JPH11510376A

JPH11510376A - 遅発成熟性トマト

Info

Publication number: JPH11510376A
Application number: JP9505241A
Authority: JP
Inventors: ベッドブルック，ジョン，アール．; ダンスミュア，パメラ; ハウイー，ウィリアム，ジェイ．; ジョー，ローレンス，ケー．; リー，キャスリーン，ワイ．
Original assignee: ディーエヌエープラントテクノロジーコーポレイション
Priority date: 1995-06-30
Filing date: 1996-06-28
Publication date: 1999-09-14
Also published as: AU710874B2; AU6402996A; WO1997001952A1; EP0837624A1; MX9800118A; CA2226088A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、遅発成熟表現型を示すトマト植物を提供する。本発明の植物は、端が切り取られたAcc2遺伝子を含むＴ−DNA 挿入物を含む。Ｔ−DNA 挿入物の植物ゲノムへの一体化は、その果実におけるエチレン生合成を阻害する。

Description

【発明の詳細な説明】遅発成熟性トマト発明の背景本発明は、広くは、トマトの育種に関する。更に詳しくは、本発明は、トマトに遅発成熟表現型を与えるトランスジーンの導入に関する。植物ホルモンエチレンは、植物生理学に顕著な影響を及ぼす。少量で活性であり、いくつかの過程、例えば果実成熟，種子発芽、植物成長、葉及び花の老化、病原体感染、及びそれらの環境との植物の相互作用に影響を及ぼす。特に、エチレンは、果実の成熟に関連するいくつかの生理的変化、例えばカロチノイド色素の蓄積、葉緑体から有色体への変化、細胞壁デグラデーション酵素をコードする遺伝子の発現の増加、果実成熟及び病原体に対する感受性を誘導する。エチレンの効果の制御は、トマトにおいて果実熟成を制御する試みに特に役立つ。合衆国で現在売られているトマトの80％超（容量）が緑色のうちに取られている。栽培者は、いくつかの理由のため緑色のトマトを収穫する：（１）緑色トマトはより堅く引き締まっており、より傷つけることなく輸送及び取扱いに耐える；（２）緑色トマト収穫は、つる−成熟収穫より労力が少くかつコストもかからない；そして（３）緑色果実は天候又は有実生物からの損失の危険を減らす、より短期間、その場にとどまる。収穫の後、荷造人又は再荷造人は、トマトを赤色に進めるために緑色トマトをエチレンガスの外部ソースに露出する。これは果実を赤くするが、これらのトマトは緑色段階でとった場合、必ずしも十分な味にならないであろう。成熟し始めた果実は、成熟を遅らせるため低温で輸送される必要があるが、これらの低温は果実の質を劣化させる。頻繁に、緑色果実の一部が未成熟緑色段階で収穫されるが、それはエチレンの適用でさえ決して十分な成熟を達成しないであろうことを意味する。このようなトマトは、他の流通−損傷したトマトと共に、十分な味の潜在性を達成せず、現在の新鮮な市場トマトの消費者の不満に寄与する主な要因であると信じられる。トマト（及び他のいわゆるクリマクテリック果実）において、果実成熟は呼吸のバースト及び付随するエチレン生産の増加に関連する。いったん成熟が始まると、自己触媒的に内在性エチレン生産が始まる。エチレン生産を制御することができるなら、トマト果実は、味に寄与する果実構成物を進展させるためにより長くつる上に残しておくことができよう。本発明はこれら及び他の必要性に取り組む。発明の概要本発明は、実質的に配列番号：１と同一の配列を有する遺伝子座を含むトマト植物を提供する。その植物は、切断(breaker)段階に達した後に大きな成熟減損を示す果実を有する。特に、その果実は、その果実が切断段階で取られ、15℃で保存された場合に、切断段階後約２〜約３週間でピンク段階に達する。好ましい植物は受託番号でAmerican Type Culture Collectionに寄託された種子から発芽される。本発明は、本発明の植物からのトマト果実を更に提供する。本発明の果実は約 1.0nl／ｇ／hr未満、好ましくは約 0.5nl／ｇ／hr未満のエチレンレベルを有する。本発明は、トマト植物のエチレン産生を減少させる方法も提供する。本方法は、親トマト植物を本発明の遺伝子座を含むトマト植物と交配することを含む。その遺伝子座を含むトマト植物は、受託番号でAmerican Typ e Culture Collectionに寄託された種子から発芽する植物であり得る。本方法は、更に、果実が切断段階で取られ、15℃で保存された場合に、切断段階後約２〜約３週間でピンク段階に達する果実を有する子孫を選択するステップを含み得る。定義 “核酸配列”という句は、５′から３′端に向かって読まれるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーをいう。それは、自己複製プラスミド、DNA又は RNAの感染性ポリマー及び非機能性 DNA又は RNAの両方を含む。用語“トマト植物”には、完全なトマト植物、トマト植物の器官（例えば葉、幹、根等）、種子及びトマト植物細胞並びにそれらの子孫を含む。トマト植物は、それが種子から直接発芽され、又は普通の有性生殖の結果として植物もしくは種子（例えばＦ₁，Ｆ₂等）の子孫であるなら、種子又は他の植物 “から得られる(由来である)”。 “一次形質転換体”とは、組換え DNA構成物で試験管内で形質転換された１又は複数の植物細胞から再生された植物である。 “異種配列”とは、他の種由来のもの又はそれが同じ種からのものであるなら、そのもとの形態から実質的に変更されたものである。例えば、構造遺伝子に作用的に結合した異種プロモーターは、その構成遺伝子が得られたものから異なる種からのもの、又は同じ種からのものであるなら、その遺伝子中に通常存在するプロモーターから異なるもの、又は実質的にもとの形態から変更されたものである。２つの核酸配列又はポリペプチドは、その２つの配列中の各々のヌクレオチド又はアミノ酸残基の配列が、以下に記載されるように最大一致のためにアラインした場合に同じであるなら、“同一である”と呼ばれる。用語“相補的”とは、その配列が対照ポリヌクレオチド配列の全部又は一部と相補的であることを意味するとして本明細書で用いられる。２つ（又はそれ超）のポリヌクレオチド又はポリペプチドの間の配列比較は、典型的には、配列類似性の局所的領域を同定及び比較するために“比較窓”にわたって２つの配列を比較することにより行われる。本明細書に用いられる“比較窓”とは２つの配列を最適にアラインした後に配列を同数の連続位置の対照配列と比較し得る少くとも約20の連続部位、通常約50〜約 200、より普通は約 100〜約 150の連続部位のセグメントをいう。比較のための配列の最適なアラインメントは、Smith及びWaterman（Adv．Appl ．Math．2：482(1981)）の局所的相同性アルゴリズムにより、Needleman及びWun sch（J．Mol．Biol．48：443(1970)）の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Pearson及びLipman（Proc．Natl．Acad．Sci.（U．S．A.）85：2444(1988) ）の類似性法のための調査により、これらのアルゴリズムのコンピューター化して行うこと(GAP，BESTFIT，FASTA，及びTFASTA（Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group(GCG)，575 Science Dr.，Madison，WI）により、又は視察により行うことができる。 “配列同一性の割合”は、比較窓にわたって２つの最適にアラインされた配列を比較することにより決定され、ここで比較窓中のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントのための（付加又は欠失を含まない）標準配列と比較して、付加又は欠失（即ちギャップ）を含み得る。その割合（％）は、同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が両配列中にある位置の数を測定して適合した位置の数を算出し、比較の窓内の位置の総数で適合した位置の数を割り、そしてその結果に 100をかけて配列同一性の割合（％）を算出することによって計算される。ポリヌクレオチド配列の“実質的な同一性”という用語は、ポリヌクレオチドが、標準パラメータを用いる上述のプログラム(好ましくはBESTFIT)を用いて対照配列と比較して、少くとも60％、好ましくは少くとも80％、より好ましくは少くとも90％、そして最も好ましくは少くとも95％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。当業者は、コドン縮退、アミノ酸類似性、及び読み枠位置等を考慮することにより、２つのヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するようにこれらの値を適切に調節することができる。これらの目的のためのアミノ酸配列の実質的な同一性は、通常、少くとも40％、好ましくは少くとも60％、より好ましくは少くとも90％、そして最も好ましくは少くとも95％の配列同一性を意味する。ヌクレオチド配列が実質的に同一であることの他の指示は、２つの分子がストリンジェント条件下で互いにハイブリダイズする場合である。ストリンジェント条件は配列依存性であり、異なる環境で異なるだろう。一般に、ストリンジェント条件は、規定されたイオン強度及びpHにおいて特定の配列について熱的融点( Ｔm)より約５℃低くなるように選択される。Ｔm は、標的配列の50％が完全に適合したプローブにハイブリダイズする（規定されたイオン強度及びpH下での）温度である。典型的には、ストリンジェント条件は、塩濃度がpH７で約0.02モーラーであり、温度が少くとも約60℃であるものであろう。図面の簡単な記載図１は、pWTT2144／AccSのＴ−DNA 領域の概略図である。図２は、ゲノムマッピングに用いたハイブリダイゼーションプローブの位置を示すpWTT2144／AccSのＴ−DNA 領域の制限マップである。図３は、Acc2ゲノム領域及びAcc2 cDNA 並びに1345−４形質転換体におけるトランスジーン構造を決定するためにプローブとして用いたフラグメントを示す概略図である。図４は、本発明のＴ−DNA 挿入の構造を示す概略図である。好ましい実施形態の記載本発明は、その植物に遅発性果実成熟表現型を供する安定に組み込まれた遺伝子座を含むトマト植物（Lycopersicon esculentum ）を提供する。特に、本発明のトマト植物は、トマト果実特異的アミノシクロプロパンカルボキシレート(Acc )シンターゼ遺伝子由来の配列（AccSトランスジーン）を含むが機能的 Accシンターゼ酵素をコードしたいＴ−DNA 挿入物を含む。 Accシンターゼは、ｓ−アデノシルメチオニンを、エチレンの直接の前駆体である１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸に転化する速度制限性酵素である。以下に詳説するように、トマト植物ゲノム内のAccSトランスジーンの組込みは、Accシンターゼ遺伝子の発現を阻害する。Accシンターゼ生合成の阻害は、エチレン生合成のレベルを減少させる。これにより、トランスジーンを含むトマト植物の果実は、遅発性の成熟表現型を示すが、通常外部からエチレンが適用された場合に成熟する。本明細書に用いる場合“AccSトランスジーン”は、カリフラワーモザイクウィルスからの35Ｓプロモーター及びアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agro bacterium tumefaciens ）からのnos3 ′末端配列に融合されたトマトAcc2遺伝子からの端を切り取られたコード化領域である。特に、Acc2遺伝子からの配列は、ヌクレオチド 149〜ヌクレオチド1237からなる配列である(Rottmanら、J．Mol． Biol．222； 937〜961(1991))。本発明の植物は、次の領域：（１）LB、アグロバクテリウム（Agrobacterium ）Ｔ−DNA の左ボーダー領域；（２）2Xpnos、アグロバクテリウムからのノパリンシンターゼ遺伝子のタンデム複製非翻訳プロモーター領域；（３）nptII、Tn ５からのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子；（４）ocs3′、アグロバクテリウムからのオクトパインシンターゼ遺伝子の３′非翻訳遺伝子領域；（５）LacZ′、非翻訳LacZポリリンカー配列；（６）p35S、カリフラワーモザイクウィルスからの35Ｓプロモーター；（７）Cab22L、35Ｓプロモーターに融合されたペチュニアからのCab22R遺伝子の５′非翻訳領域に相当するリーダー配列；（８）AccS、トマトAcc2遺伝子の塩基 149〜塩基1237の端を切りとられたコード化領域；（９）nos3′、アグロバクテリウムからのノパリンシンターゼ遺伝子の非翻訳３′領域；及び（10）RB、アグロバクテリウムＴ−DNA の右ボーダー領域を有するＴ−DNA を含む構成物でのトマト植物細胞の形質転換から直接的又は間接的に得られる。本発明の“Ｔ−DNA 挿入物”は、上述のＴ−DNA の３つのコピーを含む。その３つのコピーは、LB及びRBにおける逆方向反復で配置される。LB−LB及びRB−RB 連結部において、各々の結合部において唯一の完全なボーダーがあるように、１つのボーダーが削除される。Ｔ−DNA 構造のいずれの端のLB及びRBも削除される。上述のＴ−DNA を含む典型的なプラスミド、pWTT2144／AccSは以下に詳説される。このプラスミドは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介形質転換技術を用いてトランスジェニックトマト植物を作り出すのに用いられる。センス方向におけるトマトゲノム内へのAccSトランスジーンの安定な挿入は、対応する内因性Acc2遺伝子の発現の下降制御及び成熟する果実のエチレン生合成の削減を生じ得る。その技術に、Transwitch^TM抑制（米国特許第 5,283,184号）の一例である。Transwitch^TM遺伝子抑制の１つの特徴は、標的遺伝子mRNAの蓄積の減少（定常状態 RNAの削減）である。その特性（抑制のレベル）は、最初の有性世代を通して選択された後、単純なメンデルの様式にふるまう。本発明の方法は、新鮮な取引又はトマト生産を処理するためのいずれのトマト（大きな果実の又はサクランボの）過程の果実成熟を遅らせるのにも用いることができる。用いることができる典型的な品種は、本質的に全ての市販の品種を含む。適切なトマトのリストについては、Rick(Evolution of Crop Plants N．W． Simmonds，ed．pp 268〜273(Longman，London，1976))及びTaylor(The Tomato C rop pp 1〜35(Chapman and Hall，London，1986))を参照のこと。本発明のトマト植物は、本発明のＴ−DNA 挿入物を含む植物をその挿入物を欠くいずれかのトマト品種と交配することによって得ることができる。トマト植物を交配するのに用いられるいずれの普通の方法も、要求される植物のゲノム内にトランスジーンを挿入するのに用いることができる。一般に、本方法は、一方の親の除雄、次の他方の親からの花粉の、最初の親の柱頭への適用を含む。交配は、花粉の親としての親のいずれかを用いて行うことができる。受粉後に花の発達が終わるなら、胚救出を行うこともできる。Ｔ−DNA 挿入物を含む植物は、一次形質転換体由来の植物であり得、又はその因子が有性交配により導入されている植物であり得る。好ましい本発明の植物は、受託番号でAmerican Type Culture Collection（ATCC）に寄託された種子由来のものである。遅発性成熟表現型を示すトマト植物がそのゲノム内に本発明のＴ−DNA 挿入物を含むか否かを決定するためにいくつかの方法を用いることができる。トマト果実の成熟を記載するために本明細書に用いられる用語は、例えばThe Tomato Cro p Atherton and Rudich eds.（Chapman Hall，1986）に記載される標準成熟クラスに従う。所定の果実についての成熟クラスを表１に示す。本発明の植物の果実は、開花後約40〜約70日間、通常開花後約45〜60日の間にブレーカー段階に達する。しかしながら、その果実は、成熟阻害の点で野生型果実と大きく異なる。つる上で、本発明の植物の果実は、典型的には、野生型より長いブレーカー段階に５〜７日、保持される。成熟欠損果実におけるブレーカー段階から明赤色段階への遷移は、野生型果実についての遷移に対して更に遅らせられる。フィールド条件下で、本発明の果実は、典型的には、ブレーカー段階から明赤色段階に進むのに約21日を必要とするのに対し、野生型果実は典型的には、ブレーカー段階から赤色段階に移るのに４〜５日を必要とする。フィールド条件下の成熟欠損果実は、なお、赤色段階に達することなく、明赤色段階にいつまでもとどまることができる。ブレーカー段階でとられ、15℃で保存されたつるから取られた果実についての成熟についても同様の差がある。本発明の成熟欠損果実は、典型的には、ピンク段階に達するまでに少くとも約２週間（典型的には約３週間）を必要とし、そしていくつかは明赤色段階に達し得るが、その果実は赤色段階に達せずにいつまでも残り得る。しかしながら、果実は、エチレンの適用に基づいて赤色段階に達する。これは、比較条件下でブレーカー段階から赤色成熟段階に達するのに典型的に５〜７日を必要とする野生型果実と対照的である。ａ／ｂ比により測定される果実色の進展は、ブレーカー又はそれに等しい段階における対照果実と比較して本発明の果実において約５〜約10倍少く測定される。トマト果実色を決定するための普通の方法は、例えばGullら（J．Amer．Soc． Hort．Sci．114： 950〜954(1989)）及び Kaderら(Hort．Sci．13： 577〜578(1 978))に記載される。対照果実が赤色に熟す時、本発明の果実の色のレベルは４〜５倍小さい。更に、本果実は、成熟の間に通常のレベルのエチレンを合成しない。典型的には、ブレーカー又はそれに等しい段階において検出されるレベルは、Grierson及びTucker（Planta 157： 174〜179(1983)）及びSawamuraら(Plant Cell Physiol ．19：1061〜1069(1978))に記載されるような普通のアッセイを用いて測定して約 0.5nl／ｇ／hr未満、通常約 0.1nl／ｇ／hr未満である。ブレーカー段階に続くピンク段階において、本果実は、対照果実と比較して約50〜約 100倍削減されたエチレンレベルを有し続ける。Ｔ−DNA 挿入物は NPTII遺伝子を含むので、カナマイシン耐性は、選択培地を用いて、又は連続３日間、カナマイシンの溶液（１ｇ／Ｌ）で10〜 14日を経たトマト苗木をスプレーすることにより決定することができる。Acc2 m RNA のレベルは、ノーザンブロット及び RNAse保護アッセイ等のような普通の技術を用いて測定することができる。植物を更にキャラクタライズするために、植物中のＴ−DNA 挿入物の構造を決定するために核ハイブリダイゼーション技術を用いることができる。以下の実施例セクションは、本発明のＴ−DNA 挿入物の分子キャラクタリゼーションの詳細な記載を供する。本発明のＴ−DNA 挿入物が一体化する正確な遺伝子座は、当業者に公知である普通の遺伝子及び分子マッピング技術を用いて決定することができる。明らかに、Ｔ−DNA 挿入物を含む特定の植物又は種子（例えば受託番号でATCCに寄託されたもの）から直接的又は間接的のいずれかで得られた植物について、その遺伝子座は親植物と同じであろう。以下の実施例は詳説のために供され、本発明を限定するものではない。実施例１Ａ．アグロバクテリウム媒介性形質転換システム米国特許第 5,283,184に記載されるようなアグロバクテリウム媒介性形質転換による植物組織内への DNAの挿入。AccSトランスジーンをトマトに移すのに用いられるベクターシステムは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスからのTiプラスミドに基づく。これらの形質転換に用いられるＴ−DNA プラスミドpWTT2144／AccSは、（１）大腸菌内での複製を確実にする ACYC184起源の複製；（２）Ａ．ツメファシエンス中の複製を確実にする（シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aerugi nosa DNA由来の）pVS1リプリコン；（３）Ａ．ツメファシエンス及び大腸菌中のバイナリープラスミドの選択を許容するプラスミドRP１からのテトラサイクリン耐性マーカー、並びに（４）その植物ゲノム中の DNA挿入物を囲うＡ．ツメファシエンスのオクトパイン株からのＴ−DNA の左及び右ボーダー領域から構成される。そのＴ−DNA 内には、Ａ．ツメファシエンスからのノパリンシンターゼ（nos ）プロモーター配列及びオクトパインシンターゼ（ocs3 ′）ターミネーション配列に融合された、酵素ネオマイシンホスホトランスフェラーゼIIをコードし、形質転換された植物細胞のための選択マーカーとして機能するトランスポゾンTn５からの nptII遺伝子、並びに移されるべき遺伝子のクローニングのための多重制限部位を有するLacZ′ポリリンカー領域がある。そのＴ−DNA は、カリフラワーモザイクウィルスからの35Ｓプロモーター及びpWTT2144のLacZ′ポリリンカー領域中のnos3 ′ターミネーション配列に融合された端を切り取られたAcc2遺伝子コード化領域の挿入物を有する。プラスミドpWTT2144を、Figurskiら(Proc．Natl．Acad．Sci．USA 76：1648〜 1652(1979))により記載されるようなトリパレンタルメーティング手順により、大腸菌から、プラスミドを通じて pAL4404を有するＡ．ツメファシエンス LBA44 04に移した。以下に詳説されるように、系1345−４を作り出すために親系 91103−114 を形質転換するのにpWTT2144／AccSを用いた。このプラスミドのＴ−DNA 領域は以下の配列からなる（図１参照）。 CaMV35S。35Ｓプロモーター領域は、カリフラワーモザイクウィルスから得られ、AccS遺伝子の発現を制御する。35Ｓプロモーターは高レベルの構成的発現に関し、トランスジーンの高発現のためのプロモーターとして広く用いられる。 Cab22Lリーダー。Cab22Lリーダー配列（Cab22L）は、Cab22L遺伝子から得られ、その遺伝子についての５′非翻訳領域に相当するペツニア・ハイブリダ（Petunia hybrida ）ゲノム DNAの69bpフラグメントである。 AccS。AccS遺伝子は、トマト（L ．esculentum ）から単離された Accシンターゼ遺伝子（Acc2）由来の端を切り取られたコード化領域である。AccS遺伝子は、塩基 149〜塩基1237のAcc2遺伝子の1088bp領域に相当する。AccS遺伝子は、機能的 Accシンターゼ酵素をコードしない。ターミネーション配列。Ａ．ツメファシエンスからのノパリンシンターゼ（no s3 ′ ）及びオクトパインシンターゼ（ocs3 ′）遺伝子ターミネーション配列は、各々AccS及び nptII遺伝子の発現において機能する。 2Xpnos プロモーター。 nosプロモーターは、Ａ．ツメファシエンスからのノパリンシンターゼ遺伝子の非翻訳５′領域の重複タンデム反復として系1345−４中に存在する。それは、 nptII選択マーカー遺伝子の発現において系1345−４において機能する。系1345−４において用いられるこの配列は、Ａ．ツメファシエンスにおいて機能するノパリンシンターゼコード化領域と関連しないので、制御されたものとしてもはや機能しない。 NptII。 nptII遺伝子はトランスポゾンTn５から本来単離されるコード化領域である。それは、特定のアミノグリコシド抗生物質のリン酸化を触媒し、形質転換された細胞をカナマイシン耐性にするタンパク質であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼIIをコードする。それは、選択マーカーとして系1345−４内で機能する。 LacZ ′ポリリンカー配列。非翻訳のLacZ′ポリリンカー配列は、バイナリーベクターpWTT2144内へAccSトランスジーンをクローニングするための部位として系1345−４において機能する。ボーダー。Ａ．ツメファシエンスからのＴ−DNA の左及び右ボーダー領域は、トマトゲノム内への遺伝子配列の転移において機能する。そのボーダー領域は、Ｔ−DNA 挿入物のためのＴ−DNA 中の唯一の必要的シス作用因子である。バイナリーベクターシステムの使用は、唯一ボーダー領域が植物ホストゲノム内に一体化するのに必要とされるように、他の必要な転移因子がトランスに作用するのを許容する。そのＴ−DNA ボーダーは、トマトゲノムに部分的にのみ移される；形質転換過程の間、左ボーダーはヌクレオチド 293と 294との間（左ボーダーニック）で切断され、他方右ボーダーは、ヌクレオチド7603と7604との間（右ボーダーニック）で切断される。この開裂は、Ｔ−DNA 中のpWTT2144／AccSの右ボーダーフラグメントの長さを1900bpから 303bpに削減し、Ｔ−DNA 中のpWTT2144／Ac cSの左ボーダーフラグメントの長さを 880bpから 589bpに削減する（図１）。Ｂ．非形質転換トマト品種 91103−114 の記載 DNAPトマト系 91103−114 は、Dr．Jay．Scott(University of Florida)により開発された交配系FL7181由来のソマクローンである。系FL7181は、平均果実重量８ozの有限の大きな果実を作る品種としてキャラクタライズされる。果実は形状において少し長円形の球状であり、比較品種(即ちFloradade)の果実より実質的に堅く引きしまっている。果実のショルダー部分は円滑であり、成熟前に、果実表面の残り部分より暗緑色の陰を示す。果実はog対立遺伝子の存在のため深紅内部色に成熟する。果実幹（小花柄）は連結部を欠く。この系はバーティシリウムしおれ病菌系１及びフサリウムしおれ病菌系１及び２に対して耐性があることが知られている。 DNAP系 91103−114 は、上述の特性全てを示すが、削減された花の端の痕サイズ、強い主幹及び果実を覆う葉の増加により根本的にFL7181と異なる。系 91103−114 は、異なる成長環境への適用においてもFL7181と異なる；FL 7181はフロリダ成長領域に特に適合するが、91103−114 は、他の領域（例えばカリホルニア）において十分に成長することが証明されている。Ｃ．遅発成熟性トマト系1345−４の記載、歴史、及びメンデル遺伝系1345−４は、バイナリーベクターpWTT2144／AccSでのDNAP系 91103−114 のアグロバクテリウム・ツメファシエンス形質転換後に得られたオリジナルのTo形質転換体1345からのホモ接合Ｔ₂選択物である。一次形質転換体1345を、数百一次形質転換体の温室スクリーンにおいて、つる上に残る場合に成熟しなかった果実を有するように選択した。次に、カナマイシン耐性についてプレスクリーニングされた（自家受精由来の）1345T₁種子のうち 10を、温室内でスクリーニングし、そしてその植物及び果実表現型に基づく観察を行った。植物1345−４を、つる上で成熟しなかった果実を有するものとして選択した。1345−４植物は、Ｔ−DNA 座についてホモ接合であることが示された。次に1345−４の自家受精からの種子を、多数の成長季節にわたって多数のフィールドで分析した。いずれのフィールドでの試みでも遅発成熟性表現型における不安定性は観察されなかった。系1345−４の安定性をモニターするのに２つの独立した方法を用いた。第１に、温室中の苗木の大集団においてカナマイシン耐性を測定することによりＴ−DNA 挿入物が安定かつ完全であることを確立することを可能にする。一次形質転換体におけるカナマイシン耐性の分離を評価することにより、1345植物が単一Ｔ−DNA 挿入物を有していることを確立した。次に、多重カナマイシン耐性Ｔ２植物を選択し、その選択されたＴ２植物の自家受精から生ずる子孫植物におけるカナマイシン耐性表現型の分離を評価した。13 45−４からのＴ３植物は全てカナマイシン耐性であり、従って、1345−４植物はホモ接合であることが予想された。系1345−４の安定性を評価するための第２の試みは、そのフィールドでの遅発成熟表現型の観察によるものである。ホモ接合1345−４系及びそれから得られた子孫の評価のためのいくつかの別個のフィールドの試みを行った。これらの試みは、1345−４の少くとも2000の別個の種に基づく果実の評価に関する。成熟過程及び全ての植物からの果実の収穫の間の複数回の個々の植物の観察に関するこれらの評価の間、全ての果実が通常の速度で成熟する例外的な植物は観察されなかった。Ｄ．遅発成熟性トマト系1345−４の DNA分析系1345内でおこった天然及び挿入の数を決定するために、Ｔ−DNA 座数を示す上述の nptII分離データと組合わせて、ゲノム DNA内のＴ−DNA 挿入物の構造をキャラクタライズするのに用いた。そのＴ−DNA は、植物内に移されたバイナリーベクターpWTT2144／AccSの左及び右ボーダー間の領域として観察される（図１参照）。この領域は、左及び右ボーダー配列と一緒に、 nptII選択マーカー及び端が切り取られた Accシンターゼ遺伝子（AccS）を含む。図２は、 DNAを開裂するのに用いられる制限酵素、並びにＴ−DNA 挿入物、左ボーダー（LB）、 nptII 、Acc2、及び右ボーダー（RB）プローブの構造を決定するのに用いられる４つのプローブの位置を示す。１．複製数 1345における更なるAccS遺伝子の数は、トランスジェニック植物からのゲノム DNAを、HindIII及びEcoR Ｉを消化し、次に電気泳動してナイロン膜に移した後に、³²Ｐ−標識 Acc2 プローブとハイブリダイズすることにより決定した。このプローブは、トランスジーン（AccS）からの0.9kb EcoR Ｉ−HindIIIフラグメント及び更なる 300bpのイントロン配列を含む内因性Acc2遺伝子からの1.2kb HindIIIフラグメントとハイブリダイズする。トランスジーン及び内因性バンドの強度を比較することにより、トランスジーンの複製数の決定は、ヘミ接合一次形質転換体又はホモ接合Ｓ１子孫のいずれかで行うことができる。非形質転換トマト植物、Baxter's Early Bush Cherry(BEB)及びHindIII及びEcoR Ｉで消化されたAcc2プローブとハイブリダイズされた1345−４からのゲノム DNAのハイブリダイゼーションパターンを分析した。1345−４、1345のホモ接合Ｓ１子孫において、内因性遺伝子対トランスジーン比が２超であることは、トランスジェニック DNA中に少くとも２のAccSのコピーがあることを示唆する。 nptII遺伝子は単一座として分離するので、単一座においてＴ−DNA の２〜３のコピーが存在することがもっともらしい。２．Ｔ−DNA 構造単一の完全なコピー又は複数のＴ−DNA コピーを左又は右ボーダーのいずれかの周辺の直接又は逆方向反復として１つの遺伝子座に挿入することができることが知られており、Ｔ−DNA の欠失又はゲノム DNAの挿入がＴ−DNA コピー間に存在し得ることが知られている(Jorgensonら、Mol．Gen．Genet．207： 471〜477( 1987))。1345ゲノム中のＴ−DNA の組成を決定するために、我々は、いくつかの制限酵素で消化された1345−４ゲノムに、いくつかの異なるプローブをハイブリダイズした。図２は、Ｔ−DNA 中のプローブの相対マップ位置を示す。左及び右ボーダー： Eco −RI消化を、完全な左及び右ボーダーフラグメントの数を決定するために行った。Ｔ−DNA 中の EcoR2部位は（AccSトランスジーン内の）LBからのもので約 500bp及びRBからのもので約 2.1kbである。特定のボーダープローブにハイブリダイズするフラグメントは少くともこのサイズであろう。LBにおいて逆方向反復があり、そのボーダーが完全で平滑であるなら、我々は、LBにのみハイブリダイズする１kbフラグメントを見ることが予想されよう。RBについて、完全な逆方向反復は、RBフラグメント及びAccSプローブにハイブリダイズする 4.2kbフラグメントを供するだろう。直接的なLB−RB反復は、ボーダープローブとAccSとの両方にハイブリダイズする 2.6kbのフラグメントを生ずるだろう。 EcoR Ｉでの1345−４ DNA切断において、2.9kbフラグメントはLBプローブのみにハイブリダイズし、3.5kbフラグメントはRBプローブのみにハイブリダイズし、そのことは１つの完全な左及び右ボーダーがあることを示す。同様に、 Nco Ｉ消化は両方のプローブと単一にハイブリダイズするバンドを示し、そのフラグメントは適切なサイズのものである(1.6kb超のLBフラグメント及び 2.3kb超のRBフラグメント)。HindIII及び Xba Ｉ消化も、適切なサイズの単一バンドを示し、そのことは、単一な完全なＴ−DNA 挿入があることを示唆する。しかしながら、我々は、コピー数ブロット（先を参照のこと）から、AccSトランスジーンの少くとも２つのコピーがあることを知る。これらの結果をまとめると、完全なAccS遺伝子を含むがそのボーダーの一方又は両方を失っているＴ−DNA の削除された形態も存在することを示唆する。LB及びRBプローブが同じフラグメントとハイブリダイズしないことから、直接反復構造は存在しない。しかしながら、いずれのボーダーの周囲にも逆方向又は間接的反復があり得た。 nptII及びAccSプローブとのハイブリダイゼーションを、Ｔ−DNA 挿入物を更にキャラクタライズするために行った。 nptII：Ｔ−DNA が完全であるなら、 nptIIプローブに、完全な2Xpnos− nptI I −ocs3′融合物を含む2.4kb EcoR Ｉフラグメントにハイブリダイズするだろう（図２参照）。EcoR Ｉでの1345−４ゲノム DNA切断において、5.2kb及び 2.9kbの２つの他のハイブリダイズするフラグメントに加えて、予想される 2.4kbフラグメントが存在する。その 2.9kbフラグメントも左ボーダープローブとハイブリダイズすることは、おそらく１つの完全な内部コピー及びLBで発生した欠失を有するＴ−DNA の２つの不完全なコピーが存在することを示す。2.9kb EcoR Ｉフラグメントは nptII及びLBプローブの両方とハイブリダイズするので、この連結部分は、EcoR Ｉ部位を含むボーダーの１つの欠失を有する逆方向反復であるようである。LBプローブと nptIIとの両方へのEcoR Ｉフラグメントのハイブリダイゼーションは、削除がEcoR Ｉ部位の１つを除去する場合のみおこり得る。 Nco Ｉは nptIIコード化配列内を開裂するので、この酵素でのＴ−DNA の消化は、２つの nptIIフラグメント、即ちAccSトランスジーンの ATGに位置した Nco Ｉ部位までの nptII３′コード化領域を貫く 2.1kbのもの、並びに５′ nptIIコード化領域及びゲノム DNA又は隣接Ｔ−DNA 挿入物のいずれかにおける次の Nco Ｉ部位に対するLBを含む 1.2kb長のものを供するだろう。LBにおいて完全な逆方向反復があるなら、我々は、 nptII及びLBプローブの両方とハイブリダイズする 3.3kb Nco Ｉフラグメントを予想する。EcoR Ｉ消化からの結果に基づいて、我々は、存在するべき 2.1kbフラグメント、及び 1.2kb超の２つのフラグメントを予想する。これらの１つはLBともハイブリダイズするだろう。予想される通り、2. 1kbフラグメントが存在し、そしてこれらもLBプローブとハイブリダイズする 6. 6kbフラグメント及び 2.9kbフラグメントが存在する。これは、３つのＴ−DNA コピー、即ち完全であるもの、LBに伸びる削除(約600bp)を含む逆方向反復であるもの、及び右ボーダーに伸びる削除（約50bp）を含む第２の逆方向反復の存在で一貫している。 AccS：AccSプローブとのハイブリダイゼーションは、 Nco Ｉ及びEcoR Ｉ各々について 2.3kb及び 2.1kb超のフラグメントを供するだろう。これらのフラグメントも、そのボーダーが完全であるならRBプローブとハイブリダイズするだろう。その結果は、 Nco Ｉについて２つのハイブリダイズするフラグメント、即ち15kb 及び 3.8kb、並びにEcoR Ｉについて２つ、即ち４kb及び 3.5kbを示す。その3.8k b Nco Ｉフラグメント及び3.5kb EcoR ＩフラグメントもRBとハイブリダイズする。これらの結果は、AccSの少くとも２つのコピーが存在し、１つのコピーは削除されたRBでＴ−DNA 上に存在することを確認する。AccS自体は削除又は再配置されていないことを証明するために、完全に端を切り取られた遺伝子を含む完全な 1.1kbフラグメントをはずすために Nco Ｉ／ XbaＩ二重消化を行った。 AccS 及び nptIIの結合： Xba Ｉ及びHindIIIは、右ボーダーからのものにおいて、１回、約１kbにＴ−DNA を開裂する。これらの酵素のいずれもの消化は、 n ptII 及びAccS遺伝子の両方を含むフラグメントを形成するだろう。 Xba Ｉ消化の後、 9.2kb及び 6.2kbフラグメントが両方のプローブとハイブリダイズした。Hi ndIII 消化の後、9.2kb及び 6.4kbフラグメントは両方のプローブとハイブリダイズし、そのことは、AccSの各々のコピーが nptIIのコピーに連結されていることを確認する。9.2kbフラグメントもLBとハイブリダイズする。そのフラグメントのサイズはLB及びRBにおける逆方向Ｔ−DNA 反復の存在で一貫している。 1345−4 Ｔ−DNA 挿入物についての構造を図４に示す。それは、LB及びRBにおける逆方向反復内にアセンブルされた３つのＴ−DNA からなる。LB−LB及びRB− RB連結部において、１つのボーダーは、各々の連結部において１つのみの完全なボーダーが存在するであろうように削除される。Ｔ−DNA 構造の両端におけるLB 及びRBも削除される。終点右側は nptII遺伝子に対して内側であり、内部 Nco Ｉ部位を削除し、そして終点左側はAcc2遺伝子と右ボーダーとの間にある。最後に、1345−４のＴ−DNA 挿入物のヌクレオチド配列は、予想される制限マップからのものに従い、配列番号：１において存在する。上述の実施例は本発明を詳説するために供され、その範囲を限定するものでない。本発明の他の変形は、当業者に直ちに明らかであろうし、添付の請求の範囲に含まれる。本明細書に言及される全ての出版物、特許、及び特許出願は引用により本明細書に組み込まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ダンスミュア，パメラアメリカ合衆国，カリフォルニア 94610, ピードモント，ラサールアベニュ 160 (72)発明者ハウイー，ウィリアム，ジェイ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94520, コンコルド，エイボンアベニュ 2847 (72)発明者ジョー，ローレンス，ケー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94605, オークランド，フェイトンドライブ 8101 (72)発明者リー，キャスリーン，ワイ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94602, オークランド，ライマンロード 3992

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号：１と実質的に同一な配列を有する遺伝子座を含むトマト植物。２．前記植物が、その果実がブレーカー段階で採集され15℃で保存された場合に、ブレーカー段階後約２〜約３週間でピンク段階に達する果実を有することを特徴とする請求項１記載の植物。３．前記果実がエチレンの適用の欠如下で赤色段階に達しないことを特徴とする請求項１に記載の植物。４．受託番号でアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された種子から発芽することを特徴とする請求項１に記載の植物。５．請求項１に記載の植物からのトマト果実。６．前記果実がブレーカー段階で採集され15℃で保存された場合に、ブレーカー段階後約２〜約３週間でピンク段階に達することを特徴とするトマト果実。７．前記果実がエチレンの適用の欠如下で赤色段階に達しないことを特徴とする請求項６に記載のトマト果実。８．前記果実が、約10nl／ｇ／hr未満のエチレンレベルを有することを特徴とする請求項６に記載のトマト果実。９．エチレン生産量の少いトマト植物を生産する方法であって、配列番号：１と実質的に同一な配列を有する遺伝子座を含むトマトと親トマト植物を交配し、それにより子孫を作り出すことを含む方法。 10．前記遺伝子座を含むトマト植物が、受託番号でアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された種子から発芽したものであることを特徴とする請求項９に記載の方法。 11．果実がブレーカー段階で採集され15℃で保存された場合に、ブレーカー段階後約２〜約３週間でピンク段階に達する果実を有する子孫を選択することを含む選択ステップを更に含む請求項９に記載の方法。 12．請求項９に記載の方法に従って作り出された植物。 13．５′から３′方向に、左ボーダー配列、2Xpnosプロモーター配列、NPTII 遺伝子、ocs3′非翻訳領域、p35Sプロモーター配列、トマトAcc2遺伝子のヌクレオチド 149〜ヌクレオチド1237からなる配列、nos3′非翻訳領域、及び右ボーダー配列から本質的になる挿入されたＴ−DNA と、前記右ボーダー配列に連結されたＴ−DNA の右ボーダー逆方向反復であって左及び右ボーダー配列を欠如するものと、前記左ボーダー配列に連結された左ボーダー逆方向反復であって、左及び右ボーダー配列を欠如するものと、を含む遺伝子座を含むトマト植物。 14．請求項13に記載の植物からのトマト果実。 15．受託番号でアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された種子から発芽されるトマト植物。 16．請求項15に記載の植物からのトマト果実。