PT1650306E - Meios e métodos para modificar a expressão génica usando arn não poliadenilado - Google Patents

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Description

1
DESCRIÇÃO
"MEIOS E MÉTODOS PARA MODIFICAR A EXPRESSÃO GENICA USANDO ARN NÃO POLIADENILADO"
Campo da invenção A invenção refere-se a métodos para reduzir a expressão fenotipica de um ácido nucleico de interesse em células eucarióticas fornecendo moléculas de ARN não poliadeniladas que compreendem mais de uma sequência de nucleótido especifica do alvo homóloga ao ácido nucleico de interesse, incluindo uma cadeia com sentido, no núcleo de células eucarióticas. As moléculas de ARN não poliadeniladas especificas de alvo podem ser fornecidas pela introdução de ADNs quiméricos os quais quando transcritos sob o controlo de um promotor convencional e da formação da extremidade 3' e de regiões de poliadenilação produzem moléculas de ARN em que pelo menos o sinal de poliadenilação pode ser removido pela atividade autocatalitica de uma ribozima de auto-ligação compreendida dentro das moléculas de ARN transcritas. Também fornecidas são células eucarióticas e de plantas que compreendem tais moléculas de ARN ou ADN quimérico que codifica tais moléculas de ARN, bem como plantas ou organismos eucarióticos não humanos.
Antecedentes da invenção 0 silenciamento génico pós-transcricional (PTGS) ou a co-supressão, é um fenómeno comum associado com os transgenes em plantas transgénicas. 0 PTGS resulta na remoção especifica da sequência do ARN do transgene silenciado bem como do ARN do gene endógeno homólogo ou do ARN virai. É caracterizado por niveis de ARNm estáveis baixos com taxas 2 normais (normalmente elevadas) da transcrição nuclear de transgenes a serem mantidas. Existe um número de atributos ou caracteristicas comuns para o PTGS. 0 PTGS é i) especifico de sequência; ii) sistemicamente transmissível; iii) muitas vezes associado com a presença de múltiplas cópias de transgenes ou com a utilização de promotores fortes; iv) frequentemente correlacionado com a presença de estruturas de ADN repetitivas, incluindo padrões de inserção do ADN-T de repetição inversa; v) muitas vezes acompanhado por uma nova metilação de ADN na região transcrita, e o vi) pode ser meioticamente recolocado.
Um número de modelos hipotéticos foram propostos para explicar o PTGS (ver por exemplo Wassenegger e Pélissier, 1998). Tipicamente, estes modelos sugerem o envolvimento de uma enzima codificada pelo hospedeiro (polimerase de ARN dirigida por ARN (RdRP)) a qual é proposta para usar o ARN aberrante como padrões para sintetizar pequenas moléculas de ARN de cópia (ARNc). Estes ARNsc vão depois hibridar com o ARNm alvo para formar estruturas duplas, produzindo por esse meio o ARNm susceptivel de degradação por endorribonucleases. Por enquanto, não houve nenhuma evidência direta de que o RdRP está envolvido em PTGS em plantas.
Uma pergunta importante que resulta dos modelos existentes é a de que tipo de ARN é o ARN aberrante que seria usado como um padrão pelo RdRP, e em cujo compartimento celular o RdRP funcionaria. 3 Vários relatórios descreveram a acumulação de ARN de transgene improdutivo ou não poliadenilado em plantas os quais são póstranscricionalmente silenciados (Lee et ai. 1997; van Eldik et al. 1998; Covey et ai., 1997; van Houdt et al., 1997; Metzlaff et ai.; 1997).
Os documentos seguintes referem-se a métodos e meios para regular ou inibir a expressão génica em uma célula.
Os documentos US 5,190, 131 e EP 0 467349 Al descrevem métodos e meios para regular ou inibir a expressão génica em uma célula incorporando-se em ou associando-se com o material genético da célula uma sequência de ácido nucleico não nativa a qual é transcrita para produzir um ARNm o qual é complementar a e capaz de se ligar ao ARNm produzido pelo material genético daquela célula. O documento EP 0 223 399 Al descreve métodos para efetuar modificações somáticas úteis em plantas causando a transcrição nas células das plantas de cadeias de ARN negativas as quais são substancialmente complementares a uma cadeia de ARN alvo. A cadeia de ARN alvo pode ser um transcrito de ARNm criado na expressão génica, um ARN virai, ou outro ARN presente nas células das plantas. A cadeia de ARN negativa é complementar a pelo menos uma porção da cadeia de ARN alvo para inibir a sua atividade in vivo. O documento EP 0 240208 descreve um método para regular a expressão de genes codificados em genomas de células de plantas, conseguida pela integração de um gene sob o controlo transcricional de um promotor o qual é funcional no hospedeiro e no qual a cadeia de ADN transcrita é 4 complementar à cadeia do ADN que é transcrita do(s) gene(s) endógeno(s) que se deseja regular.
Os documentos EP 0 647 715 AI e US 5,034,323, 5,231,020 e 5,283,184 descrevem métodos e meios para produzir plantas que apresentam traços fenotipicos desejados, selecionando transgenotos que compreendem um segmento de ADN operacionalmente ligado a um promotor, em que os produtos de transcrição do segmento são substancialmente homólogos a transcritos correspondentes de genes endógenos, particularmente genes de via biossintética de flavonoides endógenos.
Waterhouse et al. 1998 descrevem que a resistência a virus e o silenciamento de genes em plantas com sentido. O ARN com sentido e anti-sentido pode estar localizado em um transcrito que tem auto-complementaridade.
Hamilton et al. 1998 descrevem que um transgene com ADN repetido, isto é cópias invertidas da sua região 5' não traduzida, causa supressão pós-transcricional de elevada frequência da expressão de ACC-oxidase no tomate. O documento WO 98/53083 descreve construções e métodos para aumentar a inibição de um gene alvo dentro de um organismo o qual envolve a inserção no vector do silenciamento génico de uma sequência de repetição inversa de toda ou parte de uma região de um polinucleótido dentro do vector.
O WO 95/34688 descreve métodos para a inibição citoplasmática da expressão génica e fornece construções genéticas para a expressão do ARN inibitório no citoplasma de células eucarióticas. O ARN inibitório pode ser um ARN 5 anti-sentido ou um co-supressor. As construções genéticas são capazes de replicarem no citoplasma de uma célula eucariótica e compreendem uma região de promotor, o qual pode ser um promotor sub-genómico do virus da planta em combinação funcional com a região que codifica o ARN.
Os documentos W095/15394 e US 5908779 descrevem um método e uma construção para regular a expressão génica através da inibição pelo ARN anti-sentido nuclear em células (de ratinho). A construção compreende um promotor, sequências anti-sentido; e uma cis- ou transribozima a qual gera extremidades 3' independentemente da maquinaria de poliadenilação e por esse meio inibe o transporte da molécula de ARN para o citoplasma.
Sumário da invenção A invenção fornece um método para reduzir a expressão fenotipica de um ácido nucleico de interesse, o qual é normalmente capaz de ser expresso numa célula eucariótica, compreendendo o referido método o passo de fornecimento ao núcleo da referida célula eucariótica de uma molécula de ARN não poliadenilado que compreende mais de uma sequência nucleotidica com sentido especifica do alvo, a referida mais de uma sequência nucleotidica especifica do alvo incluindo uma sequência nucleotidica com sentido especifica do alvo essencialmente semelhante a parte de uma molécula de ARN transcrita ou produzida a partir do ácido nucleico de interesse, a referida sequência nucleotidica com sentido especifica do alvo incluindo uma sequência de cerca de 20 nucleótidos consecutivos com 100% de identidade de sequência com a parte correspondente do ácido nucleico alvo, em que o referido método não é um método de 6 tratamento do corpo humano ou animal através de cirurgia ou terapia, ou um método de diagnóstico praticado no corpo humano ou animal.
Numa forma de realização, a mais de uma sequência nucleotidica especifica do alvo inclui também uma sequência nucleotidica anti-sentido especifica do alvo essencialmente semelhante ao complemento de parte de uma molécula de ARN transcrita ou produzida a partir do referido ácido nucleico de interesse, e as referidas sequências nucleotídicas com sentido e anti-sentido especificas do alvo são essencialmente complementares uma à outra e são capazes de formar uma estrutura em alfinete uma com a outra. A sequência nucleotidica anti-sentido especifica do alvo pode incluir uma sequência de cerca de 20 nucleótidos consecutivos com 100% de identidade de sequência com a parte correspondente do ácido nucleico alvo e pode ter uma identidade de sequência de pelo menos cerca de 95% com a referida parte da molécula de ARN transcrita ou produzida a partir do referido ácido nucleico de interesse. A sequência nucleotidica com sentido especifica do alvo pode ter uma identidade de sequência de cerca de 100%, muito especialmente pode ser idêntica à referida parte de uma molécula de ARN transcrita ou produzida a partir do referido ácido nucleico de interesse. A sequência nucleotidica anti-sentido especifica do alvo pode ter uma identidade de sequência de pelo menos cerca de 95%, mais particularmente pode ter uma identidade de sequência de cerca de 100%, muito especialmente pode ser idêntica ao referido complemento de parte de uma molécula de ARN transcrita ou produzida a partir do referido ácido nucleico de interesse. 7
Numa forma de realização, a célula pode ser uma célula animal, tal como uma célula humana. A célula eucariótica pode ser uma célula cultivada. A sequência nucleotidica com sentido especifica do alvo pode corresponder a um ou mais exões consecutivos do referido ácido nucleico de interesse ou pode corresponder a uma região transcrita e traduzida do referido ácido nucleico de interesse. A sequência nucleotidica com sentido especifica do alvo pode também corresponder a uma região não traduzida do ARN produzido a partir do referido ácido nucleico de interesse.
Noutra forma de realização da invenção, o ARN não poliadenilado é produzido através de transcrição de um gene quimérico compreendido dentro da referida célula eucariótica, o referido gene quimérico compreendendo um promotor funcional na referida células eucariótica, tal como um promotor constitutivo ou um promotor indutivel ou um promotor especifico do tecido operativamente ligado a uma região de ADN especifica do alvo codificando o referido ARN. 0 promotor pode também ser reconhecido por uma única subunidade de ARN-polimerase de um bacteriófago ou o promotor pode ser reconhecido por uma ARN-polimerase I ou III eucariótica e o referido gene quimérico compreende ainda um terminador para a referida polimerase I ou III.
Numa forma de realização da invenção, o ácido nucleico de interesse é um gene incorporado no genoma da referida célula eucariótica. 0 ácido nucleico de interesse pode ser um gene endógeno da referida célula eucariótica ou pode ser um transgene que foi introduzido na referida célula eucariótica. 0 ácido nucleico de interesse pode também ser um ácido nucleico virai.
Numa forma de realização da invenção, o ARN não poliadenilado não possui uma estrutura de proteção a 5' ou compreende um intrão persistente. A invenção proporciona também uma célula eucariótica obtida através do método de acordo com a invenção. A invenção proporciona também um gene quimérico codificando uma molécula de ARN não poliadenilado, a referida molécula de ARN não poliadenilado compreendendo mais de uma sequência nucleotidica especifica do alvo, a referida uma ou mais sequência nucleotidica especifica do alvo incluindo uma sequência nucleotidica com sentido especifica do alvo essencialmente semelhante a parte de uma molécula de ARN produzida a partir de um ácido nucleico de interesse, sendo a referida sequência nucleotidica com sentido especifica do alvo essencialmente semelhante a parte de uma molécula de ARN produzida a partir de um ácido nucleico de interesse e incluindo uma sequência de cerca de 20 nucleótidos consecutivos com 100% de identidade de sequência com a sequência de uma parte correspondente do referido ácido nucleico de interesse, em que o referido ácido nucleico de interesse está normalmente presente numa célula eucariótica e em que o referido ARN não poliadenilado reduz a expressão do referido ácido nucleico de interesse quando proporcionado ao núcleo da referida célula, o referido gene quimérico compreendendo um promotor funcional na referida célula eucariótica operativamente ligado a uma região de ADN especifica do alvo codificando o referido ARN. 9
Numa forma de realização da invenção, a mais de uma sequência nucleotídica específica do alvo pode também incluir uma sequência nucleotídica anti-sentido específica do alvo essencialmente semelhante ao complemento de parte de uma molécula de ARN produzida a partir do referido ácido nucleico de interesse, e as referidas sequências com sentido e anti-sentido específicas do alvo podem ser essencialmente semelhantes uma à outra e capazes de formar uma estrutura em alfinete uma com a outra. A sequência nucleotídica anti-sentido específica do alvo pode incluir uma sequência de cerca de 20 nucleótidos consecutivos com 100% de identidade de sequência com a correspondente parte do ácido nucleico alvo. A sequência nucleotídica com sentido específica do alvo pode ter uma identidade de sequência de pelo menos cerca de 95%, ou uma identidade de sequência de cerca de 100%, muito especialmente ser idêntica à referida parte de uma molécula de ARN produzida a partir do referido ácido nucleico de interesse. A sequência nucleotídica anti-sentido específica do alvo pode também ter uma identidade de sequência de pelo menos cerca de 95%, ou uma identidade de sequência de cerca de 100%, muito especialmente ser idêntica à referida parte de uma molécula de ARN produzida a partir do referido ácido nucleico de interesse. A célula eucariótica pode ser uma célula animal, tal como uma célula humana. O ácido nucleico de interesse pode ser um gene incorporado no genoma da referida célula eucariótica, tal como um gene endógeno da referida célula eucariótica ou um transgene que tenha sido introduzido na referida célula eucariótica. O ácido nucleico de interesse pode ser um ácido nucleico virai. O ARN não poliadenilado pode não possuir uma estrutura de proteção a 5' ou compreender um intrão persistente. O promotor do gene quimérico aqui descrito acima pode ser 10 reconhecido por uma ARN-polimerase eucariótica I ou III e o gene quimérico pode ainda compreender um terminador para a referida polimerase I ou III. A invenção proporciona ainda uma célula eucariótica cultivada compreendendo um gene quimérico tal como aqui descrito acima ou compreendendo no seu núcleo uma molécula de ARN não poliadenilado suscetível de ser produzida pelos genes quiméricos aqui descritos acima. A célula eucariótica pode ser uma célula animal, tal como uma célula humana, e pode ter um fenótipo modificado em comparação com uma célula eucariótica correspondente sem o referido ARN não poliadenilado ou gene quimérico. A invenção proporciona também um organismo eucariótico não humano, tal como um animal compreendendo a célula tal como aqui descrita acima.
Ainda noutra forma de realização, a invenção proporciona a utilização de um gene quimérico tal como aqui descrito acima, proporcionado ao núcleo da referida célula eucariótica para identificar o fenótipo associado com a expressão do referido ácido nucleico de interesse na referida célula eucariótica. 0 fenótipo pode ser observado após cultura das células eucarióticas ou pode ser um perfil modificado de metabolitos sintetizados na referida célula. 0 gene quimérico aqui descrito acima pode também ser utilizado para produzir um ARN não poliadenilado através de transcrição do gene quimérico numa célula eucariótica. 11
Breve Descrição das Figuras
Figura 1. Representação esquemática do gene quimérico GUS que contém a ribozima (pMBW267 e pMBW259) a construção de controlo (pMBW265) e o gene quimérico GUS usado para a super-transformação (pBPPGH). 35S-P: promotor de CaMV 35S; GUS: região que codifica a β-glucuronidase; SAT: cópia de ADNc do ARN satélite do Virus da Cevada Anã Amarela (BYDV) em orientação de cadeia positiva (—»)ou em orientação de cadeia negativa (<—); Ocs-T: região do gene da sintase da octopina de Agrobacterium envolvida na formação e na poliadenilação da extremidade 3'; 3' Sat: cópia de ADNc do ARN satélite do BYDV da extremidade 3'; 5' SAT: cópia de ADNc do ARN satélite do BYDV da extremidade 5'; PP2-P: região do promotor de 1.3 Kb de um gene que codifica a proteina PP2 de cucurbit phloem; Nos-T: região do gene da sintase da nopalina de Agrobacterium envolvida na formação e na poliadenilação da extremidade 3'; C: local de clivagem autocatalitica na molécula de ARN transcrita do gene quimérico.
Descrição detalhada das formas de realização preferidas da invenção
Embora o silenciamento génico, quer pelo ARN anti-sentido ou através de co-supressão utilizando ARN com sentido, seja um fenómeno habitualmente observado na pesquisa transgénica, a geração intencional de células eucarióticas transgénicas do gene silenciado e os organismos transgénicos, particularmente células de plantas e plantas, ainda enfrenta um número de problemas. Em particular a eficiência do silenciamento génico é ainda receptiva ao melhoramento, tanto no número de linhas transgénicas que 12 apresentam o fenómeno como no nível da redução da transcrição e em última análise a expressão fenotípica do ácido nucleico particular de interesse em uma linha transgénica particular. Um número de métodos melhorados para o silenciamento génico já foi descrito, por exemplo a utilização simultânea em uma célula de ARN anti-sentido e com sentido visado para o ácido nucleico de interesse, preferivelmente co-localizado em um transcrito que apresenta auto- complementaridade. Os novos métodos para aumentar a eficiência do silenciamento génico, preferivelmente o silenciamento génico através da co-supressão em uma célula eucariótica ou organismo, preferivelmente uma célula de planta ou planta, e os meios, por conseguinte, são descritos nas formas de realização diferentes fornecidas pela especificação e pelas reivindicações. A presente invenção baseia-se na inesperada observação pelos inventores de que a provisão ou a introdução de ARN específico do alvo aberrante, de preferência ARN específico do alvo não poliadenilado, particularmente um ARN específico do alvo aberrante compreendendo uma sequência nucleotídica essencialmente idêntica ao ácido nucleico de interesse na orientação com sentido, no núcleo de uma célula de um organismo eucariótico, particularmente uma célula de uma planta, resultou numa redução eficiente da expressão do ácido nucleico de interesse, tanto no nível de redução como no número de linhas transgénicas exibindo silenciamento do gene. A compreensão de mecanismos hipotéticos através dos quais o silenciamento génico, particularmente o PTGS, é suposto proceder não permitiu predizer que entre todas as variáveis potencialmente envolvidas na iniciação e na manutenção do silenciamento 13 génico, a seleção deste parâmetro, isto é que fornece o ARN não poliadenilado, teria sido suficiente para aumentar significativamente a eficiência do silenciamento génico, particularmente do silenciamento génico através da co-supressão.
Em uma forma de realização da invenção, um método é fornecido para reduzir a expressão fenotipica de um ácido nucleico de interesse, o qual é normalmente capaz de ser expresso em uma célula de planta, compreendendo o passo de fornecer o ARN não poliadenilado o qual inclui mais de uma sequência de nucleótido especifica de alvo para o núcleo daquela célula de planta. Convenientemente, o ARN não poliadenilado incluindo as sequências de nucleótidos especificas de alvo pode ser produzido pela transcrição de um ADN quimérico ou de um gene quimérico compreendido dentro da célula de planta, preferivelmente incorporado, particularmente integrado de maneira estável no genoma nuclear da célula de planta. Em uma forma de realização particularmente preferida, o ARN não poliadenilado ainda apresenta outras modificações caracteristicas de ARNm, tais como, mas não limitadas, à presença de uma estrutura de proteção na extremidade de 5'.
Tal como aqui utilizado, o termo "expressão de um gene" refere-se ao processo em que uma região de ADN a qual é operacionalmente ligada a regiões reguladoras apropriadas, particularmente a uma região de promotor, é transcrita em um ARN o qual é biologicamente ativo isto é, o qual é capaz quer da interação com outro ácido nucleico ou o qual é capaz de ser traduzido em um polipéptido ou proteína. Um gene é tido como codificando um ARN quando o produto final da expressão do gene é o ARN biologicamente ativo, como por 14 exemplo um ARN anti-sentido, uma ribozima ou um intermediário replicativo. Um gene é tido como codificando uma proteina quando o produto final da expressão do gene é uma proteina ou um polipéptido.
Um ácido nucleico de interesse é "capaz de ser expresso", quando o referido ácido nucleico, quando introduzido em uma célula hospedeira conveniente, particularmente em uma célula de planta, pode ser transcrito (ou duplicado) para produzir um ARN, e/ou traduzido para produzir um polipéptido ou uma proteina naquela célula hospedeira. 0 termo "gene" significa qualquer fragmento de ADN que compreende uma região de ADN (a "região de ADN transcrita") que é transcrito em uma molécula de ARN (por exemplo, um ARNm) em uma célula operacionalmente ligada a regiões reguladoras convenientes, por exemplo, um promotor expressável de planta. Um gene pode assim compreender vários fragmentos de ADN operacionalmente ligados tais como um promotor, uma sequência líder 5', uma região de codificação, e uma região 3' que compreende um local de poliadenilação. Um gene de planta endógeno a uma particular espécie de plantas (gene de plantas endógeno) é um gene que é naturalmente encontrado naquela espécie de plantas ou que pode ser introduzido naquela espécie de plantas por procriação convencional. Um gene quimérico é qualquer gene que não é normalmente encontrado em uma espécie de plantas ou, alternativamente, qualquer gene no qual o promotor não é associado em natureza com a parte ou toda a região de ADN transcrita ou com pelo menos uma outra região reguladora do gene. 15
Como aqui utilizada, "a expressão fenotipica de um ácido nucleico de interesse" refere-se a qualquer traço quantitativo associado com a expressão molecular de um ácido nucleico em uma célula hospedeira e pode incluir assim a quantidade de moléculas de ARN transcritas ou duplicadas, a quantidade das moléculas de ARN pós-transcricionalmente modificadas, a quantidade de péptidos ou de proteínas traduzidos, a atividade de tais péptidos ou proteínas.
Um "traço fenotípico" associado com a expressão fenotipica de um ácido nucleico de interesse refere-se a qualquer traço quantitativo ou qualitativo, incluindo o traço mencionado, bem como o efeito direto ou indireto mediado sobre a célula, ou o organismo que contém aquela célula, pela presença das moléculas de ARN, péptido ou proteína, ou péptido ou proteína, pós-traducionalmente modificados. A mera presença de um ácido nucleico em uma célula hospedeira, não é considerada uma expressão fenotipica ou um traço fenotípico daquele ácido nucleico, mesmo embora possa ser quantitativamente ou qualitativamente traçado. Os exemplos dos efeitos diretos ou indiretos mediados em células ou organismos são, por exemplo, traços agronomicamente ou industriais úteis, tal como a resistência a uma peste ou doença; conteúdo de óleo mais elevado ou modificado etc.
Tal como aqui utilizado, "a redução da expressão fenotipica" refere-se à comparação da expressão fenotipica do ácido nucleico de interesse para a célula eucariótica na presença do ARN ou dos genes quiméricos da invenção, para a expressão fenotipica do ácido nucleico de interesse na ausência do ARN ou dos genes quiméricos da invenção. A 16 expressão fenotípica na presença do ARN quimérico da invenção deve ser assim mais baixa do que a expressão fenotípica na sua ausência, preferivelmente ser só aproximadamente de 25 %, particularmente só aproximadamente de 10 %, mais particularmente só aproximadamente de 5 % da expressão fenotípica na ausência do ARN quimérico, especialmente a expressão fenotípica deve ser completamente inibida para todos os objectivos práticos pela presença do ARN quimérico ou o gene quimérico que codifica um tal ARN.
Uma redução da expressão fenotípica de um ácido nucleico onde o fenótipo é um traço qualitativo significa que na presença do ARN quimérico ou do gene da invenção, o traço fenotípico muda para um estado discreto diferente quando em comparação com uma situação na qual tal ARN ou o gene estão ausentes. Uma redução da expressão fenotípica de um ácido nucleico pode assim, a.o., ser medida como uma redução da transcrição de (parte) daquele ácido nucleico, uma redução na tradução de (parte) daquele ácido nucleico ou uma redução no efeito da presença do(s) ARN(s) transcrito (s) ou do(s) polipétido(s) traduzido(s) que têm na célula eucariótica ou no organismo, e levarão em última análise a traços fenotípicos alterados. É claro que a redução na expressão fenotípica de um ácido nucleico de interesse, pode ser acompanhada por ou correlacionada a um aumento em um traço fenotípico.
Tal como aqui utilizado "um ácido nucleico de interesse" ou "um ácido nucleico alvo" refere-se a qualquer determinada molécula de ARN ou sequência de ADN que pode estar presente em uma célula eucariótica, particularmente em uma célula de planta. 17
Tal como aqui utilizado "ARN aberrante" refere-se a moléculas de polirribonucleótido as quais têm características que se diferenciam das moléculas de ARNm normalmente encontradas naquela célula. As caracteristicas diferentes incluem mas não são limitadas à ausência ou à remoção de uma estrutura de proteção de 5', da presença de intrões persistentes por exemplo intrões os quais foram modificados nos seus locais de liqação para assim prevenir a ligação, ou da ausência da extremidade de polyA normalmente encontrada associada com o ARNm ("ARN não poliadenilado"). 0 termo "sequência de nucleótido especifica de alvo" tal como aqui utilizado, refere-se a uma sequência de nucleótido (sequência de nucleótido quer de ADN ou de ARN dependendo do contexto) a qual pode reduzir a expressão do ácido nucleico alvo de interesse pelo silenciamento génico. Preferivelmente, só a expressão do ácido nucleico alvo ou gene, ou dos ácidos nucleicos ou genes que compreendem a sequência de nucleótido essencialmente semelhante é reduzida. A mais de uma sequência de nucleótido específica de alvo compreende uma sequência de nucleótido que correspondente à sequência de nucleótido "com sentido" do ácido nucleico ou do gene de interesse. Por outras palavras, uma sequência de nucleótido com sentido específica de alvo pode ser essencialmente semelhante a parte de uma molécula de ARN transcrita ou produzida do ácido nucleico ou do gene de interesse ou, a partes do ácido nucleico ou do gene de interesse que controlam a produção daquela molécula de ARN transcrita ou produzida, quando lida na mesma direção de 5' para 3' como a molécula de ARN transcrita ou produzida. 18
Preferivelmente, sequência de nucleótido especifica de alvo corresponde a parte de uma região do ácido nucleico a partir da qual o ARN é produzido, particularmente uma região a qual é transcrita e traduzida. É particularmente preferido que a sequência alvo corresponda a um ou vários exões consecutivos, mais particularmente que esteja localizada dentro de um exão singular de uma região de codificação. No entanto, a sequência de nucleótido especifica de alvo também pode ser correspondente a regiões não traduzidas da molécula de ARN produzida a partir do ácido nucleico ou do gene de interesse. Além disso, à luz de uma publicação recente por Mette et al. (1999), é esperado que a sequência de nucleótido especifica de alvo também possa corresponder às regiões que controlam a produção ou a transcrição de ARN a partir do nucleótido ou do gene de interesse, tal como a região de promotor. 0 comprimento da sequência de nucleótido especifica de alvo com sentido pode variar aproximadamente de 20 nucleótidos (nt) até um comprimento que iguala o comprimento (em nucleótidos) do ácido nucleico de alvo. Preferivelmente o comprimento total da sequência de nucleótido de sentido é pelo menos de aproximadamente 50 nt, mais em particular pelo menos aproximadamente de 100 nt, especialmente pelo menos aproximadamente de 150 nt, mais especialmente pelo menos aproximadamente de 200 nt, bastante especialmente pelo menos aproximadamente de 550 nt. É esperado que não haja nenhum limite superior ao comprimento total da sequência de nucleótido com sentido, diferente do comprimento total do ácido nucleico alvo. No entanto por uma razão prática (tal como por exemplo a estabilidade dos genes quiméricos) é esperado que o comprimento da sequência de nucleótido com sentido não deve exceder 5000 nt, 19 particularmente não deve exceder 2500 nt e pode ser limitado a aproximadamente 1000 nt.
Será apreciado que quanto mais lonqo for o comprimento total da sequência de nucleótido de sentido, menos limitadas se tornam as exiqências para a identidade da sequência entre a sequência de nucleótido com sentido total e a sequência correspondente no ácido nucleico alvo ou qene. Preferivelmente, a sequência de nucleótido com sentido total deve ter uma identidade de sequência de pelo menos aproximadamente 75 % com a sequência de alvo correspondente, particularmente pelo menos aproximadamente 80 %, mais particularmente pelo menos aproximadamente 85 %, bastante particularmente aproximadamente 90 %, especialmente aproximadamente 95 %, mais especialmente aproximadamente 100 %, bastante especialmente ser idêntica à parte correspondente do ácido nucleico de alvo. No entanto, é preferido que a sequência de nucleótido com sentido inclua sempre uma sequência de aproximadamente 20 nt, mais particularmente aproximadamente 50 nt, especialmente aproximadamente 100 nt, bastante especialmente aproximadamente 150 nt com 100 % da identidade da sequência à parte correspondente do ácido nucleico alvo. Preferivelmente, para calcular a identidade da sequência e designar a sequência com sentido correspondente, o número de espaços deve ser minimizado, particularmente para as sequências com sentido mais curtas.
Tal como aqui utilizado, "identidade de sequência" com referência a sequências de nucleótido (ADN ou ARN), refere-se ao número de posições com nucleótidos idênticos dividido pelo número de nucleótidos na mais curta das duas sequências. O alinhamento das duas sequências de nucleótido 20 é executado pelo algoritmo de Wilbur e Lipmann (Wilbur e Lipmann, 1983) utilizando um tamanho de janela de 20 nucleótidos, um comprimento de expressão de 4 nucleótidos, e uma penalização de intervalo de 4. A análise assistida por computador e a interpretação dos dados da sequência, incluindo o alinhamento da sequência como descrito em cima, podem ser, por exemplo, convenientemente executadas usando os programas da firma Suite Intelligenetics® (Intelligenetics Inc., CA.). As sequências são indicadas como "essencialmente semelhantes" quando tal sequência tem uma identidade de sequência de pelo menos aproximadamente 75 %, particularmente pelo menos aproximadamente de 80 %, mais particularmente pelo menos aproximadamente de 85 %, bastante particularmente aproximadamente de 90 %, especialmente aproximadamente de 95 %, mais especialmente aproximadamente de 100 %, bastante especialmente são idênticas. É claro de que quando se diz que as sequências de ARN são essencialmente semelhantes ou têm um certo grau de identidade da sequência com as sequências de ADN, a timina (T) na sequência de ADN é considerada igual ao uracilo (U) na sequência de ARN. É esperado no entanto, que a sequência de nucleótido especifica de alvo também possa compreender uma sequência de nucleótido correspondente à sequência de nucleótido "anti-sentido" do ácido nucleico ou do gene de interesse. Por outras palavras, uma sequência de nucleótido anti-sentido especifico de alvo pode ser essencialmente semelhante ao complemento de parte de uma molécula de ARN transcrita ou produzida a partir do ácido nucleico ou do gene de interesse ou ao complemento de partes do ácido nucleico ou, do gene de interesse que controlam a produção daquela molécula de ARN transcrita ou produzida, quando 21 lida na mesma direção de 5' para 3' como a molécula de ARN transcrita ou produzida.
As exigências para as sequências de nucleótido especificas de alvo anti-sentido no que se refere ao comprimento, semelhança, etc. são esperadas que sejam essencialmente semelhantes como para as sequências de nucleótido especificas de alvo com sentido como especificado aqui.
De acordo com a invenção, a molécula de ARN não poliadenilada compreende mais do que uma sequência de nucleótido especifica de alvo e particularmente a molécula de ARN não poliadenilada pode compreender sequências de nucleótido especificas com sentido e anti-sentido alvo em que as sequências de nucleótido com sentido e anti-sentido são essencialmente complementares uma à outra e capazes de formar uma estrutura em alfinete artificial como descrito em Waterhouse et ai., 1998 ou no pedido de PCT, PCT/IB99/00606.
Também será claro que a molécula de ARN não poliadenilada pode compreender um ou vários elementos que estabilizam o ARN. Como aqui utilizado, "um elemento que estabiliza o ARN" é uma sequência de nucleótido a qual quando incluida em uma molécula de ARN prolonga o tempo de meia-vida daquela molécula de ARN, isto é protege-a de ser degradada. Os elementos preferidos que estabilizam o ARN incluem sequências de haste em circulo estáveis, tais como as sequências de haste em circulo encontradas no ARNm codificado pelos genes de histonas em células de mamiferos, as quais estão envolvidas na estabilidade que confere ao ARNm de histona. Um exemplo de uma tal sequência de codificação de haste em circulo de histona está incluido em 22 SEQ ID NO. 7. As sequências homólogas ou as sequências equivalentes funcionais para a sequência de SEQ ID NO. 7, derivadas de outros organismos, particularmente de plantas também podem ser usadas para o mesmo efeito. A inclusão de um tal elemento que estabiliza o ARN em uma molécula de ARN não poliadenilada, ou de uma sequência de nucleótido que codifica um tal elemento que estabiliza o ARN em um gene quimérico que codifica a molécula de ARN não poliadenilada pode aumentar adicionalmente a eficiência do silenciamento génico do gene alvo.
Como indicado em cima, a introdução do ARN não poliadenilado especifico de alvo no núcleo de uma célula de planta pode ser convenientemente conseguida pela transcrição de um ARN que codifica o ADN quimérico introduzido no núcleo, preferivelmente integrado de maneira estável no genoma nuclear de uma célula de planta.
Em uma forma de realização preferida da invenção, o ARN não poliadenilado especifico de alvo pode ser produzido no núcleo de uma célula de planta pela transcrição de um ADN quimérico que codifica um primeiro ARN especifico de alvo, o qual pode ser adicionalmente processado pela ação de uma ribozima também presente, e preferivelmente também codificado por um gene quimérico, na célula de planta para produzir um segundo ARN não poliadenilado especifico de alvo. Será claro para o especialista na técnica que 0 processamento de ARN não necessita de ser posteriormente mas pode ocorrer simultaneamente. Em uma forma de realização particularmente preferida a ribozima é uma ribozima de auto-ligação a qual está compreendida dentro do transcrito do ARN especifico de alvo gerado. 23
Assim, em uma forma de realização particularmente preferida da invenção, um método é fornecido para reduzir a expressão fenotipica de um ácido nucleico de interesse, o qual é normalmente capaz de ser expresso em uma célula de planta, compreendendo o método o passo de introdução no genoma nuclear da célula de planta de um ADN quimérico para gerar uma célula de planta transgénica, compreendendo o ADN quimérico as seguintes partes operacionalmente ligadas: a) uma região de promotor expressável de planta; b) uma região de ADN especifica de alvo; c) uma região de ADN que codifica uma ribozima de auto-ligação, e d) uma região de ADN envolvida na formação e na poliadenilação da extremidade 3' em que o ADN quimérico quando transcrito produz uma primeira molécula de ARN que compreende uma sequência de nucleótido especifica de alvo e uma ribozima de auto-ligação, a qual quando clivada pela autocatálise produz uma segunda molécula de ARN que compreende uma sequência de nucleótido especifica de alvo em que a extremidade 3' da primeira molécula de ARN que compreende o local de poliadenilação foi removida. 0 método pode compreender opcionalmente além disso o passo de regenerar a célula de planta transgénica em uma planta transgénica.
Como aqui utilizada, "uma ribozima" é uma molécula de ARN catalítica que tem a capacidade intrínseca de quebrar e formar ligações covalentes em ácidos ribonucleicos em locais específicos na ausência de um co-factor diferente de um catião bivalente. 24
Como aqui utilizado uma "ribozima de auto-ligação" ou "ribozima de auto-clivagem" é uma ribozima capaz da autocatálise em um local especifico dentro daquela ribozima. As ribozimas de auto-ligação preferidas são ribozimas de auto-ligação com uma assim chamada estrutura de cabeça de martelo. No entanto, é esperado que as ribozimas de auto-clivagem com uma outra conformação tal como as estruturas de auto-clivagem de alfinete encontradas na cadeia menos de intermediários de replicação por exemplo de nepovirus também podem ser usadas para o mesmo efeito.
As ribozimas de auto-ligação particularmente preferidas são aquelas envolvidas na replicação dos ARNs patogénicos de plantas pequenos circulares, tais como mas não limitadas à ribozima de auto-ligação do viroide de manchas solares no abacate, viroide de mosaico latente no pêssego, viroide matizado clorótico no crisântemo, viroide associado com o definhamento do cravo, o transcrito 2 do satélite de Newt, Neurospora versus ARN, ARN satélite do virus da cevada amarela anã, ARN satélite do virus de mosaico de arabis, ARN SI satélite do vírus manchado de amarelo da chicória, ARN satélite do virus de faixas passageiras da Luzerna, ARN satélite do vírus das manchas em anel do tabaco, ARN satélite do vírus de manchas de trevo subterrâneo, ARN satélite de vírus de manchas de solanum nodiflorum, ARNvSCMoV satélite do vírus de manchas de tabaco aveludado ou o ARNcscARNl semelhante ao viroide circular pequeno da cerejeira. A tabela 1 lista diferentes variantes de ribozimas convenientes para a invenção, bem como uma referência para a sua sequência de nucleótido.
As regiões de ADN que codificam as ribozimas de auto-ligação podem ser cópias de ADNc de parte dos ARNs 25 patogénicos de plantas mencionados que compreendem a ribozima, ou podem ser o ADN sintético. Também compreendidas estão as variantes tais como os mutantes incluindo substituições, eliminações ou inserções de nucleótidos dentro da sequência de nucleótido da ribozima de tal modo que a capacidade autocatalitica das ribozimas não é substancialmente alterada.
Preferivelmente, a região de ADN que codifica a ribozima de auto-ligação é localizada imediatamente a montante da região de ADN que codifica a formação da extremidade 3' e o sinal de poliadenilação. No entanto, tendo lido a especificação, o especialista na técnica realizará imediatamente que a região de ADN que codifica a ribozima de auto-ligação pode estar compreendida dentro do gene quimérico que codifica o ARN não poliadenilado em outras posições, contanto que um segundo ARN suficientemente grande que compreende um nucleótido especifico de alvo em que o local de poliadenilação é removido possa ser gerado.
Será claro que quando um elemento que estabiliza o ARN (ou sequência de ADN que codifica um tal elemento que estabiliza o ARN) está incluido, o elemento que estabiliza o ARN também deve preceder preferivelmente imediatamente a região de ADN que codifica a ribozima de auto-ligação. No entanto o elemento que estabiliza o ARN pode estar incluido em outras posições, contanto, que esteja localizado no ARN não poliadenilado para processamento pela ribozima. 26 26 Tabela 1
Diferentes ribozimas de auto-clivagem
Espécie de ARN Referência Acesso Cordão (+) Cordão (-) Viroide de manchas solares no abacate Symons 1981 Nucleic Acids Res. 9 6527-6537 JC2020 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante C-10 do Viroide de manchas solares no abacate Rakowski and Symons 1989 Virology 173 352-356 M31100 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante B-l do Viroide de manchas solares no abacate Rakowski and Symons 1989 Virology 173 352-356 M31086 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante A-2 do Viroide de manchas solares no abacate Rakowski and Symons 1989' Virology 173 352-356 M31085 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante B-2 do Viroide de manchas solares no abacate Rakowski and Symons 1989 Virology 173 352-356 M31087 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante C-2 do Viroide de manchas Rakowski and Symons 1989 Virology 173 352-356 M31092 cabeça de martelo cabeça de martelo solares no abacate Variante B-3 do Viroide de manchas solares no abacate Rakowski and Symons 1989 Virology 173 352-356 M31088 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante C-3 do Viroide de manchas solares no abacate Rakowski and Symons 1989 Virology 173 352-356 M31093 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante B-4 do Viroide de manchas solares no abacate Rakowski and Symons 1989 Virology 173 352-356 M31089 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante C-4 do Viroide de manchas solares no abacate Rakowski and Symons 1989 Virology 173 352-356 M31094 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante B-5 do Viroide de manchas solares no abacate Rakowski and Symons 1989 Virology 173 352-356 M31090 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante C-5 do Viroide de manchas solares no abacate Rakowski and Symons 1989 Virology 173 352-356 M31095 cabeça de martelo cabeça de martelo 27
Variante. B-6 do Viroide de manchas solares no abacate Rakowski and Symons 1989 Virology 173 352-356 M31091 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante C-6 do Viroide de manchas solares no abacate Rakowski and Symons 1989 Virology 173 352-356 M31098 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante C-7 do Viroide de manchas solares no abacate Rakowski and Symons 1989 Virology 173 352-358 [431097 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante C-8 do Viroide de manchas solares no abacate Rakowski and Symons 1989 Virology 173 352-356 [431098 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante C-9 do Viroide de manchas solares no abacate Rakowski and Symons 1989 Virology 173 352-356 M3I099 cabeça de martelo cabeça de martelo ASBVd-B do Viroide de manchas solares no abacate Semancik and Szychowski 1994 J. Gen Virol.75 1543-1549 S74687 cabeça de martelo cabeça de martelo AS3Vd-V do Viroide de manchas solares no abacate Semancik and Szychowski 1994 J. Gen Virol.75 1543-1549 S73881 cabeça de martelo cabeça de martelo PMLVd.l do Viroide de mosaico latente no pêssego Hernandez and Flores 1992 Prac.Natl.Aca d . Sd.89 3711-3715 M83545 cabeça de martelo cabeça de martelo PMLVd.2 do Viroide de mosaico latente no pêssego Hernandez and Flores 1992 Proc.Natl-Aca d . Sd.89 3711-3715 cabeça de martelo cabeça de martelo Viroide de mosaico latente do Pêssego no pêssego de Itália Schamloul et ai. 1995 Acta Hortic. 386 522-530 cabeça de martelo cabeça de martelo Viroide de mosaico latente do Pêssego na cerejeira do Canadá Hadini et al. 1997 Plant Dis. 81, 154-158 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante gds2 do Viroide de mosaico latente do Pêssego Ambros et al. 1998 J. Virai. 72 7397-7406 AJO05294 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante gds21 do Viroide de mosaico latente do Pêssego Ambros et al. 1998 J. Virai. 72 7397-7406 AJO05295 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante gdsl5 do Viroide de mosaico latente do Pêssego Ambros et al. 1998 J. Virai. 72 7397-7406 AJ005296 cabeça de martelo cabeça de martelo 28
Variante gds23 do Viroide de mosaico latente do Pêssego Ambros et al. 1998 J. Virai. 72 7397-7406 AJ005297 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante gdsl8 do Viroide de mosaico latente do Pêssego Ambros et al. 1998 . J. Virai. 72 7397-7406 AJO 05298 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante gdsl do Viroide de mosaico latente do Pêssego Arrbros et al. 1998 J. Virai. 72 7397-7406 AJ005299 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante gds3 do Viroide de mosaico latente do Pêssego Arrbros et al. 1998 J. Virai. 72 7397-7406 AJ005300 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante gds!9 do Viroide de mosaico latente do Pêssego Arrbros et ei. 1998 J. Virai. 72 7397-7406 AJ005301 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante gds!3 do Viroide de mosaico latente do Pêssego Ambros et al. 1998 J. Virai. 72 7397-7406 AJ005302 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante gds6 do Viroide de mosaico latente do Pêssego Ambros et al. 1998 J. Virai. 72 7397-7406 AJ005303 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante gds!6 do Viroide de mosaico latente do Pêssego Ambros et al. 1998 J. Virai. 72 7397-7406 AJ005304 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante esc8 do Viroide de mosaico latente do Pêssego Ambros et al. 1998 J. Virai. 72 7397-7406 AJ005305 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante esc!6 do Viroide de mosaico latente do Pêssego Ambros et al. 1998 J. virai. 72 7397-7406 AJ005308 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante esc5 do Viroide de mosaico latente do Pêssego Arrbros et al. 1998 J. Virol. 72 7397-7408 AJ005307 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante esc!2 do Viroide de mosaico latente do Pêssego Arrbros et al. 1998 J. Virai. 72 7397-7406 AJ005308 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante esclO do Viroide de mosaico latente do Pêssego Ardoros et al. 1998 J. Virai. 72 7397-7406 AJ005309 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante esc!4 do Viroide de mosaico latente do Pêssego Arrbros et al. 1998 J. Virol. 72 7397-7406 AJO 05310 cabeça de martelo cabeça de martelo 29
Variante Is4b do Viroide de mosaico latente do Pêssego Arrbros et al. 1998 J. Virol. 72 7397-7406 AJO 05311 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante Isl6b do Viroide de mosaico latente do Pêssego Ardoros et al. 1998 J. Virai. 72 7397-7406 AJ005312 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante Isl7b do Viroide de mosaico latente do Pêssego Arrbros ei ai. 1998 J. Virai. 72 7397-7406 AJ005313 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante Isl do viroide de mosaico latente do Pêssego Arrbros et al. 1998 J. Virai. 72 7397-7406 AJ005314 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante Isl8b do Viroide de mosaico latente do Pêssego Arrbros et al. 1998 J. Virol. 72 7397-7406 AJ005315 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante Isll do Viroide de mosaico Arrbros et al. 1998 J. Virai. 72 7397-7406 AJO05316 cabeça de martelo cabeça de martelo latente do Pêssego Variante Is8 do Viroide de mosaico latente do Pêssego Arrbros et al. 1998 J. Virai. 72 7397-7406 AJ005317 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante Isl9b do Viroide de mosaico latente do Pêssego Arrbros et al. 1998 J. Virai. 72 7397-7406 AJ005318 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante Is5b do Viroide de mosaico latente do Pêssego Arrbros et al. 1998 J. Virol. 72 7397-7406 AJ005319 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante Isllb do Viroide de mosaico latente do Pêssego Arrbros et al. 1998 J. Virai. 72 7397-7406 AJ005320 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante Is6b do Viroide de mosaico latente do Pêssego Ambros et al. 1998 J. virai. 72 7397-7406 AJ005321 cabeça de martelo cabeça de martelo Variante Isl4b do Viroide de mosaico latente do Pêssego. Ambros et al. 1998 J. Virol. 72 7397-7406 AJO05322 cabeça de martelo cabeça de martelo viroide matizado clorótico no crisântemo Navarro and Fiares 1997 Prac. Natl. Acad. Sd. 94 11262-11267 Y14700 cabeça de martelo cabeça de martelo arn satélite do vírus da cevada amarela anã Miller et al. 1991 Virology 183 711-720 M63666 cabeça de martelo cabeça de martelo 30 ARN satélite do vírus de mosaico de Arabis Kaper et ai: 1988 Bi ochem.Bi ophy s . Res. Com. 154 318-325 M21212 cabeça de martelo grampo ARN SI satélite do vírus manchado de amarelo da chicória Rubino et al. 1990 J.Gen Virol. 71 1897-1903 D00721 cabeça de martelo grampo RNA LTSV-N satélite do vírus de faixas passageiras da Luzerna Keese et al. 1983 FEBS Lett. 159 185-190 X01985 cabeça de martelo cabeça de martelo RNA LTSV-A satélite do vírus de faixas passageiras da Luzerna Keese et al. 1983 EEBS Lett. 159 185-190 X01984 cabeça de martelo cabeça de martelo RNA LTSV-C satélite do vírus de faixas passageiras da Luzerna Abouhaidar and Pallwal 1988 J. Gen. Virology 69 2369-2373 000341 cabeça de martelo cabeça de martelo ARN.1 satélite do vírus das manchas em anel do tabaco Buzayan et al. 1988 Virology 151, 186-199 M14879 cabeça de martelo grampo ARN.2 satélite do vírus das manchas em anel do tabaco Buzayan et al. 1987 Virology 160, 95-99 Ml 7 4 3 9 cabeça de martelo grampo ARN.l satélite do vírus de manchas de trevo subterrâneo Davies et al. 1990 Virology 177, 216-224 M33001 cabeça de martelo ARN.2 satélite do vírus de manchas de trevo subterrâneo Davies et al. 1990 Virology 177, 216-224 M33000 cabeça de martelo ARN satélite de vírus de manchas de solanum nodiflorum Haseloff and Symons 1982 Nucleic Acids Res. 10 3681-3691 J02388 cabeça de martelo ARN.l semelhante ao Viroide do vírus circular de manchas do de tabaco aveludado Haseloff and Symons 1982 Nucleic Acids Res. 10 3881-3691 cabeça de martelo ARN.2 semelhante ao Viroide do vírus circular de manchas do de tabaco aveludado Haseloff and Symons 1982 Nucleic Acids Res. 10 3681-3691 J02439 cabeça de martelo ARN semelhante ao Viroide circular pequeno da cerejeira Dl Serio et al. 1997 J. Virol. 71 6603-6610 Y12833 cabeça de martelo modificado. cabeça de martelo modificado . 31 ARN-1 semelhante ao Viroide pecjaeno do. cravo Hernandez et al. 1992 Nucleic Acids Re s. 20 6323-6329 X68034 cabeça de martelo cabeça de martelo ARN-2 semelhante ao Viroide pecjaeno do cravo Hernandez et al. 1992 Nucleic Acids Re s. 20 6323-6329 cabeça de martelo cabeça de martelo transcrito 2 do satélite (Newt) de Notophtalmus viridescens Epstein et al. 1986 J. Cell. Biol. 103 1137-1144 X04478 cabeça de martelo Neurospora versus ARN Saville and Collins 1990 Cell 61 885-696 M32974 VS KNA de auto-clivagem adn satélite de Schistosoma Ferbeyre et al. 1998 Mol-Cell.Biol 18 3880-3888 AF036739 A utilização de ribozimas em organismos transgénicos para gerar moléculas de ARN com extremidades 5' e ou 3' de interesse foi documentada na técnica. Rubio et al. 1999, descrevem a proteção de largo espectro contra as Tombusviruses extraídas por interferência incorreta de (Dl) ARNs em plantas transgénicas. Para produzir ARNs com extremidades 5' e 3' autênticas idênticas àquelas do Dl ARN natural, a sequência de Dl ARN transcrita de uma cassete de ADN foi flanqueada por ribozimas. As plantas transgénicas Nicotiana benthamiana foram melhor protegidas do que as plantas não transgénicas contra a infecção pelo virus de redução espesso do tomate e pelos tombusvlrus relacionados. Os Dl ARNs interferem drasticamente com a acumulação de virus através da competição eficaz com virus parentérico para factores de manejamento necessárias para a replicação. Egli e Braus, 1994 descrevem a não ligação da clivagem de 3' de ARNm e a poliadenilação pela expressão de uma ribozima de cabeça de martelo na levedura. Eckner et al. 1991 descreveram que os transcritos génicos de teste os quais podiam obter uma extremidade 3' de histona madura pela atividade de clivagem do ARN de uma ribozima de cis-atuação, logrando assim a extremidade 3' celular que 32 processa a maquinaria foram verificados como sendo o transporte deficiente e acumulado no compartimento nuclear. No entanto, estes documentos na técnica não estão relacionados a métodos para inibir a expressão fenotípica por silenciamento génico dependente da homologia, particularmente por PTGS.
Uma ribozima de auto-ligação particularmente preferida é a ribozima compreendido com o ARN satélite do virus da cevada amarela anã (BYDV), bastante particularmente o ARN satélite encontrado em BYDV isolados do serotipo de RPV.
Foi verificado que a redução da expressão fenotípica do ácido nucleico de interesse usando um gene quimérico de acordo com a invenção foi mais eficiente usando uma cópia de ADNc da ribozima compreendida dentro da cadeia menos do ARN satélite de BYDV. Por conseguinte, as ribozimas que mostram uma atividade autocatalítica semelhante à atividade autocatalítica da ribozima compreendida dentro da cadeia menor do ARN satélite de BYDV são especialmente ajustadas para os métodos da invenção. A atividade autocatalítica das ribozimas pode ser comparada com a atividade autocatalítica da cadeia (-) do ARN satélite de BYDV como descrito por Miller et al. 1991. 0 motivo da ribozima dentro da cadeia (-) do ARN satélite de BYDV foi identificado como a sequência de nucleótido de SEQ ID NO. 1 a partir do nucleótido na posição 194 para o nucleótido na posição 236. 0 motivo da ribozima dentro da cadeia (+) do ARN satélite de BYDV foi identificado como a sequência de nucleótido de SEQ ID NO. 2 a partir do nucleótido na posição 310 para o nucleótido na posição 322 seguido pela sequência de nucleótido de SEQ ID NO. 2 a 33 partir do nucleótido na posição 1 para o nucleótido na posição 89.
Continua sem se dizer que mais do que uma região de ADN que codifica uma ribozima pode estar compreendida dentro do gene quimérico. Estas ribozimas podem ser agrupadas, por exemplo podem estar todas localizadas na região que imediatamente procede a região de ADN que codifica á formação da extremidade 3' e do sinal de poliadenilação.
No entanto, é esperado que mais de uma região de ADN que codifica uma ribozima possa estar compreendida dentro do gene quimérico de tal modo que sobre a auto-clivagem mais do que uma molécula de ARN não poliadenilado compreendendo cada uma, uma sequência de nucleótido especifica de alvo seja gerada. Um tal ADN quimérico pode compreender assim: a) um promotor expressável de planta b) uma primeira região de ADN especifica de alvo c) uma região de ADN que codifica uma primeira ribozima de auto-ligação d) uma segunda região, de ADN especifica de alvo e) uma região de ADN que codifica uma segunda ribozima de auto-ligação f) uma região de ADN que codifica uma formação da extremidade 3' e o sinal de poliadenilação. A primeira e a segunda ribozima de auto-ligação podem ser idênticas, essencialmente semelhantes ou diferentes. Do mesmo modo, a primeira e a segunda região de ADN especifica de alvo que codifica o ARN com uma sequência de nucleótido especifica de alvo podem ser idênticas, essencialmente semelhantes ou diferentes. 34
Por razões práticas, pensa-se que o número de regiões de ADN que codificam uma ribozima dentro de um gene quimérico singular não deve exceder cinco.
Em uma forma de realização preferida, o ácido nucleico de interesse, cuja expressão fenotípica é visada para ser reduzida, é um gene incorporado no genoma de uma célula eucariótica, particularmente uma célula de planta. Será apreciado que os meios e os métodos da invenção possam ser usados para a redução da expressão fenotípica de um gene que pertence ao genoma da célula como ocorrendo naturalmente, (um gene endógeno) , bem como para a redução da expressão fenotípica de um gene que não pertence ao genoma da célula como ocorrendo naturalmente, mas que foi introduzido naquela célula (um transgene). 0 transgene pode ser introduzido de maneira estável ou transitoriamente, e pode estar integrado no genoma nuclear da célula, ou estar presente em um vector de replicação, tal como um vector virai.
Em uma outra forma de realização preferida, o ácido nucleico de interesse, cuja expressão fenotípica é visada para ser reduzida é um ácido nucleico virai, particularmente uma molécula de ARN virai, capaz de infectar uma célula eucariótica, particularmente uma célula de planta. Neste caso, o fenótipo a ser reduzido é a replicação do vírus, e por fim, os sintomas de doença causados pelo vírus da infecção.
Para o objectivo da invenção, o termo "promotor expressável de planta" significa um promotor o qual é capaz de transcrição de condução em uma célula de planta. Isto inclui qualquer promotor da origem de planta, mas também 35 qualquer promotor da origem de não planta o qual é capaz de dirigir a transcrição em uma célula de planta. Uma grande variedade de promotores expressáveis em plantas, está disponível para dirigir a transcrição dos genes quiméricos da invenção. Estes incluem, mas não são limitados a promotores fortes tais como os promotores de CaMV35S (por exemplo, Harpster et al., 1988). À luz da existência de formas de variantes do promotor de CaMV35S, como conhecido pelo especialista, o objectivo da invenção pode ser igualmente conseguido empregando esses promotores de CaMV35S alternativos e variantes. É também claro que outros promotores expressáveis de plantas, particularmente os promotores constitutivos, tais como os promotores da sintase das opinas dos Ti- ou Ri-plasmídeos de Agrobacterium, particularmente um promotor da sintase da nopalina, ou os promotores do vírus do trevo subterrâneo podem ser usados para se obterem efeitos semelhantes. Também contemplados pela invenção são os genes quiméricos para reduzir a expressão fenotípica de um ácido nucleico em uma célula, os quais estão sob o controlo dos promotores específicos da polimerase do ARN bacteriófago de subunidade singular, tal, como um promotor específico de T7 ou de T3, contanto que as células hospedeiras também compreendam a polimerase do ARN correspondente em uma forma ativa. É um objectivo adicional da invenção, o de fornecer métodos para reduzir a expressão fenotípica de um ácido nucleico em células específicas, particularmente em células de plantas específicas colocando os genes quiméricos da invenção sob o controlo de promotores específicos de tecido ou específicos de órgão. Tais promotores específicos de tecido ou específicos de órgão são bem conhecidos na técnica e incluem mas não são limitados a promotores específicos de 36 sementes (por exemplo, W089/03887), promotores específicos de um órgão primordial (An et ai., 1996), promotores específicos de caule (Keller et al. , 1988), promotores específicos de folhas (Hudspeth et al., 1989), promotores específicos de mesofilo (tal como os promotores de Rubisco indutíveis pela luz), promotores específicos de raiz (Keller et al., 1989), promotores específicos de tubérculo, (Keil et al., 1989), promotores específicos do tecido vascular (Peleman et al., 1989), os promotores seletivos de estame (WO 89/10396, WO 92/13956), promotores específicos em zonas de deiscência (WO 97/13865) e os semelhantes.
Em uma outra forma de realização da invenção, a expressão de um gene quimérico para reduzir a expressão fenotípica de um ácido nucleico de alvo pode ser controlada à vontade pela aplicação de um indutor químico apropriado, por se ligar operacionalmente a região de ADN transcrita dos genes quiméricos da invenção a um promotor cuja expressão é induzida por um composto químico, tal como o promotor do gene divulgado no pedido de patente europeia ("EP") 0332104, ou o promotor do gene divulgado no documento WO 90/08826.
Será claro para o especialista na técnica que o mesmo efeito na redução da expressão fenotípica de um ácido nucleico em uma célula de planta pode ser conseguida usando uma ribozima de trans-ligação para remover pelo menos o local de poliadenilação do transcrito de ARN de um gene quimérico que compreende um promotor expressável de planta, uma região de ADN específica de alvo e uma região de ADN que codifica uma terminação de extremidade 3' e o sinal de poliadenilação para gerar o ARN não poliadenilado que compreende uma sequência de nucleótido específica de alvo. 37
Como aqui utilizado "uma ribozima de trans-ligação" é uma molécula de ARN capaz de catalisar o fraccionamento ou a formação de uma ligação covalente dentro de outra molécula de ARN em um local especifico. A ribozima de trans-ligação deve ser escolhida ou designada de tal modo que reconheça um local especifico precedente, preferivelmente imediatamente precedendo o sinal de poliadenilação do transcrito de ARN que compreende uma sequência de nucleótido especifica de alvo. Os métodos para designar tal ribozima de trans-ligação com a atividade da endorribonuclease são conhecidos na técnica (ver por exemplo Haselhoff e Gerlach, 1988, WO 89/05852). A região de ADN que codifica uma ribozima de trans-ligação pode estar compreendida dentro do gene quimérico que codifica o ARN especifico de alvo. Sobre a transcrição do gene quimérico uma molécula de ARN que compreende a ribozima de trans-ligação e a sequência de nucleótido especifica de alvo pode depois ser gerada, em que a ribozima de trans-ligação é capaz de clivagem de um local especifico que precede o local de poliadenilação de outra molécula de ARN semelhante, para gerar moléculas de ARN especificas de alvo não poliadeniladas. A ribozima de trans-ligação também pode ser fornecida pela expressão de um outro gene quimérico que codifica uma molécula de ARN que compreende a ribozima de trans-ligação na mesma célula de planta, de acordo com os métodos e os meios disponíveis na técnica (ver por exemplo Vaish et al. 1998; Bramlage et al. 1998). 38
Os métodos alternativos podem existir para fornecer o ARN especifico de alvo não poliadenilado ao núcleo, de uma célula de planta. Tais métodos incluem por exemplo a transcrição de um gene quimérico, integrado no genoma nuclear de uma célula de planta que compreende uma região de ADN especifica de alvo, por uma polimerase de ARN dependente do ADN diferente da polimerase II de ARN, tal que os transcritos de ARN são gerados independentes da maquinaria normal de processamento do ARNm (incluindo a ligação do intrão, a protecção e a poliadenilação). Isto pode ser conseguido por exemplo por se ligar operacionalmente a região de ADN especifica de alvo a uma região de promotor, reconhecida por uma polimerase de ARN de subunidade singular de um bacteriófago, tal como mas não limitado à polimerase de T7, e uma região de ADN que compreende um terminador para uma tal polimerase. Neste caso, a célula de planta necessita de ser provida com um gene quimérico que codifica a polimerase do ARN correspondente. 0 fornecimento do ARN especifico de alvo não poliadenilado ao núcleo de uma célula de planta também pode ser realizado por exemplo por se ligar operacionalmente a região de ADN especifica de alvo a uma região de promotor, reconhecida por uma polimerase I ou III do ARN eucariótico, e uma região de ADN que compreende um terminador para uma tal polimerase. Os meios e os métodos para a construção de tais genes quiméricos e células de plantas são descritos detalhadamente no documento WO 97/49814. Uma outra alternativa para fornecer o ARN especifico de alvo não poliadenilado ao núcleo de uma célula de planta pode incluir a transcrição de um gene quimérico que compreende uma região de ADN especifica de alvo operacionalmente ligado a um promotor expressável de planta e ligado a uma região de ADN que compreende o sinal 39 de formação de uma extremidade 3' mas não um sinal de poliadenilação.
Embora não pretendendo limitar a invenção a um modo especifico de ação, é esperado que os mecanismos que desencadeiam o silenciamento génico dependente da homologia da célula, particularmente o mecanismo de co-supressão, é a acumulação do ARN especifico de alvo no núcleo daquela célula. 0 fornecimento de ARN não poliadenilado ao núcleo da célula pode ser um mecanismo de causar a acumulação do ARN especifico de alvo em um núcleo de uma célula, mas outras aberrações tais como a ausência de uma estrutura de tampão ou a presença de intrões persistentes etc. podem constituir formas alternativas de causar a acumulação do ARN especifico de alvo no núcleo de uma célula.
Além disso, é esperado que outras aberrações nas moléculas de ARN especificas de alvo em adição à ausência da extremidade de polyA, incluindo a ausência de uma estrutura de proteção, ou a presença de intrões persistentes ou a presença de estruturas secundárias anormais, particularmente a presença de estruturas de alfinete gigantes, possam ter um efeito cumulativo na inibição do trânsito normal do ARN do núcleo para o citoplasma e por conseguinte terem um efeito cumulativo ou sinérgico na redução da expressão fenotípica de um ácido nucleico de interesse. 0 ADN recombinante que compreende o gene quimérico para reduzir a expressão fenotípica de um ácido nucleico de interesse em uma célula hospedeira, pode ser acompanhado por um gene marcador quimérico, particularmente quando a integração estável do transgene no genoma da célula 40 hospedeira é visionada. O gene marcador quimérico pode compreender um ADN marcador que é operacionalmente ligado na sua extremidade 5' a um promotor, que funciona na célula hospedeira de interesse, particularmente um promotor expressável de planta, preferivelmente um promotor constitutivo, tal como o promotor de CáMV 35S, ou um promotor induzivel da luz tal como o promotor do gene que codifica a pequena subunidade de Rubisco; e operacionalmente ligado na sua extremidade 3' para a formação da extremidade 3' da transcrição de planta conveniente e sinais de poliadenilação. É esperado que a escolha do ADN marcador não seja critica, e que qualquer ADN marcador conveniente possa ser usado. Por exemplo, um ADN marcador pode codificar uma proteína que fornece uma cor distinguível à célula de planta transformada, tal como o gene AI (Meyer et ai., 1987), pode fornecer resistência ao herbicida para a célula de planta transformada, tal como o gene de bar, codificando a resistência à fosfinotricina (EP 0,242,246), ou pode fornecer resistência ao antibiótico às células transformadas, tal como o gene aac(6'), codificando a resistência à gentamicina (W094/01560).
Um ADN recombinante que compreende um gene quimérico para reduzir a expressão fenotípica de um gene de interesse, pode ser de maneira estável incorporado no genoma nuclear de uma célula de uma planta. A transferência génica pode ser executada com um vector que é um Ti-plasmídeo desarmado, compreendendo um gene quimérico da invenção, e transportado por Agrobacterium. Esta transformação pode ser executada utilizando os procedimentos descritos, por exemplo, no documento EP 0 116 718. 41
Alternativamente, qualquer tipo do vector pode ser usado para transformar a célula de planta, aplicando métodos tal como a transferência genética direta (como descrito, por exemplo, no documento EP 0 233 247), a transformação mediada por pólen (como descrito, por exemplo, nos documentos EP 270 356, WO 85/01856 e US 4,684,611), a transformação mediada pelo virus do ARN de planta (como descrito, por exemplo, nos documentos EP 0 067 553 e US 4,407,956), a transformação mediada por lipossoma (como descrito, por exemplo, no documento EU 4,536,475), e os semelhantes outros métodos, tais como o bombardeamento de micro-projétil como descrito para o milho por Fromm et ai. (1990) e Gordon-Kamm et ai. (1990), são também convenientes. As células de plantas monocotiledóneas, tal como a maioria dos cereais, também podem ser transformadas usando tecido embriogénico compacto degradado por enzima e/ou ferido capaz de formar calo embriogénico compacto, ou embriões imaturos degradados e/ou feridos como descrito no documento WO 92/09696. A célula de planta transformada resultante pode depois ser usada para regenerar uma planta transformada de uma maneira convencional. A planta transformada obtida pode ser usada em um esquema de procriação convencional para produzir mais plantas transformadas com as mesmas características ou para introduzir o gene quimérico para a redução da expressão fenotipica de um ácido nucleico de interesse da invenção em outras variedades da mesma espécie de plantas ou relacionadas, ou em plantas hibridas as sementes obtidas das plantas transformadas contêm os genes quiméricos da invenção como uma inserção genómica estável. 42
Os meios e os métodos da invenção também podem ser usados para a redução da expressão genética pela co-supressão em células e organismos eucarióticos.
Em uma forma de realização a invenção fornece um método para reduzir a expressão fenotipica de um ácido nucleico de interesse, o qual é normalmente capaz de ser expresso em uma célula eucariótica, compreendendo o passo de fornecer o ARN não poliadenilado que compreende mais de uma sequência de nucleótido especifica de alvo incluindo uma sequência de nucleótido com sentido especifica de alvo de pelo menos 20 nucleótidos consecutivos com 100 % de identidade de sequência da sequência de nucleótido do ácido nucleico de interesse, ao núcleo da célula eucariótica.
Em outra forma de realização, é fornecido um método para reduzir a expressão fenotipica de um ácido nucleico de interesse, o qual é normalmente capaz de ser expresso em uma célula eucariótica, compreendendo o passo da introdução no genoma nuclear da célula eucariótica de um ADN quimérico para gerar uma célula de planta transgénica, compreendendo o ADN as seguintes partes operacionalmente ligadas: (a) uma região de promotor funcional na célula eucariótica; (b) uma região de ADN especifica de alvo que compreende mais de uma sequência de nucleótido especifica de alvo incluindo uma sequência de nucleótido de pelo menos 20 nucleótidos consecutivos com 100 % de identidade da sequência à sequência de nucleótido do ácido nucleico'de interesse; (c) uma região de ADN que codifica uma ribozima de auto-ligação; e 43 (d) uma região de ADN envolvida na formação e na poliadenilação da extremidade 3' em que o ADN quimérico quando transcrito produz uma primeira molécula de ARN que compreende uma sequência de nucleótido especifica de alvo e uma ribozima de auto-ligação, a qual quando clivada pela autocatálise produz uma segunda molécula de ARN que compreende uma sequência de nucleótido especifica de alvo em que a extremidade 3' da primeira molécula de ARN que compreende o local de poliadenilação foi removida.
As formas de realização preferidas diferentes e as definições descritas em relação com a redução da expressão genética pelo silenciamento génico dependente da homologia em células de plantas e em plantas também se aplicam com as mudanças necessárias aos meios e métodos descritos para a redução da expressão génica pela cosupressão em células e organismos eucarióticos. Como aqui utilizadas "células eucarióticas" compreendem células de plantas, células de animais e células humanas e células de leveduras e fungos bem como as culturas de tais células. É um objectivo adicional da invenção o de fornecer células eucarióticas, preferivelmente células de plantas e organismos (preferivelmente plantas) que compreendem os genes quiméricos para a redução da expressão fenotipica de um ácido nucleico alvo como descrito na invenção.
Os métodos e os meios da invenção podem ser assim usados para reduzir a expressão fenotipica de um ácido nucleico em uma célula eucariótica ou organismo, em particular uma célula de planta ou uma planta, para se obter a resistência ao rompimento (WO 97/13865), para se obterem modelos de cores de flores modificados (EP 522 880, US 5,231,020), 44 para se obterem plantas resistentes a nemátodes (WO 92/21757, WO 93/10251, WO 94/17194), para atrasar a maturação dos frutos (WO 91/16440, WO 91/05865, WO 91/16426, WO 92/17596, WO 93/07275, WO 92/04456, US 5,545,366), para se obter a esterilidade masculina (WO 94/29465, WO 89/10396, WO 92/18625), para se reduzir a presença de metabolitos não desejados (secundários) em organismos, tais como os glucosinolatos (WO 97/16559) ou o conteúdo de clorofila (EP 779364) em plantas, para se modificar o perfil dos metabolitos sintetizados em uma célula eucariótica ou organismos por engenharia metabólica por exemplo por se reduzir a expressão de determinados genes envolvidos no metabolismo de carboidratos (WO 92/11375, WO 92/11376, US 5,365,016, WO 95/07355) ou a biossintese de lípidos (WO 94/18337, US 5, 530, 192), para se atrasar a senescência (WO 95/07993), para se alterar a lenhificação em plantas (WO 93/05159, WO 93/05160), para se alterar a qualidade da fibra no algodão (OS 5,597,718), para se aumentar a resistência ao esmagamento em batatas reduzindo a polifenoloxidase (WO 94/03607), etc.
Os métodos da invenção levarão a melhores resultados e/ou eficiências mais elevadas quando em comparação com os métodos que usam as sequências de nucleótido com sentido ou anti-sentido convencionais e acredita-se que outros mecanismos específicos de sequência que regulam a expressão fenotípica dos ácidos nucleicos de alvo poderiam estar envolvidos e/ou ligados pela presença das moléculas de ARN de cadeia dupla descritas nesta especificação.
Uma determinada aplicação para a redução da expressão fenotípica de um transgene em uma célula de planta, entre outros, por métodos com sentido ou anti-sentido, foi 45 descrita para a restauração da fertilidade masculina, sendo a última obtida pela introdução de um transgene que compreende um ADN de esterilidade masculino (WO 94/09143, WO 91/02069). O ácido nucleico de interesse é especificamente o ADN da esterilidade masculina.
Novamente, os processos e os produtos descritos nesta invenção podem ser aplicados a esses métodos para chegar a uma restauração mais eficiente da fertilidade masculina.
Será apreciado que os métodos e os meios descritos na especificação também possam ser aplicados nos métodos da Alta Quantidade Tratada de Proteção (HTS), para a identificação ou a confirmação de fenótipos associados com a expressão de uma sequência de ácido nucleico com a função até aqui não identificada em uma célula eucariótica, particularmente em uma célula de planta.
Um tal método compreende os passos de: 1. selecionar uma sequência alvo dentro da sequência de ácido nucleico de interesse com função/fenótipo não identificada ou não confirmada quando expressa. Preferivelmente, se o ácido nucleico tiver estruturas de leitura abertas putativas, a sequência alvo deve compreender pelo menos parte de uma dessas estruturas de leitura aberta. O comprimento da sequência de nucleótido alvo pode variar de aproximadamente 10 nucleótidos até um comprimento que iguala o comprimento (em nucleótidos) do ácido nucleico de interesse com a função não identificada. 2. introduzir um ADN quimérico no núcleo de uma célula hospedeira conveniente, que compreende o ácido nucleico de 46 interesse, em que o ADN quimérico compreende uma região de promotor conveniente para a expressão na célula hospedeira, uma região de ADN que codifica a sequência de nucleótido especifica de alvo, e uma região de ADN que codifica uma ribozima de auto-ligação localizada imediatamente a montante de uma região de ADN envolvida na formação e na poliadenilação da extremidade 3'. 3. observar o fenótipo por um método conveniente. Dependendo do fenótipo esperado, pode ser suficiente observar ou medir o fenótipo em uma célula singular, mas também pode ser necessário a cultura das células para se obter um nivel multicelular (organizado), ou mesmo regenerar um organismo transgénico, particularmente uma planta transgénica. É também claro que os métodos e os meios da invenção são ajustados para a redução da expressão fenotípica de um ácido nucleico em todas as células de plantas de todas as plantas, quer elas sejam plantas monocotiledóneas ou dicotiledóneas, particularmente em plantas de cultura de milho tal como mas não limitado a milho, arroz, trigo, cevada, cana-de-açúcar, algodão, colza oleaginosa, soja, vegetais (incluindo a chicória, vegetais de brássica, alface, tomate), tabaco, batata, beterraba sacarina mas também as plantas usadas na horticultura, floricultura ou florestal. Os meios e os métodos da invenção serão particularmente ajustados para plantas que têm genomas complexos, tais como plantas poliplóides. É esperado que as moléculas de ARN quiméricas produzidas pela transcrição dos genes quiméricos descritos aqui, possam estender-se sistemicamente em todas as partes de uma 47 planta, e assim ser possível reduzir a expressão fenotípica de um ácido nucleico em células de um descendente não transgénico de uma planta enxertada para um pé-mãe transgénico que compreende os genes quiméricos do método da invenção (ou vice-versa) o qual pode ser importante em horticultura, viticultura ou na produção de frutos.
Os Exemplos seguintes descrevem a construção de genes quiméricos para a redução da expressão fenotípica de um ácido nucleico de interesse em uma célula eucariótica e a utilização de tais genes. A menos que afirmado de outra maneira nos Exemplos, todas as técnicas de ADN recombinante são executadas de acordo com os protocolos padrão como descrito em Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NI e nos Volumes 1 .e 2 de Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Blology, Current Protocols, USA. Os materiais padrão e os métodos para o trabalho molecular de plantas são descritos em Plant Molecular Blology Labfax (1993) por R.D.D. Croy, juntamente publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (UK) e Blackwell Scientific Publications, UK.
Em todas as partes da descrição e dos Exemplos, é feita referência às sequências seguintes:
SEQ ID NO. 1: cópia de ADNc da cadeia (-) do ARN satélite de BYDV RPV
SEQ ID NO. 2: cópia de ADNc da cadeia (+) do ARN satélite de BYDV RPV SEQ ID NO. 3
oligonucleótido de amplificação de PCR (SatPRl) 48
SEQ ID NO. 4 oligonucleótido (SatPR2) de amplificação de PCR SEQ ID NO. 5 oligonucleótido (SatPR3) de amplificação de PCR SEQ ID NO. 6 oligonucleótido de amplificação de PCR (SatPR4)
Exemplos
Exemplo 1: Procedimentos experimentais 0 seguinte constitui um exemplo de referência 1.1 Construções de ADN quimérico
Construções do gene de GUS que contém a ribozima e uma construção de controlo
As sequências de ribozima usadas são as sequências de auto-clivagem de cadeia positiva ou de cadeia negativa do ARN satélite do serotipo RPV do virus anão amarelo da cevada (BYDV) , o qual foi isolado na Indústria de Plantas CSIRO (SEQ ID 1 e 2; Miller et al., 1991).
As duas construções de GUS que contêm a ribozima (pMBW259 e pMBW267) e uma construção de GUS de controlo (pMBW265) estão esquematicamente desenhadas na Figura 1. o pMBW259 contém dois locais de clivagem de cadeia positiva, enquanto o pMBW267 contém o local de clivagem de cadeia negativa.
Para fazer estas construções, uma sequência de gene de (GUS) βρ1υσυΓοηίά33β foi modificada para conter um local de Ncol em volta do ATG de partida de tradução e clonada em 49 pART7 (Gleave, 1992) nos locais de Xhol/EcoRI, formando o pMBW258. A sequência satélite de BYDV-RPV de comprimento completo foi amplificada por PCR utilizando os iniciadores SatPRl (SEQ ID NO. 3) e SatPR4 (SEQ ID NO. 6), digerida com BamHl e clonada em pMBW258 no local de BamHI, e a cassete 35S-GUS-Sat-ocs resultante foi excisada e clonada em pART27 (Gleave, 1992), formando o pMBW265. A mesma sequência satélite de comprimento completo foi inserida no local de BamHI de pMBW258 mas na orientação anti-sentido, e a 35S-GUS-asSat-ocs resultante foi clonada em pART27 para dar origem a pMBW267.
Para fazer o pMBW259, as metades 3' e 5' das sequências de ARN satélite foram amplificadas por PCR utilizando os pares de iniciadores SatPR3 (SEQ ID NO. 5) e SatPR4 (SEQ ID NO. 6), e utilizando SatPRl (SEQ ID NO. 3) e SatPR2 (SEQ. ID NO. 4), respectivamente. A fusão da sequência de comprimento completo com as sequências de metade de 3' e de metade de 5' foi feita através da ligação entre as extremidades de Hpal e EcoRV dos três fragmentos de PCR. Esta fusão imita as formas multiméricas naturais do ARN de satélite, e por conseguinte mantém a propriedade de clivagem do cordão positivo das formas nativas. A sequência de fusão foi clonada no pGEM-3Z (Promega) nos locais de Sacl/Psti, excisada com HindIII/EcoRI, embotada, e inserida em pART7 no local de Smal, no qual a sequência de GUS descrita em cima foi depois clonada nos locais de Xhol/EcoRI. A 3SS-GUS-Sat-ocs resultante foi inserida em pART27 no local de Notl, formando o pMBW259. 50
A super-transformação da construção de GUS O fragmento de BamHI foi excisado de pIG121 Hm (Hiei et al., 1994) e clonado em pART7. A sequência de GUS-nos foi depois excisada por Accl, embotada, e inserida em pBluescript no local de HincII. A região de promotor de 1.3 Kb do gene de PP2 de uma proteína de floema de cucurbit foi excisada com NotI/HindIII de um clone CPPI.3 lambda e clonada no plasmídeo Bluescript acima mencionado. Ο PP2-GUS-nos resultante foi excisado com NotI/Kpnl e inserido em pWBVec2 (Wang et ai., 1998), dando origem a pBPPGH (Fig. D · 1.2 Transformação de tabaco O W38 de Nicotiana tobaccum cv. foi transformado e regenerado em plantas inteiras essencialmente como descrito por Ellis et al. 1987. Para as construções pMBW259, pMBW265 e pMBW267, 50 mg/L de canamicina foram incluídos nos meios para a seleção do tecido transformado. Para a construção pBPPGH, 25 mg/L de higromicina B foi usado.
1.3 Ensaio de GUS A expressão do gene de GUS foi ensaiada histoquimicamente ou' fluorometricamente de acordo com Jefferson et al. 1987.
Exemplo 2: a expressão de GUS no tabaco transgénico transformado com um tipo único de construções de GUS.
Neste exemplo de referência, as plantas transgénicas que contêm pMBW259 e pMBW267 mostraram níveis muito baixos de expressão de GUS, como julgado pela ausência de coloração 51 de GUS ou pelo azul ténue. As plantas transformadas com pMBW265 mostraram mais expressão de GUS do que com pMBW259 e pMBW2 67, mas o nível foi muito mais baixo do que em plantas transformadas com pBPPGH. As melhores linhas de pMBW265 expressaram 13,3 % da atividade de GUS por uma média da linha de pBPPGH.
Exemplo 3: a expressão de GUS em linhas super-transformadas que contêm o pEPPGH e uma das três outras construções do Exemplo 1.
Neste exemplo de referência, com a finalidade de promover o silenciamento de um gene de GUS normal pela presença da sequência de ribozima próximo da extremidade 3' do transcrito do gene de GUS, as plantas que contêm pMBW259, pMBW265 ou pMBW267 e pBPPGH foram construídas por re-transformação. Os ensaios de GUS histoquímicos dos super-transformantes mostraram que o antecedente pMBW267 deu proporções substancialmente mais elevadas de transformantes do que o antecedente pMBW259 ou pMBW265 que mostrou níveis baixos da expressão de GUS como indicado pela falta de forte e uniforme coloração azul. Os super-transformantes que contêm pBPPGH e pMBW265 mostraram a melhor expressão de GUS . A tabela 2 mostra o resultado do ensaio fluorométrico de GUS (MUG) dos super-transformantes. As linhas (E e F) contendo pBPPGH e pMBW267 mostraram a expressão de GUS uniformemente baixa comparada com outras linhas. A melhor expressão de GUS veio das linhas C as quais contêm pBPPGH e pMBW2 65. 52
Tabela 2: Ensaio de MUG de linhas de tabaco super- transformadas*.
Linhas super- transformadas Leituras de MUG Linhas super- transformadas Leituras de MUG Linhas super- transformadas Leituras de MUG AI 10,1 Cl 8,84 E] . 4,32 A2 15, 8 C2 16,9 E2 3,15 A3 30, 6 C3 17, 9 E3 3,56 A4 47,3 C4 22, 8 E4 3,31 A5 0,29 C5 11,7 E5 3, 68 A6 10, 3 C6 14, 5 E6 5,02 A7 5,8 C7 44, 0 E7 2,63 A8 13,15 C8 19,0 E8 10, 27 A9 7,34 C9 29, 8 E9 10, 81 AIO 9,76 010 32, 1 E10 13, 1 A 11 17,74 Cll 37, 1 Eli 5,10 A12 34,B C12 2,51 E12 2,86 AI 3 4,33 Cl 3 14, 5 E13 4,00 AI 4 3,41 Cl 4 25, 8 E14 16, 8 AI 5 11,2 Cl 5 7,20 E15 4,02 AI 6 2,04 Cl 6 30, 2 EI 6 1,29 AI 7 13,.29 Cl 7 9,70 E17 1,78 AI 8 14, 6 Cl 8 13, 4 E1B 3,57 AI 9 0,14 Cl 9 19,3 EI 9 0,43 A2 0 17,2 C20 17, 0 E20 11, 8 A21 9,22 Dl 6,01 F1 5,73 A22 17,3 D2 12.9 F2 5.10 BI 9.57 D3 0.19 F3 4.16 B2 44.7 D4 7,88 F 4 4,69 B3 17,7 D5 1,24 F5 0 B4 1,25 D6 0,44 F6 1,93 B5 13, 5 D7 14,1 F7 3,21 B6 LI, 4 D8 0, 91 F8 2,77 B7 6, 28 D9 5,49 F9 1,86 B8 24,8 Dl 0 1,30 F10 3,27 139 16,3 Dl 1 15, 1 Fll 2,85 BI 0 9, 72 Dl 2 6, 63 F12 3.25 53 BI 1 3, 71 Dl 3 12,2 F13 2,17 BI 2 0, 08 Dl 4 15, 8 F14 2,84 BI 3 20, 6 Dl 5 1,32 F15 3,11 BI 4 11,9 Dl 6 2,29 F16 2,06 BI 5 3,11 Dl 7 3,59 F17 2,90 BI 6 8,25 Dl 8 ' 22, 1 F18 3,75 BI 7 4, 12 Dl 9 13, 0 F19 4,16 BI 8 6, 04 D2 0 ' 4,37 F20 2,49 * A e B, de super-transformação de duas linhas de pMBW259 independentes com pBPPGH; C e D, de super-transformação de duas linhas de pMBW265 independentes com pBPPGH; E e F, transformação de duas linhas de pMBW267 independentes
Entre as três construções testadas, o pMBW265 não contém as sequências de ribozima funcional de comprimento completo do ARN satélite de BYDV em uma elasticidade continua, e é por conseguinte esperado que produza principalmente poly(A)+ARN. 0 pMBW259 contém duas cópias da sequência de ribozima de cadeia positiva, e deve dar origem ao ARN que tem extremidades de poly(A) removidas pela clivagem da ribozima. 0 pMBW267 contém a ribozima de cadeia negativa. A ribozima de cadeia negativa foi previamente mostrada como sendo muito mais eficiente (pelo menos em 10 vezes) do que a ribozima de cadeia positiva (Miller et ai., 1991), e por conseguinte é esperado que o pMBW267 produza poly(A)- ARN mais eficientemente. A nossa experiência mostrou que as linhas super-transformadas que têm o antecedente pMBW267 expressaram uniformemente niveis baixos da atividade de GUS em comparação com as linhas que têm o antecedente pMBW259 ou o pMBW2 65. As linhas de expressão de GUS mais elevadas foram do antecedente pMBW265, o qual não produz poly(A)- ARN. 54
Exemplo 4. Construções de ADN quimérico adicionais
As construções de ADN quimérico adicionais são feitas usando técnicas de clonagem de ADN convencionais e introduzidas em plantas que compreendem os genes alvo apropriados
Construções silenciadoras de GUS de tipo 1 (apenas para referência)
As construções de GUS que contém ribozima semelhantes a pMBW259 e pMBW267 (ver o Exemplo 1) são adaptadas para incluir uma sequência de nucleótido que codifica um elemento que estabiliza o ARN (genes da histona de mamíferos que formam o tronco da histona; SEQ ID NO. 7) entre a sequência de nucleótido derivada do gene de GUS e a montante da região de ADN que codifica a ribozima.
Construções silenciadoras de GUS de tipo 2 (apenas para referência)
As construções de GUS que contêm ribozima semelhantes a pMBW259 e pMBW267 (ver o Exemplo 1), mas em que a sequência de nucleótido derivada do gene de GUS está na orientação anti-sentido (isto é oposta a estas sequências homólogas em pMBW259 e pMBW267) são adaptadas para incluírem uma sequência de nucleótido que codifica um elemento que estabiliza o ARN (genes da histona de mamíferos que formam o tronco da histona; SEQ ID NO. 7) entre a sequência de nucleótido derivada do gene de GUS e a montante da região de ADN que codifica a ribozima. 55
Construções silenciadoras de GUS de tipo 3
Os genes de silenciamento do Gus quimérico são construidos de forma semelhante aos genes de silenciamento do GUS quimérico descritos no documento WO 99/53050 (particularmente na página 36) que compreendem uma região de ADN adicional que codifica uma ribozima entre a região de ADN que codifica o ARN de alfinete e a região de ADN que codifica a terminação da transcrição e poliadenilação. Estas construções compreendem os elementos seguintes • um promotor de CaMV35S (como descrito no Exemplo 1) • uma sequência de nucleótido de pelo menos 500 pb derivada do gene de GUS na orientação com sentido • uma sequência de nucleótido espaçadora (por exemplo compreendendo aproximadamente 700 bp do gene PVY Nia, ver o documento W099/53050) • o complemento da sequência de nucleótido derivada do gene de GUS (isto é a parte do gene de GUS na orientação anti-sentido) • uma região de ADN que codifica a ribozima como em pMBW259 e pMBW267 (Exemplo 1) • um terminador ocs-T (como descrito no Exemplo 1)
Construções de resistência de PVY
Os genes de resistência de PVY quiméricos são construidos compreendendo os elementos seguintes • um promotor de CaMV35S (como descrito no Exemplo 1) • uma sequência de nucleótido que compreende aproximadamente 700 bp do gene de PVY Nia, ver, o documento W099/53050) na orientação com sentido 56 • uma sequência de nucleótido espaçadora (por exemplo parte do gene de GUS) • o complemento da sequência de nucleótido derivada de PVY (isto é a parte da sequência de PVY na orientação anti-sentido) • uma região de ADN que codifica a ribozima como em pMBW259 e pMBW267 (Exemplo 1) • um terminador ocs-T (como descrito no Exemplo 1)
Quando as construções silenciadoras de Gus são analisadas, as plantas transgénicas compreendem um transgene de GUS funcional e as construções silenciadoras são introduzidos quer por transformação direta das plantas que contêm o gene de GUS transgénico ou por atravessamento das plantas transgénicas apropriadas.
Quando as construções silenciadoras de PVY são usadas, as plantas transgénicas que compreendem as construções silenciadoras de PVY são inoculadas com PVY, de acordo com os métodos padrão (ver o documento WO 99/53050).
Em plantas transgénicas que contêm o transgene de GUS, a expressão de GUS é eficientemente silenciada depois da introdução das construções silenciadoras de GUS na maioria das linhas transgénicas obtidas.
As plantas transgénicas que contêm os genes de resistência de PVY, são extremamente resistentes à infecção por PVY na maioria das linhas transgénicas obtidas.
REFERÊNCIAS
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<210> 1 <211> 322 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Se.quência Artificial: ARN de satélite do vírus anão amarelo da cevada (cordão negativo) <4 00> 1 . tatccacgaa ataggaagtc gatcttttgc aagagtagcg aactcgttgc tctgtgaaag 60 attgatcgat tgtttcocgg tgtctcaagg tgcgtacctt gactgatgag tccgaaagga 120 cgaaacacca gtgttccagt gcgagcgaaa gctcgggctg aacaaacacg taaagcaagt 180 ctcctcattc gaaagagtgg tggccacotg gtggtgccac aattggagat ctttacttcg 240 gtggatttct gtatctattt gttggacgag gcaccagcct tctagtccgc gcggatacgt 300 cgtcagacag tacgcgctct gt 322
<210 2 <211> 322 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220 <223> Descrição da Sequência Artificial: ARN de satélite do vírus anão amarelo da cevada (cordão positivo) <400> 2 60 acagagcgcg tactgtctga cgacgtatcc gcgcggacta gaaggctggt gcctcgtcca 60 acaaatagat acagaaatcc accgaagtaa agatctccaa ttgtggoaoc accaggtggc 120 caccactctt tgaagtgagg agacttgctt tacgtgtttg ttaageccga gctttegota 180 gcactggaac actggtgttt cgtcctttcg gactcatcag tcaaggtacg caacttgaga 240 caccgggaaa caatcgatca atctttcaca gagcaacgag ttcgotactc ttgcaaaaga 300 tcgacttcct atttcgtgga ta 322
<210> 3 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: oligonucleótido; iniciador SATPR1 de PCR ' <400> 3 cgcggatccg ttaacagagc gcgtactgtc tg 32
<210> 4 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0>
<223> Descrição da Sequência Artificial: oligonucleótido; iniciador SATPR2 de PCR <4 00> 4 gccgagctca agtctcctca cttcaaag 28 61 < 2 1 0 > 5 <211> 28 <212 > ADN <2 13> Sequência Artificial < 2 2 0 > < 2 2 3> Descrição da Sequência Artificial: oi igonucleósido; iniciador SATFR2 de PC R <4 30> 5 gççctgcagc tttacgtçft tgttcagc 28 < 2 1 0 > 6 < 2 11 > 32 < 2 12 > ADN <213> Sequência Ari i f 1 cia .1 <320 > < 2 2 3 > descrição da Sequência Artificial: oliganacleótide; iniciador SATPR4 de ?CR <400 6 gcggçatccq ararccacga aataggaaçt cg 32 <21 C> 7 < 211 > 21 <212 > ADN < 2 1 3 > Sequência Artificial <220 A fO NJ V Descrição da Sequência Artificial: sequência de r.ucleótidc que codifica o tronco da histona do gene da historia de um mamífero < 4 0 0 > 7 ctgcaggccc ttatcagggo c 21
Lisboa, 31 de Julho de 2012

Claims (52)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para reduzir a expressão fenotípica de um ácido nucleico de interesse, o qual é normalmente capaz de ser expresso numa célula eucariótica, compreendendo o referido método o passo de fornecer ao núcleo da referida célula eucariótica uma molécula de ARN não poliadenilado compreendendo mais de uma sequência nucleotidica especifica do alvo, a referida mais de uma sequência nucleotidica especifica do alvo incluindo uma sequência nucleotidica com sentido especifica do alvo essencialmente semelhante a parte de uma molécula de ARN transcrita ou produzida a partir do ácido nucleico de interesse, em que a referida sequência nucleotidica com sentido especifica do alvo inclui uma sequência de cerca de 20 nucleótidos consecutivos com 100% de identidade de sequência com a parte correspondente do ácido nucleico alvo em que o referido método não é um método de tratamento do corpo humano ou animal através de cirurgia ou terapia, ou um método de diagnóstico praticado no corpo humano ou animal.
2. Método da reivindicação 1 caracterizado por a referida mais de uma sequência nucleotidica especifica do alvo incluir também uma sequência nucleotidica anti-sentido especifica do alvo essencialmente semelhante ao complemento de parte de uma molécula de ARN transcrita ou produzida a partir do referido ácido nucleico de interesse, e as referidas sequências nucleotídicas com sentido e anti-sentido especificas do alvo serem essencialmente complementares umas às outras e serem 2 capazes de formar uma estrutura em alfinete uma com a outra.
3. Método da reivindicação 2 caracterizado por a referida sequência nucleotidica anti-sentido especifica do alvo incluir uma sequência de cerca de 20 nucleótidos consecutivos com 100% de identidade de sequência com a parte correspondente do ácido nucleico alvo.
4. Método da reivindicação 1 ou 2 caracterizado por a referida sequência nucleotidica com sentido especifica do alvo ter uma identidade de sequência de pelo menos cerca de 95% com a referida parte de uma molécula de ARN transcrita ou produzida a partir do referido ácido nucleico de interesse.
5. Método da reivindicação 4 caracterizado por a referida sequência nucleotidica com sentido especifica do alvo ter uma identidade de sequência de cerca de 100%, muito especialmente ser idêntica, à referida parte de uma molécula de ARN transcrita ou produzida a partir do referido ácido nucleico de interesse.
6. Método da reivindicação 2 caracterizado por a referida sequência nucleotidica anti-sentido especifica do alvo ter uma identidade de sequência de pelo menos cerca de 95% com o referido complemento de parte de uma molécula de ARN transcrita ou produzida a partir do referido ácido nucleico de interesse.
7. Método da reivindicação 6 caracterizado por a referida sequência nucleotidica anti-sentido especifica do alvo ter uma identidade de sequência de cerca de 100%, 3 muito especialmente ser idêntica, ao referido complemento de parte de uma molécula de ARN transcrita ou produzida a partir do referido ácido nucleico de interesse.
8. Método da reivindicação 1 ou 2 caracterizado por a referida célula eucariótica ser uma célula animal.
9. Método da reivindicação 8 caracterizado por a referida célula animal ser uma célula humana.
10. Método da reivindicação 1 ou 2 caracterizado por a referida célula eucariótica ser uma célula cultivada.
11. Método da reivindicação 1 ou 2 caracterizado por a referida sequência nucleotidica com sentido especifica do alvo corresponder a um ou mais exões consecutivos do referido ácido nucleico de interesse.
12. Método da reivindicação 1 ou 2 caracterizado por a referida sequência nucleotidica com sentido especifica do alvo corresponder a uma região transcrita e traduzida do referido ácido nucleico de interesse.
13. Método da reivindicação 1 ou 2 caracterizado por a referida sequência nucleotidica com sentido especifica do alvo corresponder a uma região não traduzida do ARN produzido a partir do referido ácido nucleico de interesse.
14. Método da reivindicação 1 ou 2 caracterizado por o referido ARN não poliadenilado ser produzido através de transcrição de um gene quimérico compreendido 4 dentro da referida célula eucariótica, o referido gene quimérico compreendendo um promotor funcional na referida célula eucariótica operativamente ligado a uma região de ADN especifica do alvo codificando o referido ARN.
15. Método da reivindicação 14 caracterizado por o promotor ser um promotor constitutivo.
16. Método da reivindicação 14 caracterizado por o promotor ser um promotor indutivel.
17. Método da reivindicação 14 caracterizado por o promotor ser um promotor especifico do tecido.
18. Método da reivindicação 14 caracterizado por o promotor ser reconhecido por uma ARN-polimerase de subunidade única de um bacteriófago.
19. Método da reivindicação 14 caracterizado por o promotor ser reconhecido por uma ARN-polimerase I ou III eucariótica e o referido gene quimérico compreender ainda um terminador para a referida polimerase I ou III.
20. Método da reivindicação 1 ou 2 caracterizado por o ácido nucleico de interesse ser um gene incorporado no genoma da referida célula eucariótica. Método da reivindicação 1 ou 2 caracterizado por o ácido nucleico de interesse ser um gene endógeno da referida célula eucariótica.
21. 5
22. Método da reivindicação 1 ou 2 caracterizado por o ácido nucleico de interesse ser um transgene que foi introduzido na referida célula eucariótica.
23. Método da reivindicação 1 ou 2 caracterizado por o ácido nucleico de interesse ser um ácido nucleico virai.
24. Método da reivindicação 1 ou 2 caracterizado por o referido ARN não poliadenilado não possuir uma estrutura de proteção a 5'.
25. Método da reivindicação 1 ou 2 caracterizado por o referido ARN não poliadenilado compreender um intrão persistente.
26. Gene quimérico codificando uma molécula de ARN não poliadenilado, a referida molécula de ARN não poliadenilado compreendendo mais de uma sequência nucleotidica especifica do alvo, a referida mais de uma sequência nucleotidica especifica do alvo incluindo uma sequência nucleotidica com sentido especifica do alvo essencialmente semelhante a parte de uma molécula de ARN produzida a partir de um ácido nucleico de interesse, sendo a referida sequência nucleotidica com sentido especifica do alvo essencialmente semelhante a parte de uma molécula de ARN produzida a partir de um ácido nucleico de interesse e incluindo uma sequência de cerca de 20 nucleótidos consecutivos com 100% de identidade de sequência com a sequência de uma parte correspondente do referido ácido nucleico de interesse, em que o referido ácido nucleico de interesse está normalmente 6 presente numa célula eucariótica e em que o referido ARN não poliadenilado reduz a expressão do referido ácido nucleico de interesse quando proporcionado ao núcleo da referida célula, o referido gene quimérico compreendendo um promotor funcional na referida célula eucariótica operativamente ligado a uma região de ADN especifica do alvo codificando o referido ARN.
27. Gene quimérico da reivindicação 26, caracterizado por a referida mais de uma sequência nucleotidica especifica do alvo incluir também uma sequência nucleotidica anti-sentido especifica do alvo essencialmente semelhante ao complemento de parte de uma molécula de ARN produzida a partir do referido ácido nucleico de interesse, e as referidas sequências com sentido e anti-sentido especificas do alvo serem essencialmente semelhantes uma à outra e capazes de formar uma estrutura em alfinete uma com a outra.
28. Gene quimérico da reivindicação 27, caracterizado por a referida sequência nucleotidica anti-sentido especifica do alvo incluir uma sequência de cerca de 20 nucleótidos consecutivos com 100% de identidade de sequência com a correspondente parte do ácido nucleico alvo.
29. Gene quimérico da reivindicação 26 ou 27, caracterizado por a referida sequência nucleotidica com sentido especifica do alvo ter uma identidade de sequência de pelo menos cerca de 95% com a referida parte de uma molécula de ARN produzida a partir do referido ácido nucleico de interesse. 7
30. Gene quimérico da reivindicação 29, caracterizado por a referida sequência nucleotidica com sentido especifica do alvo possuir uma identidade de sequência de cerca de 100%, muito especialmente ser idêntica, à referida parte de uma molécula de ARN produzida a partir do referido ácido nucleico de interesse.
31. Gene quimérico da reivindicação 27, caracterizado por a referida sequência nucleotidica anti-sentido específica do alvo possuir uma identidade de sequência de pelo menos cerca de 95% com o referido complemento de parte de uma molécula de ARN produzida a partir do referido ácido nucleico de interesse.
32. Gene quimérico da reivindicação 31, caracterizado por a referida sequência nucleotidica anti-sentido específica do alvo possuir uma identidade de sequência de cerca de 100%, muito especialmente ser idêntica, ao referido complemento de parte de uma molécula de ARN produzida a partir do referido ácido nucleico de interesse.
33. Gene quimérico da reivindicação 26 ou 27 caracterizado por a célula eucariótica ser uma célula animal.
34. Gene quimérico da reivindicação 33 caracterizado por a célula animal ser uma célula humana.
35. Gene quimérico da reivindicação 26 ou 27 caracterizado por o ácido nucleico de interesse ser um gene incorporado no genoma da referida célula eucariótica. 8
36. Gene quimérico da reivindicação 26 ou 27 caracterizado por o ácido nucleico de interesse ser um gene endógeno da referida célula eucariótica.
37. Gene quimérico da reivindicação 26 ou 27 caracterizado por o ácido nucleico de interesse ser um transgene que foi introduzido na referida célula eucariótica.
38. Gene quimérico da reivindicação 26 ou 27 caracterizado por o ácido nucleico de interesse ser um ácido nucleico virai.
39. Gene quimérico da reivindicação 26 ou 27, caracterizado por o referido ARN não poliadenilado não possuir uma estrutura de proteção a 5'.
40. Gene quimérico da reivindicação 26 ou 27, caracterizado por o referido ARN não poliadenilado compreender um intrão persistente.
41. Gene quimérico da reivindicação 26 ou 27, caracterizado por o referido promotor ser reconhecido por uma ARN-polimerase I ou III eucariótica e em que o referido gene quimérico compreende ainda um terminador para a referida polimerase I ou III.
42. Célula eucariótica cultivada compreendendo o gene quimérico da reivindicação 26 ou 27 ou compreendendo no seu núcleo uma molécula de ARN não poliadenilado suscetível de ser produzida pelo gene quimérico da reivindicação 26 ou 27. 9
43. Célula eucariótica da reivindicação 42 que é uma célula animal.
44. Célula animal da reivindicação 43 que é uma célula humana.
45. Célula da reivindicação 42 que possui um fenótipo modificado em comparação com uma célula eucariótica correspondente sem o ARN não poliadenilado ou gene quimérico.
46. Organismo eucariótico não humano compreendendo a célula da reivindicação 42.
47. Organismo eucariótico não humano da reivindicação 46, que é um animal.
48. Célula eucariótica obtida através do método de qualquer uma das reivindicações 1 a 24.
49. Utilização in vitro do gene quimérico da reivindicação 26 ou 27 proporcionado ao núcleo da referida célula eucariótica para identificar o fenótipo associado com a expressão do referido ácido nucleico de interesse na referida célula eucariótica.
50. Utilização da reivindicação 49 caracterizada por o fenótipo ser observado após cultura das células eucarióticas.
51. Utilização da reivindicação 49 caracterizada por o fenótipo ser um perfil modificado de metabolitos sintetizados na referida célula. 10
52. Utilização do gene quimérico da reivindicação 26 ou 27 para produzir um ARN não poliadenilado através de transcrição do gene quimérico numa célula eucariótica. Lisboa, 31 de Julho de 2012
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