперативно связанный с нуклеотидной последовательностью по данному изобретению. Выражение индуцируемый в отношении к промотору хорошо знакомо специалистам. По существу, выражение под контролем индуцируемого промотора означает включение или усиление реакции на применение стимула. Природа стимула различна для различных промоторов. Некоторые индуцируемые промоторы вызывают лишь небольшие или необнаружимые уровни экспрессии (или отсутствие экспрессии) в отсутствие соответствующего стимула. Другие индуцируемые промоторы вызывают обнаружимую конститутивную экспрессию в отсутствие стимула. Каким бы ни был уровень экспрессии в отсутствие стимула, в присутствии надлежащего стимула экспрессия от любого индуцируемого промотора увеличивается. Предпочтительной является ситуация, когда уровень экспрессии при применении нужного стимула увеличивается в степени, эффективной для изменения фенотипических характеристик. Таким образом, может быть использован индуцируемый (или включаемый) промотор, который в отсутствие стимула вызывает базовый уровень экспрессии, слишком низкий для получения желаемого фенотипа (и, фактически, может быть нулевым). После применения стимула экспрессия увеличивается (или включается) до уровня, обеспечивающего желаемый фенотип.

Возможные регуляторные элементы, обеспечивающие возможность экспрессии в прокариотических клетках-хозяевах, включают, например, промоторы РЬ, 1ас, 1гр или !ас в Е. сой, а примеры регуляторных элементов, обеспечивающих возможность экспрессии в эукариотических клетках-хозяевах, включают промотор АОХ1 или САЬ1 в дрожжах или СМУ-, 8У40-, К8У-промотор (вирус саркомы Роуза), СМУэнхансер, 8У40-энхансер или глобиновый интрон в клетках млекопитающих и других животных. Пригодные в этом контексте векторы экспрессии известны в биотехнологии, например вектор экспрессии кДНК рсЭУ 1 Окаяма-Берга (Рйагтааа), рСЭМ8. рКс/СМУ, рсЭХЛ1. рсЭБАЗ (1и-уйгодеие), р8РОКТ1 (С1ВСО ВКЬ).

В частности, для данного изобретения интерес представляют растительные векторы. Специфические методики и векторы, широко и с успехом используемые ранее для растений, описаны у Веуаи (Бис1. Ас1Й8 Кек. 12,8711-8721 (1984)) и Сиепиеаи аий МиШиеаих (1993) (Р1аи! йаиДогтайои аий ехргеккюи уес!огк. 1и: Р1аи! Мо1еси1аг Вю1оду БаЬГах (Сгоу ККЭ ей.) ОхГогй, ВЮ8 8с1еиййс РиЬйкйегк, рр. 121-148). Подходящие промоторы, функционирующие в растениях, включают промотор гена мозаичного вируса цветной капусты 358 (СаМУ 358, который экспрессируется с высоким уровнем практически во всех растительных тканях (ВеиГеу е! а1. 1990а аий 1990Ь); промотор цветной капусты теп 5, который экспрессируется в вегетативной верхушечной меристеме, а также в нескольких хорошо локализованных положениях растительного организма, например внутренней флоэме, зачатках цветков, точках разветвления корней и побегов (МейГогй 1992; МейГогй е! а1. 1991), и промотор БЕАРУ АгаЬ1йор515 !йайаиа, который экспрессируется на самой ранней стадии развития цветка ^е1де1 е! а1. 1992). Другие промоторы включают промотор актина риса.

Промотор может включать один или более мотивов или элементов последовательности, обеспечивающих контроль развития и/или тканеспецифический регуляторный контроль экспрессии.

Таким образом, векторы по данному изобретению могут включать ген К1 или его вариант, в дополнение к различным последовательностям, необходимым для придания векторам улучшенных функций репликации, интеграции и/или экспрессии. Эти векторы могут быть использованы, например, для прида

- 8 008599 ния растениям, в которые они введены, устойчивости к Р. шГеЩцъ или другим грибам.

Если желательно индуцировать устойчивость более широкого спектра, в свете данного описания, применимы следующие дополнительные возможности:

(a) модифицировать последовательность К.1 с получением мутантов или других производных, описанных выше, так, чтобы ее эффект мог быть инициирован элиситорами или патогенами, отличными от Р. шГе81аи8 или от других природных элиситоров, описанных здесь;

(b) коэкспрессировать К1 непосредственно с соответствующим элиситором (например, Άντ 1 из авирулентного штамма);

(c) коэкспрессировать К1 и ген элиситора, транскрипция или трансляция которого подавляется в результате активации К1.

Это должно обеспечить сцепление К1 с его элиситором и улучшить имитацию природной реакции на инфекцию Р. шГеЩцъ. что приведет к сайленсингу широкой специфичности;

(ά) коэкспрессировать К1 с геном элиситора, трансляция которого включается только в присутствии патогена (патогенов);

(е) коэкспрессировать К1 с геном элиситора, в результате чего один из них или оба станут инактивированными, и реактивировать ген (гены) разнообразными способами, так чтобы НК ограничивалась лишь некоторыми участками растения (например, соматически определенными участками), но защитная реакция распространялась за пределы этих участков. Это может быть достигнуто, например, по аналогии с методиками, описанными в νθ 95/31564, в соответствии с которыми после беккросса между растением, несущим транспозон-меченый ген устойчивости (в том случае сГ-9) и целый элиситор (Άντ-9), и растением, несущим активаторную транспозазу, потомство показывает соматическую реактивацию сГ-9, ведущую к локализованной некротической реакции, но при этом к широко распространенной устойчивости.

Кроме векторов и конструкций, описанных выше, данное изобретение также относится к способам, включающим введение конструкций К1, описанных выше (таких, как векторы) в клетку-хозяин и/или индуцирование экспрессии конструкции в растительной клетке, путем применения подходящего стимула, эффективного экзогенного индуктора. Векторы, описанные выше, могут быть введены в хозяева любым подходящим способом, например конъюгацией, мобилизацией, трансформацией, трансфекцией, трансдукцией или электропорацией, как описано ниже более подробно.

В следующем аспекте данное изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей нуклеиновую кислоту или вектор по данному изобретению, особенно растительной или микробной клетке. Клеткойхозяином может быть любая прокариотическая или эукариотическая клетка, например бактериальная, грибковая, клетки насекомых, растений или животных. Предпочтительными грибковыми клетками являются, например, клетки рода 8ассйатотусе5, в частности вида 8. сеге\'ыае. Для экспрессии нуклеиново-кислотных молекул по изобретению в смысловой или антисмысловой ориентации в растительных клетках молекулы вводят под контроль регуляторных элементов, которые обеспечивают экспрессию в растительных клетках. Эти регуляторные элементы могут быть гетерологичными или гомологичными по отношению к экспрессируемой молекуле нуклеиновой кислоты, а также по отношению к трансформируемому виду растения. Обычно такой регуляторный элемент представляет собой промотор, активный в растительных клетках. Для получения экспрессии во всех тканях трансгенного растения предпочтительно используют конститутивные промоторы, такие как промотор 35 8 СаМУ (Обе11, ЫаЩте 313 (1985), 810-812) или промоторы генов полиубиквитина кукурузы (Сйпйеикеи, Р1аи1 Мо1. Вю1. 18 (1982), 675689). Для получения экспрессии в специфических тканях трансгенного растения можно использовать тканеспецифические промоторы (см., например, 81оскйаи5, ЕМВО 1. 8 (1989), 2245-2251). Известны также промоторы, которые являются специфически активными в клубнях картофеля или в семенах различных видов растений, например кукурузы, УШа, пшеницы, ячменя и т.д. Могут быть использованы индуцируемые промоторы для возможности точного контроля экспрессии. Примеры индуцируемых промоторов включают промоторы генов, кодирующих протеины теплового удара. Также описаны микроспораспецифические регуляторные элементы и их использование (νθ 96/16182). Кроме того, может быть использована химически индуцируемая Те1-система (Са!/, Мо1. Оеи. Сенек 227 (1991); 229-237). Другие подходящие промоторы известны специалистам и описаны, например, у νηΓά (Р1аи1 Мо1. Вю1. 22 (1993), 361-366). Регуляторные элементы могут также включать транскрипционные и/или трансляционные энхансеры, функциональные в растительных клетках. Кроме того, регуляторные элементы могут включать сигналы терминирования транскрипции, такие как сигнал поли-А, который приводит к присоединению хвоста поли-А к транскрипту, который может улучшить их стабильность; литературу см. выше.

В случае, если молекула нуклеиновой кислоты по изобретению экспрессируется в смысловой ориентации, то, в принципе, возможна модификация кодирующей последовательности таким образом, чтобы протеин был расположен в желаемом отделе растительной клетки. Такие отделы включают эндоплазматический ретикулюм, вакуоль, митохондрии, пластиды, апопласт, цитоплазму и т.д. Способы осуществления этих модификаций и сигнальные последовательности, обеспечивающие локализацию в желаемом отделе, хорошо известны специалистам.

Способы введения чужеродной ДНК в растения также хорошо известны в биотехнологии. Эти способы включают, например, трансформацию растительных клеток или тканей Т-ДНК с использованием

- 9 008599

АдгоЬас1сгшт 1итсГас1спк или АдгоЬайспит г1пходспс5. слияние протопластов, прямой перенос генов (см., например. ЕР-А164575). инъекцию. электропорацию. биолистические способы. такие как бомбардировка частицами. и другие способы. известные в биотехнологии. Векторы. используемые в способе по изобретению. могут содержать дополнительные функциональные элементы. например левые граничные и правые граничные последовательности Т-ДНК АдгоЬас1сгшт. которые дают возможность стабильной интеграции в геном растения. Кроме того. специалистам известны способы и векторы. которые дают возможность получения трансгенных растений без маркеров. т.е. селектируемый или измеряемый маркерный ген теряется на определенной стадии развития растения или селекции растения. Это может быть достигнуто. например. путем котрансформации (ΕνζπίΕ Р1ап1 Мо1. Вю1. 13 (1989). 151-161; Рспд. Р1ап1 Мо1. Βίο1. 27 (1995). 91-104) и/или путем применения систем. которые используют ферменты. способные промотировать гомологичную рекомбинацию в растениях (см.. например. \¥О 97/08331; Вау1су. Р1ап1 Мо1. Вю1. 18 (1992). 353-361); Ь1оуб. Мо1. Осп. Оспа. 242 (1994). 653-657; Масксг. Мо1. Осп. Оспа. 230 (1991). 170-176; ОпоисЫ. ЫисЕ Ас1бк Иск. 19 (1991). 6373-6378). Способы получения соответствующих векторов описаны. например. в 8атЬгоок (Мо1сси1аг С1опшд: А ЬаЬога1огу Мапиа1. 2пб Ебйюп (1989). Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога1огу Ргскк. Со1б 8ргшд НагЬог. ΝΥ).

Подходящие штаммы АдгоЬас1сгшш 1итсГас1спк и векторы. а также трансформация АдгоЬайспа и соответствующие среды роста и селекции хорошо известны специалистам и описаны в литературе (ОУ3101 (рМК90ИК). Ко^> Мо1. Осп. Сспс!. 204 (1986). 383-396; С58С1 (рОУ 3850кап). ПсЫасгс. №с1. Ааб Иск. 13 (1985). 4777; Всуап. №с1ас. Ас1б Иск. 12(1984). 8711; ^μζ. Ргос. N11. Асаб. 8ск И8А 86 (1989). 8467-8471; ^μζ. Р1ап1 Мо1. Вю1. 20 (1992). 963-976; ^μζ. 8рсааЩсб усйогк Гог дспс 1аддтд апб схргсккюп кШбюк. 1п: Р1ап1 Мо1сси1аг Вю1оду Мапиа1 Уо1. 2. ОсМп апб 8сЫ1рсгоой (Ебк.). ПогбгссЫ. Т1с №1йсг1апбк: К1игег Асабстю РиЬ1. (1994). 1-22; ЕР-А-120516; Носкста: Т1с Вшагу Р1ап1 Усйог 8ук1ст. ОГГкабгикксп) КаШсгк В.У.. А1Ь1акксгбат (1985). С’НарЮг У. Рга1су. Сгй. Ису. Р1ап1. δα.. 4. 1-46; Ап. ЕМВО 1. 4 (1985). 277-287). Хотя использование АдгоЬас1сгшт 1итсГас1спк является предпочтительным в способе по изобретению. могут быть использованы и другие штаммы АдгоЬас1сгшт. такие как АдгоЬайспит б^одснск. например. если желателен фенотип. который дает этот штамм.

Способы трансформации с использованием биолистических методик хорошо известны специалистам. см.. например. ^аи. Р1ап1 Рйукю1. 104 (1994). 37-48; Уакй. Вю/Тссйио1оду 11 (1993). 1553-1558 апб С’НпкЮн (1996) Тгспбк ίπ Р1ап1 8с1спсс 1. 423-431. Могут выполняться микроинъекции. как описано в РоПукик апб 8рапдспЬсгд (сбк.). Оспс ТгапкГсг То Р1ап1к. 8ргшдсг Усг1ад. Всг1т. ΝΥ (1995).

С использованием способов. описанных выше. возможна трансформация большинства двудольных растений. Но разработано также несколько методик успешной трансформации однодольных растений. Эти методики включают трансформацию с использованием биолистических способов. как. например. описано выше. а также трансформацию протопластов. электропорацию клеток с частично нарушенной проницаемостью мембраны. введение ДНК с использованием стекловолокна и т.д. Полученная трансформированная растительная клетка может быть затем использована для регенерации трансформированного растения способами. известными специалистам. См.. например. Нооб. Мо1сси1аг Вгссбтд 3 (1997). 291-306; Со1стап. Ргос. Асаб. δα. И8А 94 (1997). 7094-7097; 8Ы1йо. ВЫссйпокду 7 (1989). 581-587.

В целом. растения. которые могут быть модифицированы по изобретению и которые показывают чрезмерную экспрессию протеина по изобретению или снижение синтеза такого протеина. могут быть получены из любого желаемого растительного вида. Это могут быть однодольные растения или двудольные растения. предпочтительно относящиеся к виду. представляющему интерес в сельском хозяйстве. лесоводстве или садоводстве. такие как злаки (например. кукуруза. рис. ячмень. пшеница. рожь. овес и т.д.). картофель. масличные растения (например. масличный рапс. подсолнечник. арахис. соя и т.д.). хлопок. сахарная свекла. сахарный тростник. бобовые растения (например. бобы. горох и т.д.). растения для производства древесины. предпочтительно деревья. и т.д.

Конкретный выбор технологии трансформации будет определяться ее эффективностью в отношении трансформации определенных видов растений. а также опытом и предпочтениями человека. который будет осуществлять на практике данное изобретение при помощи выбранной методики. Специалистам будет понятно. что частный выбор системы трансформации для введения нуклеиновой кислоты в растительные клетки не является существенным или ограничивающим фактором для изобретения. так же. как и выбор технологии регенерации растения. Если это желательно. могут быть использованы селектируемые генетические маркеры. состоящие из химерных генов. которые сообщают селектируемые фенотипы. например устойчивость к антибиотикам. таким как канамицин. гидромицин. фосфинотрицин. хлорсульфурон. метотрексат. гентамицин. спектиномицин. имидазолиноны и глифосат.

Таким образом. в следующем аспекте данное изобретение относится к способу трансформации растительной клетки. включающему введение вектора. содержащего нуклеиновую кислоту по данному изобретению (например. И1 или вариант И1). в растительную клетку и инициирование или предоставление возможности рекомбинации между вектором и геномом растительной клетки для введения последовательности нуклеотидов в геном.

Изобретение также относится к клетке-хозяину. трансформированной нуклеиново-кислотной молекулой или вектором по изобретению. в частности растительной или микробной клетке. В трансгенных

- 10 008599 растительных клетках (т.е. с введенной нуклеиновой кислотой, рассматриваемой здесь) трансген может содержаться во внегеномном векторе или быть встроенным, предпочтительно стабильно, в геном. В гаплоидном геноме может быть более одной гетерологичной нуклеотидной последовательности.

Выражение гетерологичный широко используется в данном аспекте и означает, что ген/последовательность нуклеотидов, рассматриваемая здесь, была введена в упомянутые клетки растения или его предка с использованием генной инженерии, т.е. путем вмешательства человека. Гетерологичный ген может быть дополнительным к имеющемуся эндогенному гену. Нуклеиновая кислота, гетерологичная, или экзогенная, или чужеродная, к растительной клетке, может быть неприродной для клеток данного типа, сорта или вида. Таким образом, гетерологичная нуклеиновая кислота может включать кодирующую последовательность растительной клетки определенного типа, или вида, или сорта растения или выведенную из нее последовательность, помещенную в среду растительной клетки другого типа, или вида, или сорта растения.

После трансформации растение может быть регенерировано, например, из отдельных клеток, ткани каллуса или дисков листьев по обычной технологии. Почти любое растение может быть полностью регенерировано из клеток, тканей и органов растения. Имеющиеся технологии описаны в Уакй е! а1., Се11 Си1!иге апб 8отабс Се11 Сепебск оГ Р1ап1з, νοί. I, II апб III, ЬаЬога!огу Ргосебигек апб Тйеи Аррйсабопк, Асабетю Ргекк, 1984, и ^е1ккЬасй апб \Уе1ккЬаск МеШобк Гог Р1ап1 Мо1еси1аг Вю1оду, Асабетю Ргекк, 1989.

Производство фертильных трансгенных растений было достигнуто в таких злаках, как рис, кукуруза, пшеница, овес и ячмень (обзор в 8Ытато!о, К. (1994) Сиггеп! Оршюп ш Вю!есйпо1оду 5,158-162; νη^ е! а1. (1992) Вю/Тесйпо1оду 10, 667-674; νηίιτ е! а1., 1995, Вю!есйпо1оду Абуапсек 13 (4): 653-671; νη^Ε 1996, Ыа!иге Вю!есйпо1оду 14, раде 702).

Изобретение также относится к растениям, которые содержат растительную клетку по изобретению, включая все его части или побеги, семена, собственное или гибридное потомство. Растение по изобретению может быть таким, которое не дает чистосортного потомства по одному или нескольким свойствам. Сорта растений могут быть исключены, в частности сорта растений, регистрируемые в соответствии с Р1ап! Вгеебегк' К|д111к (Права селекционеров растений). Следует отметить, что нет необходимости рассматривать растение как сорт только потому, что оно стабильно содержит в своем геноме трансген, введенный в клетку растения или его потомка.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения трансгенное растение по изобретению в присутствии гена К.1 по изобретению приобретает устойчивость или повышает устойчивость к патогену по сравнению с соответствующим исходным растением, восприимчивым к этому патогену.

Выражение устойчивость включает целый диапазон защитной реакции, от замедления до полного ингибирования развития заболевания. Примеры наиболее важных патогенов включают РйуГорЫйога тГек1апк. возбудитель фитофтороза картофеля, Рйу!орЫйога ко)ае, патоген корневой гнили сои, Регопокрога рагакйюа (ложная мучнистая роса), Мадпароййе дпкеа, возбудитель пирикуляриоза риса, Егущрйе крр (настоящая мучнистая роса), Ркеиботопак куппдае (фактор бактериальной гнили), Ег\\ппа ату1оуога (бактериальный ожог плодовых деревьев), Ег\\ппа саго!оуога (мягкая гниль), Войуйк стегеа (ложная мучнистая роса винограда), К1нхос1оша ко1ап1 и Ру!Ыит беЬагуапит (факторы заболевания всходов или болезни высыхания). Предпочтительно трансгенное растение по изобретению приобретает устойчивость к Р. 1пГек1аик.

Кроме регенерированного растения, данное изобретение относится к клону такого растения, к семенам, к собственному или гибридному потомству (например, потомству Р1 и Г2) и любой их части, например черенкам, семенам. Изобретение также относится к побегам такого растения, т. е. любой части, которая может быть использована для воспроизводства или распространения, полового или вегетативного, включая черенки, семена и т.д.

В отличие от молекулярно-биологических способов введения К1 (или его вариантов) в растения, последовательности, описанные здесь, могут быть использованы для облегчения селекции растений, для которых желательно введение признака устойчивости традиционными способами селекции растений. Потомство от скрещиваний, которое несет нужный ген, может быть легко идентифицировано путем скрининга на основе последовательности К1, в частности сигнатурной последовательности К1.

Способы, описанные здесь для идентификации ближних маркеров локуса К1, как правило, могут быть применимы к другим кластеризованным генам, (например, растительным генам устойчивости). Такие способы отличаются тем, что они включают этап ПЦР в условиях низкой жесткости с использованием недегенеративных праймеров без мотивов законсервированных последовательностей. Общий подход может быть изложен следующим образом: (а) получение популяции, в которой ген, представляющий интерес, является сегрегирующим; (Ь) идентификация гомолога (гомологов) гена устойчивости, связанного с локусом, представляющим интерес, на основе высокозаконсервированных (ген устойчивости) мотивов и высокодегенеративных праймеров (Ье1к!ег е! а1. 1996) Ыа!иге Сепе!. 14,421-428; (с) идентификация дополнительных маркеров, соответствующих гомологичным генам, которые находятся внутри локуса (устойчивости) и которые являются ближними к гену, с использованием ПЦР в условиях низкой жесткости с использованием недегенеративных праймеров без мотивов законсервированных последовательностей; (б) использование упомянутых дополнительных маркеров для идентификации клона, несущего

- 11 008599 геномную библиотеку гена (устойчивости), представляющего интерес, из устойчивого растения, возможно, в сочетании с анализами переходной активности (Мшйппок е! а1. (1994) или как описано здесь); (е) возможно, подтверждение идентичности клонированного гена на основе фенотипа трансгенных растений.

Данное изобретение также относится к продукту экспрессии К1 или вариантных нуклеиновокислотных последовательностей, описанных здесь, и к способам получения продукта экспрессии путем экспрессии кодирующих нуклеиново-кислотных молекул в подходящих условиях, например в подходящих клетках-хозяевах ίη νίίτο, или путем химического синтеза, в частности, если требуются антигены для выработки антител.

Антитела могут быть выработаны с получением очищенного К1/вариантного полипептида или пептида любым способом, известным в биотехнологии (обзор способов см., например, в 1ттипо1оду-51й Εάίίίοη Ьу Кой!, Вгок!оГГ, Ма1е: РиЬ. 1998-МокЬу Ргекк, Ьопйоп). Такие антитела или их фрагменты или производные могут быть использованы для связывания К1 или для идентификации и/или изолирования протеинов, гомологичных К1 (т.е. имеющих с ним общие эпитопы), которые, в свою очередь, могут стать основой способа изолирования кодирующих их генов, альтернативного описанным выше способам.

Подобно этому, могут быть использованы аптамеры, которые связываются с полипептидом К1 по изобретению. Получение аптамеров известно специалистам; см., например, Тйотак апй Οίηκ1ι;·ι\ν (2000) АйарШе тесодпйюп Ьу пис1ею ар!атетк. 8с1епсе 287:820-825.

Изобретение также относится к способу воздействия на признак устойчивости в растении, включающему этап инициирования или предоставления возможности экспрессии гетерологичной нуклеиново-кислотной последовательности, описанной выше (например, К1 или варианта К1, возможно, с элиситором в обоих случаях) в клетках растения.

В качестве альтернативы, может быть желательно даунрегулировать активность К1. Это может быть выполнено, например, путем использования антисмысловой технологии (описанной в Вонище (1995), Р1ап1 8с1епсе 105,125-149, и Е^е11, (1994) ΡΝΑ8 И8А 91, 3490-3496). Альтернативой этой технологии является использование копии всего или части целевого гена, инсертированной в смысловой, т. е. в той же ориентации, что и целевой ген, для снижения экспрессии целевого гена путем косупрессии; см., например, νаη йег Кго1 е! а1., (1990) ТНе Р1ап1 Се11 2, 291-299; №рой е! а1, (1990) ТНе Р1ап1 Се11 2, 279-289; /Напу е! а1., (1992) Тйе Р1ап! Се11 4,1575-1588, и патент США И8-А-5,231,020.

Таким образом, изобретение также относится к трансгенной растительной клетке - и к трансгенным растениям, содержащим такие растительные клетки, - которая содержит молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению или ее часть, предпочтительно стабильно встроенную в геном, при этом транскрипция и/или экспрессия молекулы нуклеиновой кислоты или ее части приводит к снижению синтеза протеина К1. В предпочтительном варианте осуществления снижение достигается путем антисмыслового, смыслового, рибозимного, косупрессивного, доминантного мутантного эффекта или нокаут-мутанта в гене К1.

Однако предпочтительно изобретение относится к способу, который включает экспрессирование 8ΕΟ Ш ΝΟ: 1 или ее варианта в клетках растения (продуцирующих в результате этого кодируемый ею полипептид) после предшествующего этапа введения нуклеиновой кислоты в клетку растения или его предка. Как правило, такой способ может быть использован для введения в растение устойчивости к грибам, посредством чего К1-опосредованная устойчивость включается при контакте с соответствующим грибковым элиситором или другим инициатором или индуктором. Вообще говоря, элиситор или другой инициатор может быть закодирован непосредственно инвазирующими грибами (например, вирулентным протеином Р. шГек!апк или некоторыми другими грибами). В альтернативе, она может быть экспрессирована посредством отдельной конструкции или трансгена, который сам по себе включается или апрегулируется грибковой инфекцией. Кроме того, в обоих этих случаях модификация последовательности К1 (варианта) может обеспечить инициирование неприродным элиситором, если это предпочтительно.

Форматы, описанные выше для приобретения функции К1 или К1-производного по отношению к предполагаемому или известному элиситору, сами по себе составляют следующий аспект изобретения. В частности, способы создания гена для генной совместимости между элиситором и геном устойчивости отличаются тем, что они включают следующие этапы: (а) инициирование или предоставление возможности коэкспрессии в клетке К1 или К1-производного и элиситора, (Ь) наблюдение за НК в упомянутой клетке, (с) установление корреляции результатов наблюдений, полученных в (Ь), со специфичностью К1 или К1-производного к элиситору.

В соответствии с вышеизложенным данное изобретение также относится к таким трансгенным растениям, которые являются более чувствительными к инфицированию фитофторозом по сравнению с соответствующим растением дикого типа. Подобным образом, данное изобретение относится к частям растения, предназначенным для сбора урожая, и к материалу для размножения таких растений.

Как описано в примерах, был изолирован ген К1, который после трансформации в восприимчивый сорт картофеля Эекйее придал ему устойчивость к Р. шГек!апк. Поскольку геномный клон, соответствующая последовательность ДНК которого показана в 8ΕΟ Ш ΝΟ: 1, оказался способным вызывать этот эффект, то очевидно, что регуляторные последовательности гена К1, необходимые и достаточные для опосредования экспрессии полипептида К1 после инфицирования патогеном, содержатся в изолированной последовательности ДНК. Специалистам будет совершенно очевидно, что такие регуляторные по

- 12 008599 следовательности будут иметь важное применение сами по себе, например для специфической экспрессии гетерологичных последовательностей ДНК после инфицирования патогеном, например для индукции гиперчувствительной реакции на данный патоген.

Соответственно, данное изобретение также относится к регуляторной последовательности промотора, природным образом регулирующего экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению, описанной выше, или молекулы нуклеиновой кислоты, гомологичной молекуле нуклеиновой кислоты по изобретению, при этом упомянутая регуляторная последовательность способна вызывать или модулировать экспрессию гетерологичной последовательности ДНК после инфицирования патогеном.

В контексте данного изобретения выражение регуляторная последовательность относится к последовательностям, которые влияют на специфичность и/или уровень экспрессии, например, в том смысле, что они придают клеточную и/или тканевую специфичность. Такие области могут быть расположены выше сайта инициирования транскрипции, но могут быть также расположены ниже этого сайта, например в транскрибируемых, но не транслируемых лидерных последовательностях или в интронах.

Выражение промотор в контексте данного изобретения относится к нуклеотидным последовательностям, необходимым для инициирования транскрипции, например связывания РНК-полимеразы и успешного начала образования процессивного транскрипта, и может также включать, например, ТАТАбокс.

Выражение молекула нуклеиновой кислоты, гомологичная молекуле нуклеиновой кислоты по изобретению, здесь включает промоторные области и регуляторные последовательности других генов Я1, например генов из других видов, таких как томат, которые являются гомологичными генам Я1 картофеля и которые показывают, по существу, такую же картину экспрессии. Такие промоторы отличаются способностью вызывать, предпочтительно, только экспрессию гетерологичной последовательности ДНК в растении после инфицирования патогеном.

Выражение способный вызывать или модулировать экспрессию гетерологичной последовательности ДНК после инфицирования патогеном здесь означает, что упомянутый промотор способен контролировать экспрессию гетерологичной последовательности ДНК в растениях на участках инфекции, аналогичную или близкородственную контролируемой экспрессии патогенсвязанных генов, задействованных в природной устойчивости при наиболее несовместимых взаимодействиях хозяин-патоген, таких как смерть гиперчувствительных клеток на участках инфекции какой-либо части растения. Таким образом, регуляторная последовательность по изобретению отличается способностью избирательно опосредовать локализованную активацию транскрипции в ответ на атаку патогена или в ответ на стимулы, которые имитируют атаку патогена, такие как элиситоры, полученные, например, из патогенов, таких как грибы или бактерии или их производные. Активация транскрипции регуляторной последовательностью по изобретению может происходить также в клетках, окружающих фактический участок инфекции, благодаря взаимодействиям клетка-клетка. Регуляторная последовательность по изобретению и химерные промоторы, включающие такие последовательности, что благоприятно, могут не быть индуцируемыми или могут быть индуцируемыми лишь в малой степени при воздействии другого стимула, такого как абиотический стресс. Предпочтительно индукция со стороны химерного промотора в ответ на атаку патогена или обработку элиситором по меньшей мере в 10 раз выше, предпочтительно в 20 раз выше и наиболее предпочтительно в 30 раз выше, чем его активация абиотическим стрессом, если она вообще имеет место.

Однако специфичность экспрессии, сообщаемая регуляторными последовательностями по изобретению, может не быть ограничена локальной экспрессией гена в результате воздействия патогенов, например они могут сочетаться с другими регуляторными последовательностями, которые обеспечивают тканеспецифическую экспрессию гена. Конкретная картина экспрессии может также зависеть от используемой системы растение/вектор. Однако экспрессия гетерологичных ДНК-последовательностей, управляемая регуляторными последовательностями по изобретению, преимущественно имеет место после инфицирования патогеном или обработки соответствующим элиситором, если только некоторые элементы по изобретению не будут использованы опытным специалистом в биотехнологии для создания конструкции, обеспечивающей контроль экспрессии гетерологичной ДНК-последовательности в определенных типах клеток.

Таким образом, по данному изобретению могут быть использованы регуляторные последовательности из других видов, которые являются функционально гомологичными регуляторным последовательностям промотора описанных выше Я1-специфичных нуклеиново-кислотных молекул или промоторов генов, которые показывают идентичную или подобную картину экспрессии. Конкретная картина экспрессии также может зависеть от используемой системы растение/вектор. Однако экспрессия гетерологичных ДНК-последовательностей, управляемая регуляторными последовательностями по изобретению, преимущественно происходит в любой клетке, инфицированной соответствующим патогеном, если только некоторые элементы по изобретению не будут использованы опытным специалистом в биотехнологии для создания конструкции, обеспечивающей контроль экспрессии гетерологичной ДНК-последовательности в определенной ткани или контроль иного рода.

По данному изобретению могут быть изолированы новые регуляторные последовательности генов Я1, что проиллюстрировано на примере регуляторной последовательности гена Я1 картофеля. Например,

- 13 008599 геномная ДНК может быть расщеплена подходящими рестрикционными ферментами, денатурирована и подвергнута отжигу с обратным праймером, полученным из последовательности кДНК по изобретению. После удлинения праймера может быть лигирован адаптер с тупыми концами и может быть проведена ПЦР с использованием вложенного обратного праймера, полученного из упомянутой кДНК, и форвардпраймера, полученного из последовательности адаптера. В другой методологии клонирования регуляторных последовательностей по изобретению может быть сконструирована физическая карта геномных последовательностей выше кодирующей области посредством геномного саузерн-анализа. С этой информацией геномная ДНК может быть расщеплена выбранными рестрикционными ферментами, геномные фрагменты, содержащие отрезок вышерасположенных последовательностей и кодирующую последовательность, могут быть подвергнуты гелевой очистке и самолигированию в большом объеме для образования кольцевых молекул, которые могут быть затем амплифицированы путем ПЦР с форвард- и обратным праймером, полученными из кодирующей последовательности гена. Внутри клонированной геномной последовательности может быть определен сайт начала транскрипции путем стандартных методик, хорошо известных специалистам, таких как 5'-ВАСЕ, удлинение праймера или 81-картирование. Для определения цис-регуляторных элементов выше сайта начала транскрипции (т.е. внутри предполагаемой промоторной области) соответствующую область сливают с маркерными генами, такими как гены, кодирующие СИ8 или СЕР, и воспроизводят 5'-делеционные производные этой конструкции. Их трансформируют в подходящий растительный материал и определяют экспрессию маркерного гена в зависимости от оставшейся вышерасположенной последовательности (предполагаемый промотор). Эти технологии хорошо известны специалистам.

В одном из вариантов осуществления регуляторная последовательность по изобретению содержит последовательность ДНК, выбранную из группы, содержащей:

(a) ДНК-последовательность, включающую нуклеотидную последовательность 8 ЕС ΙΌ ΝΟ: 1 от нуклеотида 1 до 2222, или ее часть (части);

(b) ДНК-последовательность, включающую по меньшей мере 14 последовательных нуклеотидов из нуклеотидной последовательности 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 1 от нуклеотида 1 до 2222;

(c) ДНК-последовательность, гибридизирующуюся с нуклеотидной последовательностью, определенной в (а) или (Ь), в жестких условиях;

(ά) ДНК-последовательность или ее фрагмент, полученные скринингом соответствующей геномной библиотеки ДНК с зондом, полученным на основе нуклеотидной последовательности, определенной в п.1; и (с) ДНК-последовательность, соответствующую последовательностям (а), (Ь) и (с), содержащим консервативные замены нуклеотидов.

Гомологичные регуляторные последовательности отличаются в одном или более положениях от регуляторной последовательности (а) или (Ь), но все равно имеют ту же специфичность, а именно они включают такие же или подобные мотивы последовательностей, предпочтительно размером от 6 до 10 нуклеотидов, ответственные за вышеописанную картину экспрессии. Предпочтительно такие регуляторные последовательности гибридизируются с одной из вышеупомянутых регуляторных последовательностей, наиболее предпочтительно в жестких условиях. Особо предпочтительными являются регуляторные последовательности, которые имеют по меньшей мере 85%, более предпочтительно 90-95% и наиболее предпочтительно 96-99% идентичности последовательности с одной из вышеупомянутых регуляторных последовательностей и обладают такой же или, по существу, такой же специфичностью. Такие регуляторные последовательности также включают видоизмененные последовательности, например, путем одной или более нуклеотидных делеций, инсерций, замещений, присоединений и/или рекомбинаций и/или любых других модификаций, известных в биотехнологии, отдельных или в комбинации друг с другом, по сравнению с вышеупомянутой нуклеотидной последовательностью. Способы введения таких модификаций в нуклеотидную последовательность регуляторных последовательностей по изобретению хорошо известны специалистам. Также специалистам будет совершенно очевидно, что к регуляторным последовательностям по изобретению могут присоединяться дополнительные регуляторные элементы. Например, могут быть использованы транскрипционные энхансеры и/или последовательности, обеспечивающие индуцированную экспрессию регуляторных последовательностей по изобретению. Подходящие индуцируемые системы включают, например, тетрациклинрегулируемую экспрессию генов, описанную, например, у Са!/, выше.

Существует возможность модификации регуляторных последовательностей, описанных выше, или их мотивов путем, например, нуклеотидных замен, не влияющих на общую структуру или мотив связывания регуляторной последовательности, так что она остается способной вызывать экспрессию гена после инфицирования патогеном. Регуляторная последовательность по изобретению может быть получена из генов В1 картофеля (см. примеры), хотя и другие растения могут быть приемлемыми источниками для таких регуляторных последовательностей. Кроме того, нуклеотидные последовательности по изобретению могут быть подвергнуты выравниванию при помощи соответствующих компьютерных программ, известных в биотехнологии, таких как ВЬА8Т, что означает Ваис Ьоса1 А1^дитсиΐ 8сатсй Тоо1 (Инструмент Поиска Локального Выравнивания Последовательностей) (А1!8сйи1 1997; А1!8сйи1, 1. Мо1. Еуо1. 36

- 14 008599 (1993), 290-390; Л115с1ш1. 1. Мо1. Βίο1. 215 (1990); 403-410), для поиска локального выравнивания последовательностей. ВЬЛ8Т предоставляет выравнивание нуклеотидных последовательностей для определения подобия последовательностей. Благодаря локальному характеру выравнивания пакет ВЬЛ8Т особенно полезен в определении или идентификации гомологов. С такими техническими средствами можно идентифицировать законсервированные нуклеотидные последовательности, которые могут играть определенную роль в патогенспецифической экспрессии.

Как правило, упомянутая регуляторная последовательность является частью рекомбинантной молекулы ДНК. В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения регуляторная последовательность в рекомбинантной молекуле ДНК оперативно связана с гетерологичной последовательностью ДНК.

Выражение гетерологичная по отношению к последовательности ДНК, оперативно связанной с регуляторной последовательностью по изобретению, означает, что упомянутая последовательность ДНК в природе не является связанной с регуляторной последовательностью по изобретению. Экспрессия упомянутой гетерологичной последовательности ДНК включает транскрипцию последовательности ДНК, предпочтительно в транслируемую мРНК. Регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию в эукариотических клетках, предпочтительно растительных клетках, хорошо известны специалистам. Они обычно включают сигналы поли-А, обеспечивающие терминирование транскрипции и стабилизацию транскрипта, см. также выше. Дополнительные регуляторные элементы могут включать транскрипционные и трансляционные энхансеры; см. выше.

В предпочтительном варианте осуществления гетерологичная последовательность ДНК вышеописанных рекомбинантных молекул ДНК кодирует пептид, протеин, антисмысловую РНК, смысловую РНК и/или рибозим. Рекомбинантная молекула ДНК по изобретению может быть использована отдельно или как часть вектора для экспрессии гетерологичных последовательностей ДНК, которые, например, кодируют протеины, такие как протеины семенного накопления, токсины, антитела (плантитела) или для диагностики экспрессии К1 -родственных генов. Рекомбинантную молекулу ДНК или вектор, содержащий последовательность ДНК, кодирующую протеин, представляющий интерес, вводят в клетки, которые, в свою очередь, продуцируют протеин, представляющий интерес. Например, регуляторные последовательности по изобретению могут быть оперативно связанными с последовательностями, кодирующими Ваг81аг и Вагпаке, соответственно, для использования в выработке НК-ответа в растениях. Практическое применение регуляторных последовательностей по изобретению будет очевидно для специалистов и описано в литературе, например 81г|Цта11ег апб Vедепе^, /еЮсНпП Гиг ЫагигГогасйипд 48с (1993), 673-688; КаЫ, 1. М1сгоЫо1. В1о1есЬпо1. 11 (1995), 449-460 и ссылки, приведенные там.

С другой стороны, упомянутый протеин может представлять собой измеряемый маркер, например люциферазу, зеленый флуоресцентный протеин или β-галактозидазу. Данный вариант осуществления особенно полезен для простого и быстрого скрининга на соединения и вещества, описанные ниже, которые способны модулировать экспрессию гена К1. Например, трансгенное растение может быть культивировано в присутствии и в отсутствие исследуемого соединения, для того чтобы определить, влияет ли это соединение на экспрессию генов, контролируемых регуляторными последовательностями по изобретению, которая может быть измерена, например, путем измерения экспрессии вышеупомянутого маркера. Специалистам будет также совершенно очевидно, что могут быть использованы другие маркерные гены, кодирующие, например, селектируемый маркер, который обеспечивает прямую селекцию соединений, индуцирующих или ингибирующих экспрессию упомянутого маркера.

Регуляторные последовательности по изобретению могут быть также использованы в способах на основе антисмыслового принципа. Антисмысловая РНК может представлять собой короткую (обычно по меньшей мере 10, предпочтительно по меньшей мере 14 нуклеотидов и возможно до 100 или более нуклеотидов) нуклеотидную последовательность, составленную таким образом, чтобы она была комплементарна части специфической последовательности мРНК и/или ДНК гена, представляющего интерес. В литературе описаны стандартные методики, относящиеся к антисмысловой технологии; см., например, К1апп, Р1ап! Р11умо1. 112 (1996), 1321-1330 и выше. После транскрипции последовательности ДНК в антисмысловую РНК антисмысловая РНК связывается со своей целевой последовательностью внутри клетки, таким образом ингибируя трансляцию мРНК и даунрегулируя экспрессию протеина, кодируемого мРНК.

В следующем варианте осуществления изобретение относится к нуклеиново-кислотным молекулам размером по меньшей мере 15 нуклеотидов, специфически гибридизирующимся с регуляторной последовательностью, описанной выше, или с ее комплементарной нитью. Специфическая гибридизация происходит предпочтительно в жестких условиях и не включает или почти не включает перекрестной гибридизации с нуклеотидными последовательностями, не имеющими регуляторных свойств или имеющими, по существу, другие регуляторные свойства. Такие молекулы нуклеиновой кислоты могут использоваться в качестве зондов и/или для контроля экспрессии генов. Технология нуклеиново-кислотных зондов хорошо известна специалистам, которые знают, что такие зонды могут иметь различную длину. Предпочтительными являются нуклеиново-кислотные зонды размером от 17 до 35 нуклеотидов. Безусловно, могут также использоваться нуклеиновые кислоты размером до 100 и более нуклеотидов. Нуклеиново-кислотные зонды по изобретению могут применяться для различных целей. С одной стороны,

- 15 008599 они могут использоваться в качестве ПЦР-праймеров для амплификации регуляторных последовательностей по изобретению. Другое применение - в качестве гибридизационного зонда для идентификации регуляторных последовательностей, гибридизирующихся с регуляторными последовательностями по изобретению, путем гомологичного скрининга геномных библиотек ДНК. В предпочтительном варианте осуществления изобретения молекулы нуклеиновй кислоты, комплементарные регуляторной последовательности, описанной выше, могут быть также использованы для репрессии экспрессии гена, включающего такие регуляторные последовательности, например, за счет антисмыслового, косупрессивного или трехспирального эффекта, или для конструирования соответствующих рибозимов (см., например, ЕРВ10291533, ЕР-А10321201, ЕР-А20360257), которые специфически расщепляют (пре)-мРНК гена, включающего регуляторную последовательность по изобретению. Выбор соответствующих целевых сайтов и соответствующих рибозимов может быть проделан, как описано, например, в δίοίпеске, Р|Ьохутс5. Ме11юбк ίη Се11 Вю1оду 50, Са1ЬгаП11 е1 а1. ебк Асабетк Ргекк, 1пс. (1995), 449-460. Кроме того, специалистам хорошо известно, что в такой нуклеиново-кислотный зонд можно также ввести метку в виде соответствующего маркера для специфических целей, например для обнаружения присутствия молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению в образце, взятом из организма.

Вышеописанные молекулы нуклеиновй кислоты могут представлять собой ДНК или РНК или их гибрид. Кроме того, упомянутая молекула нуклеиновой кислоты может содержать, например, тиоэфирные связи и/или нуклеотидные аналоги, традиционно используемые в олигонуклеотидных антисмысловых методиках; см. выше.

Данное изобретение также относится к векторам, в частности плазмидам, космидам, вирусам и бактериофагам, традиционно используемым в генной инженерии, которые включают регуляторную последовательность или соответствующую рекомбинантную молекулу ДНК по изобретению.

Предпочтительно упомянутый вектор представляет собой вектор экспрессии и/или вектор, дополнительно включающий селективный маркер растений. Например, подходящие селективные маркеры см. выше. Для конструирования рекомбинантных векторов могут быть использованы способы, хорошо известные специалистам, см., например, методики, описанные в 8атЬтоок, Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬотакгу Мапиа1, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬота1огу (1989) Ν.Υ. и АикиЬе1, СштеШ РтоФсо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Сгееп РиЬйкЫпд Аккос1а1ек апб \УПеу Шеткскпсе, Ν.Υ. (1989). В альтернативе, рекомбинантные молекулы ДНК и векторы по изобретению могут быть реконструированы в липосомы для доставки в целевые клетки.

Данное изобретение также относится к клеткам-хозяевам, трансформированным регуляторной последовательностью, молекулой ДНК или вектором по изобретению. Упомянутые клетки-хозяева могут быть прокариотическими или эукариотическими. Регуляторная последовательность, вектор или рекомбинантная молекула ДНК по изобретению, присутствующая в клетке-хозяине, может быть встроена в ее геном или может поддерживаться во внехромосомной форме. Клетка-хозяин может быть любой прокариотической или эукариотической клеткой, такой как бактериальная клетка, клетка насекомого, грибковая, растительная клетка или клетка животного или человека. Предпочтительными клетками являются растительные.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу производства трансгенных растений, растительных клеток или растительных тканей, включающему введение молекулы нуклеиновой кислоты, рекомбинантной молекулы ДНК или вектора по изобретению в геном упомянутого растения, растительной клетки или растительной ткани. Для экспрессии гетерологичной последовательности ДНК под контролем регуляторной последовательности по изобретению в растительных клетках могут быть использованы дополнительные регуляторные последовательности, например поли-А-хвост может быть слит, предпочтительно 3'-окончанием, с гетерологичной последовательностью ДНК, см. также выше. Дополнительные возможности включают присоединение транскрипционных или трансляционных энхансеров, которые увеличивают экспрессию генов, или последовательностей, которые увеличивают стабильность мРНК. Способы введения чужеродной ДНК в растения, растительные клетки и растительную ткань описаны выше.

Таким образом, данное изобретение также относится к трансгенным растительным клеткам, которые содержат предпочтительно стабильно встроенную в геном регуляторную последовательность, рекомбинантную молекулу ДНК или вектор по изобретению. Кроме того, данное изобретение также относится к трансгенным растениям и растительной ткани, включающей вышеописанные трансгенные растительные клетки.

Кроме того, данное изобретение относится к способу идентификации соединения для защиты растений, включающему следующие этапы:

(a) культивирование клетки растения или ткани растения или выращивание растения, содержащего рекомбинантную молекулу ДНК по данному изобретению, в присутствии тестируемого соединения или образца, содержащего тестируемые соединения, в условиях, которые обеспечивают экспрессию указанной молекулы ДНК;

(b) идентификацию или верификацию образца и соединения, соответственно, как непригодного или пригодного для защиты растения на основании их способности вызывать супрессию или активацию и/или улучшение экспрессии указанной молекулы ДНК в указанном растении, клетке растения или ткани

- 16 008599 растения.

Выражение считывающая система в контексте данного изобретения означает последовательность ДНК, которая после транскрипции и/или экспрессии в клетке, ткани или организме обеспечивает измеряемый и/или селектируемый фенотип. Такие считывающие системы хорошо известны специалистам и включают, например, рекомбинантную молекулу ДНК и маркерные гены, описанные выше.

Выражение множество соединений в способе по изобретению следует понимать как множество веществ, которые могут быть или могут не быть идентичны. Упомянутое соединение или множество соединений могут быть неорганическими или органическими, природными или искусственными соединениями и могут содержаться, например, в образцах, например клеточных экстрактах, например, из растений, животных или микроорганизмов. Кроме того, упомянутое соединение(соединения) может быть известно в науке, но до настоящего времени не в качестве соединения, способного подавлять или активировать и/или усиливать транскрипцию гена К1. Множество соединений может, например, добавляться в среду культуры или вводиться путем инъекции в растение, растительные клетки или ткани или распыляться на растение или вводиться в почву.

Если образец, содержащий соединение или множество соединений, идентифицирован способом по изобретению, то можно изолировать соединение из исходного образца, идентифицированного как содержащий соединение, способное подавлять или активировать и/или усиливать транскрипцию гена К1, или можно дополнительно разделить исходный образец, например, если он включает множество различных соединений, чтобы уменьшить число различных соединений на один образец, и повторить осуществление способа с частями исходного образца. В зависимости от сложности образцов, этапы, описанные выше, могут выполняться несколько раз, предпочтительно до тех пор, пока образец, идентифицированный способом по изобретению, не будет содержать лишь ограниченное количество веществ или только одно вещество. Предпочтительно упомянутый образец содержит вещества со сходными химическими и/или физическими свойствами, и наиболее предпочтительно упомянутые вещества являются идентичными. Предпочтительно соединение, идентифицированное вышеописанным способом, смешивают с дополнительными веществами для получения формы, удобной для применения в селекции растений или обработки растительных клеткок и тканевых культур.

Соединения, которые могут быть протестированы и идентифицированы способом по изобретению, могут представлять собой библиотеки экспрессии, например библиотеки экспрессии кДНК, пептиды, протеины, нуклеиновые кислоты, антитела, малые органические соединения, гормоны, пептидомиметики, ПНК и т.п. (Мбиег, Уинге Мебкше 1 (1995), 879-880; Нирр. Се11 83 (1995), 237-245; С1ЬЬк, Се11 79 (1994), 193-198 и ссылки, приведенные выше). Кроме того, гены, кодирующие предполагаемый регулятор гена К1, могут быть идентифицированы с использованием, например, инсерционного мутагенеза, использующего, например, таргетинг-векторы генов, известные в науке (см., например, НауакЫ. 8с1еисе 258 (1992), 1350-1353; Ргйхе аиб \Уа1беп. Сеие асбуабои Ьу Τ-ΌΝΆ 1аддшд. Ιη Мебюбк ίη Мо1еси1аг Вю1оду 44 (Сагбаиб, К.М.А. аиб Иауеу, М.К., ебк). То1о\га: Нишаи Ргекк (1995), 281-294) или маркировки транспозонами (Сбаиб1ее, Р11укю1оща Р1аи1агиш 78 (1990), 105-115). Упомянутые соединения также могут быть функциональными производными или аналогами известных ингибиторов или активаторов. Способы получения химических производных и аналогов хорошо известны специалистам и описаны, например, в ВеЙ81ет, НаибЬоок ок Огдашс Сбеш18бу, 8ргшдег ебйюи №\ν Уогк 1ис., 175 ИйЬ Ауеиие, №\ν Уогк, Ν.Υ. 10010 И.8.А. аиб Огдашс 8уи1бе818, ^беу, №\ν Υо^к, И8А. Кроме того, эффекты упомянутых производных и аналогов могут быть проанализированы способами, известными в биотехнологии. Кроме того, могут быть использованы пептидомиметики и/или компьютеризованное конструирование соответствующих производных и аналогов, например, способами, описанными выше.

Определение того, способно ли соединение подавлять или активировать и/или усиливать транскрипцию гена К1, может быть произведено, например, в растениях путем наблюдения за геномрепортером. Это может быть также выполнено путем наблюдения за фенотипическими характеристиками трансгенного растения по изобретению после контакта с соединениями и сравнения их с характеристиками растений дикого типа. В дополнительном варианте осуществления упомянутые характеристики могут сравниваться с характеристиками трансгенного растения после контакта с соединением, которое известно своей способностью или неспособностью подавления или активирования и/или усиления экспрессии гена К1 или активности протеина. Соединения, идентифицированные способом по изобретению, предположительно должны быть весьма благоприятными, так как промоторы, которые были известны до сих пор, имеют лишь ограниченное использование из-за отсутствия или нестрогой специфичности их регуляторных последовательностей к патогену.

Ингибитор или активатор, идентифицированный вышеописанным способом, может оказаться полезным в качестве гербицида, пестицида и/или регулятора роста растений. Таким образом, в следующем аспекте изобретение относится к соединению, полученному или идентифицированному способом по изобретению. Такие полезные соединения могут включать, например, действующие извне факторы, которые связываются с регуляторной последовательностью по изобретению. Идентификация действующих извне факторов может проводиться с использованием стандартных способов (см., например, 8ашЬгоок, выше, и Аи8иЬе1, выше). Для определения связывания протеина с регуляторной последовательностью по

- 17 008599 изобретению могут быть использованы стандартные анализы методом футпринтинга ДНК и/или нативного гель-шифта. Для идентификации действующего извне фактора, который связывается с регуляторной последовательностью по изобретению, регуляторная последовательность должна использоваться как аффинный реагент в стандартных способах очистки протеинов или как зонд для скрининга библиотеки экспрессии. Если действующий извне фактор идентифицирован, можно добиться модуляции его связывания с регуляторными последовательностями по изобретению, начиная, например, со скрининга на ингибиторы связывания действующего извне фактора с регуляторными последовательностями по изобретению. Затем может быть достигнута активация или репрессия генов К1 в растениях путем применения действующего извне фактора (или его ингибитора) или гена, кодирующего его, например, в векторе для трансгенных растений. Кроме того, если активной формой действующего извне фактора является димер, то могут быть получены доминант-негативные мутанты действующего извне фактора, для того чтобы ингибировать его активность. Кроме того, после идентификации действующего извне фактора могут быть идентифицированы другие компоненты маршрута активации (например, сигнальная трансдукция) или репрессии гена под контролем регуляторных последовательностей по данному изобретению. Затем можно добиться модуляции активностей этих компонентов, для того чтобы разработать дополнительные лекарственные средства и способы для модулирования экспрессии гена под контролем регуляторных последовательностей по данному изобретению.

Предпочтительно соединение, идентифицированное вышеописанным способом, или его аналог или производное смешивают с дополнительными веществами для получения формы, удобной для применения в селекции растений или в растительных клетках и тканевых культурах. Например, оно может быть смешано с агрономически приемлемым носителем, известным в науке. Композиция для защиты растений может быть приготовлена с использованием вышеописанного способа по изобретению и синтеза соединения, идентифицированного как ингибитор или активатор, в количестве, достаточном для использования в агрономии. Таким образом, данное изобретение также относится к способу получения агрономической композиции для защиты растений, включающей вышеописанные этапы способа по изобретению и синтез соединения, идентифицированного этим способом, или его аналога или производного.

В композиции для защиты растений по изобретению соединение, идентифицированное вышеописанным способом, может быть предпочтительно смешано обычными способами с веществами, традиционно используемыми, например, для производства гербицидов и пестицидов, или средствами, способными индуцировать системную приобретенную устойчивость (8АК). Например, могут быть использованы некоторые добавки, известные специалистам, включающие стабилизаторы или вещества, улучшающие поглощение растительной клеткой, растительной тканью или растением, например карборунд или 0,01% раствор 8Ό8 (натрия додецилсульфата).

Следующий вариант осуществления изобретения относится к способу идентификации и получения кДНК, кодирующей фактор авирулентности или вирулентности патогена, включающему следующие этапы:

(a) скрининг с помощью полипептида К1 по данному изобретению или его фрагмента из соответствующей библиотеки экспрессии кДНК, кодирующей возможный фактор авирулентности или вирулентности патогена;

(b) идентификация кДНК патогена как кодирующей фактор авирулентности или вирулентности по способности ее продукта супрессировать или активировать транскрипцию гена полипептида К1.

Кроме вышеописанных возможностей использования нуклеиново-кислотных молекул по изобретению для генетического конструирования растений с модифицированными характеристиками и для идентификации гомологичных молекул описанные молекулы нуклеиновй кислоты могут быть также использованы для некоторых других целей, например для идентификации нуклеиново-кислотных молекул, кодирующих протеины, которые взаимодействуют с протеинами К1, описанными выше. Это осуществимо при помощи аналитических методик, хорошо известных в науке, например, описанных в 8соПе1б (8с1епсе 274 (1996), 2063-2065), путем использования так называемой дрожжевой двугибридной системы. В этой системе протеин, кодируемый нуклеиново-кислотными молекулами по изобретению, или его часть связаны с ДНК-связывающим доменом фактора транскрипции САБ4. Дрожжевой штамм, экспрессирующий этот слитый протеин и содержащий ген-репортер 1ас2, управляемый соответствующим промотором, который узнается фактором транскрипции САЬ4, трансформируют библиотекой кДНК, которая будет экспрессировать растительные протеины или их пептиды, слитые с доменом активации. Таким образом, если пептид, кодируемый одной из кДНК, способен взаимодействовать со слитым пептидом, представляющим собой пептид протеина по изобретению, то комплекс способен к прямой экспрессии гена-репортера. Таким образом, молекулы нуклеиновй кислоты по изобретению и кодируемые ими пептиды могут быть использованы для идентификации пептидов и протеинов, взаимодействующих с протеинами К1. Этот способ также может быть использован для идентификации ингибиторов и активаторов, описанных выше.

Другие способы идентификации соединений, взаимодействующих с протеинами по изобретению или нуклеиново-кислотными молекулами, кодирующими такие молекулы, представляют собой, например, ш У1!го скрининг с системой фагового дисплея, а также аналитические методики связывания на фильтре или измерение взаимодействия в реальном времени с использованием, например, аппарата

- 18 008599

В1Асоге (Рйагтааа); см. ссылки, приведенные выше.

Подобные задачи решает так называемая трехгибридная система. Дрожжевая двугибридная система впервые была описана Р1е1бк апб 8опд (№а!иге 340 (1989), 245-246; см. также обзор ^ба1, М., ш Вайе1, Р.Ь апб Р1е1б8, 8. (ебв.), Тйе уеав! Що-НуЬпб вуйет. ОхГогб Итуегвйу Ргевв, №е\\' Уогк, ΝΥ, (1997), 109147). Модифицированная версия дрожжевой двугибридной системы была описана Суигш, Се11 75 (1993), 223-232; Ζе^νо8, Се11 72 (1993), 223-232. В кратком изложении, используют домен полипептида в качестве затравки для связывания соединений. Положительные опыты затем селектируют по их способности расти на пластинах в условиях дефицита лейцина, а затем испытывают на способность к голубому окрашиванию на пластинах с Х-да1, как описано в вышеуказанной публикации более подробно; см. также \¥О 95/31544. Модифицированной версией является обратная дрожжевая двугибридная система, обеспечивающая возможность отбора дефектных аллелей на способность к взаимодействию, с использованием методики отрицательного отбора, как описано, например, в νίύη1, Ргос. №111 Асаб 8с1. И8А 93 (1996), 10321-10326; ^ба1, Ргос. №а!1 Асаб 8а. И8А 93 (1996), 10315-10320. Эта система использует контрселектируемый ген-репортер ИКА3. Дрожжевые клетки, экспрессирующие Ига3р, превращают соединение 5фтороротовую кислоту (РОА) в токсичное производное 5-фторурацил. Таким образом, двугибидное взаимодействие, которое приводит к активации гена-репортера ИКА3, может быть контрселектировано в присутствии РОА и потеря функциональных мутантов может быть специфически селектирована из большого пула аллелей дикого типа.

Другим удобным способом может быть, например, дрожжевая трехгибридная система, описанная 8епСир!а, Ргос. №а!1. Асаб. 8а. И8А 93 (1996), 8496-8501. Дрожжевая трехгибридная система селекции была разработана для изолирования генов из протеинов, которые взаимодействуют с РНК, и для изучения взаимодействий РНК-протеин. Эта система, основанная на дрожжевой двугибридной системе, состоит из ДНК-связывающего домена, слитого с известным РНК-связывающим протеином, домена активации, слитого с предполагаемым РНК-связывающим протеином, и гибридной РНК. Транскрипция геноврепортеров происходит только в том случае, если оба гибридных протеина взаимодействуют с гибридной РНК. В обратной трехгибридной системе взаимодействие протеинов с гибридной РНК приводит к экспрессии гена-репортера, продукт которого токсичен для дрожжевых клеток. Все эти методики могут быть использованы в вышеописанном способе по данному изобретению с использованием протеина К1 или его пептидных фрагментов в качестве затравки для идентификации и получения фактора авирулентности или вирулентности и кодирующих их кДНК или их частей. Способы получения последовательности ДНК клонов, оказавшихся положительными по результатам скрининга, известны специалистам и описаны в приведенных выше публикациях.

Данное изобретение также относится к кДНК и кодируемому ею продукту, полученному или идентифицированному вышеописанным способом.

Изобретение также относится к композициям, содержащим по меньшей мере одну из вышеупомянутых нуклеиново-кислотных молекул и/или содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, комплементарную такой молекуле нуклеиновой кислоты, вектор по изобретению, протеин К1 по изобретению или его иммунологически или биологически активный фрагмент или антитело или аптамер, специфически узнающий такой протеин или фрагмент; регуляторную последовательность, или рекомбинантную ДНК, или соответствующий вектор по изобретению, соединение, сконструированное ориентированным в соответствии с протеином по изобретению и/или идентифицированное способом, описанным выше, и/или антитело, специфически узнающее такое соединение или регуляторную последовательность по изобретению, и, возможно, приемлемые средства для обнаружения или приемлемые средства для культивирования растительной клетки и ткани.

Диагностические композиции могут использоваться в способах обнаружения экспрессии гена К1 путем обнаружения присутствия соответствующей мРНК, которые включают изолирование мРНК из клетки и контактирование полученной мРНК с зондом, представляющим собой нуклеиново-кислотный зонд, описанный выше, в гибридизирующих условиях, обнаружение присутствия мРНК, гибридизировавшейся с зондом, и, следовательно, обнаружение экспрессии гена клеткой. Другие способы обнаружения протеина по изобретению включают иммунотехнологии, хорошо известные специалистам, например ферментосвязанный иммуносорбентный анализ.

Кроме того, данное изобретение относится к комплекту, содержащему по меньшей мере один из вышеупомянутых элементов, т. е. нуклеиново-кислотных молекул, векторов, протеинов, соединений, антител или аптамеров по изобретению. Комплект по изобретению может содержать дополнительные ингредиенты, такие как селективные маркеры и компоненты для селективных сред, пригодных для выработки трансгенных растительных клеток, растительной ткани или растений. Кроме того, комплект может включать буферы и субстраты для генов-репортеров, которые могут присутствовать в рекомбинантном гене или векторе по изобретению. Комплект по изобретению может быть успешно использован для осуществления способа по изобретению и, среди прочего, может быть использован для различных целей, описанных здесь, например для диагностических или исследовательских целей. Компоненты комплекта по изобретению могут быть упакованы отдельно в ампулах или совместно в контейнерах или мультиконтейнерах. Производство комплекта предпочтительно осуществляется по стандартным методикам, из

- 19 008599 вестным специалистам. Комплект или его ингредиенты по изобретению могут быть использованы в культурах растительных клеток и растительных тканей, например, в любом из вышеописанных способов для обнаружения ингибиторов и активаторов генов Я1. Комплект по изобретению и его ингредиенты предположительно будут весьма полезными для селекционирования новых сортов, например растений, показывающих улучшенные свойства, такие как питательная ценность или устойчивость к болезням.

Специалистам будет также совершенно очевидно, что регуляторные последовательности, рекомбинантные молекулы ДНК, векторы и соединения по данному изобретению могут быть использованы для получения трансгенных растений с желаемым признаком; см. обзор в ПРТЕС Р1ап1 Ргобис! & Сгор Вю1есКпо1од\ 13 (1995), 312-397.

Кроме того, молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению можно использовать в качестве молекулярных маркеров в селекции растений. Сверх того, чрезмерная экспрессия нуклеиново-кислотных молекул по изобретению может быть полезна для видоизменения или модификации взаимодействия растение/патоген. Выражение патоген включает, например, бактерии, вирусы и грибки, а также протозоа. Предпочтительно упомянутый патоген представляет собой Р. 1пГее!апе.

Кроме того, данное изобретение относится к использованию молекулы нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина, протеина, регуляторной последовательности, рекомбинантной ДНК-молекулы аптамера, вектора, соединения аптамера и/или антитела по изобретению для использования в способах скрининга для идентификации вирулентных или авирулентных генов патогенов, для скрининга соединений для защиты растений, для индуцирования устойчивости к патогену в растениях, в качестве маркера в способе селекции растений при помощи маркеров. Регуляторную последовательность или рекомбинантную молекулу ДНК по данному изобретению предпочтительно используют для экспрессии гетерологичной последовательности ДНК.

Эти и другие варианты осуществления представлены в описании и примерах данного изобретения. Дополнительная литература, касающаяся любого из способов, назначений и соединений, используемых по изобретению, может быть найдена в публичных библиотеках, например, с использованием электронных устройств. Например, может быть использована публичная база данных Мей1ше, доступная в Интернет, в частности по адресу 1Шр://\у\у\у.псЫ.п11п.ш11.доу/РиЬМе0/1пе01те.1ит1. Другие базы данных и адреса, такие как 1Шр://\у\у\у.псЫ.п1т.пП1.доу/. 1Шр://\у\у\у.тГоЫодеп.Гг/. 1Шр://\у\у\у.Гт1.с11/Ью1оду/ге5еагс11_1оо15.1ит1. 11Цр:/Лу\у\у.йдг.огд/. известны специалистам и могут быть также найдены, например, через 1Шр://\у\у\у.1усое.сот. Обзор патентной информации по биотехнологии и список релевантных источников патентной информации, полезных для ретроспективного поиска и для осведомленности о текущем уровне развития, приведен в Ветке, ПВТЕСН 12 (1994), 352-364.

Далее изобретение описано при помощи следующих неограничивающих фигур и примеров.

Описание фигур

Фиг. 1. Генетическая и физическая карта области Я1. СР21 и СР179 представляют собой маркеры, используемые для конструирования карты высокого разрешения области Я1. 8РиИ237 и АГЬР1 представляют собой преобразованные маркеры АГЬР (Мекеет е1 а1. 1995, Эе 1опд е1 а1. 1997), фланкирующие Я1. Генетические расстояния приведены в сМ. Сое8 - это космидный клон, селектированный при помощи 8РиИ237. Остальные клоны в физической карте представляют собой ВАСе длиной от 70 до 90 кЬ. Сплошные черные полосы: ВАСе из хромосомы, несущей Я1. Серые полосы: ВАСе из хромосомы, несущей г1. Белая полоса: происхождение ВАС не определено. Картированные концы ВАС помечены числом рекомбинантов, отделяющих этот конец ВАС от Я1. Концы космиды и ВАС, используемые для прогулки по хромосоме, отмечены вертикальными стрелками. ЯСЬ: фрагмент, подобный гену устойчивости.

Фиг. 2. ПЦР-амплификация 1,4 кЬ фрагмента гена Я1 с использованием аллельспецифических праймеров 76-2еГ2 и 76-28Я и матрицы ДНК (А) Эеейсе; (В) устойчивого родителя Р41; (С) восприимчивого родителя Р40; (Ό) трансгенного растения Эеейсе 10-2_5; (Е) клон ВАС ВА87617, несущий аллель Я1; (Г), (С), (Н), (Ι), (1) клоны ВАС ВА122р13, ВА12101, ВА76011, ВА47Р2 и ВА27с1, соответственно, (К) отрицательный контрольный опыт.

Фиг. 3. Тест на комплементацию Я1. Симптомы заболевания показаны через 9 дней после инокуляции молодых листьев от (А) восприимчивого ИеепСе; (В) трансгенной линии Иеепсе № 10-2_5, трансформированной клоном д10-2, и (С) устойчивого родителя Р41 (Я1г1).

Фиг. 4. Ген Я1. (А) Структурная организация. Экзоны показаны в виде прямоугольников, а интроны в виде ломаный линий. (В) Дедуцированная аминокислотная последовательность. Мотив лейцинового зиппера подчеркнут дважды. Область ЬРК выделена курсивом. Предсказанные киназные мотивы выделены рамками, а сайты №гликозилации выделены жирным шрифтом. Законсервированные мотивы РЬРЬ, СГЬУ и ЬНИ, специфические для растительных протеинов устойчивости, подчеркнуты. Для аминокислот использованы стандартные однобуквенные коды.

Фиг. 5. Схематическое представление области хромосомы 5 вокруг локуса Я1. Рамки, заштрихованные вертикальными линиями, показывают гомологичные области между хромосомами, несущими аллели Я1 и г1. Функциональная аллель Я1.1 и локус Я1.2/г1.2 выделены незаштрихованными рамками. Ломаная линия показывает делецию, присутствующую в г1-хромосоме по сравнению с Я1-хромосомой.

- 20 008599

Примеры

Материал и способы

Растительный материал.

Потомство Е1 кросса между гетерозиготными диплоидными клонами Н79.1506/1 (К1г1) и Н80.696/4 (г1г1), называемыми Р41 и Р40, соответственно (беЬйатб! е! а1. 1989, Ьеопагбк-ЗсЫррегк е! а1. 1992), использовали для генетического картирования К1 высокого разрешения. Рекомбинанты в маркерном интервале 6Ρ21-6Ρ179, произошедшие от родителя Р41 (К1г1), селектировали, как описано у Меккет е! а1. 1995. Гибридный клон Р6/210, полученный кроссом Р41 х Р40 (Ье1к!ег е! а1. 1997), который несет К1 в гетерозиготном состоянии, использовали для конструирования геномных библиотек космид и ВАС. Родитель Р41 (К1г1) использовали для конструирования библиотек кДНК.

Тест на устойчивость к Ρйу!οрй!йο^а 1пГек!апк.

Устойчивость к изоляту Ρ. 1пГек!апк, содержащему соответствующий фактор авирулентности Аут1 (раса 4) определяли, как описано у Ьеопагбк-ЗсЫррегк е! а1. 1992, за исключением того, что для инокуляции использовали целые листья вместо дисков листьев. Присутствие или отсутствие гиперчувствительной реакции (НК) измеряли через 8-10 дней после инокуляции.

Геномные библиотеки картофеля.

Библиотеку ВАС приобрели в ΟΟΝ Вюкаепсе АО (Не1бе1Ьегд, Сегтапу). Библиотека была сконструирована из частично расщепленной НтбШ высокомолекулярной геномной ДНК клона Р6/210 в бинарном векторе рСБО04541 (Чопек е! а1. 1992), как описано у Меккет е! а1. 2000. Библиотека ВАС состоит из 101376 клонов со средним размером инсерции 70 кЬ. Колонии хранили в 264-х 384-микротитровальных пластинах (Сепейх, Οχΐάτά, иК) в среде 2ΥΤ (ЗатЬгоок е! а1. 1989) с замораживающим буфером (5,5% (вес./об.) глицина, 7 мМ (ΝΗ^Ο/ΐ, 1,5 мМ Ыа-цитрата, 0,3 мМ Μ§8Ο₄, 13 мМ К^ГО^ 27 мМ ^^Ο/ΐ).

Космидную библиотеку примерно из 150000 клонов конструировали с использованием стандартной методики (ЗатЬгоок е! а1. 1989) из частично расщепленной Заи3 А[ геномной ДНК (17-23 кЬ фрагменты) Р6/210, в том же векторе (сайт клонирования ВатН1), что и библиотека ВАС. Космиды упаковывали с использованием экстракта 61§араск II Со1б Ρаскад^ηд ех!гас! (З!га!адепе, СА, иЗА) и трансфектировали в штамм Е. сой ЗиКЕ™ (8!га1адепе, СА, иЗА). Плазмидную ДНК экстрагировали из пулов ~1500 бактериальных колоний (ЗатЬгоок е! а1. 1989). Было сгенерировано 103 космидных пула, которые подвергли скринингу путем ПЦР с использованием ЗΡи^237-специфических праймеров (Эе 1опд е! а1. 1997). Положительные пулы подвергали скринингу на пластинах путем гибридизации колоний с использованием стандартных протоколов (ЗатЬгоок е! а1. 1989).

Скрининг библиотек ВАС и конструирование контига.

Фильтры колоний высокой плотности для скрининга на основе гибридизации ВАС-библиотеки приготовили с применением робота ВюСКГО (Οχ&γ6, иК). Клоны разместили двойными пятнами с использованием массива 5х5 в количестве 6х384 массивов на 22,5х22,5 см нейлоновую мембрану (ΡА^^, Вюбупе, Ροήктοи!й, иК). Каждый массив 5x5 содержал 2x12 колоний, при этом контрольное положение в массиве занимал клон рЗ\У1 (ΡΕ Вюкук!етк, Еок!ег Сйу, СА иЗА). Такой шаблон размещения позволил представить 27648 колоний дважды на одном фильтре. Скрининг библиотеки проводили с использованием набора из четырех фильтров, содержащих 101376 клонов. Фильтры с колониями инкубировали в среде ЬВ в течение 15 ч при 37°С и обработали для гибридизации колоний по стандартной методике (ЗатЬгоок е! а1. 1989). Гибридизацию фильтра выполняли, как описано у СеЬйагб! е! а1. 1989, за исключением того, что 300-пикограммовую контрольную вставку рЗ\У1 маркировали и гибридизировали вместе с зондом для облегчения определения адресов положительных клонов. Плазмидную ДНК выделяли из положительных клонов, а вставки секвенировали с обоих концов с использованием в качестве праймеров секвенирования Т3 и Т7 олигонуклеотидов. Информацию последовательности ДНК концов ВАС-вставок использовали для конструирования специфических пар праймеров ПЦР. Продукты ПЦР амплифицировали этими праймерами, а соответствующие ВАС-матрицы использовали в качестве зондов для новой гибридизации на фильтре для идентификации перекрывающихся ВАС-клонов, для ориентации перекрывающихся ВАС-клонов по отношению друг к другу и для картирования в рекомбинантных растениях. Области перекрывания подтверждали путем секвенирования продуктов ПЦР. Направление удлинения контига проверяли путем генетического картирования с использованием рекомбинантных растений и маркерного анализа на основе ΒΕΕΡ (анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов) или ПЦР. Для определения размера ВАС-вставок ВАС-ДНК расщепляли ИоЙ и фрагменты отделяли путем гельэлектрофореза в импульсном поле на СНЕЕ ОКШ (ВюКаб, Негси1ек, СА, иЗА) в течение 12 ч при 11°С с временем исходного импульса 5 с и временем конечного импульса 10 с, при угле 120° и напряженности электрического поля 6 В/см.

Изоляция ВАС-ДНК.

ВАС-ДНК экстрагировали с использованием набора ОМГШег Ρ^акт^б Ρи^^Г^саΐ^οη К1! 100 Оа^еп Нйбеп, Сегтапу) согласно инструкциям изготовителя с незначительными модификациями. Одиночную колонию прекультивировали в жидкой среде ЬВ в течение 8 ч при 37°С. 75 мкл прекультуры добавили в 75 мл среды ЬВ и дополнительно инкубировали 15 ч при 37°С. Перед пропусканием супернатанта через ^IАГ^1!е^ дополнительно провели этап центрифугирования для удаления обломков бактериальных клеток.

- 21 008599

Получение зондов из ВАС-вставок.

1,5 мкг ВАС-ДНК расщепили до конца посредством ΗίηάΙΙΙ и ЕсоК1 и отделили от вектора в 0,8% низкоплавком геле агарозы (8еа Р1ацие СТС Адагоке, Вюртойисй, Коск1апй, Маше, И8Л). Инсертированную ДНК отделили от геля с использованием системы СЕЬаке (Еркепйе Тесйпо1од1ек или Вюхут) в соответствии с инструкциями изготовителя. ДНК осадили этанолом, растворили в воде и маркировали ³²РйСТР путем случайного примированного маркирования (БешЬетд апй УодеМет 1984).

Субклонирование ВАС ВА87Й17.

мкг ВАС-ДНК частично расщепили посредством 1и Ткр5091 в течение 15 мин при 65°С и отделили по размеру в 0,8% низкоплавком геле агарозы (8еа Р1ацие СТС Адагоке, Вюртойисй, Коск1апй, Мате, И8А). Фрагменты размером ~10 кЬ элюировали с использованием системы СЕЬаке (Еркепйе Тесйпо1од1ек, Майкоп, И8А) в соответствии с инструкциями изготовителя. Очищенные фрагменты клонировали в бинарный вектор рСЬО04541, линеаризованный посредством ЕсоК1, дефосфорилировали с использованием фосфатазы 8НК1МР (Косйе, Сегтапу) и трансформировали в штамм Е. сой ЭН10В (ЫГе Тесйпо1од1ек, И8А). Двести рекомбинантных колоний собрали в микротитровальные пластины.

Конструирование и скрининг библиотек кДНК.

Срезанные побеги ~8-недельных растений родителя Р41 (К1г1) и восприимчивого сорта Эекнсе инфицировали расой 4 Р. шГейапк и содержали под стеклянным цилиндром (для увеличения влажности) в воде в камере роста при 17°С на свету в течение 16 ч. В этих условиях листья восприимчивого контрольного растения заросли мицелием Р. шГейапк через 8 дней. Равные количества неинфицированных листьев родителя Р41 и инфицированных листьев собрали через 2 ч, 19 ч, 3 дня, 7 дней и 9 дней после инокуляции. Изолировали поли А⁺-РНК с использованием набора КЫеаку Р1ап! М1ш Κίΐ или набора Ойдо1ех 111Κ.ΝΑ М1ш Κίΐ (О|адеп, Нййеп, Сегтапу) в соответствии с инструкциями изготовителя. Библиотеку кДНК λΖΑΓ II (81та1адепе, СА, И8А) сконструировали из поли А⁺-РНК в соответствии с инструкциями изготовителя. Различные препараты кДНК собрали в пул перед лигированием в вектор λΖΑР. 5х10⁵ рГи (бляшкообразующих единиц) поместили в пластины и подвергли скринингу путем гибридизации бляшек (8атЬгоок е! а1. 1989) с использованием в качестве зонда вставок ВАС ВА121о1 и ВА76о11.

5'-Быстрая амплификация концов кДНК (анализ КАСЕ).

Целую РНК изолировали из ткани неинфицированных листьев Р41 (К1г1) с использованием набора К№аку Р1ап! М1ш Κίΐ (Р1адеп, Нййеп, Сегтапу) в соответствии с инструкциями изготовителя. Анализ КАСЕ выполняли с 1 мкг целой РНК с применением набора для амплификации 8МАКТ™ Касе с^NΑ Атрййсайоп Κίΐ (С1оп!есй, СА, И8А) в соответствии с инструкциями изготовителя. Вложенные генспецифичные праймеры, используемые для ПЦР-амплификации, представляли собой сначала КТ1-1: 5'-АААСССССТСТТССАААТСТААСАСТ-3' (8 ЕС) ГО N0: 3), а затем КТ2-1: 5'САТСТАСТСАССАТАТСТСАССАСТС-3' (8 ЕС) ГО N0: 4). Конечные ПЦР-продукты реакции КАСЕ клонировали в вектор рСЕМ-Т (Рготеда, СА, И8А). Два независимых клона секвенировали.

Анализ последовательности ДНК.

Обычное секвенирование ДНК проводили при помощи устройства АЭ18 в Мах Р1апск 1пкШи1е Гог Втеейтд Кекеатсй. Применяли секвенирование способом терминирования дидезоксицепей при помощи набора АВ1 РК18М Эуе ТегттаЮг Сус1е 8ециепстд Кеайу Кеасйоп Κίΐ и автоматизированного ДНКсеквенатора АВ1377 (РЕ Вюкуйетк, Бойет Сйу, СА И8А).

Анализ последовательности выполняли с использованием Χν^^ιικο! Раскаде Уеткюп 10.0, Сепейск СотрШет Сгоир (ССС), Майкоп, Χνί^, И8А. Поиск по базам данных последовательностей проводили при помощи В1ак!Х и других алгоритмов, имеющихся в распоряжении №йопа1 Сеп!ег Гог Вю1ес11по1оду 1пГоттайоп, Вейекйа, МО, И8А и сервера ЕхРА8У (Арре1 е! а1. 1994).

Трансформация АдтоЬас!етшт 1итеГас1епк.

Субклон д10 ВАС ВА87Й17 ввели электропорацией в штамм А. 1итеГас1епк БВА4404 по Vеη-^иη апй Ботйе (1989). Три штамма АдтоЬас!етшт, ЬВАд10-2, ЬВАд10-5 и ЬВАд10-23, использовали для трансформации картофеля.

АдтоЬас!епит ШтеГааепк-опосредованная трансформация картофеля и анализ трансгенных растений.

Восприимчивый сорт картофеля Эекнсе использовали во всех опытах по трансформации. АдтоЬас!епит ШтеГатепк-опосредованную трансформацию выполняли, как описано у Косйа-8ока е! а1. (1989), с тем исключением, что среда М8 содержала 250 мг/л клафорана. Канамицин-устойчивые трансгенные растения испытывали полимеразной цепной реакцией (ПЦР) на присутствие вставки д10 с использованием инсертспецифических праймеров 87е (5'-АТТАСААТСССТТСААСТСАС-3' (8ЕЦ ГО N0: 5)) и 87к (5'АССТСТТТСААТТСТТСТССТС-3' (8ЕС) ГО N0: 6)). Условия ПЦР были такие: Та при 55°С в течение 45 с и полимеризация при 72°С в течение 60 с. Трансгенные растения подвергли скринингу К1специфическими праймерами 76-2кГ2 (5'-САСТССТСАСАТАТССТСАСТА-3' (8ЕС) ГО N0: 7)) и 76-28К (5'-СААСССТСССАТСССАСС -3' (8ЕС) ГО N0: 8)), полученными из кДНК с76-2. Условия ПЦР были такие: Та при 55°С в течение 45 с и полимеризация при 72°С в течение 90 с. Тесты на устойчивость к расе 4 Р. тГек(апк проводили с использованием трех листьев от растения в каждом тесте.

- 22 008599

Пример 1. Генетическое картирование локуса К1 с высоким разрешением.

Для облегчения физического картирования локуса К1 селектировали из 588 растений 16 рекомбинантов между маркерами ОР21 и ОР179, фланкирующими К1 (Беопагбз-8сЫррегз е! а1. 1992), и тестировали на устойчивость к расе Р. 1пГ'е8!ап8, несущей соответствующий фактор авирулентности Ауг1. Вместе с 15 рекомбинантами, селектированными ранее в том же интервале (Мекзет е! а1. 1995), в наличии имелось общее количество 31 рекомбинант ОР21-ОР179 из 1049 растений, что соответствует 3,0% частоты рекомбинации (3 сМ). Частота рекомбинаций между ОР21 и К1 и между К1 и ОР179 составила 2,2 и 0,8%, соответственно (табл. 1).

Таблица 1

Число рекомбинантных экземпляров в интервалах ОР21-К1, ОР179-К1 и ОР21-ОР179, селектированных из 1049 растений сегрегирующей популяции Р1

	СР21-К1	СР 179-Ю	СР21-СР179
Число рекомбинантов	23	8	31
Рекомбинанты с генотипом К1г1	12	4	16
Рекомбинанты с генотипом г1г1	11	4	15
Частота рекомбинации (%)	2,2	0,8	3,0

Маркеры 8РБ1)237 и АРБР1, оба картирующие в интервале ОР21-ОР179 ([)е.1опу е! а1. 1997, Мекзет е! а1. 1995), фланкируют локус К1. Оба маркера были отделены от К1 путем одного рекомбинационного события в 1049 растениях (0,1 сМ, фиг. 1).

Пример 2. Прогулка по хромосоме к локусу К1 и идентификация гена-кандидата К1.

Маркер 8РЦО237 использовали в качестве зонда для скрининга космидной библиотеки. Идентифицировали один положительный клон Соз8 (фиг. 1). Концевым секвенированием вставки Соз8 выработали новый маркер, отделенный одним рекомбинационным событием (0,1 сМ) от локуса К1. Путем скрининга ВАС-библиотеки этим маркером идентифицировали ВАС-клон ВА100е13. Тремя рекомбинационными событиями отделили конец ВА100е13, дальний от К1. Конец ВА100е13, ближний к К1, идентифицировал ВА4712. Конец ВА4712, дальний от К1, перекрыли с ВА100е13 и отделили от К1 одним рекомбинационным событием. Ближний конец косегрегировал с К1, как и все последующие анализируемые ВАС-концы (правая часть фиг. 1). Конец ВА47Г2, косегрегированный с К1, идентифицировал ВА27с1. Конец ВА27с1, не перекрывающийся с ВА47Г2, идентифицировал клоны ВА122р13 и ВА121о1. Конец ВА121о1, не перекрывающийся с ВА27с1, показал существенное подобие последовательности (37% идентичности, 56% подобия транслированной аминокислотной последовательности) с геном устойчивости томата РгГ к Рзеиботопаз зугтдае (8а1тегоп е! а1. 1996). Этот подобный гену устойчивости (КОБ) фрагмент использовали в качестве зонда для рескрининга ВАС-библиотеки. КОБ-зонд идентифицировал, в дополнение к ВА122р13, несколько новых положительных клонов, из которых два, ВА87617 и ВА76о11, были подвергнуты дальнейшему анализу. Они содержали полные копии КОБ-гена, который был рассмотрен как возможный К1-кандидат. Неперекрывающиеся концы ВА76о11 и ВА87617 косегрегировали с К1.

ВАС-концевые маркеры, используемые для конструирования физической карты, использовали также для отнесения ВАС-клонов к хромосоме Р6/210 (К1г1), несущей аллель г1 или К1. Клоны ВА100е13, ВА47Г2 и ВА87б17 (фиг. 1) находились в цис-положении с аллелью К1, в то время как клоны ВА121о1, ВА122р13 и ВА76о11 были получены из гомолога, содержащего г1 (фиг. 1). Клон ВА27с1, на основе использовавшихся маркеров, не мог быть отнесен к г1 или К1 хромосоме.

Пример 3. кДНК-клоны К1-кандидата.

С использованием целых вставок ВАС хромосом ВА121о1 апб ВА76о11 в качестве зондов, были изолированы 6 и 8 кДНК-клонов, соответственно, из библиотеки кДНК, полученной из инфицированных листьев генотипа Р41 (К1г1). 8 из 14 кДНК-клонов были подобны известным растительным генам устойчивости. Наивысшее подобие было получено с геном устойчивости томата РгГ к Рзеиботопаз зуппдае (8а1тегоп е! а1. 1996). Последовательности восьми кДНК-кандидатов имели ~80-90% идентичности друг с другом. кДНК-клон с76-2 длиной в 2292 нуклеотида был идентичен, за исключением интронов, геномной последовательности клона д10, субклона, представляющего часть ВА87617 (см. ниже). Сравнение последовательностей с известными генами устойчивости из базы данных показало, что клон с76-2 не являлся полным геном. С использованием анализа КАСЕ кДНК удлинили на 1943 нуклеотида в направлении 5'-окончания, получив полную последовательность кДНК из 4235 нуклеотидов, в том числе 5'-нетранслируемую область из 59 нуклеотидов и 297 нуклеотидов 3'-нетранслируемой последовательности

- 23 008599 между стоп-кодоном и поли-А-хвостом. кДНК включала стартовый кодон в положении 2223 геномной последовательности, соответствующий первому метионину в аминокислотной последовательности, дедуцированной из клона д10 (фиг. 4В). Были идентифицированы два аденина в положениях -3 и +4 (где а в АТО=+1), что называют последовательностью узнавания рибосом у растений, насекомых, дрожжей и млекопитающих (Кохак 1991).

ПЦР-праймеры, специфические для клона кДНК с76-2, были сконструированы на основе выравнивания последовательностей с другими семью кандидатами кДНК. Праймерами 76-2зГ2 и 76-28К (см. Материал и способы) выработали 1,4 кЬ продукт ПЦР только в родительском растении Р41 (К1г1), но не в родительском растении Р40 (г1г1) (фиг. 2). Этот полиморфизм навел на мысль о том, что ВАС ВА87й17 (полученный из хромосомы, содержащей К1) мог содержать ген К1, несмотря на то, что данные картирования все еще показывали отсутствие рекомбинации между дальним концом этого ВАС-клона и К1.

Пример 4. Комплементация фенотипа К1.

Геномную суббиблиотеку в бинарном векторе рСЬО04541 (см. Материал и способы) с 10 кЬ (в среднем) инсерциями сконструировали из ВА87й17 (76 кЬ). Библиотеку скринировали путем гибридизации колоний с КОЬ-зондом из ВА121о1. Положительные клоны оценивали на присутствие полной копии КСЬ-гена-кандидата по размеру продуктов амплификации, полученных при помощи ПЦР с форвардпраймерами из краев вектора (Т3 и Т7) и обратными праймерами из КСЬ. Клоны также тестировали с использованием с76-2 кДНК-специфических праймеров 76-2з£2 и 76-28К. Субклон д10-2 селектировали и трансформировали в А. ШтеГаыеиз. Три различные бактериальные колонии использовали для трансформации восприимчивого сорта Везйее. Из трех опытов по трансформации регенерировали 15 независимых трансгенных линий и протестировали их в четырех независимых опытах на экспрессию устойчивости к расе 4 Р. т£е8!аиз (табл. 2).

Таблица 2

Тест на устойчивость к расе 4 Р. т£ез!аи8 трансгенных линий картофеля, трансформированных клоном д10

№ трансгенной линии	Устойчивость'
10-2“ 1ь	8
10-2 2	К.
10-2 3	К.
10-2 4	к
10-5 1	к
10-5 2	8
10-5 3	не обнаружена
10-5 4	не обнаружена
10-5 5	К
10-23 1	не обнаружена
10-23 2	К
10-23 3	К
10-23 4	К.
10-23 5	К
10-23 6	8

Трансгенные линии тестировали в четырех независимых опытах с тремя листьями от каждой линии на экспрессию гиперчувствительной устойчивости к расе 4 Р. т£ез!аи8.

Девять трансгенных линий явно показали типичную реакцию НК, подобно устойчивой линии Р41, содержащей К1 (фиг. 3); три линии показали неявные результаты, и остальные три были восприимчивыми, как ^трансформированное контрольное растение Везйее. На основе этих результатов было сделано заключение, что субклон д10 содержал ген К.1.

Все трансгенные линии с фенотипом К1 содержали ген, соответствующий кДНК 76-2, что было продемонстрировано присутствием 1,4 кЬ продукта ПЦР, амплифицированного праймерами 76-2кГ2 и 7628К. Этот продукт отсутствовал в ^трансформированном Везйее (контрольном) и во всех ВАС-клонах, представленных на фиг. 1 в качестве членов контига вокруг К1, за исключением ВА87й17 (фиг. 2).

Пример 5. Структура гена К1.

Субклон д10, содержащий ген К1, секвенировали; см. 8ЕР ΙΏ N0: 1. Последовательность содержала 10388 нуклеотидов и включала один ген с последовательностью, подобной другим растительным ге

- 24 008599 нам устойчивости. Никакая другая открытая рамка считывания или гомология последовательности не была идентифицирована в базе данных СспЕМВЬ. Выравнивание последовательности с кДНК с76-2 и 5'продуктом ВАСЕ выявило присутствие трех экзонов и трех интронов. Два интрона длиной 92 Ьр (положение 4878-4970) и 126 Ьр (положение 6103-6229) прерывают кодирующую область. Третий интрон длиной 81 Ьр (положение 6323-6404) расположен в 3'-нетранслируемой области сразу после стоп-кодона (фиг. 4А). Дедуцированная аминокислотная последовательность предсказывает полипептид из 1293 аминокислот с молекулярной массой 149,4 кДа (фиг. 4В). Дедуцированная аминокислотная последовательность гена В1 наиболее подобна (40% идентичности) гену устойчивости томата РгГ к Рксиботопак куппдас (8а1тсгоп с! а1. 1996). Предсказанный протеин В1 имеет предполагаемый домен сайта нуклеотидного связывания (ΝΒ8), состоящий из мотивов Р-петли (аминокислоты 572-578), киназы 2 (аминокислоты 649-653) и киназы 3а (аминокислоты 677-682) (фиг. 4В). После киназных мотивов расположены другие последовательности, подобные доменам неизвестной функции, законсервированным среди генов устойчивости: СЬРЬ (рЬРЬ (8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 10) в В1), СКЬУ (СЕЬУ (81 (С) ΙΌ ΝΟ: 12) в В1) и МНЭ (ЬНО в В1). Поиск законсервированных мотивов с использованием алгоритма ЕхРА8У обнаружил 4 предполагаемых сайта миристилирования, 9 сайтов гликозилации, 43 сайта фосфорилирования и 1 сайт амидирования в дедуцированной аминокислотной последовательности В1. Предполагаемый повторяющийся домен, богатый лейцином (ЬВВ), В1 содержит 15-16 дефектных повторов, расположенных в карбоксиконцевой части гена. Подобно некоторым растительным В-протеинам с цитоплазматическими ЬВВк, протеин В1 содержит лейциновый зиппер в аминокислотном положении 308-329 (Наттопб-Кокаск апб .Гопск, 1997).

Пример 6. Геномная организация локуса В1.

Саузерн-блот анализ в геле показал, что В1 является членом семейства генов, В1-специфические праймеры 76-2кГ2 и 76-28В амплифицировали 1,4 кЬ фрагмент в ВА87617 (В1), но не в перекрывающихся клонах ВА121о1, ВА122р13 и ВА76о11 (г1) (фиг. 2). Анализ последовательности ДНК ВАСк ВА87617 (В1) и ВА122р13 (г1) выявил, что ВА87617 содержит два высокогомологичных члена семейства генов В1: В1, соответствующий функциональному гену В1, и г1.1, ортологичный аллели г1.2 в ВА122р13. Функциональный ген В1 был частью 15 кЬ инсерции, присутствующей в В1-несущей хромосоме в области, представленной клоном ВА87617, но отсутствующей в хромосоме, содержащей г1 (фиг. 5).

Следует понимать, что изобретение может осуществляться на практике способами, отличными от приведенных в данном описании и примерах. В свете изложенных выше принципов, возможны многочисленные модификации и вариации данного изобретения, которые не выходят за пределы объема данного изобретения.

Полное содержание каждого документа (включая патенты, патентные заявки, журнальные статьи, рефераты, лабораторные инструкции, монографии, последовательности или другие описания), упомянутого в предисловии изобретения, описании, примерах и списке последовательностей, включено в данную заявку в виде ссылки.

Ссылки

Аррс1, В-Ό., Вайосй А. апб Носйк!такксг, Ό.Ε. (1994). А псте дспсгабоп оГ шЕоттабоп гс1псуа1 Юо1к Гог Ью1од1к!к: 111с схатр1с оГ 111с ЕхРА8У \ν\ν\ν ксгусг. Тгспбк Вюсйст. 8с1. 19: 258-260.

Вайуота, А., 8сйотаск, 8., Ваксг, В.Е, Сапа1, М., Вопак, и. апб Ьайаус, Т. (2001). СНготокотс 1апбшд а! 111с ЮтаЮ Вк4 1осик. Мо1. Ссп. Сспс!., т ргскк.

Вспбайтапс, А., Капуика, К. апб Ваи1сотЬс, Э.С. (1999). Т1с Вх дспс Ггот ро(аЮ соп!го1к ксрага!с У1тик гск1к1апсс апб сс11 бса!1 гскропкск. Т1с Р1ап! Сс11 11: 781-791.

В^баИтата, А., Оисгст М., Капуика, К. апб Ваи1сотЬс, Э.С. (2000). АдгоЬас!сйит ГгапкюпГ схргсккюп кук!ст ак а 1оо1 Гог 111с 1ко1а11оп оГ б1ксакс гск1к1апсс дспск: аррПсабоп !о (Нс Вх2 1осик ш ро!а!о. Т1с Р1ап! 1оита1 21: 73-81.

Оапд1, ЕЬ. апб .Гопск, Ю.С. (2001). Р1ап! раШодспк апб т!сдга!сб бсГспсс гскропкск (о шЕссбоп. №1(игс 411: 826-833.

Ос 1опд, Υ., ЕоткуШ, А., Ьс1к!ст, Ό., СсЬйатб!, С. апб Ваи1сотЬс, Э.С. (1997). А ро(а(о НурсгкспкШус гск1к(апсс дспс адатк( ро!а!о уиик X тарк (о а гск1к(апсс дспс с1ик!сг оп сйтотокотс V. ТНсог. Арр1. Сспс!. 95: 153-62.

Оопд, Е., 8опд, 1., Даскк, 8.К., Нс1дскоп, ЕР., СсЬйатб!, С., Лапд, 1. (2000). Осус1ортсп( апб аррЕсабопк о£ а кс! о£ сНготокотс-крссШс суЮдспсбс ΩΝΛ тагксгк ш ро(а(о. ТНсог. Арр1. Сспс!. 101: 1001-07.

Е1-К11агЬо11у. А., ^сοпа^бк-8с11^ррс^к. С., Ншдсп, Ό.Ε, .ГасоЬксп, Е., Рсгеиа, А., 8бскста, Υ.Ε, 8а1аттт Е. апб СсЬНатб!, С. (1994). 8сдтсдаГюп апа1ук1к апб ВЕЬР тарршд о£ (Нс В1 апб В3 а11с1ск сопГстпд гасс крссШс гск1к(апсс (о Р11у1ор1111юга шЕскГапк т ргодсшск о£ бИарЫб ро(а(о рагсп!к. Мо1. Ссп. Сспс!. 242: 749-754.

Е1-КНагЬо!1у, А., Ра1о11тто-8апс11сх, С., 8а1аттР Е., .ГасоЬксп, Е. апб СсЬНагб!, С. (1996). В6 апб В7 а11с1ск о£ ро!а!о сопГстпд гасс-крссШс гск1к(апсс Го Р11у1ор1111тога тГск(апк (МопГ.) бс Вагу 1бспбДсб дспсбс 1ос1 с1ик!стшд \νί(1ι (Нс В3 1осик оп сНготокотс ΧΙ. ТНсог. Арр1. Сспс!. 92: 880-884.

ЕШк, ЕС., Ьатегспсс, С.Е, Ьиск, ЕЕ. апб Эоббк, Γ.Ν. (1999). ШспбДсаГюп о£ гсдюпк ш а11с1ск о£ Шс Дах тик! гск1к(апсс дспс Ь (На( бс!стттс бйЕстспсск ш дспс-Гог-дспс крссШсНу. Р1апГ Сс11 11: 495-506.

ЕШк, ЕС., Эоббк, Р.К апб Ргуог, Т. (2000). 8!тис!иге, Гипсбоп апб суо1ибоп о£ р1ап! б1ксакс тскГкГапсс дспск. Сигг. Οр^п. Р1ап! Вю1. 3: 278-284.

- 25 008599

Етешд, Е.Е., 81тко, I., 8тай, С.О., ВошегЬа1е, М.^., Μίζώπ!ί, Е.8.С., Мау, 6.Ό. апб Егу, ^.Е. (2000). Семекс тарртд Ггот йе1б !ез!з оГ циапШаЙуе апб циаШаЙуе гез1з!апсе !о Рйу!орйШога 1пГез!апз ш а рори1айоп бепуеб Ггот 8о1апит !иЬегозит апб 8о1апит ЬегШаиШк Мо1. Вгеебшд 6: 25-36.

ЕешЬегд, А.Р. апб ^де1з!ет, В. (1984). А 1ес11тс.|ие Гог габю1аЬе1тд ΌΝΑ гез!псйоп епбопис1еазе Ггадтеп!з !о Шдй зресШс асЙУЙу (аббепбит). Апа1. Вюсйет. 137: 266-267.

Е1ог, Н.Н. (1971). Сиггеп! з!а!из оГ Ше депе-Гог-депе сопсер!. Аппи. Кеу. Р1у!ораШо1. 9: 275-296.

Ео1кейзта, К.Т., 8раззоуа, Μ.Ι., Рппз, М., 8!еуепз, М.К., НШе, 1. апб Со1бЬас1 К.^. (1999). Сопзкисйоп оГ а Ьас!епа1 агййс1а1 сйготозоте (ВАС) ЙЬгагу оГ Ьусорегзкоп езси1еп!ит су. 8!еуепз апб йз аррйсайоп !о рйузкайу тар !1е 8\\-5 1осиз. Мо1еси1аг Вгеебтд 5: 197-207.

Егу, ^.Е. апб Сообтет, 8.В. (1997). Кезигдепсе оГ Ше 1г1зН ро!а!о Гатте Гипдиз. Вюзаепсе 47: 363-371.

СеЬйагб!, С., Кй!ег, Е., ОеЬепег, Т., 8сйас1!зсйаЬе1, и., ^а1кете1ег, В., Ийпд, и. апб 8а1ат1ш, Е. (1989). КЕЬР апа1уз1з апб йпкаде тарртд т 8о1апит !иЬегозит. Тйеог. Арр1. Сепе!. 78: 65-75.

СеЬйагб!, С. апб Vа1копеη, 1.Р.Т. (2001). О^дап^ζайоп оГ депез сопйоШпд б1зеазе гез1з1апсе ш Ше ро!а!о депоте. Аппи. Кеу. Рйу!ораШо1. 39: 79-102.

Наттопб-Козаск, К. апб 1опез, Ю. (1997). Р1ап! б1зеазе гез1з!апсе депез. Аппи. Кеу. Р1ап! РЬузт1. Р1ап! Мо1. Вю1. 48: 575-607.

1опез, О.А., Т1отаз, С.М., Наттопб-Козаск. К.Е., Ва1т!-Кигй, Р.1. апб 1опез, Ό.1.6.(1992). ЕГГесЙуе уес!огз Гог йапзГогтайоп, ехргеззюп оГ йе!его1одоиз депез, апб аззаутд !гапзрозоп ехазтп ш !гапздешс р1ап!з. Тгапздешс Кез. 1: 285-297.

1опез, О.А. апб 1опез, Ό.1.6.(1997). Т1е го1ез оГ 1еисте пс11 гереа!з ш р1ап! беГепсез. Абу. Во!. Кез. Абу. Р1ап! Ра!1о1. 24: 90-167.

1ибе1зоп, Н.8. (1997). Т1е депейсз апб Ыо1оду оГ РЬу!орйШога тГез1апз: Мобегп арргоасйез !о а 1пз1опса1 сйайепде. Еипда1 Сепе!. апб Вю1. 22: 65-76.

Катоип, 8. (2001). №п1юз1 гез1з!апсе !о Рйу!орйШога: №уе1 ргозрес!з Гог а с1аззка1 ргоЫет. Сигг. Орт. Р1ап! Вю1. 4: 295-300.

Кге1ке, С.М., Эе Кошпд, 1.К.А., ^пке, 1.Н., Vаη Ооуеп, 1.\У. апб 8йекета, \У.1. (1994). ОиапШаШ^ге1ушйегйеб гез1з!апсе !о С1оЬобега раШба 1з ботша!еб Ьу опе та)ог 1осиз ш 8о1апит зредаζζ^η^^. Тйеог. Арр1. Сепе!. 88: 764-69.

^ζηΤ, М. (1991). 8!гис!ига1 Геа!игез ш еикагуойс пШУАз !1а! тоби1а!е !1е тШакоп оГ !гапз1а!юп. 1. Вю1. С1ет. 266: 19867-19870.

Ье1з!ег, Ό., Вайуога, А., 8а1ат1ш, Е. апб СеЬйагб!, С. (1996). А РСК Ьазеб арргоасй Гог 1зо1айпд раШодеп гез1з!апсе депез Ггот ро!а!о тейй ро!епйа1 Гог \\абе аррйсайоп т р1ап!з. №1Шге Сепейсз 14: 421-429.

Ье1з!ег, Ό., Вегдег, А., Т1е1еп, Н., Ге^тап^ ^., 8а1ат1ш, Е. апб СеЬйагб!, С. (1997). Сопз!гисйоп оГ а ро!а!о УАС ЙЬгагу апб 1бепййсайоп оГ с1опез йпкеб !о !1е б1зеазе гез1з!апсе 1ос1 К1 апб Сго1. Тйеог. Арр1. Сепе!. 95: 954-960.

Ьеопагбз-8сШррегз, С., С1еГГегз, ^., СеЬйагб!, С. апб 8а1ат1ш, Е. (1992). Т1е К1 депе сопГегппд гасезресШс гез1з!апсе !о Рйу!орй!ога 1пГез!апз т ро!а!о 1з 1оса!еб оп ро!а!о сйготозоте V. Мо1. Сеп. Сепе!. 233: 278-283.

Ьеопагбз-8сШррегз, С., С1еГГегз, ^., 8сйа&г-Ргед1, К., К1йег, Е., Кпарр, 8.1., 8а1ат1ш, Е. апб СеЬйагб!, С. (1994). ОнапШаШ'е гез1з!апсе !о Рйу!орйШога тГез1апз ш ро!а!о: а сазе з!ибу Гог ОТБ тарртд т ап а11одатоиз р1ап! зретез. Сепейсз 137: 67-77.

Ь1, X., уап Еск, Н.1., Коирре уап бег Vоо^ι. 1., Ншдет, Ό.-Ι, 8!ат, Р., апб 1асоЬзеп, Е. (1998). Аи!о!е!гарГо1бз апб депейс тарртд изтд соттоп АЕЬР тагкегз: Т1е К2 а11е1е сопГегппд гез1з!апсе !о РЬу!орйШога тГез1апз тарреб оп ро!а!о сйготозоте 4. Тйеог. Арр1. Сепе!. 96: 1121-28.

Мекзет, К. Ье1з!ег, Ό., Ре1етап, 1., 2аЬеаи, М., 8а1ат1ш, Е. апб СеЬйагб!, С. (1995). А Шдй-гезоШйоп тар оГ Ше νίαιυΐν оГ Ше К1 1осиз оп сйготозоте V оГ ро!а!о Ьазеб оп КЕЬР апб АЕЬР тагкегз. Мо1. Сеп. Сепе!. 249: 74-81.

Мекзет, К., УоЬпзГ К., КиЬеп, Е., Ну!еп, Ό., Оиам/Нои, Т., 21апд, Н.-В. апб ЫдЫЕоо!, Э.А. (2000). Ттео 1агде-тзей зоуЬеап депотк НЬгапез сопз!гис!еб т а Шпагу уес!ог: аррйсайопз ш сйготозоте теа1ктд апб депоте \\абе рйуз1са1 тарртд. Тйеог. Арр1. Сепе!. 101: 747-755.

№1езз, 8.К., Вгабееп, ЕМ., ^1е1диз, 8.М., НаЬег1асй, С.Т., МсСгаШ, ЕМ. апб Не1дезоп, ЕР. (2000). Кез1з1апсе !о 1а!е Ьйдй! ш 8о1апит Ьи1Ьосаз!апит 1з тарреб !о сйготозоте 8. Тйеог. Арр1. Сепе!. 101: 697704.

Nакаши^а, 8., Азакатеа, 8., Ойт1бо, Ν., Еикш, К., 81ιίιηίζι.ι, Ν. апб Катеазак1, 8. (1997). Сопз!гисйоп оГ ап 800 кЬ сопйд пеаг-сепйотепс гедтп оГ !1е псе Ь1аз! гез1з!апсе депе РМа² изтд а Шдй1у гергезеп!айуе псе ВАС ЙЬгагу. Мо1. Сеп. Сепе!. 254: 611-620.

ОЬегйадетапп, Р., Сйа!о!-Ва1апбгаз, С., Воппе1, Е., 8сйаЕег-Ргед1, К., ^едепег, Ό., Рактшо, С., 8а1аш^п^. Е. апб СеЬйагб!, С. (1999). А депейс апа1уз1з оГ циапШаНуе гез1з!апсе !о 1а!е Ьйдй! ш ро!а!о; Тотеагбз тагкег азз1з!еб зе1есйоп. Мо1. Вгееб 5: 399-415.

Регзоп, С., 8а1пЬогзкп Ό.Ι. апб Койппдег, К. (1962). Тйе депе-Гог-депе сопсер!. №1Шге 194: 561-562.

Кос1а-8оза, М., 8оппетеа1б, и., Еготтег, ^., 8!га!тапп, М., 8с1е11, 1. апб ХУШц-Ш/ен Ь. (1989). ВоШ беуе1ортеп!а1 апб те!аЬойс з1дпа1з асйуа!е Ше ргото!ег оГ а с1азз I ра!айп депе. Тйе ЕМВО 1оигпа1 8 (1):

- 26 008599

23-29.

Кокк, Н. (1986). Ро!а!о Ьгеейшд. РгоЬ1етк апй регкресШек. Ай\'. Р1ап! Вгеей., 8ирр1етеп! 13.

Ке1кег, Б., Мойгикап, Ζ., Магдокыап, Б., 8атасН, А., ОНай, Ν., НаидНп, С.«'. апй Р1ксНег, К. (1995). ТНе ВЕББ1 Сепе Епсойек а Нотеойоташ Рго!ет 1пто1тей т Ра!!ет Рогтайоп т !Не АгаЬ1йорк1к Оти1е Рптогйшт. Се11 83: 735-742.

Кй!ег, Е., БеЬепег, Т., Вагопе, А., 8а1ат1ш, Р. апй СеЬНагй!, С. (1991). КРБР тарртд оп ро!а!о сНготокотек оГ 1\\ό депек сопйоШпд ех!гете гек1к!апсе !о ро!а!о \агик X (РУХ). Мо1. Сеп. Сепе!. 227: 8185.

Коирре νаη йег Уоой, 1., ^о1!егк, Р., Ро1кейкта, К., Нийеп, К., νаη Ζаηйνοο^ι. Р., Ушке, Н., Капуика, К., ВепйаНтапе, А., 1асоЬкеп, Е., 1апккеп, К. апй Ваккег, 1. (1997). Марршд оГ !Не сук! пета!ойе гек1к!апсе 1осик Сра2 т ро!а!о икшд а к!га!еду Ьакей оп сош1дгайпд АРБР тагкегк. ТНеог. Арр1. Сепе!. 95: 874-80.

Коирре νаη йег Уоой, 1., νаη йег Уоккеп, Е., Ваккег, Е., О^'егтагк, Н., νаη Ζаηйνοο^ι. Р., Ни!!еп, К., К1еш-БапкНогк!, К. апй Ваккег, 1. (2000). Т\хо айййке ЦТБк сопГетпд Ьгоай-крес!гит гек1к!апсе т ро!а!о !о С1оЬойега ра1ййа аге 1осаНхей оп гекШапсе депе с1ик!егк. ТНеог. Арр1. Сепе!. 101: 1122-30.

8а1атап, ΚΝ. (1985). ТНе ро!а!о Гатте; йк саикек апй сопкесщепсек. 1п ТНе Н1к!огу апй 8оаа1 1пГ1иепсе оГ !Не Ро!а!о, ге\акей 1тргекктп, ей. БС. На^кек, рр. 289-316. СатЬпйде/№\\· Уогк/№\\' КосНе11е/ Ме1Ьоите/8уйпеу: СатЬпйде БпАегкИу Ргекк.

8а1тегоп, БМ., О1йгоуй, С.Е., Коттепк С.М., 8сойе1й, 8.К., К1т, Н.-8., ^аνе11е, Б.Т., БаН1Ьеск, Ό. апй 8!аккате1с/, В.Б (1996). Тота!о РгГ 1к а тетЬег оГ !Не 1еисше-псН гереа! с1акк оГ р1ап! й1кеаке гек1к!апсе депек апй Нек етЬеййей \\йНт !Не Р!о кшаке депе с1ик!ег. Се11, Уо1. 86: 123-133.

8атЬгоок, 1., РгйксН, Е.Р. апй Матайк, Т. (1989). Мо1еси1аг С1ошпд: А БаЬога!огу Мапиа1. (Со1й 8рппд НаГЬог, ΝΥ: Со1й 8рппд НагЬог БаЬога!огу Ргекк).

8тдН, А.К., 8а1ат1ш, Р. апй ИНлд, Н. (1989). СНготокоте ратпд ш 14 Р1 НуЬпйк атопд 11 й1р1о1й ро!а!о креаек. 1. Сепе!. Вгеей. 43:1-5.

8!аН1, Е.А., Б^уег, С., Маипсю, К., Кгейтап, М. апй Вегде1коп, 1. (1999). Бупаткк оГ й1кеаке гек1к1апсе ро1утогрЫкт а! (Не Крт1 1осик ш АгаЫйорык. №1иге 400: 667-671.

Тапкк1еу 8.Ό., Сапа1, М.^., Рппсе, БР., йе У1сеп!е, М.С., ВошегЬа1е, М.^., Вгоип, Р., Ри1!оп, Т.М., СютаппопН ББ, СгапйШо, 8., Магйп, С.В., Меккедиег, К., МШег, БС., МШег, Б., Ра!егкоп, А.Н., Ршейа, О., Кбйег, М.8., ^шд, К.А., ^и, V., Υοиηд, Ν.Ό. (1992). Н|дН йепкйу то1еси1аг Нпкаде тарк оГ !Не !ота!о апй ро!а!о депотек. Сепейск 132: 1141-60.

Уап йег Бее, Т., КоЬо1й, А., Тек!а, А., νаη '! К1оок!ег, IV. апй Бо^сгк, Р. (2001). Марршд ОГ А\аги1есе Сепек 1п РНу!орН!Нога 1пГек!апк ^йй АтрНйей Ргадтеп! Бепд£Н Ро1утогрЫкт Магкегк 8е1ес!ей Ьу Ви1кей 8едгедап! Апа1ук1к. Сепейск 157: 949-956.

Уап йег Уоккеп, Е.А.С., Коирре νаη йег Уоой, 1.Х.А.М., Капуика, К., ВепйаНтапе, А., 8апйЬппк, Н., Ваи1сотЬе, Б.С., Ваккег, 1., 8Некета, V.! апй К1еш-БапкНогк!, К.М. (2000). Ното1одиек оГ а кшд1е гек1к!апсе-депе с1ик!ег ш ро!а!о сопГег гек1к!апсе !о й1к!тс! ра!Нодепк: а \агик апй а пета!ойе. ТНе Р1ап! 1оита1 23: 567-576.

Vак!^е, К.Б. (1991). Вгеейшд Гог гек1к!апсе. Ай\'. Р1ап! Ра!Но1. 7: 193-223.

Vеη-^иη, 8. апй Рогйе, В.С. (1989). ЕГйаеп! ДапкГогтайоп оГ АдгоЬас!егшт крр. Ву ЫдН νοИаде е1ес!горога!юп. Шс. Ас1йк Кек. 17: 8385.

Υаηд, Б., Рагсо, А., №1пйН 8., 8иЬийЫ, Р., Ζ^ι, Υ., '№апд, С. апй Ниапд, Ν. (1997). СопкДисйоп оГ а Ьас!епа1 агййс1а1 сНготокоте (ВАС) НЬгагу апй 1йепййса!юп оГ ονе^1арр^ηд ВАС с1опек тейН сНготокоте

4-крес1йс КРБР тагкегк.

Υаηд, Б., 8ап/Нек, А., КНикН, С.8., Ζΐκτ Υ. апй Ниапд, Ν. (1998). СопкДисйоп оГ а ВАС сопНд согИашшд !Не ха5 1осик ш псе. ТНеог. Арр1. Сепе!. 97: 1120-1124.

- 27 008599

Список последовательностей <110> Мах-Р1апск-Сезе11зс11а£1: гиг ГбгДегипд бег Идззепзсйа^Ьеп β.ν

КИЗ ЗааС АС <12 0> Ρ1βη6-άβΓίνβά гезхзсапсе деле <130> Г 2298 РСТ <150> ЕР 01120670.3 <151> 2001-08-31 <150> 12 <170> РаДепСХп νβΓβίοη 3.1 <210> 1 <211> 10388 <212> ПЫА.

<213> Зо1ап.ит ЬиЪегозшп <220>

<221> 1пСгоп <222> (4878)..(4970) <223>

<220>

<221> 1лЕгоп <222> (6103)..(6229) <223>

- 28 008599 <220>

<221> 1пбгоп <222> (5323)..(6404) <223>

<220>

<221> СОЗ <222> (2223)..(4877) <223>

<22 О>

<221> -СОЗ <222> (4971)..(6102) <223>

<220>

<221> СОЗ <222> (6230)..(6321) <223> * <220>

<221> 5'ϋΤΚ <222> (2164)..(2222) <223>

<220>

<221> ргошобег <222> (1)..(2164) <223>

- 29 008599 <220>

<221> З'ОТН <222> (6405)..(6702) <223>

<400> 1

ЪЕааеаЬаЬа даЬддааСсд дЕд£±ЕЪааа аддсадддсд сдаддсдада сдЬЕСЕас-ЬЬ	60
адкаЬададс даддсдЬаад сскаакдаСС саЬЕЕЕЬсЬа адаасдаЬаЬ ЕааЕСсаСЕа	120
ааЬЬасЕЕаа СЬаЕааЬааа ЬЕЕаСасасЬ ЬсаааЕасас ЕЪддаЕаСда аЬаадЪааЫ:	180
аЬссЫзсасд адаЬЕсаааЬ даааааЪаад ЕддадЬЬааЕ СададЕааад ЬададЬааЕЬ	. 240
ЕааасаскЬС адЪскдааСс ЬЬЬаЪасаЬЪ аЕасаааааа адЕааСЕаЬа ЬЬЬсассааа	300
ЕЬсаааЕдда ааЬЕаааааЬ аЪаЬдаадаЬ ааЕЪасааса саадЕдЬЬак дЕдСсадЕЕд	360
дааадсЕсаа дсдЕдддксс ЕассаЪасЬс саЕдасаЕЬЬ сасЬЬЬЕадд дЬаЕдаЬЬсд	420
ЕааЬЪЕааЬд ааааЬдаЬда ссЪЬЫхЪЪЪЬ ЕддадСЕадЬ ааЬдаддксС аааЕаасЬаа	480
асаЬададда саасссЕсЬЬ аадсаадсаа аЬсЪЬдсааЬ аасаЬЕЕсаа адассаЬдаЬ	540
аЪссЪсаааЪ ЕЪЬЬЕаЬЕаа ЬдасЪааааа сЕаасаСдЬЬ ааасЬсЕссЕ дСдЬаЪЬаЪЕ	600
саЬЬдЕааСа ЬЕЬЕЬЬЕЬдд ЬЕаааЕсаЬЕ саЬЕдЕаааа ЕаааСЕсаЕС аЬасаЬааЪд	660
ЕЬааЕСЪЬСЬ сЬСааЪаакс аааЬаЬЕаЬЬ саЬсдЕаЬаС ЕЕасЕааааа ЕаСЬсааЕдЕ	. 720
аЕдаЬдаЬда дадаакааас ЬаЬаЕаадаа аЬаЬаадааа ЬЕЬааЕдааа ссаЕаЕСсаа	780
ааакддсЬЬс ЬсааЬдЬдЬс ааааааЬсаа сааЕдасада ЕсаааЬасаЬ ЕаЪсЕЪаЪЪ-Ь	840
сЬЕЕаааЬЕд ЕдЬЬадаЬаЕ аЬЬЕдЬасЬЕ СЕададдаЬЬ аЪЕааЬЬЬа!: ааЪабсааЬд	900
аадссаЕаЬа СЕЕаЬаЕаад адЬскбсЕда ааакаЬаЬЬа ЕсЕЬаЪЕаЬс ЕЬаЕсааааЕ	960
ддаЪдаЕЕЕЬ еЬссаСЬдаС ссаадЬсддд ассаааааад ааЬаСЕаЕсЪ сааададаЬЕ	1020
аЬЕааЪСЪас саааЕаЬЬаа ЕЬЬадЕдадд СЕЬЬасЬдЬа аЬЕЬдддЬд!: ддЪссаЕдас	1080
саЬаЬаЬаЪЬ сЬдааааааа асЕдсЕЕЬдЬ аааЪЕссаад ЬЬддаасдас аЬЕЕсЕасад	1140
ссааЬдЬЕда ааЬасЪаЪЕс ЫхдСссЬдаЕ ЕаддадасЬЕ аЬЕаЕС-Ьса!: ЬЬсаЬаЬака	1200
даЬаддЬссс ЬЕдадаасЪа дааадаЬЬаа аЕЬааадаЬЕ дадаЕссааЬ аакдсаЬаЬд	1260
аасасадаас аЕЕЬдксЕЬЕ ЕЕЬссааадд ддассаЬаЪа ЬаЕаЬаадаЬ дЬсаЕЬдЪдс	1320
ЬеЪаЬдСаЬд даадададаа ЬаасдаЬсЕс аЕаЬаЬаЬаЬ сЪсаЕаЕаЬа ЕаЕаЕаСсаЬ	1380

- 30 008599

сеааааеаад	аедееееааа	ссаеседдеа	еесддеаЬас	ааеееасасе	ааааадасса	1440
аасаддеддд	ааддасасаа	асаееадаес	аааааееаад	дееаадбдае	есадаеаеса	1500
ададдаасаа	еаеасеааее	ддаасаааее	ааадеаЬссе	сасееасаае	ддесаеаеае	1560
адаадсеасе	еаддЬааеас	есесасеаес	ссеааееаее	едессасеее	еаааЕеадса	1620
сассеаееаа	еаааасааее	аееддсаеад	едадеееасс	аееееассее	еееааееаед	1680
аадсдааСда	аееааааасе	Ьаадаеаееа	ааааааеесе	дссеееааса	аадеааееаЬ	1740
еедадддЬае	ааеаддеааа	аадаааеедЬ	ссеееееееа	ееедесаааа	Ьдаасаадеа	1800
дееадддаса	асеаааааад	даааааедда	едадЬааееа	ддаасддадд	дадеаеаааа	1860
саседесаес	асесаааааа	Ьаедадеаес	еедасеедса	саасаеадде	асееааесаа	1920
адасесааеа	еасаааЬсЬс	еааадЬааае	еедеаеееде	аеаеасадес	есееедааад	1980
сссааеееде	аеааааЬаее	еаааедсадс	еадаеаеаса	аасддаааее	адсаеадсаа	2040
седааасЬае	адаеаеадаа	саЬааееадд	сааедасеее	деееееедее	едЬседссес	2100
асасеееаее	едасЬдссее	ссеедааеас	ееедааеаее	сЬаадеасдс	садсеаеаад	2160
дедаадааад	ааееааасеа	СааеасесСд	еаеедсесее	сеессаеаае	адедеаасаа	2220

2267 дд аед аае еес аас ааЪ даа еед есе даб сед ааа аае сдс еес сеа Мее Азп РЬе Азп Азп (31и Ьеи Зег Азр Ьеи Ьуз Азп Агд РЬе Ьеи 15 10 15

еее РЬе

адд асд сед ада дсс

сад С51п

ааа еде

есд дае дее дса ада дае еда

2315

Агд

ТЬг

Ьеи

Агд 20

А1а

Ьуз

Суз

Зег 25

Азр

Уа1

А1а Агд

Азр Агд 30 ·

аЬа

дае

еес

еее

аеа

ьдд

дад

ееа

ааа

еес

сее

аае

еде

еее

сес

сае

2363

Не

Азр

РЬе

РЬе

Не

Тгр

<21и

Ьеи

Ьуз

РЬе

Ьеи

Азп

Суз

РЬе

Ьеи

Нгз

35

40

45

еед

сад

аде

еес

дсе

еее

дса

аде

даа

еде

дде

аед

сеа

дае

аеё

еса

2411

Ьеи

С1п

Зег

РЬе

А1а

РЬе

А1а

Зег

С1и

Суз

С1у

Мее

Ьеи

Азр

Не

Зег

50

55

60

сад

ааа

аед

аеа

даа

аее

еде

аад

адд

еее

аае

аса

сса

ссе

сса

сае

• 2459

С1п

Ьуз

Мее

Не

О1и

Не

Суз

Ьуз

Агд

РЬе

Азп

ТЬг

Рго

Рго

Рго

Н1з

65

70

75

аае

еса

еее

дса

еас

бдд

аад

дад

деа

аее

еде

аад

адд

сед

еде

дсе

2507

Азп

Зег

РЬе

А1а

Туг

Тгр

Ьуз

С1и

Уа1

Не

Суз

Ьуз

Агд

Ьеи

Суз

А1а

80

85

90

95

аее 11е

аде аее сад ссд дае

дсе аде еса дае дае дда еее дса еде едд

2555

Зег Не С1п

Рго Азр 100

А1а Зег

Зег

Азр Азр 105

С1у

РЬе

А1а Суз 110

Тгр

аад

ааа

деа

аее

едд

аад

асе

аад

саа

даа

еес

ада

дсе

ааа

еас

есс

2603

Ьуз

Ьуз

Уа1

Не

Тгр

Ьуз

ТЬг

Ьуз

С1п

С1и

РЬе

Агд

А1а

Ьуз

Туг

Зег

115

120

125

- 31 008599

СЕЕ сса ааа

аса сЕа сЕЕ дса

дас аас аад дЕа ЕаЕ дас даЕ даЕ даЕ

2651

РЬе Рго

Ьуз 130

ТЬг Ьеи

Ьеи А1а

Азр 135

Азп Ьуз

Уа1

Туг Азр 140

Азр Азр

Азр

асЕ

ааЕ

ссс

ааа

ЕЕЕ

дЕд

аЕд

даа

ЕЕс

аЕс

даЕ

дсЕ

дЕЕ

дЕд

ддд

ааЕ

2699

ТЬг

Азп 145

Рго

Ьуз

РЬе

Уа1

Мер 150

С1и

РЬе

Не

Азр

А1а 155

Уа1

Уа1

(31у

Азп

сЕс

ааЕ

дЕС

сЕа

дЕс

аад

аЕс

ааЕ

даЕ

сса

ЕсЕ

Еса

ЕЕд

сЕЕ

ЕЕЕ

дЕЕ

2747

Ьеи 160

Азп

Уа1

Ьеи

Уа1

Ьуз 165

Не

Азп

Азр

Рго

Зег 170

Зег'

Ьеи

Ьеи

РЬе

Уа1 175

сса

дда

ССС

аад

даа

саа

аЕа

даа

саа

дЕд

ЕЕа

аад

дад

ЕЕд

аад

ЕЕа

2795

Рго

<31у

Рго

Ьуз

(31и 180

С1п

Не

С1и

С1п

Уа1 185

Ьеи

Ьуз

С1и

Ьеи

Ьуз 190

Ьеи

ЕЕд

ада

ЕЕЕ

ЕЕЕ

дЕс

Еде

ЕЕЕ

дЕЕ

Еса

аас

ааа

ЕдЕ

аЕа

дад

ссЕ

саа

2843

Ьеи

Агд

РЬе

РЬе 195

Уа1

Суз

РЬе

Уа1

'Зег 200

Азп

Ьуз

Суз

Не

С1и 205

Рго

С1п

Еас

саа

саЕ

асЕ

асЕ

ЕЕЕ

ЕаЕ

асЕ

сас

дсЕ

ЕЕа

аЕЕ

дад

дсЕ

аде

сас

2891

Тут

(31η

Нхз 210

ТЬг

ТЬг

РЬе

Туг

ТЬг 215

Нхз

А1а

Ьеи

11е

61и 220

А1а

Зег

Нхз

аЕс

дса

^Ед

дЕЕ

дЕд

Едд

ЕЕд

ааЕ

ЕЕд

сса

аЕс

ЕаЕ

дда

аас

ада

ааЕ

2939

Не

А1а 225

МеЕ

Уа1

Уа1

Τζρ

Ьеи 230

Азп

Ьеи

Рго

Не

Туг 235

С1у

Азп

Агд

Азп

саа

дас

ЕЕд

дсЕ

Еса

адЕ

даа

дЕЕ

адЕ

ЕдЕ

ЕЕд

сЕЕ

ЕсЕ

даЕ

ЕЕс

аЕд

2987

О1п 240

Азр

Ьеи

А1а

Зег

Зег 245.

С1и

Уа1

Зег

Суз

Ьеи 250

Ьеи

Зег

Азр

РЬе

МеЕ 255

даа

аЕд

аад

аЕЕ

аад

Есе

аЕЕ

сад

сса

дас

аЕс

аде

сдс

аас

ааЕ

аЕЕ

3035

<31и

МеЕ

Ьуз

Не

Ьуз 260

Зег

Не

С1п

Рго

Азр 265

Не

Зег

Агд

Азп

Азп 270

Не

ЕаЕ

аЕЕ

даЕ

дЕс

ЕЕд

адд

дед

ЕЕд

аад

Еса

асе

аЕа

сса

саа

дсЕ

саа

3083

Туг

Не

Азр

Уа1 275

Ьеи

Агд

А1а

Ьеи

Ьуз 280

Зег

ТЬг

Не

Рго

С1п 285

А1а

(31п

даЬ

аад

саЕ

дсЕ

дсЕ

дад

адЕ

ддс

аЕЕ

дЕд

дад

асЕ

сса

аса

сас·

ааЕ

3131

Азр

Ьуз

Нхз 290

А1а

А1а

С1и

Зег

С1у 295

Не

Уа1

С1и

ТЬг

Рго 300

ТЬг

Нхз

Азп

сЕд

аЕд

дЕЕ

ддЕ

ЕЕд

адЕ

даЕ

саа

аЕд

дсс

аас

сЕЕ

сад

дад

аЕд

сЕс

.3179

Ьеи

МеЕ 305

Уа1

<31у

Ьеи

Зег

Азр 310

<31п

МеЕ

А1а

Азп

Ьеи 315

С1п

С1и

МеЕ

Ьеи

Еде

сЕЕ

сЕа

ада

дас

ааЕ

сЕс

аЕЕ

саЕ

сЕд

сса

аЕа

сЕа

даЕ

сЕд

даа

3227

Суз 320

Ьеи

Ьеи

Агд

Азр

Азп 325

Ьеи

Не

Нхз

Ьеи

Рго 330

Не

Ьеи

Азр

Ьеи

<51и 335

ЕЕЕ

саЕ

сЕЕ

саа

даЕ

аЕд

даЕ

ЕсЕ

дЕЕ

аЕЕ

дЕЕ

даЕ

дсс

дда

сЕЕ

сЕЕ

3275

РЬе

Нхз

Ьеи

С1п

Азр 340

МеЕ

Азр

Зег

Уа1

11е 345

Уа1

Азр

А1а

С1у

Ьеи 350

Ьеи

аЕЕ

Еас

Еса

ЕЕа

ЕаЕ

даЕ

аЕс

аад

ддд

сад

аад

даа

дас

аса

аса

ЕЕд

3323

Не

Туг

Зег

Ьеи

Туг

Азр

Не

' Ьуз

51у

С1п

Ьуз

О1и

Азр

ТЬг

ТЬг

Ьеи

355 360 365

- 32 008599

дад даб абс

аас сад дса ебб

ддб ббб даб ебб ссс ада аас

абб Не

дад С1и

3371

С1и Азр

Не 370

Азп С1п

А1а Ьеи

С1у 375

РЬе Азр

Ьеи

Рго Агд Азп 380

ссб

абс

аад

дса

абд

абс

аас

ебб

дбе

абд

саа

аад

дса

ббб

саа

едб

3419

Рго

Не 385

Ьуз

А1а

Меб

Не

Азп 390

Ьеи

Уа1

Меб

<31п

Ьуз 395

А1а

РЬе

С1п

Суз

аас

Ьбд

сса

адд

абб

саб

дда

сба

ддб

баб

дбе

даб

ббб

сба

Ьбд

ааа

3467

Азп 400

Ьеи

Рго

Агд

Не

Нхз 405

С1у

Ьеи

С1у

Туг

Уа1 410

Азр

РЬе

Ьеи

Ьеи

Ьуз 415

аас

ебд

аад

даб

ббс

саа

ддс

едб

баб

бса

даб

бса

сбс

даб

ббс

сбс

3515

Азп

Ьеи

Ьуз

Азр

РЬе 420

С1п

<31у

Агд

Туг

Зег 425

Азр

Зег

Ьеи

Азр

РЬе 430

Ьеи

аад

ааб

саа

ебб

саа

дбб

абб

саа

асб

даа

ббб

дад

аде

ббд

саа

ссб

3563

Ьуз

Азп

С1п

Ьеи 435

С1п

Уа1

Не

(31п

ТЬг 440

С1и

РЬе

С1и

Зег

Ьеи 445

С1п

Рго

6.6с

ббд

аад

дбб

дбе

дба

даа

дад

сса

сас

ааб

аад

сбс

аад

аса

ебд

3611

РЬе

Ьеи

Ьуз 450

Уа1

Уа1

Уа1

С1и

С1и 455

Рго

Нхз

Азп

Ьуз

Ьеи 460

Ьуз

ТЫ

Ьеи

ааб

даа

даб

бдб

дсб

аса

сад

аба

абб

адд

ааа

дса

баб

дад

дбд

даа

• 3659

Азп

<31и 465

Азр

Суз

А1а

ТЫ

С1п 470

Не

Не

Агд

Ьуз

А1а 475

Туг

С1и

Уа1

С1и

баб

дба

дбб

даб

дсб

бдб

аба

аас

ааа

дад

дбб

ссб

сад

бдд

бде

абс

3707

Туг 480

Уа1

Уа1

Азр

А1а

Суз 485

Не

Азп

Ьуз

С1и

Уа1 490

Рго

51п

Тгр

Суз

Не 495

дад

сдб

Ьдд

сбс

ебд

даб

абс

аба

дад -дад

абб

асб

бдб

абс

ааа

дса

3755

С1и

Агд

Тгр

Ьеи

Ьеи 500

Азр

Не

Не С1и

(31и 505

Не

ТЫ

Суз

Не

Ьуз 510

А1а

аад

абб

сад

даа

аад

аас

асд

дбб

дад

даб

аса

абд

аад

асб

дбе

абб

3803

Ьуз

Не

С1п

С1и 515

Ьуз

Азп

ГЫ

уа1

(31и 520

Азр

ТЫ

Меб

Ьуз

ТЫ 525

Уа1

Не

дсб

сдб

аса

бса

бса

ааа

ебд

дса

адд

асб

сса

адд

абд

ааб

даа

дад

3851

А1а

Агд

ТЬг 530

Зег

Зег

Ьуз

Ьеи

А1а 535

Агд

ТЬг

Рго

Агд

Меб 540

Азп

С1и

С1и

абб

дбб

ддд

ббб

дад

даб

дбе

аба

даа

ааб

бба

ада

ааа

ааа

сба

ебд

3899

Не

Уа1 545

С1у

РЬе

С1и

Азр

Л7а1 550

Не

51и

Азп

Ьеи

Агд 555

Ьуз

Ьуз

Ьеи

Ьеи .

ааб

дда

асе

ааа

ддд

саа

даб

дбе

абб

бса

абб

сас

ддс

абд

сса

ддб

3947

Азп 560

С1у

ТЬг

Ьуз

С1у

(31п 565

Азр

Уа1

Не

Зег

Не 570

Нхз

О1у

Меб

Рго

С1у 575

бба

ддь

аад

асд

асб

бба

дсс

аас

адб

сбс

баб

бсб

дас

адд

бса

дбб

3995

Ьеи

С1у

Ьуз

ТЬг

ТЫ 580

Ьеи

А1а

Азп

Зег

Ьеи 585

Туг

Зег

Азр

Агд

Зег 590

Уа1

ббб

бсб

саа

ббб

даб

абб

бдб

дса

саа

бдб

сдь

дбд

бсб

саа

дба

баб

4043

РЬе

Зег

О1п

РЬе

Азр

Не

Суз- А1а

С1п

Суз

Суз

Уа1

Зег

С1п

Уа1

Туг

595 - 600 ’ 605

- 33 008599

бсб баб аад дас бба

аба Гбд

дсс А1а 615

ЬГд сба сдЬ даб дсб абб ддб дад

4091

Зег Туг

Ьуз Азр Ьеи 610

Не

Ьеи

Ьеи Ьеи Агд

Азр

А1а Не С1у 620

С1и

ддб

бсб

дед

едб

ада

даа

ебб

саб

дсс

ааб

даа

бба

дсб

даб

абд

ебб

4139

О1у

Зег 625

Уа1

Агд

Агд

С1и

Ьеи 630

Нхз

А1а

Азп

С1и

Ьеи 635

А1а

Азр

Меб

Ьеи

сдс

ааа

ас б

сба

ббд

.ссс

еда

адд

Гас

ебб

абс

ебб

дбб

даб

дас

дЬд

4187

Агд 640

Ьуз

ТЬг

Ьеи

Ьеи

Рго 645

Агд 'Агд

Туг

Ьеи

Не 650

Ьеи

Уа1

Азр

Азр

Уа1 655

едд

даа

ааб

адб

дбб

ьдд

даб

даб

бба

ада

ддс

Гдб

ббб

сса

даб

дбе

4235

Тгр

<31и

Азп.

Зег

Уа1 660

Тгр

Азр

Азр

Ьеи

Агд 665

С1у

Суз

РЬе

Рго

Азр 670

Уа1

ааб

аае

ада

адс

ада

абс

абб

сба

аса

аса

ада

саЬ

саб

даа

дбб

дсс

4283

Азп

Азп

Агд

Зег 675

Агд

11е

Не

Ьеи

ТЬг 680

ТЬг

Агд

Нхз

Нхз

С1и 685

Уа1

А1а

ааа

баб

дсб

адб

дбб

саб

адб

да Г

ссс

ебб

саб

сбЬ

едб

абд

ббб

дас

4331

Ьуз

Туг

А1а 690

Зег

Уа1

Нхз

Зег

Азр 695

Рго

Ьеи

ΗΪ3

Ьеи

Агд 700

Меб

РЬе

Азр

даа

дбб

даа

адб

бдд

аад

ббд

ебб

даа

аад

ааа

дбд

ббб

ддб

даа

даа

4379

О1и

ν&1. 705*

С1и

Зег

Тгр

Ьуз

Ьеи 710

Ьеи

С1и

Ьуз

Ьуз

Уа1 715

РЬе

С1у

С1и

С1и

адс

бдб

бсс

ссб

сбс

сба

ааа

ааб

дбб

ддд

сба

ада

аба

дса

ааа

абд

4427

Зег 720

Суз

Зег

Рго

Ьеи

Ьеи 725

Ьуз

Азп

Уа1

51у

Ьеи 730

Агд

Не

А1а

Ьуз

Меб 735

бдб

дда

саа

сба

ссб

ебб

бса

абб

дбб

ебд

дбд

дсб

ддб

абб

ебд

бса

4475

Суз

С1у

61п

Ьеи

Рго 740

Ьеи

Зег

11е

Уа1

Ьеи 745

Уа1

А1а

<31у

Не

Ьеи 750

Зег

дад

абд

даа

аад

даа

дба

даа

бдб

бдд

даа

саа

дбд

дсс

аае

ааб

ббд

4523

(21и

Меб

С1и

Ьуз 755

С1и

Уа1

С1и

Суз

Тгр 760

С1и

С1п

Уа1

А1а

Азп 765

Азп

Ьеи

ддб

бсс

бас

абб

сас

ааб

дас

бса

ада

дсс

абб

дба

дас

ааа

адб

баб

4571

С1у

Зег

Туг 770

Не

Нхз

Азп

Азр

Зег 775

Агд

А1а

Не

Уа1

Азр 780

Ьуз

Зег

Туг

саб

дбб

бба

ссб

бдб

саб

ебб

аад

бсб

бде

Ьбс

ебб

баб

ббб

дда

дса

4619

Нхз

Уа1 785

Ьеи

Рго

Суз

Нхз

Ьеи 790

Ьуз

Зег

Суз

РЬе

Ьеи 795

Тус-

РЬе

С1у

А1а

ббб

бба

даа

даб

ада

д^д

абб

дас

абб

бса

адд

бба

аба

адд

сба

бдд

4667

РЬ.е 800

Ьеи

С1и

Азр

Агд

Уа1 805

Не

Азр

Не

Зег

Агд 810

Ьеи

Не

Агд

Ьеи

Тгр 815

аба

бса

даа

дса

ббб

аба

ааа

адб

адб

даа

ддс

адд

адд

ббд

дад

даб

4715

Не

Зег

(31и

А1а

РЬе 820

Не

Ьуз

Зег

Зег

С1и 825

С1у Агд

Агд

Ьеи

С1и 830

Азр

аба

дса

даа

ддъ

бас

ббд

дад

ааб

ебб

абб

дда

ада

ааб

сба

дба

абд

4763

Не

А1а

С1и

С1у

Туг

Ьеи

С1и

Азп

Ьеи

Не

51у Агд

Азп

Ьеи

Уа1

Меб

835 840 ' 845

- 34 008599

4811

дбб

асб

сад

адд

бсс

абб

бса

даб

ддб аад

дед

ааа

даа

бдб

сдс

ебб

Уа1

ТЬг

σΐη

Агд

Зег

11е

Зег

Азр

(21у Ьуз

А1а

Ьуз

С1и

Суз

Агд

Ьеи

850

855

860

саб

даб

дба

бба

сбс

дас

ббс

бде

аад даа

ада

дса

дсб

дад

дад

ааб

Нхз

Азр

Уа1

Ьеи

Ьеи

Азр

РЬе

Суз

Ьуз <31и

Агд

А1а

А1а

С1и

<31и

Азп

865

870

875

4859

666 сба сба бдд аба ааб аддбаабабд абаадбаасб дбасбббсаа РЬе Ьеи Ьеи Тгр Не Азп · .

880 '885

4907 бсаабсаадб абббсаадбб абабсбдааа аббаабдаба бдаббббдсб ааббдабаба 4967

ббс

адд даб

сад С1п

абб Не

асе ааа ссб бсб

бсс Зег

бдб дбб бас бсб сас аад

5015

Агд

Азр

ТЬг 890

Ьуз

Рго

Зег

Суз Уа1 895

Туг Зег

Нхз

Ьуз 900

сад

саб

дсб

сас

ббд

дсс

ббс

асб

даа

абд

саб

ааб

ебб

дба

даа

бдд

5063

αΐη

Нхз

А1а

Нхз

Ьеи 905

А1а

РЬе

ТЬг

О1и

Меб 910

Н1з

Азп

Ьеи

Уа1

(Ни 915

Тгр

адб

дед

бсб

бде

бса

ббб

дбб

ддс

бед

дба

дба

ебб

бсс

ааб

ааа

баб

5111

Зег

А1а

Зег •

Суз 920

Зег

РЬе

Уа1

С1у

Зег 925

Уа1

Уа1

Ьеи

Зег

Азп 930

Ьуз

Туг

дас

бса

бас

ббб

бсс

асб

сдЪ

дас

аба

бсс

бса

сба

саб

даб

ббб

бса

5159

Азр

Зег

Туг 935

РЬе

Зег

ТЬг

Агд

Азр 940

Не

Зег

Зег

Ьеи

Нхз 945

Азр

РЬе

Зег

абб

бса

сдс

абб

бба

сса

ааб

ббс

аад

ббб

сба

ааа

дбд

бба

даб

ббд

5207

11е

Зег 950

Агд

11е

Ьеи

Рго

Азп 955

РЬе

Ьуз

РЬе

Ьеи

Ьуз 960

Уа1

Ьеи

Азр

Ьеи

даа

сас

едд

дбб

ббб

абб

даб

ббб

абб

сса

асб

дад

ебб

дбб

бас

ббд,

5255

С1и 965

Нхз

Агд

Уа1

РЬе

11 е 970

Азр

РЬе

11е

Рго

ТЬг 975

61и

Ьеи

Уа1

Туг

Ьеи . 980

аад

баб

ббб

бсб

дса

сас

абб

даа

сад

ааб

бса

абб

ссб

бса

аде

аба

5303

Ьуз

Туг

РЬе

Зег

А1а 985

Нхз

Не

<31и

<31п

Азп 990

Зег

Не

Ргд

Зег

Зег 995

Не

бсс ааб ебб бдд Зег Азп Ьеи Тгр

аас ебб даа асб

ебб Ьеи 1005

аба бба ааа адб сса

аба Не

5348

Азп

Ьеи

О1и

ТЬг

Не Ьеи. Ьуз

Зег- Рго 1010

1000

баб

дед

бба

едб

бде

асд

сба

сба

сба

ссб

адб

аса

дбб

бдд

даб

’ 5393

Туг

А1а

Ьеи

Агд 1015

Суз

ТЬг

Ьеи

Ьеи

Ьеи , 1020

Рго;

Зег

ТЬг

Уа1

Тгр 1025

Азр -

абд

дбб

ааа

ббд

ада

саб

ебд

баб

абб

ссб

дас

ббс

аде

аса

адд

5438

Меб

Уа1

Ьуз

Ьеи 1030

Агд

Нхз

Ьеи

Туг

Не 1035

Рго

Азр

РЬе

Зег

ТЬг 1040

Агд

абб

даа

дса

дса

бба

ебб

дад

аас

бсб

дса

ааа

ебб

баб

ааб

ббд

5483

Не

С1и

А1а

А1а 1045

Ьеи

Ьеи

С1и

Азп

Зег 1050

На

Ьуз

Ьеи

Туг

Азп 1055

Ьеи

. . .

даа

асе

ебб

бсс

асб

сба

баб

ббс

бсб

едб

дбб

дад

даб

дса

даа

5528

С1и

ТЬг

Ьеи

Зег

ТЬг

Ьеи

Туг

РЬе

Зег

Агд

Уа1

<31и

Азр

А1а

01и .

- 35 008599

1060

1065

1070 ·

ЕЕд

аЕд

с Ед

ада

8.Э.Э.

аса

ссЕ

ааЕ

сЕЕ

еда

ааа

сЕд

аЕа

ЕдЕ

даа

5573

Ьеи

МеЕ

Ьеи

Агд 1075

Ьуз

ТЬг

Рго

Азп

Ьеи 1080

Агд

Ьуз

Ьеи

11е

Суз 1085

С1и

д^е

даа

ЕдЕ

ЕЕа

даа

Еас

ссс

ссЕ

сад

Еас

саЕ

дйд

ЕЕд

ааЕ

,ЕЕЕ

5618

Уа1

О1и

Суз

Ьеи 1090

(31и

Туг

Рго

Рго

(31п 1095

Туг

Нхз

Уа1

Ьеи

Азп 1100

РЬе

сса

аЕа

едд

сЕЕ

даа

аЕа

сЕа

аад

сЕЕ

ЕаЕ

еда

Еса

ааа

ЕЕЕ

ааа

5663

Рго

11е

Агд

Ьеи 1105

С1и

Не

Ьеи

Ьуз

Ьеи 1110

Туг

Агд

Зег

Ьуз

РЬе 1115

Ьуз

асе

аЕс

ссс

ЕЕЕ

Еде

аЕс

ЕсЕ

дса

сса

ааЕ

сЕс

ааа

Еас

ЕЕд

ааа

5708

ТЬг

11е

Рго

РЬе 1120

Суз

11е

Зег

А1а

Рго 1125

Азп

Ьеи

Ьуз

Туг

Ьеи ИЗО

Ьуз

с Ес

ЕдЕ

ддс

ЕЕЕ

Есс

сЕд

даЕ

ЕсЕ

сад

Еас

ЕЕа

Еса

даа

асЕ

дсЕ .

5753

Ьеи

Суз

С1у

РЬе 1135

Зег

Ьеи

Азр

Зег

С1п 1140

Туг

Ьеи

Зег

(31и

ТЬг 1145

А1а

даЕ

саЕ

сЕс

аад

сас

сЕЕ

дад

дЕа

сЕс

аЕа

сЕд

Еас

аад

дЕЕ

даа

5798

Азр

Низ •

Ьеи

Ьуз 1150

ΗΪ3

Ьеи

С1и

Уа1

Ьеи 1155

Не

Ьеи

Туг

Ьуз

Уа1 1160

С1и

• ·-

ЕЕЕ

ддЕ

даЕ

саЕ

адд

даа

Едд

ааа

дЬд

аде

ааЕ

ддс

аад

ЕЕс

ссЕ

5843

РЬе

С1у Азр

Д1з 1165

Агд

С1и

Тгр

Ьуз

ναΐ 1170

Зег

Азп

С1у

Ьуз

РЬе 1175

Рго

саа

сЕс

ааа

аЕс

ЕЕд

ааа

сЕа

даа

ЕаЕ

ЕЕд

Есс

ЕЕд

дЕд

ааа

Едд

5888

С1п

Ьеи

Ьуз

Не 1180

Ьеи

Ьуз

Ьеи

С1и

Туг 1185’

Ьеи

Зег

Ьеи

Уа1

Ьуз 1190

Тгр

аЕЕ

дЕа'

дсЕ

даЕ

даЕ

дсс

ЕЕЕ

ссЕ

аас

сЕЕ

даа

саа

ьед

дЕЕ

ЕЕд .

5933

Не

Уа1

А1а

Азр 1195

Азр

А1а

РЬе

Рго

Азп 1200

Ьей

С1и

С1п

Ьеи

Уа1 1205

Ьеи ’

сдЕ

дда

6дЕ

саа

даЕ

сЕЕ

аЕд

дад

аЕс

ссЕ

ЕсЕ

ЕдЕ

ЕЕс

айд

дас

5978

Агд

С1у

Суз

С1п 1210

Азр

Ьеи

МеЕ

(21и

Не 1215

Рго

Зег

Суз

РЬе

МеЕ 1220

Азр ,

аЕс

сЕЕ

ЕсЕ

сЕс

аад

Еас

аЕс

ддд

дЕа

даа

Еас

Еде

ааЕ

дад

Есд

6023

Не

Ьеи

Зег

Ьеи 1225

Ьуз

Туг

Не

С1у

Уа1 1230

С1и

Туг

Суз

Азп

<31и 1235

Зег

дЕЕ

дЕс

аад

Еса

дсс

ЕЕд

ааЕ

аЕа

саа

даа

аса

саа

дЕс

даа

даЕ

6068

Уа1

Уа1

Ьуз

Зег 1240

А1а

Ьеи

Азп

Не

С1п 1245

<31и

ТЬг

С1п

Уа1

С1и 1250

Азр

ЕаЕ Туг

саа С1п

ааЕ Азп

асЕ ТЬг 1255

ааЕ Азп

ЕЕс РЬе

аад Ьуз

сЕс Ьеи

дЕЕ Уа1 1260

сЕс Ьеи

аЕс Не

д аддЕасасЕа

6112

сЕдаааааад сЕЕЕаЕЕсЕд саЕдаЕЕЕЕд аЕдааЕсада ааЕсдссЕаа сЕдЕЕЕЕсЕс адЕЕаЕсЕЕЕ ассЕсдЕддс ад ЕЕЕ ЕсЕ ЕЕд сад ааа аад дед С1и РЬе Зег Ьеи 01п Ьуз Ьуз А1а сЕсдЕЕЕЕас аЕЕЕдддЕЕс

Едд ааа ЕЕа ааЕ ЕЕа Тгр Ьуз Ьеи Азп Ьеи

аЕЕЕЕасааа	6172
ЕЕсЕсЕЕ	6229
асЕ даЕ	6273
ТЬг Азр

- 36 008599

6318

1265

1270

1275

ада еаддйасЬас ΙχίζϋϋΐζϋΕίζΕϋ йЬсЬЪЕссЬе ЪЬЕййааака сассаааЬад Агд

6371 аЬадаЪЬсай сЕЬЬЫхйдЪс ЕЬеЪсдаЁаЬ дааадддайа дааЬсадйЬЬ саЪскдаЪда 6431 дааадэдаад ааасЬЬасЪд Ьдассддада ЕдЪддайдсе даЪдаадЬЬс ааеЪадеЬдй 6491 ддадааасЪд адааадсдйд дсайдссадд дСЬдЬадъсс саасйЪдЕса асасааайдЬ 6551 дсЕайасйса йЬЬЬдсййас Ьдйаайасса ЫЛсайдаса сасасасаса аасаЬЬаасЪ 6611 дйадЕааад-Ь ЕЪЬдаЬддай садйаааЕсй дадйксаасс саййдЪаайс сдЬЬсааайЬ 6671 саас'с.оаа.аа. аа.’сЪс.ссвЛ.^. дадХЛа&ЛлЪ. \Ла.а.с.адддС ь.Ьаса.дадЬ.'Ч. СдСадсСдда СТВЛ дсааыАдда айаЬсасаЬд ЬааййЬсЫхй аЬдадеЪааЕ ьсдйЕЪааЕа ааадаЪЬсйд 6791 йаааасдЬдс аасддсйдке дсаЕЬсаЬйд ЕааасЬаааЪ аЬайсЬсадЕ аЬдйааскаЬ 6851 ЬдаасааайЬ ЕЕЬсайЕЬЕа дксссЬдадд ЕЪЬдаЬдйаа дЬсаЬЬадай Ы-йасддакс 6911 сЬдаадйдаа ЕддЪЬййадс сЬйййсЪаЬЬ ЪЬсйЕаЪдад ъйсассаааа йдЪЪд-Ьдайд 6971 ссасЬбйдсй асаЬдЪЬада дааайдадаа ЪдЪЬадсасс сдададЬаЬд’ дссЕадсддЪ 7031 саайсааЬда адсаддйдаа аасаасаааа дсааааааЬа сЬаададаЬЬ ЕсЕЬсасаЬс 7091 еаЬсЬаадка ссдсЬаадса аадаЕасЕдЬ ааЬдасссЬ.с сйддЬсайЫ: а-ЬдЬдйсЪЬд 7151 ссСЬскдЬдй дйсдйЬЕада дЬдЪЕссЬаЪ адсдасссса адйсайЬйаЬ дасЕЬдсЬдд 7211 дасЬаасддй ЕсддЬсасаЪ ддйсдеЬсдЪ ЪйддЪейедд ьдсдадбъье. ЬдЪдЪЪйЬдд 7271 адсЬЕакдаа ЬсЕЪдаасда ЬдайЬЪЬсда йсааааайЬс аадаадаЬда саЬсддаайс 7331 саЬЬЬСЙаас даЬйссаЬса дсйссддаад ддксаЬЬЪЬа ддсЬадйадс ЬЪддЪсддса 7391 Ьдасъсссдд ЬдсдаЬЕадд ссййЕйаасЪ ЬйаадЬЪЬаа дссйаадЪЬЬ дасЪЕЬддЪс .7451 аасаЬ&сйда дйааасдсдс ЪсддаЕдада аСЬссд-Ьсад едсддйЬадс ЬссддааЬдЬ 7511 ' . I · ' ' саадЬйЬддй ЬЕадаЬЬдас сЕЕйсЬЕЬЕд ЕдйсЬсдадд ЬЕЬеЕдайаЕ ЕЬЕЬсддадс 7571 ЬсЬЕЕСдЬдд дЬЬЕЬдасЕЬ аааайддсаЬ ЪЬдддйдЕдд ааЬссасЕЫ: ЫсдЕсаадаЬ 7631 дассйсдЬай адааа'ЕЬЬЬд дсйдйдссаЪ Ьдадйссдаа аЬаЬсдааЬЕ ЪдакаЪдаЬЪ 7691 дсаЬаСсЬсд ЬЬЬдйдЬдса сддддЬЬссд аасдадЬЬсд дадаа.ссЕЬд ЬсдсадЬЬЬЬ 7751 ЕаааЪСйЬдд ддЬаадЪдса дааааайсЕд сасЕЬЫсдда ааасскйааа аассйсайсс 7811 сЬсйсйсайс ссЬсЬсЬсай сЬсЬсааЪса ЬЬйаддсдаЪ есдаадйдЬд ддаас£±Ьдк 7871

- 37 008599

аЕЕЕЕЕдаЕд	дсЕЕсдсЕдЕ	ададЕаЕЕса	даадсЕдЕЕд	ддЕдсдсдЕа	дЕЕсдаддЕа	7931
ааЕЕЕсдЕаа	ааЕассЕдсЕ	дссасдаЕсс	сЕЕЕЕЕдЕдд	сЕЕдаЕЕЕЕд	дааЕЕЕЕЕда	7991
даЕЕЕдЕЕЕЕ	сЕЕадссаЕЕ	ЕЕЕддЕссда	ЕЕЕсадЕдаЕ	ЕсЕЕдаддсЕ	аЕсЕЕдадЕд	8051
дЕЕЕЕЕсдад	дададсаЕсд	ЕддЕдЕЕдЕс	ддааЕЕЕасЕ	дЕадассасс	саЕЕЕЕЕддЕ. >	8111
аааЕаЕдсЕд	ааЕЕаасЕЕс	ЕдЕсссаЕЕЕ	сЕЕЕадЕЕЕЕ	ЕдадаааааЕ	ЕЕдддЕЕЕЕд	8171
дЕЕдсаЕдЕЕ	ддЕЕаЕдЕдЕ	ЕдЕЕЕЕЕдаЕ	ссссдааЕдд	ЕдЕсссаЕса	Еддаасасаа	8231
ЕЕЕддддадс	ЕдЕЕаадаас	сЕаЕЕЕЕЕдд	ддЕЕааЕЕсс	ддадЕЕЕсса	дсдсдддЕсс	8291
сасЕЕсЕссс	дЕЕЕЕдассс	сдаааЕЕдаЕ	аЕдЕсЕссдЕ	ЕЕсЕЕдсдаЕ	ЕЕЕадЕдЕсЕ	8351
ааасдассдЕ	ааЕаасаЕЕд	ЕдасЕсЕаЕЕ	ЕЕЕдаЕадсд	дддсадсдЕЕ	ЕсдаддссдЕ	8411
Есддаааддд	ааадсЕссдд	адаадЕдаЕЕ	ЕЕЕддадсдЕ	дсдЕдаЕсЕд	сссасаадЕа	8471
дддЕаЕддЕЕ	ЕсссЕсЕсЕЕ	адаЕЕдадсЕ	ЕдададЕдЕд	ааЕдсаЕдЕЕ	даЕЕадЕЕдд	8531
даЕЕЕдддЕЕ	ддЕадЕЕаЕЕ	дааЕсаЕдса	ЕаддЕдЕЕЕа	даааЕсаЕдк	ЕЕЕддссЕЕЕ	8591
ЕсдддааЕЕа	ЕсдддЕаасЕ	дЕдадсаЕдс	ЕаЕдЕдЕЕас	ЕааЕЕдассс	ЕссЕЕдсЕаЕ	’ 8651
• дЕддад-ЕдсЕ	ЕдааЕдсЕЕд	аЕЕасЕаЕЕЕ	аЕсЕдаадса	ЕдЕЕдддссЕ	ЕадЕЕЕаддЕ .	8711
ЕЕдасЕаддд	сЕЕдссЕЕад	адаЕдсаЕда	ЕЕсддаЕЕЕд	аЕаддссЕЕа	дЕЕЕЕЕдссс	8771
сдасдЕсдсЕ	сддЕсдасЕЕ	адаЕссаЕдЕ	адасЕддЕдЕ	адсаасЕЕда	дЕсЕдаЕадЕ	8831
ЕЕдддссЕЕа	дсЕаддсдаЕ	асдсЕЕдсЕс	сдаЕдаЕааЕ	ЕаЕсЕЕсЕЕс	ЕЕсЕЕЕЕЕЕЕ	8891
сдЕЕдЬЕасд	дсЕЕсасдад	ЕЕасдЕЕддс	дасаЕЕдаЕЕ	сЕдсЕЕсдсд	аЕЕЕдаадЕЕ	8951
даЕЕЕЕЕЕаЕ	ЕсддЕЕссаа	ддасЕЕасаЕ	ЕдаЕЕддсЕа	адЕдЕддасд	дсдЕЕссасд	9011
даааЕЕЕаЕа	адсаЕддаЕс	даЕЕдадасс	сЕЕЕсадсад	сЕасаЕЕддс	асЕЕаЕаЕад	9071
адсаЕссдаЕ	ЕЕааддЕссд	дссЕсЕаЕсд	сссаааЕасЕ	ЕаЕаЕададс	аассддЕЕЕа	9131
аддЕссддсс	ЕсЕаЕсдссс	адаЕасЕЕдЕ	аЕададсаЕс	сддЕЕададд	ЕсЕддссЕса	9191
дЕЕасЕЕдаЕ	асЕЕдЕдаЕЬ	ддЕЕасЕЕдд	дЕасЕЕЕЕдд	ЕдадсаЕссд	дЕЕсдаддЕс	9251
сддссЕссдЕ	асЕдЕсадаЕ	ЕсЕасЕааЕЕ	ддддЕЕдада	ЕЕсЕддЕЕсд	аЕдЬЕЕЕссд	9-311
ЕЕсЕЕдддЕЕ	сЕЕаЕаЕдса	аЕЕЕЕсЕЕЕа	дЕЕаЕадЕЕа	ЕЕЕЕдЕдЕас	ЕсаЕсдддсЕ	9371
ЕаЕддддаЕс	сдЕЕЕаддЕЕ	ЕЕЕаЕЕЕаас	ЕЕдсдсасда	дЕдЕассЕЕс	ЕдддсЕЕаЕд	9431
ддддсссадЕ	ЕаддЕдЕадЕ	ЕадсЕЕаЕад	аЕЕасЕЕЕад	ЕЕадЕЕсЕЕЕ	ЕЕасасЕЕдЕ	9491
дЕдсЕЕЕсса	ЕддЕЕЕасЕЕ	адаЕЕдЕсаЕ	ЕсЕЕдассЕс	ЕдЕЕЕдЕдЕЕ	аЕЕссЕЕсЕЕ	9551
ЬЕсаЕаЕЕдс	сЕЕЕасЕЕЕЕ	саадЕЕсадЕ	сддссЕаЕаа	ЕдсаЕасЕдд	дЕассЕдЕЕд	9611
ЕЕЕЕддкасЕ	саЕдсЕасдс	ЕсЕдсаЕсЕд	ЕЕЕсдЕдаЕд	саддЕсЕдад	сассадЕддс	9 671

- 38 008599

садсдеедае	ссадЪЫхдда	дЪадЪседае	ссддадасдд	дддЪдадсас	аеддсдеъъе	9731
дЬасЬаЬЫхс	адЪсессаЪс	ЬдЬдЬаЬаЬа	дасЪЬдЪсее	ееассЬЪесд	адасадЬсса	9791
аЪсесЪдЬдд	е.ссасЪЪЪЪд	ддасЪЪдеас	ЬсдЬЬЪедЪЬ	адеадсЪсСд	еаоеддЬдас	9851
ЬессСддеес	ЬаддадддаЬ	сЬЬЬаЬЬЬдЬ	аЬаЬаЬдЬЬЬ	ЪддЬЪсдсЪе	ссдсседЬЪЪ	9911
аЬаЬЬдЬЪаЪ	саЪааааЪЪЬ	ЪдссЬасЪсе	едЪЬадЪеес	еасссЪсада	сссаЬЪасРЪ	9971
дееаеъссдд	дЪеасдддЪЬ	ддсЬеассеа	сЪддЬдддЪе	аЬадЬаЬдЬд	ссассаЬдас	10031
ЕсдадаааЬс	дддЪсдЪдас	адаЬасаЬда	ЬдссЪсеЬЪд	дЪЬддаадаа	дсдддЪасЪс	10091
адЬсаааЪдд	ЬсдаддЪдад	сЪсдасасса	ЪаааЬаасае	сссаааааад	даасааЪдад	10151
ааадеЬасаа	аЪсасааЪас	аЪдЪссаЪае	дсееъддаас	еааадааЬЬа	ааадсасаса	10211
аЪдЪаЬЪЬса	абааСсееее	аЪсЪсЕдссЪ	дсадСЪдаае	аЪассадаЪа	ЪсадаЪсЪ.да	10271
дасдаЪдЪее	аааааддааа	сеаЬеаЪЪсд	асссЪаеесс	еЪЪсЪсааас	сЪсдааасса	10331
асассадЪЬа	ПасаасааЪа	ЪаЪдсадаас	ссееъаасЪа	ЬаЬасЪаЬае	асаааЬЬ	10388

<210> 2 <211> . 1293 <212> РНТ <213> Зо1апиш ЪиЬегозит <400> 2

МеЬ

Азп

РЬе

Азп

Азп

<31и

Ьеи

Зег

Азр

Ьеи

Ьуз

Азп

Агд

РЬе

Ьеи

РЬе

1

5

10

15

Агд

ТЬг

Ьеи

Агд

А1а

О1п

Ьуз

Суз

Зег

Азр

Уа1

А1а

Агд

Азр

Агд

Не

20

25

30

Азр

РЬе

РЬе

Не

Тгр

<31и

Ьеи

Ьуз

РЬе

Ьеи

Азп

Суз

РЬе

Ьеи

ΗΪ3

Ьеи

35

40

45

(31п

Зег

РЬе

А1а

РЬе

А1а

Зег

С1и

Суз

С1у

МеЬ

Ьеи

Азр

Не

Зег

б1п

50

55

60

Ьуз

МеЬ

Не

(31и

Не

Суз

Ьуз

Агд

РЬе

Азп

ТЬг

Рго

Рго

Рго

ΗΪ3

АЗП

65

70

75

80

Зег

РЬе

А1а

Туг

Тгр

Ьуз

О1и

Уа1

11е

Суз

Ьуз

Агд

Ьеи

Суз

А1а

Не

85

90

95

- 39 008599

Зег Не (31п Рго

Азр А1а Зег

Зег Азр Азр С1у РЬе А1а Суз Тгр Ьуз

100

105

110

Ьуз

Уа1

Не 115

Тгр

Ьуз

ТЬг

Ьуз

С1п 120

О1и

РЬе

Агд

А1а

Ьуз 125

Туг

Зег

РЬе

Рго

Ьуз 130

ТЬг

Ьеи

Ьеи

А1а

Азр 135

Азп

Ьуз

Уа1

Туг

Азр 140

Азр

Азр

Азр

ТЬг

Азп 145

Рго

Ьуз

РЬе

Уа1

МеЕ 150

С1и

РЬе

Не

Азр

А1а 155

Уа1

Уа1

С1у

Азп

Ьеи 160

Азп

Уа1

Ьеи

Уа1

Ьуз 165

Не

Азп

Азр

Рго

Зег 170

Зег

Ьеи

Ьеи

РЬе

Уа1 175

Рго

(31у

Рго

Ьуз

<31и 180

С1п

Не

С1и

С1п

Уа1 185

Ьеи

Ьуз

С1и

Ьеи

Ьуз 190

Ьеи

Ьеи

Агд

4 РЬе

РЬе 195

Уа1

Суз

РЬе

Уа1

Зег 200

Азп

Ьуз

Суз

Не

О1и 205

Рго

С1п

Туг

С1п

Нхз 210

ТЬг

ТЬг

РЬе

Туг

ТЬг 215

Нхз

А1а

Ьеи

11е

С1и 220

А1а

Зег

Нхз

Не

А1а 225

Мее

Уа1

Уа1

Тгр

Ьеи 230

Азп

Ьеи

Рго

Не

Туг 235

О1у

Азп

Агд

Азп

С1п 240

Азр

Ьеи

А1а

Зег

Зег 245

С1и

Уа1

Зег

Суз

Ьеи 250

Ьеи

Зег

Азр

РЬе

МеС 255

С1и

МеЕ

Ьуз

11е

Ьуз 260

Зег

11е

С1п

Рго

Азр 265

Не

Зег Агд

Азп

Азп 270

Не

Туг

11е

Азр

Уа1 275

Ьеи

Агд

А1а

Ьеи

Ьуз 280

Зег

ТЬг

Не

Рго

С1П 285

А1а

(31п

Азр

Ьуз

Нхз 290

А1а

А1а

С1и

Зег

С1у 295

Не

Уа1

<31и

ТЬг

Рго 300

ТЬг

ΗΪ3

Азп

Ьеи

ме£ 305

Уа1

<31У

Ьеи

Зег

Азр 310

С1П

МеИ

А1а

Азп

Ьеи 315

С1п

61и

МеЕ

Ьеи

Суз 320

Ьеи

Ьеи

Агд

Азр

Азп

Ьеи

Не

Нхз

Ьеи

Рго

Не

Ьеи·

Азр

Ьеи

С1и

РЬе

325 330 335

- 40 008599

ΗΪ3 Ьеи С1п Азр Мек Азр Зег Уа1 Не УаХ Азр А1а СХу Ьеи Ьеи Не

340

345

350

Туг

Зег

Ьеи 355

Туг

Азр

Не

Ьуз

С1у 360

С1п

Ьуз

СХи

Азр

ТЬг 365

ТЬг

Ьеи

С1и

Азр

11е 370

Азп

С1п

А1а

Ьеи

С1у 375

РЬе

Азр

Ьеи

Рго

Агд 380

Азп

Не

СХи

Рго

Не 385

Ьуз

А1а

Мер

Не

Азп 390

Ьеи

УаХ

МеЕ

СХп

Ьуз 395

АХа

РЬе

СХп

Суз

Азп 400

Ьеи

Рго

Агд

Не

Н1з 405

С1у

Ьеи

С1у

Туг

УаХ 4X0

Азр

РЬе

Ьеи

Ьеи

Ьуз 415

Азп

Ьеи

Ьуз

Азр

РЬе 420

С1п

С1у Агд

Туг

Зег .425

Азр

Зег

.Ьеи

Азр

РЬе 430

Ьеи

Ьуз

Аза.

СХп

Ьеи 435

С1п

УаХ

Не

СХп

ТЬг 440

СХи

РЬе

СХи

Зег

Ьеи 445

СХп

Рго

РЬе

Ьеи

Ьуз 450

Уа1

Уа1

Уа1

С1и

СХи 455

Рго

ΗΪ8

Азп

Ьуз

Ьеи 460

Ьуз

ТЬг

Ьеи

Азп

С1и 465

Азр

Суз

А1а

ТЬг

С1п 470

Не

Не

Агд

Ьуз

АХа 475

Туг

СХи

УаХ

СХи

Туг 480

УаХ

Уа1

Азр

АХа

Суз 455

Не

Азп

Ьуз

СХи

УаХ 490

Рго

СХп

Тгр

Суз

Не 495

С1и

Агд

Тгр

Ьеи

Ьеи 500

Азр

Не

Не

СХи

СХи 505

Не

ТЬг

Суз

Не

Ьуз 5X0

АХа

Ьуз

11е

С1п

С1и 515

Ьуз

Азп

ТЬг

Уа1·

С1и 520

Азр

ТЬг

МеЕ

Ьуз

ТЬг 525

Уа1

Не

А1а

Агд

ТЬг 530

Зег

Зег

Ьуз

Ьеи

АХа 535

Агд

ТЬг

Рго

Агд

МеЕ 540

Азп

СХи

С1и

11е

Уа1 545

С1у

РЬе

С1и

Азр

Уа1 550

Не

СХи

Азп

Ьеи

Агд 555

Ьуз

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Азп 560

С1у

ТЬг

Ьуз

С1у

С1п

Азр

Уа1

1Хе

Зег

IX е

ΗΪ3

С1у.

МеЪ

Рго

С1у

Ьеи

565 570 575

- 41 008599

С1у

Ьуз

ТЬг

ТЬг 580

Ьеи

А1а

Азп

Зег

Ьеи 585

Туг

Зег

Азр

Агд

Зег 590

Уа1

РЬе

Зег

С1п

РЬе 595

Азр

11е

Суз

А1а

С1п .600

Суз

Суз

Уа1

Зег

<31п 605

Уа1

Туг

Зег

Туг

Ьуз 610

Азр

Ьеи

11е

Ьей

А1а 615

Ьеи

Ьеи

Агд

Азр

А1а 620

Не

С1у

С1и

С1у

Зег 625

Уа1

Агд

Агд

С1и

Ьеи 630

Нхз

А1а

Азп

С1и

Ьеи 635

А1а

Азр

МеЪ

Ьеи

Агд 640

Ьуз

ТЬг

Ьеи

Ьеи

Рго 645

Агд

Агд

Туг

Ьеи

Не 650

Ьеи

Уа1

Азр

Азр

Уа1 655

Тгр

С1и

Азп

Зег

Ча1 660

Тгр

Азр

Азр

Ьеи

Агд 665

С1у

Суз

РЬе

Рго

Азр 670

Уа1

Азп

Азп

Агд

Зег 675

Агд

11е

Не

Ьеи

ТЬг 680

ТЬг

Агд

Нхз

Нхз

С1и 685

Уа1

А1а

Ьуз

Туг

А1а 690

Зег

Уа1

ΗΪ3

Зег

Азр 695

Рго

Ьеи

Нхз

Ьеи

Агд 700

МеЬ

РЬе

Азр

С1и

Ча1 705

<31и

Зег

Тгр

Ьуз

Ьеи 710

Ьеи

61и

Ьуз

Ьуз

Уа1 715

РЬе

С1у

<31и

О1и

Зег 720

Суз

Зег

Рго

Ьеи

Ьеи 725

Ьуз

Азп. Уа1

С1у

Ьеи 730

Агд

Не

А1а

Ьуз

МеЕ 735

Суз

е1у

С1п

Ьеи

Рго 740

Ьеи

Зег

Не

Уа1

Ьеи 745

Уа1

А1а

С1у

Не

Ьеи 750

Зег

С1и

МеЪ

С1и

Ьуз 755

51и

Уа1

С1и

Суз

Тгр 760

С1и

С1п

Уа1

А1а

Азп 765

Азп

Ьеи

(31у

Зег

Туг 770

Не

Нхз

Азп

Азр

Зег 775

Агд

А1а

Не

Уа1

Азр 780

Ьуз

Зег

Туг

Нхз

Уа1 785

Ьеи

Рго

Суз

НХЗ

Ьеи 790

Ьуз

Зег

Суз

РЬе

Ьеи 795

Туг

РЬе

С1у

А1а

РЬе 800

Ьеи

С1и

Азр

Агд

Уа1

Не

Азр

Не

Зег

Агд

Ьеи

Не

Агд

Ьеи

Тгр

Не

805 . 810 815

- 42 008599

Зег

61и

А1а

РЬе 820

11е

Ьуз

Зег

Зег

С1и 825

,(31у Агд

Агд

Ьеи

О1и 830

Азр

Не

А1а

Й1и

С1у 835

Туг

Ьеи

С1и

Азп

Ьеи 840

Не

СЯу Агд

Азп

Ьеи 845

Уа1

МеЬ

Уа1

ТЬг

С1п 850

Агд

Зег

Не

Зег

Азр 855

С1у

Ьуз

А1а

Ьуз

С1и 860

Суз

Агд

Ьеи

Нхз

Азр 865

Уа1

Ьеи

Ьеи

Азр

РЬе 870

Суз

Ьуз

С1и

Агд

А1а 875

А1а

61и

С1и

Азп.

РЬе 880

Ьеи

Ьеи

Тгр

11е

Азп 885

Агд Азр

С1п

11е

ТЬг 890

Ьуз

Рго

Зег

Зег

Суз 895

Уа1

Туг

Зег

Нхз

Ьуз 900

С1п

Нхз

А1а

НХЗ

Ьеи 905

А1а

РЬе

ТЬг

С1и

МеЬ 910

Нхз

Азп

Ьеи

Уа1

(31и 915

Тгр

Зег

А1а

Зег

Суз 920

Зег

РЬе

Уа1

С1у

Зег 925

Уа1

Уа1

Ьеи

Зег

Азп 930

Ьуз

Туг

Азр

Зег

Туг 935

РЬе

Зег

ТЬг

Агд

Азр 940

Не

Зег

Зег

Ьеи

Нхз 945

Азр

РЬе

Зег

Не

Зег 950

Агд

Не

Ьеи

Рго

Азп 955

РЬе

Ьуз

РЬе

Ьеи

Ьуз 960

Уа1

Ьеи

Азр

Ьеи

С1и 965

Нхз

Агд

Уа1

РЬе

Не 970

Азр

РЬе

Не

Рго

ТЬг 975

С1и

Ьеи

Уа1

Туг

Ьеи 980

Ьуз

Туг

РЬе

Зег

А1а 985

Н1з

Не

(31и

С1п

Азп 990

Зег

Не

Рго Зег Зег Не Зег Азп. Ьеи Тгр Азп Ьеи (31и ТЬг Ьеи Не Ьеи Ьу£ 995 1000 1005

Зег

Рго 1010

Не

Туг

А1а

Ьеи

Агд 1015

Суз

ТЬг

Ьеи

Ьеи

Ьеи 1020

Рго

Зег

ТЬг

Уа1

Тгр 1025

Азр

МеЬ

Уа1

Ьуз

Ьеи 1030

Агд

Нхз

Ьеи

Туг

Не 1035

Рго

Азр

РЬе

Зег

ТЬг 1040

Агд

Не

С1и

А1а

А1а 1045

Ьеи

Ьеи

С1и

Азп

Зег 1050

А1а

Ьуз

Ьеи

- 43 008599

Туг

Азп 1055

Ьеи

С1и

ТЬг

Ьеи

Зег 1060

ТЬг

Ьеи

Туг

РЬе

Зег 1065

Агд

Уа1

С1и

Азр

А1а 1070

С1и

Ьеи

МеЕ

Ьеи

Агд 1075

Ьуз

ТЬг

Рго

Азп

Ьеи 1080

Агд

Ьуз

Ьеи

Не

Суз 1085

С1и

Уа1

01и

Суз

Ьеи 1090

С1и

Туг

Рго

Рго'

С1п 1095

Туг

Нхз

Уа1

Ьеи

Азп 1100

РЬе

Рго

11е

Агд

Ьеи 1105

О1и

Не

Ьеи

Ьуз

Ьеи 1110

Туг

Агд

Зег

Ьуз

РЬе 1115

Ьуз

ТЬг

Не

Рго

РЬе ' 1120

Суз

Не

Зег

А1а

Рго 1125

Азп

Ьеи

Ьуз

Туг

Ьеи изо

Ьуз

Ьеи

Суз

С1у

РЬе 1135

Зег

Ьеи

Азр

Зег

С1п 1140

Туг

Ьеи

Зег

С1и

ТЬг 1145

А1а

Азр

Нхз

Ьеи

Ьуз 1150

Нхз

Ьеи

С1и

Уа1

Ьеи 1155

Не

Ьеи

Туг

Ьуз

νηΐ 1160

С1и

РЬе

<21у

Азр

Нхз 1165

Агд

С1и

Тгр

Ьуз

Уа! 1170

Зег

Азп

<51у

Ьуз

РЬе 1175

Рго

С1п

Ьеи

Ьуз

Не 1180

Ьеи

Ьуз

Ьеи

С1и

Туг 1185

Ьеи

Зег

Ьеи

Уа1

Ьуз 1190

Тгр

11е

Уа1

А1а

Азр 1195

Азр

А1а

РЬе

Рго

Азп 1200

Ьеи

(31и

С1п

Ьеи

Уа1 1205

Ьеи

Агд

С1у

Суз

<31п 1210

Азр

Ьеи

МеЕ

С1и

Не 1215

Рго

Зег

Суз

РЬе

МеЕ 1220

Азр

11е

Ьеи

Зег

Ьеи 1225

Ьуз

Туг

Не

О1у

Уа1 1230

С1и

Туг

Суз

Азп

С1и 1235

Зег

Уа1

Уа1

Ьуз

Зег 1240

А1а

Ьеи

Азп

Не

βΐη 1245

С1и

ТЬг

С1п

Уа1

Й1и 1250

Азр

Туг

С1п

АЗП

ТЬг 1255

Азп

РЬе

Ьуз

Ьеи

Уа1 1260

Ьеи

Не

С1и

РЬе

Зег 1265

Ьеи

С1п

Ьуз

Ьуз

А1а 1270

Тгр

Ьуз

Ьеи

Азп

Ьеи 1275

ТЬг

Азр

А1а

- 44 008599

С1и Азр Мей. Нхз Азп А1а Уа1 Ьуз Азп 11е Ьеи А1а С1и Не Агд 1280 1285 1290 <210> 3 <211> 26 <212> БИА <213> Ах±х£1сха1 зедиепсе <220>

<223> О1хдопис1ео£хс1е <40 0> 3 ааасссддЪд йЬссаааЪсЪ аасасЬ <210> 4 ' <211> «26 <212> ΏΝΆ <213> Аг£х£хсха1 зедиепсе <220>

<223> О1хдопис1ео£х(3е <400> 4 саЪдЪадЬда ддаЪаЪдЪса сдадйд <210>5 <211> 21 <212> т.

<213> Аг£х£хсха1 зедиепсе <220>

<223> 01хдопис1еоЪхс1е <400>5 аЬЬасаайдд дййдааскса д

- 45 008599

<210>	6
<211>	22
<212>	ΕΝΆ
<213>	АгЕ1£1с1а1 зедиепсе
<220>
<223>	011допи.с1 βοΕίάβ
<400>	6
ассЬсЕЕЕса аЕЕдЕЕсЕдд Ед	22
<210>	7 '
<211>	22
<212>	ϋΝΑ '
<213> »	АгЕ1£1с1а1 зедиепсе
<220>
<223>	011допис1еоЕ1<1е
<400>	7 ’
сасЕсдЕдас аЕаЕссЕсас Еа	22
<210>	8
<211>	18
<212>	СКА
<213>	АгЕ1£1с1а1 зедиепсе
<220>
<223>	011допис1еоЕ1с1е
<400>	8
саасссЕддс аЕдссасд	18
<210>	9
<211>	4
<212>	РКТ

- 46 008599 <213> АгЫ£1С1а1 зедиепсе <220>

<223> Сопзегтгей йошахп.

<400> 9

С1у Ьеи Рго Ьеи <210> 10 <211> 4 <212> РКТ <213> Аг£1£1с1а1 зедиепсе <22 0>

<223> Сопзегуей (Зотахп <-400> 10

С1п Ьеи Рго Ьеи '

<210> 11 <211* 4 <212> РКТ <213> АгЕ1£±сха1 зедиепсе <22 0>

<223> Сопзег-уес! йотахп <400> И

Суз Ьуз Ьеи Туг <210> 12 <211> 4 <212> РКТ <213> АгЕ££1с1а1 зедиепсе <220>

<223> Сопзехйгей екяпахп <400> 12

Суз РЬе Ьеи Туг

- 47 008599

Claims (18)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, способный придавать устойчивость к патогену растению, в котором экспрессируется упомянутый полипептид, при этом указанная нуклеиновая кислота содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, включающей:

   (a) нуклеотидную последовательность, кодирующую, по меньшей мере, зрелую форму полипептида В1, который содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 2;

   (b) нуклеотидную последовательность, включающую по меньшей мере одну или более кодирующих областей последовательности ДНК 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 1;

   (c) нуклеотидную последовательность, гибридизующуюся с комплементарной цепью нуклеотидной последовательности, определенной в (а) или (Ь), в жестких условиях гибридизации, при этом данная нуклеотидная последовательность по меньшей мере на 60% гомологична нуклеотидным последовательностям (а) или (Ь);

   (б) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, полученный из полипептида, кодируемого нуклеотидной последовательностью (а) или (Ь), путем замещения, делеции и/или присоединения одной или нескольких аминокислот, при этом данная нуклеотидная последовательность по меньшей мере на 60% гомологична нуклеотидным последовательностям (а) или (Ь);

   (с) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 60% идентичную аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеотидными последовательностями (а) или (Ь);

   (Г) нуклеотидную последовательность, кодирующую один, или любые два, или три домена, выбранных из домена лейциновой молнии (ΕΖ), соответствующего аминокислотным положениям 308-329 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2, домена сайта нуклеинового связывания (ИВ8), соответствующего аминокислотным положениям 572-682 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2, и домена, богатого лейциновыми повторами (ЬВК), соответствующего аминокислотным положениям 780-1280 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2;

   (д) нуклеотидную последовательность, кодирующую эпитоп-несущую часть полипептида В1, кодируемого нуклеотидной последовательностью (а) или (Ь), при этом данная нуклеотидная последовательность по меньшей мере на 60% гомологична нуклеотидным последовательностям (а) или (Ь);

   (1) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, включающий один или более мотивов, приведенных в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 10 и 12, или аминокислотную последовательность БНЭ;

   (ί) последовательность ДНК, полученную путем скрининга соответствующей библиотеки в жестких условиях при помощи зонда, включающего по меньшей мере 17 последовательно расположенных нуклеотидов любой нуклеотидной последовательности 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1 или 5-8, при этом указанная последовательность ДНК по меньшей мере на 60% гомологична нуклеотидной последовательности 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1 или нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2;

   (ί) нуклеотидную последовательность, полученную из любой нуклеотидной последовательности (а)-(1), на основе принципа вырожденности генетического кода.
2. 2. Молекула нуклеиновой кислоты по п.1, отличающаяся тем, что упомянутый патоген представляет собой Рйу!орй!йога ш£ск!апк.
3. 3. Молекула нуклеиновой кислоты длиной по меньшей мере 15 нуклеотидов, специфически гибридизирующаяся с молекулой нуклеиновой кислоты по п.1 или 2 или с ее комплементарной цепью, при этом указанная молекула нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 99% гомологична молекуле нуклеиновой кислоты 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1 или нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2.
4. 4. Вектор, включающий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-3.
5. 5. Вектор по п.4, представляющий собой вектор экспрессии, в котором молекула нуклеиновой кислоты оперативно связана с одной или более контролирующими последовательностями, обеспечивающими возможность транскрипции и, возможно, экспрессии в прокариотических и/или эукариотических клетках-хозяевах.
6. 6. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.4 или 5 или молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-3.
7. 7. Полипептид В1 или его функционально эквивалентный фрагмент, кодируемый нуклеиновой кислотой по п.1 или 2.
8. 8. Антитело или аптамер, специфически распознающий полипептид по п.7 или его фрагмент или эпитоп.
9. 9. Трансгенная клетка растения, включающая молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-3, которая оперативно связана с регуляторными элементами, обеспечивающими возможность транскрипции и/или экспрессии последовательности ДНК в растительных клетках.
10. 10. Трансгенное растение или ткань растения, содержащие клетки растения по п.9.
11. 11. Последовательность промотора, регулирующего экспрессию гена, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты по п.1 или 2, включающая последовательность ДНК, выбранную из группы, со

    - 48 008599 держащей:

    (a) ДНК-последовательность, включающую нуклеотидную последовательность 8ЕР ΙΌ N0: 1 от нуклеотида 1 до 2222 или ее часть (части);

    (b) ДНК-последовательность, включающую по меньшей мере 14 последовательно расположенных нуклеотидов из нуклеотидной последовательности 8ЕР ΙΌ N0: 1 от нуклеотида 1 до 2222;

    (c) ДНК-последовательность, гибридизующуюся с нуклеотидной последовательностью, определенной в (а) или (Ь), в жестких условиях, при этом данная ДНК-последовательность по меньшей мере на 60% гомологична нуклеотидным последовательностям (а) или (Ь);

    (й) ДНК-последовательность или ее фрагмент, полученные скринингом соответствующей геномной библиотеки ДНК-зондом, полученным на основе нуклеотидной последовательности, определенной в п.1; и (е) ДНК-последовательность, соответствующую последовательностям (а), (Ь) и (с), содержащим консервативные замены нуклеотидов, где указанная регуляторная последовательность способна вызывать или модулировать экспрессию гетерологичной последовательности ДНК после инфицирования патогеном.
12. 12. Рекомбинантная молекула ДНК, включающая регуляторную последовательность по п.11.
13. 13. Рекомбинантная молекула ДНК по п.12, в которой упомянутая регуляторная последовательность оперативно связана с гетерологичной ДНК-последовательностью.
14. 14. Клетка-хозяин, трансформированная регуляторной последовательностью по п.11 или рекомбинантной молекулой ДНК по п.12 или 13.
15. 15. Трансгенное растение, ткань растения или клетка растения, содержащая регуляторную последовательность по п.11 или рекомбинантную молекулу ДНК по п.12 или 13.
16. 16. Способ идентификации соединения для защиты растений, включающий следующие этапы:

    (a) культивирование клетки растения или ткани растения или выращивание растения, содержащего рекомбинантную молекулу ДНК по п.12, в присутствии тестируемого соединения или образца, содержащего тестируемые соединения, в условиях, которые обеспечивают экспрессию указанной молекулы ДНК;

    (b) идентификацию или верификацию образца и соединения, соответственно, как непригодного или пригодного для защиты растения на основании их способности вызывать супрессию, или активацию, и/или улучшение экспрессии указанной молекулы ДНК в указанном растении, клетке растения или ткани растения.
17. 17. Способ идентификации кДНК, кодирующей фактор авирулентности или вирулентности патогена, включающий следующие этапы:

    (a) скрининг с помощью полипептида К1 по п.7 или его фрагмента из соответствующей библиотеки экспрессии кДНК, кодирующей возможный фактор авирулентности или вирулентности патогена;

    (b) идентификацию кДНК патогена как кодирующей фактор авирулентности или вирулентности по способности её продукта супрессировать или активировать транскрипцию гена полипептида К1.
18. 18. Композиция для придания растению устойчивости к патогену, включающая в качестве активного ингредиента молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-3, вектор по п.4 или 5, полипептид по п.7, антитело или аптамер по п.8, регуляторную последовательность по п.11 или рекомбинантную молекулу ДНК по любому из пп.12 или 13.