DE60128796T2

DE60128796T2 - Verfahren zur herstellung von pflanzen mit erhöhter resistenz gegen wasserstress

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Publication number: DE60128796T2
Application number: DE60128796T
Authority: DE
Inventors: Michel Zivy; Pascual Perez
Original assignee: ARVALIS - INSTITUT DU VEGETAL; ARVALIS INST DU VEGETAL; Institut National de la Recherche Agronomique INRA; Biogemma SAS
Current assignee: ARVALIS - INSTITUT DU VEGETAL; ARVALIS INST DU VEGETAL; Institut National de la Recherche Agronomique INRA; Biogemma SAS
Priority date: 2000-04-28
Filing date: 2001-04-24
Publication date: 2008-02-07
Anticipated expiration: 2021-04-25
Also published as: CZ20023569A3; WO2001083756A1; FR2808285A1; ES2284642T3; HUP0300654A2; HUP0300654A3; FR2808285B1; ATE364082T1; CA2407240A1; DE60128796D1; AU5639801A; EP1276870A1; AU785416B2; EP1276870B1; US7154025B2; PL208102B1; US20040139505A1; CA2407240C; PL358386A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Pflanzen, die eine erhöhte Resistenz gegenüber Trockenstress aufweisen.
In gemäßigten Regionen sind unvorhersehbare Perioden mit geringem Niederschlag von unterschiedlicher Dauer Ursache einer beträchtlichen Produktivitätssenkung bei Kulturpflanzen. Dabei kann das Wasserdefizit Wachstum und Reproduktion der Pflanzen schwer beeinträchtigen. Verschiedene Strategien, bei welchen physiologische (Verringerung des Wachstums der an der Luft befindlichen Pflanzenteile und Schließung der Poren) und/oder zelluläre Mechanismen (osmotische Einstellung) angewendet werden, können es ihnen erlauben, diesem Trockenstress zu entgehen oder wenigstens zu tolerieren. An diesen Mechanismen, die wenigstens teilweise von der ABA (Abscisinsäure), ein Phytohormon, dessen Konzentration in Pflanzen ansteigt, die einem Trockenstress ausgesetzt sind (Zeevaart und Creelman, 1988), kontrolliert werden, sind zahlreiche Proteine mit verschiedenen vermuteten Funktionen beteiligt: Proteine vom Typ Membrankanäle, solche, die als Antwort auf in der Zelle verursachte Schäden exprimiert werden (Proteasen und Proteaseinhibitoren) oder Proteine, deren Funktionen nicht direkt mit dem Stress verbunden sind, die aber bei stärkeren Trockenstress- oder Salzbedingungen exprimiert werden (Enzyme der Glykolyse und der Methioninsynthese). Die Reaktion der Pflanze ist weiterhin von Umweltparametern (Art der Belastung, Stärke und Dauer) und von genetischen Parametern (Spezies und Genotyp) abhängig, welche die Bestimmung der Rolle dieser Proteine in den Mechanismen zur Tolerierung der Trockenheit schwierig machen.
Es besteht somit ein echter Bedarf an der Aufklärung der Funktion von Genkandidaten in den Tolerierungsmechanismen gegenüber Trockenstress für ihre Verwendung in der Transgenese, die auf die Herstellung von Pflanzen gerichtet ist, die eine bessere Toleranz gegenüber Trockenstress besitzen. Dies ist insbesondere von Bedeutung für landwirtschaftliche Kulturpflanzenspezies, beispielsweise Mais, der ein maximales Empfindlichkeitsniveau gegenüber Trockenheit 15 Tage vor und 15 Tage nach der Blüte der Pflanze (Juli – August in Europa) erreicht, eine Periode, in welcher die Pflanze 45% ihres gesamten Bedarfs aufnimmt.
Eine erste Studie, die von Riccardi et al. (1998) mit einer als Io (Iodent) bezeichneten Maislinie realisiert wurde, hat etwa zwanzig Proteine gezeigt, deren Expression als Antwort auf einen Trockenstress signifikant erhöht ist, und für welche vermutete Funktionen vorgeschlagen worden sind.
Eines dieser Proteine, das in der von Riccardi et al. (1998) verwendeten Linie Io, aber nicht in der Linie F2 nachgewiesen wurde, weist Homologien mit einem Protein ASR1 ("ABA-water stress-ripening-induced Protein") der Tomate auf, das von ABA, Trockenstress und Reifung der Frucht induziert wird, aber dessen Funktion noch unbekannt ist (Lusem et al., 1993). Weitere Gene, die Homologien mit dem ASR der Tomate zeigen, sind insbesondere bei der Kartoffel (Silhavy et al., 1995), der Zitrone (Canel et al., 1995) und dem Reis (Thomas et al., 1999) identifiziert worden, wobei für die von diesen Genen codierten Proteine keine Funktion klar nachgewiesen worden ist. Eine QTL-Studie ("Quantitative Trait loci") hat es erlaubt, das Gen Asr1 in einer Region zu kartographieren, die gleichzeitig den die ASR1-Menge kontrollierenden Locus und Blattalterung- und Protandrie-QTLs enthält (De Vienne et al., 1999).
Von den Erfindern ist nun die Rolle eines rekombinanten Proteins ASR bei der direkten Antwort einer Pflanze auf Trockenstress für die Anwendung der Transgenese gezeigt worden. Es ist ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze entwickelt worden, die eine modifizierte Menge an dem Protein ASR aufweist, die ihr eine bessere Resistenz gegenüber Trockenstress im Vergleich mit einer nicht transformierten Pflanze verleiht.
Die Erfindung hat somit ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze zum Gegenstand, die eine modifizierte Menge an dem Protein ASR enthält, die ihr eine bessere Resistenz gegenüber Trockenstress im Vergleich mit einer nicht transformierten Pflanze verleiht, das die Stufen umfasst, die darin bestehen:

– mindestens eine Pflanzenzelle mit einem Vektor zu transformieren, der eine Expressionskassette enthält, die eine Nucleotidsequenz umfasst, die für ein Protein ASR codiert, und
– die so transformierte Zelle derart zu kultivieren, dass eine Pflanze erzeugt wird, die in ihrem Genom diese Expressionskassette enthält.

Unter "Protein ASR" ist ein Protein, das natürlicherweise von einer Pflanze als Antwort auf einen Trockenstress exprimiert wird, und welches eine Aminosäuresequenz, die identisch oder homolog mit der Sequenz SEQ ID Nr. 2 von Mais ist, besitzt, zu verstehen.
Unter einer "homologen Sequenz" ist vorzugsweise eine Sequenz zu verstehen, die mindestens 50% und vorzugsweise 70% Ähnlichkeit mit der Sequenz SEQ ID Nr. 2 aufweist.
In der Definition von "Protein ASR" sind erfindungsgemäß alle Proteine ASR von verschiedenen Pflanzen, beispielsweise dasjenige des Reises, sowie Proteine, die beispielsweise durch (vorzugsweise konservative) Addition, Deletion und Substitution einer kleinen Anzahl von Aminosäuren modifiziert worden sind, enthalten.
Weiterhin sind in der Definition von "Protein ASR" die Polypeptide enthalten, die von der ganzen oder einem Teil der Sequenz SEQ ID Nr. 1, Nr. 3, Nr. 4 oder Nr. 5 oder einer beliebigen homologen Sequenz codiert werden, wobei selbstverständlich ist, dass diese Polypeptide die Eigenschaft Resistenz gegenüber Trockenstress behalten.
Die Nucleinsäuresequenz, die für ein Protein ASR codiert, kann insbesondere eine Getreidesequenz, speziell eine Maissequenz, sein.
Diese Sequenz kann vorteilhafterweise eine spezifische cDNA-Sequenz des Trockenstresszustandes sein, die aus einer Maislinie durch Differenzhybridisierung isoliert worden ist. Eine solche Sequenz ist in der im Anhang befindlichen Sequenzliste enthalten und wird als SEQ ID Nr. 1 bezeichnet. Es kann auch eine genomische DNA-Sequenz, die für ein Protein ASR von Mais codiert, wie durch eine der Sequenzen SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4 und SEQ ID Nr. 5 de finiert, oder eine zu dieser homologe Sequenz verwendet werden, solange sie in einer modifizierten Menge in Bezug auf die übliche Menge, die von einer nicht transformierten Pflanze erzeugt wird, exprimiert wird.
In der im Anhang befindlichen Sequenzliste ist
SEQ ID Nr. 3 eine genomische DNA-Sequenz, die aus einer Maislinie isoliert worden ist, die das Protein ASR stark exprimiert,
SEQ ID Nr. 4 eine genomische DNA-Sequenz, die aus einer Maislinie A188 als Bezug isoliert worden ist, und
SEQ ID Nr. 5 eine genomische DNA-Sequenz, die aus einer Mais-F₂-Linie isoliert worden ist.
Diese Sequenz kann insbesondere für die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 des Proteins ASR von Mais oder eine Variante davon, beispielsweise eine Variante, welche die Sequenz SEQ ID Nr. 2 mit einer Insertion eines Lysinrestes zwischen den Aminosäuren 55 und 56 der SEQ ID Nr. 2 besitzt, codieren.
Weiterhin können Nucleotidsequenzen, die für ASR anderer Pflanzen als beispielsweise die weiter oben genannten codieren, verwendet werden.
Die für ein Protein ASR codierende Nucleinsäure wird in ein Nucleinsäurekonstrukt, das als Expressionskassette bezeichnet wird, insertiert und operabel mit Elementen verknüpft, die seine Expression und gegebenenfalls Regulation erlauben.
Von diesen Elementen sind Promotoren, Aktivatoren und Transkriptionsterminatoren zu nennen.
Vorzugsweise kann ein konstitutiver Promotor wie der Actinpromotor von Reis, gefolgt von dem Actinintron von Reis (PAR-IAR), der in dem Plasmid pAct1-F4 (Mc Elroy et al., 1991) enthalten ist, der Promotor 35S (Kay et al., 1987) oder ein spezifischer Gewebepromotor verwendet werden. Beispielhaft ist der Promotor HMGW von Weizen oder der Promotor PCRU des Gens des Rettichcruciferins zu nennen, die beide eine Expression des interessierenden Proteins in den Körnern erlauben (Anderson O. D. et al., 1989, und Depigny-Thies et al., 1992). Vorteilhafterweise können Promotorsequenzen verwendet werden, welche die Expression unter Trockenstressbedingungen induzieren (Kasuga et al., 1999). Von den in den erfindungsgemäßen Konstrukten verwendbaren Terminatoren ist insbesondere das 3'-Ende des Gens der Nopalinsynthetase von Agrobacterium tumefaciens (Depicker et al., 1982) zu nennen. Weiterhin ist der Terminator polyA 35S des Blumenkohlmosaikvirus, der in dem Artikel von Franck et al. (1980) beschrieben ist, zu nennen.
Die Expression des Proteins ASR kann auch durch die Verwendung von Sequenzen vom Typ Peptidadressiersignale (beispielsweise in Chloroplasten, Vakuolen und endoplasmatischem Retikulum) oder vom Typ Intron-, Verstärker- und Leadersequenzen reguliert werden.
Erfindungsgemäß kann die interessierende Sequenz eine Nucleotidsequenz sein, die für ein Protein ASR codiert, wobei diese Sequenz in sense angeordnet wird. Wenn die Sequenz, die für ein Protein ASR codiert, in sense angeordnet wird, wird eine transformierte Pflanze erhalten, die einen erhöhten Anteil an dem Protein ASR in Bezug auf eine nicht transformierte Pflanze aufweist. Diese Pflanze hat den Vorteil, dass sie einem Trockenstress effizienter als eine nicht transformierte Pflanze widersteht.
Die Expressionskassette wird in einen Nucleotidvektor wie ein Plasmid insertiert, der außerdem ein Markergen enthalten kann, beispielsweise ein Gen, das es erlaubt, eine transformierte Pflanze gegenüber einer Pflanze, die die transfektierte Fremd-DNA nicht enthält, auszuwählen. Als Markergen ist ein Gen zu nennen, das Resistenz gegenüber einem Antibiotikum, beispielsweise Hygromycin (Herrera-Estrella et al., 1983), oder Resistenz gegenüber einem Herbizid wie dem Sulfonamid Asulam ( WO 98/49316 ) verleiht.
Dieser Vektor oder eine beliebige Sequenz, die für ein Protein ASR codiert, wie die Sequenzen SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4 und SEQ ID Nr. 5 oder zu diesen homologe Sequenzen, sind für die Transformation von Pflanzenzellen durch dem Fachmann bekannte Verfahren zur Herstellung von erhöhte Resistenz gegenüber Trockenstress aufweisenden Pflanzen verwendbar.
Entsprechend einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Pflanzenzellen durch einen wie weiter oben definierten Vektor transformiert, der in einen Zellwirt transferiert worden ist, der in der Lage ist, die Pflanzenzellen zu infizieren, wobei er die Integration der interessierenden Nucleotidsequenzen, die anfänglich in dem Genom dieses Vektors enthalten waren, in deren Genom erlaubt. Vorteilhafterweise ist der verwendete Zellwirt eine Bakterienquelle wie Agrobacterium tumefaciens, insbesondere gemäß dem in dem Artikel von An et al. (1986) beschriebenen Verfahren, oder Agrobacterium rhizogenes, insbesondere gemäß dem in dem Artikel von Guerche et al. (1987) beschriebenen Verfahren.
So kann beispielsweise die Transformation der Pflanzenzellen durch den Transfer der Region T des extrachromosomalen zirkulären Indikatorplasmids von Tumoren Ti von Agrobacterium tumefaciens realisiert werden, indem ein binäres System (Watson et al., 1994) verwendet wird. Dazu werden zwei Vektoren konstruiert. In einem dieser Vektoren ist die Region T durch Deletion, mit Ausnahme des linken und des rechten Randes, entfernt worden, wobei ein Markergen zwischen diese insertiert wird, um die Selektion in den Pflanzenzellen zu erlauben. Der andere Partner des binären Systems ist ein Ti-Hilfsplasmid, ein modifiziertes Plasmid, das keine Region T mehr hat, aber weiterhin die Virulenzgene vir enthält, die für die Transformation der Pflanzenzelle erforderlich sind.
Entsprechend einem bevorzugten Verfahren kann das Verfahren angewendet werden, das von Ishida et al. (1996) für die Transformation von einkeimblättrigen Pflanzen beschrieben worden ist.
Es sind weitere Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens zu nennen, insbesondere die Verfahren zum direkten Transfer von Genen auf Pflanzenzellen wie die direkte Mikroinjektion in Pflanzenembryoide (Neuhaus et al., 1987), die Vakuuminfiltration (Bechtold et al. 1993), die Elektroporation (Chupeau et al., 1989), die direkte Präzipitation mittels PEG (Schocher et al., 1986) oder die Bombardierung mit mit der interessierenden Plas mid-DNA beschichteten Teilchen durch eine Kanone (Fromm, M. et al., 1990).
Entsprechend einer anderen Vorschrift wird die Transformation gemäß dem von Finer et al. (1992) beschriebenen Verfahren durchgeführt, in welchem der Beschuss mit Wolfram- oder Goldteilchen angewendet wird.
Die Erfindung hat weiterhin eine mit den weiter oben beschriebenen Nucleinsäuresequenzen transformierte Wirtszelle sowie eine Pflanze oder ein Pflanzenteil, insbesondere Frucht, Samen, Korn, Pollen, Blatt oder Knolle, die in der Lage sind, durch eines der zuvor beschriebenen Verfahren erhalten zu werden, zum Gegenstand.
Dabei kann es sich beispielsweise um landwirtschaftliche Kulturpflanzen (beispielsweise Weizen, Raps, Sonnenblumen, Erbsen, Soja, Gerste und insbesondere Mais) oder um Topfpflanzen und Blumen handeln.
Die hybriden transgenen Pflanzen, die durch die Kreuzung mindestens einer erfindungsgemäßen Pflanze mit einer anderen erhalten werden, gehören ebenfalls zum Erfindungsumfang.
Die Erfindung betrifft insbesondere eine Pflanze, die eine Erhöhung der Expression des Proteins ASR in Bezug auf eine nicht transformierte Pflanze, beispielsweise um den Faktor 2 bis 3, aufweist. Von dieser Erhöhung der Expression des Proteins ASR wird den transformierten Pflanzen eine verbesserte Resistenz gegenüber Trockenstress verliehen.
Die Resistenz der erfindungsgemäß transformierten Pflanzen gegenüber Trockenstress im Vergleich mit Bezugspflanzen kann durch verschiedene morphologische, physiologische und/oder biochemische Messverfahren unter speziellen Beregnungsbedingungen bewertet werden. Beispielsweise kann die Messung der Stresstoleranz durch phänotypische Beobachtung (i) der Blattalterung, durch morphologische Messungen und durch quantitative Analyse des Chlorophylls der Blattscheiben, (ii) der Protandrie oder des Datums des Blühens der männlichen und weiblichen Pflanzen, (iii) des Pflanzenwachstums durch Messung von endgültiger Länge und Breite der Blätter sowie der endgültigen Höhe der Pflanze und durch Untersuchung des Einrollens der Blätter oder (iv) des Ertrags an Körnern, des Gewichts von tausend Körnern und der Anzahl von Ähren pro Pflanze durchgeführt werden.
Der von den Pflanzen zu ertragende Stress kann auch durch Messung des ABA-Gehalts (Methode von Quarrie et al., 1988), durch Messung des Wasserpotenzials oder gegebenenfalls durch Verfolgung der Expression des Proteins durch zweidimensionale Elektrophorese ausgehend von einer Blattprobe bewertet werden.
Die erfindungsgemäß erhaltenen Pflanzen können auch in Versuchen zur Ergänzung von Allelen zum Nachweise der Funktion des insertierten Gens verwendet werden. Die Verwendung der Transformanten in Rückkreuzungsversuchen erlaubt es, ausschließlich das insertierte Gen in den genetischen Elternpool ohne andere Sequenzen, die den Phänotyp des Rekombinanten, was seine Trockentoleranz betrifft, beeinflussen könnten, einzutragen.
Vorzugsweise wird das insertierte Gen mit einem Selektionsmarkergen gekoppelt, das das Verfolgen der Rückkreuzungen und infolgedessen das Verfolgen der Insertion des interessierenden Gens in die Linie, bei welcher der Effekt bewertet werden soll, erleichtert.
Das Prinzip besteht in der Kreuzung des Transformanten mit der Elternlinie, die das vorteilhafte Allel des interessierenden Gens nicht besitzt, und im Vergleichen der Phänotype der rekombinanten Linie mit den Elternlinien. Weiterhin können Transformanten, welche die Genomsequenzen enthalten, in diesen Ergänzungsversuchen verwendet werden. Dieser Ergänzungsversuch erlaubt es, insbesondere nachzuweisen, ob die Überexpression der cDNA in sense den schwachen (oder nicht vorhandenen) Effekt des Allels ergänzt. So kann beispielsweise nachgewiesen werden, ob das Gen ASR1 das für QTL und PQL ("Protein quantitative Loci"), die sich in dieser genetischen Position auf dem Chromosom 10 bei Mais befinden, verantwortliche Gen ist. Dabei variiert die Menge dieses Proteins zwischen einzelnen Linien, wobei stärkere Expressionen und sogar für die Verbesserung der Pflanzen vorteilhaftere Allele detektiert und genutzt werden können. Die Detektion der vorteilhafte Allele besitzenden Pflanzen kann durch immunologische quantitative Analysen mit für das Protein ASR1 spezifischen Antikörpern (beispielsweise ELISA und Western Blot) durchgeführt werden.
Weiterhin gehört zum Erfindungsumfang die Verwendung einer für ein ASR codierenden Nucleinsäure oder eines Fragmentes davon als Sonde oder Primer bei einer PCR-Amplifikation für die Auswahl von transformierten Pflanzen, die eine bessere Resistenz gegenüber Trockenstress besitzen.
Die für ein ASR codierenden Nucleinsäuresequenzen, wie die als SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4 und SEQ ID Nr. 5 bezeichneten, sowie jedes Oligonucleotid, das aus einer dieser Sequenzen erhalten worden ist, können so als Sonden in von einem Marker gestützten Selektionsprogrammen verwendet werden, beispielsweise, um die Introgression des für das Protein ASR von Mais codierenden Gens in einer Pflanze zu verfolgen. Dafür wird mindestens eine der Sonden, beispielsweise mit einem radioaktiven Isotop, markiert und anschließend mit der genomischen DNA der Pflanze, die zuvor mit Restriktionsenzymen verdaut worden ist, unter Bedingungen, die die spezifische Hybridisierung der markierten Sonde mit der betreffenden DNA erlauben, in Berührung gebracht. Weitere Verfahren, in welchen beispielsweise die PCR angewendet wird, können ebenfalls für die Durchführung der Genotypisierung angewendet werden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Figuren und Beispiele, durch welche sie jedoch nicht beschränkt wird, näher erläutert.
Erläuterung der Figuren
In 1 ist eine Restriktionskarte des Plasmids pWP 280, das den Promotor pActinintron-Barnase-Nos PolyA enthält,
in 2 ist eine Restriktionskarte des Zwischenvektors pBIOS 308, der cDNA von ZmASR1 in sense enthält,
in 3 ist eine Restriktionskarte des Zwischenvektors pBIOS 309, der cDNA von ZmASR1 in antisense enthält,
in 4 ist die Wirkung eines jeden antisense- oder sense-Transformationsereignisses im Vergleich mit seinem eigenen Bezug (Basta-sensibel) auf die Blattalterung, wobei die Wirkung am ersten Tag der Feststellung nach der Blüte gemessen wurde, und
in 5 ist eine Kinetik der Wirkung für die Gesamtheit der sense-, nicht-transformierten und antisense-Ereignisse, gegebenenfalls unter Trockenstressbedingungen, auf die Blattalterung
gezeigt.
Beispiele
Beispiel 1: Erhaltung und Klonierung der cDNA von ZmAsr1 einer Maislinie, die das Protein ASR stark exprimiert
a) Kultivierungs- und Entnahmebedingungen für die Pflanzen, die zur Isolation der cDNA dienten
Von den Erfindern wurde die cDNA von ZmAsr1 aus Maislinien Io (Riccardi et al., 1998) oder aus gemäß denselben Kriterien wie Io ausgewählten Maislinien kloniert.
Die Maispflanzen wurden in Perlit unter kontrollierten Bedingungen in einer Kultivierungskammer (Beleuchtung: 450 mmol m^–2 s^-1, Beleuchtungszeitraum: 16 h, Temperatur Tag/Nacht: 25°C/20°C, relative Luftfeuchte 60%), gegossen mit einer Nährlösung, kultiviert. Nachdem die Pflan zen das Stadium "5 Blätter" (das 5. Blatt erscheint) erreicht hatten, wurde entweder das Gießen der Pflanzen unter Trockenstressbedingungen unterbrochen oder wurden die Bezugspflanzen weiter gegossen. 10 Tage später wurden Proben aus dem umhüllten Teil des Randes des 7. Blattes entnommen.
b) Isolierung der für den Trockenstresszustand spezifischen cDNA durch Differentialhybridisierung
Ausgehend von mRNA von gestressten Pflanzenblättern und von dem Klonierungskit Lambda ZapII cDNA synthesis/Gigapack GoldI (Stratagene, La Jolla, USA) wurde entsprechend den Anweisungen des Herstellers eine cDNA-Bank hergestellt.
Die mRNA, die aus Blättern von gestressten Pflanzen und von Bezugspflanzen hergestellt worden war, wurde in cDNA transkribiert, wobei 100 μCi radiomarkiertes ³²P-dATP und als zufällige Primer dienende Hexanucleotide verwendet wurden (Sambrook et al., 1989). Die einsträngige cDNA, die entweder aus der gestressten Pflanze oder aus der Bezugspflanze stammte, wurde mit ein und demselben Anteil auf die cDNA-Klone der Bank hybridisiert. Die Hybridisierungstemperatur im Puffersystem Phosphat/SDS/EDTA (Church und Gilbert, 1984) betrug 68°C, und es wurden die letzten Waschungen mit Lösungen durchgeführt, die 0,1·SSC 0,05% (Gew./Vol.) SDS enthielten.
Die markierten Klone wurden durch in-vivo-Exzision aus dem Phagemiden entsprechend der Vorschrift von Stratagene unter Verwendung von E. coli SOLR und dem Phagenhelfer "Exassist" gewonnen. Die DNA dieser Klone wurde sequen ziert und mit Nucleinsäuresequenzbanken (BLAST) gemäß der von Altschul et al. (1990) beschriebenen Methode verglichen. Einer dieser Klone wies eine starke Homologie mit dem Asr1 der Tomate auf und wurde als ZmAsr1 für Zea-Mais Asr1 bezeichnet.
Beispiel 2: Genomsequenzen von ZmASR1
Die Primer cASR1-1F (5'-TGTCGATCCAATTGTCACTT-3') = SEQ ID Nr. 6 und cASR1-740R (5'-TGGAGAAACGTAAACAACTA-3') = SEQ ID Nr. 7, welche die zwei Enden der cDNA-Sequenz des Proteins ASR1 definieren, wurden zur PCR-Amplifikation auf die gesamte DNA der Maislinie verwendet. Die PCR-Reaktionen wurden entsprechend den herkömmlichen Verfahren durchgeführt.
Die PCR-Produkte wurden mit Elektrophorese analysiert: Eine Bande bei 900 pb wurde gewonnen, um daraus DNA zu extrahieren und entsprechend den herkömmlichen Verfahren zu klonieren. Nach Bestätigung ihrer Größe wurden die Inserts extrahiert und sequenziert.
Beispiel 3: Konstruktion von chimären Genen, welche die konstitutive Expression des Proteins ASR1 oder auch eines antisense, das zu seiner Inhibition führt, erlauben
In einem ersten Schritt wurde die Konstruktion von zwei Basisplasmidvektoren pBIOS 306 und pBIOS 307 durchgeführt, die den Promotor Actinintron-Actin (pAct), die cDNA des Gens Asr1 in sense bzw. antisense und den Terminator der Nopalinsynthetase (terNos), der ein funktionelles Polyadenylierungssignal bei zahlreichen Pflanzenspezies bringt, enthielten.
Anschließend wurden Zwischenvektoren für die homologe Rekombination mit dem Vektor pSB1 von Japan Tobacco ( EP 672 752 ) in der Quelle Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 (Hoekema et al., 1983) hergestellt.
Der Transfer und die anschließende Expression der Gene (Selektionsgen und interessierendes Gen) in Mais basieren auf den natürlichen Eigenschaften von Agrobacterium tumefaciens (Zambrisky et al., 1989) und auf der Strategie des superbinären Plasmids (Hiei et al., 1994, und Ishida et al., 1996).
Die für diese Klonierungen verwendeten Restriktionsenzyme wurden geliefert von New England Biolabs (New England Biolabs, UK). Die Enzymreaktionen wurden durchgeführt, indem die Vorschriften befolgt wurden, die von Sambrook et al. in dem Handbuch "Molecular cloning" (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) beschrieben sind.
a) Konstruktion der Basisplasmidvektoren für die konstitutive Expression des Gens Asr1 und seines antisense
Die molekularen Konstrukte, die die konstitutive Expression des Gens Asr1 in sense und antisense erlauben, wurden wie im Folgenden beschrieben hergestellt:

– Klonierung des Fragments I/XhoI mit 795 pb (cDNA Asr1 = SEQ ID Nr. 1) in den mit EcoRV restriktierten Vektor pBIOS 298.

Der Vektor pBIOS 298 enthielt den Promotor Actinintron-Actin (pAct) (Mc Elroy et al., 1991) und den Terminator Nos. Dieser Vektor war durch Deletion des Fragments PstI mit 366 pb (Gen Barstar) des Vektors pWP 280, der die Kassette pActinintron-Barstar-Nos polyA (1) enthielt, erzeugt worden.
Die ungerichtete Klonierung erlaubt es, zwei neue Vektoren zu erhalten:

– den Vektor pBIOS 306, der das Gen pAct-ZmAsr1-sense-terNos und
– den Vektor pBIOS 307, der das Gen pAct-ZmAsr1-antisense-terNos trägt.

Die Ausrichtung der cDNA in Bezug auf den Actinpromotor wurde durch einfache enzymatische Restriktion mit Eagle und doppelte enzymatische Restriktion HindIII-EcoRV festgelegt.
b) Konstruktion der Zwischenvektoren für die homologe Rekombination mit pSB1 (Erhalten von superbinären Plasmiden)
Die Vektoren, die zur homologen Rekombination in Agrobacterium tumefaciens dienten, waren von dem Vektor pBIOS 273 abgeleitet.
^*Konstruktion des Plasmids pBIOS 273
Der Basisvektor für die homologe Rekombination war der Vektor pBIOS 273. Dieser Vektor wurde in zwei Stufen erzeugt:

– Klonierung des Fragments BspDI/XhoI (pAct-Bar-terNos) des Vektors pDM 302 (Cao et al., 1992) in die Stellen SmaI und BspDI des Vektors pSB12 (Japan Tobacco); der aus dieser Klonierung resultierende Vektor wurde pBI-OS 272 genannt, und
– Deletion der Stelle XhoI in Position 3363 des Vektors pBIOS 272 durch partielle Verdauung mit XhoI und Einwirkung der DNA-Polymerase I, großes (Klenow-) Fragment; der erhaltene Vektor, der eine einzige Stelle XhoI besaß, wurde als pBIOS 273 bezeichnet.

^*Erzeugung der Zwischenrekombinationsvektoren, die die cDNA Asr1 in sense oder antisense enthielten
Diese Konstrukte wurden aus dem Vektor pBIOS 274 erzeugt, der von dem Vektor pBIOS 273 durch Klonierung des Fragments (ProA9-Barnase-terCaMV) XhoI des Vektors pWP 128 (Paul et al., 1992) in den bei XhoI restriktierten Vektor pBIOS 273 abgeleitet worden war.
Die Zwischenvektoren pBIOS308 und pBIOS309 wurden durch Klonierung der Fragmente SaII/XhoI mit 2 970 pb der Vektoren pBIOS 306 und pBIOS 307 in die Stellen BspDI/XhoI des Vektors pBIOS 274 erhalten.
Diese Klonierungen erlauben so, das Gen pA9-BarnaseterCaMV des Vektors pBIOS 274 durch das Gen pAct-ZmAsr1- sense-terNos, wobei der resultierende Vektor als pBI-OS 308 (2) bezeichnet wird, oder durch das Gen pAct-ZmAsr1-antisense-terNos, wobei der resultierende Vektor als pBIOS 309 (3) bezeichnet wird, zu ersetzen.
c) Konstruktion der superbinären Transformationsvektoren für die Expression des Gens Asr1 und seines antisense in Agrobacterium tumefaciens und Maispflanzen
^*Konstruktion der superbinären Vektoren
sDie für die Transformation von Mais verwendeten Vektoren stammten aus der homologen Rekombination der Plasmide pBIOS 308 und pBIOS 309 mit dem Vektor pSB1 ( EP 672 752 ). Der Vektor pSB1 enthielt die Gene virB und virG des Plasmids Ti, pTiBo542, das in der Quelle Agrobacterium tumefaciens A281 (ATCC 37349) vorhanden ist, das Resistenzgen gegen Tetracyclin, einen funktionellen Replikationsursprung bei E. coli und Agrobacterium und eine homologe Region, die sich in den Zwischenvektoren pBIOS 308 und pBIOS 309 wiederfindet. Das Vorhandensein dieser homologen Region in dem Empfängerplasmid (pSB1) und den Zwischenplasmiden (pBIOS 308 und pBIOS 309) war der Ursprung des homologen Rekombinationsphänomens.
Die Zwischenvektoren pBIOS 308 und pBIOS 309 wurden durch Elektroporation in die den Vektor pSB1 enthaltenden Agrobacterium-tumefaciens-Zellen eingeschleust, wobei der GIBCO BRL CELL PORATOR Voltage Booster entsprechend dem von Mattanovitch et al. (1989) beschriebenen Verfahren und die vom Lieferanten (Life Technologies, USA) gegebene Vorschrift angewendet wurden.
Die die superbinären Vektoren enthaltenden Agrobacterien wurden auf dem Medium VT CaCl₂ in Gegenwart von Rifampicin und Spectinomycin mit einer Konzentration von 50 mg/l ausgewählt. Das Resistenzgen gegen Rifampicin wurde von dem Bakterienchromosom getragen. Die Resistenz gegenüber Spectinomycin, die von den Plasmiden pBIOS 308 und pBIOS 309 (Replikationsursprung in E. coli) getragen wird, kann nur nach homologer Rekombination mit dem Vektor pSB1 (funktioneller Replikationsursprung bei Agrobacterium und E. coli) exprimiert werden.
Die nach Rekombination erhaltenen superbinären Plasmide wurden als pRec 308 (pBIOS 308 × pSBi) und pRec 309 (pBIOS 309 × pSB1) bezeichnet. Sie besitzen funktionelle Replikationsursprünge gleichzeitig in E. coli und Agrobacterium tumefaciens, die Resistenzgene gegen Tetracyclin und gegen Spectinomycin, die T-DNA, in welcher sich die Expressionskassetten der Gene Bar und Asr1 (sense- oder antisense-cDNA) befinden, und die Virulenzgene virB und virG des Plasmids pTiBo542.
^*Charakterisierung der superbinären Vektoren pRec 308 und pRec 309
Die superbinären Plasmide pRec 308 (Gen Asr1 in sense) und pRec 309 (Gen Asr1 in antisense) wurden charakterisiert durch enzymatische Restriktion mit SaII. Ein Southern Blot der Restriktionsfragmente SaII wurde anschließend mit der Sonde Bar und der Sonde des Gens Asr1 (diese Sonde entspricht dem Fragment EcoRI/XhoI mit 795 pb des Vektors pHHU516 und somit der kompletten cDNA) durchgeführt. Die erhaltenen Profile waren die erwarteten.
Beispiel 4: Transformation von Maispflanzen
Die Transformation von Maispflanzen wurde gemäß der Vorschrift von Ishida et al. (1996) durchgeführt.
Die Transformation begann mit einer Co-Kultivierung, in welcher die unausgereiften Embryonen der Maispflanzen (Größe von 1 bis 1,2 mm) 5 Minuten lang mit Agrobacterium tumefaciens LBA 4404, das die superbinären Vektoren pRec 308 oder pRec 309 enthielt, in Berührung gebracht wurden. Anschließend wurden die Embryonen drei Tage lang in der Dunkelheit bei 25°C in dem Medium LSAs gehalten.
Die folgende Stufe war diejenige der ersten Selektion der transformierten Kalli: Die "Embryonenkalli" wurden auf das Medium LSD 5 übertragen, das Phosphinotricin mit 5 mg/l und Cefotaxim mit 250 mg/l (Vernichtung von Agrobacterium tumefaciens) enthielt. Diese Stufe wurde zwei Wochen lang in der Dunkelheit und bei 25°C durchgeführt.
Die zweite Selektionsstufe erfolgte durch Übertragung der Embryonen, die sich auf dem Medium LSD 5 entwickelt hatten, auf das Medium LSD 10 (Phosphinotricin mit 10 mg/l) in Gegenwart von Cefotaxim drei Wochen lang unter denselben Bedingungen wie für die erste Selektion (25°C, Dunkelheit).
Die dritte Selektionsstufe bestand in dem Herausschneiden der Kalli vom Typ I (1 bis 2 mm große Fragmente) und ihrer Übertragung drei Wochen lang in der Dunkelheit und bei 25°C auf das Medium LSD 10 in Gegenwart von Cefotaxim.
Die Regeneration der Keimlinge wurde anschließend durchgeführt, indem die Kalli vom Typ I, die sich vermehrt hatten, herausgeschnitten wurden, und sie auf das Medium LSZ in Gegenwart von Phosphinotricin mit 5 mg/l und Cefotaxim zwei Wochen lang bei 22°C und unter kontinuierlichem Licht transferiert wurden. Die Keimlinge, die sich regeneriert hatten, wurden zwei Wochen lang bei 22°C unter kontinuierlicher Beleuchtung auf das Anwurzelungsmedium (Ishida et al., 1996) für die Entwicklungsstufe übertragen.
Die erhaltenen Pflanzen wurden danach, um sie zu akklimatisieren, in einen Phytotron übertragen.
Beispiel 5: Nachweis der Expression des Proteins ZmASR1 in den transformierten Pflanzen
Die Proteine der Blattproben, die aus den transformierten Pflanzen stammten, wurden gemäß der Methode von Damerval et al. (1986) extrahiert und anschließend durch zweidimensionale Elektrophorese (EBD) gemäß der Vorschrift von Riccardi et al. (1998) analysiert.
Die zweidimensionale Elektrophorese besteht in der Auftrennung der Polypeptide in Abhängigkeit von ihrem isoelektrischen Punkt und in Abhängigkeit von ihrem Molekulargewicht (Elektrophorese in Gegenwart von SDS). Vor der Elektrophorese wurden die Proteine extrahiert und unter denaturierten Bedingungen gehalten: Die quaternäre Struktur war eliminiert. Die verschiedenen Polypeptide, welche die oligomeren Proteine bilden, wandern unabhängig in den zwei Elektrophoresen. Die Gele wurden anschließend mit Silbernitrat angefärbt.
Das so erhaltene zweidimensionale Gel wurde mit demjenigen verglichen, das aus Proteinen von Blättern von nicht transformierten Pflanzen A188 hergestellt worden war.
Die Ergebnisse, die mit transformierten Pflanzen mit der in "sense" angeordneten codierenden Sequenz erhalten worden waren, zeigen durch einfache visuelle Untersuchung dieser zwei Gele eine stärkere Expression des Proteins ASR1 in den transformierten Pflanzen im Vergleich mit den Bezugspflanzen A188.
Der ASR-Fleck, der bei den transformierten Pflanzen mit dem antisense-Konstrukt beobachtet wurde, schien immer noch detektierbar zu sein, aber mit einer geringeren Stärke, was zeigte, dass die antisense-Transformanten das Protein weniger als die Bezugspflanzen exprimierten.
Diese Proteinanalyse zeigt somit eine Expression des Proteins ASR1 in den transformierten Pflanzen in einer Menge, die im Vergleich mit den nicht transformierten Pflanzen modifiziert war.
Beispiel 6: Messung der Toleranz gegenüber Trockenstress der erfindungsgemäß erhaltenen transgenen Pflanzen
Die Resistenz gegenüber Trockenstress der erfindungsgemäß transformierten Pflanzen im Vergleich mit den Bezugspflanzen kann mit verschiedenen phänotypischen, physiologischen und/oder biochemischen Analyseverfahren unter speziellen Berieselungsbedingungen – unter normalen Bedingungen (herkömmliche Kultivierung mit Beregnung) und unter Trockenstressbedingungen – bewertet werden.
Beispielhaft können die Wasserbedingungen auf einem Feld folgende sein:

– eine normale Berieselung in dem beregneten Teil auf der Basis von 5 mm pro Tag, gesteuert von Spannungsmessern, die in 30, 50 und 70 cm Tiefe angeordnet sind, und
– eine restriktive Berieselung ohne Wasserzufuhr, falls möglich bis zu 10 Tagen nach der Blüte; zu etwa diesem Zeitpunkt wird entschieden, Wasser zuzuführen, wenn der Stress als zu stark angesehen wird, wobei der Zufuhrrhythmus 3 mm pro Tag nicht übersteigt.

Wetterdaten und Berieselungsbedingungen wurden aufgezeichnet.
Die in den verschiedenen Blüh- und Ernteperioden getroffenen Feststellungen bestanden darin, zu messen:
a) Messung der Stresstoleranz durch phänotypische Beobachtung
Die früher durchgeführten genetischen Analysen legten eine potentielle Rolle von ASR1 bei Blattalterung und Protandrie (Verschiebung zwischen der männlichen und der weiblichen Blüte) unter trockenen Bedingungen nahe. Diese Eigenschaften wurden deshalb vorzugsweise untersucht.
Die Blattalterung kann durch morphologische Messungen untersucht werden, die darin bestehen, die Anzahl der vertrockneten und der grünen Blätter zu 4 voneinander 15 Tage entfernten Daten ausgehend von dem Blütedatum oder in verschiedenen Entwicklungsstadien auszuzählen.
Wenn sehr verschiedene Verhaltensweisen beobachtet wurden, was das Einwickeln und die Färbung der Blätter betrifft, wurde eine Messung mit einer Skala von 0 bis 5 (von der tolerantesten bis zu weniger tolerant gegenüber Stress) durchgeführt.
Die Blattalterung kann auch durch quantitative Analyse des Chlorophylls an Proben aus Blattscheiben aus dem Blatt der Ähre zur Blüte gemessen werden.
Die Protandrie oder Verschiebung zwischen den Blühdaten der männlichen Pflanzen (Vorhandensein von Pollen) und weiblichen Pflanzen (Austritt der Stempel) wurde wie folgt gemessen. Die Daten des Auftretens von Stempel und Pollen wurden einzeln für jede Pflanze notiert, und die Dynamik wurde durch die Kurve des prozentualen Anteils an Pflanzen, die geblüht hatten, in Abhängigkeit von der Zeit dargestellt.
Weiterhin wurden verschiedene Messungen zur Ernte durchgeführt, um den Einfluss der Stresstoleranz auf die Körnerproduktion zu bewerten, insbesondere des prozentualen Anteils der Befruchtung (Verhältnis von Anzahl Körner pro Ähre/Anzahl befruchtungsfähiger Eizellen), der Anzahl Stände pro Ähre, der Anzahl Körner pro Stand, der Feuchtigkeit der Körner, des Gewichts von 1000 Körnern und der Anzahl der verwelkten Pflanzen.
Die Anwendung einer zerstörungsfreien Identifikationsprüfung, in welcher das Basta verwendet wird, erlaubt es, leicht in jeder transgenen Abstammungslinie die Pflanzen, die gegen Basta resistent sind, von den sensiblen Pflanzen zu unterscheiden, wobei die resistenten Pflanzen das Gen Asr enthalten, das genetisch mit dem Selektionsmarkergen verbunden ist, außer bei einem Rekombinationsereignis. Diese Prüfung besteht im Weißen des Endes eines Blattes mit einer Basta-Lösung und im Beobachten des resultierenden Phänotyps, ohne dass die Vitalität der gesamten Pflanze beeinträchtigt wird: Das Ende des Blattes nekrotiert und vertrocknet, wenn die Pflanze sensibel ist, oder bleibt grün, wenn die Pflanze resistent ist. Dies erlaubt es, bei den Stresstoleranzmessungen zu beobachten, ob das ASR-Transgen die Antwort auf Stress in Abhängigkeit von der Expression des Gens in sense oder antisense positiv beeinflusst.
b) Bewertung des von den Pflanzen erlittenen Stress
Es wurden Proben von den Blättern entnommen, um den Gehalt an ABA (Verfahren von Quarrie et al., 1988) und gegebenenfalls die Expression des Proteins durch zweidimensionale Elektrophorese zu messen.
Der von den Pflanzen ertragene Stress kann durch Messung des Basiswasserpotentials mittels einer tragbaren Druckkammer an nicht transformierten Pflanzen unter Bezugsbedingungen und unter Trockenstressbedingungen bewertet werden. Messungen des relativen Wassergehaltes der Blätter können ebenfalls durchgeführt werden.
Die Blattalterung, die eine Verringerung der Verdampfungsoberfläche und eine Rückmobilisierung der Metaboliten in den Rest der Pflanze erlaubt, wurde wie weiter oben beschrieben an erwachsenen Pflanzen nach der Blüte durch Auszählung der Anzahl Blätter, bei welchen mindestens 50% der Oberfläche trocken war, gemessen.
Es wurde ein signifikanter Effekt der Expression des Proteins ASR auf den Anteil an vertrockneten Blättern festgestellt. Im Vergleich mit ihren Bezügen wiesen die sense-Ereignisse zu einer gegebenen Zeit einen größeren Anteil an vertrockneten Blättern als die antisense-Ereignisse (4) auf. Weiterhin zeigten unter Trockenstressbedingungen die Messungen der Blattalterungskinetik, dass die sense-Ereignisse schneller als die nicht transformierten alterten und die antisense-Ereignisse weniger schnell als die nicht transformierten Ereignisse alterten (5).
Dabei ist unter einem sense-Ereignis ein Ereignis zu verstehen, das aus einer anfänglichen Transformationsstufe mit einer Expressionskassette folgt, welche die in sense angeordnete ASR-Sequenz enthält. Unter einem antisense-Ereignis ist ein Ereignis zu verstehen, das aus einer anfänglichen Transformationsstufe mit einer Kassette folgt, welche die in antisense angeordnete ASR-Sequenz enthält.
Die sense-Ereignisse, die unter Trockenstressbedingungen schneller als die nicht transformierten altern, weisen somit einen selektiven Vorteil der Trockenstresstoleranz auf, insbesondere in dem Fall eines Stress von langer Dauer (Verringerung der Verdampfungsoberfläche und Rückmobilisierung der Metaboliten in den Rest der Pflanze).
Die antisense-Ereignisse, die unter Trockenstressbedingungen weniger schnell als die nicht transformierten altern, weisen ebenfalls einen Vorteil auf, insbesondere im Fall eines Wasserdefizits von kurzer Dauer. Diese Pflanzen bewahren sich eine größere Verdampfungsoberfläche und profitieren somit mehr von einer späteren Wasserzufuhr (Regen oder Bewässerung).
Weiterhin haben die Messungen des von den Pflanzen ertragenen Stress (ABA-Gehalt der Blätter) einen leichten, aber sehr signifikanten Stress nachgewiesen: 616 bzw. 512 ng ABA/g Trockensubstanz in den gestressten bzw. in den Bezugspflanzen, d.h. eine Erhöhung um etwa 100 ng ABA pro Gramm Trockensubstanz in den gestressten Pflanzen. Diese Antwort ist dieselbe für die sense- und antisense-Ereignisse sowie für die nicht transformierten Pflanzen. Die Transformation scheint somit keinen Einfluss auf die ABA-Ansammlung in den Blättern zu haben.
Diese Ergebnisse bestätigen somit, dass bei Vorhandensein eines leichten Trockenstress und einer geringen ASR-Expression in den transformierten Pflanzen bereits signifikante Unterschiede beobachtet werden.
Weiterhin ist der Einfluss der Trockenstresstoleranz auf die Körnerproduktion in Bezug auf die Körnerausbeute, das Gewicht von 1000 Körnern und die Anzahl Ähren pro Pflanze gemessen worden. Die bei einem geringen Trockenstress erhaltenen Ergebnisse zeigen Kornausbeutemessungen, die zwischen transformierten Pflanzen (sense und antisense) und nicht transformierten Pflanzen unter Stressbedingungen oder unter normalen Bedingungen vergleichbar waren.
Die Transformation einerseits und die Trockenstresstoleranz andererseits scheinen somit die Körnerausbeute der Pflanzen nicht zu beeinflussen.
Wachstumsmessungen der Pflanzen wurden ebenfalls durchgeführt. Die Länge von drei Blättern unter und über der Ähre wurden an sense- und antisense-Pflanzen nach der Blüte ohne Trockenstress gemessen. Es wurde ein sehr signifikanter Unterschied für die drei Blätter beobachtet:

für die Blätter F0, antisense = 78,41 cm (p < 0,01) sense = 76,11 cm

F1, antisense = 77,96 cm (p < 0,01) sense = 75,76 cm

F2, antisense = 75,04 cm (p < 0,01) sense = 72,94 cm.
Insgesamt wurde somit eine signifikante Differenz von 2 cm Länge für diese drei Blätter beobachtet, wobei die Blätter der sense-Pflanzen kleiner als diejenigen der antisense-Pflanzen waren. Diese Verringerung des Blattwachstums, die bei den Sense-Ereignissen beobachtet wurde, korreliert somit mit einer stärkeren Alterung, wobei die zwei Phänomene zu einer verkleinerten Verdampfungsoberfläche führen, die es der Pflanze erlaubt, den Trockenstress besser zu tolerieren.
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Sequenzliste

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, die eine modifizierte Menge an dem Protein ASR aufweist, die ihr eine bessere Resistenz gegenüber Trockenstress im Vergleich mit einer nicht transformierten Pflanze verleiht, das die Stufen umfasst, die darin bestehen: – mindestens eine Pflanzenzelle mit einem Vektor zu transformieren, der eine Expressionskassette enthält, die eine Nucleotidsequenz umfasst, die für ein Protein ASR codiert, das natürlicherweise von einer Pflanze als Antwort auf Trockenstress exprimiert wird, und dessen Aminosäuresequenz mindestens 50% Ähnlichkeit mit der SEQ ID Nr. 2 besitzt, wobei die Nucleotidsequenz in sense insertiert wird, und – die so transformierte Zelle derart zu kultivieren, dass eine Pflanze erzeugt wird, die in ihrem Genom diese Expressionskassette enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem das Protein ASR von einem Getreide wie Mais stammt.
Verfahren nach Anspruch 2, in welchem das Protein ASR die Sequenz SEQ ID Nr. 2 umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, in welchem die Expressionskassette einen Promotor umfasst, der die konstitutive Expression der Sequenz erlaubt, die für ASR codiert, beispielsweise den Aktin-Intron-Promotor.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, in welchem die Expressionskassette einen Promotor umfasst, der die Expression unter Trockenstressbedingungen induziert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, in welchem die Expressionskassette eine Sequenz enthält, die aus SEQ ID Nr. 1, Nr. 3, Nr. 4 oder Nr. 5 ausgewählt ist.
Pflanze oder Pflanzenteil, die (das) durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 erhalten werden kann.
Pflanze oder Pflanzenteil nach Anspruch 7, die (das) eine Erhöhung der Expression des Proteins ASR gegenüber einer nicht transformierten Pflanze aufweist.
Pflanze oder Pflanzenteil nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine landwirtschaftliche Kulturpflanze handelt, die aus Mais, Getreide, Raps, Sonnenblumen und Erbsen, insbesondere Mais, ausgewählt ist.
Hybride transgene Pflanze, die durch ein Verfahren hergestellt werden kann, das: a) das Erhalten von zwei transgenen Pflanzen gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und b) die Kreuzung dieser Pflanzen umfasst.
Verwendung einer Nucleinsäure, die für ein Protein ASR codiert, das natürlicherweise von einer Pflanze als Antwort auf Trockenstress exprimiert wird, und dessen Aminosäuresequenz mindestens 50% Ähnlichkeit mit der SEQ ID Nr. 2 besitzt, zur Herstellung einer transgenen Pflanze, die eine modifizierte Menge an Protein ASR aufweist, die ihr eine erhöhte Resistenz gegenüber Trockenstress im Vergleich mit einer nicht transformierten Pflanze verleiht.
Verwendung einer Nucleinsäure, die für ein Protein ASR codiert, das natürlicherweise von einer Pflanze als Antwort auf Trockenstress exprimiert wird, und dessen Aminosäuresequenz mindestens 50% Ähnlichkeit mit der SEQ ID Nr. 2 besitzt, oder eines Fragments davon als Sonde oder Primer zur Amplifikation für die Auswahl transformierter Pflanzen nach einem der Ansprüche 7 bis 10, die eine bessere Resistenz gegenüber Trockenstress besitzen.