DE69634361T2

DE69634361T2 - Für eine cinnamoyl-coa-reduktase kodierende dna sequenzen, und ihre verwendung zur regulation des lignun-gehalts von pflanzen

Info

Publication number: DE69634361T2
Application number: DE69634361T
Authority: DE
Inventors: Alain-Michel Boudet; Magalie Pichon; Jacqueline Grima-Pettenati; Michel Beckert; Pascal Gamas; Jean-François BRIAT
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date: 1995-10-03
Filing date: 1996-10-03
Publication date: 2005-12-29
Anticipated expiration: 2016-10-04
Also published as: CA2234477C; ATE289351T1; US6211432B1; EP0853672B1; JPH11514227A; WO1997012982A1; FR2739395A1; ES2238697T3; EP0853672A1; PT853672E; FR2739395B1; CA2234477A1; DE69634361D1

Description

Die vorliegende Erfindung hat die Verwendung von DNA-Sequenzen, die für eine Cinnamoyl-CoA-Reduktase (CCR) bei Pflanzen codieren, oder von Fragmenten dieser Sequenzen oder auch von Sequenzen, die von Letzteren abgeleitet sind, oder von ihren komplementären Sequenzen im Rahmen der Umsetzung von Verfahren zur Regulierung des Ligningehalts bei Pflanzen zum Gegenstand.
Das Lignin ist ein komplexes, heterogenes, aromatisches Polymer, das die Wände bestimmter Pflanzenzellen impermeabel macht und verstärkt.
Lignin wird durch Polymerisation von freien Radikalen gebildet, die von Monolignolen wie para-Cumaryl-, Coniferyl- und Sinapylalkoholen stammen (Higuchi, 1985, in: Biosynthesis und degradation of wood components (T. Higuchi ed.), Academic Press, Orlandon, FL, pp. 141–160).
Die Lignine weisen eine große Variation in ihrem relativen Gehalt an Monolignolen auf, abhängig von der Sorte und den verschiedenen Geweben innerhalb ein und derselben Pflanze.
Diese Variation ist wahrscheinlich zurückzuführen auf und gesteuert durch die verschiedenen Aktivitäten und Spezifitäten von Substraten, für die Biosynthese der Ligninmonomere notwendigen Enzymen (Higuchi, 1985, loc. cit.).
Neben seiner Rolle bei der Struktur und der Entwicklung von Pflanzen stellt das Lignin einen Hauptbestandteil der terrestrischen Biomasse dar und weist eine große ökonomische und ökologische Bedeutung auf (Brown, 1985, J. Appl. Biochem., 7, 371–387; Whetten und Sederoff, 1991, Forest Ecology und Management, 43, 301–316).
Hinsichtlich der Verwertung der Biomasse ist es angebracht, zuerst anzumerken, dass Lignin ein begrenzender Faktor für die Verdaulichkeit und die Futterverwertung von Futterpflanzen ist. Tatsächlich ist klar gezeigt, dass die Verdaulichkeit von Futterpflanzen durch Wiederkäuer indirekt proportional zum Ligningehalt dieser Pflanzen ist, wobei die Beschaffenheit der Lignine ebenfalls ein bestimmender Faktor bei diesem Phänomen ist (Buxton und Roussel, 1988, Crop. Sci., 28, 553–558; Jung und Vogel, 1986, J. Anim. Sci., 62, 1703–1712).
Unter den Hauptfutterpflanzen, bei denen es interessant wäre, die Ligningehalte zu verringern, kann man nennen: Luzerne, Schwingel, Mais, Futtermittel, die zur Ensilage verwendet werden, ...
Anzumerken ist auch, dass hohe Ligningehalte teilweise für die begrenzte Qualität von Sonnenblumenkuchen, die für die Ernährung von Vieh bestimmt sind, und die Verminderung der Keimfähigkeit bestimmter Samen auf dem Gebiet des Gartenbaus verantwortlich sind.
Man kann auch hervorheben, dass die starke Lignifizierung, die sich während der Aufbewahrung von Pflanzenbestandteilen nach der Ernte einstellt, Erzeugnisse wie Spargel, Yamswurzel, Karotten etc. rasch für den Verzehr ungeeignet macht.
Außerdem muss man auch anmerken, dass mehr als 50 Millionen Tonnen Lignine jedes Jahr im Rahmen der Herstellung von Papierbrei in der Papierindustrie aus der holzigen Substanz extrahiert werden. Dieser Extraktionsvorgang, der notwendig ist, um Cellulose zu erhalten, ist energetisch kostspielig und verursacht zweitens Verschmutzung durch die für die Extraktion verwendeten Chemikalien, die man in der Umwelt wiederfindet (Dean und Eriksson, 1992, Holzforschung, 46, 135–147; Whetten und Sederoff, 1991, loc. cit.).
Eine Reduktion der Ligninanteile (die je nach Sorte 20 bis 30% der Trockensubstanz ausmachen) um einige Prozent (2 bis 5%) würde einen Ertragsanstieg, eine wesentliche Ersparnis (chemische Produkte) darstellen und zur Verbesserung der Umwelt (Verringerung der Verschmutzung) beitragen. In Anbetracht des Ausmaßes der Verwendung von holzigem Material hätten diese Folgeerscheinungen sehr bedeutende Rückwirkungen. In diesem Fall könnten die betroffenen Sorten Pappel, Eukalyptus, Acacia mangium, die Gattung Casuarina und die Gesamtheit der Angiospermen und Gymnospermen, die für die Herstellung von Papierbrei verwendet werden, sein.
Es ist klar, dass auf den beiden betrachteten Gebieten die Reduktion der Ligningehalte gemäßigt sein muss, um bei der Pflanze (oder bei dem Baum) ihre bzw. seine Merkmale der Steifheit und ihre bzw. seine normale Architektur zu erhalten, da die Lignine, die die Zellwände festigen, eine wichtige Rolle beim Erhalt des aufrechten Wuchses von Pflanzen spielen.
Die natürlichen Schwankungen in den Ligningehalten, die in der Natur für ein und dieselbe Sorte beobachtet werden (Unterschiede zwischen Individuen können bis zu 6 bis 8% der Trockenmasse betragen), erlauben die vorgeschlagene höhere Verringerung.
Der Widerstand gegenüber dem Abbau von Lignin ebenso wie die Schwierigkeiten, denen man im Zusammenhang mit seiner Extraktion begegnet, sind wahrscheinlich auf die komplexe Struktur dieses Polymers zurückzuführen, das aus Etherbindungen und Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen zwischen den Monomeren aufgebaut ist, sowie auf zahlreiche chemische Bindungen, die zwischen dem Lignin und anderen Bestandteilen der Zellwand bestehen (Sarkanen und Ludwig, 1971, in: Lignins: Occurrence, Formation, Structure und Reactions (K. V. Sarkanen und C. H. Ludwig eds), New York: Wiley- Interscience, pp. 1–18).
Ausgehend von Cinnamoyl-CoA wird die Biosynthese der Lignine bei Pflanzen auf folgende Weise bewirkt:
Ein Ansatz, die Reduktion des Ligningehaltes in Pflanzen durch Gentechnologie zu versuchen, wäre die Hemmung der Synthese eines der Enzyme der Biosynthesekette dieser Lignine, die oben angegeben sind.
Eine besonders geeignete Technik im Rahmen eines solchen Ansatzes ist die Verwendung von Antisense-mRNA, die in der Lage ist, mit der mRNA, die für diese Enzyme codiert, zu hybridisieren und folglich, zumindest teilweise, die Produktion dieser Enzyme von ihrer entsprechenden mRNA zu verhindern.
Eine solche Antisense-Strategie, die mit Hilfe des Gens, das für die CAD bei Tabak codiert, realisiert wurde, ist Gegenstand der europäischen Patentanmeldung Nr. 584 117, die die Verwendung von Antisense-mRNA beschreibt, die fähig ist, die Produktion von Ligninen bei Pflanzen durch Hybridisierung mit der mRNA, die für die CAD bei diesen Pflanzen codiert, zu hemmen.
Die Ergebnisse im Bereich der so transformierten Pflanzen zeigen eine Reduktion der Aktivität der CAD, aber paradoxerweise zeigen die Ligningehalte keine Veränderung. Ergänzende Studien zeigen, dass die Lignine von transformierten Pflanzen von Vergleichsligninen verschieden sind, da die Cinnamylaldehyde direkt in das Ligninpolymer eingebaut sind.
Eines der Ziele der vorliegenden Erfindung ist genau jenes, ein Verfahren bereitzustellen, das es erlaubt, die Ligningehalte in Pflanzen wirksam zu regulieren, sei es im Sinne einer beträchtlichen Verringerung dieser Gehalte in Bezug auf die normalen Gehalte in den Pflanzen, sei es im Sinne einer Erhöhung dieser Gehalte.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, Mittel für die Durchführung eines solchen Verfahrens und insbesondere Konstruktionen, die für die Transformation von Pflanzen verwendet werden können, zu liefern.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, genetisch transformierte Pflanzen zu liefern, insbesondere Futterpflanzen, die geeignet sind, besser als nichttransformierte Pflanzen verdaut zu werden, oder auch transformierte Pflanzen oder Bäume für die Herstellung von Papierbrei, wobei die Extraktion der Lignine erleichtert und weniger verschmutzend ist als im Falle von nichttransformierten Bäumen.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, transformierte Pflanzen zu liefern, die gegen Umweltangriffe, insbesondere Parasitenbefall, resistenter sind als nichttransformierte Pflanzen, oder auch transformierte Pflanzen, die größer oder kleiner sind (als die nichttransformierten Pflanzen).
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von rekombinanten Nucleotidsequenzen, die eine (oder mehrere) codierende Region(en) enthalten, wobei diese codierende(n) Region(en) aus einer Nucleotidsequenz gebildet wird (werden), die aus den Folgenden ausgewählt ist:

– die Nucleotidsequenz, die durch SEQ ID NO 1 dargestellt wird, die für eine mRNA codiert, wobei die mRNA selbst für die Cinnamoyl-CoA-Reduktase (CCR) der Luzerne codiert, die durch SEQ ID NO 2 dargestellt wird,
– die Nucleotidsequenz, die durch SEQ ID NO 3 dargestellt wird, die für eine mRNA codiert, wobei die mRNA selbst für die CCR von Mais codiert, die durch SEQ ID NO 4 dargestellt wird,
– ein Fragment der Nucleotidsequenz, die durch SEQ ID NO 1 dargestellt wird, oder jener, die durch SEQ ID NO 3 dargestellt wird, wobei dieses Fragment für ein Fragment der CCR, die durch SEQ ID NO 2 dargestellt wird, bzw. für ein Fragment der CCR, die durch SEQ ID NO 3 dargestellt wird, codiert und wobei dieses CCR-Fragment eine enzymatische Aktivität aufweist, die jener der beiden oben genannten CCRs äquivalent ist,
– die Nucleotidsequenz, die komplementär zu jener ist, die durch SEQ ID NO 1 oder SEQ ID NO 3 dargestellt wird, wobei diese komplementäre Sequenz für eine Antisense-mRNA codiert, die in der Lage ist, mit der mRNA zu hybridisieren, die durch die Sequenzen SEQ ID NO 1 bzw. SEQ ID NO 3 codiert wird,
– ein Fragment der Nucleotidsequenz, die komplementär zu jener ist, die durch SEQ ID NO 1 oder SEQ ID NO 3 dargestellt wird, wobei dieses Sequenzfragment für eine Antisense-mRNA codiert, die in der Lage ist, mit der mRNA, die selbst für die CCR codiert, die durch SEQ ID NO 2 dargestellt wird, bzw. mit der mRNA, die selbst für die CCR codiert, die durch SEQ ID NO 4 dargestellt wird, zu hybridisieren,
– die Nucleotidsequenz, die von der Sequenz, die durch SEQ ID NO 1 oder SEQ ID NO 3 dargestellt wird, abgeleitet ist, insbesondere durch Mutation und/oder Addition und/oder Suppression und/oder Substitution eines oder mehrerer Nucleotide, wobei diese abgeleitete Sequenz entweder für eine mRNA codiert, die selbst für die CCR codiert, die durch SEQ ID NO 2 bzw. SEQ ID NO 4 dargestellt wird, oder für ein Fragment oder ein von Letzteren abgeleitetes Protein, wobei dieses Fragment oder abgeleitete Protein eine enzymatische Aktivität aufweist, die äquivalent zu jener der genannten CCRs bei den Pflanzen ist,
– die Nucleotidsequenz, die von der oben genannten komplementären Nucleotidsequenz oder dem Fragment dieser komplementären Sequenz, wie es oben beschrieben ist, durch Mutation und/oder Addition und/oder Suppression und/oder Substitution eines oder mehrerer Nucleotide abgeleitet ist, wobei diese abgeleitete Sequenz für eine Antisense-mRNA codiert, die in der Lage ist, mit einer der oben genannten mRNAs zu hybridisieren,

Unter "abgeleiteter Nucleotidsequenz" versteht man im bisherigen und im folgenden Text jede Sequenz, die mindestens ungefähr 50% (vorzugsweise mindestens 70%) Nucleotide aufweist, die homolog mit jenen der Sequenz sind, von der sie abgeleitet ist.
Unter "abgeleitetem Protein" versteht man im bisherigen und im folgenden Text jedes Protein, das mindestens ungefähr 50% (vorzugsweise mindestens 70%) Aminosäuren aufweist, die homolog zu jenen des Proteins sind, von dem es abgeleitet ist.
Die vorliegende Erfindung hat insbesondere jede DNA-Sequenz zum Gegenstand, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie als codierende Region enthält:

– die Nucleotidsequenz, die durch SEQ ID NO 1 dargestellt wird, welche für eine mRNA codiert, welche mRNA selbst für die CCR codiert, die durch SEQ ID NO 2 dargestellt wird, oder
– ein Fragment der oben genannten Nucleotidsequenz, wobei das Fragment für ein Fragment der CCR codiert, die durch SEQ ID NO 2 dargestellt wird, und wobei das Fragment der CCR eine enzymatische Aktivität aufweist, die zu jener der oben genannten CCR äquivalent ist, oder
– jede Nucleotidsequenz, die von der oben genannten Sequenz, die durch SEQ ID NO 1 dargestellt wird, oder einem Fragment dieser Sequenz, wie es oben beschrieben ist, abgeleitet ist, insbesondere durch Mutation und/oder Addition und/oder Suppression und/oder Substitution eines oder mehrerer Nucleotide, wobei diese abgeleitete Sequenz für eine mRNA codiert, die selbst für die CCR codiert, die durch SEQ ID NO 2 dargestellt wird, oder für ein Protein, das von Letzterer abgeleitet ist und eine enzymatische Aktivität aufweist, die äquivalent zu jener der genannten CCR bei den Pflanzen ist.

Die vorliegende Erfindung hat insbesondere jede DNA-Sequenz zum Gegenstand, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie als codierende Region enthält:

– die Nucleotidsequenz, die durch SEQ ID NO 3 dargestellt wird, die für eine mRNA codiert, wobei diese mRNA selbst für die CCR codiert, die durch SEQ ID NO 4 dargestellt wird, oder
– ein Fragment der oben genannten Nucleotidsequenz, wobei dieses Fragment für ein Fragment der CCR codiert, die durch SEQ ID NO 4 dargestellt wird, wobei dieses Fragment der CCR eine enzymatische Aktivität aufweist, die äquivalent zu jener der oben genannten CCR ist, oder
– jede Nucleotidsequenz, die von der oben genannten Sequenz, die durch SEQ ID NO 3 dargestellt wird, oder einem Fragment dieser Sequenz, wie es oben beschrieben ist, abgeleitet ist, insbesondere durch Mutation und/oder Addition und/oder Suppression und/oder Substitution eines oder mehrerer Nucleotide, wobei diese abgeleitete Sequenz für eine mRNA codiert, die selbst für die CCR codiert, die durch SEQ ID NO 4 dargestellt wird, oder für ein Protein, das von Letzterer abgeleitet ist und eine enzymatische Aktivität aufweist, die äquivalent zu jener der genannten CCR bei den Pflanzen ist.

Unter einem Protein, das eine enzymatische Aktivität aufweist, die äquivalent zu jener der CCR ist, die bei den Pflanzen vorhanden sind, und insbesondere der CCR, die durch SEQ ID NO 2 und SEQ ID NO 4 dargestellt werden, versteht man alle Proteine, die eine CCR-Aktivität aufweisen, wie sie nach dem Verfahren von Luderitz und Grisebach, veröffentlicht in Eur. J. Biochem. (1981), 119: 115–127, gemessen wird.
Zum Zweck der Illustration: Dieses Verfahren wird durch eine spektralphotometrische Messung der reduzierenden Aktivität des Proteins (CCR oder abgeleitet) realisiert, indem das Verschwinden von Cinnamoyl-CoA bei 366 nm verfolgt wird. Die Reaktion läuft bei 30°C während 2 bis 10 min ab. Die Zusammensetzung des Reaktionsmediums ist wie folgt: Phosphatpuffer 100 mM, pH 6,25, 0,1 mM NADPH, 70 μM Feruloyl-CoA, 5 bis 100 μl enzymatischer Extrakt in einem Gesamtvolumen von 500 μl.
Die Erfindung hat auch jede DNA-Sequenz zum Gegenstand, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie als codierende Region enthält:

– die Nucleotidsequenz, die zu jener komplementär ist, die durch SEQ ID NO 1 dargestellt wird, wobei diese komplementäre Sequenz für eine Antisense-mRNA codiert, die in der Lage ist, mit der mRNA zu hybridisieren, die selbst für die CCR codiert, die durch SEQ ID NO 2 dargestellt wird, nämlich der mRNA, die von der durch SEQ ID NO 1 dargestellten Sequenz codiert wird oder von einer Sequenz, die von Letzterer abgeleitet ist, wie oben definiert, oder
– ein Fragment der oben genannten komplementären Sequenz, welches Sequenzfragment für eine Antisense-mRNA codiert, die in der Lage ist, mit der mRNA zu hybridisieren, die selbst für die CCR codiert, die durch SEQ ID NO 2 dargestellt wird, wie oben definiert, oder
– jede Nucleotidsequenz, die von der oben genannten komplementären Sequenz abgeleitet ist, oder vom Fragment dieser komplementären Sequenz, wie es oben beschrieben ist, insbesondere durch Mutation und/oder Addition und/oder Suppression und/oder Substitution eines oder mehrerer Nucleotide, wobei diese abgeleitete Sequenz für eine Antisense-mRNA codiert, die in der Lage ist, mit der oben genannten mRNA zu hybridisieren.

Die vorliegende Erfindung hat insbesondere alle DNA-Sequenzen zum Gegenstand, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie als codierende Region enthalten:

– die Nucleotidsequenz, die zu jener komplementär ist, die durch SEQ ID NO 3 dargestellt wird, wobei diese komplementäre Sequenz für eine Antisense-mRNA codiert, die in der Lage ist, mit der mRNA zu hybridisieren, die selbst für die CCR codiert, die durch SEQ ID NO 4 dargestellt wird, nämlich der mRNA, die von der durch SEQ ID NO 3 dargestellten Sequenz codiert wird oder von einer Sequenz, die von Letzterer abgeleitet ist, wie oben definiert, oder
– ein Fragment der oben genannten komplementären Sequenz, wobei dieses Sequenzfragment für eine Antisense-mRNA codiert, die in der Lage ist, mit der mRNA zu hybridisieren, die selbst für die CCR codiert, die durch SEQ ID NO 4 dargestellt wird, wie oben definiert, oder
– jede Nucleotidsequenz, die von der oben genannten komplementären Sequenz abgeleitet ist, oder vom Fragment dieser komplementären Sequenz, wie oben beschrieben, insbesondere durch Mutation und/oder Addition und/oder Suppression und/oder Substitution eines oder mehrerer Nucleotide, wobei diese abgeleitete Sequenz für eine Antisense-mRNA codiert, die in der Lage ist, mit der oben genannten mRNA zu hybridisieren.

Es versteht sich von selbst, dass die erfindungsgemäßen Sequenzen, die durch SEQ ID NO 1 und SEQ ID NO 3 dargestellt werden, die komplementären Sequenzen, die abgeleiteten Sequenzen und die Fragmente der Sequenzen, die oben genannt sind, als in Richtung 5' → 3' dargestellt zu berücksichtigen sind.
So ist das erste Nucleotid einer komplementären Sequenz in Richtung 5' → 3', wie sie oben beschrieben wurde, das Gegenstück des letzten Nucleotids der Sequenz in Richtung 5' → 3', die für eine CCR (oder ein CCR-Fragment oder abgeleitetes Protein) codiert, das zweite Nucleotid dieser komplementären Sequenz ist das Gegenstück des vorletzten Nucleotids der Sequenz, die für eine CCR codiert, usw. bis zum letzten Nucleotid der komplementären Sequenz, das das Gegenstück des ersten Nucleotids der Sequenz ist, die für eine CCR codiert.
Die mRNA, die von der oben genannten komplementären Sequenz codiert wird, ist so, dass, wenn diese mRNA in Richtung 5' → 3' dargestellt wird, ihr erstes Nucleotid dem letzten Nucleotid der Sequenz entspricht, die für eine CCR codiert, und daher mit dem letzten Nucleotid der mRNA hybridisiert, die von dieser Letzteren codiert wird, wohingegen ihr letztes Nucleotid dem ersten Nucleotid der Sequenz entspricht, die für eine CCR codiert, und daher mit dem ersten Nucleotid der mRNA hybridisiert, die von dieser Letzteren codiert wird.
Daher versteht man unter Antisense-mRNA, in dem, was vorausging und was folgen wird, jede mRNA, die von der oben genannten komplementären Sequenz codiert wird und in inverser Richtung (3' → 5') zu der Richtung dargestellt wird, in welcher die mRNA dargestellt wird, die von der Sequenz codiert wird, die für eine CCR (oder ein CCR-Fragment oder ein abgeleitetes Protein) codiert, wobei diese letztere mRNA auch als Sense-mRNA (5' → 3') bezeichnet wird.
Der Begriff Antisense-RNA bezieht sich also auf eine RNA-Sequenz, die komplementär. zu der Basensequenz der messenger-RNA ist, wobei der Begriff komplementär in dem Sinn zu verstehen ist, dass jede Base (oder eine Mehrheit der Basen) der Antisense-Sequenz (gelesen in Richtung 3' → 5') zur Paarbildung mit den entsprechenden Basen (G mit C, A mit U) der messenger-RNA (Sequenz gelesen in Richtung 5' → 3') in der Lage ist.
Die Strategie der Antisense-RNA im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist ein molekularer Ansatz, der insbesondere an das Ziel einer Modulation der Ligningehalte der Pflanzen angepasst ist. Die Antisense-RNA ist eine RNA, die durch die Transkription des nicht codierenden DNA-Stranges (Nichtsinnstrang) produziert wird.
Diese Antisense-Strategie ist insbesondere im europäischen Patent Nr. 240 208 beschrieben.
Man denkt, dass die Hemmung der Synthese eines Proteins gemäß der Antisense-Strategie beim Vorkommen der CCR im vorliegenden Fall die Konsequenz der Bildung eines Duplex zwischen den beiden komplementären RNA (Sense und Antisense) ist, wobei die Produktion des Proteins verhindert wird. Der Mechanismus bleibt jedoch unklar. Der Komplex RNA-RNA kann eine spätere Transkription, die Reifung, den Transport oder die Translation stören oder auch zu einem Abbau der mRNA führen.
Eine Kombination dieser Effekte ist ebenfalls möglich.
Die Erfindung betrifft auch jede mRNA, die von einer DNA-Sequenz gemäß der Erfindung codiert wird, und insbesondere:

– die mRNA, die von der DNA-Sequenz codiert wird, die durch SEQ ID NO 1 dargestellt wird, oder die von einem Fragment oder einer abgeleiteten Sequenz, wie oben definiert, codiert wird, wobei die mRNA fähig ist, ihrerseits für die CCR zu codieren, die bei der Luzerne vorhanden ist, wie sie durch SEQ ID NO 2 dargestellt wird, oder für ein Fragment dieser CCR oder ein abgeleitetes Protein, wie oben definiert,
– die mRNA, die von der DNA-Sequenz codiert wird, die durch SEQ ID NO 3 dargestellt wird, oder die von einem Fragment oder einer abgeleiteten Sequenz, wie oben definiert, codiert wird, wobei die mRNA fähig ist, ihrerseits für die CCR zu codieren, die in Mais vorhanden ist, wie sie durch SEQ ID NO 4 dargestellt wird, oder für ein Fragment dieser CCR oder ein abgeleitetes Protein, wie oben definiert.

Die Erfindung hat auch jede Antisense-mRNA zum Gegenstand, wie sie oben definiert ist, dadurch gekennzeichnet, dass sie Nucleotide enthält, die komplementär zur Gesamtheit oder nur zu einem Teil der Nucleotide sind, die eine mRNA, wie sie oben beschrieben ist, gemäß der Erfindung bilden, wobei die Antisense-mRNA fähig ist, mit der Letzteren zu hybridisieren (oder paarweise zu verbinden).
Daher betrifft die Erfindung insbesondere Antisense-mRNA, die von DNA-Sequenzen gemäß der Erfindung codiert werden, die mindestens einen Bereich von 50 Basen enthalten, die homolog zu jenen eines Bereichs der Sequenzen sind, die komplementär zu den oben genannten DNA-Sequenzen der Erfindung sind.
Es gibt keine obere Grenze für die Größe der DNA-Sequenzen, die für eine Antisense-RNA gemäß der Erfindung codieren; sie können so lang sein wie die der Messenger, die normalerweise in den Zellen hergestellt werden, sogar so lang wie die genomische DNA-Sequenz, die für die mRNA der CCR codiert.
Vorteilhafterweise enthalten solche DNA-Sequenzen, die für eine Antisense-RNA gemäß der Erfindung codieren, zwischen ungefähr 100 und ungefähr 1000 Basenpaare.
Die Erfindung hat besonders bevorzugt jede Antisense-Sequenz zum Gegenstand, die eine (oder mehrere) Antisense-mRNA(s) umfasst, wie oben beschrieben, oder (ein) Fragment(e) dieser Antisense-mRNA(s), und eine (oder mehrere) Sequenz(en), die einer (oder mehreren) katalytischen Domäne(n) eines Ribozyms entspricht (entsprechen).
Daher betrifft die Erfindung insbesondere jede Antisense-Sequenz, wie oben beschrieben, die die katalytische Domäne eines Ribozyms umfasst, beiderseits flankiert von Ar men von ungefähr 8 Basen, die zu Sequenzen komplementär sind, die ein Motiv GUX (X stellt C, U oder A dar) begrenzen, die in einer der mRNAs der Erfindung enthalten sind, die oben beschrieben wurden (auch als Target-RNA bezeichnet) (Haseloff J. und Gerlach W. L., 1988, Nature, 334: 585–591).
Die Erfindung betrifft auch jede DNA-Sequenz, die fähig ist, für eine Antisense-Sequenz zu codieren, wie oben beschrieben, die zumindest eine katalytische Domäne eines Ribozyms enthält, gebunden an eine oder mehrere Antisense-mRNAs der Erfindung oder (ein) Fragment(e) der Antisense-mRNA (vorzugsweise Fragmente mit ungefähr 8 Basen, wie oben beschrieben).
Die Erfindung hat insbesondere zum Gegenstand:

– jede Antisense-mRNA, wie oben beschrieben, dadurch gekennzeichnet, dass sie von der Nucleotidsequenz codiert wird, die komplementär zu jener ist, die durch SEQ ID NO 1 dargestellt wird, wobei die Antisense-mRNA fähig ist, mit der mRNA zu hybridisieren, die von der DNA-Sequenz codiert wird, die durch SEQ ID NO 1 dargestellt wird,
– jede Antisense-mRNA, wie oben beschrieben, dadurch gekennzeichnet, dass sie von der Nucleotidsequenz codiert wird, die komplementär zu jener ist, die durch SEQ ID NO 3 dargestellt wird, wobei die Antisense-mRNA fähig ist, mit der mRNA zu hybridisieren, die von der DNA-Sequenz codiert wird, die durch SEQ ID NO 3 dargestellt wird.

Die Erfindung betrifft auch rekombinante Polypeptide, die von den DNA-Sequenzen der Erfindung codiert werden, wobei die rekombinanten Polypeptide eine enzymatische Aktivität aufweisen, die äquivalent zu jener der CCR bei den Pflanzen ist, und insbesondere rekombinante CCRs, die von den Sequenzen codiert werden, die durch SEQ ID NO 1 und SEQ ID NO 3 dargestellt werden, oder von Sequenzen, die von diesen Letzteren gemäß der Erfindung abgeleitet sind.
Die Erfindung betrifft insbesondere rekombinante Polypeptide und insbesondere rekombinante CCRs, wie jene, die durch Transformation von Pflanzenzellen erhalten werden, indem in ihr Genom eine rekombinante Nucleotidsequenz, wie sie nachfolgend definiert wird, welche eine DNA-Sequenz gemäß der Erfindung enthält, insbesondere mit Hilfe eines Vektors, wie nachfolgend beschrieben wird, auf stabile Weise integriert wird.
Unter dem Ausdruck "rekombinante Polypeptide" ist jedes Molekül zu verstehen, das eine Polypeptidkette besitzt, die durch Gentechnologie erzeugt werden kann mittels einer Phase zur Transkription der DNA des entsprechenden Gens, was zum Erhalt der RNA führt, die in Folge in mRNA (durch Suppression von Introns) transformiert wird, wobei Letztere in Folge durch Ribosomen in Form von Proteinen translatiert wird, wobei dies alles unter Kontrolle von geeigneten Regulierungselementen im Inneren einer Wirtszelle erfolgt. Folglich schließt der verwendete Ausdruck "rekombinante Polypeptide" nicht die Möglichkeit aus, dass diese Polypeptide andere Gruppierungen, wie glycosylierte Gruppierungen, enthalten.
Selbstverständlich zeigt der Ausdruck "rekombinant" an, dass das Polypeptid gentechnologisch hergestellt wurde, da es aus der Expression, in einer geeigneten Wirtszelle, der entsprechenden Nucleotidsequenz resultiert, die zuvor in einen Expressionsvektor eingebracht wurde, der zum Transformieren der Wirtszelle verwendet wurde. Jedenfalls schließt dieser Ausdruck "rekombinant" nicht die Möglichkeit aus, dass das Polypeptid durch ein anderes Verfahren hergestellt sein kann, z.B. durch klassische chemische Synthese nach bekannten Verfahren, die für die Synthese von Proteinen verwendet werden, oder durch proteolytische Spaltung größerer Moleküle.
Die Erfindung betrifft insbesondere die CCR, wie sie in den Zellen von Luzerne vorhanden ist und durch SEQ ID NO 2 dargestellt wird, oder die CCR, wie sie in den Zellen von Mais vorhanden ist und durch SEQ ID NO 4 dargestellt wird, wobei diese CCR so sind, wie sie in im Wesentlichen reiner Form durch Extraktion und Reinigung, ausgehend von Luzerne oder von Mais, erhalten werden, oder jedes Protein, das von diesen Letzteren abgeleitet ist, insbesondere durch Addition und/oder Suppression und/oder Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren, oder jedes Fragment, das von diesen CCR oder ihren abgeleiteten Sequenzen stammt, wobei diese Fragmente und abgeleiteten Sequenzen eine enzymatische Aktivität besitzen können, die äquivalent zu jener der oben genannten CCR ist.
Die Erfindung bezieht sich auch auf Nucleotidsequenzen, die für die CCR codieren, die durch SEQ ID NO 2 oder SEQ ID NO 4 dargestellt wird, oder jede abgeleitete Sequenz oder jedes Fragment dieser Letzteren, wie oben definiert, wobei diese Nucleotidsequenzen dadurch gekennzeichnet sind, dass sie ganz oder teilweise den Sequenzen entspre chen, die durch SEQ ID NO 1 bzw. SEQ ID NO 3 dargestellt werden, oder Sequenzen, die von Letzteren abgeleitet sind durch Degenerierung des genetischen Codes, und die dennoch fähig sind, für die CCR oder abgeleitete Sequenzen oder Fragmente dieser Letzteren, wie oben definiert, zu codieren.
Die Erfindung betrifft auch Komplexe, die zwischen den Antisense-mRNA, wie oben beschrieben, und den mRNA gemäß der Erfindung gebildet sind, die fähig sind, für die ganze oder einen Teil der CCR bei Pflanzen zu codieren.
Die Erfindung hat insbesondere den Komplex zum Gegenstand, der zwischen der mRNA, die von der SEQ ID NO 1 codiert wird, und der Antisense-mRNA, die von der zur Sequenz SEQ ID NO 1 komplementären Sequenz codiert wird, gebildet wird, ebenso wie den Komplex, der zwischen der mRNA, die von der Sequenz SEQ ID NO 3 codiert wird, und der Antisense-mRNA, die von der zur Sequenz SEQ ID NO 3 komplementären Sequenz codiert wird, gebildet wird.
Die Erfindung betrifft insbesondere jede rekombinante Nucleotidsequenz (oder rekombinante DNA), die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie zumindest eine DNA-Sequenz gemäß der Erfindung enthält, die unter den oben beschriebenen ausgewählt ist, wobei die DNA-Sequenz in eine heterologe Sequenz inseriert ist.
Die Erfindung betrifft insbesondere jede rekombinante Nucleotidsequenz, wie oben beschrieben, die als codierende Region die Nucleotidsequenz enthält, die durch SEQ ID NO 1 oder durch SEQ ID NO 3 dargestellt wird, oder jedes Fragment oder eine Nucleotidsequenz, die von diesen Letzteren abgeleitet ist, wie jene, die oben definiert sind, wobei diese Nucleotidsequenzen oder dieses Fragment in eine heterologe Sequenz inseriert sind, und die fähig sind, für die CCR zu codieren, die durch SEQ ID NO 2 bzw. SEQ ID NO 4 dargestellt wird, oder für ein Fragment dieser CCR oder für ein Protein, das von Letzteren abgeleitet ist, wie oben definiert.
Die Erfindung betrifft insbesondere noch jede rekombinante Nucleotidsequenz, die als codierende Region eine Nucleotidsequenz enthält, die komplementär zu jener ist, die durch SEQ ID NO 1 oder SEQ ID NO 3 dargestellt wird, oder jedes Fragment oder jede Nucleotidsequenz, die von dieser komplementären Sequenz abgeleitet ist, wie oben definiert, wobei die komplementären Sequenzen oder das Fragment in eine heterologe Sequenz inseriert sind, und die fähig sind, für eine Antisense-mRNA zu codieren, die mit der gesamten oder Teilen der mRNA hybridisieren kann, die für eine CCR bei Pflanzen codiert, und insbesondere mit der gesamten oder Teilen der mRNA, die für die CCR codiert, die durch SEQ ID NO 2 oder SEQ ID NO 4 dargestellt wird.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten DNA sind darüber hinaus dadurch gekennzeichnet, dass sie die Elemente enthalten, die für das Regulieren der Expression der Nucleotidsequenz, die für eine CCR codiert, oder ihrer komplementären Sequenz, die für eine Antisense-mRNA gemäß der Erfindung codiert, notwendig sind, insbesondere einen Promotor und einen Terminator für die Transkription dieser Sequenzen.
Unter den verschiedenen Promotoren, die bei den Konstruktionen der rekombinanten DNA gemäß der Erfindung verwendet werden können, kann man nennen:

– den endogenen Promotor, der die Expression der CCR bei einer Pflanze kontrolliert, insbesondere den Promotor, der stromaufwärts der DNA-Sequenz gelegen ist, die durch SEQ ID NO 5 dargestellt wird, die bei Eukalyptus für die CCR codiert, die durch SEQ ID NO 6 dargestellt wird, oder
– Promotoren des Typs, der starke Expression verleiht. Beispiele: ³⁵S CAMV (beschrieben in Benfey et al. (1990), EMBO J., 9(6), 1677–1684), EF1α (Promotor des Gens eines Elongationsfaktors in der Proteinsynthese, beschrieben von Curie et al. (1991), Nucl. Acids Res., 19, 1305–1310),
– Promotoren des Typs, der spezifisch für besondere Expression in einzelnen Geweben ist. Beispiele: Promotor CAD (beschrieben von Feuillet C. (1993), These de l'Université de Toulouse III), Promotor GRP 1-8 (beschrieben von Keller und Baumgartner, (1991), Plant Cell., 3, 1051–1061) für Expression in, speziellen vaskulären Geweben.

Die Erfindung betrifft auch jede rekombinante Nucleotidsequenz, wie oben beschrieben, die auch als codierende Region zumindest eine Nucleotidsequenz enthält, die für die gesamte oder einen Teil der mRNA codiert, die selbst für ein anderes Enzym als die CCR codiert, das mit einem Ligninbiosyntheseschritt bei Pflanzen in Zusammenhang steht, insbesondere die mRNA, die für Cinnamylalkoholdehydrogenase (CAD) codiert, oder die auch als codierende Region mindestens eine Nucleotidsequenz enthält, die für die gesamte oder einen Teil einer Antisense-mRNA codiert, die in der Lage ist, mit der oben genannten mRNA zu hybridisieren, insbesondere mit der mRNA, die für CAD codiert.
Die oben genannten rekombinanten Nucleotidsequenzen gemäß der Erfindung werden zweckmäßigerweise ausgehend von Vektoren erhalten, in die die DNA-Sequenzen inseriert sind, die für ein Enzym codieren, das für die Ligninbiosynthese bei den Pflanzen notwendig ist.
Die oben genannten Vektoren werden mit Hilfe von geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, um diese DNA-Sequenzen, die sich dort inseriert finden, wieder zu erhalten.
Die Letzteren werden dann stromabwärts eines geeigneten Promotors und stromaufwärts eines geeigneten Terminators der Expression in die rekombinanten DNAs gemäß der Erfindung inseriert.
Die Erfindung betrifft insbesondere rekombinante DNAs, die die durch SEQ ID NO 1 dargestellte Sequenz oder jene, die durch SEQ ID NO 3 dargestellt wird, enthalten, wie sie durch Verdauung der oben genannten Vektoren und Rückgewinnung der DNA-Sequenz gemäß der Erfindung und Inserieren dieser Letzteren in Richtung 5' → 3' in eine heterologe DNA-Sequenz, die einen Promotor und einen Terminator für die Expression der genannten Sequenz enthält, erhalten werden.
Die Erfindung hat auch insbesondere zum Gegenstand rekombinante DNAs, die eine Sequenz enthalten, die komplementär zur Sequenz ist, die durch SEQ ID NO 1 dargestellt wird, oder zu jener, die durch SEQ ID NO 3 dargestellt wird, wie sie durch Verdauung der oben genannten Vektoren, Rückgewinnung der DNA-Sequenz gemäß der Erfindung und Inserieren dieser Letzteren in inverser Richtung, d.h. in Richtung 3' → 5', in eine heterologe DNA-Sequenz, die einen Promotor und einen Terminator für die Expression der komplementären Sequenz enthält, erhalten werden.
Als Beispiel für den Terminator, der in solchen Konstruktionen verwendbar ist, kann man das 3'-Ende des Gens der Nopalinsynthase von Agrobacterium tumefaciens nennen.
So werden in allgemeiner Weise die rekombinanten Nucleotidsequenzen gemäß der Erfindung, die eine DNA-Sequenz enthalten, die für eine CCR (oder ein Fragment der CCR oder ein abgeleitetes Protein) codiert, und/oder andere Enzyme, die für die Ligninbiosynthese notwendig sind, erhalten durch Rückgewinnung der genannten DNA-Sequenz aus den oben genannten Vektoren und Inserieren dieser Sequenz in die heterologe Sequenz, während die rekombinanten Nucleotidsequenzen, die eine DNA-Sequenz enthalten, die für eine Antisense-mRNA gemäß der Erfindung codiert, durch Rückgewinnung der oben genannten DNA-Sequenz und Inserieren der Letzteren in inverser Richtung in die genannte heterologe Sequenz erhalten werden.
Zur Illustration: Man kann die gesamte oder einen Teil der komplementären DNA (cDNA), die durch SEQ ID NO 1 oder SEQ ID NO 3 dargestellt wird, für die Konstruktion der oben genannten rekombinanten DNAs verwenden, oder auch den ganzen oder Teile des genomischen Klons, der einer CCR entspricht (entsprechend der oben genannten cDNA + eventuellen Introns). Dieser genomische Klon kann erhalten werden, indem die cDNAs als Sonden zum Screening einer genomischen Bank verwendet werden, wobei diese Letztere selbst gemäß dem Verfahren erhalten wird, das von Sambrook, Fritsch und Maniatis, Molecular Cloning Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989, beschrieben wird.
Die Erfindung hat auch jeden rekombinanten Vektor zum Gegenstand, der für die Transformation von Pflanzen verwendbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass er eine rekombinante Nucleotidsequenz enthält, die unter jenen ausgewählt ist, die oben beschrieben sind, gemäß der Erfindung, die in eine der Stellen seines Genoms integriert ist, die für seine Replikation nicht essentiell sind.
Unter den oben genannten rekombinanten Vektoren, die für die Transformation von Pflanzen verwendbar sind, kann man nennen: die binären Vektoren, die von pBIN 19 stammen (Bevan et al., (1984), Nucl. Acids Res., 12(22), 8711–8721).
Beispiele für die Konstruktion rekombinanter Vektoren gemäß der Erfindung sind in der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung beschrieben.
Die vorliegende Erfindung hat auch zum Gegenstand ein Verfahren zur Regulierung der Biosynthese von Lignin bei Pflanzen, sei es durch Verringerung, sei es durch Vergrößerung der produzierten Ligninmengen im Vergleich zu den normalen Ligninmengen, die bei diesen Pflanzen produziert werden, wobei das Verfahren einen Schritt der Transformation von Zellen dieser Pflanzen mit Hilfe eines Vektors umfasst, der enthält:

– die Nucleotidsequenz, die durch SEQ ID NO 1 oder durch SEQ ID NO 3 dargestellt wird, oder ein Fragment der oben genannten Nucleotidsequenzen, wobei dieses Fragment für eine mRNA codiert, wobei diese mRNA selbst für ein Fragment einer CCR bei den Pflanzen codiert, dieses CCR-Fragment eine enzymatische Aktivität aufweist, die äquivalent zu jener der CCR ist, die durch SEQ ID NO 2 oder durch SEQ ID NO 4 dargestellt wird, oder einer Nucleotidsequenz, die von den oben genannten Nucleotidsequenzen abgeleitet ist, oder die vom oben genannten Fragment abgeleitet ist, insbesondere durch Mutation und/oder Addition und/oder Suppression und/oder Substitution eines oder mehrerer Nucleotide, wobei diese abgeleitete Sequenz für eine mRNA codiert, wobei diese mRNA selbst für ein abgeleitetes Protein codiert, das eine enzymatische Aktivität aufweist, die äquivalent zu jener von mindestens einer der oben genannten CCR ist, oder
– eine Nucleotidsequenz, die komplementär zur gesamten oder Teilen der Nucleotidsequenzen ist, die durch SEQ ID NO 1 oder durch SEQ ID NO 3 dargestellt werden, welche für eine mRNA codieren, oder zum Fragment dieser Sequenzen oder der Sequenz, die von diesen Letzteren abgeleitet ist, wie oben definiert, wobei diese komplementäre Sequenz für eine Antisense-mRNA codiert, die in der Lage ist, mit einer der oben genannten mRNA zu hybridisieren,

Die Erfindung hat insbesondere zum Gegenstand ein Verfahren zur Verminderung der Menge der durch Biosynthese bei den Pflanzen produzierten Lignine, wobei dieses Verfahren durch Transformation des Genoms dieser Pflanzen bewirkt wird, wobei eingebracht wird:

– mindestens eine DNA-Sequenz gemäß der Erfindung, wie oben beschrieben, die für eine Antisense-mRNA codiert, die in der Lage ist, mit der gesamten oder Teilen der mRNA zu hybridisieren, die für die CCR codiert, die durch SEQ ID NO 2 oder SEQ ID NO 4 dargestellt wird, oder für ein Protein, das von den Letzteren abgeleitet ist, wie oben definiert, und
– gegebenenfalls mindestens eine DNA-Sequenz, die für eine Antisense-mRNA codiert, die in der Lage ist, mit einer mRNA zu hybridisieren, die für anderes Enzym als CCR codiert, das mit einem Schritt der Biosynthese von Ligninen bei den Pflanzen in Zusammenhang steht, insbesondere die mRNA, die für CAD codiert,

– entweder mit Hilfe eines rekombinanten Vektors, wie er oben beschrieben ist, der eine DNA-Sequenz enthält, die für eine Antisense-mRNA codiert, die fähig ist, mit der mRNA zu hybridisieren, die für die CCR oder für ein abgeleitetes Protein codiert, wie oben definiert, und gegebenenfalls eine oder mehrere DNA-Sequenz(en) enthält, die für eine Antisense-mRNA codiert (codieren), die fähig ist, mit einer mRNA zu hybridisieren, die für ein anderes Enzym als CCR, wie oben definiert, codiert,
– oder mit Hilfe mehrerer rekombinanter Vektoren, von denen mindestens einer eine DNA-Sequenz enthält, die für eine Antisense-mRNA codiert, die fähig ist, mit der mRNA zu hybridisieren, die für CCR oder für ein abgeleitetes Protein codiert, wie oben definiert, während der (oder die) andere(n) rekombinante(n) Vektor(en) eine DNA-Sequenz enthält (enthalten), die für eine Antisense-mRNA codiert, die fähig ist, mit einer mRNA zu hybridisieren, die für ein anderes Enzym als die CCR codiert, wie oben definiert.

Ein anderes Verfahren zur Verringerung der Menge der durch Biosynthese bei den Pflanzen hergestellten Lignine ist jenes, das durch Transformation des Genoms dieser Pflanzen durchgeführt wird, indem eingebracht wird:

– mindestens eine DNA-Sequenz gemäß der Erfindung, dargestellt durch SEQ ID NO 1 oder SEQ ID NO 3, oder ein Fragment oder eine abgeleitete Sequenz der Letzteren, wie oben definiert, und
– gegebenenfalls wenigstens eine DNA-Sequenz, die für das gesamte oder einen Teil eines anderen Enzyms als CCR codiert, das mit einem Schritt der Biosynthese der Lignine bei den Pflanzen in Zusammenhang steht, insbesondere eine DNA-Sequenz die für das gesamte oder einen Teil der CAD codiert,

– entweder mit Hilfe eines rekombinanten Vektors, wie er oben beschrieben ist, der die oben genannte DNA-Sequenz gemäß der Erfindung enthält, oder ein Fragment oder eine Sequenz, die von der Letzteren abgeleitet ist, wie oben definiert, und gegebenenfalls eine oder mehrere DNA-Sequenz(en) enthält, die für die Gesamtheit oder einen Teil eines anderen Enzyms als CCR codiert (codieren), wie oben definiert,
– oder mit Hilfe mehrerer rekombinanter Vektoren, von denen mindestens einer eine oben genannte DNA-Sequenz gemäß der Erfindung enthält, oder ein Fragment oder eine Sequenz, die von dieser Letzteren abgeleitet ist, wie oben defi niert, während der (oder die) andere(n) rekombinante(n) Vektor(en) eine DNA-Sequenz enthält (enthalten), die für die Gesamtheit oder einen Teil eines anderen Enzyms als CCR, wie oben definiert, codiert.

Dieses letztere Verfahren beruft sich auf den Mechanismus der Co-Suppression. Die Co-Suppression wurde beobachtet, als Kopien des endogenen Gens in das Genom eingebracht wurden. Obwohl der Mechanismus der Co-Suppression derzeit unbekannt ist, ist eine der am häufigsten genannten Hypothesen, dass die negative Regulierung der Expression des Gens von der Produktion eines geringen Anteils an Antisense-RNA kommt, die von einem Transgen über ein Lesen des "schlechten" Stranges des Transgens stammt (Grierson et al., Trends Biotech., 9: 122–123).
Die Erfindung hat auch ein Verfahren zur Verringerung der Menge der durch Biosynthese bei den Pflanzen produzierten Lignine zum Gegenstand, wobei dieses Verfahren durch Transformation des Genoms dieser Pflanzen durchgeführt wird, indem dort eine DNA-Sequenz eingebracht wird, wie sie oben beschrieben ist, gemäß der Erfindung, die für eine Antisense-Sequenz codiert, die eine (oder mehrere) katalytische Domäne(n) eines Ribozyms enthält, die mit einer (oder mehreren) Antisense-mRNA oder (einem) Fragment(en) der Antisense-mRNA gemäß der Erfindung verbunden sind, wobei diese Transformation mit Hilfe eines rekombinanten Vektors durchgeführt wird, der eine rekombinante Nucleotidsequenz gemäß der Erfindung enthält, welche selbst die oben genannte DNA-Sequenz enthält.
Es ist wichtig anzumerken, dass die oben genannten Verfahren erlauben, zu transformierten Pflanzen zu gelangen, die unterschiedliche Niveaus der Reduktion der CCR-Aktivität (gemäß dem Niveau der Insertion der DNA-Sequenz, die für die Antisense-mRNA codiert, der Anzahl der Kopien dieser DNA-Sequenz, die in das Genom integriert wurde ...) und daher der Gehalte an Ligninen aufweisen.
Die Wahl der Transformanten erlaubt daher eine kontrollierte Modulation der Gehalte an Ligninen, die mit einer normalen Entwicklung der Pflanze kompatibel sind.
Allgemein: Wenn man bedenkt, dass der normale mittlere Ligningehalt einer Pflanze zwischen ungefähr 15% und ungefähr 35 Gew.-% der Trockensubstanz variiert, ist die Reduktion des Ligningehalts, die aus der Umsetzung eines der oben genannten Verfah ren resultiert, vorzugsweise so, dass die so transformierten Pflanzen einen mittleren Ligningehalt aufweisen, der ungefähr zwischen 10% und ungefähr 30% oder zwischen ungefähr 12% und ungefähr 32% variiert.
Zum Zwecke der Illustration: Der Ligningehalt einer Pflanze kann gemäß einer Variante des Verfahrens von Johnson et al., (1961), T. A. P. P. I., 44, 793–798, das im Detail in Alibert und Boudet (1979), Physiol., Veg., 17(1), 67–74, beschrieben ist, und dessen Hauptschritt wie folgt sind, gemessen werden: Nach Erhalt eines Benzol-Alkohol-Pulvers, das die Lignine des pflanzlichen Materials beinhaltet, werden die Lignine durch Acetylbromid gelöst und in Abhängigkeit von ihrer Absorption in UV-Licht quantitativ bestimmt.
Die Erfindung betrifft insbesondere die Anwendung von oben genannten Verfahren zur Verringerung der Ligningehalte in den Pflanzen, zum Erhalt von genetisch transformierten Futterpflanzen, die Ligningehalte aufweisen, die gegenüber den normalen Ligningehalten bei diesen Pflanzen reduziert sind, und deren Verdaulichkeit sich so gegenüber jener der gleichen nichttransformierten Pflanzen verbessert ist.
Unter den Hauptfutterpflanzen, die geeignet sind, im Rahmen der vorliegenden Erfindung transformiert zu werden, kann man nennen: Luzerne, Schwingel, Mais, der zur Ensilage bestimmt ist, usw.
Die Erfindung betrifft auch die Anwendung der oben genannten Verfahren zur Verringerung der Ligningehalte bei den Pflanzen, den Erhalt von Pflanzen und insbesondere von Bäumen, die genetisch transformiert wurden, die reduzierte Ligningehalte gegenüber den normalen Ligningehalten bei diesen Pflanzen aufweisen, wobei diese Pflanzen oder Bäume besonders vorteilhaft im Rahmen der Herstellung von Papierbrei zu verwenden sind.
Eine dritte potentielle Domäne für die Anwendung der oben genannten Verfahren zur negativen Regulierung der Expression des Gens der CCR betrifft die Stimulation des Wachstums der transformierten Pflanzen. Verschiedene Argumente unterstreichen (Sauter und Kende, 1992, Plant and Cell Physiology, 33(8): 1089), dass eine vorzeitige und rasche Lignifizierung eine Bremse für Zellvergrößerung und daher für das Wachstum von Pflanzen ist. So ist die Umsetzung der oben genannten Verfahren geeignet, um so transformierten Pflanzen mit reduzierter Lignifizierung ein verbessertes Wachstum und daher bessere Erträge zu erlauben.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Vergrößerung der Menge der durch Biosynthese bei den Pflanzen produzierten Lignine, wobei dieses Verfahren durch Transformation des Genoms dieser Pflanzen bewirkt wird, indem eingebracht wird:

– mindestens eine DNA-Sequenz gemäß der Erfindung, die durch SEQ ID NO 1 oder SEQ ID NO 3 dargestellt wird, oder ein Fragment oder eine Sequenz, die von der Letzteren abgeleitet ist, wie oben definiert, und
– gegebenenfalls mindestens eine DNA-Sequenz, die für die Gesamtheit oder einen Teil eines anderen Enzyms als die CCR codiert, welches mit einem Schritt der Ligninbiosynthese bei den Pflanzen in Zusammenhang steht, insbesondere eine DNA-Sequenz, die für die Gesamtheit oder einen Teil der CAD codiert,

– entweder mit Hilfe eines rekombinanten Vektors, wie oben beschrieben, der die oben genannte DNA-Sequenz gemäß der Erfindung enthält, oder ein Fragment oder eine von dieser Letzteren abgeleitete Sequenz, wie oben definiert, und gegebenenfalls eine oder mehrere DNA-Sequenz(en) enthält, die für die Gesamtheit oder einen Teil eines anderen Enzyms als die CCR codiert, wie oben definiert,
– oder mit Hilfe mehrerer rekombinanter Vektoren, von denen mindestens einer eine oben genannte DNA-Sequenz gemäß der Erfindung enthält, oder ein Fragment oder eine Sequenz, die von der Letzteren abgeleitet ist, wie oben definiert, während der (oder die) andere(n) rekombinante(n) Vektor(en) eine DNA-Sequenz enthält (enthalten), die für die Gesamtheit oder einen Teil eines anderen Enzyms als die CCR codiert, wie oben definiert.

Allgemein: Wenn man bedenkt, dass der normale mittlere Ligningehalt einer Pflanze zwischen ungefähr 15% und ungefähr 35 Gew.-% der Trockensubstanz variiert, ist die Erhöhung des Ligningehalts, die aus der Umsetzung des oben genannten Verfahrens resultiert, vorteilhafterweise so, dass die so transformierten Pflanzen einen mittleren Ligningehalt aufweisen, der zwischen ungefähr 20% und ungefähr 40% oder zwischen ungefähr 18% und ungefähr 38% variiert.
Die Erfindung betrifft insbesondere die Anwendung des oben genannten Verfahrens zur Vergrößerung der Ligningehalte bei den Pflanzen (auch Verfahren zur Überexpression des Gens der CCR genannt), zum Erhalt von genetisch transformierten Pflanzen, die erhöhte Ligningehalte im Vergleich zu normalen Ligningehalten bei diesen Pflanzen aufweisen und deren Widerstand gegen Umweltattacken, insbesondere Parasitenbefall, gegenüber den gleichen nichttransformierten Pflanzen verbessert ist. Es ist insbesondere in dem letzteren Fall von Vorteil, in Verbindung mit dem CCR-Gen oder einer abgeleiteten Sequenz in den oben genannten Vektoren spezifische Promotoren zu verwenden, die insbesondere in Oberflächengeweben und/oder bei Wundreaktion exprimiert werden.
Außerdem betrifft die Erfindung auch die Anwendung des oben genannten Verfahrens zur Überexpression des Gens der CCR zur Verbesserung des Wachstums der so genetisch transformierten Pflanzen, insbesondere in bestimmten Gebieten, wie dem Gartenbau oder der Forstwirtschaft, wo Pflanzen mit reduzierter Dimension erwünscht sind.
Schließlich haben die Benzolringe des Lignins eine viel größere innere Energie als die aliphatischen Ketten der Glucosereste der Cellulose. Daher erlaubt die Vergrößerung des Anteils an Ligninen bei den Pflanzen, die als Brennstoff verwendet werden, gemäß dem oben genannten Verfahren der Erfindung die Verbesserung der potentiellen Energie dieser so transformierten verbrennbaren Pflanzen.
In den beiden Fällen der negativen Regulierung oder der Überexpression der CCR ist es durchaus vorhersehbar, dass die Modulation dieser Aktivität sich auf den Gehalt an Ligninen der transformierten Pflanzen niederschlägt. Tatsächlich scheint die CCR, deren Aktivitätsniveau in der Pflanze sehr niedrig ist, das Regulatorenzym für die Synthese der Lignine zu sein.
Beim Ausführen der Transformationstechniken, die zur Umsetzung eines der oben beschriebenen Verfahren der Erfindung verwendet werden, kann man vorzugsweise auf folgende Techniken zurückgreifen:

A) Die Technologie der Transformation mit Hilfe von Plasmid Ti von Agrobacterium tumefaciens, beschrieben von Bevan (1984), Nucleic Acid Research, 12: 8711–8721. Sie stützt sich im Wesentlichen auf das Verfahren der Co-Kultur und setzt eine Co-Transformation mit einem ausgewählten Gen ein, um die Transformanten zu erkennen. Sie ist insbesondere auf Dikotyle, z.B. Tabak, Luzerne, Raps, anwendbar.
B) Die Technik des direkten Transfers von Genen durch Biolistik, im Detail beschrieben von Zumbrum et al., 1989, Technique 1, 204–216; Sanford et al., 1991, Technique 3, 3–16.

Diese Technik umfasst die Kombination der rekombinanten DNA gemäß der Erfindung mit Mikropartikeln von Gold oder Wolfram, die mit Hilfe einer Partikelkanone auf das zu transformierende Gewebe geschossen werden. Sie wird insbesondere bei der Transformation von Sorten verwendet, die widerstandsfähig gegen Agrobakterien sind.
In den beiden oben genannten Fällen wird der Nachweis des Vorhandenseins von rekombinanter DNA gemäß der Erfindung durch Hybridisierungsexperimente des Typs Southern und Gen-Amplifikation (Polymerase-Kettenreaktion), mit Hilfe von Sonden und Oligonucleotid-Primern realisiert, die insbesondere von der Sequenz SEQ ID NO 1 oder SEQ ID NO 3 abgeleitet sind.
Die Erfindung betrifft auch Pflanzenzellen, die durch einen Vektor gemäß der Erfindung transformiert wurden, insbesondere durch die oben beschriebenen Techniken, und eine DNA-Sequenz gemäß der Erfindung in stabiler Weise in ihrem Genom integriert haben.
Die Erfindung betrifft auch transformierte Pflanzen, wie jene, die durch Kultur der oben genannten transformierten Zellen erhalten werden.
Die transformierten Pflanzen können dann auf geschlechtlichem oder vegetativem Weg in vitro oder in natura vermehrt werden.
Die Erfindung hat auch zum Gegenstand Fragmente von Pflanzen, insbesondere Früchte, Samen, Pollen, die durch Einbringung einer DNA-Sequenz gemäß der Erfindung mit Hilfe von oben genannten rekombinanten Vektoren in ihr Genom transformiert sind.
Die Erfindung betrifft auch Antikörper, der gegen die rekombinanten Polypeptide der Erfindung gerichtet sind, und insbesondere jene, die gegen die oben genannten rekombinanten CCR gerichtet sind.
Derartige Antikörper können durch Immunisierung eines Tieres mit diesen Polypeptiden, gefolgt von Gewinnung der gebildeten Antikörper erhalten werden.
Es versteht sich, dass diese Herstellung nicht auf polyklonale Antikörper beschränkt ist.
Sie ist auch auf alle monoklonalen Antikörper anwendbar, die durch ein Hybridom erzeugt werden, das geeignet ist, durch klassische Methoden gebildet zu werden, ausgehend von einerseits Milzzellen eines Tieres, insbesondere einer Maus oder einer Ratte, die gegen eines der gereinigten Polypeptide der Erfindung immunisiert sind, und andererseits von geeigneten Myelom-Zellen, und ausgewählt zu werden nach ihrer Kapazität, monoklonale Antikörper zu erzeugen, die das oben genannte Polypeptid wiedererkennen, das ursprünglich für die Immunisierung der Tiere eingesetzt wurde.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der genannten Antikörper, die gegen die rekombinanten Polypeptide der Erfindung gerichtet sind, um ein Verfahren zum Auffinden oder für die Analyse der CCR bei Pflanzen an Proben, die diesen Letzteren entnommen wurden.
Es empfiehlt sich zu präzisieren, dass von den Nucleotidsequenzen der Erfindung und ihrer oben genannten Verwendung ausgeschlossen sind: die Nucleotidsequenzen, die durch SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 9 und SEQ ID NO 11 dargestellt werden, die jeweils für die CCR von Eukalyptus, die durch SEQ ID NO 6 dargestellt wird, die CCR von Pappeln, die durch SEQ ID NO 8 dargestellt wird, die CCR von Schwingel, die durch SEQ ID NO 10 dargestellt wird, und die CCR von Tabak, die durch SEQ ID NO 12 dargestellt wird, codieren, sowie die Sequenz, die durch SEQ ID NO 13 dargestellt wird, die für das Protein codiert, das durch SEQ ID NO 14 dargestellt wird, das von der oben genannten CCR des Eukalyptus stammt.
Ebenso sind von den Nucleotidsequenzen der Erfindung und ihrer oben genannten Verwendung ausgeschlossen: die Sequenzen, die komplementär zu den Nucleotidsequenzen SEQ ID NO Nr. 5, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11 und SEQ ID NO 13 sind, sowie die Fragmente oder Sequenzen, die von diesen Nucleotidsequenzen oder ihren komplementären Sequenzen abgeleitet sind, insofern als diese Fragmente und abgeleiteten Sequenzen identisch sind mit Fragmenten und abgeleiteten Sequenzen, wie oben definiert, von Nucleotidsequenzen, die dargestellt sind durch SEQ ID NO 1 und SEQ ID NO 3, oder ihren komplementären Sequenzen.
Ebenfalls ausgeschlossen vom Rahmen der vorliegenden Erfindung sind:

– die mRNA, die von den Sequenzen der DNA codiert wird, die durch SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11 und SEQ ID NO 13 dargestellt sind, oder die codiert werden von einem Fragment oder einer Sequenz, die von diesen DNA-Sequenzen abgeleitet ist, insofern als dieses Fragment oder die abgeleitete Sequenz identisch zu Fragmenten und abgeleiteten Sequenzen sind, wie oben definiert, von Sequenzen, die durch SEQ ID NO 1 und SEQ ID NO 3 dargestellt werden,
– die Antisense-mRNA, die aus Nucleotiden besteht, die zu den oben genannten mRNA komplementär sind,
– die Polypeptide, die durch SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 12 und SEQ ID NO 14 dargestellt werden, sowie jedes Fragment oder jede Sequenz, die von den oben genannten Polypeptiden abgeleitet ist, insofern als dieses Fragment oder diese abgeleitete Sequenz identisch sind mit Fragmenten und abgeleiteten Sequenzen, wie oben definiert, von Polypeptidsequenzen, die durch SEQ ID NO 2 und SEQ ID NO 4 dargestellt werden.

Die Erfindung wird detaillierter beschrieben in der folgenden Beschreibung über den Erhalt der CCR in gereinigter Form bei Eukalyptus und der cDNA, die für die CCR von Eukalyptus, Luzerne und Mais codiert.
A) Erhalt von gereinigter CCR von Eukalyptus und von cDNA, die für eine CCR von Eukalyptus codiert
I Reinigung der CCR von Eukalyptus
Die CCR war Gegenstand einer sehr beschränkten Anzahl von Untersuchungen. Von den wenigen sie betreffenden Publikationen kann man zitieren:

Wengenmayer H., Ebel J., Grisebach H., 1976 – Enzymatic synthesis of lignin precursors, purification and properties of a cinnamoyl CoA: NaDPH reductase from cell suspension cultures from soybean (Glycine max), Eur. J. Biochem., 65: 529–536.
Luderitz T., Grisebach H., 1981 – Enzymatic synthesis of lignin precursors, comparison of cinnamoyl: CoA reductase and cinnamyl alcohol dehydrogenase: NADP dehydrogenase from spruce (Picea abies L.) und soybean (Glycine max L.), Eur. J. Biochem., 119: 115–127.
Sarni F., Grand C., Boudet A. M., 1984 – Purification und properties of cinnamoyl: CoA reductase and cinnamoyl alcohol dehydrogenase from poplar stems (Populus x euramericana), Eur. J. Biochem., 139: 259–265.

Die nachstehend beschriebene Arbeit hat dazu beigetragen, ein neuartiges, einfaches und rasches Reinigungsprotokoll für die CCR von Eukalyptus festzulegen. Dieses Protokoll ist auch wirksamer als die zuvor in der Literatur beschriebenen. Tatsächlich gestattete es zum ersten Mal, ausreichende Mengen an bis zur Homogenität gereinigtem Enzym zu erhalten, um interne Peptidsequenzen zu erhalten und zur Klonierung der entsprechenden cDNA zu führen.
Alle Schritte der Reinigung der CCR wurden bei 4°C ausgeführt.
1. Erhalt eines Rohextraktes aus dem Xylem von Eukalyptus
Das pflanzliche Material wurde durch "Schaben" einer Gewebefraktion, die an Xylem angereichert ist, von Ästen von 5 Jahre altem Eukalyptus gunnii erhalten.
300 g Xylem, das zuvor in flüssigem Stickstoff eingefroren wurde, wurde mit Hilfe einer Kaffeemühle in Pulver umgewandelt. Das so erhaltene Mahlgut wurde in einem Liter Extraktionspuffer (100 mM Tris-HCl pH 7,6, 2% PEG 6000, 5 mM DTT, 2% PVPP) homogenisiert, durch zwei Lagen Miracloth filtriert, und einer 30%-Sättigung an Ammoniumsulfat zugeführt. Nach 30-minütigem Zentrifugieren bei 15000 × g wurde der erhaltene Rückstand in 60 ml Puffer 1 [20 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM DTT (Dithiothreitol), 5 Ethylenglycol] resuspendiert. Der so erhaltene Extrakt wird durch 15-minütige Zentrifugation bei 10000 × g "geklärt", dann durch Durchgang durch eine Sephadex G25, äquilibriert im Puffer 1, entsalzt.
2. Affinitätschromatographie auf Red Sepharose
Der entsalzte Rohextrakt wird auf eine Affinitätssäule "Red Sepharose" (1,5 × 19 cm, Pharmacia), äquilibriert in Puffer 1, gebracht. Nach einem ersten Durchspülen der Säule mit 50 ml Puffer 1 werden die Proteine durch einen linearen Tris-Gradienten von 20 mM bis 1,5 M Tris-HCl pH 7,5, der 5 mM DTT, 5% Ethylenglycol enthält, eluiert. Das Gesamtvolumen des Gradienten ist 200 ml und der Durchsatz 36 ml/h. Die eine OCR-Aktivität aufweisenden Fraktionen werden vereinigt und durch Durchgang durch eine Sephadex G25-Säule, äquilibriert in Puffer 1, entsalzt.
3. Anionenaustauschchromatographie auf MonoQ
Die so vereinigten und entsalzten Fraktionen werden auf einer Anionenaustauschsäule MonoQ (HR 5/5, Pharmacia) chromatographiert. Die Elution der Proteine erfolgt durch Anwendung eines linearen Gradienten von 20 bis 300 mM Tris-HCl pH 7,5, das 5% Ethylenglycol und 5 mM DTT enthält. Das Gesamtvolumen des Gradienten ist 50 ml und der Durchsatz 1 ml/min. Wie beim vorherigen Schritt werden die aktives CCR-Enzym enthaltenden Fraktionen vereinigt und entsalzt, aber in diesem Fall ist der Äquilibrierungspuffer der Sephadex-G25-Säulen ein 20 mM – pH 7,6 – Phosphatpuffer, der 5 mM DTT enthält (Puffer 2).
4. Affinitätschromatographie auf "Mimetic Red"
Die so erhaltene Gruppe der CCR-Fraktionen wird auf eine Mimetic Red 2 A6XL Säule (ACL, Cambridge) gebracht. Die Säule wurde zuvor mit 30 ml Puffer 2, der 8 mM NAD enthielt, gewaschen. Dieses Waschen hat zum Ziel, Enzyme zu eliminieren, die insbesondere mit NAD als Co-Faktor funktionieren, wie die Malatdehydrogenase, die zusammen mit der CCR in den vorherigen Schritten gereinigt wird. Die spezifische Elution der CCR erfolgt durch Anwendung eines NADP-Gradienten (15 ml) 0–8 mM in Puffer 2. Die das reine und aktive CCR enthaltenden Fraktionen werden nach Zugabe eines Stabilisators (Ethylenglycol in einer Endkonzentration von 5%) bei –80°C gelagert.
Das so erhaltene gereinigte Enzym weist eine spezifische Aktivität von 451 nKat/mg Protein auf, wobei Feruloyl-CoA als Substrat verwendet wird. Die erhaltene Ausbeute (36 μg reines Protein pro 300 g pflanzlichem Ausgangsmaterial) spiegelt nicht den Anteil an CCR in planta wieder, denn in dem Bestreben, das Maximum an Verunreinigungen bei jedem Reinigungsschritt zu eliminieren, wurden nur die Fraktionen im nächsten Schritt behandelt, die eine sehr hohe CCR-Aktivität zeigten. Der Reinigungsfaktor, der durch dieses Protokoll erreicht wurde, ist 282.
II Charakterisierung der CCR
Die CCR von Eukalyptus ist ein Monomer von 38 kD, wie das konvergente Ergebnisse zeigen, die man für die Größe des nativen Enzyms durch Ausschlusschromatographie auf Superose 6 (Pharmacia) und für die Größe der Monomer-Untereinheit auf denaturierendem Elektrophorese-Gel erhält. Der isoelektrische Punkt, bestimmt durch Chromatographie auf MonoP (Pharmacia), liegt nahe bei 7.
Die Untersuchung zum optimalen pH-Wert und Puffer zeigt, dass die Messung der CCR-Aktivität, wie sie anfänglich beschrieben wurde (Luderitz und Grisebach, 1981), ausgezeichnet für die Messung der CCR-Aktivität von Eukalyptus angepasst ist (Phosphatpuffer 100 mM, pH 6,25).
Die Reinheit der CCR, die in monodimensionalem Elektrophorese-Gel (SDS PAGE) als eine einzelne Bande vorliegt, wurde dadurch bestätigt, dass nach zweidimensionaler Elektrophorese und Färbung mit Silber ein einziger Fleck erhalten wurde.
III Erhalt der für die CCR von Eukalyptus codierenden cDNA
Um eventuell Probleme durch nicht nachweisbare Restkontamination zu vermeiden, wurde das reine Enzym einer präparativen Elektrophorese unter semidenaturierenden Bedingungen unterworfen und in situ im Gel verdaut. Die Verdauung wurde mit Hilfe von Endolysin C durchgeführt, das die Proteine spezifisch nach Lysinresten schneidet, was den Erhalt von relativ langen Peptiden erlaubt. Die aus der Verdauung resultierenden Peptide wurden in Umkehrphasen-HPLC getrennt und bestimmte unter ihnen wurden mit Hilfe eines Proteinmikrosequenators (Applied Biosystems 470) sequenziert. Die Sequenzen dieser internen Peptide sind nachstehend angeführt:
Peptid 8:

(a) Asn-Trp-Tyr-Cys-Tyr-Gly-Lys
(b) His-Leu-Pro-Val-Pro-X-Pro-Pro-Glu-Asp-Ser-Val-Arg X stellt irgendeine Aminosäure dar

Die für die CCR codierende cDNA wurde durch Screening mit Hilfe von Oligonucleotiden einer cDNA-Bank erhalten, die im Phagen λ ZAPII (kommerziell erhältlicher Vektor, Stratagene) konstruiert wurde, ausgehend von Messengern, die vom Xylem des Eukalyptus gunnii extrahiert wurden. 600 000 Phagen wurden mit Hilfe einer Gruppe degenerierter Oligonucleotide, die am 3'-Ende mit Hilfe einer Terminaltransferase mit ³²P markiert waren, gescreent. Die für das Screening verwendeten Oligonucleotidsequenzen wurden ausgehend von den oben genannten internen Peptidsequenzen bestimmt. Da diese Peptide durch Schneiden mit Endolysin C hergestellt wurden, wurde ein Lysin an erster Position hinzugefügt, um die Herstellung von Oligonucleotiden mit geringster Degenerierung zu erlauben. Tatsächlich gehört diese Aminosäure, die nur durch zwei Codons codiert werden kann, zu den Aminosäuren, deren Code am geringsten degeneriert ist, und daher ist sie vollkommen für die Bildung von Oligonucleotiden ausgehend von Peptidsequenzen geeignet.
Die Oligonucleotid-Sequenzen, die für das Screening der cDNA-Bank von Eukalyptus verwendet wurden, die von den unterstrichenen Aminosäuren (I = Inosin) stammen, sind unten angegeben:
Peptid 8: (a) Lys-Asn-Trp-Tyr-Cys-Tyr-Gly-Lys
Oligonucleotid 8 AA(A/G)AA(C/T)TGGTA(C/T)TG(C/T)TA(T/C)GGIAA
Peptid 13 Lys-Gly-Cys-Asp-Gly-Val-Val-His-Thr-Ala-Ser-Pro-Val-Thr-Asp-Asp
Oligonucleotid 13 AA(G/A)GGITG(C/T)GA(C/T)GGIGTIGTICA
Peptid 17 Lys-Leu-Arg-Asp-Leu-Gly-Leu-Glu-Phe-Thr-Pro-Val-Lys
Oligonucleotid 17 GA(G/A)TT(C/T)ACICCIGTIAA
Peptid 18 Lys-Gly-Asp-Leu-Met-Asp-Tyr-Gly-Ser-Leu-Glu-Glu-Ala-Ile-Lys
Oligonucleotid 18 AA(G/A)GGIGA(C/T)(C/T)TIATGGA(C/T)TA(C/T)GG
Die für das Screening verwendeten Hybridisierungsbedingungen sind wie folgt: Die Vorhybridisierung wurde für 6 bis 7 Stunden in 5 × SSPE, 0,25% Magermilchpulver, 0,05% SDS (Natriumdodecylsulfat) bei 42°C durchgeführt. Die Hybridisierung wurde in dieser selben Lösung in Gegenwart der 4 Oligonucleotide, die an 3' mit ddATPα³²P markiert waren, für 24' Stunden bei 42°C durchgeführt. Am Ende dieser 24 Stunden Hybridisierung wurden die Filter dreimal 15 Minuten in 2 × SSC, 0,1% SDS gewaschen und dann 24 Stunden bei –80°C mit einem Autoradiographiefilm in Kontakt gebracht. Die mit der Gruppe von Oligonucleotiden hybridisierenden Phagen wurden durch zwei zusätzliche Screening-Durchgänge ("plaque purification") gereinigt. Nach dem Reinigen wurden die sechs positiven Klone mit jedem der Oligonucleotide unabhängig getestet. Ein Phage hat positiv mit den 4 Oligonucleotiden reagiert, er wurde derart behandelt, dass das rekombinante Bluescript-Plasmid "ausgeschnitten" wurde, indem die Angaben des Herstellers (Stratagene) befolgt wurden. Die Restriktionskarte für das in diesem Plasmid enthaltene Insert (für CCR codierend) ist in 1 schematisch dargestellt.
IV Charakterisierung und Identifizierung der cDNA der CCR
Die Aminosäurensequenz (dargestellt durch SEQ ID NO 6), abgeleitet von der Nucleotidsequenz (dargestellt durch SEQ ID NO 5), codiert für ein Protein aus 335 Aminosäuren, dessen Molekulargewicht 36,5 kD und dessen isoelektrischer Punkt ungefähr 5,8 ist. Es ist wichtig hervorzuheben, dass alle Peptidsequenzen, die ausgehend von der gereinigten CCR erhalten wurden, in der Peptidsequenz, die von der Nucleotidsequenz der cDNA hergeleitet wurde, gefunden wurden.
Homologieuntersuchungen mit bereits existierenden Klonen wurden unter Verwendung der Programme BLAST und FASTA in allen verfügbaren Protein- und Nucleic-Bibliotheken durchgeführt. Eine signifikante Homologie wurde mit einer anderen Reduktase des Metabolimus von Phenolverbindungen, der Dihydroflavonolreduktase (DFR) gefunden. Die Identität ist ungefähr 40% und die Ähnlichkeit nahe 20% zwischen der Peptidsequenz, die von der cDNA der CCR abgeleitet wurde, und den verschiedenen Dihydroflavonolreduktasen, die in den Banken katalogisiert sind, was bestätigt, dass der identifizierte Klon von einem Klon, der für DFR codiert, verschieden ist.
V Herstellung aktiver rekombinanter CCR in E. Coli
Für die weitere Identifikation der cDNA der CCR wurde das rekombinante Protein in E. Coli hergestellt, und seine enzymatische Aktivität wurde untersucht. Die experimentellen Details dieses Versuchs sind im Folgenden beschrieben.
1 – Einbringen der cDNA in den Expressionsvektor pT7-7
Um die cDNA in dem Expressionsvektor pT7-7 (kommerziell erhältlich) unter der Kontrolle des Promotors der T7-Polymerase zu klonieren, musste man eine Nde1-Stelle beim ATG der cDNA einbringen. Das wurde mit Hilfe einer Taq-Polymerase während einer Gen-Amplifikation mit PCR (Polymerase-Kettenreaktion) zwischen einem mutierten Oligonucleotid und einem kommerziellen Primer, T7, realisiert, die auf Bluescript stromabwärts des 3'-Endes der cDNA gelegen ist. Das erhaltene Amplifikationsprodukt wird durch KpnI verdaut, diese Stelle wird dann mit Hilfe eines Klenow-Fragments der DNA-Polymerase 1 repariert, bevor man das Fragment einer Verdauung mit Nde1 unterwirft, dann wird das erhaltene Fragment, das eine Nde1-Stelle bei 5' und ein freies Ende bei 3' aufweist, mit Hilfe einer DNA-T4-Ligase in den Vektor pT7-7, der zuvor durch NdeI und Sma1 geöffnet wurde, eingebracht.
Die oben genannte mutierte Oligonucleotidsequenz ist im Folgenden angegeben.
Die unterstrichenen und kursiven Basen wurden gegenüber der ursprünglichen Sequenz geändert und erlauben die Bildung einer Nde1-Stelle (CATATG):
5'GGCAATCCCCATATGCCCGTCGACGC3'
2. Überexpression von CCR in E. Coli BL21
Die so erhaltene Konstruktion wurde in den Stamm E. Coli BL21 (kommerziell erhältlich) eingebracht, der auf seinem Chromosom das Gen der T7-Polymerase unter Kontrolle des Promotors lac UV5, einem Promotor der durch IPTG induzierbar ist, trägt. Die rekombinante Kultur wird bei 37°C bis zum Erhalt einer gemessenen OD von 1 bis 600 nm kultiviert, dann wird die Produktion von CCR durch Zugabe von IPTG (0,25% zum Schluss) in das Kulturmedium induziert. Probenahmen werden zu verschiedenen Zeit punkten nach der Induktion vorgenommen, und die Zellen werden gemäß dem Protokoll lysiert, das von Grima-Pettenati et al. (1993) beschrieben wurde. Nach der Zentrifugation wird der die löslichen Proteine enthaltende Überstand zur Messung der CCR-Aktivität und zur Sichtbarmachung der Produktion von CCR nach Elektrophorese unter denaturierenden Bedingungen verwendet. Man bemerkt das Auftreten eines Polypeptids von ungefähr 38 kD, dessen Intensität mit der Zeit nach der Induktion wächst und das nicht in den negativen Vergleichsproben (Stamm BL21, nur den Vektor pT7-7 ohne Insert enthaltend) existiert. Zusätzlich wurde der endgültige Beweis der Identität des CCR-Klons durch Messung einer CCR-Aktivität (ungefähr 7 nKat/ml Kultur nach 3 h Induktion bei 37°C) nur in den Proteinextrakten erhalten, die von den BL21-Stämmen, die das pT7-7 + cDNA-CCR enthielten, stammten.
Der pEUCCR benannte Vektor (dargestellt in 2), der die durch SEQ ID NO 5 dargestellten Sequenz kloniert in dem Bluescriptvektor enthält, wurde in Kultur in Zellen von E. Coli DH5α bei der Collection National de Culture de Microorganismes (CNCM) des Institut Pasteur in Paris am 17. März 1994 unter der Nr. I-1405 hinterlegt.
Figurenlegenden:
1: Restriktionskarte der für die CCR von Eukalyptus codierenden cDNA.
2: Schematische Darstellung des Plasmids pEUCCR, das die Sequenz enthält, die durch SEQ ID NO 5 dargestellt ist (und identifiziert durch CCR in dem Plasmid pEUCCR).
3: Schematische Darstellung der Konstruktion eines Vektors, der eine DNA-Sequenz enthält, die für die CCR von Eukalyptus codiert, gemäß der Erfindung (oder Sense-CCR-Vektor).
4: Schematische Darstellung der Konstruktion eines Vektors, der eine DNA-Sequenz enthält, die für eine Antisense-RNA codiert, die fähig ist, mit der mRNA zu hybridisieren, die für die CCR von Eukalyptus codiert, gemäß der Erfindung (oder Antisense-CCR-Vektor).
Hinsichtlich der DNA-Quelle, die der Konstruktion eines Antisense- (oder Sense-)Vekors dient
Die Antisense-RNA stammt vorzugsweise von der im Klon pEUCCR enthaltenen Sequenz. Diese Sequenz kann auf verschiedene Weise erhalten werden:

1) durch Zerschneiden der DNA-Sequenz (cDNA) der CCR, die in pEUCCR enthalten ist, mit geeigneten Restriktionsenzymen
2) durch Durchführung einer Gen-Amplifikation (PCR) mit Hilfe definierter Oligonucleotide, so dass das gewünschte DNA-Fragment synthetisiert wird.

Das so erhaltene DNA-Fragment wird in einem Expressionsvektor von Pflanzen stromabwärts eines Promotors und stromaufwärts eines Terminators kloniert. Die Klonierung wird derart durchgeführt, dass das DNA-Fragment in inverser Ausrichtung in Bezug auf den Promotor inseriert wird. In diesem neuen Vektor wird der Strang, der ursprünglich der Matrizenstrang war, der codierende Strang und vice versa.
Der neue Vektor codiert für eine RNA, deren Sequenz zu der Sequenz der messenger-RNA, die von der in pEUCCR enthaltenen Sequenz abgeleitet ist, komplementär ist.
Daher sind die beiden RNA bezüglich ihrer Sequenz, aber auch bezüglich ihrer Orientierung (5'-3') komplementär.
Es ist zweckmäßig, als DNA-Quelle für die Transkription der Antisense-RNA einen Klon der cDNA, wie jenen, der in pEUCCR enthalten ist, zu verwenden.
Beispiel für Antisense-Klonierung (cf. 4)
Die cDNA der CCR wird durch Doppelverdauung (BamHI und KpnI) ausgehend vom Vektor pEUCCR erhalten. Das so freigesetzte DNA-Fragment wird durch eine Agarosegelelektrophorese (Bluescript) physisch vom Klonierungsvektor getrennt.
Der Gelabschnitt, der dieses DNA-Fragment aufweist, wird ausgeschnitten und behandelt, um gereinigte DNA zu erhalten (mehrere Verfahren können verwendet werden, darunter die "Low Melting Agarose", beschrieben in Sambrook et al., loc. cit., Gene Clean, dessen Kit kommerziell erhältlich ist).
Das Fragment, das die BamHI- und KpnI-Enden trägt, wird mit einem Expressionsvektor von Pflanzen „ligiert", der zuvor durch dieselben Enzyme verdaut wurde, die derart ausgewählt wurden, dass die cDNA in inverser Orientierung in Bezug auf den ³⁵S-Promotor eingefügt wird. Der Strang, der in den Pflanzen transkribiert wird, ist in diesem Fall der nicht codierende Strang.
Beispiel für Sense-Klonierung (cf. 3)
In diesem Fall existieren keine "praktischen" Restriktionsstellen, um eine translationale Fusion mit dem ³⁵S-Promotor des Expressionsvektors durchzuführen. Neue zweckmäßigere Stellen wurden mit Hilfe der Technik der Gen-Amplifikation (PCR) eingefügt. Zwei Oligonucleotide wurden an 5' und 3' der cDNA definiert, an welche die Sequenzen der Stellen, die durch KpnI und BamHI erkannt werden, angefügt wurden (NB.: Es sind die gleichen Stellen, die für die oben genannte Antisense-Klonierung verwendet wurden, aber in Bezug auf die Orientierung 5'-3' verschieden positioniert).
Die Gen-Amplifikation führt zum Erhalt eines Fragments, das die Gesamtheit der codierenden Sequenz der cDNA flankiert von 2 Restriktionsstellen enthält. Die Verfahrensfolge ist identisch zu jener, die für die Antisense-Konstruktion beschrieben wurde.
Aber in diesem Fall führte man eine Fusion des Promotors in Phase mit dem ATG der CCR aus, die zu einer Überexpression der messenger-RNA und daher des Proteins CCR führen soll.
Die oben beschriebenen Klonierungsbeispiele der Sense- und Antisense-Sequenzen im Falle von CCR von Eukalyptus sind ebenso auf den Fall von CCR der Luzerne und auf jene des Mais anwendbar.
B) Erhalt der für die CCR von Luzerne (Medicago truncatula) codierenden cDNA
Merkmale der cDNA-Bank:
Die verwendete Bank wurde, ausgehend von RNA-Gesamtextrakten von Wurzeln von Medicago truncatula, im Vektor λ ZAPH (Kit „ZAP-cDNA Synthesis" von Stratagene) konstruiert.
Screening der cDNA-Bank:
Sonde:
Das Screening der Bank der Luzerne wurde mit Hilfe der cDNA, die für die CCR von Eukalyptus codiert, durchgeführt. Ein Fragment von 800 bp (Xho-Xho) von pEUCCR, markiert durch die Technik des „Random Priming", diente als Sonde.
Ausbreiten der Bank und Abdruck am Nitrocellulosefilter:
300000 Klone wurden ausgebreitet, dann auf Nitrocellulosefilter (Schleicher & Schuell) transferiert. Dazu wurden die Filter 5 min in Kulturschalen angeordnet und dann nacheinander mit den folgenden Lösungen getränkt:

1,5 M NaCl/0,5 M NaOH 5 min

1,5 M NaCl/0,5 M Tris pH 8 5 min

3 × SSC 2 min

Backen 2 Stunden bei 80°C
Vorhybridisierung – Hybridisierung:
Die Filter wurden 12 Stunden vorhybridisiert, dann 24 Stunden bei 37°C in folgendem Medium hybridisiert:
Vorhybridisierungs- und Hybridisierungsmedium:

Formamid 20%
Dextran 10%
NaCl 1 M
Lachssperma-DNA (1 mg/ml)
0,2% Polyvinylpyrrolidon
0,2% BSA
0,2% Ficoll
0,05 M Tris-HCl pH 7,5
0,1% Natriumpyrophosphat
1% SDS

Nach der Hybridisierung, wurden die Filter 2 × 10 min bei Umgebungstemperatur in 2 × SSC-1% SDS und dann 2 × 30 min bei 55°C in der gleichen Lösung gewaschen.
Nach autoradiographischer Exposition der Filter wurden 15 positive Lysebereiche identifiziert. Diese Lysebereiche wurden durch 2 zusätzliche Screening-Zyklen unter den oben beschriebenen Hybridisierungsbedingungen gereinigt.
Exzision in vivo
Ausgehend von positiven Klonen, wurde das Bluescript Plasmid des λ-Phagen gemäß dem Protokoll der in vivo Exzisonen des „ZAP-cDNA Synthesis Kit" exzisiert.
CCR-cDNA von Luzerne:
Die cDNA, die für die CCR von Luzerne codiert, mit einer Größe von 1404 bp wird zwischen den Stellen EcoR1 (Seite 5') und Xho (Seite 3') des Bluscriptvektors inseriert. Er ist aus den folgenden Teilen gebildet:

– ein nicht translatierter transkribierter 5'-Teil mit 167 bp,
– ein Bereich mit 1028 bp, der für ein Protein von 342 Aminosäuren codiert,
– ein nicht translatierter transkribierter 3'-Teil mit 209 bp.

Die erhaltene cDNA ist durch SEQ ID NO 1 dargestellt, und die von dieser cDNA abgeleitete Aminosäurensequenz ist durch SEQ ID NO 2 dargestellt.
C) Erhalt der cDNA, die für die CCR von Mais codiert:
Merkmale der cDNA-Bank:
Die verwendete Bank wurde ausgehend von RNA-Gesamtextrakten von Wurzeln von Mais (Sorte AMO 406) mit Eisenmangel im Vektor λ ZAP (Kit „ZAP-cDNA Synthesis" von Stratagene) konstruiert.
Screening der cDNA-Bank:
Sonde:
Das Screening der Bank des Mais wurde mit Hilfe der CCR cDNA von Eukalyptus durchgeführt. Ein Fragment von 800 bp (Xho-Xho) von pEUCCR, markiert durch die Technik des „Random Priming" diente als Sonde.
Ausbreiten der Bank und Abdruck am Nitrozellulosefilter:
500000 Klone wurden ausgebreitet, dann auf Nitrocellulosefilter (Schleicher & Schuell) transferiert. Dazu wurden die Filter 5 min in Kulturschalen angeordnet und dann nacheinander mit den folgenden Lösungen getränkt:

1,5 M NaCl/0,5 M NaOH 5 min

1,5 M NaCl/0,5 M Tris pH 8 5 min

3 × SSC 2 min

Backen 2 Stunden bei 80°C
Vorhybridisierung – Hybridisierung:
Die Filter wurden 12 Stunden vorhybridisiert, dann 24 Stunden bei 55°C in folgendem Medium hybridisiert:
Vorhybridisierungs- und Hybridisierungsmedium:

3 × SSC
0,5% SDS
0,1% Milchpulver
Lachssperma-DNA (1 mg/ml)

Nach der Hybridisierung wurden die Filter 2 × 10 min bei Umgebungstemperatur in 3 × SSC-0,5% SDS und dann 2 × 45 min bei 60°C in der gleichen Lösung gewaschen.
Nach autoradiographischer Exposition der Filter, wurden 20 positive Lysebereiche identifiziert. Diese Lysebereiche wurden durch 3 zusätzliche Screening-Zyklen unter den oben beschriebenen Hybridisierungsbedingungen gereinigt.
Exzision in vivo
Ausgehend von positiven Klonen, wurde das Bluescript Plasmid des λ-Phagen gemäß dem Protokoll der in vivo Exzison des „ZAP-cDNA Synthesis Kit" exzisiert.
Die erhaltene cDNA ist durch SEQ ID NO 3 dargestellt, und die von dieser cDNA abgeleitete Aminosäuresequenz ist durch SEQ ID NO 4 dargestellt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung von rekombinanten Nucleotidsequenzen, die eine (oder mehrere) codierende Region(en) enthalten, wobei diese codierende(n) Region(en) aus einer Nucleotidsequenz gebildet wird (werden), die aus den folgenden ausgewählt ist: – die Nucleotidsequenz, die durch SEQ ID NO 1 dargestellt ist, die für eine mRNA codiert, die selbst für die Cinnamoyl-CoA-Reduktase (CCR) der Luzerne, dargestellt durch SEQ ID NO 2, codiert, – die Nucleotidsequenz, die durch SEQ ID NO 3 dargestellt ist, die für eine mRNA codiert, die selbst für die CCR von Mais, dargestellt durch SEQ ID NO 4, codiert. – die Nucleotidsequenz, welche zu jener, die durch SEQ ID NO 1 oder SEQ ID NO 3 dargestellt ist, komplementär ist, für die Transformation von Pflanzenzellen, um transgene Pflanzen zu erhalten, in denen die Ligninbiosynthese im Sinne einer Erhöhung oder im Sinne einer Verringerung der Gehalte an produziertem Lignin im Vergleich zu den normalen Gehalten an in Pflanzen produziertem Lignin reguliert wird.
DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, dass sie als codierende Region die Nucleotidsequenz, die durch SEQ ID NO 1 dargestellt ist, enthält, welche für eine mRNA codiert, die selbst für die CCR codiert, die durch SEQ ID NO 2 dargestellt ist.
DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, dass sie als codierende Region die Nucleotidsequenz, die durch SEQ ID NO 3 dargestellt ist, enthält, welche für eine mRNA codiert, die selbst für die CCR codiert, die durch SEQ ID NO 4 dargestellt ist.
DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, dass sie als codierende Region die Nucleotidsequenz enthält, die komplementär zu jener ist, die durch SEQ ID NO 1 dargestellt ist.
DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, dass sie als codierende Region die Nucleotidsequenz enthält, die komplementär zu jener ist, die durch SEQ ID NO 3 dargestellt ist.
mRNA, die durch eine DNA-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 2 bis 5 codiert ist, ausgewählt aus: – der mRNA, die durch die DNA-Sequenz, die durch SEQ ID NO 1 dargestellt ist, codiert ist, wobei die mRNA ihrerseits für die CCR der Luzerne codieren kann, wie sie durch SEQ ID NO 2 dargestellt ist, – der mRNA, die durch die DNA-Sequenz, die durch SEQ ID NO 3 dargestellt ist, codiert ist, wobei die mRNA ihrerseits für die CCR des Mais codieren kann, wie sie durch SEQ ID NO 4 dargestellt ist.
Antisense-mRNA, die eine Modulation der Biosynthese von Lignin bei Pflanzen bewirkt, dadurch gekennzeichnet, dass sie Nucleotide enthält, die komplementär zu Nucleotiden sind, die eine mRNA gemäß Anspruch 6 bilden.
Rekombinante CCR von Luzerne oder von Mais, die durch SEQ ID NO 2 bzw. SEQ ID NO 4 dargestellt ist.
Nucleotidsequenzen, die für die durch SEQ ID NO 2 oder SEQ ID NO 4 dargestellte CCR codieren, wobei die Nucleotidsequenzen dadurch gekennzeichnet sind, dass sie den Sequenzen, die durch SEQ ID NO 1 bzw. SEQ ID NO 3 dargestellt sind, oder Sequenzen, die von Letzteren durch Degeneration des genetischen Codes abgeleitet wurden und dennoch für eine oben genannte CCR codieren können, entsprechen.
Komplexe, die zwischen einer Antisense-mRNA gemäß Anspruch 7 und einer mRNA gemäß Anspruch 6 gebildet sind.
Rekombinante Nucleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens eine DNA-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 2 und 3 enthält, die für eine mRNA codieren kann, die selbst für eine CCR von Luzerne oder von Mais codieren kann, wobei die Sequenz gemäß einem der Ansprüche 2 und 3 in eine heterologe Sequenz inseriert ist.
Rekombinante Nucleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens eine komplementäre DNA-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 4 und 5 enthält, die in eine heterologe Sequenz inseriert ist, wobei die komplementäre DNA-Se quenz für eine Antisense-mRNA gemäß Anspruch 7 codiert.
Rekombinante Nucleotidsequenz gemäß Anspruch 11 oder Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass sie die notwendigen Elemente zur Regulierung der Expression der Nucleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 2 und 3 oder ihrer komplementären Sequenz nach einem der Ansprüche 4 und 5, insbesondere einen Promotor und einen Terminator für die Transkription dieser Sequenzen, und gegebenenfalls mindestens eine DNA-Sequenz, die für ein anderes Enzym als CCR codiert, das mit einem Ligninbiosyntheseschritt bei Pflanzen in Zusammenhang steht, insbesondere mRNA, die selbst für Cinnamylalkoholdehydrogenase (CAD) codiert, oder mindestens eine Sequenz, die für eine Antisense-mRNA codiert, die fähig ist, mit der oben genannten mRNA, insbesondere mit der mRNA, die für die CAD codiert, zu hybridisieren, enthält.
Rekombinanter Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er eine rekombinante Nucleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13 enthält, die an einer seiner Stellen seines Genoms inseriert ist, die für seine Replikation nicht essentiell ist.
Verfahren zur Regulierung der Biosynthese von Lignin bei Pflanzen durch Verringerung oder Erhöhung der Gehalte an produziertem Lignin im Vergleich zu den normalen Gehalten an produziertem Lignin bei Pflanzen, wobei das Verfahren einen Schritt der Transformation der Zellen der Pflanzen mit Hilfe eines Vektors gemäß Anspruch 14 umfasst.
Verfahren zur Verringerung der Biosynthese von Lignin bei Pflanzen und somit zur Verringerung der Gehalte an produziertem Lignin im Vergleich zu den normalen Gehalten an produziertem Lignin bei Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, dass dies durch Transformation des Genoms dieser Pflanzen bewirkt wird, indem dort eingebracht wird: – mindestens eine DNA-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 4 und 5, – und gegebenenfalls mindestens eine DNA-Sequenz, die für eine Antisense-mRNA codiert, die fähig ist, mit einer mRNA, die für ein anderes Enzym als CCR codiert, das mit einem Ligninbiosyntheseschritt bei Pflanzen in Zusammenhang steht, insbesondere der mRNA, die für die CAD codiert, zu hybridisieren, wobei die Transformation durchgeführt wird mit: – einem rekombinanten Vektor gemäß Anspruch 14, der eine rekombinante Nucleotidsequenz gemäß Anspruch 12 oder Anspruch 13 enthält, – oder mehreren rekombinanten Vektoren, von denen mindestens einer eine rekombinante Nucleotidsequenz gemäß Anspruch 12 enthält, wohingegen der (oder die) andere(n) rekombinante(n) Vektor(en) eine DNA-Sequenz enthält (enthalten), die für eine Antisense-mRNA codiert, die fähig ist, mit einer mRNA zu hybridisieren, die für ein anderes Enzym als CCR, wie oben definiert, codiert.
Verfahren zur Verringerung der Biosynthese von Lignin bei Pflanzen und somit zur Verringerung der Gehalte an produziertem Lignin im Vergleich zu den normalen Gehalten an produziertem Lignin bei Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, dass dies durch Transformation des Genoms dieser Pflanzen bewirkt wird, indem dort eingebracht wird: – mindestens eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 2 und 3, – und gegebenenfalls mindestens eine DNA-Sequenz, die für ein anderes Enzym als CCR codiert, das mit einem Ligninbiosyntheseschritt bei Pflanzen in Zusammenhang steht, insbesondere eine DNA-Sequenz, die für die CAD codiert, wobei die Transformation durchgeführt wird mit: – einem rekombinanten Vektor gemäß Anspruch 14, der eine rekombinante Nucleotidsequenz gemäß Anspruch 11 oder Anspruch 13 enthält, – oder mehreren rekombinanten Vektoren, von denen mindestens einer eine rekombinante Nucleotidsequenz gemäß Anspruch 11 enthält, wohingegen der (oder die) andere(n) rekombinante(n) Vektor(en) eine DNA-Sequenz enthält (enthalten), die für ein anderes Enzym als CCR, wie oben definiert, codiert.
Verfahren zur Erhöhung der Biosynthese von Lignin bei Pflanzen und somit zur Erhöhung der Gehalte an produziertem Lignin im Vergleich zu den normalen Gehalten an produziertem Lignin bei Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, dass dies durch Transformation des Genoms dieser Pflanzen bewirkt wird, indem dort eingebracht wird: – mindestens eine DNA-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 2 und 3, – und gegebenenfalls mindestens eine DNA-Sequenz, die für ein anderes Enzym als CCR codiert, das mit einem Ligninbiosyntheseschritt bei Pflanzen in Zusammenhang steht, insbesondere eine DNA-Sequenz, die für die CAD codiert, wobei die Transformation durchgeführt wird mit: – einem rekombinanten Vektor gemäß Anspruch 14, der eine rekombinante Nucleotidsequenz gemäß Anspruch 11 oder Anspruch 13 enthält, – oder mehreren rekombinanten Vektoren, von denen mindestens einer eine rekombinante Nucleotidsequenz gemäß Anspruch 11 enthält, wohingegen der (oder die) andere(n) rekombinante(n) Vektor(en) eine DNA-Sequenz enthält (enthalten), die für ein anderes Enzym als CCR, wie oben definiert, codiert.
Pflanzen oder Teile von Pflanzen, insbesondere Zellen, Früchte, Samen, Pollen, die durch Einbringen mindestens einer Nucleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 2 bis 5 in ihr Genom transformiert sind.
Rekombinante CCR, dargestellt durch SEQ ID NO 2 oder SEQ ID NO 4, wie man sie durch Transformation von Pflanzenzellen durch Einbringen einer rekombinanten Nucleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13, insbesondere mit Hilfe eines Vektors gemäß Anspruch 14, in ihr Genom auf stabile Weise erhält.