KR100561889B1 - 정제된 단백질, 재조합 디엔에이서열 및 카페인 없는 음료를 제조하는 방법 - Google Patents

정제된 단백질, 재조합 디엔에이서열 및 카페인 없는 음료를 제조하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 카페인의 발현을 억제하기 위하여 커피 식물을 형질전환시키기 위한 정제된 단백질, 발현시 이를 암호화하는 DNA 서열 및 재조합 DNA 분자 및 이로 형질전환된 숙주에 관하다. DNA 서열 및 재조합 DNA 분자는 발현시 커피 카페인 합성 경로에서 효소를 암호화하는 것을 특징으로 한다. 커피 식물은 발현시 카페인 생합성 경로에서 하나 이상의 효소를 암호화하는 mRNA에 대하여 안티센스인 mRNA를 전사시 암호화는 DNA 분자로 형질전환된다.

Description

정제된 단백질, 재조합 디엔에이 서열 및 카페인 없는 음료를 제조하는 방법
본 출원은 정제된 단백질, 재조합 DNA 서열, 이로 형질전환된 숙주 및 카페인 없는 음료 및 식품을 제조하는 방법에 관한다. 더 구체적으로 본 출원은 정제된 단백질 및 커피 식물 및 이로부터 수확되는 열매에서 카페인의 발현을 억제하는 재조합 DNA 서열에 관한다. 본 발명은 그 열매를 볶고 분쇄한 후 카페인 없는 커피를 제조하는데 사용할 수 있는 카페인 없는 커피 식물의 안정한 라인을 제공한다. 본 발명은 쵸콜렛(테오브로마 카카오:Theobroma cacao)에서 관련된 알칼로이드 뿐만 아니라 차(카멜리아 시넨시스:Camellia sinensis) 및 콜라(콜라 아쿠미나타:Cola acuminata)에서 카페인 합성을 억제하는데 사용할 수 있을 것으로 기대된다.
커피는 일반적으로 씨. 아라비카 종으로부터 커피는 건과인 커피 원두내에 존재하는 알칼로이드 카페인을 생성시킨다. 많은 커피 소비자들이 카페인 없는 커피를 더 선호하므로 커피 원두로부터 카페인을 제거하기 위한 다수의 방법이 개발되어 왔다. 이들 방법 모두는 원두로부터 카페인 외에 다른 물질들을 제거하는 결과를 낳아 이렇게 처리된 원두로 끓인 커피 맛에 좋지 않은 영향을 미친다. 소수의 자연적으로 발생하는 카페인 없는 커피 및 관련 속(마스카로코페아 에스피피.(Mascarocoffea spp.), 및 코페아 벵갈렌시스(Coffea bengalensis))들이 공지되어 있으나 상업적인 가치는 없다. (Charrier 및 Berthaud, "Variation Of Caffein Content In The Coffea Genus", Cafe' Cacao The'. 14:251-264(1975)). 따라서, 원두로부터 카페인 이외의 물질을 제거하지 않는 카페인 제거된 커피 원두를 제조하는 방법이 필요하다.
카페인은 커피 및 차 식물에서 생성되는 천연적으로 발생하는 알칼로이드이다. 카페인 합성 생성물은 식물을 해충으로부터 보호한다고 사료되어진다. 커피 식물은 도1에 도시된 바와 같은 4가지 연속 반응에서 누클레오시드 크산토신으로부터 카페인을 합성한다. Suzuki, T., Ashihara, H. 및 Waller, G.R. Phytochemistry 31:2575(1992)를 참조하시오. 경로 중 제1단계는 효소인 크산토신 N7 메틸 전달효소(XMT)에 의하여 촉매되는 S-아데노실메티오닌에 의한 누클레오시드 크산토신의 메틸화이다. 생성물인 7-메틸크산토신은 7-메틸크산틴으로 가수분해되어(리보오스가 제거됨) 테오브롬 및 카페인으로 다시 메틸화된다. 합성 반응의 이러한 서열 중단은 카페인 합성을 블록킹할 것으로 예상된다.
따라서, 커피 식물로부터 선택적으로 카페인을 제거하는 방법은 카페인 생합성 경로에서 특정 효소의 합성을 방해하는 것이다. 한 구체예에서, 본 발명은 XMT의 합성을 제거하기 위한 커피 식물의 유전적 대안에 관한다. 바람직한 구체예에서, XMT의 합성은 메신저 RNA(mRNA)에 대한 전사시 암호화되는 DNA 서열로 커피 식물을 형질전환시켜 억제한다. 본 발명은 차, 코코아 및 기타 쵸콜럿을 베이스로 하는 음료 또는 식품을 포함하는 기타 카페인 없는 음료 및 식품을 제조하는 것으로 일반화될 수 있을 것이다.
발명의 요약
카페인의 발현을 억제하기 위하여 커피 식물을 형질전환하기 위한 정제된 단백질, 발현시 암호화되는 DNA 서열 및 재조합 DNA 분자(이로 형질전환된 숙주 포함). DNA 서열 및 재조합 DNA 분자는 이들이 발현시 효소인 크산토신 N7 메틸 전달효소(XMT)를 암호화한다는 것을 특징으로 하는데 이것이 커피 카페인 합성 경로의 제1단계이다. DNA의 염기 서열 및 예상되는 XMT의 아미노산 서열을 제공한다.
커피 식물은 카페인 생합성 경로에서 발현시 하나 이상의 효소를 암호화하는 mRNA에 대한 안티센스인 mRNA를 전사시 암호화하는 DNA 분자로 형질전환된다. 안티센스 RNA는 XMT에 mRNA를 결합시켜 카페인 합성 경로 제1단계를 암호화하는 mRNA를 비활성화시킨다. 그 결과는 형질전환된 식물은 기타의 대사 양상은 영향받지 않으나 카페인을 합성시킬 수 없다는 것이다.
도1은 코페아 아라비카(Coffea arabica)에서 카페인 합성 경로의 대략적인 도면이다.
도2는 정제된 크산토신 N7 메틸 전달효소(XMT)의 은 스테이닝된 SDS PAGE 젤의 사진이다.
도3은 HPLC 분리후 정제된 크산토신 N7 메틸 전달효소(XMT)의 트립신 단편의 용리를 보여주는 농도 플롯이다.
도4는 크산토신 N7 메틸 전달효소(XMT)를 암호화하는 cDNA 라이브러리 cDNA를 스크리닝하는데 사용되는 올리고누클레오티드 프라이머를 도시한 것이다.
도5는 크산토신 N7 메틸 전달효소(XMT)를 암호화하는 cDNA의 염기서열이다.
도6은 크산토신 N7 메틸 전달효소(XMT)의 예상되는 아미노산 서열이다.
누클레오티드 -- 설탕 성분(펜토오스), 포스페이트 및 질소를 함유하는 복소환식 염기로 이루어지는 DNA 또는 RNA의 단량체 단위. 염기는 글리코시드 탄소(펜토오스의 1' 탄소)를 통하여 설탕 부분에 연결되며 염기 및 설탕의 조합물은 누클레오시드로 불리운다. 염기는 누클레오티드를 특성화한다. 4개의 DNA 염기는 아데닌("A"), 구아닌("G"), 시토신("C") 및 티민("T")이다. 4개의 RNA 염기는 A, G, C 및 우라실("U")이다.
DNA 서열 -- 인접하는 펜토오스의 3' 및 5' 사이의 포스포디에스테르 결합에 의하여 서로 연결된 누클레오티드의 선형 배열.
코돈 -- mRNA, 아미노산, 번역 개시 시그널 또는 번역 종결 시그널을 통하여 암호화되는 3 누클레오티드(삼중자)의 DNA 서열. 예를들어 아미노산 류신("Leu"), TAG, TAA 및 TGA를 암호화하는 누클레오티드 삼중자 TTA, TTG, CTT, CTC, CTA 및 CTG는 번역 중단 시그널이고 ATG는 번역 개시 시그널인데 이것은 또한 아미노산 메티오닌("MET")을 암호화한다.
폴리펩티드 -- 인접 아미노산의 아미노 및 카복시 그룹 사이에 펩티드 결합으로 서로 연결된 아미노산의 선형 배열.
게놈 -- 바이러스 또는 세포의 전체 DNA. 특히 촉진유전자, 전사 및 번역 개시 및 종결 부위 뿐만 아니라 물질의 폴리펩티드를 암호화하는 구조적 유전자를 포함한다.
유전자 -- 주형 또는 메신저 RNA("mRNA")를 통하여 아미노산 특성 특이 폴리펩티드의 서열을 암호화하는 DNA 서열.
전사 -- DNA 서열 또는 유전자로부터 mRNA를 생성시키는 과정.
번역 -- mRNA로부터 폴리펩티드를 생성시키는 과정.
발현 -- 폴리펩티드를 생성시키기 위하여 유전자 또는 DNA 서열이 거치는 과정. 전사 및 번역의 조합이다.
플라스미드 -- 숙주 세포내에서 플라스미드가 복제되도록 접촉 "레플리콘"을 포함하는 비염색체 이중 가닥 DNA 서열. 플라스미드가 단세포 유기체내에 위치될 경우 그 유기체의 특성은 플라스미드의 DNA 결과로서 변화하거나 형질전환될 수 있을 것이다. 예를들어 유전자를 함유하는 플라스미드
파지 또는 박테리오파지 -- 대부분 단백질 외피에 싸인("캡시드") DNA 서열로 이루어지는 박테리아 바이러스
클로닝 담체 -- 플라스미드, 파지 DNA, 코스미드 또는 숙주 세포내에서 복제될 수 있는 다른 DNA 서열. 예를들어 테트라싸이클린 내성 또는 암피실린 내성과 같은 형질전화된 세포의 확인에 사용하기 적당한 마커를 함유하고 DNA의 본질적인 생물학적 작용(예를들어 복제, 외피 단백질 생성 또는 촉진유전자 또는 결합 부위의 손실)을 손실시키지 않고 이러한 DNA 서열이 측정가능한 방식으로 잘릴 수 있는 하나 또는 소수의 엔도누클레아제 인식 부위를 특징으로 함. 클로닝 담체는 보통 벡터로 불린다.
클로닝 -- 유기체 집단 또는 이러한 유기체로부터 유도되는 DNA 서열 또는 무성 생식에 의하여 서열을 얻는 방법.
재조합 DNA 분자 또는 혼성화 DNA -- 살아있는 세포내에서 유지될 수 있으며 살아있는 세포의 외부에서 꼬리에 꼬리를 물고 결합된 상이한 게놈에서 얻은 DNA 단편들로 이루어지는 분자.
cDNA -- 특정 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA에 상보적인 DNA 가닥.
카페인 없는 커피를 제조하는 방법은 커피 및 기타 카페인 생성 식물의 카페인 합성 경로에서 다른 효소들로 일반화될 수 있을지라도 본 발명의 바람직한 구체예에서는 경로 중 제1의 독특한 효소, 즉 크산토신 N7 메틸 전달효소(XMT)의 발현을 억제한다. 카페인 합성에서 XMT의 역할은 전구체를 방사라벨링에 의하여 설명되어 왔으나 효소가 정제되지도 그 아미노산 서열이 밝혀지지도 않았다. 따라서 본 발명은 실질적으로 정제된 XMT를 포함한다. 또한 본 발명은 정제된 XMT로부터 분리된 트립신 단편의 아미노산 서열을 포함한다.
정제된 효소 시료로부터 얻은 아미노산 서열을 합성하고 유전자의 일부를 PCR을 사용하여 증폭시켰다. PCR 생성물을 사용하여 XMT를 암호화하는 전사물을 확인하는 어린 잎 mRNA부터 합성한 cDNA 라이브러리를 스크리닝시켰다. 양성 전사물을 시퀀싱하여 대략 90%의 XMT를 암호화하는 유전자를 얻었다.
발현시 XMT를 암호화하는 DNA는 캐너마이신 내성 유전자를 포함하는 pBI-121 형질전환 벡터내에 합체된다. 벡터의 식물 세포내로의 성공적인 합체는 항생물질 저항성의 취득으로 모니터링될 것이다. 이러한 구조물을 사용하여 조직 배양액내 커피 체세포 배를 형질전환시킨다. 이후 형질전환된 배를 카페인을 생성시키지 않는 신규한 커피 식물로 생장시킨다. 천연적으로 카페인이 제거된 커피가 이들 신규한 식물로부터 얻어진 볶은 분쇄 과실에서 제조된다.
더 구체적으로, 씨. 아라비카(C. arabica)의 어린 잎으로부터 얻은 신선한 잎 조직을 액체에 담가 부드럽게 하고 이로부터 단백질을 추출하였다. 기질로서 C14 표지된 S-아데노실메티오닌을 사용하여 크산토신의 메틸화를 모니터링함으로써 칼럼 정제된 추출물을 효소 활성에 대하여 분석하였다. 4개의 상이한 크로마토그래피 시스템 각각에서 3-메틸크산틴, 7-메틸크산틴, 8-메틸크산틴, 7-메틸크산토신, 크산틴 및 크산토신의 이동과 표지된 반응 생성물의 이동을 비교함으로써 반응생성물이 7-메틸크산토신임을 확인하였다.
SDS PAGE 전기영동 및 2차원 겔 전기영동을 이용하여 단백질 분리물의 순도를 측정하였다. 1차원 SDS PAGE 겔을 은 스테이닝시켰더니 도2에 도시된 바와 같이 36-37 킬로달톤(kD)의 분자량을 가지며 XMT의 효소 활성을 가지는 이중자의 존재를 나타내었다. 등전기 초점으로 각각의 단백질을 더 용해시켰다. 데이터는 단백질의 번역후 변형으로부터 얻어질 수 있는 XMT 이소효소의 존재를 나타낸다; 이와는 다르게 XMT 효소를 암호화하는 유전자 군이 있을 수 있을 것이다.
SDS PAGE 상에서 보여지는 이중자를 단백질 시퀀싱에 사용하였다. 정제된 를 XMT를 부분적으로 트립신 소화시켜 추가의 분석을 위한 단편을 만들었으며 HPLC를 이용하여 3개의 피크를 분석하였다. 자동 Edman 분해법(Edman, P. 및 Begg, G., Eur. J. Biochem. 1:80)을 이용하여 데이비스의 캘리포니아 대학 단백질 구조 실험실이 시퀀싱을 수행하였다. 2가지의 독특한 서열이 분석되었고 이를 탐침 합성을 위한 프라이머를 조립하는데 사용하였다. 커피 잎으로부터 RNA를 추출하였다. 이로부터 폴리(A+) 서열을 함유하는 mRNA를 정제하였다. 역 전사효소를 사용하여 폴리(A+) mRNA로부터 cDNA 라이브러리를 제조하였다. DNA 중합효소 I을 사용하여 이중가닥 DNA를 제조하고 침전법으로 회수하였다. cDNA를 분별하여 파지 내에 삽입하여 증폭하였다. 정제된 XMT의 아미노산 서열로부터 예상되는 DNA 서열을 베이스로 하는 프라이머를 사용하여 제조한 PCR 합성된 탐침으로 cDNA 라이브러리를 스크리닝하였다. XMT를 암호화하는 모든 서열을 함유하는 cDNA를 만드는 클론이 확인되었다.
XMT를 암호화하는 유전자에 해당하는 cDNA를 사용하여 배 상태의 커피 식물을 형질전환시킨다. 형질전환 벡터로서 플라스미드 p81-121을 사용한다, 발현시 XMT를 암호화하는 DNA에 해당하는 서열을 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 촉진유전자에 인접한 역방향의 플라스미드내에 삽입한다. 이로부터 전사된 RNA는 XMT의 아미노산 서열을 암호화하는 mRNA에 상보적이 될 것이다. 오나전한 구축물을 박테리아 숙주내에서 증폭시킨다. 숙주를 파괴하고 증폭된 벡터를 콜로이드성 금 입자에 부착시킨다. 미국 특허 제5,107,065호에 기술된 바와 같이 세포에 고속으로 입자를 추진시켜 점착성 벡터를 갖는 금 입자를 커피 식물 원형질체에 삽입산다. 성공적으로 형질전환된 어린 잎은 항생물질 저항성을 가지는 것으로 확인된다. 형질전환된 식물은 카페인을 생성시키지 않는다.
A. 씨. 아라비카로부터 얻은 크산토신- N7-메틸전달효소(XMT)의 정제
하와이 오하우에 소재하는 하와이 대학 웨마날로 리서치 스테이션에서 생장한 나무에서 길이 5mm 미만의 어린 잎 조직(B3 단계에 상당함. Frischknecht, P.M., Ulmer-Dufek, J. 및 Baumann, T.W.(1986) Phytochemistry 25:613)을 수거하였다. 즉시 잎을 액화 질소(액체 N2)에 함침시키고 사용시까지 -70℃에서 저장하였다. 다른 지시가 없는 한 이후의 모든 절차는 4℃에서 수행하였다. 액화 N2하에 막자와 막자사발에서 잎 조직(150g)을 분쇄하고 아직 얼어있는 동안 미리 냉각시켜 놓은 가정용 커피 분쇄기로 옮겨 작은 조각의 건조한 얼음과 함께 약 30초간 분쇄하였다. 1.5L의 아이스 콜드 80% 아세톤, 5mM의 티오우레아 및 12.5mM와 β-머캅토에탄올을 함유하는 비이커에 분말화된 조직을 가하였다. 45분간 자기 교반기 상에서 혼합한 후 와트만 1번 여과지가 딸린 부크너 깔때기내에서 진공 여과하여 조직을 회수하였다. 상기와 같이 티오우레아 및 β-머캅토에탄올을 함유하는 2.5L의 80% 아이스 콜드 아세톤으로 조직을 세척하고 20분간 자연 건조시킨 다음 48시간동안 냉동건조시켰다.
400 mL의 추출 완충액(EB)(0.1 M의 PIPES [pH 7.0], 0.5mM의 Na2EDTA, 0.5 mM의 Na2EGTA, 5%의 아스코르브산, 5mM의 디티오트레이톨[DTT], 5mM의 티오우레아, 12mM의 L-시스테인 HCl, 1%의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)20,000, 0.1mM의 페닐메틸설포닐 플루오라이드[PMSF] 및 20g의 폴리비닐-폴리피롤리돈[PVPP])으로 블렌더내에서 균질화하였다. 중간 속도로 10분간 슬러리를 균질화한 다음 250mL의 원심분리기 병에 옮기고 GSA(Dupont-Sorvall) 로터내에서 30분간 23,000xg로 원심분리하였다.
얻어진 350mL의 조 상청액을 79.86g의 암모늄 설페이트(AS) 분말을 30분에 걸쳐 천천히 가하여 40%의 암모늄 설페이트(AS) 포화액이 되게 하고 얼음조에 둘러싸인 비이커내에서 교반하였다. 다시 한 번 상기 혼합물을 250mL의 원심분리기 병에 옮기고 상기와 같이 30분간 23,000xg에서 원심분리시켰다. 얻어진 350 mL의 상청액을 유동 속도 2.5mL/min에서 40mL Macro-Prep(Bio-Rad) 메틸 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 칼럼내에 로딩시켰다. 280nm에서의 흡수로써 모든 칼럼 분별물을 단백질에 대하여 모니터링하였다. 베이스라인이 0근처에서 이루어질때까지 1.7M의 AS, 20mM의 비스-트리스-프로판(pH 6.8) 및 5mM의 DTT를 함유하는 예비평형 완충액으로 HIC 칼럼을 세척하였다. 이후 10mM의 트리스(pH 7.0), 5mM의 DTT, 1mM의 MgCl2를 함유하는 완충액으로 칼럼을 스트리핑하였다. 칼럼에서 처음 15mL를 제거하고 남아있는 용출액(200mL)을 중력하에 매트릭스에 공유적으로 결합되어 있는 염료 Cibarcon 블루 F3GA를 가지는 100mL의 Affi-Gel 블루 친화 겔(100-200 메쉬, Bio-Rad) 칼럼에 로딩시켰다. 10mM의 트리스(pH 7.0), 5mM의 DTT, 1mM의 MgCl2 로딩 완충액으로 상기 겔을 미리 평형을 맞추었다. 베이스라인이 제로 근처에서 안정화될때까지 이 로딩 완충액으로 칼럼을 집중적으로 세척하고 10mM의 트리스(pH 7.0), 5mM의 DTT, 1.5M의 소듐 클로라이드(NaCl)를 함유하는 완충액으로 결합되어 있는 단백질을 용리시켰다.
31.8g의 AS 분말을 천천히 가하여 142mL의 Affi-Gel 블루 겔 칼럼 용출액을 1.7M AS가 되게 하면서 얼음 조로 둘러싸인 비이커에서 30분간 교반하였다. 상기와 같이 30분간 23,000xg에서 슬러리를 250mL 원심분리기 병에서 원심분리시키고 상청액을 23℃, FPLC 페닐-세파로즈 XK 26/20(Pharmacia)으로 로딩시켰다. 20mM의 비스-트리스-프로판(pH 6.8), 5mM의 DTT, 1.7M의 AS를 함유하는 완충액으로 칼럼의 평형을 미리 맞추었다. 베이스라인이 제로 근처에서 형성될때까지 유속 5mL/min에서 1.7M AS 내지 0 M AS의 40분 가역 경사에서 칼럼 밖으로 단백질을 용리시켰다. 0 M의 AS 용리 완충액은 10mM의 트리스(pH 7.0), 5mM의 DTT, 1mM의 MgCl2를 함유하였다.
수거한 분급물에 대하여 활성 분석을 한 결과 크산토신-N7-메틸 전달효소에 대한 대부분의 효소 활성은 분급물 49-54로 모아졌다. 이들 분급물을 30mL의 최종부피로 풀링시킨 다음 4℃에서 중력에 의하여 6mL의 ATP-아가로즈 칼럼(Sigma Chemicals, A2767)에 로딩시켰다. 10mM의 트리스(pH 7.0), 5mM의 DTT, 1mM의 MgCl2를로 칼럼의 평형을 미리 맞추었다. 베이스라인이 안정된 후 10μM의 크산토신을 함유하는 20mL의 예비평형 완충액으로 칼럼을 스트리핑하고 추가로 40mL의 예비평형 완충액으로 세척하였다. 두 칼럼 용출액을 풀링시키고 23℃에서 25mM의 비스-트리스(pH 6.0) 및 9%의 베타인으로 미리 평형을 맞춘 Mono-P HR 5/20 FPLC(Pharmacia) 칼럼에 로딩시켰다. 베이스라인이 안정된 후, 100mL의 Polybuffer 74(10mL:90mL H2O, v/v)(pH 4.0)(Pharmacia) 및 유속 1mL/mon의 9%의 베타인으로 칼럼을 용리시켰다. 수거 튜브는 100μL 0.5M 트리신 완충액(pH 7.0) 및 5 mM의 DDT를 함유하여 최종 농도가 1분 분급물내에서 1mL 50mM의 트리신(pH 7.0) 5mM의 DTT였다. 이것은 사실상 다소 산성인 pH에서 Mono-P 칼럼으로부터 용리된 단백질의 최종 pH 조건을 안정시켰다. 트리신 없는 수거 튜브에서 크산토신-N7-메틸 전달효소에 대한 주요 활성은 각각 5.42 및 5.35를 가지는 칼럼으로부터 경사 용리의 분급물 15 및 16에서 관찰되었다. 크산토신-N7-메틸 전달효소의 활성상태에 실질적으로 부정적인 영향을 미치므로 정제의 어느 단계에서도 단백질 시료를 동결시키지 않는 것이 중요하였다.
B. 효소 활성 분석
100μL의 표준 분석 혼합물은 50mM의 트리신(pH 7.0), 1200μM의 크산토신, 5mM의 DTT, 7.5μM의 S-아데노실-L-[메틸-14C]-메티오닌(SAM)(60mCi/mmol; DuPont NEN) 및 1mM의 Na2EDTA를 함유하였다. 반응 혼합물(효소 없이 50μL)을 25℃에서 10분간 미리 인큐베이팅시키고 50μL의 효소 용액을 가하여 반응을 개시시켜 25℃에서 1시간동안 진행시켰다. 인큐베이팅 시간의 끝에 30μL의 반응물 알리코트 3개를 분리하여 8μL의 0.6M 염산(HClO4)을 가하여 종결시켰다. 진정한 효소 활성을 검출하기 위해서 제로 타임 대조구에 대하여도 동일하게 실시하였다. 이 혼합물을 5분간 마이크로원심분리기에서 원심분리하고 19μL의 상청액을 1.0μL의 33mM 7-메틸-크산토신과 혼합하였다. 이들 혼합물을 와트만 1호 크로마토그래피 용지에 스포팅하고 n-부탄올-아세트산-H2O(n-BuOH-HOAc-H2O)(4:1:1)로 전개하였다. 단파 UV 빛에 노출될 경우 청색 형광에 의하여 7-메틸크산토신의 위치를 측정하였다. 이 영역을 크로마토그램에서 자르고 3mL의 신티-버스(Scinti-verse) 신틸레이션 유체를 사용하여 신틸레이션 카운팅에 의하여 방사성을 측정하였다. 카운팅 효율은 74.7%였다. 제로 타임 시료의 7-메틸크산토신에서 검출된 배경 및 비특이 방사성을 감하였다.
C. 반응 생성물의 확인
메틸화된 크산토신 반응 생성물로부터 설탕을 가수분해하고 4가지 상이한 크로마토그래피 시스템내에서 분리하여 크산틴 고리 상의 메틸화 부위를 확인하였다. 담체로서 6μL의 33mM 7-메틸크산토신을 함유하고 상기 기술한 바와 같이 행한 2 100μL 반응에서 얻은 생성물을 와트만 1호 용지 크로마토그램의 시발 밴드로서 가하였다. n-부탄올-아세트산-H2O(n-BuOH-HOAc-H2O)(4:1:1)내에서 크로마토그램을 전개시켰다. 메틸화된 크산토신에 해당하는 크로마토그램의 영역을 상기와 같이 검출하고 작은 조각으로 잘라 살균 튜브내에 위치시키고 밤새 흔들어주면서 37℃에서 35mL의 탈염수로 인큐베이팅시켰다. 2층의 미러클로쓰를 통과시키고 이어 0.22μm의 필터로 추출물을 여과한 다음 동결건조시켰다. 건조시킨 추출물을 1.0mL의 탈염수내에 재현탁시키고 유리 소화 유리병내에 두고 동결건조시킨다. 시료를 400μL의 1.0M HCl내에 재현탁시키고 100℃에서 1시간동안 인큐베이팅시켰다. 소화물을 동결건조시키고 400μL의 3mM의 7-메틸크산틴내에 재현탁시키고 다시 동결건조시켰다. 소화물을 40μL의 탈염수내에 재현탁시키고 10μL를 4개의 각각 상이한 시스템내에서 크로마토그래피시켰다. 1-메틸크산틴, 3-메틸크산틴, 7-메틸크산틴, 8-메틸크산틴, 7-메틸크산토신, 크산틴 및 크산토신을 비교의 목적으로 각 크로마토그램 상에 포함시켰다. 다음 크로마토그래피 시스템을 사용하였다; 와트만 1호 용지를 n-BuOH-HOAc-H2O(4:1:1)내에서 전개시키고 C8 주석 층 플레이트(Whatman KC18F)를 이소아밀 알콜-H2O-아세토니트릴(41:4:5), 에탄올-H2O(4:1) 또는 t-BuOH-HOAc-H2O(4:1:1)내에서 전개시켰다. 건조후 En3Hance(Dupont NEN)으로 크로마토그램을 분무하고 재건조시키고 30일동안 -76℃에서 미리 플래쉬시킨 Fuji RKGCU X-선 필름에 노출시켰다.
D. 겔 전기영동에 의한 단백질의 확인
상기와 같이 얻어진 추출물을 O'Farrell(O'Farrell, P.Z., Goodman, H.M., O'Farrell P.H., Cell 12:1133(1977)) 등의 개질된 방법에 의하여 2-차원(2D) 미니 IEF/SDS-PAGE에서 Laemmli 시료 완충액(영국, Laemmli, Nature 227:680(1970))과 혼합하여 단일 차원(1D) SDS-PAGE 미니겔(주요 겔:12.5% 아크릴아미드, 0.8% 메틸렌 비스아크릴아미드; 스태킹 겔:7.5% 아크릴아미드, 0.21% 메틸렌 비스아크릴아미드)내에 사용하였다. 50 부피의 100% 에탄올로 1시간동안 단백질을 침전시키고 5%의 암폴린(1:1, v/v, pH 3-10:pH 5-7, LKB-Pharmacia)을 함유하는 등전기 초점(IEF) 시료 완충액내에서 단백질을 재용해시켜 2차원 전기영동을 가능하게 하였다. 크로마토그래피 단계로부터 남아있는 흑종의 완충 성분이 IEF로 방해되지 않도록 IEF 시료 완충액에 대한 본래의 단백질 추출물의 비를 1:2 이상으로 유지시켰다. 동일한 총 단백질 시료(20μg 미만)를 상기와 같이 5%의 암폴린을 함유하는 미리 초점을 맞춘 튜브 겔(8.8%의 아크릴아미드, 1.6%의 메틸렌 비스아크릴아미드)의 염기성 말단에 도포하였다. 1,000V 에서 추가로 2시간에 더하여 10,000V-몇시간동안 겔울 포커싱하였다. 블랭크 포커싱된 겔을 5mm의 섹션으로 잘라 0.5mL 100mM CaCl2에서 24시간동안 인큐베이팅하고 세그먼트의 pH를 측정하였다. 이러한 분석으로부터 IEF 겔의 pH 경사는 4.4-6.0인 것으로 추정되었다.
간단히 H2O 세척한후 이어 고온의 Laemmli 시료 완충액에서 3번 세척(매번 10분)하여 SDS-PAGE를 위하여 튜브 겔을 준비하였다. SDS-PAGE 겔(주요 겔:12.5%의 아크릴아미드, 0.8%의 메틸렌 비스아크릴아미드; 스태킹 겔:7.5%의 아크릴아미드, 0.21%의 메틸렌 비스아크릴아미드)의 상부에 상기 튜브 겔을 위치시키고 Laemmli 시료 완충액내 3%의 아가로즈로 제자리에 유지시켰다. 은-스태이닝에 의하여 단백질을 시각화하였다. 1D에서 가장 높은 효소 활성을 가지는 Mono-P 분급물 16은 은 스태이닝 하에 이중자의 존재만을 나타내었다(도2). 이들 단백질의 분자량(kD)은 대략 37.6 및 36.2kD였다. 2D 겔에서 각 단백질은 2점으로 분리되었다. 더욱 산성인 쪽의 등전기 포인트(IP)는 몇몇 겔에 대하여 5.2의 평균치를 가졌고 보다 염기성인 쪽은 5.3이었다. 그러나 이제 분자량은 평균 43.5kD로서 상부 및 하부 펩티드는 서로를 포커싱하고 있다. 따라서, 1D 및 2D 겔 사이에는 kD에서 명백한 차이가 있다. Mono-P 칼럼, 1D 및 2D 겔내에서 이들 4 펩티드 모두의 유사한 이동은 이들이 번역후 변형될 수 있는 이소자임이라는 것을 나타낸다. 이와는 다르게 이들은 서로 구조면에서 약간의 차이를 보이는 유전자 군의 생성물이어서 상이한 이소자임이 관찰되는 것일 수 있을 것이다.
E. 단백질 시퀀싱
Lowry(Lowry 0.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L. 및 Randall, R.J., J. Biol. Chem. 193:265(1951))의 절차에 의하여 Mono-P의 단편 16에 대한 총 단백질 추정을 한 것은 1mL의 단편내 총 100μg의 단백질이 있음을 나타내었다. 우리의 경험으로는 이러한 저농도의 단백질에서의 Lowry값은 존재하는 정확한 양의 초과 추정이 되는 경향이 있다. 우리는 단백질 시퀀싱 분급물의 실제적인 부분을 사용하여 이를 보상하기로 결정하였다. 90μg을 나타내는 Mono-P 단편 16의 900μL의 부분을 살균 1.5mL의 마이크로원심분리기 튜브내에 위치시키고 여기에 216μL의 100% 트리클로로아세트산(TCA)를 가하였다. 혼합후 튜브를 밤새 얼음 위에서 인큐베이팅시킨 다음 4℃에서 30분간 마이크로원심분리기에서 14,000 rpm으로 원심분리시켰다. 흡인시켜 상청액을 분리하고 펠릿을 1mL의 75% 에탄올로 두 번 세척하고 매 세척후 원심분리하였다. 튜브를 스피드백내에 위치시키고 진공하에 1분간 회전시켜 펠릿을 건조시켰다. 침전물은 여기에 가해진 20μL의 2 x Laemmli 시료 완충액을 함유하였다. 이후 5분간 수조에서 이것을 끓인 다음 1분간 마이크로퓨징시켰다. 튜브 온도를 23℃로 내리고 전량을 12.5% 1D 겔의 단일 레인 상에 로딩시켰다. 전기영동이 끝날 때 수성 50% 메탄올 및 10% 아세트산(w:v:v)에 0.1% Coomassie R-250으로 스태이닝시켜 단백질을 시각화한 다음 탈스태이닝하였다. 은 스태이닝된 겔에서 관찰된 37.6 및 36.1 kD의 동일한 이중자 또한 Coomassie 스태이닝된 겔에서 시각화할 수 있었다. 이러한 이중자를 포함하는 겔의 영역을 잘라 자동 Edmann 생분해에 의해 단백질 시퀀싱에 사용하였다.
데이비스 캘리포니아 대학 단백질 구조 실험실 표준 프로토콜에 의하여 단백질을 시퀀싱하였다. 이중자를 함유하는 겔 조각을 15mL의 H2O로 4번 세척하고 15분간 부드럽게 흔들어주어 전 단계에서 남은 아세트산 및 SDS를 분리하였다. 겔 조각을 레이저 블레이드로 2mm의 정사각형으로 주사위모양이 되게 하고 1.5mL의 마이크로원심분리 튜브에 옮겼다. 겔 조각들을 튜브에 점착하지 않을때까지 2시간 동안 Speed-Vac내에서 탈수시켰다. 다음 30μL의 겔 재수화 완충액(0.1M Tris-HCl, pH 9.0, 0.05% SDS)을 가하고 pH 종이 상에 0.5μL를 스포팅시켜 pH가 8.0임을 확인하였다. Achromobacter lyticus(Wako)로부터 얻은 소화 효소 Lys-C(0.2μg)를 추가의 재수화 완충액과 함께 가하여 겔 조각들을 완전히 수화시켰더니 약간 초과의 완충액이 남았다. 혼합물을 30℃에서 밤새 인큐베이팅시켰다. 인큐베이팅후 새로운 살균 마이크로원심분리 튜브로 상청액을 분리하고 저장하였다. 충분한 물을 가하여 겔 조각을 덮고 30℃에서 추가로 2시간동안 인큐베이팅시켰다. 상청액을 분리하여 전과 동일한 마이크로원심분리기내에 저장하였다. 세척 단계를 한 번 더 반복하고 이전 두 세척액으로 상청액을 수거하였다. 이후 겔 조각들을 80% 아세토니트릴내 0.1%의 트리플루오로아세트산(TFA)을 포함하는 용액으로 덮고 30℃에서 1시간동안 인큐베이팅시켰다. 상청액을 수거하여 앞선 상청액을 모두 함유하는 튜브에 가하였다. 마지막 세척을 한 번 더 반복하고 풀링된 상청액을 스피드-백내에서 건조시켰다.
건조시킨 트립신 소화 생성물을 25μL의 6M 구아니딘-HCl, 0.4M의 트리스(pH 8.2)에 용해시키고 pH 페이퍼 상에 0.5μL를 스포팅시켜 pH를 확인하였다. 1μL 450mM의 DTT를 가하고 소화물을 50℃에서 45분간 인큐베이팅시켰다. 실온으로 냉각시킨후 2μL 500mM의 아이오도아세트아미드를 가하고 23℃에서 추가로 15분간 인큐베이팅시켰다. 이 인큐베이팅이 끝날 때 72μL의 물을 가하여 최종농도가 1.5M 구아니딘 및 0.1M 트리스가 되게 하였다. 이후 마이크로원심분리기내에서 14,000rpm에서 5분간 시료를 원심분리하고 상청액을 새로운 원심분리 튜브로 조심스럽게 분리하였다. 침전된 펠릿에 25μL의 0.1% TFA를 가하고 와륜시켰다. 이후 튜브를 전과 같이 재원심분리하고 상청액을 전 단계의 상청액에 가하였다.
트립신 소화물로부터 얻은 절단 단편들을 분당 100μL의 유속으로 5% 용매 A(0.1% TFA)에서 70% 용매 B(0.075% 아세토니트릴)의 90분에 걸친 선형 경사를 이용하여 C18 1mm x 10cm 칼럼내에서 모세관 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의하여 각각으로부터 용해시켰다. 0 - 0.1 A 의 스케일, 210nm에서 UV 검출을 세칭하였다. 개별적인 피크의 회복은 도3에 도시된 바와 같은 몇몇 명백한 펩티드의 존재를 나타내었다. 단백질을 함유하지 않는 본래의 BDS-PAGE겔의 일부를 대조구로서 소화 과정에 통과시켰다. 도3에 도시된 완전한 피크는 이 대조구 및 시료 사이에 공통이었다. A, B 및 C로 표지된 3개의 피크를 자동 Edman 생분해시켰다. 두 피크(A 및 B)는 동일한 단백질 단편(도2, 단편 A 및 B)을 나타내는 독특한 오버랩 서열을 나타내었다. 제3의 피크(C)는 상이한 독특한 서열(도2, 단편 C)을 나타니였다.
F. 크산토신-N7-메틸 전달효소에 대한 올리고누클레오티드 DNA 프라이머의 합성
The Midland Certified Reagent Company사가 크산토신-N7-메틸 전달효소의 소화 단편에 의하여 얻어진 두 아미노산 서열에 대한 20머 프라이머의 화학적인 합성을 하였다. 선택된 단편의 영역은 최소한의 핵산 퇴화를 보였으며 광범위한 유전 암호 중복을 가지는 아미노산은 가능한 경우 피하였다. 이것이 가능하지 않을 경우 가능한 모든 다른 코돈 조합을 포함할 수 있도록 동일한 단편에 대하여 하나이상의 프라이머를 합성하였다. 또한 우리는 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열의 암호화 가닥에 상보적일 수 있도록 프라이머를 합성하였다. 3이상의 제3위치 누클레오티드 퇴화는 이들 위치에서 이노신을 사용하여 극복하였다. 누클레오티드의 퇴화가 2배일 경우 두 누클레오티드 모두 프라이머 합성에 포함되었다(도 3).
G. B3 단계 어린 커피 잎들로 부터 얻은 RNA의 추출
추출동안 사용된 모든 품목들은 RNase가 없는 살균수이며, 이는 0.1%의 DEPC수를 반응시킴으로써 제조된 것이다. 모든 원심분리 단계는 특정한 언급이 없는 한 4℃에서 수행되었다.
B3 단계의 어린 커피 잎들은 전술된 바와 같이 채집되고 저장되었다. 전체 RNA는 100g의 상기 어린 커피 잎들을 액체 질소하에 분쇄하고 즉시 이를 예냉각한 국내 커피 분쇄기에 넣음으로써 분리되었다. 상기 조직들을 작은 조각들의 드라이-아이스와 함께 분쇄하여 분말로 제조하였다. 이후, 100mM 트리스-HCl (pH 9.0), 200mM NaCl, 15mM Na2EDTA, 0.5% 사르코실로 구성된 균질화 완충용액 200mL을 상기 조직에 가하고, 100mM β-머켑토에탄올을 가하였다. 상기 용액에 200mL 완충-평형상태에 있는 페놀, 및 클로로포름 : 이소아밀 알콜 (24 : 1, v:v)의 혼합물 40mL을 가하였다. 이후, 상기 조직들을 Polytron 균질화기 내에서 고속으로 2분 동안 얼음 중탕 내 유리통에서 균질화를 시켰다. 균질화 후 즉시 14mL의 3M 소듐 아세테이트 (pH 4.0)를 가하고 추가적으로 1분 동안 균질화기를 작동시켜 혼합하였다. 상기 파쇄액을 15분 동안 얼음에 저장하고, 이를 연이어 두개의 250mL 폴리프로필렌 원심분리기의 튜브안에 옮겼다. 10분 동안 GSA(DuPont Sorvall) 로터 내에서 16,000xg로 원심분리를 수행하였다. 상기 수용액상 (상부층)을 신규한 250mL 폴리프로필렌 원심분리기 튜브에 옮겨 담고, 동일한 양의 이소프로판올을 이에 가하였다.
상기 혼합물들을 -20℃하에 밤새도록 배양시키고, 10분 동안 10,000xg로 원심분리하여 침전된 RNA를 수집하였다. 상기 RNA 펠릿을 70%의 에탄올로 세척하고 5분 동안 10,000xg로 다시 원심분리시켰다. 상기 에탄올을 따라내고 5분 동안 진공하에 건조시켰다. 이후, 상기 펠릿을 15m의 DEPC-처리된 물 내에 재현탁시켰다. 상기 상청액을 신규한 40mL의 스크류-캡 원심분리기 튜브에 옮겨 담고 5분 동안 10,000xg로 원심분리시켜 불용성 물질들을 제거하였다. 상기 상청액을 새로운 40mL의 스크류-캡 원심분리기 튜브에 옮겨 담고 5mL의 8M LiCl을 상기에 가하여 최종 농도가 2M LiCl이 되도록 하였다. 상기 튜브를 4℃로 밤새도록 배양하고 10분 동안 14,000xg로 원심분리하여 RNA를 회수하였다. 상기 RNA 펠릿을 70% 에탄올로 세척하고, 5분 동안 10,000xg로 원심분리하여 간단히 진공하에서 건조시켰다. 상기 펠릿을 5mL의 DEPC-처리된 물로 재현탁하고 5분 동안 10,000xg로 원심분리하여 불용성 물질들을 제거하였다. 상청액을 4개의 살균된 1.5mL 마이크로원심분리기 튜브에 옮겨 담고 얼음에 저장하였다. 230 - 330nm 스펙트럼 인Shinadzu UV 160U 분광광도계 내의 10㎛의 전체 RNA 용액은 42.8mg의 RNA가 존재함을 나타내는 것이다. RNA를 함유하는 상기 튜브를 -70℃로 저장하였다.
H. 전체 RNA로 부터 얻은 폴리(A+)mRNA의 정제
폴리(A+)mRNA를 위해 PolyATract Ⅱ mRNA 분리 시스템 키트 (Promega Corporation)를 사용하여 전제 RNA 제조를 강화하였다. 5.1mg과 동일한 전제 RNA의 600㎕ 엘리콧을 상기 언급한 키트의 튜브 안으로 가하고, RNase가 없는 물로 최종 부피가 2.43mL로 되도록 하였다. 10분 동안 65℃로 가열한 후, 50 pmole/mL 비오티릴레이트화된 올리고(dT) 및 60㎕의 20x SSC (175.3g/L NaCl, 88.2g/L 소듐 시트레이트, pH 7.0)을 가하고, 이 혼합액을 약 30분에 걸쳐 실온으로 천천히 냉각시켰다. 상기 스트렙타비딘 상자성 입자들의 엘리콧을 0.5x SSC(1번 세척 당 1.5㎕)로 3번 세척하고 0.5mL의 0.5x SSC 내 재현탁시켰다. 비오티릴레이트화된 올리고(dT)를 함유하는 RNA 용액을 세척된 스트렙타비딘 상자성 입자들에 가하였다. 실온에서 10분 동안 배양한 후, 분리된 RNA와 더불어 상기 스트렙타비딘 상자성 입자들을 자석을 사용하는 튜브의 면에 포획시켰다. 상청액을 제거하고, 입자들을 0.1 X SSC (1번 세척 당 1.5mL)로 4번 세척하였다. 0.1mL RNase가 없는 물 내 입자들은 현탁시켜 mRNA를 회수하고 물을 제거하는 반면, 상기 입자들은 튜브의 면 상에 포획되었다. 상기 물을 한 번에 500㎕씩 두개의 살균된 마이크로원심분리기 튜브 안에 넣었다. 3M 소듐 아세테이트 (1개의 튜브 당 50㎕)의 1/10 부피를 가한 후, 동일한 부피의 이소프로판올 (1개의 튜브 당 550㎕)을 갖는 침전물로 mRNA를 회수하였다. 상기 튜브들을 -20℃로 밤새도록 저장한 후, 4℃하에 30분 동안 14,000rpm으로 원심분리시켰다. 상기 펠릿을 500㎕의 얼음으로 차가워진 75% 에탄올로 세척하고 다시 원심분리시켰다. 상기 에탄올을 따르고 진공하에 간단히 건조시켰다. 상기 전체 RNA에 대하여 기술한 같이 15㎕의 용해된 mRNA를 정량분석하였다. 5mg의 전체 RNA로 부터 약 9.6μg의 mRNA가 회수되었다.
I. cDNA 라이브러리의 제조
제 1 및 제 2의 사슬 cDNA를 ZAP-cDNA 합성 키트(Stratagene)를 사용하여 합성하였다. 25㎕의 물 내 4㎍의 mRNA를 5분 동안 65℃로 배양시켰다. 3㎕의 100mM 메틸 머큐리를 가하고 10분 동안 실온에서 배양시켰다. 4㎕의 700mM β-머켑토에탄올를 가하고 추가적으로 5분 동안 배양을 계속하였다. 변성 mRNA에 5㎕의 10x 제 1 사슬 완충용액, 5㎕의 100mM DTT, 3㎕의 뉴클레오티드 혼합물 (각기 10mM인 dATP, dGTP, TTP 및 5-메틸-dCTP), 2㎕의 1.4㎍/㎖ 링커-프라이머, , 1㎕의 RNase 블록 및 5㎕의 물을 가하였다. 상기 프라이머를 mRNA로 어닐링하기 위해 상기 반응물을 10분 동안 실온에서 배양시키고 2.5㎕의 20u/㎕ M-MuLv 역 전사효소를 가하였다. 5㎕의 상기 반응 혼합물을 0.5㎕의 800 Ci/mmole [a-32p]dCTP (DuPont NEN)를 함유하는 튜브로 옮겼다. 상기 두 반응물들을 한시간 동안 37℃에서 배양하였다. 방사성 동위원소를 써서 식별된 반응물은 이후의 겔 분석 동안 -20℃로 동결되었다.
45㎕의 주 반응물에 40㎕의 제 2 사슬 버퍼, 15㎕의 100mM DTT, 6㎕의 뉴클레오티드 혼합물 (각기 10mM인 dATP, dGTP, TTP 및 26mM dCTP), 268.3㎕의 물 및 2㎕의 800 Ci/mmole [a-32p]dCTP를 가하였다. 혼합한 후에, 4.5㎕의 1u/㎕ RNase H 및 19.2㎕의 5.2u/㎕ E.coli DNA 중합효소I를 가하고 상기 반응물을 2.5시간 동안 16℃에서 배양시켰다. 상기 반응물을 400㎕의 페놀:클로로포름 (1:1)으로 추출하고 원심분리에 의해 상을 분리시켰다. 수용액 상을 새로운 튜브에 옮겨 담고 클로로포름으로 재-추출하였다. 수용액 상을 상기와 같이 회수하였다. 33.3㎕의 3M 소듐 아세테이트 및 867㎕의 100% 에탄올을 가한 후, -20℃로 밤새도록 침전시켜 이중-사슬로된 cDNA를 회수하였다. 상기 침전물은 4℃하에서 60분 동안 마이크로원심분리기 내에서 원심분리시킴으로서 회수되었다. 상기 침전물을 1㎕의 80% 에탄올로 세척하고 마이크로원심분리기 내에서 최고속도로 실온에서 원심분리시킴으로써 회수하였다. 상청액을 제거하고 상기 침전물을 진공하에 건조시킨 후 45㎕의 물에 용해시켰다. 3㎕의 재현탁된 이중-사슬로된 cDNA를 제거하여 겔 전기이동법으로 분석할 때 까지 -20℃로 냉동시켰다.
남아있는 42㎕의 이중-사슬로된 cDNA 5㎕의 10x Klenow 완충용액 (완충용액 #3)에 2.5㎕의 2.5mM 뉴클레오티드 (dCTP, dGTP, dATP 및 TTP), 및 0.5㎕의 5u/㎕ Klenow 조각들을 가하였다. 37℃에서 30분 놓아둔 후 50㎕의 물을 가하고 상기 반응물을 동일한 부피의 페놀:클로로포름 (1:1)으로, 이후 전술한 바와 같은 클로로포름으로 추출하였다. 7㎕의 3M 소듐 아세테이트 및 226㎕의 100% 에탄올을 가한 후, 30분 동안 얼음 상에 배양시키고 4℃하에 60분 동안 최고속도로 마이크로 원심분리하여 블런트-말단을 가진 이중-사슬 DNA를 회수하였다. 상기 펠릿을 300㎕의 80% 에탄올로 세척하고 전술한 바와 같이 원심분리하고 건조시켰다. 7㎕의 0.4㎍/㎕ EcoRI 링커들을 건조된 cDNA에 가하였다. EcoRI 링커들의 구조는 하기와 같다:
재현탁시키기 위해 교반한 후, cDNA, 1㎕의 10×결찰 완충용액, 1㎕의 10mM ATM 및 1㎕의 4 Weiss u/㎕ T4 DNA 리가제를 가하고 이 반응물을 8℃에서 밤새도록 배양시켰다. 상기 리가제는 30분 동안 70℃로 가열됨으로써 비활성되었다. cDNA에 부착된 EcoRI 링커의 5'말단은 폴리뉴클레오티드 키나제를 사용하여 포스포릴레이트화되었다. 1㎕의 10x 완충용액 #3, 2㎕의 10mM ATM, 6mL의 물 및 1mL의 10u/mL T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 결찰 반응에 가하였다. 37℃에서 30분 지난 후, 상기 키나제 반응은 70℃에서 30분 동안 열적 비활성이었다.
XhoI "점착성 말단"은 링커-프라이머 내 XhoI 부위를 소화시킴으로써 mRNA의 3'말단에 해당하는 cDNA의 말단에 발생되었다 (상기 참조). 28㎕의 XhoI 완충용액 및 3㎕의 40u/mL XhoI를 cDNA에 가하고 이 반응물을 1.5시간 동안 37℃에서 배양하였다. 5'말단에 EcoRI 점착성 말단 및 3'말단에 XhoI 점착성 말단을 갖는 cDNA는 하기와 같이 Sephacryl S-400 스핀 칼럼을 통하는 통과에 의해 크기로 분류되었다. 5㎕의 10x STE (100mM 트리스 (pH 7.0), 5mM EDTA 및 100mM NaCl)를 가하고 cDNA를 Sephacryl S-400를 함유하는 1㎕의 주입기 상부에 사용하였다. 500mL의 마이크로원심분리기 튜브는 주입기의 기저부에 장착되어 있고 칼럼은 원심분리기 튜브 내에 장착되어 있으며, 이를 이용하여 2분 동안 약 400xg로 원심분리시켰다. 60㎕의 10x STE를 주입기의 상부에 가하고, 신규한 마이크로원심분리기 튜브를 기저부에 장착하였으며, 상기 칼럼을 전술한 바와 같이 다시 원심분리시켰다. 6 개의 단편(fraction)이 수집될 때 까지 상기 공정을 반복하였다.
각각의 단편 내에 있는 cDNA의 크기 분배를 측정하기 위해 약 10%의 각기 단편들을 1%의 아가로스 겔로 전기영동을 시켰다. 각기 단편의 잔류물들을 동등한 부피의 페놀:클로로포름으로, 이후 상기에서 기술한 바와 같이 클로로포름으로 추출한 후, 2 부피의 100% 에탄올을 가함으로써 침전시켰다. -20℃에서 밤새도록 배양한 후, 마이크로원심분리기 내 4℃하에 60분 동안 14,000rpm으로 원심분리시킴으로서 cDNA를 회수하였다. 상기 cDNA를 상기 기술한 바와 같이 200㎕의 80% 에탄올로 세척하고 건조시켰다. 상기 cDNA을 5㎕의 물 내에 용해시키고, Hoefer TKO 100 DNA 형광계를 사용하여 형광사진법를 수행함으로써 cDNA의 농도를 측정하기 위해 0.5㎕를 옮겨 담았다. 가장 큰 cDNA 분자들을 함유하고 있는 잔류 4.5mL의 1 단편은 약 304ng의 cDNA를 함유하고 있다.
1 단편으로 부터 얻은 100ng의 cDNA를 1㎍의 Uni-Zap, EcoRI 및 XhoI (Stratagene)으로 소화된 박테리오파지 람다 ZAP 벡터 내로 결찰하었다. 1 단편 cDNA (2.9MI)를 0.54㎕의 10x 결찰 완충용액, 0.5㎕의 10mM ATP, 1㎕의 1㎍/㎕의 Uni-Zap XR 벡터 및 0.5㎕의 4 Weiss u/㎕ T4 DNA 리가제에 가하였다. 상기 반응물을 8℃하에 약 44시간 동안 배양시켰다. 상기 결찰 반응물의 1㎕ 엘리콧을 Gigapack Ⅱ Gold 충전 키트 (Stratagene)으로 부터 얻은 1 엘리콧의 'Freeze-Thaw' 추출물에 가하였다. 15㎕의 음파 추출물을 가하고 이 내용물들을 부드럽게 혼합하였다. 실온에서 다발화 (packaging)를 수행하였다. 2시간 후, 500㎕의 SM 완충용액 (0.01M 트리스-HCL pH 7.5, 0.01M MgCl2, 0.1mM Na2EDTA) 및 20㎕의 클로로포름을 상기 다발화 반응에 가하고, 마이크로원심분리기로 단시간 원심분리를 함으로써 잔해들을 제거하였으며, 다발화된 파지들을 사용할 때 까지 4℃로 저장하였다.
J. 제 1 라이브러리의 적정(Titering)
500㎕의 제 1 라이브러리 중 1㎕을 1/10로 희석하기 위해 9㎕의 SM 완충용액과 혼합하였다. 1㎕의 상기 희석액을 O.D.600=0.5과 동일한 밀도로 성장된 200㎕의 E.coli XL1-Blue MRF 세포들에 영향을 주기 위하여 사용하였다. 상기 세포들을 부드럽게 교반시켜 주며 15분 동안 37℃하에서 배양시켜 주었다. 상기 영향을 받은 세포들을 15㎕의 0.5M IPTG을 함유하는 2.5㎕의 48℃ 상부 아가(agar), 및 50㎕의 250mg/mL X-갈(gal)로 혼합한 후, 100x15mm NZY 평판 상에 놓았다 (5g/L NaCl, 2g/L MgSO4.7H2O, 5g/L 효모 추출물, 10g/L NZ 아민 [pH 7.5], 및 15g/L Difco 아가). 상기 평판들을 37℃하에서 밤새도록 배양시켰다. 배경 플라크는 청색인 반면, 재조합 플라크는 백색이었다. 3개의 상기 평판의 평균은 1㎕의 제 1 라이브러리가 1,930개의 백색 재조합 플라크, 및 65개의 청색 플라크를 생산함을 나타낸 것이었다. 총 500㎕의 제 1 라이브러리를 배양시켰더니, 965,000개의 재조합 플라크가 생성되었다.
K. 제 1 라이브러리의 증폭
O.D.600=0.5로 성장된 300㎕의 E.coli XL1-Blue MRF 세포들을 20개의 살균 튜브 내에 가하였다. 각각 튜브의 12.5㎕ 제 1 라이브러리 스톡에 90㎕의 SM 완충용액을 가하고, 이 튜브를 15분 동안 37℃에서 배양하였다. 2 및 1.5㎕의 48℃ 상부 아가를 각각의 튜브에 가하고 이 세포들을 100x15mm NZY 평판 위에 놓았다. 상기 평판들을 37℃에서 밤새도록 배양하였다. 5mL의 SM 완충용액을 각각의 평판에 가하고 이 평판들을 4℃에서 추가로 8시간 동안 배양시켰다. SM 완충용액을 살균 피펫으로 수집하고 살균의 250mL 원심분리기 튜브내에 저장하였다. 각각의 평판을 앞서 수집된 물질들에 가해진 약 4mL의 담수 SM 완충용액으로 세척하였다. 5%의 최종 부피가 되도록 클로로포름을 증폭된 라이브러리에 가하였다. 상기 라이브러리를 15분 동안 실온에서 배양한 후, 10분 동안 2,000xg으로 원심분리하여 세포 파편을 제거하였다. 상기 상청액 (114.5mL)를 회수한 후 이를 살균된 폴리프로필렌 병에 옮겨 담았다. 0.3%의 최종 부피가 되도록 클로로포름을 가하고, 증폭된 라이브러리를 4℃로 저장하였다.
L. 증폭된 라이브러리의 적정
SM 완충용액 내 1㎕의 증폭된 라이브러리의 10-11 희석액은 상기 기술한 바와 같이 배양기로 배양할 경우 192개의 재조합 플라크를 함유하였다. 50,000개의 재조합 플라크를 얻기 위하여, 25㎕의 10-7 희석액을 사용하여 O.D.600=0.5으로 성장된 600㎕의 E.coli XL1-Blue MRF 세포들에 영향을 주었고, 이를 15분 동안 37℃에서 배양시켰다. 상기 세포들에 6.5mL의 48℃ 상부 아가를 가하고 라이브러리를 150x15mm NZY 평판 상에 배양시켰다. 200,000개의 재조합 플라크를 나타내는 4개의 상기 평판들을 준비하여 37℃에서 밤새도록 배양하였다. 상기 평판들을 4시간 동안 4℃로 식힌 후, 상기 라이브러리의 DNA 스크리닝을 위해 사용하였다.
M. 크산토신-N7-메틸 전달효소 cDNA의 중합효소 사슬 반응(PCR) 증폭
제 1 사슬 cDNA의 합성은 상기 Stratagene 실험 계획안에 기술된 바와 같다. 트립신 소화에 의해 얻어진 2개의 독특한 펩티드 서열은 도 4에 도시된 동의성 프라이머의 합성을 가능하게 한다. 중합효소 사슬 반응(PCR)(Saika, R.K., Gelfand, D.H., Stoffel, S., Scharf, S.J., Higuchi, R., Horn, G.T., Mullis, K.B. 및 Erlich, H.A., Science 239:487 (1988))을 4ng cDNA, 1㎕의 20μM 프라이머, 각각 0.5㎕의 1mM 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 1.5mM MgCl2, 0.3㎕의 Taq DNA 중합효소 [5,000u/mL], 2.5㎕ 10x PCR 완충용액 [10mM 트리스-HCl (pH 9.0), 0.1% 트리톤 X-100] 및 살균 H2O를 사용하여 상기 프라이머들의 쌍들 사이에서 최종 부피가 25㎕이 되도록 수행하였다. PCR 조건들은 94℃에서 4분 동안 [1 순환(cycle)]; 94℃에서 1분 동안, 43℃에서 1분 동안, 72℃에서 1분 동안 [35 순환]; 72℃로 5분 동안 [1 순환]이었다. 상기 반응은 Perkin Elmer DNA 열 순환기 480을 사용하여 500㎕의 살균한 마이크로원심분리 튜브 내에서 수행되었다. 단지 조합 1 및 6만으로 43℃의 어닐링 온도에서 단일한 생성물을 얻었다. SeaPlaque 아가로스(FMC)를 사용하는 아가로스 겔 전기영동으로 상기 생성물들을 측정하였더니 약 750 염기쌍들이 존재하였다. 크기 마커(marker; Promega Corporation)로서 산업적 이용가능한 100bp 래더(ladder)를 사용하였다.
M. 커피-특정 크산토신-N7-메틸 전달효소 PCR 유전자 생성물의 복제
50㎕의 PCR 반응에서 프라이머 1 및 6 (도 4)를 사용하여 얻은 750bp 조각은 50㎕의 클로로포름을 가지고 있으며, 100㎕의 살균수를 이에 가하였다. 상기 혼합물들을 교반하고 2분 동안 14,000rpm으로 마이크로원심분리기 내에서 원심분리를 시켰다. DNA를 함유하고 있는 상부 수용액 층을 분리하여 살균 튜브 내에 넣었다. 에티디움-브로마이드 평판 정량은 약 5ng의 PCR 증폭된 DNA/㎕의 존재를 나타내는 것이다. 이후 상기 PCR 생성물은 1㎕의 10x결찰 완충용액, 2㎕의 PCRⅡ 벡터 (25ng/㎕), 3㎕의 담수 PCR 생성물 (5ng/㎕), 1㎕의 T4 DNA 리가제, 및 3㎕의 살균수를 함유하는 10㎕의 결찰 반응 내 TA 복제 Kit pCR Ⅱ 벡터 (Invitrogen Corporation) 속으로 결찰하였다. 상기 결찰 반응물을 14℃에서 밤새도록 배양시켰다. 상기 결찰 반응물들을 2분 동안 14,000rpm으로 원심분리시키고 얼음위에 놓았다. E.coli XL1-Blue 적당한 세포들의 충분히 해동된 유리병에 2㎕의 0.5M a-머켑토에탄올을 가하여 피펫 팁으로 가볍게 혼합하여 주었다. 2㎕의 결찰 반응물을 상기 세포들 안으로 피펫팅하여 주고 이들을 피펫 팁으로 가볍게 교반하여 혼합시켜 주었다. 상기 유리병을 30분 동안 얼음에 배양시켜 준 후, 42℃ 열-블록 내에서 정확히 30분 동안 열-충격을 주었다. 상기 유리병을 얼음 위에 놓았다. 2분 후에, 450㎕의 살균 SOC 배지 (20g/L 트립톤, 5g/L 효모 추출물, 0.5g/L NaCl, 10mL/L 250mM KCl, 10mM/L MgCl2, 20mL/L 1M 글루코스, [pH7.0])를 상기 유리병에 가하였다. 상기 유리병를 1시간 동안 연속해서 회전식 교반기 내에서 225rpm으로 교반시켜 주고 얼음 위에 놓았다.
상기 형질전환된 세포들은, 50㎍/mL 암피실린 및 40㎍/mL X-Gal을 함유하는 두 개의 LB 평판들 (10g/L 트립톤, 5g/L 효모 추출물, 10g/L NaCl, 15g/L Difco 아가, pH 7.5)중 한 개 위에 상기 세포 현탁액으로 부터 50㎕ 및/또는 200㎕를 피펫팅함으로서 배양시켰다. 상기 평판들을 20시간 동안 37℃에서 배양시킨 후, 3시간 동안 4℃로 변화시켜 색 전개를 수행하였다. 6개의 백색 형질전환체 콜로니를 PCR 조각의 존재 및 배향에 대하여 분석하였다.
N. 비등(boiling) 플라스미드 미니-제조
각각의 형질전환체 콜로니들을 50㎍/mL 암피시린으로 추가된 5mL의 고깃국(12g/L 트립톤, 24g/L 효모 추출물, 4mL/L 글리세롤, 100mL/L 10x TB 포스페이트 [0.17M KH2PO4, 0.72M K2HPO4])내에서 성장시켰다. 상기 튜브들을 회전식 교반기 내 37℃에서 밤새도록 배양시켰다. 각각의 3mL 콜로니를 한 번에 1mL씩 1.5mL 마이크로원심분리기 튜브에 옮기고 상기 세포들을 2분 동안 14,000rpm으로 원심분리하여 농축시켰다. 매번 상기 상청액을 제거하고, 세포 펠릿을 가능한 건조하게 하였다. 상기 세포들을 1mL의 살균 H2O로 한 번 세척하고 전술한 바와 같이 원심분리하였다. 상기 상청액을 제거하고 세포 펠릿을 320㎕ STET 완충용액 (8% 수크로스, 0.5% 트리톤 X-100, 50mM EDTA, 10mM 트리스-HCl, pH8.0) 내에 재현탁시켰다. 상기 세포들에, TE 완충용액 (10mL/L 1M 트리스-HCl pH8.0, 2mL/L 0.5M EDTA pH8.0) 내 32㎕의 10mg/mL 라이소자임를 가하였고, 몇번에 걸쳐 상기 튜브들을 교환함으로써 혼합하였다. 상기 튜브들을 5분 동안 끊는 물중탕에 넣은 후 즉시 얼음 위에 놓았다. 냉각되자 마자 이들을 4℃하에서 30분 동안 14,000rpm으로 원심분리시켰다. 각각의 튜브로 부터 상기 펠릿을 살균된 이쑤시개로 제거하였다. 상기 상청액은 170㎕의 7.5M NH4OAc를 가지고 있으며, 이에 550㎕의 얼음으로 차가워진 이소프로판올를 가한 후, 상기 DNA를 -20℃하에서 밤새도록 침전시켰다. 상기 튜브들을 4℃에서 30분 동안 14,000rpm으로 원심분리시키고, 상기 펠릿을 75% 에탄올로 세척하여 스피드-백.(speed-vac.) 내에서 1시간 동안 건조시켰다. 상기 DNA를 1㎕의 5mg/mL RNase A를 함유하는 50㎕의 살균 H2O 내에 재현탁시켰다.
O. pCR Ⅱ 플라스미드로 부터 얻은 삽입물을 제거하기 위한 제한 가수분해
상기로 부터 얻은 바와 같은 15㎕의 플라스미드 미니-제조 DNA, 2.5㎕의 완충용액 H (90mM 트리스-HCl [pH7.5], 10mM MgCl2, 50mM NaCl), 1㎕의 EcoRI (8-12u/㎕), 및 6.5㎕의 살균 H2O를 가함으로써 25㎕의 반응 혼합물을 제조하였다. 상기 혼합물을 1시간 동안 37℃하에 교반되고 있는 물중탕 내에서 배양하고, 물중탕 내에서 1분 동안 끓였다. 상기 튜브들을 15초 동안 14,000rpm으로 원심분리시킨 후, 실온으로 냉각하였다. 각각의 10㎕ 혼합물에 2㎕의 로딩 염료를 가하고, 크기 마커 (Promega Corporation)로서 100bp 래더 및 극히-순수한 아가로스(ultra-pure agarose) (GibcoBRL)를 사용하는 1.5% 아가로스 겔 전기영동에 의해 상기 소화 생성물을 분석하였다.
상기 여섯 개의 반응들 중 단지 하나만이 750bp 이하의 소화된 삽입물이 존재하는 것으로 나타났다. 750bp 크산토신-N7-메틸 전달효소 PCR 생성물을 갖는 플라스미드에 해당하는 본래의 박테리아 콜로니를 50㎍/mL 암피실린이 추가된 50mL의 살균 LB 배지 (10g/L 트립톤, 5g/L 효모 추출물, 10g/L NaCl, pH7.5)를 함유하는 250mL Erlenmayer 플라스크 안에 주입하였다. 상기 플라스크를 30℃하에 밤새도록 회전식 교반기 내에서 배양시켰다. 1.5mL 마이크로원심분리기 튜브 내의 18mL 결과로 얻어진 세포 배지들을 상기와 같이 원심분리하여 농축시켰다.
QIAGEN 플라스미드 미니 키트 절차 (Qiagen Inc.)를 사용하여 플라스미드 DNA를 정제하였다. 상기 세척된 박테리아 펠럿을 공급된 RNase를 함유하는 0.3mL의 완충용액 P1 내에 재현탁시켰다. 상기 0.3mL의 알카리 용균에 완충용액 P2를 가하고 상기 튜브를 가볍게 흔들어 혼합한 후, 실온에서 5분 이하로 배양시켰다. 0.3mL의 냉각된 완충용액 P3를 가하고 상기 튜브를 6번 뒤집어 혼합하였다. 얼음 위에 10분 놓은 후, 상기 추출물을 마이크로원심분리기 내에서 15분 동안 14,000rpm으로 원심분리를 하였다. 상기 상청액을 제거하고 중력 흐름에 의해 1mL의 QBT 완충용액을 사용함으로써 앞서 평형을 이루고 있던 QIAGEN-팁 20을 사용하였다. 상기 사용된 세포 추출물 상청액은 또한 중력 흐름에 의해 칼럼의 그 수지 안으로 들어가게 하였다. 칼럼을 통과하는 흐름이 중지되었을 때, QIAGEN-팁 20을 1mL의 완충용액 QC로 4번 세척하였다. 상기 DNA는 QIAGEN-팁 20을 0.8mL 완충용액 QC로 세척함으로써 용리되었고, 0.7 부피 (560㎕)의 실온 이소프로판올을 부가함으로써 침전되었다. 상기 튜브를 즉시 30분 동안 14,000rpm으로 원심분리시키고 상기 상청액을 조심스럽게 제거하였다. 상기 침전된 DNA를 1mL의 얼음으로 차가워진 70% 에탄올로 세척하고 상기와 같이 원심분리시켰으며 5분 동안 대기중에 건조시켰다. 상기 DNA를 100㎕의 살균 H2O 내에 현탁시켰다. 전술한 바와 같이, 1㎕의 DNA 재현탁액을 UV 분광광도법에 의해 측정한 결과 100㎕ 당 55㎍의 순수한 재조합 pCRⅡ 플라스미드 DNA가 존재한다는 것을 알았다.
5' 말단으로 부터 얻은 pCRⅡ 플라스미드 내 삽입물의 자동화된 DNA 서열화는 PCR 생성물이 삽입되는 부위와 근접한 pCRⅡ 내 표준으로 바인딩되는 M13 역 프라이머를 사용하여 달성되었다. 서열화는 University of Hawaii Biotechnology 서비스 기관에서 실행하였다. 상기 서열화 반응은 1㎍의 플라스미드 템플레이트 및 3.2 pmol M13 프라이머를 함유한다. 상기 얻어진 서열은 PCR 생성물이 펩티드 조각 A 및 B의 첫 번째 6 아미노산의 DNA 서열(도 4)을 암호화 지정하며, 퇴화 DNA 프라이머 1 및 2(도 4)가 이로 부터 제조됨을 나타낸다. 또한, 상기 서열은 펩티드 조각의 7 아미노산을 암호화 지정하며, 이 서열의 DNA는 프라이머 제조에 사용되지 않았다. 결과로, 올바른 단백질을 위한 DNA 서열을 복제하였다.
P. PCR 생성물을 사용하여 cDNA 스크리닝용 무작위 프라이밍된 소식자의 제조
상기 기술한 바와 같은 순수한 pCRⅡ 플라스드의 2개 17.5㎕ 엘리콧으로 EcoRl를 사용하는 2개의 25㎕ 제한 소화를 수행하였다. 상기 제조물을 전술한 바와 같이 1% 아가로스 겔로 분리하고, 750bp 삽입물을 두 개 레인의 겔들로 부터 무균화 절제하였다. 0.65g의 덩어리를 가지고 있는 상기 겔 조각들을 살균된 40mL의 폴리프로필렌 튜브로 옮겨 담고, GenecleanⅡ 키트 정제 (BIO 101. Inc)를 하였다. 4 및 1.5 부피의 NaI (2.93mL) 저장 용액를 상기 겔 조각에 가하였다. 1.5 부피의 겔 TBE 개질제 (325㎕)를 가하고, 상기 튜브를 5분 동안 45℃에서 배양시켰다. 상기 15㎕의 글래스밀크 현탁액를 가하고 추가로 5분 동안 배양시켰다. 글래스밀크/DNA 착물을 10초 동안 1,000rpm으로 원심분리시켜 펠릿으로 제조하고 상청액을 제거하였다. 상기 글래스밀크 펠릿을 1mL의 New Wash 용액으로 3번 세척하고 DNA를 50㎕의 살균 H2O로 용리하였다. 에티디움 브로마이드 평판(plate)은 DNA 농도가 10ng/㎕임을 나타내었다.
무작위 프라이밍된 소식자를 30ng (3㎕)의 순수한 DNA로 부터 합성하였다. 3㎕의 DNA를 27㎕의 살균수에 가하고 상기 DNA를 끊는 물중탕 내에서 가열함으로써 변성시켰다. 상기 Promega Corporations Prime-a-Gene 키트 구성물들 (10㎕의 5x 표식된 완충용액, 2㎕의 표식되지 않는 dNTP들 [20μM의 각기 dCTP, dGTP, TTP], 2㎕의 1mg/㎕ 아세틸레이트된 BSA, 1㎕의 5u/㎕ Klenow 효소) 및 5㎕의 [α-32P]dATP (50μCi, 3,000Ci/mmol; DuPont NEN)를 가하여 최종 부피가 50㎕로 되게하였고 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 2㎕의 0.5M Na2EDTA (20mM 최종 농도)를 가함으로써 상기 반응을 종결하고 끊는 물중탕 내에서 2분 동안 가열하였다.
Q. 무작위 프라이밍된 소식자를 갖는 증폭된 라이브러리의 스크리닝
한 개의 평판 당 약 50,000개의 재조합 복제물들을 갖는 4개의 150x15mm NZY 평판들을 4℃로 냉각시키고 (평판 배양 및 성장 조건에 대한 상기를 참조), 재조합 플라크들은 10초 동안 5x SSC 완충용액으로 포화된 크로마토그래피 용지 상의 132mm Magma 나일론 이송 멤브레인을 적심으로 해서 올려졌다. 상기 멤브레인을 5분 동안 재조합 플라크를 함유하는 평판 상에, 파지를 함유하는 측면에 놓았고, 0.5M NaOH 및 1.5M NaCl로 포화된 크로마토그래피 용지 상에 2분 동안 들었다 놓았다 했다. 0.5M 트리스-HCl (pH 8.0) 및 1.5M NaCl로 포화된 크로마토그래피 용지 위에 멤브레인을 옮김으로써 이를 중화시켰다. 이후, 이들을 2x SCC 완충용액, 0.2M 트리스-HCL (pH 7.5)으로 포화된 크래마토그래피 용지 상에 20초 동안 놓아두어 블롯-건조시켰다. 대기 중에 1시간 동안 건조한 후, UV Stratalinker 1800 (Stratagene Corporation)을 사용하여 12,000 μJoule의 UV에 노출시킴으로써 DNA를 멤브레인과 교차-결합하였다. 4개의 멤브레인들을 Hybrid MarkⅡ 혼성화 오븐 안에서 100mL의 6x SSPE (52.2g/L NaCl, 8.3g/L NaH2PO4-H2O, 2.2g/L Na2EDTA, [pH 7.4]), 5x Denhardt 용액 (1g/L Ficoll, 1g/L 폴리비닐피롤리돈, 1g/L BSA [펜탁스 단편 V]), 0.5% SDS 및 100㎍/mL 변성된 청어 정충 DNA로 2시간 동안 65℃하에 혼성잡종시켰다.
혼성잡종을 상기 기술한 바와 같이 10mL의 6x SSPE, 0.5% SDS, 100㎍/mL의 분말/변성된 청어 정충 DNA, 및 52㎕의 15 X 106 dpms/mL의 무작위 프라이밍된 소식자 내에서 12시간 동안 65℃로 수행하였다. 혼성화 기간의 종료시에 소식자를 제거하고 멤브레인을 간단히 30초 동안 0.5%의 SDS를 함유하는 100mL의 65℃ 2x SSC로 세척하였다. 이후, 상기 멤브레인을 동일한 양 및 농도의 담수 완충용액으로 추가적으로 30분 동안 세척하였다. 상기 멤브레인을 65℃ 0.2x SSC, 0.5% SDS로 두 번 이상 30분 동안 100mL 세척하고 셀로판 봉지 내에 싸서 예비-섬광을 받은 Fuji RXGCU X-레이 필름에 24시간 동안 -70℃로 노출시켰다. 15개의 양성 복제물들이 관찰되었다. 상기 플라크들을 수집하여 20㎕의 클로로포름 (파지 저장)을 함유하는 1mL의 SM 완충용액 내에 넣었다. 상기들 중, 11개를 단일한 개개의 플라크들이 얻어질 때 까지 2차 또는 3차 스크리닝을 수행하였다.
R. 크산토신-N7-메틸전달효소 cDNA 복제물들의 특성화
추정상의 크산토신-N7-메틸전달효소 CDNA 복제물들의 크기는, 복제화 벡터 및 이 측면 cDNA 삽입 부위 내에 존재하는 T3 및 T7 촉진유전자에 상동성인 프라이머들을 사용하는 중합효소 사슬 반응에 의해 측정되었다. 중합효소 사슬 반응을 위한 조건은 순환이 95℃로 1분, 50℃로 1분 및 72℃로 2분의 35순환이라는 것을 제외하고는 상기 기술한 바와 같다. 전술한 바와 같이 아가로스 겔 전기영동을 이용하여 분석하였다. 3개의 가장 큰 복제물들을 얻었으며, 이를 O.D.600=1.0으로 성장된 200㎕의 담수 XL1-Blue MRF 세포들과 더불어 살균 튜브 200㎕의 단일한 플라크 파지 저장액을 혼합함으로써 생체내에서 절제하였다. 상기 혼합물에 1㎕의 ExAssist (Stratagene Corporation) 헬퍼 파지 (＞1×106 pfu/㎕)를 가하고 이 튜브를 15분 동안 37℃에서 배양하였다. 3mL의 살균 LB 고깃국을 가하고 교반하면서 37℃에서 3시간 동안 계속 배양하였다. 상기 배양물들을 20분 동안 70℃ 물중탕으로 가열한 후, 이 튜브를 15분 동안 1,000xg로 원심분리시켰다. 섬유상 파지 입자들로서 충전된 절제된 pBluesript 파지미드를 함유하는 1mL의 상청액을 살균 1.5mL 마이크로원심분리기 튜브 안으로 옮기고 4℃에서 저장 용액으로서 저장하였다. 25㎕의 저장 용액을 마이크로원심분리기 내에서 O.D.600=1로 성장된 200㎕의 E.coli Solar 세포들에 가하였다. 37℃로 15분 동안 배양한 후, 상기 200㎕ 세포들을 50㎍/mL 암피실린을 함유하는 100x15mm NZY 아가 평판 위에서 평판배양시켰다. 상기 평판들을 콜로니가 생성될 때 까지 37℃로 밤새도록 배양시켰다. 단일한 콜로니를 50㎍/mL 암피실린을 함유하는 10mL의 살균 LB 고깃국 속에 주입하고, 교반시키면서 37℃로 밤새도록 성장시켰다. 10mL의 세포 배양물을 1.5mL의 살균 마이크로원심분리기 튜브 내에 농축시키고, 전술한 바와 같이 펠릿으로 된 세포들을 QIAGEN 플라스미드로 정제시켰다. 정제된 플라스미드 DNA를 50㎕의 살균 H2O 내 재현탁시켰다. 8㎕의 상기 DNA 표본 (0.8㎍)들을 4㎕의 T3 또는 T7 서열화 프라이머 (0.8pmol/㎕)와 혼합시킴으로써 DNA 자동 서열화 반응을 달성하였다. 상기 공정의 잔류물은 전술한 바와 같다. 각각의 서열화 반응은 약 350 염기의 서열을 제공하였다. 상기 서열은 도5에 보여지는 바와 같다. cDNA의 염기 서열로 도시된 바와 같이 크산토신-N7-메틸 전달효소의 아미노산 서열은 도 6에 나타난다.
전술된 실시예들은 실례가 되는 목적들에 대한 것일 뿐, 출원인의 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며 이는 본원에 첨부된 청구에 의해 기재되어 있다.
부록
서열 목록

Claims (38)

  1. 다음 아미노산 서열로 구성되는 크산토신-N7-메틸 트랜스퍼라제.
  2. a)
    b) 상기 DNA 서열에 상보적인 서열로 구성되는 DNA 서열, 또는
    C) 상기 DNA 서열에 대하여 축퇴된 DNA 서열
    로 구성되는 크산토신-N7-메틸 전달효소의 발현을 코드하는 핵산 서열.
  3. a) 다음 DNA 서열에 대하여 안티센스인 DNA 서열로 커피 식물을 형질전환시키는 단계
    b) 상기 형질전환된 커피 식물로부터 얻은 과실을 수확하는 단계
    를 포함하는 카페인 없는 커피 원두를 생산하는 방법.
  4. 발현시 다음을 암호화하는 DNA 서열에 대하여 안티센스인 DNA 서열로 커피 식물을 형질전환시키는 것을 포함하는 카페인 없는 커피 원두를 생산하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, Coffea arabica로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 크산토신-N7-메틸트랜스퍼라제.
  6. (서열 제10번)의 아미노산 서열을 가지는 크산토신-N7-메틸트랜스퍼라제의 발현을 코드하는, 커피 식물에서 분리시킨 핵산 서열.
  7. 제6항에 있어서, 커피 식물이 Coffea arabica인 것을 특징으로 하는 핵산 서열.
  8. (서열 제10번)의 아미노산 서열을 가지는 크산토신-N7-메틸트랜스퍼라제의 발현을 코드하는 mRNA에 대하여 안티센스이면서 크산토신-N7-메틸트랜스퍼라제의 발현을 방해하기에 충분한 길이인 RNA에 대한 전사를 코드하는 핵산 서열로 커피 식물 세포를 형질전환시키는 것을 포함하는 커피 식물 세포를 유전자 변형시키는 방법.
  9. (서열 제10번)의 아미노산 서열을 가지는 크산토신-N7-메틸트랜스퍼라제의 발현을 코드하는 mRNA에 대하여 센스이면서 크산토신-N7-메틸트랜스퍼라제의 발현을 방해하기에 충분한 길이인 RNA에 대한 전사를 코드하는 핵산 서열로 커피 식물 세포를 형질전환시키는 것을 포함하는 커피 식물 세포를 유전자 변형시키는 방법.
  10. (서열 제10번)의 아미노산 서열을 가지는 크산토신-N7-메틸트랜스퍼라제의 발현을 코드하는 핵산 서열로 커피 식물 세포를 유전자 변형시키는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 핵산 서열이 안티센스 방향으로 전사 프로모터와 링크되어 있는 것을 특징으로하는 방법.
  12. 제10항에 있어서, 핵산 서열이 센스 방향으로 전사 프로모터와 링크되어 있는 것을 특징으로하는 방법.
  13. (서열 제10번)의 아미노산 서열을 가지는 크산토신-N7-메틸트랜스퍼라제의 발현을 코드하는 mRNA에 대하여 안티센스인 RNA에 대한 전사를 코드하는 핵산서열을 식물 게놈에 삽입시키는 것을 포함하는 커피 식물 세포를 유전자 변형시키는 방법.
  14. (서열 제10번)의 아미노산 서열을 가지는 크산토신-N7-메틸트랜스퍼라제의 발현을 코드하는 mRNA에 대하여 센스인 RNA에 대한 전사를 코드하는 핵산서열을 식물 게놈에 삽입시키는 것을 포함하는 커피 식물 세포를 유전자 변형시키는 방법.
  15. 제8항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법으로부터 얻어지는 커피 원두.
  16. (ⅰ)핵산 서열 (서열 제11번) 또는 (ⅱ)(서열 제10번)의 아미노산 서열의 발현을 코드하는 핵산 서열에 작동 링크된 전사 프로모터를 포함하는 형질전환 벡터.
  17. 제16항에 있어서, 핵산 서열이 센스 방향으로 전사 프로모터에 작동 링크된 형질전환 벡터.
  18. 제16항에 있어서, 핵산 서열이 안티센스 방향으로 전사 프로모터에 작동 링크된 형질전환 벡터.
  19. 제16항에 있어서, 프로모터가 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터인 형질전환 벡터.
  20. 제16항에 있어서, 핵산 서열 (서열 제11번) 또는 (ⅱ)(서열 제10번)의 아미노산 서열의 발현을 코드하는 핵산 서열에 작동 링크된 전사 프로모터가 플라스미드 pBI-121에 합체된 형질전환 벡터.
  21. (서열 제10번)의 아미노산 서열을 가지는 크산토신-N7-메틸트랜스퍼라제의 발현을 코드하는 mRNA에 대하여 안티센스이면서 크산토신-N7-메틸트랜스퍼라제의 발현을 방해하기에 충분한 길이인 RNA에 대한 전사를 코드하는 핵산 서열로 커피 식물 세포를 형전전환시키는 방법.
  22. (서열 제10번)의 아미노산 서열을 가지는 크산토신-N7-메틸트랜스퍼라제의 발현을 코드하는 mRNA에 대하여 센스이면서 크산토신-N7-메틸트랜스퍼라제의 발현을 방해하기에 충분한 길이인 RNA에 대한 전사를 코드하는 핵산 서열로 커피 식물 세포를 형전전환시키는 방법.
  23. (서열 제10번)의 아미노산 서열을 가지는 크산토신-N7-메틸트랜스퍼라제의 발현을 코드하는 핵산 서열로 형질전환시킨 커피 식물 세포.
  24. 제23항에 있어서, 핵산 서열이 안티센스 방향으로 전사 프로모터와 링크되어 있는 커피 식물 세포.
  25. 제23항에 있어서, 핵산 서열이 안티센스 방향으로 전사 프로모터와 링크되어 있는 커피 식물 세포.
  26. (서열 제10번)의 아미노산 서열을 가지는 크산토신-N7-메틸트랜스퍼라제의 발현을 코드하는 핵산 서열에 작동 링크된 전사 프로모터를 포함하는 형질전환 벡터를 커피 식물 세포에 삽입시키는 방법으로 얻은 형질전환된 커피 식물 세포.
  27. 제26항에 있어서, 핵산 서열이 센스 방향으로 전사 프로모터에 작동 링크된 형질전환된 커피 식물 세포.
  28. 제26항에 있어서, 핵산 서열이 안티센스 방향으로 전사 프로모터에 작동 링크된 형질전환된 커피 식물 세포.
  29. 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 서열로 형질전환되지 않은 커피 식물 세포와 비교하여 카페인 생성이 감소된, 형질전환된 커피 식물 세포.
  30. (서열 제10번)의 아미노산 서열을 가지는 크산토신-N7-메틸트랜스퍼라제의 발현을 방해하기에 충분한 길이인 RNA에 대한 전사를 코드하며 안티센스 방향으로 전사 프로모터에 작동 링크된 핵산 서열을 포함하는 형질전환 벡터를 준비하는 단계; 및
    형질전환 벡터를 커피 식물 세포에 삽입시키는 단계로서, 이후 상기 핵산 서열이 커피 식물 세포의 게놈에 삽입되어 형질전환된 세포를 생성시키고 이 형질전환된 세포는 핵산 서열로 형질전환되지 않은 커피 식물 세포와 비교하여 카페인 생성이 감소되는 단계
    를 포함하는, 커피 식물 세포에 의하여 카페인의 생성을 저해시키는 방법.
  31. (서열 제10번)의 아미노산 서열을 가지는 크산토신-N7-메틸트랜스퍼라제의 발현을 방해하기에 충분한 길이인 RNA에 대한 전사를 코드하며 센스 방향으로 전사 프로모터에 작동 링크된 핵산 서열을 포함하는 형질전환 벡터를 준비하는 단계; 및
    형질전환 벡터를 커피 식물 세포에 삽입시키는 단계로서, 이후 상기 핵산 서열이 커피 식물 세포의 게놈에 삽입되어 형질전환된 세포를 생성시키고 이 형질전환된 세포는 핵산 서열로 형질전환되지 않은 커피 식물 세포와 비교하여 카페인 생성이 감소되는 단계
    를 포함하는, 커피 식물 세포에 의하여 카페인의 생성을 저해시키는 방법.
  32. 크산토신-N7-메틸트랜스퍼라제의 발현을 코드하는 mRNA에 대하여 안티센스인 RNA에 대한 전사를 코드하는 핵산 서열로 커피 식물 세포를 형질전환시키는 것을 포함하는 커피 식물 세포를 유전자 변형시키는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 크산토신-N7-메틸트랜스퍼라제가 (서열 제10번)의 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제32항의 방법으로부터 얻어지는 커피 원두.
  35. 크산토신-N7-메틸트랜스퍼라제의 발현을 코드하는 mRNA에 대하여 센스이면서 커피 식물 크산토신-N7-메틸트랜스퍼라제의 발현을 방해하기에 충분한 길이인 RNA에 대한 전사를 코드하는 핵산 서열로 커피 식물 세포를 형질전환시키는 것을 포함하는 커피 식물 세포를 유전자 변형시키는 방법.
  36. 제35항의 방법으로부터 얻어지는 커피 원두.
  37. 크산토신-N7-메틸트랜스퍼라제의 발현을 코드하는 mRNA에 대하여 안티센스이면서 커피 식물 크산토신-N7-메틸트랜스퍼라제의 발현을 방해하기에 충분한 길이인 RNA에 대한 전사를 코드하는 핵산 서열로 커피 식물 세포를 형질전환시키는 방법.
  38. 크산토신-N7-메틸트랜스퍼라제의 발현을 코드하는 mRNA에 대하여 센스이면서 커피 식물 크산토신-N7-메틸트랜스퍼라제의 발현을 방해하기에 충분한 길이인 RNA에 대한 전사를 코드하는 핵산 서열로 커피 식물 세포를 형질전환시키는 방법.
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