PL208102B1 - Sposób otrzymywania roślin wykazujących zwiększoną oporność na stres wodny, roślina możliwa do uzyskania za pomocą tego sposobu, hybrydowa roślina transgeniczna, oraz zastosowanie kwasu nukleinowego kodującego białko ASR - Google Patents
Sposób otrzymywania roślin wykazujących zwiększoną oporność na stres wodny, roślina możliwa do uzyskania za pomocą tego sposobu, hybrydowa roślina transgeniczna, oraz zastosowanie kwasu nukleinowego kodującego białko ASRInfo
- Publication number
- PL208102B1 PL208102B1 PL358386A PL35838601A PL208102B1 PL 208102 B1 PL208102 B1 PL 208102B1 PL 358386 A PL358386 A PL 358386A PL 35838601 A PL35838601 A PL 35838601A PL 208102 B1 PL208102 B1 PL 208102B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- plant
- asr
- plants
- protein
- stress
- Prior art date
Links
- 208000005156 Dehydration Diseases 0.000 title claims abstract description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 46
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 title claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 112
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 72
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 54
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 46
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 9
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 157
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 37
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 25
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 claims description 22
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 claims description 22
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 15
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 claims description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 11
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 10
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 claims description 9
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 claims description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 9
- 230000025508 response to water Effects 0.000 claims description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 5
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 4
- 241000209140 Triticum Species 0.000 claims description 4
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 claims description 3
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 claims description 3
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 claims description 3
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 2
- 244000038559 crop plants Species 0.000 claims description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 30
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 19
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 16
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 12
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 10
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 8
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 7
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 7
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 7
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 7
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid;azane Chemical compound [NH4+].CP(O)(=O)CCC(N)C([O-])=O ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 4
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 4
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 4
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 4
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 4
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 4
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 3
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 3
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 3
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 2
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 2
- UTKUTMJSWKKHEM-WDSKDSINSA-N Glu-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O UTKUTMJSWKKHEM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- HKCCVDWHHTVVPN-CIUDSAMLSA-N Lys-Asp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HKCCVDWHHTVVPN-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- IBQMEXQYZMVIFU-SRVKXCTJSA-N Lys-Asp-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N IBQMEXQYZMVIFU-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 2
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- IWZRODDWOSIXPZ-IRXDYDNUSA-N Phe-Phe-Gly Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)NCC(O)=O)C1=CC=CC=C1 IWZRODDWOSIXPZ-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 2
- 101100018379 Shigella flexneri icsA gene Proteins 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 101100476911 Yersinia enterocolitica yscW gene Proteins 0.000 description 2
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229910002056 binary alloy Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 2
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 2
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 2
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000024346 drought recovery Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 2
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000014634 leaf senescence Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 108010084525 phenylalanyl-phenylalanyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 101150076562 virB gene Proteins 0.000 description 2
- 101150033532 virG gene Proteins 0.000 description 2
- IGXNPQWXIRIGBF-KEOOTSPTSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoic acid Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 IGXNPQWXIRIGBF-KEOOTSPTSA-N 0.000 description 1
- 241000023308 Acca Species 0.000 description 1
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 1
- SBGXWWCLHIOABR-UHFFFAOYSA-N Ala Ala Gly Ala Chemical compound CC(N)C(=O)NC(C)C(=O)NCC(=O)NC(C)C(O)=O SBGXWWCLHIOABR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WKOBSJOZRJJVRZ-FXQIFTODSA-N Ala-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WKOBSJOZRJJVRZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- ROLXPVQSRCPVGK-XDTLVQLUSA-N Ala-Glu-Tyr Chemical compound N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O ROLXPVQSRCPVGK-XDTLVQLUSA-N 0.000 description 1
- VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N Ala-Lys-Lys Natural products NCCCCC(NC(=O)C(N)C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010011667 Ala-Phe-Ala Proteins 0.000 description 1
- HYIDEIQUCBKIPL-CQDKDKBSSA-N Ala-Phe-His Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N HYIDEIQUCBKIPL-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 1
- VHAQSYHSDKERBS-XPUUQOCRSA-N Ala-Val-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O VHAQSYHSDKERBS-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- IIFDPDVJAHQFSR-WHFBIAKZSA-N Asn-Glu Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IIFDPDVJAHQFSR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101710183938 Barstar Proteins 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 102100036008 CD48 antigen Human genes 0.000 description 1
- 101100289888 Caenorhabditis elegans lys-5 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000005979 Citrus limon Nutrition 0.000 description 1
- 244000131522 Citrus pyriformis Species 0.000 description 1
- 101710190853 Cruciferin Proteins 0.000 description 1
- LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N D-nopaline Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)N[C@@H](C(O)=O)CCC(O)=O LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- JJKKWYQVHRUSDG-GUBZILKMSA-N Glu-Ala-Lys Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O JJKKWYQVHRUSDG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- CGOHAEBMDSEKFB-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CGOHAEBMDSEKFB-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- BUZMZDDKFCSKOT-CIUDSAMLSA-N Glu-Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BUZMZDDKFCSKOT-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- VXQOONWNIWFOCS-HGNGGELXSA-N Glu-His-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N VXQOONWNIWFOCS-HGNGGELXSA-N 0.000 description 1
- XOFYVODYSNKPDK-AVGNSLFASA-N Glu-His-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N XOFYVODYSNKPDK-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- YGLCLCMAYUYZSG-AVGNSLFASA-N Glu-Lys-His Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 YGLCLCMAYUYZSG-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- HRBYTAIBKPNZKQ-AVGNSLFASA-N Glu-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O HRBYTAIBKPNZKQ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- SOYWRINXUSUWEQ-DLOVCJGASA-N Glu-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O SOYWRINXUSUWEQ-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- ZQIMMEYPEXIYBB-IUCAKERBSA-N Gly-Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CN ZQIMMEYPEXIYBB-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- GDOZQTNZPCUARW-YFKPBYRVSA-N Gly-Gly-Glu Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O GDOZQTNZPCUARW-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KAJAOGBVWCYGHZ-JTQLQIEISA-N Gly-Gly-Phe Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 KAJAOGBVWCYGHZ-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- INLIXXRWNUKVCF-JTQLQIEISA-N Gly-Gly-Tyr Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 INLIXXRWNUKVCF-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- IDNNYVGVSZMQTK-IHRRRGAJSA-N His-Arg-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N IDNNYVGVSZMQTK-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- AIPUZFXMXAHZKY-QWRGUYRKSA-N His-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O AIPUZFXMXAHZKY-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- DEOQGJUXUQGUJN-KKUMJFAQSA-N His-Lys-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N DEOQGJUXUQGUJN-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 101000716130 Homo sapiens CD48 antigen Proteins 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N Leu-Ala-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- KTOIECMYZZGVSI-BZSNNMDCSA-N Leu-Phe-His Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 KTOIECMYZZGVSI-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- OVIVOCSURJYCTM-GUBZILKMSA-N Lys-Asp-Glu Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O OVIVOCSURJYCTM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- YEIYAQQKADPIBJ-GARJFASQSA-N Lys-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)C(=O)O YEIYAQQKADPIBJ-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- PRCHKVGXZVTALR-KKUMJFAQSA-N Lys-His-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N PRCHKVGXZVTALR-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- JQSIGLHQNSZZRL-KKUMJFAQSA-N Lys-Lys-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCCN)N JQSIGLHQNSZZRL-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- BBDSZDHUCPSYAC-QEJZJMRPSA-N Phe-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BBDSZDHUCPSYAC-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 244000088415 Raphanus sativus Species 0.000 description 1
- 235000006140 Raphanus sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- VGYBYGQXZJDZJU-XQXXSGGOSA-N Thr-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VGYBYGQXZJDZJU-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 1
- AQAMPXBRJJWPNI-JHEQGTHGSA-N Thr-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AQAMPXBRJJWPNI-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 1
- KZTLZZQTJMCGIP-ZJDVBMNYSA-N Thr-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KZTLZZQTJMCGIP-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 1
- YGKVNUAKYPGORG-AVGNSLFASA-N Tyr-Asp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O YGKVNUAKYPGORG-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- JLKVWTICWVWGSK-JYJNAYRXSA-N Tyr-Lys-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 JLKVWTICWVWGSK-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 108010076324 alanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 101150007564 asr gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- -1 asulam sulfonamide Chemical class 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011325 biochemical measurement Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000004345 fruit ripening Effects 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Natural products NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010045126 glycyl-tyrosyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 108010028295 histidylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000002015 leaf growth Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000010451 perlite Substances 0.000 description 1
- 235000019362 perlite Nutrition 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008288 physiological mechanism Effects 0.000 description 1
- 229930195732 phytohormone Natural products 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000008458 response to injury Effects 0.000 description 1
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 1
- 230000033764 rhythmic process Effects 0.000 description 1
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 1
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 1
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 1
- 239000012882 rooting medium Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania roślin wykazujących zwiększoną oporność na stres wodny, roślina możliwa do uzyskania za pomocą tego sposobu, hybrydowa roślina transgeniczna oraz zastosowanie kwasu nukleinowego kodującego białko ASR.
W regionach umiarkowanych, okresy słabych opadów, o intensywności zmiennej i nieprzewidywalnej są przyczyną spadku produktywności zauważalnej u roślin podczas hodowli. Niedobór wody może ostro wpływać na wzrost i rozmnażanie roślin. Różne strategie odwołujące się do mechanizmów fizjologicznych (zmniejszenie wzrostu części powietrznych, zamknięcie jamek) i/lub komórkowych (dopasowanie osmotyczne) mogą pozwolić im uciec przed tym stresem wodnym, a przynajmniej go tolerować. Te mechanizmy co najmniej częściowo kontrolowane przez ABA (kwas abcysowy), fitohormon, którego stężenie zwiększa się w roślinach poddanych stresowi wodnemu (Zeevaart i Creelman, 1988) obejmują wiele białek o różnych przypuszczalnych funkcjach: białka typu kanały błonowe lub wyrażane w odpowiedzi na uszkodzenia powodowane w komórce (proteazy, inhibitory proteaz), lub też białka, których funkcje nie są bezpośrednio związane ze stresem, ale które wyrażane są na poziomach podwyższonych w warunkach stresu wodnego lub soli (enzymy glikolizy i syntezy metioniny). Odpowiedź rośliny zależy zresztą od parametrów środowiska (typ ograniczenia, intensywność, trwanie) i genetycznych (gatunek i genotyp) czyniąc trudnym określenie roli tych białek w mechanizmach tolerancji suszy.
Istnieje więc rzeczywista potrzeba wykazania funkcji genów kandydatów w tych mechanizmach tolerancji stresu wodnego dla ich wykorzystania w transgenezie mającej na celu otrzymanie roślin posiadających lepszą tolerancję stresu wodnego. Jest to szczególnie ważne dla gatunków wielkich upraw, jak na przykład kukurydza, która osiąga maksymalny poziom wrażliwości na suszę 15 dni przed i 15 dni po kwitnieniu roślin (lipiec-sierpień w Europie), w okresie którego roślina absorbuje 45% całości swoich potrzeb.
Pierwsze badania przeprowadzone przez Riccardi'ego i wsp. (1998) na linii kukurydzy określonej jako lo (lodent) wykazały około dwudziestu białek, których ekspresja jest znacząco zwiększona w odpowiedzi na stres wodny i dla których proponowano przypuszczalne funkcje.
Jedno z tych białek wykazanych w linii lo stosowanych przez Riccardi'ego i wsp. (1998), ale nie w linii F2, wykazuje homologie z biał kiem ASRl („ABA-water stress ripening-induced protein”) pomidora, które jest indukowane przez ABA, stres wodny i dojrzewanie owocu, ale którego funkcja nie jest jeszcze znana (Iusem i wsp., 1993). Inne geny wykazujące homologie do ASR pomidora były zidentyfikowane, w szczególności u ziemniaka (Silhavy i wsp., 1995), cytryny (Canel i wsp., 1995), ryżu (Thomas i wsp., 1999), ale nie wykazano jasno żadnej funkcji dla białek kodowanych przez te geny. Badania QTL („Quantitative Trait Loci” - loci cech ilościowych) pozwoliły na zmapowanie genu Asr1 w regionie zawierającym także locus kontrolujący ilość ASR1 i QTL starzenia liści i protoandrię (De Vienne i wsp., 1999).
Twórcy niniejszego wynalazku wykazali obecnie rolę zrekombinowanego białka ASR w bezpośredniej odpowiedzi rośliny na stres wodny dla wykorzystania transgenezy. W efekcie udało się uzyskać im sposób otrzymania rośliny wykazującej zmodyfikowaną ilość białka ASR nadając jej lepszą oporność na stres wodny w stosunku do rośliny nie transformowanej.
Celem wynalazku jest więc sposób otrzymania roślin wykazujących zwiększoną odporność na stres wodny i zmodyfikowaną ilość białka ASR, nadającą jej lepszą oporność na stres wodny w stosunku do rośliny nie transformowanej. Sposób ten obejmuje etapy złożone z:
- transformacji co najmniej jednej komórki roś liny wektorem posiadającym kasetę ekspresyjną zawierającą sekwencję nukleotydów kodującą białko ASR, które jest naturalnie wyrażane przez roślinę w odpowiedzi na stres niedoboru wody i którego sekwencja aminokwasów wykazuje co najmniej 50% podobieństwo do SEQ ID nr 2, przy czym ta sekwencja nukleotydów jest wstawiona w orientacji sensownej,
- hodowli tak transformowanej komórki, aby wygenerować roś linę zawierają c ą tę kasetę ekspresyjną w swoim genomie.
Korzystnie, w sposobie tym, wymienione białko ASR pochodzi od zboża, takiego jak kukurydza.
Korzystnie, w sposobie tym, wymienione białko ASR zawiera sekwencję SEQ ID nr 2.
Korzystnie, kaseta ekspresyjna zawiera promotor pozwalający na ekspresję konstytutywną sekwencji kodującej ASR, na przykład, promotor aktyny - intron.
PL 208 102 B1
Korzystnie, kaseta ekspresyjna zawiera promotor, który indukuje ekspresję sekwencji kodującej ASR w warunkach stresu niedoboru wody.
Korzystnie, kaseta ekspresyjna zawiera sekwencję wybraną z sekwencji SEQ ID nr 1, nr 3, nr 4 i nr 5.
Roślina lub część rośliny, możliwa jest do uzyskania za pomocą opisanego sposobu.
Korzystnie, roślina lub część rośliny, wykazuje wzrost ekspresji białka ASR w porównaniu do rośliny nie transformowanej.
Korzystnie, rośliną lub częścią rośliny, jest roślina wielkiej uprawy wybrana z kukurydzy, pszenicy, rzepaku, słonecznika i groszku, a zwłaszcza kukurydzy.
Z kolei hybrydowa roś lina transgeniczna możliwa jest do uzyskania za pomocą sposobu obejmującego:
a) uzyskanie dwóch roślin transgenicznych zgodnie z wyżej opisanym sposobem oraz
b) krzyżowanie tych roślin.
Natomiast zastosowaniem kwasu nukleinowego kodującego białko ASR, które jest naturalnie wyrażane przez roślinę w odpowiedzi na stres niedoboru wody i którego sekwencja aminokwasów wykazuje co najmniej 50% podobieństwo do SEQ ID nr 2, jest uzyskanie rośliny transgenicznej wykazującej zmodyfikowaną ilość białka ASR, nadającą jej zwiększoną oporność na stres wodny w porównaniu do rośliny nie transformowanej.
Zastosowaniem kwasu nukleinowego kodującego białko ASR, które jest naturalnie wyrażane przez roślinę w odpowiedzi na stres niedoboru wody i którego sekwencja aminokwasów wykazuje co najmniej 50% podobieństwo do SEQ ID nr 2 lub fragmentu tego kwasu nukleinowego, jest użycie go jako sondy lub startera do amplifikacji, w celu selekcji roślin transformowanych, wykazujących lepszą oporność na stres wodny.
Przez „białko ASR” rozumie się białko wyrażane naturalnie przez roślinę w odpowiedzi na stres wodny mające sekwencję aminokwasów identyczną lub homologiczną do SEQ ID nr 2 kukurydzy.
Przez „sekwencję homologiczną” rozumie się korzystnie sekwencję wykazującą co najmniej 50%, a korzystnie 70% podobieństwa do sekwencji SEQ ID nr 2.
W definicji „białko ASR” w znaczeniu wynalazku zawarte są wszystkie białka ASR różnych roślin jak, na przykład, ta z ryżu, jak i białka zmodyfikowane, na przykład przez addycję, delecję, podstawienie (korzystnie konserwatywne) ograniczonej ilości aminokwasów.
W definicji „białka ASR” zawarte są też polipeptydy kodowane przez całą lub część SEQ ID nr 1, nr 3, nr 4 lub nr 5 lub dowolnej sekwencji homologicznej i jest zrozumiałe, że te polipeptydy zachowują właściwość oporności na stres wodny.
Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca białko ASR może być zwłaszcza sekwencją jednego ze zbóż, w szczególności sekwencją kukurydzy.
Ta sekwencja może być korzystnie sekwencją cDNA specyficznego dla stanu stresu wodnego, wyizolowaną wychodząc z linii kukurydzy przez różnicową hybrydyzację. Taka sekwencja prezentowana jest w załączonej liście sekwencji i określona jako SEQ ID nr 1. Można też stosować sekwencję DNA genomowego kodującą białko ASR kukurydzy, takie jak zdefiniowano przez sekwencje SEQ ID nr 3, SEQ ID nr 4 i SEQ ID nr 5 lub sekwencję do nich homologiczną, o ile jest ona wyrażana w ilości zmodyfikowanej w stosunku do ilości zwykle produkowanej przez roślinę nie transformowaną.
W liś cie sekwencji i w załączniku:
SEQ ID nr 3 jest sekwencją DNA genomowego wyizolowanego z linii kukurydzy, który silnie wyraża białko ASR,
SEQ ID nr 4 jest sekwencją DNA genomowego wyizolowaną wychodząc z linii A188 kukurydzy kontrolnej i
SEQ ID nr 5 jest sekwencją DNA genomowego wyizolowaną z linii F2 kukurydzy.
Ta sekwencja może w szczególności kodować sekwencję aminokwasów SEQ ID nr 2 białka ASR kukurydzy albo jej wariant, na przykład wariant mający sekwencję SEQ ID nr 2 z insercją reszty lizyny między aminokwasami 55 i 56 SEQ ID nr 2.
Można też stosować sekwencje nukleotydów kodujące ASR u innych roślin, jak na przykład te, cytowane uprzednio.
Kwas nukleinowy kodujący białko ASR jest wstawiony do konstruktu kwasu nukleinowego zwanego kasetą ekspresyjną i jest połączony w sposób funkcjonalny z tymi elementami pozwalającymi na jego ekspresję i ewentualnie jego regulację.
Wśród tych elementów, można podać promotory, aktywatory i terminatory transkrypcji.
PL 208 102 B1
Można korzystnie stosować promotor konstytutywny, taki jak promotor aktyny ryżu, po którym następuje intron aktyny ryżu (PAR-1AR) zawarty w plazmidzie pAct1-F4 (Mc Elroy i wsp. 1991) lub promotor 35S (Kay i wsp., 1987), lub promotor specyficzny tkankowo. Jako przykład, można podać promotor HMGW pszenicy lub promotor PCRU genu krucyferyny rzodkiewki, przy czym oba pozwalają na ekspresję interesującego białka w ziarnach (Anderson O. D. i wsp. 1989; Depigny-This i wsp., 1992). Można korzystnie stosować sekwencje promotorowe indukujące ekspresję w warunkach wodnych (Kasuga i wsp., 1999). Wśród terminatorów do stosowania w konstruktach według wynalazku można w szczególności podać koniec 3' genu syntetazy nopaliny Agrobacterium tumefaciens (Depicker i wsp., 1982). Można też podać terminator poliA 35S wirusa mozaiki kalafiora (CaMV) opisany w artykule Franck'a i wsp. (1980).
Ekspresja białka ASR może jeszcze być regulowana przez stosowanie sekwencji typu sygnały adresowania peptydowego (chloroplastowe, wakuoli, zatrzymania endoplazmatycznego) lub typu sekwencji intronów, sekwencji enhancerów, sekwencji liderów.
W niniejszym wynalazku interesująca sekwencja może być sekwencją nukleotydów kodującą białko ASR, przy czym ta sekwencja umieszczona jest w orientacji sensownej lub sekwencją nukleotydów blokującą ekspresję białka ASR. Ta sekwencja nukleotydów blokująca ekspresję białka ASR korzystnie jest sekwencją kodującą całe lub część białka ASR, przy czym ta sekwencja jest umieszczona antysensownie. Gdy sekwencja kodująca białko ASR jest umieszczona sensownie, uzyskuje się roślinę transformowaną, która wykazuje przyrost białka ASR w porównaniu z rośliną nie transformowaną. Ta roślina ma przewagę opierania się stresowi wodnemu bardziej skutecznie niż roślina nie transformowana. Gdy sekwencja umieszczona jest antysensownie, uzyskuje się roślinę transformowaną, która wykazuje także modyfikację oporności na stres wodny. Bez wiązania się w jakikolwiek sposób z określonym mechanizmem działania, ta obserwacja mogłaby być wyjaśniona przez aktywację w roślinie alternatywnego szlaku oporności na stres wodny, w odpowiedzi na inhibicję ASR przez antysensy.
Kaseta ekspresyjna wstawiona jest do wektora nukleotydowego, takiego jak plazmid, który poza tym może zawierać gen markera, na przykład gen pozwalający na selekcję rośliny transformowanej od rośliny, która nie zawiera obcego transfekowanego DNA. Jako gen markera, można podać gen zawierający oporność na antybiotyk, na przykład hygromycynę (Herrera-Estrella i wsp., 1983) lub oporność na herbicyd, taki jak sulfonamid asulam (WO 98/49316).
Ten wektor lub dowolna sekwencja kodująca białko ASR, takie jak sekwencje SEQ ID nr 1, SEQ ID nr 3, SEQ ID nr 4 i SEQ ID nr 5 lub sekwencje homologiczne do tych ostatnich mogą być stosowane do transformacji tych komórek roślinnych według technik znanych specjaliście, aby otrzymać rośliny wykazujące zwiększoną oporność na stres wodny.
Według sposobu wykonania wynalazku, komórki roślinne transformuje się wektorem, takim jak uprzednio zdefiniowano, przeniesionym do komórki gospodarza, która może zakazić te komórki roślinne pozwalając na integrację do genomu tych ostatnich interesujących sekwencji nukleotydów, pierwotnie zawartych w genomie wymienionego wektora.
Korzystnie, stosowany gospodarz komórkowy jest szczepem bakterii, takiej jak Agrobacterium tumefaciens, zwłaszcza według sposobu opisanego w artykule An i wsp. (1986) lub też Agrobacterium rhizogenes, zwłaszcza według sposobu opisanego w artykule Guerche i wsp. (1987).
Na przykład, transformacja komórek roślinnych może być przeprowadzona przez przeniesienie regionu T kolistego pozachromosomowego plazmidu markera guzów Ti Agrobacterium tumefaciens, stosując układ binarny (Watson i wsp., 1994). Aby tego dokonać, konstruuje się dwa wektory. W jednym z tych wektorów region T został wyeliminowany za pomocą delecji, z wyjątkiem prawej i lewej granicy, między nie wstawiono gen markera, aby pozwolić na selekcję w komórkach roślin. Drugi partner systemu binarnego jest pomocniczym plazmidem Ti, plazmidem modyfikowanym, który już nie ma regionu T, ale który nadal zawiera geny wirulencji vir, potrzebne do transformacji komórki roślinnej.
Według korzystnego wykonania, można stosować sposób opisany przez Ishida i wsp. (1996) do transformacji jednoliściennych.
Można też podać inne sposoby wykonania sposobu według wynalazku, w szczególności sposoby bezpośredniego przenoszenia genów do komórek roślinnych, takie jak mikroiniekcja bezpośrednia do embroidów rośliny (Neuhaus i wsp., 1987), nasączanie pod próżnią (Bechtold i wsp., 1993) lub elektroporacja (Chupeau i wsp., 1989), lub w końcu strącanie bezpośrednie za pomocą PEG (Schocher i wsp., 1986) albo bombardowanie strzelbą cząsteczkami pokrytymi interesującym DNA plazmidowym (Fromm M. i wsp., 1990).
PL 208 102 B1
Według innego protokołu, transformacje przeprowadza się według sposobu opisanego przez Finer'a i wsp. (1992) stosując strzelbę cząsteczkową z cząsteczkami wolframu lub złota.
Celem wynalazku jest też komórka gospodarza transformowana sekwencjami kwasu nukleinowego opisanymi powyżej, jak i roślina lub część rośliny, w szczególności owoc, nasiono, ziarno, pyłek, liść lub bulwa, podatne na uzyskanie za pomocą jednego ze sposobów podanych powyżej. Może, na przykład, chodzić o rośliny z wielkich upraw (pszenica, rzepak, słonecznik, groszek, soja, jęczmień, a zwłaszcza kukurydza lub warzywa i kwiaty.
Hybrydowe rośliny transgeniczne uzyskane przez krzyżowanie co najmniej jednej rośliny według wynalazku z drugą też stanowią część wynalazku.
Wynalazek dotyczy w szczególności rośliny wykazującej wzrost ekspresji białka ASR w stosunku do rośliny nie transformowanej, na przykład o czynnik 2 lub 3. To zwiększenie ekspresji białka ASR nadaje roślinom zwiększoną oporność na stres wodny.
Oporność na stres wodny roślin transformowanych, według wynalazku, w stosunku do roślin kontrolnych może być doceniona wychodząc z różnych sposobów pomiarów morfologicznych, fizjologicznych i/lub biochemicznych dla szczególnych warunków nawadniania. Jako przykład, miara tolerancji stresu może być przeprowadzona na podstawie obserwacji genotypowej (i) starzenia się liści za pomocą miar morfologicznych i przez oznaczanie chlorofilu w krążkach liści, (ii) protoandrii lub daty kwitnienia roślin męskich i żeńskich, (iii) wzrostu rośliny przez pomiar długości i szerokości końcowej liści lub też (iv) plonu ziarna, wagi tysiąca ziarna, liczby kłosów na roślinę.
Stres, któremu poddane są rośliny, może być oceniony przez pomiar zawartości ABA (metoda Quarrie'go i wsp., 1988) lub przez pomiar potencjału wodnego, albo też ewentualnie przez śledzenie ekspresji białka przez dwukierunkową elektroforezę na podstawie pobrania z liści.
Rośliny uzyskane według wynalazku mogą też być stosowane w doświadczeniach komplementacji alleli, w celu walidacji funkcji wstawionego genu. Wykorzystanie transformantów w doświadczeniach krzyżówek wstecznych może dać wyłącznie gen wstawiony do rodzicielskiego tła genowego, bez innych sekwencji, które mogłyby wpłynąć na fenotyp rekombinanta pod kątem tolerancji suszy.
Korzystnie, łączy się gen wstawiony z genem markera selekcji, który ułatwia krzyżowanie wsteczne i w efekcie śledzenie wstawienia interesującego genu do linii, w której chce się sprawdzać efekt.
Zasada polega na krzyżowaniu transformanta z linią rodzicielską nie posiadającą korzystnego allelu interesującego genu i porównaniu fenotypów linii zrekombinowanej z liniami rodzicielskimi. Można też stosować transformanty zawierające sekwencje genomowe w doświadczeniach z komplementacją. Ten test komplementacji pozwala na sprawdzenie w szczególności, że nadekspresja sensownego cDNA komplementuje efekt allelu słabego (lub zerowego). Tak więc, można, na przykład, sprawdzić, że gen ASRl jest genem odpowiedzialnym za QTL i PQL („Protein Quantitative Loci” - miejsca ilościowych cech białek) znalezione w tej pozycji genetycznej na chromosomie 10 kukurydzy. Ilość tego białka zmienia się między różnymi liniami, ekspresje silniejsze czy też bardziej korzystnych alleli mogą być wykryte i wykorzystane do polepszenia roślin. Detekcja roślin mających korzystne allele może być przeprowadzona przez dawki immunologiczne ze specyficznymi przeciwciałami dla białka ASRl (test ELISA, Western Blot itd.).
W ramy wynalazku wchodzi zastosowanie kwasu nukleinowego zawierają cego ASR lub jego fragment, jako sondy lub startera do amplifikacji typu PCR dla selekcji roślin transformowanych wykazujących lepszą oporność na stres wodny.
Sekwencje kwasów nukleinowych kodujące ASR, takie jak te określone jako SEQ ID nr 1, SEQ ID nr 3, SEQ ID nr 4, SEQ ID nr 5, jak i każdy oligonukleotyd uzyskany wychodząc z jednej z sekwencji mogą w ten sposób być stosowane jako sondy w programach selekcji wspomaganej przez marker, na przykład, aby śledzić introgresję genu kodującego białko ASR kukurydzy do rośliny. W tym celu co najmniej jedna z tych sond znakowana jest, na przykład, izotopem radioaktywnym, a następnie umieszczana w kontakcie z genomowym DNA rośliny uprzednio strawionym enzymami restrykcyjnymi w warunkach pozwalających na specyficzną hybrydyzację sondy znakowanej z omawianym DNA. Inne techniki stosujące, na przykład, PCR mogą być też zastosowane, aby otrzymać genotyp.
Podane w dalszej części figury rysunku i przykłady wykonania ilustrują wynalazek bez ograniczania jego zakresu.
PL 208 102 B1
Opis figur rysunku
Figura 1 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidu pWP 280 niosącego promotor pAktyna intronbamaza-Nos PolyA, fig. 2 przedstawia mapę restrykcyjną wektora pośredniego pBIOS 308 zawierającego sensowny cDNA ZmASRl, fig. 3 przedstawia mapę restrykcyjną wektora pośredniego pBIOS 309 zawierającego antysensowny cDNA ZmASRl, fig. 4 przedstawia wpływ każdego zdarzenia transformacji „antysensownej” lub „sensownej” w stosunku do odpowiedniej kontroli (wrażliwy na Basta) na starzenie się liści, z efektem mierzonym w pierwszym dniu notowania po kwitnieniu, fig. 5 przedstawia kinetykę wpływu dla całości zdarzeń „sensownych” „nietransformowanych” i „antysensownych” i umieszczonych lub nie w warunkach stresu wodnego, na starzenie się liści.
Przykłady
P r z y k ł a d 1. Uzyskanie i klonowanie cDNA ZmAsrl linii kukurydzy, która silnie wyraża białko ASR
a) Warunki hodowli i pobierania roślin, z których izolowano cDNA
Autorzy wynalazku dali cDNA ZmAsrl wychodząc z linii kukurydzy lo (Riccardi i wsp., 1998) lub linii kukurydzy selekcjonowanych według tych samych kryteriów jak lo.
Rośliny kukurydzy kultywowane są w perlicie w warunkach kontrolowanych w komorze hodowli (oświetlenie: 450 mmol m-2 s-1, fotoperiod 16 godzin, temperatura dzień/noc: 25°C/20°C, względna wilgotność 60%) podlana roztworem odżywczym. Gdy rośliny osiągną stadium „5 liści” (wychodzący 5-ty liść) zatrzymuje się podlewanie dla roślin w warunkach stresu wodnego, albo przeprowadza się podlewanie roślin kontrolnych. 10 dni później przechodzi się do pobrania w roślinie otoczonej wieńcem
7-ego liścia.
b) Izolacja cDNA specyficznych dla stanu stresu wodnego przez hybrydyzację różnicową
Bank cDNA przygotowuje się na podstawie mRNA liści roślin zestresowanych i zestawu do klonowania Lambda Zapił cDNA synthesis/Gigapack Goldl (Stratagene, La Jolla, USA), według wskazówek producenta.
mRNA przygotowane wychodząc z liści zestresowanych i roślin kontrolnych transkrybowano do znakowanego radioaktywnie cDNA stosując 100 μφ 32P-dATP i heksanukleotydy służące jako przypadkowe startery (Sambrook i wsp., 1989). cDNA jednoniciowe pochodzące bądź od zestresowanej rośliny lub z rośliny kontrolnej hybrydyzuje się w tej samej proporcji do klonów cDNA banku. Temperatura hybrydyzacji w systemie buforu fosforanowego/SDS/EDTA (Church i Gilbert, 1984) wynosi 68°C i ostatnie płukania przeprowadzono z roztworami zawierającymi 0,1 x SSC 0,05% SDS (masa/objętość).
Klony znakowane odzyskiwano przez wycinanie in vivo fagemidu według protokołu Stratagene stosując E. coli SOLR i fag pomocniczy „Exassist”. DNA tych klonów sekwencjonowano i porównano z bankami sekwencji kwasów nukleinowych (BLAST) według sposobu opisanego przez Altschufa i wsp. (1990). Jedna z tych danych wykazuje silną homologię z Asrl pomidora i jest nazwana ZmAsrl dla Zea mays Asrl.
P r z y k ł a d 2. Sekwencje genomowe ZmASRl
Startery cASRl-lF (5'-TGTCGATCCAATTGTCACTT-3' = SEQ ID nr 6 i CASR1-740R (5'-TGGAGAAACGTAAACAACTA-3') = SEQ nr 7, zdefiniowane z dwóch końców sekwencji cDNA białka ASRl zastosowano do amplifikacji PCR na całkowitym DNA linii kukurydzy. Reakcje PCR przeprowadzano według klasycznych technik.
Produkty PCR analizowano za pomocą technik elektroforezy: jeden prążek 900 bp (par zasad) odzyskiwano, aby wyekstrahować z niego DNA i klonować go według technik klasycznych. Po sprawdzeniu ich wielkości wstawki ekstrahowano i sekwencjonowano.
P r z y k ł a d 3. Konstrukcja genów chimerowych pozwalających na ekspresję konstytutywną białka ASRl lub też antysensu prowadzącego do jego hamowania
W pierwszym etapie przeprowadzono konstrukcję 2 wektorów plazmidowych podstawowych pBIOS 306 i pBIOS 307 zawierających promotor aktyny - intron aktyny (pAct), cDNA genu Asrl odpowiednio w orientacji sensownej i antysensownej i terminator syntazy nopaliny (terNos), który wnosi sygnał poliadenylacji funkcjonalny w wielu gatunkach roślin.
Następnie uzyskano wektory pośrednie przez rekombinację homologiczną z wektorem pSBl Japan Tobacco (EP 672 752) w Agrobacterium tumefaciens szczep LBA 4404 (Hoekema i wsp., 1983).
Dalsze badanie ekspresji genów (genu selekcji i interesującego genu) w kukurydzy oparte jest na naturalnych właściwościach Agrobacterium tumefaciens (Zambrisky i wsp., 1989) i na strategii plazmidu superbinarnego (Hiei i wsp., 1994 i Ishida i wsp., 1996).
PL 208 102 B1
Enzymy restrykcyjne stosowane do klonowania dostarczone są przez New England Biolabs (New England Biolabs, UK). Reakcje enzymatyczne przeprowadzono stosując protokoły opisane przez Sambrook'a i wsp. w podręczniku Molecular cloning (Molecular cloning: A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Habror Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).
a) Konstrukcja podstawowych wektorów plazmidowych do ekspresji konstytutywnej genu Asrl i jego antysensu
Konstrukty molekularne pozwalające na ekspresję genu Asrl w orientacji sensownej i antysensownej w sposób konstytutywny uzyskano jak opisano dalej:
- klonowanie fragmentu I/XhoI o wielkoś ci 795 bp (cDNA Asrl = SEQ ID nr 1) w wektorze pBIOS 298 strawionym EcoRV.
Wektor pBIOS 298 zawiera promotor aktyny - intron aktyny (pAct) (McElroy i wsp. 1991) i terminator Nos. Ten wektor był wygenerowany przez delecję fragmentu Pstl 366 bp (gen Barstar) wektora pWP 280, zawierającego kasetę pAktyna-intron-Barstar-Nos-poliA (fig. 1).
To klonowanie nie zorientowane pozwala na uzyskanie 2 nowych wektorów:
- wektor pBIOS 306 niosą cy gen pAct-ZmAsrl sensowny - terNos,
- wektor pBIOS 307 niosą cy gen pAct-ZmAsrl antysensowny - terNos.
Orientacja cDNA w stosunku do promotora aktyny określona była przez trawienie enzymem restrykcyjnym pojedynczym EagI i podwójne trawienie enzymatyczne Hind III - EcoRV.
b) Konstrukcja wektorów pośrednich do rekombinacji homologicznej z pSB 1 (uzyskanie plazmidów superbinarnych)
Wektory służące do rekombinacji homologicznej w Agrobacterium tumefaciens pochodzą z wektora pBIOS 273.
* Konstrukcja plazmidu pBIOS 273
Podstawowym wektorem do rekombinacji homologicznej jest wektor pBIOS 273. Ten wektor wygenerowano w 2 etapach:
- klonowanie fragmentu BspDl/XhoI (pAct-Bar-terNos) wektora pDM 302 (Cao i wsp., 1992) w miejscach Smal i BspDI wektora pSB12 (Japan Tobacco). Wektor powstały z tego klonowania nazwano pBIOS 272.
- delecja miejsca XhoI w pozycji 3363 wektora pBIOS 272 przez częściowe trawienie XhoI i działanie dużego fragmentu polimerazy I DNA (Klenow). Uzyskany wektor posiadający unikalne miejsce XhoI nazwano pBIOS 273.
* Generacja wektorów pośrednich rekombinacji zawierających cDNA Asrl sensowny i antysensowny
Te konstrukty wygenerowano wychodząc z wektora pBIOS 274, pochodnej wektora pBIOS 273 przez klonowanie fragmentu (ProA9-Bamaza-terCaMY) XhoI wektora pWP 128 (Paul i wsp., 1992) w wektorze pBIOS 273 trawionym XhoI.
Wektory pośrednie pBIOS 308 i pBIOS 309 uzyskano przez klonowanie fragmentów SalI/XhoI o wielkoś ci 2970 bp wektorów pBIOS 306 i pBIOS 307 w miejscach BspDl/XhoI wektora pBIOS 274.
Klonowania te pozwalają na podstawienie genu pA9-Bamaza-terCaMY wektora pBIOS 274 przez gen pAct-ZmAsrl sensowny terNos dając wektor zwany pBIOS 308 (fig. 2) lub przez gen pAct-ZmAsrl antysensowny terNos dając wektor zwany pBIOS 309 (fig. 3).
c) Konstrukcja wektorów superbinarnych do transformacji dla ekspresji genu Asrl i jego antysensów w Agrobacterium tumefaciens i w roślinach kukurydzy * Konstrukcja wektorów superbinarnych
Wektory stosowane do transformacji kukurydzy pochodzą z rekombinacji homologicznej plazmidów pBIOS 308 i pBIOS 309 z wektorem pSBl (EP 672 752). Wektor pSBl zawiera geny virB i virG plazmidu Ti pTiBo542 obecnego w szczepie Agrobacterium tumefaciens A281 (ATCC 37349), gen oporności na tetracyklinę, miejsce replikacji funkcjonujące w E. coli i Agrobacterium i region homologiczny spotykany w wektorach pBIOS 308 i pBIOS 309. Obecność tego regionu homologicznego w plazmidzie biorcy (pSBl) i plazmidach po ś rednich (Bios 308 i pBlOS 309) jest podstawą zjawiska rekombinacji homologicznej.
Wektory pośrednie pBlOS 308 i pBIOS 309 wprowadzono do komórek Agrobacterium tumefaciens zawierających wektor pSBl za pomocą elektroporacji stosując GIBCO BRL CELL PORATOR Voltage Booster według sposobu opisanego przez Mattanovitch'a i wsp. (1989) i protokołu podanego przez dostawcę (Life Technologies, USA).
PL 208 102 B1
Agrobakterie zawierające wektory superbinarne selekcjonowano na podłożu YT CaCl2 w obecności rifampicyny i spektynomycyny w stężeniu 50 mg/l. Gen oporności na spektynomycynę niesiony przez plazmidy pBIOS 308 i Bios 309 (miejsce początku replikacji w E. coli) będzie mógł dopiero być wyrażany po rekombinacji homologicznej z wektorem pSBl (miejsce początku replikacji funkcjonalne w Agrobacterium i E. coli).
Plazmidy superbinarne uzyskane po rekombinacji nazwano pRec 308 (pBIOS 308 X pSB1) i pRec 309 (pBIOS 309 x pSB1). Posiadają miejsca startu replikacji funkcjonalne zarazem w E. coli i Agrobacterium tumefaciens, geny opornoś ci na tetracyklinę i spektynomycynę, T-DNA, w którym się znajdują kasety ekspresyjne genów Bar i Asrl (cDNA sensowny i antysensowny) i geny wimlencji virB i virG plazmidu pTiBo542.
* Charakterystyka wektorów superbinarnych pRec 308 i pRec 309
Te plazmidy superbinarne pRec 308 (gen Asrl w orientacji sensownej) oraz pRec 309 (gen Asrl w orientacji antysensownej) scharakteryzowano za pomocą restrykcji enzymatycznej SalI. Nastę pnie przeprowadzono analizę typu Southern fragmentów restrykcyjnych SalI za pomocą sondy Bar i sondy geny Asrl (ta sonda odpowiada fragmentowi EcoRI/XhoI 795 bp wektora pHHU516 czyli całkowitemu cDNA). Uzyskano oczekiwane profile.
P r z y k ł a d 4. Transformacja roślin kukurydzy
Transformację roślin kukurydzy przeprowadzono według protokołu Ishida i wsp. (1996).
Transformacja zaczyna się od ko-kultury, w której niedojrzałe zarodki roślin kukurydzy (wielkość w zakresie 1 do 1,2 mm) umieszcza się w kontakcie przez 5 minut z Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 zawierającym wektory superbinarne pRec 308 lub pRec 309. Zarodki następnie umieszcza się na podłożu LSAs na 3 dni w ciemności, w temperaturze 25°C.
Następny etap to etap pierwszej selekcji transformowanych kalusów: „kalusy zarodki” przenosi się na podłoże LSD 5 zawierające fosfmotricynę 5 mg/ml i cefatoksym 250 mg/l (eliminacja Agrobacterium tumefaciens). Ten etap prowadzi się przez 2 tygodnie w ciemności i w temperaturze 25°C.
Drugi etap selekcji przeprowadzano przez przeniesienie zarodków, które rozwinęły się na podłożu LSD 5, na podłoże LSD 10 (fosfmotricyna 10 mg/l) w obecności cefatoksymu przez 3 tygodnie w tych samych warunkach, jak w pierwszej selekcji (25°C, ciemność).
Trzeci etap selekcji polega na wycięciu kalusów typu 1 (fragmenty 1 do 2 mm) i przeniesieniu ich na 3 tygodnie w ciemności i w temperaturze 25°C na podłoże LSD 10 w obecności cefatoksymu.
Regeneracja roślinek jest następnie przeprowadzana przez wycięcie kalusów typu I, które namnożyły się przez przeniesienie ich na podłoże LSZ w obecności fosfmotricyny w stężeniu 5 mg/l i cefatoksymu przez dwa tygodnie w 22°C pod ciągłym ś wiatłem. Zregenerowane roślinki przenosi się na podłoże do ukorzenienia (Ishida i wsp., 1996) na dwa tygodnie w 22°C i pod ciągłym oświetleniem dla etapu rozwoju.
Uzyskane roślinki następnie przenoszono do fitotronu pod kątem ich aklimatyzacji.
P r z y k ł a d 5. Wykazanie ekspresji białka ZmASRl w transformowanych roślinach
Białka z próbek liści pochodzących z roślin transformowanych ekstrahowano według metody Dameryal'a i wsp. (1986), a następnie analizowano je za pomocą elektroforezy dwukierunkowej według protokołu Riccardi'ego i wsp. (1998).
Elektroforeza dwukierunkowa polega na rozdziale polipeptydów na podstawie ich punktu izoelektrycznego i pod kątem ich masy cząsteczkowej (elektroforeza w obecności SDS). Przed elektroforezą białka są ekstrahowane i utrzymywane w warunkach zdenaturowanych: wyeliminowana jest struktura czwartorzędowa. Różne polipeptydy tworzące białka oligomeryczne migrują niezależnie w czasie dwóch elektroforez. Następnie żele barwi się azotanem srebra. Tak uzyskany żel dwukierunkowy następnie porównuje się z tym, uzyskanym wychodząc z białek z liści roślin A188 nie transformowanych.
Uzyskane wyniki dla roślin transformowanych sekwencją kodującą umieszczoną „sensownie” wykazują na podstawie prostej obserwacji dwóch żeli bardziej intensywną ekspresję białka ASRl u transformowanych roślin w stosunku do roś lin kontrolnych A188. Plama ASR obserwowana u roś lin transformowanych konstruktem antysensownym wydaje się być nadal wykrywalna, ale ze słabszą intensywnością co wykazuje, że transformanty „antysensowne” wyrażają mniej białka niż rośliny kontrolne. Ta analiza białkowa wykazuje więc ekspresję białka ASRl w roślinach transformowanych w ilości zmodyfikowanej w stosunku do roślin nie transformowanych.
PL 208 102 B1
P r z y k ł a d 6. Pomiar tolerancji na stres wodny roślin transgenicznych uzyskanych według wynalazku
Oporność na stres wodny roślin transformowanych według wynalazku w stosunku do roślin kontrolnych może być zauważona na podstawie różnych metod analizy fenotypowej, fizjologicznej i/lub biochemicznej dla danych warunków nawadniania i warunków normalnych (hodowla tradycyjna z podlewaniem) i warunków stresu wodnego.
Jako przykład, warunki nawadniające w polu mogą być następujące:
- normalne nawadnianie w części nawadnianej na zasadzie 5 mm dziennie pilotowane przez tensometry umieszczone na głębokości 30, 50, 70 cm,
- ograniczone nawadnianie, bez podawania wody jeś li jest to moż liwe, aż do 10 dni po kwitnię ciu. W tej przybliżonej dacie decyduje się na podanie wody jeśli uzna się stres jako zbyt intensywny, rytm podawania nie może przekroczyć 3 mm dziennie.
Zapisuje się dane meteorologiczne i warunki nawadniania.
Zapisy czynione w różnych okresach kwitnięcia i zbioru polegają na zapisywaniu:
a) Miary tolerancji na stres przez obserwacje fenotypowe
Analizy genetyczne przeprowadzone uprzednio sugerowały, potencjalną rolę ASRl w starzeniu się liści i protoandrii (rozdział czasowy między kwitnięciem męskim i żeńskim) w warunkach suszy. Te cechy bada się więc preferencyjnie.
Starość liści może być badana przez pomiary morfologiczne, które polegają na liczeniu liczby liści wysuszonych i zielonych w 4 datach oddzielonych o 15 dni poczynając od daty kwitnięcia lub różnych stadiów rozwoju. W czasie bardzo różnych zachowań obserwowanych pod względem zwinięcia i barwy liści przeprowadza się pomiar na skali od 0 do 5 (od najbardziej do najsłabiej tolerującej stres).
Starzenie może też być mierzone przez dawkę chlorofilu w pobranych krążkach liści z kłosów przy kwitnięciu. Protoandria lub rozfazowanie między datami kwitnięcia roślin męskich (obecność pyłku) i żeńskich (wyjście kitek) mierzona jest jak następuje: oddzielnie zapisuje się daty pojawienia kitek i pyłku dla każdej roś liny, a dynamizm rejestruje się przez krzywą procentu roślin, które zakwitły w funkcji czasu.
Poza tym przeprowadza się różne pomiary zbioru dla oceny efektu tolerancji na stres na produkcję ziarna, a mianowicie procent zapłodnienia (stosunek liczby ziaren na kłos/liczba komórek jajowych do zapłodnienia), liczba rzędów na kłos, liczba ziaren na rząd, wilgotność ziaren, waga 1000 ziaren i liczba roślin ulegających fuzji.
Zastosowanie nie niszczącego testu identyfikacji stosującego basta pozwala na łatwe rozróżnienie każdych potomnych transgenicznych roślin, które są oporne na basta od roślin wrażliwych, rośliny oporne niosą gen Asr genetycznie sprzężony z markerem selekcji z wyjątkiem zjawiska rekombinacji. Ten test polega na potarciu końca liścia roztworem basta i obserwacji powstałego fenotypu bez narażania żywotności całej rośliny: koniec liścia podlega nekrozie i wysycha, gdy roślina jest wrażliwa lub pozostaje zielony, jeśli roślina jest oporna. Pozwala to na obserwację pomiaru tolerancji na stres, czy transgen ASr dodatnio wpływa na odpowiedź na stres w zależności od ekspresji genu w orientacji sensownej czy antysensownej.
b) Ocena stresu, któremu poddane są rośliny
Przeprowadza się pobrania z liści, aby zmierzyć zawartość ABA (metoda Quarrie'go i wsp. 1988), w danym przypadku, ekspresji białka za pomocą dwukierunkowej elektroforezy.
Stres, któremu poddane są rośliny może być oceniony przez pomiar potencjału podstawowego wodnego za pomocą przenośnej komory ciśnień na tych nie transformowanych roślinach w warunkach kontrolnych i warunkach stresu wodnego. Można też przeprowadzić pomiar względnej zawartości wody w liściach.
Starzenie się liści, które pozwala na zmniejszenie powierzchni parowania i remobilizację metabolitów w kierunku reszty rośliny mierzone było tak, jak opisano powyżej, na dorosłych roślinach po kwitnięciu przez liczenie liczby liści, które miały co najmniej 50% powierzchni suchej.
Obserwuje się znaczący wpływ ekspresji białka ASR na udział liści suchych. W efekcie, w stosunku do swoich własnych kontroli, zdarzenia „sensowne” wykazują, w danym momencie, większy udział liści suchych niż zdarzenia „antysensowne” (fig. 4). Tak samo w warunkach stresu wodnego, pomiar kinetyki starzenia się liści wykazuje, że zdarzenia „sensowne” starzeją się szybciej niż „nie transformowane” i że zdarzenia „antysensowne” starzeją się wolniej niż „nie transformowane” (fig. 5).
Przez zdarzenia „sensowne” rozumie się zdarzenie wynikające z etapu wstępnego transformacji kasetą ekspresyjną zawierającą sekwencję ASR umieszczoną sensownie. Przez zdarzenie „antysen10
PL 208 102 B1 sowne” rozumie się zdarzenie wynikające ze wstępnego etapu transformacji kasetą zawierającą sekwencję ASR umieszczoną antysensownie.
Zdarzenia „sensowne”, które starzeją się szybciej niż „nie transformowane” w warunkach stresu wodnego wykazują więc korzyść selekcyjną tolerancji na stres wodny, w szczególności dla przypadku stresu długotrwałego (zmniejszenie powierzchni parowania i remobilizacja metabolitów w kierunku reszty rośliny).
Zdarzenia „antysensowne”, które starzeją się wolniej niż „nie transformowane” w warunkach stresu wodnego także są interesujące, w szczególności w razie krótkotrwałego stresu wodnego. W efekcie, te rośliny zachowają większą powierzchnię parowania i skorzystają bardziej z następnego dostarczenia wody (deszcz lub podlewanie).
Z drugiej strony, pomiar stresu znoszonego przez rośliny (zawartość ABA w liś ciach) wykazał stres lekki, ale wysoce znaczący: odpowiednio 616 i 512 ng ABA/g suchej masy u roślin zestresowanych i kontrolnych, czyli zwiększenie o około 100 ng ABA na gram suchej substancji u roślin zestresowanych. Ta odpowiedź jest taka sama dla zdarzeń „sensownych” i „antysensownych”, jak i dla roślin nie transformowanych. Transformacja nie wydaje się więc mieć wpływu na akumulację ABA w liściach.
Te wyniki potwierdzają więc, że w obecności stresu wodnego lekkiego i słabej ekspresji ASR u roś lin transformowanych już obserwuje się znaczą ce róż nice.
Ponadto, efekt tolerancji na stres wodny na produkcję ziaren został zmierzony w stosunku do wydajności ziarna, masy tysiąca ziaren i liczby kłosów na roślinę. Uzyskane wyniki ze słabym stresem wodnym wykazują, że pomiar wydajności ziaren porównywalnych między roślinami transformowanymi („sensowne” i „antysensowne”) i roślinami nie transformowanymi, zmierzono w warunkach stresu lub w warunkach normalnych.
Z jednej strony transformacja i z drugiej strony tolerancja stresu wodnego nie wydają się więc wpływać na wydajność ziarna u roślin.
Przeprowadzono także pomiary wzrostu roślin. Długości 3 liści poniżej kłosa mierzono na roślinach „sensownych” i „antysensownych” po kwitnięciu przy nieobecności stresu wodnego. Zaobserwowano wysoce znaczące różnice dla 3 liści.
dla liści:
| F0 | antysensowny = sensowny = | 78,41 cm 76,11 cm | (p < 0,01) |
| F1 | antysensowny = sensowny = | 77,96 cm 75,76 cm | (p < 0,01) |
| F2 | antysensowny = sensowny = | 75,04 cm 72,94 cm | (p < 0,01) |
Globalnie obserwuje się więc znaczącą różnicę 2 cm długości dla 3 liści, liście roślin „sensownych” są mniejsze niż „antysensownych”. To zmniejszenie wzrostu liści obserwowane u zdarzeń „sensownych”: koreluje więc z większym starzeniem, dwa zjawiska dają w efekcie zmniejszoną powierzchnię parowania, co pozwala roślinie na lepszą tolerancję stresu wodnego.
Bibliografia:
- An et al., (1986), Plant Physiol. 81: 86-91
- Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403-410
- Anderson O. D. et al., (1989),T.A.G., 77: 689-700
- Bechtold et al., (1993), Comptes Rendus Academie des Sciences Paris Serie 3, 316: 1194-1199
- Canel C. et al., (1995), Plant Physiol. 108 (1995), 1323-1325
- Chupeau et al., (1989), Biotechnology, 7 (5): 503-508
- Church et Gilbert, (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1991-1995
- Damerval et al., Electrophoresis 7: 52-54, 1986
- Depicker et al., (1982), J. Mol. Appl. Genet, 1, 561-573
- Depigny-This et al., (1992), Plant Mol. Biol., 20: 467-479
- De Vienne et al., (1999), Journal of Experimental Botany, 50 (332): 303-309
- Finer et al., (1992), Plant Cell Report, 11: 323-328
- Franek et al., (1980), Cell, 21: 285-294
- Fromm M. et al., (1990), Biotechnology, 8: 833-839
- Guerche et al., (1987), Mol. Gen. Genet., 206: 382
- Herrera-Estrella et al., (1983), EMBO J. 2, 987-995
PL 208 102 B1
- Hiei et al., (1994), The Plant Journal, 6, 271-282 - Hoekema et al., (1983), Nature, 303, 179-180 - lusem et al., (1993), Plant Physiol., 102: 1353-1354 - Ishida et al., (1996), Nature Biotechnology 14: 754-750 - Kasuga et al., (1999), Nature Biotechnologie, 17: 287-291 - Kay et al., (1987), Science, 236: 4805
- Mattanovitch et al., (1989), Nucleic Acids Research, 17 (16): 6747 - Mc Elroy et al., (1991), Molecular and General Genetics, 231 (1), 150-160 - Neuhaus et al., (1987), Theoretical and Applied Genet., 75 (1): 30-36
- Quarrie et al., (1988), Planta 173: 330-339
- Riccardi et al., (1998), Plant Physiol., 117: 1253-1263
- Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning, A laboratory manual, 2nd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press
- Schocher et al., (1986), Biotechnology 4: 1093-1096 - Silhavy D. et al., (1995), Plant. Mol. Biol. 27 (1995), 587-595 - Thomas et al., (1999), Plant Science 140, 21-30
- Watson et al., (1994), ADN Recombinant, Ed. De Boeck Universite, 273-292 - Zambryski et al., (1989) Cell, 56, 193-201 - Zeewart et Creelman (1988), Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 39: 439-473
PL 208 102 B1
PL 208 102 B1
Lys Asp His Lys Asp Ala Glu Glu Ala Gly Gly Glu Lys Lys His His 125 130 135 ttc etc ggc tgattgatcc ctcccgtatc gtcgtccctc cccgcgtgct 544
Phe Phe Gly
140
| acgcgtgcgt | gtgcgagagt | gatategage | gcccgccgtg | ttgtgcgcgc | gtacgtatgt | 604 |
| atgcgctcgt | gtgatgcacg | aataagcgtg | gctacgtaat | ctatcgtatg | tatacgtgtg | 664 |
| tgtatgcatg | tgcttgtgta | tgatcgtggt | acgaggaccg | aaaaaatgta | tgcaactctg | 724 |
| atttacttac | atgtttagtt | gtttacgttt | ctccaaaaaa | aaa | 777 |
<210> 2 <211> 140 <212> PRT <213> Zea mays <400> 2
| Met 1 | Ala | Glu | Glu | Lys 5 | His | His | His | His | His 10 | Leu | Phe | His | His | Lys 15 | Lys |
| Asp | Glu | Glu | Gin | Glu | Glu | Gin | Leu | Ala | Gly | Gly | Gly | Tyr | Gly | Glu | Ser |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Ala | Glu | Tyr | Thr | Glu | Ala | Thr | Val | Thr | Glu | Val | Val | Ser | Thr | Gly | Glu |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Asn | Glu | Tyr | Asp | Glu | Tyr | Lys | Glu | Glu | Lys | Gin | His | Lys | His | Lys | Gin |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| His | Leu | Gly | Glu | Ala | Gly | Al 3 | Ile | Ala | Ala | Gly | Ala | Phe | Ala | Leu | Tyr |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Glu | Lys | His | Glu | Ala | Lys | Lys | Asp | Pro | Glu | His | Ala | His | Arg | His | Lys |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Ile | Glu | Glu | Glu | Val | Ala | Ala | Ala | Ala | Ala | Val | Gly | Ser | Gly | Gly | Phe |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Ala | Phe | His | Glu | His | His | Glu | Lys | Lys | Lys | Asp | His | Lys | Asp | Ala | Glu |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Glu | Ala | Gly | Gly | Glu | Lys | Lys | His | His | Phe | Phe | Gly | ||||
| 130 | 13 5 | 140 |
<210> 3 <211> Θ92 <212> DNA <213> Zea mays <400> 3 tgtcgatcca attgtcactt gctctccctc caacaagcta actaaggccg gtcgtcatcc 60 ctcttctagc tcgttttatt atccatggcg gaggagaagc accaccacca ccacctgttc 120 caccataaga aggacgagga gcaggaggag cagctcgccg gcggcgggta cggcgagtcc 130 gccgagtaca cggaggccac gctgacggag gtggtgtcca cgggcgagaa cgagcacgac 240
PL 208 102 B1 gagtacaagg aggagaagca gcataagcac aagcagcacc tcggcgaggc cggcgccatc 300 gccgccggcg ccttcgcact cgtacgtagt cctccgatcg atccgatcct ccttgagtag 360 tatatacata catgaacgcg ataacgaata atatattaat cgaacgaact gaatgatgat 420 cacggatcac ctcgtgtgac gtggacatgc acagtacgag aagcacgagg caaagaagga 480 cccggagcac gcgcaccgcc acaagatcga ggaggaggtc gcggcggcgg cggccgtcgg 540 ctccggcggc ttcgccttcc acgagcacca cgagaagaag aaggaccaca aggacgccga 600 ggaggccggc ggcgagaaga agcaccactt cttcggctga ttgatccctc ccgtatcgtc 660 gtccctcccc gtgtgctacg cgtgcgtgtg tgagagtgat atcgagcgcc cgccgtgttg 720 tgcgcgcgta cgtatgtatg cgctcgtgtg atgcacgaat aagcgtggct acgtaatcta 780 tcgtatgtat acgtgtgtgt atgcatgtgc ttgtgtatga tcgtggtacg aggaccgaaa 840 aaatgtatgc aactctgatt tacttacatg tttagttgtt tacgtttctc ca 892 <210> 4 <211> 890 <212> DNA <213> Zea mays <400> 4 tgtcgatcca attgtcactt gctctccctc caacaagcta attaaggccg gtcatccctc 60 ttctagctcg tttcattatc catggcggag gagaagcacc accaccacca cctgttccac 120 cacaagaagg acgaggagca ggaggagcag ctcgccggcg gcgggtacgg cgagtccgcc 180 gagtacacgg aggccacggt gacggaggtg gtgtccacgg gcgagaacga gtacgacgag 240 tacaagaagg aggagaagca gcacaagcac aagcagcacc tcggcgaggc cggcgccatc 300 gccgccggcg ccttcgcacc cgtacgtagt cctccgatcg atccgatcct ccttgagtag 360 tatatacata catgaacgcg ataacgaata atatattaat cgaacgaact gaatgatgat 420 cacggatcac ctcgtgtgac gtggacatgc acagtacgag aagcacgagg caaagaagga 480 cccggagcac gcgcaccgcc acaagatcga ggaggaggtc gcggcggcgg cggccgtcgg 540 ctccggcggc ttcgccttcc acgagcacca cgagaagaag aaggaccaca aggacgccga 600 ggaggccggc ggcgagaaga agcaccactt cttcggctga ttgatccctc ccgtatcgtc 660 gtccctcccc gtgtactacg cgtgcgtgtg tgagagtgat atcgagcgcc cgccgtgttg 720 tgcgcgcgta cgtatgtatg cgctcgtgtg atgcacgaat aagcgtggct acgtaatcta 780 tcgtatgtat acgtgtgtgt atgcatgtgc ttgtgtatga tcgtggtacg aggaccgaaa 840 aaatgtatgc aactctgatt tacttacatg tttagttgtt tacgtttctc 890 <210> 5 <211> 814 <212> DNA <213> Zea mays <400> 5 gctaattaag gccggtcgtc atccctcttc tagctcgttt tattatccat ggcggaggag 60 aagcaccacc accaccacct gttccaccat aagaaggacg aggagcagga ggagcagctc 120 gccggcggcg ggtacggcga gtccgccgag tacacggagg ccacggtgac ggaggtggtg 180 tccacgggcg agaacgagta cgacgagtac aagaaggagg agaagcagca caagcacaag 240 cagcacctcg gcgaggccgg cgccatcgcc gccggcgcct tcgcactcgt acgtagtcct 300 ccgatcgatc cgatcctcct tgagtagtat atacatacat gaacgcgata acgaataata 360 tattaatcga acgaactgaa tgatgatcac ggatcacctc gtgtgacgtg gacatgcaca 420 gtacgagaag cacgaggcaa agaaggaccc ggagcacgcg caccgccaca agatcgagga 480 ggaggtcgcg gcggcggcgg ccgtcggctc cggcggcttc gccttccacg agcaccacga 540 gaagaagaag gaccacaagg acgccgagga ggccggcggc gagaagaagc accacttctt 600 cggctgattg atcctcccgt atcgtcgtcc ctccccgtgt gctacgcgtg cgtgtgtgag 660 actgatatcg agcgcccgcc gtgttgtgcg cgcgtacgta tgtatgcgct cgtgtgatgc 720 acgaataagc gtggctacgt aatctatcgt atgtatacgt gtgtgtatgc atgtgcttgt 780 gtatgatcgt ggnacgagga ccgaaaaaat gtat 614 <210> 6 <211> 20 c212> DNA
PL 208 102 B1 <213> Zea mays <400> 6 tgtcgatcca attgtcactt <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Zea mays <400> 7 tggagaaacg taaacaacta
Claims (12)
1. Sposób otrzymywania roślin wykazujących zwię kszoną odporność na stres wodny i zmodyfikowaną ilość białka ASR, nadającą jej lepszą oporność na stres wodny w porównaniu do rośliny nie transformowanej, znamienny tym, że obejmuje etapy polegające na:
- transformacji co najmniej jednej komórki rośliny wektorem posiadającym kasetę ekspresyjną zawierającą sekwencję nukleotydów kodującą białko ASR, które jest naturalnie wyrażane przez roślinę w odpowiedzi na stres niedoboru wody i którego sekwencja aminokwasów wykazuje co najmniej 50% podobieństwa do SEQ ID nr 2, przy czym ta sekwencja nukleotydów jest wstawiona w orientacji sensownej,
- hodowli tak transformowanej komórki, aby wygenerować roślinę zawierającą tę kasetę ekspresyjną w swoim genomie.
2. Sposób wedł ug zastrz. 1, znamienny tym, ż e wymienione białko ASR pochodzi od zboż a, takiego jak kukurydza.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, ż e wymienione białko ASR zawiera sekwencję SEQ ID nr 2.
4. Sposób według zastrz. 1 albo zastrz. 2, albo zastrz. 3, znamienny tym, że kaseta ekspresyjna zawiera promotor pozwalający na ekspresję konstytutywną sekwencji kodującej ASR, na przykład promotor aktyny - intron.
5. Sposób według zastrz. 1 albo zastrz. 2, albo zastrz. 3, znamienny tym, że kaseta ekspresyjna zawiera promotor, który indukuje ekspresję sekwencji kodującej ASR w warunkach stresu niedoboru wody.
6. Sposób według zastrz. 1 albo zastrz. 2, albo zastrz. 3, albo zastrz. 4, albo zastrz. 5, znamienny tym, że kaseta ekspresyjna zawiera sekwencję wybraną z sekwencji SEQ ID nr 1, nr 3, nr 4 i nr 5.
7. Roś lina lub część rośliny, możliwa do uzyskania za pomocą sposobu według któregokolwiek z zastrz. 1 do 6.
8. Roś lina lub część rośliny, według zastrz. 7, wykazująca wzrost ekspresji białka ASR w porównaniu do rośliny nie transformowanej.
9. Roślina lub część rośliny, według zastrz. 7 albo 8, znamienna tym, że jest nią roślina wielkiej uprawy wybrana z kukurydzy, pszenicy, rzepaku, słonecznika i groszku, a zwłaszcza kukurydzy.
10. Hybrydowa roślina transgeniczna możliwa do uzyskania za pomocą sposobu obejmującego: a) uzyskanie dwóch roś lin transgenicznych zgodnie ze sposobem wedł ug któregokolwiek z zastrz. 1 do 6 oraz b) krzyżowanie tych roślin.
11. Zastosowanie kwasu nukleinowego kodującego białko ASR, które jest naturalnie wyrażane przez roślinę w odpowiedzi na stres niedoboru wody i którego sekwencja aminokwasów wykazuje co najmniej 50% podobieństwo do SEQ ID nr 2, do uzyskania rośliny transgenicznej wykazującej zmodyfikowaną ilość białka ASR, nadającą jej zwiększoną oporność na stres wodny w porównaniu do rośliny nie transformowanej.
PL 208 102 B1
12. Zastosowanie kwasu nukleinowego kodującego białko ASR, które jest naturalnie wyrażane przez roślinę w odpowiedzi na stres niedoboru wody i którego sekwencja aminokwasów wykazuje co najmniej 50% podobieństwo do SEQ ID nr 2 lub fragmentu tego kwasu nukleinowego, jako sondy lub startera do amplifikacji, w celu selekcji roślin transformowanych według jednego z zastrz. 7 do 10, wykazujących lepszą oporność na stres wodny.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0005534A FR2808285B1 (fr) | 2000-04-28 | 2000-04-28 | Procede d'obtention de plantes presentant une resistance accrue a un stress hydrique |
| PCT/FR2001/001252 WO2001083756A1 (fr) | 2000-04-28 | 2001-04-24 | Procede d'obtention de plantes presentant une resistance accrue a un stress hydrique |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL358386A1 PL358386A1 (pl) | 2004-08-09 |
| PL208102B1 true PL208102B1 (pl) | 2011-03-31 |
Family
ID=8849761
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL358386A PL208102B1 (pl) | 2000-04-28 | 2001-04-24 | Sposób otrzymywania roślin wykazujących zwiększoną oporność na stres wodny, roślina możliwa do uzyskania za pomocą tego sposobu, hybrydowa roślina transgeniczna, oraz zastosowanie kwasu nukleinowego kodującego białko ASR |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7154025B2 (pl) |
| EP (1) | EP1276870B1 (pl) |
| AT (1) | ATE364082T1 (pl) |
| AU (1) | AU785416B2 (pl) |
| CA (1) | CA2407240C (pl) |
| CZ (1) | CZ20023569A3 (pl) |
| DE (1) | DE60128796T2 (pl) |
| ES (1) | ES2284642T3 (pl) |
| FR (1) | FR2808285B1 (pl) |
| HU (1) | HUP0300654A3 (pl) |
| PL (1) | PL208102B1 (pl) |
| WO (1) | WO2001083756A1 (pl) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AUPR482101A0 (en) * | 2001-05-07 | 2001-05-31 | Agresearch Limited | Abiotic stress protection |
| MX2009011716A (es) | 2007-05-03 | 2009-12-11 | Basf Plant Science Gmbh | Plantas con rasgos mejorados relacionados con el rendimiento y un metodo para producirlas. |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5633440A (en) * | 1994-12-20 | 1997-05-27 | Dna Plant Technology Corporation | P119 promoters and their uses |
| EP0874897A4 (en) * | 1995-10-12 | 2001-09-19 | Cornell Res Foundation Inc | PRODUCTION OF TRANSGENIC CEREALS WITH TOLERANCE AGAINST WATER OR SALT STRESS |
-
2000
- 2000-04-28 FR FR0005534A patent/FR2808285B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-04-24 CA CA2407240A patent/CA2407240C/fr not_active Expired - Fee Related
- 2001-04-24 AT AT01929693T patent/ATE364082T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-04-24 PL PL358386A patent/PL208102B1/pl unknown
- 2001-04-24 HU HU0300654A patent/HUP0300654A3/hu unknown
- 2001-04-24 EP EP01929693A patent/EP1276870B1/fr not_active Revoked
- 2001-04-24 DE DE60128796T patent/DE60128796T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-04-24 AU AU56398/01A patent/AU785416B2/en not_active Ceased
- 2001-04-24 ES ES01929693T patent/ES2284642T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-04-24 WO PCT/FR2001/001252 patent/WO2001083756A1/fr active IP Right Grant
- 2001-04-24 US US10/258,521 patent/US7154025B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-04-24 CZ CZ20023569A patent/CZ20023569A3/cs unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20040139505A1 (en) | 2004-07-15 |
| DE60128796D1 (de) | 2007-07-19 |
| US7154025B2 (en) | 2006-12-26 |
| PL358386A1 (pl) | 2004-08-09 |
| ES2284642T3 (es) | 2007-11-16 |
| AU785416B2 (en) | 2007-05-03 |
| CA2407240C (fr) | 2012-08-28 |
| HUP0300654A2 (hu) | 2003-07-28 |
| ATE364082T1 (de) | 2007-06-15 |
| HUP0300654A3 (en) | 2004-10-28 |
| EP1276870B1 (fr) | 2007-06-06 |
| CA2407240A1 (fr) | 2001-11-08 |
| WO2001083756A1 (fr) | 2001-11-08 |
| DE60128796T2 (de) | 2008-02-07 |
| FR2808285A1 (fr) | 2001-11-02 |
| AU5639801A (en) | 2001-11-12 |
| EP1276870A1 (fr) | 2003-01-22 |
| CZ20023569A3 (cs) | 2003-06-18 |
| FR2808285B1 (fr) | 2004-10-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2005251653B2 (en) | The shine clade of transcription factors and their use | |
| ES2485384T3 (es) | Plantas que tienen rasgos potenciados relacionados con el rendimiento y/o mayor resistencia al estrés abiótico y un procedimiento para fabricar las mismas | |
| US9074006B2 (en) | Use of HUB1 polynucleotides for improving growth characteristics in plants | |
| US20110041210A1 (en) | Plants Having Enhanced Yield-Related Traits and a Method for Making the Same | |
| MX2011002028A (es) | Plantas que tienen rasgos relacionados con rendimiento mejoradas y un metodo para producirlas. | |
| MX2011006178A (es) | Plantas que tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento y/o mejor tolerancia al estres abiotico y un metodo para producirlas. | |
| US8026413B2 (en) | EMP4 gene | |
| CN105063063A (zh) | 具有增强的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法 | |
| US20100138962A1 (en) | Use of plant chromatin remodeling genes for modulating plant architecture and growth | |
| ES2451669T3 (es) | Plantas que tienen características mejoradas y un procedimiento de fabricación de las mismas | |
| AU2004243601B2 (en) | Transgenic monocotyledonous plants overexpressing a NHX protein and having improved growth charcteristics and a method for making the same | |
| PL208102B1 (pl) | Sposób otrzymywania roślin wykazujących zwiększoną oporność na stres wodny, roślina możliwa do uzyskania za pomocą tego sposobu, hybrydowa roślina transgeniczna, oraz zastosowanie kwasu nukleinowego kodującego białko ASR | |
| CA2272241A1 (en) | Agl15 sequences in transgenic plants | |
| CA2425794C (en) | Nucleic acid molecules associated with plant cell proliferation and growth and uses thereof |