CZ20023569A3 - Způsob získání rostlin, které vykazují zvýšenou odolnost vůči vodnímu stresu - Google Patents
Způsob získání rostlin, které vykazují zvýšenou odolnost vůči vodnímu stresu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20023569A3 CZ20023569A3 CZ20023569A CZ20023569A CZ20023569A3 CZ 20023569 A3 CZ20023569 A3 CZ 20023569A3 CZ 20023569 A CZ20023569 A CZ 20023569A CZ 20023569 A CZ20023569 A CZ 20023569A CZ 20023569 A3 CZ20023569 A3 CZ 20023569A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- plant
- asr
- plants
- protein
- transformed
- Prior art date
Links
- 208000005156 Dehydration Diseases 0.000 title claims abstract description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 title claims 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 101
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 59
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 54
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 41
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 11
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 140
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 27
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 25
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 22
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 claims description 19
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 claims description 19
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 claims description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 8
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 7
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 6
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 3
- 241000209140 Triticum Species 0.000 claims description 3
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 claims description 2
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 claims description 2
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 claims description 2
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract 1
- JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N (+)-Abscisic acid Chemical compound OC(=O)/C=C(/C)\C=C\[C@@]1(O)C(C)=CC(=O)CC1(C)C JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N 0.000 description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 18
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 16
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 16
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 13
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 11
- FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N desoxyabscisic acid Natural products OC(=O)C=C(C)C=CC1C(C)=CC(=O)CC1(C)C FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 10
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 7
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 7
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 102100034003 FAU ubiquitin-like and ribosomal protein S30 Human genes 0.000 description 6
- 101000732045 Homo sapiens FAU ubiquitin-like and ribosomal protein S30 Proteins 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 5
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 5
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 5
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid;azane Chemical compound [NH4+].CP(O)(=O)CCC(N)C([O-])=O ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 4
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 229960004261 cefotaxime Drugs 0.000 description 4
- AZZMGZXNTDTSME-JUZDKLSSSA-M cefotaxime sodium Chemical compound [Na+].N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(C)=O)CS[C@@H]21)C([O-])=O)=O)C(=O)\C(=N/OC)C1=CSC(N)=N1 AZZMGZXNTDTSME-JUZDKLSSSA-M 0.000 description 4
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 4
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 4
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 3
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 3
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 3
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 3
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 2
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 2
- 101100018379 Shigella flexneri icsA gene Proteins 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 101100476911 Yersinia enterocolitica yscW gene Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229910002056 binary alloy Inorganic materials 0.000 description 2
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 2
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 2
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000024346 drought recovery Effects 0.000 description 2
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000025508 response to water Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 2
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 2
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 101150076562 virB gene Proteins 0.000 description 2
- 101150033532 virG gene Proteins 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- 101150032318 ASR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 1
- 101710183938 Barstar Proteins 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 235000005979 Citrus limon Nutrition 0.000 description 1
- 244000131522 Citrus pyriformis Species 0.000 description 1
- LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N D-nopaline Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)N[C@@H](C(O)=O)CCC(O)=O LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 101710138460 Leaf protein Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N Phosphinothricin Natural products CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 244000088415 Raphanus sativus Species 0.000 description 1
- 235000006140 Raphanus sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000003679 aging effect Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 101150007564 asr gene Proteins 0.000 description 1
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000002015 leaf growth Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000010422 painting Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000010451 perlite Substances 0.000 description 1
- 235000019362 perlite Nutrition 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000008288 physiological mechanism Effects 0.000 description 1
- 229930195732 phytohormone Natural products 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000004382 potting Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000010201 protandry Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 1
- 230000033764 rhythmic process Effects 0.000 description 1
- 239000012882 rooting medium Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Botany (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Cultivation Of Plants (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Curing Cements, Concrete, And Artificial Stone (AREA)
- Fertilizers (AREA)
- Hydroponics (AREA)
Description
'Předložený vynález se týká způsobu získání rostlin, které vykazují zvýšenou odolnost vůči vodnímu stresu.
Dosavadní stav techniky
Je známo, že v mírném pásmu jsou období nečetných srážek, různých a neočekávaných intenzit, zodpovědná za výrazné snížení produktivity pěstovaných rostlin. Vodní deficit může výrazně zasáhnout do růstu a rozmnožování rostlin. Různé strategie, které využívají fyziologické mechanismy (snížení růstu částí, které jsou ve vzduchu, uzavření průduchů) a/nebo buněčné mechanismy (osmotická úprava), jim dovolí uniknout tomuto vodnímu stresu nebo jej alespoň tolerovat. Tyto mechanismy, alespoň z části kontrolované ABA (kyselina abscisová), což je fytohormon, jehož koncentrace vzrůstá u rostlin, které jsou podrobené vodnímu stresu (Zeevaart and Creelman, 1988), zahrnují početné proteiny různých předpokládaných funkcí: proteiny typu membránových kanálů, nebo exprimované v odpovědi na poškození způsobených buňce (proteázy, inhibitory proteáz) nebo ještě proteiny, jejichž • 0 · · · 0
funkce nejsou přímo spojené se stresem, ale které jsou exprimované ve vyšších koncentracích v případě vodního nebo solného stresu (enzymy glykolýzy, enzymy syntézy methioninu). Rostlinná odpověď závisí mimo jiné na parametrech prostředí (typ omezení, intenzita, doba) a genetických parametrech (druh a genotyp), čímž se určení role těchto proteinů v mechanismech tolerance vůči suchu stává nesnadným.
Existuje tedy reálná potřeba prokázat funkci kandidátských genů v mechanismech tolerance vodního stresu pro jejich použití v transgenezi mající za cíl získání rostlin, které vykazují toleranci vůči vodnímu stresu. Toto je obzvláště důležité pro druhy, které jsou pěstovány ve velkém měřítku, jako je například kukuřice, která dosahuje maximální citlivosti vůči suchu 15 dní před a 15 dní po vykvetení rostliny červenec-srpen v Evropě), což je období, během kterého rostlina absorbuje 45% svých potřeb.
Prvotní studie provedená Riccardi a kol. (1998) na linii kukuřice označené lo (lodent) dokázala, že. u přibližně dvaceti proteinů, u kterých jsou navrhované předpokládané funkce, se exprese výrazně zvýší v odpovědi na vodní stres.
Jeden z těchto proteinů, prokázaný v linii lo použité Riccardi a kol, (1998), ale ne v linii F2, představuje homologie s proteinem ASR1 (ABA-water stress-ripeninginduced protein) rajčete, který je indukován ABA, vodním
- 3 ·· 0 0 0 0 stresem a zráním plodu, ale jehož funkce je prozatím neznámá (lůsem a kol., 1993). Jiné geny představující homologie s ASR rajčete byly identifikovány hlavně u brambory (Šilhavý a kol., 1995), citronu (Canel a kol. , 1995), rýže (Thomas a kol., 1999), ale žádná funkce nebyla jasně prokázána pro proteiny, které . jsou kódované těmito geny. Studie QTL (Quantitative Trait Loci) umožnila zmapovat gen Asrl v oblasti obsahující zároveň oblast kontrolující množství ASRl a QTL stárnutí listů a protandrie (De Vienne a kol., 1999).
Přihlašovatelé předložené přihlášky vynálezu nyní prokázali roli rekombinantního proteinu ASR v přímé odpovědi rostliny na vodní stres pro použití transgeneze. Dokázali vytvořit postup pro získání rostliny, která vykazuje pozměněné množství proteinu ASR, vedoucí k větší odolnosti vůči vodnímu stresu v porovnání s rostlinou, která není transformovaná.
Podstata vynálezu
Předložený vynález se týká způsobu získání rostliny obsahujících změněné množství proteinu ASR, což jí dodá zvýšenou odlnost vůči vodnímu stresu v porovnání s rostlinou, která není transformovaná. Zahrnuje kroky sestávající z:
- transformování alespoň jedné rostlinné buňky vektorem obsahujícím kazetu exprese, obsahující nukleotidovou fc ·
- 4 sekvenci kódující protein ASR nebo blokující expresi proteinu ASR;
- kultivace takto transformované buňky způsobem, který vede k získání rostliny obsahující ve svém genomu uvedenou kazetu exprese.
Proteinem ASR se má na mysli protein přirozeně exprimovaný rostlinou v odpovědi na vodní stres, mající stejnou nebo homologní sekvenci aminokyselin se sekvencí SEQ ID No. 2 kukuřice.
Homologní sekvencí se má na mysli s výhodou sekvence, která vykazuje alespoň 50 %, s výhodou 70 % podobnosti se sekvencí SEQ ID No. 2.
Do definice protein ASR ve smyslu předložené přihlášky vynálezu, spadají veškeré proteiny ASR různých rostlin, jako například protein ASR rýže, stejně tak jako pozměněné proteiny, například adicí, deleci, substitucí (s výhodou konzervativní) omezeného počtu aminokyselin.
Do definice protein ASR ve smyslu předložené přihlášky vynálezu spadají také polypeptidy částečně nebo úplně kódované sekvencí SEQ ID No. 1, No. 3, No. 4 nebo No. 5, nebo jakoukoli homologní sekvencí s tím, že tyto polypeptidy uchovávají schopnost odolávat vůči vodnímu stresu.
* β·· « · « • · · · · · • · · · « 9 •999 999 99 9 9
Nukleotidová sekvence kódující protein ASR může být obzvláště sekvence obiloviny, obzvláště sekvence kukuřice.
Uvedená sekvence může být s výhodou sekvence cDNA specifická pro stav vodního stresu, izolovaná z kukuřičné linie diferenciální hybridací. Taková sekvence je uvedena v přiloženém seznamu sekvencí a je uvedena pod SEQ ID No 1. Lze rovněž použít genomickou sekvenci DNA kódující protein ASR kukuřice tak, jak je definován jednou ze sekvencí SEO ID No 3. SEQ ID No 4 a SEQ ID No 5 nebo homologní sekvencí těchto sekvencí, s tím, že bude exprimována ve změněném množství v porovnání s množstvím normálně produkovaným rostlinou, která není transformovaná.
V přiloženém seznamu sekvencí je
SEQ ID No. 3 genomická sekvence DNA izolovaná z kukuřičné linie, která silně exprimuje protein ASR,
SEQ ID No 4 je genomická sekvence DNA izolovaná z kukuřičné linie A188, kontrola, a SEQ ID No 5 je genomická sekvence DNA izolovaná z kukuřičné linie F2.
Uvedená sekvence může kódovat obzvláště sekvenci aminokyselin SEQ ID No 2 proteinu ASR kukuřice nebo její variantu, například variantu mající sekvenci SEQ ID No. 2 s inzercí zbytku lysinu mezi aminokyseliny 55 a 56 SEQ ID No. 2.
• · ··· · » · » • · · ·
- β ·· ·<·· • · · ♦ · · · ·
Lze rovněž použít nukleotidové sekvence kódující ASR jiných rostlin, jako například výše uvedené sekvence.
Nukleová kyselina kódující protein ASR je vložená do konstruktu nukleové kyseliny, zvaného expresní kazeta a je vázaná proveditelným způsobem s prvky dovolující její expresi a popřípadě její regulaci.
Mezi těmito prvky lze uvést promotory, aktivátory a terminátory transkripce.
Lze použít s výhodou konstitutivní promotor, jako promotor aktinu rýže následovaný intronem aktinu rýže (PAR-IAR), který je obsažen v plazmidu pActl-F4 (Mc Elroy a kol., 1991) nebo promotor 35S (Kay a kol., 1987) nebo tkáňově specifický promotor. Pouze jako příklad lze uvést promotor HMGW pšenice nebo ještě promotor PCRU genu ředkve, dovolující v obou případech expresi cíleného proteinu v zrnech (Anderson O.D. a kol., 1989 ; Depigny-This a kol., 1992). Lze s výhodou použít promotorové sekvence indukující expresi ve vodných podmínkách (Kasuga a kol., 1999). Mezi použitelnými terminátory v konstruktech předložené přihlášky vynálezu lze uvést hlavně 3' konec genu nopalin syntetázy Agrobakteria tumefaciens (Depicker a kol., 1982). Lze uvést rovněž terminátor polyA 35S viru mozaiky květáku (CaMV), popsaný v článku Franck a kol. (1980).
- Ί • ·9·
Exprese proteinu ASR může být ještě regulovaná použitím sekvencí typu signálů vedoucích k adresování peptidů (do chloroplastu, vakuol, k endoplazmatické retenci a podobně) nebo typu sekvencí intronů, sekvencí enhancerů, sekvencí leaderů.
V předložené přihlášce vynálezu může být sekvencí zájmu nukleotidová sekvence kódující protein ASR, uvedená sekvence je umístěna ve správném (pozitivním) směru, nebo nukleotidová sekvence blokující expresi proteinu ASR. Tato nukleotidová sekvence blokující expresi proteinu ASR je s výhodou sekvence kódující celý protein nebo část proteinu ASR, uvedená sekvence je umístěna v protisměru (v negativním směru). Pokud je sekvence kódující protein ASR umístěna ve správném směru, získá se transformovaná rostlina, která vykazuje zvýšené množství proteinu ASR v porovnání s rostlinou, která není transformovaná. Výhodou této rostliny je vyšší odolnost vůči vodnímu stresu než v případě rostliny, která není transformovaná. Pokud je sekvence umístěna v protisměru, získá se transformovaná rostlina, která představuje rovněž změnu odolnosti vůči vodnímu stresu. Bez jakékoli vazby na mechanismus účinku by se toto pozorování mohlo vysvětlit aktivací alternativní cesty odolnosti vůči vodnímu stresu rostlinou, v odpovědi na inhibici ASR sekvencemi v protisměru.
- 8 • ··· ·· ··· ·
Kazeta exprese je vložena do nukleotidového vektoru jako je plazmid, jež může kromě toho obsahovat márkerový gen, například gen, který umožňuje selekci transformované rostliny mezi rostlinami, které neobsahují cizí transfektovanou DNA. Jako márkerový gen lze uvést gen udělující odolnost vůči antibiotiku, například vůči hygromycinu (Herrera-Estrella a kol., 1983) nebo odolnost vůči herbicidu jako je sulfonamid asufam (WO 98/49316).
Tento vektor nebo všechny sekvence kódující protein ASR, jako jsou sekvence SEQ ID No 1, SEQ ID No 3, SEQ ID No 4 a SEQ ID No 5 nebo sekvence, které jsou homologní s těmito sekvencemi, jsou použitelné , pro transformování rostliných buněk podle protokolů známých odborníkovi v oboru, za účelem získání rostlin, které vykazují zvýšenou odolnost vůči vodnímu stresu.
Podle způsobu provedení předložené přihlášky vynálezu jsou rostlinné buňky transformované vektorem, podle výše uvedené definice, vneseným do hostitelské buňky se schopností infikovat uvedené rostlinné buňky, umožňujíce integraci uvažované nukleotidové sekvence, původně obsažené v genomu výše uvedeného vektoru, do genomu. těchto buněk. Použitá hostitelská buňka je s výhodou bakteriálním kmenem jako je Agrobacterium tumefaciens, s výhodou vnášená způsobem, který je popsán v článku An a kol., (1986), nebo ještě ·· ····
- 9 • ·· ·
Agrobacterium rhizogenes, výhodou způsobem, který je popsán v článku Guerche a kol., (1987).
Transformace rostlinných buněk může být například provedena přesunem oblasti T extrachromozomálního cirkulárního plazmidu indikující nádor Ti z Agrobacterium tumefaciens, za použití binárního systému (Watson a kol., 1994). Za tímto účelem se sestaví dva vektory. V jednom z těchto vektorů se oblast T odstraní delecí kromě pravé a levé hranice, markerový gen se vloží mezi ně, což umožní selekci v buňkách rostlin. Dalším partnerem binárního systému je pomocný plazmid Ti, modifikovaný plazmid neobsahuje oblast T, ale stále obsahuje geny virulence viru, potřebné pro transformování rostlinné buňky.
Podle výhodného provedení předložené přihlášky vynálezu lze použít způsob popsaný v Ishida a kol. (1996) pro transformování Monocotyledonů.
Lze také uvést jiné způsoby provedení postupu předložené přihlášky vynálezu, hlavně způsoby přímého přenosu genů do rostlinné buňky, jako jsou přímá mikroinjekce do embryí rostlin (Neuhaus a kol, 1987), infiltrace ve vakuu (Bechtold a kol. 1993) nebo elektroporace (Chupeau a kol, 1989) nebo ještě přímá precipitace za pomoci PEG (Schocher a kol, 1986) nebo bombardování částicovým dělem s částicemi potaženými uvažovanou plazmidickou DNA (Fromm M. a kol., 1990).
- 10 ·· ·«·· • · • · ··
Podle jiného protokolu se transformace provede způsobem popsaným v v Finer a kol. (1992), za použití částicového děla s částicemi wolframu nebo zlata.
Předložená přihláška vynálezu se rovněž týká hostitelské buňky, transformované výše popsanými nukleotidovými sekvencemi, stejně tak jako rostliny nebo části rostliny, hlavně ovoce, osiva, zrna, pylu, listu nebo hlízy, které lze získat jedním z dříve uvedených postupů.
Může se jednat například o velkoprodukční rostliny (pšenice, řepku, slunečnici, hrách, sóju, ječmen, obzvláště kukuřici a podobně) nebo zeleninu a květiny.
Hybridní transgenické rostliny, získané křížením alespoň jedné rostliny podle předložené přihlášky vynálezu s jinou rostlinou, jsou také částí předložené přihlášky vynálezu.
Předložená přihláška vynálezu se týká hlavně rostliny, která vykazuje zvýšení exprese proteinu ASR v porovnání s rostlinou, která není transformovaná, například v poměru 2 až 3. Tato zvýšení exprese proteinu ASR udělují transformovaným rostlinám zvýšenou odolnost vůči vodnímu stresu.
Odolnost rostlin transformovaných podle předložené přihlášky vynálezu vůči vodnímu stresu, v porovnání s kontrolními •fc ·«·· « · · ·
- 11 rostlinami, se může hodnotit na základě různých morfologických, fyziologických a/nebo biochemických způsobů měření, při různých podmínkách zavodnění. Pouze jako příklad může být měření tolerance vůči stresu provedeno fenotypovým pozorováním, (i) stárnutí listů, morfologickými měřeními a měřením množství chlorofylu disků listů, (ii) protandrie nebo data květenství rostlin samčího a samičího pohlaví, (iii) růstu rostliny měřením délky a šířky konců listů, stejně tak jako konečné výšky rostliny a studie stočení listů, nebo ještě (iv) výnosu zrn, váhy tisíce zrn, počtu klasů na rostlinu.
Stres, kterému je rostlina podrobena, se múze rovněž hodnotit měřením obsahu ABA (způsob Quanie a kol., 1988) nebo měřením vodního potenciálu nebo ještě v případě potřeby sledováním exprese proteinu dvourozměrnou elektroforézou z odběru listu.
Získané rostliny podle předložené přihlášky vynálezu se rovněž mohou použít v pokusech doplňování alel pro potvrzení funkce vloženého genu. Použití transformantů v pokusech zpětných křížení umožňuje vnést pouze gen vložený do rodičovského genetického fondu, bez jiných sekvencí, což by mohlo mít vliv na rekombinantní fenotyp v otázce tolerance vůči suchu.
·« ···· • ·
- 12 S výhodou se spojí vložený gen s markerovým genem selekce, který umožňuje sledování zpětných křížení a následovně sledování vložení uvažovaného genu do linie, kde se snažíme potvrdit účinek.
Princip spočívá v křížení transformantu s rodičovskou líníií neobsahující vhodnou alelu uvažovaného genu a porovnání fenotypů rekombinantní linie s rodičovskými liniemi. V těchto doplňovacích pokusech lze rovněž použít transformanty obsahující genomické sekvence. Tento doplňovací test umožňuje hlavně prokázat, že nadměrná exprese cDNA ve správném (pozitivním) směru zastupuje účinek slabé alely (nebo neexprimující alely). Takto lze například potvrdit, že gen ASR1 je genem, který je zodpovědný za QTL a PQL (Protein Quantitative Loci), nalezených v této genetické pozici na chromozomu 10 u kukuřice. Pro zlepšení rostlin lze zjišťovat a prozkoumávat množství tohoto proteinu lišící se mezi různými liniemi, vyšší exprese či dokonce výhodnější alely. Detekce rostlin, které vykazují vhodné alely může být provedena dávkováním specifických protilátek proti proteinu ASR1 (test ELISA, Western Blot atd.).
Do rámce předložené přihlášky vynálezu rovněž spadá použití nukleové kyseliny kódující ASR nebo jeho fragment jako sondy nebo primeru pro amplifikaci typu PCR, pro selekci transformovaných rostlin, které vykazují lepší odolnost vůči vodnímu stresu.
····
99 9
9999
• · 9 9 .99
- 13 Sekvence nukleových kyselin kódující ASR, jako sekvence uvedené jako SEQ ID No 1, SEQ ID No 3, SEQ ID No 4, SEQ ID No 5, stejně tak jako všechny oligonukleotidy získané na základě jedné z těchto sekvencí, mohou být takto použitelné jako sondy v programech selekce s použitím markéru, například při sledování vnesení genu kódujícího protein ASR kukuřice do rostliny. Za tímto účelem je alespoň jedna z těchto sond označena, . například radioktivním izotopem, potom uvedena do kontaktu s genomickou DNA rostliny, předtím natrávenou restrikčními enzymy za podmínek, které umožňují specifickou hybridizaci označené sondy na uvedenou DNA. Lze rovněž použít jiné protokoly za použití například PCR za účelem genotypizace.
Obrázky a příklady ilustrují předloženou přihlášku vynálezu, aniž by omezovaly její rozsah.
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1 představuje restrikční mapu plazmidu pWP 280 obsahujícího promotor pAktin intron-barnáza-Nos PolyA.
Obrázek 2 představuje restrikční mapu intermediálního vektoru pBIOS 308 obsahujícího cDNA ZmASRl ve správném (pozitivním) směru.
····
- 14 ·· ··»· • · · · ···· • ·
Obrázek 3 představuje restrikční mapu intermediálníého vektoru pBIOS 309 obsahujících cDNA ZmASRl v protisměru (negativním) směru.
Obrázek 4 představuje účinek každé transformace v protisměru nebo ve správném směru , v porovnání se svojí kontrolou (citlivou na Basta), na stárnutí listů, účinek se měří první den od označení po vykvetení.
Obrázek 5 představuje kinetiku účinku, pro soubor případů ve správném směru , netransformovaných a v protisměru a umístěných nebo neumístěných podmínkách vodního stresu, na stárnutí listů.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Získání a klonování cDNA ZmAsrl kukuřičné linie, silně exprimující protein ASR
a) Podmínky kultury a odběry rostlin sloužící pro izolaci cDNA
Přihlašovatelé předložené přihlášky vynálezu klonovali cDNA ZmAsrl z linií kukuřice lo (Riccardi a kol, 1998) nebo z
• · · • · ·· ··· • · · • ···
linií kukuřice podrobených selekci podle stejných kritérii jako lo.
Rostliny kukuřice se kultivují v perlitu za kontrolovaných podmínek v kultivační místnosti (osvětlení : 450 mmol nř2 s1, fotoperioda: 16 hodin, teplota den/noc: 25°C/20°C, relativní vlhkost 60%), zalévají se výživným roztokem. Když rostliny dosáhnou stádia 5 listů (objeví se 5. list), buď se zalévání rostlin zastaví za podmínek vodního stresu, nebo se se zaléváním u kontrolních rostlin pokračuje. 10 dní později se postupuje s odběry části čepele sedmého listu.
b) Izolace cDNA specifické pro , stav vodního stresu diferenciální hybridací
Banka cDNA se připraví na základě mRNA listů rostlin podrobených stresu a klonovací soupravy Lambda Zapil cDNA synthesis/GIgapack GoldI (Stratagene, La Jolla, USA), podle návodu výrobce.
mRNA připravená z listů rostlin podrobených stresu a kontrolních rostlin se přepíše na cDNA, která je radioktivně značená za použití 100 μθί 32PdATP a hexanukleotidů sloužících jako náhodné přimery (Sambrook a kol., 1989). Jednovláknová cDNA, pocházející buď z rostliny, která byla podrobena stresu nebo kontrolní rostliny, se hybridizuje ve stejné proporci na klonech cDNA banky. Teplota hybridizace v pufrovaném systému ·· ···» ·« <··«
- 16 ·· ···· * · • ··· fosfát/SDS/EDTA (Church a Gilbert, 1984) je rovna 68 °C a konečná mytí se provedou roztoky obsahujícími Ο,ΐχ SSC 0,05% (hmotnost/objem) SDS.
Označené klony se získají excizí in vivo fagemidu podle protokolu Stratagene za použití E.coli SOLR a pomocného fága Exassist. DNA těchto klonů se sekvenuje a srovná se s bankami sekvencí nukleových kyselin (BLAST) podle metody popsané ,v Altschul a kol. (1990). Jeden z těchto klonů vykazuje silnou homologii s Asrl rajčete a je nazván ZmAsrl jako zkratka pro Zea maize Asrl.
Příklad 2: Genomické sekvence ZmASRl
Primery cASRt-lF (5'-TGTCGATCCAATTGTCACTT-3')= SEO ID No 6 a CA5R1-740R (5'-TGGAGAAACGTAAACAACTA-3')= SEQ ID No 7, definované na koncích cDNA sekvence proteinu ASRl, se použijí pro PCR amplifikaci celkové DNA linie kukuřice. PCR reakce se provedou podle klasických protokolů.
PCR produkty se analyzují elektroforézou: pro extrakci DNA se získá pruh o velikosti 900 pb a klonuje se podle klasických protokolů. Po ověření velikosti se inserty extrahují a sekvenují.
Příklad 3:
• · β «
- 17 Konstrukce chimérických genů, které umožňují konstitutivní expresi proteinu ASRl nebo protisměru vedoucího k jeho inhibici
V první části se provede konstrukce 2 bazálních plazmidových vektorů pBIOS 306 a pBlOS 307 obsahujících promotor aktinuintron aktinu (pAct), cDNA genu Asrl, podle uvedeného pořadí, ve správném směru a v protisměru a terminátor nopalin syntetázy (terNos), který je funkčním polyadenylačním signálem u četných rostlinných druhů.
Potom se vytvoří intermediální vektory pro homologní rekombinaci s vektorem pSBl společnosti Japan Tobacco (EP 672 752) v kmenu Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 (Hoekema a kol., 1983) .
Přesun, který je následovaný expresí genů (selekční gen selekce a gen zájmu) v kukuřici, je založen na přirozených vlastnostech Agrobacterium tumefaciens (Zambrisky a kol. 1989) a na strategii superbinárního plazmidu (Hiei a kol.; 1994 a Ishida a kol.; 1996).
Restrikční enzymy používané pro klonování jsou dodány společností New England Biolabs (New England Biolabs, UK) . Enzymatické reakce se provedou podle protokolů popsaných v Sambrook a kol., Učebnice melekulárního klonování (Molecular • · · ·
- 18 • ·· ·
Cloning : A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
a) Konstrukce základních plazmidových vektorů pro konstitutivní expresi genu Asrl a jeho protisměru
Molekulární konstrukty, které umožňují konstitutivní expresi genu Asrl ve správném směru a v protisměru, byly sestaveny podle následujícího způsobu:
- klonování fragmentu I/Xhol o velikosti 795 pb (cDNA Asrl = SEQ ID No 1) do vektoru pBIOS 298 natráveném EcoRV.
Vektor pBIOS 298 obsahuje promotor aktinu intron-aktinu(pAct) (Mc Elroy a kol. 1991) a terminátor Nos. Tento vektor byl vytvořen delecí fragmentu Pstl o velikosti 366 pb (gen Barstar) vektoru pWP 280, obsahujícího kazetu pAktin-intronBarstar-Nos polyA (Obrázek 1).
Toto neorintované klonování umožňuje získat 2 nové vektory :
- vektor pBIOS 306 nosič genu pAct-ZmASrl ve směru-terNos
- vektor pBIOS 307 nosič genu pAct-ZmAsrt v protisměru terNos
Oreintace cDNA v porovnání s promotorem aktinu se určí jednoduchou enzymatickou restrikcí s Eagl a dvojitou enzymatickou restrikcí Hind III - EcoRV.
• · · «
4 4
44
- 19 • · · • ··· • 4 • 4 • · · · 44 9
b) Konstrukce intermediálních vektorů pro homologní rekombinaci s pSBl (získání superbinárních plazmidů)
Vektory sloužící k homologní rekombinaci v Agrobacterium tumefaciens jsou odvozeny od vektoru pBIOS 273.
Konstrukce plazmidů pBIOS 273
Základní vektor pro homologní rekombinaci je vektor pBIOS 273. Tento vektor se získá ve 2 krocích:
- klonováním fragmentu BspDI/Xhol (pAct-Bar-terNos) vektoru pDM 302 (Cao a kol., 1992) v místech Smál a BspDI vektoru pSBl2 (Japan Tobacco). Výsledný vektor tohoto klonování se nazývá pBIOS 272.
- delecí místa Xhol v pozici 3363 vektoru pBIOS 272 částečným natrávením za použití Xhol a účinku DNA polymerázy I, velký (Klenow) fragment. Získaný vektor, obsahující jediné místo Xhol, se nazývá pBIOS 273.
Získání rekombinovaných intermediálních vektorů obsahujících cDNA Asrl ve správném směru nebo v protisměru
Tyto konstrukty se vytvoří na základě vektoru pBIOS 274, odvozeného od vektoru pBIOS 273, klonováním fragmentu (ProAg·· ·4 ► · · • · ····
- 20 Bamase-terCaMV) Xhol vektoru pWP 128 (Paul a kol. 1992) ve vektoru pBIOS 273 natráveném Xhol.
Intermediální vektory pBIOS308 a pBIOS309 se získají klonováním Sall/Xhol fragmentů vektorů pBIOS 306 a pBIOS 307 o velikosti 2970 pb v místech BspDI/Xhol vektoru pBIOS 274.
Tato klonování takto umožňují nahradit gen pA9-BarnaseterCaMV vektoru pBIOS 274 genem pAct-ZmAsrl pozitivní-terNos, výsledný vektor se nazývá pBIOS 308 (Obrázek 2) nebo genem pAct-ZmASrl negativní terNos, výsledný vector se nazývá pBIOS 309 (Obrázek 3).
c) Konstrukce superbinárních vektorů pro transformaci pro expresi genu Asrl a jeho protisměru v Agrobacterium tumefaciens a v rostlině kukuřice
Konstrukce superbinárních vektorů
Vektory, které se používají pro transformování kukuřice, se získají homologní rekombinací plazmidů pBIOS 308 a pBIOS 309 s vektorem pSBl (EP 672 752). Vektor pSBl obsahuje geny virB a virG plazmidů Ti pTiBo542, který je přítomný v kmenu Agrobacterium tumefaciens A281 (ATCC 37349), gen odolnosti vůči tetracyklinu, funkční začátek replikace u E. coli a Agrobacterium a homologní oblast, kterou lze nalézt . u intermediálních vektorů pBIOS 308 a pBIOS 309. Přítomnost
- 21 této homologní oblasti v přijímacím plazmidu (pSBl) a intermediálních plazmidech (pBIOS 308 a. pBIOS 309) je zodpovědná za fenomén homologní rekombinace.
Intermediální vektory pBIOS 308 a pBIOS 309 jsou vneseny do buněk Agrobacterium fumefaciens obsahujících vektor pSBl elektroporaci za použití GIBCO BRL CELL PORATOR Voltage Booster způsbem, který popsal Mattanovitch a kol. (1989) a protokolu, který je dodán výrobcem (Life Technologies, USA) .
Agrobakterie obsahující superbinární vektory jsou podrobeny selekci v médiu YT CaCl2 v přítomnosti rifampicinu a spektinomycinu o koncentraci, která je rovná 50 mg/1. Gen odolnosti vůči rifampicinu je nesen na bakteriálním chromozomu. Odolnost vůči spektinomycinu, nesená na plazmidech pBIOS 308 a pBIOS 309 (počátek replikace u E. coli), se exprimuje pouze po homologní rekombinaci s vektorem pSBl (počátek funkční replikace u Agrobacterium a E. coli).
Po rekombinaci získané superbinární plazmidy se nazývají pRec 308 (pBIOS 308 x pSBl) a pRec 309 (pBIOS 309 x pSBl) . Obsahují počátky funkční replikace jak v E. coli, tak v Agrobacterium tumefaciens, geny odolností vůči tetracyklinu a spektinomycinu, T-DNA, ve které se nacházejí kazety exprese genů Bar a Asrl (cDNA ve správném směru nebo v protisměru) a geny virulence virB a virG plazmidu pTiBo542.
- 22 Charakterizace superbinárních vektorů pRec 308 a pRec 309
Tyto superbinární plazmidy pRec 308 (gen Asrl ve správném směru) a pRec 309 (gen Asrl v protisměru) se vyznačují enzymatickou restrikcí Sáli. Potom se provede analýza restrikčních fragmentů Sáli za pomoci Southern blottingu za pomoci sondy Bar a sondy genu Asrl (tato sonda odpovídá fragmentu EcoRI/Xhol o velikosti 795 pb vektoru pHHU516, tedy úplné cDNA ). Získané profily odpovídají očekávaným profilům.
Příklad 4 :
Transformace kukuřice
Transformování kukuřice se provede podle protokolu Ishida a kol. (1996)
Transformování začíná souběžnou kulturou, kde se nezralé zárodky kukuřice (velikost v rozmezí od 1 do 1,2 mm) uvedou po dobu 5 minut do kontaktu s Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 obsahujícím superbinární vektory pRec 308 nebo pRec 309. Zárodky se potom umístí do média LSAs po dobu 3 dní v temnu a při teplotě 25°C.
Náseldující etapa je etapa první selekce transformovaných závalů (kalus): zárodky-závaly se přenesou do média LSD 5 obsahujícího fosfinotricin o koncentraci 5 mg/1 a cefotaxim o ·· «··· • · • ·
- 23 ··· • · koncentraci 250 mg/1 (odstranění Agrobacterium tumefaciens). Tato etapa se provádí po dobu 2 týdnů v temnu a při teplotě 25°C.
Druhá etapa selekce se provede přenesením zárodků, které se vyvinuly v médiu LSD 5 do média LSD 10 (fosfinotricin o koncentraci 10 mg/1) za přítomnosti cefotaximu, po dobu 3 týdnů za stejných podmínek jako při první selekci (25°C, temno).
Třetí etapa selekce spočívá ve vyřezání závalů typu I (fragmenty o velikosti od 1 do 2 mm) a v jejich přenesení po dobu 3 týdnů do temna a při teplotě 2 5°C do médiu LSD 10 v přítomnosti cefotaximu.
Regenerace rostlinek se potom provede vyřezáním závalů typu I, které se rozrostly a jejich přenesením do média LSZ v přítomnosti fosfinotricinu o koncentraci 5 mg/1 a cefotaximu po dobu dvou týdnů při teplotě 22°C a za neustálého osvětlení. Rostlinky, které regenerovaly, se přenesou do média pro zakořenění (Ishida a kol, 1996) po dobu dvou týdnů při teplotě 22 °C a za neustálého osvětlení pro etapu vývoje.
Získané rostliny se přenesou do fytotronu za účelem jejich aklimatizace.
ο«· ·· ····
- 24 Příklad 5:
Důkaz exprese proteinu ZmASRl u transformovaných rostlin
Proteiny vzorků listů pocházejících z transformovaných rostlin byly získány způsobem podle Damerval a kol. (1986), potom byly podrobeny analýze dvourozměrnou elektroforézou (EBD) podle protokolu Ríccardi a kol. (1998).
Dvourozměrná elektroforéza spočívá v oddělení polypeptidů v závislosti na jejich izoelektrickém bodě a v závislosti na jejich molekulární hmotnosti (elektroforéza v přítomnosti SDS) . Před provedením elektroforézy se proteiny extrahují a udržují za podmínek zajišťujících denaturaci: zruší se kvarterní struktura. Různé polypeptidy tvořící oligomerní proteiny migrují nezávisle během obou elektroforéz. Gely se potom obarví dusičnanem stříbrným.
Dvourozměrný gel, který se takto získá, se porovná s gelem obsahujícím proteiny listů rostlin A188, které nejsou transformované.
Získané výsledky transformovaných rostlin s kódující sekvencí umístěnou ve směru ukazují, pouhým prohlédnutím těchto dvou gelů pouhým okem, vyšší expresi proteinu ASR1 ······· ·· ··«· ····
- 25 transformovaných rostlin v porovnání s kontrolními rostlinami
A188.
Skvrna ASR pozorovaná u transformovaných rostlin s konstruktem v protisměru se zdá být stále prokazatelná, ale se slabší intenzitou, což ukazuje, že rostliny transformované v protisměru exprimují méně proteinu než kontrolní rostliny.
Tato proteinová analýza tedy prokazuje expresi proteinu ASR1 v transformovaných rostlinách, ve změněném množství v porovnání s netransformovanými rostlinami.
Příklad 6 :
Měření tolerance vůči vodnímu stresu u transgenních rostlin získaných podle předložené přihlášky vynálezu
Odolnost vůči vodnímu stresu transformovaných rostlin podle předložené přihlášky vynálezu, v porovnání s kontrolními rostlinami, se může hodnotit na základě různých metod fenotypových analýz, fyziologických analýz a/nebo biochemických analýz, pro různé podmínky zavodnění - za normálních podmínek (tradiční kultura se zaléváním) a za podmínek vodního stresu.
·· ···· «« ·♦<< • · · · · « • ··· · · · • · · · · · • · · · · · ···· ··· ·· M ·· ···· • · · • · · • · · • · · · • · « ·
- 26 Pouze jako příklad lze uvést podmínky zavodnění na poli, které mohou být následující:
- normální zavodnění v zalévané části na základě 5 mm na den, měřeno tenziometry, které jsou umístěny v hloubce 30, 50, 70 cm.
- omezené zavodnění, bez přísunu vody, pokud možno až do 10 dne po vykvetení. V den tohoto přibližného data, když se stres hodnotí jako příliš významný, se dodá voda, rytmus přísunu nesmí přesáhnout 3 mm za den.
Zaznamenávají se povětrnostní podmínky a podmínky zavodnění.
Značení provedená během různých období kvetu a sklizně spočívají v měření :
a) Měření tolerance vůči stresu pozorováním fenotypu
Dříve provedené genetické analýzy naznačují potenciální roli ASR1 ve stárnutí listů a protandrii (posun mezi samčím a samičím kvetením) v podmínkách sucha. Tyto znaky jsou tedy studovány přednostně.
Stárnutí listů lze studovat morfologickými měřeními, která spočívají v počítání počtu uschlých listů a počtu zelených listů během 4 časových bodů, které jsou od sebe vzdáleny 15 dní, na základě data kvetu nebo různých stádiií vývoje. Pokud se pozorují velmi rozdílná chování týkající se srolování a ·· ··«·
• » • * · • · ···· ·· ·· barvy listů, provedou se měření podle stupnice, která jde od 0 do 5 (od nejvíce odolné k nejméně odolné vůči stresu).
Stárnutí se může rovněž měřit měřením množství chlorofylu na odběrech disků listů v listu výhonu na květ.
Protandrie nebo posun mezi daty kvetu samčích rostlin (přítomnost pylu) a samičích rostlin (přítomnost tyčinek) se měří následujícím způsobem: data, kdy se objeví tyčinky a pyl se zaznamenají odděleně pro každou rostlinu, a dynamika je znázorněna na procentuální křivce rostlin které vykvetly, v závislosti na čase.
Jinak se jednotlivá měření provedou během sklizně pro zhodnocení účinku tolerance vůči stresu na produkci zrn, hlavně: procento oplodnění (poměr počtu zrn na klas/ počet oplodnitelných zárodků), počet řad na klas, počet zrn v řadě, vlhkost zrn, hmotnost 1000 zrn.
Použití nedestruktivního identifikačního testu za použití Basta umožňuje snadno odlišit v každém transgenním potomstvu rostliny, které jsou odolné vůči Basta od citlivých rostlin, odolné rostliny obsahují gen Asr, geneticky vázaný na markerový gen selekce, kromě případu rekombinace. Tento test spočívá v natření konce listu roztokem Basta a v pozorování výsledného fenotypu, aniž by se ohrozila vitalita celé rostliny: konec listu nekrotizuje a uschne, když je rostlina • · · · · ·
• · · e · · • · fr · · ·
citlivá, nebo zůstane zelený v případě, kdy je rostlina odolná. Toto umožňuje pozorovat na základě měření tolerance vůči stresu, zda transgenní ASR pozitivně ovlivňuje odpověď vůči stresu v závislosti na expresi genu ve správném směru nebo v protisměru.
b) Hodnocení stresu, kterému jsou rostliny podrobeny
Na listech se provedou odběry za účelem měření, obsahu ABA (metoda Quarrie a kol., 1988) a, v případě potřeby, exprese proteinu dvourozměrnou elektroforézou.
Stres, kterému se podrobí rostliny, může být hodnocen měřením bazálního vodního potenciálu, za pomoci přenosné tlakové komory, na rostlinách, které se netransformovaly, za kontrolních podmínek a za podmínek vodního stresu. Mohou se rovněž provést měření relativního obsahu vody listů.
Stárnutí listů, které umožňuje snížení plochy odpařování a remobilizaci metabolitů ke zbytku rostliny, se měří způsobem, který je popsán výše, na dospělých rostlinách po vykvetení, počítáním počtu listů, jejichž alespoň 50% plochy je suchá.
Pozoruje se výrazný účinek exprese proteinu ASR na podíl suchých listu. Případy ve správném směru představují v daném čase, vztaženo ke kontrolám, větší podíl suchých listů, než případě 'v protisměru' (Obrázek 4). Stejně tak za
- 29 podmínek vodního stresu ukazují měření kinetiky stárnutí listů, že v případech ve správném směru probíhá stárnutí rychleji, než v netransformovaných případech a že v případech v protisměru stárnutí probíhá pomaleji, než v netransformovaných případech (Obrázek 5) .
Případem ve správném směru se má na mysli případ odvozený z úvodní etapy transformace expresní kazetou obsahující sekvenci ASR, která je umístěná ve správném směru. Případem v protisměru se má na mysli případ odvozený z úvodní etapy, transformace kazetou obsahující sekvenci ASR, která je umístěná v protisměru.
Případy ve správném směru . , které stárnou rychleji než netransformované případy za podmínek vodního stresu, představují tedy selekční výhodu tolerance vůči vodnímu stresu, hlavně v případě stresu dlouhého trvání (snížení plochy odpařování a re-mobilizace metabolitů do zbytku rostliny).
Případy v protisměru, které stárnou pomaleji než v netransformovaných případech za podmínek vodního stresu, mají rovněž význam, obzvláště v případě vodního deficitu krátkého trvání. Vskutku, tyto rostliny si uchovají větší odpařovací plochu a více tedy využijí pozdější přísun vody (deštěm nebo zaléváním).
e · ···· ·· ··«· «« ·»·» *' · * 99 · 9 · «
9 99 9 9 · » a a • · * · · 9 9 9 9 9 • · 9 9 9 9 9 9^9
9999 999 9* 99 99 9 9
- 30 Měření stresu, kterému jsou rostliny podrobeny (obsah ABA v listech) také prokázaly mírný, ale velice významný stres: v uvedeném pořadí 616 a 512 ng ABA/g suché hmoty rostlin podrobených stresu a kontrol, to znamená zvýšení o přibližně 100 ng ABA na gram suché hmoty v rostlinách podrobených stresu. Tato odpověd je stejná v případech ve správném směru a v protisměru, stejně tak jako pro rostliny, které nejsou transformované. Transformování se tedy nezdá mít účinek na akumulací ABA v listech.
Tyto výsledky tedy potvrzují, že v přítomnosti mírného vodního stresu a při malé expresi ASR transformovaných rostlin se již pozorovaly výrazné rozdíly.
Jinak účinek tolerance vůči vodnímu stresu na produkci zrn se měřil v porovnání s výnosem zrn, hmotností tisíce zrn a počtu klasů vztažených na rostlinu. Získané výsledky při mírném vodním stresu ukazují měření výnosu zrn srovnatelná mezi transformovanými rostlinami (ve správném směru a v protisměru) a rostlinami, které nejsou transformované, za podmínek stresu nebo za normálních podmínek.
Na jednu stranu transformování a na druhou stranu tolerance vůči vodnímu stresu se tedy nezdají mít účinek na výnos zrn rostlin.
- 31 • * · · · · ·· ···· • · · · ♦ 9 ··· 9 9 9 • 9 (η 9 9 9 • 9 9 9 9 9
9999 999 +9 « · • · 9·· ·
9 9
9 9
9 9 • · · · • · 9 9
Byla rovněž provedena měření růstu rostlin. Délky 3 listů pod a nad klasem se měří na rostlinách ve správném směru a v protisměru po vykvetení, v nepřítomnosti vodního stresu. Velmi významný rozdíl se pozoruje pro 3 listy :
pro listy FO
Fl,
F2, v protisměru ve správném směru v protisměru ve správném směru v protisměru ve správném směru
| 78,41 | cm | (p<0, | 01) |
| 76, 11 | cm | ||
| 77,96 | cm | (p<0, | 01) |
| 75, 76 | cm | ||
| 75,04 | cm | (p<0, | 01) |
| 72.94 | cm |
Globálně se tedy pozoruje významný rozdíl 2 cm délky pro tyto 3 listy, listy rostlin ve správném směru jsou menší než listy rostlin v protisměru. Tento pokles růstu listu pozorovaný u případů ve správném směru tedy koreluje s výraznějším stárnutím, obojí vede ke snížené odpařovací ploše, která umožňuje rostlině lépe tolerovat vodní stres.
BIBLIOGRAFIE
- Án a kol. (1986). Plant Physiol. 81 : 86-91
- Altschul a kol. (1990), J. Mol. Biol. 215:403-410
- Anderson O.D. a kol., (1989),T.A.G., 77:689-700
- Bechtold a kol. (1993), Comptes rendus Académie des Sciences Paris Serie 3,316:1194-1199
- Canel C. a kol. (1995), Plant Physiol. 108 (1995), 13231325.
« · · *
- 32 Chupeau a kol. (1989), Biotechnology, 7(5):503-508
Church a·Gilbert, (1984) Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 81:
1991-1995
Damerval a kol. Electrophoresis 7:52-54, 1986
Depicker a kol., (1982), J. Mol. AppLGenet., 1, 561-573. Depigny-This a kol., (1992), Plant Mol. Biol., 20:467-479 De Vienne a kol., (1999), Journal of Experimental Botany, 50(332) : 303-309.
Finer a kol. (1992). Plant Cell Report, 11:323-328 Franck a kol. (1980), Cell, 21:285-294 Fromm M. a kol. (1990), Biotechnology. 8:833-839 Guerche a kol. (1987), Mol. Gen. Genet., 206:382 Herrera-Estrella a kol. (1983), EMBO J.2,987-995 Hiei a kol. (1994). The Plant Journal, 6, 271-282.
Hoekema a kol. (1983). Nátuře, 303, 179-180. lůsem a kol., (1993). Plant Physiol., 102:1353-1354 Ishida a kol. (1996), Nátuře Biotechnology 14 : 754-750 Kasuga a kol. (1999), Nátuře Biotechnologie, 17:287-291 Kay a kol., (1987) Science, 236:4805
| Mattanovitch, a | kol., | (1989), Nucleic | Acids Research, |
| 17(16):6747. | |||
| Mc Elroy a kol. 231(1), 150-160. | (1991). | Molecular and | General Genetics, |
| Neuhaus a kol. 75(1):30-36 | (1987), | Theoretical and | applied Genet., |
Quarrie a kol. (1988).Planta 173 :330-339
Riccardi a kol. (1998). Plant Physiol., 117:1253-1263,
999 ·· · · 99 9
- 33 Sambrook a kol. (1989). Molecular cloning, A laboratory manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press Schocher a kol. (1986). Biotechnology 4:1093-1096 Šilhavý D. a kol. (1995), Plant. Mol. Biol. 27 (1995),
587-595.
Thomas et al., (1999), Plant Science 140, 21-30
Watson a kol. (1994), ADN recombinant, Ed. De Boeck Universitě PP 273-292
Zambryski a kol. (1989) Cell, 56, 193-201.
Zeewart a Creelman (1988), Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol 39 : P439-473
Zastupuj e:
dr. P. Kalen
JUDr. P. Kalenský . advokát
Hálkova 2, 120 00 Praha 2
Claims (13)
1. Způsob získání rostliny, která vykazuje změněné množství proteinu ASR, což jí uděluje zvýšenou odlnost vůči vodnímu stresu v porovnání s rostlinou, která není transformovaná, vyznačující se tím, že obsahuje etapy spočívající v:
transformování alespoň jedné rostlinné buňky vektorem obsahujícím kazetu exprese obsahující nukleotidovou sekvenci kódující protein ASR nebo blokující expresi proteinu ASR ;
- kultivaci takto transformované buňky způsobem, který vede k tvorbě rostliny obsahující ve svém genomu uvedenou kazetu exprese.
2. 'Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se uvedený protein ASR získá z obilniny, jako je kukuřice.
3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že uvedený protein ASR obsahuje sekvenci SEQ ID No 2.
4. Způsob podle jednoho z patentových nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že uvedená nukleotidové sekvence je vložena ve správném směru.
• · · · · · • · ··· ·
- 35
5. Způsob podle jednoho z patentových nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že uvedená nukleotidová sekvence je sekvencí kódující protein ASR, a je vložena v protisměru.
6. Způsob podle jednoho z patentových nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že kazeta exprese obsahuje promotor, který umožňuje konstitutivní expresi sekvence kódující ASR, například promotor aktin - intron.
7. Způsob podle jednoho z patentových nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že kazeta exprese obsahuje sekvenci, která zvolenou se souboru zahrnujícího SEQ ID No. 1, No. 3, No. 4 nebo No. 5.
8. Rostlina nebo část rostliny, vyznačující se tím, že lze získat způsobem podle jednoho z patentových nároků 1 až 7.
9. Rostlina nebo část rostliny podle patentového nároku 8, vyznačující se tím, že vykazuje zvýšení exprese proteinu ASR v porovnání s rostlinou, která není transformovaná.
10. Rostlina nebo část rostliny podle patentového nároku 8 nebo 9, vyznačující se tím, že se jedná o velkoprodukční rostliny, vybrané ze souboru, zahrnujícího kukuřici, pšenici, řepku, slunečnici a hrách, obzvláště kukuřici.
- 36 • · · ·· · * fcfcfcfc • · · · · • fc fc fc fc fc fcfcfcfc · • · · · fcfc fc fc· · · fcfc 9 9
11. Hybridní transgenická rostlina, vyznačující se tím, že lze získat postupem sestávajícím ze:
a) získání dvou transgenických rostlin podle postupu podle jednoho z patentových nároků 1 až 7, a
b) křížení těchto rostlin.
12. Použití nukleové kyseliny kódující protein ASR pro získání transgenické rostliny, která vykazuje změněné množství proteinu ASR, což jí uděluje zvýšenou odolnost vůči vodnímu stresu v porovnání s rostlinou, která není transformovaná.
13. Použití nukleové kyseliny kódující protein ASR nebo jeho fragment, jako sondy nebo primerů pro amplifikaci pro selekci rostlin transformovaných podle podle jednoho z patentových nároků 8 až 11, vykazujících zvýšenou odlnost vůči vodnímu stresu.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0005534A FR2808285B1 (fr) | 2000-04-28 | 2000-04-28 | Procede d'obtention de plantes presentant une resistance accrue a un stress hydrique |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20023569A3 true CZ20023569A3 (cs) | 2003-06-18 |
Family
ID=8849761
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20023569A CZ20023569A3 (cs) | 2000-04-28 | 2001-04-24 | Způsob získání rostlin, které vykazují zvýšenou odolnost vůči vodnímu stresu |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7154025B2 (cs) |
| EP (1) | EP1276870B1 (cs) |
| AT (1) | ATE364082T1 (cs) |
| AU (1) | AU785416B2 (cs) |
| CA (1) | CA2407240C (cs) |
| CZ (1) | CZ20023569A3 (cs) |
| DE (1) | DE60128796T2 (cs) |
| ES (1) | ES2284642T3 (cs) |
| FR (1) | FR2808285B1 (cs) |
| HU (1) | HUP0300654A3 (cs) |
| PL (1) | PL208102B1 (cs) |
| WO (1) | WO2001083756A1 (cs) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AUPR482101A0 (en) * | 2001-05-07 | 2001-05-31 | Agresearch Limited | Abiotic stress protection |
| DE112008001044T5 (de) | 2007-05-03 | 2010-09-02 | Basf Plant Science Gmbh | Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen und Verfahren zu ihrer Herstellung |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5633440A (en) * | 1994-12-20 | 1997-05-27 | Dna Plant Technology Corporation | P119 promoters and their uses |
| WO1997013843A1 (en) * | 1995-10-12 | 1997-04-17 | Cornell Research Foundation, Inc. | Production of water stress or salt stress tolerant transgenic cereal plants |
-
2000
- 2000-04-28 FR FR0005534A patent/FR2808285B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-04-24 HU HU0300654A patent/HUP0300654A3/hu unknown
- 2001-04-24 US US10/258,521 patent/US7154025B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-04-24 CA CA2407240A patent/CA2407240C/fr not_active Expired - Fee Related
- 2001-04-24 AT AT01929693T patent/ATE364082T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-04-24 WO PCT/FR2001/001252 patent/WO2001083756A1/fr active IP Right Grant
- 2001-04-24 PL PL358386A patent/PL208102B1/pl unknown
- 2001-04-24 EP EP01929693A patent/EP1276870B1/fr not_active Revoked
- 2001-04-24 AU AU56398/01A patent/AU785416B2/en not_active Ceased
- 2001-04-24 ES ES01929693T patent/ES2284642T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-04-24 CZ CZ20023569A patent/CZ20023569A3/cs unknown
- 2001-04-24 DE DE60128796T patent/DE60128796T2/de not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL358386A1 (en) | 2004-08-09 |
| AU785416B2 (en) | 2007-05-03 |
| ES2284642T3 (es) | 2007-11-16 |
| PL208102B1 (pl) | 2011-03-31 |
| FR2808285A1 (fr) | 2001-11-02 |
| CA2407240A1 (fr) | 2001-11-08 |
| DE60128796T2 (de) | 2008-02-07 |
| EP1276870B1 (fr) | 2007-06-06 |
| CA2407240C (fr) | 2012-08-28 |
| US20040139505A1 (en) | 2004-07-15 |
| WO2001083756A1 (fr) | 2001-11-08 |
| HUP0300654A3 (en) | 2004-10-28 |
| EP1276870A1 (fr) | 2003-01-22 |
| FR2808285B1 (fr) | 2004-10-15 |
| US7154025B2 (en) | 2006-12-26 |
| AU5639801A (en) | 2001-11-12 |
| ATE364082T1 (de) | 2007-06-15 |
| HUP0300654A2 (hu) | 2003-07-28 |
| DE60128796D1 (de) | 2007-07-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2003236475B2 (en) | Genes involved in tolerance to environmental stress | |
| AU2005251653B2 (en) | The shine clade of transcription factors and their use | |
| AU2012351627B2 (en) | Method for plant improvement | |
| JPH08508412A (ja) | エチレンに対する修正された応答をもつ植物 | |
| US8796507B2 (en) | MEG1 endosperm-specific promoters and genes | |
| US8026413B2 (en) | EMP4 gene | |
| CN105063063A (zh) | 具有增强的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法 | |
| US7612258B2 (en) | Nucleic acid molecules associated with plant cell proliferation and growth and uses thereof | |
| AU785416B2 (en) | Method for obtaining plants exhibiting enhanced resistance to water stress | |
| WO2014108220A1 (en) | Stress tolerant plants | |
| WO2005037863A2 (en) | Alternative splicing factors polynucleotides, polypeptides and uses thereof | |
| AU2007214296A1 (en) | Genes involved in tolerance to environmental stress |