JP2001519649A

JP2001519649A - 精製タンパク質、組換えｄｎａ配列、およびカフェインを含まない飲料を製造するための方法

Info

Publication number: JP2001519649A
Application number: JP53462397A
Authority: JP
Inventors: アイ．スタイレス，ジョン; モイシャディ，イステフォ; ラジニュウペーン，カビ
Original assignee: ユニバーシティオブハワイ
Priority date: 1996-03-26
Filing date: 1997-03-24
Publication date: 2001-10-23
Also published as: US6075184A; US6348641B1; EP0862635A1; NO984463D0; NO324871B1; AP9801347A0; EA199800765A1; EA003835B1; UA73465C2; BR9710815A; AU711481B2; HUP0300851A3; OA11175A; KR100561889B1; FI982070A; CZ295397B6; IS4851A; PT862635E; FI982070A0; WO1997035960A8

Abstract

(57)【要約】精製タンパク質、その発現をコードするDNA配列、およびカフェインの発現を抑制するためにコーヒー植物を形質転換するための組換えDNA分子（それらで形質転換された宿主を含む）。DNA配列および組換えDNA分子は、これらがコーヒーにおけるカフェイン合成経路の酵素の発現をコードすることにより特徴付けられる。カフェイン生合成経路の少なくとも１つの酵素の発現をコードするmRNAに対してアンチセンスであるmRNAの転写をコードするDNA分子で形質転換されたコーヒー植物。

Description

【発明の詳細な説明】精製タンパク質、組換えDNA配列、およびカフェインを含まない飲料を製造するための方法本出願は、精製タンパク質、組換えDNA配列、それらで形質転換された宿主、ならびにカフェインを含まない飲料および食料品の製造方法に関する。より詳細には、本出願は、精製タンパク質、ならびにコーヒー植物およびそれから収穫した果実におけるカフェインの発現を抑制する組換えDNA配列に関する。本発明は、カフェインを含まないコーヒー植物の安定な系統を生じる。その果実は、ローストおよび粉砕の後に、カフェインを含まないコーヒーを調製するために使用され得る。本発明は、チャ（Camellia sinensis）およびコーラ（Cola acuminata ）におけるカフェイン合成、ならびにチョコレート（Theobroma cacao）における関連するアルカロイドを抑制するために使用され得ると予想される。発明の背景コーヒーは、Coffea属、一般に、C.arabica種の植物のローストして粉砕した豆から調製される。コーヒー植物は、アルカロイドカフェインを生産する。これは、それらの乾燥果実、コーヒー豆中に存在する。多くのコーヒー飲者は、カフェインを含まないコーヒーを好むので、コーヒー豆からカフェインを除去するために多くの方法が開発されている。これらの方法は全て、豆からのカフェイン以外の物質の除去を生じる。それゆえ、処理された豆から入れたコーヒーの風味に有害に影響を与える。少数の天然に存在するカフェインを含まないコーヒーおよび近縁の属が公知である（Mascarocoffea spp.およびCoffea bengalensis）が、これらは商業的な価値がない（CharrierおよびBerthaud，「Variation Of Caffe ine Content In The Coffea Genus」，Cafe’Cacao The'，14:251-264(1975)）。従って、豆からのカフェイン以外の物質の除去を生じない、カフェイン除去したコーヒー豆を生産するための方法についての必要性がある。カフェインは、とりわけコーヒー植物およびチャ植物により生産される、天然に存在するプリンアルカロイドである。カフェイン合成により植物が昆虫から防御されていると考えられている。コーヒー植物は、図１に示すように、４つの連続反応において、ヌクレオシドキサントシンからカフェインを合成する。概説については、Suzuki，T.，Ashihara，H.およびWaller，G.R.，Phytochemistry 31: 2575(1992)を参照のこと。この経路の第１段階は、S-アデノシルメチオニンによるヌクレオシドキサントシンのメチル化である。これは、酵素キサントシンＮ⁷ メチルトランスフェラーゼ（XMT）により触媒される。生成物である7-メチルキサントシンは、加水分解されて（リボースが除去されて）7-メチルキサンチンになり、そしてさらなるメチル化を受けてテオブロミンおよびカフェインになる。この一連の合成反応の妨害がカフェイン合成をブロックすると予想される。従って、コーヒー植物からカフェインを選択的に除去するストラテジーは、カフェイン生合成経路の特定の酵素の合成を防ぐことである。１つの実施態様において、本発明は、XMTの合成をなくすためのコーヒー植物の遺伝的改変に関する。現在好ましい実施態様において、XMTの合成は、XMTの発現をコードするメッセンジャーRNA（mRNA）にアンチセンスであるmRNAの転写をコードするDNA配列でコーヒー植物を形質転換することにより抑制される。本発明は、カフェインを含まない他の飲料および食料品（茶、ココア、およびチョコレートに基づく他の飲料または食品を含む）を生産することに一般化され得る。発明の要旨精製タンパク質、その発現をコードするDNA配列、およびカフェインの発現を抑制するためにコーヒー植物を形質転換するための組換えDNA分子（それらで形質転換された宿主を含む）。DNA配列および組換えDNA分子は、これらがコーヒーにおけるカフェイン合成経路の第１段階である酵素、キサントシンＮ⁷メチルトランスフェラーゼ（XMT）の発現をコードすることにより特徴付けられる。このD NAの塩基配列およびXMTの推定アミノ酸配列が提供される。コーヒー植物は、カフェイン生合成経路における少なくとも１つの酵素の発現をコードするmRNAにアンチセンスであるmRNAの転写をコードするDNA分子で形質転換される。アンチセンスRNAはXMT mRNAに結合し、それによりカフェイン合成経路の第１段階をコードするmRNAを不活化する。その結果、形質転換された植物は、カフェインを合成することができないが、それらの代謝の他の局面は影響を受けない。図面の簡単な説明図１は、Coffea arabicaにおけるカフェイン合成経路の模式図である。図２は、精製キサントシンＮ⁷メチルトランスフェラーゼの銀染色したSDS PAG Eゲルの写真である。図３は、精製キサントシンＮ⁷メチルトランスフェラーゼのトリプシン処理フラグメントのHPLC分離後の溶出を示す濃度測定プロットである。図４は、キサントシンＮ⁷メチルトランスフェラーゼをコードするcDNAをcDNA ライブラリーからスクリーニングするために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーの記載である。図５は、キサントシンＮ⁷メチルトランスフェラーゼをコードするcDNAの塩基配列である。図６は、キサントシンＮ⁷メチルトランスフェラーゼの推定アミノ酸配列を有する。発明の詳細な説明本明細書中に記載される発明がより充分に理解され得るように、以下の詳細な説明を示す。説明において、以下の用語が使用される：ヌクレオチド--糖部分（ペントース）、リン酸、および窒素含有複素環式塩基からなるDNAまたはRNAのモノマー単位。この塩基は、グリコシド炭素（ペントースの1'炭素）を介して糖部分に連結し、そして塩基および糖のこの組み合わせをヌクレオシドという。塩基は、ヌクレオチドを特徴付ける。４つのDNA塩基は、アデニン（「Ａ」）、グアニン（「Ｇ」）、シトシン（「Ｃ」）、およびチミン（「Ｔ」）である。４つのRNA塩基は、Ａ、Ｇ、Ｃ、およびウラシル（「Ｕ」）である。 DNA 配列--隣接するペントースの3'炭素と5'炭素との間のホスホジエステル結合により相互に連結されたヌクレオチドの直鎖状の配置。コドン--mRNAを通してアミノ酸、翻訳開始シグナル、または翻訳終結シグナルをコードする３つのヌクレオチド（トリプレット）のDNA配列。例えば、ヌクレオチドトリプレットTTA、TTG、CTT、CTC、CTA、およびCTGは、アミノ酸ロイシン（「Leu」）をコードし、TAG、TAA、およびTGAは、翻訳停止シグナルであり、そしてATGは翻訳開始シグナルであり、これはまたアミノ酸メチオニン（「MET」）をコードする。ポリペプチド--隣接するアミノ酸のアミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合により相互に連結されたアミノ酸の直鎖状の配置。ゲノム--細胞またはウイルスのDNA全体。これは、特に、物質のポリペプチドをコードする構造遺伝子、ならびにプロモーター、転写および翻訳の開始および終結の部位を含む。遺伝子--そのテンプレートまたはメッセンジャーRNA（「mRNA」）を通して、特定のポリペプチドに特有のアミノ酸の配列をコードするDNA配列。転写--遺伝子またはDNA配列からmRNAを生成するプロセス。翻訳--mRNAからポリペプチドを生成するプロセス。発現--遺伝子またはDNA配列により行われ、ポリペプチドを生成するプロセス。これは転写および翻訳の組み合わせである。プラスミド--インタクトな「レプリコン」を含み、その結果、プラスミドが宿主細胞において複製される、非染色体性二本鎖DNA配列。プラスミドが単細胞生物内に配置される場合、この生物の特徴は、プラスミドのDNAの結果として変化または形質転換され得る。例えば、テトラサイクリン耐性（TETR）のための遺伝子を有するプラスミドは、以前にテトラサイクリンに感受性であった細胞をそれに耐性の細胞に形質転換する。プラスミドにより形質転換された細胞を「形質転換体」と呼ぶ。ファージまたはバクテリオファージ--その多くが、タンパク質エンベロープまたはコート（「キャプシド」）内にキャプシド化されたDNA配列からなる細菌ウイルス。クローン化ビヒクル--宿主細胞内で複製し得る、プラスミド、ファージDNA、コスミド、または他のDNA配列。これらは、１つまたは少数のエンドヌクレアーゼ認識部位により特徴付けられる。この部位では、このようなDNA配列は、DNAの必須の生物学的機能（例えば、複製、コートタンパク質の産生）の付随する喪失、またはプロモーターもしくは結合部位の喪失を伴わずに、決定可能な様式で切断され得、そしてこれは形質転換された細胞の同定に使用されるのに適切なマーカー（例えば、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性）を含む。クローン化ビヒクルはしばしばベクターと呼ばれる。クローン化--ある生物または配列の１つに由来するこのような生物またはDNA 配列の集団を、無性生殖により得るプロセス。組換えDNA分子またはハイブリッドDNA-生存細胞の外で端と端とで連結されており、そして生存細胞中で維持され得る、異なるゲノム由来のDNAのセグメントからなる分子。 cDNA-特定のポリペプチドをコードするmRNAに相補的なDNA鎖。カフェインを含まないコーヒーを生産するためのストラテジーは、コーヒーおよび他のカフェイン生産植物におけるカフェイン合成経路における他の酵素に一般化され得るとはいえ、本発明の現在好ましい実施態様においては、この経路における第１の独特の酵素、キサントシンＮ⁷メチルトランスフェラーゼ（XMT）の発現が抑制される。カフェイン合成におけるXMTの役割は前駆体の放射標識により解明されているが、今日までこの酵素は精製されておらず、かつアミノ酸配列は決定されていない。従って、本発明は、実質的に精製されたXMTを含む。本発明はさらに、精製XMTから単離されたトリプシン処理フラグメントのアミノ酸配列を含む。精製酵素のサンプルから得たアミノ酸配列部分に基づくcDNAプローブを合成し、そして遺伝子の部分をPCRを用いて増幅した。PCR産物を用いて、若い葉のmRNA から合成したcDNAライブラリーをスクリーニングしてXMTをコードする転写産物を同定した。ポジティブな転写産物を配列決定し、そしてXMTをコードする遺伝子の約90％を得た。 XMTの発現をコードするDNAは、pBI-121形質転換ベクターに組み込まれる。このベクターは、カナマイシン耐性遺伝子を含む。植物細胞へのベクターの首尾良い取り込みは、抗生物質耐性の獲得によりモニターされる。構築物を用いて組織培養中のコーヒー体細胞性胚を形質転換する。その後、形質転換された胚は生長して、カフェインを生産しない新規なコーヒー植物となる。元々カフェイン除去されたコーヒーは、これらの新規な植物由来のローストして粉砕した果実から調製される。より詳細には、C.arabicaの若い葉由来の新鮮な葉組織を細断し、そしてそれからタンパク質を抽出した。カラム精製した抽出物を、Ｃ¹⁴標識したS-アデノシルメチオニンを基質として用いてキサントシンのメチル化をモニターすることにより、酵素活性についてアッセイした。反応生成物を、標識した反応生成物の移動を、４つの異なるクロマトグラフィー系の各々において3-メチルキサンチン、 7-メチルキサンチン、8-メチルキサンチン、7-メチルキサントシン、キサンチン、およびキサントシンの移動と比較することにより、7-メチルキサントシンとして確認した。タンパク質単離物の純度を、SDS PAGE電気泳動および二次元ゲル電気泳動を用いて決定した。一次元SDS PAGEゲルの銀染色は、XMTの酵素活性を有するダブレットの存在を示した。このダブレットは、図２に示すように、36〜37キロダルトン（kD）の分子量を有する。各タンパク質をさらに、等電点電気泳動を用いて分離した。データは、タンパク質の翻訳後修飾に起因し得るXMTのアイソザイムの存在；あるいは、XMT酵素をコードする遺伝子ファミリーが存在し得ることを示す。 SDS PAGEゲルで可視化されたダブレットを、タンパク質配列決定に用いた。精製XMTを、部分的トリプシン消化に供してさらなる分析のためのフラグメントを作製した；３つのピークが、HPLCを用いて分離された。配列決定は、Protein St ructure Laboratory of the University of California，Davisによって、自動化Edman分解（Edman，P.およびBegg，G.，Eur.J.Biochem．1:80）を用いて行なわれた。２つの独特の配列を分離し、そしてプローブ合成のためのプライマーを構築するために用いた。RNAをコーヒーの葉から抽出した。ポリ(A⁺)配列含有mRN Aを、そこから精製した。cDNAライブラリーを、ポリ(A⁺)mRNAから逆転写酵素を用いて調製した。二本鎖DNAを、DNAポリメラーゼＩを用いて調製し、そして沈澱により回収した。cDNAを分画し、そして増幅のためにファージに挿入した。cDNA ライブラリーを、精製XMTのアミノ酸配列から予測されるDNA配列に基づくプライマーを用いて生成したPCR合成プローブを用いてスクリーニングした。XMTをコードする配列の全てを含むcDNAを生成するクローンを同定した。 XMTをコードする遺伝子に対応するcDNAを用いて、胚性のコーヒー植物を形質転換する。プラスミドpBI-121を、形質転換ベクターとして用いる。XMTの発現をコードするDNAに対応する配列を、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターに隣接して逆方向でプラスミドに挿入する。そこから転写されたRNAは、XMTのアミノ酸配列をコードするmRNAに相補的である。完全な構築物は、細菌宿主において増幅される。宿主を破壊し、そして増幅されたベクターをコロイド状金粒子に付着させる。米国特許第5,107,065号に記載されるように、付着したベクターを有する金粒子を高速で細胞に推進することにより、その粒子をコーヒー植物のプロトプラスト中に挿入する。首尾良く形質転換された幼植物を、抗生物質耐性により同定する。形質転換された植物は、カフェインを生産しない。実施例Ａ．C．arabica L．cv Guatemalanコーヒーの葉からのキサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼの精製。長さ５mm未満の若い葉の組織（B3段階（Frischknecht，P.M.，Ulmer-Dufek，J ．およびBaumann，T.W.(1986)Phytochemistry 25:613）に等しい）を、Universi ty of Hawaii Waimanalo Research Station，Oahu，Hawaiiで成長させた木から採取した。葉をすぐに液体窒素（液体Ｎ₂）に浸漬し、そして使用するまで−70 ℃で保存した。全ての続いての手順を、他に示さない限り４℃で行なった。葉の組織（150ｇ）を、液体Ｎ₂の下で乳鉢および乳棒の中で細断し、そして依然として凍結したまま、予め冷やした家庭用コーヒー粉砕機に移し、そしてドライアイスの小片と共に約30秒間粉砕した。粉末化組織を、1.5Ｌの氷冷80％アセトン、５mMチオ尿素、および12.5mM β-メルカプトエタノールを含むビーカーに添加した。マグネチックスターラーで45分間混合した後、組織を、Whatman No.1濾紙を入れたBuchner漏斗における減圧濾過により回収した。組織を、上記のようにチオ尿素およびβ-メルカプトエタノールを含む80％氷冷アセトン2.5Lで洗浄し、2 0分間風乾し、次いで48時間凍結乾燥した。得られたアセトン粉末を、ブレンダー中で400mLの抽出緩衝液（EB）（0.1M PI PES[pH7.0]、0.5mM Na₂EDTA、0.5mM Na₂EGTA、５％アスコルビン酸、５mMジチオトレイトール[DTT]、５mMチオ尿素、12mM L-システインHCl、１％ポリエチレングリコール（PEG）20,000、0.1mMフェニルメチルスルホニルフルオリド[PMSF]、および20ｇポリビニル-ポリピロリドン[PVPP]）とともにホモジナイズした。スラリーを、10分間、中程度の速度でホモジナイズし、次いで250mLの遠心管に移し、そして23,000×gで30分間、GSA（Dupont-Sorvall）ローター中で遠心分離した。得られた350mLの粗上清を、氷浴により取り囲まれたビーカー中で撹拌する間に79.86ｇの硫酸アンモニウム（AS）粉末をゆっくりと添加することにより、30 分間かけて40％AS飽和にした。混合物をもう一度250mLの遠心管に移し、そして2 3,000×ｇで30分間、上記のように遠心分離した。得られた350mLの上清を、40mL Macro-Prep（Bio-Rad）メチル疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）カラムに2.5mL／分の流速でロードした。全てのカラム画分を、280nmでの吸光度を用いてタンパク質についてモニターした。HICカラムを、1.7Ｍ AS、20mM ビス-tri s-プロパン（pH6.8）、および５mM DTTを含む予め平衡化した緩衝液で、ゼロに近いベースラインが確立されるまで洗浄した。次いで、カラムを、10mM tris（p H7.0）、５mM DTT、１mM MgCl₂を含む緩衝液を用いてストリッピングした。カラムから流出した最初の15mLを捨て、そして残りの溶出液（200mL）を、重力下で1 00mL Affi-Gelブルーアフィニティーゲル（100〜200メッシュ、Bio-Rad）カラム中にロードした。このカラムは、マトリックスに共有結合した色素CibacronブルーF3GAを有していた。ゲルを、10mM tris（pH7.0）、５mM DTT、１mM MgCl₂ローディング緩衝液を用いて予め平衡化した。カラムを、このローディング緩衝液を用いて、ベースラインがゼロの近くに安定するまで充分に洗浄し、そして結合したタンパク質を、10mM tris（pH7.0）、５mM DTT、および1.5M塩化ナトリウム（ NaCl）を含む緩衝液で溶出させた。 142mL Affi-Gel Blue Gelカラムの溶出液を、氷浴により取り囲まれたビーカー中で30分間撹拌する間に31.8ｇ AS粉末をゆっくりと添加することにより、1.7 Ｍ ASにした。スラリーを、250mL遠心管中で23,000×ｇで30分間、上記のように遠心分離し、そして上清をFPLC Phenyl-SepharoseカラムXK 26/20（Pharmacia）中に23℃でロードした。カラムを、20mM ビス-Tris-プロパン（pH6.8）、５mM D TT、および1.7Ｍ ASを含む緩衝液を用いて予め平衡化した。ベースラインがゼロの近くに確立されたとき、タンパク質を、1.7Ｍ ASから０Ｍ ASへの40分間の逆勾配で５mL/分の流速でカラムから溶出し、１分間の画分を収集した。０Ｍ AS溶出緩衝液は、10mM tris（pH7.0）、５mM DTT、および１mM MgCl₂を含んでいた。収集した画分での活性アッセイは、キサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼの酵素活性の大部分が画分49〜54に濃縮されたことを示した。これらの画分を、30mLの最終容量にプールし、次いで重力をかけながら４℃で６mL ATP-アガロースカラム（Sigma Chemicals，A2767）にロードした。カラムを、10mM tris （pH7.0）、５mM DTT、および１mM MgCl₂を用いて予め平衡化した。ベースラインの安定化の後、カラムを、100μMキサントシンを含む前駆平衡緩衝液20mLを用いてストリッピングし、そしてさらに40mLの前駆平衡緩衝液を用いて洗浄した。両方のカラムの溶出液をプールし、そして25mM ビス-tris（pH6.0）および９％ベタインで予め平衡化したMono-P HR 5/20 FPLC（Pharmacia）カラムに23℃でロードした。ベースラインが安定化した後、カラムを、100mL Polybuffer 74（10m L：90mL H₂O、v:v）（pH4.0）（Pharmacia）、および９％ベタインを用いて１mL /分の流速で溶出した。収集管は、100μL 0.5Mトリシン緩衝液（pH7.0）および5 0mM DTTを含んでおり、１分間の画分において、１mLの50mMトリシン（pH7.0）および５mM DTTの最終濃度を与えた。これは、結果的に、最終的なpH条件を、僅かに酸性のpH下でMono-Pカラムから溶出したタンパク質について安定化した。トリシンを含まない収集管におけるキサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼの活性の大部分は、それぞれ、5.42および5.35のpHでカラムから溶出した勾配の画分15および16に見出された。精製のどの段階でもタンパク質サンプルを凍結させないことが重要であった。なぜなら、これは、キサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼの活性状態に実質的に負の影響をもたらしたからである。Ｂ．酵素活性のアッセイ。 100μLの標準的なアッセイ混合物は、50mMトリシン（pH7.0）、1200μMキサントシン、５mM DTT、7.5μM S-アデノシル-L-[メチル-¹⁴Ｃ]-メチオニン（SAM）（60mCi/mmol；DuPont NEN）、および１mM Na₂EDTAを含んでいた。反応混合液（ 50μL、酵素なし）を、25℃で10分間、プレインキュベートし、そして反応を50 μL酵素溶液の添加により開始しそして25℃で１時間進行させた。インキュベーション時間の終わりに、反応液の３つの30μLアリコートを取り出し、そして８ μLの0.6Ｍ過塩素酸（HClO₄）の添加により終了させた。真の酵素活性を検出するために、同じことを、０時間のコントロールについて行なった。この混合物を、微量遠心機において５分間遠心分離し、そして19μLの上清を1.0μLの33mM 7- メチル-キサントシンと混合した。これらの混合物を、Whatman No.1クロマトグラフィーペーパー上にスポットし、そしてn-ブタノール-酢酸-H₂O（n-BuOH-HOAc -H₂O）（4:1:1）を用いて展開させた。7-メチルキサントシンの位置を、短波長のUV光に曝した場合のその青色蛍光により決定した。この領域をクロマトグラムから切り出し、そして放射活性を、３mL Scinti-verseシンチレーション液（Fis her Scientific）を用いるシンチレーション計測により決定した。計測効率は74 .7％であった。ゼロ時間のサンプルの7-メチルキサントシン領域において検出されたバックグランドおよび非特異的放射を差し引いた。Ｃ．反応生成物の同定。キサンチン環上でのメチル化の部位を、メチル化キサントシン反応生成物からの糖の加水分解および４つの異なるクロマトグラフィー系における分離により同定した。上記のように行われ、そして６μLの33mM 7-メチルキサントシンをキャリアとして含む２つの100μL反応物からの生成物を、Whatman No.1ペーパークロマトグラムの基点においてバンドとして塗布した。クロマトグラムを、n-BuOH-H OAc-H₂O（4:1:1）中で展開させた。メチル化キサントシンに対応するクロマトグラムの領域を上記のように検出し、小片に切り出し、滅菌管に入れ、そして35mL の脱イオン水とともに37℃で撹拌しながら一晩インキュベートした。抽出物を、２層のミラクロス（miracloth）、続いて0.22μmフィルターを通して濾過し、次いで凍結乾燥した。乾燥した抽出物を、1.0mLの脱イオン水中に再懸濁し、そしてガラス消化バイアル中に入れ、そして凍結乾燥した。サンプルを400μLの1.0M HCl中に再懸濁し、そして100℃で１時間インキュベートした。消化物を凍結乾燥し、400μLの3mM 7-メチル-キサンチン中に再懸濁し、そして再度凍結乾燥した。消化物を40μLの脱イオン水中に再懸濁し、そして10μLを４つの異なる系のそれぞれにおいてクロマトグラフした。1-メチルキサンチン、3-メチルキサンチン、7-メチルキサンチン、8-メチルキサンチン、7-メチルキサントシン、キサンチン、およびキサントシンを、比較のために各クロマトグラムに含めた。以下のクロマトグラフィー系を用いた；n-BuOH-HOAc-H₂O（4:1:1）中で展開させるWhatma n No.1ペーパー、ならびにイソアミルアルコール-H₂O-アセトニトリル（41:4:5 ）、エタノール-H2O（4:1）、またはtert-BuOH-HOAc-H₂O（4:1:1）のいずれかで展開させるC8薄層プレート（Whatman KC18F）。乾燥後、クロマトグラムに、En³ Hance（Dupont NEN）をスプレーし、再乾燥し、そして照射前のFuji RX_GCUX線フィルムに−70℃で30日間露出した。Ｄ．ゲル電気泳動によるタンパク質の同定。上記のように得た抽出物を、Laemmliサンプル緩衝液（Laemmli，U.K.，Nature 227:680(1970)）と混合することにより一次元（1D）SDS-PAGEミニゲル（主なゲル：12.5％アクリルアミド、0.8％メチレンビスアクリルアミド；濃縮ゲル：7.5 ％アクリルアミド、0.21％メチレンビスアクリルアミド）に、そしてO'Farrell ら（O'Farrell，P.Z.,Goodman，H.M.，O'Farrell P.H.，Cell 12:1133(1977)）の改変法により二次元（2D）ミニIEF/SDS-PAGEに用いた。二次元電気泳動は、50 容量の100％エタノールで１時間、タンパク質を沈澱させ、そしてタンパク質を、５％アンホライン（ampholine）を含む等電点電気泳動（IEF）サンプル緩衝液（1:1，v:v，pH３〜10；pH５〜７、LKB-Pharmacia）中に溶解することにより可能になった。元のタンパク質抽出物対IEFサンプル緩衝液の比は、クロマトグラフィー工程由来の全ての残存する緩衝液構成成分がIEFを干渉しないことを確実にするために、少なくとも１：２に維持された。等しい総タンパク質サンプル（＜20μｇ）を、上記のように５％アンホラインを含む電気泳動前のチューブゲル（8.8％アクリルアミド、1.6％メチレンビスアクリルアミド）の塩基性末端に適用した。ゲルを、10,000Ｖで数時間、および1,000Ｖでさらに２時間電気泳動した。ブランクの電気泳動ゲルを、５mm切片に切断し、そして0.5mLの100mM CaC l₂で24時間インキュベートし、そしてセグメントのpHを決定した。この分析から、IEFゲルのpH勾配は、4.4〜6.0の範囲であると見積もられた。チューブゲルを、短時間のH₂O洗浄、それに続く加熱Laemmliサンプル緩衝液中での３回の洗浄（各10分間）によりSDS-PAGEのために調製した。チューブゲルを、SDS-PAGEゲル（主なゲル：12.5％アクリルアミド、0.8％メチレンビスアクリルアミド；濃縮ゲル：7.5％アクリルアミド、0.21％メチレンビスアクリルアミド）の頂部に配置し、そしてLaemmliサンプル緩衝液中で３％アガロースで適切に保持した。タンパク質を、銀染色により可視化した。1Dゲルにおいて、最大の酵素活性を有するMono-P画分16は、銀染色下でダブレットの存在しか示さなかった（図２）。これらのタンパク質の分子量（kD）は、約37.6および36.1kDであった。2Dゲルにおいて、各タンパク質は、２つの点に分離した。より酸性のタンパク質の等電点（IP）は、いくつかのゲルでの平均値5.2を有し、そしてより塩基性のタンパク質では5.3であった。しかし、これらの分子量は、現在では平均43. 5kDであり、上部および下部のペプチドは相互に融合している。従って、1Dゲルと2Dゲルとの間ではkDに明確な相違が存在する。Mono-Pカラム、1Dおよび2Dゲルにおけるこれら４つのペプチド全ての同様の移動は、これらが、翻訳後に修飾され得るアイソザイムであることを示す。あるいは、これらは、それらの構造に相互に僅かな相違を有し、これにより観察されるアイソザイムが異なる、遺伝子ファミリーの産物であり得る。Ｅ．タンパク質配列決定。 Mono-Pの画分16についてのLowryの手順（Lowry，O.H.，Rosebrough，N.J.，Fa rr，A.L.およびRandall，R.J.，J ．Biol．Chem．193:265(1951)）による総タンパク質の見積もりは、１mL画分中に計100μｇのタンパク質が存在することを示した。本発明者らの経験によれば、これらの低濃度のタンパク質では、Lowry値は存在する実際量よりも多く見積もられる傾向がある。本発明者らは、タンパク質配列決定のためにこの画分のかなりの部分を用いることにより、これを過補償することを決心した。90μgを示すMono-P画分16の900μL部分を、滅菌1.5mL微量遠心管に入れ、そして216μLの100％トリクロロ酢酸（TCA）をこれに添加した。混合した後、この管を氷上で一晩インキュベートし、次いで微量遠心機において14,000rpmで４℃にて30分間遠心分離した。上清を吸引により除去し、そしてペレットを１mLの75％エタノールで２回洗浄し、各洗浄の後遠心分離工程を行なった。この管をspeedvac中に配置し、そして減圧下で１分間回転させることにより、ペレットを乾燥させた。沈殿物に、20μLの２×Laemmliサンプル緩衝液を添加した。次いで、これを水浴中で５分間沸騰させ、次いで１分間微量遠心分離を行なった。管の温度が23℃まで冷却されたときに、全量を12.5％ 1Dゲルの１つのレーンにロードした。電気泳動の終了時に、50％メタノールおよび10％酢酸の水溶液（w:v:v）中の0.1％ Coomassie R-250で染色し、次いで脱染することによりタンパク質を可視化した。銀染色ゲルにおいて観察された37.6および36.1kDの同じダブレットは、Coomassie染色ゲルにおいてもまた可視的であった。このダブレットを含むゲルの領域を切り出し、そして自動化Edman分解によるタンパク質配列決定のために用いた。タンパク質配列決定を、University of California，Davis，Protein Structu re Laboratoryの標準的プロトコルにより行なった。ダブレットを含むゲル片を1 5mLのH₂Oで15分間穏やかに振盪することにより４回洗浄して、以前の工程から残存している酢酸およびSDSを除去した。ゲル片を、かみそりの刃で２mm四方の賽の目に切り、そして1.5mL微量遠心管に移した。ゲル片を、Speed-Vac中で２時間、これらが管に付着しなくなるまで脱水した。次に、30μLのゲル再水和緩衝液（0.1Ｍ Tris-HCl，pH9.0、0.05％SDS）を添加し、そして0.5μLをpH紙にスポットすることによりpHが8.0であることを確認した。Achromobacter lyticus（Wako ）由来の消化酵素Lys-C（0.2μｇ）をさらなる再水和緩衝液とともに添加してゲル片を完全に水和させ、そして僅かに余分の緩衝液を残した。混合物を30℃で一晩インキュベートさせた。インキュベーション時間の後に、上清を新たな滅菌微量遠心管に取り出し、そして保存した。ゲル片を覆うに十分な水を添加し、そしてこれらをさらに２時間、30℃でインキュベートした。上清を取り出し、そして以前と同じ微量遠心管内に保存した。この洗浄工程をもう１回繰り返し、上清を以前の２つの洗浄液と組み合わせた。次いで、ゲル片を、80％アセトニトリル中に 0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）を含む溶液で覆い、そして30℃で１時間インキュベートした。上清を収集し、そして以前の全ての上清を含む管に添加した。最後の洗浄をもう１回繰り返し、そしてプールした上清をspeed-vac中で乾燥させた。乾燥したトリプシン消化産物を、25μLの６Ｍグアニジン-HCl、0.4Ｍ tris（p H8.2）に溶解し、そしてpH紙上に0.5μLをスポットすることによりpHを確認した。１μLの450mM DTTを添加し、そして消化物を50℃で45分間インキュベートした。室温まで冷却した後、２μLの500mMヨードアセトアミドを添加し、そして23℃ でさらに15分間インキュベートした。このインキュベーションの終わりに、72μ Lの水を添加して最終濃度を1.5Ｍグアニジンおよび0.1Ｍ trisにした。次いでサンプルを微量遠心機において14,000rpmで５分間遠心分離し、そして上清を新しい微量遠心管に注意深く取り出した。沈澱したペレットに対して、25μLの0.1％ TFAを添加し、そしてボルテックスした。次いで管を上記のように再度遠心分離し、そして上清を以前の工程からのものに添加した。トリプシン消化由来の切断フラグメントを、C18 １mm×10cmカラムにおけるキャピラリー高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により、１分あたり100μLの流速での５％溶媒Ａ（0.1％ TFA）から70％溶媒Ｂ（0.075％アセトニトリル）への 90分間にわたる直線状勾配を利用して相互に分離した。UV検出を、０〜0.1Ａの範囲のスケールで210nmで設置した。個々のピークの回収は、図３に示されるようにいくつかの異なるペプチドの存在を示した。コントロールとして、タンパク質を含まない元のBDS-PAGEゲルの一部を、消化プロセスを通して行った。図３に示される塗りつぶされたピークは、このコントロールとサンプルとの間に共通であった。Ａ、Ｂ、およびＣと標識した３つのピークを、自動化Edman分解に供した。ピークのうち２つ（ＡおよびＢ）は、同じタンパク質フラグメントを示す重複する独特の配列を生じた（図４、フラグメントＡおよびＢ）。第３のピーク（Ｃ）は、異なる独特の配列（図４、フラグメントＣ）を生じた。Ｆ．キサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼのためのオリゴヌクレオチドDNAプライマーの合成キサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼの消化フラグメントにより得られた２つのアミノ酸配列のための20マーのプライマーの化学合成は、The Midlan d Certified Reagent Companyによって行なわれた。選択されたフラグメントの領域は、最小の核酸縮重（degeneracy）を有しており、ここで、幅広い遺伝コードの重複性（redundancy）を有する可能なアミノ酸は避けられた。これが可能でない場合、可能な別のコドンの組み合わせの全てを含むように、同じフラグメントについて１つよりも多くのプライマーを合成した。さらに、本発明者らはまた、アミノ酸配列をコードするDNA配列のコード鎖に相補的であるようにプライマーを合成した。３つ以上の３位のヌクレオチドの縮重が、イノシンをこれらの位置に用いることにより克服された。ヌクレオチドの縮重が２倍である場合、プライマー合成において両方のヌクレオチドが含まれた（図３）。Ｇ．B3段階の若いコーヒー葉からのRNAの抽出。抽出の間に使用した全ての品目は無菌でRNaseを含まず、そして0.1％DEPC水で処理することにより調製した。全ての遠心分離工程を、他に言及しない限り４℃ で行った。 B3段階の若いコーヒーの葉を採取し、そして以前に記載したように保存した。総RNAを100gのこの若い葉の組織から、液体窒素下で粉砕し、そしてすぐに予め冷やした家庭用コーヒー粉砕器中に移すことによって単離した。組織を、ドライアイスの小片とともに粉砕して粉末状にした。次いで、組織を100mM tris-HCl（ pH9.0）、200mM NaCl、15mM Na₂EDTA、0.5％サルコシルおよび新たに添加した10 0mMのβ-メルカプトエタノールからなる200mLのホモジネーション緩衝液に添加した。これに、200mLの緩衝液平衡化フェノール、およびクロロホルム：イソアミルアルコール（24：１、v:v）の混合液40mLを添加した。次いで、組織を、Pol ytronホモジナイザーを用いて、氷浴中のガラスビーカーで、高速で２分間ホモジナイズした。ホモジネーションの後すぐに、14mLの３M酢酸ナトリウム（pH4.0 ）を添加し、そしてさらに１分間ホモジナイザーを操作することによって混合した。次いで、ホモジネートを氷上で15分間保存し、続いて２つの250mLポリプロピレン遠心管に移した。遠心分離をGSA（DuPont Sorvall）ローター中で16,00 0×gで10分間行った。水相（上層）を新たな250mLポリプロピレン遠心管に移し、そして等容量のイソプロパノールを添加した。この混合物を-20℃で一晩インキュベートし、次いで10,000×gで10分間遠心分離し、沈殿したRNAを回収した。 RNAペレットを70％エタノールで洗浄し、そして10,000×gで５分間再遠心分離した。エタノールをデカンテーションし、そしてペレットを減圧下で５分間乾燥させた。次いで、ペレットを、15mLのDEPC処理水に再懸濁した。RNA懸濁物を、滅菌40mLスクリューキャップ遠心管に移し、そして10,000×gで５分間遠心分離することによって、不溶性物質を除去した。上清を、新たな40mLスクリューキャップ遠心管に移し、そして５mLの８M LiClをそれに添加し、最終濃度を２M LiCl にした。管を４℃で一晩インキュベートし、そしてRNAを14,000×gで10分間遠心分離することによって回収した。次いで、RNAペレットを70％エタノールで洗浄し、10,000×gで５分間遠心分離し、そして減圧下で手短かに乾燥させた。ペレットを５mLのDEPC処理水に再懸濁し、そして10,000×gで５分間遠心分離して不溶性物質を除去した。上清を、４つの滅菌1.5mL微量遠心管に移し、そして氷上で保存した。Shimadzu UV 160U分光光度計の230〜330nmのスペクトルにおける10 μLの総RNA溶液の定量は、42.8mgのRNAが存在することを示した。RNAを含む管を、-70℃で保存した。Ｈ．総RNAからのポリ（A⁺）mRNAの精製。総RNA調製物を、PolyATtract II mRNA単離系キット（Promega Corporation）を使用して、ポリ（A⁺）RNA（mRNA）について濃縮した。5.1mgに等しい総RNAの6 00μLのアリコートを、上記のキットのチューブに添加し、そしてRNaseを含まない水で2.43mLの最終容量にした。65℃で10分間加熱した後、10μLの50pmole/ml ビオチン化オリゴ（dT）および60μLの20×SSC（175.3g/L NaCl、88.2g/Lクエン酸ナトリウム、pH7.0）を添加し、そして混合物を約30分の時間をかけて室温までゆっくりと放冷させた。ストレプトアビジン常磁性粒子のアリコートを、0.5 ×SSC（一回の洗浄につき1.5μL）中で３回洗浄し、そして0.5mLの0.5×SSCに再懸濁した。ビオチン化オリゴ（dT）を含むRNA溶液を、洗浄したストレプトアビジン常磁性粒子に添加した。室温で10分間インキュベートした後、捕獲されたmR NAと一緒に常磁性粒子を、磁石を用いてチューブの側面に捕えた。上清を除去し、そして粒子を、0.1×SSC（1.5mL/洗浄）で４回洗浄した。mRNAを、RNaseを含まない水1.0mLに粒子を懸濁させ、そして粒子がチューブの側面に捕えられている間に水を取り出すことによって回収した。この水を、２つの1.5mL滅菌微量遠心管に入れた（１回に500μL）。1/10容量の３M酢酸ナトリウム(50μL／管)を添加した後、mRNAを、等容量のイソプロパノール（550μL／管）で沈殿させることによって回収した。管を、-20℃で一晩保存し、次いで14,000rpmで30分間４℃で遠心分離した。ペレットを、500μLの75％氷冷エタノールで洗浄し、そして再遠心分離した。エタノールをデカンテーションし、そしてペレットを減圧下で手短かに乾燥させた。mRNAを、DEPC処理したヌクレアーゼを含まない滅菌水60μLに溶解させた。定量を、総RNAについて記載の通りに15μLの溶解させたmRNAで実施した。約9.6μgのmRNAを、５mgの総RNAから回収した。Ｉ．cDNAライブラリーの構築。第１鎖および第２鎖のcDNAを、ZAP-cDNA合成キット（Stratagene）を使用して合成した。25μLの水中の４μgのmRNAを、65℃で５分間インキュベートした。３ μLの100mMメチル水銀を添加し、そして室温で10分間インキュベートした。４μ Lの700mMβ-メルカプトエタノールを添加し、そしてインキュベーションをさらに５分間続けた。変性したmRNAに、５μLの10×第１鎖緩衝液、５μLの100mM DT T、３μLのヌクレオチド混合物（10mMの各dATP、dGTP、TTP、および5-メチル-dC TP）、２μLの1.4μg/mLリンカープライマー、（5'GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGT CTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT3'）、１μLのRNaseブロックおよび５μLの水を添加した。反応物を、プライマーをmRNAにアニールするために室温で10分間インキュベートし、そして2.5μLの20u/μL M-MuLV逆転写酵素を添加した。５μLのこの反応混合物を、0.5μLの800 Ci/mmole[a-³²P]dCTP（DuPont NEN）を含む管に移した。両反応物を、37℃で１時間インキュベートした。放射活性標識した反応物を、後のゲル分析のために、-20℃で冷凍した。 45μLの主要な反応物に、40μLの第２鎖緩衝液、15μLの100mM DTT、６μLのヌクレオチド混合物（10mMのdATP、dGTP、TTP、および26mMのdCTP）、268.3μL の水、および２μLの800 Ci/mmol[a-³²P]dCTPを添加した。混合後、4.5μLの１u /μL RNase Hおよび19.2μLの5.2u/μL E.coli DNAポリメラーゼIを添加し、そして反応物を16℃で2.5時間インキュベートした。反応物を、400μLのフェノール：クロロホルム（１：１）で抽出し、そして相を、遠心分離によって分離した。水相を新たな管に移し、そしてクロロホルムで再抽出した。水相を上記のように回収した。二本鎖cDNAを、33.3μLの３M酢酸ナトリウムおよび867μLの100％エタノールの添加の後に、-20℃で一晩沈殿させることにより回収した。沈殿を、微量遠心機において４℃で60分間遠心分離することによって回収した。沈殿を、１μLの80％エタノールで洗浄し、そして微量遠心機において、室温で最大速度で遠心分離することにより回収した。上清を除去し、沈殿を減圧下で乾燥し、そして45μLの水に溶解した。３μLの再懸濁した二本鎖cDNAを取り出し、そしてゲル電気泳動によって分析するまで-20℃で冷凍した。残りの42μLの二本鎖cDNAに、５μLの10×Klenow緩衝液（緩衝液#3）、2.5μL の2.5mMヌクレオチド（dCTP、dGTP、dATP、およびTTP）、および0.5μLの５u/μ L Klenowフラグメントを添加した。37℃で30分後、50μLの水を添加し、そして反応物を、等容量のフェノール：クロロホルム（１：１）、次いでクロロホルムで上記のように抽出した。７μLの３M酢酸ナトリウムおよび226μLの100％エタノールの添加の後、平滑末端化二本鎖DNAを、30分間氷上でインキュベートし、そして最大速度で４℃で60分間微量遠心分離することによって沈殿させることにより回収した。ペレットを300μLの80％エタノールで洗浄し、遠心分離し、そして先のように乾燥させた。７μLの0.4μg/μL EcoRIリンカーを、乾燥させたcDN Aに添加した。EcoRIリンカーの構造は以下の通りである： cDNAを再懸濁するためにボルテックスした後に、１μLの10×連結緩衝液、１μL の10mM ATP、および１μLの４Weiss u/μL T4 DNAリガーゼを添加し、そして反応物を８℃で一晩インキュベートした。リガーゼを70℃で30分間加熱することによって不活化した。cDNAに付着したEcoRIリンカーの5'末端を、ポリヌクレオチドキナーゼを使用してリン酸化した。１μLの10×緩衝液#3、２μLの10mM ATP、６MLの水、および１MLの10u/ML T4ポリヌクレオチドキナーゼを連結反応物に添加した。37℃で30分後に、キナーゼ反応物を、70℃で30分間熱不活化した。 XhoI「付着末端」を、mRNAの3'末端に対応するcDNAの末端で、リンカープライマー（上記を参照のこと）中のXhoI部位の消化によって作製した。28μLのXhoI 緩衝液および３μLの40u/mL XhoIをcDNAに添加し、そして反応物を、37℃で1.5 時間インキュベートした。(元のmRNAと比較して)5'末端でEcoRI付着末端および3 '末端でXhoI付着末端を有するcDNAを、以下のようにSephacryl S-400スピンカラムを通過させることによって、サイズ分画した。５μLの10×STE（100mM tris（ pH7.0）、５mM EDTA、および100mM NaCl）を添加し、そしてcDNAを、Sephacryl S-400を含む１μLのシリンジの頂部にアプライした。500ml微量遠心管をシリンジの底部に置き、そしてカラムを遠心管の中に置き、そして400×gで２分間遠心分離した。60μLの10×STEをシリンジの頂部に添加し、新たな微量遠心管を底部に置き、そしてカラムを再び先のように遠心分離した。このプロセスを、６つの画分が回収されるまで繰り返した。各画分の約10％を１％アガロースゲルで電気泳動し、各画分中のcDNAのサイズ分布を決定した。各画分の残りを、等容量のフェノール：クロロホルムで、次いで上記のようにクロロホルムで抽出し、次いで２容量の100％エタノールの添加によって沈殿させた。-20℃で一晩インキュベートした後、cDNAを、微量遠心機において、14,000rpmで４℃で60分間遠心分離することによって回収した。cDNA を、上記のように200μLの80％エタノールで洗浄し、そして乾燥した。cDNAを５ μLの水に溶解し、そして0.5μLを取り出して、Hoefer TKO 100 DNA Fluoromete rを使用する蛍光間接撮影法によってcDNA濃度を決定した。画分１の残りの4.5mL は、最大のcDNA分子を含んでおり、約304ngのcDNAを含んでいた。画分１からの100ngのcDNAを、１μgのUni-Zap（EcoRIおよびXhoIで消化したバクテリオファージλZAPベクター（Stratagene））に連結した。画分１のcDNA（2 .9Ml）を、0.54μLの10×連結緩衝液、0.5μL 10mM ATP、１μLの１μg/μL Uni - Zap XRベクターおよび0.5μLの4Weiss u/μL T4 DNAリガーゼに添加した。反応物を８℃で約44時間インキュベートした。１μLアリコートの連結反応物を、Gig apack II Goldパッケージングキット（Stratagene）の「凍結−融解」抽出物の１アリコートに添加した。15μLの超音波抽出物を添加し、その内容物を穏やかに混合した。パッケージングを室温にて実施した。２時間後、500μLのSM緩衝液（0.01M tris-HCl pH7.5、0.01M MgCl₂ 0.1mM Na₂EDTA）および20μLのクロロホルムを、パッケージング反応物に添加し、破片を微量遠心機における短時間の遠心分離により除去し、そしてパッケージ化されたファージを使用するまで４℃で保存した。Ｊ．一次ライブラリーの力価測定。 1/10希釈のために、500μLの一次ライブラリーの１μLを、９μLのSM緩衝液と混合した。１μLのこの希釈液を使用して、O.D.₆₀₀=0.5に等しい密度になるまで増殖した200μLのE.coli XL1-Blue MRF'細胞を感染させた。細胞を穏やかに振盪しながら37℃にて15分間インキュベートした。次いで、感染した細胞を2.5mLの4 8℃のトップアガー（15μLの0.5M IPTGおよび50μLの250mg/ml X-galを含有する）と混合し、100×15mm NZYプレート（5g/L NaCｌ、2g/L MgSO₄・7H₂O、5g/L酵母抽出物、10g/L NZアミン[pH7.5]、および15g/L Difco寒天）にプレートした。プレートを37℃にて１晩インキュベートした。バックグラウンドプラークは青色であった一方、組換えプラークは白色であった。平均で３つのこのようなプレートは、１μLの一次ライブラリーが1,930個の白色組換えプラークおよび65個の青色プラークを生じたことを示した。計500μLの一次ライブラリーを計算すると、 965,000組換えプラークを表した。Ｋ．一次ライブラリーの増幅。 20の滅菌チューブへ、O.D.₆₀₀=0.5まで増殖した300μLのE.coli XL1-Blue MRF '細胞を添加した。各チューブに12.5μLの一次ライブラリーストックおよび90μ LのSM緩衝液を添加し、そしてチューブを37℃で15分間インキュベートした。2.5 mLの48℃のトップアガーを各チューブに添加し、そして細胞を100×15mm NZYプレートにプレートした。プレートを37℃にて１晩インキュベートした。５mLのSM 緩衝液を各プレートに添加し、そしてプレートをさらに４℃にて８時間インキュベートした。SM緩衝液を滅菌ピペットで回収し、そして250mLの滅菌遠心管に保存した。各プレートを、以前に回収した物質に添加した約４mLの新鮮なSM緩衝液で洗浄した。クロロホルムを、５％の最終容積になるように、増幅したライブラリーに添加した。次いで、ライブラリーを室温で15分間インキュベートし、次いで2,000×gにて10分間遠心分離して、細胞の破片を除去した。上清（114.5mL）を回収し、次いで滅菌ポリプロピレン瓶に移した。クロロホルムを0.3％の最終容積にまで添加し、そして増幅したライブラリーを４℃にて保存した。Ｌ．増幅したライブラリーの力価測定。１μLの増幅したライブラリーのSM緩衝液中の10^-11希釈物は、上記のようにプレートした場合、192個の組換えプラークを含んだ。50,000個の組換えプラークを得るために、25μLの10^-7希釈物を使用して、O.D.₆₀₀=0.5まで増殖した600μL のE.coli XL1-Blue MRF'細胞を感染させ、次いで、これを37℃にて15分間インキュベートした。これらの細胞へ、6.5mLの48℃のトップアガーを添加し、そしてライブラリーを150×15mm NZYプレートにプレートした。200,000個の組換えプラークを表すこのような４つのプレートを調製し、そして37℃にて１晩インキュベートした。次いで、プレートを４℃にて４時間冷却し、次いでライブラリーのDN Aスクリーニングのために使用した。Ｍ．キサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼcDNAのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅。 cDNAの第一鎖の合成は、上記のStratageneプロトコルに記載の通りであった。トリプシン消化により得た２つの独特なペプチド配列により、図４に示す縮重プライマーの合成が可能になった。これらのプライマー（1-6、2-6、3-5、または4 -5）の対の間のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）(Saikl,R.K.，Gelfand,D.H.,Stoff el,S.，Scharf,S.J.，Higuchi,R.，Horn,G.T.,Mullis,K.B.，およびErlich H.A. ，Science 239:487(1988))を、4ng cDNA、1μL 20μMプライマー、0.5μLの各１ mM デオキシリボヌクレオチド三リン酸、1.5mM MgCl₂、0.3μL Taq DNAポリメラーゼ[5,000 u/mL]、2.5μL 10×PCR緩衝液[10mM tris-HCl(pH9.0)、0.1%triton X- 100]および滅菌H₂Oで25μLの最終容積にしたものを使用して、実施した。PCR条件は、94℃にて４分間[１サイクル]；94℃にて１分間、43℃にて１分間、72℃にて１分間[35サイクル]；72℃にて５分間[１サイクル]であった。反応は、Perkin Elmer DNAサーマルサイクラー480を用いて、500μLの滅菌微量遠心管にて行った。１および６のプライマーの組合せのみが、43℃のアニーリング温度で単一の産物を生じた。産物は、SeaPlaqueアガロース（FMC）を用いたアガロースゲル電気泳動により、およそ750塩基対であることが測定された。市販の100bpラダー(P romega Corporation)を、サイズマーカーとして使用した。Ｍ．コーヒー特異的キサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼPCR遺伝子産物のクローニング。 50μL PCR反応においてプライマー１および６（図４）を使用して得た750bpフラグメントは、50μLのクロロホルムを有し、そして100μLの滅菌水をそれに添加した。混合物をボルテックスし、次いで、微量遠心機において14,000rpmにて２分間遠心分離した。DNAを含む上の水層を取り出し、そして滅菌チューブに入れた。エチジウムブロミドプレート定量化により、約５ngのほぼPCR増幅したDNA /μLの存在が示された。次いで、PCR産物を、１μL 10×連結緩衝液、２μL pCR IIベクター（25ng/μL）、３μLの新鮮なPCR産物（5ng/μL）、１μL T4 DNAリガーゼ、および3μLの滅菌水を含む、10μLの連結反応物中でTAクローニングキットpCR IIベクター（Invitrogen Corporation）に連結した。連結反応物を14℃ にて１晩インキュベートした。連結反応物を14,000rpmで２分間遠心分離し、そして氷上においた。新たに融解したE.coli XL1-Blueコンピテント細胞のバイアルに、2μLの0.5M β-メルカプトエタノールを添加し、そしてピペットチップで穏やかに混合した。２μLの連結反応物をピペッティングで細胞に添加し、そしてそれらをピペットチップで穏やかに撹拌して混合した。次いで、バイアルを氷上で30分間インキュベートし、そして正確に30秒間42℃の熱ブロック内で熱ショックをかけた。バイアルを氷上においた。２分後、450μLの滅菌SOC培地（20g /Lトリプトン、5g/L酵母抽出物、0.5g/L NaCl、10mL/L 250mM KCl、10mL/L MgCl₂ 、20mL/L 1Mグルコース、[pH7.0]）をそれに添加した。続いて、バイアルを225 rpmにてロータリー振盪機で１時間振盪し、次いで氷上においた。形質転換した細胞を、細胞懸濁液からの50μLおよび/または200μLを、50μg/ mLアンピシリンおよび40μg/mL X-Galを含む２つのLBプレート（10g/Lトリプトン、5g/L酵母抽出物、10g/L NaCl、15g/L Difco寒天、pH7.5）の１つにピペッティングすることによりプレートした。プレートを37℃にて20時間インキュベートし、次いで４℃に移動して３時間発色させた。６個の白色形質転換コロニーを、 PCRフラグメントの存在および方向について分析した。Ｎ．沸騰プラスミドミニプレップ。各形質転換コロニーを、50μg/mLアンピシリンを補充した５mLの滅菌猛烈ブロス（12g/Lトリプトン、24g/L酵母抽出物、４mL/Lグリセロール、100mL/L 10×TB ホスフェート[0.17M KH₂PO₄、0.72M K₂HPO₄]）にて増殖させた。チューブを、ロータリー振盪機で37℃にて１晩インキュベートした。各コロニー３mLを、１回当たり１mLで、1.5mL微量遠心管に移し、そして細胞を、14,000rpmで２分間遠心分離することにより濃縮した。上清を毎回捨て、そして残った細胞ペレットを可能な限り乾燥させた。細胞を１mLの滅菌H₂Oで一回洗浄し、そして以前のように遠心分離した。上清を捨て、そして細胞ペレットを320μL STET緩衝液（８％ショ糖、0.5% triton X-100、50mM EDTA、10mM tris-HCl、pH8.0）に再懸濁した。これらの細胞に、32μLのTE緩衝液（10mL/L 1M tris-HCl pH8.0、2mL/L 0.5M EDTA pH8.0）中の10mg/mLリゾチームを添加し、そして何回かチューブを反転することにより混合した。チューブを沸騰水浴中に５分間おき、次いで直ちに氷上においた。一旦冷却したら、それらを４℃で14,000rpmにて30分間遠心分離した。ペレットを各チューブから滅菌つまようじで取り出した。上清に、170μLの7.5M N H₄OAcおよび550μLの氷冷イソプロパノールを添加し、そしてDNAを-20℃で１晩沈澱させた。チューブを４℃で14,000rpmにて30分間遠心分離し、そしてペレットを75％エタノールで洗浄し、そしてspeed-vacにて１分間乾燥させた。DNAを、１μLの5mg/mL RNaseAを含む50μLの滅菌H₂Oに再懸濁した。Ｏ．pCR IIプラスミドからの挿入物の切り出しのための制限消化。 25μLの反応混合物を、上記で得た15μLのプラスミドミニプレップDNA、2.5μ Lの緩衝液H（90mM tris-HCl[pH7.5]、10mM MgCl₂、50mM NaCl）、１μLのEcoRI （８〜12u/μL）および6.5μLの滅菌H₂Oを添加することにより調製した。混合物を振盪水浴中で37℃にて１時間インキュベートし、次いで水浴中にて１分間沸騰させた。チューブを14,000rpmにて15秒間遠心分離し、次いで室温まで放冷した。各混合物10μLに２μLのローディング染料を添加し、そして消化産物を超純粋アガロース(GibcoBRL)およびサイズマーカーとしての100bpのラダー（Promega C orporation）を用いて1.5％アガロースゲル電気泳動にて分析した。６つの反応物中ただ１つのみが、約750bpの消化された挿入物の存在を示した。750bpキサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼPCR産物を有するプラスミドに対応する元々の細菌コロニーを、50μg/mLのアンピシリンを補充した50mLの滅菌LB培地（10g/Lトリプトン、５g/L酵母抽出物、10g/L NaCl、pH7.5）を含む2 50mLエルレンマイヤーフラスコに接種した。フラスコをロータリー振盪機中で30 ℃にて１晩インキュベートした。1.5mL微量遠心管に、18mLの得られた細胞培地を上記のように遠心分離により濃縮した。プラスミドDNAを、QIAGENプラスミドミニキット手順（Qiagen Inc.）を使用して精製した。洗浄した細菌ペレットを、補充したRNaseを含む0.3mLの緩衝液P1に再懸濁した。これに0.3mLのアルカリ溶解緩衝液P2を添加し、チューブを軽く叩くことにより穏やかに混合し、そして室温で5分以内でインキュベートした。次に、0.3mLの冷した緩衝液P3を添加し、そしてチューブを6回反転することにより混合した。氷上で10分後、抽出物を微量遠心分離機で15分間14,000rpmで遠心分離した。上清を除去し、そして１mLのQBT緩衝液を重力による流れによってアプライすることにより、先に平衡化したQIAGEN-tip 20にアプライした。アプライした細胞抽出上清をまた、重力による流れによりカラムの樹脂に進入させた。一旦カラムを通じた流れが停止したら、QIAGEN-tip 20を１mLの緩衝液QCで４回洗浄した。DNAをQIAGEN-tip 20を0.8mLの緩衝液QFで洗浄することにより溶出し、そして0.7容量（560μL）の室温イソプロパノールを添加することにより沈殿させた。チューブをすぐに14,000rpmで30分間遠心分離し、そして上清を慎重に除去した。沈殿したDNAを１mLの氷冷70％エタノールで洗浄し、上記のように遠心分離し、そして５分間風乾させた。DNAを100μlの滅菌H₂Oに再懸濁した。１μL のDNA再懸濁物についての上記のようなUV分光測光法は、100μLあたり55μgの精製組換えpCRIIプラスミドDNAが存在することを示した。 pCRIIプラスミド中の挿入物のその5'末端からの自動DNA配列決定を、PCR産物が挿入された部位にすぐに隣接したpCRII中の参照に結合するM13逆方向プライマーを使用して達成した。配列決定を、University of Hawaii Biotechnologyの設備施設（service facility）で行った。配列決定反応物は、１μgのプラスミドテンプレートおよび3.2pmol M13プライマーを含んだ。得られた配列は、PCR産物がペプチドフラグメントAおよびB（図４）の最初の６アミノ酸のDNA配列（この配列から縮重DNAプライマー１および２（図４）を作製した）をコードすることを示した。さらに、配列はまた、ペプチドフラグメントの以下の７アミノ酸をコードし、このDNA配列はプライマー構築において使用されなかった。それゆえ、結果として、正しいタンパク質に対するDNA配列がクローニングされた。Ｐ．PCR産物を使用するcDNAスクリーニングのためのランダムプライムプローブの作製。２つの25μLのEcoRIによる制限消化を、上記のように、精製pCRIIプラスミドの２つの17.5μLアリコートで行なった。この産物を先のように１％アガロースゲル上で分離し、そして750bpの挿入物をゲルの２つのレーンから無菌的に切り出した。0.65gの質量を有するゲル片を滅菌40mLポリプロピレンチューブに移し、そしてGeneclean IIキット精製（BIO 101，Inc）に供した。４と1/2の容量のN aI（2.93mL）ストック溶液をゲル切片に添加した。1/2の容量のゲルTBE修飾剤（ 325μL）を添加し、そしてチューブを45℃で５分間インキュベートした。これに 15μLのガラスミルク懸濁液を添加し、そしてさらに５分間インキュベートした。ガラスミルク/DNA複合体を1,000rpmで10秒間遠心分離することによりペレット化し、そして上清を除去した。ガラスミルクペレットを１mLのNew Wash溶液で３回洗浄し、そしてDNAを50μＬの滅菌H₂Oで溶出した。エチジウムブロミドプレートは、DNA濃度が10ng/μLであることを示した。ランダムプライムプローブを、30ng(3μL)の精製DNAから合成した。３μLのDN Aを27μLの滅菌水に添加し、そしてDNAを沸騰水浴中で加熱することにより変性した。これにPromega Corporations Prime-a-Geneキット構成物（10μLの５×標識緩衝液、２μLの非標識dNTP[20μMの各dCTP、dGTP、TTP]、２μLの１mg/mLアセチル化BSA、１μLの５u/μLクレノウ酵素）および５μLの[α-³²P]dATP（50μ Ci、3,000Ci/mmole；DuPont NEN）を50μLの最終容量に添加し、そして室温で１時間インキュベートさせた。反応を２μLの0.5M Na₂EDTA（20mMの最終濃度）を添加することにより終結させ、そして沸騰水浴中で２分間加熱した。Ｑ．ランダムプライムプローブによる増幅ライブラリーのスクリーニング。１プレートあたり約50,000の組換えクローンを有する４つの150×15mm NZYプレートを４℃で冷却し（プレーティングおよび増殖条件については上記を参照のこと）、組換えプラークを、５×SSC緩衝液で飽和したクロマトグラフィー紙上で132mm Magnaナイロントランスファーメンブレン（MSI Corporation）を最初に 10秒間予備浸漬することによって拾い上げた。メンブレンを、組換えプラークを含むプレート上に５分間置き、次いで持ち上げ、そしてファージを含む側を上にして、0.5M NaOHおよび1.5M NaClで飽和したクロマトグラフィー紙上に２分間置いた。膜を、0.5M tris-HCl(pH8.0)および1.5M NaClで飽和したクロマトグラフィー紙上に移すことにより５分間中和した。次いで、それらを２×SCC緩衝液、0 .2M tris-HCl(pH7.5)で飽和したクロマトグラフィー紙上に20秒間置き、次いでブロットして乾燥させた。１時間の風乾後、DNAを、UV Stratalinker 1800(Stra tagene Corporation)を使用して12,000μジュールのUVに曝すことによりメンブレンに架橋した。４つのメンブレンを、Hybrid Mark IIハイブリダイゼーションオーブンにおいて、65℃で２時間、100mLの６×SSPE(52.2g/L NaCl、8.3g/L NaH₂ PO₄・H₂O、2.2g/L Na₂EDTA、[pH7.4])、５×デンハルト溶液（1g/L Ficoll、1g/L ポリビニルピロリドン、1g/L BSA[pentax fraction V]）、0.5% SDSおよび100μ g/mL変性ニシン精子DNA中でプレハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションを、65℃で12時間、10mLの６×SSPE、0.5% SDS、100 μg/mL粉末/変性ニシン精子DNA、および52μLの15×10⁶dpms/mlの上記ランダムプライムプローブ中で行った。ハイブリダイゼーションの期間の最後において、プローブを除去し、そしてメンブレンを、30秒間、0.5% SDSを含む100mLの65℃ の２×SSCで簡単に洗浄した。次いで、メンブレンを、さらに30分間、同じ容量および濃度の新鮮な緩衝液で洗浄した。メンブレンを、30分間、65℃、0.2×SSC 、0.5% SDSでのさらに２回の100mLの洗浄に供し、次いでセロハンのおおいの中にラップし、そして予備フラッシュFuji RX_GCUＸ線フィルムに-70℃で24時間曝した。15個の陽性クローンが観察された。これらのプラークを拾い、そして20μ Lのクロロホルムを含む１mLのSM緩衝液（ファージストック）中に置いた。これらのうち、11個を、単一の個々のプラークが得られるまで二次または三次スクリーニングで処理した。Ｒ．キサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼcDNAクローンの特徴付け。推定のキサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼcDNAクローンのサイズを、クローニングベクター中に存在し、そしてcDNA挿入部位に隣接するT3およびT7 プロモーターに相同なプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応により決定した。ポリメラーゼ連鎖反応の条件は、サイクルが95℃で１分間、50℃で１分間、および72℃で２分間の35サイクルであること以外は上記の通りであった。分析は先のようにアガロースゲル電気泳動を用いた。得られた３つの最大のクローンを、滅菌チューブ中で、200μLの単一プラークファージストックと200μLの新鮮な XL1-Blue MRF細胞（O.D.₆₀₀=1.0にまで増殖した）とを混合することにより、インビボ切り出しに供した。この混合物に１μLのExAssist(Stratagene Corporati on)へルパーファージ（＞１×10⁶pfu/μL）を添加し、そしてチューブを37℃で1 5分間インキュベートした。３mLの滅菌LBブロスを添加し、そしてインキュベーションを37℃で３時間振盪しながら継続した。培養物を70℃の水浴中で20分間加熱し、次いでチューブを1,000×gで15分間遠心分離した。繊維状ファージ粒子としてパッケージした切り出したpBluesriptファージミドを含む１mLの上清を滅菌 1.5mL微量遠心管に移し、そして４℃でストック溶液として保存した。25μLのストック溶液を、微量遠心管中の200μLのE.coli Solar細胞（O.D.₆₀₀=1.0にまで増殖した）に添加した。37℃で15分間のインキュベーション後、200μLの細胞を50μ g/mLアンピシリンを含む100×15mm NZYアガープレート上にプレートした。プレートを、37℃で一晩、コロニーが出現するまでインキュベートした。単一のコロニーを、50μg/mLアンピシリンを含む10mLの滅菌LBブロス中に接種し、そして37 ℃で一晩、振盪しながら増殖させた。10mLの細胞培養物を1.5mL滅菌微量遠心管中に濃縮し、そしてペレット化細胞を先に記載されたようにQIAGENプラスミド精製に供した。精製したプラスミドDNAを50μLの滅菌H₂Oに再懸濁した。DNA自動配列決定反応を、８μLのこのDNAサンプル（0.8μg）と、T3またはT7配列決定プライマー（0.8pmol/μL）のいずれか４μLとを混合することにより行なった。このプロセスの残りは、先に記載した通りであった。各配列決定反応は約350塩基の配列をもたらした。この配列を図５に示す。cDNAの塩基配列から推定されるキサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を図６に示す。上記の実施例は、例示を目的とするのみであって、本明細書に添付の請求の範囲に記載される出願人の発明の範囲を制限するものとしてみなされるべきではない。

【手続補正書】【提出日】平成１０年１１月４日（１９９８．１１．４）【補正内容】 6.1 請求の範囲を別紙の通り補正する。 6.2 明細書の第28頁の後に、別紙の配列表を追加する。請求の範囲１．本質的に配列番号10のアミノ酸配列からなる、実質的に純粋なキサントシン -Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼ。２．キサントシンＮ⁷メチルトランスフェラーゼの発現をコードする実質的に純粋な核酸配列であって、以下の配列： a)配列番号11のDNA配列； b)上記DNA配列にハイブリダイズするDNA配列であって、該ハイブリダイズする配列は、本質的に、上記DNA配列に相補的である配列からなる、配列；または c)上記DNA配列に関して縮重しているDNA配列、を含む、核酸配列。３．カフェインを含まないコーヒー豆を生産するための方法であって、以下の工程： a)配列番号11のDNA配列にアンチセンスであるDNA配列でコーヒー植物を形質転換する工程；および b)該形質転換したコーヒー植物から果実を収穫する工程、を包含する、方法。４．カフェインを含まないコーヒー豆を生産するための方法であって、以下の工程：コーヒー植物を、配列番号10の配列の発現をコードするDNA配列にアンチセンスであるDNA配列で形質転換する工程、を包含する、方法。５．コーヒー植物由来の単離されたキサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼであって、(i)配列番号１、または(ii)配列番号２、または(iii)配列番号７のアミノ酸配列を有するトリプシン処理フラグメントを含む、キサントシン-Ｎ⁷- メチルトランスフェラーゼ。６．前記コーヒー植物が、Coffea arabicaである、請求項１または５のいずれかに記載のキサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼ。７．配列番号10のアミノ酸配列を有するキサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼの発現をコードする、コーヒー植物由来の単離された核酸配列。８．前記コーヒー植物が、Coffea arabicaである、請求項７に記載の核酸配列。９．配列番号10のアミノ酸配列を有するキサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼの発現をコードするmRNAにアンチセンスであるRNAの転写をコードする核酸配列で形質転換されたコーヒー植物であって、ここで、該RNAは、キサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼの発現を妨害するに充分な長さを有する、コーヒー植物。１０．配列番号10のアミノ酸配列を有するキサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼの発現をコードするmRNAにセンスであるRNAの転写をコードする核酸配列で形質転換されたコーヒー植物であって、ここで、該RNAは、キサントシン-Ｎ ⁷-メチルトランスフェラーゼの発現を妨害するに充分な長さを有する、コーヒー植物。１１．配列番号10のアミノ酸配列を有するキサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼの発現をコードする核酸配列で形質転換されたコーヒー植物。１２．前記核酸配列が、アンチセンス方向で転写プロモーターに連結される、請求項１１に記載のコーヒー植物。１３．前記核酸配列が、センス方向で転写プロモーターに連結される、請求項１１に記載のコーヒー植物。１４．配列番号10のアミノ酸配列を有するキサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼの発現をコードするmRNAにアンチセンスであるRNAの転写をコードする核酸配列を植物ゲノムへ挿入するプロセスにより生成された、形質転換コーヒー植物。１５．配列番号10のアミノ酸配列を有するキサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼの発現をコードするmRNAにセンスであるRNAの転写をコードする核酸配列を植物ゲノムへ挿入するプロセスにより生成された、形質転換コーヒー植物。１６．請求項９〜１５のいずれかに記載のコーヒー植物由来のコーヒー豆。１７．(i)配列番号11の核酸配列；または(ii)配列番号10のアミノ酸配列の発現をコードする核酸配列に作動可能に連結された転写プロモーターを含む、形質転換ベクター。１８．前記核酸配列が、センス方向で前記転写プロモーターに作動可能に連結される、請求項１７に記載の形質転換ベクター。１９．前記核酸配列が、アンチセンス方向で前記転写プロモーターに作動可能に連結される、請求項１７に記載の形質転換ベクター。２０．前記プロモーターが、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターである、請求項１７に記載の形質転換ベクター。２１．前記ベクターが、改変されたプラスミドpBI-121である、請求項１７に記載の形質転換ベクター。２２．配列番号10のアミノ酸配列を有するキサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼの発現をコードするmRNAにアンチセンスであるRNAの転写をコードする核酸配列で形質転換されたコーヒー植物細胞であって、ここで、該RNAは、キサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼの発現を妨害するに充分な長さを有する、コーヒー植物細胞。２３．配列番号10のアミノ酸配列を有するキサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼの発現をコードするmRNAにセンスであるRNAの転写をコードする核酸配列で形質転換されたコーヒー植物細胞であって、ここで、該RNAは、キサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼの発現を妨害するに充分な長さを有する、コーヒー植物細胞。２４．配列番号10のアミノ酸配列を有するキサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼの発現をコードする核酸配列で形質転換されたコーヒー植物細胞。２５．前記核酸配列が、アンチセンス方向で転写プロモーターに作動可能に連結される、請求項２４に記載のコーヒー植物細胞。２６．前記核酸配列が、センス方向で転写プロモーターに作動可能に連結される、請求項２４に記載のコーヒー植物細胞。２７．形質転換ベクターをコーヒー植物細胞へ挿入するプロセスにより生成された形質転換コーヒー植物細胞であって、ここで、該形質転換ベクターは、配列番号10のアミノ酸配列を有するキサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼの発現をコードする核酸配列に作動可能に連結された転写プロモーターを含む、形質転換コーヒー植物細胞。２８．前記核酸配列が、センス方向で前記転写プロモーターに作動可能に連結される、請求項２７に記載の形質転換コーヒー植物細胞。２９．前記核酸配列が、アンチセンス方向で前記転写プロモーターに作動可能に連結される、請求項２７に記載の形質転換コーヒー植物細胞。３０．前記細胞が、前記核酸配列で形質転換されていないコーヒー植物細胞と比較して減少したカフェイン生産を示す、請求項２２〜２９のいずれかに記載の形質転換コーヒー植物細胞。３１．請求項２２〜３０のいずれかに記載の形質転換コーヒー植物細胞から再生したコーヒー植物。３２．請求項３１に記載の再生したコーヒー植物由来のコーヒー豆。３３．コーヒー植物細胞によるカフェインの生産を阻害するための方法であって、以下の工程：配列番号10のアミノ酸配列を有するキサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼの発現を妨害するに充分な長さを有するRNAの転写をコードする核酸配列を含む形質転換ベクターを提供する工程であって、ここで、該核酸配列が、アンチセンス方向で転写プロモーターに作動可能に連結されている、工程；および該形質転換ベクターをコーヒー植物細胞に挿入する工程であって、ここで、該核酸配列は、その後、該コーヒー植物細胞のゲノムに挿入されて形質転換細胞を形成し、そしてここで、該形質転換細胞は、該核酸配列で形質転換されていないコーヒー植物細胞と比較して減少したカフェイン生産を示す、工程；を包含する、方法。３４．コーヒー植物細胞によるカフェインの生産を阻害するための方法であって、以下の工程：配列番号10のアミノ酸配列を有するキサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼの発現を妨害するに充分な長さを有するRNAの転写をコードする核酸配列を含む形質転換ベクターを提供する工程であって、ここで、該核酸配列が、センス方向で転写プロモーターに作動可能に連結されている、工程；および該形質転換ベクターをコーヒー植物細胞に挿入する工程であって、ここで、該核酸配列は、その後、該コーヒー植物細胞のゲノムに挿入されて形質転換細胞を形成し、そしてここで、該形質転換細胞は、該核酸配列で形質転換されていないコーヒー植物細胞と比較して減少したカフェイン生産を示す、工程；を包含する、方法。３５．キサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼの発現をコードするmRNAにアンチセンスであるRNAの転写をコードする核酸配列で形質転換されたコーヒー植物であって、ここで、該RNAは、コーヒー植物のキサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼの発現を妨害するに充分な長さを有する、コーヒー植物。３６．前記キサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼが、配列番号10のアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載のコーヒー植物。３７．請求項３５に記載のコーヒー植物由来のコーヒー豆。３８．キサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼの発現をコードするmRNAにセンスであるRNAの転写をコードする核酸配列で形質転換されたコーヒー植物であって、ここで、該RNAは、コーヒー植物のキサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼの発現を妨害するに充分な長さを有する、コーヒー植物。３９．前記キサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼが、配列番号10のアミノ酸配列を含む、請求項３８に記載のコーヒー植物。４０．請求項３８に記載のコーヒー植物由来のコーヒー豆。４１．キサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼの発現をコードするmRNAにアンチセンスであるRNAの転写をコードする核酸配列で形質転換されたコーヒー植物細胞であって、ここで、該RNAは、コーヒー植物のキサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼの発現を妨害するに充分な長さを有する、コーヒー植物細胞。４２．前記キサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼが、配列番号10のアミノ酸配列を含む、請求項４１に記載のコーヒー植物細胞。４３．キサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼの発現をコードするmRNAにセンスであるRNAの転写をコードする核酸配列で形質転換されたコーヒー植物細胞であって、ここで、該RNAは、コーヒー植物のキサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼの発現を妨害するに充分な長さを有する、コーヒー植物細胞。４４．前記キサントシン-Ｎ⁷-メチルトランスフェラーゼが、配列番号10のアミノ酸配列を含む、請求項４３に記載のコーヒー植物細胞。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＬＫ，ＬＲ，ＭＧ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＳＧ，ＴＲ，ＵＡ，ＶＮ (72)発明者ニュウペーン，カビラジアメリカ合衆国ハワイ 96826，ホノルル，コロプレイス 2724

Claims

【特許請求の範囲】１．実質的に純粋なキサントシンＮ⁷メチルトランスフェラーゼであって、 a)S-アデノシルメチオニンを基質として用いての、プリン環の７位でのキサントシンのメチル化； b)以下のアミノ酸配列を有するトリプシン処理フラグメントを含むこと、により特徴付けられる、キサントシンＮ⁷メチルトランスフェラーゼ。２．本質的に以下のアミノ酸配列からなる、実質的に純粋なキサントシン-Ｎ⁷- メチルトランスフェラーゼ：３．キサントシンＮ⁷メチルトランスフェラーゼの発現をコードする実質的に純粋な核酸配列であって、以下の配列： b)上記DNA配列にハイブリダイズするDNA配列であって、該ハイブリダイズする配列は、本質的に、上記DNA配列に相補的である配列からなる、配列；および c)上記DNA配列に関して縮重しているDNA配列、を含む、核酸配列。４．カフェインを含まないコーヒー豆を生産するための方法であって、以下の工程： a)以下のDNA配列にアンチセンスであるDNA配列でコーヒー植物を形質転換する工程： b)該形質転換したコーヒー植物から果実を収穫する工程、を包含する、方法。５．カフェインを含まないコーヒー豆を生産するための方法であって、以下の工程：コーヒー植物を、以下の配列：の発現をコードするDNA配列にアンチセンスであるDNA配列で形質転換する工程、を包含する、方法。