DE69533794T2

DE69533794T2 - Für eine cinnamoyl-coa-reduktase kodierende dna-sequenzen, und ihre verwendung in regulation des lignin-gehalts von pflanzen

Info

Publication number: DE69533794T2
Application number: DE69533794T
Authority: DE
Inventors: Alain Boudet; Jacqueline Pettenati; Deborah Goffner; Michel Romestant; Jean-Charles Leple; Ann O'connell; Wout Boerjan; Claire Halpin
Original assignee: Biogemma SAS
Current assignee: Biogemma SAS
Priority date: 1994-04-11
Filing date: 1995-04-11
Publication date: 2005-10-06
Anticipated expiration: 2015-04-12
Also published as: WO1995027790A2; FR2718460A1; JPH09511647A; EP0755449A1; WO1995027790A3; EP0755449B1; AU2347295A; ATE283361T1; US6015943A; DE69533794D1; BR9507291A; CA2185334A1; FR2718460B1; ES2233942T3; AU705401B2; ZA952980B; NZ284823A

Description

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von DNA-Sequenzen, die für eine Cinnamoyl-CoA-Reduktase (CCR) in Pflanzen kodieren, oder von jedem Fragment dieser Sequenzen oder auch von jeder Sequenz, die sich von letzteren ableitet, oder von ihren komplementären Sequenzen im Rahmen der Durchführung von Verfahren zur Regulation des Ligninanteils in den Pflanzen.
Lignin ist ein komplexes heterogenes aromatisches Polymer, das die Wände bestimmter Pflanzenzellen undurchlässig macht und verstärkt.
Lignin wird durch Polymerisation freier Radikale gebildet, die sich von Monolignolen ableiten, wie den Paracumaryl-, Coniferyl- und Sinapylalkoholen (Higuchi, 1985, in Biosynthesis and degradation of wood components (T. Higuchi, Hrsg.), Academic Press, Orlando, FL, S. 141–160).
Lignine zeigen große Schwankungen in ihrem relativen Monolignolgehalt je nach der Spezies und den verschiedenen Geweben in der gleichen Pflanze.
Diese Schwankung ist wahrscheinlich auf die verschiedenen Aktivitäten und Substratspezifitäten der Enzyme zurückzuführen, die für die Biosynthese der Ligninmonomere erforderlich sind, und wird davon kontrolliert (Higuchi, 1985, siehe oben).
Über seine Rolle in der Struktur und Entwicklung der Pflanzen hinaus stellt Lignin einen Hauptbestandteil der irdischen Biomasse dar und erlangt eine große ökonomische und ökologische Bedeutung (Brown, 1985, J. Appl. Biochem. 7, 371–387; Whetten und Sederoff, 1991, Forest Ecology and Management, 43, 301–316).
Auf der Ebene der Nutzung der Biomasse soll vor allem darauf hingewiesen werden, daß Lignin ein Faktor ist, der die Verdaulichkeit und die Nährstoffausbeute von Futterpflanzen beschränkt. Tatsächlich wird deutlich gezeigt, daß die Verdaulichkeit von Futterpflanzen durch Wiederkäuer umgekehrt proportional zum Ligningehalt dieser Pflanzen ist. Die Art der Lignine ist ebenfalls ein bestimmender Faktor bei diesem Phänomen (Buxton und Roussel, 1988, Crop. Sci., 28, 553–558; Jung und Vogel, 1986, J. Anim. Sci., 62, 1703–1712).
Unter den hauptsächlichen Futterpflanzen, bei denen es interessant wäre, die Ligningehalte zu senken, lassen sich folgende nennen: Luzerne, Schwingel, Mais, zur Silage verwendetes Futter...
Es wird ebenfalls darauf hingewiesen, daß die erhöhten Ligningehalte teilweise für die begrenzte Qualität der Sonnenblumenkuchen, die zur Verfütterung an Vieh bestimmt sind, und die verringerte Keimungsfähigkeit bestimmter Samenkörner auf dem Gebiet des Gartenbaus verantwortlich sind.
Man kann ebenfalls betonen, daß die intensive Verholzung, die während der Lagerung der Pflanzenorgane nach der Ernte erfolgt, Produkte, wie Spargel, Jamswurzel, Karotten usw. ... schnell für den Verzehr ungeeignet macht.
Außerdem soll ebenfalls darauf hingewiesen werden, daß mehr als 50 Millionen Tonnen Lignine jedes Jahr im Rahmen der Produktion von Papiermasse in der Papierindustrie aus Liginsubstanz extrahiert werden. Dieser Extraktionsarbeitsgang, der zur Gewinnung der Cellulose notwendig ist, ist energieintensiv und zweitens umweltverschmutzend aufgrund der chemischen Verbindungen, die zur Extraktion eingesetzt werden und die man in der Umgebung wiederfindet (Dean und Eriksson, 1992, Holzforschung, 46, 135–147; Whetten und Sederoff, 1991, siehe oben).
Eine Verringerung der Ligninanteile (die je nach Spezies 20 bis 30% der Trockensubstanz ausmachen) um einige Prozent (2 bis 5%) würde einen Ausbeutegewinn, eine beträchtliche Wirtschaftlichkeit (chemische Produkte) darstellen und zur Verbesserung der Umwelt beitragen (Verringerung der Umweltverschmutzungen). Bei gegebenem Grad der Nutzung der Ligninsubstanz hätten diese Rückschritte äußerst entscheidende Rückwirkungen. In diesem Fall könnte es sich bei den betreffenden Spezies um Pappel, Eukalyptus, Acacia mangium, die Gattung Casuarina und die Gruppe der Angiospermen und Gymnospermen, die zur Herstellung von Papiermasse verwendet werden, handeln.
Es ist deutlich, daß auf den beiden in Betracht kommenden Gebieten die Verringerung der Ligninanteile mäßig sein muss, um bei der Pflanze (oder dem Baum) ihre (seine) Steifheitseigenschaften und normale Architektur beizubehalten, weil die Lignine, welche die Zellwände verstärken, eine wichtige Rolle bei der Erhaltung des aufrechten Wuchses der Pflanzen spielen.
Die natürlichen Schwankungen bei den Ligningehalten, die in der Natur für die gleiche Spezies beobachtet werden, (die Abweichungen können bis zu 6–8% der Trockenmasse zwischen einzelnen Individuen betragen) ermöglichen die obengenannten Erniedrigungen.
Die Beständigkeit des Lignins gegen Abbau sowie die Schwierigkeiten, denen man im Rahmen seiner Extraktion gegenübersteht, sind wahrscheinlich auf die komplexe Struktur dieses Polymers, das aus Ether- und Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen zwischen den Monomeren besteht, sowie auf die zahlreichen chemischen Bindungen zwischen Lignin und anderen Bestandteilen der Zellwand zurückzuführen (Sarkanen und Ludwig, 1971, in Lignins: Occurrence, Formation, Structure and Reactions (K. V. Sarkanen und C. H. Ludwig, Hrsg.) New York: Wiley-Interscience, S. 1–18).
Ausgehend von Cinnamoyl-CoA erfolgt die Biosynthese der Lignine in Pflanzen aus die folgende Weise:
Ein gentechnologischer Ansatz, um zu versuchen, den Ligninanteil in den Pflanzen zu erniedrigen, besteht aus der Hemmung der Synthese eines der Enzyme der Biosynthesekette dieser obengenannten Lignine.
Eine im Umfang eines solchen Ansatzes besonders geeignete Technik ist die Verwendung von Antisense-mRNA, die mit der mRNA, die für diese Enzyme kodiert, zu hybridisieren und folglich mindestens teilweise die Produktion dieser Enzyme ausgehend von ihrer entsprechenden mRNA zu verhindern vermag.
Eine solche Antisense-Strategie, die mit Hilfe des für CAD im Tabak kodierenden Gens durchgeführt wurde, ist Gegenstand der europäischen Patentanmeldung Nr. 584 117, welche die Verwendung von Antisense-mRNA beschreibt, die die Produktion von Ligninen in den Pflanzen zu hemmen vermag, indem sie mit der für CAD kodierenden mRNA in diesen Pflanzen hybridisiert.
Die Ergebnisse in den so transformierten Pflanzen zeigen eine Verringerung der CAD-Aktivität, aber die Ligningehalte an zeigen paradoxerweise keine Veränderung. Ergänzende Untersuchungen zeigen, daß die Lignine der transformierten Pflanzen sich von den Kontroll-Ligninen unterscheiden, weil Cinnamylaldehyde direkt in das Ligninpolymer eingebaut sind.
Eines der Ziele der vorliegenden Erfindung ist, genauer gesagt, die Bereitstellung eines Verfahrens, das eine wirksame Regulation der Ligningehalte in den Pflanzen entweder im Sinne einer erheblichen Erniedrigung dieser Gehalte im Vergleich zu den normalen Gehalten in den Pflanzen oder im Sinne einer Erhöhung dieser Gehalte gestattet.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Werkzeugen zur Durchführung dieses Verfahrens und insbesondere von Konstruktionen, die sich zur Transformation von Pflanzen eignen.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von genetisch transformierten Pflanzen, insbesondere von Futterpflanzen, die besser verdaulich sein können als die nichttransformierten Pflanzen, oder auch von transformierten Pflanzen oder Bäumen zur Herstellung von Papiermasse, bei denen die Extraktion der Lignine leichter und weniger umweltverschmutzend ist als im Fall nichttransformierter Bäume.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung transformierter Pflanzen, die dazu noch im Gegensatz zu den nichttransformierten Pflanzen resistent gegen Angriffe aus der Umgebung, insbesondere Angriffe durch Parasiten, sind, oder auch transformierter Pflanzen, die größer oder kleiner sind (als nichttransformierte Pflanzen).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung rekombinanter Nukleotidsequenzen, die eine (oder mehrere) Kodierregion(en) enthalten, wobei diese Kodierregion(en) folgendermaßen zusammengesetzt ist/sind:

– aus einer Nukleotidsequenz, die für eine Boten-RNA (mRNA) kodiert, wobei diese mRNA wiederum für eine Cinnamoyl-CoA-Reduktase (CCR) in Pflanzen kodiert, oder einem Fragment der obengenannten Nukleotidsequenz, wobei das Fragment für eine mRNA kodiert, wobei diese mRNA wiederum für ein Fragment einer CCR in Pflanzen kodiert, wobei das CCR-Fragment eine enzymatische Aktivität besitzt, die äquivalent zu derjenigen der obengenannten CCR ist, oder einer Nukleotidsequenz, die sich von der obengenannten Nukleotidsequenz oder von dem obengenannten Fragment insbesondere durch Mutation und/oder Addition und/oder Suppression und/oder Substitution von einem oder mehreren Nukleotiden ableitet, wobei diese abgeleitete Sequenz für eine mRNA kodiert, wobei die mRNA wiederum für ein abgeleitetes Protein kodiert, das eine zu derjenigen der obengenannten CCR äquivalente enzymatische Aktivität aufweist, oder
– aus einer Nukleotidsequenz, die zu der Gesamtheit oder einem Teil der für eine mRNA kodierenden Nukleotidsequenz komplementär ist, oder aus einem Fragment dieser Sequenz oder aus einer von diesen letzteren abgeleiteten Sequenz, wie oben definiert, wobei diese komplementäre Sequenz für eine Antisense-Nukleotidsequenz (auch AntisensemRNA genannt) kodiert, die mit einer der obengenannten mRNAs zu hybridisieren vermag,

Unter dem Ausdruck "abgeleitete Nukleotidsequenz" wird vorstehend und nachstehend jede Sequenz verstanden, die mindestens etwa 50% homologe Nukleotide zu denjenigen der Sequenz, von der sie abgeleitet ist, aufweist.
Unter "abgeleitetem Protein" wird vorstehend und nachstehend jedes Protein verstanden, das mindestens etwa 50% homologe Aminosäuren zu denjenigen des Proteins, von dem es abgeleitet ist, aufweist.
Unter den Nukleotidsequenzen, die als Kodierregionen in den rekombinanten Nukleotidsequenzen verwendet werden können, kann man hauptsächlich nennen:

– die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 1, die für eine mRNA kodiert, wobei diese mRNA wiederum für die CCR von Eukalyptus gemäß SEQ ID Nr. 2 kodiert,
– die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 3, die für eine mRNA kodiert, wobei diese mRNA wiederum für die CCR von Pappel gemäß SEQ ID Nr. 4 kodiert,
– die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 5, die für eine mRNA kodiert, wobei diese mRNA wiederum für die CCR von Schwingel gemäß SEQ ID Nr. 6 kodiert,
– die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 7, die für eine mRNA kodiert, wobei diese mRNA wiederum für die CCR von Tabak gemäß SEQ ID Nr. 8 kodiert,
– die Nukleotidsequenz, die zu derjenigen gemäß SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 7 komplementär ist, wobei diese komplementäre Sequenz für eine Antisense-mRNA kodiert, die mit der durch die Sequenzen SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5 bzw. SEQ ID Nr. 7 kodierten mRNA zu hybridisieren vermag,
– die Nukleotidsequenz, die sich von der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 7 insbesondere durch Mutation und/oder Addition und/oder Suppression und/oder Substitution von einem oder mehreren Nukleotiden ableitet, wobei diese abgeleitete Sequenz entweder für eine mRNA kodiert, die wiederum für die CCR gemäß SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 6 bzw. SEQ ID Nr. 8 kodiert, oder für ein Protein, das sich von letzteren ableitet und eine äquivalente enzymatische Aktivität zu derjenigen dieser CCR in Pflanzen aufweist, insbesondere die von der Sequenz SEQ ID Nr. 1 abgeleitete Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 9, wobei letztere für eine mRNA kodiert, wobei diese mRNA wiederum für ein Protein gemäß SEQ ID Nr. 10 kodiert, das von der obengenannten Eukalyptus-CCR abgeleitet ist,
– die Nukleotidsequenz, die von der obengenannten komplementären Nukleotidsequenz durch Mutation und/oder Addition und/oder Suppression und/oder Substitution von einem oder mehreren Nukleotiden abgeleitet ist, wobei diese abgeleitete Sequenz für eine Antisense-mRNA kodiert, die mit einer der obengenannten mRNAs zu hybridisieren vermag.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist insbesondere jede DNA-Sequenz, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie als Kodierregion folgendes umfaßt:

– die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 1, die für eine mRNA kodiert, wobei diese mRNA wiederum für die CCR gemäß SEQ ID Nr. 2 kodiert, oder
– ein Fragment der obengenannten Nukleotidsequenz, wobei dieses Fragment für ein Fragment der CCR gemäß SEQ ID Nr. 2 kodiert, wobei dieses CCR-Fragment eine zu derjenigen der obengenannten CCR äquivalente enzymatische Aktivität aufweist, oder
– jede von der obengenannten Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 oder von einem Fragment dieser Sequenz, wie oben beschrieben, insbesondere durch Mutation und/oder Addition und/oder Suppression und/oder Substitution von einem oder mehreren Nukleotiden abgeleitete Nukleotidsequenz, wobei diese abgeleitete Sequenz für eine mRNA kodiert, die wiederum für die CCR gemäß SEQ ID Nr. 2 oder für ein von letzterer abgeleitetes Protein kodiert, das eine zu derjenigen der CCR äquivalente enzymatische Aktivität in Pflanzen aufweist, insbesondere die von der Sequenz SEQ ID Nr. 1 abgeleitete Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 9, wobei letztere für eine mRNA kodiert, wobei diese mRNA wiederum für ein Protein gemäß SEQ ID Nr. 10, das sich von der obengenannten Eukalyptus-CCR ableitet, kodiert.

– die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 3, die für eine mRNA kodiert, wobei diese mRNA wiederum für die CCR gemäß SEQ ID Nr. 4 kodiert, oder
– ein Fragment der obengenannten Nukleotidsequenz, wobei dieses Fragment für ein Fragment der CCR gemäß SEQ ID Nr. 4 kodiert, wobei dieses CCR-Fragment eine zu derjenigen der obengenannten CCR äquivalente enzymatische Aktivität aufweist, oder
– jede von der obengenannten Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 3 oder von einem Fragment dieser Sequenz, wie oben beschrieben, insbesondere durch Mutation und/oder Addition und/oder Suppression und/oder Substitution von einem oder mehreren Nukleotiden abgeleitete Nukleotidsequenz, wobei diese abgeleitete Sequenz für eine mRNA kodiert, die wiederum für die CCR gemäß SEQ ID Nr. 4 oder für ein von letzterer abgeleitetes Protein kodiert, das eine zu derjenigen der CCR äquivalente enzymatische Aktivität in Pflanzen aufweist.

– die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 5, die für eine mRNA kodiert, wobei diese mRNA wiederum für die CCR gemäß SEQ ID Nr. 6 kodiert,
– ein Fragment der obengenannten Nukleotidsequenz, wobei dieses Fragment für ein Fragment der CCR gemäß SEQ ID Nr. 6 kodiert, wobei dieses CCR-Fragment eine zu derjenigen der obengenannten CCR äquivalente enzymatische Aktivität aufweist, oder
– jede von der obengenannten Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 5 oder von einem Fragment dieser Sequenz, wie oben beschrieben, insbesondere durch Mutation und/oder Addition und/oder Suppression und/oder Substitution von einem oder mehreren Nukleotiden abgeleitete Nukleotidsequenz, wobei diese abgeleitete Sequenz für eine mRNA kodiert, die wiederum für die CCR gemäß SEQ ID Nr. 6 oder für ein von letzterer abgeleitetes Protein kodiert, das eine zu derjenigen der CCR äquivalente enzymatische Aktivität in Pflanzen aufweist.

– die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 7, die für eine mRNA kodiert, wobei diese mRNA wiederum für die CCR gemäß SEQ ID Nr. 8 kodiert,
– ein Fragment der obengenannten Nukleotidsequenz, wobei dieses Fragment für ein Fragment der CCR gemäß SEQ ID Nr. 8 kodiert, wobei dieses CCR-Fragment eine zu derjenigen der obengenannten CCR äquivalente enzymatische Aktivität aufweist, oder
– jede von der obengenannten Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 7 oder von einem Fragment dieser Sequenz, wie oben beschrieben, insbesondere durch Mutation und/oder Addition und/oder Suppression und/oder Substitution von einem oder mehreren Nukleotiden abgeleitete Nukleotidsequenz, wobei diese abgeleitete Sequenz für eine mRNA kodiert, die wiederum für die CCR gemäß SEQ ID Nr. 8 oder für ein von letzterer abgeleitetes Protein kodiert, das eine zu derjenigen der CCR äquivalente enzymatische Aktivität in Pflanzen aufweist.

Unter Protein, das eine zu derjenigen der in den Pflanzen vorhandenen CCR und insbesondere den CCR gemäß SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 6 und SEQ ID Nr. 8 äquivalente enzymatische Aktivität aufweist, wird jedes Protein verstanden, das eine CCR-Aktivität besitzt, wie gemäß dem in Eur. J. Biochem. (1981), 119: 115–127 veröffentlichten Verfahren von Luderitz und Grisebach gemessen.
Zur Veranschaulichung sie gesagt, daß dieses Verfahren mittels spektralphotometrischer Messung der verringernden Aktivität des Proteins (CCR oder Derivat) durch Verfolgen des Verschwindens von Cinnamoyl-CoA bei 366 nm durchgeführt wird. Die Umsetzung läuft bei 30°C für 2 bis 10 Minuten ab. Die Zusammensetzung des Reaktionsmediums ist wie folgt: 100 mM Phosphatpuffer, pH 6,25, 0,1 mM NADPH, 70 μM Feruloyl-CoA, 5 bis 100 μl enzymatischer Extrakt in einem Gesamtvolumen von 500 μl.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls jede DNA-Sequenz, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie als Kodierregion folgendes umfaßt:

– die Nukleotidsequenz, die zu der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 komplementär ist, wobei diese komplementäre Sequenz für eine Antisense-mRNA kodiert, die mit der mRNA, die selbst wiederum für die CCR gemäß SEQ ID Nr. 2 kodiert, nämlich der mRNA, die von der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 oder von einer von der letzteren abgeleiteten Sequenz kodiert wird, wie oben definiert, zu hybridisieren vermag, oder
– ein Fragment der obengenannten komplementären Sequenz, wobei dieses Sequenzfragment für eine Antisense-mRNA kodiert, die mit der mRNA, die selbst wiederum für die CCR gemäß SEQ ID Nr. 2 kodiert, wie oben definiert, zu hybridisieren vermag, oder
– jede von der obengenannten komplementären Sequenz oder dem Fragment dieser komplementären Sequenz, wie oben beschrieben, insbesondere durch Mutation und/oder Addition und/oder Suppression und/oder Substitution von einem oder mehreren Nukleotiden abgeleitete Nukleotidsequenz, wobei diese abgeleitete Sequenz für eine Antisense-mRNA kodiert, die mit der obengenannten mRNA zu hybridisieren vermag, insbesondere die zu der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 9 komplementäre Sequenz.

– die Nukleotidsequenz, die zu der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 3 komplementär ist, wobei diese komplementäre Sequenz für eine Antisense-mRNA kodiert, die mit der mRNA, die selbst wiederum für die "CCR gemäß SEQ ID Nr. 4 kodiert, nämlich der mRNA, die von der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 3 oder von einer von der letzteren abgeleiteten Sequenz kodiert wird, wie oben definiert, zu hybridisieren vermag, oder
– ein Fragment der obengenannten komplementären Sequenz, wobei dieses Sequenzfragment für eine Antisense-mRNA kodiert, die mit der mRNA, die selbst wiederum für die CCR gemäß SEQ ID Nr. 4 kodiert, wie oben definiert, zu hybridisieren vermag, oder
– jede von der obengenannten komplementären Sequenz oder dem Fragment dieser komplementären Sequenz, wie oben beschrieben, insbesondere durch Mutation und/oder Addition und/oder Suppression und/oder Substitution von einem oder mehreren Nukleotiden abgeleitete Nukleotidsequenz, wobei diese abgeleitete Sequenz für eine Antisense-mRNA kodiert, die mit der obengenannten mRNA zu hybridisieren vermag.

– die Nukleotidsequenz, die zu der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 5 komplementär ist, wobei diese komplementäre Sequenz für eine Antisense-mRNA kodiert, die mit der mRNA, die selbst wiederum für die CCR gemäß SEQ ID Nr. 6 kodiert, nämlich der mRNA, die von der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 5 kodiert wird oder von einer von der letzteren abgeleiteten Sequenz kodiert wird, wie oben definiert, zu hybridisieren vermag, oder
– ein Fragment der obengenannten komplementären Sequenz, wobei dieses Sequenzfragment für eine Antisense-mRNA kodiert, die mit der mRNA, die selbst wiederum für die CCR gemäß SEQ ID Nr. 5 kodiert, wie oben definiert, zu hybridisieren vermag, oder
– jede von der obengenannten komplementären Sequenz oder dem Fragment dieser komplementären Sequenz, wie oben beschrieben, insbesondere durch Mutation und/oder Addition und/oder Suppression und/oder Substitution von einem oder mehreren Nukleotiden abgeleitete Nukleotidsequenz, wobei diese abgeleitete Sequenz für eine Antisense-mRNA kodiert, die mit der obengenannten mRNA zu hybridisieren vermag.

– die Nukleotidsequenz, die zu der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 7 komplementär ist, wobei diese komplementäre Sequenz für eine Antisense-mRNA kodiert, die mit der mRNA, die selbst wiederum für die CCR gemäß SEQ ID Nr. 8 kodiert, nämlich der mRNA, die von der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 7 oder von einer von der letzteren abgeleiteten Sequenz kodiert wird, wie oben definiert, zu hybridisieren vermag, oder
– ein Fragment der obengenannten komplementären Sequenz, wobei dieses Sequenzfragment für eine Antisense-mRNA kodiert, die mit der mRNA, die selbst wiederum für die CCR gemäß SEQ ID Nr. 7 kodiert, wie oben definiert, zu hybridisieren vermag, oder
– jede von der obengenannten komplementären Sequenz oder dem Fragment dieser komplementären Sequenz, wie oben beschrieben, insbesondere durch Mutation und/oder Addition und/oder Suppression und/oder Substitution von einem oder mehreren Nukleotiden abgeleitete Nukleotidsequenz, wobei diese abgeleitete Sequenz für eine Antisense-mRNA kodiert, die mit der obengenannten mRNA zu hybridisieren vermag.

Es ist selbstverständlich, daß die obengenannten Sequenzen gemäß SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7 und SEQ ID Nr. 9, die komplementären Sequenzen, die abgeleiteten Sequenzen und die Fragmente von erfindungsgemäßen Sequenzen so betrachtet werden müssen, daß sie in 5' → 3'-Richtung dargestellt sind.
Somit ist das erste Nukleotid einer komplementären Sequenz in 5' → 3'-Richtung, wie oben beschrieben, das Komplement des letzten Nukleotids der Sequenz in 5' → 3'-Richtung, die für eine CCR (oder ein CCR-Fragment oder abgeleitetes Protein) kodiert, das zweite Nukleotid dieser komplementären Sequenz ist das Komplement des vorletzten Nukleotids der Sequenz, die für eine CCR kodiert, und so weiter, bis zum letzten Nukleotid dieser komplementären Sequenz, welches das Komplement des letzten Nukleotids der für eine CCR kodierenden Sequenz ist.
Die mRNA, die von der obengenannten komplementären Sequenz kodiert wird, ist derart, daß, wenn diese mRNA in 5' → 3'-Richtung dargestellt wird, ihr erstes Nukleotid dem letzten Nukleotid der für eine CCR kodierenden Sequenz entspricht und somit mit dem letzten Nukleotid der mRNA, die von der letzteren kodiert wird, zu hybridisieren vermag, während ihr letztes Nukleotid dem ersten Nukleotid der für eine CCR kodierenden Sequenz entspricht und somit mit dem ersten Nukleotid der von der letzteren kodierten mRNA hybridisiert.
Unter Antisense-mRNA wird also vorstehend und nachstehend jede mRNA verstanden, die von der obengenannten komplementären Sequenz kodiert und in umgekehrter Richtung (3' → 5') zu der Richtung dargestellt wird, in der die mRNA dargestellt wird, die von der für eine CCR (oder ein CCR-Fragment oder ein abgeleitetes Protein) kodierenden Sequenz kodiert wird, wobei diese letztere mRNA wiederum als Sense-mRNA (5' → 3') bezeichnet wird.
Der Begriff Antisense-mRNA bezeichnet somit eine RNA-Sequenz, die zu der Basensequenz der Boten-RNA komplementär ist, wobei der Begriff komplementär in dem Sinne verstanden werden soll, daß jede Base (oder eine Mehrzahl der Basen) der Antisense-Sequenz (die in 3' → 5'-Richtung gelesen wird) sich mit den entsprechenden Basen (G mit C, A mit U) der Boten-RNA (einer in 5' → 3'-Richtung gelesenen Sequenz) zu paaren vermag.
Die Antisense-RNA-Strategie ist im Umfang der vorliegenden Erfindung ein molekularer Ansatz, der für das Ziel einer Modulation der Ligninanteile der Pflanzen besonders geeignet ist. Die Antisense-RNA ist eine RNA, die durch Transkription des nichtkodierenden DNA-Strangs (Unsinn-Strangs) erzeugt wird.
Diese Antisense-Strategie ist insbesondere im europäischen Patent Nr. 240 208 beschrieben.
Es wird angenommen, daß die Hemmung der Synthese eines Proteins gemäß der Antisense-Strategie, im vorliegenden Fall auf das Auftreten von CCR, die Folge der Bildung eines Duplex zwischen den beiden komplementären RNAs (Sense und Antisense) ist, was somit die Produktion des Proteins hemmt. Der Mechanismus bleibt jedoch unbekannt. Der RNA-RNA-Komplex kann entweder eine schließliche Transkription oder die Reifung, den Transport oder die Übersetzung stören oder auch zu einem Abbau der mRNA führen.
Eine Kombination dieser Wirkungen ist ebenfalls möglich.
Die Erfindung betrifft auch jede mRNA, die von einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz kodiert wird, und insbesondere:

– die mRNA, die von der DNA-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 oder von einem Fragment oder einer abgeleiteten Sequenz, wie oben definiert, kodiert wird, wobei diese mRNA wiederum für die beim Eukalyptus vorhandene CCR gemäß SEQ ID Nr. 2 oder für ein Fragment dieser CCR oder ein abgeleitetes Protein, wie oben definiert, insbesondere für das Protein gemäß SEQ ID Nr. 10, zu kodieren vermag,
– die mRNA, die von der DNA-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 3 oder von einem Fragment oder einer abgeleiteten Sequenz, wie oben definiert, kodiert wird, wobei diese mRNA wiederum für die bei der Pappel vorhandene CCR gemäß SEQ ID Nr. 4 oder für ein Fragment dieser CCR oder ein abgeleitetes Protein, wie oben definiert, zu kodieren vermag,
– die mRNA, die von der DNA-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 5 oder von einem Fragment oder einer abgeleiteten Sequenz, wie oben definiert, kodiert wird, wobei diese mRNA wiederum für die beim Schwingel vorhandene CCR gemäß SEQ ID Nr. 6 oder für ein Fragment dieser CCR oder ein abgeleitetes Protein, wie oben definiert, zu kodieren vermag,
– die mRNA, die von der DNA-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 7 oder von einem Fragment oder einer abgeleiteten Sequenz, wie oben definiert, kodiert wird, wobei diese mRNA wiederum für die beim Tabak vorhandene CCR gemäß SEQ ID Nr. 8 oder für ein Fragment dieser CCR oder ein abgeleitetes Protein, wie oben definiert, zu kodieren vermag.

Aufgabe der Erfindung ist auch jede Antisense-mRNA, wie oben definiert, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie Nukleotide umfaßt, die zu der Gesamtheit oder einem Teil der Nukleotide komplementär sind, die eine erfindungsgemäße mRNA, wie oben beschreiben, bilden, wobei die Antisense-mRNA mit letzterer zu hybridisieren (oder sich damit zu paaren) vermag.
Dazu sieht die Erfindung insbesondere die Antisense-mRNAs vor, die von erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen kodiert werden, die mindestens eine Region von 50 Basen umfassen, die zu denjenigen einer Region von zu den obengenannten erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen komplementären Sequenzen homolog sind.
Es gibt keine Obergrenze für die Größe der DNA-Sequenzen, die eine erfindungsgemäße Antisense-RNA kodieren; sie können so lang sein wie diejenigen des normalerweise in den Zellen produzierten Boten oder auch so lang wie die genomische DNA-Sequenz, die für die CCR-mRNA kodiert.
Vorteilhafterweise umfassen diese DNA-Sequenzen, die für eine erfindungsgemäße Antisense-RNA kodieren, zwischen etwa 100 und etwa 1000 Basenpaaren.
Aufgabe der Erfindung ist insbesondere jede Antisense-Sequenz, die eine (oder mehrere) Antisense-mRNA(s), wie oben beschrieben, oder (ein) Fragment(e) dieser Antisense-mRNA(s) und eine (oder mehrere) Sequenz(en), die einer (oder mehreren) katalytischen Domäne(n) eines Ribozyms entsprechen, umfaßt.
Dazu sieht die Erfindung insbesondere jede Antisense-Sequenz, wie oben beschrieben, vor, welche die katalytische Domäne eines Ribozyms umfaßt, die auf jeder Seite von Armen von etwa 8 Basen flankiert sind, die zu Sequenzen komplementär sind, die ein GUX-Motiv (wobei X für C, U oder A steht) tragen, das in einer der obengenannten erfindungsgemäßen mRNAs (auch als Ziel-RNA bezeichnet) enthalten ist (Haseloff J. und Gerlach W. L., 1988, Nature, 334: 585–591).
Die Erfindung betrifft ferner jede DNA-Sequenz, die für eine Antisense-Sequenz, wie oben beschrieben, die mindestens eine katalytische Domäne eines Ribozyms in Verbindung mit einer oder mehreren erfindungsgemäßen Antisense-mRNAs oder (einem) Fragment(en) von Antisense-mRNAs (vorteilhafterweise Fragmenten von etwa 8 Basen, wie oben beschreiben) umfaßt, zu kodieren vermag.
Gegenstand der Erfindung ist insbesondere auch jede Antisense-Sequenz, die folgendes umfaßt
Gegenstand der Erfindung ist insbesondere:

– jede Antisense-mRNA, wie oben beschrieben, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie von der Nukleotidsequenz kodiert wird, die zu der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 komplementär ist, wobei die Antisense-mRNA mit der mRNA, die von der DNA-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 kodiert wird, zu hybridisieren vermag,
– jede Antisense-mRNA, wie oben beschrieben, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie von der Nukleotidsequenz kodiert wird, die zu der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 3 komplementär ist, wobei die Antisense-mRNA mit der mRNA, die von der DNA-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 3 kodiert wird, zu hybridisieren vermag,
– jede Antisense-mRNA, wie oben beschrieben, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie von der Nukleotidsequenz kodiert wird, die zu der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 5 komplementär ist, wobei die Antisense-mRNA mit der mRNA, die von der DNA-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 5 kodiert wird, zu hybridisieren vermag,
– jede Antisense-mRNA, wie oben beschrieben, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie von der Nukleotidsequenz kodiert wird, die zu der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 7 komplementär ist, wobei die Antisense-mRNA mit der mRNA, die von der DNA-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 7 kodiert wird, zu hybridisieren vermag,
– jede Antisense-mRNA, wie oben beschrieben, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie von der Nukleotidsequenz kodiert wird, die zu der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 9 komplementär ist, wobei die Antisense-mRNA mit der mRNA, die von der DNA-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 9 kodiert wird, zu hybridisieren vermag.

Die Erfindung betrifft ferner rekombinante Polypeptide, die von den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen kodiert werden, wobei diese rekombinanten Polypeptide eine zu derjenigen der CCR in Pflanzen und insbesondere den rekombinanten CCR, die von den Sequenzen gemäß SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 7 oder von den Sequenzen, die von den letzteren erfindungsgemäßen Sequenzen abgeleitet sind, insbesondere von SEQ ID Nr. 9, kodiert werden, äquivalente enzymatische Aktivität aufweisen.
Aufgabe der Erfindung sind insbesondere die rekombinanten Polypeptide und insbesondere die rekombinanten CCR, wie sie durch Transformation von Pflanzenzellen durch stabile Integration einer rekombinanten Nukleotidsequenz, wie nachstehend definiert, die eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz enthält, insbesondere mit Hilfe eines Vektors, wie nachstehend beschrieben, in deren Genom erhalten werden.
Unter dem Ausdruck "rekombinante Polypeptide" soll jedes Molekül verstanden werden, das eine Polypeptidkette besitzt, die mittels Gentechnologie über eine Phase der Transkription der DNA des entsprechenden Gens hergestellt werden kann, was zum Erhalt von RNA führt, die anschließend (durch Suppression der Introns) in mRNA umgewandelt wird, wobei letztere anschließend durch die Ribosomen in Form von Proteinen übersetzt wird, wobei das Ganze unter der Kontrolle geeigneter Regulationselemente im Inneren einer Wirtszelle erfolgt. Folglich schließt der verwendeten Begriff "rekombinante Polypeptide" die Möglichkeit nicht aus, daß diese Polypeptide andere Gruppen, wie glykosylierte Gruppen, umfassen.
Es ist selbstverständlich, daß der Begriff "rekombinant" bedeutet, daß das Polypeptid mittels Gentechnologie hergestellt wurde, weil es aus der Expression der entsprechenden Nukleotidsequenz, die zuvor in einen Expressionsvektor eingebracht wurde, der zur Transformation dieses zellulären Wirts verwendet wurde, in einer geeigneten Wirtszelle hervorgeht. Dennoch schließt der Begriff "rekombinant" die Möglichkeit nicht aus, daß das Polypeptid durch ein anderes Verfahren, beispielsweise klassische chemische Synthese gemäß bekannter, zur Synthese von Proteinen verwendeter Verfahren oder durch proteolytische Spaltung von größeren Molekülen, hergestellt wird.
Die Erfindung betrifft insbesondere die CCR, die in Eukalyptus-Zellen vorhanden ist, gemäß SEQ ID Nr. 2, die CCR, die in Pappel-Zellen vorhanden ist, gemäß SEQ ID Nr. 4, die CCR, die in Zellen des Aufrechten Schwingels vorhanden ist, gemäß SEQ ID Nr. 6 oder die CCR, die in Tabakzellen vorhanden ist, gemäß SEQ ID Nr. 8 oder jedes von letzteren insbesondere durch Addition und/oder Suppression und/oder Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren abgeleitete Protein, insbesondere das von der Eukalyptus-CCR gemäß SEQ ID Nr. 10 abgeleitete Protein oder jedes von diesen CCR oder ihren abgeleiteten Sequenzen stammende Fragment, wobei diese Fragmente und abgeleiteten Sequenzen eine zu derjenigen der obengenannten CCR äquivalente enzymatische Aktivität besitzen können.
Aufgabe der Erfindung sind ferner die Nukleotidsequenzen, die für die CCR gemäß SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 8 oder SEQ ID Nr. 10 oder jede abgeleitete Sequenz oder jedes Fragment der letzteren, wie oben definiert, kodieren, wobei diese Nukleotidsequenzen dadurch gekennzeichnet sind, daß sie der Gesamtheit oder einem Teil der Sequenzen gemäß SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7 bzw. SEQ ID Nr. 9 oder jeder von letzteren durch Degeneration des genetischen Codes abgeleiteten Sequenz entsprechen und dennoch für die CCR oder eine abgeleitete Sequenz oder eine Fragment von letzteren, wie oben definiert, zu kodieren vermögen.
Die Erfindung sieht ferner die zwischen den Antisense-mRNAs, wie oben definiert, und den erfindungsgemäßen mRNAs, die für die Gesamtheit oder einen Teil einer CCR in Pflanzen zu kodieren vermögen, gebildeten Komplexe vor.
Aufgabe der Erfindung ist insbesondere der Komplex, der zwischen der von der Sequenz SEQ ID Nr. 1 kodierten mRNA und der von der zu der Sequenz SEQ ID Nr. 1 komplementären Sequenz kodierten Antisense-mRNA, der von der Sequenz SEQ ID Nr. 3 kodierten mRNA und der von der zu der Sequenz SEQ ID Nr. 3 komplementären Sequenz kodierten Antisense-mRNA, der von der Sequenz SEQ ID Nr. 5 kodierten mRNA und der von der zu der Sequenz SEQ ID Nr. 5 komplementären Sequenz kodierten Antisense-mRNA, der von der Sequenz SEQ ID Nr. 7 kodierten mRNA und der von der zu der Sequenz SEQ ID Nr. 7 komplementären Sequenz kodierten Antisense-mRNA, der von der Sequenz SEQ ID Nr. 9 kodierten mRNA und der von der zu der Sequenz SEQ ID Nr. 9 komplementären Sequenz kodierten Antisense-mRNA gebildet wird.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch jede rekombinante Nukleotidsequenz, die eine (oder mehrere) Kodierregion(en) enthalten, wobei diese Kodierregion(en) folgendermaßen zusammengesetzt ist/sind:

– aus einer Nukleotidsequenz, die für eine mRNA kodiert, wobei diese mRNA wiederum für eine CCR in Pflanzen kodiert, oder einem Fragment der obengenannten Nukleotidsequenz, wobei dieses Fragment für eine mRNA kodiert, wobei diese mRNA wiederum für ein Fragment einer CCR in Pflanzen kodiert, wobei dieses CCR-Fragment eine enzymatische Aktivität besitzt, die zu derjenigen der obengenannten CCR äquivalent ist, oder einer Nukleotidsequenz, die sich von der obengenannten Nukleotidsequenz oder von dem obengenannten Fragment insbesondere durch Mutation und/oder Addition und/oder Suppression und/oder Substitution von einem oder mehreren Nukleotiden ableitet, wobei diese abgeleitete Sequenz für eine mRNA kodiert, wobei diese mRNA wiederum für ein abgeleitetes Protein kodiert, das eine zu derjenigen der obengenannten CCR äquivalente enzymatische Aktivität aufweist, oder
– aus einer Nukleotidsequenz, die zu der Gesamtheit oder einem Teil der für eine mRNA kodierenden Nukleotidsequenz komplementär ist, oder einem Fragment dieser Sequenz oder aus der von den letzteren abgeleiteten Sequenz, wie vorstehend definiert, wobei diese komplementäre Sequenz für eine Antisense-mRNA kodiert, die mit einer der obengenannten mRNAs zu hybridisieren vermag.

Gegenstand der Erfindung ist insbesondere jede rekombinante Nukleotidsequenz (oder rekombinante DNA), die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie mindestens eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz umfaßt, die aus den oben beschriebenen ausgewählt ist, wobei diese DNA-Sequenz in eine heterologe Sequenz insertiert wird.
Die Erfindung betrifft insbesondere jede rekombinante Nukleotidsequenz, wie oben beschrieben, die als Kodierregion die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 oder gemäß SEQ ID Nr. 3 oder gemäß SEQ ID Nr. 5 oder gemäß SEQ ID Nr. 7 oder jedes Fragment oder eine von letzteren abgeleiteten Nukleotidsequenz, wie oben definiert, umfaßt, wobei diese Nukleotidsequenzen oder dieses Fragment in eine heterologe Sequenz insertiert werden und für die CCR gemäß SEQ ID Nr. 2 oder gemäß SEQ ID Nr. 4 oder gemäß SEQ ID Nr. 6 bzw. gemäß SEQ ID Nr. 8 oder für ein Fragment dieser CCR oder für ein von den letzteren abgeleitetes Protein, wie oben definiert, zu kodieren vermögen.
Die Erfindung betrifft insbesondere auch jede rekombinante Nukleotidsequenz, die als Kodierregion eine zu der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 oder gemäß SEQ ID Nr. 3 oder gemäß SEQ ID Nr. 5 oder gemäß SEQ ID Nr. 7 komplementäre Nukleotidsequenz oder jedes Fragment oder jede von dieser komplementären Sequenz abgeleitete Nukleotidsequenz, wie oben definiert, umfaßt, wobei diese komplementären Sequenzen oder dieses Fragment in eine heterologe Sequenz insertiert werden und für eine Antisense-mRNA zu kodieren vermögen, die mit der Gesamtheit oder einem Teil der mRNA, die für eine CCR in Pflanzen kodiert, und insbesondere mit der Gesamtheit oder einem Teil der mRNA, die für die CCR gemäß SEQ ID Nr. 2 oder gemäß SEQ ID Nr. 4 oder gemäß SEQ ID Nr. 6 bzw. gemäß SEQ ID Nr. 8 kodiert, zu hybridisieren vermag.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten DNAs sind zusätzlich noch dadurch gekennzeichnet, daß sie die für die Regelung der Expression der Nukleotidsequenz, die für eine CCR kodiert, oder ihrer komplementären Sequenz, die für eine erfindungsgemäße Antisense-mRNA kodiert, erforderlichen Elemente, insbesondere einen Promotor und einen Terminator für die Transkription dieser Sequenzen, umfassen.
Unter den verschiedenen Promotoren, die in den erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Konstruktionen verwendet werden können, lassen sich folgende nennen:

– der endogene Promotor, der die Expression der CCR in einer Pflanze kontrolliert, insbesondere der stromaufwärts der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 beim Eukalyptus gelegene Promotor, oder
– stark exprimierende, konstitutive Promotoren, beispielsweise: ³⁵S-CAMV (in Benfey et al. (1990), EMBO J., 9 (6), 1677–1684 beschrieben), EF1α (Promotor des Gens eines Elongationsfaktors bei der Proteinsynthese, der von Curie et al. (1991), Nucl. Acids Res., 19, 1305–1310 beschrieben ist),
– spezifische Promotoren für die besondere Expression in einzelnen Geweben, beispielsweise: CAD-Promotor (von Feuillet C. (1993), Doktorarbeit Universität Toulouse III beschrieben), GRP-1-8-Promotor (von Keller und Baumgartner, (1991), Plant Cell., 3, 1051–1061 beschrieben) für die Expression in spezifischen Gefäßgeweben.

Die Erfindung betrifft auch jede rekombinante Nukleotidsequenz, wie oben beschrieben, die ferner als Kodierregion mindestens eine Nukleotidsequenz umfaßt, die für die Gesamtheit oder einen Teil einer mRNA kodiert, die selbst wiederum für ein Enzym, bei dem es sich nicht um die CCR handelt und das an einem Ligninbiosyntheseschritt bei Pflanzen beteiligt ist, kodiert, insbesondere der mRNA, die für die Cinnamylalkoholdehydrogenase (CAD) kodiert, oder die als Kodierregion auch mindestens eine Nukleotidsequenz, die für die Gesamtheit oder einen Teil einer Antisense-mRNA, die mit der obengenannten mRNA, insbesondere mit der für die CAD kodierenden mRNA, zu hybridisieren vermag, kodiert.
Die obengenannten erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleotidsequenzen werden vorteilhafterweise ausgehend von Vektoren erhalten, in welche die DNA-Sequenzen, die für ein Enzym, das für die Ligninbiosynthese bei Pflanzen notwendig ist, kodieren, insertiert werden.
Dazu ist der Gegenstand der Erfindung insbesondere der als pEUCCR bezeichnete Vektor, der die Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 umfaßt, die in den Bluescript-Vektor kloniert und in Kultur in E.-coli-DH5α-Zellen bei der Collection Nationale de Culture de Micro-organisms (CNCM) beim Institut Pasteur in Paris (Frankreich) am 17. März 1994 unter der Nr. I-1405 hinterlegt wurde.
Die obengenannten Vektoren werden mit Hilfe geeigneter Restriktionsenzyme gespalten, um die darin insertierten DNA-Sequenzen zu gewinnen.
Letztere werden anschließend stromabwärts eines geeigneten Promotors und stromaufwärts eines geeigneten Terminators für die Expression in die erfindungsgemäßen rekombinanten DNAs insertiert.
Die Erfindung sieht insbesondere die rekombinanten DNAs vor, die die Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 umfassen, die für die mRNA kodiert, die wiederum selbst für die CCR gemäß SEQ ID Nr. 2 kodiert, wie sie mittels Spaltung des obengenannten Vektors pEUCCR, Gewinnung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz und Insertion der letzteren in 5' → 3'-Richtung in eine heterologe DNA-Sequenz, die einen Promotor und einen Terminator für die Expression dieser Sequenz umfaßt, erhalten werden.
Gegenstand der Erfindung sind insbesondere auch die rekombinanten DNAs, die die Sequenz umfassen, die zu der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 komplementär ist und für eine Antisense-mRNA kodiert, die mit der mRNA, die für die CCR gemäß SEQ ID Nr. 2 kodiert, zu hybridisieren vermag, wie sie mittels Spaltung des obengenannten Vektors pEUCCR, Gewinnung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz und Insertion der letzteren in umgekehrter Richtung, d. h. in 3' → 5'-Richtung, in eine heterologe DNA-Sequenz, die einen Promotor und einen Terminator für die Expression der komplementären Sequenz umfaßt, erhalten werden.
Als Beispiel für einen in diesen Konstruktionen verwendbaren Terminator kann man das 3'-Ende des Gens für die Nopalinsynthase von Agrobacterium tumefaciens nennen.
So werden allgemein die erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleotidsequenzen, die eine DNA-Sequenz enthalten, die für eine CCR (oder ein CCR-Fragment oder ein abgeleitetes Protein) und/oder andere, für die Ligninbiosynthese erforderlich Enzyme kodiert, durch Gewinnung dieser DNA-Sequenz ausgehend von den obengenannten Vektoren und Insertion dieser Sequenz in die heterologe Sequenz erhalten, während die rekombinanten Nukleotidsequenzen, die eine DNA-Sequenz enthalten, die für eine erfindungsgemäße Antisense-mRNA kodiert, durch Gewinnung der obengenannten DNA-Sequenz und Insertion von letzterer in umgekehrter Richtung in diese heterologe Sequenz erhalten.
Zur Veranschaulichung sei gesagt, daß die Gesamtheit oder ein Teil der komplementären DNA (cDNA) gemäß SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7 oder SEQ ID Nr. 9 oder auch die Gesamtheit oder ein Teil des genomischen Klons, der einer CCR entspricht (welcher den obengenannten cDNAs + eventueller Introns entspricht) zur Konstruktion der obengenannten rekombinanten DNAs verwendet werden kann. Dieser genomische Klon kann unter Verwendung der cDNAs als Sonden zur Durchmusterung einer genomischen Bank erhalten werden, wobei letztere wiederum selbst gemäß dem von Sambrook, Fritsch und Maniatis, Molecular Cloning Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989, beschriebenen Verfahren erhalten wird.
Gegenstand der Erfindung ist auch jeder rekombinante Vektor, der für die Transformation von Pflanzen einsetzbar ist und dadurch gekennzeichnet ist, daß er eine erfindungsgemäße rekombinante Nukleotidsequenz umfaßt, die aus den oben beschriebenen ausgewählt ist und in eine der Stellen seines Genoms integriert ist, die für seine Replikation nicht wesentlich sind.
Unter den obengenannten rekombinanten, für die Transformation von Pflanzen einsetzbaren Vektoren kann man folgende nennen: von pBIN 19 abgeleitete binäre Vektoren (Bevan et al., (1984), Nucl. Acids Res., 12(22), 8711–8721).
Beispiele für die Konstruktion erfindungsgemäßer rekombinanter Vektoren sind in der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung beschrieben.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren für die Regulation der Ligninbiosynthese bei Pflanzen entweder durch Erniedrigung oder durch Erhöhung der produzierten Ligninmengen im Vergleich zu den normalen Ligninmengen, die von den Pflanzen produziert werden, wobei dieses Verfahren einen Schritt umfaßt, bei dem die Zellen dieser Pflanzen mit Hilfe eines Vektors transformiert werden, der folgendes umfaßt:

– eine Nukleotidsequenz, die für eine mRNA kodiert, wobei diese mRNA wiederum für eine CCR in Pflanzen kodiert, oder ein Fragment der obengenannten Nukleotidsequenz, wobei das Fragment für eine mRNA kodiert, wobei diese mRNA wiederum für ein Fragment einer CCR in Pflanzen kodiert, wobei dieses CCR-Fragment eine zu derjenigen der obengenannten CCR äquivalente enzymatische Aktivität aufweist, oder eine Nukleotidsequenz, die sich von der obengenannten Nukleotidsequenz oder von dem obengenannten Fragment insbesondere durch Mutation und/oder Addition und/oder Suppression und/oder Substitution von einem oder mehreren Nukleotiden ableitet, wobei diese abgeleitete Sequenz für eine mRNA kodiert, wobei diese mRNA wiederum für ein abgeleitetes Protein, das eine zu derjenigen der obengenannten CCR äquivalente enzymatische Aktivität aufweist, kodiert, oder
– eine Nukleotidsequenz, die zu der Gesamtheit oder einem Teil der Nukleotidsequenz, die für eine mRNA kodiert, oder zu einem Fragment dieser Sequenz oder der von den letzteren abgeleiteten Sequenz, wie oben definiert, komplementär ist, wobei diese komplementäre Sequenz für eine Antisense-mRNA kodiert, die mit einer der obengenannten mRNAs zu hybridisieren vermag,

Gegenstand der Erfindung ist insbesondere ein Verfahren zur Erniedrigung der durch Biosynthese in den Pflanzen produzierten Ligninmenge, wobei das Verfahren durch Transformation des Genoms dieser Pflanzen durchgeführt wird, wobei folgendes in diese eingebracht wird:

– mindestens eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz, wie oben beschrieben, die für eine Antisense-mRNA kodiert, die mit der Gesamtheit oder einem Teil der mRNA, die für die CCR gemäß SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 6 oder SEQ ID Nr. 8 oder für ein von den letzteren abgeleitetes Protein, wie oben beschrieben, insbesondere für das Protein gemäß SEQ ID Nr. 10, kodiert, zu hybridisieren vermag,
– und gegebenenfalls mindestens eine DNA-Sequenz, die für eine Antisense-mRNA kodiert, die mit einer mRNA, die für ein Enzym, bei dem es sich nicht um CCR handelt und das an einem Ligninbiosyntheseschritt bei Pflanzen beteiligt ist, kodiert, insbesondere der mRNA, die für die CAD kodiert, zu hybridisieren vermag,

– entweder mit Hilfe eines rekombinanten Vektors, wie oben beschrieben, der eine DNA-Sequenz enthält, die für einen Antisense-mRNA kodiert, die mit der mRNA, die für die CCR oder ein abgeleitetes Protein kodiert, wie oben definiert, zu hybridisieren vermag, und die gegebenenfalls eine oder mehrere DNA-Sequenz(en) enthält, die für eine Antisense-mRNA kodiert/kodieren, die mit einer mRNA zu hybridisieren vermag/vermögen, die für ein Enzym kodiert, bei dem es sich nicht um die CCR handelt, wie oben definiert,
– oder mit Hilfe von mehreren rekombinanten Vektoren, von denen mindestens einer eine DNA-Sequenz enthält, die für eine Antisense-mRNA kodiert, die mit der mRNA, die für die CCR oder ein abgeleitetes Protein, wie oben definiert, kodiert, zu hybridisieren vermag, während der (oder die) andere(n) rekombinante(n) Vektor(en) eine DNA-Sequenz enthält/enthalten, die für eine Antisense-mRNA kodiert, die mit einer mRNA, die für ein Enzym kodiert, bei dem es sich nicht um die CCR handelt, wie oben definiert, zu hybridisieren vermag,

Ein anderes Verfahren zur Erniedrigung der durch Biosynthese in den Pflanzen produzierten Ligninmenge wird durch Transformation des Genoms dieser Pflanzen durchgeführt, wobei folgendes in diese eingebracht wird:

– mindestens eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 7 oder ein Fragment oder eine von der letzteren abgeleitete Sequenz, wie oben definiert, insbesondere die Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 9,
– und gegebenenfalls mindestens eine DNA-Sequenz, die für die Gesamtheit oder einen Teil eines Enzyms, bei dem es sich nicht um CCR handelt und das an einem Ligninbiosyntheseschritt bei Pflanzen beteiligt ist, kodiert, insbesondere eine DNA-Sequenz, die für die Gesamtheit oder einen Teil der CAD kodiert,

– entweder mit Hilfe eines rekombinanten Vektors, wie oben beschrieben, der die obengenannte erfindungsgemäße DNA-Sequenz oder ein Fragment oder eine von der letzteren abgeleitete Sequenz, wie oben definiert, und gegebenenfalls eine oder mehrere DNA-Sequenz(en) enthält, die für die Gesamtheit oder einen Teil eines Enzyms kodiert, bei dem es sich nicht um die CCR handelt, wie oben definiert,
– oder mit Hilfe von mehreren rekombinanten Vektoren, von denen mindestens einer eine obengenannte erfindungsgemäße DNA-Sequenz oder ein Fragment oder eine von der letzteren abgeleitete Sequenz, wie oben definiert, enthält, während der (oder die) andere(n) rekombinante(n) Vektor(en) eine DNA-Sequenz enthält/enthalten, die für die Gesamtheit oder einen Teil eines Enzyms kodiert, bei dem es sich nicht um die CCR handelt, wie oben definiert,

Das letztere Verfahren nutzt den Mechanismus der Co-Suppression. Co-Suppression wird beobachtet, wenn Kopien des endogenen Gens in das Genom eingebracht wurden. Obwohl der Mechanismus der Co-Suppression zurzeit unbekannt ist, besteht eine der Hypothesen, an der am häufigsten festgehalten wird, darin, daß die negative Regulation der Expression des Gens zur Produktion eines kleinen Anteils an Antisense-RNA führt, die von einem Transgen ausgehend vom Ablesen des "falschen" Strangs des Transgens stammt (Grierson et al., Trends Biotech., 9: 122–123).
Aufgabe der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Erniedrigung der durch Biosynthese in den Pflanzen produzierten Ligninmenge, wobei das Verfahren durch Transformation des Genoms dieser Pflanzen durchgeführt wird, wobei in diese eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz, wie oben beschrieben, eingebracht wird, die für einen Antisense-Sequenz kodiert, die eine (oder mehrere) katalytische Domäne(n) eines Ribozyms in Verbindung mit einer (oder mehreren) Antisense-mRNA(s) oder (einem) Fragment(en) der erfindungsgemäßen Antisense-mRNA umfaßt, wobei die Transformation mit Hilfe eines rekombinanten Vektors durchgeführt wird, der eine erfindungsgemäße rekombinante Nukleotidsequenz, die wiederum die obengenannte DNA-Sequenz enthält, umfaßt.
Es soll darauf hingewiesen werden, daß die obengenannten Verfahren die Gewinnung transformierter Pflanzen gestatten, die unterschiedliche Niveaus der Erniedrigung der CCR-Aktivität (je nach dem Ausmaß der Insertion der DNA-Sequenz, die für die Antisense-mRNA kodiert, der Anzahl der Kopien dieser DNA-Sequenz, die in das Genom integriert sind ...) und somit der Ligningehalte aufweisen.
Die Auswahl der Transformanten gestattet somit eine kontrollierte Modulation der Ligningehalte, die mit einer normalen Entwicklung der Pflanze verträglich ist.
Wenn man in Betracht zieht, daß der durchschnittliche normale Ligningehalt einer Pflanze zwischen etwa 15% und etwa 35%, bezogen auf das Gewicht der Trockensubstanz, variiert, ist die Verringerung des Ligningehalts, die sich aus der Durchführung der obengenannten Verfahren ergibt, allgemein vorteilhafterweise derart, daß die so transformierten Pflanzen einen durchschnittlichen Ligningehalt aufweisen, der zwischen etwa 10% und etwa 30% oder auch zwischen etwa 12% und etwa 32% variiert.
Zur Veranschaulichung sei gesagt, daß der Ligningehalt einer Pflanze gemäß einer Variante des Verfahrens von Johnson et al., (1961), T. A. P. P. I., 44, 793–798, das in Alibert und Boudet (1979), Physiol., Veg., 17 (1), 67–74, detailliert beschrieben ist, gemessen werden kann, dessen hauptsächliche Schritte wie folgt sind: Nach Gewinnung eines Benzylalkoholpulvers, das die Lignine des Pflanzenmaterials enthält, werden die Lignine durch Acetylbromid solubilisiert und in Abhängigkeit von ihrer Absorption im Ultraviolettlicht bestimmt.
Die Erfindung sieht insbesondere die Anwendung der obengenannten Verfahren für die Erniedrigung der Ligningehalte in Pflanzen zur Gewinnung von genetisch transformierten Futterpflanzen vor, die verglichen mit den normalen Ligningehalten in diesen Pflanzen verringerte Ligningehalte aufweisen und deren Verdaulichkeit somit im Vergleich zu den gleichen, nichttransformierten Pflanzen verbessert ist.
Unter den hauptsächlichen Futterpflanzen, die im Umfang der vorliegenden Erfindung transformiert werden können, kann man nennen: Luzerne, Schwingel, zur Silage bestimmter Mais usw...
Die Erfindung betrifft auch die Anwendung der obengenannten Verfahren für die Erniedrigung der Ligningehalte in Pflanzen auf die Gewinnung von Pflanzen und insbesondere Bäumen, die genetisch transformiert sind und im Vergleich zu den normalen Ligningehalten in diesen Pflanzen verringerte Ligningehalte aufweisen, wobei diese Pflanzen oder Bäume im Rahmen der Herstellung von Papiermasse besonders vorteilhaft verwendbar sind.
Ein drittes potenzielles Anwendungsgebiet für die obengenannten Verfahren für die negative Regulation der Expression des CCR-Gens betrifft die Stimulation des Wachstums der transformierten Pflanzen. Verschiedene Argumente unterstreichen (Sauter und Kende, 1992, Plant and Cell Physiology, 33 (8): 1089), daß eine frühzeitige und schnelle Verholzung ein Hindernis für die Zellvergrößerung und somit für das Wachstum der Pflanzen ist. Somit vermag die Durchführung der obengenannten Verfahren den so transformierten Pflanzen mit verringerter Verholzung ein besseres Wachstum und somit bessere Ausbeuten zu gestatten.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren für die Erhöhung der durch Biosynthese in den Pflanzen produzierten Ligninmenge, wobei das Verfahren durch Transformation des Genoms dieser Pflanzen durchgeführt wird, wobei folgendes in diese eingebracht wird:

– mindestens eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 7 oder ein Fragment oder eine von letzterer abgeleitete Sequenz, wie oben definiert, insbesondere die Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 9,
– und gegebenenfalls mindestens eine DNA-Sequenz, die für die Gesamtheit oder einen Teil eines Enzyms kodiert, bei dem es sich nicht um die CCR handelt und das an einem Ligninbiosyntheseschritt bei Pflanzen beteiligt ist, insbesondere eine DNA-Sequenz, die für die Gesamtheit oder einen Teil der CAD kodiert,

– entweder mit Hilfe eines rekombinanten Vektors, wie oben beschrieben, der die obengenannten erfindungsgemäße DNA-Sequenz oder ein Fragment oder eine von der letzteren abgeleitete Sequenz, wie oben definiert, und gegebenenfalls eine oder mehrere DNA-Sequenz(en) enthält, die für die Gesamtheit oder einen Teil eines Enzyms kodiert/kodieren, bei dem es sich nicht um die CCR handelt, wie oben definiert,
– oder mit Hilfe von mehreren rekombinanten Vektoren, von denen mindestens einer eine obengenannte erfindungsgemäße DNA-Sequenz oder ein Fragment oder eine von der letzteren abgeleitete Sequenz, wie oben definiert, enthält, während der (oder die) andere(n) rekombinante(n) Vektor(en) eine DNA-Sequenz enthält/enthalten, die für die Gesamtheit oder einen Teil eines Enzyms kodiert, bei dem es sich nicht um die CCR handelt, wie oben definiert,

Wenn man in Betracht zieht, daß der durchschnittliche normale Ligningehalt einer Pflanze zwischen etwa 15% und etwa 35%, bezogen auf das Gewicht der Trockensubstanz, variiert, ist die Erhöhung des Ligningehalts, der sich aus der Durchführung des obengenannten Verfahrens ergibt, allgemein vorteilhafterweise derart, daß die so transformierten Pflanzen einen durchschnittlichen Ligningehalt aufweisen, der zwischen etwa 20% und etwa 40%, zwischen etwa 18% und etwa 38%, variiert.
Die Erfindung sieht insbesondere die Anwendung des obengenannten Verfahren für die Erhöhung der Ligningehalte in Pflanzen (auch als Verfahren für die Überexpression des CCR-Gens bezeichnet) auf die Gewinnung genetisch transformierter Pflanzen vor, die im Vergleich zu den normalen Ligningehalten in diesen Pflanzen erhöhte Ligningehalte aufweisen und deren Resistenzeigenschaften gegen Umweltangriffe, insbesondere Angriffe durch Parasiten, somit im Vergleich zu den gleichen, nichttransformierten Pflanzen, verbessert sind. Im letzten Fall ist es besonders vorteilhaft, in Verbindung mit dem CCR-Gen oder einer abgeleiteten Sequenz in den obengenannten Vektoren spezifische Promotoren zu verwenden, die besonders in den Geweben der Oberfläche und/oder als Antwort auf eine Verletzung exprimiert werden.
Außerdem betrifft die Erfindung auch die Anwendung des obengenannten Verfahrens für die Überexpression des CCR-Gens auf die Verbesserung des Wachstums der so genetisch transformierten Pflanzen, insbesondere auf bestimmten Gebieten, wie Gartenbau oder Baumschule, auf denen es wünschenswert ist, Pflanzen geringerer Größe zu erhalten.
Schließlich haben die Benzolringe des Lignins eine größere intrinsische Energie als die aliphatischen Ketten der Glucosereste der Cellulose. Somit gestattet die Erhöhung des Ligninanteils in den Pflanzen, die als Brennstoffe verwendet werden, gemäß dem obengenannten erfindungsgemäßen Verfahren die Verbesserung des Energiepotenzials dieser so transformierten, brennbaren Pflanzen.
In den beiden Fällen der negativen Regulation oder der Überexpression der CCR ist es völlig vorstellbar, daß sich die Modulation dieser Aktivität auf den Ligningehalt der transformierten Pflanzen auswirkt. Tatsächlich scheint die CCR, deren Aktivitätsniveau in der Pflanze sehr niedrig ist, das Regulationsenzym der Ligninsynthese darzustellen.
Hinsichtlich der Transformationstechniken, die zur Durchführung eines der oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, kann man vorteilhafterweise auf die folgenden Techniken zurückgreifen:

A) Die Transformationstechnologie mit Hilfe des Ti-Plasmids von Agrobacterium tumefaciens, die von Bevan (1984) Nucleic Acid Research, 12: 8711–8721, beschrieben ist. Sie nutzt im Wesentlichen das Co-Kulturverfahren und umfaßt eine Co-Transformation mit einem Selektionsgen, damit man die Transformanten auffinden kann. Sie eignet sich insbesondere für Dikotyledonen, beispielsweise: Tabak, Luzerne, Raps.
B) Die direkte Gentransfertechnik mittels biologischer Ballistik, die detailliert von (Zumbrum et al., 1989, Technique 1, 204–216; Sanford et al., 1991, Technique 3, 3–16) beschrieben ist.

Diese Technik umfaßt die Verbindung der erfindungsgemäßen rekombinanten DNA mit Mikropartikeln aus Gold oder Wolfram, die mit Hilfe einer Partikelkanone auf das zu transformierende Gewebe geschossen werden. Sie wird besonders bei der Transformation von Spezies eingesetzt, die für Agrobakterien nicht zugänglich sind.
In den beiden obengenannten Fällen erfolgt die Bestätigung des Vorhandenseins der erfindungsgemäßen rekombinanten DNA durch Hybridisierungsexperimente des Southern-Typs und genetische Amplifikation (Polymerasekettenreaktion) mit Hilfe von Sonden und Oligonukleotidfragmenten, die insbesondere von der Sequenz SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7 oder SEQ ID Nr. 9 stammen.
Die Erfindung betrifft auch die Pflanzenzellen, die mit dem erfindungsgemäßen Vektor, insbesondere durch die oben beschriebenen Techniken transformiert, worden sind und eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz umfassen, die stabil in ihr Genom integriert ist.
Die Erfindung sieht auch transformierte Pflanzen vor, die durch Kultur der obengenannten transformierten Zellen erhalten werden.
Die transformierten Pflanzen können anschließend sexuell oder vegetativ in vitro oder in natura vermehrt werden.
Aufgabe der Erfindung sind auch Pflanzenteile, insbesondere Früchte, Samen, Pollen, die durch Einbringen einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz mit Hilfe der obengenannten rekombinanten Vektoren in ihr Genom transformiert wurden.
Die Erfindung betrifft auch die Antikörper, die gegen die erfindungsgemäßen rekombinanten Polypeptide gerichtet sind, und insbesondere diejenigen, die gegen die obengenannten rekombinanten CCR gerichtet sind.
Diese Antikörper werden erhalten, indem ein Tier mit den Polypeptiden immunisiert wird und anschließend die gebildeten Antikörper gewonnen werden.
Es ist selbstverständlich, daß diese Produktion nicht auf polyklonale Antikörper beschränkt ist.
Sie betrifft auch jeden monoklonalen Antikörper, der durch jedes Hybridom produziert wird, das durch klassische Verfahren, einerseits ausgehend von Milzzellen eines Tiers, insbesondere von Maus oder Ratte, die gegen eines der erfindungsgemäßen gereinigten Polypeptide immunisiert worden sind, und andererseits einem geeigneten Myelom, gebildet und aufgrund seiner Fähigkeit, monoklonale Antikörper, die das obengenannte Polypeptid, das zu Beginn für die Immunisierung der Tiere verwendet wurde, selektioniert werden kann.
Die Erfindung sieht auch die Verwendung der obengenannten Antikörper, die gegen die erfindungsgemäßen rekombinanten Polypeptide gerichtet sind, für die Durchführung eines Nachweis- oder Bestimmungsverfahrens der CCR in den Pflanzen ausgehend von aus den letzteren entnommenen Proben vor.
Die Erfindung wird in der folgenden Beschreibung der Gewinnung der CCR in gereinigter Form aus dem Eukalyptus und der für die CCR von Eukalyptus, Pappel, Aufrechtem Schwingel und Tabak kodierenden cDNA weiter ausgeführt.
A) Gewinnung der gereinigten Eukalyptus-CCR und der für eine Eukalyptus-CCR kodierenden cDNA
I Reinigung der Eukalyptus-CCR
Die CCR bildete den Gegenstand einer Reihe sehr eingeschränkter Studien. Unter den wenigen Veröffentlichungen, die sie betreffen, kann man nennen:

Wengenmayer H., Ebel J., Grisebach H., 1976 – Enzymatic synthesis of lignin precursors, purification and properties of a cinnamoyl CoA: NaDPH reductase from cell suspension cultures from soyabean (Glycine max), Eur. J. Biochem., 65: 529–536.
Luderitz T., Grisebach H., 1981 – Enzymatic synthesis of lignin precursors, comparison of cinnamoyl: CoA reductase and cinnamyl alcohol dehydrogenase: NADP dehydrogenase from spruce (Picea abies L.) and soybean (Glycine max L.), Eur. J. Biochem., 119: 115–127.
Sarni F., Grand C., Boudet A. M., 1984 – Purification and properties of cinnamoyl: CoA reductase and cinnamyl alcohol dehydrogenase from poplar stems (Populus x euramericana). Eur. J. Biochem., 139: 259–265.

Die nachstehend beschriebene Arbeit hat dazu beigetragen, ein Protokoll für die ursprüngliche, einfache und schnelle Reinigung der Eukalyptus-CCR festzulegen. Diese Protokoll ist auch effizienter als die zuvor in der Literatur beschriebenen.
Tatsächlich gestattete es zum ersten Mal, Mengen des bis zur Homogenität gereinigten Enzyms zu erhalten, die dazu ausreichen, interne Peptidsequenzen zu erhalten und schließlich zur Klonierung der entsprechenden cDNA zu führen.
Alle Reinigungsschritte der CCR wurden bei 4°C durchgeführt.
1. Gewinnung eines Xylemrohextrakts von Eukalyptus
Das Pflanzenmaterial wurde mittels "Abkratzen" einer an Xylem angereicherten Gewebefraktion aus 5 Jahren alten Zweigen von Eucalyptus gunnii erhalten.
300 g zuvor in flüssigem Stickstoff eingefrorenes Xylem wurden mit Hilfe einer Kaffeemühle zu einem Pulver zerkleinert. Die so erhaltene zerkleinerte Substanz wurde in einem Liter Extraktionspuffer (100 mM Tris-HCl pH 7,6, 2% PEG 6000, 5 mM DTT, 2% PVPP) homogenisiert, durch zwei Lagen Miracloth filtriert und mit Ammoniumsulfat auf 30%ige Sättigung gebracht. Nach einer Zentrifugation für 30 Minuten bei 15000 × g wurde das erhaltene Sediment in 60 ml Puffer 1 [20 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM DTT (Dithiothreitol), 5% Ethylenglycol] resuspendiert. Der so erhaltene Extrakt wird durch eine 15-minütige Zentrifugation bei 10000 × g "geklärt", dann mittels Hindurchleiten durch mit Puffer 1 äquilibriertes Sephadex G25 entsalzt.
2. Affinitätschromatographie an Red Sepharose
Der entsalzte Rohextrakt wird auf eine "Red Sepharose"-Affinitätssäule (1,5 × 19 cm, Pharmacia), die mit Puffer 1 äquilibriert wurde, aufgetragen. Nach erstem Spülen der Säule mit 50 ml Puffer 1 werden die Proteine mit einem linearen Tris-Gradienten von 20 mM bis 1,5 M Tris-HCl pH 7,5, das 5 mM DTT, 5% Ethylenglycol enthielt, eluiert. Das Gesamtvolumen des Gradienten beträgt 200 ml, und die Flussrate beträgt 36 ml/Std. Die Fraktionen mit CCR-Aktivität werden gesammelt und mittels Hindurchleiten durch eine Sephadex-G25-Säule, die mit Puffer 1 äquilibriert wurde, entsalzt.
3. Anionenaustauschchromatographie an MonoQ
Die so gesammelten und entsalzten Fraktionen werden auf einer MonoQ-Anionenaustauschsäule (HR 5/5, Pharmacia) chromatographisch aufgetrennt. Die Elution der Proteine erfolgt durch Anlegen eines linearen Gradienten von 20 bis 300 mM Tris-HCl pH 7,5, der 5% Ethylenglycol und 5 mM DTT enthält. Das Gesamtvolumen des Gradienten beträgt 50 ml und der Durchsatz 1 ml/min. Wie bei der vorherigen Stufe werden die Fraktionen, die aktives CCR-Enzym enthalten, gesammelt und entsalzt, aber in diesem Fall ist der Äquilibrierungspuffer für die Sephadex-G25-Säulen ein 20 mM Phosphatpuffer, pH 7,6, der 5 mM DTT enthält (Puffer 2).
4. Affinitätschromatographie an "Mimetic Red"
Die so erhaltene Gruppe der CCR-Fraktionen wird auf eine Mimetic Red 2 A6XL-Säule (ACL, Cambridge) aufgebracht. Die Säule wird zuvor mit 30 ml Puffer 2, der 8 mM NAD enthält, gewaschen. Das Ziel dieses Waschschritts ist es, die Enzyme zu beseitigen, die spezifisch mit NAD als Cofaktor wirken, wie die Malatdehydrogenase, die in den vorherigen Stufen zusammen mit der CCR gereinigt wird. Die spezifische Elution der CCR wird durch Anlegen eines Gradienten (15 ml) von 0–8 mM NADP in Puffer 2 erhalten. Die Fraktionen, die die reine und aktive CCR enthalten, werden nach Zugabe eines Stabilisators (Ethylenglycol in einer Endkonzentration von 5%) bei –80°C aufbewahrt.
Das so erhaltene gereinigte Enzym hat eine spezifische Aktivität von 451 nKat/mg Protein unter Verwendung von Feruloyl-CoA als Substrat. Die erhaltene Ausbeute (36 μg reines Protein pro 300 g Ausgangs-Pflanzenmaterial) spiegelt nicht den Anteil der CCR in planta wider, was tatsächlich auf ein hauptsächliches Bestreben, Verunreinigungen auf jeder Stufe der Reinigung maximal zu beseitigen, zurückzuführen ist, wobei nur die Fraktionen, die eine sehr starke CCR-Aktivität aufweisen, werden im nachfolgenden Schritt behandelt werden. Der durch dieses Protokoll erhaltene Reinigungsfaktor beträgt 282.
II Charakterisierung der CCR
Die Eukalyptus-CCR ist ein Monomer von 38 kD, wie die übereinstimmenden Ergebnisse, die für die Größe des nativen Enzyms mittels Ausschlusschromatographie an Superose 6 (Pharmacia) und für die Größe der monomeren Untereinheit auf einem denaturierenden Elektrophoresegel erhalten wurden, beweisen. Der isoelektrische Punkt, der durch Chromatographie an MonoP (Pharmacia) bestimmt wurde, beträgt nahezu 7.
Die Untersuchung des pH und des Optimumpuffers zeigt, daß die Messung der CCR-Aktivität, wie anfänglich beschrieben (Luderitz und Grisebach, 1981), perfekt an die Messung der Eukalyptus-CCR-Aktivität angepasst ist (100 mM Phosphatpuffer, pH 6,25).
Die Reinheit der in einer einzigen Bande auf einem eindimensionalen Elektrophoresegel (SDS-PAGE) vorliegenden CCR wird durch Erhalt eines einzigen Flecks ("Spot") nach zweidimensionaler Elektrophorese und Silberfärbung bestätigt.
III Gewinnung der für Eukalyptus-CCR kodierenden cDNA
Um das mögliche Problem einer restlichen, nicht nachweisbaren Verunreinigung zu lösen, wurde das reine Enzym einer präparativen Elektrophorese unter halbdenaturierenden Bedingungen unterzogen und in situ auf dem Gel gespalten. Die Spaltung erfolgte mit Hilfe von Endolysin C, das die Proteine spezifisch hinter den Lysinresten schneidet, wodurch relativ lange Peptide erhalten werden können. Die aus der Spaltung erhaltenen Peptide wurden mittels Umkehrphasen-HPLC aufgetrennt, und einige von ihnen wurden mit Hilfe einer Protein-Mikrosequenzierapparatur (Applied Biosystems 470) sequenziert. Die Sequenzen dieser internen Peptide sind nachstehend dargestellt:
Peptid 8

(a) Asn-Trp-Tyr-Cys-Tyr-Gly-Lys
(b) His-Leu-Pro-Val-Pro-X-Pro-Pro-Glu-Asp-Ser-Val-Arg wobei X für jede Aminosäure steht

Peptid 10

Thr-Tyr-Ala-Asn-Ser-Val-Gln-Ala-Tyr-Val-His-Val-Lys

Peptid 13

Gly-Cys-Asp-Gly-Val-Val-His-Thr-Ala-Ser-Pro-Val-Thr-Asp-Asp

Peptid 17

Leu-Arg-Asp-Leu-Gly-Leu-Glu-Phe-Thr-Pro-Val-Lys

Peptid 18

Gly-Asp-Leu-Met-Asp-Tyr-Gly-Ser-Leu-Glu-Glu-Ala-Ile-Lys

Die für die CCR kodierende cDNA wurde mittels Durchmusterung einer cDNA-Bank, die im Phagen λ ZAPII (von Stratagene kommerziell erhältlicher Vektor) ausgehend von Boten-Extrakten von Xylem von Eucalyptus gunnii konstruiert wurde, mit Hilfe von Oligonukleotiden erhalten. 600000 Phagen wurden mit Hilfe einer Gruppe von degenerierten Oligonukleotiden durchmustert, die unter Verwendung einer Terminalen Transferase am 3'-Ende mit Phosphor 32 markiert waren. Die Sequenzen der für die Durchmusterung verwendeten Oligonukleotide wurden ausgehend von den obengenannten internen Peptidsequenzen bestimmt. Da diese Peptide durch Spaltung mit Endolysin C erzeugt wurden, wurde ein Lysin wieder an die erste Position gefügt, damit die Erzeugung von Oligonukleotiden mit der geringsten Degeneration möglich war. Tatsächlich gehört diese Aminosäure, die nur von zwei Codons kodiert werden kann, zu den Aminosäuren, deren Code am wenigsten degeneriert ist, und ist folglich zur Erzeugung von Oligonukleotiden ausgehend von Peptidsequenzen sehr gut geeignet.
Die Sequenzen der von den unterstrichenen Aminosäuren (I = Inosin) ableiteten Oligonukleotide, die zur Durchmusterung der Eukalyptus-cDNA-Bank verwendet wurden, sind nachstehend angegeben:
Peptid 8 (a) Lys-Asn-Trp-Tyr-Cys-Tyr-Gly-Lys
Oligonukleotid 8
AA(A/G)AA(C/T)TGGTA(C/T)TG(C/T)TA(T/C)GGIAA
Peptid 13 Lys-Gly-Cys-Asp-Gly-Val-Val-His-Thr-Ala-Ser-Pro-Val-Thr-Asp-Asp
Oligonukleotid 13
AA(G/A)GGITG(C/T)GA(C/T)GGIGTIGTICA
Peptid 17 Lys-Leu-Arg-Asp-Leu-Gly-Leu-Glu-Phe-Thr-Pro-Val-Lys
Oligonukleotid 17
GA(G/A)TT(C/T)ACICCIGTIAA
Peptid 18 Lys-Gly-Asp-Leu-Met-Asp-Tyr-Gly-Ser-Leu-Glu-Glu-Ala-Ile-Lys
Oligonukleotid 18
AA(G/A)GGIGA(C/T)(C/T)TIATGGA(C/T)TA(C/T)GG
Die für die Durchmusterung verwendeten Hybridisierungsbedingungen sind wie folgt: Die Vorhybridisierung erfolgt für 6 bis 7 Stunden in 5 × SSPE, 0,25% Magermilchpulver, 0,05% SDS (Natriumdodecylsulfat) bei 42°C. Die Hybridisierung erfolgt in der gleichen Lösung in Gegenwart von 4 Oligonukleotiden, die am 3'-Ende mit α³²P-ddATP markiert sind, für 24 Stunden bei 42°C. Am Ende dieser 24stündigen Hybridisierung werden die Filter dreimal für 15 Minuten in 2 × SSC, 0,1% SDS gewaschen, dann mit einem autoradiographischen Film für 24 Stunden bei –80°C in Kontakt gebracht. Die Phagen, die mit der Gruppe der Oligonukleotide hybridisierten, wurden durch 2 zusätzliche Durchmusterungsrunden ("Plaquereinigung") gereinigt. Nach der Reinigung wurden die sechs positiven Klone mit jedem der Oligonukleotide unabhängig gestestet. Ein Phage reagierte positiv mit den 4 Oligonukleotiden, er wurde derart behandelt, daß er aus dem rekombinanten Bluescript-Plasmid gemäß den Angabe des Herstellers (Stratagene) "ausgeschnitten" wurde. Die Restriktionskarte des in diesem Plasmid enthaltenen Inserts (das die CCR kodiert) ist in 1 schematisch dargestellt.
IV Charakterisierung und Identifizierung der cDNA der CCR
Die Aminosäuresequenz (gemäß SEQ ID Nr. 2), die von der Nukleotidsequenz (gemäß SEQ ID Nr. 1) abgeleitet wurde, kodiert für ein Protein von 335 Aminosäure, dessen Molekulargewicht 36,5 kD und dessen isoelektrischer Punkt etwa 5,8 beträgt. Es soll darauf hingewiesen werden, daß alle ausgehend von der gereinigten CCR erhaltenen Peptidsequenzen in der Peptidsequenz wiedergefunden wurden, die von der Nukleotidsequenz der cDNA abgeleitet wurde.
Suchen nach Homologien mit bereits bestehenden Klonen wurden unter Verwendung der Programme BLAST und FASTA in allen verfügbaren Protein- und Nukleinsäurebanken durchgeführt. Eine signifikante Homologie wurde mit einer anderen Reduktase des Stoffwechsels von Phenolverbindungen, der Dihydroflavonolreduktase (DFR), gefunden. Zwischen der von der cDNA von CCR abgeleiteten Peptidsequenz und den Sequenzen der verschiedenen in den Banken aufgeführten Ddihydroflavonolreduktasen beträgt die Identität etwa 40% und die Ähnlichkeit nahe 20%, was bestätigt, daß der identifizierte Klon kein Klon ist, der für eine DFR kodiert.
V Produktion von aktiver rekombinanter CCR in E. coli
Um mit der Identifikation der cDNA der CCR fortzufahren, wurde das rekombinante Protein in E. coli produziert und seine enzymatische Aktivität untersucht. Die experimentellen Einzelheiten dieses Ansatzes sind nachstehend beschrieben.
1 – Einbringen der cDNA in den Expressionsvektor pT7-7
Um die cDNA in den (kommerziell erhältlichen) Expressionsvektor pT7-7 unter der Kontrolle des T7-Polymerase-Promotors einbringen zu können, mussten wir eine Nde1-Stelle an der Position des ATG der cDNA einführen. Dies erfolgte unter Verwendung von Taq-Polymerase bei einer Genamplifikationsreaktion mittels PCR (Polymerasekettenreaktion) zwischen einem mutierten Oligonukleotid und einem kommerziell erhältlichen Primer, T7, der sich auf Bluescript stromabwärts des 3'-Endes der cDNA befindet. Das erhaltene Amplifikationsprodukt wird mit Kpn1 gespalten, diese Stelle wird anschließend mit Hilfe des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I repariert, bevor das Fragment einer Spaltung durch Nde1 unterworfen wird, dann wird das erhaltene, eine Nde1-Stelle an 5' und ein glattes Ende an 3' umfassende Fragment unter Verwendung von T4-DNA-ligase in den Vektor pT7-7, der zuvor mit Nde1 und Sma1 geöffnet wurde, insertiert.
Die Sequenz des obengenannten mutierten Oligonukleotids ist nachstehend angegeben.
Die unterstrichenen und kursiven Basen wurden im Vergleich zu der Ausgangssequenz modifiziert, wodurch eine Nde1-Stelle (CATATG) erhalten werden konnte:
5'GGCAATCCCCATATGCCCGTCGACGC3'
2. Überexpression von CCR in E. coli BL21
Die so erhaltene Konstruktion wird in den (kommerziell erhältlichen) Stamm E. coli BL21 eingebracht, der auf seinem Chromosom das Gen der T7-Polymerase unter der Kontrolle des Promotors lac UV5, der durch IPTG induzierbar ist, trägt. Die rekombinante Kultur wird bei 37°C bis zum Erhalt einer bei 600 nm gemessenen OD von 1 gezüchtet, dann wird die CCR-Produktion durch Zugabe von IPTG (0,25% Endkonzentration) in das Kulturmedium induziert. Proben werden zu verschiedenen Zeiten nach Induktion entnommen, und die Zellen werden gemäß dem von Grima-Pettenati et al. (1993) beschriebenen Protokoll lysiert. Nach Zentrifugation wird der Überstand, der die löslichen Protein enthält, zum Messen der CCR-Aktivität und zum Sichtbarmachen der Produktion von CCR nach Elektrophorese unter denaturierenden Bedingungen verwendet. In 2 erkennt man das Auftreten eines Polypeptids von etwa 38 kD, dessen Intensität mit der Zeit nach Induktion zunimmt und das nicht in den negativen Kontrollen (Stamm BL21, der nur den Vektor pT7-7 ohne Insert enthält) vorhanden ist. Außerdem wird der endgültige Beweis für die Identität des CCR-Klons durch Messung einer CCR-Aktivität (etwa 7 nKat/ml Kultur nach 3 Stunden Induktion bei 37°C) in den Proteinextrakten erbracht, die von BL21-Stämmen stammen, die nur pT7-7 + CCR-cDNA enthalten.
Legenden der Figuren
1: Restriktionskarte der für Eukalyptus-CCR kodierenden cDNA.
2: Entwicklung eines Elektrophoresegels unter denaturierenden Bedingungen (SDS-PAGE) von Gesamtproteinextrakten von E. coli BL21, die den Vektor pT7-7 ohne Insert (Spur 6 zum Zeitpunkt 0 der Induktion mit IPTG; 7, 3 Stunden nach Induktion) und den Vektor pT7-7, der die cDNA der CCR enthielt (Spuren 1, 2, 3, 4 bzw. 5, Zeitpunkt 0 der Induktion, 30 min, 1, 2, 3 Stunden nach Induktion), enthielten, mit Coomassie Blue, wobei der Pfeil das CCR-Monomer zeigt.
3: Schematische Darstellung des Plasmids pEUCCR, das die durch SEQ ID Nr. 1 dargestellte (und durch CCR im Plasmid pEUCCR angegebe) Sequenz enthält.
4: Schematische Darstellung der Konstruktion eines Vektors, der eine DNA-Sequenz enthält, die für die erfindungsgemäße Eukalyptus-CCR kodiert (auch Sense-CCR-Vektor).
5: Schematische Darstellung der Konstruktion eines Vektors, der eine DNA-Sequenz enthält, die für eine Antisense-RNA kodiert, die mit der erfindungsgemäßen mRNA, die für Eukalyptus-CCR kodiert, zu hybridisieren vermag (auch Antisense-CCR-Vektor).
Die zur Konstruktion eines Antisense- (oder Sense-) Vektors dienende "Quellen-DNA"
Die Antisense-RNA ist vorzugsweise von der im Klon pEUCCR enthaltenen Sequenz abgeleitet. Diese Sequenz kann auf unterschiedliche Weisen erhalten werden:

1) Durch Schneiden der in pEUCCR enthaltenen DNA-Sequenz (cDNA) der CCR mit geeigneten Restriktionsenzymen,
2) mittels Durchführen einer Genamplifikation (PCR) mit Hilfe von Oligonukleotiden, die derart gestaltet wurden, daß das gewünschte DNA-Fragment synthetisiert wird.

Das so erhaltene DNA-Fragment wird in einen Pflanzenexpressionsvektor stromabwärts von einem Promotor und stromaufwärts von einem Terminator kloniert. Die Klonierung erfolgt derart, daß das DNA-Fragment in umgekehrter Orientierung in Bezug auf den Promotor insertiert wird. In diesem neuen Vektor wird der Strang, der zu Beginn der Matrizenstrang war, zum kodierenden Strang, und umgekehrt.
Der neue Vektor kodiert eine RNA, deren Sequenz zu der Sequenz der Boten-RNA ist, die von der in pEUCCR enthaltenen Sequenz abgeleitet ist, komplementär ist.
Somit sind die 2 RNAs nicht nur in ihrer Sequenz, sondern auch in ihrer Orientierung (5'-3') komplementär.
Als Quelle für die DNA für die Transkription der Antisense-RNA wird praktischerweise ein cDNA-Klon, wie der in pEUCCR enthaltene, verwendet.
Klonierungsbeispiel (vgl. 5)
Die cDNA der CCR wird durch eine doppelte Spaltung (BamHI und KpnI) ausgehend von dem Vektor pEUCCR erhalten. Das so freigesetzte DNA-Fragment wird durch eine Agarosegelelektrophorese von dem Klonierungsvektor (Bluescript) physikalisch getrennt.
Der Teil des Gels, der dieses DNA-Fragment enthält, wird ausgeschnitten und derart behandelt, daß die gereinigte DNA erhalten wird (mehrere Verfahren können verwendet werden, darunter die "Low melting Agarose", die im obengenannten Sambrook et al. beschrieben ist, und Gene Clean, für das ein Kit kommerziell erhältlich ist).
Das die BamHI- und KpnI-Enden tragende Fragment wird mit einem Pflanzenexpressionsvektor, der zuvor durch die gleichen ausgewählten Enzyme gespalten worden ist, derart "ligiert", daß die cDNA in umgekehrter Orientierung in Bezug auf den ³⁵S-Promotor insertiert wird. Der Strang, der in Pflanzen transkribiert wird, ist in diesem Fall der nichtkodierende Strang.
Klonierungsbeispiel (vgl. 4)
In diesem Fall gibt es keine "praktischen" Restriktionsstellen, um eine herkömmliche Fusion mit dem ³⁵S-Promotor des Expressionsvektors durchzuführen. Neue, geeignetere Stellen wurden mit Hilfe der Genamplifikationstechnik (PCR) insertiert. Zwei Oligonukleotide wurden 5' und 3' der cDNA gestaltet, an die die Sequenzen für die von KpnI und BamHI erkannten Stellen angefügt wurden (Bem.: dies sind die gleichen Stellen, die für die obengenannte Antisense-Klonierung verwendet wurden, aber in Bezug auf die 5'-3'-Orientierung anders positioniert).
Die Genamplifikation führt zum Erhalt eines Fragments, das die Gesamtheit der Kodiersequenz für die cDNA, flankiert von 2 Restriktionsstellen, kodiert. Das folgende Verfahren ist identisch mit dem für die Antisense-Konstruktion beschriebenen.
In diesem Fall führt man jedoch eine Fusion des Promotors im Leserahmen mit dem ATG der CCR durch, die zu einer Überexpression der Boten-RNA und somit des CCR-Proteins führen muss.
B) Gewinnung der für Pappel-CCR kodierenden cDNA
Die cDNA wurde mittels Durchmusterung einer im Phagen lambda ZAPII (Stratagene) konstruierten cDNA-Bank ausgehend von Botenextrakten von Xylemen von 2 Jahre alten Pappeln (Populus trichocarpa) erhalten. Die Phagen wurden mit Hilfe der aus Eucalyptus gunnii (XhoI-Fragment von 804 bp aus pEUCCR) isolierten cDNA, die mittels Random Priming mit α³²P-dCTP markiert wurde, durchmustert.
Die zur Durchmusterung verwendeten Hybridisierungsbedingungen waren wie folgt:
Die Vorhybridisierung erfolgt für eine Nacht bei 68°C in 6 × SSC, 5 × Denhardt, 0,5% SDS, 100 μg Lachssperma-DNA. Die Hybridisierung wird im gleichen Puffer ohne Zugabe des Denhardt-Reagenzes für eine Nacht bei 60°C durchgeführt. Die Membrane werden dann 2-mal für 30 Minuten in 0,1 × SSC, 0,5% SDS bei 60°C gewaschen.
Ein Klon, der die vollständige cDNA enthielt, wurde gereinigt, subkloniert und in beiden Richtungen sequenziert. Die cDNA-Sequenz ist diejenige gemäß SEQ ID Nr. 3, und die abgeleitete Aminosäuresequenz der letzteren ist diejenige gemäß SEQ ID Nr. 4.
Der Vergleich zwischen den Aminosäuresequenzen der Eukalyptus-CCR und der Pappel zeigen eine Identität von 83% und eine Homologie von 93% zwischen diesen zwei Sequenzen.
C) Gewinnung der für Schwingel-CCR kodierenden cDNA
Die cDNR wurde mittels Durchmusterung einer im Phagen lambda ZAPII (Stratagene) ausgehend von Botenextrakten von Blättern von Festuca arundinacea konstruierten cDNA-Bank erhalten. 500000 Phagen wurden mit Hilfe der aus Eucalyptus gunnii (XhoI-Fragment von 804 bp aus pEUCCR) isolierten cDNA, die mittels Random Priming mit α³²p-dCTP markiert wurde, durchmustert.
Die zur Durchmusterung verwendeten Hybridisierungsbedingungen waren wie folgt:
Die Vorhybridisierung erfolgt für 6 Stunden in 5 × SSPE, 0,5% SDS, 0,1 mg/ml Lachssperma-DNA, 1 mg/ml Ficoll Typ 400, 1 mg/ml Polyvinylpyrrolidon, 1 mg/ml BSA bei 60°C. Die Hybridisierung wird im gleichen Puffer in Gegenwart der mit α³²p-dCTP markierten Sonde für 16 Stunden bei 60°C durchgeführt. Die Filter werden dann 2-mal für 15 Minuten in 2 × SSPE, 0,1% SDS bei 60°C und dann 2-mal in 0,5 × SSPE, 0,1% SDS bei 60°C gewaschen und schließlich für 3 Tage bei –80°C mit einem autoradiographischen Film in Kontakt gebracht. Die Phagen wurden durch 2 oder 3 zusätzliche Durchmusterungsrunden gereinigt.
Nach der Reinigung wurden 3 Klone analysiert, nachdem das Plasmid pBluescript nach den Angaben des Herstellers (Stratagene) geschnitten wurde.
Die Sequenzierung ermöglichte es, einen Klon auszuschließen und zu zeigen, daß die übrigen 2 Klone identisch waren und der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 5 entsprachen, die für Schwingel-CCR gemäß SEQ ID Nr. 6 codiert.
D) Gewinnung der für Tabak-CCR kodierenden cDNA
Die cDNA wurde mittels Durchmusterung einer im Phagen lambda ZAPII (Stratagene) ausgehend von Botenextrakten von Tabakstängeln konstruierten cDNA-Bank erhalten. Die Phagen wurden mit Hilfe der aus Eucalyptus gunnii (XhoI-Fragment von 804 bp aus pEUCCR) isolierten cDNA, die mittels Random Priming mit α³²p-dCTP markiert wurde, durchmustert.
Die für die Durchmusterung verwendeten Hybridisierungsbedingungen waren wie folgt:
Die Vorhybridisierung erfolgt in 0,25% Marvel, 5 × SSPE, 0,05% SDS bei 58°C. Die Hybridisierung erfolgt im gleichen Puffer in Gegenwart von 50 ng einer mit α³²p-dCTP markierten Sonde bei 58°C. Die Filter werden dann mit 2 × SSC/0,1% SDS für 20 Minuten bei Umgebungstemperatur, 2 × SSC/0,1% SDS für 20 Minuten bei 58°C, 1 × SSC/0,1% SDS für 15 Minuten bei 58°C gewaschen.
Das Plasmid pBluescript SK^–, das den (unter Verwendung von EcoR1-Adaptoren in die EcoR1-Stelle klonierten) cDNA-Klon enthielt, wurde in vivo geschnitten.
Die erhaltene cDNA ist diejenige gemäß SEQ ID Nr. 7, und die abgeleitete Aminosäuresequenz dieser cDNA ist diejenige gemäß SEQ ID Nr. 8.

Claims

Verwendung von rekombinanten Nukleotidsequenzen, die eine oder mehrere Kodierregion(en) enthalten, wobei diese Kodierregion(en) folgendermaßen zusammengesetzt ist/sind: a) aus einer Nukleotidsequenz, die für eine Boten-RNA (mRNA) kodiert, wobei diese mRNA wiederum für eine Cinnamoyl-CoA-Reduktase (CCR) in Pflanzen kodiert, oder einer Nukleotidsequenz, die sich von der obengenannten Nukleotidsequenz insbesondere durch Mutation und/oder Addition, und/oder Suppression und/oder Substitution von einem oder mehreren Nukleotiden ableitet, wobei diese abgeleitete Sequenz für eine mRNA kodiert, wobei diese mRNA wiederum für ein abgeleitetes Protein, das CCR-Aktivität aufweist, kodiert, oder b) aus einer Nukleotidsequenz, die zu der für eine mRNA kodierenden Nukleotidsequenz oder zu der von letzterer abgeleiteten Sequenz wie in a) definiert komplementär ist, wobei die komplementäre Sequenz für eine Antisense-mRNA, die mit einer der obengenannten mRNAs zu hybridisieren vermag, kodiert, wobei sich diese Hybridisierung dahingehend auswirkt, daß die CCR-Synthese gehemmt wird, für die Transformation von pflanzlichen Zellen zwecks Gewinnung von transgenen Pflanzen, in denen die Ligninsynthese im Vergleich zu den normalen von den Pflanzen produzierten Ligningehalten entweder in Form einer Erhöhung oder in Form einer Erniedrigung der produzierten Ligningehalte reguliert ist.
Verwendung von rekombinanten Nukleotidsequenzen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Kodierregion die Gesamtheit oder einen Teil einer Nukleotidsequenz, die aus den folgenden Sequenzen ausgewählt ist, enthalten: – die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 1, die für eine mRNA kodiert, wobei die mRNA wiederum für die Eukalyptus-CCR gemäß SEQ ID Nr. 2 kodiert, – die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 3, die für eine mRNA kodiert, wobei die mRNA wiederum für die Pappel-CCR gemäß SEQ ID Nr. 4 kodiert, – die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 5, die für eine mRNA kodiert, wobei die mRNA wiederum für die Schwingel-CCR gemäß SEQ ID Nr. 6 kodiert, – die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 7, die für eine mRNA kodiert, wobei die mRNA wiederum für die Tabak-CCR gemäß SEQ ID Nr. 8 kodiert, – die zu der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 7 komplementäre Nukleotidsequenz, wobei die Komplementärsequenz für eine Antisense-mRNA, die mit der von den Sequenzen SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5 bzw. SEQ ID Nr. 7 kodierten mRNA zu hybridisieren vermag, kodiert, wobei sich diese Hybridisierung dahingehend auswirkt, daß die CCR-Synthese gehemmt wird, – die von der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 7 insbesondere durch Mutation und/oder Addition, und/oder Suppression und/oder Substitution von einem oder mehreren Nukleotiden abgeleitete Nukleotidsequenz, wobei diese abgeleitete Sequenz entweder für eine mRNA, die selbst wiederum für die CCR gemäß SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 6 bzw. SEQ ID Nr. 8 kodiert, oder für ein von letzteren abgeleitetes Protein, das eine CCR-Aktivität in Pflanzen aufweist, kodiert, insbesondere die von SEQ ID Nr. 1 abgeleitete Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 9, wobei letztere für eine mRNA kodiert, die selbst wiederum für ein Protein gemäß SEQ ID Nr. 10 kodiert, welches von der obengenannten Eukalyptus-CCR abgeleitet ist, – die Nukleotidsequenz, die von der obengenannten komplementären Nukleotidsequenz durch Mutation und/oder Addition und/oder Suppression und/oder Substitution von einem oder mehreren Nukleotiden abgeleitet ist, wobei diese abgeleitete Sequenz für eine Antisense-mRNA kodiert, die mit einer der obengenannten mRNAs zu hybridisieren vermag, wobei sich diese Hybridisierung dahingehend auswirkt, daß die CCR-Synthese gehemmt wird.
DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Kodierregion folgendes umfaßt: – die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 1, die für eine mRNA kodiert, wobei die mRNA wiederum für die CCR gemäß SEQ ID Nr. 2 kodiert, oder – die von SEQ ID Nr. 1 abgeleitete Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 9, wobei letztere für eine mRNA kodiert, wobei die mRNA wiederum für ein von der Eukalyptus-CCR abgeleitetes Protein gemäß SEQ ID Nr. 10 kodiert.
DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Kodierregion die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 3, die für eine mRNA kodiert, wobei diese mRNA wiederum für die CCR gemäß SEQ ID Nr. 4 kodiert, enthält.
DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Kodierregion die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 5, die für eine mRNA kodiert, wobei diese mRNA wiederum für die CCR gemäß SEQ ID Nr. 6 kodiert, enthält.
DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Kodierregion die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 7, die für eine mRNA kodiert, wobei diese mRNA wiederum für die CCR gemäß SEQ ID Nr. 8 kodiert, enthält.
DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Kodierregion die Nukleotidsequenz, die zu der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 komplementär ist, wobei diese komplementäre Sequenz für eine AntisensemRNA kodiert, die mit der mRNA, die selbst wiederum für die CCR gemäß SEQ ID Nr. 2 kodiert, nämlich der mRNA, die von der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 kodiert wird, zu hybridisieren vermag, oder die Nukleotidsequenz, die zu der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 9 komplementär ist, wobei diese Sequenz für eine Antisense-mRNA kodiert, die mit der obengenannten mRNA zu hybridisieren vermag, wobei sich diese Hybridisierung dahingehend auswirkt, daß die CCR-Synthese gehemmt wird, enthält.
DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Kodierregion die Nukleotidsequenz, die zu der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 3 komplementär ist, enthält, wobei diese komplementäre Sequenz für eine Antisense-mRNA kodiert, die mit der mRNA, die selbst wiederum für die CCR gemäß SEQ ID Nr. 4 kodiert, nämlich der mRNA, die von der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 3 kodiert wird, zu hybridisieren vermag, wobei sich diese Hybridisierung dahingehend auswirkt, daß die CCR-Synthese gehemmt wird.
DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Kodierregion die Nukleotidsequenz, die zu der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 5 komplementär ist, enthält, wobei diese komplementäre Sequenz für eine Antisense-mRNA kodiert, die mit der mRNA, die selbst wiederum für die CCR gemäß SEQ ID Nr. 6 kodiert, nämlich der mRNA, die von der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 5 kodiert wird, zu hybridisieren vermag, wobei sich diese Hybridisierung dahingehend auswirkt, daß die CCR-Synthese gehemmt wird.
DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Kodierregion die Nukleotidsequenz, die zu der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 7 komplementär ist, enthält, wobei diese komplementäre Sequenz für eine Antisense-mRNA kodiert, die mit der mRNA, die selbst wiederum für die CCR gemäß SEQ ID Nr. 8 kodiert, nämlich der mRNA, die von der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 7 kodiert wird, zu hybridisieren vermag, wobei sich diese Hybridisierung dahingehend auswirkt, daß die CCR-Synthese gehemmt wird.
mRNA, die von einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 3 bis 10 kodiert wird, insbesondere: – die mRNA, die von der DNA-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 kodiert wird, wobei diese mRNA wiederum für die beim Eukalyptus vorhandene CCR gemäß SEQ ID Nr. 2 zu kodieren vermag, – die von der DNA-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 9 kodierte mRNA, wobei die mRNA wiederum für ein von der Eukalyptus-CCR abgeleitetes Protein gemäß SEQ ID Nr. 10 zu kodieren vermag, – die mRNA, die von der DNA-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 3 kodiert wird, wobei diese mRNA wiederum für die in der Pappel vorhandene CCR gemäß SEQ ID Nr. 4 zu kodieren vermag, – die mRNA, die von der DNA-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 5 kodiert wird, wobei diese mRNA wiederum für die beim Schwingel vorhandene CCR gemäß SEQ ID Nr. 6 zu kodieren vermag, – die mRNA, die von der DNA-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 7 kodiert wird, wobei diese mRNA wiederum für die beim Tabak vorhandene CCR gemäß SEQ ID Nr. 8 zu kodieren vermag.
Antisense-mRNA, dadurch gekennzeichnet, daß sie Nukleotide enthält, die zu Nukleotiden komplementär sind, welche eine mRNA gemäß Anspruch 11 darstellen, und dadurch, daß sie mit letzterer zu hybridisieren vermag, wobei sich diese Hybridisierung dahingehend auswirkt, daß die CCR-Synthese gehemmt wird.
Komplex, der zwischen einer Antisense-mRNA gemäß Anspruch 12 und einer mRNA gemäß Anspruch 11 gebildet wird.
Rekombinante Nukleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 3 bis 6 enthält, die für eine mRNA zu kodieren vermag, die selbst wiederum für eine CCR bei Pflanzen zu kodieren vermag, wobei die Sequenz nach einem der Ansprüche 3 bis 6 in eine heterologe Sequenz insertiert ist.
Rekombinante Nukleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens eine komplementäre DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 7 bis 10 enthält, die in eine heterologe Sequenz insertiert ist, wobei die komplementäre DNA-Sequenz für eine Antisense-mRNA kodiert, die mit der mRNA, die für eine CCR bei Pflanzen kodiert, zu hybridisieren vermag, wobei sich diese Hybridisierung dahingehend auswirkt, daß die CCR-Synthese gehemmt wird.
Nukleotidsequenz nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß sie die für die Regelung der Expression der Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 3 bis 6, seiner komplementären Sequenz nach einem der Ansprüche 7 bis 10, erforderlichen Elemente, insbesondere einen Promoter und einen Terminator für die Transkription dieser Sequenzen, gegebenenfalls mindestens eine DNA-Sequenz, die für die Gesamtheit oder einen Teil eines Enzyms, bei dem es sich nicht um die CCR handelt und das an einem Ligninbiosyntheseschritt bei Pflanzen beteiligt ist, kodiert, insbesondere die mRNA, die selbst wiederum für die Cinnamylalkoholdehydrogenase (CAD) kodiert, oder mindestens eine Sequenz, die für die Gesamtheit oder einen Teil der Antisense-mRNA, die mit der obengenannten mRNA, insbesondere mit der für die CAD kodierenden mRNA, zu hybridisieren vermag, kodiert, umfaßt.
Rekombinanter Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er eine rekombinante Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 14 bis 16 in einen der Orte seines Genoms, die nicht für seine Replikation wesentlich sind, integriert enthält.
Verfahren für die Regulation der Ligninbiosynthese bei Pflanzen durch Erniedrigung oder Erhöhung der produzierten Ligningehalte im Vergleich zu den normalen Ligningehalten, die von den Pflanzen produziert werden, wobei dieses Verfahren einen Schritt umfaßt, bei dem Zellen dieser Pflanzen mit Hilfe eines Vektors transformiert werden, der folgendes umfaßt: a) eine Nukleotidsequenz, die für eine Boten-RNA (mRNA) kodiert, wobei diese mRNA wiederum für eine CCR in Pflanzen kodiert, oder eine Nukleotidsequenz, die sich von der obengenannten Nukleotidsequenz insbesondere durch Mutation und/oder Addition und/oder Suppression und/oder Substitution von einem oder mehreren Nukleotiden ableitet, wobei diese abgeleitete Sequenz für eine mRNA kodiert, wobei diese mRNA wiederum für ein abgeleitetes Protein, das CCR-Aktivität aufweist, kodiert, oder b) eine Nukleotidsequenz, die zu der für eine mRNA kodierende Nukleotidsequenz oder zu der von letzterer abgeleiteten Sequenz wie in a) definiert komplementär ist, wobei die komplementäre Sequenz für eine AntisensemRNA, die mit einer der obengenannten mRNAs zu hybridisieren vermag, kodiert, wobei sich diese Hybridisierung dahingehend auswirkt, daß die CCR-Synthese gehemmt wird, insbesondere mit Hilfe eines Vektors nach Anspruch 17.
Verfahren zur Erniedrigung der Ligninbiosynthese bei Pflanzen und daher zur Erniedrigung der im Vergleich zu den normalen von den Pflanzen produzierten Ligningehalten produzierten Ligningehalte, dadurch gekennzeichnet, daß es durch Transformation des Genoms dieser Pflanzen durchgeführt wird, wobei folgendes in diese eingebracht wird: – mindestens eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 7 bis 10, – und gegebenenfalls mindestens eine DNA-Sequenz, die für ein Enzym, bei dem es sich nicht um die CCR handelt und das an einem Ligninbiosyntheseschritt bei Pflanzen beteiligt ist, kodiert, insbesondere die mRNA, die für die CAD kodiert, wobei diese Transformation – entweder mit Hilfe eines rekombinanten Vektors nach Anspruch 17, der eine rekombinante Nukleotidsequenz nach Anspruch 15 oder 16 enthält, – oder mit Hilfe von mehreren rekombinanten Vektoren, von denen mindestens einer eine rekombinante Nukleotidsequenz nach Anspruch 15 enthält, während der andere rekombinante Vektor, bzw. die anderen rekombinanten Vektoren, der bzw. die eine DNA-Sequenz enthält bzw. enthalten, die für eine Antisense-mRNA kodiert, die mit einer mRNA, die für ein Enzym, bei dem es sich nicht um die CCR wie oben definiert handelt, kodiert, zu hybridisieren vermag, durchgeführt wird.
Verfahren zur Erniedrigung der Ligninbiosynthese bei Pflanzen und daher zur Erniedrigung der im Vergleich zu den normalen von den Pflanzen produzierten Ligningehalten produzierten Ligningehalte, dadurch gekennzeichnet, daß es durch Transformation des Genoms dieser Pflanzen durchgeführt wird, wobei folgendes in diese eingebracht wird: – mindestens eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 3 bis 6, – und gegebenenfalls mindestens eine DNA-Sequenz, die für die Gesamtheit oder einen Teil eines Enzyms, bei dem es sich nicht um die CCR handelt und das an einem Ligninbiosyntheseschritt bei Pflanzen beteiligt ist, kodiert, insbesondere eine DNA-Sequenz, die für die Gesamtheit oder einen Teil der CAD kodiert, wobei diese Transformation – entweder mit Hilfe eines rekombinanten Vektors nach Anspruch 17, der eine rekombinante Nukleotidsequenz nach Anspruch 14 oder 16 enthält, – oder mit Hilfe von mehreren rekombinanten Vektoren, von denen mindestens einer eine rekombinante Nukleotidsequenz nach Anspruch 14 enthält, während der andere rekombinante Vektor, bzw. die anderen rekombinanten Vektoren eine DNA-Sequenz, die für die Gesamtheit oder einen Teil eines Enzyms, bei dem es sich nicht um die CCR wie oben definiert handelt, kodiert, enthält/enthalten, durchgeführt wird.
Verfahren zur Erhöhung der Ligninbiosynthese bei Pflanzen und daher zur Erhöhung der im Vergleich zu den normalen von den Pflanzen produzierten Ligningehalten produzierten Ligningehalte, dadurch gekennzeichnet, daß es durch Transformation des Genoms dieser Pflanzen durchgeführt wird, wobei folgendes in diese eingebracht wird: – mindestens eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 3 bis 6, – und gegebenenfalls mindestens eine DNA-Sequenz, die für ein Enzym, bei dem es sich nicht um die CCR handelt und das an einem Ligninbiosyntheseschritt bei Pflanzen beteiligt ist, kodiert, insbesondere eine DNA-Sequenz, die für die CAD kodiert, wobei diese Transformation – entweder mit Hilfe eines rekombinanten Vektors nach Anspruch 17, der eine rekombinante Nukleotidsequenz nach Anspruch 14 oder 16 enthält, – oder mit Hilfe von mehreren rekombinanten Vektoren, von denen mindestens einer eine rekombinante Nukleotidsequenz nach Anspruch 14 enthält, während der andere rekombinante Vektor, bzw. die anderen rekombinanten Vektoren eine DNA-Sequenz enthält bzw. enthalten, die für die Gesamtheit oder einen Teil eines Enzyms, bei dem es sich nicht um die CCR wie oben definiert handelt, kodiert. durchgeführt wird.
Pflanzen oder Pflanzenteile, insbesondere Zellen, Früchte, Samen, Pollen, die dadurch transformiert wurden, daß man in ihr Genom mindestens eine Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 3 bis 10 einbringt.
Rekombinante Polypeptide, insbesondere rekombinante CCR, gemäß SEQ ID Nr. 2; SEQ ID Nr. 4; SEQ ID Nr. 6 oder SEQ ID Nr. 8, die dadurch erhalten wurden, daß man pflanzliche Zellen dadurch transformiert, daß man eine rekombinante Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 14 bis 16, insbesondere mit Hilfe eines Vektors nach Anspruch 17, stabil in ihr Genom einbringt. SEQUENZPROTOKOLL