JP2004049022A - 遺伝子組換えによるカフェインレスコーヒー植物の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】カフェイン生合成関連酵素をコードする遺伝子群の発現をアンチセンス法やＲＮＡｉ法で抑制することにより、カフェイン含量の少ないコーヒー植物を創出する方法を提供する。
【解決手段】カフェイン生合成関連酵素をコードする遺伝子のアンチセンス配列またはＲＮＡｉ配列を作製し、形質転換用の発現ベクターを構築する工程と、得られた発現ベクターをアグロバクテリウムに導入する工程と、コーヒー植物の細胞分裂の活性化した組織片、またはコーヒー植物の組織片から誘導したカルスもしくは不定胚を上記アグロバクテリウムに感染させることにより上記組織片、カルスまたは不定胚の形質転換を行う工程と、形質転換された組織片、カルスまたは不定胚から形質転換コーヒー植物体を得る工程とを含む、遺伝子組換えによるカフェインレスコーヒー植物の製造方法である。
【選択図】 なし
【解決手段】カフェイン生合成関連酵素をコードする遺伝子のアンチセンス配列またはＲＮＡｉ配列を作製し、形質転換用の発現ベクターを構築する工程と、得られた発現ベクターをアグロバクテリウムに導入する工程と、コーヒー植物の細胞分裂の活性化した組織片、またはコーヒー植物の組織片から誘導したカルスもしくは不定胚を上記アグロバクテリウムに感染させることにより上記組織片、カルスまたは不定胚の形質転換を行う工程と、形質転換された組織片、カルスまたは不定胚から形質転換コーヒー植物体を得る工程とを含む、遺伝子組換えによるカフェインレスコーヒー植物の製造方法である。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、遺伝子組換えによるカフェインレスコーヒー植物ないしは減カフェインコーヒー植物の製造方法に関するものである。
【０００２】
【発明の背景】
コーヒーに含まれるカフェインは、覚醒作用や心機能の増進といった効果を有する一方で、不眠・動機・めまいなどをきたす副作用を有する。そのため、カフェインレスコーヒーの需要が高く、従来は主に有機溶媒抽出など物理化学的な分離手法によりこれを生産していた。しかし、この方法では生産コストが高くつく上に、コーヒー本来の味・香りが損なわれてしまう。そこで、これに代わる新しいカフェインレスコーヒーの創出技術開発が望まれている。
【０００３】
【従来の技術】
コーヒー植物の育種は、交配による優良品種の選抜、種子繁殖あるいは接木による増殖を主流としている。しかし交配選抜による育種は長い年月を要し、コーヒー種子は貯蔵条件により急激に発芽率低下を来たす。接木による増殖は優良形質品種のクローン増殖に有効であるが、広い育種場の確保や台木の更新などが必要となる。その後、選抜・交配育種に替わるコーヒー植物の育種技術として組織培養技術が開発されてきた（Ｂｅｒｔｈｏｕｌｙ ａｎｄ Ｅｔｉｅｎｎｅ， Ｓｏｍａｔｉｃ Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｗｏｏｄｙ Ｐｌａｎｔｓ， Ｖｏｌ． ５， Ｋｌｕｗｅｒ： ２５９−２８８， １９９９）。また、近年、遺伝子組換え技術により形質転換植物を創出することが可能になり、コーヒー植物においても形質転換例が幾つか報告されている。最近の報告例としては、耐虫性遺伝子の導入が挙げられる（Ｌｅｒｏｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． １９： ３８２−３８９， ２０００）。新しいカフェインレスコーヒーの創出技術として、遺伝子組換え技術を応用したカフェインレスコーヒーの分子育種が理論的には提案されてきたが、これを具体的に実証した報告は未だない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、遺伝子組換え技術を応用した新しいコーヒー植物の分子育種技術を提供すること、具体的には、コーヒーより単離したカフェイン生合成関連酵素をコードする遺伝子群の発現をアンチセンス法やＲＮＡｉ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）法で抑制することにより、カフェイン含量の少ないコーヒー植物を創出する方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、カフェイン生合成関連酵素をコードする遺伝子のアンチセンス配列またはＲＮＡｉ配列を作製し、形質転換用の発現ベクターを構築する工程と、
得られた発現ベクターをアグロバクテリウムに導入する工程と、
コーヒー植物の細胞分裂の活性化した組織片、またはコーヒー植物の組織片から誘導したカルスもしくは不定胚を、上記アグロバクテリウムに感染させることにより上記組織片、カルスまたは不定胚の形質転換を行う工程と、
形質転換された組織片、カルスまたは不定胚から形質転換コーヒー植物体を得る工程とを含む、
遺伝子組換えによるカフェインレスコーヒー植物の製造方法に関する。
【０００６】
コーヒー植物（コーヒーノキ）では、アデニンヌクレオチドおよびグアニンヌクレオチドの異化代謝中間産物であるキサントシンを出発材料とし、７−メチルキサントシン、７−メチルキサンチン、３，７−ジメチルキサンチン（テオブロミン）を経て１，３，７−トリメチルキサンチン（カフェイン）が生合成される。
【０００７】
上記カフェイン生合成関連酵素はキサントシンから７−メチルキサントシンへのメチル化を触媒するキサントシンメチル化酵素、７−メチルキサントシンから７−メチルキサンチンへの脱リボースを触媒するヌクレオシド脱リボース酵素、７−メチルキサンチンから３，７−ジメチルキサンチンへのメチル化を触媒する７−メチルキサンチンメチル化酵素、および３，７−ジメチルキサンチンから１，３，７−トリメチルキサンチンへのメチル化を触媒する３，７−ジメチルキサンチンメチル化酵素のいずれであってもよい。
【０００８】
細胞分裂の活性化した葉組織片とは、葉の主に切断面の細胞が分裂を活発に行っている状態で一部カルス化しているものである。細胞分裂の活性化した葉組織片は、例えば、植物ホルモンとしてフェニルウレアタイプのサイトカイニンを加えた培地で切断組織片を前培養することにより得ることができる。フェニルウレアタイプのサイトカイニンとしては、４−ＣＰＰＵ（Ｎ−２−クロロ−４−ピリジル−Ｎ−フェニルウレア）またはＴＤＺ（チジアズロン）が好ましい。
【０００９】
本発明による方法が適用できるコーヒー属植物は、世界のマーケットで需要の高いコーヒー種であるコーヒー・アラビカ種（Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ）およびロブスタ種（＝カネフォラ種（Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ））の外、コーヒー・リベリカ種（Ｃｏｆｆｅａ ｌｉｂｅｒｉｃａ）およびコーヒー・デウェブレイ種（Ｃｏｆｆｅａ ｄｅｗｅｖｒｅｉ）であってもよい。
【００１０】
本発明により得られたカフェインレスコーヒー植物から果実を得ることによりカフェインレスコーヒーないしは減カフェインコーヒーが得られる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明を下記の実施例により具体的に説明する。
【００１２】
実施例１（コーヒー組織培養系の確立）
遺伝子組換えを行うために、以下の材料および方法を用いて、コーヒーの組織培養系を調製した。
【００１３】
材料：
温室内で栽培しているコーヒー植物、アラビカ種およびカネフォラ種の鉢植え個体を用いた。
【００１４】
方法：
（１） コーヒー属植物組織、好ましくは新葉、特に好ましくは枝先端の第一展開葉を採取した後、滅菌処理し、滅菌組織を好ましくはクリーンベンチ内で例えば２〜２０ｍｍ角に、好ましくは約７ｍｍ角に切断した。
【００１５】
上記滅菌処理では、例えば、採取葉を７０％エタノール中に１分間、次いで２％次亜塩素酸水溶液中に１０分間浸漬する。この浸漬により滅菌はほぼ１００％達成される。この処理液および処理条件は適宜調整できる。
【００１６】
（２） 各種栄養成分を含む液体あるいは固体培地、例えばＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ， Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ １５： ４７３−４９７， １９６２ ）、Ｂ５培地（Ｇａｍｂｏｒｇ， Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ． Ｒｅｓ． ５０： １５１−１５８， １９６８）、あるいはそれらの改変培地に、植物ホルモンとして、例えばアデニンタイプのサイトカイニン（ＢＡ：ベンジルアデニン、２ｉｐ：２イソペンテニルアデニン）や、フェニルウレアタイプのサイトカイニン（４−ＣＰＰＵ：Ｎ−２−クロロ−４−ピリジル−Ｎ−フェニルウレアやＴＤＺ：チジアズロン）またはオーキシンである２，４−Ｄ：２，４−ジクロロフェノキシアセティックアシッドなどを添加する。植物ホルモンの組み合わせは上記のものに限定されず、適宜調節する。改変培地は、例えば、無機塩類のみを通常の濃度から１／２に低下させた改良ＭＳ培地（ｍｏｄｉｆｉｅｄ １／２ ＭＳ：以下ｍ１／２ＭＳと略記する）である。植物ホルモンの濃度は、好ましくは０．１〜４０μＭ、より好ましくは０．５〜２０μＭ、最も好ましくは１〜１０μＭである。この培地にショ糖を好ましくは１０〜１００ｇ／ｌ、より好ましくは２０〜５０ｇ／ｌ添加し、ｐＨを至適値例えば５．６〜５．８に調節した後、培地固化剤を加える（以下、固体培地とはゲランガムで固化した培地をいう。また培地とは、特にことわりの無い限りは固体培地をいう。）。培地固化剤としてはゲランガムが好ましく、その添加量は２〜４ｇ／ｌである。その後、この培地を高圧高温条件下で滅菌する。この滅菌条件は、好ましくは温度１１５〜１２５℃、１０〜３０分である。
【００１７】
この実施例では、培地にショ糖を３０ｇ／ｌ添加し、ｐＨを５．７に調節した後、ゲランガム３ｇ／ｌを加えた。滅菌条件は温度１２１℃、期間２０分の高圧高温条件とした。
【００１８】
（３） 次いで、２ｉｐを１〜４０μＭ、特に２ｉｐを２０μＭ含む滅菌ｍ１／２ＭＳ培地にカネフォラ種の葉切断組織片を植え付け、９〜１２週間培養することによって（概ね３週間毎に同一組成の新鮮培地に移植）、不定胚を誘導し、４−ＣＰＰＵを１μＭと２，４−Ｄを５μＭ含む滅菌ｍ１／２ＭＳ培地にアラビカ種の葉切断組織片を植え付け、３〜９週間培養することによって（概ね３週間毎に同一組成の新鮮培地に移植）、カルスを誘導した。誘導した不定胚やカルスは特にことわりのない限り、同一組成の新鮮培地に移植して増殖を促し、遺伝子組換えの材料として用いた。
【００１９】
不定胚やカルスの誘導培養条件は、従来のコーヒー属植物組織培養（例えばＢｅｒｔｈｏｕｌｙ ａｎｄ Ｍｉｃｈａｕｘ−Ｆｅｒｒｉｅｒｅ， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ４４： １６９−１７６， １９９６） で用いられている条件と同じであってよく、例えば温度は２５〜２８℃である。この培養は好ましくは暗所で行う。この実施例では、培養は２５℃暗黒条件下で行った。この培養は、巨視的に細胞分裂の促進、すなわち培養細胞塊の誘導が確認できる程度の期間（約２から３０日間）、継続して行うことが望ましい。
【００２０】
実施例２（形質転換用の発現ベクターの構築）
本実施例では、既に本発明者らが単離・解析した（Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６： ８２１３−８２１８， ２００１）７−メチルキサンチンメチル化酵素（テオブロミン合成酵素）をコードする遺伝子であるＣａＭＸＭＴの制御について述べる。この遺伝子ＣａＭＸＭＴ ｃＤＮＡ は、ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０４８７９４ として登録されているものである。遺伝子発現ベクターには様々な種類があり、それらを適宜用いることができるが、本実施例ではｐＩＧ１２１−Ｈｍ（＝ｐＢＩＨ１−ＩＧ）（Ｏｈｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ３１： ８０５−８３１， １９９０）を用いた。遺伝子発現ベクターｐＩＧ１２１−Ｈｍ（＝ｐＢＩＨ１−ＩＧ）は、ＮＯＳプロモータによって制御されるカナマイシン耐性遺伝子、植物において強力な転写活性を示すプロモーターとして知られるカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ ）によって制御されるイントロンを含むＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子、および、ハイグロマイシン耐性遺伝子が組み込まれたベクターである（図１の最上段参照）。したがって一度の操作でこれら３つの遺伝子が植物に組み込まれる。この場合、好ましいターミネーターとしてはＮＯＳターミネーターが組み込まれている。ＣａＭＸＭＴ発現制御のために改良ベクター（図１の第２〜４段参照）を次の手順で構築した。
【００２１】
（１） ＣａＭＸＭＴの３３２ｂｐ 断片（９４６ｂｐ から１２７７ｂｐ間）：Ａ、１６１ｂｐ 断片（１１１７ｂｐから１２７７ｂｐ間）：Ｂ、および１３９ｂｐ 断片（１１３９ｂｐから１２７７ｂｐ間）：Ｃをそれぞれ増幅した。また、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子の５１７ｂｐ 断片（３４３６ｂｐから３９５２ｂｐ間）：ＤをＲＮＡｉコンストラクトのリンカーとして増幅した。
【００２２】
なお、ＣａＭＸＭＴ発現制御に用いる遺伝子断片およびＲＮＡｉコンストラクトのリンカーとして用いる遺伝子断片は上記領域に限定されず、またＣａＭＸＭＴの塩基置換などの変異配列を含めて適宜変更することができる。
【００２３】
（２） ｐＢＩＨ１−ＩＧのイントロンを含むＧＵＳ遺伝子を制限酵素（Ｘｂａ ＩおよびＳａｃ Ｉ ）で切断した後、断片Ａをアンチセンス配列としてここに組み込んだ。こうして得られた改良ベクターを便宜上ｐＢＩＨ１−ａｎｔｉｓｅｎｓｅＣａＭＸＭＴ とする。
【００２４】
（３） ｐＢＩＨ１−ＩＧのイントロンを含むＧＵＳ遺伝子を制限酵素（Ｘｂａ ＩおよびＳａｃ Ｉ ）で切断した後、断片Ａをセンス配列、断片Ｄをリンカー配列、断片Ａをアンチセンス配列としてここに組み込んだ。こうして得られた改良ベクターを便宜上ｐＢＩＨ１−ＲＮＡｉ １ＣａＭＸＭＴとする。
【００２５】
（４） ｐＢＩＨ１−ＩＧのイントロンを含むＧＵＳ遺伝子を制限酵素（Ｘｂａ ＩおよびＳａｃ Ｉ ）で切断した後、断片Ｂをセンス配列、断片Ｄをリンカー配列、断片Ｃをアンチセンス配列としてここに組み込んだ。こうして得られた改良ベクターを便宜上ｐＢＩＨ１−ＲＮＡｉ ２ＣａＭＸＭＴとする。
【００２６】
図１中、ｎｏｓ−ｐｒｏはＮＯＳプロモータ、Ｋｍ ｒはカナマイシン耐性遺伝子、３５Ｓ−ｐｒｏ は３５Ｓプロモーター、ｉｎｔｒｏｎ−ＧＵＳはイントロンを含むＧＵＳ、ｎｏｓ−ｔｅｒはＮＯＳターミネーター、Ｈｙｇ ｒはハイグロマイシン耐性遺伝子、←Ａはアンチセンス配列、Ｓ→はセンス配列をそれぞれ意味する。
【００２７】
実施例３（アグロバクテリウム細菌による遺伝子導入）
こうして得られた発現ベクターをアグロバクテリウム法による遺伝子導入操作に供する。アグロバクテリウム法による遺伝子導入は常法によって行ってよい。植物組織への外来遺伝子導入はアグロバクテリウムのバイナリーベクター法により行うことができる。アグロバクテリウム細菌およびベクターには多くの種類があり、それらを適宜用いることができるが、本実施例においては、コーヒー植物の形質転換に有効であると報告されている（Ｈａｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１９： １０６−１１０， １９９９）アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ）の１種であるＥＨＡ１０１（Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １６８： １２９１−１３０１， １９８６）を用いた。遺伝子発現ベクターとしては、ｐＩＧ１２１−Ｈｍ（＝ｐＢＩＨ１−ＩＧ）の改良ベクターである、実施例２で構築したベクター、ｐＢＩＨ１−ａｎｔｉｓｅｎｓｅＣａＭＸＭＴ、ｐＢＩＨ１−ＲＮＡｉ １ＣａＭＸＭＴ およびｐＢＩＨ１−ＲＮＡｉ ２ＣａＭＸＭＴ を用いた。
【００２８】
コーヒー属植物への遺伝子導入に先立ち、各ベクターをエレクトロポーレーション法によりアグロバクテリウム細菌：ＥＨＡ１０１に組み込む。ベクターを組み込んだアグロバクテリウム細菌を抗生物質であるカナマイシンおよびハイグロマイシンを含む培地で増殖させ、アグロバクテリウム懸濁液を調製する。
【００２９】
本実施例ではアラビカ種の遺伝子導入例を示す。手順は以下の通りである。（１） 前述の実施例１に従って誘導したアラビカ種のカルスを実施例１と同一培地条件（２５℃、暗黒下）で培養し、増殖させた。
【００３０】
（２） ベクターを組み込んだアグロバクテリウム細菌を抗生物質カナマイシンおよびハイグロマイシンを１００ｍｇ／ｌの濃度で含む培地で増殖させ、６００ｎｍにおける光学濃度（Ｏ．Ｄ．）値約０．５のアグロバクテリウム懸濁液を調製した。この懸濁液にカルスを３０分間浸漬した後、滅菌したろ紙上で水分を除いた。その後好ましくはアセトシリンゴン（遺伝子発現誘導剤）５０ｍｇ／ｌを添加した固体ｍ１／２ＭＳ（４−ＣＰＰＵを１μＭおよび２，４−Ｄ を５μＭ含有）で１日培養する。
【００３１】
（３） アセトシリンゴン含有培地で培養後のカルスをアグロバクテリウム細菌の除菌剤としてセフォタキシン３００ｍｇ／ｌを添加した液体ｍ１／２ＭＳ培地で洗浄後、セフォタキシン３００ｍｇ／ｌと抗生物質としてハイグロマイシンを５０ｍｇ／ｌの濃度で添加した固体ｍ１／２ＭＳ（４−ＣＰＰＵを１ μＭおよび２，４−Ｄ を５ μＭ含有）で培養、次いでセフォタキシンを除き、抗生物質を１００ｍｇ／ｌ の濃度で添加した培地で約２ヶ月間培養以降（３週間毎に同一組成の培地に移植する）、順次形質転換体を得た。
【００３２】
実施例４（導入遺伝子の確認）
前述の通り、得られた形質転換体が抗生物質耐性を示すことは、例えばハイグロマイシン耐性遺伝子が導入され、発現したことを示している。また、ゲノムＤＮＡ を抽出し、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ）法によっても外来遺伝子の導入を確認している。例えばハイグロマイシン耐性遺伝子は、５−ＧＣＧＴＧＡＣＣＴＡＴＴＧＣＡＴＣＴＣＣ−３、５−ＴＴＣＴＡＣＡＣＡＧＣＣＡＴＣＧＧＴＣＣ−３のプライマー対により増幅された。ＰＣＲは９４℃で５分間熱変性後に、熱変性：９４℃、３０秒、アニーリング：５８℃、３０秒、伸長反応：７２℃、３０秒、３０サイクルで行った。非形質転換体には増幅されるＤＮＡ 断片が認められないのに対して、形質転換体には７１３−ｂｐのハイグロマイシン耐性遺伝子断片を示す明瞭なバンドが確認された。
【００３３】
実施例５（ＣａＭＸＭＴ発現の確認）
得られた形質転換体について、アンチセンス法やＲＮＡｉ法で抑制した遺伝子であるＣａＭＸＭＴ発現様式をＲｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ （ＲＴ）−ＰＣＲ法により確認した。これを図２に示す。トータルＲＮＡを抽出した後、ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ （ＡＭＶ） Ｖｅｒ．２．１ （Ｔａｋａｒａ）によってｃＤＮＡを合成した。ＣａＭＸＭＴは ５−ＴＣＣＴＡＣＡＡＴＣＴＧＧＣＴＣＴＴＧＣ−３ 、５−ＴＧＣＴＴＴＡＡＴＴＴＧＴＴＣＡＴＧＧＧＡＴＣ−３ のプライマー対により増幅された。ＰＣＲは熱変性：９４℃、３０秒、アニーリング：５８℃、３０秒、伸長反応：７２℃、１分間、２４サイクルで行った。
【００３４】
図２に示すように、非形質転換体では明瞭なバンドが検出されるのに対して（レーン１）、選抜されたＲＮＡｉ形質転換体（ｐＢＩＨ１−ＲＮＡｉ １ＣａＭＸＭＴ導入：レーン２，３）およびアンチセンス形質転換体（ｐＢＩＨ１−ａｎｔｉｓｅｎｓｅＣａＭＸＭＴ 導入：レーン４）について検出されるバンドは明らかに薄い傾向を示した。中でも、例えばＲＮＡｉ形質転換体（レーン２）ではバンドがほとんど検出されなかった。これは選抜された形質転換体のＣａＭＸＭＴ発現が強く抑制されていることを示している。
【００３５】
実施例６（ＨＰＬＣによる内生テオブロミン、カフェイン量の定量）
得られた形質転換体についてＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）分析法によって内生のプリンアルカロイドであるテオブロミンおよびカフェインの含量を調べた。分析用のプリンアルカロイドは、以下の熱水抽出法により得た。生重量で概ね１００ｍｇの植物組織、カルスなどを８０℃、１ｍｌの超純水にて２０分間煮沸する工程を２回繰り返した。抽出溶液を孔径０．２μｍのメンブレンフィルターによりろ過し、分析試料とした。ＨＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ ６００Ｅ ）を用い、メチルアルコール：水＝２０：８０、すなわち２０％メチルアルコール溶液によりプリンアルカロイド類を分離した。カラムはＷａｔｅｒｓ Ｐｕｒｅｓｉｌ Ｃ１８（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）を用いた。独立した３試料より抽出を行い各抽出試料につき３回分析を行い、９回のＨＰＬＣ分析値の平均値（標準偏差）を求めた。分析結果を表１に示す。
【００３６】
【表１】
表１中、（ ）内の数値は標準偏差を示す。各試験体番号（１〜４）は図２のレーン（１〜４）の番号に一致する。
【００３７】
表１から分かるように、形質転換体の内生テオブロミンおよびカフェイン量は、有意に減少しており、特に２および３のＲＮＡｉ形質転換体においてカフェインは検出されなかった。この結果は実施例５の図２に示す結果と一致するものであり、本発明によってＣａＭＸＭＴ発現が強く抑制され、カフェインを含まないコーヒー形質転換体が得られたことを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、形質転換用の発現ベクターおよびその改良ベクターを模式的に示す図である。
【図２】図２は、得られた形質転換体について、アンチセンス法やＲＮＡｉ法で抑制した遺伝子であるＣａＭＸＭＴ発現様式をＲｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ （ＲＴ）−ＰＣＲ法により確認したことを示すものである。
【発明の属する技術分野】
この発明は、遺伝子組換えによるカフェインレスコーヒー植物ないしは減カフェインコーヒー植物の製造方法に関するものである。
【０００２】
【発明の背景】
コーヒーに含まれるカフェインは、覚醒作用や心機能の増進といった効果を有する一方で、不眠・動機・めまいなどをきたす副作用を有する。そのため、カフェインレスコーヒーの需要が高く、従来は主に有機溶媒抽出など物理化学的な分離手法によりこれを生産していた。しかし、この方法では生産コストが高くつく上に、コーヒー本来の味・香りが損なわれてしまう。そこで、これに代わる新しいカフェインレスコーヒーの創出技術開発が望まれている。
【０００３】
【従来の技術】
コーヒー植物の育種は、交配による優良品種の選抜、種子繁殖あるいは接木による増殖を主流としている。しかし交配選抜による育種は長い年月を要し、コーヒー種子は貯蔵条件により急激に発芽率低下を来たす。接木による増殖は優良形質品種のクローン増殖に有効であるが、広い育種場の確保や台木の更新などが必要となる。その後、選抜・交配育種に替わるコーヒー植物の育種技術として組織培養技術が開発されてきた（Ｂｅｒｔｈｏｕｌｙ ａｎｄ Ｅｔｉｅｎｎｅ， Ｓｏｍａｔｉｃ Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｗｏｏｄｙ Ｐｌａｎｔｓ， Ｖｏｌ． ５， Ｋｌｕｗｅｒ： ２５９−２８８， １９９９）。また、近年、遺伝子組換え技術により形質転換植物を創出することが可能になり、コーヒー植物においても形質転換例が幾つか報告されている。最近の報告例としては、耐虫性遺伝子の導入が挙げられる（Ｌｅｒｏｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． １９： ３８２−３８９， ２０００）。新しいカフェインレスコーヒーの創出技術として、遺伝子組換え技術を応用したカフェインレスコーヒーの分子育種が理論的には提案されてきたが、これを具体的に実証した報告は未だない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、遺伝子組換え技術を応用した新しいコーヒー植物の分子育種技術を提供すること、具体的には、コーヒーより単離したカフェイン生合成関連酵素をコードする遺伝子群の発現をアンチセンス法やＲＮＡｉ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）法で抑制することにより、カフェイン含量の少ないコーヒー植物を創出する方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、カフェイン生合成関連酵素をコードする遺伝子のアンチセンス配列またはＲＮＡｉ配列を作製し、形質転換用の発現ベクターを構築する工程と、
得られた発現ベクターをアグロバクテリウムに導入する工程と、
コーヒー植物の細胞分裂の活性化した組織片、またはコーヒー植物の組織片から誘導したカルスもしくは不定胚を、上記アグロバクテリウムに感染させることにより上記組織片、カルスまたは不定胚の形質転換を行う工程と、
形質転換された組織片、カルスまたは不定胚から形質転換コーヒー植物体を得る工程とを含む、
遺伝子組換えによるカフェインレスコーヒー植物の製造方法に関する。
【０００６】
コーヒー植物（コーヒーノキ）では、アデニンヌクレオチドおよびグアニンヌクレオチドの異化代謝中間産物であるキサントシンを出発材料とし、７−メチルキサントシン、７−メチルキサンチン、３，７−ジメチルキサンチン（テオブロミン）を経て１，３，７−トリメチルキサンチン（カフェイン）が生合成される。
【０００７】
上記カフェイン生合成関連酵素はキサントシンから７−メチルキサントシンへのメチル化を触媒するキサントシンメチル化酵素、７−メチルキサントシンから７−メチルキサンチンへの脱リボースを触媒するヌクレオシド脱リボース酵素、７−メチルキサンチンから３，７−ジメチルキサンチンへのメチル化を触媒する７−メチルキサンチンメチル化酵素、および３，７−ジメチルキサンチンから１，３，７−トリメチルキサンチンへのメチル化を触媒する３，７−ジメチルキサンチンメチル化酵素のいずれであってもよい。
【０００８】
細胞分裂の活性化した葉組織片とは、葉の主に切断面の細胞が分裂を活発に行っている状態で一部カルス化しているものである。細胞分裂の活性化した葉組織片は、例えば、植物ホルモンとしてフェニルウレアタイプのサイトカイニンを加えた培地で切断組織片を前培養することにより得ることができる。フェニルウレアタイプのサイトカイニンとしては、４−ＣＰＰＵ（Ｎ−２−クロロ−４−ピリジル−Ｎ−フェニルウレア）またはＴＤＺ（チジアズロン）が好ましい。
【０００９】
本発明による方法が適用できるコーヒー属植物は、世界のマーケットで需要の高いコーヒー種であるコーヒー・アラビカ種（Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ）およびロブスタ種（＝カネフォラ種（Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ））の外、コーヒー・リベリカ種（Ｃｏｆｆｅａ ｌｉｂｅｒｉｃａ）およびコーヒー・デウェブレイ種（Ｃｏｆｆｅａ ｄｅｗｅｖｒｅｉ）であってもよい。
【００１０】
本発明により得られたカフェインレスコーヒー植物から果実を得ることによりカフェインレスコーヒーないしは減カフェインコーヒーが得られる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明を下記の実施例により具体的に説明する。
【００１２】
実施例１（コーヒー組織培養系の確立）
遺伝子組換えを行うために、以下の材料および方法を用いて、コーヒーの組織培養系を調製した。
【００１３】
材料：
温室内で栽培しているコーヒー植物、アラビカ種およびカネフォラ種の鉢植え個体を用いた。
【００１４】
方法：
（１） コーヒー属植物組織、好ましくは新葉、特に好ましくは枝先端の第一展開葉を採取した後、滅菌処理し、滅菌組織を好ましくはクリーンベンチ内で例えば２〜２０ｍｍ角に、好ましくは約７ｍｍ角に切断した。
【００１５】
上記滅菌処理では、例えば、採取葉を７０％エタノール中に１分間、次いで２％次亜塩素酸水溶液中に１０分間浸漬する。この浸漬により滅菌はほぼ１００％達成される。この処理液および処理条件は適宜調整できる。
【００１６】
（２） 各種栄養成分を含む液体あるいは固体培地、例えばＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ， Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ １５： ４７３−４９７， １９６２ ）、Ｂ５培地（Ｇａｍｂｏｒｇ， Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ． Ｒｅｓ． ５０： １５１−１５８， １９６８）、あるいはそれらの改変培地に、植物ホルモンとして、例えばアデニンタイプのサイトカイニン（ＢＡ：ベンジルアデニン、２ｉｐ：２イソペンテニルアデニン）や、フェニルウレアタイプのサイトカイニン（４−ＣＰＰＵ：Ｎ−２−クロロ−４−ピリジル−Ｎ−フェニルウレアやＴＤＺ：チジアズロン）またはオーキシンである２，４−Ｄ：２，４−ジクロロフェノキシアセティックアシッドなどを添加する。植物ホルモンの組み合わせは上記のものに限定されず、適宜調節する。改変培地は、例えば、無機塩類のみを通常の濃度から１／２に低下させた改良ＭＳ培地（ｍｏｄｉｆｉｅｄ １／２ ＭＳ：以下ｍ１／２ＭＳと略記する）である。植物ホルモンの濃度は、好ましくは０．１〜４０μＭ、より好ましくは０．５〜２０μＭ、最も好ましくは１〜１０μＭである。この培地にショ糖を好ましくは１０〜１００ｇ／ｌ、より好ましくは２０〜５０ｇ／ｌ添加し、ｐＨを至適値例えば５．６〜５．８に調節した後、培地固化剤を加える（以下、固体培地とはゲランガムで固化した培地をいう。また培地とは、特にことわりの無い限りは固体培地をいう。）。培地固化剤としてはゲランガムが好ましく、その添加量は２〜４ｇ／ｌである。その後、この培地を高圧高温条件下で滅菌する。この滅菌条件は、好ましくは温度１１５〜１２５℃、１０〜３０分である。
【００１７】
この実施例では、培地にショ糖を３０ｇ／ｌ添加し、ｐＨを５．７に調節した後、ゲランガム３ｇ／ｌを加えた。滅菌条件は温度１２１℃、期間２０分の高圧高温条件とした。
【００１８】
（３） 次いで、２ｉｐを１〜４０μＭ、特に２ｉｐを２０μＭ含む滅菌ｍ１／２ＭＳ培地にカネフォラ種の葉切断組織片を植え付け、９〜１２週間培養することによって（概ね３週間毎に同一組成の新鮮培地に移植）、不定胚を誘導し、４−ＣＰＰＵを１μＭと２，４−Ｄを５μＭ含む滅菌ｍ１／２ＭＳ培地にアラビカ種の葉切断組織片を植え付け、３〜９週間培養することによって（概ね３週間毎に同一組成の新鮮培地に移植）、カルスを誘導した。誘導した不定胚やカルスは特にことわりのない限り、同一組成の新鮮培地に移植して増殖を促し、遺伝子組換えの材料として用いた。
【００１９】
不定胚やカルスの誘導培養条件は、従来のコーヒー属植物組織培養（例えばＢｅｒｔｈｏｕｌｙ ａｎｄ Ｍｉｃｈａｕｘ−Ｆｅｒｒｉｅｒｅ， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ４４： １６９−１７６， １９９６） で用いられている条件と同じであってよく、例えば温度は２５〜２８℃である。この培養は好ましくは暗所で行う。この実施例では、培養は２５℃暗黒条件下で行った。この培養は、巨視的に細胞分裂の促進、すなわち培養細胞塊の誘導が確認できる程度の期間（約２から３０日間）、継続して行うことが望ましい。
【００２０】
実施例２（形質転換用の発現ベクターの構築）
本実施例では、既に本発明者らが単離・解析した（Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６： ８２１３−８２１８， ２００１）７−メチルキサンチンメチル化酵素（テオブロミン合成酵素）をコードする遺伝子であるＣａＭＸＭＴの制御について述べる。この遺伝子ＣａＭＸＭＴ ｃＤＮＡ は、ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０４８７９４ として登録されているものである。遺伝子発現ベクターには様々な種類があり、それらを適宜用いることができるが、本実施例ではｐＩＧ１２１−Ｈｍ（＝ｐＢＩＨ１−ＩＧ）（Ｏｈｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ３１： ８０５−８３１， １９９０）を用いた。遺伝子発現ベクターｐＩＧ１２１−Ｈｍ（＝ｐＢＩＨ１−ＩＧ）は、ＮＯＳプロモータによって制御されるカナマイシン耐性遺伝子、植物において強力な転写活性を示すプロモーターとして知られるカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ ）によって制御されるイントロンを含むＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子、および、ハイグロマイシン耐性遺伝子が組み込まれたベクターである（図１の最上段参照）。したがって一度の操作でこれら３つの遺伝子が植物に組み込まれる。この場合、好ましいターミネーターとしてはＮＯＳターミネーターが組み込まれている。ＣａＭＸＭＴ発現制御のために改良ベクター（図１の第２〜４段参照）を次の手順で構築した。
【００２１】
（１） ＣａＭＸＭＴの３３２ｂｐ 断片（９４６ｂｐ から１２７７ｂｐ間）：Ａ、１６１ｂｐ 断片（１１１７ｂｐから１２７７ｂｐ間）：Ｂ、および１３９ｂｐ 断片（１１３９ｂｐから１２７７ｂｐ間）：Ｃをそれぞれ増幅した。また、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子の５１７ｂｐ 断片（３４３６ｂｐから３９５２ｂｐ間）：ＤをＲＮＡｉコンストラクトのリンカーとして増幅した。
【００２２】
なお、ＣａＭＸＭＴ発現制御に用いる遺伝子断片およびＲＮＡｉコンストラクトのリンカーとして用いる遺伝子断片は上記領域に限定されず、またＣａＭＸＭＴの塩基置換などの変異配列を含めて適宜変更することができる。
【００２３】
（２） ｐＢＩＨ１−ＩＧのイントロンを含むＧＵＳ遺伝子を制限酵素（Ｘｂａ ＩおよびＳａｃ Ｉ ）で切断した後、断片Ａをアンチセンス配列としてここに組み込んだ。こうして得られた改良ベクターを便宜上ｐＢＩＨ１−ａｎｔｉｓｅｎｓｅＣａＭＸＭＴ とする。
【００２４】
（３） ｐＢＩＨ１−ＩＧのイントロンを含むＧＵＳ遺伝子を制限酵素（Ｘｂａ ＩおよびＳａｃ Ｉ ）で切断した後、断片Ａをセンス配列、断片Ｄをリンカー配列、断片Ａをアンチセンス配列としてここに組み込んだ。こうして得られた改良ベクターを便宜上ｐＢＩＨ１−ＲＮＡｉ １ＣａＭＸＭＴとする。
【００２５】
（４） ｐＢＩＨ１−ＩＧのイントロンを含むＧＵＳ遺伝子を制限酵素（Ｘｂａ ＩおよびＳａｃ Ｉ ）で切断した後、断片Ｂをセンス配列、断片Ｄをリンカー配列、断片Ｃをアンチセンス配列としてここに組み込んだ。こうして得られた改良ベクターを便宜上ｐＢＩＨ１−ＲＮＡｉ ２ＣａＭＸＭＴとする。
【００２６】
図１中、ｎｏｓ−ｐｒｏはＮＯＳプロモータ、Ｋｍ ｒはカナマイシン耐性遺伝子、３５Ｓ−ｐｒｏ は３５Ｓプロモーター、ｉｎｔｒｏｎ−ＧＵＳはイントロンを含むＧＵＳ、ｎｏｓ−ｔｅｒはＮＯＳターミネーター、Ｈｙｇ ｒはハイグロマイシン耐性遺伝子、←Ａはアンチセンス配列、Ｓ→はセンス配列をそれぞれ意味する。
【００２７】
実施例３（アグロバクテリウム細菌による遺伝子導入）
こうして得られた発現ベクターをアグロバクテリウム法による遺伝子導入操作に供する。アグロバクテリウム法による遺伝子導入は常法によって行ってよい。植物組織への外来遺伝子導入はアグロバクテリウムのバイナリーベクター法により行うことができる。アグロバクテリウム細菌およびベクターには多くの種類があり、それらを適宜用いることができるが、本実施例においては、コーヒー植物の形質転換に有効であると報告されている（Ｈａｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１９： １０６−１１０， １９９９）アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ）の１種であるＥＨＡ１０１（Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １６８： １２９１−１３０１， １９８６）を用いた。遺伝子発現ベクターとしては、ｐＩＧ１２１−Ｈｍ（＝ｐＢＩＨ１−ＩＧ）の改良ベクターである、実施例２で構築したベクター、ｐＢＩＨ１−ａｎｔｉｓｅｎｓｅＣａＭＸＭＴ、ｐＢＩＨ１−ＲＮＡｉ １ＣａＭＸＭＴ およびｐＢＩＨ１−ＲＮＡｉ ２ＣａＭＸＭＴ を用いた。
【００２８】
コーヒー属植物への遺伝子導入に先立ち、各ベクターをエレクトロポーレーション法によりアグロバクテリウム細菌：ＥＨＡ１０１に組み込む。ベクターを組み込んだアグロバクテリウム細菌を抗生物質であるカナマイシンおよびハイグロマイシンを含む培地で増殖させ、アグロバクテリウム懸濁液を調製する。
【００２９】
本実施例ではアラビカ種の遺伝子導入例を示す。手順は以下の通りである。（１） 前述の実施例１に従って誘導したアラビカ種のカルスを実施例１と同一培地条件（２５℃、暗黒下）で培養し、増殖させた。
【００３０】
（２） ベクターを組み込んだアグロバクテリウム細菌を抗生物質カナマイシンおよびハイグロマイシンを１００ｍｇ／ｌの濃度で含む培地で増殖させ、６００ｎｍにおける光学濃度（Ｏ．Ｄ．）値約０．５のアグロバクテリウム懸濁液を調製した。この懸濁液にカルスを３０分間浸漬した後、滅菌したろ紙上で水分を除いた。その後好ましくはアセトシリンゴン（遺伝子発現誘導剤）５０ｍｇ／ｌを添加した固体ｍ１／２ＭＳ（４−ＣＰＰＵを１μＭおよび２，４−Ｄ を５μＭ含有）で１日培養する。
【００３１】
（３） アセトシリンゴン含有培地で培養後のカルスをアグロバクテリウム細菌の除菌剤としてセフォタキシン３００ｍｇ／ｌを添加した液体ｍ１／２ＭＳ培地で洗浄後、セフォタキシン３００ｍｇ／ｌと抗生物質としてハイグロマイシンを５０ｍｇ／ｌの濃度で添加した固体ｍ１／２ＭＳ（４−ＣＰＰＵを１ μＭおよび２，４−Ｄ を５ μＭ含有）で培養、次いでセフォタキシンを除き、抗生物質を１００ｍｇ／ｌ の濃度で添加した培地で約２ヶ月間培養以降（３週間毎に同一組成の培地に移植する）、順次形質転換体を得た。
【００３２】
実施例４（導入遺伝子の確認）
前述の通り、得られた形質転換体が抗生物質耐性を示すことは、例えばハイグロマイシン耐性遺伝子が導入され、発現したことを示している。また、ゲノムＤＮＡ を抽出し、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ）法によっても外来遺伝子の導入を確認している。例えばハイグロマイシン耐性遺伝子は、５−ＧＣＧＴＧＡＣＣＴＡＴＴＧＣＡＴＣＴＣＣ−３、５−ＴＴＣＴＡＣＡＣＡＧＣＣＡＴＣＧＧＴＣＣ−３のプライマー対により増幅された。ＰＣＲは９４℃で５分間熱変性後に、熱変性：９４℃、３０秒、アニーリング：５８℃、３０秒、伸長反応：７２℃、３０秒、３０サイクルで行った。非形質転換体には増幅されるＤＮＡ 断片が認められないのに対して、形質転換体には７１３−ｂｐのハイグロマイシン耐性遺伝子断片を示す明瞭なバンドが確認された。
【００３３】
実施例５（ＣａＭＸＭＴ発現の確認）
得られた形質転換体について、アンチセンス法やＲＮＡｉ法で抑制した遺伝子であるＣａＭＸＭＴ発現様式をＲｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ （ＲＴ）−ＰＣＲ法により確認した。これを図２に示す。トータルＲＮＡを抽出した後、ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ （ＡＭＶ） Ｖｅｒ．２．１ （Ｔａｋａｒａ）によってｃＤＮＡを合成した。ＣａＭＸＭＴは ５−ＴＣＣＴＡＣＡＡＴＣＴＧＧＣＴＣＴＴＧＣ−３ 、５−ＴＧＣＴＴＴＡＡＴＴＴＧＴＴＣＡＴＧＧＧＡＴＣ−３ のプライマー対により増幅された。ＰＣＲは熱変性：９４℃、３０秒、アニーリング：５８℃、３０秒、伸長反応：７２℃、１分間、２４サイクルで行った。
【００３４】
図２に示すように、非形質転換体では明瞭なバンドが検出されるのに対して（レーン１）、選抜されたＲＮＡｉ形質転換体（ｐＢＩＨ１−ＲＮＡｉ １ＣａＭＸＭＴ導入：レーン２，３）およびアンチセンス形質転換体（ｐＢＩＨ１−ａｎｔｉｓｅｎｓｅＣａＭＸＭＴ 導入：レーン４）について検出されるバンドは明らかに薄い傾向を示した。中でも、例えばＲＮＡｉ形質転換体（レーン２）ではバンドがほとんど検出されなかった。これは選抜された形質転換体のＣａＭＸＭＴ発現が強く抑制されていることを示している。
【００３５】
実施例６（ＨＰＬＣによる内生テオブロミン、カフェイン量の定量）
得られた形質転換体についてＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）分析法によって内生のプリンアルカロイドであるテオブロミンおよびカフェインの含量を調べた。分析用のプリンアルカロイドは、以下の熱水抽出法により得た。生重量で概ね１００ｍｇの植物組織、カルスなどを８０℃、１ｍｌの超純水にて２０分間煮沸する工程を２回繰り返した。抽出溶液を孔径０．２μｍのメンブレンフィルターによりろ過し、分析試料とした。ＨＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ ６００Ｅ ）を用い、メチルアルコール：水＝２０：８０、すなわち２０％メチルアルコール溶液によりプリンアルカロイド類を分離した。カラムはＷａｔｅｒｓ Ｐｕｒｅｓｉｌ Ｃ１８（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）を用いた。独立した３試料より抽出を行い各抽出試料につき３回分析を行い、９回のＨＰＬＣ分析値の平均値（標準偏差）を求めた。分析結果を表１に示す。
【００３６】
【表１】
【００３７】
表１から分かるように、形質転換体の内生テオブロミンおよびカフェイン量は、有意に減少しており、特に２および３のＲＮＡｉ形質転換体においてカフェインは検出されなかった。この結果は実施例５の図２に示す結果と一致するものであり、本発明によってＣａＭＸＭＴ発現が強く抑制され、カフェインを含まないコーヒー形質転換体が得られたことを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、形質転換用の発現ベクターおよびその改良ベクターを模式的に示す図である。
【図２】図２は、得られた形質転換体について、アンチセンス法やＲＮＡｉ法で抑制した遺伝子であるＣａＭＸＭＴ発現様式をＲｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ （ＲＴ）−ＰＣＲ法により確認したことを示すものである。
Claims (3)
- カフェイン生合成関連酵素をコードする遺伝子のアンチセンス配列またはＲＮＡｉ配列を作製し、形質転換用の発現ベクターを構築する工程と、 得られた発現ベクターをアグロバクテリウムに導入する工程と、
コーヒー植物の細胞分裂の活性化した組織片、またはコーヒー植物の組織片から誘導したカルスもしくは不定胚を上記アグロバクテリウムに感染させることにより上記組織片、カルスまたは不定胚の形質転換を行う工程と、
形質転換された組織片、カルスまたは不定胚から形質転換コーヒー植物体を得る工程とを含む、
遺伝子組換えによるカフェインレスコーヒー植物の製造方法。 - カフェイン生合成関連酵素がキサントシンメチル化酵素、ヌクレオシド脱リボース酵素、７−メチルキサンチンメチル化酵素または３，７−ジメチルキサンチンメチル化酵素である、請求項１記載のカフェインレスコーヒー植物の製造方法。
- 請求項１または２記載の方法により作製された、形質転換コーヒー植物。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
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Families Citing this family (3)
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Family Cites Families (3)
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2005
- 2005-01-14 US US10/521,244 patent/US20080127373A1/en not_active Abandoned
Cited By (2)
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