DE69736801T2

DE69736801T2 - Gereinigte proteine, rekombinante dns-sequenzen und prozesse für die produktion von koffeinfreien getränken

Info

Publication number: DE69736801T2
Application number: DE69736801T
Authority: DE
Inventors: I. John Kaneohe STILES; Istefo Honolulu MOISYADI; Raj Kabi Honolulu NEUPANE
Original assignee: University of Hawaii
Current assignee: University of Hawaii
Priority date: 1996-03-26
Filing date: 1997-03-24
Publication date: 2007-08-16
Anticipated expiration: 2017-03-25
Also published as: KR20040069364A; KR100561889B1; AP752A; WO1997035960A8; EA003835B1; EA199800765A1; ATE342363T1; AU711481B2; EP0862635A4; FI982070A0; IS4851A; TR199801909T2; NO984463L; US6075184A; AU4511197A; WO1997035960A1; HUP0300851A2; EP0862635A1; NO984463D0; CA2257120A1

Description

Die vorliegende Anmeldung betrifft gereinigte Proteine, rekombinante DNA-Sequenzen, damit transformierte Wirte und Verfahren zur Herstellung von koffeinfreien Getränken und Nahrungsmittelprodukten. Insbesondere betrifft die vorliegende Anmeldung gereinigte Proteine und rekombinante DNA-Sequenzen, die die Expression von Koffein in Kaffeepflanzen und in daraus geernteten Früchten unterdrücken. Die Erfindung ergibt stabile Linien von koffeinfreien Kaffeepflanzen, deren Früchte nach dem Rösten und Mahlen zur Herstellung von koffeinfreiem Kaffee verwendet werden können. Es wird erwartet, dass die Erfindung zur Unterdrückung der Koffeinsynthese in Tee (Camellia sinensis) und Cola (Cola acuminata) sowie von verwandten Alkaloiden in Schokolade (Theobroma cacao) verwendet werden kann.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Kaffee wird aus den gerösteten Kaffeebohnen der Pflanzen des Genus Coffea und im Allgemeinen der Spezies C. arabica hergestellt. Kaffeepflanzen produzieren das Alkaloid Koffein, das in den getrockneten Früchten, den Kaffeebohnen, vorkommt. Da viele Kaffeetrinker lieber Kaffee ohne Koffein trinken, wurden eine Reihe von Verfahren entwickelt, um Koffein aus Kaffeebohnen zu entfernen. Diese Verfahren führen alle dazu, dass außer Koffein auch andere Substanzen aus den Bohnen entfernt werden, wodurch der Geschmack des aus den behandelten Bohnen gebrühten Kaffees beeinträchtigt wird. Es gibt zwar einige natürlich vorkommende koffeinfreie Kaffeesorten und verwandte Arten (Mascarocoffea spp. und Coffea bengalensis), aber diese haben keinen kommerziellen Wert. (Charrier und Berthaud, „Variation of Caffeine Content In The Coffea Genus", Cafe Cacao The, 14:251-264 (1975)). Demnach besteht ein Bedarf nach einem Verfahren zur Herstellung von entkoffeinierten Kaffeebohnen, das nicht zur Entfernung von anderen Substanzen außer Koffein aus den Bohnen führt.
Koffein ist ein natürlich vorkommendes Purinalkaloid, das unter anderem von Kaffee- und Teepflanzen produziert wird. Es wird angenommen, dass die Koffeinsynthese die Pflanzen vor Insekten schützt. Kaffeepflanzen synthetisieren Koffein aus dem Nucleosid Xanthosin in vier sequentiellen Reaktionen wie in 1 gezeigt. Eine Übersicht findet sich in Suzuki, T., Ashihara, H. und Waller, G.R., Phytochemistry 31:2575 (1992). Der erste Schritt auf diesem Pfad ist die Methylierung des Nucleosids Xanthosin durch S-Adenosylmethionin, das von dem Enzym Xanthosin N⁷ Methyltransferase (XMT) katalysiert wird. Das Produkt, 7-Methylxanthosin, wird zu 7-Methylxanthin hydrolysiert (eine Ribose wird entfernt) und wird weiter zu Theobromin und Koffein methyliert. Es ist davon auszugehen, dass eine Unterbrechung dieser Reihenfolge von synthetischen Reaktionen die Koffeinsynthese blockieren würde.
Demnach besteht eine Strategie zur selektiven Eliminierung von Koffein aus Kaffeepflanzen darin, die Synthese spezifischer Enzyme in einem Pfad für die Koffeinbiosynthese zu verhindern. In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die genetische Veränderung von Kaffeepflanzen zur Eliminierung der Synthese von XMT. In der zurzeit bevorzugten Ausführungsform wird die Synthese von XMT durch Transformation der Kaffeepflanzen mit einer DNA-Sequenz unterdrückt, die bei Transkription für eine im Gegensinn zur mRNA, die bei Expression für XMT kodiert, stehenden Boten-RNA (mRNA) kodiert. Die Erfindung kann so verallgemeinert werden, dass andere koffeinfreie Getränke oder Nahrungsmittelprodukte, einschließlich Tee, Kakao und andere Getränke oder Nahrungsmittel auf Schokoladenbasis hergestellt werden können.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gereinigte Proteine, DNA-Sequenzen, die bei Expression dafür kodieren, und rekombinante DNA-Moleküle, einschließlich damit transformierte Wirte, zur Transformation von Kaffeepflanzen zur Unterdrückung der Expression von Koffein. Die DNA-Sequenzen und rekombinanten DNA-Moleküle sind dadurch gekennzeichnet, dass sie bei Expression für ein Enzym, Xanthosin N⁷ Methyltransferase (XMT) kodieren; dies ist der erste Schritt auf dem Weg zur Koffeinsynthese in Kaffee. Die Grundsequenz dieser DNA und die vorhergesagte Aminosäurensequenz von XMT werden bereitgestellt.
Kaffeepflanzen werden mit DNA-Molekülen transformiert, die bei Transkription für mRNA kodieren, die gegensinnig (antisense) zur mRNA vorliegt, die bei Expression für mindestens ein Enzym auf dem Weg zur Koffeinbiosynthese kodiert. Die gegensinnige RNA bindet an XMT mRNA und inaktiviert so die mRNA, die den ersten Schritt auf dem Weg zur Koffeinsynthese kodiert. Als Ergebnis können die transformierten Pflanzen nicht mehr Koffein synthetisieren, aber andere Aspekte ihres Stoffwechsels bleiben unbeeinflusst.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine schematische Zeichnung des Wegs zur Koffeinsynthese in Coffea arabica.
2 ist ein Foto eines mit Silber angefärbten SDS PAGE Gels von gereinigter Xanthosin-N⁷-methyltransferase.
3 ist eine densitometrische Darstellung der Elution tryptischer Fragmente von gereinigter Xanthosin-N⁷-methyltransferase nach HPLC-Trennung.
4 ist eine Beschreibung der Oligonucleotid-Primer, die für die Durchsuchung der cDNA-Bank-cDNA, die für Xanthosin-N⁷-methyltransferase kodiert, verwendet wurden.
5 ist die Grundsequenz der cDNA, die für Xanthosin-N⁷-methyltransferase kodiert.
6 mit der vorhergesagten Aminosäuresequenz von Xanthosin-N⁷-methyltransferase.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Zum vollständigen Verständnis der hierin beschriebenen Erfindung dient die nachfolgende detaillierte Beschreibung. In der Beschreibung werden folgende Begriffe verwendet:
Nucleotid – Eine monomere Einheit von DNA oder RNA aus einem Zuckerteil (Pentose), einem Phosphat und einer nitrogenen heterocyclischen Base. Die Base ist mit dem Zuckerteil über den glykosidische Kohlenstoff (1' Kohlenstoff von Pentose) verbunden und diese Kombination aus Base und Zucker wird Nucleotid genannt. Die Base charakterisiert das Nucleotid. Die vier DNA-Basen sind Adenin („A"), Guanin („G"), Cytosin („C") und Thymin („T"). Die vier RNA-Basen sind A, G, C und Uracil („U").
DNA-Sequenz – Eine lineare Anordnung von Nucleotiden, die durch Phosphodiesterbindungen zwischen den 3' und 5' Kohlenstoffen benachbarter Pentosen miteinander verbunden sind.
Codon – Eine DNA-Sequenz aus drei Nucleotiden (ein Triplett), die durch mRNA eine Aminosäure kodiert, ein Translationsstartsignal oder ein Translationsterminationssignal. Die Nucleotidtripletts TTA, TTG, CTT, CTC, CTA und CTG kodieren beispielsweise für die Aminosäure Leucin („Leu"), TAG, TAA und TGA sind Translationsterminationssignale und ATG ist ein Translationsstartsignal, das auch die Aminosäure Methionin („MET") kodiert.
Polypeptid – Eine lineare Anordnung von Aminosäuren, die über Peptidbindungen zwischen den Amino- und Carboxygruppen benachbarter Aminosäuren miteinander verbunden sind.
Genom – Die gesamte DNA einer Zelle oder eines Virus. Sie umfasst unter anderem das strukturelle Gen, das für die Polypeptide der Substanz kodiert, sowie Promotor-, Transkriptions- und Translationseinleitungs- und -terminationsstellen.
Gen – Eine DNA-Sequenz, die durch ihre Template- oder Boten-RNA („mRNA") eine Aminosäuresequenz kodiert, die für ein spezifisches Polypeptid charakteristisch ist.
Transkription – Das Verfahren der Herstellung von mRNA aus einem Gen oder einer DNA-Sequenz.
Translation – Das Verfahren der Herstellung eines Polypeptids aus mRNA.
Expression – Das Verfahren, dem ein Gen oder eine DNA-Sequenz unterworfen wird, um ein Polypeptid herzustellen. Es ist eine Kombination aus Transkription und Translation.
Plasmid – Eine nichtchromosomale doppelsträngige DNA-Sequenz mit einem intakten „Replikon", so dass das Plasmid in einer Wirtszelle repliziert wird. Wenn das Plasmid in einen einzelligen Organismus gebracht wird, können die Eigenschaften dieses Organismus durch die DNA des Plasmids verändert oder transformiert werden. Ein Plasmid, das das Gen für Tetracyclinresistenz (TETR) trägt, transformiert beispielsweise eine Zelle, die zuvor für Tetracyclin empfindlich war, in eine Zelle, die dagegen resistent ist. Eine Zelle, die durch ein Plasmid transformiert wird, nennt man eine „Transformante".
Phage oder Bakteriophage – Bakterienviren, von denen viele aus DNA-Sequenzen bestehen, die in einer Proteinhülle oder einem Proteinmantel verkapselt sind („Kapsid").
Klonvehikel – Plasmid, Phagen-DNA, Kosmid oder andere DNA-Sequenz, die in einer Wirtszelle replizieren kann, gekennzeichnet durch ein oder wenige Endonuklease-Erkennungsstellen, an denen solche DNA-Sequenzen auf vorbestimmbare Weise ausgeschnitten werden können, ohne Verlust einer wesentlichen biologischen Funktion der DNA, z.B. Replikation, Produktion von Mantelproteinen oder Verlust von Promotor- oder Bindungsstellen, und die einen Marker enthält, der zur Identifizierung von transformierten Zellen, z.B. Tetracyclinresistenz oder Ampicillinresistenz verwendet werden kann. Ein Klonvehikel wird häufig als Vektor bezeichnet.
Klonen – Verfahren der Gewinnung einer Population von Organismen oder DNA-Sequenzen aus einem solchen Organismus oder einer solchen Sequenz durch asexuelle Reproduktion.
Rekombinantes DNA-Molekül oder Hybrid-DNA – Ein Molekül aus Segmenten von DNA unterschiedlicher Genome, die auf der Außenseite von lebenden Zellen Ende an Ende verbunden wurden und die in lebenden Zellen aufrechterhalten werden können.
cDNA – Ein DNA-Strang, der einer mRNA komplementär ist und für ein bestimmtes Polypeptid kodiert.
Die Strategie zur Herstellung von koffeinfreiem Kaffee kann zwar auch auf andere Enzyme auf dem Weg zur Koffeinsynthese in Kaffee und andere Koffein produzierenden Pflanzen verallgemeinert werden, aber in der zurzeit bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Expression des ersten einzigartigen Enzyms auf diesem Weg, Xanthosin-N⁷-Methyltransferase (XMT) unterdrückt. Die Rolle von XMT in der Koffeinsynthese wurde zwar durch radioaktive Markierung von Vorläufern aufgeklärt, aber bis heute wurde das Enzym noch nicht gereinigt und seine Aminosäuresequenz wurde noch nicht bestimmt. Diese Erfindung umfasst daher im Wesentlichen gereinigtes XMT. Die Erfindung umfasst ferner die Aminosäuresequenz von tryptischen Fragmenten, die aus dem gereinigten XMT isoliert wurden.
CDNA-Sonden auf Basis von Teilen der Aminosäuresequenz, die aus Proben des gereinigten Enzyms gewonnen wurden, wurden synthetisiert und ein Teil des Gens wurde mit PCR amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden durch Screenen einer cDNA-Bank verwendet, die aus mRNA von jungen Blättern synthetisiert wurde, um für XMT kodierende Transkripte zu identifizieren. Die positiven Transkripte wurden sequenziert und ca. 90% des für XMT kodierenden Gens wurden erhalten.
DNA, die bei Expression für XMT kodiert, wird in einen pBI-121-Transformationsvektor eingebaut, der ein Kanamycin-Resistenzgen enthält. Der erfolgreiche Einbau des Vektors in die Pflanzenzellen wird durch Erfassung von antibiotischer Resistenz überwacht. Die Konstrukte werden zur Transformation von somatischen Kaffee-Embryos in Gewebekulturen verwendet. Die transformierten Embryos wachsen anschließend zu neuen Kaffeepflanzen heran, die kein Koffein produzieren. Natürlich entkoffeinierter Kaffee wird aus den gerösteten und gemahlenen Früchten dieser neuen Pflanzen hergestellt.
Insbesondere wurde frisches Blattgewebe von jungen Blättern von C. arabica mazeriert und das Protein daraus extrahiert. Säulengereinigte Extrakte wurden durch Überwachung der Methylierung von Xanthosin mit C¹⁴-markiertem S-Adenosylmethionin als Substrat auf enzymatische Aktivität untersucht. Das Reaktionsprodukt wurde durch Vergleich der Migration des markierten Reaktionsprodukts mit der Migration von 3-Methylxanthin, 7-Methylxanthin, 8-Methylxanthin, 7-Methylxanthosin, Xanthin und Xanthosin in jeweils vier verschiedenen Chromatographiesystemen als 7-Methylxanthosin bestätigt.
Die Reinheit der Proteinisolate wurde mit SDS PAGE Elektrophorese und zweidimensionaler Gelelektrophorese bestimmt. Anfärbung der eindimensionalen SDS PAGE Gels mit Silber zeigte die Anwesenheit eines Dupletts mit der enzymatischen Aktivität von XMT und einem Molekulargewicht von 36-37 kiloDalton (kD) wie in 2 gezeigt. Jedes Protein wurde durch isoelektrische Fokussierung weiter aufgelöst. Die Daten weisen auf das Vorliegen von Isozymen von XMT hin, die das Resultat einer posttranslationalen Modifikation des Proteins sein können; alternativ kann es eine Genfamilie geben, die für XMT-Enzyme kodiert.
Das auf SDS PAGE Gels visualisierte Duplett wurde für die Proteinsequenzierung verwendet. Gereinigtes XMT wurde partiell tryptisch aufgeschlossen, um Fragmente zur weiteren Analyse zu erhalten; drei Peaks wurden mit HPLC aufgelöst. Die Sequenzierung erfolgte durch das Protein Structure Laboratory der Universität von Kalifornien, Davis, unter Verwendung von automatischer Edman Degradierung. (Edman, P. und Begg, G., Eur. J. Biochem. 1:80). Zwei einzigartige Sequenzen wurden aufgelöst und zur Herstellung von Primern für die Sondensynthese verwendet. RNA wurde aus Kaffeeblättern extrahiert. mRNA enthaltende Poly (A+)Sequenzen wurden daraus gereinigt. Eine cDNA-Bank wurde mit Reverse-Transkriptase aus der Poly (A+) mRNA hergestellt. Doppelsträngige DNA wurde mit DNA Polymerase I hergestellt und durch Präzipitation wiedergewonnen. Die cDNA wurde fraktioniert und in den Phagen zur Amplifikation eingefügt. Die cDNA-Bank wurde mit einer PCR-synthetisierten Sonde durchsucht, die mit Primern auf Basis der von der Aminosäuresequenz des gereinigten XMT erwarteten DNA-Sequenz hergestellt wurde. Ein Klon, der eine cDNA produziert, die alle für XMT kodierenden Sequenzen enthält, wurde identifiziert.
Die cDNA, die dem für XMT kodierenden Gen entspricht, wird zur Transformation von embryonischen Kaffeepflanzen verwendet. Das Plasmid-pBI-121 wird als Transformationsvektor verwendet. Die der DNA, die bei Expression für XMT kodiert, entsprechenden Sequenzen werden in umgedrehter Orientierung neben einem Blumenkohl-Mosaikvirus-35S-Promotor in das Plasmid eingefügt. Daraus transkribierte RNA ist komplementär zur mRNA, die für die Aminosäuresequenz von XMT kodiert. Vollständige Konstrukte werden in Bakterienwirten amplifiziert. Die Wirte werden aufgebrochen und der amplifizierte Vektor wird an kolloidale Goldpartikel angeheftet. Die Goldpartikel mit den anhängenden Vektoren werden in Kaffeepflanzenprotoplasten eingefügt, indem die Partikel bei hoher Geschwindigkeit wie in US Patent 5.107.065 beschrieben an die Zellen geschleudert werden. Erfolgreich transformierte Jungpflanzen werden durch antibiotische Resistenz identifiziert. Die transformierten Pflanzen produzieren kein Koffein.
BEISPIELE
A. Reinigung von Xanthosin-N⁷-Methyltransferase aus C. arabica L. cv Kaffeeblättern aus Guatemala.
Junges Blattgewebe mit einer Länge von unter 5 mm (entsprechend dem Stadium B3 (Frischknecht, P.M., Ulmer-Dufek, J. und Baumann, T.W. (1986) Phytochemistry 25:613) wurde von Bäumen gesammelt, die in der University of Hawaii Waimanalao Research Station, Oahu, Hawaii, gezüchtet wurden. Die Blätter wurden sofort in flüssigen Stickstoff (flüssigen N₂) eingetaucht und bis zur Verwendung bei –70°C aufbewahrt. Alle anschließenden Verfahren wurden bei 4°C durchgeführt, sofern nichts anderes angegeben ist. Blattgewebe (150 g) wurde in einem Mörser mit Pistill unter flüssigem N₂ mazeriert und im noch gefrorenen Zustand in eine vorgekühlte Haushaltskaffeemühle überführt und mit einem kleinen Stück Trockeneis ca. 20 Sekunden gemahlen. Das Gewebepulver wurde in einen Becher mit 1,5 l eiskaltem 80%igen Aceton, 5 mM Thioharnstoff und 12,5 mM β-Mercaptoethanol gegeben. Nach dem Mischen auf einem Magnetrührer für 45 Minuten wurde das Gewebe durch Filtration unter Vakuum in einem Buchner-Trichter mit Whatman Nr. 1 Filterpapier zurückgewonnen. Das Gewebe wurde mit 2,5 l 80%igem eiskaltem Aceton gewaschen, das wie oben Thioharnstoff und β-Mercaptoethanol enthielt, 20 Minuten an der Luft getrocknet und dann 48 Stunden gefriergetrocknet.
Das resultierende Acetonpulver wurde in einem Mischer mit 400 ml Extraktionspuffer (EB) (0,1 M PIPES [pH 7,0], 0,5 mM Na₂EDTA, 0,5 mM Na₂EGTA, 5% Ascorbinsäure, 5 mM Dithiotreitol [DTT], 5 mM Thioharnstoff, 12 mM L-Cystein-HCl, 1 % Polyethylenglykol (PEG) 20.000, 0.1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid [PMSF] und 20 g Polyvinyl-polypyrrolidon [PVPP]) homogenisiert. Die Aufschlämmung wurde 10 Minuten bei mittlerer Geschwindigkeit homogenisiert und dann in 250 ml Zentrifugenflaschen überführt und bei 23.000 × g 30 Minuten in einem GSA (Dupont-Sorvall) Rotor zentrifugiert.
Der erhaltene rohe Überstand von 350 ml wurde über 30 Minuten durch langsames Hinzufügen von 79,86 g AS Pulver unter Rühren in einem Becher, der von einem Eisbad umgeben war, auf 40% Ammoniumsulfat (AS) Sättigung gebracht. Das Gemisch wurde erneut in 250 ml Zentrifugenflaschen überführt und bei 23.000 × g 30 Minuten wie oben beschrieben zentrifugiert. Der erhaltene Überstand von 350 ml wurde in eine 40 ml Macro-Pep (Bio-Rad) Methyl hydrophobische Interaktionschromatographie (HIC) Säule bei einer Fließgeschwindigkeit von 2,5 ml/Minute geladen. Alle Säulenfraktionen wurden mit Absorption bei 280 nm auf Protein überwacht. Die HIC-Säule wurde mit Prä-Äquilibrierungspuffer gewaschen, der 1,7 M AS, 20 mM bis-tris-Propan (pH 6,8) und 5 mM DTT enthielt, bis eine Grundlinie in der Nähe von Null erreicht wurde. Die Säule wurde dann mit einem Puffer gestrippt, der 10 mM tris (pH 7,0), 5 mM DTT, 1 mM MgCl₂ enthielt. Die ersten 15 ml aus der Säule wurden verworfen und das verbleibende Eluat (200 ml) wurde unter Schwerkraft in eine 100 ml Affi-Gel blaue Affinitätsgel (100-200 Mesh, Bio-Rad) Säule geladen, bei der der Farbstoff Cibacron blue F3Ga kovalent an der Matrix befestigt war. Das Gel wurde mit 10-mM tris (pH 7,0), 5 mM DTT, 1 MgCl₂ Ladepuffer voräquilibriert. Die Säule wurde gründlich mit diesem Ladepuffer gewaschen, bis sich die Grundlinie bei Null stabilisierte, und die gebundenen Proteine wurden mit einem Puffer eluiert, der 10 mM tris (pH 7,0), 5 mM DTT und 1,5 M Natriumchlorid (NaCl) enthielt.
Das Eluat (142 ml) der Affi-Gel Blue Gel Säule wurde durch langsames Hinzufügen von 31,8 g AS Pulver unter Rühren für 30 Minuten in einem Becher, der von einem Eisbad umgeben war, 1,7 M AS gemacht. Die Anschlämmung wurde in 250 ml Zentrifugenflaschen wie oben beschrieben 30 Minuten bei 23.000 × g zentrifugiert und der Überstand wurde in eine FPLC Phenyl-Sepharose Säule XK 26/20 (Pharmacia) bei 23°C geladen. Die Säule wurde mit einem Puffer voräquilibriert, der 20 mM tris-Propan (pH 6,8), 5 mM DTT und 1,7 M AS enthielt. Wenn sich eine Grundlinie in der Nähe von Null einstellte, wurden die Proteine aus der Säule in einem 40 Min umgekehrten Gefälle von 1,7 M AS bis 0 M AS bei einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/Minuten eluiert, wobei 1 Min Fraktionen gesammelt wurden. Der 0 M AS Elutionspuffer enthielt 10 mM tris (pH 7,0), 5 mM DTT und 1 mM MgCl₂.
Aktivitätsassays an den gesammelten Fraktionen wiesen darauf hin, dass der größte Teil der enzymatischen Aktivität für Xanthosin-N⁷-Methyltransferase in den Fraktionen 49 bis 54 konzentriert war. Diese Fraktionen wurden in ein Endvolumen von 30 ml zusammengefasst und dann in eine 6 ml ATP-Agarose Säule (Sigma Chemicals, A2767) durch Schwerkraft bei 4°C geladen. Die Säule wurde mit 10 mM tris (pH 7,0), 5 mM DTT und 1 mM MgCl₂ voräquilibriert. Nach Stabilisierung der Grundlinie wurde die Säule mit 20 ml Prä-Äquilibrierungspuffer mit 100 μM Xanthosin gestrippt und mit weiteren 40 ml Prä-Äquilibrierungspuffer gewaschen. Beide Säuleneluate wurden zusammengefasst und in eine Mono-P HR 5/20 FPLC (Pharmacia) Säule geladen, die mit 25 mM bis-tris (pH 6,0) und 9% Betain bei 23°C voräquilibriert war. Nach Stabilisierung der Grundlinie wurde die Säule mit 100 ml Polypuffer 74 (10 ml:90 ml H₂O, v:v) (pH 4,0) (Pharmacia) und 9% Betain bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/Minute eluiert. Die Sammelröhrchen enthielten 100 μl 0,5 M Tricin-Puffer (pH 7,0) und 50 mM DTT zu einer Endkonzentration von 1 ml 50 mM Tricin (pH 7,0) und 5 mM DTT in 1 Min-Fraktionen. Dadurch wurden die endgültigen pH-Bedingungen für die unter leicht saurem pH aus der Mono-P Säule eluierten Proteine stabilisiert. Die Hauptaktivität für Xanthosin-N⁷-Methyltransferase in Sammelröhrchen ohne Tricin wurde in Fraktionen 15 und 16 des aus der Säule eluierenden Gradienten mit einem pH von 5,42 bzw. 5,35 gefunden. Es war wichtig, die Proteinproben zu keinem Zeitpunkt der Reinigung einzufrieren, weil dies eine erhebliche negative Auswirkung auf den Aktivitätszustand der Xanthosin-N⁷-Methyltransferase hatte.
B. Untersuchung der Enzymaktivität
Das 100 μl Standardassaygemisch enthielt 50 mM Tricin (pH 7,0), 1200 μM Xanthosin, 5 mM DTT, 7,5 μM S-Adenosyl-L-[methyl-¹⁴C]-methionin (SAM) (60 mCi/mmol; DuPont NEN) und 1 mM Na₂EDTA. Das Reaktionsgemisch (50 μl ohne Enzym) wurde 10 Minuten bei 25°C vorinkubiert und die Reaktion wurde durch Hinzufügen von 50 μl Enzymlösung eingeleitet und bei 25°C 1 Stunde laufen gelassen. Am Ende der Inkubationszeit wurden 30 μl Aliquote der Reaktion entnommen und durch Hinzufügen von 8 μl 0,6 M Perchlorsäure (HClO₄) beendet. Der gleiche Vorgang erfolgte für Nullzeitkontrollen zum Nachweis echter Enzymaktivität. Dieses Gemisch wurde 5 Minuten in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert und 19 μl des Überstands wurde mit 1,0 μl 33 mM 7-Methyl-Xanthosin gemischt. Diese Gemische wurden auf Whatman Nr. 1 Chromatographiepapier angefleckt und mit n-Butanol-Essigsäure-H₂O (n-BuOH-HOAc-H₂O) (4:1:1) entwickelt. Die Position von 7-Methylxanthosin wurde anhand seiner blauen Fluoreszenz bei Exposition gegenüber kurzwelligem UV-Licht bestimmt. Diese Region wurde aus den Chromatogrammen geschnitten und die Radioaktivität wurde durch Szintillationszählung mit 3 mL Scinti-verse Szintillationsflüssigkeit (Fisher Scientific) bestimmt. Die Zähleffizienz betrug 74,7%. Hintergrundstrahlung und unspezifische Strahlung, die in der 7-Methylxanthosin-Region der Nullzeitproben festgestellt wurde, wurde subtrahiert.
C. Identifikation des Reaktionsprodukts.
Die Methylierungsstelle auf dem Xanthinring wurde durch Hydrolyse des Zuckers aus dem methylierten Xanthosin-Reaktionsprodukt und Trennung in 4 verschiedenen Chromatographiesystemen identifiziert. Das Produkt aus zwei 100 μl Reaktionen, die wie oben beschrieben durchgeführt wurden, und das 6 μl 33 mM 7-Methylxanthosin als Träger enthielt, wurde als Band am Ursprung eines Whatman Nr.1 Papierchromatogramms aufgetragen. Das Chromatogramm wurde in n-BuOH-HOAc-H₂O (4:1:1) entwickelt. Die Region des Chromatogramms, die dem methylierten Xanthosin entsprach, wurde wie oben nachgewiesen, in kleine Stücke geschnitten, in ein steriles Röhrchen gelegt und mit 35 ml entionisiertem Wasser bei 37°C unter Schütteln über Nacht inkubiert. Der Extrakt wurde durch 2 Schichten Miracloth und dann durch einen 0,22 μm Filter filtriert und anschließend lyophilisiert. Der getrocknete Extrakt wurde in 1,0 ml entionisiertem Wasser resuspendiert, in eine Glasaufschlussampulle verbracht und gefriergetrocknet. Die Probe wurde in 400 μl 1,0 M HCl resuspendiert und 1 Stunde bei 100°C inkubiert. Das Aufschlussprodukt wurde lyophilisiert, in 400 μl 3 mM 7-Methylxanthin resuspendiert und erneut gefriergetrocknet. Das Aufschlussprodukt wurde in 40 μl entionisiertem Wasser resuspendiert und 10 μl wurde in jeweils einem von vier verschiedenen Systemen chromatographiert. 1-Methylxanthin, 3-Methylxanthin, 7-Methylxanthin, 8-Methylxanthin, 7-Methylxanthosin, Xanthin und Xanthosin wurde auf jedem Chromatogramm zum Vergleich aufgenommen. Die folgenden Chromatographiesysteme wurden verwendet: Whatman Nr. 1 Papier, entwickelt in n-BuOH-HOAc-H₂O (4:1:1) und C8 Dünnschichtplatten (Whatman KC18F), entwickelt entweder in Isoamylalkohol-H₂O-Acetonitril (41:4:5), Ethanol-H₂O (4:1) oder tert-BuOH-HOAc-H₂O (4:1:1). Nach dem Trocknen wurden die Chromatogramme mit En³Hance (Dupont NEN) besprüht, erneut getrocknet und 30 Tage vorbelichtetem Fuji RX_GCU Röntgenfilm bei –70°C ausgesetzt.
D. Identifikation von Proteinen durch Gelelektrophorese.
Wie oben erhaltene Extrakte wurden in eindimensionalen (1D) SDS-PAGE Minigels (Hauptgel: 12,5% Acrylamid, 0,8% Methylenbisacrylamid; Stapelgel: 7,5% Acrylamid, 0,21 % Methylenbisacrylamid) durch Mischen mit Laemmli Probenpuffer (Laemmli, UK, Nature 227:680 (1970)) und in zweidimensionalen (2D) Mini IEF/SDS-PAGE nach der modifizierten Methode von O'Farrell et al. (O'Farrell, P.Z., Goodman, H.M., O'Farrell P.H., Cell 12:1133 (1977)) verwendet. Die zweidimensionale Elektrophorese war durch Abscheiden von Proteinen mit 50 Volumen von 100% Ethanol für 1 Stunde und erneutes Auflösen der Proteine in isoelektrischem Fokussier (IEF)-Probenpuffer mit 5% Ampholinen (1:1, v:v, pH 3-10:pH 5-7, LKB-Pharmacia) möglich. Das Verhältnis von ursprünglichem Proteinextrakt zum IEF Probenpuffer wurde bei mindestens 1:2 gehalten, um sicherzustellen, dass verbleibende Pufferbestandteile aus den Chromatographieschritten IEF nicht störten. Gleiche Gesamtproteinproben (<20 μg) wurde auf das basische Ende der vorfokussierten Röhrchengels (8,8% Acrylamid, 1,6% Methylenbisacrylamid) mit 5% Ampholinen wie oben aufgebracht. Die Gels wurden 10.000 V-Stunden plus weiteren 2 Stunden bei 1.000 V fokussiert. Blank fokussierte Gels wurden in 5 mm Abschnitte geschnitten und in 0,5 ml 100 mM CaCl₂ 24 Stunden inkubiert und der pH-Wert der Segmente wurde bestimmt. Aus dieser Analyse wurde der pH-Gradient des IEF-Gels auf einen Bereich von 4,4 bis 6,0 geschätzt.
Die Röhrchengels wurden für SDS-PAGE durch eine kurze H₂O-Wäsche gefolgt von drei Wäschen (jeweils 10 Minuten) in heißem Laemmli Probenpuffer vorbereitet. Die Röhrchengels wurden auf die SDS-PAGE Gels gesetzt (Hauptgel: 12,5% Acrylamid, 0,8% Methylenbisacrylamid; Stapelgel: 7,5% Acrylamid, 0,21% Methylenbisacrylamid) und mit 3% Agarose in Laemmli Probenpuffer festgehalten. Proteine wurden durch Anfärbung mit Silber visualisiert. In 1D Gels wies die Mono-P Fraktion 16 mit der höchsten enzymatischen Aktivität nur auf Anwesenheit eines Dupletts unter Silberanfärbung hin (2). Die Molekulargewichte dieser Proteine (kD) betrugen ca. 37,6 und 36,1 kD. In 2D Gels trennte sich jedes Gels in zwei Flecken. Der isoelektrische Punkt (IP) des saureren Flecks hatte einen durchschnittlichen Wert über mehrere Gels von 5,2, während der basischere Fleck einen Wert von 5,3 aufwies. Ihre Molekulargewichte lagen nun aber durchschnittlich bei 43,5 kD, wobei die oberen und untere Peptide ineinander übergingen. Deshalb gibt es einen klaren Unterschied in kD zwischen 1D und 2D Gels. Die ähnliche Migration aller vier Peptide in Mono-P Säulen, 1D und 2D Gels weist darauf hin, dass es Isozyme sind, die nach der Translation modifiziert werden können. Alternativ können sie Produkte einer Genfamilie sein, die sich in ihrer Struktur leicht voneinander unterscheiden können, wodurch die unterschiedlichen beobachteten Isozyme entstehen.
E. Proteinsequenzierung
Die Gesamtproteinschätzung nach dem Verfahren von Lowry (Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L. und Randall, R.J., J. Biol. Chem. 193:265 (1951)) für Fraktion 16 von Mono-P wies darauf hin, dass in der 1 ml Fraktion insgesamt 100 μg Protein vorlag. Unsere Erfahrung hat gezeigt, dass bei diesen niedrigen Proteinkonzentrationen die Lowry-Werte die tatsächlich vorliegende Menge eher überschätzen. Wir beschlossen, diesen Umstand durch Verwendung eines erheblichen Teils dieser Fraktion für die Proteinsequenzierung überzukompensieren. Ein 900 μl Teil der Mono-P Fraktion 16 entsprechend 90 μg, wurde in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen gelegt und 216 μl 100% Trichloressigsäure (TCA) wurden hinzugefügt. Nach dem Mischen wurde das Röhrchen auf Eis über Nacht inkubiert und dann in einer Mikrozentrifuge 30 Minuten bei 4°C bei 14.000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde durch Aspiration entfernt und das Pellet wurde zweimal mit 1 ml 75%igem Ethanol gewaschen, wobei jeder Wäsche ein Zentrifugationsschritt folgte. Das Pellet wurde getrocknet, indem das Röhrchen in einen Speedvac gestellt und 1 Minuten unter Vakuum geschleudert wurde. Dem Präzipitat wurde 20 μl 2 × Laemmli Probenpuffer hinzugefügt. Es wurde dann 5 Minuten in einem Wasserbad gekocht und 1 Minute mikrozentrifugiert. Wenn die Röhrchentemperatur auf 23°C abgekühlt war, wurde die gesamte Menge in eine einzelne Bahn eines 12,5% 1D Gels geladen. Am Ende der Elektrophorese wurden die Proteine visualisiert, indem mit 0,1% Coomassie R-250 in wässrigem 50%igem Methanol und 10% Essigsäure (w:v:v) angefärbt und dann entfärbt wurde. Das gleiche Duplett von 37,6 und 36,1 kD, das in mit Silber angefärbten Gels beobachtet wurde, war auch in den mit Coomassie angefärbten Gels sichtbar. Die Region des Gels, die dieses Duplett enthielt, wurde ausgeschnitten und für die Proteinsequenzierung mit automatischer Edman Degradierung verwendet.
Die Sequenzierung erfolgte mit dem Standardprotokoll des Protein Structure Laboratory der Universität von Kalifornien, Davis. Das das Duplett enthaltende Gelstück wurde 4 Mal mit je 15 ml H₂O durch vorsichtiges Schwenken für 15 Minuten gewaschen, um die Essigsäure und SDS aus den vorherigen Schritten zu entfernen. Das Gelstück wurde mit einer Rasierklinge in 2 mm große Quadrate geschnitten und in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Die Gelstücke wurden 2 Stunden in einem Speed-Vac dehydriert, bis sie nicht mehr am Röhrchen anhafteten. Als nächstes wurden 30 μl des Gelrehydrierungspuffers (0,1 M tri-HCl, pH 9,0, 0,05% SDS) hinzugefügt und der pH von 8,0 wurde durch Auftupfen von 0,5 μl auf pH-Papier überprüft. Das Aufschlussenzym Lys-C (0,2 μg) von Achromobacter lyticus (Wako) wurde hinzugefügt sowie zusätzlicher Rehydrierungspuffer, um die Gelstücke vollständig zu hydrieren und etwas Extrapuffer zurückzulassen. Das Gemisch wurde über Nacht bei 30°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde der Überstand in eine frische sterile Mikrozentrifuge überführt und gelagert. Es wurde so viel Wasser zugefügt, dass die Gelstücke bedeckt waren, und diese wurden weitere 2 Stunden bei 30°C inkubiert. Der Überstand wurde entfernt und in derselben Mikrozentrifuge wie zuvor aufbewahrt. Dieser Wäscheschritt wurde noch einmal wiederholt, wobei die Überstände mit den vorherigen zwei Wäschen kombiniert wurden. Die Gelstücke wurden dann mit einer Lösung aus 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) in 80% Acetonitril bedeckt und 1 Stunde bei 30°C inkubiert. Der Überstand wurde gesammelt und dem Röhrchen mit allen vorherigen Überständen zugefügt. Die letzte Wäsche wurde noch einmal wiederholt und die zusammengefassten Überstände wurden in einem Speed-vac getrocknet.
Die getrockneten tryptischen Aufschlussprodukte wurden in 25 μl 6 M Guanidin-HCl, 0,4 M tris (pH 8,2) gelöst und der pH wurde durch Auftupfen von 0,5 μl auf pH-Papier überprüft. Ein μl 450 mM DTT wurde zugefügt und das Aufschlussprodukt wurde 45 Minuten bei 50°C inkubiert. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurden 2 μl 500 mM Iodoacetamid zugefügt und weitere 15 Minuten bei 23°C inkubiert. Am Ende dieser Inkubation wurden 72 μl Wasser bis zu einer Endkonzentration von 1,5 M Guanidin und 0,1 M Tris zugefügt. Die Probe wurde dann 5 Minuten bei 14.000 U/Min in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert und der Überstand wurde sorgfältig in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Dem abgeschiedenen Pellet wurden 25 μl 0,1 % TFA zugefügt und gewirbelt. Das Röhrchen wurde dann wie zuvor erneut zentrifugiert und der Überstand wurde dem des vorherigen Schritts zugefügt.
Die Spaltfragmente des tryptischen Aufschlusses wurden durch kapillare Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) in einer C18 1 mm × 10 cm Säule unter Verwendung eines linearen Gradienten über 90 Minuten von 5% Lösungsmittel A (0,1% TFA) auf 70% Lösungsmittel B (0,075% Acetonitril) bei einer Fließgeschwindigkeit von 100 μl pro Minute gelöst. Der UV-Nachweis wurde auf 210 nm gestellt, wobei die Skala von 0 bis 0,1 A reichte. Die Wiedergewinnung einzelner Peaks wies auf die Anwesenheit von mehreren eindeutigen Peptiden wie in 3 gezeigt hin. Als Kontrolle wurde ein Teil des ursprünglichen BDS-PAGE Gels, das kein Protein enthielt, durch den Aufschlussprozess geführt. Die in 3 gezeigten gefüllten Peaks waren zwischen dieser Kontrolle und der Probe häufig. Die 3 Peaks A, B und C wurden einer automatischen Edman Degradierung unterworfen. Zwei der Peaks (A und B) ergaben überlappende einzigartige Sequenzen, die dasselbe Proteinfragment darstellten (2, Fragmente A und B). Der dritte Peak (C) ergab eine andere einzigartige Sequenz (2, Fragment C).
F. Synthese von Oligonucleotid-DNA-Primern für Xanthosin-N⁷-Methyltransferase.
Die chemische Synthese von 20 mer Primern für die beiden Aminosäuresequenzen, die durch die Aufschlussfragmente von Xanthosin-N⁷-Methyltransferase erhalten wurden, erfolgte durch The Midland Certified Reagent Company. Regionen der ausgewählten Fragmente zeigten minimale Nukleinsäure-Degeneration und wo möglich wurden Aminosäuren mit ausgedehnter genetischer Coderedundanz vermieden. Wenn dies nicht möglich war, wurde mehr als ein Primer für dasselbe Fragment synthetisiert, um alle möglichen alternativen Codonkombinationen einzuschließen. Ferner synthetisierten wir Primer auch so, dass sie zum kodierenden Strang der DNA-Sequenzen, die für die Aminosäuresequenz kodieren, komplementär waren. Nukleotid-Degenerationen in der dritten Position von drei oder mehr wurden durch Verwendung von Inosin an diesen Stellen überwunden. Bei zweifacher Degeneration eines Nukleotids wurden beide Nukleotide in die Primersynthese aufgenommen (3).
G. Extraktion von RNA aus jungen Kaffeeblättern im Stadium B3.
Alle Gegenstände, die bei der Extraktion verwendet wurden, waren steril, RNase-frei und durch Behandlung mit 0,1 % DEPC Wasser hergestellt. Alle Zentrifugationsschritte wurden bei 4°C durchgeführt, sofern nichts anderes angegeben ist.
Junge Kaffeepflanzen im Stadium B3 wurden gesammelt und wie oben beschrieben aufbewahrt. Die gesamte RNA wurde aus 100 g dieses jungen Blattgewebes isoliert, indem das Gewebe unter Flüssigstickstoff gemahlen und sofort in eine vorgekühlte Haushaltskaffeemühle überführt wurde. Das Gewebe wurde zusammen mit einem kleinen Stück Trockeneis zu einem Pulver gemahlen. Das Gewebe wurde dann zu 200 ml Homogenisierungspuffer aus 100 mM tris-HCl (pH 9,0), 200 mM NaCl, 15 mM Na₂EDTA, 0,5% Sarcosyl und frisch zugefügtem 100 mM β-Mercaptoethanol hinzugefügt. Diesem Gemisch wurden 200 ml mit Puffer äquilibriertes Phenol und 40 ml eines Gemisches aus Chloroform:Isoamylalkohol (24:1, v:v) zugefügt. Das Gewebe wurde dann in einem Glasbecher in einem Eisbad für 2 Minuten bei hoher Geschwindigkeit in einem Polytron-Homogenisator homogenisiert. Unmittelbar nach der Homogenisierung wurden 14 ml 3M Natriumacetat (pH 4,0) hinzugefügt und durch Laufenlassen des Homogenisators für weitere 1 Minute gemischt. Das Homogenisat wurde dann 15 Minuten auf Eis gelagert und anschließend in zwei 250 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen überführt. Die Zentrifugation erfolgte in einem GSA (DuPont Sorvall) Rotor bei 16.000 × g für 10 Minuten. Die wässrige Phase (obere Schicht) wurde in ein neues 250 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen überführt und ein gleiches Volumen Isopropanol wurde hinzugefügt.
Dieses Gemisch wurde über Nacht bei –20°C inkubiert und dann bei 10.000 × g für 10 Minuten zentrifugiert, um die abgeschiedene RNA zu sammeln.
Das RNA Pellet wurde mit 70%igem Ethanol gewaschen und bei 10.000 × g 5 Minuten erneut zentrifugiert. Der Ethanol wurde dekantiert und das Pellet wurde unter Vakuum 5 Minuten getrocknet. Das Pellet wurde in 15 ml mit DEPC behandeltem Wasser resuspendiert. Die RNA-Suspension wurde in ein steriles 40 ml Zentrifugenröhrchen mit Schraubkappe überführt und das unlösliche Material wurde durch 5-minütige Zentrifugation bei 10.000 × g entfernt. Der Überstand wurde in ein neues 40 ml Zentrifugenröhrchen mit Schraubkappe überführt und 5 ml 8M LiCl wurde bis zu einer Endkonzentration von 2M LiCl zugefügt. Das Röhrchen wurde über Nacht bei 4°C inkubiert und die RNA wurde durch 10-minütige Zentrifugation bei 14.000 × g gewonnen. Das RNA-Pellet wurde dann mit 70%igem Ethanol gewaschen, 5 Minuten bei 10.000 × g zentrifugiert und kurz unter Vakuum getrocknet. Das Pellet wurde in 15 ml mit DEPC behandeltem Wasser resuspendiert und 5 Minuten bei 10.000 × g zentrifugiert, um unlösliches Material zu entfernen. Der Überstand wurde in vier sterile 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen überführt und auf Eis gelagert. Die Quantifizierung von 10 μl der gesamten RNA-Lösung in einem Shimadzu UV 160 U Spektrophotometer in einem 230 bis 330 nm Spektrum wies darauf hin, dass 42,8 mg RNA vorlag. Die Röhrchen mit der RNA wurden bei –70°C aufbewahrt.
H. Reinigung von Poly (A+) mRNA aus Gesamt-RNA
Das gesamte RNA-Präparat wurde für Poly (A+) RNA (mRNA) mit dem PolyATtract II mRNA Isoliersystemkit (Promega Corporation) angereichert. Ein 600 μl Aliquot der Gesamt-RNA entsprechend 5,1 mg wurde einem Röhrchen aus dem oben erwähnten Kit hinzugefügt und das Endvolumen wurde mit RNase-freiem Wasser auf 2,43 ml gebracht. Nach dem Erhitzen auf 65°C für 10 Minuten wurden 10 μl 50 pMol/ml biotinyliertes Oligo(dT) und 60 μl 20 × SSC (175,3 g/l NaCL, 88,2 g/l Natriumcitrat, pH 7,0) zugefügt und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von ca. 30 Minuten langsam abgekühlt. Ein Aliquot der paramagnetischen Streptavidin-Teilchen wurde 3 Mal in 0,5 × SSC (1,5 μl pro Wäsche) gewaschen und in 0,5 ml 0,5 × SSC resuspendiert. Die RNA-Lösung mit dem biotinyliertem Oligo(dT) wurde den gewaschenen paramagnetischen Streptavidin-Teilchen zugefügt. Nach 10-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die paramagnetischen Teilchen und die eingefangene RNA mit einem Magneten auf der Seite des Röhrchens festgehalten. Der Überstand wurde entfernt und die Teilchen wurden vier Mal mit 0,1 × SSC gewaschen (1,5 ml/Wäsche). Die mRNA wurde gewonnen, indem die Teilchen in 1,0 ml RNasefreiem Wasser resuspendiert wurden und das Wasser entfernt wurde, während die Teilchen an der Seite des Röhrchens festgehalten wurden. Das Wasser wurde in Portionen von jeweils 500 μl in zwei 1,5 ml sterile Mikrozentrifugationsröhrchen überführt. Nach Zufügen von 1/10 des Volumens von 3M Natriumacetat (50 μl pro Röhrchen) wurde die mRNA durch Präzipitation mit einem gleichen Volumen Isopropanol (550 μl pro Röhrchen) gewonnen. Die Röhrchen wurden über Nacht bei –20°C gelagert und dann 30 Minuten bei 14.000 U/Min bei 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde mit 500 μl 75%igem eiskaltem Ethanol gewaschen und erneut zentrifugiert. Der Ethanol wurde dekantiert und das Pellet wurde kurz unter Vakuum getrocknet. Die mRNA wurde in 60 μl mit DEPC behandeltem nucleasefreiem sterilen Wasser gelöst. Die Quantifizierung erfolgte an 15 μl der gelösten mRNA wie für die Gesamt-RNA beschrieben. Ca. 9,6 μg mRNA wurden aus 5 mg Gesamt-RNA gewonnen.
I. Konstruktion der cDNA-Bank
Erst- und Zweitstrang-cDNA wurde mit dem ZAP-cDNA Synthesekit (Stratagene) synthetisiert. Vier μg mRNA in 25 μl Wasser wurden 5 Minuten bei 65°C inkubiert. Drei μl 100 mM Methylquecksilber wurden zugefügt und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Vier μl 700 mM β-Mercaptoethanol wurden zugefügt und die Inkubation wurde weitere 5 Minuten fortgesetzt. Der denaturierten mRNA wurden 5 μl 10 × Erststrang-Puffer, 5 μl 100 mM DTT, 3 μl Nucleotid-Gemisch (je 10 mM dATP, dGTP, TTP und 5-Methyl-dCTP), 2 μl 1,4 μg/ml Linker-Primer, (5'GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3'), 1 μl RNase Block und 5 μl Wasser zugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um den Primer an der mRNA zu befestigen, und 2,5 μl 20 μ/μl M-MuLV Reverse-Transkriptase wurden zugefügt. Fünf μl dieses Reaktionsgemisches wurden entfernt und in ein Röhrchen mit 0,5 μl 800 Ci/mMol [a-³²P]dCTP (DuPont NEN) überführt. Beide Reaktionen wurden 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Das radioaktiv markierte Reaktionsgemisch wurde für eine spätere Gelanalyse bei –20°C eingefroren.
Dem 45 μl Reaktionsgemisch wurden 40 μl Zweitstrang-Puffer, 15 μl 100 mM DTT, 6 μl Nucleotid-Gemisch (10 mM dATP, dGTP, TTP und 26 mM dCTP), 268,3 μl Wasser und 2 μl 800 Ci/mmol [a-³²P]dCTP hinzugefügt. Nach dem Mischen wurden 4,5 μl 1 μ/μl RNase H und 19,2 μl 5,2 μ/μl zugefügt. E. coli DNA Polymerase I wurde zugefügt und die Reaktion wurde 2,5 Stunden bei 16°C inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde mit 400 μl Phenol:Chloroform (1:1) extrahiert und die Phasen wurden durch Zentrifugation getrennt. Die wässrige Phase wurde in ein neues Röhrchen überführt und erneut mit Chloroform extrahiert. Die wässrige Phase wurde wie oben gewonnen. Die Doppelstrang-cDNA wurde durch Präzipitation über Nacht bei –20°C nach Zufügen von 33,3 μl 3M Natriumacetat und 867 μl 100% Ethanol gewonnen. Das Präzipitat wurde durch 60-minütige Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge bei 4°C gewonnen. Das Präzipitat wurde mit 1 μl 80%igem Ethanol gewaschen und durch Zentrifugation bei Raumtemperatur bei voller Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge gewonnen. Der Überstand wurde entfernt, das Präzipitat wurde unter Vakuum getrocknet und in 45 μl Wasser gelöst. Drei μl der resuspendierten Doppelstrang-cDNA wurden entfernt und bis zur Analyse durch Gelelektrophorese bei –20°C eingefroren.
Den restlichen 42 μl der Doppelstrang-cDNA wurden 5 μl 10 × Klenow Puffer (Puffer Nr. 3), 2,5 μl 2,5 mM Nucleotide (dCTP, dGTP, dATP und TTP) und 0,5 μl 5 μ/μl Klenow-Fragment zugefügt. Nach 30 Minuten bei 37°C wurden 50 μl Wasser zugefügt und das Reaktionsgemisch wurde mit einem gleichen Volumen Phenol : Chloroform (1:1) und dann mit Chloroform wie oben extrahiert. Nach Zugabe von 7 μl 3M Natriumacetat und 226 μl 100%igem Ethanol wurde die Doppelstrang-DNA mit stumpfem Ende durch Ausfällen durch Inkubation auf Eis für 30 Minuten und Mikrozentrifugation bei voller Geschwindigkeit bei 4°C für 60 Minuten gewonnen. Das Pellet wurde mit 300 μl 80%igem Ethanol gewaschen, zentrifugiert und wie oben getrocknet. Sieben μl der 0,4 μg/μl EcoRI Linker wurden der getrockneten cDNA zugefügt. Die Strukturen der EcoRI Linker sind wie folgt:
5' AATTCGGCACGAG 3'
– 3' GCCGTGCTC 5'
Nach Verwirbeln zur Resuspension der cDNA wurden 1 μl 10 × Ligationspuffer, 1 μl 10 mM ATP und 1 μl 4 Weiss μ/μl T4 DNA Ligase zugefügt und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei 8°C inkubiert. Die Ligase wurde durch Erhitzen bei 70°C für 30 Minuten inaktiviert. Die 5' Enden der an der cDNA anhängenden EcoRI Linker wurden mit Polynucleotidkinase phosphoryliert. Ein μl von 10 × Puffer Nr. 3, 2 μl 10 mM ATP, 6 ml Wasser und 1 ml 10 μ/ml T4 Polynucleotidkinase wurden dem Ligationsreaktionsgemisch zugefügt. Nach 30 Minuten bei 37°C wurde das Kinasereaktionsgemisch durch Erhitzen bei 70°C für 30 Minuten inaktiviert.
XhoI „Klebeenden", die dem 3' Ende der mRNA entsprachen, wurden am Ende der cDNA durch Aufschluss der XhoI Stelle im Linker-Primer erzeugt (siehe oben). 28 μl XhoI Puffer und 3 μl 40 μ/ml XhoI wurden der cDNA zugefügt und das Reaktionsgemisch wurde 1,5 Stunden bei 37°C inkubiert. Die cDNA mit den EcoRI Klebeenden am 5' Ende und den XhoI Klebeenden am 3' Ende (relativ zur ursprünglichen mRNA) wurde größenfraktioniert, indem sie wie folgt durch eine Sephacryl 5-400 Spinsäule geführt wurde. 5 μl 10 × STE (100 mM tris (ph 7.0)), 5 mM EDTA und 100 mM NaCl) wurden zugefügt und die cDNA wurde auf die Oberseite einer 1 μl Spritze mit Sephacryl S-400 aufgebracht. Ein 500 ml Mikrozentrifugenröhrchen wurden auf den Boden der Spritze gelegt und die Säule wurde in ein Zentrifugenröhren gestellt und 2 Minuten bei 400 × g zentrifugiert. 60 μl 10 × STE wurden auf die Spritze gegeben, ein neues Mikrozentrifugenröhren wurde auf den Boden gestellt und die Säule wurde erneut wie zuvor zentrifugiert. Dieses Verfahren wurden wiederholt, bis sechs Fraktionen gesammelt worden waren.
Ca. 10% jeder Fraktion wurden einer Elektrophorese auf einem 1% Agarosegel unterworfen, um die Größenverteilung der cDNA in jeder Fraktion zu bestimmen. Der Rest jeder Fraktion wurde mit einem gleichen Volumen Phenol:Chloroform und dann Chloroform wie oben beschrieben extrahiert und dann durch Zugabe von 2 Volumen 100% Ethanol ausgefällt. Nach Inkubation bei –20°C über Nacht wurde die cDNA durch Zentrifugation bei 14.000 U/Min bei 4°C für 60 Minuten in einer Mikrozentrifuge gewonnen. Die cDNA wurde mit 200 μl 80%igem Ethanol wie oben beschrieben gewaschen und getrocknet. Die cDNA wurde in 5 μl Wasser gelöst und 0,5 μl Wasser wurde entnommen, um die cDNA-Konzentration fluorographisch mit einem Hoefer TKO 100 DNA Fluorometer zu bestimmen. Die restlichen 4,5 ml von Fraktion 1, die die größten cDNA-Moleküle enthielt, enthielten ca. 304 ng cDNA.
Einhundert ng cDNA aus Fraktion 1 wurden in 1 μg Uni-Zap, einem Bakteriophagen Lambda ZAP Vektor, der mit EcoRI und XhoI (Stratagene) aufgeschlossen wurde, ligiert. Fraktion 1 cDNA (2,0 ml) wurden 0,54 μl 10 × Ligationspuffer, 0,5 μl 10mM ATP, 1 μl 1 μg/μl Uni-Zap XR Vektor und 0,5 μl 4 Weiss μ/μl T4 DNA Ligase zugefügt. Die Reaktionsmischung wurde ca. 44 Stunden bei 8°C inkubiert. Ein μl Aliquot des Ligationsreaktionsgemisches wurde einem Aliquot des „Freeze-Thaw" Extrakts aus dem Gigapack II Gold Verpackungskit (Stratagene) zugefügt. 15 μl sonischer Extrakt wurde zugefügt und der Inhalt wurde vorsichtig vermischt. Die Verpackung erfolgte bei Raumtemperatur. Nach 2 Stunden wurden 500 μl SM Puffer (0,01 M tris-HCl pH 7,5, 0,01 M MgCl₂ 0,1 mM Na₂EDTA) und 20 μl Chloroform dem Packreaktionsgemisch zugefügt, Trümmer wurden durch eine kurze Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge entfernt und die verpackten Phagen wurden bis zum Gebrauch bei 4°C aufbewahrt.
J. Titrierung der Primärbank.
Ein μl der 500 μl Primärbank wurde mit 9 μl SM Puffer für eine 1/10 Verdünnung gemischt. Mit 1 μl dieser Verdünnung wurden 200 μl E. coli XL1-Blue MRF' Zellen, die bis zu einer Dichte entsprechend einem Außendurchmesser₆₀₀= 0,5 gezüchtet worden waren, infiziert. Die Zellen wurden 15 Minuten bei 37°C unter leichtem Schütteln inkubiert. Die infizierten Zellen wurden dann mit 2,5 ml 48°C Top Agar mit 15 μl 0,5 M IPTG und 50 μl 250 mg/ml X-gal gemischt und auf 100 × 15 mm NZY Platten ausgestrichen (5 g/l NaCl, 2 g/l MgSO₄ × 7H₂O, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l NZ Amin [pH 7,5] und 15 g/l Difco Agar). Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Hintergrund-Plaques waren blau, während die rekombinanten Plaques weiß waren. Der Durchschnitt von drei solcher Platten wies darauf hin, dass 1 μl der Primärbank 1.930 weiße rekombinante Plaques und 65 blaue Plaques produzierte. Die gesamte 500 μl Primärbank repräsentierte den Berechnungen nach 965.000 rekombinante Plaques.
K. Amplifikation der Primärbank
In 20 sterile Röhrchen wurden 300 μl E. coli XL1-Blue MRF' Zellen, die bis zu einem Außendurchmesser₆₀₀= 0,5 gezüchtet worden waren, zugefügt. Jedem Röhrchen wurden 12,5 μl Primärbank und 90 μl SM Puffer zugefügt und die Röhrchen wurden 15 Minuten bei 37°C inkubiert. 2 ½ ml 48°C Top Agar wurden jedem Röhrchen zugefügt und die Zellen wurden auf 100 × 15 mm NZY Platten ausgestrichen. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. Fünf ml SM Puffer wurden jeder Platte zugefügt und die Platten wurden weitere 8 Stunden bei 4°C inkubiert. Der SM Puffer wurde mit einer sterilen Pipette gesammelt und in einem sterilen 250 ml Zentrifugenröhrchen aufbewahrt. Jede Platte wurde mit ca. 4 ml frischem SM Puffer gewaschen, der dem zuvor gesammelten Material zugefügt wurde. Chloroform wurde bis zu einem Endvolumen von 5% der amplifizierten Bank zugefügt. Die Bank wurde dann 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und 10 Minuten bei 2.000 × g zentrifugiert, um die Zelltrümmer zu entfernen. Der Überstand (114,5 ml) wurde gewonnen und dann in eine sterile Polypropylenflasche überführt. Chloroform wurde bis zu einem Endvolumen von 0,3% zugefügt und die amplifizierte Bank wurde bei 4°C aufbewahrt.
L. Titration der amplifizierten Bank.
Ein μl einer 10^–11 Verdünnung der amplifizierten Bank in SM Puffer enthielt 192 rekombinante Plaques, wenn sie wie oben ausgestrichen wurde. Um 50.000 rekombinante Plaques zu erhalten, wurden 25 μl einer 10^–7 Verdünnung verwendet, um 600 μl E. coli XL1-Blue MRF' Zellen, die bis zu einem Außendurchmesser₆₀₀ 0,5 gezüchtet worden waren, zu infizieren, die dann 15 Minuten bei 37°C inkubiert wurden. Diesen Zellen wurden 6,5 ml 48°C Top Agar zugefügt und die Bank wurde auf 150 × 15 mm NZY Platten ausgestrichen. Vier solche Platten entsprechend 200.000 rekombinanten Plaques wurden hergestellt und bei 37°C über Nacht inkubiert. Die Platten wurde dann 4 Stunden bei 4°C gekühlt und anschließend für das DNA-Screening der Bank verwendet.
M. Amplifikation mit Polymerasekettenreaktion (PCR) von Xanthosin-N⁷-Methyltransferase cDNA.
Die Synthese der Erststrang-cDNA erfolgte wie im Stratagene-Protokoll oben beschrieben. Die beiden durch tryptischen Aufschluss erhaltenen einzigartigen Peptidsequenzen ermöglichten die Synthese der in 4 gezeigten degenerierten Primer. Eine Polymerasekettenreaktion (PCR) (Saiki, R.K., Gelfand, D.H., Stoffel, S., Scharf, S.J., Higuchi, R., Horn, G.T., Mullis, K.B. und Erlich, H.A., Science 239:487 (1988) zwischen Paaren dieser Primer (1-6, 2-6, 3-5 oder 4-5) mit 4 ng cDNA, 1 μl 20 μM Primer, je 0,5 μl 1 mM Deoxyribonucleotidtriphosphat, 1,5-mM MgCl₂, 0,3 μl Taq DNA Polymerase [5.000 μ/ml], 2,5 μl 10 × PCR Puffer [10 mM tris-HCl (pH 9.0), 0.1% Triton X-100] und sterilem H₂O bis zu einem Endvolumen von 25 μl wurde durchgeführt. Die PCR Bedingungen waren 94°C für 4 Minuten [1 Cyclus]; 94°C für 1 Minute, 43°C für 1 Minute, 72°C für 1-Minute [35 Cyclen]; 72°C für 5 Minuten [1 Cyclus]). Die Reaktionen erfolgten in 500 μl sterilen Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Perkin Elmer DNA Thermal Cycler 480. Nur die Primerkombination 1 und 6 führte zu einem einzelnen Produkt bei einer Glühtemperatur von 43°C. Das Produkt wurde durch Agarosegelelektrophorese mit SeaPlaque Agarose (FMC) gemessen und enthielt ca. 750 Basenpaare. Eine handelsübliche 100 bp Leiter wurde als Größenmarker verwendet (Promega Corporation).
M. Klonen von kaffeespezifischem Xanthosin-N⁷-Methyltransferase-PCR-Genprodukt.
Dem mit Primer 1 und 6 (4) in einer 50 μl PCR Reaktion erhaltenen 750 bp Fragment wurden 50 μl Chloroform und 100 μl steriles Wasser zugefügt. Das Gemisch wurde verwirbelt und dann in einer Mikrozentrifuge 2 Minuten bei 14.000 U/Min zentrifugiert. Die obere wässrige Schicht mit der DNA wurde entfernt und in ein steriles Röhrchen überführt. Die Quantifizierung der Platte mit Ethidiumbromid wies auf das Vorliegen von ca. 5 ng von PCR-amplifizierter DNA/μl hin. Das PCR-Produkt wurde dann in einen TA Cloning Kit pCR II Vektor (Invitrogen Corporation) in einem 10 μl Ligationsreaktionsgemisch mit 1 μl 10 × Ligationspuffer, 2 μl pCR II Vektor (25 ng/μl), 3 μl frischem PCR-Produkt (5 ng/μl), 1 μl T4 DNA Ligase und 3 μl sterilem Wasser ligiert. Das Ligationsreaktionsprodukt wurde über Nacht bei 14°C inkubiert. Die Ligationsreaktionsprodukte wurden 2 Minuten bei 14.000 U/Min zentrifugiert und auf Eis gelegt. Einem frisch angetauten Fläschchen mit E. coli XL1-Blue kompetenten Zellen wurden 2 μl 0,5 M a-Mercaptoethanol zugefügt und vorsichtig mit der Pipettenspitze vermischt. Zwei μl des Ligationsreaktionsgemisches wurden in die Zellen pipettiert und die Zellen wurden vorsichtig mit der Pipettenspitze zum Vermischen gerührt. Das Fläschchen wurde dann 30 Minuten auf Eis inkubiert und exakt 30 Sekunden in einem 42°C Wärmeblock einem Hitzeschock unterzogen. Das Fläschchen wurde auf Eis gelegt. Nach 2 Minuten wurden 450 μl steriles SOC Medium (20 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 0,5 g/l NaCl, 10 ml/l 250 mM KCl, 10 ml/l MgCl₂, 20 ml/l 1 M Glucose [pH 7.0] zugefügt. Das Fläschchen wurde dann bei 225 U/Min in einem rotierenden Schüttler 1 Stunde geschüttelt und dann auf Eis gelegt.
Die transformierten Zellen wurden durch Pipettieren von 50 μl und/oder 200 μl der Zellsuspension auf ein von zwei LB Platten (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l NaCl, 15 g/l Difco Agar, pH 7,5) mit 50 μg/ml Ampicillin und 40 μg/ml X-Gal ausgestrichen. Die Platten wurden 20 Stunden bei 37°C inkubiert und dann 3 Stunden auf 4°C gebracht, um die Farbentwicklung zu ermöglichen. Sechs weiße Transformantenkolonien wurden auf Anwesenheit und Orientierung des PCR-Fragments untersucht.
N. Kochen von Plasmid Mini-Prep.
Jede Transformantenkolonie wurde in 5 ml steriler Nährbrühe (12 g/l Trypton, 24 g/l Hefeextrakt, 4 ml/l Glycerol, 100 ml/l 10 × TB Phosphat [0,17 M KH₂PO₄, 0,72 M K₂HPO₄]), ergänzt mit 50 μg/ml Ampicillin, gezüchtet. Die Röhrchen wurden über Nacht bei 37°C in einem rotierenden Schüttler inkubiert. Drei ml jeder Kolonie wurden in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen überführt, jeweils 1 ml, und die durch die Zellen wurde durch Zentrifugieren bei 14.000 U/Min für 2 Minuten konzentriert. Der Überstand wurde jedes Mal verworfen und das Zellpellet wurde möglichst trocken gelassen. Die Zellen wurden einmal mit 1 ml sterilem H₂O gewaschen und wie zuvor zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet wurde in 320 μl STET Puffer (8% Saccharose, 0,5% Triton X-100, 50 mM EDTA, 10 mM tris-HCl, pH 8,0) resuspendiert. Diesen Zellen wurde 32 μl 10 mg/ml Lysozym in TE Puffer (10 ml/l 1 M tris-HCl pH 8,0, 2 ml/l 0,5 M EDTA pH 8,0) zugefügt und durch mehrmaliges Umdrehen des Röhrchens gemischt. Die Röhrchen wurden 5 Minuten in ein kochendes Wasserbad gestellt und dann sofort auf Eis gelegt. Nach dem Abkühlen wurden sie 30 Minuten bei 14.000 U/Min und 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde mit einem sterilen Zahnstocher aus jedem Röhrchen entfernt. Dem Überstand wurden 170 μl 7,5 M NH₄OAc und 550 μl eiskalter Isopropanol zugefügt und die DNA wurde über Nacht bei –20°C ausgefällt. Die Röhrchen wurden 30 Minuten bei 14.000 U/Min und 4°C zentrifugiert und das Pellet wurde mit 75%igem Ethanol gewaschen und 1 Minute in einem Speed-Vac getrocknet. Die DNA wurde in 50 μl sterilem H₂O mit 1 μl 5 mg/ml RNase A resuspendiert.
O. Restriktionsaufschluss zur Entfernung des Einschubs aus pCR II Plasmid
Ein Reaktionsgemisch von 25 μl wurde durch Zufügen von 15 μl Plasmid mini-prep DNA, die wie oben erhalten wurde, 2,5 μl Puffer H (90 mM tris-HCl [pH 7,5], 10 mM MgCl₂, 50 mM NaCl), 1 μl EcoRI (8-12 μ/μl) und 6,5 μl steriles H₂O hergestellt. Das Gemisch wurde in einem gerüttelten Wasserbad für 1 Stunde bei 37°C inkubiert und dann 1 Minute in einem Wasserbad gekocht. Die Röhrchen wurden 15 Sekunden bei 14.000 U/Min zentrifugiert und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Zu 10 μl jedes Gemisches wurden 2 μl Beladungsfarbstoff zugefügt und die Aufschlussprodukte wurden durch 1,5% Agarosegelelektrophorese mit ultrareiner Agarose (GibcoBRL) und einer 100 bp Leiter als Größenmarker (Promega Corporation) analysiert.
Nur eines der sechs Reaktionsgemische wies auf das Vorliegen eines aufgeschlossenen Einschubs von ca. 750 bp hin. Die dem Plasmid entsprechende ursprüngliche Bakterienkolonie mit dem 750 bp Xanthosin-N⁷-Methyltransferase-PCR-Produkt wurde in einen 250 ml Erlenmeyerkolben mit 50 ml sterilem LB Medium (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l NaCl, pH 7,5)ergänzt mit 50 μg/ml Ampicillin geimpft. Der Kolben wurde in einem Drehen-Schüttler bei 30°C über Nacht inkubiert. In einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen wurden 18 ml des resultierenden Zellmediums durch Zentrifugation wie oben konzentriert.
Plasmid-DNA wurde mit dem QIAGEN Plasmid Mini Kit Verfahren (Qiagen Inc.) gereinigt. Das gewaschene Bakterienpellet wurde in 0,3 ml Puffer P1 mit der gelieferten RNase resuspendiert. Dazu wurden 0,3 ml alkalischer Lysepuffer P2 zugefügt, vorsichtig gemischt und für höchstens 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die nächsten 0,3 ml des gekühlten Puffers P3 wurden zugefügt und durch 6-maliges Umdrehen des Röhrchens gemischt. Nach 10 Minuten auf Eis wurde der Extrakt bei 14.000 U/Min 15 Minuten in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und auf eine QIAGEN-Spitze 20 aufgebracht, die zuvor durch Aufbringen von 1 ml QBT Puffer durch Schwerkraft äquilibriert worden war. Der aufgebrachte Zellextrakt-Überstand konnte durch Schwerkraftströmung auch in das Harz der Säule fließen. Sobald der Fluss durch die Säule beendet war, wurde die QIAGEN-Spitze 20 4 Mal mit einem ml Puffer QC gewaschen. Die DNA wurde durch Waschen der QIAGEN-Spitze 20 mit 0,8 ml Puffer QF eluiert und durch Zugabe von 0,7 Volumen (560 μl) Isopropanol bei Raumtemperatur ausgefällt. Das Röhrchen wurde sofort bei 14.000 U/Min 30 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde sorgfältig entfernt. Die ausgefällte DNA wurde mit 1 ml eiskaltem 70%igem Ethanol gewaschen, wie oben zentrifugiert und 5 Minuten an der Luft getrocknet. Die DNA wurde in 100 μl sterilem H₂O resuspendiert. UV-Spektrometrie wie oben beschrieben an 1 μl der DNA Resuspension wies darauf hin, dass 55 μg gereinigte rekombinante pCRII Plasmid DNA pro 100 μl vorlag.
Die automatische DNA-Sequenzierung des Einschubs im pCRII Plasmid vom 5' Ende erfolgte mit dem M13 Reverse Primer, der an eine Referenz in pCRII direkt neben der Stelle, an der das PCR Produkt eingefügt wurde, bindet. Die Sequenzierung erfolgte in der biotechnologischen Serviceeinrichtung der University of Hawaii. Das Sequenzierungsreaktionsgemisch enthielt 1 μg Plasmid-Matrize und 3,2 pmol M13 Primer. Die erhaltene Sequenz wies darauf hin, dass das PCR Produkt für die DNA-Sequenz der ersten 6 Aminosäuren der Peptidfragmente A und B (4) kodierte, aus deren Sequenz die degenerierten DNA-Primer 1 und 2 (4) bestanden. Darüber hinaus kodierte die Sequenz auch für die folgenden 7 Aminosäuren des Peptidfragments, deren DNA-Sequenz nicht bei der Konstruktion des Primers verwendet worden war. Tatsächlich wurde somit die DNA-Sequenz für das korrekte Protein geklont.
P. Herstellung einer willkürlich geprimten Sonde für das cDNA-Screening mit dem PCR-Produkt.
Zwei 25 μl Restriktionsaufschlüsse mit EcoR1 wurden an zwei 17,5 μl Aliquoten des gereinigten pCRII Plasmids wie oben beschrieben durchgeführt. Die Produkte wurden wie zuvor auf 1% Agarosegel getrennt und der 750 bp Einschub wurde aseptisch aus zwei Bahnen des Gels ausgeschnitten. Die Gelstücke mit einem Gewicht von 0,65 g wurden in ein steriles 40 ml Polypropylenröhrchen überführt und einer Geneclean II Kit Reinigung (BIO 101, Inc.) unterworfen. Viereinhalb Volumen NaI (2,93 ml) Stammlösung wurden den Gelscheiben zugefügt. Die Hälfte des Volumens des Gel TBE Modifikators (325 μl) wurde zugefügt und das Röhrchen wurde 5 Minuten bei 45°C inkubiert. Dazu wurden 15 μl Glasmilchsuspension zugefügt und weitre 5 Minuten inkubiert. Der Glasmilch/DNA-Komplex wurde durch Zentrifugation bei 1.000 U/Min 10 Sekunden pelletiert und der Überstand wurde entfernt. Das Glasmilchpellet wurde 3 Mal mit 1 ml New Wash Lösung gewaschen und die DNA wurde mit 50 μl sterilem H₂O eluiert. Ethidiumbromid-Platten wiesen darauf hin, dass die DNA-Konzentration 10 ng/μl betrug.
Eine willkürlich geprimte Sonde wurde aus 30 ng (3 μl) der gereinigten DNA synthetisiert. Drei μl der DNA wurde 27 μl sterilem Wasser zugefügt und die DNA wurde durch Erhitzen in einem kochenden Wasserbad denaturiert. Dazu wurden die Bestandteile des Promega Corporations Prime-a-Gene Kit (10 μl 5 × Markierpuffer, 2 μl unmarkierte dNTP [jeweils 20 μM dCTP, dGTP, TTP], 2 μl 1 mg/ml acetyliertes BSA, 1 μl 5 μ/μl Klenow-Enzym) und 5 μl [a-³²P]dATP (50 μCi, 3.000 Ci/mmol; DuPont NEN) bis zu einem Endvolumen von 50 μl zugefügt und bei Raumtemperatur 1 Stunde inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2 μl 0,5 M Na₂EDTA (20 mM Endkonzentration) beendet und 2 Minuten in einem kochenden Wasserbad erhitzt.
Q. Screening der amplifizierten Bank mit einer willkürlich geprimten Sonde
Die vier 150 × 15 mm NZY-Platten mit ca. 50.000 rekombinanten Klons pro Platte wurde auf 4°C gekühlt (Ausstreich- und Wachstumsbedingungen siehe oben) und die rekombinanten Plaques wurden angehoben, indem zunächst 132 mm Magna Nylon-Transfermembranen (MSI Corporation) auf 10 Sekunden mit 5 × SSC Puffer gesättigtem Chromatographiepapier vorgeweicht wurden. Die Membranen wurden 5 Minuten auf die Platten mit den rekombinanten Plaques gelegt, dann angehoben und mit der die Phagen enthaltenden Seite nach oben 2 Minuten auf Chromatographiepapier gelegt, das mit 0,5 M NaOH und 1,5 M NaCl gesättigt war. Die Membranen wurden durch Überführung auf Chromatographiepapier, das mit 0,5 M tris-HCl (pH 8,0) und 1,5 M NaCl gesättigt war, für 5 Minuten neutralisiert. Sie wurden dann 20 Sekunden auf Chromatographiepapier gelegt, das mit 2 × SSC Puffer, 0,2 M tris-HCl (pH 7,5) gesättigt war, und dann trocken getupft. Nach 1 Stunde Lufttrocknen wurde die DNA durch Exposition gegenüber 12.000 μJoules UV mit einem UV Stratalinker 1800 (Stratagene Corporation) mit den Membranen vernetzt. Die vier Membranen wurden bei 65°C 2 Stunden in 100 ml 6 × SSPE (52,2 g/l NaCl, 8,3 g/l NaH₂PO₄ × H₂O, 2,2 g/l Na₂EDTA [pH 7,4], 5 × Denhardt Lösung (1 g/l Ficoll, 1 g/l Polyvinylpyrrolidon, 1 g/l BSA [Pentaxfraktion V]), 0,5% SDS und 100 μg/ml denaturierte Heringssperma-DNA in einem Hybrid Mark II Hybridisierungsofen vorhybridisiert.
Die Hybridisierung erfolgte bei 65°C für 12 Stunden in 10 ml 6 × SSPE, 0,5% SDS, 100 μg/ml pulverisierter/denaturierter Heringssperma-DNA und 52 μl 15 × 10⁶ dpms/ml der oben beschriebenen willkürlichen geprimten Sonde. Am Ende des Hybridisierungszeitraums wurde die Sonde entfernt und die Membranen wurden 30 Sekunden kurz mit 100 ml 65°C 2 × SSC mit 0,5% SDS gewaschen. Die Membranen wurden dann weitere 30 Minuten mit der gleichen Menge und der gleichen Konzentration frischem Puffer gewaschen. Die Membranen wurden zwei weiteren Wäschen mit jeweils 100 ml für 30 Minuten mit 65°C, 0,2 × SSC, 0,5% SDS unterworfen und dann in eine Zellophanhülle gewickelt und mit einem vorgeblitzten Fuji RX_GCU Röntgenfilm bei –70°C für 24 Stunden belichtet. Fünfzehn positive Klone wurden beobachtet. Diese Plaques wurden aufgenommen und in 1 ml SM Puffer mit 20 μl Chloroform (Phagenstamm) gelegt. Davon wurden 11 bis zum sekundären oder tertiären Screening aufbereitet, bis einzelne individuelle Plaques erhalten wurden.
R. Charakterisierung von Xanthosin-N⁷-Methyltransferase-cDNA-Klons
Die Größen der putativen Xanthosin-N⁷-Methyltransferase-cDNA-Klons wurden mit Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von Primern bestimmt, die zu den T3 und T7 Promotern homolog sind, die auf dem Klonvektor vorliegen und die cDNA-Einschubstelle flankieren. Die Bedingungen für die Polymerasekettenreaktion waren wie oben beschrieben, mit der Ausnahme, dass der Cyclus wie folgt aussah: 35 Cyclen bei 95°C für 1 Minute, 50°C für 1 Minute und 72°C für 2 Minuten. Die Analyse erfolgte mittels Agarosegelelektrophorese wie zuvor. Die drei größten erhaltenen Klone wurden in vivo ausgeschnitten, indem in einem sterilen Röhrchen 200 μl Einzelplaque-Phagenstamm mit 200 μl frischen XL1-Blue MRF' Zellen, die bis zu einem Außendurchmesser₆₀₀ = 1,0 gezüchtet wurden, gemischt wurden. Diesem Gemisch wurde 1 μl ExAssist (Stratagene Corporation) Helferphage (> 1 × 10⁶ pfu/μl) zugefügt und die Röhrchen wurden 15-Minuten bei 37°C inkubiert. Drei ml sterile LB Brühe wurde zugefügt und die Inkubation wurde 3 Stunden bei 37°C unter Schütteln fortgesetzt. Die Kulturen wurden in einem 70°C warmen Wasserbad 20 Minuten erhitzt und anschließend wurden die Röhrchen bei 1.000 × g 15 Minuten zentrifugiert. Ein ml des Überstands mit dem ausgeschnittenen pBluesript Phagemid, verpackt als filamentöser Phagenpartikel, wurde in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen überführt und bei 4°C als Stammlösung aufbewahrt. 25 μl der Stammlösung wurden 200 μl E. coli Solar Zellen, die bis zu einem Außendurchmesser₆₀₀ = 1 gezüchtet worden waren, in einem Mikrozentrifugenröhrchen zugefügt. Nach Inkubation bei 37°C für 15 Minuten wurden die 200 μl Zellen auf 100 × 15 mm NZY Agarplatten mit 50 μg/ml Ampicillin ausgestrichen. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert, bis Kolonien erschienen. Eine einzelne Kolonie wurde in 10 ml sterile LB Brühe mit 50 μg/ml Ampicillin geimpft und über Nacht bei 37°C unter Schütteln gezüchtet. Die 10 ml Zellkultur wurden in einem 1,5 ml sterilen Mikrozentrifugenröhrchen konzentriert und die pelletierten Zellen wurden einer QIAGEN Plasmidreinigung wie oben beschrieben unterworfen. Die gereinigte Plasmid-DNA wurde in 50 μl sterilem H₂O resuspendiert. Automatische DNA-Sequenzierungsreaktionen erfolgten durch Mischen von 8 μl dieser DNA-Probe (0,8 μg) mit 4 μl T3 oder T7 Sequenzierungsprimern (0,8 pmol/μl). Der Rest des Verfahrens war wie bereits beschrieben. Jede Sequenzierungsreaktion ergab ca. 350 Sequenzbasen. Die Sequenz ist in 5 gezeigt. Die Aminosäuresequenz von Xanthosin-N⁷-Methyltransferase wie von der Basensequenz der cDNA vorhergesagt ist in 6 gezeigt.
Die vorstehenden Beispiele sind nur zur Veranschaulichung bestimmt und sollten den Umfang der Erfindung der Anmelderin, die in den anhängenden Beispielen aufgeführt ist, nicht einschränken.
SEQUENCE LISTING

Claims

Im Wesentlichen reine Xanthosin-N⁷-methyltransferase unter Verwendung von S-Adenosylmethionin als ein Substrat charakterisiert durch tryptische Fragmente A, B oder C gemäß der folgenden Formeln:
Transferase nach Anspruch 1, im Wesentlichen bestehend aus der Aminosäuresequenz gemäß 6.
Genetisch veränderte Kaffeepflanze, dadurch gekennzeichnet, dass die Veränderung auf der Transformation mit einer DNA-Sequenz beruht, die die Synthese von Xanthosin-N⁷-methyltransferase gemäß Anspruch 1 oder 2 unterdrückt.
Genetisch veränderte Frucht oder Bohne der Kaffeepflanze, welche sich von der Pflanze nach Anspruch 3 ableitet, enthaltend ein DNA-Molekül, welches die Synthese von Xanthosin-N⁷-methyltransferase gemäß Anspruch 1 oder 2 unterdrückt.
Genetisch veränderte Kaffeepflanze, Frucht oder Bohne der Pflanze enthaltend ein DNA-Molekül, das bei der Transkription für mRNA codiert, welches gegensinnig (antisense) zur mRNA vorliegt, welche bei der Expression für Xanthosin-N⁷-methyltransferase gemäß Anspruch 1 oder 2 codiert.
Im Wesentlichen reine DNA-Sequenz, welche bei der Expression für Xanthosin-N⁷-methyltransferase codiert, ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus a) einer Sequenz gemäß 5; b) DNA-Sequenzen, welche zur Sequenz gemäß 5 hybridisieren, wobei besagte hybridisierende Sequenzen im Wesentlichen aus Sequenzen bestehen, welche komplementär zur Sequenz nach 5 sind; und c) DNA-Sequenzen, welche bezüglich der Sequenz gemäß 5 degeneriert sind.
DNA nach Anspruch 6, welche ein Kloniervehikel ist.
Verfahren zur Herstellung von Kaffeebohnen, welche frei sind von Koffein, umfassend: a) Transformieren der Kaffeepflanzen mit einer DNA-Sequenz, die entweder gegensinnig zu einer zweiten DNA-Sequenz ist, oder welche bei der Transkription für eine mRNA codiert, die gegensinnig zu einer zweiten DNA-Sequenz ist, wobei besagte zweite DNA-Sequenz entweder die DNA-Sequenz gemäß 5 ist oder eine DNA-Sequenz, welche bei der Expression für eine Proteinsequenz gemäß 6 codiert; und gegebenenfalls b) Ernten der Frucht von den transformierten Kaffeepflanzen.