DE60037123T2 - Mittel und verfahren zur veränderung der genexpression mittels nicht-polyadenylierter rna - Google Patents

Mittel und verfahren zur veränderung der genexpression mittels nicht-polyadenylierter rna Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft Verfahren zum Verringern der phänotypischen Expression einer Nucleinsäure von Interesse in Pflanzenzellen durch Zuführen von nicht-polyadenylierten RNA-Molekülen, welche mindestens eine zielspezifische Nucleotidsequenz umfassen, die homolog zum Sense-Strang der Nucleinsäure von Interesse ist, in den Kern von Pflanzenzellen. Die zielspezifischen nicht-polyadenylierten RNA-Moleküle können durch Einführen von chimären DNAs bereitgestellt werden, welche, wenn sie unter der Kontrolle eines konventionellen Promotors und Bereichen für die Bildung der 3'-Ende- und der Polyadenylierung transkribiert werden, RNA-Moleküle ergeben, bei denen mindestens das Polyadenylierungssignal durch die autokatalytische Aktivität eines selbst-spleißenden Ribozyms entfernt werden kann, welches innerhalb der transkribierten RNA-Moleküle enthalten ist. Es werden auch Pflanzenzellen bereitgestellt, welche derartige RNA-Moleküle oder chimäre DNAs umfassen, die solche RNA-Moleküle codieren, ebenso wie Pflanzen. Es werden ähnliche Verfahren und Mittel zum Verringern der phänotypischen Expression einer Nucleinsäure durch Co-Suppression in eukaryontischen Zellen bereitgestellt.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Post-transkriptionelles Gen-Silencing (PTGS) oder Co-Suppression ist ein häufig zu beobachtendes Phänomen in Verbindung mit Transgenen in transgenen Pflanzen. PTGS führt zu einem Sequenz-spezifischen Entfernen der von Silencing betroffenen RNA ebenso wie RNA von homologen endogenen Genen oder viraler RNA. Es ist durch niedrige stationäre Spiegel von mRNA gekennzeichnet, während normale (üblicherweise hohe) Raten der nukleären Transkription der Transgene aufrechterhalten werden. Es gibt eine Reihe von häufig zu beobachtenden Merkmale oder Charakteristika für PTGS. PTGS ist
    • i) Sequenz-spezifisch
    • ii) systemisch übertragbar
    • iii) oft mit der Anwesenheit von mehreren Kopien der Transgene oder mit der Verwendung starker Promotoren assoziiert
    • iv) häufig mit der Anwesenheit sich wiederholender DNA-Strukturen korreliert, einschließlich Inverted-Repeat-Mustern von T-DNA-Insertionen
    • v) oft begleitet von de novo DNA-Methylierung in der transkribierten Region und
    • vi) kann meiotisch zurückgestellt werden.
  • Man hat eine Reihe hypothetischer Modelle vorgeschlagen, um PTGS zu erklären (siehe z. B. Wassenegger und Pélissier, 1998). Üblicherweise legen diese Modelle die Beteiligung eines Wirts-codierten Enzyms (der RNA-gesteuerten RNA-Polymerase (RdRP)) nahe, die dem Vorschlag zufolge abweichende RNA als Matrize verwenden, um Kopien kleiner RNA-Moleküle (cRNA) zu synthesieren. Die cRNAs würden dann mit der Ziel-mRNA hybridisieren, um Duplexstrukturen auszubilden, wodurch sie die mRNA gegenüber einem Abbau durch Endoribonucleasen anfällig machen. Bis heute hat es keinen direkten Beweis dafür gegeben, dass RdRP bei PTGS in Pflanzen eine Rolle spielt.
  • Eine wichtige Frage, die sich aus den vorliegenden Modellen ableitet, ist welche Art von RNA die abweichende RNA ist, die von RdRP als eine Matrize verwendet werden würde, und in welchem zellulären Kompartiment RdRP arbeiten würde.
  • Mehrere Berichte haben die Anhäufung unproduktiver oder nicht-polyadenylierter Transgen-RNA in Pflanzen beschrieben, die einem post-transkriptionellen Silencing unterworfen sind (Lee et al., 1997; van Eldik et al., 1998; Covey et al., 1997; van Houdt et al., 1997; Metzlaff et al., 1997).
  • Die folgenden Schriftstücke beziehen sich auf Verfahren und Mittel, um die Genexpression in einer Zelle zu regulieren oder zu hemmen.
  • US 5,190,131 und EP 0 467 349 A1 beschreiben Verfahren und Mittel zur Regulierung oder Hemmung der Genexpression in einer Zelle durch Einbau in oder durch Bindung an das genetische Material der Zelle einer nicht-nativen Nucleinsäuresequenz, welche transkribiert wird, um eine mRNA zu produzieren, die komplementär zu der mRNA ist, die von dem genetischen Material dieser Zelle erzeugt worden ist, und die in der Lage ist, an diese zu binden.
  • EP 0 223 399 A1 beschreibt Verfahren um nützliche somatische Veränderungen in Pflanzen herbeizuführen, indem man in den Pflanzenzellen die Transkription negativer RNA-Stränge auslöst, die im Wesentlichen komplementär zu einem Ziel-RNA-Strang sind. Der Ziel-RNA-Strang kann ein mRNA-Transkript sein, das durch Genexpression erzeugt worden ist, eine virale RNA, oder eine andere RNA, die in den Pflanzenzellen vorliegt. Der Negativstrang der RNA ist komplementär zu mindestens einem Teil des Ziel-RNA-Strangs, um dessen Aktivität in vivo zu hemmen.
  • EP 0 240 208 beschreibt ein Verfahren um die Expression von Genen zu regulieren, die in Pflanzenzellgenomen codiert sind, was durch die Integration eines Gens unter der transkriptionellen Kontrolle eines Promotors erreicht wird, der in dem Wirt funktionsfähig ist, und in dem der transkribierte Strang der DNA komplementär zu dem Strang der DNA ist, der von dem (den) endogenen Gen(en) transkribiert wird, die man regulieren möchte.
  • EP 0 647 715 A1 und die US-Patente 5,034,323 , 5,231,020 und 5,283,184 beschreiben Verfahren und Mittel um Pflanzen zu erzeugen, die erwünschte phänotypische Eigenschaften zeigen, indem Transgenoten ausgewählt werden, welche ein DNA-Segment umfassen, das funktionell mit einem Promotor verknüpft ist, wobei Transkriptionsprodukte des Segments im Wesentlichen homolog zu entsprechenden Transkripten von endogenen Genen sind, insbesondere zu endogenen Genen des Flavonoid-Biosynthese-Signalwegs.
  • Waterhouse et al., 1998 beschreiben, dass Resistenz gegenüber Viren und Gen-Silencing in Pflanzen durch gleichzeitige Expression von Sense- und Antisense-RNA induziert werden kann. Die Sense- und die Antisense-RNA kann in einem Transkript liegen, das Selbstkomplementarität aufweist.
  • Hamilton et al., 1998 beschreiben, dass ein Transgen mit sich wiederholender DNA, d. h. invertierten Kopien ihrer 5' untranslatierten Region, mit hoher Häufigkeit eine post-transkriptionelle Suppression der Expression der ACC-Oxidase in der Tomate auslöst.
  • WO 98/53083 beschreibt Konstrukte und Verfahren zum Verstärken der Hemmung eines Zielgens innerhalb eines Organismus, welche das Einführen einer invertierten Repeat-Sequenz der ganzen oder eines Teils der Polynucleotidregion innerhalb des Vektors in den Gen-Silencing-Vektor beinhalten.
  • WO 95/34688 beschreibt Verfahren für die cytoplasmatische Inhibierung der Genexpression und stellt genetische Konstrukte für die Expression inhibitorischer RNA im Cytoplasma eukaryontischer Zellen bereit. Die genetischen Konstrukte sind in der Lage, im Cytoplasma einer eukaryontischen Zelle zu replizieren und umfassen eine Promotorregion, bei der es sich um einen subgenomischen Pflanzenvirus-Promotor in funktioneller Kombination mit der die RNA codierenden Region handeln kann.
  • WO95/15394 und US 5,908,779 beschreiben ein Verfahren und ein Konstrukt zur Regulation der Genexpression durch Hemmung durch nukleäre Antisense-RNA in (Maus)-Zellen. Das Konstrukt umfasst einen Promotor, Antisense-Sequenzen und ein cis- oder trans-Ribozym, welches 3'-Enden unabhängig von der Polyadenylierungs-Maschinerie erzeugt und dadurch den Transport des RNA-Moleküls in das Cytoplasma hemmt.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Verringern der phänotypischen Expression einer Nucleinsäure von Interesse bereit, die normalerweise fähig ist, in einer Pflanzenzelle exprimiert zu werden, wobei das Verfahren den Schritt umfasst, dem Kern dieser Pflanzenzelle nicht-polyadenylierte RNA zuzuführen, die eine zielspezifische Sense-Nucleotidsequenz umfasst, insbesondere durch Produzieren von nicht-polyadenylierter RNA durch Transkription einer chimären DNA, die in der Pflanzenzelle enthalten ist, wobei die chimäre DNA einen Pflanzen-exprimierbaren Promotor umfasst, der funktionell mit einem zielspezifischen DNA-Bereich verknüpft ist, der diese RNA codiert, und darüber hinaus einen DNA-Bereich umfasst, der an der 3'-Ende-Bildung und Polyadenylierung beteiligt ist, dem ein selbst-spleißender Ribozym-codierender DNA-Bereich vorangeht.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Verringern der phänotypischen Expression einer Nucleinsäure von Interesse bereit, die normalerweise fähig ist, in einer Pflanzenzelle exprimiert zu werden, wobei das Verfahren den Schritt umfasst, eine chimäre DNA in das Zellkern-Genom der Pflanzenzelle einzubringen, um eine transgene Pflanzenzelle zu erzeugen, wobei die chimäre DNA die folgenden funktionell verknüpften Teile enthält:
    • a) einen Pflanzen-exprimierbaren Promotorbereich, bevorzugt einen konstitutiven Promotor oder einen induzierbaren Promotor oder einen Gewebespezifischen Promotor;
    • b) einen zielspezifischen DNA-Bereich, der eine zielspezifische Sense-Nucleotidsequenz codiert, umfassend eine Nucleotidsequenz von 20 zusammenhängenden Nucleotiden, die 100%ige Sequenzidentität mit einem Teil eines RNA-Moleküls aufweist, das von der Nucleinsäure von Interesse transkribiert oder produziert wird;
    • c) einen DNA-Bereich, der ein selbst-spleißendes Ribozym codiert, bevorzugt ein selbst-spleißendes Ribozym, das eine cDNA-Kopie eines selbst-spleißenden Ribozyms aus Avocado-Sunblotch-Viroid, Pfirsich-Latent-Mosaic-Viroid, Chrysanthemen-Chlorotic-Mottle-Viroid, Nelken-Stunt-Associated-Viroid, Molch-Satellite 2-Transkript, Neurospora-VS-RNA, Gerste-Yellow-Dwarf-Virus- Satelliten-RNA, Arabis-Mosaic-Virus-Satelliten-RNA, Chicorée-Yellow-Mottle-Virus- Satelliten-RNA S1, Luzernen-Transient-Streck-Virus-Satelliten-RNA, Tabak-Ringspot-Virus- Satelliten-RNA, Subterranean-Clover-Mottle-Virus-Satelliten-RNA, Solanum nodiflorum Mottle-Virus-Satelliten-RNA, Velvet-Tobacco-Mottle-Virus-Satelliten-RNA vSCMoV oder Kirsch-Small-Circular-Viroid-ähnliches RNA oder Hepatitis Delta Virus-RNA umfasst, insbesondere einen DNA-Bereich, der die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 oder einen als Ribozym wirksamen Teil davon umfasst; und
    • d) einen DNA-Bereich, der an der 3'-Ende-Bildung und Polyadenylierung beteiligt ist;
    wobei die chimäre DNA, wenn sie transkribiert wird, ein erstes RNA-Molekül produziert, das eine zielspezifische Nucleotidsequenz und ein selbst-spleißendes Ribozym umfasst, das, wenn es durch Autokatalyse geschnitten wird, ein zweites RNA-Molekül produziert, das eine zielspezifische Nucleotidsequenz umfasst, wobei das 3'-Ende des ersten RNA-Moleküls, das die Polyadenylierungsstelle umfasst, entfernt worden ist.
  • Gegebenenfalls kann eine transgene Pflanze aus der transgenen Pflanzenzelle regeneriert werden. Bevorzugt ist der DNA-Bereich, der das selbst-spleißende Ribozym codiert, unmittelbar stromaufwärts von dem DNA-Bereich gelegen, der an der 3'-Ende-Bildung und Polyadenylierung beteiligt ist.
  • Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung ein chimäres DNA-Molekül bereitzustellen, um die phänotypische Expression einer Nucleinsäure von Interesse zu verringern, die normalerweise fähig ist, in einer Pflanzenzelle exprimiert zu werden, umfassend
    • a) einen Pflanzen-exprimierbaren Promotorbereich, bevorzugt einen konstitutiven Promotor oder einen induzierbaren Promotor oder einen Gewebespezifischen Promotor;
    • b) einen zielspezifischen DNA-Bereich, der eine zielspezifische Nucleotidsequenz codiert, umfassend eine Nucleotidsequenz von 20 zusammenhängenden Nucleotiden, die 100%ige Sequenzidentität mit einem Teil eines RNA-Moleküls aufweist, das von der Nucleinsäure von Interesse transkribiert oder produziert wird;
    • c) einen DNA-Bereich, der ein selbst-spleißendes Ribozym codiert, bevorzugt ein selbst-spleißendes Ribozym, das eine cDNA-Kopie eines selbst-spleißenden Ribozyms aus Avocado-Sunblotch-Viroid, Pfirsich-Latent-Mosaic-Viroid, Chrysanthemen-Chlorotic-Mottle-Viroid, Nelken-Stunt-Associated-Viroid, Molch-Satellite 2-Transkript, Neurospora-VS-RNA, Gerste-Yellow-Dwarf-Virus-Satelliten-RNA, Arabis-Mosaic-Virus-Satelliten-RNA, Chicorée-Yellow-Mottle-Virus-Satelliten-RNA S1, Luzernen-Transient-Streck-Virus-Satelliten-RNA, Tabak-Ringspot-Virus- Satelliten-RNA, Subterranean-Clover-Mottle-Virus-Satelliten-RNA, Solanum nodiflorum Mottle-Virus-Satelliten-RNA, Velvet-Tobacco-Mottle-Virus-Satelliten-RNA vSCMOV oder Kirsch-Small-Circular-Viroid-ähnliche RNA oder Hepatitis Delta Virus-RNA umfasst, insbesondere einen DNA-Bereich, der die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 oder einen als Ribozym wirksamen Teil davon umfasst; und
    • d) einen DNA-Bereich, der an der 3'-Ende-Bildung und Polyadenylierung beteiligt ist;
    wobei die chimäre DNA, wenn sie transkribiert wird, ein erstes RNA-Molekül produziert, das eine zielspezifische Nucleotidsequenz und ein selbst-spleißendes Ribozym umfasst, das, wenn es durch Autokatalyse geschnitten wird, ein zweites RNA-Molekül produziert, das eine zielspezifische Nucleotidsequenz umfasst, wobei das 3'-Ende des ersten RNA-Moleküls, das die Polyadenylierungsstelle umfasst, entfernt worden ist. Bevorzugt ist der DNA-Bereich, der das selbst-spleißende Ribozym codiert, unmittelbar stromaufwärts von dem DNA-Bereich gelegen, der an der 3'-Ende-Bildung und Polyadenylierung beteiligt ist.
  • Noch ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, Pflanzenzellen und Pflanzen bereitzustellen, die eine Nucleinsäure von Interesse umfassen, die normalerweise fähig ist, phänotypisch exprimiert zu werden, die ferner eine chimäre DNA umfasst, die bevorzugt stabil in das Kerngenom integriert ist, umfassend
    • a) einen Pflanzen-exprimierbaren Promotorbereich, bevorzugt einen konstitutiven Promotor oder einen induzierbaren Promotor oder einen Gewebespezifischen Promotor;
    • b) einen zielspezifischen DNA-Bereich, der eine zielspezifische Sense-Nucleotidsequenz codiert, umfassend eine Nucleotidsequenz von 20 zusammenhängenden Nucleotiden, die 100%ige Sequenzidentität mit einem Teil eines RNA-Moleküls aufweist, das von der Nucleinsäure von Interesse transkribiert oder produziert wird;
    • c) einen DNA-Bereich, der ein selbst-spleißendes Ribozym codiert, bevorzugt ein selbst-spleißendes Ribozym, das eine cDNA-Kopie eines selbst-spleißenden Ribozyms aus Avocado-Sunblotch-Viroid, Pfirsich-Latent-Mosaic-Viroid, Chrysanthemen-Chlorotic-Mottle-Viroid, Nelken-Stunt-Associated-Viroid, Molch-Satellite 2-Transkript, Neurospora-VS-RNA, Gerste-Yellow-Dwarf-Virus-Satelliten-RNA, Arabis-Mosaic-Virus-Satelliten-RNA, Chicorée-Yellow-Mottle-Virus-Satelliten-RNA S1, Luzernen-Transient-Streck-Virus-Satelliten-RNA, Tabak-Ringspot-Virus- Satelliten-RNA, Subterranean-Clover-Mottle-Virus-Satelliten-RNA, Solanum nodiflorum Mottle-Virus-Satelliten-RNA, Velvet-Tobacco-Mottle-Virus-Satelliten-RNA vSCMoV oder Kirsch-Small-Circular-Viroid-ähnliche RNA oder Hepatitis Delta Virus-RNA umfasst, insbesondere einen DNA-Bereich, der die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 oder einen als Ribozym wirksamen Teil davon umfasst; und
    • d) einen DNA-Bereich, der an der 3'-Ende-Bildung und Polyadenylierung beteiligt ist;
    wobei die chimäre DNA, wenn sie transkribiert wird, ein erstes RNA-Molekül produziert, das eine zielspezifische Nucleotidsequenz und ein selbst-spleißendes Ribozym umfasst, das, wenn es durch Autokatalyse geschnitten wird, ein zweites RNA-Molekül produziert, das eine zielspezifische Nucleotidsequenz umfasst, wobei das 3'-Ende des ersten RNA-Moleküls, das die Polyadenylierungsstelle umfasst, entfernt worden ist.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Identifizierung eines Phänotyps bereit, der mit der Expression einer Nucleinsäure von Interesse in einer Pflanzenzelle assoziiert ist, wobei das Verfahren umfasst
    • 1) Auswählen einer Zielsequenz von mindestens 20 zusammenhängenden Nucleotiden innerhalb der Nucleinsäure von Interesse;
    • 2) Einbringen einer chimären DNA in den Kern einer geeigneten Pflanzen-Wirtszelle, welche die Nucleinsäure von Interesse umfasst, wobei die chimäre DNA die folgenden funktionell verknüpften DNA-Fragmente umfasst:
    • a) einen Pflanzen-exprimierbaren Promotorbereich;
    • b) einen zielspezifischen DNA-Bereich, umfassend eine Nucleotidsequenz von 20 zusammenhängenden Nucleotiden, der 100%ige Sequenzidentität mit einem Teil eines RNA-Moleküls aufweist, das von der Zielsequenz transkribiert oder produziert wird; gefolgt von
    • c) einem DNA-Bereich, der ein selbst-spleißendes Ribozym codiert, der unmittelbar stromaufwärts von
    • d) einem DNA-Bereich gelegen ist, der an der 3'-Ende-Bildung und Polyadenylierung beteiligt ist;
    • 3) Beobachten des Phänotyps mit einem geeigneten Verfahren.
  • Noch ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Verringern der phänotypischen Expression einer Nucleinsäure von Interesse bereitzustellen, die normalerweise fähig ist, in einer eukaryontischen Zelle exprimiert zu werden, wobei das Verfahren den Schritt umfasst, dem Kern dieser eukaryontischen Zelle nicht-polyadenylierte RNA zuzuführen, umfassend eine zielspezifische Sense-Nucleotidsequenz aus 20 zusammenhängenden Nucleotiden mit 100%iger Sequenzidentität zu der Nucleotidsequenz der Nucleinsäure von Interesse, insbesondere durch Erzeugen von nicht-polyadenylierter RNA durch Transkription einer chimären DNA, die in der eukaryontischen Zelle enthalten ist, wobei die chimäre DNA einen Pflanzen-exprimierbaren Promotor umfasst, der funktionell mit einem zielspezifischen DNA-Bereich verknüpft ist, der diese RNA codiert, und gegebenenfalls ferner einen DNA-Bereich umfasst, der an der 3'-Ende-Bildung und Polyadenylierung beteiligt ist, welchem ein selbst-spleißendes Ribozym codierender DNA-Bereich vorangeht.
  • Noch ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Verringern der phänotypischen Expression einer Nucleinsäure von Interesse bereitzustellen, die normalerweise fähig ist, in einer eukaryontischen Zelle exprimiert zu werden, umfassend den Schritt, in das Kerngenom der eukaryontischen Zelle eine chimäre DNA einzubringen, um eine transgene Pflanzenzelle herzustellen, umfassend die folgenden funktionell verknüpften Teile:
    • a) einen Promotorbereich, der in einer eukaryontischen Zelle funktionsfähig ist;
    • b) einen zielspezifischen DNA-Bereich, umfassend eine Nucleotidsequenz von 20 zusammenhängenden Nucleotiden mit 100%iger Sequenzidentität mit einem Teil eines RNA-Moleküls, das von der Nucleotidsequenz der Nucleinsäure von Interesse transkribiert oder produziert wird;
    • c) einen DNA-Bereich, der ein selbst-spleißendes Ribozym codiert; und
    • d) einen DNA-Bereich, der an der 3'-Ende-Bildung und Polyadenylierung beteiligt ist;
    wobei die chimäre DNA, wenn sie transkribiert wird, ein erstes RNA-Molekül produziert, das eine zielspezifische Nucleotidsequenz und ein selbst-spleißendes Ribozym umfasst, das, wenn es durch Autokatalyse geschnitten wird, ein zweites RNA-Molekül produziert, das eine zielspezifische Nucleotidsequenz umfasst, wobei das 3'-Ende des ersten RNA-Moleküls, das die Polyadenylierungsstelle umfasst, entfernt worden ist.
  • Die Erfindung stellt auch eine eukaryontische Zelle bereit, die eine Nucleinsäure von Interesse umfasst, die normalerweise fähig ist, phänotypisch exprimiert zu werden, ferner umfassend eine chimäre DNA, die die folgenden funktionell verknüpften Teile umfasst:
    • a) einen Promotorbereich, der in einer eukaryontischen Zelle funktionsfähig ist;
    • b) einen zielspezifischen DNA-Bereich, umfassend eine Nucleotidsequenz von 20 zusammenhängenden Nucleotiden mit 100%iger Sequenzidentität mit einem Teil eines RNA-Moleküls, das von der Nucleotidsequenz der Nucleinsäure von Interesse transkribiert oder produziert wird;
    • c) einen DNA-Bereich, der ein selbst-spleißendes Ribozym codiert; und
    • d) einen DNA-Bereich, der an der 3'-Ende-Bildung und Polyadenylierung beteiligt ist;
    wobei die chimäre DNA, wenn sie in der eukaryontischen Zelle transkribiert wird, ein erstes RNA-Molekül produziert, das eine zielspezifische Nucleotidsequenz und ein selbst-spleißendes Ribozym umfasst, das, wenn es durch Autokatalyse geschnitten wird, ein zweites RNA-Molekül produziert, das eine zielspezifische Nucleotidsequenz umfasst, wobei das 3'-Ende des ersten RNA-Moleküls, das die Polyadenylierungs stelle umfasst, entfernt worden ist, ebenso wie nicht-menschliche eukaryontische Organismen, die solche eukaryontischen Zellen umfassen oder im Wesentlichen aus diesen bestehen.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1. Schematische Darstellung des chimären Ribozym-enthaltenden GUS-Gens (pMBW267 und pMBW259) für das Kontroll-Konstrukt (pMBW 265) und das chimäre GUS-Gen, das für die Supertransformation eingesetzt wurde (pBPPGH). 35S-P: CaMV 35S-Promotor; GUS: Bereich, der β-Glucuronidase codiert; SAT: cDNA-Kopie der Satelliten-RNA von Gerste-Yellow-Dwarf-Virus (BYDV) in der Positivstrang-Orientierung (→) oder in der Negativstrang-Orientierung (←); Ocs-T: Bereich aus dem Octopin-Synthasegen von Agrobacterium, das an der 3'-Ende-Bildung und Polyadenylierung beteiligt ist: 3' Sat: cDNA-Kopie des 3'-Endes der Satelliten-RNA von BYDV; 5' SAT: cDNA-Kopie des 5'-Endes der Satelliten-RNA von BYDV; PP2-P: 1,3 kb großer Promotorbereich eines Gens, das das Kürbis-Phloem-Protein PP2 codiert; NosT: Bereich aus dem Nopalin-Synthasegen von Agrobacterium, das an der 3'-Ende-Bildung und Polyadenylierung beteiligt ist; C: autokatalytische Spaltstelle in dem von dem chimären Gen transkribierten RNA-Molekül.
  • Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung
  • Obwohl Gen-Silencing, entweder durch Antisense-RNA oder durch Co-Suppression mittels Sense-RNA, ein häufig zu beobachtendes Phänomen in der Forschung über Transgene ist, ist die absichtliche Erzeugung von transgenen eukaryontischen Zellen und transgenen Organismen mit stillgelegten Genen, insbesondere von Pflanzenzellen und von Pflanzen mit einer Reihe von Problemen konfrontiert. Besonders ist die Effizienz von Gen-Silencing noch verbesserungsfähig, sowohl was die Zahl der transgenen Linien anbelangt, die das Phänomen zeigen als auch was das Ausmaß der Verringerung der Transkription und schlussendlich die phänotypische Expression einer bestimmten Nucleinsäure von Interesse in einer bestimmten transgenen Linie angeht.
  • Es ist bereits eine Reihe von verbesserten Verfahren für Gen-Silencing beschrieben worden, z. B. die gleichzeitige Verwendung von gegen die Nucleinsäure von Interesse gerichtete Anti-Sense und Sense-RNA in einer Zelle, die bevorzugt gemeinsam auf einem Transkript liegen, das Selbstkomplementarität aufweist. Neue Verfahren zur Erhöhung der Effizienz des Gen-Silencing, vorzugsweise Gen-Silencing durch Co-Suppression in einer eukaryontischen Zelle oder Organismus, bevorzugt in einer Pflanzenzelle oder in einer Pflanze sowie Mittel hierfür sind in den verschiedenen Ausführungsformen beschrieben, die durch die Beschreibung und die Ansprüche bereitgestellt werden.
  • Die aktuelle Erfindung basiert auf der unerwarteten Beobachtung durch die Erfinder, dass das Zuführen oder das Einbringen von nicht-polyadenylierter zielspezifischer RNA, insbesondere einer zielspezifischen RNA, die eine Nucleotidsequenz umfasst, welche im Wesentlichen identisch mit der Nucleinsäure von Interesse in der Sense-Orientierung ist, in den Kern einer Zelle eines eukaryontischen Organismus, insbesondere einer Zelle einer Pflanze, eine effiziente Verringerung der Expression der Nucleinsäure von Interesse zur Folge hatte, sowohl was das Ausmaß der Verringerung anbelangte als auch was die Zahl der transgenen Linien anging, die Gen-Silencing zeigten. Das Verständnis der hypothetischen Mechanismen, über die wie man annimmt Gen-Silencing, insbesondere PTGS abläuft, erlaubten keine Vorhersage darüber, dass unter allen möglicherweise an der Initiation und der Aufrechterhaltung von Gen-Silencing beteiligten Parametern die Auswahl dieses einen Parameters, d. h. Zuführen nicht-polyadenylierter RNA, ausreichend gewesen wäre, um die Effizienz von Gen-Silencing signifikant zu erhöhen, insbesondere von Gen-Silencing durch Co-Suppression.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zum Verringern der phänotypischen Expression einer Nucleinsäure von Interesse bereitgestellt, die normalerweise fähig ist, in einer Pflanzenzelle exprimiert zu werden, umfassend den Schritt, dem Kern dieser Pflanzenzelle nicht-polyadenylierte RNA zuzuführen, die eine zielspezifische Nucleotidsequenz beinhaltet. Praktischerweise kann nicht-polyadenylierte RNA, einschließlich der zielspezifischen Nucleotidsequenz durch Transkription einer chimären DNA oder eines chimären Gens erzeugt werden, welche innerhalb der Pflanzenzelle enthalten sind, vorzugsweise eingebaut, insbesondere stabil in das Kerngenom der Pflanzenzelle integriert. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist die nicht-polyadenylierte RNA weitere Modifikationen auf, die für mRNA charakteristisch sind, wie z. B., aber nicht darauf beschränkt, das Vorliegen einer Cap-Struktur am 5'-Ende.
  • Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Expression eines Gens" auf den Prozess, bei dem ein DNA-Bereich, der funktionell mit geeigneten regulatorischen Bereichen verknüpft ist, insbesondere mit einem Promotorbereich, in eine RNA transkribiert wird, die biologisch aktiv ist, d. h. die entweder in der Lage ist mit einer anderen Nucleinsäure zu interagieren oder die in der Lage ist, in ein Polypeptid oder Protein translatiert zu werden. Man sagt, dass ein Gen eine RNA codiert, wenn das Endprodukt der Expression des Gens biologisch aktive RNA ist, wie z. B. eine Antisense-RNA, ein Ribozym oder ein Zwischenprodukt der Replikation. Man sagt, dass ein Gen ein Protein codiert, wenn das Endprodukt der Expression des Gens ein Protein oder ein Polypeptid ist.
  • Eine Nucleinsäure von Interesse ist „fähig, exprimiert zu werden", wenn die Nucleinsäure, wenn sie in eine geeignete Wirtszelle, insbesondere in eine Pflanzenzelle, eingebracht wird, transkribiert (oder repliziert) werden kann, um eine RNA zu ergeben, und/oder translatiert werden kann, um in dieser Wirtszelle ein Polypeptid oder Protein zu ergeben.
  • Der Begriff „Gen" bedeutet ein beliebiges DNA-Fragment, das einen DNA-Bereich (den „transkribierten DNA-Bereich") umfasst, der in ein RNA-Molekül (z. B. eine mRNA) transkribiert wird, der funktionell mit geeigneten regulatorischen Bereichen verknüpft ist, z. B. einem Pflanzen-exprimierbaren Promotor. Ein Gen kann daher mehrere funktionell verknüpfte DNA-Fragmente wie z. B. einen Promotor, eine 5'-Leader-Sequenz, einen codierenden Bereich und einen eine Polyadenylierungsstelle umfassenden 3'-Bereich umfassen. Ein Pflanzengen, das für eine bestimmte Pflanzenspezies endogen ist (endogenes Pflanzengen), ist ein Gen, das natürlicherweise in dieser Pflanzenspezies gefunden wird, oder das durch herkömmliche Züchtung in diese Pflanzenspezies eingeführt werden kann. Ein chimäres Gen ist ein beliebiges Gen, das nicht natürlicherweise in einer Pflanzenspezies gefunden wird, oder alternativ ein beliebiges Gen, bei dem der Promotor in der Natur nicht mit einem Teil oder dem ganzen transkribierten DNA-Bereich oder mit mindestens einem anderen regulatorischen Bereich des Gens assoziiert ist.
  • Wie hierin verwendet bezieht sich „phänotypische Expression einer Nucleinsäure von Interesse" auf ein beliebiges quantitatives Merkmal, das mit der molekularen Expression einer Nucleinsäure in einer Wirtszelle assoziiert ist, und kann daher die Menge der transkribierten oder replizierten RNA-Moleküle, die Menge der posttranskriptionell modifizierten RNA-Moleküle, die Menge der translatierten Peptide oder Proteine, die Aktivität solcher Peptide oder Proteine einschließen.
  • Ein „phänotypisches Merkmal", das mit der phänotypischen Expression einer Nucleinsäure von Interesse assoziiert ist, bezieht sich auf ein beliebiges quantitatives oder qualitatives Merkmal, einschließlich des erwähnten Merkmals, ebenso wie auf die direkte oder indirekte Wirkung, die durch die Anwesenheit der RNA-Moleküle, des Peptids oder des Proteins oder des posttranslationell modifizierten Peptids oder Proteins auf die Zelle oder auf den Organismus, der diese Zelle enthält, ausgeübt wird. Die bloße Anwesenheit einer Nucleinsäure in einer Wirtszelle wird nicht als phänotypische Expression oder als phänotypisches Merkmal dieser Nucleinsäure angesehen, obwohl sie quantitativ oder qualitativ nachgewiesen werden kann. Beispiele für direkte oder indirekte Wirkungen, die auf Zellen oder Organismen ausgeübt werden, sind z. B. agronomisch oder industriell nützliche Eigenschaften wie z. B. die Resistenz gegenüber einem Unkraut oder einer Krankheit; ein höherer oder ein modifizierter Ölgehalt etc.
  • Wie hierin verwendet bezieht sich „Verringerung der phänotypischen Expression" auf den Vergleich der phänotypischen Expression der Nucleinsäure von Interesse in der eukaryontischen Zelle in Anwesenheit der RNA oder der chimären Gene der Erfindung auf die phänotypische Expression der Nucleinsäure von Interesse in Abwesenheit der RNA oder der chimären Gene der Erfindung. Die phänotypische Expression in der Anwesenheit der chimären RNA der Erfindung sollte daher niedriger sein als die phänotypische Expression in deren Abwesenheit, bevorzugt nur etwa 25%, stärker bevorzugt nur etwa 10%, noch stärker bevorzugt nur etwa 5% der phänotypischen Expression in Abwesenheit der chimären RNA, insbesondere sollte die phänotypische Expression für alle praktischen Zwecke durch die Anwesenheit der chimären RNA oder des chimären Gens, das eine solche RNA codiert, vollständig inhibiert werden.
  • Eine Verringerung der phänotypischen Expression einer Nucleinsäure, bei der der Phänotyp ein qualitatives Merkmal ist, bedeutet, dass das phänotypische Merkmal in Anwesenheit der chimären RNA oder Gens der Erfindung zu einem anderen unterschiedlichen Zustand wechselt, wenn man es mit einer situation vergleicht, in der eine solche RNA oder ein solches Gen nicht vorliegt. Eine Verringerung der phänotypischen Expression einer Nucleinsäure kann daher, inter alia, als eine Verringerung der Transkription der Nucleinsäure (eines Teils davon), als eine Verringerung der Translation der Nucleinsäure (eines Teils davon) oder als eine Verringerung der Wirkung gemessen werden, welche die Anwesenheit der transkribierten RNA(s) oder des/r translatierten Polypeptids/e auf die eukaryontische Zelle oder den Organismus haben und die schlussendlich zu veränderten phänotypischen Merkmalen führt. Es ist klar, dass die Verringerung der phänotypischen Expression einer Nucleinsäure von Interesse von einer Verstärkung eines phänotypischen Merkmals begleitet sein kann oder damit korreliert.
  • Wie hierin verwendet bezieht sich „eine Nucleinsäure von Interesse" oder eine „Ziel-Nucleinsäure" auf ein beliebiges bestimmtes RNA-Molekül oder beliebige bestimmte DNA-Sequenz, die in einer eukaryontischen Zelle, insbesondere einer Pflanzenzelle vorliegen kann.
  • Wie hierin verwendet bezieht sich „abweichende RNA" auf Polyribonucleotidmoleküle, die Merkmale aufweisen, die sich von mRNA-Molekülen unterscheiden, die normalerweise in der Zelle gefunden werden. Die unterschiedlichen Merkmale umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die Abwesenheit oder das Entfernen einer 5'-Cap-Struktur, die Anwesenheit von persistenten Introns, d. h. Introns, die in ihren Spleißstellen modifiziert worden sind, so dass Spleißen verhindert wird, oder die Abwesenheit eines polyA-Schwanzes, der normalerweise mit der mRNA assoziiert zu finden ist (nicht-polyadenylierte RNA).
  • Der Begriff „zielspezifische Nucleotidsequenz" wie hierin verwendet bezieht sich auf eine Nucleotidsequenz (entweder eine DNA- oder eine RNA-Nucleotidsequenz je nach Zusammenhang), welche die Expression der Ziel-Nucleinsäure von Interesse durch Gen-Silencing verringern kann. Bevorzugt wird nur die Expression der Ziel-Nucleinsäure oder des Zielgens oder von Nucleinsäuren oder Genen verringert, die eine im Wesentlichen ähnliche Nucleotidsequenz aufweisen.
  • Die zielspezifische Nucleotidsequenz umfasst eine Nucleotidsequenz, die der Sense-Nucleotidsequenz der Nucleinsäure des Gens von Interesse entspricht. Mit anderen Worten ist eine zielspezifische Sense-Nucleotidsequenz im Wesentlichen ähnlich zu einem Teil eines RNA-Moleküls, das von der Nucleinsäure oder dem Gen von Interesse transkribiert oder produziert wird, oder zu Teilen der Nucleinsäure oder des Gens von Interesse, welches die Produktion dieses transkribierten oder produzierten RNA-Moleküls kontrolliert, wenn es in derselben 5' nach 3' Richtung abgelesen wird wie das transkribierte oder produzierte RNA-Molekül.
  • Vorzugsweise entspricht die zielspezifische Nucleotidsequenz einem Teil eines Nucleinsäurebereichs, von dem RNA produziert wird, insbesondere einem Bereich, der transkribiert und translatiert wird. Es ist besonders bevorzugt, dass die Zielsequenz einem oder mehreren zusammenhängenden Exons entspricht, stärker bevorzugt, wenn diese innerhalb eines einzigen Exons eines codierenden Bereichs liegt. Die zielspezifische Nucleotidsequenz kann jedoch auch untranslatierten Bereichen des RNA-Moleküls entsprechen, das von der Nucleinsäure oder von dem Gen von Interesse produziert wird. Im Licht einer kürzlichen Veröffentlichung von Mette et al. (1999) steht es darüber hinaus zu erwarten, dass die ziel-spezifische Nucleotidsequenz auch den Bereichen entsprechen kann, welche die Produktion oder die Transkription der RNA von dem Nucleotid oder von dem Gen von Interesse kontrollieren, wie z. B. dem Promotorbereich.
  • Die Länge der zielspezifischen Sense-Nucleotidsequenz kann von etwa 20 Nucleotiden (nt) bis zu einer Länge variieren, die der Länge (in Nucleotiden) der Zielnuclein säure entspricht. Bevorzugt ist die Gesamtlänge der Sense-Nucleotidsequenz mindestens 10 nt, bevorzugt 15 nt, besonders bevorzugt mindestens etwa 50 nt, stärker bevorzugt mindestens etwa 100 nt, speziell mindestens etwa 150 nt, spezieller mindestens etwa 200 nt, ziemlich speziell mindestens etwa 550 nt. Es ist zu erwarten, dass es keine Obergrenze für die Gesamtlänge der Sense-Nucleotidsequenz gibt, mit Ausnahme der Gesamtlänge der Ziel-Nucleinsäure. Aus praktischen Gründen (wie z. B. der Stabilität der chimären Gene) ist es jedoch zu erwarten, dass die Länge der Sense-Nucleotidsequenz nicht größer sein sollte als 5000 nt, dass sie insbesondere nicht größer sein sollte als 2500 nt und dass sie auf etwa 1000 nt begrenzt werden könnte.
  • Es ist ersichtlich, dass, je länger die Gesamtlänge der Sense-Nucleotidsequenz ist, desto weniger stringent werden die Erfordernisse an die Sequenzidentität zwischen der gesamten Sense-Nucleotidsequenz und der entsprechenden Sequenz in der Ziel-Nucleinsäure oder dem Zielgen. Bevorzugt sollte die gesamte Sense-Nucleotidsequenz eine Sequenzidentität von mindestens 75% mit der entsprechenden Zielsequenz aufweisen, besonders bevorzugt mindestens etwa 80%, stärker bevorzugt mindestens etwa 85%, außerordentlich bevorzugt etwa 90%, speziell etwa 95%, spezieller etwa 100%, ziemlich speziell identisch mit dem entsprechenden Teil der Ziel-Nucleinsäure sein. Es ist jedoch bevorzugt, dass die Sense-Nucleotidsequenz immer eine Sequenz von etwa 10 zusammenhängenden Nucleotiden einschließt, besonders bevorzugt von etwa 20 nt, stärker bevorzugt von etwa 50 nt, speziell etwa 100 nt, ziemlich speziell etwa 150 nt mit einer 100%igen Sequenzidentität mit dem entsprechenden Teil der Ziel-Nucleinsäure. Um die Sequenzidentität zu berechnen und um die entsprechende Sense-Sequenz zu konstruieren, sollte die Anzahl der Lücken bevorzugt minimiert werden, insbesondere für die kürzeren Sense-Sequenzen.
  • Wie hierin verwendet bezieht sich „Sequenzidentität" im Hinblick auf Nucleotidsequenzen (DNA oder RNA) auf die Zahl der Positionen mit identischen Nucleotiden geteilt durch die Zahl der Nucleotide in der kürzeren der beiden Sequenzen. Die Anordnung der beiden Nucleotidsequenzen wird mit dem Algorithmus von Wilbur und Lipmann durchgeführt (Wilbur und Lippmann, 1983), wobei eine Fensterbreite von 20 Nucleotiden, eine Wortlänge von 4 Nucleotiden und eine Lückenstrafe (Gap Penalty) von 4. Eine Computer-unterstützte Analyse und Interpretation von Sequenzdaten, einschließlich der Sequenzanordnung wie vorstehend beschrieben lässt sich z. B. einfach unter Verwendung der Programme der IntelligeneticsTM Suite (Intelligenetics Inc., CA) durchführen. Sequenzen werden als „im Wesentlichen ähnlich" angezeigt, wenn solche Sequenzen eine Sequenzidentität von mindestens etwa 75% aufweisen, besonders bevorzugt mindestens etwa 80%, stärker bevorzugt mindestens etwa 85%, außerordentlich bevorzugt etwa 90%, speziell etwa 95%, spezieller etwa 100%, ziemlich speziell identisch sind. Es ist klar, dass, wenn man von RNA-Sequenzen sagt, dass sie im Wesentlichen ähnlich sind oder dass sie einen bestimmten Grad von Sequenzidentität mit RNA-Sequenzen aufweisen, dass Thymin (T) in der DNA-Sequenz als gleichwertig zu Uracil (U) in der RNA-Sequenz angesehen wird.
  • Es ist jedoch zu erwarten, dass die zielspezifische Nucleotidsequenz auch eine Nucleotidsequenz umfassen kann, die der Antisense-Nucleotidsequenz der Nucleinsäure oder des Gens von Interesse entspricht. Mit anderen Worten, eine zielspezifische Antisense-Nucleotidsequenz kann im Wesentlichen ähnlich zu dem Komplement eines Teils eines RNA-Moleküls sein, das von der Nucleinsäure oder von dem Gen von Interesse transkribiert oder produziert wird, oder zu dem Komplement von Teilen der Nucleinsäure oder des Gens von Interesse, welche die Produktion des transkribierten oder produzierten RNA-Moleküls kontrollieren, wenn sie in derselben 5' nach 3' Richtung abgelesen werden wie das transkribierte oder produzierte RNA-Molekül.
  • Es ist zu erwarten, dass die Erfordernisse für zielspezifische Antisense-Nucleotidsequenzen hinsichtlich der Länge, der Ähnlichkeit etc. im Wesentlichen ähnlich sind wie die für zielspezifische Sense-Nucleotidsequenzen wie sie hierin beschrieben sind.
  • Es ist einem Fachmann auf dem Gebiet klar, dass das nicht-polyadenylierte RNA-Molekül mehr als eine zielspezifische Nucleotidsequenz umfassen kann, und dass das nicht-polyadenylierte RNA-Molekül insbesondere zielspezifische Sense- und Antisense-Nucleotidsequenzen umfassen kann, wobei die Sense- und Antisense- Nucleotidsequenzen im Wesentlichen komplementär zueinander sind und fähig sind, eine künstliche Haarnadelstruktur auszubilden wie in Waterhouse et al., 1998 oder in der PCT-Anmeldung PCT/B99/00606 beschrieben.
  • Es ist ebenfalls klar, dass das nicht-polyadenylierte RNA-Molekül eines oder mehrere RNA-stabilisierende Elemente umfassen kann. Wie hierin verwendet ist ein „RNA-stabilisierendes Element" eine Nucleotidsequenz, die, wenn sie in einem RNA-Molekül enthalten ist, die Halbwertszeit dieses RNA-Moleküls verlängert, d. h. es davor schützt, abgebaut zu werden. Bevorzugte RNA-stabilisierende Elemente schließen stabile Stem-Loop-Sequenzen ein, wie z. B. die Stem-Loop-Sequenzen, die man in der mRNA findet, die von den Histon-Genen in Säugerzellen codiert werden, die daran beteiligt sind, der Histon-mRNA Stabilität zu verleihen. Ein Beispiel für eine solche einen Stem-Loop codierende Sequenz ist in SEQ ID NO: 7 enthalten. Man kann auch zu der Sequenz von SEQ ID NO: 7 homologe Sequenzen oder funktionell gleichwertige Sequenzen, die von anderen Organismen abgeleitet sind, mit derselben Wirkung einsetzen.
  • Die Einbeziehung eines solchen RNA-stabilisierenden Elements in ein nicht-polyadenyliertes RNA-Molekül oder einer Nucleotidsequenz, die ein solches RNA-stabilisierendes RNA-Molekül in ein chimäres Gen, das das nicht-polyadenylierte RNA-Molekül codiert, kann die Effizienz des Gen-Silencing des Zielgens weiter verstärken.
  • Wie vorstehend angegeben lässt sich das Einbringen einer zielspezifischen nicht-polyadenylierten RNA in den Kern einer Pflanzenzelle leicht durch Transkription einer in den Kern eingebrachten chimären DNA erreichen, die RNA codiert, die bevorzugt stabil in das Kerngenom einer Pflanzenzelle integriert ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann die zielspezifische nicht-polyadenylierte RNA im Kern einer Pflanzenzelle durch Transkription einer chimären DNA hergestellt werden, die eine erste zielspezifische RNA codiert, die weiter durch die Einwirkung eines ebenfalls vorhandenen und vorzugsweise auch von einem chimären Gen codierten Ribozyms in der Pflanzenzelle prozessiert werden kann, um eine zweite zielspezifische nicht-polyadenylierte RNA zu ergeben. Es ist einem Fach mann auf dem Gebiet klar, dass die RNA-Prozessierung nicht anschließend ablaufen muss, sondern gleichzeitig geschehen kann. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Ribozym um ein selbst-spleißendes Ribozym, das innerhalb des erzeugten zielspezifischen RNA-Transkripts enthalten ist.
  • Daher wird in einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ein Verfahren bereitgestellt, um die phänotypische Expression einer Nucleinsäure von Interesse zu verringern, die normalerweise fähig ist, in einer Pflanzenzelle exprimiert zu werden, wobei das Verfahren den Schritt umfasst, eine chimäre DNA in das Kerngenom der Pflanzenzelle einzuführen, um eine transgene Pflanzenzelle zu erzeugen, wobei die chimäre DNA die folgenden funktionell verknüpften Teile enthält:
    • a) einen Pflanzen-exprimierbaren Promotorbereich;
    • b) einen zielspezifischen DNA-Bereich;
    • c) einen DNA-Bereich, der ein selbst-spleißendes Ribozym codiert; und
    • d) einen DNA-Bereich, der an der 3'-Ende-Bildung und Polyadenylierung beteiligt ist,
    wobei die chimäre DNA, wenn sie transkribiert wird, ein erstes RNA-Molekül produziert, das eine zielspezifische Nucleotidsequenz und ein selbst-spleißendes Ribozym umfasst, das, wenn es durch Autokatalyse geschnitten wird, ein zweites RNA-Molekül produziert, das eine zielspezifische Nucleotidsequenz umfasst, wobei das 3'-Ende des ersten RNA-Moleküls, das die Polyadenylierungsstelle umfasst, entfernt worden ist. Das Verfahren kann gegebenenfalls ferner den Schritt enthalten, die transgene Pflanzenzelle in eine transgene Pflanze zu regenerieren.
  • Wie hierin verwendet handelt es sich bei einem „Ribozym" um ein katalytisches RNA-Molekül, das die intrinsische Fähigkeit besitzt, in Abwesenheit eines Co-Faktors außer einem divalenten Kation an spezifischen Stellen in Ribonucleinsäuren kovalente Bindungen aufzubrechen und zu bilden.
  • Wie hierin verwendet handelt es sich bei einem „selbst-spleißenden Ribozym" oder „selbst-schneidenden Ribozym" um ein Ribozym, das an einer spezifischen Stelle innerhalb des Ribozyms zur Autokatalyse befähigt ist. Bevorzugte selbst-spleißende Ribozyme sind selbst-spleißende Ribozym mit einer sogenannten Hammerhead-Struktur. Es ist jedoch zu erwarten, dass selbst-spleißende Ribozyme mit einer anderen Konformation wie z. B. die selbst-schneidenden Haarnadel-Strukturen, die man im Negativstrang von Replikationsintermediaten von z. B. Nepoviren antrifft, mit derselben Wirkung eingesetzt werden können.
  • Besonders bevorzugte selbst-spleißende Ribozyme sind diejenigen, die an der Replikation kleiner circulärer Pflanzen-pathogener RNAs beteiligt sind, wie z. B. aber nicht beschränkt auf das selbst-spleißende Ribozym aus Avocado-Sunblotch-Viroid, Pfirsich-Latent-Mosaic-Viroid, Chrysanthemen-Chlorotic-Mottle-Viroid, Nelken-Stunt-Associated-Viroid, Molch-Satellite 2-Transkript, Neurospora-VS-RNA, Gerste-Yellow-Dwarf-Virus-Satelliten-RNA, Arabis-Mosaic-Virus-Satelliten-RNA, Chicorée-Yellow-Mottle-Virus-Satelliten-RNA S1, Luzernen-Transient-Streck-Virus-Satelliten-RNA, Tabak-Ringspot-Virus- Satelliten-RNA, Subterranean-Clover-Mottle-Virus-Satelliten-RNA, Solanum nodiflorum Mottle-Virus-Satelliten-RNA, Velvet-Tobacco-Mottle-Virus-Satelliten-RNA vSCMoV oder Kirsch-Small-Circular-Viroid-ähnliches RNA cscRNA 1. Die Tabelle 1 führt verschiedene variante Ribozyme auf, die für die Erfindung geeignet sind, ebenso wie eine Referenz auf deren Nucleotidsequenz.
  • Bei den DNA-Bereichen, die selbst-spleißende Ribozyme codieren, kann es sich um cDNA-Kopien eines Teils der erwähnten Pflanzen-pathogenen RNAs handeln, die das Ribozym umfassen, oder es kann sich um synthetische DNA handeln. Ebenfalls eingeschlossen sind Varianten wie z. B. Mutanten, einschließlich Substitutionen, Deletionen oder Insertionen von Nucleotiden in die Nucleotidsequenz des Ribozyms auf eine solche Weise, dass die autokatalytische Leistungsfähigkeit der Ribozyme nicht wesentlich verändert wird.
  • Bevorzugt liegt der DNA-Bereich, der das selbst-spleißende Ribozym codiert, unmittelbar stromaufwärts von dem DNA-Bereich, der die 3'-Ende-Bildung und das Polyadenylierungssignal codiert. Der Fachmann auf dem Gebiet wird jedoch, wenn er die Beschreibung gelesen hat, sofort erkennen, dass der DNA-Bereich, der das selbst-spleißende Ribozym codiert, innerhalb des chimären Gens enthalten sein kann, das die nicht-polyadenylierte RNA an anderen Stellen codiert, vorausgesetzt, dass eine ausreichend große zweite RNA erzeugt werden kann, die ein zielspezifische Nucleotidsequenz umfasst, in welcher die Polyadenylierungsstelle entfernt ist.
  • Es ist klar, dass, wenn ein RNA-stabilisierendes Element (oder die DNA-Sequenz, die ein solches RNA-stabilisierendes Element codiert) enthalten ist, das RNA-stabilisierende Element auch bevorzugt unmittelbar stromaufwärts dem DNA-Bereich vorangehen sollte, welcher das selbst-spleißende Ribozym codiert. Das RNA-stabilisierende Element kann jedoch auch an anderen Stellen enthalten sein, vorausgesetzt dass es nach der Prozessierung durch das Ribozym in der nicht-polyadenylierten RNA liegt.
  • Figure 00230001
  • Figure 00240001
  • Figure 00250001
  • Die Verwendung von Ribozymen in transgenen Organismen, um RNA-Moleküle mit 5'- und 3'-Enden von Interesse zu erzeugen, ist auf dem Fachgebiet dokumentiert worden. Rubin et al., 1999 beschreiben einen Breitspektrum-Schutz gegen Tombusviren, der in transgenen Pflanzen durch defekte interferierende (DI) RNAs hervorgerufen wird. Um RNAs mit authentischen 5'- und 3'-Enden zu erzeugen, die identisch mit denen der nativen DI-RNA sind, wurde die von einer DNA-Kassette transkribierte DI-RNA-Sequenz von Ribozymen flankiert. Transgene Nicotiana benthamiana – Pflanzen waren besser gegen eine Infektion mit Tomaten-Bushy-Stunt-Virus und verwandte Tombusviren geschützt als nicht-transgene Pflanzen. DI-RNAs beeinträchtigen drastisch die Akkumulierung von Viren durch eine wirksame Kompetition mit dem parentalen Virus für transagierende Faktoren, die für die Replikation erforderlich sind. Egli und Braus, 1994 beschreiben die Entkopplung der 3'-Spaltung der mRNA und der Polyadenylierung durch die Expression eines Hammerhead-Ribozyms in Hefe. Eckner et al., 1991 beschrieben, dass man festgestellt hat, dass Test-Gentranskripte, die durch die RNA-Spaltungs-Aktivität eines cis-agierenden Ribozyms ein reifes Histon 3'-Ende erhalten wurden und somit die zelluläre 3'-Enden-Prozessierungsmaschinerie umgingen, Transport-defizient waren und sich in dem nucleären Kompartiment anreicherten. Diese Schriftstücke auf dem Fachgebiet beziehen sich jedoch nicht auf Verfahren zum Hemmen der phänotypischen Expression durch Homologie-abhängiges Gen-Silencing, insbesondere durch PTGS.
  • Ein besonders bevorzugtes selbst-spleißendes Ribozym ist das Ribozym, das in der Gerste-Yellow-Dwarf-Virus (BYDV) – Satelliten-RNA enthalten ist, vor allem die Satelliten-RNA, die in den BYDV-Isolaten des RPV-Serotyps zu finden ist.
  • Man hat festgestellt, dass eine Verringerung der phänotypischen Expression der Nucleinsäure von Interesse unter Verwendung eines chimären Gens gemäß der Erfindung am wirksamsten war, wenn man eine cDNA-Kopie des Ribozyms verwendete, das innerhalb des Negativstrangs der BYDV-Satelliten-RNA enthalten ist. Daher sind Ribozyme, die eine autokatalytische Aktivität zeigen, die ähnlich der autokatalytischen Aktivität des in dem Negativstrang der BYDV-Satelliten-RNA enthaltenen Ribozyms ist, in besonderem Maße für die Verfahren der Erfindung geeignet. Die autokatalytische Aktivität von Ribozymen lässt sich wie von Miller et al., 1991 beschrieben mit der autokatalytischen Aktivität des (–) Strangs der BYDV-Satelliten-RNA vergleichen.
  • Das Ribozym-Motiv innerhalb des (–) Strangs der BYDV-Satelliten-RNA ist als die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 von dem Nucleotid an Position 194 bis zu dem Nucleotid an Position 236 identifiziert worden. Das Ribozym-Motiv innerhalb des (+) Strangs der BYDV-Satelliten-RNA ist als die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 2 von dem Nucleotid an Position 310 bis zu dem Nucleotid an Position 322 identifiziert worden, gefolgt von der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 2 von dem Nucleotid an Position 1 bis zu dem Nucleotid an Position 89.
  • Es versteht sich von selbst, dass mehr als ein Ribozym codierender DNA-Bereich innerhalb des chimären Gens enthalten sein kann. Diese Ribozyme können in einem Cluster auftreten, z. B. können sie alle in dem Bereich liegen, der unmittelbar dem DNA-Bereich vorangeht, welcher das Signal für die Bildung des 3'-Endes und die Polyadenylierung codiert.
  • Es ist jedoch zu erwarten, dass mehr als ein Ribozym codierender DNA-Bereich auf eine solche Weise innerhalb des chimären Gens enthalten sein kann, dass nach einer Selbstspaltung mehr als ein nicht-polyadenyliertes RNA-Molekül erzeugt wird, wobei jedes eine zielspezifische Nucleotidsequenz umfasst. Eine solche chimäre DNA könnte daher umfassen:
    • a) einen Pflanzen-exprimierbaren Promotor;
    • b) einen ersten zielspezifischen DNA-Bereich;
    • c) einen DNA-Bereich, der ein erstes selbst-spleißendes Ribozym codiert;
    • d) einen zweiten zielspezifischen DNA-Bereich;
    • e) einen DNA-Bereich, der ein zweites selbst-spleißendes Ribozym codiert;
    • f) einen DNA-Bereich, der ein 3'-Ende-Bildungs- und Polyadenylierungssignal codiert.
  • Das erste und zweite selbst-spleißende Ribozym können identisch, im Wesentlichen ähnlich oder verschieden sein. Ebenso können der erste und zweite zielspezifische DNA-Bereich, der die RNA mit einer zielspezifischen Nucleotidsequenz codiert, identisch, im Wesentlichen ähnlich oder verschieden sein.
  • Aus praktischen Gründen denkt man, dass die Zahl der DNA-Bereiche, die ein Ribozym innerhalb eines einzelnen chimären Gens codieren, nicht größer als fünf sein sollte.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nucleinsäure von Interesse, deren phänotypische Expression zielgerichtet verringert werden soll, ein Gen, das in das Genom einer eukaryontischen Zelle eingebaut ist, speziell einer Pflanzenzelle. Es ist ersichtlich, dass die Mittel und Verfahren der Erfindung zur Verringerung der phänotypischen Expression eines Gens verwendet werden können, das zu dem Genom der Zelle gehört, wie sie in der Natur vorkommt (ein endogenes Gen) ebenso wie zur Verringerung der phänotypischen Expression eines Gens, das nicht zu dem Genom der Zelle gehört, wie sie in der Natur vorkommt, sondern in diese Zelle eingeführt worden ist (ein Transgen). Das Transgen kann stabil oder transient eingeführt werden, und kann in das Kerngenom der Zelle integriert werden oder auf einem replizierenden Vektor vorliegen, wie z. B. einem viralen Vektor.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Nucleinsäure von Interesse, deren phänotypische Expression zielgerichtet verringert werden soll, eine virale Nucleinsäure, speziell ein virales RNA-Molekül, das in der Lage ist, eine eukaryontische Zelle, insbesondere eine Pflanzenzelle zu infizieren. In diesem Fall handelt es sich bei dem Phänotyp, der verringert werden soll, um die Replikation des Virus, und schlussendlich die Krankheitssymptome, die von dem infizierenden Virus verursacht werden.
  • Für den Zweck der Erfindung bedeutet der Begriff „Pflanzen-exprimierbarer Promotor" einen Promotor, der in der Lage ist, die Transkription in einer Pflanzenzelle zu steuern. Das schließt einen beliebigen Promotor pflanzlichen Ursprungs ein, aber auch einen beliebigen Promotor nicht-pflanzlichen Urpsrungs, der in der Lage ist, Transkription in einer Pflanzenzelle zu steuern. Es steht eine ganze Palette von Pflanzen-exprimierbaren Promotoren zur Verfügung, um die Transkription des chimären Gens der Erfindung zu steuern. Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf starke Promotoren wie z. B. CaMV35S-Promotoren (z. B. Harpster et al., 1988). Da es, wie der Fachmann weiß, variante Formen des CaMV35S-Promotors gibt, kann das Ziel der Erfindung ebenfalls erreicht werden, wenn diese alternativen CaMV35S-Promotoren und Varianten eingesetzt werden. Es ist auch klar, dass andere Pflanzen-exprimierbare Promotoren, vor allem konstitutive Promotoren wie z. B. die Opin-Synthase-Promotoren der Agrobacterium Ti- oder Ri-Plasmide, speziell ein Nopalin-Synthase-Promotor oder Subterranean-Clover-Virus-Promotoren verwendet werden können, um ähnliche Wirkungen zu erzielen. Anhand der Erfindung sind auch chimäre Gene zur Verringerung der phänotypischen Expression einer Nucleinsäure in einer Zelle in Erwägung zu ziehen, die unter der Kontrolle von Promotoren stehen, die spezifisch für Bakteriophagen-RNA-Polymerase mit einer einzelnen Untereinheit sind, wie z. B. ein T7- oder ein T3-spezifischer Promotor, vorausgesetzt dass die Wirtszellen auch die entsprechende RNA-Polymerase in einer aktiven Form enthalten.
  • Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, Verfahren zum Verringern der phänotypischen Expression einer Nucleinsäure in spezifischen Zellen bereitzustellen, vor allem in spezifischen Pflanzenzellen, indem die chimären Gene der Erfindung unter die Kontrolle eines Gewebe-spezifischen oder Organ-spezifischen Promotors gebracht werden. Solche Gewebe-spezifischen oder Organ-spezifischen Promotoren sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Samen-spezifische Promotoren (z. B. WO 89/03887 ), Organanlagen-spezifische Promotoren (An et al., 1996), Stamm-spezifische Promotoren (Keller et al., 1988), Blatt-spezifische Promotoren (Hudspeth et al., 1989), Mesophyll-spezifische Promotoren (wie z. B. die Licht-induzierbaren Rubisco-Promotoren), Wurzel-spezifische Promotoren (Keller et al., 1989), Knollen-spezifische Promotoren (Keil et al., 1989), Gefäßgewebe-spezifische Promotoren (Peleman et al., 1989), Staubblatt-selektive Promotoren ( WO 89/10396 , WO 92/13956 ), Dehiszenz-Zonen-spezifische Promotoren ( WO 97/13865 ) und dergleichen.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann die Expression eines chimären Gens zur Verringerung der phänotypischen Expression einer Ziel-Nucleinsäure nach Belieben durch die Anwendung eines geeigneten chemischen Induktors kontrolliert werden, indem man den transkribierten DNA-Bereich der chimären Gene der Erfindung mit einem Promotor funktionell verknüpft, dessen Expression durch eine chemische Verbindung induziert wird, wie z. B. dem Promotor des Gens, das in der Europäischen Patentveröffentlichung ( EP 0332104 ) offenbart ist, oder dem Promotor des Gens, das in WO 90/08826 offenbart ist.
  • Es ist einem Fachmann auf dem Gebiet klar, dass dieselbe Wirkung bei der Verringerung der phänotypischen Expression einer Nucleinsäure in einer Pflanzenzelle erzielt werden kann, wenn man ein trans-spleißendes Ribozym verwendet, um mindestens die Polyadenylierungsstelle aus dem RNA-Transkript eines chimären Gens zu entfernen, das einen Pflanzen-exprimierbaren Promotor, einen zielspezifischen DNA-Bereich und einen DNA-Bereich umfasst, der ein 3'-Ende-Terminations- und ein Polyadenylierungssignal codiert, um eine nicht-polyadenylierte RNA zu erzeugen, die eine zielspezifische Nucleotidsequenz umfasst.
  • Wie hierin verwendet handelt es sich bei einem „trans-spleißenden Ribozym" um ein RNA-Molekül, das in der Lage ist, das Aufbrechen oder die Bildung einer kovalenten Bindung an einer spezifischen Stelle innerhalb eines anderen RNA-Moleküls zu katalysieren.
  • Das trans-spleißende Ribozym sollte so ausgewählt oder konstruiert werden, dass es eine spezifische Stelle erkennt, die dem Polyadenylierungssignal des RNA-Transkripts vorangeht, bevorzugt unmittelbar vorangeht, das eine zielspezifische Nucleotidsequenz umfasst. Verfahren, um solche trans-spleißenden Ribozyme mit Endoribonuclease-Aktivität zu konstruieren, sind auf dem Fachgebiet bekannt (siehe z. B. Haseloff und Gerlach, 1988, WO 89/05852 ).
  • Der DNA-Bereich, der ein trans-spleißendes Ribozym codiert, kann innerhalb des chimären Gens enthalten sein, welches die zielspezifische RNA codiert. Nach Transkription des chimären Gens kann dann ein RNA-Molekül erzeugt werden, welches das trans-spleißende Ribozym und die zielspezifische Nucleotidsequenz umfasst, wobei das trans-spleißende Ribozym in der Lage ist, eine spezifische Stelle zu schneiden, die der Polyadenylierungsstelle eines anderen ähnlichen RNA-Moleküls vorangeht, um nicht-polyadenylierte zielspezifische RNA-Moleküle zu erzeugen.
  • Das trans-spleißende Ribozym kann auch durch Expression eines anderen chimären Gens bereitgestellt werden, welches in derselben Pflanzenzelle ein RNA-Molekül codiert, das das trans-spleißende Ribozym umfasst, gemäß den auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren und Methoden (siehe z. B. Vaish et al., 1998; Bramlage et al., 1998).
  • Es kann alternative Verfahren geben, um nicht-polyadenylierte zielspezifische RNA dem Kern einer Pflanzenzelle zuzuführen. Solche Verfahren schließen z. B. Transkription eines chimären Gens ein, das in dem Kerngenom einer Pflanzenzelle integriert ist, welches einen zielspezifischen DNA-Bereich umfasst, durch eine andere DNA-abhängige RNA-Polymerase als die RNA-Polymerase II, so dass RNA-Transkripte unabhängig von der normalen mRNA-Prozessierungsmaschinerie (wozu das Spleißen von Introns, das Capping und die Polyadenylierung gehört) erzeugt werden. Dies kann z. B. dadurch erreicht werden, dass man den zielspezifischen DNA-Bereich funktionell mit einem Promotorbereich verknüpft, der von einer RNA-Polymerase aus einem Bakteriophagen mit einer einzigen Untereinheit erkannt wird, wie z. B. aber nicht beschränkt auf der T7-Polymerase, sowie einem DNA-Bereich, der einen Terminator für eine solche Polymerase umfasst. In diesem Fall muss der Pflanzenzelle ein chimäres Gen zugeführt werden, welche die entsprechende RNA-Polymerase codiert. Das Zuführen von nicht-polyadenylierter zielspezifischer RNA in den Kern einer Pflanzenzelle kann auch erreicht werden, indem man z. B. den zielspezifischen DNA-Bereich funktionell mit einem Promotorbereich verknüpft, der von einer eukaryontischen RNA-Polymerase I oder III erkannt wird, sowie einem DNA-Bereich, der einen Terminator für eine solche Polymerase enthält. Die Mittel und Methoden, um solche chimären Gene und Pflanzenzellen zu konstruieren, sind ausführlich in WO 97/49814 beschrieben. Eine andere Alternative, um dem Kern einer Pflanzenzelle nicht-polyadenylierte zielspezifische RNA zuzuführen, kann Transkription eines chimären Gens beinhalten, das einen zielspezifischen DNA-Bereich umfasst, der funktionell mit einem Pflanzen-exprimierbaren Promotor verknüpft ist und mit einem DNA-Bereich verbunden ist, der ein 3'-Ende-Bildungs- aber kein Polyadenylierungssignal umfasst.
  • Obgleich es nicht beabsichtigt ist, die Erfindung auf eine spezielle Wirkungsweise zu beschränken, ist es zu erwarten, dass der Auslöser der Homologie-abhängigen Gen-Silencing-Mechanismen der Zelle, insbesondere des Co-Suppressions-Mechanismus die Akkumulierung von zielspezifischer RNA im Kern dieser Zelle ist. Zuführen von nicht-polyadenylierter RNA in den Kern der Zelle kann ein Mechanismus sein, eine Akkumulierung von zielspezifischer RNA in einem Kern einer Zelle zu verursachen, aber andere Abweichungen wie z. B. das Fehlen einer Cap-Struktur oder die Anwesenheit persistenter Introns etc. können alternative Wege darstellen, die Akkumulierung zielspezifischer RNA im Kern einer Zelle zu verursachen.
  • Darüber hinaus ist zu erwarten, dass andere Abweichungen in den zielspezifischen RNA-Molekülen außer dem Fehlen eines polyA-Schwanzes, einschließlich des Fehlens einer Cap-Struktur oder der Anwesenheit persistenter Introns oder des Vorliegens anomaler Sekundärstrukturen, vor allem des Vorliegens von riesigen Haarnadelstrukturen, einen kumulativen Effekt auf die Inhibition des normalen Transports der RNA vom Kern in das Cytoplasma haben kann, und somit einen kumulativen oder synergistischen Effekt auf die Verringerung der phänotypischen Expression einer Nucleinsäure von Interesse.
  • Die rekombinante DNA, welche das chimäre Gen enthält, um die phänotypische Expression einer Nucleinsäure von Interesse in einer Wirtszelle zu verringern, kann von einem chimären Markergen begleitet sein, vor allem wenn die stabile Integration des Transgens in das Genom der Wirtszelle beabsichtigt ist. Das chimäre Markergen kann eine Marker-DNA umfassen, die an ihrem 5'-Ende funktionell mit einem Promotor verknüpft ist, der in der Wirtszelle von Interesse funktioniert, speziell mit einem Pflanzen-exprimierbaren Promotor, bevorzugt einem konstitutiven Promotor wie z. B. dem CaMV35S-Promotor, oder einem nicht-induzierbaren Promotor wie z. B. dem Promotor des Gens, das die kleine Untereinheit von Rubisco codiert; und an ihrem 3'-Ende funktionell mit geeigneten Pflanzen-Transkription-3'-Ende-Bitdungs- und Polyadenylierungssignalen verknüpft ist. Es ist zu erwarten, dass die Auswahl der Marker-DNA nicht entscheidend ist und dass jede beliebige geeignete Marker-DNA verwendet werden kann. Eine Marker-DNA kann z. B. ein Protein codieren, das der transformierten Pflanzenzelle eine unterscheidbare Farbe verleiht, wie z. B. das Al- Gen (Meyer et al., 1987), der transformierten Pflanzenzelle eine Resistenz gegenüber Herbiciden verleihen kann, wie z. B. das bar-Gen, das Resistenz gegen Phosphinothricin ( EP 0 242 246 ) codiert, oder den transformierten Zellen eine Resistenz gegen Antibiotika verleiht, wie z. B. das aac(6')-Gen, das Resistenz gegen Gentamycin codiert ( WO 94/01560 ).
  • Eine rekombinante DNA, die ein chimäres Gen umfasst, um die phänotypische Expression eines Gens von Interesse zu verringern, kann stabil in das Kerngenom einer Zelle einer Pflanze eingebaut werden. Der Gentransfer kann mit einem Vektor durchgeführt werden, der ein entschärftes Ti-Plasmid ist, das ein chimäres Gen der Erfindung enthält, und von Agrobacterium transportiert wird. Diese Transformation kann unter Zuhilfenahme der Prozeduren durchgeführt werden, die z. B. in EP 0 116 718 beschrieben sind.
  • Alternativ kann ein beliebiger Vektortyp dazu verwendet werden, die Pflanzenzelle zu transformieren, wobei man Verfahren wie z. B. direkten Gentransfer (wie z. B. in EP 0 233 247 beschrieben), durch Pollen vermittelte Transformation (wie z. B. in EP 0 270 356 , WO 85/01856 und US 4,684,611 beschrieben), Pflanzen-RNA-Virus-vermittelte Transformation (wie z. B. in EP 0 067 553 und US 4,407,956 beschrieben), Liposomen-vermittelte Transformation (wie z. B. in US 4,536,475 beschrieben) und dergleichen anwendet.
  • Andere Verfahren, wie z. B. die Bombardierung mir Mikroprojektilen wie sie von Fromm et al. (1990) und von Gordon-Kamm et al. (1990) für Mais beschrieben worden ist, sind ebenfalls geeignet. Zellen von monokotyledonen Pflanzen wie z. B. den Hauptgetreidearten können ebenfalls transformiert werden, wenn man verwundetes und/oder durch Enzyme abgebautes kompaktes embryogenes Gewebe verwendet, das in der Lage ist, einen kompakten embryogenen Kallus zu bilden, oder verwundete und/oder abgebaute unreife Embryonen wie in WO 92/09696 beschrieben. Die so erhaltene transformierte Pflanzenzelle kann dann dazu verwendet werden, auf herkömmliche Weise eine transformierte Pflanze zu regenerieren.
  • Die erhaltene transformierte Pflanzenzelle kann in einem herkömmlichen Züchtungsschema eingesetzt werden, um mehr transformierte Pflanzen mit denselben Merkmalen zu produzieren oder um das chimäre Gen zur Verringerung der phänotypischen Expression einer Nucleinsäure von Interesse der Erfindung in andere Varietäten derselben oder einer verwandten Pflanzenspezies oder in hybride Pflanzen einzuführen. Samen, die von den transformierten Pflanzen erhalten wurden, enthalten die chimären Gene der Erfindung als eine stabile genomische Insertion.
  • Die Verfahren und Hilfsmittel der Erfindung können auch in eukaryontischen Zellen und Organismen für die Verringerung der Genexpression durch Co-Suppression eingesetzt werden.
  • In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Verringerung der phänotypischen Expression einer Nucleinsäure von Interesse bereit, die normalerweise fähig ist, in einer eukaryontischen Zelle exprimiert zu werden, umfassend den Schritt, dem Kern einer eukaryontischen Zelle nicht-polyadenylierte RNA zuzuführen, die eine zielspezifische Nucleotidsequenz von 20 zusammenhängenden Nucleotiden mit 100%iger Sequenzidentität zu der Nucleotidsequenz der Nucleinsäure von Interesse umfasst.
  • In einer anderen Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verringerung der phänotypischen Expression einer Nucleinsäure von Interesse bereitgestellt, die normalerweise fähig ist, in einer eukaryontischen Zelle exprimiert zu werden, umfassend den Schritt, in das Kerngenom der eukaryontischen Zelle eine chimäre DNA einzuführen, um eine transgene Pflanzenzelle zu erzeugen, wobei die DNA die folgenden funktionell verknüpften Teile umfasst:
    • a) einen Promotorbereich, der in der eukaryontischen Zelle funktionsfähig ist;
    • b) einen zielspezifischen DNA-Bereich, umfassend eine Nucleotidsequenz von 20 zusammenhängenden Nucleotiden mit 100%iger Sequenzidentität mit der Nucleotidsequenz der Nucleinsäure von Interesse;
    • c) einen DNA-Bereich, der ein selbst-spleißendes Ribozym codiert; und
    • d) einen DNA-Bereich, der an der 3'-Ende-Bildung und Polyadenylierung beteiligt ist, wobei die chimäre DNA, wenn sie transkribiert wird, ein erstes RNA-Molekül produziert, das eine zielspezifische Nucleotidsequenz und ein selbst-spleißendes Ribozym umfasst, das, wenn es durch Autokatalyse geschnitten wird, ein zweites RNA-Molekül produziert, das eine zielspezifische Nucleotidsequenz umfasst, wobei das 3'-Ende des ersten RNA-Moleküls, das die Polyadenylierungsstelle umfasst, entfernt worden ist.
  • Verschiedene bevorzugte Ausführungsformen und Begriffserklärungen, die in Verbindung mit der Verringerung der Genexpression durch Homologie-abhängiges Gen-Silencing in Pflanzenzellen und Pflanzen beschrieben worden sind, gelten mutatis mutandis auch für die Verfahren und Hilfsmittel, die für die Verringerung der Genexpression durch Co-Suppression in eukaryontischen Zellen und Organismen beschrieben worden sind. Wie hierin verwendet umfassen „eukaryontische Zellen" Pflanzenzellen, tierischen Zellen und menschliche Zellen und Zellen von Hefen und Pilzen ebenso wie Kulturen solcher Zellen.
  • Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung eukaryontische Zellen bereitzustellen, vor allem Pflanzenzellen und Organismen (bevorzugt Pflanzen), welche die chimären Gene für die Verringerung der phänotypischen Expression einer Ziel-Nucleinsäure umfassen, wie sie in der Erfindung beschrieben worden ist.
  • Die Verfahren und Hilfsmittel der Erfindung können somit dazu verwendet werden, phänotypische Expression einer Nucleinsäure in einer eukaryontischen Zelle oder Organismus, speziell einer Pflanzenzelle oder einer Pflanze zu verringern, um Bruchresistenz zu erhalten ( WO 97/13865 ), um veränderte Blumenfarbmuster zu erhalten ( EP 522 880 , US 5,231,020 ), um gegen Nematoden resistente Pflanzen zu erhalten ( WO 92/21757 , WO 93/10251 , WO 94/17194 ), um die Fruchtreifung zu verzögern ( WO 91/16440 , WO 91/05865 , WO 91/16426 , WO 92/17596 , WO 93/07275 , WO 92/04456 , US 5,545,366 ), um männliche Sterilität zu erhalten ( WO 94/29465 , WO 89/10396 , WO 92/18625 ), um die Anwesenheit unerwünschter (sekundärer) Metaboliten in Organismen zu verringern, wie z. B. von Glucosinolaten ( WO 97/16559 ) oder des Chlorophyll-Gehalts ( EP 770 364 ) in Pflanzen, um durch metabolisches Engineering das Profil von Metaboliten zu modifizieren, die in einer eukaryontischen Zelle oder Organismen synthetisiert werden, z. B. indem man die Expression bestimmter Gene verringert, die an dem Kohlenhydratmetabolismus ( WO 92/11375 , WO 92/11376 , US 5,365,016 , WO 95/07355 ) oder an der Lipidbiosynthese ( WO 94/18337 , US 5,530,192 ) beteiligt sind, um die Seneszenz zu verzögern ( WO 95/07993 ), um die Lignifizierung in Pflanzen zu verändern ( WO 93/05159 , WO 93/05160 ), um die Qualität der Fasern bei Baumwolle zu verändern ( US 5,597,718 ), um die Verletzungsresistenz in Kartoffeln zu erhöhen, indem Polyphenoloxidase verringert wird ( WO 94/03607 ) etc.
  • Die Verfahren der Erfindung werden, verglichen mit den Verfahren, bei denen man herkömmliche Sense- oder Antisense-Nucleotidsequenzen verwendet, zu besseren Ergebnissen und/oder höheren Effizienzen führen, und es ist anzunehmen, dass andere Sequenz-spezifische Mechanismen, welche die phänotypische Expression von Ziel-Nucleinsäuren regulieren, beteiligt sein könnten und/oder durch die Anwesenheit von doppelsträngigen RNA-Molekülen ausgelöst werden könnten, die in dieser Beschreibung beschrieben sind.
  • Eine spezielle Anwendung zur Verringerung der phänotypischen Expression eines Transgens in einer Pflanzenzelle, unter anderem durch Antisense- oder Sense-Verfahren, ist für die Wiederherstellung der männlichen Fertilität beschrieben worden, wobei die letztere durch die Einführung eines Transgens erzielt wurde, das eine DNA für männliche Sterilität umfasste ( WO 94/09143 , WO 91/02069 ). Die Nucleinsäure von Interesse ist speziell die DNA für männliche Sterilität.
  • Wiederum können die Prozesse und Produkte, die in dieser Erfindung beschrieben sind, auf diese Verfahren angewandt werden, um zu einer effizienteren Wiederherstellung der männlichen Fertilität zu gelangen.
  • Es ist ersichtlich, dass die in der Beschreibung beschriebenen Verfahren und Hilfsmittel auch auf Hochdurchsatz-Screening (HTS) – Methoden angewandt werden können, zur Identifizierung und Bestätigung von Phänotypen, die mit der Expression einer Nucleinsäuresequenz mit bislang nicht identifizierter Funktion in einer eukaryontischen Zeile assoziiert sind, insbesondere in einer Pflanzenzelle.
  • Ein solches Verfahren umfasst die Schritte:
    • 1. Auswählen einer Zielsequenz innerhalb der Nucleinsäuresequenz von Interesse mit nicht identifizierter/m oder nicht bestätigter/m Funktion/Phänotyp, wenn sie exprimiert wird. Bevorzugt sollte die Zielsequenz, wenn die Nucleinsäure mutmaßliche offene Leserahmen aufweist, mindestens einen Teil dieser offenen Leserahmen umfassen. Die Länge der Zielnucleotidsequenz kann von etwa 20 Nucleotiden bis zu einer Länge variieren, die der Länge (in Nucleotiden) der Nucleinsäure von Interesse mit nicht identifizierter Funktion entspricht.
    • 2. Einführen einer chimären DNA in den Kern einer geeigneten Wirtszelle, welche die Nucleinsäure von Interesse umfasst, wobei die chimäre DNA einen Promotorbereich umfasst, der für die Expression in der Wirtszelle geeignet ist, einen DNA-Bereich, der die zielspezifische Nucleotidsequenz codiert, und einen DNA-Bereich, der ein selbst-spleißendes Ribozym codiert, das unmittelbar stromaufwärts von einem DNA-Bereich liegt, der an der 3'-Ende-Bildung und Polyadenylierung beteiligt ist.
    • 3. Beobachten des Phänotyps mit einem geeigneten Verfahren. Je nach dem erwarteten Phänotyp kann es ausreichend sein, den Phänotyp in einer einzelnen Zelle zu beobachten oder zu messen, aber es kann auch notwendig sein, die Zellen zu züchten, um eine (organisierte) multizelluläre Ebene zu erhalten, oder sogar einen transgenen Organismus zu regenerieren, vor allem eine transgene Pflanze.
  • Es ist auch klar, dass die Verfahren und Hilfsmittel der Erfindung dazu geeignet sind, die phänotypische Expression einer Nucleinsäure in allen Pflanzenzellen aller Pflanzen zu verringern, ob es sich um monokotyledone oder dikotyledone Pflanzen handelt, speziell um Feldfrüchte wie z. B. aber nicht beschränkt auf Mais, Reis, Weizen, Gerste, Zuckerrohr, Baumwolle, Raps, Sojabohne, Gemüsepflanzen (einschließlich Chicorée, Kohlgemüse, Salat, Tomate), Tabak, Kartoffel, Zuckerrübe, aber auch Pflanzen, die im Gartenbau, der Blumenzucht und der Forstwirtschaft genutzt werden. Die Verfahren und Hilfsmittel der Erfindung sind vor allem für Pflanzen geeignet, die komplexe Genome haben, wie z. B. polyploide Pflanzen.
  • Es is zu erwarten, dass die chimären RNA-Moleküle, die durch Transkription der hierin beschriebenen chimären Gene produziert werden, sich systemisch durch eine Pflanze verbreiten können und es somit möglich ist, die phänotypische Expression einer Nucleinsäure in Zellen eines nicht-transgenen Sprösslings einer Pflanze zu verringern, der auf einen transgenen Stamm aufgepfropft wird, welcher die chimären Gene der Erfindung umfasst (oder umgekehrt), ein Verfahren, das im Gartenbau, im Weinbau oder der Obstproduktion wichtig sein kann.
  • Die folgenden Beispiele beschreiben die Konstruktion chimärer Gene zur Verringerung der phänotypischen Expression einer Nucleinsäure von Interesse in einer eukaryontischen Zelle und die Verwendung solcher Gene. Sofern es in den Beispielen nicht anderweitig angegeben ist, werden alle rekombinanten DNA-Techniken gemäß Standardprotokollen durchgeführt, wie sie in Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y. und in den Bänden 1 und 2 von Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA beschrieben sind. Standardmaterialien und -verfahren für molekulare Arbeit in Pflanzen sind in Plant Molecular Biology Labfax (1993) von R. D. D. Croy beschrieben, das gemeinsam von BIOS Scientific Publications Ltd (Vereinigtes Königreich) und Blackwell Scientific Publications, Vereinigtes Königreich veröffentlicht worden ist.
  • Überall in der Beschreibung und den Beispielen wird auf die folgenden Sequenzen Bezug genommen:
    SEQ ID NO: 1: cDNA-Kopie des (–) Strangs der BYDV RPV – Satelliten-RNA
    SEQ ID NO: 2: cDNA-Kopie des (+) Strangs der BYDV RPV – Satelliten-RNA
    SEQ ID NO: 3: Oligonucleotid zur PCR-Amplifikation (SatPR1)
    SEQ ID NO: 4: Oligonucleotid zur PCR-Amplifikation (SatPR2)
    SEQ ID NO: 5: Oligonucleotid zur PCR-Amplifikation (SatPR3)
    SEQ ID NO: 6: Oligonucleotid zur PCR-Amplifikation (SatPR4)
    SEQ ID NO: 7: Nucleotidsequenz, die einen Histon-Stamm aus Säuger-Histon
    genen codiert.
  • Beispiele
  • Beispiel 1: Experimentelle Prozeduren
  • 1.1 Chimäre DNA-Konstrukte
  • Ribozym-enthaltende GUS-Genkonstrukte und ein Kontrollkonstrukt
  • Bei den verwendeten Ribozym-Sequenzen handelt es sich um die selbst-schneidenden Sequenzen des Plus-Strangs oder des Negativ-Strangs der Satelliten-RNA von Gerste-Yellow-Dwarf-Virus (BYDV) des Serotyps RPV, die in CSIRO Plant Industry isoliert wurde (SEQ ID NO: 1 und 2; Miller et al., 1991).
  • Die zwei Ribozym-enthaltenden GUS-Konstrukte (pMBW259 und pMBW267) und ein GUS-Kontrollkonstrukt (pMBW265) sind in 1 schematisch dargestellt. pMBW259 enthält zwei Plus-Strang-Schnittstellen, während pMBW267 die Negativ-Strang-Schnittstelle enthält.
  • Um diese Konstrukte herzustellen wurde eine β-Glucuronidase (GUS) – Gensequenz so modifiziert, dass sie eine Nco I – Stelle in der Nähe des Translationsstarts ATG enthielt, und in die Xho IIEcoRI – Stellen in pART7 (Gleave, 1992) cloniert, wodurch pMBW258 gebildet wurde. Die Volllänge-BYDV-RPV-Satelliten-Sequenz wurde mit den Primern SatPR1 (SEQ ID NO: 3) und SatPR4 (SEQ ID NO: 6) mittels PCR amplifiziert, mit BamHI verdaut und an der BamHI – Stelle in pMBW258 cloniert, und die so erhaltene 35S-GUS-Sat-ocs-Kassette wurde ausgeschnitten und in pART27 (Gleave, 1992) cloniert. Dieselbe Volllänge-Satelliten-Sequenz wurde in die BamHI – Stelle von pMBW258 eingesetzt, jedoch in der Antisense-Orientierung, und das so erhaltene 35S-GUS-asSat-ocs wurde in pART27 cloniert, um pMBW267 zu ergeben.
  • Um pMBW259 herzustellen wurden die 3'- und 5'-Hälften der Satelliten-RNA-Sequenzen mittels PCR mit den Primerpaaren SatPR3 (SEQ ID NO: 5) und SatPR4 (SEQ ID NO: 6) bzw. SatPR1 (SEQ ID NO: 3) und SatPR2 (SEQ ID NO: 4) amplifiziert. Eine Fusion der Volllänge-Sequenz mit der 3'-Hälfte- und 5'-Hälfte-Sequenzen wurde durch Ligierung zwischen den EcoRV – und Hpa I – Enden der drei PCR- Fragmente hergestellt. Diese Fusion ahmt die natürlichen multimeren Formen der Satelliten-RNA nach und behält daher die Plus-Strang-Schnitteigenschaft der nativen Formen bei. Die Fusionssequenz wurde an den Sac I/Pst I-Stellen in pGEM-3Z (Promega) cloniert, mit Hind III/EcoRI ausgeschnitten, in glatte Enden überführt und an der Sma I-Stelle in pART7 eingesetzt, in die dann die vorstehend beschriebene GUS-Sequenz an den Xho I/EcoRI-Stellen cloniert wurde. Das so erhaltene 35S-GUS-Sat-ocs wurde an der Not I-Stelle in pART27 cloniert, wodurch pMBW259 gebildet wurde.
  • Das super-transformierende GUS-Konstrukt
  • Das BamHI – Fragment wurde aus plG121 Hm (Hiei et al., 1994) ausgeschnitten und in pART7 cloniert. Die GUS-nos-Sequenz wurde dann mit Acc I ausgeschnitten, in glatte Enden überführt und an der Hinc II-Stelle in pBluescript eingesetzt. Der 1,3 kb große Promotorbereich eines Gens für das Kürbis-Phloem-Protein PP2 wurde mit Not I/Hind III aus einem Lambda-Clon CPPI.3 ausgeschnitten und in das vorstehende Bluescript Plasmid cloniert. Das so erhaltene PP2-GUS-nos wurde mit Not I/Kpn I ausgeschnitten und in pWBVec2 (Wang et al., 1998) eingesetzt, wodurch pBPPGH entstand (1).
  • 1.2 Transformation von Tabak
  • Nicotiana tobaccum cv. W38 wurde im Wesentlichen wie von Ellis et al., 1987 beschrieben transformiert und zu ganzen Pflanzen regeneriert. Für die Konstrukte pMBW259, pMBW265 und pMBW267 wurden zur Selektion von transformiertem Gewebe 50 mg/l Kanamycin zu dem Medium hinzugegeben. Für das Konstrukt pBPPGH wurde 25 mg/l Hygromycin B eingesetzt.
  • 1.3 GUS-Assay
  • Die Expression des GUS-Gens wurde histochemisch oder fluorometrisch gemäß Jefferson et al., 1987 untersucht.
  • Beispiel 2: Expression von GUS in transgenem Tabak, der mit einer einzigen Art von GUS-Konstrukten transformiert worden war.
  • Transgene Pflanzen, die pMBW259 und pMBW267 enthielten, zeigten sehr geringe Spiegel an GUS-Expression, wie sich anhand des Fehlens von oder einer schwach blauen GUS-Färbung beurteilen ließ. Pflanzen, die mit pMBW265 transformiert worden waren, zeigten eine höhere Expression von GUS als mit pMBW259 und pMBW267, aber der Spiegel war viel niedriger als bei Pflanzen, die mit pBPPGH transformiert worden waren. Die besten Linien von pMBW265 exprimierten 13,3% der GUS-Aktivität von einer durchschnittlichen Linie von pBPPGH.
  • Beispiel 3: Expression von GUS in super-transformierten Linien, die pBPPGH und eines der drei anderen Konstrukte von Beispiel 1 enthielten.
  • Um das Silencing eines normalen GUS-Gens durch die Anwesenheit der Ribozym-Sequenz nahe dem 3'-Ende des GUS-Gentranskripts zu fördern, wurden Pflanzen durch Retransformation konstruiert, die pMBW259, pMBW265 oder pMBW267 und pBPPGH enthielten. Histochemische GUS-Assays der Super-Transformanten zeigten, dass der pMBW267-Hintergrund wesentlich höhere Anteile von Transformanten ergab als der pMBW259- oder der pMBW265-Hintergrund, die geringe Spiegel von GUS-Expression zeigten, wie durch das Fehlen einer starken und gleichmäßigen Blaufärbung angezeigt wurde. Super-Transformanten, die pBPPGH und pMBW265 enthielten, zeigten die beste Expression von GUS.
  • Tabelle 2 zeigt das Ergebnis eines fluorometrischen GUS (MUG)-Assays der Super-Transformanten. Die Linien (E und F), die pBPPGH und pMBW267 enthielten, zeigten verglichen mit den anderen Linien eine gleichmäßig niedrige Expression von GUS. Die beste Expression von GUS kam von den C-Linien, die pBPPGH und pMBW265 enthalten.
  • Unter den drei getesteten Konstrukten enthält pMBW265 nicht die Volllänge-Sequenzen mit dem funktionellen Ribozym der BVDV-Satelliten-RNA in einem durchgehenden Stück, und es ist daher zu erwarten, dass es hauptsächlich poly (A)+- RNA produziert. pMBW259 enthält zwei Kopien der Plus-Strang-Ribozym-Sequenz und sollte daher RNA bilden, deren poly(A)-Schwänze durch Ribozymspaltung entfernt wurden. pMBW267 enthält das Negativ-Strang-Ribozym. Es wurde früher gezeigt, dass das Negativ-Strang-Ribozym viel (mindestens 10-fach) effizienter ist als das Plus-Strang-Ribozym (Miller et al., 1991), und daher ist zu erwarten, dass pMBW267 effizienter poly(A)-RNA produziert. Unser Experiment zeigte, dass die super-transformierten Linien, die den pMBW267-Hintergrund aufwiesen, im Vergleich zu den Linien, die den pMBW259- oder den pMBW265-Hintergrund hatten, gleichmäßig niedrige Spiegel von GUS-Aktivität exprimierten. Die Linien mit der höchsten Expression von GUS waren von dem pMBW265-Hintergrund, der keine polyA-RNA produziert. Tabelle 2: MUG-Assay der super-transformierten Tabak-Linien*.
    Supertransformierte Linien MUG-Messwerte Supertransformierte Linien MUG-Messwerte Supertransformierte Linien MUG-Messwerte
    A1 10.1 C1 8.84 E1 4.32
    A2 12.8 C2 16.9 E2 3.15
    A3 30.6 C3 17.9 E3 3.56
    A4 47.3 C4 22.8 E4 3.31
    A5 0.29 C5 11.7 E5 3.68
    A6 10.3 C6 14.5 E6 5.02
    A7 5.8 C7 44.0 E7 2.63
    A8 13.15 C8 19.0 E8 10.27
    A9 7.34 C9 29.8 E9 10.81
    A10 9.76 C10 32.1 E10 13.1
    A11 17.74 C11 37.1 E11 5.10
    A12 34.8 C12 2.51 E12 2.86
    A13 4.33 C13 14.5 E13 4.00
    A14 3.41 C14 25.8 E14 16.8
    A15 11.2 C15 7.20 E15 4.02
    A16 2.04 C16 30.2 E16 1.29
    A17 13.29 C17 9.70 E17 1.78
    A18 14.6 C18 13.4 E18 3.57
    A19 0.14 C19 19.3 E19 0.43
    A20 17.2 C20 17.0 E20 11.8
    A21 9.22 D1 6.01 F1 5.73
    A22 17.3 D2 12.9 F2 5.10
    B1 9.57 D3 0.19 F3 4.16
    B2 44.7 D4 7.88 F4 4.69
    B3 17.7 D5 1.24 F5 0
    B4 1.25 D6 0.44 F6 1.93
    B5 13.5 D7 14.1 F7 3.21
    B6 11.4 D8 0.91 F8 2.77
    B7 6.28 D9 5.49 F9 1.86
    B8 24.8 D10 1.30 F10 3.27
    B9 16.3 D11 15.1 F12 2.85
    B10 9.72 D12 6.63 F13 3.25
    B11 3.71 D13 12.2 F13 2.17
    B12 0.08 D14 15.8 F14 2.84
    B13 20.6 D15 1.32 F15 3.11
    B14 11.9 D16 2.29 F16 2.06
    B15 3.11 D17 3.59 F17 2.90
    B16 8.25 D18 22.1 F18 3.75
    B17 4.12 D19 13.0 F19 4.16
    B18 6.04 D20 4.37 F20 2.49
    • * A und B, aus einer Super-Transformation von zwei unabhängigen pMBW259-Linien mit pBPPGH; C und D, aus einer Super-Transformation von zwei unabhängigen pMBW265-Linien mit pBPPGH; E und F, aus einer Super-Transformation von zwei unabhängigen pMBW267-Linien mit pBPPGH.
  • Beispiel 4: Weitere chimäre DNA-Konstrukte
  • Weitere chimäre DNA-Konstrukte werden mit herkömmlichen DNA-Clonierungstechniken hergestellt und in Pflanzen eingeführt, welche die geeigneten Zielgene enthalten.
  • GUS-Silencing-Konstrukte vom Typ 1
  • Ribozym-enthaltende GUS-Konstrukte ähnlich zu pMBW259 und pMBW267 (siehe Beispiel 1) werden so angepasst, dass sie zwischen der Nucleotidsequenz, die von dem GUS-Gen stammt und stromaufwärts von dem das Ribozym codierenden DNA-Bereich eine Nucleotidsequenz enthalten, die ein RNA stabilisierendes Element (einen Histon-Stamm von Säuger-Histongenen; SEQ ID NO: 7) codiert.
  • GUS-Silencing-Konstrukte vom Typ 2
  • Ribozym-enthaltende GUS-Konstrukte ähnlich zu pMBW259 und pMBW267 (siehe Beispiel 1), in denen die von dem GUS-Gen stammende Nucleotidsequenz aber in der Antisense-Orientierung vorliegt (d. h. in umgekehrter Orientierung zu diesen homologen Sequenzen in pMBW259 und pMBW267) werden so angepasst, dass sie zwischen der Nucleotidsequenz, die von dem GUS-Gen stammt und stromaufwärts von dem das Ribozym codierenden DNA-Bereich eine Nucleotidsequenz enthalten, die ein RNA stabilisierendes Element (einen Histon-Stamm von Säuger-Histongenen; SEQ ID NO: 7) codiert.
  • GUS-Silencing-Konstrukte vom Typ 3
  • Chimäre GUS-Silencing-Gene werden ähnlich den in WO 99/53050 (insbesondere Seite 36) beschriebenen chimären GUS-Silencing-Genen konstruiert, wobei diese zwischen dem DNA-Bereich, der die Haarnadel-RNA codiert und dem DNA-Bereich, der die Transkription-Termination und Polyadenylierung codiert, einen zusätzlichen DNA-Bereich enthalten, der ein Ribozym codiert. Diese Konstrukte enthalten die folgenden Elemente:
    • • einen CaMV35S-Promotor (wie in Beispiel 1 beschrieben)
    • • eine Nucleotidsequenz in Sense-Orientierung von mindestens 500 bp, die von dem GUS-Gen abgeleitet ist
    • • eine Spacer-Nucleotidsequenz (die z. B. etwa 700 bp von dem PVY Nia-Gen umfasst, siehe WO 99/53050 )
    • • das Komplement der Nucleotidsequenz, die von dem GUS-Gen abgeleitet ist (d. h. ein Teil des GUS-Gens in Antisense-Orientierung)
    • • ein Ribozym-codierender DNA-Bereich wie in pMBW259 und pMBW267 (Beispiel 1)
    • • ein ocs-T Terminator (wie in Beispiel 1 beschrieben)
  • Konstrukte mit PVY-Resistenz
  • Es werden chimäre PVY-Resistenzgene konstruiert, welche die folgenden Elemente enthalten
    • • einen CaMV35S-Promotor (wie in Beispiel 1 beschrieben)
    • • eine Nucleotidsequenz in Sense-Orientierung, die etwa 700 bp von dem PVY Nia-Gen umfasst, siehe WO 99/53050
    • • eine Spacer-Nucleotidsequenz (z. B. ein Teil des GUS-Gens)
    • • das Komplement der Nucleotidsequenz, die von PVY abgeleitet ist (d. h. ein Teil der PVY-Sequenz in Antisense-Orientierung)
    • • ein Ribozym-codierender DNA-Bereich wie in pMBW259 und pMBW267 (Beispiel 1)
    • • ein ocs-T Terminator (wie in Beispiel 1 beschrieben)
  • Wenn man GUS-Silencing-Konstrukte analysiert, enthalten die transgenen Pflanzen ein funktionelles GUS-Transgen und die Silencing-Konstrukte werden entweder durch direkte Transformation von Pflanzen eingeführt, die ein transgenes GUS-Gen enthalten, oder indem man geeignete transgene Pflanzen kreuzt.
  • Wenn man PVY-Silencing-Konstrukte verwendet, werden transgene Pflanzen, die die PVY-Silencing-Konstrukte enthalten, nach Standardmethoden mit PVY inokuliert (siehe WO 99/53050 ).
  • In transgenen Pflanzen, die ein GUS-Transgen enthalten, wird die Expression von GUS nach Einführung der GUS-Silencing-Konstrukte in der Mehrheit der erhaltenen transgenen Linien effizient stillgelegt.
  • Transgene Pflanzen, die die PVY-Resistenzgene enthalten, sind in der Mehrheit der erhaltenen transgenen Linien extrem resistent gegenüber Infektion mit PVY.
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  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00490001
  • Figure 00500001
  • Figure 00510001

Claims (39)

  1. Verfahren zum Verringern der phänotypischen Expression einer Nucleinsäure von Interesse, die normalerweise fähig ist, in einer Pflanzenzelle exprimiert zu werden, wobei das Verfahren den Schritt umfasst, dem Zellkern der Pflanzenzelle nicht-poyladenylierte RNA zuzuführen, die eine zielspezifische Sense-Nucleotidsequenz umfasst, wobei die zielspezifische Nucleotidesequenz eine Nucleotidsequenz von 20 zusammenhängenden Nucleotiden umfasst, mit 100%iger Sequenzidentität zu einem Teil eines RNA-Moleküls, das von der Nucleinsäure von Interesse transkribiert oder produziert wird,.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die nicht-polyadenylierte RNA, die die zielspezifische Sense-Nucleotidsequenz umfasst, durch Transkription einer chimären DNA, die in der Pflanzenzelle enthalten ist, produziert wird, wobei die chimäre DNA einen Pflanzen-exprimierbaren Promotor umfasst, der funktionell mit einem zielspezifischen DNA-Bereich, der die RNA codiert, verknüpft ist.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die chimäre DNA ferner einen DNA-Bereich umfasst, der an der 3'-Ende-Bildung und Polyadenylierung beteiligt ist, dem ein selbst-spleißendes Ribozym-codierender DNA-Bereich vorangeht.
  4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 oder 3, wobei die chimäre DNA in das Zellkern-Genom der Pflanzenzelle eingebracht wird.
  5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die zielspezifische Sense-Nucleotidsequenz einem oder mehreren zusammenhängenden Exons oder nicht-translatierten Bereichen des RNA-Moleküls entspricht, das von der Nucleinsäure von Interesse transkribiert oder produziert wird.
  6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die nicht-polyadenylierte RNA ferner eine zielspezifische Antisense-Sequenz umfasst, wobei die zielspezifische Sense-Nucleotidsequenz und die zielspezifische Antisense-Nucleotidsequenz fähig sind, miteinander eine künstliche Haarnadelstruktur auszubilden.
  7. Chimäres DNA-Molekül zum Verringern der phänotypischen Expression einer Nucleinsäure von Interesse, die normalerweise fähig ist, in einer Pflanzenzelle exprimiert zu werden, wobei das chimäre DNA-Molekül umfasst: (a) einen Pflanzen-exprimierbaren Promotorbereich; (b) einen zielspezifischen DNA-Bereich, wobei der zielspezifische DNA-Bereich eine Sense-Nucleotidsequenz von 20 zusammenhängenden Nucleotiden umfasst, mit 100%iger Sequenzidentität mit einem Teil eines RNA-Moleküls, das von der Nucleinsäure von Interesse transkribiert oder produziert wird; (c) einen DNA-Bereich, der ein selbst-spleißendes Ribozym codiert; und (d) einen DNA-Bereich, der an der 3'-Ende-Bildung und Polyadenylierung beteiligt ist; wobei die chimäre DNA, wenn sie transkribiert wird, ein erstes RNA-Molekül produziert, das eine zielspezifische Sense-Nucleotidsequenz und ein selbst-spleißendes Ribozym umfasst, das, wenn es durch Autokatalyse geschnitten wird, ein zweites RNA-Molekül produziert, das die zielspezifische Sense-Nucleotidsequenz umfasst, wobei das 3'-Ende des ersten RNA-Moleküls, das die Polyadenylierungsstelle umfasst, entfernt wurde.
  8. Chimäres DNA-Molekül gemäß Anspruch 7, wobei der DNA-Bereich, der ein selbst-spleißendes Ribozym codiert, unmittelbar stromaufwärts des DNA-Bereichs, der an der die 3'-Ende-Bildung und Polyadenylierung beteiligt ist, lokalisiert ist.
  9. Chimäres DNA-Molekül gemäß Anspruch 7 oder 8, wobei der DNA-Bereich, der ein selbst-spleißendes Ribozym codiert, eine cDNA-Kopie eines selbst-spleißenden Ribozyms aus Avocado-Sunblotch-Viroid, Pfirsich-Latent-Mosaic-Viroid, Chrysanthemen-Chlorotic-Mottle-Viroid, Nelken-Stunt-Associated-Viroid, Molch-Satellite 2-Transkript, Neurospora-VS-RNA, Gerste-Yellow-Dwarf-Virus-Satelliten-RNA, Arabis-Mosaic-Virus-Satelliten-RNA, Chicorée-Yellow-Mottle-Virus-Satelliten-RNA S1, Luzernen-Transient-Streck-Virus-Satelliten-RNA, Tabak-Ringspot-Virus-Satelliten-RNA, Subterranean-Clover-Mottle-Virus-Satelliten-RNA, Solanum nodiflorum-Mottle-Virus-Satelliten-RNA, Velvet-Tobacco-Mottle-Virus-Satelliten-RNA vSCMoV oder Kirsch-Small-Circular-Viroid-ähnliches RNAcscRNA1 umfasst.
  10. Chimäres DNA-Molekül gemäß Anspruch 9, wobei der DNA-Bereich, der ein selbst-spleißendes Ribozym codiert, eine cDNA-Kopie eines selbst-spleißenden Ribozyms der Gerste-Yellow-Dwarf-Virus-Satelliten-RNA umfasst.
  11. Chimäres DNA-Molekül gemäß Anspruch 10, wobei der DNA-Bereich, der ein selbst-spleißendes Ribozym codiert, die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 umfasst.
  12. Chimäres DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 7 bis 11, wobei das chimäre DNA-Molekül ferner einen DNA-Bereich umfasst, der ein RNA-stabilisierendes Element codiert, der dem DNA-Bereich, der ein selbst-spleißendes Ribozym codiert, vorangeht.
  13. Chimäres DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 7 bis 12, wobei das zweite RNA-Molekül ein persistentes Intron umfasst oder ihm die 5'-Cap-Struktur fehlt.
  14. Chimäres DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 7 bis 13, wobei der Pflanzen-exprimierbare Promotor ausgewählt ist aus einem konstitutiven Promotor, einem induzierbaren Promotor, einem gewebespezifischen Promotor, einem Promotor, der durch eine Einzeluntereinheit-RNA-Polymerase eines Bakteriophagen erkannt wird, einem Promotor, der durch eine eukaryontische RNA-Polymerase I erkannt wird, oder einem Promotor, der durch eine eukaryontische RNA-Polymerase III erkannt wird.
  15. Chimäres DNA-Molekül gemäß Anspruch 14, wobei der Promotor ein Promotor ist, der von einer eukaryontischen RNA-Polymerase I erkannt wird, oder ein Promotor ist, der von einer eukaryontischen RNA-Polymerase III erkannt wird, und die chimäre DNA ferner einen Terminator für die RNA-Polymerase I oder die RNA-Polymerase III umfasst.
  16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei die chimäre DNA wie in einem der Ansprüche 6 bis 13 definiert ist.
  17. Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die Nucleinsäure von Interesse ein Transgen oder ein endogenes Gen ist.
  18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 oder 17, wobei die Nucleinsäure von Interesse in einem Virus oder einem viralen Vektor enthalten ist.
  19. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 6 oder 16 bis 18, das den weiteren Schritt des Regenerierens einer transgenen Pflanze aus der transgenen Pflanzenzelle umfasst.
  20. Pflanzenzelle, die eine Nucleinsäure von Interesse umfasst, die normalerweise fähig ist, phänotypisch exprimiert zu werden, die ferner die chimäre DNA gemäß einem der Ansprüche 7 bis 15 enthält.
  21. Pflanze, die die Pflanzenzelle gemäß Anspruch 20 umfasst.
  22. Verfahren zum Identifizieren eines Phänotyps, der mit der Expression einer Nucleinsäure von Interesse in einer Pflanzenzelle in Zusammenhang steht, wobei das Verfahren umfasst: (a) das Auswählen einer Zielsequenz von mindestens 20 zusammenhängenden Nucleotiden in der Nucleinsäure von Interesse; (b) das Einbringen einer chimären DNA in den Zellkern einer geeigneten Pflanzen-Wirtszelle, die die Nucleinsäure von Interesse umfasst, wobei die chimäre DNA die folgenden funktionell verknüpften DNA-Fragmente umfasst: i. einen Pflanzen-exprimierbaren Promotor-Bereich; ii. einen zielspezifischen DNA-Bereich, der eine Nucleotidsequenz von 20 zusammenhängenden Nucleotiden umfasst, mit 100%iger Sequenzidentität mit einem Teil eines RNA-Moleküls, das von der Zielsequenz transkribiert oder produziert wird; gefolgt von iii. einem DNA-Bereich, der ein selbst-spleißendes Ribozym codiert, das unmittelbar stromaufwärts von iv. einem DNA-Bereich, der an der 3'-Ende-Bildung und Polyadenylierung beteiligt ist, lokalisiert ist; (c) das Verfolgen des Phänotyps durch ein geeignetes Verfahren.
  23. Verfahren zum Verringern der phänotypischen Expression einer Nucleinsäure von Interesse, die normalerweise fähig ist, in einer eukaryontischen Zelle exprimiert zu werden, wobei das Verfahren den Schritt umfasst, dem Zellkern der eukaryontischen Zelle nicht-polyadenylierte RNA zuzuführen, die eine zielspezifische Sense-Nucleotidsequenz umfasst, die 20 zusammenhängende Nucleotide mit 100%iger Sequenzidentität zu der Nucleotidsequenz eines Teils eines RNA-Moleküls, das von der Nucleinsäure von Interesse transkribiert oder produziert wird.
  24. Verfahren gemäß Anspruch 23, wobei die nicht-polyadenylierte RNA, die die zielspezifische Nucleotidesequenz umfasst, durch Transkription einer chimären DNA produziert wird, die in der eukaryontischen Zelle enthalten ist, wobei die chimäre DNA einen Promotor umfasst, der in der eukaryontischen Zelle funktionell ist, der funktionell mit einem zielspezifischen DNA-Bereich, der die RNA codiert, verknüpft ist.
  25. Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei der Promotor, der in der eukaryontischen Zeile funktionell ist, ausgewählt ist aus einem konstitutiven Promotor, einem induzierbaren Promotor, einem gewebespezifischen Promotor, einem Promotor, der von einer Einzeluntereinheit-RNA-Polymerase eines Bakteriophagen erkannt wird, einem Promotor, der von einer eukaryontischen RNA-Polymerase I erkannt wird, oder einem Promotor, der von einer eukaryontischen RNA-Polymerase III erkannt wird.
  26. Verfahren gemäß Anspruch 25, wobei die chimäre DNA ferner einen DNA-Bereich umfasst, der an der 3'-Ende-Bildung und Polyadenylierung beteiligt ist, dem eine selbst-spleißendes-Ribozym-codierender DNA-Bereich vorangeht.
  27. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 23 bis 26, wobei die zielspezifische Sense-Nucleotidsequenz einem oder mehreren zusammenhängenden Exons oder nicht-translatierten Regionen des RNA-Moleküls, das von der Nucleinsäre von Interesse transkribiert oder produziert wird, entspricht.
  28. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 23 bis 27, wobei die nicht-polyadenylierte RNA ferner eine zielspezifische Antisense-Sequenz umfasst, wobei die zielspezifische Sense-Nucleotidsequenz und die zielspezifische Antisense-Nucleotidsequenz fähig sind, miteinander eine künstliche Haarnadelstruktur auszubilden.
  29. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 23 bis 28, wobei das Verfahren den Schritt des Einbringens einer chimären DNA in das Zellkern-Genom der eukaryontischen Zelle umfasst, um eine transgene eukaryontische Zelle herzustellen, wobei die chimäre DNA die folgenden funktionell verknüpften Teile umfasst: (a) einen Promotor-Bereich, der in der eukaryontischen Zelle funktionell ist; (b) einen zielspezifischen DNA-Bereich, der eine Nucleotidsequenz von 20 zusammenhängenden Nucleotiden umfasst, mit 100%iger Sequenzidentität mit der Nucleotidsequenz eines Teil eines RNA-Moleküls, das von der Nucleinsäure von Interesse transkribiert oder produziert wird, umfasst; (c) einen DNA-Bereich, der ein selbst-spleißendes Ribozym codiert; und (d) einen DNA-Bereich, der an der 3'-Ende-Bildung und Polyadenylierung beteiligt ist, wobei die chimäre DNA, wenn sie transkribiert wird, ein erstes RNA-Molekül, das eine zielspezifische Sense-Nucleotidsequenz und ein selbst-spleißendes Ribozym umfasst, produziert, das, wenn es durch Auto-Katalyse geschnitten wurde, ein zweites RNA-Molekül produziert, das die zielspezifische Sense-Nucleotidsequenz umfasst, wobei das 3'-Ende des ersten RNA-Moleküls, das die Polyadenylierungsstelle umfasst, entfernt wurde.
  30. Eukaryontische Zelle, die eine Nucleinsäure, die normalerweise fähig ist, phänotypisch exprimiert zu werden, umfasst, die ferner eine chimäre DNA umfasst, die die folgenden funktionell verknüpften Teile umfasst: (a) einen Promotor-Bereich, der in der eukaryontischen Zelle funktionell ist; (b) einen zielspezifischen DNA-Bereich, der eine Nucleotidsequenz von 20 zusammenhängenden Nucleotiden umfasst, mit 100%iger Sequenzidentität mit der Nucleotidsequenz eines Teil eines RNA-Moleküls, das von der Nucleinsäure von Interesse transkribiert oder produziert wird; (c) einen DNA-Bereich, der ein selbst-spleißendes Ribozym codiert; und (d) einen DNA-Bereich, der an der 3'-Ende-Bildung und Polyadenylierung beteiligt ist, wobei die chimäre DNA, wenn sie in der eukaryontischen Zelle transkribiert wird, ein erstes RNA-Molekül, das eine zielspezifische Sense-Nucleotidsequenz und ein selbst-spleißendes Ribozym umfasst, produziert, das, wenn es durch Auto-Katalyse geschnitten wurde, ein zweites RNA-Molekül produziert, das die zielspezifische Sense-Nucleotidsequenz umfasst, wobei das 3'-Ende des ersten RNA-Moleküls, das die Polyadenylierungsstelle umfasst, entfernt wurde.
  31. Nicht-menschlicher eukaryontischer Organismus, der die eukaryontische Zelle gemäß Anspruch 30 umfasst.
  32. Eukaryontische Zelle, die umfasst: i) eine Nucleinsäure von Interesse, die normalerweise fähig ist in der eukaryontischen Zelle exprimiert zu werden; und ii) nicht-polyadenylierte RNA, die der eukaryontischen Zelle zugeführt wird, die eine zielspezifische Sense-Nucleotidsequenz umfasst, wobei die zielspezifische Sense-Nucleotidsequenz eine Nucleotidsequenz von 20 zusammenhängenden Nucleotiden mit 100%iger Sequenzidentität zu der Nucleotidsequenz eines Teils eines RNA-Moleküls, das von der Nucleinsäure von Interesse transkribiert oder produziert wird, umfasst, wobei die Expression der Nucleinsäure von Interesse durch die Anwesenheit der nicht-polyadenylierten RNA reduziert wird.
  33. Eukaryontische Zelle gemäß Anspruch 32, wobei die nicht-polyadenylierte RNA im Zellkern der eukaryontischen Zelle vorliegt.
  34. Eukaryontische Zelle gemäß Anspruch 32 oder 33, wobei die Nucleinsäure von Interesse eine RNA ist.
  35. Eukaryontische Zelle gemäß einem der Ansprüche 32 bis 34, die eine Pflanzenzelle ist.
  36. Eukaryontische Zelle gemäß einem der Ansprüche 32 bis 35, wobei die zielspezifische Sense-Nucleotidsequenz einem oder mehreren zusammenhängenden Exons oder nicht-translatierten Regionen des RNA-Moleküls, das von der Nucleinsäure von Interesse transkribiert oder produziert wird, entspricht.
  37. Eukaryontische Zelle gemäß einem der Ansprüche 32 bis 36, wobei die nicht-polyadenylierte RNA ferner eine zielspezifische Antisense-Sequenz umfasst, wobei die zielspezifische Sense-Nucleotidsequenz und die zielspezifische Antisense Nucleotidsequenz fähig sind, miteinander eine künstliche Haarnadelstruktur auszubilden.
  38. Nicht-menschlicher eukaryontischer Organismus, der die eukaryontische Zelle gemäß einem der Ansprüche 32 bis 37 umfasst.
  39. Nicht-menschlicher eukaryontischer Organismus gemäß Anspruch 38, der eine Pflanze ist.
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