CZ295397B6 - Čistá xanthosin-N7-methyltransferáza, geneticky obměněný kávovník, čistá DNA sekvence kódující expresi této transferázy a způsob produkce kofeinu prosté zrnkové kávy - Google Patents

Abstract

Čistá xanthosin-N.sup.7.n.-methyltransferáza, užívající S-adenosylmethionin jako substrát, mající charakteristické tryptické fragmenty A, B a C definované na obr. 4. Tato transferáza s výhodou sestává z aminokyselinové sekvence definované na obr. 6. Geneticky obměněný kávovník, jehož obměna je založena na transformaci DNA sekvencí eliminující syntézu výše uvedené transferázy. Čistá DNA sekvence, která kóduje expresi výše uvedené transferázy zvolená ze souboru sestávajícího ze (a) sekvence definované na obr. 5, (b) sekvencí DNA, které hybridizují k sekvenci podle odstavce (a), přičemž hybridizující sekvence sestávají ze sekvencí, které jsou komplementární k sekvenci podle odstavce (a) a c) sekvencí DNA, které jsou degenerovány vzhledem k výše uvedeným sekvencím. Způsob produkce kofeinu prosté zrnkové kávy, při němž se a) transformuje kávovník DNA sekvencí, která je antisenze jak k sekvenci DNA definované na obr. 5, tak k sekvenci DNA, která kóduje expresi proteinové definované na obr. 6 a popřípadě se b) sklízejí plody transformovaného kávovníku.ŕ

Description

Čistá xanthosin-N⁷-methyltransferáza, geneticky obměněný kávovník, ěistá DNA sekvence kódující expresi této transferázy a způsob produkce kofeinu prosté zrnkové kávy

Oblast techniky

Vynález se týká čisté xanthosin-N⁷-methyltransferázy, geneticky obměněného kávovníku, čisté DNA sekvence kódující expresi této transferázy a způsob produkce kofeinu prosté zrnkové kávy. Především se vynález týká čištěných proteinů, rekombinantních DNA sekvencí, které protlačují expresi kofeinu v rostlinách kávovníku a v plodech z nich sklizených. Způsobem podle vynálezu se produkují stálé linie kofeinu prostých kávovníkových rostlin, jejichž plody po pražení a mletí se mohou používat pro přípravu kávy prosté kofeinu. Očekává se, že obdobně se vynálezu použije k otlačení syntézy kofeinu v čaji (Camellia sinensis) a v kolách (Cola acuminata), jehož také příbuzných alkaloidů v čokoládě (Tjeobroma cacao).

Dosavadní stav techniky

Káva se připravuje z pražených a mletých zrn rostliny rodu Coffea, obecně druhu C. arabica. Rostliny kávovníku produkují alkaloid kofein, který je obsažen v sušených plodech v kávových zrnech. Jelikož četní spotřebitelé dávají přednost kávě bez kofeinu, byly vyvinuty četné způsoby k odstraňování kofeinu z kávovníkových zrn. Všechny tyto způsoby vedou k odstranění i jiných látek než kofein ze zrn, čímž se nepříznivě ovlivňuje několik málo přírodně se vyskytujících kávovníkových rostlin prostých kofeinu a příbuzných druhů (Mascarocoffea spp. a Coffea bengalensis), nemají tyto druhy obchodní význam (Charrier a Berthaud, „Variation Of Caffeine Content in Thea Coffea Genus“, Café' Cacao the', 14, str. 251 až 264, 1975). Proto se hledá způsob produkce kofeinu prostých kávovníkových zrn, u kterých by nebylo nutno odstraňovat ze zrn jiné látky než kofein.

Kofein je přírodní čistý alkaloid produkovaný například kávovníkovými a čajovníkovými rostlinami. Je domněnka, že syntéze kofeinu chrání rostliny před hmyzem. Kávovníkové rostliny syntetizují kofein z nukleosidu xanthosinu ve čtyřech následných reakcích, jak je zřejmé z obr. 1 (Suzuki T., Ashihara H. a Waller G.R., Phytochemistry 31, str. 2575, 1992). Prvním stupněm je methylace nukleosidu xanthosinu S-adenosylmethioninem, která se katalyzuje enzymem xanthosin-N⁷-methyltransferáza (XMT). Produkt, 7-methylxanthosin, se hydrolyzuje (odstraňuje se ribóza) ze získání 7-methylxantinu, který se dále methyluje za získání theobrominu a kofeinu. Očekává se, že přerušení tohoto sledu syntézních reakcí bude blokovat syntézu kofeinu.

Proto je strategií selektivní eliminace kofeinu k kávovníkových rostlin předcházet syntéze specifických enzymů uplatňujících se na kofeinové biosyntetické dráze. Podle jednoho provedení se vynález týká genetické obměny kávovníkových rostlin k eliminaci syntézy XMT. Podle výhodného provedení se syntéza XMT, potlačuje transformací kávovníkových rostlin DNA sekvencí, která kóduje transkripci mediátorové RNA (mRNA), která je antisenze k mRNA, jež kóduje expresi XMT. Kromě kávy se obecně může vynález využít i při výrobě jiných kofeinu prostých nápojů a potravinových produktů, včetně čaje, kakaa a jiných nápojů nebo potravin na bázi kakaa.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je čistá xanthosin-N⁷-methyltransferáza (XMT), užívající S-adenosylmethionin jako substrát, mající charakteristické tryptické fragmenty A, B a C definované na obr. 4.

-1 CZ 295397 B6

Ve výhodném provedení sestává tato transferáza z aminokyselinové sekvence definované na obr. 6.

Předmětem vynálezu je dále také geneticky obměněný kávovník, jehož obměna je založena na transformaci DNA sekvencí eliminující syntézu xanthosin-N⁷-methyltransferázy podle uvedeného výše. Pod označením „kávovník“ se rozumějí i jeho části, jako jsou s výhodou plody nebo zrna.

Předmětem vynálezu je dále také čistá DNA sekvence, která kóduje expresi xanthosin-N⁷methyltransferázy zvolená ze souboru sestávajícího ze (a) sekvence definované na obr. 5, (b) sekvencí DNA, které hybridizují k sekvenci podle odstavce (a), přičemž hybridizující sekvence sestávají ze sekvencí, které jsou komplementární k sekvenci podle odstavce (a) a (c) sekvencí DNA, které jsou degenerovány vzhledem k výše uvedeným sekvencím.

Ve výhodném provedení je tato DNA sekvence klonujícím vehikulem.

Předmětem vynálezu je dále také způsob produkce kofeinu prosté zrnkové kávy, jehož podstata spočívá v tom, že se (a) transformuje kávovník DNA sekvencí, která je antisenze jak j sekvenci DNA definované na obr. 5, tak k sekvenci DNA, která kóduje expresi proteinové definované na obr. 6 a popřípadě se (b) sklízejí plody transformovaného kávovníku. V podstatě čistá xanthosin N⁷-methyltransferáza spočívá podle vynálezu v tom, že

a) se methyluje xanthosin v poloze 7 purinového kruhu,

b) obsahuje tryptické fragmenty s aminokyselinovou sekvencí.

Vynález se tedy týká čištěných proteinů, sekvencí DNA, které kódují jejich expresi a rekombinantní DNA molekuly, včetně jimi transformovaných hostitelů pro transformaci kávovníkových rostlin k potlačení exprese kofeinu. Sekvence DNA a rekombinantní DNA sekvence a rekombinantní DNA molekuly jsou charakterizovány tím, že kódují expresi enzymu xanthosin-N⁷methyltransferáza (XMT), který je prvním stupněm na cestě syntézy kofeinu v kávovníkové rostlině. Uvádí se základní sekvence takové DNA a předvídaná aminokyselinová sekvence XMT.

Kávovníkové rostliny se transformují DNA molekulami, které kódují transkripci mRNA, která je antimediátorová se zřetelem na mRNA, která kóduje expresi alespoň jednoho enzymu na cestě biosyntézy kofeinu. Antimediátorová RNA se váže na XMT mRNA, čímž inaktivuje mRNA kódující první stupeň na cestě kofeinové syntézy. Výsledkem je, že tranformované rostliny jsou neschopné syntetizovat kofein, přičemž jiný metabolismus rostliny není dotčen.

Vynález blíže objasňuje následující podrobný popis a obrázky.

-2CZ 295397 B6

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 je schéma kofeinové biosyntetické dráhy v Cofea arabica.

Na obr. 2 je polyakrylamidový stříbrem obarvený gel SDS PAGE čištěné xanthosin-N⁷methyltransferázy.

Na obr. 3 je denzitometrický diagram eluce tryptických fragmentů čištěné xanthosin-N⁷methyltransferázy po chromatografíckém dělení HPLC.

Na obr. 4 je popis oligonukleotidových primerů použitých je skrínování cDNA knihovny cNDA kódující xanthosin-N⁷-methyltransferázu.

Na obr. 5 je sekvence bází cDNA, která kóduje xanthosin-N⁷-methyltransferázu.

Na obr. 6 je předpověděná aminokyselinová sekvence xanthosin-N⁷-methyltransferázy.

Význam v textu používaných výrazů je následující:

Nukleotid-je monomemí jednotka DNA nebo RNA obsahující cukerný podíl (pentózu), fosfát a dusíkatou heterocyklickou bázi. Báze je vázána na cukerný podíl glykosidickým uhlíkem (1'uhlík pentózy) a tato kombinace báze a cukru se nazývá nukleosid. Báze charakterizuje nukleosid. Čtyři DNA báze jsou adenin („A“), guanin („G“), cytosin („C“) a thymin („T“). Čtyři RNA báze jsou A, G, C a uráčil („U“).

DNA sekvence-je lineární seřazení nukleotidů navzájem spojených fosfodiesterovými vazbami mezi uhlíkem 3'a 5' přilehlých pentóz.

Kodon-je DNA sekvence tří nukleotidů (triplet), který kóduje prostřednictvím mRNA aminokyselinu, translační startovací signál nebo translační koncový signál. Například nukleotidové triplety TTA, TTG, CTT, CTA a CTG kódují aminokyselinu leucin („Leu“), TAG, TAA a TGA jsou translační stop signály a ATG je translační startovací signál, který také kóduje aminokyselinu methionin („MET“).

Polypeptid-je seřazení aminokyselin spojených navzájem peptidovými vazbami mezi aminoskupinami a karboxylovými skupinami sousedních aminokyselin.

Genom-jsou veškeré DNA buňky nebo viru. Zahrnuje kromě jiného strukturální gen kódující polypeptidy substance, jakož také promotor iniciace transkripce a translace a terminačních míst.

Gen-je DNA sekvence, která kóduje prostřednictvím své matrice nebo mediátoru RNA („mRNA“) sekvenci aminokyselin charakteristickou pro specifický polypeptid.

Transkripce - je proces produkce mRNA z genu nebo z DNA sekvence.

Translace - je proces produkce polypeptidu z mRNA.

Exprese - je proces podléhající genu nebo DNA sekvenci k produkci polypeptidu. Je kombinací transkripce a translace.

Plazmid-je monochromozomální dvouřetězcová DNA sekvence obsahující nedotčený „replikon“, takže se plazmid replikuje v hostitelské buňce. Když se plazmid vnese do jednobuněčného organismu, mohou se charakteristické vlastnosti organismu změnit nebo transformovat v důsledku působení plazmidu. Například plazmid nesoucí gen odolnosti proti tetracyklinu (TETR)

-3CZ 295397 B6 transformuje buňku dříve citlivou na tetracyklin na buňku, která je odolná k tetracyklinu. Buňka, transformovaná plazmidem, se nazývá „transformant“.

Fág nebo bakteriofág - je bakteriální virus, z nichž mnohé sestávají z DNA sekvencí zapouzdřených v proteinovém obalu nebo plášti („kapsid“).

Klonující nosič je plazmid, fág DNA, kozmid nebo jiná sekvence DNA, která je schopná replikace v hostitelské buňce, charakterizovaný jedním nebo malým počtem endonukleázových rozpoznávacích míst, ve kterých se takové DNA sekvence mohou odříznout určujícím způsobem bez očekávané ztráty podstatné biologické funkce DNA, to je replikace, produkce obalovacích proteinů nebo bez ztráty promotujících nebo vázacích míst a obsahující signální znak vhodný pro použití při identifikaci transformovaných buněk, například k tetracyklinu nebo ampicilinu odolných buněk. Klonující nosič je často označován jako vektor.

Klonování-je proces získání populace organismů nebo DNA sekvencí odvozených od jednoho takového organismu nebo sekvence nepohlavní reprodukcí.

Rekombinantní DNA molekula nebo hybrid DNA - je molekula sestávající ze segmentů DNA z rozdílných genomů, které jsou spojeny svými konci vně žijících buněk a jsou schopny se udržet v živých buňkách.

cDNA je DNA řetězec, komplementární k mRNA, kteiý kóduje určitý polypeptid.

Jakkoliv se strategie produkce kofeinu prosté kávy může generalizovat na jiné enzymy na cestě syntézy kofeinu v kávovníkové rostlině a v jiných rostlinách produkujících kofein, podle výhodného provedení vynálezu se potlačuje exprese prvního provedení vynálezu se potlačuje exprese prvního jedinečného enzymu na cestě xanthosin-N⁷-methyltransferázy (XMT). Jakkoliv byla objasněna úloha XMT při syntéze kofeinu radiovým značením prekurzorů až dosud nebyl enzym izolován ani nebyla zjištěna jeho aminokyselinová sekvence. Vynález se proto týká v podstatě izolovaného XMT. Vynález se dále týká aminokyselinové sekvence tryptických fragmentů izolovaných z čištěného XMT. Vynález se dále týká aminokyselinové sekvence tryptických fragmentů izolovaných z čištěného XMT.

Syntetizují se nukleotidové sondy cDNA na bázi podílů aminokyselinové sekvence, získané ze vzorku izolovaného enzymu a část genu se zesílí za použití PCR. Produkty PCR se použijí ke skrínování cDNA knihovny syntetizované z mladých lístků mRNA k identifikaci transkriptů kódujících XMT. Pozitivní transkripty se sekvencují a získá se přibližně 90 % genu kódujícího XMT.

Začlení se DNA, která kóduje expresi XMT, do pBI-121 transformačního vektoru, který zahrnuje gen odolný ke kanamycinu. Úspěšné vnesení vektoru do buněk rostliny se monitoruje získáním odolnosti k antibiotiku. Použijí se konstrukty k transformaci somatických embryí kávovníku do tkáňové kultury. Transformovaná embrya se pak nechají růst v nové kávovníkové rostlině, která neprodukuje kofein. Přírodní cestou kofeinu zbavená káva se připravuje z pražených mletých plodů těchto nových rostlin.

Čerstvá listová tkáň z mladých lístků C. arabika se tedy maceruje a extrahuje se z nich protein. Na sloupci čištěné extrakty se zkoušejí se zřetelem na enzymatickou aktivitu monitorováním methylace xanthosinu za použití C¹⁴ značeného S-adenosylmethioninu jakožto substrátu. Potvrzuje se, že reakčním produktem je 7-methylxanthosin porovnáním migrace značeného reakčního produktu s migrací 3-methylxanthinu, 7-methylxanthinu, 8-methylxanthinu, 7methylxanthosinu, xanthinu a xanthosinu v každém ze čtyř odlišných chromatografických systémů.

-4CZ 295397 B6

Stanovuje se čistota proteinových izolátů za použití SDS PAGE elektroforézy a dvourozměrové gelové elektroforézy. Zabarvení stříbrem jednorozměrových SDS Page gelů naznačuje přítomnost dubletu s enzymatickou aktivitou XMT, s molekulární hmotností 36-37 kiloDaltonů (kD), jak je zřejmé z obr. 2. Každý protein se dále štěpí izoelektrickým zaostřením. Získané hodnoty udávají obsah izozymů XMT, který může být výsledkem posttransformační modifikace proteinu; nebo může být genovou rodinou kódující XMT enzymy.

Dublet zviditelněný na SDS PAGE gelech se používá pro sekvencování proteinu. Čištěný XMT se podrobuje parciální tryptické digesci k vytvoření fragmentů pro další analýzu; rozliší se tři píky za použití chromatografie HPLC. Sekvencování provedla univerzitní laboratoř Protein Structure Laboratory of the University of Califomia, Davis za použití automatizovaného Edmanova odbourávání (Edman P. a Begg G., Eur. J. Biochem. 1, str. 80). Rozlišily se dvě jedinečné sekvence a použily se pro konstruování primerů pro syntézu nukleotidové sondy. Extrahuje se RNA z lístků kávovníku. Z extraktu se izoluje mRNA obsahující poly(A⁺)mRNA za použití reverzní transkriptázy. Připraví se dvouřetězcová DNA za použití DNA polymerázyl a izoluje se srážením. Frakcionuje se cDNA a včlení se do fágu k zesílení. Knihovna cDNA se skrínuje PCR syntetizovanou nukleotidovou sondou produkovanou za použití primerů na bázi DNA sekvence očekávané z aminokyselinové sekvence izolované XMT. Klonově produkovaná cDNA obsahující všechny sekvence kódující XMT se identifikuje.

Používá se cDNA odpovídající genu kódujícímu XMT k transformaci embryonických kávovníkových rostlin. Jakožto transformačního vektoru se používá pBI-121. Sekvence, odpovídající DNA kódující expresi XMT, se začlení do plazmidu v převrácené orientační přiléhající ke promotoru květákového mozaikového viru 35S. Z něho transkribovaná DNA bude komplementární k mRNA, která kóduje aminokyselinovou sekvenci XMT. Kompletní konstrukty se zesílí v bakteriálních hostitelech. Hostitelé se rozruší a zesílený vektor se váže na koloidní částice zlata. Částice zlata s ulpělým vektorem se včlení do protoplastů kávovníkové rostliny hnaním velikou rychlostí částic do buněk, jak je popsáno v americkém patentovém spise číslo US 5 107 065. Úspěšné transformované mladé rostliny se identifikují prostřednictvím odolnosti k antibiotikům. Transformované rostliny neprodukují kofein.

Vynález blíže objasňují, aniž nějak omezují následující příklady praktického provedení vynálezu.

Příklad provedení vynálezu

Příklad 1

Izolace xanthosin-N⁷-methyltransferázy z kávovníkových lístků C. arabica L. cv Guatamalan

Tkáně mladých lístků o délce alespoň 5 mm (ekvivalent B3 stadiu) (Frischknecht P.M., UlmerDufek J. a Baumann T.W., Phytochemistry 25, str. 613, 1986) se seberou ze tří keřů rostoucích ve výzkumné stanici univerzity University of Hawai Waimanalo Research Station, Oahu, Hawai). Lístky se bezprostředně ponoří do tekutého dusíku a až do použití se uloží při teplotě -70 °C. Všechny následující procedury se provádějí při teplotě 4 °C, pokud není uvedeno jinak. Lístková tkáň (150 g) se maceruje ve hmoždíři paličkou v prostředí tekutého dusíku za stálého mrazení, převede se do předem ochlazeného mlýnku na kávu pro domácnost a mele se s malými kousky suchého ledu po dobu přibližně 30 sekund. Prášková tkáň se vnese do kádinky obsahující 1,5 litru studené směsi ledu a 80% acetonu, 5 mM thiomočoviny a 12,5 mM β-merkaptoethanolu. Míchá se magnetickým míchadlem po dobu 45 minut, tkáň se oddělí filtrací ve vakuu na Bůchnerově nálevce obsahující filtrační papír Whatman č. 1. Tkáň e promyje 2,5 litry 80% ledově studeného acetonu obsahujícího thiomočovinu a β-merkaptoethanol, jak shora uvedeno, suší se na vzduchu po dobu 20 minut a lyofilizuje se po dobu 48 hodin.

-5CZ 295397 B6

Získaný acetonový prášek se homogenizuje v mísiči se 400 ml extrakčního pufru (EB) (0,1 M PIPES [hodnota pH 7,0], 0,5 mM Na₂EDTA, 0,5 mM Na₂EGTA, 5 % kyseliny askorbové, 5 mM dithiothreitolu (DTT), 5 mM thiomočoviny, 12 mM L-cystein HC1, 1 % polyethylenglykolu (PEG) 20 000, 0,1 mM fenylmethylsulfonylfluoridu (PMSF) a 20 g polyvinylpolypyrrolidonu (PVPP). Suspenze se homogenizuje po dobu 10 minut střední rychlostí, převede se do odstředivkových kyvet obsahu 250 ml a odstřeďuje se při 23 OOOxg po dobu 30 minut v rotoru GSA (DuPont-Sorvall).

Získaných 350 ml surového supematantu se vnese do 40% nasyceného síranu amonného (AS) v průběhu 30 minut pomalým přidáváním 79,86 g AS prášku za míchání v kádince obklopené ledem. Směs se opět převede do odstředivkových kyvet o obsahu 250 ml a odstřeďuje se při 23 OOOxg po dobu 30 minut, jak shora uvedeno. Získaných 350 ml supematantu se převede do 40 ml Macro-Prep (Bio-Rad)methylového hydrofobního interakčního chromatografíckého (HIC) sloupce při průtokové rychlosti 2,5 ml/min. Všechny frakce sloupce se monitorují se zřetelem na protein za použití absorbance 280 nm. Sloupec se promyje předvyvažujícím pufrem, obsahujícím 1,7 M AS, 20 mM bis-tris-propanu (hodnota pH 6,8) a 5 mM DTT až do nastavení základní čáry blízké nule. Sloupec se stripuje pufrem obsahujícím 10 mM tris (hodnota pH 7,0) a 5 mM DTT a 1 mM MgCl₂. Prvních 15 ml ze sloupce se vyhodí a zbylý eluát (200 ml) se vnese za využití tíže na lOOml sloupec modrého afinitního gelu Affi-Gel (100 až 200 mesh, to znamená velikost otvoru ok síta 150 až 75 pm, Bio-Rad), který má barvivo Cibacronová modř F3GA kovalentně vázané na matrici. Gel se předběžně vyváží plnicím pufrem 10 mM tris (hodnota pH7,0), 5 mM DTT, 1 mM MgCl₂. Sloupec se promyje extenzivně tímto plnicím pufrem až do stabilizace základní čáry v blízkosti nuly a vázané proteiny se eluují pufrem obsahujícím 10 mM tris (hodnota pH 7,0), 5 mM DTT a 1,5 M chloridu sodného (NaCl).

Do 142 ml eluátu modrého gelového sloupce Affi-Gel se vnese 1,7 M AS pomalým přidáváním 31,8 g AS prášku za míchání v průběhu 30 minut v kádince obklopené ledovou lázní. Suspenze se odstřeďuje v odstředivkových kyvetách o obsahu 250 ml při 23 OOOxg po dobu 30 minut, jako shora uvedeno, a supernatant se vnese na sloupec FPLC fenyl-Sepharose XK 26/20 (Pharmacia) při teplotě 23 °C. Sloupec se předběžně vyváží pufrem obsahujícím 20 mM bis-tris-propanu (hodnota pH 6,8), 5 mM DTT a 1,7 M AS. Když se základní čára ustálí v blízkosti nuly, eluují se proteiny ze sloupce ve 40 minutovém reverzním gradientu 1,7 MAS až 0MAS při průtočné rychlosti 5 ml/min za shromažďování 1 minutových frakcí. Eluční pufr 0 M AS obsahuje 10 mM tris (hodnota pH 7,0), 5 mM DTT a 1 mM MgCl₂.

Zkouška aktivity shromážděných frakcí naznačuje, že se většina enzymatické aktivity xanthosinN⁷-methyltransferázy koncentruje ve frakcích 49 až 54. Tyto frakce se spojí konečného objemu 30 ml a vnesou se na 6ml ATP-agarózový sloupec (Sigma Chemicals, A2767) využitím tíže při teplotě 4 °C. Sloupec se předběžně vyváží lOmMtris (hodnota pH7,0), 5 mMDTT a 1 mM MgCl₂. Po stabilizaci bazické čáry se sloupec stripuje 20 ml předběžně vyvažujícím pufrem obsahujícím 100 μΜ xanthosinu a promyje se přídavnými 40 ml předběžně vyvažujícího pufru. Oba eluáty sloupce se spojí a vnesou se na sloupec Mono-P HR 5/20 FPLC (Pharmacia) předběžně vyvážený 25 mM bis-tris (hodnota pH 6,0) a 9 % betainu při teplotě 23 °C. Po stabilizaci získání čáry se sloupec eluuje 100 ml pufru Polybuffer74 (10ml:90ml vody, objem/objem) (hodnota pH 4,0) (Pharmacia) a 9 % betainu při průtočné rychlosti 1 ml/min. Shromažďovací zkumavka obsahuje 100 μΐ 0,5 M tricinového pufru (hodnota pH 7,0) a 50 mM DTT, čímž se získá konečná koncentrace v 1 ml 50 mM tricinu (hodnota pH 7,0) a 5 mM DTT v 1 minutové frakci. Tyto ve skutečnosti stabilizují podmínky konečné hodnoty pH pro proteiny eluované za mírně kyselé hodnoty pH ze sloupce Mono-P. Hlavní aktivita xanthosin-N⁷methyltransferázy ve shromažďovacích zkumavkách bez tricinu je ve frakci 15 a 16 gradientu elujícího ze sloupce s hodnotou pH 5,42 nebo 3,35. Je důležité nezmrazovat vzorky proteinu v žádném stadiu izolace, jelikož zmrazování má podstatný negativní vliv na stupeň aktivity xanthosin-N⁷-methy!transferázy.

-6CZ 295397 B6

Příklad 2

Zkouška enzymové aktivity

Připraví se 100 μΐ standardní zkušební směsi obsahující 50mMtricinu (hodnota pH7,0), 1200 μΜ xanthosinu, 5 mM DTT, 7,5 μΜ S-adenosyl-L-[methyl-¹⁴C]methioninu (SAM) (60 mCi/mmol, DuPontNEN) a lmMNa2EDTA. Reakční směs (50 μΐ bez enzymu) se předinkubuje po dobu 10 minut při teplotě 25 °C a reakce se iniciuje přidáním 50 μΐ enzymového roztoku a reakce se nechá probíhat při teplotě 25 °C po dobu jedné hodiny. Na konci inkubační doby se tři 30μ1 podíly reakční směsi odeberou a reakce se ukončí přidáním 8 μΐ 0,6 M chloristé kyseliny (HC1O₄). Totéž se provede pro kontroly v době nula k detekci pravé enzymatické aktivity. Tato směs se odstřeďuje v mikroodstředivce po dobu 5 minut a 19 μΐ supernatantu se smísí s 1,0 μΐ 33 mM 7-methylxanthosinu. Tyto směsi se ve formě skvrn nanesou na chromatografický papír Whatman č. 1 a vyvolají se systémem n-butanol-octová kyselina-voda (n-BuOHHOAc-H₂O) (4:1:1). Poloha 7-methylxanthosinu se stanovuje modrou fluorescencí při expozici v krátkovlnovém ultrafialovém světle. Oblast se odstřihne z chromatogramů a radioaktivita se stanoví scintilačním počtem za použití 3 ml scintilační kapaliny Scinti-verse (Fisher Scientific). Čítači účinnost je 74,7 %. Odečte se pozadí a nespecifická radiace zjištěná v oblasti 7methylxanthosinu vzorků v době nula.

Příklad 3

Identifikace reakčního produktu

Místo demethylace xanthinového jádra se identifikuje hydrolýzou cukru z methylovaného xanthosinového reakčního produktu a separací ve čtyřech odlišných chromatografických systémech. Produkt ze dvou 100μ1 reakcí, provedených jak shora popsáno, a obsahující 6 μΐ 33 mM 7-methylxanthosinu jakožto nosiče, se nanese jako pás na začátek Whatman č. 1 papírového chromatogramů. Chromatogram se vyvolá v systému (n-BuOH-HOAc-H₂O) (4:1:1). Oblast chromatogramů, odpovídající methylovanému xanthosinu, se zjišťuje, jak shora popsáno, rozřeže se na malé kousky, vnese se do sterilní zkumavky a inkubuje se s 35 ml deionizované vody při teplotě 37 °C za třepání přes noc. Extrakt a lyofilizuje se. Vysušený extrakt se znova suspenduje v 1,0 ml deionizované vody, umístí se do skleněné digesční fioly a lyofilizuje se. Vzorek se resuspenduje ve 400 μΐ 1,0 MHC1 a inkubuje se po dobu jedné hodiny při teplotě 100 °C. Digest se lyofilizuje, resuspenduje se ve 400 μΐ 3 mM 7-methylxanthosinu a opět se lyofilizuje. Digest se resuspenduje ve 40 μΐ deionizované vody a 10 μΐ se chromatografuje v každém ze čtyř různých systémů. Na každém chromatogramů pro srovnání je zahrnut 1-methylxanthin, 3-methylxanthin, 7-methylxanthin, 8-methylxanthin, 7-methylxanthosin, xanthin a xanthosin. Používá se následujících chromatografických systémů: Whatman číslo 1 papír vyvolávaný v systému n-BuOH-HOAc-H₂O (4:1:1) a C8 tenkovrstvé destičky (Whatman KC18F) vyvolávané buď v systému izoamylalkohol-voda-acetonitril (41:4:5), ethanol-voda (4:1) nebo v systému terc.-BuOH-HOAc-H₂O (4:1:1). Po zaschnutí se chromatogramy postříkají En³Hance (DuPont NEN), usuší se a vystaví se po dobu 30 dní předběžně osvitnutému rentgenovému filmu Fuj i RXgcu při teplotě -70 °C.

Příklad 4

Identifikace proteinů gelovou elektroforézou

Extrakty, získané shora popsaným způsobem, se používají v jednorozměrných minigelech (ID) SDS-PAGE (hlavní gel: 12,5 % akrylamidu, 0,8 % methylenbisakrylamidu; „stacking“ gel:

7,5 % akrylamidu, 0,21 % methylenbisakrylamidu) smíšením se vzorkovým pufrem Leammli

-7CZ 295397 B6 (Leammli, U.K., Nátuře 227, str. 680, 1970) a ve dvourozměrových minigelech (2D) IEF/SDSPAGE modifikovaným způsobem, který popsal 0'Farell a kol. (0'Farell P.Z., Goodman H.M., OTarell P.H., Cell 12, str. 1133, 1977). Dvourozměrová elektroforéza je umožněna vysrážením proteinů 50 objemy 100% ethanolu v průběhu jedné hodiny a opětným rozpuštěním proteinů v izoelektrickém zaostřovacím (IEF) vzorkovém pufru obsahujícím 5 % amfolinů (1:1, objem/objem, hodnota pH 3 až 10: hodnota pH 5 až 7, LKB-Pharmacia). Poměr originálního proteinového extraktu k IEF vzorkovému pufru se udržuje alespoň 1:2 k zajištění, že veškeré zbylé složky pufru z chromatografíckých stupňů neinterferují sIEF. Stejné vzorky proteionu jako celku (< 20 pg) se nanesou na bazický konec předběžně zaostřených zkumavkových gelů (8,8 % akrylamidu, 1,6 % methylenbisakrylamidu) obsahujících 5 % amfolinů, jak shora uvedeno. Gely se ozáří při 10 000 V-hodin plus přídavně dvě hodiny při 1000 V. Slepé ozářené gely se rozkrájí na 5mm sekce a inkubují se v 0,5 ml 100 mM CaCl₂ po dobu 24 hodin a stanoví se hodnota pH segmentů. Pro analýzu gradient pH IEF gelu se stanovuje v oboru 4,4 až 6,0.

Zkumavkové gely se připraví pro SDS-PAGE krátkým promytím vodou a následným trojím promytím (vždy 10 minut) v horkém Laemmli vzorkovém pufru. Zkumavkové gely se umístí navrch SDS-PAGE gelů (hlavní gel: 12,5 % akrylamidu, 0,8 % methylenbisakrylamidu; „stacking“ gel: 7,5 % akrylamidu, 0,21 methylenbisakrylamidu) a udržuje se na místě s 3 % agarózy ve Laemmlivzorkovém pufru. Proteiny se zviditelní zabarvením stříbrem. V Dl gelech Mono-P frakce 16, která má nejvyšší enzymatickou aktivitu, naznačuje toliko přítomnost dubletu při zabarvování stříbrem (obr. 2). Molekulové hmotnosti těchto proteinů (kD) jsou přibližně 37,6 a 36,1 kD. V 2D gelech se každý protein rozděluje do dvou skvrn. Izoelektrický bod (IP) kyselejší má střední hodnotu gelů 5,2 a zásaditější 5,3. Molekulové hodnoty dosáhly střední hodnoty 43,5 kD, přičemž horní a spodní peptidy do sebe přecházejí. Proto je výrazný rozdíl v kD mezi gely IDa 2D. Podobná migrace všech čtyř peptidů v Mono-P sloupcích, ID a 2D gelů naznačuje, že jsou izozymy, které se mohou posttranslačně modifikovat. Nebo mohou být produkty genové rodiny, která má mírné vzájemné rozdíly ve své struktuře, vedoucí k odlišným pozorovaným izozymům.

Příklad 5

Sekvencování proteinu

Protein jako celek stanovený způsobem, který popsal Lowiy (Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L. a Randall R.J., J. Biol. Chem. 193, str. 265, 1951) pro frakci 16 Mono-P naznačuje, že je celkem lOOpg proteinu v 1 ml frakce. Podle zkušenosti, při těchto nízkých koncentracích proteinu směřují hodnoty Lowry ktomu, že jsou nadhodnotami skutečného obsaženého množství. Pro kompenzaci tohoto jevu se zde používá podstatného podílu frakce pro sekvencování proteinu. Vnese se 900 μΐ podílu Mono-P frakce 16, představující 90 pg, do sterilní

1,5 ml mikroodstředivkové kyvety a přidá se 216 pl 100% trichloroctové kyseliny (TCA). Promíchá se a kyveta se inkubuje na ledu přes noc a odstřeďuje se otáčkami 14 000/min v mikroodstředivce po dobu 30 minut při teplotě 4 °C. Supematant se oddělí odsátím a peleta se promyje dvakrát 1 ml 75% ethanolu, přičemž se po každém promytí provede odstředění. Peleta se vysuší umístěním kyvety do zařízení speedvac a otáčením po dobu jedné minuty ve vakuu. Do sraženiny se přidá 20 pl 2 x vzorkového pufru Laemmli. Směs se vaří na vodní lázni po dobu 5 minut a mikroodstřeďuje se po dobu jedné minuty. Kyveta se ochladí na 23 °C a celé množství se nanese najeden pruh 12,5% ID gelu. Na konci elektroforézy proteinu se zviditelní zabarvením 0,1% Coomassie R-250 ve vodném 50% methanolu a v 10% kyselině octové (hmotnost:objem) a odbarví se. Tentýž dublet 37,6 a 36,1 kD, pozorovaný ve stříbrem zabarvených gelech, se také zviditelní v gelech zabarvených Coomassie. Oblast gelu, obsahující tento dublet, se odřízne a použije se pro sekvencování proteinu automatizovaným Edmanovým odbouráním.

Sekvencování proteinu se provádí podle normalizovaného protokolu laboratoře univerzity Univerzity of California, Davis, Protein Structure Laboratory. Kousky gelu, obsahující dublet, se

-8CZ 295397 B6 promyjí čtyřikrát 15 ml vody mírným třepáním po dobu 15 minut k odstranění kyseliny octové a SDS, zbylých po předchozích stupních. Kousky gelu se rozkrájí na čtverečky o straně 2 mm žiletkou a přenesou se do kyvety mikroodstředivky o obsahu 1,5 ml. Kousky gelu se dehydratují ve Speed.-Vac po dobu dvou hodin, až již na stěny kyvety nepřilínají. přidá se 30 μΐ gelového rehydratačního pufru (0,lM Tris-HCl, hodnota se 9,0, 0,05 % SDS) a hodnota pH 8,0 se ověří kápnutím 0,5 μΐ na pH papírek. Přidá se digesční enzym Lys-C (0,2 pg) z Achromobacter Lyticus (Wako) spolu s přídavným rehydratačním pufřem k dokonalé hydrataci gelových kousků a k uchování malého množství extra pufru. Směs se nechává inkubovat přes noc při teplotě 30 °C. Po inkubační době se supematant přenese do čerstvé sterilní kyvety mikroodstředivky a uschová se. Přidá se dostatečné množství vody k pokrytí gelových částí a inkubuje se po dobu dalších dvou hodin při teplotě 30 °C. Supematant se odstraní a uloží se ve stejné mikroodstředivce jako předešlý. Ještě jednou se opakuje stupeň promytí se spojenými supematanty z předchozích dvou promytí. Gelové částice se pokryjí roztokem obsahujícím 0,1 % trifluoroctové kyseliny (TFA) v 80 % acetonitrilu a inkubují se po dobu jedné hodiny při teplotě 30 °C. Supematant se shromáždí a přidá se do kyvety obsahující všechny předešlé supematanty. Poslední promytí se ještě jednou opakuje a spojené supematanty se usuší ve speed-vac.

Vysušené tryptické digesční produkty se rozpustí ve 25 μΐ 6M guanidin-HCl, 0,4 M tris (hodnota pH 8,2) a hodnota pH se ověří kápnutím 0,5 μΐ na pH papírek. Přidá se 1 μΐ 450 mM DTT a digest se inkubuje po dobu 45 minut při teplotě 50 °C. Po ochlazení na teplotu místnosti se přidají 2 μΐ 500 mM jodacetamidu a inkubuje se po dobu dalších 15 minut při teplotě 23 °C. Na konci inkubace se přidá 72 μΐ vody k dosažení konečné koncentrace 1,5 M guanidinu a 0,lM Tris. Vzorek se odstřeďuje po dobu 5 minut při otáčkách 14 000/min v mikroodstředivce a supematant se pečlivě přenese do nové mikroodstředivkové kyvety. K vysrážené peletě se přidá 25 μΐ 0,1% trifluoroctové kyseliny a víří se. Kyveta se pak znova odstřeďuje za shora popsaným podmínek a supematant se přidá do supematantu z předešlého stupně.

Rozštěpené fragmenty z tryptické digesce se navzájem oddělí kapilární vysokotlakou kapalinovou chromatografíí (HPLC) na sloupci Cl8 1 mm x 10 cm, za použití lineárního gradientu v průběhu 90 minut 5 % rozpouštědla A (0,1% TFA) k 70 % rozpouštědla B (0,075% acetonitril) za průtočné rychlosti 100 μΐ/min. Ultrafialová detekce se nastaví na 210 nm za použití stupně od 0 do 0,1 A. Získání jednotlivých píků naznačuje obsah několika oddělených peptidů, jak je zřejmé z obr. 3. Pro kontrolu část původního BDS-PAGE gelu, která neobsahuje protein, se nechá prodělat digesční proces. Naplněné píky podle obr. 3 jsou společné pro tuto kontrolu a vzorek. Tři píky, označené jako A, B a C se podrobí automatizovanému Edmanovu odbourání. Dva píky (A a B) mají překrývající se jedinečné sekvence reprezentující tentýž proteinový fragment (obr. 2, fragmenty A a B). Třetí pík (C) je pro odlišnou jedinečnou sekvenci (obr. 2, fragment C).

Příklad 6

Syntéza oligonukleotidových DNA primerů pro xanthosin-N⁷-methyltransferázu

Chemicky se syntetizuje 20 mer primerů pro dvě aminokyselinové sekvence, získané digescí fragmentů xanthosin-N⁷-methyltransferázy, společnost Midland Cartified Reagent Company. Vybrané oblasti fragmentů vykazují minimální degeneraci nukleové kyseliny a pokud je možné vyhýbání se aminokyselinám, které mají nadpočet extenzivního genetického kódu. Kde to není možné, syntetizuje se více než jeden primer pro stejný fragment k zahrnutí všech možných alternativních kodonových kombinací. Kromě toho se také syntetizovaly primery komplementární ke kódujícímu řetězci DNA sekvencí, které kódují pro aminokyselinovou sekvenci. Degeneraci tří nebo několika nukleotidů ve třetí poloze se předchází použitím inosinu v těchto polohách. Kde je degenerace nukleotidu dvojnásobná, zahrnují se oba nukleotidy do syntézy primerů (obr. 3).

-9CZ 295397 B6

Příklad 7

Extrakce RNA z mladých kávovníkových lístků stupně B3

Při všech extrakcích se použilo sterilní, RNasa prosté vody, připravené úpravou 0,1% DEPC. Pokud není uvedeno jinak, provádělo se odstředění vždy při teplotě 4 °C.

Mladé kávovníkové lístky stupně B3 se shromáždí a uloží jako shora popsáno. Veškerá RNA se izoluje ze 100 g tkáně mladých lístků mletím vprostřed! dusíku a bezprostředně se převede do předem ochlazeného domácího mlýnku na kávu. Tkáň se mele na prášek spolu s malými kousky suchého ledu. Tkáň se vnese do 200 ml homogenizačního pufru, připraveného ze 100 mM tris-HCl (hodnota pH 9,0), ze 200 mM NaCl, z 15 mM Na₂EDTA, z 0,5 % sarkosylu a čerstvě se přidá 100 mM β-merkaptoethanolu. Do směsi se přidá 200 ml pufrem vyváženého fenolu a 40 ml směsi chloroform:izoamylalkohol (24:1, objem/objem). Tkáň se homogenizuje ve skleněné kádince na ledové lázni po dobu dvou minut ve vysokorychlostním homogenizátoru Polytron. Bezprostředně po homogenizaci se přidá 14 ml 3M octanu sodného (hodnota pH4,0) a mísí se v homogenizátoru po dobu další jedné minuty. Homogenizát se ponechá v ledu po dobu 15 minut a převede se do dvou 250ml polypropylenových odstředivkových kyvet. Odstřeďování se provádí v rotoru GSA (DuPont Sorvall) při 16 OOOxg po dobu 10 minut. Vodná fáze (horní vrstva) se převede do nové 250ml polypropylenové odstředivkové kyvety a přidá se stejný objem izopropanolu.

Směs se inkubuje přes noc při teplotě -20 °C a odstřeďuje se při 10 OOOxg po dobu 10 minut k získání vysrážené RNA.

Peleta RNA se promyje 70% ethanolem a znova se odstřeďuje při 10 OOOxg po dobu 5 minut. Ethanol se dekantuje a peleta se suší ve vakuu po dobu 5 minut. Peleta se resuspenduje v 15 ml DEPC upravené vody. RNA suspenze se převede do sterilní odstředivkové kyvety o obsahu 40 ml se šroubovacím uzávěrem a nerozpustný materiál se odstraní odstřeďováním při 10 OOOxg po dobu 5 minut. Supematant se převede do nové sterilní odstředivkové kyvety o obsahu 40 ml a přidá se 5 ml 8M chloridu lithného za dosažení konečné koncentrace 2M chloridu lithného. Kyveta se inkubuje přes noc při teplotě 4 °C a RNA se získá odstřeďováním při 14 OOOxg po dobu 10 minut. Peleta RNA se promyje 70% ethanolem, odstřeďuje se při 10 OOOxg po dobu 5 minut a krátce se suší ve vakuu. Peleta se resuspenduje v 5 ml DEPC upravené vody a nerozpustný materiál se odstraní odstřeďováním při 10 OOOxg po dobu 5 minut. Supematant se převede do čtyř sterilních mikroodstředivkových kyvet o obsahu 1,5 ml a uloží se na ledu. Kvantifikace 10 μΐ celkového roztoku RNA ve spektrofotometru Shimadzu UV 160U ve spektru 230 až 330 nm udává obsah 42,8 mg RNA. Kyvety, obsahující RNA, se uloží při teplotě -70 °C.

Příklad 8

Izolace poly(A⁺)mRNA z veškeré RNA

Preparát RNA jako celek se obohacuje poly(A⁺)RNA (mRNA) za použití PolyATract II mRNA kitu izolačního systému (Promega Corporation). Množství 600 μΐ celkové RNA, odpovídající 5,1 mg, se vnese do kyvety shora uvedeného kitu a celkový objem se upraví na 2,43 ml vodou prostou RNasy. Zahříváním se udržuje na teplotě 65 °C po dobu 10 minut, přidá se 10 μΐ 50 pmol/ml biotinylovaného oligo(dT) a 60 μΐ 20x SSC (175,3 g/1 NaCl, 88,2 g/1 citrátu sodného, hodnota pH 7,0) a směs se nechá pomalu ochladit na teplotu místnosti v průběhu přibližně 30 minut. Podíl streptavidinparamagnetických částic se promyje třikrát 0,5x SSC (1,5 μΐ najedno promytí) a resuspenduje se v 0,5 ml 0,5x SSC. RNA roztok, obsahující biotinylovaný oligo (dT),

-10CZ 295397 B6 se přidá do promytých streptavidinparamagnetických částic. Inkubuje se po dobu 10 minut při teplotě místnosti, paramagnetické částice spolu se strženou mRNA se zadrží na stěně kyvety za použití magnetu. Supematant se odstraní a částice se promyjí čtyřikrát 0,1 X SSC (1,5 ml/na jedno promytí). Získá se mRNA suspendováním částic v 1,0 ml vody prosté RNase a voda se odstraní, přičemž se částice zachytí na stěně kyvety. Voda se převede, vždy 500 pl, do dvou l,5ml sterilních mikroodstředivkových kyvet. Po přidání 1/10 objemu 3 M octanu sodného (50 μΐ na kyvetu) mRNA se získá vysrážením stejným objemem izopropanolu (550 μΐ na kyvetu). Kyvety se uloží při teplotě -20 °C přes noc a odstřeďují se při otáčkách 14 000/min po dobu 30 minut při teplotě 4 °C. Peleta se promyje 500 μΐ 75% ledově chladného ethanolu a znova se odstřeďuje. Ethanol se dekantuje, peleta se krátce suší ve vakuu. Rozpustí se mRNA v 60 μΐ sterilní vody prosté DEPC zpracované nukleázy. Kvantifikace se provádí pro 15 μΐ rozpuštěné mRNA stejně, jako je popsáno pro RNA jako celek. Z 5 mg RNA jako celku se získá přibližně

9,6 pg mRNA.

Příklad 9

Konstrukce cDNA knihovny

První a druhý řetězec cDNA se syntetizuje za použití ZAP-cDNA syntézního kitu (Stratagene). Inkubují se 4 pg mRNA ve 25 μΐ vody při teplotě 65 °C po dobu 5 minut. Přidají se 3 μΐ 100 mM methylrtuti a inkubuje se pří teplotě místnosti po dobu 10 minut. Přidají se 4 μΐ 700 mM β-merkaptoethanolu a v inkubaci se pokračuje po dobu dalších pěti minut. Do denaturované mRNA se přidá 5 μΐ lOx prvního řetězcového pufru, 5 μΐ 100 mM DTT, 3 μΐ nukleotidové směsi (10 mM vždy dATP, dGTP, TTP a 5-methyl-dCTP), 2 μΐ 1,4 pg/ml příměrového linkeru (5OAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT3'), 1 μΐ RNase bloku a 5 μΐ vody. Reakční směs se inkubuje při teplotě místnosti po dobu 10 minut ke konjugování primeru na mRNA a přidá se 2,5 μΐ 20 u/μΐ M-MuLV reverzní transkriptázy. Převede se 5 μΐ reakční směsi do kyvety obsahující 0,5 pL 800 Ci/mmol [a³²P]dCTP (DuPont NEN). Obě reakční směsi se inkubují při teplotě 37 °C po dobu jedné hodiny. Radioaktivně značená reakční směs se zmrazí při teplotě -20 °C pro pozdější gelovou analýzu.

Do 45 pl hlavní reakční směsi se přidá 40 pl druhého řetězcového pufru, 15 pl 100 mM DTT, 6 pl nukleotidové směsi (10 mM vždy dATP, dGTP, TTP a 26 mM dCTP), 268,3 pl vody a 2 pl 800 Ci/mmol [cc³²P]dCTP. Po zamíchání se přidá 4,5 pl 1 u/pl RNase H a 19,2 pl 5,2 u/pl E. coli DNA polymerázy I a reakce se inkubuje při teplotě 16 °C po dobu 2,5 hodin. Reakční směs se extrahuje 400 pl systému fenokchloroform (1:1) a fáze se oddělí odstředěním. Vodná fáze se převede do nové kyvety a reextrahuje se chloroformem. Vodná fáze se odstraní, jak shora uvedeno. Dvouřetězcová cDNA se získá vysrážením přes noc při teplotě -20 °C po přidání 33,3 pl 3M octanu sodného a 867 pl 100% ethanolu. Sraženina se odstraní odstřeďováním v mikroodstředivce při teplotě 4 °C po dobu 60 minut. Sraženina se promyje 1 pl 80% ethanolu a získá se odstředěním při teplotě místnosti při plné rychlosti mikroodstředivky. Supernatant se odstraní, sraženina se vysuší ve vakuu a rozpustí se ve 45 pl vody. Odejmou se 3 pl resuspendované dvouřetězcové cDNA a zmrazí se při teplotě -20 °C až do chvíle analýzy gelovou elektroforézou.

Do zbylých 42 pl dvouřetězcové cDNA se přidá 5 pl lOxKlenowa pufru (pufr #3), 2,5 pl 2,52,5 mM nukleotidů (dCTP, dGTP, dATP a TTP), a přidá se 0,5 pl 5u/pl Klenowa fragmentu. Po 30 minutách při teplotě 37 °C se přidá 50 pl vody a reakční směs se extrahuje stejným objemem systému fenokchloroform (1:1) a pak chloroformem, jak shora uvedeno. Po přidání 7 pl 3M octanu sodného a 226 pl 100% ethanolu se získá dvouřetězcová DNA s tupým zakončením vysrážením inkubací na ledu po dobu 30 minut a mikroodstřeďováním při plné rychlosti při teplotě 4 °C po dobu 60 minut. Peleta se promyje 300 pl 80% ethanolu, odstředí a usuší se, jak

-11 CZ 295397 B6 shora popsáno. Přidá se 7 μΐ 0,4 pg/μΙ EcoRI linkeru do usušené cDNA. Struktury EcoRI linkerů jsou následující:

'AATTCGGCACGAG 3'

-3OCCGTGCTC 5'

Po vortexování resuspendované cDNA, se přidá 1 μΐ lOx ligačního pufru, 1 μΐ 10 mM ATP a 1 μΐ 4 Weiss u/μΐ T4 DNA ligázy a reakce se inkubuje přes noc při teplotě 8 °C. Ligáza se inaktivuje udržováním na teplotě 70 °C po dobu 30 minut. Zakončení 5' EcoRI linkerů, vázaných na cDNA se fosforyluje za použití polynukleotidové kinázy. Přidá se 1 μΐ 1 Οχ pufr #3, 2 μΐ 10 mM ATP, 6 ml vody a 1 ml 10 u/ml T4 polynukleotidkinázy do ligační reakční směsi. Po 30 minutách při teplotě 37 °C se kinázová reakce tepelně inaktivuje při teplotě 70 °C po dobu 30 minut.

„Kohezní konce“ Xhol se generují na konci cDNA odpovídajícím 3' zakončení mRNA digescí Xhol místa v linkerovém primeru (jak uvedeno shora). Přidá se 28 μΐ Xhol pufru a 3 μΐ 40 u/ml Xhol do cDNA a reakční směs se inkubuje při teplotě 37 °C po dobu 1,5 hodin. Podle rozměru se frakcionuje cDNA s EcoRI kohezními konci na 5' zakončení a Xhol kohezními konci na 3' zakončení (se zřetelem na původní mRNA) pasáží spinovým sloupcem Sephacryl S400 následujícím způsobem. Přidá se 5 μΐ lOx STE (100 mM tris (hodnota pH 7,0), 5 mM EDTA a 100 mMNaCl) a cDNA se nanese nahoru Ιμΐ injekční stříkačky obsahující Sephacryl S-400. Mikroodstředivková kyveta o obsahu 500 μΐ se umístí na dno injekční stříkačky a sloupec se umístí do odstředivkové kyvety a odstřeďuje se přibližně 400xg po dobu dvou minut. Nahoru stříkačky se přidá 60 μΐ lOx STE a nová mikroodstředivková kyveta se umístí na dno a sloupec se opět odstřeďuje, jak shora uvedeno. Proces se opakuje tak dlouho, až se shromáždí šest frakcí.

Přibližně 10 % každé frakce se podrobí elektroforéze na 1% agarózovém gelu ke stanovení velikostního rozdělení cDNA v každé frakci. Zbytek každé frakce se extrahuje stejným objemem systému fenolxhloroform a chloroformem, jak shora popsáno a pak se vysráží přidáním dvou objemů 100% ethanolu. Po inkubaci při teplotě -20 °C přes noc se získá cDNA odstřeďováním otáčkami 14 000/min při teplotě 4 °C po dobu 60 minut v mikroodstředivce. Získaná cDNA se promyje 200 μΐ 80% ethanolu, shora popsaným způsobem a vysuší se. Rozpustí se cDNA v 5 μΐ vody a 0,5 μΐ se převede ke stanovení cDNA koncentrace fluorografií za použití Hoefer TKO 100 DNA fluorometru. Zbylých 4,5 ml frakce 1, obsahujících nevětších cDNA molekuly, obsahuje přibližně 304 ng cDNA.

Liguje se 100 ng cDNA z frakce 1 do 1 pg Uni-Zap, bakteriofág Lambda ZAP vektoru, který se digeruje s EcoRI a Xhol (Stratagene). Frakce 1 cDNA (2,9 Ml) se vnese do 0,54 μΐ lOx ligačního faktoru, 0,5 μΐ 10 mM ATP, 1 μΐ 1 pg/μΙ Uni-Zap XR vektoru a 0,5 μΐ 4 Weiss u/μΐ T4 DNA ligázy. Reakce se inkubuje při teplotě 8 °C po dobu 44 hodin. Do reakční směsi se přidá 1 μΐ podíl ligační reakce na 1 podíl „Freeze-Taw“ extraktu z kitu Gigapack II Gold (Stratagene). Přidá se 15 μΐ prozvučeného extraktu a obsahy se mírně míchají. Operace se provádí při teplotě místnosti. Po dvou hodinách se přidá 500 μΐ SM pufru (0,01 Mtris-HCl (hodnota pH 7,5), 0,01 M MgCl₂, 0,1 mM Na₂EDTA) a 20 μΐ chloroformu do reakční směsi, úlomky se odstraní krátkých odstředěním v mikroodstředivce a balené fágy se uloží až do použití při teplotě 4 °C.

Příklad 10

Titrace primární knihovny

Smísí se 1 μΐ z 500 μΐ primární knihovny s 9 μΐ SM pufru pro získání zředění 1/10. Použije se 1 μΐ tohoto zředění k infikování 200 μΐ buněk E.coli XLl-Blue MRF' narostlých do hustoty odpovídající O.D.6₀o ⁼ 0,5. Buňky se inkubují při teplotě 37 °C po dobu 15 minut za mírného

- 12CZ 295397 B6 protřepávání. Infikované buňky se pak smísí s 2,5 ml 48 °C teplého horního agaru obsahujícího 15 μΐ 0,5 M IPTG a 50 μΐ 250 mg/ml X-gal a směs se nanese na 100 x 15 mm NZY destičky (5 g/1 NaCl, 2 g/1 MgSO₄.7H₂O, 5 g/1 kvasnicového extraktu, 10 g/1 NZ aminu (hodnota pH 7,5) a 15 g/1 agaru Difco). Destičky se inkubují přes noc při teplotě 37 °C. Pozadí povlaků bylo modré zatímco rekombinantní povlaky byly bílé. Střední hodnota tří takových destiček indikuje, že 1 μΐ primární knihovny produkuje 1,930 bílých rekombinantních povlaků a 65 modrých povlaků. Vypočítalo se, že 500 μΐ primární knihovny jako celku představuje 965 000 rekombinantních povlaků.

Příklad 11

Zesílení primární knihovny

Do 20 sterilních zkumavek se vnese 300 μΐ buněk E.coli XLl-Blue MRF' narostlých na O.D.600 = 0,5. Do každé zkumavky se přidá 12,5 μΐ zásobní primární knihovny a 90 μΐ SM pufru a zkumavky se inkubují při teplotě 37 °C po dobu 15 minut. Přidá se 2,5 ml horního agaru o teplotě 48 °C do každé zkumavky a buňky se nanesou na 100 x 15 mm NZY destičky. Destičky se inkubují přes noc při teplotě 37 °C. Nanese se 5 ml SM pufru na každou destičku a destičky se inkubují po dobu dalších 8 hodin při teplotě 4 °C. SM pufr se odebere sterilní pipetou a uloží se ve sterilní odstředivkové kyvetě o obsahu 250 ml. Každá destička se omyje přibližně 4 ml čerstvého SM pufru, který se přidá do dříve shromážděného materiálu. Přidá se chloroform do konečného objemu 5 % k zesílení knihovny. Knihovna se inkubuje při teplotě místnosti po dobu 15 minut a odstřeďuje se při 2000xg po dobu 10 minut k odstranění zlomků buněk. Supematant (114,5 ml) se získá a převede se do sterilní polypropylenové baňky. Přidá se chloroform do konečného objemu 0,3 % a zesílená knihovna se uloží při teplotě 4 °C.

Příklad 12

Titrace zesílené knihovny μΐ 10“¹¹ zředění zesílené knihovny v SM pufru obsahuje 192 rekombinantních povlaků při nanesení na destičky, jak shora popsáno. Pro získání 50 000 rekombinantních povlaků se použije 25 μΐ 10“⁷ zředění k infikování 600 μΐ buněk E.coli XLl-Blue MRF'narostlých na O.D.₆oo⁼ 0,5. Buňky se inkubují při teplotě 37 °C po dobu 15 minut. Do těchto buněk se přidá 6,5 ml 48 °C teplého horního agaru a knihovna se nanese na 150 x 15 mm NZY destičky. Připraví se čtyři takové destičky představující 200 000 rekombinantních povlaků a inkubují se přes noc při teplotě 37 °C. Destičky se ochladí na teplotu 4 °C v průběhu čtyř hodin a použijí se pro DNA skrínování knihovny.

Příklad 13

Zesílení xanthosin-N⁷-methyltransferázy cDNA polymerázovou řetězcovou reakcí

Syntéza prvního řetězce cDNA je shora popsaná v protokolu Stratagene. Dvě jedinečné peptidové sekvence, získané tryptickou digescí, umožnily syntetizovat degenerované příměry, jak naznačeno na obr. 4. Polymerázová řetězcová reakce („polymerase chain reaction“ = PCR) (Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Scharf S.J., Higuchi R., Hom G.T., Mullis K.B. a Erlich H.A., Science 239, str. 487, 1988) mezi páry primerů (1-6, 2-6, 3-5 nebo 4-5) se provádí za použití 4 ng cDNA, 1 μΐ 20 μΜ primerů, 0,5 μΐ každého činidla ze souboru zahrnujícího 1 mM deoxyribonukleidtrifosfátu, 1,5 mM MgCl₂, 0,3 μΐ Taq DNA polymerázy (5 000 j/ml), 2,5 μΐ lOx PCR pufru (10 mM tris-HCl (hodnota pH9,0), 0,1 % triton X-100) a sterilní vody do konečného

-13 CZ 295397 B6 objemu 25 μΐ. PCR podmínky jsou 94 °C po dobu 4 minut (1 cyklus); 94 °C po dobu jedné minuty, 43 °C po dobu jedné minuty, 72 °C po dobu jedné minuty (35 cyklů); 72 °C po dobu 5 minut (1 cyklus). Reakční směs se převede do sterilní mikroodstředivkové kyvety o obsahu 500 μΐ za použití Perkin Elmerova DNA termálního cykleru 480. Pouze příměrová kombinace 1 a 6 vede kjen jednomu produktu při kopulační teplotě 43 °C. Produkt měřený agarózovou gelovou elektroforézou za použití agarózy Sea Plaque (FMC) vykazuje přibližně 750 páru bází. Použije se obchodně dostupný 100 bp žebřík jako velikostní signální znak (Promega Corporation).

Příklad 14

Klonování pro kávovník specifického xanthosin-N⁷-methyltransferázového PCR genového produktu

Do fragmentu 750 bp, získaného za použití primerů 1 a 6 (obr. 4), v 50 μΐ PCR reakční směsi se přidá 50 μΐ chloroformu a 100 μΐ sterilní vody. Směs se víří a odstřeďuje se v mikroodstředivce při otáčkách 14 000/min po dobu dvou minut. Odebere se horní vodná vrstva obsahující DNA a vnese se do sterilní kyvety. Kvantifikace na ethidium-bromidové destičce dokládá obsah přibližně 5 ng přibližně PCR zesílené DNA/μΙ. PCR produkt se pak liguje do TA klonovacího kitu pCRII vektoru (Invitrogen Corporation) v 10 μΐ ligační reakční směsi obsahující 1 μΐ lOx ligačního pufru, 2 μΐ pCR II vektoru (25 ng/μΐ), 3 μΐ čerstvého PCR produktu (5 ng/μΐ), 1 μΐ T4 DNA ligázy a 3 μΐ sterilní vody. Ligační reakce se inkubuje při teplotě 14 °C přes noc. Ligační reakční směs se odstřeďuje při otáčkách 14 000/min po dobu dvou minut a vnese se na led. Do čerstvě roztavené fioly E.Coli XLl-Blue schopných buněk se přidají 2 μΐ 0,5M α-merkaptoethanolu a mírně se mísí pipetovým koncem. Pipetují se 2 μΐ ligační reakční směsi do buněk a mírně se míchá pipetovým koncem za účelem promísení. Fiola se inkubuje na ledu po dobu 30 minut a tepelně se sráží přesně 30 sekund ve vyhřívacím bloku o teplotě 42 °C. Fiola se umístí do ledu. Po dvou minutách se přidá 450 μΐ sterilního SOC prostředí (20 g/1 tryptofanu, 5 g/1 kvasnicového extraktu, 0,5 g/1 chloridu sodného, 10ml/l 250 mM chloridu draselného, 10ml/l chloridu hořečnatého, 20ml/l 1M glukózy (hodnota pH7,0)). Fiola se protřepává na rotační třepačce při otáčkách 225/min po dobu jedné hodiny a vloží se do ledu.

Transformované buňky se nanesou pipetováním 50 μΐ a/nebo 200 μΐ z buněčné suspenze na jednu ze dvou destiček (10 g/1 tryptofanu, 5 g/1 kvasnicového extraktu, 10 g/1 chloridu sodného, 15 g/1 agaru Difco, (hodnota pH 7,5)) obsahujících 50 pg/ml anpicillinu a 40 pg/ml X-Gal. Destičky se inkubují při teplotě 37 °C po dobu 20 hodin a pak se jimi pohybuje při teplotě 4 °C po dobu tří hodin k vyvolání barvy. Šest bílých transformantových kolonií se analyzuje ke zjištění obsahu a orientace PCR fragmentů.

Příklad 15

Var plasmidového mini-prep

Každá transformantová kolonie se nechá růst v 5 ml sterilní bezvadné půdy (12 g/1 tryptofanu, 24 g/1 kvasnicového extraktu, 4ml/l glycerolu, 100ml/l lOxTB fosfátu (0,17 M kaliumdihydrogenfosfátu, 0,72 M dikaliumhydrogenfosfátu)) doplněného 50 pg/ml ampicillinu. Zkumavky se inkubují přes noc v rotační třepačce při teplotě 37 °C. Převedou se 3 ml každé kolonie do mikroodstředivkové kyvety o obsahu 1,5 ml, vždy 1 ml, a buňky se zkoncentrují odstřeďováním při otáčkách 14 000/min po dobu dvou minut. Supematant se vždy vyhodí a peleta buněk se nechá nejdříve pokud možno uschnout. Buňky se promyjí jednou 1 ml sterilní vody a odstřeďují se, jak shora uvedeno. Supernatant se vyhodí a peleta buněk se resuspenduje v 320 μΐ STEZ pufru (8 % sacharózy, 0,5 % tritonu X-100, 50 mM EDTA, lOmM tris-HCl (hodnota

-14CZ 295397 B6 pH 8,0)). Do těchto buněk se přidá 32 μΐ 10 mg/ml lysozymu v TE pufru (10 ml/1 1M tris-HCl (hodnota pH 8,0), 2 ml/1 0,5 EDTA (hodnota pH 8,0)) a zamíchá se několikerým převrácením kyvet. Kyvety se umístí do vroucí vody na dobu 5 minut a bezprostředně se vloží do ledu. Jakmile se ochladí, odstřeďují se při otáčkách 14 000/min po dobu 30 minut při teplotě 4 °C. Z každé kyvety se vyjme peleta sterilním párátkem. Do supematantu se přidá 170 μΐ 7,5 M NH4OAC a 550 μΐ ledově chladného izopronolu a DNA se vysráží přes noc při teplotě -20 °C. Kyvety se odstřeďují při otáčkách 14 000/min po dobu 30 minut při teplotě 4 °C a pelety se promyjí 75% ethanolem a suší se jednu minutu ve speed-vac. DNA se resuspenduje v 50 μΐ sterilní vody obsahující 1 μΐ 5 mg/ml RNase A.

Příklad 16

Restrikční digesce k odstranění inzertu z pCR II plazmidu

Reakční směs v množství 25 μΐ se připraví přidáním 15 μΐ plazmid mini-prepu DNA, připraveného shora popsaným způsobem, 2,5 μΐ pufru H (90 mM tris-HCl (hodnota pH 7,5), 10 mM chloridu hořečnatého, 50 mM NaCl), 1 μΐ EcoRI (8-12 u/μΐ) a 6,5 μΐ sterilní vody. Směs se inkubuje v protřepávané vodní lázni při sterilní vody. Směs se inkubuje v protřepávané vodní lázni při teplotě 37 °C po dobu jedné hodiny, a vaří se na vodní lázni po dobu jedné minuty. Kyvety se odstřeďují při otáčkách 14 000/min po dobu 15 sekund a nechají se ochladit na teplotu místnosti. Do 10 μΐ každé směsi se přidají 2 μΐ plnicího barviva a produkt digesce se analyzuje za použití 1,5% agarózové gelové elektroforézy za použití ultra-čisté agarózy (GibcoBRL) a 100 bp žebříku jakožto rozměrového signálního znaku (Promega Corporation).

Pouze jedna ze šesti reakčních směsí indikuje přítomnost digerovaného inzertu přibližně 750 bp. Originální bakteriální kolonie odpovídající plazmidu se 750 bp xanthosin-N⁷-methyltransferázového PCR produktu se naočkuje do Erlenmayerovy baňky o obsahu 250 ml obsahující 50 ml sterilního LB prostředí (10 g/1 tryptonu, 5 g/1 kvasnicového extraktu, 10 g/1 chloridu sodného, hodnota pH 7,5) doplněného 50 pg/ml ampicillinu. Baňka se inkubuje na rotační třepačce při teplotě 30 °C přes noc. V l,5ml mikroodstředivkové kyvetě se 18 ml získaného buněčného prostředí koncentruje odstředěním, jak shora uvedeno.

Plazmid DNA se čistí za použití QIAGEN plazmidového minikitu (Qiagen Inc.). Promytá bakteriální peleta se resuspenduje v 0,3 ml pufru Pl, který obsahuje dodanou RNasu. Do těchto 3 ml se přidá alkalický lyzový pufr P2, mírně se promíchá poklepáváním na kyvetu a inkubuje se ne déle než 5 minut při teplotě místnosti. Přidá se dalších 0,3 ml chlazeného pufru P3 a promíchá se šestinásobným převracením kyvety. Nechá se 10 minut v ledu a extrakt se odstřeďuje při otáčkách 14 000/min po dobu 15 minut v mikroodstředivce. Supematant se odstraní a nanese se na QIAGEN-špičku 20, která se předem vyváží aplikací 1 ml QBT pufru za využití gravitačního toku. Aplikovaný buněčný extraktový supematant se také nechá vniknout do sloupce pryskyřice působením gravitačního toku. Jakmile se tok sloupcem zastaví, špička QIAGEN 20 se čtyřikrát omyje 1 ml pufru QC. DNA se eluuje promytím špičky QIAGEN 20 0,8 ml pufru QF a vysráží se přidáním 0,7 objemů (560 μΐ) izopropanolu o teplotě místnosti. Kyveta se bezprostředně odstřeďuje při otáčkách 14 000/min po dobu 30 minut a supematant se pečlivě odebere. Vysrážená DNA se promyje 1 ml ledově chladného 70% ethanolu, odstředí se, jak shora uvedeno a suší se po dobu 5 minut na vzduchu. DNA se resuspenduje ve 100 μΐ sterilní vody. Ultrafialovou spektrometrií, jak shora uvedeno, v 1 μΐ DNA resuspenze se zjišťuje 55 pg izolovaného rekombinantního pCRII plazmidu DNA ve 100 μΐ.

Automatizované DNA sekvencování inzertu v pCRII plazmidu z jeho zakončení 5' se provádí za použití Ml3 reverzního primeru, který se váže na referenci v pCRII právě přiléhající na stranu, kde je inzertován PCR produkt. Sekvencování se provedlo na pracovišti Biotechnology univerzity University of Hawai. Sekvencovací směs obsahuje 1 pg plazmidové matrice a 3,2 pmol Ml3

- 15CZ 295397 B6 primeru. Získaná sekvence naznačuje, že PCR produkt kóduje DNA sekvenci prvních šestí aminokyselin peptidových fragmentů A a B (obr. 4), ze kterého se tvoří sekvence degenerovaného DNA primeru 1 a 2 (obr. 4). Kromě toho sekvence kóduje také následujících sedm aminokyselin peptidového fragmentu, jejichž DNA sekvence není použita při konstrukci primeru. Tak se ve skutečnosti klonuje DNA sekvence pro správný protein.

Příklad 17

Výroba statické senzibilizované nukleotidové sondy pro cDNA skríning za použití PCR produktu

Provedou se dvě 25 μΐ restrikční digesce s EcoRI na dvou 17,5μ1 podílech čištěného pCRII plazmidu, jak shora popsáno. Produkty se oddělí na 1% agarózovém gelu, jak shora popsáno, a 750 bp inzertu se asepticky vyřízne ze dvou pásů gelu. Kousky gelu o hmotnosti 0,65 g se přenesou do sterilní 40 ml polypropylenové kyvety a podrobí se čištění na Geneslean II čisticím kitu (BIO 101, lne.). Přidá se 4,5 objemů NaJ (2,93 ml) zásobního roztoku na gelové řízky. Přidá se polovina objemu modifíkátoru gelu TBE (325 μΐ) a kyveta se inkubuje při teplotě 45 °C po dobu 5 minut. Do této směsi se přidá 15 μΐ sklovitomléčné suspenze a inkubuje se po dobu dalších 5 minut. Komplex sklovitomléčná suspenze/DNA se peletizuje odstřeďováním při otáčkách 1000/min po dobu 10 sekund a supematant se odstraní. Sklovitomléčná peleta se promývá třikrát 1 ml roztoku New Wash a DNA se eluuje 50 μΐ sterilní vody. Podle ethidiumbromidových destiček se soudí, že koncentrace DNA je 10 ng/μΐ.

Statistická senzibílizovaná nukleotidová sonda se syntetizuje ze 30 ng (3 μΐ) čištěné DNA. Přidají se 3 μΐ DNA do 27 μΐ sterilní vody a DNA se denaturuje zahříváním na vroucí vodní lázni. Do směsi se přidají složky kitu Promega Corporation Prime-a-Gene (10 μΐ 5x značkovacího pufru, 2 μΐ neznačených dN.P' [20 μΜ vždy dCTP, dGTP, TTP], 2 μΐ 1 mg/ml acetylovaného BSA, 1 μΐ 5υ/μ1 Klenowa enzymu) a 5 μΐ [a-³²p]dATP (50 pCi, 3 000 Ci/mmol, DuPont NEN) do konečného objemu 50 μΐ a nechává se inkubovat při teplotě místnosti po dobu jedné hodiny. Reakce se ukončí přidáním 2 μΐ 0,5 M Na₂EDTA (konečná koncentrace 20 mM) a směs se zahřívá po dobu dvou minut ve vroucí vodní lázni.

Příklad 18

Skrínování zesílené knihovny statistickou senzibilizovanou nukleotidovou sondou

Čtyři 150x15 mm NZY destičky, které mají přibližně 50 000 rekombinantních klonů na destičku, se ochladí na teplotu 4 °C (podmínky jak shora uvedeny pro nanášení na destičky a pro růst) a rekombinantní destičky se zvednou prvními předběžně napouštěcími nylonovými transfemími membránami 132 mm Magna (MSI Corporation) na chromatografícký papír nasycený 5x SSC pufrem v průběhu 10 sekund. Membrány se položí na destičky obsahující rekombinantní povlaky na 5 minut a zvednou se a uloží se fág obsahující stranou nahoru na 2 minuty na chromatografický papír nasycený 0,5MNaOH a 1,5 MNaCl. Membrány se neutralizují přenesením na chromatografícký papír nasycený 0,5 Tris-HCl (hodnota pH 8,0) a 1,5 M NaCl na dobu 5 minut. Potom se umístí na dobu 20 sekund na chromatografícký papír nasycený 2x SCC pufrem, 0,2 M Tris-HCl (hodnota pH 7,5) a pak se skvrny usuší. Po jedné hodině sušení na vzduchu se DNA zesítí na membránách vystavením 12 000 pJoulů UV za použití jednotky UV Stratalinker 1800 (Stratagene Corporation). Čtyři membrány se předhybridizují při teplotě 65 °C po dobu dvou hodin v 100 ml 6x SSPE (52,2 g/1 chloridu sodného, 8,3 g/1 monohydrátu dihydrogenkaliumfosfátu, 2,2 g/1 Na₂EDTA (hodnota pH 7,4), 5x Denthatdrův roztok (1 g/1 Ficollu, 1 g/1 polyvinylpyrrolidonu, 1 g/1 BSA [frakce pentaxV], 0,5 % SDS a 100pg/ml denaturovaného sleďového sperma DNA v hybridizační pícce Hybrid Mark II.

- 16CZ 295397 B6

Hybridizace se provádí při teplotě 65 °C po dobu 12 hodin v 10 ml 6x SSPE, 0,5 % SDS, 100 pg/ml práškového/denaturovaného sleďového sperma DNA, a 52 μΐ 15 XI O⁶ dpms/ml statistické senzibilizované nukleotidové sondy, shora popsané. Na konci hybridizační periody se nukleidová nukleotidová sonda odstraní a membrány se krátce promyjí po dobu 30 sekund 100 ml 65 °C teplého 2x SSC, obsahujícího 0,5 % SDS. Membrány se promývají přídavně 30 minut stejným množstvím a stejnou koncentrací čerstvého pufru. Membrány se podrobí dvakrát promývání 100 ml po dobu 30 minut o teplotě 65 °C, 0,2x SSC, 0,5 % SDS a pak zabalené v celofánu se exponují na předem osvitnutý rentgenový film Fuji RXgcu při teplotě -70 °C po dobu 24 hodin. Pozoruje se 15 pozitivních klonů. Tyto povlaky se umístí do 1 ml SM pufru, obsahujícího 20 μΐ chloroformu (zásobní fág). Z nich se 11 zpracovává sekundárním nebo terciárním skrínováním až do získání individuálních povlaků.

Příklad 19

Charakterizace xanthosin-N⁷-methyltransferázy cDNA klonů

Stanoví se velikost domnělých xanthosin-N⁷-methyltransferázových cDNA klonů polymerázovou řetězcovou reakcí za použití primerů homologických s T3 a T7 promotory, které jsou obsaženy ve klonovacím vektoru a které lemují cDNA inzerční místo. Podmínky polymerázové řetězcové reakce jsou shora popsány, přičemž však cyklem je 35 cyklů při teplotě 95 °C po dobu jedné minuty, při teplotě 50 °C po dobu jedné minuty a při teplotě 72 °C po dobu dvou minut. Analýza se provádí agarózovou gelovou elektroforézou, jak uvedeno shora. Tři největší získané klony se podrobují in vivo excisi smíšením ve sterilní zkumavce o obsahu 200 μΐ jednoho povlaku fágového zásobního roztoku s 200 μΐ čerstvých BLl-Blue MRF' buněk pěstovaných na O.D.6oo= 1,0. Do této směsi se přidá 1 μΐ ExAssist (Stratagene Corporation) pomocného fágu (>lxl0⁶ pfu/μΐ) a zkumavky se inkubují při teplotě 37 °C po dobu 15 minut. Přidají se 3 ml sterilní živné půdy LB a v inkubaci se pokračuje při teplotě 37 °C po dobu tří hodin za protřepávání. Kultury se zahřívají na vodní lázni o teplotě 70 °C po dobu 20 minut a kyvety se odstřeďují při lOOOxg po dobu 15 minut. Transferuje se 1 μΐ supematantu, obsahujícího vyříznutý pásek pBlue fagemidu baleného jako filamentózní fágová částice do sterilní 1,5 mikroodstředivkové kyvety a uloží se při teplotě 4 °C jako zásobní roztok. Přidá se 25 μΐ zásobního roztoku do 200 μΐ buněk E. coli Solar pěstovaných na O.D.6oo⁼l,0 v mikroodstředivkové kývete. Po inkubaci při teplotě 37 °C po dobu 15 minut se 200 μΐ buněk nanese na agarové destičky 100x15 mm NZY, obsahující 50 pg/ml ampicillinu. Destičky se inkubují při teplotě 37 °C přes noc až do objevení kolonií. Jedna jediná kolonie se naočkuje do 10 ml sterilní živné půdy LB obsahující 50 μg/ml ampicillinu a nechá se růst přes noc při teplotě 37 °C za protřepávání. Zkoncentruje se 10 ml buněčné kultury v l,5ml sterilní mikroodstředivkové kyvetě a peletizované buňky se podrobí QIAGEN plazmidovému čištění, jak shora popsáno. Vyčištěný DNA plazmid se resuspenduje v 50 μΐ sterilní vody. DNA automatizované sekvencovací reakce se provádějí míšením 8 μΐ DNA vzorku (0,8 μg) se 4 μΐ buď T3 nebo T7 sekvenčními primery (0,8 pmol/μΐ). Dále se postupuje, jak shora uvedeno. Každá sekvenční reakce poskytuje přibližně 350 bází sekvence. Sekvence je na obr. 5. Tři aminokyselinová sekvence xanthosin-N⁷-methyltransferázy, jak předvídáno z bázové sekvence cDNA jsou na obr. 6.

Průmyslová využitelnost

Izolované proteiny a rekombinantní DNA sekvence, které potlačují expresi kofeinu v rostlinách kávovníku a v plodech z nich sklizených pro přípravu kávy a jiných potravinářských výrobků prostých kofeinu.

-17CZ 295397 B6

Seznam sekvencí (1) Obecné informace (i) Přihlašovatel: Stiles, John I. Moisyadi, Istefo Neupane, Kabi R.

(ii) Název vynálezu: Čištěné proteiny, rekombinantní DNA sekvence a způsob výroby nápojů prostých kofeinu (iii) Počet sekvencí: 11 (iv) Adresy pro korespondenci (A) Adresát: Jones, Day, Reavis & Pogue (B) Ulice: North Point, 901 Lekeside Avenue (C) Město: Cleveland (D) Stát: Ohio (E) Země: Sp. st. a.

(F) ZIP: 44114 (v) Forma pro počítač (A) Typ média: disketa, 88,9 mm (3,5 palce) 1,44 Mb (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: MS-DOS v. 5.1 (D) Software: WordPerfect pro window v. 6.1.

(vi) Platné přihlašovací údaje (A) Číslo přihlášky: 08/622,679 (B) Datum podání: 26. března 1996 (C) Klasifikace: 800 (vii) Předchozí přihlašovací údaje (viii) Informace o zástupci/zmocněnci (A) Jméno: Griffíth, Calvin P.

(B) Registrační číslo: 34,831 (C) Referenční/štítkové číslo: 265036600003 (ix) Telekomunikační informace (A) Telefon: (216)586-7050 (B) Telefax: (216) 579-0212 (2) Informace o sekv ID. č. 1:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 15 aminokyselinových zbytků (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězcovitost: N/A

-18CZ 295397 B6 (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly:

(A) Popis: peptid (v) Typ fragmentu: vnitřní fragment (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: fragment A (D) jiné informace: Xaa znamená nestanoveno (xi) Popis sekvence: SEQ IDNO:1:

ILe Asn Tyr Ala Ser Gly Ala Ser Gly Ile Leu Asp Gin Xaa Gly 15 10 15 (2) Informace o sekv ID. č. 2:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 14 aminokyselinových zbytků (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly:

(A) Popis: peptid (xi) Popis sekvence: SEQ IDNO:2:

Ile Asn Tyr Ala Ser GLy Ala Ser Gly Ile Leu Asp Gin Thr

5 10 (2) Informace o sekv ID. č. 3:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Retězcovitost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: primer (v) Typ fragmentu: vnitřní fragment (ix) Charakteristiky (D) jiné informace: N je inosin

-19CZ 295397 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:3:

ATNAAYTAYG CNAGYGGNGC 20 (2) Informace o sekv ID. č. 4:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězcovitost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: primer (v) Typ fragmentu: vnitřní fragment (ix) Charakteristiky (D) jiné informace: N je inosin (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:4:

ATNAAYTAYG CNAGYGGNGC 20 (2) Informace o sekv ID. č. 5:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězcovitost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: primer (v) Typ fragmentu: vnitřní fragment (ix) Charakteristiky (D) jiné informace: Nje inosin (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:5:

CGNCCAGNCG NYTAYTTNAT 20

-20CZ 295397 B6 (2) Informace o sekv ID. č. 6:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězcovitost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: primer (v) Typ fragmentu: vnitřní fragment (ix) Charakteristiky (D) jiné informace: N je inosin (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:6:

CGNCCYCTYG CYTAYTTNAT 20 (2) Informace o sekv ID. č. 7:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 14 aminokyselinových zbytků (B) Typ: Aminokyselina (C) Řetězcovitost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly:

(A) Popis: peptid (v) Typ fragmentu: vnitřní fragment (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: fragment A (D) jiné informace: Xaa je buď Thr nebo Asp (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:7:

Gin Tyr Val Pro Cys Tyr Phe Xaa Phe Ile Asp Asp Gin Asp

5 10

-21 CZ 295397 B6 (2) Informace o sekv ID. č. 8:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězcovitost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: primer (v) Typ fragmentu: vnitřní fragment (ix) Charakteristiky (D) jiné informace: N je inosin (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:8:

CAWTATGTNC CNTGTTATTT 20 (2) Informace o sekv ID. č. 9:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězcovitost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: primer (v) Typ fragmentu: vnitřní fragment (íx) Charakteristiky (D) jiné informace: Nje inosin (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:9:

AAWTAWCAHG GNACWTATTG 20 (2) Informace o sekv ID. č. 10:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 371 aminokyselinových zbytků (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězcovitost: jeden (D) Topologie: lineární

-22CZ 295397 B6 (ii) Typ molekuly:

(A) Popis: protein (xi) Popis sekvence: SEQ IDNO:10:

Met 1

Ala Phe Val Ala 5

Arg

Gin Trp

Phe Leu Leu 10

Ser Ile

Ile Asn 15

Val

Val

Val

Val

Cys

Phe

Leu

Lys

Pro

Phe

Ala

Leu

Gly

Glu

Gin

20

25

30

Gin

Val

Pro

Cys

Tyr

Phe

ne

Phe

Gly

Asp

Ser

Gin

Asp

Asp

Asn

35

40

45

Gly

Asn

Asn

Asn

His

Leu

Asn

Thr

Thr

Ala

Arg

Ala

Asn

Tyr

Pro

50

55

60

Pro

Tyr

Gly

Ile

Asp

Phe

Pro

Glu

Gly

Pro

Thr

Gly

Arg

Phe

Thr

65

70

75

Asn

Gly

Arg

Asn

His

Ala

Asp

Phe

Ile

Gly

Glu

Leu

Leu

Gly

Phe

80

85

90

Asp

Ser

Tyr

Ile

Pro

Pro

Phe

Ala

Asn

Thr

Lys

Gly

Arg

Asp

Ile

95

100

105

Thr

Lys

Gly

Ile

Asn

Tyr

Ala

Ser

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

Leu

ASp

110

115

120

Gin

Thr

Gly

Arg

His

Leu

Gly

Asp

Leu

Phe

Ser

Phe

Asn

Glu

Gin

125

130

135

Leu

His

Asn

His

G1U

Arg

Ala

Ile

Ser

Arg

Ile

Val

Arg

Leu

Ile

140

145

150

Gly

Asn

Arg

Ser

Ala

Thr

Lys

Glu

Tyr

Leu

Ala

Lys

Cys

Leu

Tyr

155

160

165

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Asn

Asn

Asp

Tyr

Ile

Asn

Asn

Tyr

Leu

Leu

170

175

180

Pro

Glu

Tyr

Tyr

Pro.

Thr.

Ser

His

Leu

Tyr

Thr

Pro

Arg

Glu

Phe

185

190

195

Ala

Ser

Leu

Leu

Ile

Arg

His

Tyr

ser

Gin

Gin

Leu

Arg

Thr

Leu

200

205

210

Tyr

Arg

Leu

Gly

Ala

Arg

Lys

Ile

Ala

Val

Phe

Gly

Leu

Gly

Trp

215

220

225

Leu

Gly

Cys

Ile

Pro

Ala

Glu

Leu

Ser

Thr

Asp

Gly

Asn

Cys

Val

230

235

240

Asp

Ser

Ile .

Asn

Glu

Glu

Val

Leu

Leu

Phe

Asn

Asp

Lys

Leu

Lys

245 250 255

-23 CZ 295397 B6

Pro Leu Val

Asp Glu 260

Leu Asn

Thr

Glu Leu 265

Ser Gly

Ala

Gin Phe 270

Leu

Tyr

Val

Asp

Val

Ile

Ala

Ile

Asn

Leu

Asn

Asn

Leu

Ser

Thr

275

280

285

Pro

Ala

Glu

Ile

Thr

Ile

Gly

Asn

Ala

Pro

Cys

Cys

Asn

Val

Ser

290

295

300

Ala

Ala

Val

Ala

Gly

Gly

Gin

Cys

Ile

Pro

Gly

Gin

Ile

Pro

Cys

3 05

310

315

Ser

Asn

Arg

Asn

Gin

Tyr

Tyr

Phe

Trp

ASp

Asp

Phe

His

Pro

Ser

320

325

330

Glu

Val

Val

Asn

G1U

Ala

Tyr

Ser

Arg

Leu

Ala

Tyr

Ser

Ala

Leu

335

340

345

Ser

Ser

Leu

Leu

Asp

Ala

Asp

Pro

Leu

Ala

Ile

Gly

Gly

Leu

Thr

350

3 55

360

Gly

Lys

Asn

Cys

His

Asp

Lys

Val

Lys

Ile

Gin

365

370

(2) Informace o sekv ID. č. 11:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 1347 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězcovitost: jeden io (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA až mRNA (ix) Charakteristiky (A) Jméno/klíč: CDS (B) Lokace: 53.. 1168 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:

CCTCTGACTT GCTAAACCTA CCATTACCTT TTTCTTCTTG TCATCTGCAT TC 52

ATG Met 1

GCT TTT GTA

GCC Ala 5

AGG Arg

CAA TGG Gin Trp

TTT Phe

CTC CTA TCC ATC

ATT Ile

Ala

Phe Val

Leu 10

Leu

Ser

Ile

AAT

GTA

GTG

GTT

GTC

TGT

TTC

TTG

AAA

CCA

TTT

GCC

CTA

GGC

Asn

Val

Val

Val

Val

Cys

Phe

Leu

Lys

Pro

Phe

Ala

Leu

Gly

15

20

25

-24CZ 295397 B6

GAA CAA CAG Glu Gin Gin 30

GTC Val

CCT Pro

TGC TAC TTC Cys Tyr Pne 35

ATT TTT GGA GAC TCA CAA

178

Ile

Phe

Gly Asp 40

Ser Gin

GAT

GAC

AAT

GGC

AAC

AAT

AAT

CAC

CTG

AAC

ACC

ACT

GCC

AGG

220

Asp

Asp

Asn 45

Gly

Asn

Asn

Asn

His 50

Leu

Asn

Thr

Thr

Ala 55

Arg

GCA

AAT

TAT

CCA

CCT

TAC

GGC

ATT

GAT

TTC

CCA

GAA

GGT

CCA

262

Ala

Asn

Tyr

Pro 60

Pro

Tyr

Gly

Ile

Asp 65

Phe

Pro

Glu

Gly

Pro 70

ACT

GGT

CGC

TTC

ACC

AAT

GGT

CGA

AAT

CAT

GCA

GAC

TTC

ATT

304

Thr

Gly

Arg

Phe

Thr 75

Asn

Gly

Arg

Asn

His 80

Ala

Asp

Phe

Ile

GGT

GAG

CTC

CTT

GGA

TTT

GAC

AGC

TAC

ATA

CCT

CCA

TTT

GCA

3 46

Gly 85

Glu

Leu

Leu

Gly

Phe 90

Asp

Ser

Tyr

Ile

Pro 95

Pro

Phe

Ala

AAT

ACA

AAA ,

GGC

CGG

GAT

ATC

ACT

AAA

GGC

ATT

AAT

TAT

GCT

388

Asn

Thr 100

Lys

Gly

Arg

Asp

Ile 105

Thr

Lys

Gly

Ile

Asn 110

Tyr

Ala

TCG

GGA

GCA

TCT

GGA

ATT

CTT

GAT

CAG

ACC

GGT

CGT

CAC

CTG

430

Ser

Gly

Ala 115

Ser

Gly

Ile

Leu

Asp 120

Gin

Thr

Gly

Arg

His 125

Leu

GGC

GAT

CTC

TTC

AGC

TTC

AAC

GAA

CAA

TTG

CAC

AAT

CAC

GAG

472

Gly

Asp

Leu

Phe 13 0

Ser

Phe

Asn

Glu

Gin 135

Leu

His

Asn

His

Glu 140

AGA GCA ATT TCG CGC ATC GTG Arg Ala Ile Ser Arg Ile Val 145

GCA ACA AAA GAA TAT CTA GCC Ala Thr Lys Glu Tyr Leu Ala 155 I⁶⁰

TTG GGG AAT AAT GAT TAC ATC Leu Gly Asn Asn Asp Tyr Ile 170 I⁷⁵

TAT TAT CCT ACC AGC CAC CTA

Tyr Tyr Pro Thr Ser His Leu 18 5

AGC TTG TTA ATT AGG CAT TAT ser Leu Leu Ile Arg His Tyr 200

TAC AGA TTG GGG GCA AGA AAA Tyr Arg Leu Gly Ala Arg Lys 215

CGG Arg	TTG ATT GGA AAC AGA TCT	514
Leu	Ile 150	Gly Asn Arg Ser
AAA	TGT	CTG	TAC	ACT	GTT	GCA	556
Lys	Cys	Leu	Tyr 165	Thr	Val	Ala
AAC	AAC	TAC	TTG	TTG	CCA	GAA	598
Asn	Asn	Tyr	Leu	Leu 180	Pro	G1U
TAT	ACT	CCA	AGA	GAA	TTT	GCC	640
Tyr 190	Thr	Pro	Arg	GlU	Phe 195	Ala
TCT	CAG	CAA	CTA	CGG	ACT	TTG	682
Ser	Gin 205	Gin	Leu	Arg	Thr	Leu 210
ATA	GCC	GTT	TTT	GGG	CTT	GGT	724
Ile	Ala	Val 220	Phe	Gly	Leu	Gly

-25CZ 295397 B6

TGG

Trp

225

CTT

Leu

GGC

Gly

TGC

Cys

ATA Ile

CCT Pro 230

TGT cys

GTG

Val

240

GAT

Asp

TCT Ser

ATT Ile

AAC Asn

AAG

Lys

CTC

Leu

AAG

Lys

255

CCA Pro

CTG

Leu

GTT Val

GGT

Gly

GCA

Ala

CAA Gin

TTT Phe 270

TAT

CTT Leu. Tyr

AAC Asn

AAT Asn

TTA Leu

TCC Ser

ACC

Thr

285

CCT Pro

CCA

Pro

295

TGC

Cys

TGC

Cys

AAC

Asn

GTG Val

TCT Ser 300

ATT Ile

CCT Pro 310

GGG

Gly

CAA

Gin

ATT Ile

CCC Pro

TTT Phe

TGG

Trp

GAT

Asp

325

GAT

Asp

TTC Phe

CAT

His

TAT

Tyr

TCA Ser

AGA

Arg

TTA

Leu

340

GCA Ala

TAT

Tyr

GCT

Ala

GAT

Asp

CCT Pro

CTT Leu

GCC Ala 355

ATT Tle

GCT

GAG

TTA

TCT

ACA

GAT

GGT

AAC

766

Ala	Glu Leu	Ser	Thr Asp Gly Asn 235
GAG	GAA	GTT	CTG	TTA	TTC	AAT	GAC	808
Glu 245	G1U	Val	Leu	Leu	Phe 250	Asn	Asp
GAT	GAA	CTG	AAT	ACC	GAG	TTA	AGC	850
Asp	Glu 2 60	Leu	Asn	Thr	Glu	Leu 265	Ser
GTA	GAT	GTG	ATA	GCA	ATC	AAT	TTG	892
Val	Asp	Val 275	Ile	Ala	Ile	Asn	Leu 280
GCA	GAA	ATT	ACA	ATT	GGC	AAT	GCA	934
Ala	G1U	Ile	Thr 290	Ile	Gly	Asn	Ala
GCA	GCA	GTT	GCT	GGT	CGA	CAG	TGT	976
Ala	Ala	Val	Ala	Gly 305	Gly	Gin	Cys
TGC	AGC	AAC	AGG	AAC	CAA	TAT	TAT	1018
Cys 315	Ser	Asn	Arg	Asn	Gin 320	Tyr	Tyr
CCC	AGT'	GAA	GTA	GTC	AAT	GAA	GCA	1060
Pro	Ser 330	Glu	Val. Val	Asn	Glu 335	Ala
TCT	GCG	TTA	TCC	TCA	TTA	CTT	GAT	1102
Ser	Ala	Leu 345	Ser	Ser	Leu	Leu	Asp 350
GGC	GGC	CTA	ACA	GGC	AAA	AAC	TGT	1144
Gly	Gly	Leu	Thr 360	Gly	Lys	Asn	Cys

1185

TAGACTGTAT CTATGTGTCC

CAT

His

365

GAT

Asp

AAA

Lys

GTG Val

AAG Lys

ATA Ile 370

CAA Gin

CATGATATTT CTATATTCCA

AAACTTGAGA GTCCGAATGT

CAATATGTTA TCATTAATCT

AGTTTCCGAC AAGTCAAACT

GCTAGTGTGA TGTTATCTCC

CAGACTATTT ATAATTACTA

CAATGTAATA	1235
TCAATGGAAA	1285
TTAAAAAAAA	1335

1347

AAAAAAAAAA AA

Claims (7)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Čistá xanthosin-N⁷-methyltransferáza, užívající S-adenosylmethionin jako substrát, mající charakteristické tryptické fragmenty A, B a C definované na obr. 4.
2. 2. Transferáza podle nároku 1 sestávající z aminokyselinové sekvence definované na obr. 6.
3. 3. Geneticky obměněný kávovník, jehož obměna je založena na transformaci DNA sekvencí eliminující syntézu xanthosin-N⁷-methyltransferázy podle nároku 1 nebo 2.
4. 4. Geneticky obměněné plody nebo zrna kávovníku podle nároku 3.
5. 5. Čistá DNA sekvence, která kóduje expresi xanthosin-N⁷-methyltransferázy zvolená ze souboru sestávajícího ze (a) sekvence definované na obr. 5, (b) sekvencí DNA, které hybridizují k sekvenci podle odstavce (a), přičemž hybridizující sekvence sestávají ze sekvencí, které jsou komplementární k sekvenci podle odstavce (a) a (c) sekvencí DNA, které jsou degenerovány vzhledem k výše uvedeným sekvencím.
6. 6. DNA podle nároku 5, která je klonujícím vehikulem.
7. 7. Způsob produkce kofeinu prosté zrnkové kávy, vyznačující se tím, že se (a) transformuje kávovník DNA sekvencí, která je antisenze jak k sekvenci DNA definované na obr. 5, tak k sekvenci DNA, která kóduje expresi proteinové definované na obr. 6 a popřípadě se (b) sklízejí plody transformovaného kávovníku.