KR100571194B1 - 사과속 병저항성 유전자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사과속 병저항성 유전자에 관한 것으로서, 다양한 유전자가 존재하는 야생종 사과에서 TIR-NBS-LRR type R gene인 고유의 병저항성 유전자를 찾아 이병성 품종으로 과발현시킴으로 내병성 품종의 육종을 이루기 위한 것이다.

사과, 병저항성 유전자, 내병성, Malus baccata, R gene

Description

사과속 병저항성 유전자{DISEASE TOLERANCE TYPE GENE MBR7 FROM APPLE}

도 1은 본 발명의 실험예에 따른 전기영동 사진.

도 2는 본 발명의 MbR7유전자를 형질전환한 식물체의 내병성 발현을 기타 종래 식물체와 비교한 것으로서,

(A)는 종래 일반적인 형질전환하지 않은 식물체.

(B)는 본 발명에 따른 형질전환 식물체.

(C)는 본 발명의 비교예로서 MbR7유전자가 미포함되고 vector만 형질전환한 식물체.

본 발명은 사과속 병저항성 유전자에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 사과에서 다수의 병저항성 유전자를 찾기 위해 야생종 사과의 저항성 유전자를 새로이 찾아 이병성 사과품종에 이를 발현시켰을때 내병성을 유도하는 품종육종을 이루기 위한 것이다.

지금까지는 식물의 병 방제법중에서 주로 농약을 살포하는 화학적 방제법에 크게 의존하는 까닭에 농약의 다량살포에 따른 환경파괴와 인축독성 잔류 독성등의 많은 문제점이 대두되고 있다. 이에 따라 환경과 인류에 해가 없거나 적은 병 방제 방법의 개발 및 도입이 요구되었으며 생물학적 방제와 함께 저항성 품종의 육성, 보급 및 재배를 통해 병 발생의 억제를 유도하고자 하는 방제법의 활용에 대한 관심이 증폭되고 있다.

그러나 주로 전통적인 육성에 의해서 식물체를 육성해 내는데에는 현재까지 저항성이 가장 강한 야생종 형태의 계통을 교배친으로 이용하여 왔는데 이러한 경우 저항성 관련 형질 이외에 많은 유용형질에서 분리가 일어나 1차적인 목표형질인 과실의 우수한 형질을 잃게되는 경우가 많아 육종상 어려움이 있다.

그러므로 기존 우수품질의 형질을 유지하면서 야생종의 저항성 유전자를 도입하는 것이 가능한 생명공학 기술을 전통적 육종 방법에 접목하여 전통적 육종의 단점을 최소화 할 수 있는 육종의 확립이 절대적으로 필요하다.

따라서, 본 발명에서는 병저항성이 강한 야생종사과 Malus baccata(매주나무)의 잎에서 TIR-NBS type의 저항성 유전자를 확보하기 위해 NBS domain을 probe로 하는 RGA를 확보하고 cDNA library제작 및 screening, RACE 법을 통하여 full length 유전자를 찾는데 그 목적이 있다.

상기 목적을 이루기 위한 본 발명은 야생종 사과 (Malus baccata)의 cDNA library 제작과 RGA probe로 screening을 하여 cDNA fragment를 얻은 후 RACE (Rapid Amplification cDNA Ends)를 통하여 full length TIR-NBS-LRR type R gene 의 발현 유전자를 찾고, 이를 cloning 및 염기서열 분석을 통한 단계로 이루어진다.

이하 본 발명은 하기 실시예를 통하여 상세히 설명하지만 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

<제 1 단계: 사과 잎으로부터의 게놈 DNA 추출>

먼저, Genomic DNA를 분리하기 위해 cethyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) 방법을 사용하였다. 사과의 어린잎을 4g 채취하여 깨끗이 씻고 물기를 제거한 다음, 액체질소를 이용하여 곱게 마쇄한다.

그리고, 2g polyvynylpyrrolidone (PVP) 가루를 넣고 섞어준 후 원심분리 튜브에 옮겼다. 미리 얼음에 식힌 extraction buffer I (0.25M NaCl, 0.2 M Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM EDTA (pH 8.0) 35ml 과 0.7ml β-mercaptoethanol을 넣고, 잘 섞은 다음 10분 후 얼음에 꽂아두었다가 7000rpm, 4℃, 10분간 원심분리하고 상층액을 제거한 후, 미리 65℃로 데운 extraction buffer II(0.1M Tris-HCl(pH 8.0), 20 mM EDTA, 1.4M NaCl, 2%(w/v) CTAB) 15ml과 β-mercaptoethanol 30 ml을 넣고 잘 섞어준 후, 65℃, 40분에서 1시간 30분 정도 가끔 섞어주면서 반응시켰다.

Chloroform과 isoamylalcohol을 혼합 (24:1 부피비)하여 만든 추출 용액을 같은 부피로 넣고 10분 동안 잘 섞어준 후, 7000 rpm, 4℃, 20 분 동안 원심분리하였다. 상층액을 새 튜브로 옮긴 후 같은 부피만큼 chlroform과 isoamylalcohol을 혼합하여 추출용액으로 한번 더 불순물을 추출하였다. 상층액을 넣고, -20℃에서 침전되도록 하였다.

30분 이상 지난 후 10,000 rpm, 4℃, 5분간 원심분리하여 침전물을 가라앉힌 후, 상층액을 제거하고, 1X TE를 5ml 넣고 잘 녹인 후 1.5ml 튜브에 옮겼다. 1/2 부피의 5M NaCl을 넣고 잘 섞은 후 미리 얼음에 식힌 ethanol을 2배 부피 넣은 후 -20℃에서 30분 이상 침전물을 가라앉힌 후 10,000 rpm, 4℃, 5 분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 2회에 걸쳐 75% ethanol을 넣어 씻어내기를 하였다. 진공펌프로 완전히 말려 적당한 부피의 0.1X TE완충액에 녹인 후 사용하기 전까지 -20℃에 보관하였다.

<제 2 단계: cDNA library 제작을 위한 RNA 추출>

가) LiCl 침전법과 CsCl 침전법을 변형시킨 RNA 분리

조직 2g을 액체 질소에서 분말상태가 될 때까지 간 후, 미리 냉각시킨 2ml 튜브에 담아 RNA 추출용 완충용액(100mM Tris-Cl(pH 9.0), 20mM EDTA pH 8.0, 200mM NaCl, 4% sarkosyl, 16mM β-mercaptobenzothiazol, 16mM DTT, 10mg/ml heparin, 5% BSA) 10mL을 넣고 5분간 세게 흔들어 주었다. 다시 15ml의 기본 추출 완충용액 (100mM Tris-Cl (pH 9.0), 20mM EDTA pH 8.0, 200mM NaCl, 4% sarkosyl, 16mM β-mercaptobenzothiazol, 16mM DTT)을 넣고 5분간 더 섞어주었다.

그리고, 새로운 40 mL 튜브에 옮기고 1ml의 proteinase K (10mg/ml)을 넣고 잘 섞은 후, 37℃에서 100rpm으로 흔들어 주면서 15분간 반응시켰다. 12000 rpm, 20℃에서 10분간 원심분리하여 위층을 얻었다. Tris 완충용액에 포화된 페놀을 이용한 추출을 두 번 더 시행하였다. 같은 부피의 chloroform과 isoamylalcohol (24:1)을 넣고 잘 섞은 다음, 12000 rpm, 20℃에서 10분간 원심분리하고 윗층을 튜 브에 옮긴 후, 이를 한번 더 시행하였다. 1/3 부피의 8 M LiCl을 넣고 잘 섞은 다음, 4℃에서 30분 이상 원심분리하여 위층액을 버리고 2 M LiCl 5 mL로 12000 rpm, 4℃에서 30분이상 원심분리 한 후 위층액을 버리고 2M LiCl 5 mL로 12000 rpm, 4℃에서 20분간 원심분리 한 후 충분히 잘 혼합하였다.

4.5mL의 5.7 M CsCl을 첨가한 후 충분히 잘 혼합한 용액을 끝까지 채워 넣었다. 밀봉 후 Ti71로터를 이용하여 55000rpm, 22℃에서 12시간 동안 멈춤없이 초원심 분리하였다. 다음날 주사기로 위층 일부를 제거한 후 튜브를 자르고, pasteur pippet으로 위층액을 제거한 후 상온에 두어 말렸다. 5분 후 RNA 침전물을 500μL의 DEPC 처리된 증류수에 충분히 녹인 후, 1.5mL튜브에 옮기고 같은 부피의 acidic phenol : chloroform : isoamylalccohol (25:24:1 부피비)로 추출한 후 위층을 새 튜브에 옮기고 다시 같은 부피의 chloroform : isoamylalcohol (24:1 부피비)을 잘 섞은 다음, 12000rpm, 20℃에서 10분간 원심분리하였다.

윗층을 튜브에 옮긴 후 1/10 부피의 3 M sodium acetate (pH 5.2)와 2.5배 부피의 100% 에탄올을 넣고 잘 섞은 다음 -70℃에 1시간 동안 침전 시켰다. 1시간 후 12000 rpm, 4℃에서 30분간 원심분리 한 후 75% 에탄올로 두 번 세척하였다. 침전물을 상온에서 잘 말린 후 DEPC 처리한 물로 적당한 부피로 녹였다. Spectrophotometer로 O.D₂₆₀, ₂₈₀을 측정하여 정량한 후 사용하기 직전까지 -70℃에 보관하였다.

나) Poly (A⁺) RNA 분리

약 0.5~1 mg의 total RNA를 RNase-free물에 잘 녹였다. 65℃에서 10분간 반응시킨 후, 150 pmol의 biotinylated-oligo (dT)¹⁸ probe의 annealing을 위해 25μL의 20 X TEN₁₀₀ (10mM Tris-HCl pH8.0, 0.1mM EDTA pH8.0, 100mM NaCl) 첨가한 후 상온에서 10분간 반응시켰다. 300μL의 TEN₁₀₀으로 3번 정도 씻어준 streptavidin magnetic particle (Boehringer Mannheim)이 들어있는 튜브에 annealing 시킨 반응액을 넣고 10~20분간 상온에서 반응시켰다. streptavidin magnetic particle 이 붙은 Poly(A⁺) RNA을 magnetic stand로 잡은 후 300μL의 TEN₁₀₀₀ (10 mM Tris-HCl pH8.0, 1mM EDTA pH8.0, 1M NaCl)으로 4번정도 씻었다.

마지막으로 250 μL의 RNase-free 물로 충분히 우려냈다. cDNA합성을 위해 농축하기 위해서 에탄올 침전법을 수행하고 적당한 부피의 RNase-free 물로 녹였다. 실험에 사용하기까지 -70℃에 보관하였다.

<제 3 단계: cDNA library 제조와 탐침자의 준비>

사과 잎에서 Poly(A⁺) RNA로부터 λZAPII cDNA Synthesis kit와 ZAP-cDNA Gigapack II Gold Cloning kit를 사용하여 cDNA library를 제조하였다.단일가닥과 이중가닥의 cDNA합성에는 5μg의 Poly(A⁺) RNA을 사용하였다. superscript II RT와 XhoI절단 부위가 부착된 oligo dT를 primer로 사용하여 첫 번째 가닥 cDNA을 합성하였다. RNaseH와 E.coli DNA polymerase I 으로 RNA를 제거하면서 두 번째 가닥 cDNA을 합성하였다. 말단을 만들고 EcoRI adaptor를 양쪽말단에 결합시킨 후 T4 polynucleotide kinase 처리하고 XhoI으로 절단하였다. 합성한 이중가닥 cDNA는 Sephacryl S-500 HR spin 컬럼을 사용하여 500bp 이하의 이중가닥 cDNA를 제거하고 λZAPII백터의 EcoRI/XhoI 부위에 클로닝하였다. 이렇게 만든 cDNA는 Poly(A)가 부착된 3´부위의 백터의 XhoI 부위에 cDNA 5´부위가 EcoRI 부위에 결합되기 때문에 cDNA의 방향이 쉽게 구분될 수 있는 장점이 있다. ZAP-cDNA Gigapack II Gold packaging extract를 사용하여 in vitro packaging 한 후 대장균 균주인 XL1-Blue MRF´에 접종하여 titration 및 cDNA library 증폭을 수행하였다.

<제 4 단계: 탐침자의 제작>

Random primer labeling kit (strategene)를 이용하여 탐침자를 만들었다. 탐침으로 할 NBS domain부분을 PCR 하여 마든 plasmid DNA를 SpeI과 BamHI 제한효소로 절단한 후 low melting temperature (LMT) agarose gel (1%)에 전기영동하여 크기에 따라 분리한 후, 원하는 크기의 DNA를 포함한 부분을 잘라내었다. gel 1g당 증류수 3 mL을 넣고 65℃, 5분간 처리한 후 잘 섞고 random labeling kit로 reaction 하였다.

<제 5 단계: cDNA library screening>

cDNA library 10⁵ pfu의 phage들을 XL1 Blue MRF` 균주 600μL (OD₆₀₀=0.5)와 37℃에서 15분간 반응시킨 후, 6.5 ml의 NZY top agar와 섞어 10개의 NZCYM 고형 배지에 부어 굳힌 다음, 6시간 동안 키웠다. 4℃에서 8시간 동안 두어 차갑게 한 다음, phage를 nitrocellulose membrane 2장으로 옮겼다.

변성화 용액 (1.5M NaCl, 0.5M NaOH)에 2분, 중성화 용액 (1.5M NaCl, 0.5M Tris-HCl (pH8.0))에 5분, 세척 용액 (0.2 M Tris-HCl (pH7.5), 2X SSC)에 3000초간 담근다음 Whatman 3MM paper위에서 잠깐 말리고 80℃에서 1시간 45분간 구워 고정이 되도록 하였다.

Membrane을 혼성화 용액 (1% BSA, 0.25 M sodium phosphate (pH 7.0)), 7% SDS, 1mM EDTA, 0.25 M NaCl, 50% forrmamide)에 넣고 1시간 동안 42℃에서 흔들어 혼성화 전반응을 한 다음, 방사성 동위원소로 표지한 탐침자로 혼성화 반응을 42℃에서 하룻밤 동안 수행하였다. 다음날 세척용액으로 상온에서 30분씩 두 번, 65℃에서 15분간 두 번 세척한 후 X-RAY 필름에 1시간 노출시켰다.

혼성화가 된 phage plaque들 SM 완충용액 1ml, chloroform 20 μL에 넣고, titer 한다음, 플레이트당 50~200 pfu가 되도록 NZCYM 고형배지에 깔고 2차 screening을 1차 screening과 같은 방법으로 수행하였다. 단일 plaque로 얻어진 것들은 in vivo excision을 수행하여 대장균 균주내의 plasmid 형태로 전환시켰다.

각 클론들은 EcoRI/XhoI 제한효소로 자르고 전기영동으로 분리한 후, cDNA blotting을 수행하여 1 kb 이상인 클론에 대해 sequencing 수행해 full length cDNA 클론인지 여부를 확인한다.

<제 6 단계: Northern analysis>

4.5μg의 Poly(A⁺) RNA를 1.3% agarose/formaldehyde gel에 30 Voltage로 3 시간 30분 정도 전기영동한 후, Hybond-N+ nylon membrane (Amersham)으로 옮겼다. 이때 사용한 탐침자는 라이브러리 screening 결과 확보된 plasmid를 KpnI/EcoRI 제한 효소로 37℃로 자른 후 cDNA 삽입 절편을 얻었다. 이 탐침자를 42℃에서 밤새 혼성화 반응한 후, 다음날 상온에서 2X SSC/0.5% SDS로 30분간 2번 세척하고, 0.5X SSC/0.5% SDS 로 15분간 두 번 세척 후 x-ray film에서 -70℃에서 48시간 노출시킨 후 현상하였다.(도 1)

한편, 도 2는 본 발명의 병저항성 유전자를 형질전환한 식물체의 병저항성 특성을 확인하기 위한 것으로서, 식물체를 자연상태에서 약 6개월간 경과시킨 것이다.

즉, 형질전환을 하지 않은 식물체는(A)와 본 발명의 MbR7 유전자가 미포함된 vector만으로 형질전환한 식물체는 토마토세균성 반점병이 심하게 발생하였으나, 본 발명의 유전자 형질전환 식물체는 반점병의 발생정도가 크게 감소된 것을 확인할 수 있었다.

이상에서 살펴본 바와같은 본 발명은, 다양한 유전자가 존재하는 야생종 사과에서 고유의 병저항성 유전자를 찾아 이병성 품종으로 과발현시킴으로 내병성 품종의 육종을 이루는 효과를 나타내게 된다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (2)

1. 사과 야생종 정선매주의 genomic DNA인 서열번호 1의 염기서열을 갖는 병저항성 유전자.
2. 사과 야생종 정선매주의 cDNA인 서열번호 2의 염기서열을 갖는 병저항성 유전자.

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